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TW202045728A - 用於治療克拉培氏病之組成物 - Google Patents

用於治療克拉培氏病之組成物 Download PDF

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TW202045728A
TW202045728A TW109106249A TW109106249A TW202045728A TW 202045728 A TW202045728 A TW 202045728A TW 109106249 A TW109106249 A TW 109106249A TW 109106249 A TW109106249 A TW 109106249A TW 202045728 A TW202045728 A TW 202045728A
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raav
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seq
protein
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TW109106249A
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詹姆士Ｍ 威爾森
茱麗葉 豪杜司
拿單 卡茲
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賓州大學委員會
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Abstract

提供一種用以投予至克拉培氏病病患之經調配以鞘內遞送重組腺相關病毒(rAAV)載體之組成物，其包含帶有人類半乳糖基神經醯胺酶(GALC)基因之AAVhu68衣殼。亦提供新穎基因序列及其用途。

Description

用於治療克拉培氏病之組成物
本發明係關於一種用以投予至克拉培氏病(Krabbe disease)病患之經調配以鞘內遞送重組腺相關病毒(rAAV)載體之組成物，其包含帶有人類半乳糖基神經醯胺酶(GALC)基因之AAVhu68衣殼；亦關於新穎基因序列及其用途。
腺相關病毒(AAV)為小病毒(Parvovirus)家族的成員，係一種小的無套膜二十面體病毒，具有約4.7千鹼基(kb)長的單股線性DNA(ssDNA)基因體。野生型基因體包含在DNA鏈兩端的反向末端重複(ITR)和兩個開讀框(ORF)：rep及cap。Rep由編碼AAV生命週期所需之rep蛋白的四個重疊基因組成，且cap包含衣殼蛋白VP1、VP2和VP3的重疊核苷酸序列，VP1、VP2和VP3自組裝形成二十面對稱體的衣殼。
已將衍生自複製缺陷型人類小病毒的重組腺相關病毒(rAAV)載體描述為用於基因遞送的適當媒介。通常，從載體中除去功能性rep基因和cap基因，產生無複製能力的載體。這些功能在載體生產系統中提供，但在最終載體中不存在。
至今為止，已有從人類或非人類靈長類(NHP)分離的多種不同的充分表徵的AAV。已經發現，不同血清型的AAV呈現出不同的轉染效率，且呈現出對不同細胞或組織的向性。WO 2005/033321中描述許多不同的AAV演化支，包括演化支F，其在其中被鑒定為僅具有AAV9、AAVhu31和AAVhu32三個成員。AAV9的結構分析被提供於M. A. DiMattia et al, J. Virol. (2012年6月) vol. 86 no. 12 6947-6958中。該文獻報導AAV9具有三種可變蛋白(vp)的60個拷貝(總共)，該可變蛋白(vp)由cap基因編碼並具有重疊序列。這些包括VP1(87 kDa)、VP2(73 kDa)及VP3(62 kDa)，它們分別以1：1：10的預測比率存在。VP3的整體序列在VP2內，且VP2整個在VP1內。VP1具有獨特的N端結構域。精細坐標(refined coordinate)和結構因子可在RCSB PDB資料庫中以登錄號3UX1獲得。
多種不同的AAV9變體已被工程化以便去靶向(detarget)或靶向不同的組織。參見，例如，N. Pulicheria, “Engineering Liver-detargeted AAV9 Vectors for Cardiac and Musculoskeletal Gene Transfer”, Molecular Therapy, Vol, 19, no. 6, p. 1070-1078 (2011年6月)。亦報導了遞送基因穿過血腦屏障的AAV9變體的開發，參見，例如B.E. Deverman et al, Nature Biotech, Vol. 34, No. 2, p 204 - 211 (2016年2月1日線上公佈)及Caltech press release, A. Wetherston, www.neurology-central.com/2016/02/10/successful-delivery-of-genes-through-the-blood-brain-barrier/,accessed 10/05/2016。亦可參見WO 2016/0492301及US 8,734,809。
最近，從天然來源擴增衣殼基因後所鑑定出的AAVhu68被鑑定為新的AAV衣殼，參見例如WO 2018/160582，該AAV和AAV9一樣都在演化支F內。
克拉培氏病(球狀細胞白血質障礙；globoid cell leukodystrophy；GLD)是一種體染色體隱性遺傳型溶酶體貯積病(溶酶體貯積病；LSD)，由編碼水解酵素半乳糖基神經醯胺酶(galactosylceramidase；GALC)的基因突變引起(Wenger D.A., et al. (2000) Mol Genet Metab. 70(1)：1-9)，此酵素負責某些半乳醣脂類的降解，包括半乳糖基神經醯胺(腦醯胺(ceramide))及半乳糖基鞘胺醇(galactosylsphingosine)(鞘胺醇半乳糖苷(psychosine))，其等幾乎僅存在於髓磷脂鞘(myelin sheath)中。在克拉培氏病中，GALC缺乏會導致溶酶體中的鞘胺醇半乳糖苷(而非半乳糖基神經醯胺)發生毒性積累(Svennerholm et al., 1980)。鞘胺醇半乳糖苷的積累對CNS中產生髓磷脂的寡樹突神經膠質細胞(oligodendrocyte)及PNS中的許旺氏細胞(Schwann cell)特別具有毒性，導致這些細胞類型迅速廣泛的死亡。CNS及PNS中的髓磷脂分解均伴隨反應性星狀神經膠質細胞增殖(astroytic gliosis)及巨大多核巨噬細胞(「球狀細胞」)的浸潤(Suzuki K. (2003) J Child Neurol. 18(9)：595-603)。在缺乏GALC活性的情況下，半乳糖基神經醯胺並不會積聚，其主要是由於另一種酵素，GM1神經節苷脂β-半乳糖苷酶(GM1 ganglioside β-galactosidase)的水解(Kobayashi T., et al. (1985) J Biol Chem. 260(28)：14982-7)和寡樹突神經膠質細胞的死亡導致半乳糖基神經醯胺合成的停止(Svennerholm L., et al. (1980) J Lipid Res. 21(1)：53-64)所致。
目前可用於克拉培氏病的唯一改變病程治療為造血幹細胞移植(HSCT)，通常由臍帶血移植(UCBT)、同種異體周圍血液幹細胞或同種異體骨髓所提供。使用HSCT來治療嬰兒克拉培氏病(infantile Krabbe disease)的病患僅取得不太多的成功，這些病患通常在他們的第一個生日之前就出現症狀，當在嬰兒克拉培氏病的明顯症狀發作後進行HSCT時，其僅提供最小的神經系統改善，並不能顯著改善存活率(Escolar M.L., et al. (2005) N Engl J Med. 352(20)：2069-81)。在有症狀前之病患中進行HSCT是有效的，但即使這樣，運動成效仍然很差(Escolar M.L., et al. (2005) N Engl J Med. 352(20)：2069-81；Wright M.D., et al. (2017) Neurology. 89(13)：1365-1372；van den Broek B.T.A., et al. (2018) Blood Adv. 2(1)：49-60)。與後來移植的嬰兒相比，在30天之前移植的嬰兒具有更佳的存活率和功能性功效(Allewelt H., et al. (2018) Biol Blood Marrow Transplant. 24(11)：2233-2238)。與症狀發作後未經治療或經治療的嬰兒克拉培氏病病患相比，症狀發生前的移植在改善進行性中央髓鞘化、正常的接受語言、減輕症狀的嚴重程度及較長的存活期上產生顯著較佳的功效(Escolar M.L., et al. (2005) N Engl J Med. 352(20)：2069-81；Duffner P.K., et al. (2009) Genet Med. 11(6)：450-4；Wright M.D., et al. (2017) Neurology. 89(13)：1365-1372)。即便如此，大多數在症狀出現之前接受治療的兒童在身高和體重仍遠低於平均水平，且具有進行性總體動作遲緩從輕度痙攣到無法獨立行走(Escolar M.L., et al. (2005) N Engl J Med. 352(20)：2069-81；Duffner P.K., et al. (2009) Genet Med. 11(6)：450-4)，一些兒童還具有殘留損傷，包括後天性小頭畸形、需要進行胃造口術及發音困難(Duffner P.K., et al. (2009) Genet Med. 11(6)：450-4)。此外，HSCT似乎僅影響CNS特異性疾病病理，與例如周圍神經病變之PNS病理相關的臨床特徵仍不受HSCT的影響。這些結果突顯了HSCT的局限性，尤其是在疾病的快速發展超過了造血幹細胞植入、遷移至CNS、分化並通過GALC分泌和交叉校正(即，校正細胞所分泌之酵素被GALC缺陷型細胞吸收的過程)所提供治療效果所需的時間的早期發作形式中。
在本技術領域中仍需要針對克拉培氏病病患的改善治療方法。
[發明概要]
本發明提供一種包含重組腺相關病毒(rAAV)組成物，其包含靶定中樞神經系統中之細胞的AAV衣殼及載體基因體，該載體基因體包含：(i)半乳糖基神經醯胺酶編碼序列，其在指導該蛋白質表現之調控序列的控制下，編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO：10之成熟半乳糖基神經醯胺酶蛋白質，及(ii)將載體基因體包裝在AAV衣殼中所必需的AAV反向末端重複，其中該載體基因體被包裝於AAV衣殼中。在某些實施方式中，該AAV衣殼為AAVhu68衣殼。在某些實施方式中，該編碼序列具有核酸序列SEQ ID NO：9或與其具有95%至99.9%同一性之序列。在某些實施方式中，該編碼序列編碼SEQ ID NO：10成熟蛋白質及適於人類中樞神經系統細胞之外源性信號肽。在某些實施方式中，該調控序列包含：β-肌動蛋白啟動子、插入子及/或兔球蛋白polyA。在某些實施方式中，該組成物包含具有載體基因體CB7.CI.hGALC.rBG之rAAV。
在某些實施方式中，提供一種重組腺相關病毒，其包含靶定中樞神經系統中之細胞的AAV衣殼及載體基因體，該載體基因體包含(i)半乳糖基神經醯胺酶編碼序列，其在指導該成熟半乳糖基神經醯胺酶蛋白質表現之調控序列的控制下，編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO：10之成熟半乳糖基神經醯胺酶蛋白質，及(ii)將載體基因體包裝在AAV衣殼中所必需的AAV反向末端重複。在某些實施方式中，該AAV衣殼為AAVhu68衣殼。在某些實施方式中，該編碼序列具有核酸序列SEQ ID NO：9或與其具有95%至99.9%同一性之序列。在某些實施方式中，該編碼序列編碼成熟蛋白質SEQ ID NO：10及適於人類中樞神經系統細胞之外源性信號肽。在某些實施方式中，該調控序列包含β-肌動蛋白啟動子、插入子及/或兔球蛋白polyA。在某些實施方式中，該載體基因體為CB7.CI.hGALC.RBG。
在某些實施方式中，提供一種組成物，其包含用於治療克拉培氏病的rAAV儲料(stock)。在某些實施方式中，提供一種包含rAAV儲料之組成物於製備醫藥品之用途。在某些實施方式中，該所提供之組成物有用於治療周圍神經功能障礙及/或有用於治療克拉培氏病。在某些實施方式中，rAAV可作為與造血幹細胞療法、骨髓移植及/或基質減少療法之協同療法。
在某些實施方式中，提供一種包含半乳糖基神經醯胺酶編碼序列之質體，該序列編碼信號肽及具有胺基酸序列SEQ ID NO：10 (aa 43至685)之成熟人類半乳糖基神經醯胺酶蛋白質。在某些實施方式中，該質體包含核酸序列SEQ ID NO：9或與其具有95%至99.9%同一性之序列。
在某些實施方式中，提供一種組成物之用途，用於治療克拉培氏病、矯正由克拉培氏病所引起之引起呼吸衰竭及運動功能喪失之周圍神經功能障礙、或延緩由克拉培氏病引起的癲癇發作或頻率，其包含投予病患含重組腺相關病毒(rAAV)儲料之組成物，該rAAV包含：(a)靶定中樞神經系統中之細胞的AAV衣殼；及(b)含半乳糖基神經醯胺酶編碼序列之載體基因體，在控制指導蛋白質表現的調控序列下，該半乳糖基神經醯胺酶編碼序列編碼胺基酸序列SEQ ID NO：10之成熟半乳糖基神經醯胺酶蛋白質，該載體基因體劑進一步包含將載體基因體包裝至AAV衣殼所必須之AAV反向末端重複，其中該載體基因體被包裝於AAV衣殼中。在某些實施方式中，該病患具有晚期嬰兒型克拉培氏病(Late infantile Krabbe disease；LIKD)。在某些實施方式中，該病患具有少年型克拉培氏病(Juvenile Krabbe disease；JKD)。在某些實施方式中，該病患具有青少年/成年發作型克拉培氏病。在某些實施方式中，投予rAAV作為造血幹細胞移植(HSCT)、骨髓移植及/或基質減量療法的協同療法。在某些實施方式中，rAAV藉由鞘內、腦室內或腦實質內投予。
在某些實施方式中，所提供之組成物被調配用於鞘內、腦室內、腦實質內投予。在某些實施方式中，該組成物以單一劑量藉由電腦斷層掃描攝影-(CT-)導引的枕骨下注射而投予至小腦延髓池(cisterna magna)(小腦延髓池內(intra-cisterna magna))。
從以下對本發明的詳細描述中，本發明的這些及其它面向將是顯而易見的。
提供一種表現人類半乳糖基神經醯胺酶 (GALC)蛋白之重組腺相關病毒(rAAV)、含該rAAV之組成物及其用途。在某些實施方式中，rAAV.hGALC首次為有症狀的嬰兒克拉布氏病(早期嬰兒克拉培氏病；EIKD)之疾病修飾(disease-modifying)治療。在某些實施方式中，rAAV.hGALC提供一種用於症狀發生前的嬰兒病患的治療。在某些實施方式中，rAAV.hGALC提供一種可矯正導致呼吸衰竭及運動功能喪失的周圍神經療法。在某些實施方式中，rAAV.hGALC提供受益風險比例(benefit-risk ratio)不支持造血幹細胞移植(HSCT)的額外選擇，因為HSCT是目前唯一的疾病修飾治療。
如本文所使用，「rAAV.GALC」係指具有AAV衣殼之rAAV， 該AAV衣殼中包裝至少含一種半乳糖基神經醯胺酶蛋白質(酵素)的編碼序列的載體基因體。rAAVhu68.GALC係指一種rAAV，其中該AAV衣殼為AAVhu68衣殼，其如本文中所定義。以下實施例亦說明其它AAV衣殼。
術語「cGALC」係指一種表現犬GALC之編碼序列，在以下實施例中用於犬類研究。犬GALC具有26 bp信號肽且蛋白質總長度為669個胺基酸。
術語「hGALC」係指一種人類GALC之編碼序列。
hGALC之同功型1為典型序列且長度為685個胺基酸，此胺基酸序列轉載於SEQ ID NO：6。儘管有認為起始Met位於位置17而不是位置1，但成熟蛋白質位於約胺基酸43至約685，且信號肽位於位置1至42。雖然已知GALC的多個同功型(同功型1-5)，並且已經描述了超過三十六個天然變體，但是本發明人發現在位置641上由蘇胺酸(T)至丙胺酸(A)的變異是特別受期望的，此序列提供於SEQ ID NO：10。此變體為經人類半乳糖基神經醯胺酶(hGALC)編碼序列所編碼之蛋白序列，該編碼序列於本文所提供之rAAV及載體基因體的實施例中說明。半乳糖基神經醯胺酶(GALC)亦被稱為半乳糖腦苷脂酶(galactocerebrosidase)，且這些名稱可以互換使用。在某些實施方式中，此變體可被用於酵素置換療法或聯合療法。
如本文所使用，「CB7.CI.hGALC.rBG」係指一種載體基因體(例如，如圖2所示)，其包含在普遍存在的CB7啟動子控制下的人類GALC之編碼序列及包括至少一CMV IE (細胞巨大病毒立即早期)增強子、嵌合插入子及兔β-球蛋白(rBG)polyA序列，其等的兩側為5'ITR及3'ITR。在某些實施方式中，CB7.CI.hGALC.rBG包括編碼具有SEQ ID NO：10之胺基酸序列之成熟GALC蛋白質的GALC編碼序列。在某些實施方式中，CB7.CI.hGALC.rBG包括GALC之編碼序列，其包含SEQ ID NO：9之核酸序列或與其具有95%至99.9%同一性之序列。在另一種實施方式中，CB7.CI.hGALC.rBG載體基因體包括SEQ ID NO：19。在某些實施方式中，CB7.CI.hGALC.rBG包含SEQ ID NO：10之成熟蛋白質及外源性信號肽之編碼序列。
在某些實施方式中，所考量之融合蛋白質為至少含有成熟GALC，其中全部或一部分天然信號肽被移除(aa 1-17，或aa 1-42)並以外源性信號肽取代。此類融合蛋白質可含有外源性信號肽及至少成熟人類GALC蛋白質(例如，SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：10之胺基酸43至695)。在某些實施方式中，該融合蛋白質含有適於人類CNS中之細胞的外源性信號肽，即一種取代天然信號肽的信號肽，以改善人類CNS所存在之細胞中的蛋白質(即hGALC)產生、胞內運輸及/或分泌。適於人類CNS中之細胞的外源性信號肽，包括但不限於，天然存在於免疫球蛋白(例如，IgG)、細胞介素(例如，IL-2、IL12、IL18等)、胰島素、白蛋白，β-葡萄醣醛酸苷酶、鹼性蛋白酶，馮威里氏因子(von Willebrand factor；VWF)或纖連蛋白分泌信號肽的那些外源性信號肽(亦參見，例如www.signalpeptide.de/index.php?m=listspdb_mammalia)。
本發明亦包括編碼本文提供之GALC蛋白質的核酸序列(例如，SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10或含成熟GALC之融合蛋白質)。在某些實施方式中，編碼序列為編碼蛋白質之cDNA序列。然而，亦包括對應的RNA序列。
在某些實施方式中，核酸編碼序列具有cDNA序列SEQ ID NO：5或與其具有95%至99.9%同一性之序列，或其片段。適當的片段包括成熟蛋白質之編碼序列(約nt 127至約nt 2058)，或具有信號肽的片段之成熟蛋白的編碼序列(例如，約nt 54至約nt 2058)。在某些實施方式中，編碼序列具有編碼SEQ ID NO：5之成熟hGALC的核酸序列(nt 127至2058)或含相同及外源性領導序列之融合蛋白質，或與其具有95%至99.9%同一性之序列。在某些實施方式中，編碼序列具有編碼SEQ ID NO：5之成熟hGALC的核酸序列 (nt 127至2058)或與其具有95%至99.9%同一性之序列，或其包含領導序列片段和成熟hGALC之片段。在某些實施方式中，該編碼序列編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO：10之全長人類GALC蛋白。在某些實施方式中，該編碼序列編碼SEQ ID NO：5的hGALC領導序列(核酸1至126)及成熟蛋白質(經核酸127至2058編碼)。
在某些實施方式中，表現匣包含一或多個miRNA目標序列，該目標序列抑制hGALC在背根神經節(drg)中表現(參見例如，International Patent Application No. PCT/US19/67872, 12, 2020年2月12日申請，其藉由引用併入本文)。
如本文所使用，克拉培氏病，亦稱為球狀細胞白血質障礙(globoid cell leukodystrophy；GLD)，為一種因影響半乳糖基神經醯胺酶(GALC)活性的突變引起的溶酶體貯積病，GALC是負責降解髓磷脂半乳醣脂的一種酵素。依據酶的欠缺嚴重程度已經描述數種類型之克拉培氏病，由最嚴重至最不嚴重的酶欠缺為：≤6個月發病定義為早期嬰兒克拉克氏病(EIKD)；7到12個月發病定義為晚期嬰兒克拉克氏病(LIKD)；少年克拉培氏病(JKD)的定義是發病時間為13個月至10歲；以及青少年/成年發作型克拉培氏病。
在某些實施方式中，有效量的rAAV.GALC載體可將CSF中的GALC酵素水平提高至正常水平的30%至100%以內。在其它實施方式中，有效量的rAAV.GALC載體可使血漿中的GALC酵素水平增加至正常水平的30%至100%以內。在某些實施方式中，觀察到GALC之CSF或血漿水平的較低增加量，但是觀察到如本文所述與克拉培氏病相關的一種或多種症狀的改善。
「重組AAV」或「rAAV」為一種DNA酶抗性病毒顆粒，包含AAV衣殼及載體基因體兩個元件，該載體基因體至少含有包裝在AAV衣殼內的非AAV編碼序列。除非另有說明，否則該術語可與短語「rAAV載體」互換使用。rAAV為一種「複製缺陷型病毒」或「病毒載體」，因為其缺少任何功能性AAV rep基因或功能性AAV cap基因且不能產生子代。在某些實施方式中，唯一的AAV序列是AAV反向末端重複序列(ITR)，通常置於載體基因體的5'和3'末端，以便使位於ITR之間的基因和調節序列包裝在AAV衣殼內。
如本文中所使用，「載體基因體」係指包裝在形成病毒顆粒的rAAV衣殼內部的核酸序列。此核酸序列含有AAV反向末端重複序列(ITRs)。在本文實施例中，載體基因體由5’至3’含有(最低限度)AAV 5’ ITR、編碼序列及AAV 3’ ITR。可選擇來自AAV2之ITR，一種異於衣殼之不同來源AAV，或可選擇除全長ITR以外者。在某些實施方式中，ITR係來自與生產過程中提供rep功能的AAV或與反式互補AAV相同的AAV來源。再者，可使用其它ITR。此外，載體基因體含有指導表現基因產物的調節序列，載體基因體的適當成分於本文中更詳細地討論。
AAVhu68 如以下實施例中所述，本文所提供之rAAV包含AAVhu68衣殼，參見例如，WO 2018/160582，其藉由引用併入本文。AAVhu68包含於演化支F，AAVhu68 (SEQ ID NO：2)與另一演化支F病毒AAV9 (SEQ ID NO：4)的區別在於vp1位置67及157的二個編碼胺基酸。相較之下，另一演化支F AAV(AAV9，hu31，hu31)在位置67具有Ala，在位置157位具有Ala。
rAAVhu68由AAVhu68衣殼及載體基因體組成。在一實施方式中，含rAAVhu68之組成物包含vp1之異源族群、vp2之異源族群及vp3蛋白質之異源族群的組裝。如本文中所使用，當用來指稱vp衣殼蛋白時，術語「異源」或其任何語法變化，係指一個由不相同元件組成的族群，例如，具有帶有不同修飾胺基酸序列的vp1、vp2或vp3單體(蛋白質)。SEQ ID NO：2提供AAVhu68 vp1蛋白質之經編碼的胺基酸序列。AAVhu68衣殼包含vp1蛋白質內、vp2蛋白質內及vp3蛋白質內的亞群，其在SEQ ID NO：2中具有對預期之胺基酸殘基的修飾。這些亞群至少包括某些去醯胺化之天冬醯胺酸(N或Asn)殘基。例如，某些亞群在SEQ ID NO：2中的天冬醯胺酸-甘胺酸對中包含至少一個、兩個、三個或四個高度去醯胺化的天冬醯胺酸(N)位置，且可選擇地進一步包含其它去醯胺化的胺基酸，該去醯胺化會導致胺基酸變化及其它可選擇的修飾。這些和其它修飾的各種組合在本文中描述。
如本文所使用，vp蛋白質之「亞群」係指一組vp蛋白，其具有至少一個確定的共同特徵，並且由參考組的至少一個組成員至少於全部成員組成，除非另有說明。例如，vp1蛋白質的「亞群」為至少一個(1)在組裝的AAV衣殼中的vp1蛋白質並且少於全部vp1蛋白質，除非另有說明。vp3蛋白質的「亞群」可為一種(1)在組裝的AAV衣殼中的vp3蛋白質，少於全部vp3蛋白質，除非另有說明。例如，vp1蛋白質可為vp蛋白質的亞群；vp2蛋白質可為vp蛋白質的分離亞群，且vp3是組裝的AAV衣殼中vp蛋白的另一亞群。在另一個實例中，vp1、vp2和vp3蛋白質可包含具有不同修飾的亞群，例如至少一個、兩個、三個或四個高度去醯胺化的天冬醯胺，例如在天冬醯胺-甘胺酸對處。
除非另有指出，否則高度去醯胺化係指與參考胺基酸位置的所預測的胺基酸序列相比，在參考胺基酸位置處至少45%去醯胺化、至少50%去醯胺化、至少60%去醯胺化、至少65%去醯胺化、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、97%、99%、至多約100%去醯胺化(例如基於全部vp1蛋白，SEQ ID NO：2的胺基酸57處的至少80%的天冬醯胺酸可被去醯胺化，或基於全部vp1、vp2和vp3蛋白質，SEQ ID NO：2的胺基酸409處的天冬醯胺酸中20%可被去醯胺化)。此類百分比可以使用2D-凝膠、質譜技術或其它適當技術來確定。
如本文所提供，SEQ ID NO：2之各個去醯胺化的N可獨立為天冬胺酸(Asp)、異天冬胺酸(isoAsp)、天冬胺酸鹽及/或Asp和isoAsp的互變混合，或其等之組合。α-及異天冬胺酸可存在任何適當比例，例如，在某些實施方式中，該比例可為10：1至1：10之天冬胺酸與異天冬胺酸，約50：50之天冬胺酸：異天冬胺酸，或約1：3之天冬胺酸：異天冬胺酸，或另一選擇的比例。在某些實施方式中，在SEQ ID NO：2中一或多個麩醯胺酸(Q)去醯胺化成麩胺酸(Glu)，即α-麩胺酸、γ-麩胺酸(Glu)或α-及γ-麩胺酸之混合物，其可經由普通的戊二醯亞胺(glutarinimide)中間體相互轉化。α-及γ-麩胺酸可存在任何適當的比例，例如，在某些實施方式中，該比例可為10：1至1：10的α與γ，約50：50之α：γ或約1：3之α：γ，或另一選擇的比例。
因此，rAAVhu68包括在具有去醯胺化胺基酸之vp1、vp2及/或vp3蛋白質的rAAVhu68衣殼內的亞群，其至少包括含至少一個高度去醯胺化的天冬醯胺酸的至少一個亞群。此外，其它修飾可包括異構化，特別是在所選擇的天冬胺酸(D或Asp)殘基位置。在另一其它實施方式中，修飾可包括Asp位置的醯胺化。
在某些實施方式中，AAVhu68衣殼包含與SEQ ID NO：2的編碼胺基酸序列相比，具有至少4個至至少約25個去醯胺化胺基酸殘基位置的vp1、vp2及vp3的亞群，其中至少1%至10%被去醯胺化，這些中的大部分可為N殘基。然而，Q殘基亦可被去醯胺化。
在某些實施方式中，AAVhu68衣殼的進一步特徵為下列一或多者。AAVhu68衣殼蛋白質，包含：由編碼SEQ ID NO：2之1至736的預期胺基酸序列的核酸序列表現所產生的AAVhu68 vp1蛋白質、由SEQ ID NO：1產生的vp1蛋白質、或由與編碼SEQ ID NO：2之1至736的預期胺基酸序列的SEQ ID NO：1具有至少70%同一性的核酸序列所產生的vp1蛋白質；由編碼SEQ ID NO：2的至少約胺基酸138至736的預期胺基酸序列的核酸序列表現所產生的AAVhu68 vp2蛋白質、由包含SEQ ID NO：1的至少核苷酸412至2211之序列所產生的vp2蛋白質、或由與編碼SEQ ID NO：2的至少約胺基酸138至736的預期胺基酸序列的SEQ ID NO：1的至少核苷酸412至2211具有至少70%同一性的核酸序列所產生的vp2蛋白質；及/或由編碼SEQ ID NO：2的至少約胺基酸203至736的預期胺基酸序列的核酸序列表現所產生的AAVhu68 vp3蛋白質、由包含SEQ ID NO：1的至少核苷酸607至2211的序列產生的vp3蛋白質、或由與編碼SEQ ID NO：2的至少約胺基酸203至736的預期胺基酸序列的SEQ ID NO：1的至少核苷酸607至2211具有至少70%同一性的核酸序列所產生的vp3蛋白質。
另外或或者，提供一種AAV衣殼，其包含可選擇地包含位置157處的纈胺酸之vp1蛋白質的異源族群、可選擇地包含位置157處的纈胺酸之vp2蛋白質的異源族群、及vp3蛋白質之異源族群，其中基於SEQ ID NO：2的vp1衣殼的編號，至少vp1和vp2蛋白質亞群包含位置157處的纈胺酸，且可選擇地進一步包含位置67處的麩胺酸。另外或或者，提供了一種AAVhu68衣殼，其包含：為編碼SEQ ID NO：2的胺基酸序列的核酸序列的產物的vp1蛋白質之異源族群、為編碼SEQ ID NO：2的至少約胺基酸138至736之胺基酸序列的核酸序列的產物的vp2蛋白質之異源族群、及為編碼SEQ ID NO：2的至少胺基酸203至736之核酸序列的產物的vp3蛋白質之異源族群，其中：該vp1、vp2及vp3蛋白質包含具有胺基酸修飾的亞群。
AAVhu68 vp1、vp2和vp3蛋白質通常表現為由編碼SEQ ID NO：2的全長vp1胺基酸序列(胺基酸1至736)的相同核酸序列編碼的可選擇剪接變體。可選擇地，vp1編碼序列單獨用於表現vp1、vp2及vp3蛋白質。或者，此序列可以與以下一或多者共同表現：編碼不具有vp1獨特區域(約aa 1至約aa 137)及/或vp2獨特區域(約aa 1至約aa 202)的SEQ ID NO：2的AAVhu68 vp3胺基酸序列(約aa 203至736)之核酸序列、或其互補股、對應的mRNA或tRNA(SEQ ID NO：1之約nt 607至約nt 2211)，或與編碼SEQ ID NO：2的aa 203至736的SEQ ID NO：1具有至少70%至至少99%(例如至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%)同一性的序列。另外或或者，vp1編碼序列及/或vp2編碼序列可以與以下共同表現：編碼不具有vp1獨特區域(約aa 1至約137)的SEQ ID NO：2的AAVhu68 vp2胺基酸序列(約aa 138至736)的核酸序列、或其互補股、對應之mRNA或tRNA(SEQ ID NO：1的nt 412至22121)，或與編碼SEQ ID NO：2之約aa 138至736的SEQ ID NO：1具有至少70%至至少99%(例如至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%)同一性的序列。
如本文所述，rAAVhu68具有由AAVhu68核酸表現衣殼的產生系統中所的生產的rAAVhu68衣殼，該核酸編碼SEQ ID NO：2之vp1胺基酸序列及可選擇地額外核酸序列，例如，編碼不含vp1及/或vp2獨特區域的vp3蛋白質，使用單一核酸序列vp1產生的rAAVhu68可產生vp1蛋白質、vp2蛋白質及vp3蛋白質的異源族群。更明確而言，rAAVhu68衣殼包含vp1蛋白質內、vp2蛋白質內及vp3蛋白質內的亞群，這些亞群具有來自SEQ ID NO：2中預期的胺基酸殘基的修飾。這些亞群至少包括去醯胺化天冬醯胺酸(N或Asn)殘基。例如，天冬醯胺酸-甘胺酸對中的天冬醯胺酸被高度去醯胺化。
在一實施方式中，AAVhu68 vp1核酸序列具有SEQ ID NO：1序列，或與其互補之股，例如，對應mRNA或tRNA。在某些實施方式中，vp2及/或vp3蛋白質可以從不同於vp1的核酸序列中另外表現或替代表現，以在所選擇的表現系統中改變vp蛋白質的比例。某些實施方式中，亦提供一種核酸序列，其編碼不具有vp1-獨特區域(約aa 1至約aa 137)及/或vp2-獨特區域(約aa 1至約aa 202)之SEQ ID NO：2的AAVhu68 vp3胺基酸序列(約aa 203至736)，或與其互補之股，對應的mRNA或tRNA (SEQ ID NO：1的約nt 607至約nt 2211)。在某些實施方式中，亦提供一種核酸序列，其編碼不具有vp1-獨特區域(約aa 1至約137)之SEQ ID NO：2的AAVhu68 vp2胺基酸序列(約aa 138至736)，或與其互補之股，對應的mRNA或tRNA (SEQ ID NO：1的nt 412至2211)。
然而，可選擇編碼SEQ ID NO：2的胺基酸序列的其它核酸序列用於產生rAAVhu68衣殼。在某些實施方式中，該核酸序列具有核酸序列SEQ ID NO：1，或與編碼SEQ ID NO：2的SEQ ID NO：1具有至少70%至99%同一性、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%同一性的序列。在某些實施方式中，該核酸序列具有核酸序列SEQ ID NO：1，或與SEQ ID NO：1的約nt 412至約nt 2211(其編碼SEQ ID NO：2的vp2衣殼蛋白質(約aa 138至736))具有至少70%至99%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%同一性的序列。在某些實施方式中，該核酸序列具有SEQ ID NO：1的約nt 607至約nt 2211的核酸序列，或與編碼SEQ ID NO：2的vp3衣殼蛋白質(約aa 203至736)的SEQ ID NO：1具有至少70%至99%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%同一性的序列。
設計編碼此AAVhu68衣殼的核酸序列(包括DNA(基因體或cDNA)或RNA(例如mRNA))在本領域技術範圍內。在某些實施方式中，編碼AAVhu68 vp1衣殼蛋白質的核酸序列提供於SEQ ID NO：1中。在其它實施方式中，可選擇與SEQ ID NO：1具有70%至99.9%同一性的核酸序列以表現AAVhu68衣殼蛋白。在某些其它實施方式中，該核酸序列與SEQ ID NO：1具有至少約75%同一性、至少80%同一性、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%同一性、或至少99%至99.9%同一性。此類核酸序列可為密碼子優化以在所選擇的系統(即，細胞類型)中表現，可藉由各種方法設計，可使用可在線上獲得的方法(例如，GeneArt)、公開的方法或提供密碼子優化服務的公司，例如DNA2.0(Menlo Park ,CA)來進行此優化。一種密碼子優化方法描述於例如美國國際專利公開號WO 2015/012924中，其藉由引用將其整體併入本文。亦參見例如美國專利公開號2014/0032186及美國專利公開號2006/0136184。適當地，對產物的開讀框(ORF)的整個長度進行修飾。然而，在一些實施方式中，可僅改變ORF的片段。藉由使用這些方法之一，可頻繁應用於任何給定的多肽序列，並產生編碼多肽的密碼子優化編碼區的核酸片段。許多選擇可用於進行密碼子的實際改變或用於合成如本文所述設計的密碼子優化編碼區，此種修飾或合成可以使用本技術領域中具有通常知識者熟知的標準和常規分子生物學操作進行。在一種方法中，藉由標準方法合成一系列各自長度為80-90個核苷酸且跨越所欲序列之長度的互補寡核苷酸對，合成這些寡核苷酸對，從而當退火時其等可形成包含黏性末端的80-90個鹼基對的雙股片段，例如，合成成對的各寡核苷酸以延伸超出該區域3、4、5、6、7、8、9、10或更多個鹼基，而該區域係互補於成對的其它寡核苷酸。各寡核苷酸對的單股末端被設計為退火貼合於另一寡核苷酸對的單股末端。使寡核苷酸對退火貼合，然後使約5至6個這些雙股片段通過黏性單股末端一起退火，然後將它們連接在一起並選殖到標準細菌選殖載體中，例如可從Invitrogen Corporation, Carlsbad, Calif獲得的TOPO®載體，然後通過標準方法對構築體進行定序。製備數個由5至6個片段的80至90個鹼基對片段連接在一起所構成(即約500個堿基對的片段)的這些構築體，從而整個所欲之序列表現於一系列質粒構築體中。然後用適當的限制酶切割這些質體的插入物並連接在一起形成最終構築體。然後將最終構築體選殖到標準細菌選殖載體中，並定序。其它方法對於熟悉技術者而言是顯而易見的。此外，基因合成在商業上是易於獲得的。
在某些實施方式中，rAAVhu68 vp1、vp2和vp3蛋白質中的N-G對中的天冬醯胺酸(N)是高度去醯胺化的。對於rAAVhu68衣殼蛋白質，有4個殘基(N57、N329、N452、N512)通常顯示去醯胺化水平>70%，且大多數情況下在不同批次中>90%。另外的天冬醯胺酸殘基(N94、N253、N270、N304、N409、N477及Q599)在不同批次中亦顯示去醯胺化水平高至~20%，最初使用胰蛋白酶消化物鑑定去醯胺化水平，並以胰凝乳蛋白酶消化驗證。
在某些實施方式中，rAAVhu68衣殼包含AAVvp1、vp2及/或vp3衣殼蛋白的亞群，該亞群在高度去醯胺化的rAAVhu68衣殼蛋白中具有至少四個高度去醯胺化天冬醯胺酸(N)位置。在某些實施方式中，約20%至50%的N-N對(不包括N-N-N三聯體)顯示去醯胺化。在某些實施方式中，第一個N被去醯胺化。在某些實施方式中，第二個N被去醯胺化。在某些實施方式中，去醯胺化為約15%至約25%去醯胺化。對於AAVhu68蛋白的AAVhu68 vp1、vp2和vp3衣殼蛋白質，SEQ ID NO：2的位置259處的Q處之去醯胺化為約8%至約42%。
在某些實施方式中，rAAVhu68衣殼的進一步特徵在於vp1、vp2及vp3蛋白質之D297處的醯胺化。在某些實施方式中，基於SEQ ID NO：2的編號，AAVhu68衣殼中vp1、vp2及/或vp3蛋白質的位置297處的D中約70%至約75%被醯胺化。在某些實施方式中，衣殼的vp1、vp2及/或vp3中的至少一個Asp異構化成D-Asp。基於SEQ ID NO：2的編號，這些異構物通常在一或多個殘基位置97、107、384處的Asp以少於約1%的量存在。
在某些實施方式中，rAAVhu68具有具vp1、vp2及vp3蛋白質的AAVhu68衣殼，該蛋白具有包含在下表中所列出之位置處的一、二、三、四或更多個去醯胺化殘基之組合的亞群。可以使用2D凝膠電泳及/或質譜法及/或蛋白質模型化技術來確定rAAV中的去醯胺化。可使用Acclaim PepMap管柱及偶和至具有NanoFlex源之Q Exactive HF(Thermo Fisher Scientific)的Thermo UltiMate 3000RSLC系統(Thermo Fisher Scientific)進行線上層析法，使用Q Exactive HF的數據依賴性top-20方法獲取MS數據，從調查掃描(200-2000m/z)動態選擇最豐富的尚未定序的前驅離子。藉由更高能量的碰撞解離片段化(collisional dissociation fragmentation)進行定序，其中以預測性自動增益對照(predictive automatic gain control)確定1e5離子的目標值，並使用4 m/z的窗口進行前驅物的分離。在m/z 200下120,000的分辨率獲得調查掃描，HCD光譜的分辨率可在m/z 200下設置為30,000，最大離子注入時間為50 ms且標準碰撞能量為30。S-lens RF水平可設定為50，以給出由來自消化物的肽所佔據的m/z區域的最佳傳遞。前軀離子可從片段化選擇中以單個、未指定的、或六個和更高的電荷狀態排除。可使用BioPharma Finder 1.0軟體(Thermo Fischer Scientific)分析所獲得的數據。對於肽作圖，使用單入口蛋白質FASTA數據庫進行搜索，其中胺甲醯甲基化設定為固定修飾；氧化、去醯胺化及磷酸化設定為可變修飾，10 ppm質量準確度，高蛋白酶特異性和MS/MS譜的信賴度為0.8。適當的蛋白酶之實例可包括例如胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶。去醯胺化的肽之質譜鑒定相對簡單，因為去醯胺化使完整分子的質量增加了+0.984 Da(-OH和-NH2 基團之間的質量差異)。特定肽的去醯胺化百分比是確定的去醯胺化的肽之質量面積除以去醯胺化及天然肽的面積之和。考慮到可能的去醯胺化位點的數量，在不同位點去醯胺的同量異位(isobaric)物質可能在單個峰中共遷移。因此，源自具有多個潛在去醯胺化位點的肽的片段離子可用於定位或區分多個去醯胺化位點。在這些情況下，觀察到的同位素模型中的相對強度可用於特異性地確定不同去醯胺化肽異構物的相對豐度。此方法假定所有異構物種類的片段化效率是相同的並且獨立於去醯胺化的位點。本領域技術人員將可理解，可使用這些說明性方法的許多變型。例如，適當的質譜儀可包括例如四極時間飛行式質譜儀(quadrupole time of flight mass spectrometer，QTOF)，例如Waters Xevo或Agilent 6530或軌道阱(orbitrap)儀器，例如Orbitrap Fusion或Orbitrap Velos(Thermo Fisher)。合適的液相層析系統包括例如來自Waters或Agilent系統的Acquity UPLC系統(1100或1200系列)。適當的數據分析軟體可包括例如MassLynx (Waters) 、Pinpoint和Pepfinder (Thermo Fischer Scientific)、Mascot (Matrix Science)、Peaks DB (Bioinformatics Solutions)。仍有述及其它技術，例如X .Jin et al, Hu Gene Therapy Methods, Vol. 28, No. 5, pp. 255-267, 2017年6月16日在線發表。
去醯胺化 基於預期的AAVHu68 (SEQ ID NO：2) 基於AAVhu68衣殼中VP1/VP2/VP3蛋白質的平均%
去醯胺化的殘基 + 1 (鄰近AA) 寬範圍百分比(%) 窄範圍(%)
N57 (N-G) 78至100% 80至100、85至97
N66 (N-E) 0至5 0、1至5
N94 (N-H) 0至15 0、1至15、5至12、8
N113  (N-L) 0至2 0、1至2
~N253  (N-N) 10至25 15至22
Q259  (Q-I) 8至42 10至40、20至35
~N270  (N-D) 12至30 15至28
~N304 (N-N) (位置303亦為N) 0至5 1至4
N319  (N-I) 0至5 0、1至5、1至3
N329 * (N-G)*(位置328亦為N) 65至100 70至95、85至95、80至100、85至100
N336 (N-N) 0至100 0、1至10、25至100、30至100、30至95
~N409  (N-N) 15至30 20至25
N452  (N-G) 75至100 80至100、90至100、95至100、
N477 (N-Y) 0至8 0、1至5
N512 (N-G) 65至100 70至95、85至95、80至100、85至100,
~N515  (N-S) 0至25 0、1至10、5至25、15至25
~Q599 (Asn-Q-Gly) 1至20 2至20、5至15
N628  (N-F) 0至10 0、1至10、2至8
N651 (N-T) 0至3 0、1至3
N663 (N-K) 0至5 0、1至5、2至4
N709 (N-N) 0至25 0,1至22、15至25
N735 0至40 0. 1至35、5至50、20至35
在某些實施方式中，AAVhu68衣殼的特徵在於，其衣殼蛋白質中在基於SEQ ID NO：2的胺基酸序列編號的位置N57、N329、N452及/或N512中的至少一處的至少45%N殘基被去醯胺化。在某些實施方式中，在這些N-G位置(即基於SEQ ID NO：2的胺基酸序列的編號，N57、N329、N452及/或N512)的一或多處的至少約60%、至少約70%、至少約80%、或至少90%的N殘基被去醯胺化。在這些及其它實施方式中，AAVhu68衣殼的進一步特徵在於具有一蛋白質群，其中在下列一或多個位置處的N殘基中約1%至約20%已被去醯胺化：基於SEQ ID NO：2的胺基酸序列編號，N94、N253、N270、N304、N409、N477及/或Q599。在某些實施方式中，AAVhu68至少包含vp1、vp2及/或vp3蛋白質的亞群，該亞群在下列一或多個位置處被去醯胺化：基於SEQ ID NO：2的胺基酸序列編號，N35、N57、N66、N94、N113、N252、N253、Q259、N270、N303、N304、N305、N319、N328、N329、N336、N409、N410、N452、N477、N515、N598、Q599、N628、N651、N663、N709、N735或其等之組合。在某些實施方式中，衣殼蛋白質可具有一或多個醯胺化胺基酸。
還觀察到其它修飾，其中大多數不導致一個胺基酸轉化為不同的胺基酸殘基。可選擇地，衣殼的vp1、vp2及vp3中的至少一個Lys被乙醯化。可選擇地，衣殼的vp1、vp2及/或vp3中的至少一個Asp異構化為D-Asp。可選擇地，衣殼的vp1、vp2及/或vp3中的至少一個S(Ser，絲胺酸)被磷酸化。可選擇地，衣殼的vp1、vp2及/或vp3中的至少一個T (Thr，蘇胺酸)被磷酸化。可選擇地，衣殼的vp1、vp2及/或vp3中的至少一個W (trp，色胺酸)被氧化。可選擇地，衣殼的vp1、vp2及/或vp3中的至少一個M (Met，甲硫胺酸)被氧化。在某些實施方式中，衣殼蛋白質具有一或多個磷酸化，例如，某些vp1衣殼蛋白質可在位置149處磷酸化。
在某些實施方式中，rAAVhu68衣殼包含：vp1蛋白質的異源族群，其為編碼SEQ ID NO：2胺基酸序列之核酸序列的產物，其中vp1蛋白質包含位置67處的麩胺酸(Glu)及/或位置157處的纈胺酸(Val)；vp2蛋白質的異源族群，其可選擇地包含位置157處的纈胺酸(Val)；及vp3蛋白質的異源族群。AAVhu68衣殼包含至少一個亞群，其中基於SEQ ID NO：2胺基酸序列的殘基編號，位於vp1蛋白的位置57處的天冬醯胺酸-甘胺酸對中的至少65%的天冬醯胺酸(N)以及vp1、v2和vp3蛋白質的位置329、452及/或512處的天冬醯胺酸-甘胺酸對中的至少70%的天冬醯胺酸(N)被去醯胺化，其中去醯胺化導致胺基酸改變。
如本文中更詳細的討論，去醯胺化的天冬醯胺酸可被去醯胺化為天冬胺酸、異天冬胺酸、互變天冬胺酸/異天冬胺酸對、或其等之組合。在某些實施方式中，rAAVhu68進一步特徵在於下列一或多者：(a)各vp2蛋白質獨立為編碼SEQ ID NO：2之至少vp2蛋白質的核酸序列的產物；(b)各vp3蛋白質獨立為編碼SEQ ID NO：2之至少vp3蛋白質的核酸序列的產物；(c)編碼vp1蛋白質的核酸序列為SEQ ID NO：1，或與編碼胺基酸序列SEQ ID NO：2的SEQ ID NO：1具有至少70%至至少99%(例如至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%)同一性的序列。可選擇地，該序列單獨用於表現vp1、vp2及vp3蛋白質。或者，此序列可與下列一或多者共同表現：編碼不具有vp1獨特區域(約aa 1至約aa 137)及/或vp2獨特區域(約aa 1至約aa202)的SEQ ID NO：2之AAVhu68 vp3胺基酸序列(約aa 203至736)的核酸序列，或其互補股、對應mRNA或tRNA(SEQ ID NO：1的約nt 607至約nt 2211)，或與編碼SEQID NO：2的aa 203至736之SEQ ID NO：1具有至少70%至至少99%(例如至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%)同一性的序列。另外或或者，vp1編碼序列及/或vp2編碼序列可與以下共同表現：編碼不具有vp1獨特區域(約aa 1至約137)的SEQ ID NO：2之AAVhu68 vp2胺基酸序列(約aa 138至736)的核酸序列，或其互補股、對應mRNA或tRNA(SEQ ID NO：1的nt 412至2211)，或與編碼SEQ ID NO：2的約aa 138至736之SEQ ID NO：1具有至少70%至至少99%(例如至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%)同一性的序列。
另外或或者，rAAVhu68衣殼至少包含vp1、vp2及/或vp3蛋白質的亞群，該亞群在下列一或多個位置處被去醯胺化：基於SEQ ID NO：2的編號，N57、N66、N94、N113、N252、N253、Q259、N270、N303、N304、N305、N319、N328、N329、N336、N409、N410、N452、N477、N512、N515、N598、Q599、N628、N651、N663、N709或其等之組合；(e) rAAVhu68衣殼包含vp1、vp2及/或vp3蛋白質的亞群，該亞群在下列一或多個位置處包含1%至20%的去醯胺化：基於SEQ ID NO：2的編號，N66、N94、N113、N252、N253、Q259、N270、N303、N304、N305、N319、N328、N336、N409、N410、N477、N515、N598、Q599、N628、N651、N663、N709或其等之組合；(f) rAAVhu68衣殼包含vp1的亞群，其中基於SEQ ID NO：2的編號，vp1蛋白質位置57處的65%至100%的N被去醯胺化；(g) rAAVhu68衣殼包含vp1蛋白質的亞群，其中vp1蛋白質位置57處的75%至100%的N被去醯胺化；(h) rAAVhu68衣殼包含vp1蛋白質、vp2蛋白質及/或vp3蛋白質的亞群，其中基於SEQ ID NO：2的編號，位置329處的80%至100%的N被去醯胺化；(i) rAAVhu68衣殼包含vp1蛋白質、vp2蛋白質及/或vp3蛋白質的亞群，其中基於SEQ ID NO：2的編號，位置452處的80%至100%的N被去醯胺化；(j) rAAVhu68衣殼包含vp1蛋白質、vp2蛋白質及/或vp3蛋白質的亞群，其中基於SEQ ID NO：2的編號，位置512處的80%至100%的N被去醯胺化；(k) rAAV包含約60個總衣殼蛋白質，其比率約1個vp1比約1至1.5個vp2比3至10個vp3蛋白質；(l) rAAV包含約60個總衣殼蛋白質，其比率約1個vp1比約1個vp2比3至9個vp3蛋白質。
在某些實施方式中，修飾AAVhu68以改變天冬醯胺-甘胺酸對中的甘胺酸，以降低去醯胺化。在其它實施方式中，將天冬醯胺酸改變為不同的胺基酸，例如以較慢的速率去醯胺化的麩醯胺酸；或改變成缺少醯胺基團的胺基酸(例如，麩醯胺酸及天冬醯胺酸包含醯胺基團)；及/或缺少胺基的胺基酸(例如，離胺酸、精胺酸和組胺酸包含醯胺基團)。如本文所使用，缺少醯胺或胺側基團的胺基酸係指例如甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、胱胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸及/或脯胺酸。如所述的修飾可在經編碼的AAVhu68胺基酸序列中所發現的一、二或三個天冬醯胺酸-甘胺酸對中。在某些實施方式中，此類修飾不是在所有四個天冬醯胺酸-甘胺酸對中進行的。因此，用於降低rAAVhu68及/或工程化rAAVhu68變體的去醯胺化方法具有較低去醯胺化速率。此外，一或多個其它醯胺胺基酸可被改變為非醯胺胺基酸以降低rAAVhu68的去醯胺化。
這些胺基酸修飾可藉由常規遺傳工程技術進行，例如，可產生含有修飾的AAVhu68 vp密碼子的核酸序列，其中編碼SEQ ID NO：2 (天冬醯胺酸-甘胺酸對)中位置58、330、453及/或513處之甘胺酸的一至三個密碼子被修飾成編碼甘胺酸以外的胺基酸。在某些實施方式中，可在位於SEQ ID NO：2中位置57、329、452及/或512處的一至三個天冬醯胺酸-甘胺酸對處，對含經修飾的天冬醯胺酸密碼子的核酸序列進行工程化，從而經修飾的密碼子編碼天冬醯胺酸以外的胺基酸，每個修飾的密碼子可編碼不同的胺基酸。或者，一或多個經改變的密碼子可編碼相同的胺基酸。在某些實施方式中，這些經修飾的AAVhu68核酸序列可用於產生具有比天然hu68衣殼更低去醯胺化衣殼的突變體rAAVhu68，此類突變體rAAVhu68可具有降低的免疫原性及/或提高儲存穩定性，特別是以懸浮形式儲存。如本文所使用，「密碼子」係指編碼胺基酸之序列中的三個核苷酸。
如本文所使用，「經編碼的胺基酸序列」係指基於被轉譯為胺基酸的參考核酸序列之已知DNA密碼子的轉譯而預期的胺基酸。下表舉例說明DNA密碼子和20種常見胺基酸，顯示單一字母代碼(SLC)和三字母代碼(3LC)。
胺基酸 SLC 3LC DNA密碼子
異白胺酸 I Ile ATT、ATC、ATA
白胺酸 L Leu CTT、CTC、CTA、CTG、TTA、TTG
纈胺酸 V Val GTT、GTC、GTA、GTG
苯丙胺酸 F Phe TTT、TTC
甲硫胺酸 M Met ATG
半胱胺酸 C Cys TGT、TGC
丙胺酸 A Ala GCT、GCC、GCA、GCG
甘胺酸 G Gly GGT、GGC、GGA、GGG
脯胺酸 P Pro CCT、CCC、CCA、CCG
蘇胺酸 T Thr ACT、ACC、ACA、ACG
絲胺酸 S Ser TCT、TCC、TCA、TCG、AGT、AGC
酪胺酸 Y Tyr TAT、TAC
色胺酸 W Trp TGG
麩醯胺酸 Q Gln CAA、CAG
天冬醯胺酸 N Asn AAT、AAC
組胺酸 H His CAT、CAC
麩胺酸 E Glu GAA、GAG
天冬胺酸 D Asp GAT、GAC
離胺酸 K Lys AAA、AAG
精胺酸 R Arg CGT、CGC、CGA、CGG、AGA、AGG
終止密碼子 Stop   TAA、TAG、TGA
rAAVhu68衣殼可用於某些實施方式中，例如，此類衣殼可用於產生單株抗體及/或產生用於監測基因療法病患中AAVhu68濃度水平的分析中所使用的試劑。用於產生有用的抗AAVhu68抗體、標記此類抗體或空衣殼的技術及適當的分析形式為本領域技術人員已知的。
在某些實施方式中，本文提供SEQ ID NO：1核酸序列，或至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%的序列，其編碼具有如本文所述之修飾(例如去醯胺化胺基酸)的SEQ ID NO：2的vp1胺基酸序列。在某些實施方式中，vp1胺基酸序列再現於SEQ ID NO：2。
如本文所使用，與AAV族群相關的術語「演化支(clade)」係指在種系發生上彼此相關的AAV族群，如使用近鄰結合演算法(Neighbor-Joining algorithm)，藉由至少75%的拔靴值(bootstrap value)(至少1000個重複)和基於AAV vp1胺基酸排列比對的泊松校正距離(Poisson correction distance)測量不大於0.05所確定的。近鄰結合演算法已在文獻中描述，參見例如，M. Nei and S. Kumar,Molecular Evolution and Phylogenetics (Oxford University Press, New York (2000)。可用於實施此演算法的電腦程式是可獲得的，例如，MEGA v2.1程式執行改進的Nei-Gojobori方法。使用這些技術和電腦程式及AAV vp1衣殼蛋白的序列，本領域技術人員可易於確定所選擇的AAV是否包含在本文鑒定的一個進化支中、在另一進化支中或在這些演化支之外。參見例如，G Gao,et al , J Virol, 2004 Jun；78(10：6381-6388，其鑒定了演化支A、B、C、D、E及F，GenBank登錄號AY530553至AY530629。亦可參見WO 2005/033321。
如本文所使用，「AAV9衣殼」為由多個AAV9 vp蛋白質所構成之自我組裝的AAV衣殼，AAV9 vp蛋白質通常被表現為由SEQ ID NO：3核酸序列編碼之可替代的剪接變體，該核酸序列編碼SEQ ID NO：4之vp1胺基酸序列(GenBank登錄號：AAS99264)，這些剪接變體造成SEQ ID NO：4不同長度之蛋白質。在某些實施方式中，「AAV9衣殼」包括具有與AAS99264具有99%同一性或與SEQ ID NO：4具有99%同一性之胺基酸序列的AAV。亦參見US 7,906,111及WO 2005/033321。如本文所使用，「AAV9變體」包括例如WO 2016/049230、US 8,927,514、US 2015/0344911及US 8,734,809中描述的那些。
已經描述產生衣殼方法、其編碼序列及產生rAAV病毒載體的方法。參見例如，Gao, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (10), 6081-6086 (2003)及US 2013/0045186A1。
當提及核酸或其片段時，術語「實質上同源」或「實質上相似性」表示當與另一核酸(或其互補股)的適當核苷酸插入或刪除最佳比對時，比對的序列中存在至少約95%至99%的核苷酸序列同一性。較佳地，同源係在全長序列、或其開讀框、或長度為至少15個核苷酸的另一適當片段上。適當片段的實例描述於本文中。
在核酸序列的情況下，術語「序列同一性」、「百分比序列同一性」或「百分比同一性」係指在用於最大對應比對時兩個序列中相同的殘基。序列同一性比較的長度可為基因體的全長、基因編碼序列的全長或至少約500至5000個核苷酸的片段是期望的。然而，亦可期望較小片段之間的同一性，例如至少約9個核苷酸、通常至少約20至24個核苷酸、至少約28至32個核苷酸、至少約36個或更多個核苷酸。類似地，對於胺基酸序列，可在蛋白質的全長或其片段上容易地確定「百分比序列同一性」。合適地，片段長度為至少約8個胺基酸，並可多至約700個胺基酸。適當片段之實例描述於本文中。
當提及胺基酸或其片段時，術語「實質上同源」或「實質上相似性」表示當與另一胺基酸(或其互補鏈)的適當胺基酸插入或刪除最佳比對時，經比對的序列中存在至少約95%至99%的胺基酸序列同一性。較佳地，同源是在全長序列、或其蛋白質，例如cap蛋白質、rep蛋白質，或長度為至少8個胺基酸，或更理想地為其長度至少15個胺基酸的片段。適當片段的實例描述於本文中。
術語「高度保守的」意指至少80%同一性，較佳為至少90%同一性，更佳為大於97%同一性。藉由本領域技術人員已知的演算法和電腦程式，本領域技術人員可易於確定同一性。
一般而言，當於兩不同腺相關病毒之間指「同一性」、「同源性」或「相似性」時，「同一性」、「同源性」或「相似性」係由「比對的」序列來決定。「比對的」序列或「比對」係指多個核酸序列或蛋白質(胺基酸)序列，與參考序列相比，通常包含缺失或額外的鹼基或胺基酸的校正。在實施例中，使用公開的AAV9序列作為參考點的AAV比對為較佳。使用許多公開或市售的Multiple Sequence Alignment Programs進行比對。這類程式之實例包括「Clustal Omega」、「Clustal W」、「CAP Sequence Assembly」、「MAP」及「MEME」，其等可透過網際網路上的Web伺服器進行訪問。此類程式的其它來源是本領域技術人員已知的。或者，亦可使用載體NTI公用程式。還有許多技術中已知可用於測量核苷酸序列同一性的演算法，包括上述程序中包含的演算法。作為另一實例，可使用Fasta™ (GCG版本6.1中的程式)比較多核苷酸序列，Fasta™提供在查詢和搜尋序列之間最佳重疊區域的比對和百分比序列同一性。例如，核酸序列之間的百分比序列同一性可使用Fasta™及其默認參數決定(字組大小為6及用於得分矩陣的NOPAM因數)，如GCG版本6.1中所提供，藉由引用併入本文。胺基酸序列亦可使用多序列比對程式，例如，「Clustal Omega」、「Clustal X」、「MAP」、「PIMA」、「MSA」、「BLOCKMAKER」、「MEME」及「Match-Box」程式。一般而言，儘管本項技術領域中具通常知識者可根據需要改變這些設定，此等程式之任一者皆於內定值下使用。或者，本領域技術人員可利用另一算法或電腦程式，其至少提供由參考演算法及程式提供的同一性程度或比對。參見，例如，J. D. Thomson et al, Nucl. Acids. Res., “A comprehensive comparison of multiple sequence alignments”,27(13)：2682-2690(1999)。
rAAV 載體 如上所指，AAVhu68序列及蛋白質有用於製造rAAV，且亦有用於重組AAV載體，其可為反義遞送載體、基因療法載體或疫苗載體。此外，如本文所述之工程化AAV衣殼，例如相對於SEQ ID NO：2中vp1衣殼蛋白質的編號，在位置67、157或二者處具有突變體胺基酸者，可用於工程化遞送數種適當核酸分子至標的細胞及組織的rAAV載體。
包裝於AAV衣殼中並遞送到宿主細胞的基因體序列通常由(最低限度)轉殖基因及其調節序列和AAV反向末端重複(ITR)組成。單股AAV及自我互補(self-complementary；sc) AAV二者皆包含rAAV。轉殖基因為一種核酸編碼序列，與載體序列異源，其編碼有興趣之多肽、蛋白質、功能性RNA分子(例如，miRNA、miRNA抑制劑)或其它基因產物。核酸編碼序列係以在標靶組織的細胞中允許轉殖基因轉錄、轉譯及/或表現的方式與調節成分可操作地連接。
尤其，本揭示提供含人半乳糖基神經醯胺酶(GALC)之編碼序列的rAAV。在一些實施方式中，該編碼序列為工程化GALC編碼序列。在一些實施方式中，該編碼序列為SEQ ID NO：9之cGALC基因序列(cGALCco)。
核酸編碼序列係以在標靶組織的細胞中允許轉殖基因轉錄、轉譯及/或表現的方式與調節成分可操作地連接。在一些實施方式中，該調控序列包含β-肌動蛋白啟動子、插入子及兔球蛋白polyA。在一些實施方式中，該調控序列包含SEQ ID NO：13。在一些實施方式中，該調控序列包含SEQ ID NO：15。在一些實施方式中，該調控序列包含SEQ ID NO：16。
載體的AAV序列通常包含順式作用(cis-acting) 5'及3'反向末端重複序列(參見例如，B. J. Carter, in “Handbook of Parvoviruses”, ed., P. Tijsser, CRC Press, pp. 155 168 (1990))。ITR序列長度約為145 bp。較佳地，在分子中使用實質上編碼ITR的整個序列，儘管這些序列的某些程度上的微小修飾是允許的，修飾這些ITR序列的能力是在本領域技的術範圍內(參見例如，例如文檔Sambrook et al, “Molecular Cloning. A Laboratory Manual”, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989)；及K. Fisher et al., J. Virol., 70：520 532 (1996))。在本發明中使用的這種分子的實例為含有轉殖基因的「順式作用」質體，其中所選擇的轉殖基因序列和相關的調控元件位於5'和3' AAV ITR序列的兩側。在一實施方式中，ITR來自與提供衣殼的AAV不同的AAV。 在一實施方式中，ITR序列來自AAV2。已經描述被稱為ΔITR的5' ITR的簡化版本，其中刪除了D-序列和終端解析位點(terminal resolution site；trs)。在其它實施方式中，使用全長AAV 5’及3’ ITR。然而，可選擇來自其它AAV來源的ITR。當ITR的來源是AAV2，而AAV衣殼來自另一AAV來源時，所生成的載體可稱為假型(pseudotype)。然而，這些成分的其它構造可以是適當的。
除了上述確定的重組AAV載體的主要成分外，該載體亦包括必需的習知控制成分，該習知控制成分以允許其在細胞中轉錄、轉譯及/或表現的方式可操作地連接至轉殖基因，該細胞係經本發明所製造的質體載體轉染或病毒感染。如本文中所使用，「可操作地連接」序列包括與感興趣之基因相鄰的表現控制序列及以反向或遠距控制感興趣之基因的表現控制序列二者。
調節控制成分通常包含啟動子序列作為表現控制序列的一部分，例如，位於所選擇的5’ ITR序列及編碼序列之間。持續性啟動子(constitutive promoter)、調節性啟動子(regulatable promoter) [參見例如，WO 2011/126808及WO 2013/04943]、組織特異性啟動子或對生理提示有反應的啟動子可被用於本文所述的載體。啟動子可選自不同來源，例如，人類細胞巨大病毒(CMV)立即早期增強子/啟動子、SV40早期增強子/啟動子、JC多瘤病毒啟動子、髓磷脂鹼性蛋白(myelin basic protein；MBP)或膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein；GFAP)啟動子、單純泡疹病毒(HSV-1)潛伏相關啟動子(latency associated promoter；LAP)、勞斯氏肉瘤病毒(rouse sarcoma virus；RSV)末端長重複序列(long terminal repeat；LTR)啟動子、神經元特異性啟動子(neuron-specific promoter；NSE)、血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor；PDGF)啟動子、hSYN、黑色素聚集激素(melanin-concentrating hormone；MCH)啟動子、CBA、基質金屬蛋白酶啟動子(matrix metalloprotein promoter；MPP)及雞β-肌動蛋白啟動子。除了啟動子之外，載體可含有一或多種其它適當的轉錄起始、終止、增強子序列、有效的RNA處理信號，例如剪接及多腺核苷酸化(polyA)信號；穩定細胞質mRNA的序列，例如WPRE；增強轉譯效率的序列(即，Kozak一致序列)；增強蛋白質穩定性的序列；及當需要時，增強經編碼產物分泌的序列。 適當的增強子之實例為CMV增強子。其它適當的增強子包括那些適於所欲標的組織指示者。在一實施方式中，表現匣包含一或多種表現增強子。在一實施方式中，表現匣含有二或多個表現增強子，這些增強子可為相同或相異。例如，增強子可包括CMV立即早期增強子，此增強子可存在於彼此相鄰的兩個拷貝中。或者，增強子的雙重拷貝可藉由一或多序列分開。在另外的實施方式中，表現匣進一步含有插入子，例如，雞β-肌動蛋白插入子。其它適當的插入子包括技術領域中所知者，舉例而言，例如WO 2011/126808中所述者。適當的polyA序列之實例包括例如，SV40、SV50、牛生長激素(bovine growth hormone；bGH)、人類生長激素及合成polyA。可選擇地，可選擇一或多種序列以穩定mRNA，這些序列的實例為經修飾之WPRE序列，其可被工程化於polyA序列的上游及編碼序列之下游[參見例如，MA Zanta-Boussif, et al, Gene Therapy (2009) 16：605-619]。
這些rAAV特別適於用於治療目的及用於免疫的基因遞送，包括誘導保護性免疫。此外，本發明的組成物亦可用於活體外產生所欲之基因產物。對於體外生產，可在以含編碼所欲產物之分子的rAAV轉染宿主細胞並在允許表現的條件下培養細胞培養基之後，由所欲之培養物中獲得所欲產物(例如蛋白質)，然後可根據需要純化及分離經表現之產物。用於轉染、細胞培養、純化及分離的適當技術為本領域技術人員已知的。
rAAV 載體製造 為了用於產生AAV病毒載體(例如，重組(r)AAV)，可將表現匣攜至任何適當的載體(例如質體)上，然後將其遞送至包裝宿主細胞(packaging host cell)中。可用於本發明的質體可被工程化，從而使其適於在原核細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞等活體外複製及包裝。適當的轉染技術和包裝宿主細胞是已知的，及/或可被熟悉技術者容易地設計。
用於產生和分離適合用作載體之AAV的方法是技術領域中已知的，通常參見例如，Grieger & Samulski, 2005, “Adeno-associated virus as a gene therapy vector：Vector development, production and clinical applications,”Adv. Biochem. Engin/Biotechnol. 99：119-145; Buninget al., 2008, “Recent developments in adeno-associated virus vector technology,”J. Gene Med. 10：717-733；及下文引用之參考文獻，其等各藉由引用將其整體併入本文。為了將基因包裝到病毒顆粒中，在與含表現匣的核酸分子相同結構中，ITR是順式中唯一所需的AAV成分，cap及rep基因可以反式提供。
在一實施方式中，本文所述之表現匣工程化至遺傳成分(例如，穿梭質體(shuttle plasmid))中，將攜帶在其上的免疫球蛋白構築體序列轉移至包裝宿主細胞中以生產病毒載體。在一實施方式中，所選擇的遺傳成分可以適當方法遞送至AAV包裝細胞，包括以轉染、電穿孔、脂質體遞送、膜融合技術、高速DNA包覆小丸(high velocity DNA-coated pellet)、病毒感染及原生質體融合。穩定的AAV包裝細胞亦可被製造。或者，表現匣可用於產生AAV以外的病毒載體，或用於活體外抗體混合物之製造。用於製造此類構築體的方法是核酸操作且包括遺傳工程、重組工程及合成技術的技術人員已知的。參見例如，Molecular Cloning：A Laboratory Manual, ed. Green and Sambrook, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2012)。
術語「AAV中間體」或「AAV載體中間體」係指一種經組裝的rAAV衣殼，其缺少包裝在其內的所欲基因體序列，這些亦可稱為「空」衣殼。此類衣殼可不包含表現匣的可檢測基因體序列，或僅包含不足以達到基因產物表現的部分包裝基因體序列。這些空衣殼對於將目的基因轉移到宿主細胞是沒有功能的。
本文所述之重組腺相關病毒(AAV)可使用已知的技術產生。參見例如，WO 2003/042397；WO 2005/033321、WO 2006/110689；US 7588772B2。此類方法包括培養包含編碼AAV衣殼蛋白質之核酸序列的宿主細胞；功能性rep基因；(最低限度)由AAV反向末端重複(ITR)和轉基因所組成的表現匣；及足夠的輔助功能，以允許將表現匣包裝至AAV衣殼蛋白質中。產生衣殼的方法、其所用之編碼序列以及製造rAAV病毒載體的方法已被描述，參見例如，Gao, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (10), 6081-6086 (2003)及US 2013/0045186A1。
在一實施方式中，提供用於製造重組rAAVhu68的生產細胞培養物。此類細胞培養物包含在宿主細胞中表現rAAVhu68衣殼蛋白質的核酸；適於包裝至rAAVhu68衣殼中的核酸分子，例如包含AAV ITR及編碼基因產物的非AAV核酸序列的載體基因體，該非AAV核酸序列可操作連接至與指導產物在宿主細胞中表現的序列；及足夠的AAV rep功能和腺病毒協助者功能，以允許將核酸分子包裝至重組AAVhu68衣殼中。在一實施方式中，細胞培養物由哺乳動物細胞(例如人類胚腎293細胞等)或昆蟲細胞(例如桿狀病毒(baculovirus))組成。
適當地，rep功能是由AAV所提供，該AAV來自與存在於載體基因體中的ITR相同的來源，或來自另一個將載體基因體包裝至AAV衣殼中的來源(例如，AAVhu68)。在某些實施方式中，rep蛋白質來自AAV2。然而，在另一實施方式中，rep蛋白為AAVhu68rep以外的異源性rep蛋白質，例如但不限於，AAV1 rep蛋白質、AAV2 rep蛋白質、AAV3 rep蛋白質、AAV4 rep蛋白質、AAV5 rep蛋白質、AAV6 rep蛋白質、AAV7 rep蛋白質、AAV8 rep蛋白質；或rep 78、rep 68、rep 52、rep 40、rep68/78及rep40/52；或其片段；或其它來源。這些AAVhu68或突變體AAV衣殼序列中的任何一者皆可在外源性調節控制序列的控制下，該序列指導其在生產細胞中的表現。
在一實施方式中，細胞在合適的細胞培養物(例如，HEK 293)細胞中製造。製造本文所述之基因療法載體的方法包括技術領域中熟知的方法，例如產生用於製造基因療法載體的質體DNA、產生載體及純化載體。在一些實施方式中，基因療法載體為AAV載體，且所產生的質體為編碼AAV基因體及感興趣之基因的AAV順式質體、包含AAV rep及cap基因的AAV反式質體、及腺病毒協助者質體。載體產生方法可包括以下方法步驟：例如開始細胞培養、繼代細胞、細胞接種、以質體DNA轉染細胞、將轉染後培養基更換為無血清培養基以及收穫含載體的細胞和培養基。所收穫的含載體之細胞及培養基在本文中係指粗製細胞收穫物。在另一系統中，藉由以基於桿狀病毒載體感染將基因療法載體導入昆蟲細胞中。關於這些生產系統的綜述，通常參見例如，Zhang et al., 2009, “Adenovirus-adeno-associated virus hybrid for large-scale recombinant adeno-associated virus production,” Human Gene Therapy 20：922-929，其各自的內容通過引用整體併入本文。製造和使用這些和其它AAV生產系統的方法亦敘述於下列美國專利案中，其各自內容藉由引用整體併入本文：5,139,941；5,741,683；6,057,152；6,204,059；6,268,213；6,491,907；6,660,514；6,951,753；7,094,604；7,172,893；7,201,898；7,229,823；及7,439,065。
在某些實施方式中，rAAV.hGALC之製程涉及以質體DNA短暫轉染HEK293細胞。藉由經PEI調控之三重轉染HEK293細胞在PALL iCELLis生物反應器中產生單批或多批次。隨後，藉由澄清、TFF、親和性層析及陰離子交換層析，在可能的一次性、封閉式生物處理系統中純化所收穫的AAV材料。
之後，粗製細胞收穫物可施以以下方法步驟，例如載體收穫物的濃縮、載體收穫物的透析濃縮(diafiltration)、載體收穫物的微射流體法(microfluidization)、載體收穫物的核酸酶消化、微射流體化中間體的過濾、藉由層析之粗製物純化、藉由超速離心的粗製物純化、藉由切向流過濾的緩衝液交換，及/或調配及過濾以製備大量載體。
可使用高鹽濃度下的兩步驟親和性層析純化然後使用陰離子交換樹脂層析以純化載體藥品並除去空衣殼。這些方法更詳細描述於國際專利申請號PCT/US2016/065970(2016年12月9日申請)及其優先權文件、美國專利申請號62/322,071 (2016年4月13日申請)及62/226,357 (2015年12月11日申請)且名稱為「AAV9的可擴充純化方法(Scalable Purification Method for AAV9)」，其等藉由引用併入本文。關於AAV8的純化方法，國際專利申請號PCT/US2016/065976 (2016年12月9日申請)及其優先權文件美國專利申請號62/322,098 (2016年4月13日申請)及62/266,341 (2015年12月11日申請)，及關於rh10，國際專利申請號PCT/US16/66013 (2016年12月9日申請)及其優先權文件，美國專利申請號62/322,055 (2016年4月13日申請)及62/266,347，名稱為「AAVrh10的可擴充純化方法(Scalable Purification Method for AAVrh10)」的同樣申請於2015年12月11日，及關於AAV1，國際專利申請號PCT/US2016/065974 (2016年12月9日申請)及其優先權文件美國專利申請號62/322,083 (2016年4月13日申請)及62/26,351，關於 「AAV1的可擴充純化方法(Scalable Purification Method for AAV1)」(2015年12月11日申請)，其等全部藉由引用併入本文中。
為了計算空顆粒和完整顆粒含量，將所選擇的樣本的VP3帶體積(band volume) (例如，在本文實施例中，碘克沙醇(iodixanol)梯度純化的製劑，其中GC#=顆粒#)相對於裝載的GC顆粒作圖。將所產生的線性方程(y=mx+c)用於計算測試製品峰的帶體積中的顆粒數。然後將每20 μL裝載的顆粒數(pt)乘以50，得到顆粒(pt)/mL。Pt/mL除以GC/mL得到顆粒與基因體拷貝數的比率(pt/GC)。Pt/mL-GC/mL得到空pt/mL。空pt/mL除以pt/mL並 x 100得到空顆粒的百分比。
一般而言，用於測定空衣殼及具有包裝的基因體之AAV載體顆粒的方法是技術領域中已知的，參見例如，Grimm et al.,Gene Therapy (1999) 6：1322-1330; Sommer et al., Molec. Ther. (2003) 7：122-128。為了測試變性衣殼，該方法包括使經處理的AAV儲料受SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳，其由能夠分離三種衣殼蛋白質的任何凝膠組成，例如，在緩衝液中含有3-8%Tris-乙酸鹽的梯度凝膠，然後進行凝膠直至樣本材料分離，並將凝膠轉印到尼龍或硝化纖維素膜上，較佳為尼龍。然後使用抗AAV衣殼抗體作為與變性衣殼蛋白質結合的初級抗體，較佳為抗AAV衣殼單株抗體，最佳為B1抗AAV-2單株抗體(Wobus et al.,J. Virol . (2000) 74：9281-9293)。然後使用二級抗體，一種與初級抗體結合的抗體並包含用於檢測與初級抗體結合之方法，更佳為包含與其共價結合之檢測分子的抗IgG抗體，最佳為與辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase)共價連接的綿羊抗小鼠IgG抗體。將用於檢測結合的方法用於半定量測定初級及二級抗體之間的結合，較佳為能夠檢測放射性同位素發射、電磁輻射或比色變化的檢測方法，最佳為化學發光檢測套組，例如，對於SDS-PAGE，來自管柱餾分的樣本可被取出並在含有還原劑(例如DTT)的SDS-PAGE裝載樣本緩衝液中加熱，並在預製的梯度聚丙烯醯胺凝膠(例如Novex)上分離衣殼蛋白質。可使用SilverXpress (Invitrogen，CA)，根據製造商的說明書或其它適當的染色方法，即，SYPRO紅寶石或考馬斯(Coomassie)染色進行銀染色。在一實施方式中，可藉由定量即時PCR (Q-PCR)測量管柱餾分中AAV載體基因體(vg)的濃度。將樣本稀釋並用DNA酶I(或另一適當核酸酶)消化以除去外源DNA。在核酸酶去活化後，將樣本進一步稀釋並使用引子和對引子之間的DNA序列具有特異性的TaqManTM 螢光探針進行擴增。在Applied Biosystems Prism 7700序列檢測系統上測量各樣本達到確定螢光水平所需的循環數(閾值循環，Ct)。將含有與AAV載體中所含序列之相同序列的質體DNA用於在Q-PCR反應中產生標準曲線。從樣本獲得的循環閾值(Ct)數值用於藉由將其相對於質體標準曲線的Ct值進行歸一化來確定載體基因體力價。亦可使用基於數位PCR的終點分析(End-point assay)。
一方面，使用優化的q-PCR方法，其利用廣譜絲胺酸蛋白酶，例如蛋白酶K (例如可從Qiagen商購獲得)。更具體而言，優化的qPCR基因體力價分析與標準分析相似，除了在DNA酶I消化之後，將樣本以蛋白酶K緩衝液稀釋並以蛋白酶K處理，然後加熱去活化。適當地，將樣本以等量於樣本大小的蛋白酶K緩衝液稀釋。蛋白酶K緩衝液可濃縮至2倍或更高。通常，蛋白酶K處理約為0.2 mg/mL，但可在0.1 mg/mL至約1 mg/mL之間變化。處理步驟通常在約55℃下進行約15分鐘，但可在較低溫度(例如，約37℃至約50℃)下進行較長一段時間(例如，約20分鐘至約30分鐘)，或在較高溫度(例如，高至約60℃)下進行較短一段時間(例如，約5至10分鐘)。類似地，加熱去活化通常在約95℃下保持約15分鐘，但溫度可降低(例如，約70℃至約90℃)並延長時間(例如，約20分鐘至約30分鐘)。然後將樣本稀釋(例如，1000倍)並如標準分析中所述進行TaqMan分析。
另外或或者，可使用微滴數位化PCR(ddPCR)。例如，藉由ddPCR確定單股及自我互補AAV載體基因體力價的方法已被敘述，參見例如，M. Lock et al, Hu Gene Therapy Methods. 2014 Apr; 25(2)：115-25. doi：10.1089/hgtb.2013.131. Epub 2014 Feb 14。
簡而言之，用於分離具有經包裝之基因體序列的rAAVhu68顆粒與缺少基因體的AAVhu68中間體的方法涉及對包含重組AAVhu68病毒顆粒及AAVhu689衣殼中間體的懸浮液進行快速表現液相層析(fast performance liquid chromatography)，其中AAVhu68病毒顆粒和AAVhu68中間體與在pH 10.2平衡的強陰離子交換樹脂結合，並進行鹽度梯度，同時在約260和約280下監測洗提液的紫外吸收。雖然對於rAAV9hu68而言並非最理想的，但pH可在約10.0至10.4的範圍內。在此方法中，當A260/A280的比率達到轉折點時，自被洗提的餾分中收集全部衣殼。在一實例中，關於親和性層析步驟，可將透析濃縮的產物施用於有效捕獲AAV2/hu68血清型的Capture SelectTM Poros-AAV2/9親和性樹脂(Life Technologies)，在這些離子條件下，顯著百分比的殘留細胞DNA及蛋白質流過管柱，而AAV顆粒被有效捕獲。
組成物及用途 本文提供包含至少一種rAAV.hGALC儲料(例如rAAVhu68儲料或突變體rAAV儲料)及可選擇的載劑、賦形劑及/或防腐劑的組成物。rAAV儲料係指多個相同的rAAV載體，例如，如於下文討論的濃度及劑量單位中所述的量。
如本文中所使用，「載劑(carrier)」包括任何及所有的溶劑、分散介質、媒劑、塗料、稀釋劑、抗細菌及抗真菌劑、等滲及吸收延遲劑、緩衝劑、載劑溶液、懸浮液、膠體等。此類用於醫藥活性物質的介質及試劑的用途為技術領域中所熟知的。補充活性成分亦可摻入組成物中。詞語「醫藥上可接受的」係指當投予宿主時不會產生過敏或類似不良反應的分子實體及組成物。遞送媒劑，例如脂質體、奈米膠囊、微粒、微球、脂質顆粒、囊泡等可用於將本發明之組成物導入適當的宿主細胞中。特別是，可將rAAV載體遞送載體基因體調配用於遞送包封在脂質顆粒、脂質體、囊泡、奈米球或奈米顆粒等之中。
在一實施方式中，組成物包括適於遞送至受試者的最終調配物，例如，為緩衝至生理相容性pH及鹽濃度的水性液體懸浮劑。可選擇地，一或多種表面活性劑可存在於調配物中。在另一實施方式中，組成物可作為濃縮物輸送，將其稀釋後投予受試者。在其它實施方式中，組成物可被凍乾並在給藥時重構(reconstituted)。
適當的表面活性劑或表面活性劑之組合物可選自無毒非離子表面活性劑之中。在一實施方式中，選擇終止於一級羥基的雙官能嵌段共聚物表面活性劑，例如Pluronic® F68 [BASF]，也稱為泊洛沙姆188，其具有中性pH，平均分子量為8400。可以選擇其它表面活性劑和其它泊洛沙姆，即由兩側是兩個聚氧乙烯(聚(環氧乙烷))親水鏈的聚氧丙烯(聚(環氧丙烷))中央疏水鏈所構成的非離子三嵌段共聚物、SOLUTOL HS 15 (聚乙烯二醇(Macrogol)-15羥基硬脂酸酯)、LABRASOL (聚氧基辛基甘油酯(Polyoxy capryllic glyceride))、聚氧基10油基醚、TWEEN(聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯)、乙醇和聚乙二醇。在一實施方式中，調配物包含泊洛沙姆。這些共聚物通常用字母「P」(用於泊洛沙姆)跟三個數字命名：前兩個數字x100給出聚氧丙烯核心的近似分子量，最後一個數字x10給出聚氧乙烯含量百分比。在一實施方式中，選擇泊洛沙姆188。表面活性劑可以以懸浮液的高至約0.0005%至約0.001%的量存在。
以足夠的量將載體投予轉染細胞並提供足夠程度的基因轉移和表現，以提供治療益處而沒有不適當的副作用，或具有醫學上可接受的生理作用，這可由醫學領域的技術人員確定。習知及醫藥上可接受的給藥途徑包括，但不限於直接遞送至所欲之器官(例如，肝臟(可選擇地藉由肝動脈)、肺臟、心臟、眼睛、腎臟)、口服、吸入、鼻內、鞘內、氣管內、動脈內、眼內、靜脈內、肌肉內、皮下、皮內和其它腸胃外投予路徑。若需要，可組合投予途徑。
病毒載體的劑量主要取決於例如所欲治療的症狀、患者的年齡、體重和健康等因素，因此可能因患者而異。例如，病毒載體的治療有效人類劑量範圍通常為約25至約1000微升至約100 mL的含濃度約1x109 至1x1016 基因體病毒載體的溶液。調節劑量以平衡治療效益與任何副作用，且此劑量可根據所採用之重組載體的治療應用而變化。可監測轉殖基因產物的表現水平以確定產生病毒載體的劑量頻率，所述病毒載體較佳為包含小基因的AAV載體。可選擇地，類似於用於治療目的所描述的劑量方案可被用於使用本發明組成物之免疫作用。
可在劑量單位中調配複製缺陷型病毒組成物以包含一定量之複製缺陷型病毒，即範圍在約1.0 x 109 GC至約1.0 x 1016 GC (治療平均體重70公斤的受試者)，包括該範圍內的所有整數或分數量，並對於人類病患較佳為1.0x1012 GC至1.0x1014 GC。在一實施方式中，將組成物調配成每劑量含至少1x109 、2x109 、3x109 、4x109 、5x109 、6x109 、7x109 、8x109 或9x109 GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。在另一實施方式中，將組成物調配成每劑量含至少1x1010 、2x1010 、3x1010 、4x1010 、5x1010 、6x1010 、7x1010 、8x1010 或9x1010 GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。在另一實施方式中，將組成物調配成每劑量含至少1x1011 、2x1011 、3x1011 、4x1011 、5x1011 、6x1011 、7x1011 、8x1011 或9x1011 GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。在另一實施方式中，將組成物調配成每劑量含至少1x1012 、2x1012 、3x1012 、4x1012 、5x1012 、6x1012 、7x1012 、8x1012 或9x1012 GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。在另一實施方式中，將組成物調配成每劑量含至少1x1013 、2x1013 、3x1013 、4x1013 、5x1013 、6x1013 、7x1013 、8x1013 或9x1013 GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。在另一實施方式中，將組成物調配成每劑量含至少1x1014 、2x1014 、3x1014 、4x1014 、5x1014 、6x1014 、7x1014 、8x1014 或9x1014 GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。在另一實施方式中，將組成物調配成每劑量含至少1x1015 、2x1015 、3x1015 、4x1015 、5x1015 、6x1015 、7x1015 、8x1015 或9x1015 GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。在一實施方式中，對於人類施用，劑量可為每劑量1x1010 至約1x1012 GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。在一實施方式中，用於人類施用，劑量之範圍可在每劑量1.4x1013 至約4x1014 GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。
這些上述劑量可在各種體積的載劑、賦形劑或緩衝劑調配物中投予，範圍約25至約1000微升，或更高的體積，包括該範圍內的所有數字，取決於欲治療之區域的大小、使用的病毒力價、給藥途徑及該方法所欲之效果。在一個實施方式中，載劑、賦形劑或緩衝劑的體積為至少約25 μL。在一個實施方式中，體積為約50 μL。在另一個實施方式中，體積為約75 μL。在另一個實施方式中，體積為約100 μL。在另一個實施方式中，體積為約125 μL。在另一個實施方式中，體積為約150 μL。在另一個實施方式中，體積為約175 μL。在另一個實施方式中，體積為約200 μL。在另一個實施方式中，體積為約225 μL。在另一個實施方式中，體積為約250 μL。在另一個實施方式中，體積為約275 μL。在另一個實施方式中，體積為約300 μL。在另一個實施方式中，體積為約325 μL。在另一個實施方式中，體積為約350 μL。在另一個實施方式中，體積為約375 μL。在另一個實施方式中，體積為約400 μL。在另一個實施方式中，體積為約450 μL。在另一個實施方式中，體積為約500 μL。在另一個實施方式中，體積為約550 μL。在另一個實施方式中，體積為約600 μL。在另一個實施方式中，體積為約650 μL。在另一個實施方式中，體積為約700 μL。在另一個實施方式中，體積為約700至1000 μL。
rAAV.hGALC之治療有效的鞘內/腦池內劑量範圍約為1 x 1011 至7.0 x 1014 GC (固定劑量(flat dose))-相當於109 至5 x 1010 GC/g病患腦質量。或者，下列治療有效之固定劑量可投予至所指定年齡群之病患： ● 新生兒：約1 x 1011 至約3 x 1014 GC； ● 3-9月齡：約6 x 1012 至約3 x 1014 GC； ● 9月齡-6歲：約6 x 1012 至約3 x 1014 GC； ● 3-6歲：約1.2 x 1013 至約6 x 1014 GC； ● 6-12歲：約1.2 x 1013 至約6 x 1014 GC； ● 12+歲：約1.4 x 1013 至約7.0 x 1014 GC； ● 18+歲(成年)：約1.4 x 1013 至約7.0 x 1014 GC。
在某些實施方式中，劑量可在範圍約1 x 109 GC/g腦質量至約1 x 1012 GC/g腦質量。在某些實施方式中，劑量可在範圍約3 x 1010 GC/g腦質量至約3 x 1011 GC/g腦質量。在某些實施方式中，劑量可在範圍約5 x 1010 GC/g腦質量至約1.85 x 1011 GC/g腦質量。對於嬰幼兒與青少年/成年之間的比例，在某些情況下，對於4至12月齡之嬰兒，腦質量估計約為600g至約800 g；對於9月齡至18月齡約800 g至約1000 g，對於18月齡至3歲約1000 g至約1100 g；對於青少年或成年人為1100 g至約1300 g，或對於成年人為約1300 g。
在一實施方式中，病毒構築體可以至少約1x109 GCs至約1 x 1015 ，或約1 x 1011 至5 x 1013 GC之劑量遞送。用於遞送這些劑量的適當體積及濃度可由本領域技術人員確定。例如，可選擇體積約1 µL至150 mL，對於成年人選擇更高體積。通常，對於新生兒，適當的體積約為0.5 mL至約10 mL，對於較大的嬰兒，可選擇約0.5 mL至約15 mL。對於幼兒，可選擇約0.5 mL至約20 mL的體積。對於兒童，可選擇最高至約30 mL的體積。對於前青少年期和青少年，可以選擇最高至約50 mL的容量。在另外其它實施方式中，病患可選擇接受鞘內投予的量約5 mL至約15 mL，或約7.5 mL至約10 mL，可確定其它適當的體積及劑量。調節劑量以平衡治療效益與任何副作用，且這種劑量可根據所採用重組載體的治療應用而變化。
可以根據公開的方法將上述重組載體遞送至宿主細胞。較佳懸浮在生理學上相容載劑中的rAAV可施用於人類或非人類哺乳動物病患。在某些實施方式中，對於投予人類病患，rAAV適合懸浮在含有生理鹽水、表面活性劑和生理學相容之鹽或鹽類混合物的水溶液中。適當地，將調配物調節至生理學上可接受的pH，例如範圍在pH 6至9、或pH 6.5至7.5、pH 7.0至7.7、或pH 7.2至7.8。由於腦脊髓液的pH為約7.28至約7.32，對於鞘內遞送，可能需要在此範圍內的pH；而對於靜脈內遞送，可能需要約pH 6.8至約7.2。然而，可選擇最寬之範圍和這些子範圍內的其它pH用於其它遞送途徑。
在另一個實施方案中，組成物包含載劑、稀釋劑、賦形劑及/或佐劑。考慮到轉移病毒針對的適應症，本領域技術人員可易於選擇適當的載劑。例如，一種適當的載劑包括生理鹽水，其可以各種緩衝溶液(例如磷酸鹽緩衝生理鹽水)調配。其它例示性載劑包括無菌生理鹽水、乳糖、蔗糖、磷酸鈣、明膠、葡聚糖、瓊脂、果膠、花生油、芝麻油和水。緩衝劑/載劑應包括防止rAAV黏附於輸注管但不干擾體內rAAV結合活性的成分。
在一個實例中，調配物可包含例如緩衝生理鹽水溶液，其包含於水中的氯化鈉、碳酸氫鈉、右旋糖、硫酸鎂(例如硫酸鎂·7H2 O)、氯化鉀、氯化鈣(例如氯化鈣·2H2 O)、磷酸二鈉及其等之混合物中的一或多種。適當地，對於鞘內遞送，容積滲透壓濃度在與腦脊髓液相容的範圍內(例如，約275至約290)；參見例如emedicine.medscape.com/article/2093316-overview。可選擇地，對於鞘內遞送，可使用市售稀釋劑作為助懸劑，或與另一種助懸劑及其它可選擇的賦形劑組合使用。參見例如，Elliotts B® solution [Lukare Medical]。
在某些實施方式中，調配物可包含不含碳酸氫鈉之緩衝鹽水溶液，此類調配物可含有緩衝鹽水溶液，其包含於水中的磷酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂及其等之混合物中的一或多種，例如哈佛氏緩衝液(Harvard’s buffer)。水溶液可進一步包含Kolliphor® P188，一種可從BASF商購的泊洛沙姆(poloxamer)，先前以商品名Lutrol® F68出售，該水溶液可具有pH 7.2。
在其它實施方式中，調配物可含有一或多種滲透增強劑。適當的滲透增強劑之實例可包括例如，甘露醇、甘胺膽酸鈉、牛磺膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、水楊酸鈉、辛酸鈉、癸酸鈉、十二烷基硫酸鈉、聚氧乙烯-9-月桂基醚或EDTA。
可選擇地，除了rAAV和載劑之外，本發明之組成物可包含其它習知醫藥成分，例如防腐劑或化學穩定劑。適當的例示性防腐劑包括氯丁醇、山梨酸鉀、山梨酸、二氧化硫、沒食子酸丙酯、對羥基苯甲酸酯、乙基香草醛、甘油、苯酚及對氯苯酚。適當的化學穩定劑包括明膠和白蛋白。
根據本發明之組成物可包含如上文所定義之醫藥上可接受的載劑。適當地，本文所述之組成物包含有效量之一或多種AAV，其懸浮在藥學上適當之載劑中及/或與被設計用於藉由注射、滲透泵、鞘內導管遞送或用於藉由其它裝置或路線遞送至受試者的適當賦形劑混合。在一個實例中，組成物被調配以用於鞘內遞送。
如本文中所使用，術語「鞘內遞送」或「鞘內投予」係指藥物藉由注射入椎管的投予途徑，更具體而言為進入蜘蛛膜下腔以使其到達腦脊液(CSF)。鞘內遞送可包括腰椎穿刺、室內(包括腦室內(ICV))、枕骨下/腦池內及/或C1-2穿刺。例如，可以藉由腰椎穿刺方法導入物質以在整個蜘蛛膜下腔擴散。在另一實例中，注射可進入小腦延髓池。
如本文中所使用，術語「腦池內遞送」或「腦池內投予」係指藥物直接進入小腦延髓池cerebellomedularis之腦脊髓液的給藥途徑，更具體而言為藉由枕骨下穿刺或藉由直接注射入小腦延髓池或藉由永久定位管。
如本文中所使用，術語電腦斷層掃描攝影(CT)係指放射線照相術，其中身體結構的三維影像經電腦係藉由從沿軸線製作的一系列平面橫截面影像所構建。
本文所提供的rAAV.GALC載體及組成物可用於矯正與GALC酵素活性不足水平相關症狀。在某些實施方式中，本文所提供的rAAV.GALC載體及組成物可用於治療由GALC的不足所引起的周圍神經功能障礙，可用於治療由GALC不足所引起的呼吸衰竭及/或運動功能喪失，可用於治療克拉培氏病病患的相關症狀。
在某些實施方式中，將含有效量rAAV.hGALC之組成物投予小於6月齡具有早期嬰兒克拉培氏病(EIKD)的病患。在某些實施方式中，該病患小於6月齡且具有小於EIKD嚴重性之GALC酵素缺乏。
在某些實施方式中，將含有效量rAAV.hGALC之組成物投予大於6月齡(例如，7月齡至約12月齡)具有晚期嬰兒克拉培氏病(LIKD)的病患。在某些實施方式中，該病患大於6月齡，或7月齡至約12月齡，且具有小於EIKD嚴重性之GALC酵素缺乏。
在某些實施方式中，病患大於1歲(例如，13月齡至10歲)且具有少年克拉培氏病(JKD)。在某些實施方式中，該病患為13月齡至10歲且具有小於JKD嚴重性之GALC酵素缺乏。
在某些實施方式中，該病患超過10歲(例如，超過10歲至12歲，或10歲至18歲或更年長)，且具有青少年或成年發作型克拉培氏病。
在任何上述實施方式中，可投予本文所提供之rAAV.hGALC療法作為造血幹細胞替代療法、骨髓移植(BMT)及/或基質減量療法(Substrate reduction therapy，SRT)之協同療法。在某些實施方式中，在rAAV.hGALC療法(例如，EIKD)之後進行協同療法，例如HSCT或BMT或酵素替代療法。在某些實施方式中，該療法在投予載體後(包括治療後1週內)產生快速的酵素製造。
在某些實施方式中，酵素替代療法涉及投予SEQ ID NO：10的人類GALC蛋白質。在其它實施方式中，其它hGALC蛋白質變體(例如，如本文所鑑定之規範序列或工程化蛋白質)可用於酵素替代療法。酵素替代療法中可使用不同的hGALC蛋白質組合。在此實施方式中，可使用適當製造系統在活體外製造hGALC蛋白質，參見例如，C. Lee et al, 2005/10/01, Enzyme replacement therapy results in substantial improvements in early clinical phenotype in a mouse model of globoid cell leukodystrophy, FASEB journal, The FASEB Journal 19(11)：1549-51, October 2005。可調配hGALC蛋白質用於以任何適當途徑遞送(例如，懸浮於生理相容性生理鹽水溶液中)，包括但不限於靜脈內、腹膜內或鞘內途徑。適當劑量可在範圍為1 mg/kg至20 mg/kg，或5 mg/kg至10 mg/kg，且依據需要可每週一次或更多或更少的頻率重新給藥(例如，每隔一天一次、每兩週一次等等)。使用CSF投予hAAVhu68.GALC載體，在腦及血清中之GALC水平可為超生理學的、沒有毒性且可觀察到CNS和PNS中神經運動功能和髓鞘化的改善。當在出生後的條件動物模型中進行新生兒CSF給藥後再進行骨髓移植時，可在沒有明顯體徵的情況下延長存活期(例如，延長至>300天)。在症狀發生前的克拉培氏病病患中，單一小腦延髓池注射AAV.cGALC可提供表型矯正、存活率增加、神經傳導正常化及/或改善腦MRI。
在某些實施方式中，在HSCT或BMT(例如，LIKD或JKD)之後提供rAAV.hGALC療法。然而，在某些實施方式中，rAAV.hGALC提供足夠的GALC水平，因此不需要HSCT或BMT。
治療的目標是藉由基於rAAV的CNS和PNS指導的基因療法功能性地替代病患不足的GALC。對於EIKD或LIKD病患的療效可藉由評估EIKD或LIKD的一或多個症狀的改善來衡量：哭鬧及煩躁不安、痙攣、拳頭彎曲、失去笑容、頭部控制不佳及進食困難；精神和運動功能惡化，高滲透壓或低滲透壓、癲癇、失明、失聰及存活率增加 (對於EIKD，未經治療通常會在2歲前死亡；對於LIKD，存活期可能會增加到3-5歲)。此外，對於這些及其它克拉培氏病病患，可藉由以下方法評估治療效果：可藉由影像學檢查(例如磁振造影(MRI))監測影響周圍神經及CNS白質(深腦白質和齒狀(dentate)/小腦白質)的髓鞘形成障礙和脫髓鞘的減少；異常神經傳導速度(NCV)及/或聽性腦幹誘發電位(brainstem auditory evoked potentials，BAEPs)的降低；腦脊髓液及/或血漿中所觀察到的GALC含量增加；及/或鞘胺醇半乳糖苷的蓄積減少。
提供包含重組腺相關病毒(rAAV)之組成物，其包含靶定中樞神經系統中之細胞的AAV衣殼，且在其中已包裝含半乳糖基神經醯胺酶編碼序列的載體基因體，該編碼序列在指導蛋白質表現之調控序列的控制下編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO：10之成熟半乳糖基神經醯胺酶蛋白質，該載體基因體進一步包含用於包裝載體基因體至AAV衣殼中所需之AAV反向末端重複。
在某些實施方式中，提供有用於治療克拉培氏病之組成物，其包含具有CB7.CI.hGALC.rBG之載體基因體的rAAVhu68。在一實施方式中，載體基因體具有編碼序列(SEQ ID NO：19)。
在某些實施方式中，提供一種組成物在用於矯正由GALC不足所引起之周圍神經功能障礙的方法及/或治療由GALC不足所引起的呼吸衰竭和運動功能喪失的方法中的用途。在某些實施方式中，該方法包含投予含重組腺相關病毒(rAAV) 儲料之組成物，該重組腺相關病毒(rAAV)包含：(a)靶定中樞神經系統中之細胞的AAV衣殼且其具有(b)之載體基因體包裝於其中；及(b)含半乳糖基神經醯胺酶編碼序列之載體基因體，該半乳糖基神經醯胺酶編碼序列在指導蛋白質表現之調控序列的控制下編碼具有SEQ ID NO：10之胺基酸序列的成熟半乳糖基神經醯胺酶蛋白質，其中該載體基因體進一步包含用於包裝載體基因體至AAV衣殼中所需之AAV反向末端重複。
在某些實施方式中，本文所提供之rAAV.hGALC組成物被鞘內遞送用於治療具有早期嬰兒克拉培氏病之病患。在某些實施方式中，本文所提供之組成物被鞘內遞送用於治療具有晚期嬰兒克拉培氏病(LIKD)之病患。在某些實施方式中，本文所提供之rAAV.hGALC組成物被鞘內遞送用於治療具有少年克拉培氏病(JKD)之病患。在某些實施方式中，本文所提供之rAAV.hGALC組成物被鞘內遞送用於治療具有青少年或成年發作型克拉培氏病之病患。在某些實施方式中，投予rAAV.hGALC組成物作為造血幹細胞移植(HSCT)、骨髓移植及/或基質減量療法之協同療法。在某些實施方式中，rAAV.hGALC組成物以單一劑量藉由電腦斷層掃描攝影-(CT-)導引枕骨下注射投予至小腦延髓池(小腦延髓池內)。
投予rAAV.hGALC經存活率的測量可穩定化疾病進展、防止發育和動作里程碑的喪失(潛在支持獲得新的里程碑)、癲癇發作和頻率。因此，在某些實施方式中，提供用於監測治療之方法，其中在例如，30日、90日及/或6個月測量端點，然後在例如兩年的短期追蹤期內，例如每6個月測量端點。在某些實施方式中，在長期延期期間，測量頻率降低到每12個月一次。考慮到目標族群中疾病的嚴重性，受試者可能藉由入學已經掌握動作技能、發展並隨後失去其它動作里程碑，或尚未顯示出動作里程碑發展的跡象。因此，評估會跟蹤所有里程碑的隨年齡達成和隨年齡喪失。在某些實施方式中，里程碑包括，例如，無支撐坐立、手膝爬行、輔助下站立、輔助下行走、獨自站立及/或獨自行走中的一或多者。在某些實施方式中，治療導致癲癇發作活動延遲和/或癲癇發作頻率降低。
在某些實施方式中，監測受試者治療的方法係使用臨床量表來量化在適應行為、認知、語言、運動功能及/或健康相關生活品質的發展與變化的治療效果。量表及領域包括，例如，貝里嬰幼兒發展量表(評估五個領域的嬰幼兒發展：認知、語言、運動、社會情感及適應行為)、文蘭德適應行為量表(Vineland Adaptive Behavior Scales) (第三版) (從五個領域評估從出生到成年(0-90歲)的適應行為：溝通、日常生活技能、社交、運動技能和適應不良行為)、皮巴迪動作發展量表(Peabody Developmental Motor Scales)- 第二版(測量從出生到五歲兒童的相關運動功能；評估集中在六個領域：反射、靜止、運動、物體操縱、抓握和視覺運動整合)、嬰幼兒生活品質問卷(Infant Toddler Quality of Life Questionnaire，ITQOL) (針對與健康有關的生活質量的父母報告量度，專為2個月以下嬰兒至5歲幼兒設計)及穆林早期學習量表(Mullen Scales of Early Learning)(評估在68月齡以下的嬰兒及幼兒的語言、運動和感知能力)。在某些實施方式中，藉由評估髓鞘化的變化、髓鞘化相關的功能性結果及潛在疾病生物標記，來監測或評估治療效果。在某些實施方式中，受試者治療後中樞和周圍脫髓鞘化進展緩慢或停止。可藉由白質區域的擴散張量磁振造影(diffusion-tensor magnetic resonance imaging，DT-MRI)向異性測量和皮質脊髓運動徑(corticospinal motors tracts)之纖維追踪來追踪中央脫髓鞘鞘化，變化是疾病狀態和進展的指標。可藉由對運動神經(深腓骨、脛骨和尺骨神經)和感覺神經(腓腸神經和正中神經)的神經傳導速度(NCV)研究間接測量周圍脫髓鞘鞘化，以監測象徵生物活性髓磷脂變化的波動(即F波和遠端潛伏期、振幅或反應存在或不存在)。
在某些實施方式中，提供一種在rAAV.hGALC投予後監測治療的方法，其中對於那些在治療之前沒有發展出顯著視力喪失的受試者，評估該受試者視力喪失的延遲或未有視力喪失。因此，視覺誘發電位(VEP)的測量可客觀地測量對視覺刺激的反應，作為中樞視力損害或喪失的指標。在某些實施方式中，使用例如腦幹聽覺誘發反應(BAER)測試對受試者在治療後的聽力損失進行監測。在某些實施方式中，提供一種在rAAV.hGALC投予後監測治療的方法，其中測量受試者的鞘胺醇半乳糖苷水平。
應注意的是，術語「一(a/an)」係指一個(種)或多個(種)。因此，術語「一」(或「一個(種)」)、「一或多個(種)」及「至少一個(種)」在本文中可互換使用。
詞語「含」、「包含」、「包括」及「含有」應包含性而非排他性地解釋。詞語「由...組成」、「由...構成」及其變化應排他性地而不是包含性地解釋。雖然說明書中的多個實施方式使用「包含」語句來呈現，但在其它情況下，相關實施方式亦旨在使用「由...組成」或「實質上由...組成」語句來解釋和描述。
如本文中所使用，除非另有指明，術語「約」意指與給定參考值間有10%(±10%)的變化。
如本文中所使用，「疾病」、「失調」及「症狀」可互換使用，以指示受試者的不正常狀態。
術語「表現」在本文中以其最廣泛的含義使用，且包含RNA或RNA及蛋白質的產生。關於RNA，術語「表現」或「轉譯」特別涉及肽或蛋白質的產生。表現可為一時的或可為穩定的。
如本文中所使用，「表現匣」係指包含編碼序列、啟動子並且可包括其它調控序列的核酸分子。在某些實施方式中，載體基因體可含有兩個或更多個表現匣。在其它實施方式中，術語「轉殖基因」可與「表現匣」互換使用。通常，此類用於產生病毒載體的表現匣包含本文所述基因產物的編碼序列，其兩側是病毒基因組的包裝信號及其它表達控制序列，例如本文所述的那些。
縮寫「sc」指的是自我互補。「自我互補AAV」係指其中由重組AAV核酸序列攜帶的編碼區被設計形成分子內雙股DNA模板的構築體。當感染時，並非等待細胞調控的第二股的合成，而是scAAV的兩個互補半部將結合形成準備立即複製和轉錄的一個雙股DNA(dsDNA)單元，參見例如，D M McCartyet al,“Self -complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis”, Gene Therapy, (2001年8月), Vol 8, Number 16, Pages 1248-1254。自我互補AAV描述於例如美國專利號6,596,535、7,125,717及7,456,683中，其各藉由引用整體併入本文。
當術語「異源的」使用於所提及之蛋白質或核酸時，表示該蛋白質或核酸包含在自然界中彼此之間沒有相同關係的兩個或更多個序列或子序列。例如，核酸通常是重組產生的，具有二或多個來自無關基因的序列，其排列以產生新的功能性核酸。例如，在一實施方式中，該核酸具有來自一個基因的啟動子，其被安排為指導來自不同基因的編碼序列的表現。因此，參照編碼序列，啟動子是異源的。
「複製缺陷型病毒」或「病毒載體」係指合成或人工病毒顆粒，其中含有感興趣基因的表現匣包裝在病毒衣殼或套膜中，其中也包裝在病毒衣殼內或套膜內的任何病毒基因體序列是複製缺陷的；即，它們並不能產生子代病毒粒子但保留感染目標細胞的能力。在一個實施方式中，病毒載體的基因體不包含編碼複製所需酵素的基因(基因體可工程化為「完全不含病毒基因的(gutless)」-僅包含目的基因，其兩側是人工基因體擴增和包裝所需的信號)，但這些基因可在生產過程中提供。因此，由於除非存在複製所需的病毒酵素，否則不能發生子代病毒的複製和感染，所以在基因療法中的使用被認為是安全的。
在許多情況下，rAAV顆粒被稱為DNA酶(DNase)抗性。然而，除了此核酸內切酶(DNA酶)之外，其它核酸內切酶及核酸外切酶亦可用於本文所述的純化步驟，以除去污染的核酸。可選擇此類核酸酶以降解單股DNA及/或雙股DNA和RNA。這些步驟可包含單一核酸酶，或針對不同目標之核酸酶的混合物，且可為核酸內切酶或核酸外切酶。
術語「核酸酶抗性」表示AAV衣殼已完全組裝在表現匣周圍，其被設計用於將基因遞送至宿主細胞並保護這些經包裝的基因體序列在核酸酶培養步驟期間免於降解(消化)，核酸酶培養步驟被設計用於除去可能存在於生產過程中的污染的核酸。
如本文所使用，「有效量」係指rAAV組成物的量，其在目標細胞中遞送及表現一定量的來自載體基因體的基因產物。可基於動物模型而不是人類病患來確定有效量。本文描述適當的鼠類模型之實例。
除非在本說明書中另有定義，否則本文所使用的技術和科學術語具有與本領域中具有通常知識者所通常理解的含義相同，且藉由參考公開的文本，其為本領域技術人員提供了本申請案中所使用之術語的一般性規範。
實施例 以下實施例僅為說明性的，並非意圖限制本發明。
縮寫 說明
A 吸光度
aa 胺基酸
AAV 腺相關病毒
AAVhu68 腺相關病毒血清型hu68
Ad5 腺病毒血清型5
AE 不良事件
AEX 陰離子交換
AmpR 安比西林抗性(基因)
ANOVA 變異數分析
AUC 分析型超高速離心機
BA 雞β-肌動蛋白啟動子
BAER 腦幹聽覺誘發反應
BBB 血腦障壁
BCA 二喹啉甲酸(Bicinchoninic Acid)
BDS 大批原料藥(Bulk Drug Substance)
BMCB 細菌主細胞庫(Bacterial Master Cell Bank)
bp 鹼基對
BRF 批次紀錄表(Batch Record Form)
BSA 牛血清白蛋白
BSC 生物安全櫃(Biological Safety Cabinet)
BWCB 細菌工作細胞庫(Bacterial Working Cell Bank)
cap 衣殼(基因)
CBC 全血細胞計數
CBER 生物製品評估與研究中心(Center for Biologics Evaluation and Research)
CFR 聯邦法規(Code of Federal Regulations)
CFU 菌落形成單位(Colony Forming Units)
CI 嵌合插入子
CMC 化學製造與控制
CMO 受託製造機構
CMV IE 細胞巨大病毒立即早期增強子
CNS 中樞神經系統
COA 檢驗證明書(Certificate of Analysis)
CRL 查爾斯河實驗室
CRO 受託研究機構(Contract Research Organization)
CSF 腦脊髓液
CT 電腦斷層掃描攝影
CTL 胞毒型T淋巴球
ddPCR 微滴數位化聚合酶連鎖反應(Droplet Digital Polymerase Chain Reaction)
DLS 動態光散射
DMEM 達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)
DMF 原料藥主檔案(Drug Master File)
DNA 去氧核醣核酸
DO 溶氧
DP 藥品
DRG 背根神經節(Dorsal Root Ganglia)
DS 原料藥(Drug Substance)
DSMB 資料安全監視會
E1A 早期區域1A (基因)
ECG 心電圖
EDTA 伸乙二胺四乙酸
ELISA 酶聯免疫吸附分析法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
ELISpot 酶聯免疫斑點法(Enzyme-Linked Immunospot)
ERT 酵素替代療法
EU 內毒素單位
F 女性
F/U 追蹤(Follow-Up)
FBS 胎牛血清
FDA 食品藥物管理局
FDP 最終藥品
FFB 最終調配緩衝液
FIH 第一期人體試驗
GALC 半乳糖基神經醯胺酶(基因，人類)
Galc 半乳糖基神經醯胺酶(基因，小鼠)
GALC 半乳糖基神經醯胺酶(蛋白)
GC 基因體拷貝數(Genome Copies)
GLP 優良實驗室操作規範
GMP 優良藥品製造規範
HCDNA 宿主細胞去氧核醣核酸
HCP 宿主細胞蛋白
HEK293 人類胚腎293
ICH 國際藥品法規協和會(International Conference on Harmonization)
ICM 小腦延髓池內(Intra-Cisterna Magna)
ICV 腦室內(Intracerebroventricular)
IDS 己醛醣酸鹽硫酸脂酵素(Iduronate-2-Sulfatase)
IFN-γ 干擾素γ
IT 鞘內(Intrathecally)
ITFFB 鞘內最終調配緩衝液
ITR 反向末端重複
IU 感染單位(Infectious Unit)
IV 靜脈內
KanR 康黴素抗性(基因)
LAL 鱟阿米巴樣細胞溶解物(Limulus Amoebocyte Lysate)
LFTs 肝功能檢查
LOD 偵測極限
LTFU 長期追蹤(Long-Term Follow-Up)
M 男性
MBR 主批次紀錄(Master Batch Record)
MCB 主細胞庫(Master Cell Bank)
MED 最小有效劑量(Minimum Effective Dose)
MRI 磁振造影
mRNA 信使核醣核酸
MS 質譜法
MTD 最大耐受劑量
N 受試者或動物數量
N/A 不適用
NAbs 中和抗體
NBS 新生兒篩檢
NCV 神經傳導速度
NGS 次世代定序法(Next-Generation Sequencing)
NHP 非人類靈長類(Non-Human Primate)
NHS 自然史研究(Natural History Study)
OL 開放性(Open-Label)
PAS 過碘酸-希夫氏
PBS 磷酸鹽緩衝生理鹽水
PEI 聚乙烯亞胺
PES 聚醚碸
PND 出生後天數
POC 概念驗證
PolyA 多腺核苷酸化(Polyadenylation)
QA 品質保證
QC 品質管制
qPCR 定量聚合酶連鎖反應
rAAV 重組腺相關病毒
rcAAV 具複製能力腺相關病毒(Replication-Competent Adeno-Associated Virus)
rBG 兔β-球蛋白
rDNA 核醣體去氧核醣核酸
rep 複製酶(基因)
RNA 核醣核酸
RPM 每分鐘轉數
SA 單臂
SAE 嚴重不良事件
SD 標準差
SDS 十二烷基硫酸鈉
SDS-PAGE 十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳
SOP 標準作業程序
SRT 安全審核觸發因素(Safety Review Trigger)
ssDNA 單股去氧核醣核酸
TBD 待確定(To Be Determined)
TCID50 50%組織培養感染劑量
TE Tris-EDTA
TFF 切向流過濾(Tangential Flow Filtration)
twi Twitcher功能喪失對偶基因
UPLC 超高效液相層析
US 美國
USP 美國藥典(United States Pharmacopeia)
VEP 視覺誘發電位(Visual Evoked Potential)
VP1 病毒蛋白質 1
VP2 病毒蛋白質 2
VUS 未知意義變體(Variants of Unknown Significance)
WCB 工作細胞庫(Working Cell Bank)
WHO 世界衛生組織
WT 野生型
實施例 1- 重組 AAVhu68.hGALC rAAVhu68.hGALC為一種攜帶編碼人類GALC之工程化序列的AAV。rAAVhu68.hGALC之AAVhu68衣殼在胺基酸水平上與AAV9有99%同一性。AAV9[SEQ ID NO：4]與AAVhu68衣殼[SEQ ID NO：2]之間相異的二個胺基酸位於衣殼之VP1(67及157)及VP2(157)區，並確認於圖1中。亦參見WO 2018/160852，其藉由引用併入本文。
rAAVhu68.hGALC是由HEK293細胞的三重質體轉染產生的，該HEK293細胞具有編碼AAV ITR兩側的轉殖基因匣之AAV順式質體、編碼AAV2 rep及AAVhu68 cap基因(pAAV2/hu68.KanR)之AAV反式質體及輔助腺病毒質體(pAdΔF6.KanR)。
A. AAV 載體基因體質體序列元件 載體基因體的線性圖譜如圖2所示。載體基因體包含以下序列元件： 反向末端重複(ITR)：ITR為衍生自AAV2(130 bp，GenBank：NC_001401)的相同反向互補序列，位於載體基因體的所有組件旁。當反式提供AAV及腺病毒輔助功能時，ITR作為載體DNA複製的起始及載體基因體的包裝信號的二項功能。因此，ITR序列代表載體基因體複製及包裝所需的唯一順式序列。
人類細胞巨大病毒立即早期增強子(CMV IE)：此獲自人類衍生之CMV (382 bp，GenBank：K03104.1)的增強子序列加下游轉殖基因的表現。
雞β-肌動蛋白啟動子(BA)：選擇此普遍存在的啟動子(282 bp，GenBank：X00182.1)驅動任何CNS細胞類型中的轉殖基因表現。
嵌合插入子(CI)：雜合的插入子由雞β-肌動蛋白剪接供體(973 bp，GenBank：X00182.1)與兔β-球蛋白剪接受體成分組成。插入子被轉錄，但藉由剪接將其從成熟的mRNA中移除，從而將其任一側的序列匯集在一起，已顯示在表現匣中存在插入子可促進mRNA從細胞核到細胞質的轉運，因此增強用於轉譯的mRNA之穩定水平的蓄積，此為欲在增加基因表現水平的基因載體的共同特徵。
編碼序列：人類GALC基因的工程化cDNA編碼人類半乳糖基神經醯胺酶蛋白質，其為一種溶酶體酶，負責髓磷脂半乳醣脂的水解和降解(2055 bp；685個胺基酸[aa]，GenBank：EAW81361.1)。
兔β-球蛋白多腺核苷酸化信號(rBG PolyA)： rBG PolyA信號(127 bp，GenBank：V00882.1)促進順式轉殖基因mRNA的高效多腺苷酸化。此元件係為作為轉錄終止的訊息、在初期轉錄本的3’端的特定裂解事件及多腺核苷酸尾的添加的功能。
B. 反向質體： pAAV2/1.KanR (p0068) AAV2/hu68反向質體pAAV2/hu68.KanR (p0068)顯示於圖21。
AAV2/hu68反向質體為pAAV2/hu68.KanR (p0068)。pAAV2/hu68.KanR質體為8030 bp長且編碼複製和包裝AAV載體基因體所需的四種野生型AAV2複製酶(Rep)蛋白。pAAV2/hu68.KanR質體亦編碼三種WT AAVhu68病毒顆粒蛋白衣殼(Cap)蛋白，其等組裝成AAV血清型hu68的病毒顆粒外殼，以容納AAV載體基因體。
為了創建pAAV2/hu68.KanR反向質體，將來自質體pAAV2/9n(p0061-2)(其在源自pBluescript KS載體的質體骨架上編碼野生型AAV2rep 和AAV9 cap基因)之AAV9cap 基因移除並以AAVhu68cap 基因置換。安比西林抗性(AmpR )基因亦以康黴素抗性(KanR )基因置換，產生pAAV2/hu68.KanR(p0068)。此種選殖策略將AAVp5 啟動子序列(通常驅動rep 表現)由rep 的5'端遷移至cap 的3'端，在rep 的上游留下一個截短的p5 啟動子。此截短的啟動子可下調rep 的表現，從而使載體的產量最大化(圖21)。
質體的所有組成部分均已通過直接定序驗證。
C. 腺病毒輔助質體： pAdDeltaF6(KanR) 腺病毒輔助質體pAdDeltaF6(KanR)顯示於圖22B。
質體pAdDeltaF6(KanR)大小為15,770 bp。該質體包含對AAV複製很重要的腺病毒基因體區域；即，E2A 、E4 及VA RNA(腺病毒E1之功能由HEK293細胞提供)。然而，該質體並不包含其它腺病毒複製或結構基因。該質體並不包含對複製至關重要的順式元件，例如腺病毒ITR；因此，預計不會產生感染性腺病毒。質體源自Ad5(pBHG10，一種pBR322系質體)之E1、E3缺失分子殖株。將缺失導入至Ad5中以消除不必要之腺病毒基因的表現並將腺病毒DNA的數量從32 kb減少到12 kb(圖22A)。最後，將安比西林抗性基因替換為康黴素抗性基因以產生pAdeltaF6 (KanR) (圖22B)。保留在此質體中的E2 、E4 及VAI 腺病毒基因，以及存在於HEK293細胞中的E1 ，對於AAV載體生產都是必需的。載體是分別根據圖30及圖31中所示之流程圖生產及調配。
實施例 2- 在 GALC- 缺失 twitcher 小鼠模型中之 AAVhu68.hGALC 遞送 下述研究使用Twitcher小鼠模型以建立遞送編碼工程化人類GALC序列(SEQ ID NO：9)之rAAVhu68載體(圖2)至CSF中的潛在性，達到GALC表現水平的治療水平並挽救該疾病的幾種生物標記。圖4B提供了Twitcher小鼠研究的概述。
小鼠是克拉培氏病的天然近親配種模型，1976年在傑克遜實驗室(Jackson Laboratory)被鑑定為自發性突變(Kobayashi T., et al. (1980) Brain Research. 202(2)：479-483)。受影響的小鼠對於twitcher功能喪失對偶基因(twi )是同基因型組合的，該對偶基因由Galc基因中的G到A突變組成。此突變產生早期終止密碼子(W339X)。截短的GALC蛋白質具有接近0%的殘留酵素活性，其與嬰兒型克拉培氏病之病患中所觀察到的GALC活性水平相似。異基因型組合的載劑小鼠 (twi /+)是表型上正常的。
Twitcher小鼠疾病的進展已得到充分證明(圖4A)，且各種神經病理學及行為缺陷模擬表型嬰兒克拉培氏病如表5所示。如同嬰兒克拉培氏病病患，小鼠GALC缺陷會導致細胞毒性脂質中間體鞘胺醇半乳糖苷的蓄積。Twitcher小鼠同樣顯示出PNS和CNS白質因吞噬而充滿鞘胺醇半乳糖苷之球狀細胞的大量浸潤，該球狀細胞被認為源自巨噬細胞及/或小神經膠質細胞譜系(Tanaka K., et al. (1988) Brain Research. 454(1)：340-346；Levine S.M., et al. (1994) Intl J Dev Neuro. 12(4)：275-288)。此導致脫髓鞘化，這是克拉培氏病病患的疾病關鍵特徵之一。在正常髓鞘化之初始階段後，受影響的Twitcher小鼠於10日齡後，由於形成髓磷脂的許旺氏細胞的死亡，在PNS喪失髓磷脂 (Jacobs J.M., et al. (1982) J Neurol Sci. 55(3)：285-304)，及於20日齡由於形成髓磷脂之寡樹突神經膠質細胞的死亡，在CNS中喪失髓磷脂。可能是因為這種延遲，這些小鼠周圍神經中的脫髓鞘化比在CNS中更為嚴重(Suzuki K. & Suzuki K. (1983) The American journal of pathology. 111(3)：394-397)。最後， Twitcher小鼠表現出持續且迅速的神經惡化，在症狀發作後嬰兒克拉培氏病病患中也觀察到類似情況。這些小鼠中的行為症狀包括讓人聯想到在人類病患中所觀察到的運動表型，包括在約20日齡的震顫、抽搐和後腿無力。小鼠最終在約40日齡發展成特徵為嚴重體重減輕及麻痺的人道終點(Wenger D.A. (2000) Molec Med Today. 6(11)：449-451)。
嬰兒克拉培氏病病患表現出與Twitcher小鼠相似的臨床特徵。因此，Twitcher小鼠模型足以評估rAAVhu68.hGALC支持嬰兒克拉培氏病適應症的功效(解救酵素活性以改善存活、運動功能及腦和神經病理)。如下所述，使用Twitcher小鼠進行的研究證實在單一ICV投予(在ICM技術上不可行的小鼠模型中最有效的方法)後，rAAVhu68.hGALC在相關組織中表現活性GALC酶素、挽救存活、改善運動功能及改善CNS和PNS組織病理學的功效。
症狀發生前的新生 Twitcher 小鼠 此研究的目的是在Twitcher小鼠模型中建立獲得最大功效的最佳ROA、衣殼血清型及劑量範圍。選擇症狀發生前的新生小鼠用於這些研究以便最大化觀察疾病搶救的變化。
為了建立最佳的ROA，將藉由注射到顳靜脈的IV路徑與ICV路徑比較，因為這兩種路徑都可轉導新生動物的CNS和PNS。將症狀發生前的Twitcher小鼠(twi /twi )於PND 0 以1.00 x 1011 GC之IV劑量或低5倍劑量的2.00 x 1010 GC之ICV劑量投予rAAVhu68.hGALC。選擇IV劑量是因為它對應於1.00 x 1014 GC/kg，此為達到CNS轉導所需的高劑量，而選擇低5倍之ICV劑量是因為直接投予到CSF中有利於低劑量的CNS的轉導。關於對照組，將症狀前年齡相仿的Twitcher小鼠以媒劑(PBS) ICV注射。在達到體重減輕>20%最大體重及/或後腿麻痺所定義的人道終點時，將動物安樂死，並記錄其存活率。與未治療的對照組相比，以較高劑量(1.00 x 1011 GC) IV投予rAAVhu68.hGALC可提供一些存活效益。然而，與IV投予相比，ICV投予低5倍劑量(2.00 x 1010 GC)的rAAVhu68.hGALC可帶來更高的存活效益(圖5)。因此，選擇ICV ROA進行後續研究。
為確定編碼人類GALC之載體基因體對於神經系統遞送的最佳AAV衣殼，測試四種不同的AAV衣殼。該衣殼包括AAV 血清型3b (AAV3b)、AAV血清型5 (AAV5)、AAV血清型1 (AAV1)及AAV血清型hu68 (rAAVhu68.hGALC)。將各AAV載體以2.00 x 1010 GC之劑量ICV投予，該劑量為低劑量且先前建立的ROA可有效延長症狀發生前之Twitcher小鼠的存活時間，同時允許較短的研究期間(圖5)。作為對照組，症狀發生前之Twitcher小鼠組別僅以媒劑(PBS)在PND 0 ICV投予。儘管與媒劑處理之對照組相比，所有四種衣殼均增長存活，但AAVhu68衣殼(rAAVhu68.hGALC)產生優於AAV3b、AAV5及AAV1的存活(圖6)。因此，選擇AAVhu68衣殼(rAAVhu68.hGALC)進行後續研究。
為了確定劑量範圍，將rAAVhu68.hGALC以劑量為2.00 x 1010 GC、5.00 x 1010 GC或1.00 x 1011 GC於PND 0 ICV投予至新生的症狀發生前之Twitcher小鼠。作為對照組，年齡相仿的症狀發生前之Twitcher (twi /twi )小鼠及未受影響的異基因型合子(twi /+)及野生型小鼠於PND 0 ICV投予媒劑(PBS)。
於PND 35，小鼠的活動性和協調性用桿分析法(rod assay)評估(圖7)。該旋轉架是一個小鼠在其上奔跑的加速桿，且在分析開始至小鼠墜落桿之時點之間與動作協調性相關的潛在時間已充分建立。選擇PND 35時間點是因為它是受影響的Twitcher小鼠在達到人道安樂死終點之前顯示出可測量的運動障礙的時間點。旋轉桿分析顯示，在投予rAAVhu68.hGALC後，部分動作和協調性得以搶救。搶救的程度似乎為劑量依賴性的，且對於最高的rAAVhu68.hGALC劑量1.00 x 1011 GC，觀察到明顯更長的落下潛時(fall latencies)(p >0.01)(圖7)。
進行旋轉桿分析後，追踪所有治療組別的存活情況。與接受媒劑治療的Twitcher (twi /twi )對照組相比，在PND 0於症狀發生前投予rAAVhu68.hGALC的Twitcher(twi /twi )小鼠觀察到存活情況的劑量依賴性增加。投予1.00 x 1011 GC之最高rAAVhu68.hGALC劑量的小鼠，觀察到最長的中位數存活(130日)(圖8)。
總之，這些用於確定最佳ROA、衣殼及劑量範圍的POC實驗證實，若在Twitcher小鼠症狀發作前給藥，rAAVhu68.hGALC可具有保持神經運動功能及延長存活的功能。
有症狀的 Twitcher 小鼠 此項研究之目的為檢查在行為症狀發作前在疾病病理早期階段(PND 12；稱為「早期-有症狀的」)給藥時，或當小鼠顯現行為症狀在疾病病理後期階段(PND 21；稱為「晚期-有症狀的」)給藥時，rAAVhu68.hGALC的功效，因為想概括一個與症狀發作後才登錄的病患相似的情況。此外，在PND 0小鼠的大腦成熟相當於早產兒，而PND 12和PND 21分別代表2月齡及9月齡(www.translatingtime.org)，這更接近概括對於FIH的預期嬰兒族群。
早期-有症狀的Twitcher小鼠於PND 12以1.00 x 1011 GC或2.00 x 1011 GC之劑量ICV投予rAAVhu68.hGALC，而另一晚期-有症狀的Twitcher小鼠之群體則於PND 21以2.00 x 1011 GC之較高劑量ICV投予rAAVhu68.hGALC。選擇1.00 x 1011 GC較低劑量投予是因為發現它是提高Twitcher小鼠存活的最有效劑量(如上所述)。2.00 x 1011 GC之較高的rAAVhu68.hGALC劑量在PND 21亦被用於治療小鼠，因為據推測，具有更嚴重的脫髓鞘化的小鼠可能需要更高的劑量。作為對照組，早期-有症狀的Twitcher小鼠(twi /twi )及未受影響的異基因型合子(twi / +)僅在PND 12被ICV投予媒劑(PBS)，且研究1之歷史數據用於與在PND 0投予1.11 x 1011 GC之Twitcher小鼠(twi /twi )比較。
在PND35，使用旋轉桿分析評估小鼠的活動性及協調性，此為Twitcher小鼠(twi /twi )表現出可測量的運動障礙的時間點。當rAAVhu68.hGALC在PND 0以1.00 x 1011 GC (p>0.01)之劑量投予至尚未有症狀的Twitcher小鼠或在PND 12以1.00 x 1011 GC (p>0.001)或2.00 x 1011 GC (p>0.01)之劑量投予至早期-有症狀的Twitcher小鼠時，旋轉桿分析顯示出動作及協調性的部分挽救。當在PND 21以2.00 x 1011 GC之rAAVhu68.hGALC劑量投予晚期-有症狀的Twitcher小鼠時，沒有觀察到明顯的動作及協調性挽救(圖9)。
進行旋轉桿分析後，追踪所有治療組的存活情況。與經媒劑處理的Twitcher對照組相比，經rAAVhu68.hGALC在PND 12投予早期-有症狀的Twitcher小鼠及在PND 21投予晚期-有症狀的Twitcher小鼠後，觀察到較長的存活。然而，當在PND 12以2.00 x 1011 GC之高劑量rAAVhu68.hGALC投予早期-有症狀的Twitcher小鼠時，獲得最大的存活(圖10)。
總之，Twitcher小鼠的存活及神經運動功能的改善表明，若在疾病的早期階段給藥，rAAVhu68.hGALC可能更為有效。
有症狀的 Twitcher 小鼠之藥理學研究 此研究之目的為評估rAAVhu68.hGALC給藥後的藥理學、功能性及組織病理學讀數。由於先前的研究是為了方便生存分析而在人道終點處犧牲動物，此排除了在Twitcher小鼠和經媒劑治療之對照組之年齡相仿時間點收集藥理學和組織學讀數的可能性。因此，本研究檢測這些終點。
早期-有症狀的Twitcher小鼠(twi/twi )於PND 12以2.00 x 1011 GC之劑量ICV投予 rAAVhu68.hGALC。年齡相仿未受影響之Twitcher異基因型合子(twi/ +)及野生型小鼠於PND 12 ICV投予PBS作為對照組。選擇2.00 x 1011 GC之rAAVhu68.hGALC劑量用於POC以達到最大效力，且選擇PND 12作為投劑之日，因為此相當於2月齡嬰兒的具有腦部成熟的動物中PNS脫髓鞘化開始後不久(www.translatingtime.org)，此反映FIH試驗的預期嬰兒族群。
從PND 22開始，每日對所有小鼠監測臨床症狀。選擇PND 22作為此評估之第一時間點是因為此為在Twitcher小鼠中可觀察到行為表型的最早日期之一。使用未發表的緊握能力、步態、震顫、駝背及毛皮品質之評估，對臨床症狀進行評分，詳如表1所示。這些量測有效評估Twitcher小鼠基於他們通常所呈現之症狀的臨床狀況，得分高於0表示臨床惡化。
表1.小鼠之臨床評分評估
評估類別 觀察 得分
後肢緊握 無緊握 0
非永久緊握 1
永久緊握 2
步態 正常 0
稍有異常的步態，但小鼠可容易且自發地移動 1
明顯異常的步態，自發活動性降低 2
向前移動非常困難，後腿拖行 3
震顫 正常 0
最小的震顫，僅當小鼠不動時可見 1
中度震顫，在靜止及移動時均為明顯，抽搐 2
明顯震顫及抽搐，在靜止及移動時均顯著。 3
脊柱彎曲 正常 0
輕度駝背(彎曲的脊柱)，但能完全拉直脊柱 1
駝背無法完全拉直脊柱；維持持續的輕度駝背 2
行走或坐著時維持明顯的駝背 3
毛皮品質 正常 0
任何異常 (不整齊、脫毛等) 1
使用此評估，在PND 12投予rAAVhu68.hGALC之早期-有症狀的Twitcher小鼠(twi/twi )顯示臨床得分接近0，其與野生型及未受影響的Twitcher異基因型合子(twi /+)的得分相當。相較之下，年齡相仿之經媒劑治療的Twitcher(twi/twi )小鼠在大部分時間過程中顯示出更高的評估分數，表明臨床表現惡化(圖11A)。
作為互補功能性分析，於PND 35進行旋轉桿測試以評估神經運動表型。在PND 12投予rAAVhu68.hGALC之早期-有症狀的Twitcher小鼠(twi/twi )相較於野生型及未受影響之Twitcher異基因型合子(twi /+)顯示出落下潛時，同時年齡相仿的經媒劑治療的Twitcher小鼠(twi/twi )顯示出明顯較短的落下潛時(p>0.05)，表明神經運動功能惡化(圖11B)。
為了確定在功能性終點上觀察到的rAAVhu68.hGALC給藥效益是否與組織學改善相關，所有小鼠均在PND 40時進行屍體剖檢，並以組織學檢查後肢坐骨神經。選擇PND 40作為屍體剖檢時間點是因為其為未經治療或經媒劑治療的Twitcher小鼠達到人道終點的大致年齡，且其為神經病理最嚴重的時間點。選擇坐骨神經用於組織學是因為與CNS相比，Twitcher小鼠中的周圍神經受脫髓鞘化的影響更大。此外，在病患中缺乏以HSCT對PNS的校正仍是嬰兒病患的主要未解決問題，因此檢測rAAVhu68.hGALC給藥對PNS的作用是值得關注的。
對坐骨神經部分進行處理，以觀察髓磷脂(深色染色)及球狀細胞(淺色染色)(圖12)。在PND 40，經媒劑治療的野生型對照組之坐骨神經富含髓磷脂，且通常沒有球狀細胞浸潤。然而，在經媒劑治療的有症狀的Twitcher小鼠(twi /twi )中，在坐骨神經中觀察到嚴重的不完全脫髓鞘化，伴隨神經增厚及球狀細胞的浸潤。相反地，在PND 12投予rAAVhu68.hGALC之有症狀的Twitcher小鼠(twi /twi )的坐骨神經中保存了皮質磷脂，儘管在程度上不及在年齡相仿野生型小鼠中通常觀察到的程度。與經媒劑治療的Twitcher小鼠相比，在rAAVhu68.hGALC處理的Twitcher小鼠的神經中亦觀察到較少的球狀細胞。這些數據與功能性終點相關，表明在疾病發展的早期，在投予rAAVhu68.hGALC的有症狀的Twitcher小鼠中改善的臨床得分及神經運動功能可能與逆轉或延遲潛在疾病的神經病理學發作有關。
最後，在屍體剖檢當天(PND 40)，從野生型及Twitcher小鼠(twi/twi )獲得腦、肝及血清樣品，以量化轉殖基因產物GALC的活性水平。使用基於螢光團的GALC活性分析法定量GALC，以證實在投予rAAVhu68.hGALC後，轉導AAV載體及表現功能性酵素。將野生型動物用作此分析的對照組，且排除Twitcher異基因型合子(twi /+)，因為儘管沒有可觀察之表型，但這些小鼠中的GALC活性水平降低。檢測大腦，因為神經系統是GALC遞送的目標組織，且檢測肝臟及血清以評估周圍器官系統的轉導。
以劑量為2.00 x 1011 GC之rAAVhu68.hGALC ICV投予後28天，在Twitcher (twi/twi )的腦、肝臟及血清中觀察到超生理水平的GALC活性，其高於經媒劑治療的Twitcher (twi/twi )小鼠及野生型對照組(圖13)之相同組織中所觀察到的水平(圖13)。
總之，數據證實，投予rAAVhu68.hGALC至早期有症狀的Twitcher小鼠會導致超生理水平的GALC活性，此與較少的嚴重臨床症狀、神經運動功能障礙、PNS脫髓鞘化及球狀細胞神經病理學相互關聯。
骨髓移植合併 rAAVhu68.hGALC 給藥的效果 此研究調查rAAVhu68.hGALC及骨髓移植(BMT)雙重療法的潛在效益。由於克拉培氏病顯著的神經炎症成分，因而探討此組合療法。理論上，具有協同作用，因為HSCT在CNS中提供GALC酵素的另一種來源(來自移植細胞所衍生之巨噬細胞/小神經膠質細胞及經rAAVhu68.hGALC轉化的神經元)，而rAAVhu68.hGALC可矯正PNS，不受HSCT的影響。此外，此研究亦審查不同的組合治療的設計以評估rAAVhu68.hGALC在以下病患中是否有效：1)先通過NBS方案接受HSCT，然後進行基因療法的病患，及/或2)如果符合條件，先接受基因療法然後接受HSCT的病患。
組合療法研究總結於表2。
表2.小鼠中AAV及BMT組合療法之研究
組別 基因型 N 治療 #1 時間點 治療 #2 時間點 基本原理
1 twi /twi 13 BMT PND 10 - - 評估BMT單一療法的功效
2 twi /twi 7 rAAVhu68.hGALC PND 0 BMT PND 10 在新生的症狀發生前的小鼠中評估以rAAVhu68.hGALC治療之後儘早進行BMT的療效
3 twi /twi 7 BMT PND 10 rAAVhu68.hGALC PND 12 評估BMT之後進行rAAVhu68.hGALC治療的療效；在先導實驗中，發現PND 10是BMT最早的時間點，因為硫酸布他卡因(busulfan)調理對重量小於4 g的小鼠有毒
4 twi /twi TBD rAAVhu68.hGALC PND 12 BMT PND 28 在疾病進展較晚階段的早期有症狀小鼠中評估rAAVhu68.hGALC治療之後進行BMT的療效
5 twi /twi 12 rAAVhu68.hGALC PND 0* - - 對照組： 在症狀發生前之小鼠中的rAAVhu68.hGALC單一療法
6 twi /twi 13 rAAVhu68.hGALC PND 12* - - 對照組： 在早期有症狀的小鼠中的rAAVhu68.hGALC單一療法
7 twi /twi 12 PBS * - - 對照組：僅以媒劑治療
  以劑量為1.00 x 1011 GC投予rAAVhu68.hGALC。 所有接受BMT的小鼠在BMT程序開始前1-2天亦以硫酸布他卡因進行完全骨髓抑制調理(myeloablative conditioning)，以減少內源性骨髓細胞的數量。 *歷史對照組用於這些組別，組別5是來自研究1的歷史對照組，組別6是來自研究2的歷史對照組，組別7是來自研究1 N=8隻小鼠(PND 0)與研究2 N=4隻小鼠(PND 12)所構成的歷史對照組。 縮寫：AAV，腺相關病毒；BMT，骨髓移植；GC，基因體拷貝數；PBS，磷酸鹽緩衝生理鹽水；PND，出生後天數；TBD，待確定。
使用1.00 x 1011 GC的rAAVhu68.hGALC劑量是因為預期由於組合療法所致之更好反應，該組合療法允許比先前rAAVhu68.hGALC單一療法研究中所使用更低的rAAVhu68.hGALC劑量。就存活、體重及神經系統觀察(例如，是否有震顫和異常緊握反射)方面評估rAAVhu68.hGALC的功效。
組別1-3的存活數據如圖14A–圖14B所示。迄今為止，症狀發生前的Twitcher小鼠(twi /twi )在PND 0以ICV投予rAAVhu68.hGALC治療之後在PND 10進行BMT的組合(組別2)上，可達到最佳的存活，在沒有明顯症狀下，存活延長至>300天。基於先前所述的臨床評估(表1)，這些小鼠呈現更好的身理狀況，顯示出輕微的震顫，沒有明顯的步態異常，亦無緊握(分析仍在進行；數據未顯示)。在rAAVhu68.hGALC之前接受BMT的小鼠(組別3)目前仍存活(N = 3/7)，但牠們顯示出明顯的震顫，某些步態異常和較低的體重。然而，硫酸布他卡因調理療法與BMT結合使用對10日齡以下的年輕小鼠具有毒害，且在組別2及3中的小鼠在BMT之前或之後不久均顯示出死亡率增加，而與組合療法的順序無關。組別4被注射以模仿將基因療法投予至早期有症狀的病患之後進行BMT的臨床相關情況。
總之，這些數據表明，在克拉培氏病的鼠類模型中，將rAAVhu68.hGALC治療與隨後的BMT結合可能比單獨的各種治療提供更高的效果。
實施例 3-Twitcher 小鼠模型中 rAAVhu68.GALC 之最小有效劑量 (MED) 的鑑定 MED研究是在Twitcher小鼠中使用針對非人類靈長類藥理毒物學研究生產的一批毒物學載體進行的，該研究包括至少兩個時間點，並評估四個劑量水平以確定MED、藥理學及組織病理學(功效和安全性)。根據前導劑量範圍研究和當提升至人類時的最大可行劑量選擇劑量水平。在PND 12將動物ICV注射以模仿早期有症狀的病患，注射後一個月後(當用媒劑治療達到人道終點時)犧牲一些動物，以獲得與年齡相仿對照組相比較的藥理學和功效讀數(與研究3相似設計)，其餘的小鼠被追踪直至人道終點，以評估治療對於存活的影響。對於小鼠的治療及基因型，研究人員進行盲測生活評估(in-life evaluation)(體重，臨床評分和旋轉桿分析)。
MED是根據生存效益、臨床評分、體重、使用旋轉桿分析之神經運動功能、目標器官中GALC活性水平及CNS及PNS中之神經病理學矯正(即，改善的髓鞘化、減少球狀細胞浸潤)的分析而確定的。
研究設計和研究時間表如下表3及表4所示。
表3.鼠類MED研究設計
組別 # 治療 ( 劑量 ) 受影響小鼠 (twi /twi ) (N) WT 小鼠 (+/+) (N) 生活評估 犧牲： 基線 PND 12-14 犧牲： 注射後 PND 40-42 日 (N) 犧牲： 人道終點 (N)
1 無 6 - ●無 6(twi /twi ) ；6 (+/+) N/A N/A
2 無 - 6
3 媒劑 (人工CSF ITFFB) 16 - ●每日觀察 ●體重3x/週 ●臨床得分3x/週 ●於PND35-37之旋轉桿 N/A 8 (twi /twi ) 8 (twi /twi )
4 媒劑 (人工CSF ITFFB) - 10 N/A 5 (+/+) 5 (+/+)
5 rAAVhu68.hGALC 2.00 x 1011 GC 16 - N/A 8 8
6 rAAVhu68.hGALC 6.80 x 1010 GC 16 - N/A 8 8
7 rAAVhu68.hGALC 2.00 x 1010 GC 16 - N/A 8 8
8 rAAVhu68.hGALC 6.80 x 109 GC 16 - N/A 8 8
縮寫：CSF，腦脊髓液；N，動物數量；WT，野生型；ITFFV，鞘內最終調配緩衝液 (ITFFB)
表4.研究時間表
研究日 樣本 / 程序                
組別 1 組別 2 組別 3 組別 4 組別 5 組別 6 組別 7 組別 8
PND 1- PND 7 微紋身識別 數窩
基因分型 數窩
PND 12-14 ICV注射 - - 16 (twi /twi ) 10 +/+ 16 (twi /twi ) 16 (twi /twi ) 16 (twi /twi ) 16 (twi /twi )
屍體剖檢 6 (twi /twi ) 6 +/+ - - - - - -
PND 12-14 – 研究終了 每日觀察 和生存監測 - - 16 (twi /twi ) 10 +/+ 16 (twi /twi ) 16 (twi /twi ) 16 (twi /twi ) 16 (twi /twi )
PND 21-28 斷奶 - - 16 10 16 16 16 16
基因分型確認 - - 16 10 16 16 16 16
微晶片識別 - - 16 10 16 16 16 16
斷奶 – 學習結束 3 x/週體重和 神經系統檢查 - - 16 10 16 16 16 16
PND 35-37 旋轉桿 - - 16 10 16 16 16 16
頜下採血 - - 16 10 16 16 16 16
PND 40-42 屍體剖檢 - - 8 5 8 8 8 8
生存追蹤 屍體剖檢 人道終點 - - 8 5 8 8 8 8
實施例 4- 經 AAV 調控之基因療法治療克拉培氏病的犬隻之功效 -rAAVhu68.CB7.CI.cGALCco.rBG 經小腦延髓池注射 雖然Twitcher小鼠是一種訊息豐富的疾病模型，但具有一些局限性。小鼠僅顯示出輕度的CNS涉入，此與嬰兒克拉培氏病病患不同，嬰兒克拉培氏病病患表現出更嚴重的腦萎縮之脫髓鞘化CNS特徵。此外，小鼠的小尺寸在實驗上帶來挑戰。在小鼠中必須使用ICV路徑，因為它們的體積小，難以藉由預期的臨床路徑(ICM)可靠地注射AAV載體。也無法從對於所有所需的藥理分析的小鼠獲得足夠量的CSF和血液連續樣本。因此，在較大的動物，克拉培氏病的犬隻模型中評估以rAAVhu68.GALC之治療，該動物可克服這些技術限制並證實治療方法的可擴展性。
如同Twitcher小鼠，克拉培氏病的犬隻是一種自然發生的體染色體隱性疾病模型，源於導致誤義突變(Y158S)的GALC基因中的自發性A到C突變。突變體GALC蛋白質具有接近0%的殘留酵素活性，這與在以克拉培氏病嬰兒型病患中所觀察到的GALC活性水平相似，儘管異基因型組合的犬隻不顯示症狀，但同基因型組合的突變犬隻卻會受到影響。
克拉培氏病的犬隻表現出與嬰兒克拉培氏病相似的嚴重表型，如表5所示。克拉培氏病的犬隻表型進展不及Twitcher小鼠，但受影響的克拉培氏病的犬隻表現出脫髓鞘化及影響CNS和周圍神經的球狀細胞蓄積。牠們在大約4–6週齡時發展出後肢無力、前肢發育不良及震顫，如同嬰兒克拉培氏病病患，克拉培氏病的犬隻在症狀發作後表現出持續且快速的神經系統惡化。最終，這些症狀在15週齡左右進展到特徵為嚴重共濟失調、骨盆麻痺、消瘦、尿失禁及感覺缺陷為的人道終點(Fletcher T.F. & Kurtz H.J. (1972) Am J Pathol. 66(2)：375-8；Wenger D.A. (2000) Molec Med Today. 6(11)：449-451；Bradbury A.M., et al. (2018) Hum Gene Ther. 29(7)：785-801)。
表5.克拉培氏病之鼠類及犬隻模型以及與人類早期嬰兒表現的比較
  突變 GALC 活性水平 呈現症狀及演變 病理學  
Twitcher小鼠 鼠類： G.A1017 (W339X) 小於正常之10% ●於18–22日時抽搐、後肢無力 ●於40–45日時嚴重體重減輕及麻痺 PNS>CNS  
克拉培氏病 的犬隻 犬：A.C 473 (Y158S) 小於正常之10% ●於於4–6週時前肢發育不良、後肢無力、震顫 ●在約15週時後肢麻痺、嚴重共濟失調、消瘦、尿失禁、感覺障礙 PNS及CNS  
人類早期嬰兒 克拉培氏病 各式各樣，最常見的為在插入子10附近開始的30 kb刪除 (502T/del) 小於正常之10% ●6月齡前出現煩躁、痙攣、吞嚥困難 ●新的里程碑獲得的退化和缺乏、失聰、失明、癲癇、兩年前死亡 PNS及CNS  
縮寫 ：A，腺嘌呤；C，胞嘧啶；CNS，中樞神經系統；G，鳥嘌呤；GALC，半乳糖基神經醯胺酶；kb，千鹼基；PNS，周圍神經系統；W339X，在位置339色胺酸變成終止密碼子；Y158S，在位置158酪胺酸取代為絲胺酸。
此研究之目的為藉由在大型動物疾病模型中評估類似於rAAVhu68.hGALC的AAV載體的功效來評價本案治療途徑的可擴充性。為完成此目的，利用克拉培氏病自然發生之犬隻模型，該模型界由預定的臨床途徑(ICM)投予類似於可編碼GALC 的工程化犬版本的rAAVhu68.hGALC (AAVhu68.CB7.CI.cGALCco.rBG)的載體(圖3)。選擇GALC 的犬版本作為轉殖基因以便限制對外來轉殖基因過度免疫反應的風險，但該載體的其它成分相當於rAAVhu68.hGALC (包括普遍存在的CB7啟動子及AAVhu68衣殼)。
研究設計提供於圖23，將犬 (共N=7)於2–3週齡ICM注射劑量為3.00 x 1013 GC (N=4之受影響犬隻)的GALC -表現AAV載體或媒劑(人工CSF；N=2之受影響犬隻；N=1健康野生型同窩仔犬)。選擇動物的年齡以確保在行為症狀發作前儘早對犬隻進行治療，因為發現rAAVhu68.hGALC在症狀發生前的Twitcher小鼠中比在有症狀小鼠而在稍後時間點治療更為有效(參見實施例2)。
組別指定
組別指定 1 2 3
每組動物數量 1 3 1
性別 M或F M或F M或F
治療 人工CSF AAVhu68.CB7.CI. cGALCco.rBG 人工CSF
ROA ICM ICM ICM
屍體剖檢日 第70日或人道終點 在與組別1相同時間點將1隻實施安樂死，並在第180天將二隻實施安樂死 第180日
投劑後，每天監測動物(籠側觀察)、每週稱重、每兩週錄像一次。牠們還接受腦部MRI檢查，並定期接受完整的體檢、神經檢查、神經傳導記錄及BAER記錄。這些檢查的目的為評估CNS和PNS的完整性。功效讀數包括腦髓鞘化(藉由注射後8週之MRI、BAER及末端終點的組織學評估)、周圍神經髓鞘化(藉由在末端終點的NCV及組織學評估)、神經檢查及體檢(體重、步態、反射，本體感覺、每兩週在空曠地區狗遊玩之的錄像)。此外，評估藥理學、安全性及載體生物分佈，因為所注射的載體與rAAVhu68.hGALC相當，並使用所欲之臨床ROA(ICM投予)。神經傳導評估測量神經的完整性，作為髓磷脂完整性的間接測量。BAER記錄與NCV相似，除了其檢測CNS(即腦幹)之聽覺路徑中的傳導及髓磷脂完整性。安全性讀數包括注射前第0日以及第14、28、56、70、120及180日(每次±2天)的定期細胞血液計數(CBC)、血清化學及凝血。當體積允許調查疾病矯正(脂質體學、鞘胺醇半乳糖苷濃度)及WBC計數(腦脊髓液細胞增多)作為安全讀數時，亦對CSF進行脂質體生物標記分析及細胞計數。在第56日，藉由MRI(T1和T2加權)檢測犬隻以觀察CNS中樞神經系統的髓鞘化。在以下指出的時間點的CSF及血清基線，評估GALC的酵素活性以測量CNS及PNS中所分泌的活性治療性酵素的量。選擇用於各分析的研究天數，以便最小化動物的鎮靜作用，同時在適當時間點收集完整的數據，該時間點對應於在犬隻中的已知克拉培氏病之進展(圖15)。
收集血液及CSF用於安全性及生物標記分析。取樣組織的完整列表用於組織病理學以確定投予rAAVhu68.hGALC是否能減少脫髓鞘化及神經炎，藉由生物分佈評估rAAVhu68.hGALC的轉導及表現。GALC酶素活性讀數(圖24B及圖24C)指出，所有經治療的克拉培氏病犬隻皆有快速的酵素分泌進入CSF。
在症狀發生前的克拉培氏病犬隻中，rAAVhu68.cGALC以3.00 x 1013 GC單一小腦延髓池注射提供表型矯正(圖25E)、存活增加(圖24A)、神經傳導正常化(圖25A - 圖25D)、正常的血液檢查及改善的腦MRI(圖29A及圖29B)，證實該途徑的可擴展性。相對於對照組，在rAAVhu68.cGALC克拉培氏病犬隻中腦組織學顯示改善的髓鞘化(圖26A)及降低神經炎(小腦白質中的IBA1染色)(圖26B)，在此研究中最初投予GALC表現載體或媒劑的犬隻皆未發生不良事件。投予rAAVhu68.cGALC之克拉培氏病犬隻呈現正常生長(圖27)，且基於沒有CSF腦脊髓液細胞增多(圖28A)及組織病理學損傷(圖28B)，在六個月時未觀察到毒性。經媒劑治療的犬隻於8及12週必須進行安樂死是由於克拉培氏病的進展，包括後肢嚴重輕癱、尿失禁、頭部震顫及妨礙活動之共濟失調。注射後超過45週，所有經載體治療的犬隻均顯得光亮、機敏且無症狀，並且均已超過克拉培氏病犬隻的最大預期壽命。
研究時間表及終點在下表6中列出。
表 6
研究日 樣本 / 程序 組別 1 組別 2 組別 3
PND 0-7 基因型 1 3 1
PND 14-21 研究日 0 ICM媒劑 1 - 1
ICM AAVHu68.CB7.cGALC - 3 -
CSF (200ul用於酵素活性及200ul用於脂質) 1 3 1
用於基線酵素及免疫學的血清最高200 uL 1 3 1
CBC/化學/凝血(依據血液體積理出優先順序：1=化學，2=CBC，3=凝血) 1 3 1
研究日 0- 研究終了 每日籠側觀察 1 3 1
每週體重 1 3 1
第 14 日 (± 1 日 ) CSF (200ul用於酵素活性，300至500 uL用於細胞計數及細胞學) 1 3 1
用於酵素及免疫學的血清最高300 uL 1 3 1
CBC/化學/凝血(依據血液體積理出優先順序：1=化學，2=CBC，3=凝血) 1 3 1
第 28 日 (± 2 日 ) CSF (200ul用於酵素活性，200 uL用於脂質、細胞計數，300至500 uL用於細胞計數及細胞學) 1 3 1
用於酵素及免疫學的血清最高400 uL 1 3 1
CBC/化學/凝血(依據血液體積理出優先順序：1=化學，2=CBC，3=凝血) 1 3 1
身體及神經檢查 1 3 1
NCV 1 3 1
第 56 日 (± 2 日 ) 以T1和T2加權的MRI 1.5 特斯拉大腦 1 3 1
第 70 日 (± 3 日或人道終點組別 1 ，如果需要，早於第 70 日 CSF (200ul用於酵素活性，200 uL用於脂質、細胞計數，300至500 uL用於細胞計數及細胞學) 1 3 1
用於酵素及免疫學的血清最高400 uL 1 3 1
CBC/化學/凝血 1 3 1
身體及神經檢查 1 3 1
NCV 1 3 1
BAER 1 3 1
第 70 日 (± 3 日或人道終點組別 1 ，如果需要，早於第 70 日 屍體剖檢 1 1 -
第 120 日 (±3 日 ) CSF (200ul用於酵素活性，200 uL用於脂質、細胞計數，300至500 uL用於細胞計數及細胞學) - 2 1
用於酵素及免疫學的血清最高400 uL - 2 1
CBC/化學/凝血 - 2 1
身體及神經檢查 - 2 1
NCV - 2 1
第 180 日 (±3 日 ) CSF (200ul用於酵素活性，200 uL用於脂質、細胞計數，300至500 uL用於細胞計數及細胞學) - 2 1
用於酵素及免疫學的血清最高400 uL - 2 1
CBC/化學/凝血 - 2 1
身體及神經檢查 - 2 1
NCV - 2 1
BAER - 2 1
屍體剖檢 - 2 1
實施例 5- 於非人類靈長類中之毒物學研究 使用如小鼠MED研究相同的rAAVhu68.hGALC載體進行毒物學研究，並在NHP中進行研究，因為它們可更佳地複製人類的大小及CNS解剖學，並可使用臨床ROA(ICM)進行治療。可預期的是，在大小、解剖學及ROA上的相似性會造成代表性的載體分佈及轉導輪廓，其可允許比可能在小鼠或犬隻中更準確地評估毒性。此外，與囓齒動物或犬隻模型相比，在NHP中可進行更嚴謹的神經學評估，允許更靈敏地檢測CNS毒性。
ICM載體投予導致CSF腔室內立即分佈載體，劑量等比於腦質量，可提供CSF腔室大小的近似值。劑量轉換基於新生小鼠的0.15 g腦質量(Gu Z., et al. (2012) PLoS One. 7(7)：e41542.)、少年-成年小鼠的0.4 g腦質量(Gu Z., et al. (2012) PLoS One. 7(7)：e41542.)、少年及成年恒河猴的90 g腦質量(Herndon J.G., et al. (1998) Neurobiol Aging. 19(3)：267-72)、犬隻的60 g腦質量、4–12月齡嬰兒的800 g腦質量及成年人類的1300 g腦質量(Dekaban A.S. (1978) Ann Neurol. 4(4)：345-56)。用於NHP毒物學研究、鼠類MED研究的劑量及等效的人類劑量顯示於表7。
表7.用於鼠類MED研究、NHP毒物學研究的載體劑量及等效犬及人類劑量：
劑量 (GC/g 腦質量 ) 少年小鼠 MED 研究 (GC) 少年 NHP 毒物學研究 (GC) 犬 (GC) 人類 (GC)
5.00 x 1011 2.00 x 1011 4.50 x 1013 3.00 x 1013 4.00 x 1014
1.70 x 1011 6.80 x 1010 1.50 x 1013 - 1.40 x 1014
5.00 x 1010 2.00 x 1010 4.50 x 1012 - 4.00 x 1013
1.70 x 1010 6.80 x 109 - - 1.40 x 1013
縮寫：GC，基因體拷貝數；MED，最小有效劑量；NHP，非人類靈長類。
依據疾病目標選擇少年恒河猴，以便在解剖學上相似於擬議之1/2期研究人群。NHP毒物學研究的劑量反映1/2期臨床研究中使用的劑量，且選擇時需考慮：1)藥理研究的結果，及2)考慮最大可行劑量，將藥理研究的劑量轉換成NHP及人類劑量。
因此，在成年恒河猴中進行180天符合GLP的安全性研究，以探討投予ICM後rAAVhu68.CB7.CI.cGALCco.rBG(rAAVhu68.hGALC)的毒物學。180天評估期是因為這樣可使ICM AAV投予後有足夠的時間使分泌的轉殖基因產物達到穩定的高原水平。研究設計概述於表8和表9，少年恒河猴(約1.5歲)接受總計4.50 x 1012 GC或總計1.50 x 1013 GC (或媒劑)。當按大腦質量(假設少年-成年小鼠0.4 g、恒河猴90 g)換算時，選擇劑量水平相當於MED研究中所評估的那些，高劑量相當於在克拉培氏病犬隻模型(假設大腦質量60 g)中所評估之劑量。進行基線神經系統檢查、臨床病理學(細胞差別計數、臨床化學和凝血操作盤)、CSF化學及CSF細胞學檢查，投予載體(或媒劑)後，每日監測動物的不適及異常行為跡象。
投予載體或媒劑後及在此之後每30日，每週進行30天的血液和CSF臨床病理學評估及神經系統檢查。在基線及之後的每30天時間，藉由干擾素γ(IFN-γ)酶聯免疫斑點法(ELISpot)分析來評估抗AAVhu68 NAbs及胞毒型T淋巴球(CTL)對AAVhu68及GALC產物的反應。
在投予rAAVhu68.hGALC或媒劑後90日或180日，將動物安樂死，並收集組織進行全面性顯微組織病理學檢查。組織病理學檢測聚焦於CNS組織(大腦、脊髓及背根神經節)和肝臟，因為它們是ICM投予rAAVhu68載體後最多經轉導的組織。此外，屍體剖檢時，從體循環(PBMC)、脾臟及和CNS-引流淋巴結中收集淋巴細胞以評估這些器官中對衣殼及轉殖基因產物皆有反應的T細胞的存在。如果發現需要進一步分析載體生物分佈，則對組織進行收集和保存。
表8.恒河猴GLP毒物學研究(組別指定)
組別指定 1 2 3 4 5 6 7 8
rAAVhu68.hGALC /ITFFB ITFFB rAAV rAAV rAAV ITFFB rAAV rAAV rAAV
劑量 (GC) N/A 4.5.0x1012 1.5x1013 4.5.0x1013 NA 4.5.0x1012 1.5x1013 4.5.0x1013
獼猴數量 1 3 3 3 1 3 3 3
性別 任一 二者 二者 二者 任一 二者 二者 二者
ROA ICM ICM ICM ICM ICM ICM ICM ICM
屍體剖檢日 90±4 90±4 90±4 90±4 180±5 180±5 180±5 180±5
縮寫：F，雌性；GLP，優良實驗室操作規範；ICM，小腦延髓池內；M，雄性；NA，不適用；ROA，給藥途徑。
表9.恒河猴研究時間表
研究時點 樣本 / 程序 組別 1 a 組別 2 a 組別 3 a 組別 4 a 組別 5 a 組別 6 a 組別 7 a 組別 8 a
                   
基線-最多至投劑前28天 體重、體溫、呼吸頻率、心率 1 3 3 3 1 3 3 3
神經學監測 1 3 3 3 1 3 3 3
生物標記-血液(基線) 1 3 3 3 1 3 3 3
Clin Path (基線)b 1 3 3 3 1 3 3 3
NAb (基線) 1 3 3 3 1 3 3 3
免疫學-ELISPOT(基線) (PBMC) 1 3 3 3 1 3 3 3
載體排泄 (尿液、糞便) 1 3 3 3 1 3 3 3
神經傳導速度測試 1 3 3 3 1 3 3 3
                   
研究第0日 體重、體溫、呼吸頻率、心率 1 3 3 3 1 3 3 3
Clin Pathb 1 3 3 3 1 3 3 3
CSFc 1 3 3 3 1 3 3 3
載體PK CSF 1 3 3 3 1 3 3 3
載體PK血液 1 3 3 3 1 3 3 3
ITFFB ICM 1 -- -- -- 1 -- -- --
GTP-206，4.5.0x1012 GC，ICM -- 3 -- -- -- 3 -- --
GTP-206，1.5x1013 GC，ICM -- -- 3 -- -- -- 3 --
GTP-206，4.5x1013 GC，ICM -- -- -- 3 -- -- -- 3
                   
研究第5日 (±2日) 載體排泄 (尿液、糞便) 1 3 3 3 1 3 3 3
研究時點 樣本 / 程序 組別 1 a 組別 2 a 組別 3 a 組別 4 a 組別 5 a 組別 6 a 組別 7 a 組別 8 a
                   
研究第7日 (±1日) 體重、體溫、呼吸頻率、心率 1 3 3 3 1 3 3 3
Clin Pathb 1 3 3 3 1 3 3 3
CSFc 1 3 3 3 1 3 3 3
載體PK CSF 1 3 3 3 1 3 3 3
載體PK 血液 1 3 3 3 1 3 3 3
                   
研究第14日 (±2日) 體重、體溫、呼吸頻率、心率 1 3 3 3 1 3 3 3
神經學監測 1 3 3 3 1 3 3 3
生物標記-血液 1 3 3 3 1 3 3 3
Clin Pathb 1 3 3 3 1 3 3 3
CSFc 1 3 3 3 1 3 3 3
載體PK CSF 1 3 3 3 1 3 3 3
載體PK 血液 1 3 3 3 1 3 3 3
                   
研究第28日 (±3日) 體重、體溫、呼吸頻率、心率 1 3 3 3 1 3 3 3
神經學監測 1 3 3 3 1 3 3 3
生物標記-血液 1 3 3 3 1 3 3 3
Clin Pathb 1 3 3 3 1 3 3 3
CSFc 1 3 3 3 1 3 3 3
載體PK血液 1 3 3 3 1 3 3 3
載體PK CSF 1 3 3 3 1 3 3 3
免疫學-ELISPOT (PBMC) 1 3 3 3 1 3 3 3
NAb 1 3 3 3 1 3 3 3
載體排泄 (尿液、糞便) 1 3 3 3 1 3 3 3
神經傳導速度測試 1 3 3 3 1 3 3 3
研究時點 樣本 / 程序 組別 1 a 組別 2 a 組別 3 a 組別 4 a 組別 5 a 組別 6 a 組別 7 a 組別 8 a
                   
研究第60日 (±3日) 體重、體溫、呼吸頻率、心率 1 3 3 3 1 3 3 3
神經學監測 1 3 3 3 1 3 3 3
生物標記-血液 1 3 3 3 1 3 3 3
Clin Pathb 1 3 3 3 1 3 3 3
CSFc 1 3 3 3 1 3 3 3
載體PK CSF 1 3 3 3 1 3 3 3
載體PK血液 1 3 3 3 1 3 3 3
NAb 1 3 3 3 1 3 3 3
免疫學-ELISPOT (PBMC) 1 3 3 3 1 3 3 3
載體排泄 (尿液、糞便) 1 3 3 3 1 3 3 3
神經傳導速度測試 1 3 3 3 1 3 3 3
                   
研究第90日 (±4日) 體重、體溫、呼吸頻率、心率 1 3 3 3 1 3 3 3
神經學監測 1 3 3 3 1 3 3 3
生物標記-血液 1 3 3 3 1 3 3 3
Clin Pathb 1 3 3 3 1 3 3 3
CSFc 1 3 3 3 1 3 3 3
載體PK CSF 1 3 3 3 1 3 3 3
載體PK 血液 1 3 3 3 1 3 3 3
NAb 1 3 3 3 1 3 3 3
免疫學-ELISPOT (PBMC) 1 3 3 3 1 3 3 3
載體排泄 (尿液、糞便) 1 3 3 3 1 3 3 3
神經傳導速度測試 1 3 3 3 1 3 3 3
屍體剖檢 1 3 3 3 -- -- -- --
                   
研究第120日 (±4日) 體重、體溫、呼吸頻率、心率 -- -- -- -- 1 3 3 3
神經學監測 -- -- -- -- 1 3 3 3
生物標記-血液 -- -- -- -- 1 3 3 3
Clin Pathb -- -- -- -- 1 3 3 3
CSFc -- -- -- -- 1 3 3 3
NAb -- -- -- -- 1 3 3 3
免疫學-ELISPOT (PBMC) -- -- -- -- 1 3 3 3
載體排泄 (尿液、糞便) -- -- -- -- 1 3 3 3
神經傳導速度測試 -- -- -- -- 1 3 3 3
                   
研究第150日 (±4日) 體重、體溫、呼吸頻率、心率 -- -- -- -- 1 3 3 3
神經學監測 -- -- -- -- 1 3 3 3
生物標記-血液 -- -- -- -- 1 3 3 3
Clin Pathb -- -- -- -- 1 3 3 3
CSFc -- -- -- -- 1 3 3 3
NAb -- -- -- -- 1 3 3 3
免疫學-ELISPOT (PBMC) -- -- -- -- 1 3 3 3
載體排泄 (尿液、糞便) -- -- -- -- 1 3 3 3
神經傳導速度測試 -- -- -- -- 1 3 3 3
                   
研究第180日 (±5日) 體重、體溫、呼吸頻率、心率 -- -- -- -- 1 3 3 3
神經學監測 -- -- -- -- 1 3 3 3
生物標記-血液 -- -- -- -- 1 3 3 3
Clin Pathb -- -- -- -- 1 3 3 3
CSFc -- -- -- -- 1 3 3 3
NAb -- -- -- -- 1 3 3 3
載體PK CSF -- -- -- -- 1 3 3 3
載體PK 血液 -- -- -- -- 1 3 3 3
免疫學-ELISPOT (PBMC) -- -- -- -- 1 3 3 3
載體排泄 (尿液、糞便) -- -- -- -- 1 3 3 3
神經傳導速度測試 -- -- -- -- 1 3 3 3
屍體剖檢 -- -- -- -- 1 3 3 3
a 動物數量評估b 包括完整血液計數及差異(血液學)、臨床化學和凝血操作盤c 包括臨床病理學和生物標記 縮寫：Nab，中和抗體；PBMC，周圍血液單核細胞；CSF，腦脊髓液；Clin Path，臨床路徑；PK，藥物動力學
實施例 6- 以 rAAVhu68.hGALC 治療克拉培氏病 FIH試驗為單一ICM投予rAAVhu68.hGALC之1/2期劑量遞增研究，其在患有嬰兒型克拉培氏病(由在GALC 基因上的同基因型組合或複合異基因型組合的突變所引起)的小兒病患中進行。此項FIH試驗招募並治療了至少12位受試者，其等接受2年追蹤，並在給藥後持續進行5年的長期追踪(LTFU)，符合對於腺病毒載體的推薦LTFU，敘述於草案「FDA Guidance for Industry：Long Term Follow-Up after Administration of Human Gene Therapy Products」 (2018年7月)。主要目標是評估rAAVhu68.hGALC的安全性和耐受性。此研究的次要目標是評估rAAVhu68.hGALC對疾病相關評估的影響，包括存活、適當年齡的神經認知測量及適當年齡的運動及/或語言評估。在與疾病專家和臨床醫生協商及基於在未治療的患有嬰兒克拉培氏病的病患中觀察到的疾病演變來選擇這些終點。
可選擇地，可評估HSCT與AAV基因療法的組合療法。
FIH是rAAVhu68.hGALC的開放性、多中心、劑量遞增研究，以評估患有嬰兒型克拉培氏病小兒受試者中的安全性、耐受性及探究的功效終點。劑量遞增階段評估以受試者的交錯順序投劑，單一ICM投予兩個劑量水平的rAAVhu68.hGALC的安全性和耐受性。rAAVhu68.hGALC劑量水平是根據GLP NHP毒物學研究及鼠類(MED)研究的數據確定的，且由低劑量(投予群體1)及高劑量(投予群體2)所組成。兩個劑量水平被預期都將帶來治療效益，但應理解，如果可以忍受，則預期較高劑量是有利的。依次評估低劑量和高劑量可確定所測試劑量的最大耐受劑量(MTD)。最後，擴充的群體(群體3)接受MTD的rAAVhu68.hGALC (圖16)。投予載體後(治療後1週)快速產生GALC酵素，提供擴展的治療窗口。
由於嬰兒克拉培氏病的特徵為一旦症狀出現，疾病會迅速發作，並且考慮到一些新生兒在出生時就出現疾病徵兆，因此根據調查人員對受試者的效益風險評估，擬議的研究設計允許對於在群體1(低劑量)和群體2(高劑量)中第一病患給藥後30天同時招募受試者。這樣做的理由是，由於病患經歷的疾病進展而錯過治療窗口的風險將超過對下一位患者給藥之前延長安全追踪的潛在益處。通過紐約NBS識別出的EIKD病患中，觀察到病患在數週之內出現實質性疾病進展的這種情況可能是導致移植結果不良的可能原因(Wasserstein M.P., et al. (2016) Genet Med. 18(12)：1235-1243)，強調需要及時轉診病患進行治療。
獨立安全委員會將對所有群體之間及第二群體完全登錄後的所有累積安全性數據進行安全審查，對於關於試驗的進一步進行提出建議。每當發現安全審核觸發因素(SRT)時，安全委員會每次都會進行複查。每個群體中第一及第二受試者之間的1個月給藥間隔可用於評估顯示急性免疫反應、免疫原性或其它劑量限制性毒性及任何感覺神經病變之臨床複查的AE，該感覺神經病變可能與DRG轉導繼發的感覺神經病理學發展的預期時間一致，其在非臨床研究中發生在2-4週內。
額外受試者登錄接受MTD的擴充的群體。登錄這些額外的受試者並不需要受試者之間有4週的觀察窗(圖16)。可選擇地，此群體接受HSCT與rAAVhu68.hGALC的組合治療。
追蹤所有受治療的受試者2年以評估安全性輪廓，並特徵化rAAVhu68.hGALC的藥效和功效。在研究的LTFU期間，再追蹤受試者3年(給藥後共計5年)以評估長期臨床療效，其符合草案「FDA Guidance for Industry：Long Term Follow-Up after Administration of Human Gene Therapy Products」 (2018年7月)。
表10.首次於人類臨床試驗之議定書綱要
議定書名稱： 1/2期開放性、多中心、劑量遞增研究以評估單一劑量rAAVhu68.hGALC遞送至患有嬰兒球狀細胞白血質障礙(克拉培氏病)之小兒受試者的小腦延髓池(ICM)中的安全性和耐受性
受試者數量： 最多至12個可評估之受試者
目標： 主要： 投予單一ICM劑量經24個月後，經由評估下列以評價rAAVhu68.hGALC之安全性及耐受性： ○  不良事件 (AEs)及嚴重不良事件 (SAEs) ○  生命跡象及身體檢查 ○  神經檢查 ○  心電圖(ECG) ○  感覺神經傳導研究 (用於評估DRG毒性) ○  實驗室評估(血清化學、血液學、凝血研究、肝功能檢查(LFTs)、尿液分析及CSF化學及細胞學) ○  載體及轉殖基因產物的免疫原性  次要 ( 探索功效 ): ●  投予單一ICM劑量後超過2年，基於以下端點評價rAAVhu68.hGALC的藥效學及生物活性： ○   CSF及血清中GALC之水平   ●  投予單一ICM劑量經2年後，經量測下列以評價rAAVhu68.hGALC之功效： ○  存活 ○  疾病進展，藉由達成時的年齡、失去時的年齡及維持或取得適於年齡發展里程碑的兒童百分比評價 ○  疾病進展，藉由達成時的年齡、失去時的年齡及維持動作里程碑(由WHO標準定義)的受試者百分比和疾病分期進展的受試者百分比評價。  探索： ●  為了進一步評估單一ICM劑量後2年rAAVhu68.hGALC的功效，如以下量測： ○  藉由癲癇發作日記評估癲癇發作年齡和發作頻率 ○  臨床結果，藉由貝里量表(BSID-III)或穆林早期學習量表 (依據受試者年齡)、文蘭德適應行為量表(第三版)、皮巴迪動作發展量表、嬰幼兒生活品質問卷評價   ●  為了進一步評估單一ICM劑量後經過24個月rAAVhu68.hGALC的藥效學作用，如以下量測： ○  中樞神經系統髓鞘化藉由MRI及DT-MRI量測 ○  腓深神經、脛骨神經、尺骨神經、腓腸神經、正中神經的神經傳導速度(NCV)測量(以評價感覺及運動神經周圍神經病變) ○  視覺誘發電位(VEP) ○  腦幹聽覺誘發反應(BAER) ○  疾病之CSF及血漿/血清生物標記，包括鞘胺醇半乳糖苷及其它
研究設計： 藉由單一ICM注射投予rAAVhu68.hGALC於患有嬰兒克拉培氏病之小兒受試者之1/2期、FIH、多中心、開放性、單臂、劑量遞增研究。在2年內評估安全性和耐受性、藥效學和臨床功效，並在投予rAAVhu68.hGALC後追蹤5年，對所有受試者進行安全性和耐受性、藥效學、疾病進展及臨床結果的長期評估。研究設計如圖16所示。該研究包括篩選階段以確定從大約第35天前到第1天前的每個潛在受試者的資格。在確認受試者的資格和父母/監護人願意讓他們的孩子參與研究的意願後，受試者將接受基礎評估，包括腦部磁振造影 (MRI)、腦脊髓液(CSF)採集之腰椎穿刺(LP)、抽血、尿液採集、肺活量、ECG、體檢、神經學檢查及臨床評估。基礎評估發生在第1天前及第0天，且給予rAAVhu68.hGALC前，應在基線再次確認是否合格。在治療階段，受試者在第0天早晨入院，受試者在第0天接受單一ICM劑量的rAAVhu68.hGALC，並在給藥後留院觀察至少24小時。後續研究訪視是在給藥後第7天、第14天、第30天、3個月及6個月，然後在投劑後的前2年每6個月一次，如略述於圖18A-18C。以每12個月一次頻率LTFU訪視額外3年，至投劑後5年。 該研究由以單一ICM注射投予rAAVhu68.hGALC的三個群體組成： ● 群體 1( 低劑量 ) ：依次登錄三名合格受試者(受試者#1至#3)，並投予低劑量的rAAVhu68.hGALC，第一及第二位受試者之間有4週的安全觀察期。若未觀察到安全審核觸發因素(SRT)，則在群體1中的第三名受試者投予rAAVhu68.hGALC後4週，由安全委員會評估所有可用的安全數據。 ● 群體 2( 高劑量 ) ：若決定繼續進行，則依次登錄三名合格受試者(受試者#4至#6)，並在第4及第5名受試者之間進行4週安全觀察期的情況下，投予高劑量的rAAVhu68.hGALC。若未觀察到SRT，則在向第三名受試者群體2投予rAAVhu68.hGALC後4週，由安全委員會評估所有可用的安全性數據，包括群體1中受試者的安全性數據。 ● 群體 3(MTD) ： 在安全委員會提出正面建議之前，招募另外6名受試者(受試者#7至#12)，並以MTD投予單一ICM劑量的rAAVhu68.hGALC。在每位受試者之間的4週安全觀察期內，對於此群體中之受試者給藥並未錯開，且在此群體中前三位受試者給藥後，無需安全委員會審查。 總之，預期高劑量或低劑量群體中總共登記9名受試者，總共登記12位受試者(所有劑量)。
入選標準： 1.投劑時大於1月齡 2.克拉培氏病的診斷藉由低GALC活性、高鞘胺醇半乳糖苷水平及同基因型組合或複合異基因型組合的GALC缺失或突變的遺傳文件紀錄確認 3.登錄於群體1或群體2的受試者在9月齡之前已紀錄症狀發作 4.登錄於群體3的受試者必須具有以下之一： a) 在9月齡之前紀錄症狀發作，或 b) 為症狀發生前且具有已確診為克拉培氏病並在9月齡前已出現症狀的兄弟姐妹，或已經NBS確定且基於對NBS、診斷及治療的一致性規範診斷為IKD (Kwon J.M., et al. (2018) Orphanet J Rare Dis. 13(1)：30)
排除標準： 1.在群體1及群體2中的受試者：先前的HSCT具有供體來源的殘留細胞的證據 2.受試者呈現下列任何症狀的晚期疾病： ●  失聰 ●  失明 ●  嚴重虛弱，失去原始反射 3.受試者呈現一種以上的下列病徵： ●  瞳孔反射異常 ●  眼球急動 ●  視覺追踪困難 4.研究人員所認為可能會混淆研究結果的解釋的任何非歸因於克拉培氏病或次要原因的臨床上重要的神經認知功能障礙。 5.對於人類免疫缺陷病毒(HIV)或C型肝炎，病患具有陽性檢測結果 6.研究者所認為會使受試者面臨不必要的風險或干擾研究產品的評估或受試者安全性或研究結果的解釋的任何條件(例如，任何疾病病、任何當前疾病的證據、體檢的發現或實驗室的異常情況) 7.ICM投予程序的任何禁忌，包括螢光成像的禁忌。 8.MRI或腰椎穿刺的任何禁忌。 9.在篩選前4週內或在該臨床研究中所使用之研究產品的5個半衰期內(以較長者為準)，登錄於使用研究產品的其它任何臨床研究
研究產品 rAAVhu68.hGALC
給藥途徑及程序 在第0日，藉由CT引導的枕骨下注射至小腦延髓池，將rAAVhu68.hGALC以單一劑量投予住院受試者。 在第0日，與研究相關的研究藥房準備含5.6 mL適當力價的rAAVhu68.hGALC的注射器，並送至手術室。   在研究藥物給藥之前，先將受試者麻醉，插管，並使用無菌技術將注射部位備妥並用布蓋好。執行LP以去除預定體積的CSF，然後IT注射碘化造影劑以幫助可視化小腦延髓池的相關解剖結構。IV造影劑可在插入針頭之前或期間投予，以代替IT造影劑。使用IV或IT造影劑的決定由執行該過程的介入醫師自行決定。在螢光鏡引導下，將一根脊柱針(22–25 G)推入小腦延髓池，較大的導引針可用於輔助針頭放置，確認針頭位置後，將延伸套件連接到脊柱針上，並使其充滿CSF。根據介入醫師的判斷，可以在延伸套件上連接含造影劑的注射器，並少量注入以確認針頭在小腦延髓池中的位置。確認針頭放置後，將包含rAAVhu68.hGALC的注射器連接到延伸套件，在1-2分鐘期間緩慢注入注射器中的內容物，遞送5.0 mL的體積。
安全性評估 安全性評估，包括不良事件(AE)及嚴重不良事件(SAE)的收集、身體及神經學檢查、生命體徵、臨床實驗室(血清化學、血液學、凝血、LFT、尿液分析)、ECG、神經傳導研究及CSF細胞學和化學(細胞計數、蛋白質、葡萄糖)在研究時間表中所指定的時間進行(圖18A-18C)。 調查人員主要負責在整個研究過程中以及在劑量遞增階段登錄每位受試者之前對安全性數據(AE、SAE、實驗室數據等)進行持續的醫學審查。安全委員會在整個研究過程中以指定的時間間隔審查安全數據，並向申辦者提出有關進一步進行研究的建議。如圖17所示，對群體1中的前三名受試者和群體2中的前三名受試者進行安全性評估。
統計方法 沒有計劃進行安全性評估的統計比較；所有結果僅是描述性的，列出數據並生成匯總表。
對次要及探察終點進行統計比較，將每個時間點的測量值與每個受試者的基線值比較，且來自年齡匹配的健康對照組數據及來自克拉培氏病病患的自然歷史數據與可用於每個終點的可比較群體特徵進行比較。
所有數據都顯示在受試者數據列表中。使用頻率和百分比匯總類別變數(categorical variable)，並使用敘述統計學(無缺失觀測值的數量、均值、SD、中位數、最小值和最大值)匯總連續變數(continuous variable)，圖形顯示是適當的。
族群之基本原理 研究族群 –小兒病患 FIH重點關注9月齡前開始具有症狀發作的嬰兒，由於未針對這些病患指示使用HSCT，因此嬰兒受試者是最未滿足需求的族群。此外，這些病患具有極具破壞性的疾病過程，其快速且高度可預測的下降趨勢在運動和認知損傷二者呈現上均一(Bascou N., et al. (2018) Orphanet J Rare Dis. 13(1)：126)。事實上，在9月齡前出現症狀的病患具有類似於早期嬰兒克拉培氏病的病程，具有快速和嚴重的認知和運動障礙進展，並在疾病最初徵狀及症狀之後無法獲得任何功能性技能。大多數這些病患被預計會在生命的最初幾年內死亡(2年存活率為26%至50%(Duffner P.K., et al. (2011) Pediatr Neurol. 45(3)：141-8；Beltran-Quintero M.L., et al. (2019) Orphanet J Rare Dis. 14(1)：46)。發病年齡在9到12月齡之間的嬰兒表型變化更大，有些呈現嚴重的早期嬰兒克拉培氏病表型，而其它則具有認知能力(接近)正常，適應能力和精細動作技能明顯更好的不太嚴重的疾病表現，這使得很難預測9到12個月內發病的新診斷病患的表型(Bascou N., et al. (2018) Orphanet J Rare Dis. 13(1)：126)。因此，該人群僅限於症狀發病年齡小於9個月的族群，其可預測且快速的下降支持在合理的追蹤期內進行健全的研究設計和功能性結果評估。對於此組別，治療有望穩定疾病的發展並防止技能喪失，例如獲得性發展和動作里程碑、延長存活期、延緩或預防癲癇發作。 儘管有共同的潛在病理生理學，但從破壞性的嬰兒克拉培氏病形式來看，成年克拉培氏病表型和病程明顯較溫和，因此成年中疾病穩定的證明不會為嬰兒克拉培氏病的治療提供依據。重要的是，成年克拉培氏病的發作高度易變，且進展緩慢且易變，數年到數十年間都出現下降(Jardim L.B., et al. (1999) Arch Neurol. 56(8)：1014-7；Debs R., et al. (2013) J Inherit Metab Dis. 36(5)：859-68)，設計一個能夠在長期自然過程中明確證明試驗性療法之功效的臨床試驗將是非常具有挑戰性的。提供能夠穩定甚至改善疾病表現的治療選擇的事實是另一個重要的考慮因素(Sharp M.E., et al. (2013) JIMD Rep. 10：57-9；Laule C., et al. (2018)  Journal of Neuroimaging. 28(3)：252-255)。最後，NBS在美國尚未得到廣泛採用，且在歐洲亦沒有，且模糊、非特定的臨床表現意味著成年克拉培氏病繼續是診斷不足的，因此接觸這種病患仍然極為罕見(Wasserstein M.P., et al. (2016) Genet Med. 18(12)：1235-1243)。
研究族群 –排除患有嚴重疾病的受試者 考慮到克拉培氏病具有被認為在很大程度上是不可逆之CNS損傷的性質及在嬰兒族群中疾病進展非常迅速，在無或輕度至中度疾病的病患中，這些疾病沒有呈現出與疾病後期階段相關的獨特症狀，包括失聰、失明、嚴重虛弱及原始反射的喪失，而rAAVhu68.hGALC被預期在此病患中可發揮最大的潛在效益 (Escolar M.L., et al. (2006) Pediatrics. 118(3)：e879-89)。此外，在非常重症中，異常瞳孔反射、眼球急動或視覺跟蹤困難比具有中度徵狀及症狀的病患更常見，且在早期疾病階段通常不會觀察到(Escolar M.L., et al. (2006) Pediatrics. 118(3)：e879-89)。因此，多於一種這些症狀的證據被認為是重症的指標，並被排除在試驗之外。由於嚴重的殘疾，除了穩定疾病於低水平的臨床功能外，這些疾病患者不太可能從該療法中獲得實質上的效益，效益/風險輪廓將是不利的，且它們將對各種臨床和儀器評估呈現產生最低的效果，這將無法評估rAAVhu68.hGALC的功效。由於疾病後遺症的嚴重狀況，該人群亦可出現與非治療相關的安全問題的更高風險，因此被排除在本試驗之外。
具有臨床癲癇之病患並不從試驗中排除，除非調查人員認為該孩子有其它重症症狀，並且不太可能從治療中受益，這是因為1)癲癇並非與重症有獨特的關聯，且2)癲癇是試驗的終點，將具有癲癇的病患排除可能會使研究偏向於不易遭受癲癇的族群。
研究族群 –包括症狀發生前的受試者 在僅對rAAVhu68.hGALC評估的研究之劑量遞增部分(群體1及群體2)中，排除症狀發生前的嬰兒克拉培氏病病患。關於這些病患，至少在美國，HSCT被認為是一種治療選項和治療選擇，即使它僅提供延緩疾病進展的作用。普遍的US KOL看法是在此族群中測試未經證實的試驗療法將被認為是不道德的，因為極其狹窄的治療窗口將有力地剝奪病患獲得顯示提供至少部分益處之治療的機會(亦即，如果基因療法證實不成功，那麼就不太可能有時間以HSCT 「挽救」)。因此，應將rAAVhu68.hGALC留給最明顯未滿足需求的病患(即，患有不符合HSCT資格而具有徵狀及症狀的嬰兒克拉培氏病病患)。
我們的臨床前研究證實，基因療法和HSCT組合優於單獨使用任一路徑，因此HSCT和rAAVhu68.hGALC的組合療法在FIH研究中被評估為擴充群體(群體3)。符合本文件所概述之規範的有症狀的及症狀發生前的二種病患有資格登錄此群體，因為此群體評估HSCT背景下rAAVhu68.hGALC的安全性和有效性，且僅在臨床前數據有理由相信可以比單獨HSCT提供改善的功效下才能進行。
研究族群 –年齡下限的正當理由 考慮到症狀發作可發生在產期，甚至在子宮內，治療應儘早進行以最大程度地發揮潛在的益處，因此，本研究的最低年齡選擇在給藥時為1月齡，因為目前的一致性規範建議在符合條件的病患中於1月齡前進行HSCT(Kwon J.M., et al. (2018) Orphanet J Rare Dis. 13(1)：30)。要求年齡至少為1個月以上允許殘疾人士及其家庭在參加此試驗之前考慮其它形式的護理標準治療。
選擇年齡下限的另一個考慮因素是確保可在這樣年輕的患者中安全地進行治療，尤其是ICM程序。在仔細審查1或2週齡嬰兒的成像掃描後，賓夕法尼亞大學的一名介入的放射學專家證實，假設治療的基本原理是被支持的，在1月齡的嬰兒中進行CT導引的ICM投予並沒有特殊的解剖學上的顧慮。
終點 除了將安全性和耐受性作為主要終點指標之外，亦根據當前文獻並與專門研究克拉培氏病的主導臨床醫師進行諮詢，為該研究選擇了第二及探索性藥效學及功效終點，這些終點預期在此族群中證實有意義的功能性和臨床結果。在30日、90日及6個月內對終點進行測量，然後在2年的短期追踪期內每6個月進行測量，但需要鎮靜及/或腰椎穿刺者除外，如圖18A-18C所示。在長期延伸期(long-term extension phase)期間，測量頻率降低為每12個月一次。選擇這些時點有助於全面評估rAAVhu68.hGALC的安全性和耐受性。考慮到未經治療的嬰兒克拉培氏病病患的疾病進展快速，亦選擇較早時間點和6個月的間隔，此允許在存在未治療的比較數據的追蹤期內，徹底評估經治療之受試者的藥效學和臨床功效指標。投予rAAVhu68.hGALC後，將持續監測受試者的安全性和有效性，總計5年，依據草案「FDA Guidance for Industry: Long Term Follow-Up After Administration of Human Gene Therapy Products」 (2018年7月)。
疾病進展和臨床結果 考慮到嬰兒族群中疾病進展快速和均勻的速率(Duffner P.K., et al. (2011) Pediatr Neurol. 45(3)：141-8；Bascou N., et al. (2018) Orphanet J Rare Dis. 13(1)：126)，初步結果評估的2年追蹤被認為足以評估rAAVhu68.hGALC隨著時間的影響。此外，治療後5年的LTFU對於評估長期預後提供非常有用的訊息，如果該療法可有效延長存活期並穩定病患於與HSCT後症狀發生前的病患中所觀察到的結果相似或更好的水平。
藉由量測存活、預防發育和動作里程碑的喪失(潛在支持獲得新的里程碑)、癲癇發作和頻率，投予rAAVhu68.hGALC可穩定疾病的進展。死亡通常發生在大多數被診斷為早期嬰兒克拉培氏病病患生命的前3年，晚期嬰兒族群的中位死亡率可延長至5年，其中合併有7-12個月症狀發作的患者(Duffner P.K., et al. (2012) Pediatr Neurol. 46(5)：298-306)。藉由將入選規範限制為發病於9月齡或之前的病患，該族群具有更嚴重的類早期嬰兒表型和病程(Bascou N., et al. (2018) Orphanet J Rare Dis. 13(1)：126)。考慮到未經治療的嬰兒克拉培氏病迅速的衰退，在追蹤期期間以rAAVhu68.hGALC治療可延長預期壽命。動作里程碑的發展取決於受試者登錄時的年齡和疾病階段(Bascou N., et al. (2018) Orphanet J Rare Dis. 13(1)：126；Beltran-Quintero M.L., et al. (2019) Orphanet J Rare Dis. 14(1)：46)。考慮到目標族群的疾病嚴重程度，受試者可登錄已獲得動作技能、發展並隨後失去其它動作里程碑，或尚未顯示出動作里程碑發展的跡象。因此，評估會跟蹤所有里程碑的達成年齡及喪失年齡。基於表11中所概述的世界衛生組織(WHO)規範，動作里程碑的達成被定義為6個粗里程碑。
表11.粗動作里程碑(Gross Motor Milestone)之WHO規範
粗動作里程碑 多中心生長參考研究表現規範 (Multicenter Growth Reference Study Performance Criteria)
無支撐坐立 兒童直立坐著，頭部直立至少10秒鐘，兒童不使用手臂或手來平衡身體或支撐姿勢。
手膝爬行 兒童交替地前後移動手和膝蓋，腹部不接觸到支撐表面，有持續且連續的動作，至少連續三個。
輔助下站立 兒童雙腳以直立姿勢站立，以雙手托住一穩定物體(例如，家具)而不靠在上面，身體不碰到穩定的物體，且腿支撐著大部分體重。因此，兒童在幫助下站立至少10秒鐘。
輔助下行走 兒童處於直立的姿勢，背部挺直，兒童用兩隻手握住一穩定物體(例如，家具)向側邊或前方進行邁步，一隻腿向前移動，而另一隻腿支撐部分體重，兒童以此方式取得至少五步。
獨自站立 兒童以雙足(不是腳趾)直立姿勢站立，背部挺直，雙腿支撐小孩100%體重，沒有與人或物體的接觸，兒童獨自站立至少10秒鐘。
獨自行走 兒童在直立姿勢背部挺直下，至少要獨立走五步，一條腿向前移動，另一條腿支撐大部分體重，沒有與人或物體的接觸。
改編自(Wijnhoven T.M., et al. (2004) Food Nutr Bull. 25(1 Suppl)：S37-45)。 縮寫：WHO，世界衛生組織。
考慮到患有嬰兒克拉培氏病之受試者可在在生命的最初幾週或幾個月內發展出症狀，且在4月齡(中位數：5.9月齡)前通常不會表現出獲得第一個WHO動作里程碑(無支撐坐立)，此終點可能缺乏評估治療效益廣度的敏感性，尤其是在治療時點具有明顯的症狀的受試者中。為此原因，亦包括可應用於嬰兒之適於年齡的發展里程碑評估(Sharp M.E., et al. (2013) JIMD Rep. 10：57-9)。有一個缺點是已公布的工具旨在供臨床醫生和父母使用，並在無參考正常範圍下安排在典型的里程碑獲取年齡附近技能，而沒有參考正常範圍。然而，相對於未經治療的患有嬰兒克拉培氏病的兒童或神經學典型兒童的典型獲取時間，這些數據可能有助於總結發展里程碑隨著時間的推移的保有、獲得或喪失。
雖然癲癇並非嬰兒呈現的症狀，但大約30-60%的嬰兒病患最終會在疾病的後期發展出癲癇(Duffner P.K., et al. (2011) Pediatr Neurol. 45(3)：141-8)。癲癇發作活動的延遲發作使我們能夠確定以rAAVhu68.hGALC治療是否可以預防或延緩此族群中癲癇發作，或降低癲癇發作事件的頻率。父母被要求準備癲癇發作日記，以追蹤癲癇發作的發生、頻率、時間和類型。每次訪視時，臨床醫生都會討論並解釋這些項目。
作為探索性量測，臨床量表用於量化rAAVhu68.hGALC在適應行為、認知、語言、運動功能和健康相關生活質量的發展和變化的效果，所建議的每種量測已在克拉培氏病族群或相關族群中使用。
量表和相關領域簡要敘述如下： ●    貝里嬰幼兒發展量表(第三版)：評估五個跨領域的嬰幼兒發展：認知、語言、運動、社會情感及適應行為，在試驗中評估所有領域。 ●    文蘭德適應行為量表(第三版)：評估從出生到成年(0-90歲)這五個領域的適應行為：溝通、日常生活技能、社交、運動技能和適應不良行為。從v2到v3的改進包含一些問題，可更佳地理解發育障礙。 ●    皮巴迪動作發展量表第二版：測量從出生到五歲兒童的相關運動功能，評估集中在六個領域：反射、靜止、運動、物體操縱、抓握和視覺運動整合。 ●    嬰幼兒生活品質問卷(ITQOL)：與健康有關的生活品質之經父母報告的量測，設計用於2月齡嬰兒至5歲幼兒。 ●    穆林早期學習量表：評估不超過68月齡嬰兒的語言、運動和知覺能力。
疾病生物標記 為了評估rAAVhu68.hGALC對疾病病理的功效，測量髓鞘化的變化、與髓鞘化有關的功能性結果及潛在疾病的生物標記。作為疾病的主要標誌，投予rAAVhu68.hGALC可使中樞和周圍脫髓鞘化減慢或停止進程。藉由白質區域的擴散張量磁振造影(DT-MRI)各向異性測量和皮質脊髓運動區的纖維追蹤來追蹤中樞脫髓鞘鞘化，變化是疾病狀態和進展的指標(McGraw P., et al. (2005) Radiology. 236(1)：221-30；Escolar M.L., et al. (2009) AJNR Am J Neuroradiol. 30(5)：1017-21)。藉由神經傳導速度(NCV)對運動神經(深腓骨、脛骨和尺骨神經)及感覺神經(腓腸和正中神經)的研究，以監測指示生物活性髓磷脂變化的波動(即F波和遠端潛伏期，振幅或反應的存在或缺乏)來間接量測周圍脫髓鞘化。
根據一項研究，視覺障礙的發展在早期嬰兒克拉培氏病很普遍，有61.2%的族群在該疾病的某個時點發展至視力喪失(Duffner P.K., et al. (2011) Pediatr Neurol. 45(3)：141-8)。類似於癲癇，視力減退不是常見的症狀。這對治療前未出現明顯視力喪失的受試者提供評估rAAVhu68.hGALC延緩或預防視力喪失之能力的機會。因此，視覺誘發電位(VEP)的測量被用來客觀測量對視覺刺激的反應，作為中樞視力損害或喪失的指標。聽力喪失在疾病發展過程中也很常見，並藉由腦幹聽覺誘發反應(BAER)測試來測量聽覺異常的早期跡象。
GALC負責鞘胺醇半乳糖苷的水解，克拉培氏病中GALC的缺乏導致中樞和周圍蓄積鞘胺醇半乳糖苷，增加鞘胺醇半乳糖苷的水平已被建議作為克拉培氏病的指標(Escolar M.L., et al. (2017) Mol Genet Metab. 121(3)：271-278)。雖然有證據支持將其用於檢測早期及嚴重的嬰兒克拉培氏病，但隨時間推移對鞘胺醇半乳糖苷水平波動的解釋，隨後的治療可能很困難，因為在晚期疾病中鞘胺醇半乳糖苷水平也可能會下降。因此，僅憑鞘胺醇半乳糖苷水平下降的證據不足以證明其具有治療效果，除非伴隨有臨床疾病的穩定。
(序列表非關鍵詞文字) 對於包含在數字識別號>223>下的非關鍵詞文字的序列，提供下列資訊。
SEQ ID NO： (含非關鍵詞文字) 在>223>下的非關鍵詞文字
1 >223>  AAVhu68 vp1衣殼
2 >223>  合成構築體
3 >223>  AAV9 VP1衣殼   >220> >221>  CDS >222>  (1)..(2208) >223>  AAV9 VP1衣殼
4 >223>  合成構築體
5 >223>  人類GALC編碼序列   >220> >221>  sig_肽 >222>  (1)..(126)   >220> >221>  CDS >222>  (1)..(2058)
6 >223>  合成構築體
7 >223>  工程化犬GALC >220> >221>  CDS >222>  (1)..(2007)
8 >223>  合成構築體
9 >223>  工程化人類GALC 編碼序列   >220> >221>  CDS >222>  (1)..(2055)   >220> >221>  sig_肽 >222>  (1)..(126)   >220> >221>  mat >222>  (108)..(2055)
10 >223>  合成構築體  
11 >223>  AAV2 - 5' ITR
12 >223>  CMV IE啟動子
13 >223>  CB啟動子
14 >223>  CB7啟動子
15 >223>  嵌合插入子
16 >223>  兔球蛋白polyA
17 >223>  AAV2 - 3' ITR
18 >223>  具有犬GALC之載體基因體
19 >223>  CB7.CI.hGALC.rBG   >220> >221>  misc_特徵 >222>  (1)..(130) >223>  5' ITR   >220> >221>  misc_特徵 >222>  (198)..(579) >223>  CMV IE增強子   >220> >221>  misc_特徵 >222>  (582)..(863) >223>  CB啟動子   >220> >221>  misc_特徵 >222>  (836)..(839) >223>  TATA   >220> >221>  misc_特徵 >222>  (958)..(1930) >223>  嵌合插入子   >220> >221>  misc_特徵 >222>  (1948)..(4002) >223>  hGALCco   >220> >221>  misc_特徵 >222>  (4042)..(4168) >223>  兔球蛋白poly A   >220> >221>  misc_特徵 >222>  (4257)..(4386) >223>  3' ITR
20 >223>  AAV1 VP1基因   >220> >221>  CDS >222>  (1)..(2208)
21 >223>  合成構築體
22 >223>  AAV5衣殼VP1基因   >220> >221>  CDS >222>  (1)..(2172)
23 >223>  合成構築體
24 >223>  AAV3B VP1衣殼
25 >223>  UbC啟動子
26 >223>  SV40晚期polyA
27 >223>  EF-1a啟動子
本說明書所引用之所有文件，以及與之一併提交的序列表和序列表的文本(標示為「18-8584PCT_ST25.txt」)皆藉由引用併入本文。美國臨時專利申請號62/810,708 (2019年2月26日申請)、美國臨時專利申請號62/817,482 (2019年3月12日申請)、美國臨時專利申請號62/877,707 (2019年7月23日申請)及美國臨時專利申請號62/916,652 (2019年10月17日申請)藉由引用將其全部及其序列表一起併入本文。儘管已參考特定實施方式而描述本發明，應理解於不脫離本發明的精神下可進行修飾。意圖使此種修飾落入所附申請專利範圍的範疇。
無。
圖1提供AAV9(SEQ ID NO：4)及AAVhu68(SEQ ID NO：2)衣殼序列之排列比對。在AAV9和AAVhu68衣殼之間不同的兩個胺基酸位於衣殼的VP1(67，157)和VP2(157)區域。縮寫：AAV9，腺相關病毒血清型9；AAVhu68；腺相關病毒血清型hu68；VP1，病毒蛋白質1；VP2，病毒蛋白質。 圖2顯示CB7.CI.hGALC.rBG載體基因體之示意圖。線性圖譜描繪載體基因體，其被設計成在普遍存在的CB7啟動子控制下表現人類GALC。CB7由CMV IE增強子和雞β-肌動蛋白(CB)啟動子之間混雜構成。縮寫：CMV IE，細胞巨大病毒立即早期(cytomegalovirus immediate-early)；GALC，半乳糖基神經醯胺酶；ITR，反向末端重複； PolyA，多腺核苷酸化；rBG，兔β-球蛋白。 圖3顯示以工程化cGALC基因(cGALCco)插入之pENN.AAV.CB7.CI.RBG (p1044)載體圖譜。 圖4A顯示Twitcher小鼠(twi /twi )的神經病理學和行為表型的進展。小鼠表現出細胞毒性鞘胺醇半乳糖苷蓄積，隨後吞噬球狀細胞滲透PNS和CNS白質。在最初的髓鞘化之後，由於形成髓磷脂之許旺氏細胞和寡樹突神經膠質細胞分別死亡，在PNS中隨後在CNS中觀察到脫髓鞘化作用。行為表型體現在PND 20附近，包括震顫、抽搐、後肢無力，隨後出現麻痺和體重減輕，因此需要在PND 40附近實施安樂死。調整自(Nicaise A.M., et al. (2016) J Neurosci Res. 94(11)：1049-61)。縮寫：CNS，中樞神經系統；PND，出生後天數；PNS，周圍神經系統；twi ，twitcher功能喪失對偶基因。 圖4B顯示使用Twitcher小鼠模型評估AAV.CB7.cGALCco.rBG基因療法的研究設計。 圖5顯示對症狀發生前的Twitcher小鼠靜脈內或腦室內投予rAAVhu68.hGALC後的存活曲線。在PND 0以高劑量IV投予rAAVhu68.hGALC (1.00 x 1011 GC [相當於1.00 x 1014 GC/kg])至新生Twitcher小鼠導致49天之存活中位數(N=6)。在PND 0以低5倍劑量之rAAVhu68.hGALC (2.00 x 1010 GC) ICV投予至新生Twitcher小鼠導致61.5日之存活中位數(N=10)。將投予rAAVhu68.hGALC之Twitcher小鼠的存活與作為對照組年齡相仿ICV投予媒劑(PBS)之Twitcher小鼠(N=8)比較。縮寫：GC，基因體拷貝數；ICV，腦室內；IV，靜脈內；N，動物數量；PND，出生後天數。 圖6顯示使用不同AAV衣殼以腦室內遞送GALC至症狀發生前的Twitcher小鼠後的存活曲線。於PND 0以2.00 x 1010 GC劑量ICV投予AAVhu68載體(rAAVhu68.hGALC)賦予61.5日之存活中位數(N=10)。於PND 0以2.00 x 1010 GC劑量ICV投予AAV1、AAV3b或AAV5載體導致少於60日之存活中位數(AAV1：57日[N=6]，AAV3b：51日[N=9]，AAV5：51日[N=6])，而對照組Twitcher小鼠僅於PND 0 ICV投予媒劑(PBS)，呈現43日之存活中位數(N=8)。縮寫：AAV3b，AAV血清型3b；AAV5，AAV血清型5；AAV1，AAV血清型1；及AAVhu68，AAV血清型hu68 (rAAVhu68.hGALC)；GC，基因體拷貝數；ICV，腦室內；N，動物數量；PBS，磷酸鹽緩衝生理鹽水；PND，出生後天數。 圖7顯示將不同劑量之rAAVhu68.hGALC以腦室內投予至症狀發生前的Twitcher小鼠後的神經運動功能。將症狀發生前的Twitcher小鼠(twi /twi )於PND 0以2.00 x 1010 GC (N=10)、5.00 x 1010 GC (N=12)或1.00 x 1011 GC (N=12)之劑量ICV投予rAAVhu68.hGALC，腦質量(新生小鼠為0.15 g)之每克劑量各相當於1.30 x 1011 GC/g、3.30 x 1011 GC/g及6.70 x 1011 GC/g。作為對照組，PND 0將PBS ICV投予至年齡相仿之症狀發生前的Twitcher小鼠(twi /twi ) (N=8)及年齡相仿之未受影響的小鼠(twi /+或+/+；N=14)。於PND 35，藉由在加速桿上奔跑之小鼠的落下時間(秒)評估神經運動功能，起初是5 RPM，之後在120秒內增加到40 RPM。** p>0.01，以單因子ANOVA之後以鄧恩多重比較法(Dunn’s multiple comparison test)確定。縮寫：ANOVA，變異數分析；GC，基因體拷貝數；ICV，腦室內；N，動物數量；PBS，磷酸鹽緩衝生理鹽水；PND，出生後天數；RPM，每分鐘轉數。 圖8顯示將不同劑量之rAAVhu68.hGALC以腦室內投予至症狀發生前的Twitcher小鼠後的存活曲線。以ICV投予媒劑(PBS)之對照組Twitcher小鼠(twi /twi )顯示43日之存活中位數(N=8)。在PND 0以2.00 x 1010 GC之劑量ICV投予rAAVhu68.hGALC之Twitcher小鼠(twi /twi )顯示61.5日之存活中位數(N=10)，以5.00 x 1010 GC之劑量為99日(N=12)，及以1.00 x 1011 GC之劑量為130日(N=12)。腦質量(新生小鼠為0.15 g)的每克rAAVhu68.hGALC劑量各相當於1.30 x 1011 GC/g、3.30 x 1011 GC/g及6.70 x 1011 GC/g。縮寫：GC，基因體拷貝數；ICV，腦室內；N，動物數量；PBS，磷酸鹽緩衝生理鹽水；PND，出生後天數。 圖9顯示將rAAVhu68.hGALC腦室內投予至有症狀的Twitcher小鼠後的神經運動功能。在PND 0以1.00 x 1011 GC (N=12)之劑量的rAAVhu68.hGALC ICV投予至症狀發生前的新生Twitcher小鼠 (twi /twi )。在PND 12以1.00 x 1011 GC (N=12)或2.00 x 1011 GC (N=11) 之劑量的rAAVhu68.hGALC ICV投予有早期症狀的Twitcher小鼠(twi /twi )。在PND 21以2.00 x 1011 GC (N=16)之劑量的rAAVhu68.hGALC ICV投予有晚期症狀的Twitcher小鼠(twi /twi )。在PND 12，將年齡相仿之未受影響的小鼠(twi /+ 及+/+；N=27)及受影響的Twitcher小鼠(twi /twi ；N=15) ICV投予媒劑(PBS)作為對照。在PND35，藉由在加速桿上奔跑之小鼠的落下時間(秒)評估神經運動功能，起初是5 RPM，之後在120秒內增加到40 RPM。**p>0.01及***p>0.001，以單因子ANOVA之後以鄧恩多重比較法確定。縮寫：ANOVA，變異數分析；GC，基因體拷貝數；ICV，腦室內；N，動物數量；PBS，磷酸鹽緩衝生理鹽水；PND，出生後天數；RPM，每分鐘轉數。 圖10顯示將rAAVhu68.hGALC腦室內投予至有症狀的 Twitcher小鼠後的存活曲線。在PND 12，以1.00 x 1011 GC(N=12)或2.00 x 1011 GC (N=11)之劑量的rAAVhu68.hGALC ICV投予有早期症狀的Twitcher小鼠 (twi /twi )各具有71日或81日之存活中位數。於PND 21，以2.00 x 1011 GC (N=16)之劑量的rAAVhu68.hGALC ICV投予有晚期症狀的Twitcher小鼠 (twi /twi )具有51.5日之存活中位數。藉由比較，在PND 0或PND 12，將對照組Twitcher小鼠 (twi /twi ；歷史對照組；N=8 來自研究1 [PND 0]及N=4來自研究2 [PND 12]) ICV投予媒劑(PBS)，顯示少於50日之存活中位數。縮寫：GC，基因體拷貝數；ICV，腦室內；N，動物數量；PBS，磷酸鹽緩衝生理鹽水；PND，出生後天數。 圖11A及圖11B顯示以腦室內投予rAAVhu68.hGALC至有症狀之Twitcher小鼠後的臨床評分及神經運動功能。在PND 12，以2.00 x 1011 GC之劑量的rAAVhu68.hGALC ICV投予有早期症狀的Twitcher小鼠(twi /twi ；N=9)。在PND 12，將年齡相仿的有早期症狀的Twitcher小鼠(twi /twi ；N=9)、未受影響的Twitcher異基因型合子(twi /+；N=10)及野生型小鼠(N=8) ICV投予PBS作為對照(圖11A)。從PND 22開始，每日對每隻小鼠使用臨床評分評估進行評估緊握能力(clasping ability)、步態、震顫，駝背和毛皮品質，直到PND 40進行屍體剖檢。為每隻動物指定一個累積分數，然後在研究期間藉由AAV治療將其標準化，分數越高表示臨床狀態越差(圖11B)。在PND 35，藉由在加速桿上奔跑之小鼠的落下時間(秒)評估神經運動功能，起初是5 RPM，之後在120秒內增加到40RPM。*p>0.05，以單因子ANOVA之後以鄧恩多重比較法確定。縮寫：GC，基因體拷貝數；ICV，腦室內；N，動物數量；PBS，磷酸鹽緩衝生理鹽水；PND，出生後天數；RPM，每分鐘轉數 圖12顯示將rAAVhu68.hGALC腦室內投予有症狀的Twitcher小鼠後的坐骨神經組織學。在PND 12，以2.00 x 1011 GC之劑量的rAAVhu68.hGALC ICV投予有早期症狀的Twitcher小鼠(twi /twi ；N=9)。在PND 12，將年齡相仿之有早期症狀的Twitcher小鼠(twi /twi ；N=9)及未受影響的野生型小鼠(N=8) ICV投予PBS作為對照。28日後，於PND 40，將小鼠屍體剖檢，並獲得坐骨神經樣本。在組織切片上進行羅克沙爾藍(Luxol blue)及PAS反應染色以分別顯現髓磷脂(深藍色)和球狀細胞(粉紅色)。縮寫：GC，基因體拷貝數；ICV，腦室內；N，動物數量；PBS，磷酸鹽緩衝生理鹽水；PAS，過碘酸希夫氏(Schiff)；PND，出生後天數。 圖13顯示在出生後12天時對有症狀的Twitcher小鼠進行腦室內投予rAAVhu68.hGALC後28天的GALC活性。在PND 12，以2.00 x 1011 GC之劑量的rAAVhu68.hGALC ICV投予有早期症狀的Twitcher小鼠(twi /twi ；N=9)。在PND 12，將年齡相仿之有早期症狀的Twitcher小鼠(twi /twi ；N=9)及未受影響的野生型小鼠(N=8) ICV投予PBS作為對照。28日後，於PND 40，將小鼠屍體剖檢，並獲得大腦、肝臟及血清樣本。使用基於螢光團(fluorophore)的分析以量化GALC酶素活性的水平(相對FU)。縮寫：FU，螢光單位；GALC，半乳糖基神經醯胺酶；GC，基因體拷貝數；ICV，腦室內；N，動物數量；PBS，磷酸鹽緩衝生理鹽水；PND，出生後天數。 圖14A及圖14B顯示rAAVhu68.hGALC與骨髓移植之組合療法後的期間存活曲線。Twitcher小鼠(twi /twi )僅以BMT治療(N=13，PND 10)、僅以rAAVhu68.hGALC治療(N=12，PND 0或N=13，PND 12；ICV；1.00 x 1011 GC)，以rAAVhu68.hGALC之後以BMT治療(N=7；分別為PND 0及PND 10)，或以BMT之後以rAAVhu68.hGALC治療(N=7；分別為PND 10及PND 12)。僅以投予PBS之Twitcher小鼠(twi /twi )作為歷史對照(N=8，研究1，PND 0；N=4，研究2，PND 12)。顯示期間存活結果，並仍進行實驗。縮寫：BMT，骨髓移植；GC，基因體拷貝數；ICV，腦室內；N，動物數量；PBS，磷酸鹽緩衝生理鹽水；PND，出生後天數。 圖15顯示提出克拉培氏病犬之神經病理學及行為表型的進展(Wenger D.A., et al. (1999) J Hered. 90(1)：138-42；Bradbury A., et al. (2016) Neuroradiol J. 29(6)：417-424；Bradbury A.M., et al. (2016b) 94(11)：1007-17；Bradbury A.M., et al. (2018) Hum Gene Ther. 29(7)：785-801)。虛線表示尚未描述指定表型的較早時間點的數據。*星號係指經組織學所觀察到的脫髓鞘化。縮寫：BAER，腦幹聽覺誘發反應；CNS，中樞神經系統；MRI，磁振造影；NCV，神經傳導速度；PNS，周圍神經系統。 圖16顯示1/2期人類首次臨床試驗的設計。三位受試者分別以群體1(低劑量)及群體2(高劑量)給藥，然後受試者#3及#6後進行強制性安全委員會審查(safety board review)。在群體1和群體2中登錄第一個受試者後的30天間隔之後，在每個群體中的下兩個受試者同時登錄。隨後，群體3(MTD)中的6名受試者同時登錄而無需交錯給藥。縮寫：FIH，人類首次；LTFU，長期追蹤；MTD，最大耐受劑量。 圖17顯示擬議的1/2期試驗的安全性評估決策樹(decision tree)。*研究中止標準包括任何事件，其中一個以上的受試者經歷了3級或更高的AE，此與調查人員所評估的研究產品或ICM注射程序相關。**醫學審查由醫學監督員與原則調查人員一起執行。***群體3位受試者同時登錄，在每個受試者之間，MTD的給藥間隔不超過4週的安全觀察期，且在登錄群體3中的前3位受試者後，無需進行安全委員會審查。縮寫：AE，不良事件；ICM，小腦延髓池內；MTD，最大耐受劑量；SRT，安全審核觸發因素(safety review trigger)。 圖18A、圖18B及圖18C顯示1/2期試驗活動時間表的表格。 圖19顯示HSCT 8週之後，野生型及Twitcher(克拉培氏病)小鼠小腦中GFP+供體細胞的腦植入。 圖20顯示投予具有經工程化GALC(cGALCco)或天然犬GALC(cGALnat)序列的rAAVhu68之twitcher小鼠中血清GALC活性的比較，與具有天然序列的rAAVhu68相比，在投予rAAVhu.cGALCco的twitcher小鼠中觀察到改善的存活。 圖21顯示反向質體pAAV2/hu68.KanR (p0068)之線性載體圖譜。縮寫：AAV2，腺相關病毒血清型 2；AAVhu68，腺相關病毒血清型hu68；bp，鹼基對；Cap，衣殼；KanR，康黴素(kanamycin)抗性；Ori，複製起點；Rep，複製酶。 圖22A及圖22B顯示腺病毒輔助質體(helper plasmid) pAdDeltaF6(KanR)。(圖22A)由母體質體pBHG10通過中間體pAdΔF1及pAdΔF5衍生出輔助質體pAd∆F6。(圖22B) pAd∆F6中的安比西林(ampicillin)抗性基因被康黴素抗性基因置換，生成pAd∆F6(Kan)。 圖23顯示評估克拉培氏病犬之AAV.CB7.cGALCco.rBG基因療法的研究設計。 圖24A-圖24C顯示在ICM投予AAVhu68.cGALC至克拉培氏病犬後，存活及酵素分泌至腦脊髓液中。(圖24A)存活曲線 (進行中)。(圖24B及圖24C)使用螢光基質測量CSF中的GALC活性(Marker Gene Techonologies, Inc., Cat. No. M2774)。 圖25A-圖25D顯示在投予AAVhu68.cGALC後的克拉培氏病犬之脛骨運動神經(圖25A)，及橈骨感覺神經(圖25B)、坐骨運動神經(圖25C)及尺骨運動神經(圖25D)中的神經傳導速度(NCV)。在克拉培氏病假治療之犬中定期NCV紀錄顯示減緩的(圖25A)或未偵測到的(圖25B)信號，而所有四隻經rAAVhu68.cGALC治療的動物具有與年齡相仿WT對照組犬隻相似的標準化速度。 圖25E顯示假治療及rAAVhu68.cGALC治療之克拉培氏病犬的神經檢查結果。 圖26A及圖26B顯示經假治療及AAVhu68.cGALC治療之克拉培氏病犬的大腦切片組織學。(圖26A) Luxol藍染色用於髓磷脂。(圖26B)IBA1免疫染色(小神經膠質細胞標記)。 圖27顯示接受媒劑或AAVhu68.cALC的野生型(經媒劑治療)及克拉培氏病犬的體重曲線。 圖28A及圖28B顯示在假治療的克拉培氏病及野生型犬及投予AAVhu68.cALC之克拉培氏病犬中的CSF與感覺神經元安全性監測。(圖28A) CSF细胞增多(pleocytosis)。(圖28B)來自經AAVhu68.cGALC治療的克拉培氏病犬的背根神經節組織學。 圖29A顯示假治療之克拉培氏病犬和野生型犬隻及投予AAVhu68.cALC之克拉培氏病犬的MRI測量。圖29B顯示圖29A中MRI測量的累積評分結果。 圖30顯示載體生產的製造方法流程圖。縮寫：AEX，陰離子交換；CRL，查爾斯河實驗室(Charles River Laboratories)；ddPCR，微滴數位化聚合酶連鎖反應；DMEM，達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(Dulbecco’s modified Eagle medium)；DNA， 去氧核醣核酸；FFB，最終調配緩衝液；GC，基因體拷貝數；HEK293，人類胚腎293細胞；ITFFB，鞘內最終調配緩衝液；PEI，聚乙烯亞胺；SDS-PAGE，十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳；TFF，切向流過濾(tangential flow filtration)；USP，美國藥典；WCB，工作細胞庫。 圖31顯示載體調配物的製造方法流程圖。縮寫：Ad5，腺病毒血清型5；AUC，分析型超高速離心機；BDS，大批原料藥；BSA，牛血清白蛋白；CZ，Crystal Zenith；ddPCR，微滴數位化聚合酶連鎖反應；E1A，早期區域1A (基因)；ELISA，酶聯免疫吸附分析法；FDP，最終藥品；GC，基因體拷貝數；HEK293，人類胚腎293細胞；ITFFB，鞘內最終調配緩衝液；KanR，康黴素抗性(基因)；MS，質譜法；NGS，次世代定序法；qPCR，定量聚合酶連鎖反應；SDS-PAGE，十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳；TCID50 50% 組織培養感染劑量；UPLC，超高效液相層析；USP，美國藥典。
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無。

Claims (55)

  1. 一種包含重組腺相關病毒(rAAV)之組成物，該rAAV包含： (a)靶定中樞神經系統中之細胞的AAV衣殼；及 (b)載體基因體，其包含：(i)半乳糖基神經醯胺酶編碼序列，其在指導該蛋白質表現之調控序列的控制下，編碼信號肽及至少一具有SEQ ID NO：10之aa 43至685胺基酸序列之成熟人類半乳糖基神經醯胺酶蛋白質，及(ii)將載體基因體包裝在AAV衣殼中所必需的AAV反向末端重複，其中該載體基因體被包裝於AAV衣殼中。
  2. 如請求項1之組成物，其中該AAV衣殼為AAVhu68衣殼。
  3. 如請求項1或2之組成物，其中該編碼序列編碼全長人類半乳糖基神經醯胺酶信號肽及SEQ ID NO：10 (胺基酸1至685)之成熟人類半乳糖基神經醯胺酶蛋白質。
  4. 如請求項1至3中任一項之組成物，其中該編碼序列具有外源性肽編碼序列之核酸序列及SEQ ID NO：9之核苷酸127至2055，或與其具有95%至99.9%同一性之序列；或SEQ ID NO：9之核苷酸1至2055之核苷酸序列或與其具有95%至99.9%同一性之序列。
  5. 如請求項1或2之組成物，其中該編碼序列編碼SEQ ID NO：10 (胺基酸43至685)之成熟人類半乳糖基神經醯胺酶蛋白質及適於人類中樞神經系統細胞之外源性信號肽。
  6. 如請求項1至5中任一項之組成物，其中該調控序列包含：β-肌動蛋白啟動子、插入子、及兔球蛋白polyA。
  7. 如請求項1至6中任一項之組成物，其中該調控序列包含SEQ ID NO：13。
  8. 如請求項1至7中任一項之組成物，其中該調控序列包含SEQ ID NO：15。
  9. 如請求項1至8中任一項之組成物，其中該調控序列包含SEQ ID NO：16。
  10. 如請求項1或2之組成物，其中該載體基因體包含具有SEQ ID NO：19之nt 198至4168之序列的CB7.CI.hGALC.RBG。
  11. 如請求項1至10中任一項之組成物，其中該載體基因體進一步包含AAV2之5’ ITR、編碼序列、及調控序列、及AAV2之3’ ITR。
  12. 如請求項1至11中任一項之組成物，其中該組成物進一步包含適於鞘內遞送至病患之水性液體。
  13. 如請求項1至12中任一項之組成物，其中該組成物包含人工腦脊髓液及表面活性劑。
  14. 如請求項1至13中任一項之組成物，其中該組成物被調配用於鞘內遞送且包含1.4 x 1013 至4 x 1014 GC之rAAV。
  15. 如請求項1至13中任一項之組成物，其中該組成物被調配用於小腦延髓池內(intra-cisterna magna)遞送且包含1.4 x 1013 至4 x 1014 GC之rAAV。
  16. 一種重組腺相關病毒，其包含(a)靶定中樞神經系統中之細胞的AAV衣殼；及(b)載體基因體，其包含(i)半乳糖基神經醯胺酶編碼序列，其於指導信號肽及成熟人類半乳糖基神經醯胺酶蛋白質表現之調控序列的控制下，編碼信號肽及具有SEQ ID NO：10之aa 43至685之胺基酸序列的成熟人類半乳糖基神經醯胺酶蛋白質，及(ii)將載體基因體包裝在AAV衣殼中所必需的AAV反向末端重複，其中該載體基因體被包裝於AAV衣殼中。
  17. 如請求項16之rAAV，其中該AAV衣殼為AAVhu68衣殼。
  18. 如請求項16或17之rAAV，其中該編碼序列具有外源性信號肽編碼序列及SEQ ID NO：9之核苷酸127至2055或與其具有95%至99.9%同一性之序列，或SEQ ID NO：9之核苷酸1至2055的核苷酸序列或與其具有95%至99.9%同一性之序列。
  19. 如請求項16至18中任一項之rAAV，其中該編碼序列編碼SEQ ID NO：10之胺基酸43至685之成熟蛋白質及外源性信號肽。
  20. 如請求項16至19中任一項之rAAV，其中該調控序列包含：雞β-肌動蛋白啟動子、插入子、及兔球蛋白polyA。
  21. 如請求項16至20中任一項之rAAV，其中該調控序列包含SEQ ID NO：13。
  22. 如請求項16至21中任一項之rAAV，其中該調控序列包含SEQ ID NO：15。
  23. 如請求項16至22中任一項之rAAV，其中該調控序列包含SEQ ID NO：16。
  24. 如請求項16至23中任一項之rAAV，其中該載體基因體包含具有SEQ ID NO：19之nt 198至4168之序列的CB7.CI.hGALC.RBG。
  25. 如請求項16至24中任一項之rAAV，其中該載體基因體包含AAV2之5’ ITR、編碼序列、及調控序列、及AAV2之3’ ITR。
  26. 一種重組腺相關病毒，其包含AAVhu68衣殼及CB7.CI.hGALC.RBG載體基因體。
  27. 一種組成物，其包含如請求項16至26中任一項之重組腺相關病毒 (rAAV)的儲料，該組成物有用於治療克拉培氏病(Krabbe disease)。
  28. 一種包含如請求項16至26中任一項之重組腺相關病毒 (rAAV)的儲料之組成物之用途，其用於製備醫藥品。
  29. 如請求項27之組成物或如請求項28之用途，其中該組成物有用於治療周圍神經功能障礙及/或治療克拉培氏病。
  30. 如請求項27之組成物或如請求項28之用途，其中該rAAV可被投予作為與造血幹細胞療法或骨髓移植之協同療法。
  31. 如請求項27之組成物或如請求項28之用途，其中該rAAV可被投予作為基質減量療法之協同療法。
  32. 一種質體，其包含半乳糖基神經醯胺酶編碼序列，該半乳糖基神經醯胺酶編碼序列編碼信號肽及具有SEQ ID NO：10之胺基酸43至685之胺基酸序列的成熟人類半乳糖基神經醯胺酶蛋白質。
  33. 如請求項32之質體，其中該編碼序列具有SEQ ID NO：9之核酸序列或與其具有95%至99.9%同一性之序列。
  34. 一種治療克拉培氏病之方法，其包含投予組成物至需要之病患，該組成物包含重組腺相關病毒(rAAV)之儲料，該rAAV包含：(a)靶定中樞神經系統中之細胞的AAV衣殼；及(b)載體基因體，其包含半乳糖基神經醯胺酶編碼序列，該半乳糖基神經醯胺酶編碼序列於指導蛋白質表現的調控序列的控制下，編碼信號肽及具有SEQ ID NO：10之胺基酸43至685的胺基酸序列的成熟人類半乳糖基神經醯胺酶蛋白質，該載體基因體進一步包含將載體基因體包裝在AAV衣殼中所必需的AAV反向末端重複，其中該載體基因體被包裝於AAV衣殼中。
  35. 一種矯正由克拉培氏病所引起的造成呼吸衰竭及運動功能喪失的周圍神經功能障礙之方法，該方法包含投予病患一種組成物，其包含重組腺相關病毒(rAAV)之儲料，該rAAV包含：(a)靶定中樞神經系統中之細胞的AAV衣殼；及(b)載體基因體，其包含半乳糖基神經醯胺酶編碼序列，該半乳糖基神經醯胺酶編碼序列於指導蛋白質表現的調控序列的控制下，編碼信號肽及具有SEQ ID NO：10之胺基酸43至685的胺基酸序列的成熟人類半乳糖基神經醯胺酶蛋白質，該載體基因體進一步包含將載體基因體包裝在AAV衣殼中所必需的AAV反向末端重複，其中該載體基因體被包裝於AAV衣殼中。
  36. 一種延遲由克拉培氏病所引起的癲癇之發作或頻率之方法，該方法包含投予病患一種組成物，其包含重組腺相關病毒(rAAV)之儲料，該rAAV包含：(a)靶定中樞神經系統中之細胞的AAV衣殼；及(b)載體基因體，其包含半乳糖基神經醯胺酶編碼序列，該半乳糖基神經醯胺酶編碼序列於指導蛋白質表現的調控序列的控制下，編碼信號肽及具有SEQ ID NO：10之胺基酸43至685的胺基酸序列的成熟人類半乳糖基神經醯胺酶蛋白質，該載體基因體進一步包含將載體基因體包裝在AAV衣殼中所必需的AAV反向末端重複，其中該載體基因體被包裝於AAV衣殼中。
  37. 如請求項34至36中任一項之方法，其中該病患具有早期嬰兒克拉培氏病(early infantile Krabbe disease (EIKD))。
  38. 如請求項34至36中任一項之方法，其中該病患具有晚期嬰兒克拉培氏病(late infantile Krabbe disease (LIKD))。
  39. 如請求項34至36中任一項之方法，其中該病患具有少年克拉培氏病(juvenile Krabbe disease (JKD))。
  40. 如請求項34至36中任一項之方法，其中該病患具有青少年/成年發作型克拉培氏病。
  41. 如請求項34至40中任一項之方法，其中該AAV衣殼為AAVhu68衣殼。
  42. 如請求項34至41中任一項之方法，其中該編碼序列具有外源性肽編碼序列及SEQ ID NO：9之核苷酸127至2055或與其具有95%至99.9%同一性之序列，或SEQ ID NO：9之核苷酸1至2055之核苷酸序列或與其具有95%至99.9%同一性之序列。
  43. 如請求項34至41中任一項之方法，其中該編碼序列編碼SEQ ID NO：10之胺基酸43至685之成熟人類半乳糖基神經醯胺酶蛋白質及外源性信號肽。
  44. 如請求項34至43中任一項之方法，其中該調控序列包含：β-肌動蛋白啟動子、插入子、及兔球蛋白polyA。
  45. 如請求項34至44中任一項之方法，其中該rAAV 被投予作為與造血幹細胞移植(HSCT)或骨髓移植之協同療法。
  46. 如請求項45之方法，其中該HSCT或骨髓移植係於rAAV投予之投予前進行。
  47. 如請求項34至46中任一項之方法，其中該rAAV 被投予作為與基質減量療法之協同療法。
  48. 如請求項1至15中任一項之組成物，其中該組成物被調配用於鞘內、腦室內、或腦實質內投予。
  49. 如請求項34至47中任一項之方法，其中該rAAV 係經由鞘內、腦室內、或腦實質內投予被遞送。
  50. 如請求項1至15中任一項之組成物，其中該組成物被調配用於以單一劑量藉由電腦斷層掃描攝影-(CT-)導引枕骨下注射投予至小腦延髓池(小腦延髓池內)。
  51. 如請求項34至47中任一項之方法，其中該組成物以單一劑量藉由電腦斷層掃描攝影-(CT-)導引枕骨下注射投予至小腦延髓池(小腦延髓池內)。
  52. 如請求項1至14中任一項之組成物，其中該組成物被調配用於鞘內投予劑量為1 x 1010 GC/g腦質量至5 x 1011 GC/g腦質量之rAAV。
  53. 如請求項34至47中任一項之方法，其中該組成物以鞘內投予劑量為1 x 1010 GC/g腦質量至5 x 1011 GC/g腦質量之rAAV。
  54. 如請求項1至13中任一項之組成物，其中該組成物被調配用於投予劑量為1.4 x 1013 至4 x 1014 GC之rAAV。
  55. 如請求項34至47中任一項之方法，其中該組成物被投予至人類病患且投予劑量為1.4 x 1013 至4 x 1014 GC 之rAAV。
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