TWI781387B - 超高密度細胞儲存方法 - Google Patents
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Abstract
本發明提供用於產生超高密度凍存細胞庫的方法。在某些具體例中，這些方法採用經過修改的灌注培養技術，該等技術容許生成超高密度細胞培養物，而超高密度細胞培養物以出乎預期的高細胞密度被凍存而不需要任何細胞濃縮步驟，同時維持絕佳細胞存活率及品質。
Description
本申請案請求於2014年9月18日提申之美國臨時申請案第62/052,257號的優先權。若允許的話，前述申請案就任何與所有目的以引用的方式併入。
本發明提供用於產生超高密度凍存細胞庫的方法。在某些具體例中，這些方法採用經過修改的灌注培養技術，該等技術容許生成超高密度細胞培養物，而超高密度細胞培養物以出乎預期的高細胞密度被凍存而不需要任何細胞濃縮步驟，同時維持絕佳細胞存活率及品質。
細胞儲存廣泛用於維持冷凍、經特徵鑑定之細胞的貯存品(stocks)，該等細胞可解凍而用於若干應用，包括生產治療相關蛋白質。通常，經凍存的貯存品維持在低密度(例如約1或2 x107細胞/mL)或者經離心而產生更高密度的等分試樣儲藏。較低密度的貯存品不考慮用於有效率接種大量容積培養物，且濃縮方法可能危及細胞，從而降低冷凍貯存品的細胞存活率。為此，先前的細胞儲存方法相對效率不佳，且最後不被考慮用於從冷凍貯存品來快速生產高密度細胞培養物。因此，對於改善細胞儲存方法存在有需要。
本揭示內容提供用於創造超高密度細胞庫的改善方法。在某些具體例中，本發明方法採用經改善的灌注細胞培養技術，其容許產生能夠以出乎預期高的細胞密度凍存且不需要任何細胞濃縮步驟，同時維持極佳細胞存活率供後續用來產生細胞培養物的超高密度細胞培養物。
因此，在一個態樣中，本揭示內容提供一種用於直接從培養細胞群生產超高密度冷凍細胞庫的方法，該方法包含：在灌注生物反應器中培養細胞以獲得濃度為至少1.0 x 108細胞/mL的超高密度細胞群，其中該灌注生物反應器偶合至一個細胞貯留系統；以及向該超高密度細胞群添加抗凍劑以產生超高密度冷凍細胞庫，其中該超高密度冷凍細胞庫具有至少1.0 x 108細胞/mL的濃度，且其中在培養細胞以及向超高密度細胞群添加抗凍劑之間未進行額外濃縮步驟。
在某些具體例中，細胞貯留系統包含含有過濾器的交替切向流過濾系統。在某些具體例中，該過濾器具有至少約0.08m2的表面積。在某些具體例中，該過濾器具有約0.08m2至約0.3m2、約0.3m2至約0.5m2、約0.5m2至約1.0m2、約0.7m2至約0.8m2、約1.0m2至約2.0m2、約2.0m2至約3.0m2、約3.0m2至約4.0m2，或約4.0m2至約5.5m2的表面積。在某些具體例中，該過濾器具有選自由0.2μm、0.4μm以及0.65μm組成之群的孔徑。在其他具體例中，該過濾器具有選自由0.7μm、1.2μm以及7μm組成之群的孔徑。
在某些具體例中，超高密度細胞群具有選自由1.0 x 108細胞/mL、約1.1 x 108細胞/mL、約1.2 x 108細胞/mL、約1.3 x 108細胞/mL、約1.4 x 108細胞/mL、約1.5 x 108細胞/mL、約1.6 x 108細胞/mL、約1.7 x 108細胞/mL、約1.8 x 108細胞/mL、約1.9 x 108細胞/mL，以及約2.0 x 108
細胞/mL組成之群的活細胞密度。
在某些具體例中，抗凍劑包含以約5%至約10%的最終濃度(vol/vol)向超高密度細胞群添加二甲亞碸(DMSO)。在某些具體例中，凍存包含在適用於貯存的容器中於凍存條件下冷凍至少一部份超高密度細胞群。
在某些具體例中，該容器為小瓶。在某些具體例中，該超高密度冷凍細胞庫包含約4.5 x 108細胞/小瓶。
在某些具體例中，該容器為冷凍袋。在某些具體例中，該冷凍袋具有約5至約150mL的容積。在某些具體例中，該超高密度冷凍細胞庫具有至少約1.0 x 108細胞/mL的細胞密度。
在某些具體例中，灌注生物反應器中的灌注率是介於約0.02nL/細胞/天至約0.5nL/細胞/天。在某些具體例中，灌注生物反應器中的灌注率是介於每天0與15個反應器容積。
在某些具體例中，灌注生物反應器細胞培養物具有介於約6.8至約7.2的pH。
在某些具體例中，灌注生物反應器細胞培養物具有至少約30%的溶氧濃度(DO)。
在某些具體例中，生物反應器為可撓性袋生物反應器。在某些具體例中，生物反應器包含內建過濾器。
在某些具體例中，超高密度冷凍細胞庫具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%，或至少約95%的解凍後細胞存活率。
在某些具體例中，該等細胞為哺乳動物細胞。在某些具體例中，該等哺乳動物選自由以下組成之群：CHO、CHO-DBX11、CHO-DG44、CHO-S、CHO-K1、Vero、BHK、HeLa、COS、MDCK、HEK-293、NIH-3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT20、T47D、
NS0、CRL7030、HsS78Bst細胞、PER.C6、SP2/0-Agl4，以及融合瘤細胞。在某些具體例中，該等細胞為經轉染細胞。在某些具體例中，該等細胞表現治療性蛋白質。
在某些具體例中：該灌注生物反應器包含可撓性袋生物反應器；該過濾器具有至少0.3m2的過濾器表面積以及至少50kDa的分子量截斷(MWCO)尺寸；添加至超高密度細胞群的抗凍劑為DMSO；且該超高密度冷凍細胞庫包含約5%至約10%，vol/vol DMSO。
在某些具體例中，培養物的pH以及DO是受到自動方法所控制。在某些具體例中，培養物的pH以及DO是受到非自動方法所控制。在某些具體例中，pH以及DO是透過下列中的任一或多者所控制：調節被引入培養物的氣體混合物、調節生物反應器的搖動速率，或調節生物反應器的搖動角度。在某些具體例中，生物反應器在8°的搖動角度下以15rpm搖動。在某些具體例中，生物反應器在10°的搖動角度下以22rpm搖動。在某些具體例中，生物反應器在12°的搖動角度下以25rpm搖動。
在某些具體例中，該超高密度細胞群在添加抗凍劑以及分裝之前與期間被冷卻並維持在約4℃的溫度下。在某些具體例中，該超高密度細胞群在添加抗凍劑以及分裝期間被維持在約20℃至約26℃的溫度下。在某些具體例中，該超高密度細胞群透過使用冰水浴在添加抗凍劑與分裝期間被維持非控制低溫下。
圖1：是超高密度細胞凍存方法的圖式。
圖2：是說明rCHO細胞株1例示性培養物的活細胞密度(細胞/mL)、灌注率(RV/天)，以及10X細胞比灌注率(nL/細胞-天)的圖。
圖3：是顯示rCHO細胞株1培養物的離線pH概況的圖。
圖4A-C：是連續圖，說明rCHO細胞株1之5-mL超-HD細胞庫等分式樣的解凍後細胞生長概況(A)、解凍後晚期細胞凋亡細胞的百分率(B)，及比生產率(單位/E9細胞-天)。
圖5：是說明rCHO細胞株2例示性培養物的活細胞密度(細胞/mL)、灌注率(RV/天)，以及10X細胞比灌注率(nL/細胞-天)的圖。
圖6：是說明rCHO細胞株2培養物的離線pH概況的圖。
圖7：是說明當以0.5 x 106vc/mL接種在250-mL與3-L搖瓶中時，rCHO細胞株2以活細胞密度Xv(細胞/mL；實線)與存活率(V虛線)為基礎的細胞生長的圖。
圖8：是說明當以1.0 x 106vc/mL接種在250-mL與3-L搖瓶中時，rCHO細胞株2以活細胞密度Xv(細胞/mL；實線)與存活率(虛線)為基礎的細胞生長的圖。
圖9：是說明當以0.5 x 106vc/mL接種在250-mL與3-L搖瓶中時，rCHO細胞株2培養物的晚期細胞凋亡與死細胞百分率的圖。
圖10：是說明當以1.0 x 106vc/mL接種在250-mL與3-L搖瓶中時，rCHO細胞株2培養物的晚期細胞凋亡與死細胞百分率的圖。
圖11：是說明當以0.5 x 106vc/mL接種在250-mL與3-L搖瓶中時，rCHO細胞株2的搖瓶培養物的比生產率(SPR)之圖。
圖12：是說明當以1.0 x 106vc/mL接種在250-mL與3-L搖瓶中時，rCHO細胞株2的搖瓶培養物的比生產率(SPR)之圖。
圖13：是說明rCHO細胞株2在WAVE袋中基於活細胞密度Xv(細胞/mL；實線)與存活率(虛線)之細胞生長的圖。
圖14：是說明rCHO細胞株2培養物的晚期細胞凋亡與死細胞的百分率之圖。
圖15：是說明rCHO細胞株3例示性培養物的活細胞密度(細胞/mL)、灌注率(RV/天)，以及10X細胞比灌注率(nL/細胞-天)之圖。
圖16：是顯示rCHO細胞株3培養物的離線pH概況之圖。
圖17A-C：是說明下列連續圖：(A)rCHO細胞株3燒瓶培養物的細胞生長(實線)與存活率(虛線)；(B)rCHO細胞株3燒瓶培養物的晚期細胞凋亡與死細胞百分率；以及(C)比生產率(SPR)。
圖18：是比較rCHO細胞株3例示性培養物使用內部培養基(黑)與CD CHO培養基(灰)的活細胞密度(細胞/mL，實線)與存活率(虛線)之圖。
圖19：是比較rCHO細胞株3例示性培養物使用內部培養基(黑)與CD CHO培養基(灰)的灌注率(圓，實線)與細胞比灌注率(三角形，虛線)之圖。
圖20：是比較rCHO細胞株1例示性培養物使用補充有Efficient Feed B之CD CHO培養基(黑)與CD CHO培養基(灰)的活細胞密度(細胞/mL，實線)與存活率(虛線)之圖。
圖21：是比較rCHO細胞株1例示性培養物使用補充有Efficient Feed B之CD CHO培養基(黑)與CD CHO培養基(灰)的灌注率(圓，實線)與細胞比灌注率(三角形，虛線)之圖。
圖22：是說明rCHO細胞株3例示性培養物使用20-L WAVE生物反應器(10-L工作容積，黑)及10-L WAVE生物反應器(5-L工作容積，灰)的活細胞密度(細胞/mL，實線)及存活率(虛線)之圖。
本揭示內容提供一種超高密度細胞儲存方法，其包含使用連結至非離心細胞貯留裝置的灌注培養系統。
I.定義
如本文所用，術語「批次培養」意指一種細胞培養技術，其中某個數量的新鮮培養基接種快速進入對數生長期的細胞且其中培養的生長培養基未持續被移持並更換為新鮮培養基。
如本文所用，術語「饋料批次培養」意指一種細胞培養技術，其中某個數量的新鮮培養基最初接種細胞，並且培養終止前在有或沒有週期性細胞及/或產物收取的情況下，於培養過程期間將額外培養營養物質饋送(連續或分次漸增)至培養物。
如本文所用，術語「灌注培養」意指一種細胞培養技術，其中某個數量的新鮮培養基接種快速進入對數生長期(如上)的細胞且其中從培養物連續移除生長培養基並更換為新鮮培養基。
如本文所用，術語「生物反應器」應意指一種用於培養細胞的容器。
在一個具體例中，該生物反應器為「可撓性袋生物反應器」。「可撓性袋生物反應器」是一種能夠容納液體培養基以及細胞接種物的無菌室，其另外包含連接器、接口、轉接器以及可撓性管路。在一個具體例中，該室是由塑膠製成。在一個特定具體例中，該室是由多層疊置的透明塑膠製成。在又一個特定具體例中，該室是由多層疊置的透明塑膠製成且具有一個由USP第VI級乙烯乙酸乙烯酯/低密度聚乙烯共聚物製成的流體接觸層，而外層是由低密度聚乙烯製成。
另外，連接器、接口以及轉接器可由任一類塑膠製成，塑膠包括但不限於：聚乙烯、聚丙烯以及聚碳酸酯，而管路可由任一類塑膠建構而成，塑膠包括但不限於：熱塑性彈性體或聚矽氧(例如鉑硬化聚矽氧)。
適當的可撓性袋生物反應器通常可在技藝中發現到，且包括但不
限於彼等描述於美國專利第6,544,788號中者，該專利案整體以引用的方式併入。
該可撓性袋生物反應器可部分填充培養基且接而膨脹至堅硬。之後可放置在搖動台(諸如GE Life Sciences的BASE20/50EHT搖動裝置)上，該搖動台以預設搖動角度以及預設搖動速率前後搖動。此搖動動作包括培養基的波樣動作，促使攪動與氧傳輸以增進細胞培養物的性能。此搖動角度可為至少約4度，例如約4度、5度、6度、7度、8度、9度、10度、11度或12度。另外，此搖動速率可設定為下列的每分鐘搖動速率(rpm)：至少約6rpm、約7rpm、8rpm、9rpm、10rpm、11rpm、12rpm、13rpm、14rpm、15rpm、16rpm、17rpm、18rpm、19rpm、20rpm、21rpm、22rpm、23rpm、24rpm、25rpm、26rpm、27rpm、28rpm、29rpm、30rpm、31rpm、32rpm、33rpm、34rpm、35rpm、36rpm、37rpm、38rpm、39rpm或40rpm。在一個特定具體例中，每分鐘的搖動速率為約22rpm。
如本文所用，術語「細胞貯留系統」意指所有能夠透過使用過濾器將細胞與培養基及其中之廢棄產物分開來的裝置。過濾器可包括膜、陶瓷或金屬過濾器，呈任何形狀(包括螺形旋繞、管狀，或片狀)。過濾器可具有不同表面積。例如，過濾器表面積可為0.08m2至約5.5m2，例如約0.08m2、0.09m2、0.1m2、0.2m2、0.3m2、0.4m2、0.5m2、0.6m2、0.7m2、0.77m2、0.8m2、0.9m2、1.0m2、1.1m2、1.2m2、1.3m2、1.4m2、1.5m2、1.6m2、1.7m2、1.8m2、1.9m2、2.0m2、2.1m2、2.2m2、2.3m2、2.4m2、2.5m2、2.6m2、2.7m2、2.8m2、2.9m2、3.0m2、3.1m2、3.2m2、3.3m2、3.4m2、3.5m2、3.6m2、3.7m2、3.8m2、3.9m2、4.0m2、4.1m2、4.2m2、4.3m2、4.4m2、4.5m2、4.6m2、4.7m2、4.8m2、4.9m2、5.0m2、5.1m2、5.2m2、5.3m2、5.4m2或5.5m2。
在某些具體例中，過濾器模組具有約10千道耳頓(kDa)至約100千道耳頓(kDa)的分子量截斷(MWCO)尺寸，例如其為約10kDa、20kDa、30kDa、40kDa、50kDa、60kDa、70kDa、80kDa、90kDa或100kDa。在其他具體例中，過濾器模組具有約0.1μm至約7μm的篩目，例如約0.1μm、0.2μm、0.3μm、0.4μm、0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm、0.9μm、1.0μm、1.1μm、1.2μm、1.3μm、1.4μm、1.5μm、1.6μm、1.7μm、1.8μm、1.9μm、2.0μm、2.1μm、2.2μm、2.3μm、2.4μm、2.5μm、2.6μm、2.7μm、2.8μm、2.9μm、3.0μm、3.1μm、3.2μm、3.3μm、3.4μm、3.5μm、3.6μm、3.7μm、3.8μm、3.9μm、4.0μm、4.1μm、4.2μm、4.3μm、4.4μm、4.5μm、4.6μm、4.7μm、4.8μm、4.9μm、5.0μm、5.1μm、5.2μm、5.3μm、5.4μm、5.5μm、5.6μm、5.7μm、5.8μm、5.9μm、6.0μm、6.1μm、6.2μm、6.3μm、6.4μm、6.5μm、6.6μm、6.7μm、6.8μm、6.9μm或7.0μm。
如本文所用，術語「凍存」意指一種透過冷卻並儲存於零度以下溫度來保存容易因為時間或因為酵素或化學活性而受到損傷的細胞、組織或任何其他物質的方法。
如本文所用，術語「冷凍儲存」意指一種將細胞與抗凍劑(例如在有或沒有羥乙基澱粉(HES)存在下與DMSO)混合並在適於儲存在凍存條件下放置於容器中的技術。這些容器接而使用技藝中已知技術予以冷凍並儲存在低溫下，通常是介於約-130℃與約-196之間。透過這個方法獲得的細胞集聚為細胞庫。
在一個具體例中，細胞庫為超高密度細胞庫。如本文所用，術語「超高密度細胞庫」應意指經冷凍儲存的細胞等分試樣，其以超高密度冷凍，其中密度為至少約1 x 108活細胞/mL，例如約1 x 108活細胞/mL、約1.1 x 108活細胞/mL、約1.2 x 108活細胞/mL、約1.3 x 108活細
胞/mL、約1.4 x 108活細胞/mL、約1.5 x 108活細胞/mL、約1.6 x 108活細胞/mL、約1.7 x 108活細胞/mL、約1.8 x 108活細胞/mL、約1.9 x 108活細胞/mL、約2 x 108活細胞/mL、約3 x 108活細胞/mL、約4 x 108活細胞/mL，或約5 x 108活細胞/mL。細胞依據技藝中可用任一方法並在任一適於儲存在凍存條件下的容器中予以冷凍。
在另一具體例中，細胞庫為種原細胞庫(master cell bank)。如本文所用，術語「種源細胞庫」應意指一種細胞培養物(例如經充分特徵鑑定的細胞)，其自單株長成、分裝至儲存容器(例如分裝至單一操作的容器)中，並且如上述儲存在凍存條件下。在某些具體例中，該等細胞適於稍後用於生產細胞培養物並進一步收取由此生產之治療相關蛋白質。
在另一個具體例中，該細胞庫為操作細胞庫。如本文所用，術語「操作細胞庫」應意指一種細胞培養物(例如經充分特徵鑑定的細胞)，其自種原細胞庫的單一小瓶中長成或由兩個種原細胞庫的集中小管長成、分裝至儲存容器(例如分配至單一操作的容器)中，並且如上述儲存在凍存條件下。在某些具體例中，該等細胞適於稍後用於生產細胞培養物並進一步收取由此生產之治療相關蛋白質。
在另一個具體例中，細胞庫為迷你細胞庫。如本文所用，術語「迷你庫」應意指細胞等分試樣，其已依據「冷凍儲存」程序(如上所述)凍存但由比通常建立一個細胞庫所用更少的樣本所組成。這類型的細胞庫通常用來在建立細胞庫(諸如「種原細胞庫」)之前最佳化被考慮用來凍存細胞株的條件。例如，「迷你庫」用來決定本揭示內容中所述之超高密度細胞儲存程序的最佳細胞密度。
如本文所用，術語「適於儲存在凍存條件下的容器」包括任一種可在適於細胞在約-130℃與約-196℃之間儲存之條件下使用的容器。
這些容器包括但不限於由適於凍存的材料製成的小瓶。這些材料包括聚合物(例如聚四氟乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯或聚丙烯)。此外，表面處理可施用至凍存小瓶的表面，以改善凍存條件(例如親水性塗層，其降低吸附與變性)。在例示性具體例中，小瓶可具有超過約0.1mL的容積，例如小瓶可具有約0.1mL、約0.5mL、約0.75mL、約1mL、約1.5mL、約2mL、約2.5mL、約4.5mL、約10mL、約15mL、約20mL、約25mL，或約50mL的容積。容器亦可為冷凍袋，其可具有約30mL、約50mL、約100mL、約150mL、約200mL、約300mL、約400mL，或約500mL的容積。
如本文所用，術語「冷凍袋」是一個能夠容納液體培養基的無菌室，適於細胞儲存在約-130℃與約-196℃之間，且另外包含連接器、接口、轉接器以及可撓性管路。該冷凍袋可由任何適當材料所構成，包括但不限於聚合物(諸如聚四氟乙烯(PTFE)、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、氟化乙烯丙烯(FEP)、聚烯烴及乙烯乙酸乙烯酯(EVA))。例示性冷凍袋包括但不限於：KryoSure®冷凍儲存袋(Saint-Gobain)、PermaLifeTM袋(OriGen Biomedical)、CryoStore冷凍袋(OriGen Biomedical)、Freeze-PakTM Biocontainers(Charter Medical)，以及美國臨時申請案第62/037,181號(Merial Ltd.,a Sanofi company)中揭示的袋，其整體以引用的方式併入本文。在某些具體例中，冷凍袋可維持密封態的細胞儲存系統(例如透過使用至少兩個無菌可焊導管，容許袋的「密封系統」充填)。
如本文所用，術語「搖瓶」應意指用作為培養燒瓶的容器，其中培養基與細胞培養物在培育期間持續地攪動。
如本文所用，術語「搖瓶接種培養(shake flask seed train」應意指一種細胞擴增的方法，其中細胞等分試樣首先培養(接種)於搖瓶中並
在其中生長。依據細胞的生長速率來培養細胞並且通常在其生長期間分至較大及/或多個容器，直到生物量達到足以接種生物反應器的程度。
如本文所用，術語「接種密度」應意指接種燒瓶或生物反應器的初始細胞密度。
如本文所用，術語「治療相關蛋白質」應意指任一種可用於治療疾病或病症或在動物(包括哺乳動物，諸如小鼠、大鼠、猴、猿及人類)體內治療疾病或病症的蛋白質。這些蛋白質可包括，但不限於結合多肽(諸如單株抗體)、Fc融合蛋白、抗凝血劑、血液因子、成骨蛋白、經工程化蛋白骨架、酵素、生長因子、激素、干擾素、介白素及血栓溶解劑。
如本文所用，術語「結合多肽」或「結合多肽」應意指一種含有至少一個結合部位的多肽(例如抗體)，該結合部位負責選擇性結合至感興趣的目標抗原(例如人類抗原)。例示性結合部位包括抗體可變域、受體的配體結合部位，或配體的受體結合部位。在某些態樣中，結合多肽包含多個(例如兩個、三個、四個或更多個)結合部位。
如本文所用，術語「抗體」意指集合體(例如完整抗體分子、抗體片段或其變體)，其對感興趣抗原(例如腫瘤相關抗原)具有明顯已知的具體免疫反應活性。抗體及免疫球蛋白包含輕鏈與重鏈，其間有或沒有鏈間共價鍵連。在脊椎動物系統中，基礎免疫球蛋白結構是相對充分了解的。
上位術語「抗體」包含五個不同類型能夠在生物化學上加以區別的抗體。所有五類抗體明顯落在本揭示內容範疇內，下面討論大體上是針對IgG類的免疫球蛋白分子。關於IgG，免疫球蛋白包含兩個分子量大約23,000道耳頓的相同輕鏈，以及兩個分子量53,000-70,000的相
同重鏈。四個鏈藉由雙硫鍵以「Y」構型連結，其中輕鏈在「Y」開口處起撐托重鏈並且連續通過可變區。
如本文所用，術語「溶氧」或「DO」是以飽和空氣為基準，存在於給定液體(諸如細胞培養基)中的溶解氧氣百分率。
如本文所用，術語「細胞比灌注率」(CSPR)應意指細胞培養基饋送至細胞培養物的速率，表示為每天每個活細胞添加的培養基容積(Ozturk,SS.Engineering challenges in high density culture systems.Cytotechnology.1996；22：3-16)。
如本文所用，術語「約」應意指某一個定值之誤差為10%的範圍。因此，當術語「約」用來修飾某個定值時，所指範圍應含括定值±0.01%、0.02%、0.05%、0.1%、0.2%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%內的任一數字。
II.灌注細胞培養
傳統細胞培養涉及「批次」培養程序。在這類的培養中，某量的新鮮培養基接種快速進入對數生長期的細胞。因為這些細胞生長並分裂，它們消耗可自培養基獲得的營養並且分泌有害廢棄產物。隨著時間經過，培養物將進入停滯生長期，以及最終進入衰退期。儘管修改「批次」培養程序可使其隨著時間更有效率，但所產生的修改批次培養程序仍然會造成快速生長與衰退循環。此外，「批次」培養程序達到容許高密度細胞儲存所需之細胞密度程度的能力有限。
「饋送批次」培養程序意指另一種勝過傳統「批次」培養技術的改進細胞培養技術。儘管這個程序容許更高細胞密度生長，但其容許有效高密度細胞培養物生長以及因此有效率產生高密度細胞儲存用之細胞仍有限。
在較佳具體例中，本發明採用灌注培養程序。灌注培養是一種生長細長的方法，其中某量的新鮮培養基接種快速進入對數生長期(如上)的細胞且其中生長培養基連續地自培養物被移除並更換成新鮮培養基。以此，培養物持續地接收具有高營養含量的新鮮培養基，同時含有廢棄產物與低營養含量的培養基被移除。此類的培養容許維持細胞對數生長，其中至少一半的培養物容積每天交換且細胞密度可比那些在傳統或經修改批次培養者高得多(增加2倍至超過10倍)。在本發明的一個具體例中，細胞比灌注率(CSPR)可介於0.02nL細胞-1天-1與約0.5nL細胞-1天-1，例如其可為約0.02nL細胞-1天-1、0.025nL細胞-1天-1、0.05nL細胞-1天-1、0.1nL細胞-1天-1、0.2nL細胞-1天-1、0.3nL細胞-1天-1、0.4nL細胞-1天-1，或0.5nL細胞-1天-1。在本發明的另一個具體例中，灌注率可以測為每天的反應器容積且可介於每天0與15個反應器容積，例如其可為每天約0個反應器容積、每天約0.5個反應器容積、每天約1 reactor volume per day、每天約2個反應器容積、每天約3個反應器容積、每天約4個反應器容積、每天約5個反應器容積、每天約6個反應器容積、每天約7個反應器容積、每天約8個反應器容積、每天約9個反應器容積、每天約10個反應器容積、每天約11個反應器容積、每天約12個反應器容積、每天約13個反應器容積、每天約14個反應器容積，或每天約15個反應器容積。在一個特定具體例中，灌注培養可以在生物反應器中以最少一個液浸管來進行。
在某些具體例中，培養物的pH、溫度、溶氧濃度(DO)，以及滲透壓可以調節至使得培養物健康及產量最大化。控制培養物DO與pH的一個方法是透過自動回饋控制器。此類的自動控制器是使用微處理器為基礎的電腦來操作，以監控並調節培養物的pH與DO，從而維持最佳的細胞生長條件。但是，這些自動回饋控制系統所費不貲。因此，
在某些具體例中，可採用非自動方法控制這些參數。在一個例示性方法中，可使用下列任一者來控制選定參數(例如pH或DO)：隨著培養調節氣體混合物流、調節WAVE®搖動率，或調節培養物的搖動角度。在某些具體例中，可採用自動回饋控制以及非自動控制這兩者。
在一個具體例中，二氧化碳氣體的起始含量為約10%而氧氣的起始含量為約20%，且氣流速率為每分鐘約0.2公升(lpm)。若pH不超過約6.9，則CO2設定點可從10%降低至5%。若pH在之後的時間點仍不超過約6.9，則CO2設定點可進一步從5%降低至0%。若pH仍不超過約6.9，則可增加灌注率。若DO不超過約45%，則O2設定點應從20%提高至30%。若DO在之後的時間點仍不超過45%，則O2含量應從30%提高至40%，搖動速度應增加至約25rpm，且搖動角度應改成12°。
i.細胞培養基
可在本發明方法中使用適用於培養細胞的任一類型細胞培養基。關於選擇適當培養基的指引為技藝中已知並且提供於例如Freshney,R.I.Culture of Animal Cells(a manual of basic techniques),4th edition 2000,Wiley-Liss的第8與9章；以及Doyle,A.,Griffiths,J.B.,Newell,D.G.Cell & Tissue Culture：Laboratory Procedures 1993,John Wiley & Sons中。這些引用資料各自以整體併入。技藝中有更多在無動物衍生組分以及無蛋白質條件下用於製備並維持細胞培養的方法(包括關於CHO細胞的方法)，諸如彼等在國際專利申請案第WO97/05240號、第WO 96/26266號與第WO 00/11102號，以及美國專利第6,100,061號、第6,475,725號與第8,084,252號中所見者。先前文件各自整體以引用的方式併入。在本發明的一個具體例中，可使用無動物衍生組分(ADC)培養基。習知合成最低培養基可含有無機鹽、胺基酸、維生素、碳水化合物源，及水。在本發明的一個特定具體例中，
可使用的培養基為CD-CHO(GIBCO,Invitrogen Corp.；無動物來源培養基，其為化學限定且不含未知來源的蛋白質、水解產物，或組分)。此外，培養基可具有額外組分，包括麩醯胺酸及/或胺甲喋呤或其他有助生長或附著的因子。在一個特定具體例中，額外組分可為GLUTAMAX-1或L-麩醯胺酸，以約2mM與約8mM之間添加，例如約2mM、約3mM、約4mM、約5mM、約6mM、約7mM或約8mM。
ii.宿主細胞及表現載體
在某些具體例中，在本發明細胞儲存程序中採用的細胞為帶有表現構築體用以表現治療相關蛋白質或其他感興趣多肽的宿主細胞。可依據本文所述方法使用可用來表現感興趣多肽(例如結合多肽)的任一細胞。細胞可視情況含有天然或重組核酸序列，例如編碼感興趣多肽的表現載體。表現載體可視情況含有適當轉錄與轉譯控制並且使用技藝中已知的重組DNA技術來加以構築。表現載體可以透過技藝中已知的技術轉移至任何宿主細胞，而經轉形細胞接而可依據本發明方法加以培養而產生高密度細胞庫。此外，高密度細胞庫之後可依據技藝中已知技術加以解凍並培養，以生產感興趣的編碼蛋白質，若需要的話，此蛋白質隨後經純化。
在某些具體例中，可使用各種宿主表現系統來生產治療相關蛋白質。此外，宿主表現系統可為哺乳動物細胞系統(例如CHO、CHO-DBX11、CHO-DG44、CHO-S、CHO-K1、Vero、BHK、HeLa、COS、MDCK、HEK-293、NIH-3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT20、T47D、NS0、CRL7030、HsS78Bst細胞、PER.C6、SP2/0-Agl4，以及融合瘤細胞)，其帶有包含衍生自哺乳動物細胞基因體之啟動子的重組表現構築體。關於哺乳動物細胞，也可以採用病毒為主的表現系統(參見例如Logan et al,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA
8：355-359，其整體以引用方式併入)。表現效率可以透過納入包括(但不限於)適當轉錄增強要素及轉錄終止子而獲得提升(參見例如Bittner et al.,1987,Methods in Enzymol.153：516-544，其整體以引用方式併入)。
在其他具體例中，可以選擇調節感興趣序列表現或調節並加工處理呈特定所需形式之基因產物的宿主細胞系。不同宿主細胞對轉譯後加工處理與蛋白質及基因產物修飾具有特徵與特定機制。可選定適當細胞株或宿主系統以確保所表現之多肽(例如結合多肽)正確修飾及加工處理。此等細胞包括，例如已建立的哺乳動物細胞株及動物細胞，還有昆蟲細胞株、真菌細胞與酵母菌細胞。
iii.生物反應器
可在本發明方法中採用任一種適用於在灌注培養條件下培養細胞的生物反應器。生物反應器可使用細胞等分試樣以適當接種密度予以接種(諸如細胞小瓶或種原培養物的細胞，例如搖瓶或搖瓶接種培養，其經培養至那個密度)。培養物的適當接種密度取決於數個因素，包括所用細胞以及待接種生物反應器的類型。適當的接種密度可以使用技藝中可用方法予以決定。
在某些具體例中，生物反應器可以是拋棄式，例如生物反應器可以是透過可撓性管路而連結至細胞貯留裝置的可撓性袋或塑膠燒瓶。設計可包括，但不必然包括入口導管以及出口或接種導管，其經無菌焊接或連結至真核細胞的來源。在某些具體例中，生物反應器具有至少約1L的容積，例如約1L、2L、5L、10L、20L、50L、75L、85L、100L、150L或400L。在本發明的一個特定具體例中，生物反應器為10L可撓性袋，其經客製化而具有一個或兩個用來移除培養基或產物的液浸管。例示性拋棄式生物反應器為WAVE®細胞袋生物反應器
(GE Healthcare,Pittsburgh,PA)，諸如20L WAVE®生物反應器。這些是灌注生物反應器系統，描述於以下文件中：Singh,1999,Disposable bioreactor for cell culture using wave-induced agitation,Cytotechnology,p.149-158，其整體以引用的方式併入。
生物反應器的工作容積是培養物所占容積。工作容積可以是，例如培養物的約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或更高，但較佳不超過約75%。
或者，生物反應器可以是非拋棄式。例如，生物反應器可以由不銹鋼或玻璃製成。適用於本發明的替用性生物反應器包括，但不限於：可藉由搖動、震盪或攪拌而混合的搖瓶、攪拌槽容器、氣泡容器，以及拋棄式袋。
在一個具體例中，生物反應器可偶合至細胞貯留系統，包括但不限於內建過濾器、脫水籃、切向流過濾(TFF)系統，以及交替切向流過濾(ATF)系統。
III.細胞貯存
灌注培養取決於從培養物移除營養耗竭且含有廢棄產物之培養基，同時將對細胞的損害減至最低的能力。將耗竭培養基與培養細胞分離之細胞貯存起始方法通常會因為例如產生剪力而損害細胞。這樣的細胞損害會致使細胞堵塞過濾器還有灌注裝置故障，而灌注裝置許多是培養系統內部的。因此，在一個態樣中，本揭示內容提供一種利用容許培養基交換之「細胞貯留系統」的方法。
在一個具體例中，所用細胞貯留系統的類型為「內建」型過濾器，其中過濾器設置在生物反應器的腔室中並且可在腔室內自由移除。過濾器可與引出腔室的管路之一偶合，從而容許將經過濾培養基從培養
物中抽離。「內建」型過濾器的一個實例可以在美國專利第6,544,788號中找到，其整體以引用的方式併入。
在另一個具體例中，所用細胞貯留系統是切向流過濾系統(TFF)。在TFF系統中，經由附接至過濾模組與培養容器之間產生貫穿過濾器之切向流的管路的泵，培養基從培養容器經由過濾模組，然後循環回到培養容器。第二個泵位在過濾器模組的濾液側且用來控制濾液移除的速率。在此系統中偏好使用中空纖維膜過濾器，因為它們容易滅菌且容許維持均勻流動通過過濾器模組。但是，若在此系統中採用中空纖維過濾器，則它們容易因為單向流造成在內室入口處有顆粒物質聚集而堵塞。
在一個特定具體例中，所用細胞貯留系統的類型為交替切向流(ATF)系統。在ATF型細胞貯留系統中，過濾隔室在一端連接至儲存容器而在另一端連接至隔膜泵。泵首先將培養基從容器移動通過過濾元件到泵，然後逆向將培養基從泵通過過濾器送回到容器中，產生雙向或交替流。這稱為交替切向流(ATF)，因為在過濾器模組處有交替切向流，亦即一個流與過濾器模組的膜表面同向(與那個表面切向)，而有另一個流實質上垂直於那些表面。此類過濾器自2000年起存在於文獻中，且產生快速、低剪力、均勻流。ATF過濾可以透過技藝中已知的方法獲得，諸如美國專利第6,544,424號中所述，其整體以引用方式併入。此外，交替切向流系統在商業上可由諸如Refine Technology的製造商取得，並包括各種模組，諸如ATF2、ATF4、ATF6、ATF8與ATF10系統。
在本發明的另一個特定具體例中，過濾器為管膜過濾器，而另外可為中空纖維過濾器。
如上文所指，本發明方法容許細胞有效率地生長至超高密度。在
本發明的一個特定具體例中，培養物生長到至少約1 x 108細胞/mL的密度，例如到約1 x 108細胞/mL、約1.1 x 108細胞/mL、約1.2 x 108細胞/mL、約1.3 x 108細胞/mL、約1.4 x 108細胞/mL、約1.5 x 108細胞/mL、約1.6 x 108細胞/mL、約1.7 x 108細胞/mL、約1.8 x 108細胞/mL、約1.9 x 108細胞/mL，或約2 x 108細胞/mL。培養物生長至此等高濃度容許立即凍存高密度貯存品而不需要透過離心或非離心方法進一步濃縮細胞群。
IV.凍存及細胞儲存
凍存意指容易因為時間或因為酵素或化學活性而受損之細胞、組織或任何其他物質透過冷卻並儲存在零度下溫度而保存的過程。重要細胞株的凍存重要性不能被低估，因為(在其他重要益處中)這容許維持細胞株而不需要將它們維持在恆定培養，降低汙染風險，並且減少遺傳漂變風險。
在使用凍存方法時，達成並維持在這些低溫下而不因為在冷凍過程期間形成冰造成額外損傷至為重要。在技藝中的方法習知使用降低對細胞之冷凍損傷的物質，稱為抗凍劑。抗凍劑可以在冷凍過程之前添加至細胞培養基。在一個特定具體例中，所用抗凍劑可以是下列之一或多者：甘油或二甲亞碸(DMSO)。另外，抗凍劑可以在有或沒有羥乙基澱粉(HES)存在下添加。在又一個特定具體例中，DMSO可以至少約5%的濃度添加，例如其可以約5%、約6%、約7%、約8%、約9%、約10%、約11%、約12%、約13%、約14%、約15%、約16%、約17%、約18%、約19%，或以約20%添加。
添加有抗凍劑的培養物可以分裝至適用於儲存在凍存條件下的容器中。在一個具體例中，此容器可以是由包括(但不限於)聚合物(諸
如聚四氟乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯或聚丙烯)之材料製成的小瓶。在一個特定具體例中，小瓶可有額外表面處理以改善凍存條件(例如親水性塗層，其降低吸附與變性)。在例示性具體例中，小瓶可具有超過約0.1mL的容積，例如小瓶可具有約0.1mL、約0.5mL、約0.75mL、約1mL、約1.5mL、約2mL、約2.5mL、約4.5mL、約10mL、約15mL、約20mL、約25mL，或約50mL的容積。在另一個具體例中，容器亦可為冷凍袋，具有超過約30mL的容積，例如冷凍袋可具有約30mL、約50mL、約100mL、約150mL、約200mL、約300mL、約400mL，或約500mL的容積。冷凍袋可由任何適當材料製成，包括但不限於聚合物(諸如聚四氟乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、氟化乙烯丙烯(FEP)、聚烯烴及乙烯乙酸乙烯酯(EVA))。例示性拋棄式生物反應器包括但不限於：KryoSure®凍存袋、PermaLifeTM袋(OriGen Biomedical)、CryoStore冷凍袋(OriGen Biomedical)、Freeze-PakTM Biocontainers(Charter Medical)，以及美國臨時申請案第62/037,181號(Merial Ltd.,a Sanofi company)中揭示的袋，其整體以引用的方式併入本文。
在儲存於低溫(通常介於約-130℃與約-196℃之間)下之前，這些容器接著使用技藝中已知的技術及裝置予以冷凍。在一個具體例中，所用冷凍技術可以是控制速率及緩慢冷凍(也稱為緩慢程控冷凍，或SPF)。透過這個方法獲得的細胞集聚為細胞庫。
在一個具體例中，細胞庫可以是，但不限於超高密度細胞庫、種原細胞庫、操作細胞庫或迷你庫。
V.測定細胞存活率
如上所指，本發明方法容許在高密度下儲存細胞，同時維持絕佳
細胞存活率供後續使用。如本文所用，術語「細胞存活率」可定義為給定樣品中的健康細胞數目或百分率。細胞存活率可以使用技藝中任何可用方法在所述超高密度細胞儲存方法任一點時來測定。測定細胞存活率的常用方法大多是基於活細胞具有完整細胞壁能排除特定染料(諸如錐蟲藍(一種偶氮染料)、伊紅或丙啶)而死細胞不會的原理。
在一個具體例中，錐蟲藍可用來將某量的細胞染色並從而指出具有完整細胞膜(未染色)之細胞存在以及具有破裂膜之細胞存在(藍色)。接著計數這些細胞以決定培養物中的活細胞與死細胞數目，並且呈現為百分率來指明培養物的相對健康狀態。
在一個特定具體例中，細胞存活率可以使用已長成超高密度，但尚未冷凍的培養物(亦即冷凍前或解凍前培養物)來測定。在一個特定具體例中，細胞存活率可以使用已冷凍且之後解凍的培養物(亦即冷凍後或解凍後培養物)來測定。
在一個特定具體例中，細胞存活率為至少約60%，例如約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%，或約95%。在某些具體例中，細胞的解凍後存活率為至少約80%，例如至少約85%、90%，或95%，包括至多100%。
VI.治療相關蛋白質
衍生自本發明超高密度細胞儲存方法的細胞可用於在稍後生產期中用來製造蛋白質。例如，依據本發明方法在生物反應器中增生並以高密度庫等分試樣冷凍的細胞可用來生產生物物質，包括治療相關蛋白質。這些生物物質可包括，但不限於：病毒(參見例如WO200138362)、結合多肽(諸如抗體，例如單株抗體及其片段，例如Fab片段)；Fc融合蛋白、抗凝血劑、血液因子、成骨蛋白、經工程化
蛋白骨架、酵素、生長因子、激素、干擾素、介白素及血栓溶解劑。這些生物物質可以使用技藝中可用任一方法來收取。在一個具體例中，本發明提供一種生產生物物質的方法，該方法包含：培養能夠在適於生產生物物質的條件下表現生物物質的細胞，其中該等細胞是得自於使用灌注培養所產生的高超密度冷凍細胞庫。生物物質可以是(但不限於)蛋白質(例如任何治療相關蛋白質)。
實例
本發明將進一步透過以下實例來說明，該等實例不應被認為是進一步的限制。在本申請案通篇中引用的圖式與所有參考資料、專利案及公開專利申請案的內容整體清楚地以引用的方式併入本文。
實例1：一般性方法
下列條件對於以下實例3-6中所述實驗是通用的。
pH設定點為7.0±0.1。經由自動回饋控制，透過WAVE POD控制器將培養物的pH維持在設定點。自動控制器改變至頂部空間之氣體中的CO2濃度並進一步調節添加的基底(CO2/基底控制計畫)。若控制器偵測到pH低於選定pH設定點，則首先試圖透過降低CO2位準達到設定pH值。若未在限定時間內達到要求的pH位準，則添加基底。在高於選定pH設定點的pH下，增加CO2濃度。
DO(溶氧)設定點為
40%。經由自動回饋控制，透過WAVE POD控制器將培養物的DO維持在設定點。氧濃度自動由21%變成50%(O2濃度控制計畫)。手動供應額外純氧氣至頂部空間並組合手動調節搖動條件以維持DO
40%。具體來說，當線上DO為約40%，且POD控制器的O2濃度從21%增加至>30%，則將波搖動速度與角度從22
rpm/10°增加至25rpm/12°。若POD O2又變成30%，則波搖動速度與角度從25rpm/12°增加至30rpm/12°，或供應純O2至頂部空間(偏好後者)。最後，氣體中的純O2容積百分率逐漸增加以提高至頂部空間的總O2。透過調節POD氧氣(21%-50%，由POD控制器供應)以及額外純氧氣(100%，由浮標控制)之間的容積控制率，手動添加策略使得每天增加約10%。略為增加總氣體流率以促使氣體轉移。
基於測量的細胞密度，透過增加每日灌注率，培養物的CSPR(細胞比灌注率)維持在幾乎恆定。
實例2：超高密度細胞儲存程序的設計及實施
此超高密度細胞儲存程序始於2-mL細胞的種原細胞庫小瓶(工作容積1.5mL)，呈大約2.0-2.4 x 107活細胞/mL的密度(正常細胞凍存條件)。之後，細胞在灌注培養物中生長。在將DMSO添加至細胞培養物之後，此超高密度細胞培養物分裝至適合凍存與儲存的個別5-mL小瓶(約4.5mL工作容積)或冷凍袋(約100mL工作容積)中作為超高密度細胞庫(至少約10 x 107細胞/mL)。此程序的簡要代表圖顯示於圖1中。
實例3：使用rCHO 1的超高密度細胞培養以及細胞庫性能
以下實驗使用的參數如下：
1)若Xv
約3×107活細胞/mL(vc/mL)(在第9天)，則CO2降低至0%，之後若需要的話添加基底；
2)WAVE搖動速度&角度：初始22rpm/10°(自第0天至第8天)；若POD O2從21%增加至>30%(在第8天)，則增加至25rpm/12°，且之後增加至30rpm/12°(在第9天)以促進氣體轉移(供給O2並移除CO2)；
3)額外純O2(100%)：當POD O2>30%且Xv
約6×107vc/mL(在第
11天)，手動供應至頂部空間；
4)總氣體流率：自第0天至第10天0.2 lpm(每分鐘公升)，若Xv>4×107vc/mL，在第10天增加至0.4 lpm，且之後在第11天增加至約0.5 lpm(POD O2：純O2=3：1，總O2：約62%)；以及
5)細胞比灌注率：目標為起始
約0.2nL/細胞-天；灌注率逐步增加至多到12 RV/天(註記：RV定義為反應器容積)。最終日的CSPR介於0.1nL/細胞-天與0.2nL/細胞-天之間。
6)接種培養及生物反應器培養基：具有4mM L-麩醯胺酸的CD CHO
7)生物反應器：GE客製10-L Cellbag灌注生物反應器，具有兩個液浸管；工作容積5L；
8)生物反應器接種物：搖瓶接種培養；接種密度：約5×105vc/mL
9)細胞貯留方法：ATF4(0.2μm孔徑)
10)細胞培養物的溫度：37℃
11)冷凍：CryoMedTM控制速率冷凍庫
測試rCHO細胞株1的超高密度(UHD)細胞培養以及細胞庫性能(冷凍與解凍後)。灌注培養在第12天達到約1.11×108vc/mL的Xv，具有高存活率(整個程序>97%)。超高密度灌注培養物的活細胞密度(細胞/mL)、反應器容積中的灌注率/天，以及10X CSPR(10X細胞比灌注率，以nL/細胞-天計)顯示於圖2中。圖3顯示培養物的離線pH概況。在未濃縮的情況下直接收取培養物，在兩個DMSO維持溫度下於5-mL小瓶中產生兩個UHD庫：充分控制的低溫，使用4℃夾套旋轉器；以及未控制低溫，使用由冰水浴降溫之旋轉器。圖4A-C顯示從前述細胞培養條件產生之5mL UHD小瓶的冷凍後性能。UHD庫皆具有快速的冷凍後細胞生長，相當高的存活率，與低細胞凋亡率。但是，當與在冰
水浴中較被動的溫度控制相比時，越積極控制夾套旋轉器的溫度會造成儲存後還原與生長略為改善。
實例4：使用rCHO 2的超高密度細胞培養及細胞庫性能
以下實驗使用的參數如下：
1)若Xv
約5×107vc/mL(在第9天)，則CO2降低至0%，之後若需要的話添加基底。
2)WAVE搖動速度&角度：初始22rpm/10°(自第0天至第7天)；若POD O2從21%增加至>30%(在第7天)，則增加至25rpm/12°以促使氣體轉移(供給O2並移除CO2)。
3)若POD O2>30%且Xv
約3×107vc/mL(在第8天)，則手動額外供應純O2(100%)至頂部空間。
4)總氣體流率起始為0.2 lpm(從第0天至第8天)，且若Xv
約3×107vc/mL(POD O2：純O2=3：1，總O2：約62%)，則在第8天增加至0.4 lpm，且在第9天增加至約0.5 lpm(POD O2：純O2=1：1，總O2：約75%)。
5)細胞比灌注率：在開始時目標為
約0.2nL/細胞-天，但灌注率逐步增加至多到12 RV/天。在最終日，0.1nL/細胞-天<CSPR<0.2nL/細胞-天。
6)接種培養及生物反應器培養基：具有4mM L-麩醯胺酸的CD CHO
7)生物反應器：GE客製10-L Cellbag灌注生物反應器，具有一個液浸管；工作容積5L；
8)生物反應器接種物：搖瓶接種培養；接種密度：約5×105vc/mL
9)細胞貯留方法：ATF4(0.2μm孔徑)
10)細胞培養物的溫度：37℃
11)冷凍：CryoMedTM控制速率冷凍庫
測試rCHO細胞株2的超HD細胞培養及細胞庫性能(冷凍與解凍後)。超高密度灌注培養物的活細胞密度(細胞/mL)、反應器容積中的灌注率/天，以及10X CSPR(10X細胞比灌注率，以nL/細胞-天計)顯示於圖5中。圖6顯示培養物的離線pH概況。收取培養物在兩個不同DMSO維持條件下做出UHD(超高密度)5-mL小瓶與100-mL UHD冷凍袋供凍存：1)室溫(RT，大約22-25℃)；以及2)控制低溫(CT，大約5℃，使用4℃夾套旋轉器)。
圖7與8是顯示從前述細胞培養條件產生之UHD小瓶及袋在250-mL與3-L搖瓶中在室溫與充分控制冷維持條件(分別為RT與CT)下的細胞生長(Xv；實線)與存活率(虛線)概況的圖。這些UHD小瓶及袋恢復良好，其中當以0.5 x 106vc/mL和1.0 x 106vc/mL接種於250-mL與3-L搖瓶中時的冷凍後細胞生長快速、存活率高、細胞凋亡低，且生產率相當。就解凍後生長、存活率、細胞凋亡及生產率來說，UHD冷凍袋與冷凍小瓶之間在個別維持條件下沒有觀察到有差異。但是，受4℃夾套旋轉器充分控制低溫的小瓶及袋當與彼等在室溫下者的生長更快、存活率更高且細胞凋亡較低。圖9及10分別顯示當以0.5 x 106vc/mL及1.0 x 106vc/mL接種時，UHD庫的解凍後細胞凋亡概況，而圖11及圖12說明比生產率(SPR，RT-室溫；CT-充分控制低溫)。
實例5：在20-L WAVE生物反應器中使用rCHO 2的超高密度細胞庫性能
以下實驗的參數如下：
1)細胞庫：在實例2做出的100mL UHD冷凍袋
2)生物反應器培養基：具有4mM L-麩醯胺酸的CD CHO
3)冷凍後生物反應器：GE 20-L Cellbag；工作容積：10L。
4)生物反應器接種物：來自解凍之冷凍袋的解凍後培養物；接種密度：約5×105vc/mL.
5)生物反應器溫度：37℃，O2：20%，CO2：5%，搖動速度&角度：22rpm/8°
將一個100mL UHD冷凍袋解凍。將50mL的解凍培養物直接接種至一個具有總計10L工作容積的20-L WAVE生物反應器(A)中。另外50mL用冷培養基先慢慢地稀釋以降低因為滲透梯度大而引起的可能細胞損傷，接著接種到具有總計10L工作容積的第二個20-L WAVE生物反應器(B)中。兩個生物反應器在相同條件下操作。兩個生物反應器的等分試樣轉移至衛星搖瓶(60mL工作容積)用作為生長比對。生物反應器培養物也與接種另一個經解凍100mL冷凍袋的搖瓶培養物比對(60mL/250-mL搖瓶與1.5L/3-L搖瓶)。
兩種WAVE培養物在解凍後細胞生長、存活率及細胞凋亡方面的表現十分相當。且兩個生物反應器中的培養物不僅在彼等於衛星搖瓶中者相當，在彼等解凍與於搖瓶中生長者也相當。這些數據暗示，一個UHD冷凍袋可直接解凍至2x 20-L WAVE生物反應器中而不需要冷培養基緩慢稀釋至搖瓶，具有相當的性能，其使得種原培養程序從袋解凍到WAVE生物反應器擴增是完全封閉的。
圖13是證實遵循實例2中所示前述細胞培養條件在室溫下產生之rCHO細胞株2的UHD袋在20-L WAVE袋中的細胞生長(Xv；實線)與存活率(虛線)概況的圖。
實例6：使用rCHO 3的超高密度細胞培養及細胞庫性能
以下實驗的參數如下：
1)若Xv
約2×107vc/mL(在第8天)，則CO2降低至0%，之後若需
要的話添加基底；
2)WAVE搖動速度&角度：初始22rpm/10°(自第0天至第7天)；若POD O2從21%增加至>30%，則增加至25rpm/12°(在第7天)以促使氣體轉移(供給O2並移除CO2)；
3)若POD O2>30%且Xv
約3×107vc/mL(在第9天)，則手動額外供應純O2(100%)至頂部空間。
4)總氣體流率：起始0.2 lpm(自第0天至第9天)，且若Xv
約3×107vc/mL，則在第9天增加至0.4 lpm(POD O2：純O2=3：1，總O2：約62%)，且在第10天增加至約0.5 lpm(POD O2：純O2=1：1，總O2：約75%)，在第12天增加至約0.6 lpm(POD O2：純O2=1：2，總O2：約83%)。
5)細胞比灌注率：在第2天開始以0.5 RV/天開始灌注並逐步增加以維持低CSPR為
0.05nL/細胞-天
6)接種培養及生物反應器培養基：具有4mM L-麩醯胺酸的CD CHO
7)生物反應器：GE客製10-L Cellbag灌注生物反應器，具有一個液浸管：工作容積：5L；
8)生物反應器接種物：搖瓶接種培養；接種密度：約5×105vc/mL
9)細胞貯留方法：ATF4(0.2μm孔徑)
10)細胞培養物的溫度：37℃
11)冷凍：CryoMedTM控制速率冷凍庫
12)儲存後評估：搖瓶(兩代)及20-L WAVE(一代)，評估Xv、存活率、細胞凋亡、生產率。
13)儲存後評估培養基：具有4mM L-麩醯胺酸的CD CHO
測試rCHO細胞株3的超HD細胞培養及細胞庫性能(冷凍與解凍後)。超高密度灌注培養物的活細胞密度(細胞/mL)、反應器容積中的
灌注率/天，以及10X CSPR(10X細胞比灌注率，以nL/細胞-天計)顯示於圖15中。圖16顯示培養物的離線pH概況。使用超高密度灌注培養物在兩個不同DMSO維持條件下做出UHD(超高密度)5-mL小瓶與100-mL UHD袋：1)室溫(RT，大約22-25℃)；以及2)控制低溫(CT，大約5℃，使用4℃夾套旋轉器)。
UHD小瓶及UHD袋的所有解凍後培養物恢復良好，其中生長快速、細胞凋亡低，且生產率相當。在充分控制冷控制條件下的UHD袋及小瓶相當，其中在第一次繼代時比在室溫下者的生長略快且存活率較高(>95%)。UHD袋在搖瓶及WAVE生物反應器中具有相當的解凍後性能。然後也暗示，一個UHD冷凍袋可直接解凍至2x 20-L WAVE生物反應器中，其使得種原培養程序從袋解凍到WAVE生物反應器擴增是完全封閉的。圖17A是證實由前述細胞培養條件在室溫與充分控制冷維持條件(分別為RT及CT)下產生之UHD小瓶與袋在250-mL與3-L搖瓶及20-L WAVE中的細胞生長(Xv；實線)與存活率(虛線)概況的圖。圖17B與C顯示解凍後細胞凋亡與比生產率(SPR)的概況。
實例7：在使用rCHO 3的超高密度灌注培養程序中減少使用培養基
使用內部開發的培養基，使rCHO細胞株3以
0.025nL/細胞-天的低細胞比灌注率(CSPR)生長。與ATF4偶合的10-L客製WAVE Cellbag用於灌注培養。培養物在第11天達到約1.25×108vc/mL的活細胞密度，其中灌注率至高為3個反應器容積/天。在整個生物反應器培養過程的培養物存活率為>97%。當與使用市售培養基的相同培養條件相比時，培養基使用降低至約50%。但是，觀察到細胞生長比當使用商業CD CHO培養基時略為更快。直接收取培養物(且不需要濃縮)以在5-mL小瓶及100-mL冷凍袋中產生UHD庫，在充分控制冷DMSO維持
溫度下藉由使用4℃夾套旋轉器。儲存後研究證實，小瓶與冷凍袋UHD在解凍之後於搖瓶中恢復良好，生長快速、存活率高(>95%)，且生產率相當。另外，一個冷凍袋解凍至兩個20-L WAVE生物反應器中且證實細胞生長及存活率與搖瓶相當。圖19是比較rCHO細胞株3的例示性培養物使用內部培養基(黑)與CD CHO培養基(灰)的灌注率(圓，實線)與細胞比灌注率(三角形，虛線)的圖。
實例8：在使用rCHO 1的超高密度灌注培養程序中減少使用培養基
使用補充有Efficient Feed B(EFB)的商用CD CHO培養基，使rCHO細胞株1以
0.04nL/細胞-天的低細胞比灌注率生長並維持。具有內建過濾器的GE 10-L WAVE灌注Cellbag用作為灌注培養生物反應器。為供比對，也測試不具任何營養補充的商用CD CHO培養基。沒有添加EFB的培養物在第13天達到約1.0×108vc/mL的活細胞密度，灌注率至高達8個反應器容積/天。透過自第5天至第10天添加10% EFB到CD CHO培養基中並自第10天至第14天添加20% EFB，培養物在第14天達到約1.03×108vc/mL的活細胞密度，灌注率至多達4個反應器容積/天。因此，在EFB添加的情況下，達到相當的UHD灌注細胞培養物，其中培養基使用大約降低50%。圖20是比較rCHO細胞株1的例示性培養物使用補充有Efficient Feed B之CD CHO培養基(黑)與CD CHO培養基(灰)的活細胞密度(細胞/mL，實線)與存活率(虛線)的圖。圖21是比較rCHO細胞株1的例示性培養物使用補充有Efficient Feed B之CD CHO培養基(黑)與CD CHO培養基(灰)的灌注率(圓，實線)與細胞比灌注率(三角形，虛線)的圖。
實例9：使用rCHO 3放大超高密度灌注程序
20-L WAVE Cellbag經客製化與ATF4偶合，以供應10L UHD灌注培養。在商用CD CHO培養基中測試rCHO細胞株3生長。培養物在第14天達到約1.1×108vc/mL的活細胞密度，其中灌注率至多達5個反應器容積/天。細胞比灌注率(CSPR)維持在
0.04nL/細胞-天而存活率為>97%。細胞生長與使用5L工作容積的10-L WAVE Cellbag相當。圖22說明rCHO細胞株3的例示性培養物使用20-L WAVE生物反應器(10-L工作容積，黑)及10-L WAVE生物反應器(5-L工作容積，灰)的活細胞密度(細胞/mL，實線)及存活率(虛線)。可以直接收取培養物用於做出約90x 100mL冷凍袋。
實例10：使用rCHO 2及rCHO 3之超高密度冷凍袋在汽相液態氮儲存冷凍庫中儲存一年後的評估
針對解凍後性能測試rCHO細胞株2及3的100mL UHD冷凍袋(約1.0×108vc/mL，每個冷凍袋100mL)並且與0時間點(當庫冷凍並轉移至汽相液態N2儲存過夜)相比較。觀察到細胞在時間0以及在一年時的解凍後細胞生長、存活率及生產率相當。
Claims (34)
- 一種從培養之細胞群直接產生超高密度冷凍細胞庫的方法，該方法包含：a)在灌注生物反應器中培養細胞以獲得濃度為至少約1.0 x 108細胞/mL的超高密度細胞群，其中該灌注生物反應器偶合至細胞貯留系統，其中當溶氧濃度(DO)低於30%時，藉由供應純氧氣，使該灌注生物反應器中的溶氧濃度(DO)維持在30%以上；以及b)添加抗凍劑至超高密度細胞群以產生超高密度冷凍細胞庫，其中該超高密度冷凍細胞庫具有至少約1.0 x 108細胞/mL的濃度，且其中在培養細胞以及添加抗凍劑至超高密度細胞群之間未進行額外濃縮步驟。
- 如請求項1之方法，其中該細胞貯留系統包含含有過濾器的交替切向流過濾系統。
- 如請求項2之方法，其中該過濾器具有至少約0.08m2的表面積。
- 如請求項3之方法，其中該過濾器具有約0.3m2至約0.5m2、約0.5m2至約1.0m2、約0.7m2至約0.8m2、約1.0m2至約2.0m2、約2.0m2至約3.0m2、約3.0m2至約4.0m2，或約4.0m2至約5.5m2的表面積。
- 如請求項1至4中任一項之方法，其中該過濾器具有選自由0.7μm、1.2μm以及7μm所組成之群的孔徑。
- 如請求項1至4中任一項之方法，其中該超高密度細胞群具有選自由1.0 x 108細胞/mL、約1.1 x 108細胞/mL、約1.2 x 108細胞/mL、約1.3 x 108細胞/mL、約1.4 x 108細胞/mL、約1.5 x 108細胞/mL、 約1.6 x 108細胞/mL、約1.7 x 108細胞/mL、約1.8 x 108細胞/mL、約1.9 x 108細胞/mL，以及約2.0 x 108細胞/mL所組成之群的活細胞密度。
- 如請求項1至4中任一項之方法，其中該添加抗凍劑包含以約5%至約10%(vol/vol)的最終濃度向超高密度細胞群添加二甲亞碸(DMSO)。
- 如請求項1至4中任一項之方法，其中該產生超高密度冷凍細胞庫包含在適用於貯存的容器中於凍存條件下冷凍至少一部份超高密度細胞群。
- 如請求項8之方法，其中該容器為小瓶。
- 如請求項9之方法，其中該超高密度冷凍細胞庫包含約4.5 x 108細胞/小瓶。
- 如請求項8之方法，其中該容器為冷凍袋。
- 如請求項11之方法，其中該超高密度冷凍細胞庫包含約100 x 108細胞/冷凍袋。
- 如請求項1至4中任一項之方法，其中該超高密度冷凍細胞庫具有至少約1.1 x 108細胞/mL的細胞密度。
- 如請求項1至4中任一項之方法，其中該灌注生物反應器中的灌注率是介於約0.02nL/細胞/天至約0.5nL/細胞/天。
- 如請求項1至4中任一項之方法，其中該灌注生物反應器中的灌注率是介於每天0與15個反應器容積。
- 如請求項1至4中任一項之方法，其中該灌注生物反應器細胞培養物具有介於約6.8至約7.2的pH。
- 如請求項1至4中任一項之方法，其中該灌注生物反應器細胞培養物具有至少約30%的溶氧濃度(DO)。
- 如請求項1至4中任一項之方法，其中該生物反應器為可撓性袋生物反應器。
- 如請求項1至4中任一項之方法，其中該超高密度冷凍細胞庫具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%，或至少約95%的解凍後細胞存活率。
- 如請求項1至4中任一項之方法，其中該等細胞為哺乳動物細胞。
- 如請求項20之方法，其中該等哺乳動物選自由以下組成之群：CHO、CHO-DBX11、CHO-DG44、CHO-S、CHO-K1、Vero、BHK、HeLa、COS、MDCK、HEK-293、NIH-3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT20、T47D、NS0、CRL7030、HsS78Bst細胞、PER.C6、SP2/0-Ag14，以及融合瘤細胞。
- 如請求項1至4中任一項之方法，其中該等細胞為經轉染細胞。
- 如請求項1至4中任一項之方法，其中該等細胞表現治療性蛋白質。
- 如請求項1之方法，其中：a)該灌注生物反應器包含可撓性袋生物反應器；b)該過濾器具有至少0.08m2的過濾器表面積以及至少50kDa的分子量截斷(MWCO)尺寸；c)該添加至超高密度細胞群的抗凍劑為DMSO；且d)該超高密度冷凍細胞庫包含約5%至約10%，vol/vol的DMSO。
- 如請求項1至4中任一項之方法，其中該培養物的pH以及DO是受到自動方法所控制。
- 如請求項1至4中任一項之方法，其中該培養物的pH以及DO是受到非自動方法所控制。
- 如請求項26之方法，其中pH以及DO是透過下列中的任一或多者 所控制：調節被引入培養物的氣體混合物、調節生物反應器的搖動速率，或調節生物反應器的搖動角度。
- 如請求項27之方法，其中該生物反應器在12°的搖動角度下以25rpm搖動。
- 如請求項27之方法，其中該生物反應器在10°的搖動角度下以22rpm搖動。
- 如請求項1至4中任一項之方法，其中該超高密度細胞群在添加抗凍劑以及分裝之前與期間被冷卻並維持在約4℃的溫度下。
- 如請求項1至4中任一項之方法，其中該超高密度細胞群在添加抗凍劑以及分裝之前與期間被維持在約20℃至約26℃的溫度下。
- 如請求項1至4中任一項之方法，其中該超高密度細胞群在添加抗凍劑以及分裝之前與期間被維持在冰水浴中。
- 如請求項1至4中任一項之方法，其中該生物反應器包含內建型過濾器。
- 如請求項1至4中任一項之方法，其中將第一時段之搖動角度設定在10°及搖動速度設定在22rpm，第二時段之搖動角度設定在12°及搖動速度設定在25rpm，使該灌注生物反應器中的溶氧濃度(DO)維持在30%以上。
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