TWI656839B

TWI656839B - 高密度細胞儲存方法

Info

Publication number: TWI656839B
Application number: TW103109317A
Authority: TW
Inventors: 金曉霞; 董浩迪; 克勞蒂亞布瑟
Original assignee: 健臻公司
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-14
Publication date: 2019-04-21
Also published as: MX2015011965A; DK2970843T3; IL241339A0; WO2014143691A1; AU2014228275A1; HUE056073T2; RU2015143439A; SG10201707554WA; SG11201506344TA; US10188099B2; MX369521B; US20140273206A1; EP4008768A1; KR102282939B1; AR095354A1; BR112015021189B1; EP2970843B1; TW201524352A; CN105102605A; AU2014228275B2

Abstract

本揭示內容提供使用灌注培養技術及非離心濃縮細胞產生高密度冷凍保存細胞儲存庫之方法；亦提供使用此高密度冷凍保存細胞儲存庫之生產方法。

Description

高密度細胞儲存方法

本申請案請求2013年3月15日提出申請的美國臨時申請案No.61/793,021之優先權，就各方面而言，其全部內容併入本文以資參考。

本發明提供使用灌注培養技術及非離心濃縮細胞產生高密度冷凍保存細胞儲存庫之方法；亦提供使用此高密度冷凍保存細胞儲存庫之生產方法。

習知之細胞儲存廣用於保持冷凍、可解凍以供包括生產治療相關蛋白質之若干應用的表徵細胞(characterized cells)之貯存。通常，經冷凍保存之貯存係保持於較低密度或離心產生較高密度等分試樣(aliquots)供貯存用。較低密度貯存未慮及大量培養之有效接種，而以離心為基礎之濃縮方法則可能非常傷害細胞(冷凍保存過程中甚至使細胞變得更脆弱)。因此，業界對於改良之細胞儲存方法有所需求。

本揭示內容提供用於產生細胞儲存庫(cell bank)之改良方法。於特定態樣中，本發明之細胞儲存法採用灌注培養技術及非離心濃縮細胞，慮及以意想不到之高細胞密度進行冷凍保存，而於之後用於生產細胞培養物時仍保持優異之細胞存活率。

因此，於一態樣中，本發明提供用於產生高密度冷凍細胞儲存庫之非離心方法，該方法包括：a)於灌注生物反應器中培養細胞，其中該生物反應器連接於細胞滯留(retention)系統；b)非離心濃縮該等細胞，產生濃縮細胞群；及c)冷凍保存濃縮細胞群，產生高密度冷凍細胞儲存庫。

於一具體實例中，細胞滯留系統包含由濾器構成之交替式切向流過濾系統。於另一具體實例中，濾器具有至少0.3平方米之表面積。於另一具體實例中，濾器具有約0.5至約1.0平方米之表面積。於另一具體實例中，濾器具有約0.7至約0.8平方米之表面積。於另一具體實例中，濾器具有約2.0至約3.0平方米之表面積。於另一具體實例中，濾器具有約4至約5平方米之表面積。

於一具體實例中，濾器具有約0.2微米之孔徑。

於一具體實例中，濃縮之細胞群具有至少約1.1 x 10⁸個細胞/毫升之細胞密度。

於一具體實例中，濃縮之細胞群具有約1.1 x 10⁸個細胞/毫升之細胞密度。

於一具體實例中，冷凍保存包括添加DMSO於濃縮細胞群中，至最終濃度為約5%至約10%(容積比)。於另一具體實例中，冷凍保存包括於適合在冷凍保存條件下貯存的容器中冷凍濃縮細胞群之至少一部分。

於一具體實例中，容器為小瓶。於一具體實例中，容器容積為至少2毫升。於一具體實例中，容器容積為約5毫升。

於一具體實例中，高密度冷凍細胞儲存庫包含約4.5 x 10⁸個細胞。

於一具體實例中，容器為冷凍袋。於另一具體實例中，冷凍袋容積為約5至約150毫升。

於一具體實例中，高密度冷凍細胞儲存庫具有約1 x 10⁸個細胞/毫升之細胞密度。

於一具體實例中，灌注生物反應器中之灌注率至少約0.2奈升/細胞/每日。

於一具體實例中，灌注生物反應器細胞培養pH約7及溶氧濃度至少約40%。

於一具體實例中，生物反應器為撓性袋(flexible bag)生物反應器。於另一具體實例中，撓性袋生物反應器容積為10公升。於另一具體實例中，撓性袋生物反應器容積為至少20公升。於另一具體實例中，撓性袋生物反應器進一步包含至少一個液浸管(dip tube)。

於一具體實例中，高密度冷凍細胞儲存庫解凍後存活率為至少60%。於另一具體實例中，高密度冷凍細胞儲存庫解凍後存活率為至少90%。於另一具體實例中，高密度冷凍細胞儲存庫解凍後存活率為至少95%。

於一具體實例中，細胞為哺乳動物細胞。於另一具體實例中，哺乳動物細胞係選自包括：CHO、CHO-DBX11、CHO-DG44、CHO-S、CHO-K1、Vero、BHK、HeLa、COS、MDCK、HEK-293、NIH-3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT20、T47D、NSO、CRL7030、HsS78Bst細胞、PER.C6、SP2/0-Agl4、與融合瘤細胞所組成之組群。

於一具體實例中，細胞為經轉染之細胞。

於一態樣中，本發明提供用於產生高密度冷凍細胞儲存庫之非離心方法，該方法包括：a)於連接於交替式切向流過濾系統之灌注生物反應器中培養細胞，其中生物反應器包含撓性袋生物反應器，及其中濾器具有至少0.3平方米之濾器表面積及至少50kDa之MWCO大小；b)使用交替式切向流過濾系統非離心濃縮該等細胞，產生濃縮細胞群密度為約1.1 x 10⁸個細胞/毫升；c)冷凍保存濃縮細胞群，產生高密度冷凍細胞儲存庫，其中冷凍保存係包括添加DMSO於濃縮細胞群中，至最終濃度為約5%至約10%(容積比)；及其中高密度冷凍細胞儲存庫具有約10⁸個細胞/毫升之細胞密度。

於一具體實例中，培養物之pH與DO係利用自動化方法調控。

於一具體實例中，培養物之pH與DO係利用非自動化方法調控。於另一具體實例中，其中pH與DO係經由下述任一或多項予以調控：調整導入培養物中的氣體混合物、調整生物反應器之振動速率、或調整生物反應器之振動角度。

於一具體實例中，生物反應器係於15rpm下，以8°之振動角度振動。

於一具體實例中，生物反應器係於22rpm下，以10°之振動角度振動。

圖1：高密度細胞冷凍儲存程序圖。

圖2：描述使用不同細胞滯留法之WAVE®灌注培養的細胞生長概況圖。

圖3：使用生長期間多個時間點獲取之培養物製成之微型儲存庫(mini-banks)儲存後表現[活細胞密度(Xv)、存活率]之圖。

圖4：使用生長期間多個時間點獲取之培養物製成之微型儲存庫儲存後表現(晚期細胞凋亡)圖。

圖5：顯示有及無自動化pH與DO反饋調控之細胞生長圖。

圖6：顯示有及無自動化pH與DO反饋調控之pH與DO概況圖。

圖7A-B：濃縮前、濃縮後、及暴露於DMSO 0至120分鐘後等不同階段，細胞之活細胞密度(A)及晚期細胞凋亡(B)圖。

圖8：相較於正常密度儲存，rCHO細胞株1高密度儲存之儲存後表現圖。

圖9：相較於正常密度儲存，rCHO細胞株2高密度儲存之儲存後表現圖。

圖10：相較於正常密度儲存，rCHO細胞株3高密度儲存之儲存後表現圖。

圖11：表示使用不同細胞滯留系統下，培養濃度經時變化之圖。

本揭示內容提供高密度細胞冷凍儲存之方法，該方法包括使用連接於非離心細胞滯留裝置之灌注培養系統。

I.界定

本文所用之「批次培養」一詞係指一種細胞培養技術，於大量新鮮培養基中接種細胞，細胞迅速進入對數生長期，其中未將培養之生長培養基連續移除及以新鮮培養基替換。

本文所用之「饋料批次培養」一詞係指一種細胞培養技術，首先於大量新鮮培養基中接種細胞，培養過程期間，於培養中饋入(連續或分離增量)額外培養營養物，終止培養之前，定期或不無定期獲取細胞及/或產物。

本文所用之「灌注培養」一詞係指一種細胞培養技術，於大量新鮮培養基中接種細胞，細胞迅速進入對數生長期(同上)，其中將培養之生長培養基連續自培養中移除並以新鮮培養基替換。

本文所用之「生物反應器」一詞係意指用於培養細胞之容器。

於一具體實例中，生物反應器為「撓性袋生物反應器」。「撓性袋生物反應器」係能容納液體培養基之無菌腔，另外包含連接器、接口、接合器(adaptors)與撓性管。於一具體實例中，無菌腔由塑料製成。於特定具體實例中，無菌腔由多層層壓透明塑料製成。於進一步特定具體實例中，無菌腔由多層層壓透明塑料製成並具有以USP Class VI乙烯乙酸乙烯酯/低密度聚乙烯共聚物製造之流體接觸層，而外層係由低密度聚乙烯製成。

此外，連接器、接口、與接合器可以任何種類塑料製造，包括惟不限於：聚乙烯、聚丙烯、與聚碳酸酯，而撓性管可由任何種類塑料構成，包括惟不限於：熱塑性彈性體或矽酮(例如經鉑固化之矽酮)。

適當之「撓性袋生物反應器」腔室通常可於此項技藝中發現，包括，惟不限於，見述於美國專利案No.6,544,788者，其全部內容併入本文以資參考。

「撓性袋生物反應器」腔室可部分裝填培養基，然後充氣至堅硬(rigidity)；接著可將其放置於由於預設振動角度及預設振動速率而來回運動之振動平臺(例如得自GE Life Sciences之BASE20/50EHT振動單元)上。此振動動作誘發培養基中之波浪狀運動，促進攪動與氧傳送，俾使增進細胞培養之表現。預設之振動角度可為至少約4度，例如約4度、5度、6度、7度、8度、9度、或10度。再者，預設之振動速率可設定每分鐘振動速率(rpm)為至少約6rpm，例如約7rpm、8rpm、9rpm、10rpm、11rpm、12rpm、13rpm、14rpm、15rpm、16rpm、17rpm、18rpm、19rpm、20rpm、21rpm、22rpm、23rpm、24rpm、25rpm、26rpm、27rpm、28rpm、29rpm、30rpm、31rpm、32rpm、33rpm、34rpm、35rpm、36rpm、37rpm、38rpm、39rpm、或40rpm。於特定具體實例中，每分鐘之振動速率為約8rpm。

本文所用之「細胞滯留系統」一詞係指經由使用濾器而具有使細胞與培養基及其中之廢物分離的能力之所有裝置。濾器可包含呈包括螺旋纏繞、管狀、或板片(sheets)等任何形狀之膜狀、陶瓷、或金屬濾器。濾器可具不同表面積；舉例而言，濾器表面積可為約0.3平方米至約5平方米，例如約0.3平方米、0.4平方米、0.5平方米、0.6平方米、0.7平方米、0.77平方米、0.8平方米、0.9平方米、1.0平方米、1.1平方米、1.2平方米、1.3平方米、1.4平方米、1.5平方米、1.6平方米、1.7平方米、1.8平方米、1.9平方米、2.0平方米、2.1平方米、2.2平方米、2.3平方米、2.4平方米、2.5平方米、2.6平方米、2.7平方米、2.8平方米、2.9平方米、3.0平方米、3.1平方米、3.2平方米、3.3平方米、3.4平方米、3.5平方米、3.6平方米、3.7平方米、3.8平方米、3.9平方米、4.0平方米、4.1平方米、4.2平方米、4.3平方米、4.4平方米、4.5平方米、4.6平方米、4.7平方米、4.8平方米、4.9平方米、或約5平方米。於特定具體實例中，濾器組件具有約10千道爾頓(kDa)至約100kDa之截留分子量(MWCO)大小，例如其為約10kDa、20kDa、30kDa、40kDa、50kDa、60kDa、70kDa、80kDa、90kDa、或100kDa。於其他具體實例中，濾器組件具有約0.1微米至約3微米之篩孔大小，例如約0.1微米、0.2微米、0.3微米、0.4微米、0.5微米、0.6微米、0.7微米、0.8微米、0.9微米、1.0微米、1.1微米、1.2微米、1.3微米、1.4微米、1.5微米、1.6微米、1.7微米、1.8微米、1.9微米、2.0微米、2.1微米、2.2微米、2.3微米、2.4微米、2.5微米、2.6微米、2.7微米、2.8微米、2.9微米、或約3.0微米。

本文所用之「冷凍保存」一詞係指易受時間或由於酵素或化學活性引致傷害之細胞、組織、或任何其他物質，利用使其冷卻及貯存至零度以下之溫度予以保存之方法。

本文所用之「冷凍儲存」一詞係指使細胞與冷凍保護劑[例如有或無羥乙基澱粉(HES)之DMSO]混合，並置於適合在冷凍保存條件下貯存的容器中之技術。然後使用此項技藝中悉知之技術冷凍彼等容器並低溫(通常於約-130℃與約-195℃之間)貯存。以此方法獲得之細胞集合為細胞儲存庫。

於一具體實例中，細胞儲存庫為高密度細胞儲存庫。本文所用之「高密度細胞儲存庫」一詞意指已於高密度冷凍之細胞冷凍儲存等分試樣，其中密度為至少約7 x 10⁷個活細胞/毫升，例如為約7 x 10⁷個活細胞/毫升、8 x 10⁷個活細胞/毫升、9 x 10⁷個活細胞/毫升、1 x 10⁸個活細胞/毫升、2 x 10⁸個活細胞/毫升、或3 x 10⁸個活細胞/毫升。該等細胞可依照此項技藝中可用之任何方法，於適合在冷凍保存條件下貯存之任何容器中冷凍。

於另一具體實例中，細胞儲存庫為主細胞儲存庫。本文所用之「主細胞儲存庫」一詞係意指已自單一殖株生長，被分配至貯存容器中(例如以單一操作分配至容器中)，並於如上述之冷凍保存條件下貯存之細胞培養物(例如完全表徵之細胞)。於特定具體實例中，該等細胞適合之後用於生產細胞培養物，從而產生治療相關蛋白質之進一步獲取。

於另一具體實例中，細胞儲存庫為微型細胞儲存庫。本文所用「微型儲存庫」一詞應意指已根據「冷凍儲存」程序(如上述)冷凍保存惟係由比通常用以產生細胞儲存庫更少之試樣構成之細胞等分試樣。此類型儲存庫通常係於產生例如「主細胞儲存庫」之細胞儲存庫之前，用以最適化被考慮用於冷凍保存細胞株之條件。舉例而言，「微型儲存庫」被用於確定本揭示內容所述高密度細胞儲存方法之最適細胞密度。

本文所用「適合在冷凍保存條件下貯存之容器」一詞包括適於約-130℃與約-195℃間之細胞貯存條件下使用之任何容器。彼等容器包括由適用於冷凍保存之材料製成之小瓶，惟不以此為限。彼等材料包括聚合物(例如聚四氟乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、或聚丙烯)。再者，冷凍保存小瓶表面可施加表面處理，以改善冷凍保存狀況(例如減少吸附及變性之親水性塗層)。於例示具體實例中，小瓶可具有大於約0.1毫升之容積，例如小瓶容積可為約0.1毫升、約0.5毫升、約0.75毫升、約1毫升、約2毫升、約2.5毫升、約5毫升、約10毫升、約15毫升、約20毫升、約25毫升、或約50毫升。容器亦可為冷凍袋。

本文所用之「冷凍袋」一詞為能容納液體培養基之無菌腔，適於約-130℃與約-195℃間之細胞貯存，且可另外包含連接器、接口、接合器與撓性管。冷凍袋可由任何適當材料構成，包括，惟不限於，聚合物例如聚四氟乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、氟化乙烯丙烯(FEP)與乙烯乙酸乙烯酯(EVA)。例示冷凍袋包括惟不限於：KryoSure®冷凍保存袋、PermaLife^TM袋(Origen Pharmaceutical)、CryoStore冷凍袋、Freeze-Pak^TM Bio-容器。

本文所用之「搖瓶」一詞係意指作為培養瓶用之容器，其中於培育期間，培養基不斷地攪動。

本文所用之「搖瓶接種培養」一詞係意指一種細胞擴增(expansion)方法，其中係於搖瓶中首先培養(接種)等分試樣之細胞，使於其中生長。細胞根據其生長速率培養，於其生長期間，通常將其拆分入較大及/或多個容器中，至生物質量達到足以接種生物反應器為止。

本文所用之「接種密度」一詞係意指接種於燒瓶或生物反應器之初始細胞密度。

本文所用之「治療相關蛋白質」一詞係意指可針對疾病或疾患產生處理或可治療動物(包括哺乳動物例如小鼠、大鼠、猴、猿、與人類)之疾病或疾患之任何蛋白質。彼等蛋白質可包括，惟不限於，結合多肽例如單株抗體、Fc融合蛋白質、抗凝血劑、血液因子、骨形成蛋白、人工蛋白支架、酵素、生長因子、激素、干擾素、介白素、與血栓溶解劑。

本文所用之「結合多肽"或「結合多肽」一詞係意指含有至少一個負責選擇性結合於所關注標靶抗原(例如人類抗原)之結合位點之多肽(例如，抗體)。例示結合位點包括抗體變異功能區、受體之配體結合位點、或配體之受體結合位點。於特定態樣中，本發明之結合多肽含有多個(例如，二、三、四、或多個)結合位點。

本文所用之「抗體」一詞係指對所關注抗原(例如腫瘤相關抗原)具顯著已知之特異免疫反應活性之此類構件(例如，完整抗體分子、抗體片段、或其變異體)。抗體及免疫球蛋白包含輕鏈與重鏈，其間有或無鏈間共價鍵結。對於脊椎動物系統中之基本免疫球蛋白結構已有相當充分之理解。

通用術語「抗體」包含可於生物化學上區分之五個不同類別之抗體。所有五類抗體顯然隸屬本揭示內容範圍之內，下述討論概括而言係針對IgG類免疫球蛋白分子。關於IgG，免疫球蛋白包含分子量大約23,000道爾頓之兩條完全相同之輕鏈，及分子量53,000至70,000之兩條完全相同之重鏈。四條鏈利用雙硫鍵連接成為「Y」組態，其中輕鏈從「Y」的口開始圍住重鏈並連續直達變異區。

II.灌注細胞培養

傳統細胞培養包括「批次」培養法。此類型培養中，係以迅速進入對數生長期之細胞接種大量新鮮培養基。於彼等細胞生長及分裂時，消耗得自培養基中之有用營養物並排出有害廢物。隨著時間，培養進入靜止生長期，最後為衰退期。儘管「批次」培養法之修飾已使其隨著時間而更具效力，惟所得經修飾之批次培養流程仍產生迅速生長與衰退週期。再者，「批次」培養法欲達到慮及高密度細胞儲存所需之細胞密度程度，能力有限。

「饋料批次」培養法係指比傳統「批次」培養技術進一步增進之細胞培養技術。儘管此方法慮及較高之細胞密度生長，惟於慮及高密度細胞培養有效生長及，因此，有效地產生供高密度細胞儲存用之細胞上，其能力仍受到限制。

於較佳具體實例中，本發明採用灌注培養法。灌注培養係用於生長細胞之方法，其中係以迅速進入對數生長期(同上述)之細胞接種大量新鮮培養基，從培養中連續移除生長培養基並以新鮮培養基替換。以此方式，培養持續接收具高量營養物之新鮮培養基，同時移除含有廢物及具低量營養物之培養基。此類型培養慮及維持細胞之對數生長，其中每天更換至少一個培養容積，及其中細胞濃度會比傳統或經修飾之批次培養高出許多(增加2至大於10倍間)。於本發明一具體實例中，細胞比灌注率(CSPR)可介於約0.02奈升/細胞/每日與約0.5奈升/細胞/每日之間，例如可為約0.02奈升/細胞/每日、0.05奈升/細胞/每日、0.1奈升/細胞/每日、0.2奈升/細胞/每日、0.3奈升/細胞/每日、0.4奈升/細胞/每日、或0.5奈升/細胞/每日。於特定具體實例中，灌注培養可於具有最少的一個液浸管之生物反應器中進行。

於特定具體實例中，可調整培養物之pH、溫度、溶氧濃度(DO)、與滲透濃度，以最大化培養生命力及生產力。調控培養DO與pH之一方法係經由自動化反饋調控器。此類型自動化調控器使用微處理器系電腦操作，以監控及調整培養物之pH與DO，從而維持細胞生長之最適條件。然而，彼等自動化反饋調控系統昻貴。因此，於特定具體實例中，可使用調控彼等參數之非自動化方法。於一例示具體實例中，可使用調整流過培養物之氣體混合物、調整WAVE®振動速率、或調整培養振動角度以調控選定之參數(例如pH或DO)。

於一具體實例中，在空氣流速為每分鐘約0.2公升(lpm)之下，二氧化碳氣體起始量約10%，氧氣起始量約20%。若pH不超過約6.9，則CO2設定點可從10%降低至5%。於以後之時間點，若pH仍不超過約6.9，則CO2設定點可進一步從5%降低至0%。若pH仍不超過約6.9，則可增加灌注率。若DO不超過約45%，則O2設定點應從20%升高至30%。於以後之時間點，若DO不超過約45%，則O2量應從30%升高至40%，振動速度應增加至約25rpm，振動角度應改變為約12°。

於一具體實例中，最後濃縮步驟期間，亦可調整培養物之振動速率，以避免將空氣併入細胞滯留系統中。

i.細胞培養基

適用於培養細胞之任何類型細胞培養基均可用於本發明方法中。選擇適當細胞培養基之準則為此項技藝中悉知，及提供於，例如，Freshney,R.I.Culture of Animal Cells(a manual of basic techniques),4th edition 2000,Wiley-Liss第8及9章；與Doyle,A.,Griffiths,J.B.,Newell,D.G.Cell & Tissue Culture：Laboratory Procedures 1993,John Wiley & Sons中。各個彼等參考文獻全部內容併入本文以資參考。此項技藝中存在不含動物衍生成分及不含蛋白質條件下，用於製備及維持細胞培養之進一步方法(包括有關CHO細胞之方法)，例如見述於國際專利申請案No.WO97/05240、No.WO 96/26266、與No.WO 00/11102、美國專利案No.6,100,061、No.6,475,725、與8,084,252中者。上述每一文件全部內容併入本文以資參考。於本發明一具體實例中，可使用不含動物衍生成分(ADC)之培養基。習知之合成基本培養基可含無機鹽、胺基酸、維生素、碳水化合物源、與水。於本發明特定具體實例中，可使用之培養基為CD-CHO(GIBCO，Invitrogen Corp.；一種不含動物源及不含蛋白質、水解物、或未知來源成分之於化學上界定之培養基)。此外，培養基可具附加成分，包括麩胺醯胺及/或胺甲喋呤或可幫助生長或黏著之其他因子。於特定具體實例中，附加成分可為GLUTAMAX-1或L-麩胺醯胺，添加介於約2mM與約8mM間，例如約2mM、約3mM、約4mM、約5mM、約6mM、約7mM、或約8mM。

ii.宿主細胞與表現載體

於特定具體實例中，本發明細胞儲存法所用細胞為懷有表現治療相關蛋白質或所關注其他多肽之表現建構之宿主細胞。可用以表現所關注多肽(例如結合多肽)之任何細胞均可根據本文敘述之方法使用。該等細胞可視需要含有天然存在或重組之核酸序列，例如含所關注多肽之表現載體。表現載體可視需要含適當之轉錄及轉譯調控，及可使用此項技藝中已知之重組DNA技術建構。表現載體可利用此項技藝中已知之技術轉移至任何宿主細胞，然後可根據本發明方法培養該轉形細胞，以產生高密度細胞儲存庫。此外，接著可使高密度細胞儲存庫解凍，根據此項技藝中已知之技術培養，俾使產生經編碼之所關注蛋白質及，需要時，隨後可純化此蛋白質。

於特定具體實例中，各種宿主表現系統可用以產生治療相關蛋白質。再者，宿主表現系統可為懷有含衍生自哺乳動物細胞基因體的啟動子之重組表現建構體之哺乳動物細胞系(例如，CHO、CHO-DBX11、CHO-DG44、CHO-S、CHO-K1、Vero、BHK、HeLa、COS、MDCK、HEK-293、NIH-3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT20、T47D、NSO、CRL7030、HsS78Bst細胞、PER.C6、SP2/0至Agl4、與融合瘤細胞)。病毒系表現系統亦可與哺乳動物細胞一起協調利用(參見，例如，Logan et al,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8：355-359，其全部內容併入本文以資參考)。表現效率可利用納入包括(惟不限於)適當轉錄增強子元件及轉錄終止子等元件予以增強(參見，例如，Bittner et al.,1987,Methods in Enzymol.in Enzymol.153：516-544，其全部內容併入本文以資參考)。

於其他具體實例中，可挑選調節插入序列之表現或以所需特定方式修飾及處理基因產物之宿主細胞株。不同宿主細胞對於蛋白質與基因產物之轉譯後處理及修飾具有獨特及特定之機制。可挑選適當細胞株或宿主系統以確保所表現多肽(例如，結合多肽)之正確修飾及處理。此類細胞包括，例如，已確立之哺乳動物細胞株與動物細胞，以及昆蟲細胞株、真菌細胞、與酵母細胞。

iii.生物反應器

適用於灌注培養條件下培養細胞之任何生物反應器可於本發明方法中使用。生物反應器可以適當接種密度，使用細胞等分試樣接種(例如得自起始培養之細胞小瓶，如已培養至該密度之搖瓶或搖瓶接種培養)。供培養用之適當接種密度取決於數項因素，包括所用細胞類型及所接種之生物反應器。適當之接種密度可使用此項技藝中可用之方法測定。

於特定具體實例中，生物反應器可具抛棄式性質，例如生物反應器可為利用撓性管連接於細胞滯留裝置之撓性袋或塑膠瓶；其容積可為約1公升、2公升、5公升、10公升、約20公升、50公升、75公升、85公升、100公升、150公升或約400公升。於本發明特定具體實例中，生物反應器為10公升撓性袋，經客製化具有兩個液浸管，亦即用於移除培養基或產物之管子。例示抛棄式生物反應器為WAVE® Cellbag生物反應器(GE Healthcare,Pittsburgh,PA)，例如20公升WAVE®生物反應器；彼等為見述於其他文獻中(例如Singh,1999,Disposable bioreactor for cell culture using wave-induced agitation,Cytotechnology,p.149-158，其全部內容併入本文以資參考)之灌注生物反應器系統。

反應器之操作空間為培養物所佔據之體積；該操作空間可為，例如，培養物之10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或更多，惟較佳為不超過75%。

替代地，生物反應器可具非抛棄式性質；例如，其可由不銹鋼或玻璃製成。適合於本發明中使用之替代生物反應器包括，惟不限於：可利用振動、振盪、或攪拌混合之搖瓶、攪拌桶容器、空運容器、及抛棄式袋子。

於一具體實例中，生物反應器可連接於細胞滯留系統，包括，惟不限於，內建濾器、旋轉筐TFF系統、與ATF系統。

II.非離心濃縮

灌注培養取決於從培養物中移除營養已耗盡且含廢物之培養基，同時使細胞傷害減至最小的能力。細胞滯留之初始方法，其中係使耗盡之培養基與培養之細胞分離，經常由於例如產生切變力等內在問題而傷害細胞。如此最終導致濾器阻塞及灌注裝置失敗，其中許多係培養系統內置。因此，於一態樣中，本揭示內容提供利用慮及培養基交換之「細胞滯留系統」，然後用以進一步濃縮細胞培養物以供冷凍儲存之方法。

於一具體實例中，所用細胞滯留系統類型為「內建」型濾器，其中濾器係置於生物反應器腔室中，於腔室內可自由移動。濾器可連接於引出腔室之一管，從而容許從培養中汲取經過濾之培養基。「內建」型濾器之一實例可於美國專利案No.6,544,788中發現，其全部內容併入本文以資參考。

於另一具體實例中，所用細胞滯留系統為切向流過濾系統(TFF)。於TFF系統中，培養基從培養容器通過過濾組件進行循環，然後利用連接於過濾組件與培養容器間的管路之泵，回到培養容器，產生穿過濾器組件之切向流。第二個泵放置於濾器組件之濾液側，係用以調控移除濾液之速率。於此系統中，較佳為使用中空纖維膜濾器，因其較易消毒且慮及維持穿過濾器組件之均勻流動。然而，於此系統中使用中空纖維濾器時，由於單向流動導致微粒狀物質於內腔入口聚集，因此有阻塞之傾向。

於特定具體實例中，所用細胞滯留系統類型為交替式切向流(ATF)系統。於ATF型細胞滯留系統中，過濾室一端連接於貯存容器，另一端連接隔膜泵。泵首先使培養基從容器通過濾器元件移動至泵，然後反轉將培養基從泵通過濾器送回容器中，製造雙向或交替式流動；此稱為交替式切向流(ATF)，因為濾器組件存在交替式切向流，亦即有一個流動與濾器組件膜表面相同方向(與該表面相切)，另一個流動實質上與該等表面垂直。此類型過濾從2000年以來一直存在文獻中，其產生迅速、低剪切、均勻流動。ATF過濾可利用此項技藝中已知之方法獲得，例如見述於美國專利案6,544,424者，其全部內容併入本文以資參考。再者，交替式切向流系統可自廠商例如Refine Technology購得，並包括各種模式例如ATF2、ATF4、ATF6、ATF8、與ATF10系統。

於本發明另一特定具體實例中，濾器為管狀膜濾器，此外可為中空纖維濾器。

如上所示，本發明方法慮及以高密度非離心濃縮細胞。於本發明特定具體實例中，係使培養物生長至密度為至少1 x 10⁷個細胞/毫升，例如至約1 x 10⁷個細胞/毫升、約2 x 10⁷個細胞/毫升、約3 x 10⁷個細胞/毫升、約4 x 10⁷個細胞/毫升、約5 x 10⁷個細胞/毫升、約6 x 10⁷個細胞/毫升、約7 x 10⁷個細胞/毫升、或約8 x 10⁷個細胞/毫升，於該生長期後，使用非離心方法進行進一步濃縮步驟。此濃縮步驟可濃縮培養物至密度為至少5 x 10⁷個細胞/毫升，例如約5 x 10⁷個細胞/毫升、6 x 10⁷個細胞/毫升、7 x 10⁷個細胞/毫升、8 x 10⁷個細胞/毫升、9 x 10⁷個細胞/毫升、10 x 10⁷個細胞/毫升、11 x 10⁷個細胞/毫升、12 x 10⁷個細胞/毫升、13 x 10⁷個細胞/毫升、14 x 10⁷個細胞/毫升、15 x 10⁷個細胞/毫升、16 x 10⁷個細胞/毫升、或17 x 10⁷個細胞/毫升。用於進一步濃縮培養物之非離心方法可使用此項技藝中已知之任何細胞滯留系統(例如包括上文所敘述之「內建」型濾器、TFF系統、或ATF系統)。

III.冷凍保存及細胞儲存

冷凍保存係指易受時間或由於酵素或化學活性引致傷害之細胞、組織、或任何其他物質，利用使其冷卻及貯存至零度以下之溫度予以保存之方法。冷凍保存重要細胞株之重要性不可低估，因(在其他重要優勢中)其容許維持彼等細胞株而不必持續不斷地培養，減少污染風險，且降低基因漂變之風險。

使用冷凍保存法時，重要的是達到及保持於彼等低溫，於冷凍過程中，不致於經由形成冰而造成額外傷害。此項技藝中之方法傳統上使用減少對細胞造成冷凍傷害之物質，稱為冷凍保護劑。冷凍保護劑可於冷凍過程之前添加於細胞培養之培養基中。於特定具體實例中，所用冷凍保護劑可為一或多種甘油或二甲亞碸(DMSO)。此外，冷凍保護劑中可添加或不加羥乙基澱粉(HES)。於進一步特定具體實例中，所添加DMSO之濃度可為至少5%，例如其可為約5%、約6%、約7%、約8%、約9%、約10%、約11%、約12%、約13%、約14%、約15%、約16%、約17%、約18%、約19%、或約20%。

然後可將已添加冷凍保護劑之培養物分配至適合在冷凍保存條件下貯存的容器中。於一具體實例中，此容器可為由包括(惟不限於)聚合物例如聚四氟乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、或聚丙烯等材料製成之小瓶。於特定具體實例中，小瓶可具額外之表面處理，以改善冷凍保存狀況(例如減少吸附及變性之親水性塗層)。於例示具體實例中，小瓶可具有大於約0.1毫升之容積，例如小瓶容積可為約0.1毫升、約0.5毫升、約0.75毫升、約1毫升、約2毫升、約2.5毫升、約5毫升、約10毫升、約15毫升、約20毫升、約25毫升、或約50毫升。於另一具體實例中，容器亦可為冷凍袋。冷凍袋可由任何適當材料構成，包括，惟不限於，聚合物例如聚四氟乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、氟化乙烯丙烯(FEP)與乙烯乙酸乙烯酯(EVA)。例示抛棄式生物反應器包括惟不限於：KryoSure®冷凍保存袋、PermaLife^TM袋(Origen Pharmaceutical)、CryoStore冷凍袋、Freeze-Pak^TM Bio-容器。

於低溫貯存之前，接著使用此項技藝中悉知之技術及裝置冷凍彼等容器，通常於約-130℃與約-195℃之間。於一具體實例中，所用冷凍技術可為調控速率及緩慢冷凍(亦稱為緩慢可程式冷凍，或SPF)。以此方法獲得之細胞集合為細胞儲存庫。

於一具體實例中，細胞儲存庫可為，惟不限於，高密度細胞儲存庫、主細胞儲存庫、或微型儲存庫。

IV.測定細胞存活率

如上所示，本發明方法慮及以高密度儲存細胞，而於之後使用時仍保持優異之細胞存活率。本文所用之「細胞存活率」一詞可界定為於給定試樣中，健康細胞之數量或百分比。細胞存活率可於所述高密度細胞儲存程序中任何點，使用此項技藝中可用之任何方法測定。測定細胞存活率之常用方法主要係根據活細胞具有排拒例如錐蟲藍(一種重氮染料)、曙紅、或丙錠等特定染料之完整細胞膜，而死細胞則不然。

於一具體實例中，錐蟲藍可用於染色大量細胞，從而顯示具完整膜細胞(未著色)與具破碎膜細胞(藍色)之存在。然後可計算彼等細胞，決定培養物中之活細胞數與死細胞數，並以百分比表示，以顯示培養物之相對健康狀況。

於特定具體實例中，細胞存活率可使用已濃縮處理，惟尚未冷凍(即冷凍前培養物)之培養物進行測定。於特定具體實例中，細胞存活率可使用已濃縮、冷凍、然後解凍(即解凍後培養物)之培養物進行測定。

於特定具體實例中，細胞存活率可為大於約60%，例如約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%。於特定具體實例中，細胞之解凍後存活率大於約80%，例如，大於85%、90%、或95%，包括高達100%。

V.治療相關之蛋白質

衍生自本發明高密度細胞冷凍儲存法之細胞可用於之後生產階段以製造蛋白質。例如，根據本發明方法於生物反應器中增殖並呈高密度儲存等分試樣冷凍之細胞可用於生產包括與治療相關蛋白質之生物物質。彼等生物物質可包括，惟不限於：病毒(參見例如WO200138362)、結合多肽例如抗體如單株抗體、及其片段例如fab片段、Fc融合蛋白、抗凝血劑、血液因子、骨形成蛋白、人工蛋白支架、酵素、生長因子、激素、干擾素、介白素、與血栓溶解劑。彼等生物物質可使用此項技藝中可用之任何方法獲取。於一具體實例中，本發明提供生產生物物質之方法，該方法包括：於適於生產生物物質之條件下，培養能表現生物物質之細胞，其中該等細胞係使用灌注培養及非離心濃縮法，從高密度冷凍細胞儲存庫獲得。生物物質可為(惟不限於)蛋白質(例如任何與治療相關之蛋白質)。

實例

茲利用下述實例進一步說明本發明，彼等實例不應被視為構成進一步限制。本申請案之圖式及全文所引用之所有參考案、專利案、與公告之專利申請案之全部內容均明確地併入本文以資考。

實例1：高密度細胞儲存流程之設計及實施

此高密度細胞冷凍儲存流程從密度大約2.0至2.4 x 10⁷個活細胞/毫升(正常細胞冷凍保存條件)之細胞之2毫升主細胞儲存小瓶(操作空間1.5毫升)著手。然後使細胞進行灌注培養生長，並經由交替式切向流予以濃縮。添加DMSO至濃縮之細胞培養物後，將此高密度細胞培養物分配於大約200個5毫升小瓶(操作空間大約4.5毫升)中，呈高密度細胞儲存庫(大約10 x 10⁷個細胞/毫升)予以貯存。

實例2：確定證實快速細胞生長與濃縮速度之最適細胞滯留法

為了確定用於產生高密度細胞培養儲存系統(圖1)之最適細胞滯留法，乃於界定參數下，評估標準GE灌注生物反應器中之內建浮動濾器、TFF(切向流過濾)、ATF2、與ATF4證實增加細胞生長與活細胞密度之能力(表1)。

ATF4交替式切向流系統證實使用彼等參數以及最後迅速(30分鐘)之4倍培養物濃縮速度達成較迅速之細胞生長而無濾器結垢。調查中之其他方法每毫升產生較低濃度之活細胞，展示較低濃度效率及/或於培養及/或濃縮期間產生結垢。彼等結果可從圖2、圖11、與表2看出。

實例3：確定獲取濃縮及高密度儲存用之培養細胞之最適時機

為了確定用於接續之最後濃縮及高密度細胞冷凍儲存之最適細胞獲取時機，乃於訂製之10公升WAVE®(GE Healthcare Life Sciences)Cellbag生物反應器中，使用交替式切向流系統之灌注培養條件下，使rCHO細胞株1培養物生長。於灌注培養期間多個時間點收集細胞，製造不同細胞密度(14×10⁶、33×10⁶、56×10⁶/毫升)之微型儲存庫(圖l)。

比較生長速率、存活率、與細胞死亡(細胞凋亡)等方面之解凍後細胞品質，以評估彼等儲存庫。初始培養期間，彼等細胞生長之參數及儲存後之評估示於表3。

得自彼等培養物之以不同細胞密度製造之微型儲存庫之解凍後細胞表現於細胞生長速率、存活率(圖3)、與細胞凋亡率(圖4)等方面具可較性。彼等數據表明，該等細胞健康且已就緒，收穫量高達大約60 x 10⁶個細胞/毫升。

選定大約(30至40) x 10⁶個細胞/毫升之收穫密度，以縮短培養期，使此方法更切實可行。然後使用交替式切向流系統，於30分鐘內進一步濃縮彼等培養至>11 x 10⁷個細胞/毫升。

實例4：確定高密度細胞培養期間之最適WAVE®參數

為了使此高密度細胞培養及儲存方法更穩健及GMP可行，乃研究及界定WAVE®操作參數，以建立自動pH與DO調控不存在時亦可維持此培養之系統。

於結合使用表4中所示參數界定之交替式切向流系統之灌注培養系統中，測試彼等WAVE®操作參數。

氧質量傳送(kLa)研究顯示，WAVE®振動速率與角度係影響氧傳送之關鍵參數。再者，氧以及二氧化碳二者之頂部空間濃度會顯著影響DO與pH。

應用簡化之生物反應器操作條件，包括結合高灌注率之WAVE®振動及氣體處理調整(表5)，以於無自動調控下，達成目標DO與pH值。

以血液氣體分析儀(BGA)測得之離線pH6.9時，將CO2設定點從10%降低至5%。若測得之離線pH再次6.9，將CO2設定點從5%降低至0%。若離線pH仍6.9，增加灌注率。當測得之DO45%時，將O2 設定點從20%提升至30%。若測得之DO再次45%，增加振動速度至25rpm，振動角度改為12°；此外，將O2量從30%提升至40%。

於最後濃縮步驟期間，利用調整振動速率(表6)進一步細化此方法，以避免將空氣併入ATF4系統中。

包括WAVE®振動及氣體處理調整之一組簡化之生物反應器操作條件導致不依賴自動化pH與DO反饋調控之可相較之細胞生長表現，圖5與6。該振動調整於ATF4濃縮步驟期間亦導致最小之空氣併入。

實例5：測定ATF濃縮步驟及DMSO暴露對細胞健康之影響

為了測定ATF4濃縮步驟及冷凍前之DMSO暴露對細胞品質之影響，搖瓶以高密度細胞儲存程序中不同階段收集之活細胞接種以供生長評估。收集及於表7所示條件檢測之細胞為：濃縮前、濃縮後、及具0至120分鐘之DMSO暴露期(exposure length)。

濃縮前細胞及濃縮後細胞之細胞生長(圖7A)與細胞凋亡率(圖7B)可相較，DMSO暴露期不同的細胞之細胞生長與細胞凋亡率亦可相較；暗示於容器內30分鐘之ATF4濃縮及以90分鐘全面分配於超過200個小瓶，同時維持冷凍前之細胞品質是可行的。

實例6：儲存後細胞品質之測定及此平臺對多種細胞株之適用性

為了測定高密度細胞儲存庫之儲存後細胞品質，乃培養及檢測解凍後細胞，以測定其相對細胞生長速率、存活率、與細胞凋亡程度。再者，為了確保此平臺可容易地應用於其他細胞株，乃使用三個不同之細胞株(rCHO細胞株1、2、與3)。彼等細胞儲存前後生長之實驗條件詳述於表8。

針對rCHO細胞株1(圖8)、rCHO細胞株2(圖9)、與rCHO細胞株3(圖10)，評估高密度(10 x 10⁷個細胞/毫升)以及正常密度(2.0至2.4 x 10⁶個活細胞/毫升)儲存試樣之解凍後細胞生長、存活率、與細胞凋亡程度。該等細胞顯示良好之生長速率與存活率、細胞凋亡程度低。回收率視所檢測細胞株而不同。

Claims

一種用於產生高密度冷凍細胞儲存庫之非離心方法，該方法包括：a)於灌注生物反應器中培養細胞至一細胞密度，其藉由將生長培養基連續自培養中移除並以新鮮生長培養基替換，其中該生物反應器連接於細胞滯留(retention)系統，該細胞滯留系統包含包括一濾器之交替式切向流過濾系統；b)非離心濃縮培養在連接於細胞滯流系統之灌注生物反應器中的該等細胞，其中該等細胞係濃縮至高於得自a)的該細胞密度之細胞密度，其藉由使用濾器將生長培養基自培養中移除且藉此減少該生長培養基的容積，產生約1 x 10⁸個細胞/毫升之細胞密度的濃縮細胞群；c)冷凍保存濃縮細胞群，產生高密度冷凍細胞儲存庫，其具有至少90%之解凍後存活率。
如請求項1之方法，其中濾器具有至少0.3平方米之表面積。
如請求項1之方法，其中濾器具有約0.5至約1.0平方米之表面積。
如請求項1之方法，其中濾器具有約0.7至約0.8平方米之表面積。
如請求項1之方法，其中濾器具有約2.0至約3.0平方米之表面積。
如請求項1之方法，其中濾器具有約4至約5平方米之表面積。
如請求項1之方法，其中濾器具有約0.2微米之孔徑。
如請求項1之方法，其中該冷凍保存包括添加DMSO於濃縮細胞群中，至最終濃度為約5%至約10%(容積比)。
如請求項1之方法，其中該冷凍保存包括於適合在冷凍保存條件下貯存的容器中冷凍濃縮細胞群之至少一部分。
如請求項5之方法，其中容器為小瓶。
如請求項9之方法，其中容器容積為至少2毫升。
如請求項11之方法，其中容器容積為約5毫升。
如請求項1之方法，其中高密度冷凍細胞儲存庫包含約4.5 x 10⁸個存活細胞。
如請求項9之方法，其中容器為冷凍袋。
如請求項14之方法，其中冷凍袋容積為約5至約150毫升。
如請求項1之方法，其中高密度冷凍細胞儲存庫具有約1 x 10⁸個存活細胞/毫升之細胞密度。
如請求項1之方法，其中灌注生物反應器中之灌注率為至少約0.2奈升/細胞/每日。
如請求項1之方法，其中灌注生物反應器細胞培養物pH約7及溶氧濃度至少約40%。
如請求項1之方法，其中生物反應器為撓性袋(flexible bag)生物反應器。
如請求項19之方法，其中撓性袋生物反應器容積為10公升。
如請求項19之方法，其中撓性袋生物反應器容積為至少20公升。
如請求項19之方法，其中撓性袋生物反應器進一步包含至少一個液浸管(dip tube)。
如請求項19之方法，其中高密度冷凍哺乳細胞儲存庫解凍後存活率為至少95%。
如請求項1之方法，其中細胞係為哺乳動物細胞，其選自下列組成之組群：CHO、CHO-DBX11、CHO-DG44、CHO-S、CHO-K1、Vero、BHK、HeLa、COS、MDCK、HEK-293、NIH-3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT20、T47D、NSO、CRL7030、HsS78Bst細胞、PER.C6、SP2/0-Agl4與融合瘤細胞。
如請求項1之方法，其中細胞為經轉染之細胞。
一種用於產生高密度冷凍哺乳動物細胞儲存庫之非離心方法，該方法包括：a)於灌注生物反應器中培養細胞至小於1 x 10⁸個細胞/毫升之細胞密度，其藉由將生長培養基連續自培養中移除並以新鮮生長培養基替換，其中該灌注生物反應器係連接至具有一濾器之交替式切向流過濾系統，其中生物反應器包含撓性袋生物反應器，及其中濾器具有至少0.3平方米之濾器表面積及至少50kDa之截留分子量(MWCO)大小；b)非離心濃縮培養在連接於細胞滯流系統之灌注生物反應器中的該等細胞，其中該等細胞係使用交替式切向流過濾系統、藉由將生長培養基自培養中移除且減少該生長培養基的容積而濃縮，產生密度為約1 x 10⁸個細胞/毫升之濃縮細胞群；c)冷凍保存濃縮細胞群，產生高密度冷凍哺乳動物細胞儲存庫，其中冷凍保存係包括添加DMSO於濃縮細胞群中，至最終濃度為約5%至約10%(容積比)；且其中高密度冷凍哺乳動物細胞儲存庫具有約10⁸個細胞/毫升之細胞密度；且其中高密度冷凍哺乳動物細胞儲存庫之解凍後存活率為至少90%。
如請求項1之方法，其中培養物之pH與DO係利用自動化方法調控。
如請求項1之方法，其中培養物之pH與DO係利用非自動化方法調控。
如請求項27之方法，其中灌注生物反應器中培養物之pH與DO係經由下述任一或多項予以調控：調整導入培養物中的氣體混合物、調整生物反應器之振動速率、或調整生物反應器之振動角度。
如請求項28之方法，其中生物反應器係於15rpm下，以8°之振動角度振動。