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KR102619142B1 - 초고밀도 세포 뱅킹 방법 - Google Patents

초고밀도 세포 뱅킹 방법 Download PDF

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KR102619142B1
KR102619142B1 KR1020237003199A KR20237003199A KR102619142B1 KR 102619142 B1 KR102619142 B1 KR 102619142B1 KR 1020237003199 A KR1020237003199 A KR 1020237003199A KR 20237003199 A KR20237003199 A KR 20237003199A KR 102619142 B1 KR102619142 B1 KR 102619142B1
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Abstract

초고밀도의 저온보존된 세포 뱅크를 생성시키기 위한 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 이러한 방법은 우수한 세포 생존률 및 품질을 보유하면서 임의의 세포 농축 단계에 대한 필요없이 예상외로 높은 세포 밀도에서 저온보존될 수 있는 초고밀도 세포 배양물의 생성을 가능하게 하는 변경된 관류 배양 기술을 사용한다.

Description

초고밀도 세포 뱅킹 방법{ULTRA-HIGH DENSITY CELL BANKING METHODS}
관련 출원
본 출원은 2014년 9월 18일에 출원된 미국 가출원 제62/052,257호를 우선권으로 주장한다. 허용되는 경우, 상기 선행 출원은 임의의 목적 및 모든 목적을 위해 참조로서 포함된다.
배경
세포 뱅킹(cell banking)은, 치료적으로 관련된 단백질의 생성을 포함하는 다수의 적용분야에서 사용되도록 해동될 수 있는, 동결된 특성규명된(characterized) 세포의 스톡(stock)을 유지하기 위해 널리 사용된다. 전형적으로, 저온보존(cryopreservation)되는 스톡은, 저밀도(예를 들어, 약 1 또는 2 x 107개 세포/mL)에서 유지되거나, 저장을 위해 고밀도 분취량을 생성시키도록 원심분리된다. 저밀도 스톡은 부피가 큰 배양물의 효율적인 접종을 가능하게 하지 않으며, 농축 방법은 세포를 손상시킴으로써 동결된 스톡의 세포 생존률(viability)을 감소시킬 수 있다. 이러한 이유로, 이전의 세포 뱅킹 방법은 비교적 비효율적이며, 결국 동결된 스톡으로부터의 고밀도 세포 배양물의 신속한 생성을 가능하게 하지 않는다. 따라서, 개선된 세포 뱅킹 방법이 필요하다.
본 명세서는 초고밀도(ultra-high density) 세포 뱅크(cell bank)의 생성을 위한 개선된 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 방법은, 생산 세포 배양(production cell culture)에 추후 사용되도록 우수한 세포 생존률을 보유하면서 임의의 세포 농축 단계에 대한 필요없이 예상외로 높은 세포 밀도에서 저온보존될 수 있는 초고밀도 세포 배양물의 생성을 가능하게 하는, 개선된 관류 세포 배양 기술을 사용한다.
따라서, 하나의 양태에서, 본 명세서는 배양된 세포의 집단으로부터 직접 초고밀도의 동결된 세포 뱅크를 생성시키는 방법을 제공하며, 이러한 방법은, 적어도 1.0 x 10^8개 세포/mL의 농도를 지닌 초고밀도 세포 집단을 수득하기 위해 관류 생물반응기에서 세포를 배양하는 단계로서, 상기 관류 생물반응기는 세포 보유 시스템에 커플링되어 있는, 단계; 및 초고밀도의 동결된 세포 뱅크를 생성시키기 위해 초고밀도 세포 집단에 동결보호제(cryoprotectant)를 첨가하는 단계로서, 초고밀도의 동결된 세포 뱅크가 적어도 1.0 x 10^8개 세포/mL의 농도를 지니는, 단계를 포함하며, 세포를 배양하는 단계와 초고밀도 세포 집단에 동결보호제를 첨가하는 단계 사이에 추가의 농축 단계는 수행되지 않는다.
특정 구현예에서, 세포 보유 시스템은 필터를 포함하는 교번식(alternating) 접선 유동 여과 시스템을 포함한다. 특정 구현예에서, 필터는 적어도 약 0.08 m2의 표면적을 지닌다. 특정 구현예에서, 필터는 약 0.08 m2 내지 약 0.3 m2, 약 0.3 m2 내지 약 0.5 m2, 약 0.5 m2 내지 약 1.0 m2, 약 0.7 m2 내지 약 0.8 m2, 약 1.0 m2 내지 약 2.0 m2, 약 2.0 m2 내지 약 3.0 m2, 약 3.0 m2 내지 약 4.0 m2, 또는 약 4.0 m2 내지 약 5.5 m2의 표면적을 지닌다. 특정 구현예에서, 필터는 0.2 μm, 0.4 μm, 및 0.65 μm로 구성된 군으로부터 선택되는 포어(pore) 크기를 지닌다. 다른 구현예에서, 필터는 0.7 μm, 1.2 μm, 및 7 μm로 구성된 군으로부터 선택되는 포어 크기를 지닌다.
특정 구현예에서, 초고밀도 세포 집단은 약 1.0 x 10^8개 세포/mL, 약 1.1 x 10^8개 세포/mL, 약 1.2 x 10^8개 세포/mL, 약 1.3 x 10^8개 세포/mL, 약 1.4 x 10^8개 세포/mL, 약 1.5 x 10^8개 세포/mL, 약 1.6 x 10^8개 세포/mL, 약 1.7 x 10^8개 세포/mL, 약 1.8 x 10^8개 세포/mL, 약 1.9 x 10^8개 세포/mL, 및 약 2.0 x 10^8개 세포/mL으로 구성된 군으로부터 선택되는 생존 세포 밀도를 지닌다.
특정 구현예에서, 저온보존은 초고밀도 세포 집단에 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 약 5% 내지 약 10%(부피/부피)의 최종 농도로 첨가하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 저온보존은, 저온보존 조건하에서 저장하기에 적절한 용기 내에서 초고밀도 세포 집단의 적어도 일부를 동결시키는 것을 포함한다.
특정 구현예에서, 용기는 바이알(vial)이다. 특정 구현예에서, 초고밀도의 동결된 세포 뱅크는 약 4.5 x 10^8개 세포/바이알을 포함한다.
특정 구현예에서, 용기는 크라이오백(cryobag)이다. 특정 구현예에서, 크라이오백은 약 5 내지 약 150 mL의 부피를 지닌다. 특정 구현예에서, 초고밀도의 동결된 세포 뱅크는 적어도 약 1.0 x 10^8개 세포/mL의 세포 밀도를 지닌다.
특정 구현예에서, 관류 생물반응기 내의 관류 속도는 약 0.02 nL/세포/일(day) 내지 약 0.5 nL/세포/일이다. 특정 구현예에서, 관류 생물반응기 내의 관류 속도는 일당 0 내지 15 반응기 부피이다.
특정 구현예에서, 관류 생물반응기 세포 배양물은 약 6.8 내지 약 7.2의 pH를 지닌다.
특정 구현예에서, 관류 생물반응기 세포 배양물은 적어도 약 30%의 용존 산소 농도(DO)를 지닌다.
특정 구현예에서, 생물반응기는 가요성 백(flexible bag) 생물반응기이다. 특정 구현예에서, 생물반응기는 빌트-인(built-in) 필터를 포함한다.
특정 구현예에서, 초고밀도의 동결된 세포 뱅크는 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%의 해동 후 세포 생존률을 지닌다.
특정 구현예에서, 세포는 포유류 세포이다. 특정 구현예에서, 포유류 세포는, CHO, CHO-DBX11, CHO-DG44, CHO-S, CHO-K1, Vero, BHK, HeLa, COS, MDCK, HEK-293, NIH-3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20, T47D, NS0, CRL7030, HsS78Bst 세포, PER.C6, SP2/0-Agl4, 및 하이브리도마 세포로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 세포는 트랜스펙션(transfection)된 세포이다. 특정 구현예에서, 세포는 치료용 단백질을 발현한다.
특정 구현예에서, 관류 생물반응기는 가요성 백 생물반응기를 포함하고; 필터는 적어도 0.3 m2의 필터 표면적 및 적어도 50 kDa의 분자량 컷오프(cut off)(MWCO) 크기를 지니고; 초고밀도 세포 집단에 첨가되는 동결보호제는 DMSO이며; 초고밀도의 동결된 세포 뱅크는 약 5% 내지 약 10%(부피/부피)의 DMSO를 포함한다.
특정 구현예에서, 배양물의 pH 및 DO는 자동화된 방법에 의해 제어된다. 특정 구현예에서, 배양물의 pH 및 DO는 비자동화된(non-automated) 방법에 의해 제어된다. 특정 구현예에서, pH 및 DO는 다음 중 어느 하나 이상을 통해 제어된다: 배양물에 도입되는 가스 혼합물의 조정, 생물반응기의 로크(rock) 속도의 조정, 또는 생물반응기의 로크 각도의 조정. 특정 구현예에서, 생물반응기는 8°의 로크 각도로 15 rpm으로 로킹(rocking)된다. 특정 구현예에서, 생물반응기는 10°의 로크 각도로 22 rpm으로 로킹된다. 특정 구현예에서, 생물반응기는 12°의 로크 각도로 25 rpm으로 로킹된다.
특정 구현예에서, 초고밀도 세포 집단은, 동결보호제의 첨가 및 분배 전과 그 동안 약 4℃의 온도까지 냉각되고 그 온도에서 유지된다. 특정 구현예에서, 초고밀도 세포 집단은, 동결보호제의 첨가 및 분배 동안 약 20℃ 내지 약 26℃의 온도에서 유지된다. 특정 구현예에서, 초고밀도 세포 집단은, 동결보호제의 첨가 및 분배 동안 빙수 배쓰(ice-water bath)를 사용함으로써 비제어되는(uncontrolled) 냉온에서 유지된다.
도 1은 초고밀도 세포 크라이오뱅킹(cryobanking) 공정을 도시한다.
도 2는 예시적인 rCHO 세포주 1의 배양물에서의 생존 세포 밀도(세포/mL), 관류 속도(RV/일) 및 10X 세포 특이적 관류 속도(nL/세포-일)를 표현하는 그래프를 도시한다.
도 3은 rCHO 세포주 1의 배양물에서의 오프라인(offline) pH 프로파일을 표현하는 그래프를 도시한다.
도 4a 내지 도 4c는 rCHO 세포주 1의 5 mL 초고밀도 세포 뱅크 분취량에 대한 해동 후 세포 성장 프로파일(도 4a), 해동 후 후기 아폽토시스(apoptotic) 세포의 백분율(도 4b), 및 특이적 생성 속도(유닛(unit)/E9 세포-일)를 표현하는 일련의 그래프를 도시한다.
도 5는 예시적인 rCHO 세포주 2의 배양물에서의 생존 세포 밀도(세포/mL), 관류 속도(RV/일) 및 10X 세포 특이적 관류 속도(nL/세포-일)를 표현하는 그래프를 도시한다.
도 6은 rCHO 세포주 2의 배양물에서의 오프라인 pH 프로파일을 표현하는 그래프를 도시한다.
도 7은 250 mL 및 3 L 진탕 플라스크 내에 0.5 x 10^6개 vc/mL로 시딩(seeding)된 경우 rCHO 세포주 2에 대한 생존 세포 밀도 Xv(세포/mL; 실선) 및 생존률(점선)에 기반하여 세포 성장을 표현하는 그래프를 도시한다.
도 8은 250 mL 및 3 L 진탕 플라스크 내에 1.0 x 10^6개 vc/mL로 시딩된 경우 rCHO 세포주 2에 대한 생존 세포 밀도 Xv(세포/mL; 실선) 및 생존률(점선)에 기반하여 세포 성장을 표현하는 그래프를 도시한다.
도 9는 250 mL 및 3 L 진탕 플라스크 내에 0.5 x 10^6개 vc/mL로 시딩된 경우 rCHO 세포주 2의 배양물에서의 후기 아폽토시스 및 사멸 세포의 백분율을 표현하는 그래프를 도시한다.
도 10은 250 mL 및 3 L 진탕 플라스크 내에 1.0 x 10^6개 vc/mL로 시딩된 경우 rCHO 세포주 2의 배양물에서의 후기 아폽토시스 및 사멸 세포의 백분율을 표현하는 그래프를 도시한다.
도 11은 250 mL 및 3 L 진탕 플라스크 내에 0.5 x 10^6개 vc/mL로 시딩된 경우 rCHO 세포주 2의 진탕 플라스크 배양물에서의 특이적 생성 속도(SPR)을 표현하는 그래프를 도시한다.
도 12는 250 mL 및 3 L 진탕 플라스크 내에 1.0 x 10^6개 vc/mL로 시딩된 경우 rCHO 세포주 2의 진탕 플라스크 배양물에서의 특이적 생성 속도(SPR)을 표현하는 그래프를 도시한다.
도 13은 rCHO 세포주 2에 대한 생존 세포 밀도 Xv(세포/mL; 실선) 및 생존률(점선)에 기반하여 WAVE 백(bag)에서의 세포 성장을 표현하는 그래프를 도시한다.
도 14는 rCHO 세포주 2의 배양물에서의 후기 아폽토시스 및 사멸 세포의 백분율을 표현하는 그래프를 도시한다.
도 15는 예시적인 rCHO 세포주 3의 배양물에서의 생존 세포 밀도(세포/mL), 관류 속도(RV/일) 및 10X 세포 특이적 관류 속도(nL/세포-일)를 표현하는 그래프를 도시한다.
도 16은 rCHO 세포주 3의 배양물에서의 오프라인 pH 프로파일을 표현하는 그래프를 도시한다.
도 17a 내지 도 17c는 rCHO 세포주 3의 진탕 플라스크 배양물에서의 세포 성장(실선) 및 생존률(점선)(도 17a); 후기 아폽토시스 및 사멸 세포의 백분율(도 17b); 및 특이적 생성 속도(SPR)(도 17c)를 표현하는 일련의 그래프를 도시한다.
도 18은 예시적인 rCHO 세포주 3의 배양물에서 인-하우스(in-house) 배지(검정색) 및 CD CHO 배지(회색)에 따른 생존 세포 밀도(세포/mL, 실선) 및 생존률(점선)을 비교한 그래프를 도시한다.
도 19는 예시적인 rCHO 세포주 3의 배양물에서 인-하우스 배지(검정색) 및 CD CHO 배지(회색)에 따른 관류 속도(원형, 실선) 및 세포 특이적 관류 속도(삼각형, 점선)를 비교한 그래프를 도시한다.
도 20은 예시적인 rCHO 세포주 1의 배양물에서 이피션트 피드(Efficient Feed) B가 보충된 CD CHO 배지(검정색) 및 CD CHO 배지(회색)에 따른 생존 세포 밀도(세포/mL, 실선) 및 생존률(점선)을 비교한 그래프를 도시한다.
도 21은 예시적인 rCHO 세포주 1의 배양물에서 이피션트 피드 B가 보충된 CD CHO 배지(검정색) 및 CD CHO 배지(회색)에 따른 관류 속도(원형, 실선) 및 세포 특이적 관류 속도(삼각형, 점선)를 비교한 그래프를 도시한다.
도 22는 예시적인 rCHO 세포주 3의 배양물에서 20 L WAVE 생물반응기(10 L의 유효 부피(working volume), 검정색) 및 10 L WAVE 생물반응기(5 L의 유효 부피, 회색)를 사용한 경우 생존 세포 밀도(세포/mL, 실선) 및 생존률(점선)을 표현하는 그래프를 도시한다.
본 명세서는 비원심분리형(non-centrifugal) 세포 보유 장치에 연결된 관류 배양 시스템을 사용하는 것을 포함하는 초고밀도 세포 크라이오뱅킹 방법을 제공한다.
I. 정의
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "회분식(batch) 배양"은, 일정량의 신선한 배양 배지에 대수 성장기로 신속히 진입하는 세포가 접종되고, 배양물의 성장 배지는 연속적으로 제거되어 신선한 배지로 대체되지 않는, 세포 배양 기술을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "유가식(fed batch) 배양"은, 일정량의 신선한 배양 배지에 세포가 먼저 접종되고, 추가의 배양 영양분이 배양 공정 동안 배양물에 공급되며(연속적으로 또는 불연속 증분식으로), 배양 종료 전에 주기적인 세포 및/또는 생성물 수거가 이루어지거나 이루어지지 않는, 세포 배양 기술을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "관류 배양"은, 일정량의 신선한 배지에 대수 성장기로 신속히 진입하는 세포가 접종되고(상기와 같음), 성장 배지가 연속적으로 제거되어 신선한 배지로 대체되는, 세포 배양 기술을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "생물반응기"는 세포를 배양하기 위한 용기를 지칭할 것이다.
일 구현예에서, 생물반응기는 "가요성 백 생물반응기"이다. "가요성 백 생물반응기"는, 액체 배지 및 세포 접종물을 수용할 수 있으며 컨넥터(connector), 포트(port), 어댑터(adaptor) 및 가요성 배관을 추가로 포함하는, 무균 챔버이다. 일 구현예에서, 챔버는 플라스틱으로 제조된다. 특정 구현예에서, 챔버는 다층으로 적층된 투명 플라스틱으로 제조된다. 추가의 특정 구현예에서, 챔버는 다층으로 적층된 투명 플라스틱으로 제조되고, 이의 유체 접촉 층은 USP 클래스(Class) VI 에틸렌 비닐 아세테이트/저밀도 폴리에틸렌 공중합체로 제조되는 한편 외부 층은 저밀도 폴리에틸렌으로 제조된다.
또한, 컨넥터, 포트, 및 어댑터는 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 및 폴리카르보네이트를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 종류의 플라스틱으로 제조될 수 있는 한편, 배관은 열가소성 탄성체 또는 실리콘(예를 들어, 백금-경화(platimum-cured) 실리콘)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 종류의 플라스틱으로부터 제작될 수 있다.
적절한 가요성 백 생반응기는 당 분야에서 통상적으로 발견될 수 있고, 전체 내용이 참조로 본 명세서에 포함되는 미국 특허 제6,544,788호에 기재된 것을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
가요성 백 생물반응기는 배양 배지로 부분적으로 충전될 수 있고, 이후 강성이 되도록 팽창될 수 있다. 이후 이것은 미리 설정된 로킹 각도 및 미리 설정된 록킹 속도를 통해 앞뒤로 움직이는 로킹 플랫폼(예를 들어, GE Life Sciences로부터의 BASE20/50EHT 로킹 유닛) 상에 위치하게 될 수 있다. 이러한 로킹 운동은 배양 배지 내에 물결 같은 운동을 유도하고, 이는 교반 및 산소 전달을 촉진하여 세포 배양물의 성능을 개선시킨다. 미리 설정된 로킹 각도는 적어도 약 4도, 예를 들어, 약 4도, 5도, 6도, 7도, 8도, 9도, 10도, 11도, 또는 12도일 수 있다. 또한, 미리 설정된 로킹 속도는 분 당 로크 속도(rpm)로 설정될 수 있으며, 이는 적어도 약 6 rpm, 예를 들어, 약 6 rpm, 약 7 rpm, 8 rpm, 9 rpm, 10 rpm, 11 rpm, 12 rpm, 13 rpm, 14 rpm, 15 rpm, 16 rpm, 17 rpm, 18 rpm, 19 rpm, 20 rpm, 21 rpm, 22 rpm, 23 rpm, 24 rpm, 25 rpm, 26 rpm, 27 rpm, 28 rpm, 29 rpm, 30 rpm, 31 rpm, 32 rpm, 33 rpm, 34 rpm, 35 rpm, 36 rpm, 37 rpm, 38 rpm, 39 rpm, 또는 40 rpm이다. 특정 구현예에서, 분 당 로크 속도는 약 22 rpm이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "세포 보유 시스템"은 필터를 사용함으로써 세포를 배지 및 그 안의 폐생성물(waste product)과 분리시키는 능력을 갖는 모든 장치를 지칭한다. 필터는 나선권취형(spiral wound), 관형(tubular) 또는 시트형(sheet)을 포함하는 임의의 형태의 막, 세라믹, 또는 금속 필터를 포함할 수 있다. 필터는 다양한 표면적을 지닐 수 있다. 예를 들어, 필터 표면적은 약 0.08 m2 내지 약 5.5 m2, 예를 들어, 약 0.08 m2, 0.09 m2, 0.1 m2, 0.2 m2, 0.3 m2, 0.4 m2, 0.5 m2, 0.6 m2, 0.7 m2, 0.77 m2, 0.8 m2, 0.9 m2, 1.0 m2, 1.1 m2, 1.2 m2, 1.3 m2, 1.4 m2, 1.5 m2, 1.6 m2, 1.7 m2, 1.8 m2, 1.9 m2, 2.0 m2, 2.1 m2, 2.2 m2, 2.3 m2, 2.4 m2, 2.5 m2, 2.6 m2, 2.7 m2, 2.8 m2, 2.9 m2, 3.0 m2, 3.1 m2, 3.2 m2, 3.3 m2, 3.4 m2, 3.5 m2, 3.6 m2, 3.7 m2, 3.8 m2, 3.9 m2, 4.0 m2, 4.1 m2, 4.2 m2, 4.3 m2, 4.4 m2, 4.5 m2, 4.6 m2, 4.7 m2, 4.8 m2, 4.9 m2, 5.0 m2, 5.1 m2, 5.2 m2, 5.3 m2, 5.4 m2, 또는 5.5 m2일 수 있다. 특정 구현예에서, 필터 모듈은 약 10 킬로돌턴(kDa) 내지 약 100 kDa의 분자량 컷오프(MWCO) 크기를 지니며, 예를 들어 이것은 약 10 kDa, 20 kDa, 30 kDa, 40 kDa, 50 kDa, 60 kDa, 70 kDa, 80 kDa, 90 kDa, 또는 100 kDa이다. 다른 구현예에서, 필터 모듈은 약 0.1 μm 내지 약 7 μm, 예를 들어, 약 0.1 μm, 0.2 μm, 0.3 μm, 0.4 μm, 0.5 μm, 0.6 μm, 0.7 μm, 0.8 μm, 0.9 μm, 1.0 μm, 1.1 μm, 1.2 μm, 1.3 μm, 1.4 μm, 1.5 μm, 1.6 μm, 1.7 μm, 1.8 μm, 1.9 μm, 2.0 μm, 2.1 μm, 2.2 μm, 2.3 μm, 2.4 μm, 2.5 μm, 2.6 μm, 2.7 μm, 2.8 μm, 2.9 μm, 3.0 μm, 3.1 μm, 3.2 μm, 3.3 μm, 3.4 μm, 3.5 μm, 3.6 μm, 3.7 μm, 3.8 μm, 3.9 μm, 4.0 μm, 4.1 μm, 4.2 μm, 4.3 μm, 4.4 μm, 4.5 μm, 4.6 μm, 4.7 μm, 4.8 μm, 4.9 μm, 5.0 μm, 5.1 μm, 5.2 μm, 5.3 μm, 5.4 μm, 5.5 μm, 5.6 μm, 5.7 μm, 5.8 μm, 5.9 μm, 6.0 μm, 6.1 μm, 6.2 μm, 6.3 μm, 6.4 μm, 6.5 μm, 6.6 μm, 6.7 μm, 6.8 μm, 6.9 μm, 또는 7.0 μm의 메쉬(mesh) 크기를 지닌다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "저온보존"은, 시간에 의해 또는 효소적 또는 화학적 활성에 의해 야기되는 손상에 민감한, 세포, 조직, 또는 임의의 다른 물질을 영하(sub-zero)의 온도까지 냉각시키고 저장함으로써 이들이 보존되게 하는 공정을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "크라이오뱅킹"은, 세포가 동결보호제(예를 들어, 하이드록시에틸 전분(HES)을 동반하거나 동반하지 않는 DMSO)와 혼합되게 하고 저온보존 조건하에서 저장하기에 적절한 용기에 위치되어 지게 하는 기술을 지칭한다. 이후 이러한 용기는 당 분야에 널리 공지된 기술을 사용하여 동결되고, 저온, 전형적으로 약 -130℃ 내지 약 -196℃에서 저장된다. 이러한 공정에 의해 수득된 세포의 수집물이 세포 뱅크이다.
하나의 구현예에서, 세포 뱅크는 초고밀도 세포 뱅크이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "초고밀도 세포 뱅크"는, 초고밀도로 동결된 세포의 크라이오뱅킹된 분취량을 지칭할 것인데, 여기서 밀도는 적어도 약 1 x 10^8개 생존 세포/mL, 예를 들어, 약 1 x 10^8개 생존 세포/mL, 약 1.1 x 10^8개 생존 세포/mL, 약 1.2 x 10^8개 생존 세포/mL, 약 1.3 x 10^8개 생존 세포/mL, 약 1.4 x 10^8개 생존 세포/mL, 약 1.5 x 10^8개 생존 세포/mL, 약 1.6 x 10^8개 생존 세포/mL, 약 1.7 x 10^8개 생존 세포/mL, 약 1.8 x 10^8개 생존 세포/mL, 약 1.9 x 10^8개 생존 세포/mL, 약 2 x 10^8개 생존 세포/mL, 약 3 x 10^8개 생존 세포/mL, 약 4 x 10^8개 생존 세포/mL, 또는 약 5 x 10^8개 생존 세포/mL이다. 세포는 당 분야에서 이용 가능한 임의의 방법에 따라 그리고 저온보존 조건하에서 저장하기에 적절한 임의의 용기 내에서 동결될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 세포 뱅크는 마스터(master) 세포 뱅크이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "마스터 세포 뱅크"는, 단일 클론으로부터 성장되고, 저장 용기 내로 분배되고(예를 들어, 단일 작업으로 용기 내로 분배됨), 상기 기재된 바와 같이 저온보존 조건하에서 저장된, 세포(예를 들어, 완전히 특성규명된 세포)의 배양물을 지칭할 것이다. 특정 구현예에서, 세포는, 생산 세포 배양물 그리고 이에 의해 생성된 치료적으로 관련된 단백질의 추가 수확에서, 추후 사용하기에 적합하다.
또 다른 구현예에서, 세포 뱅크는 작업용(working) 세포 뱅크이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "작업용 세포 뱅크"는 마스터 세포 뱅크의 단일 바이알로부터 또는 마스터 세포 뱅크의 2개의 풀링된(pooled) 바이알로부터 성장되고, 저장 용기 내로 분배되고(예를 들어, 단일 작업으로 용기 내로 분배됨), 상기 기재된 바와 같이 저온보존 조건하에서 저장된, 세포(예를 들어, 완전히 특성규명된 세포)의 배양물을 지칭할 것이다. 특정 구현예에서, 세포는, 생산 세포 배양물 그리고 이에 의해 생성된 치료적으로 관련된 단백질의 추가 수확에서, 추후 사용하기에 적합하다.
또 다른 구현예에서, 세포 뱅크는 미니(mini) 세포 뱅크이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "미니-뱅크"는, "크라이오뱅킹" 절차(상기 기재된 바와 같음)에 따라 저온보존된 것이만 세포 뱅크를 생성시키기 위해 통상 사용되는 것보다 더 적은 샘플로 구성되는, 세포의 분취량을 지칭할 것이다. 이러한 유형의 뱅크는, 세포 뱅크, 예를 들어 "마스터 세포 뱅크"가 생성되기 전에 세포주의 저온보존을 위해 고려되는 조건을 최적화시키기 위해 일반적으로 사용될 수 있다. 예로서, "미니-뱅크"는, 본 명세서에 기재된 초고밀도 세포 뱅킹 절차를 위한 최적 세포 밀도를 결정하기 위해 사용된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "저온보존 조건하에서 저장하기에 적절한 용기"는 약 -130℃ 내지 약 -196℃에서 세포를 저장하기에 적절한 조건하에서 사용될 수 있는 임의의 용기를 포함한다. 이러한 용기는, 저온보존을 위해 적합한 재료로 제조된 바이알을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이러한 재료는 중합체(예를 들어, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 또는 폴리프로필렌)을 포함한다. 또한, 저온보존 조건을 개선시키기 위해 저온보존 바이알의 표면에 표면 처리(예를 들어, 흡착 및 변성을 감소시키는 친수성 코팅)가 적용될 수 있다. 예시적인 구현예에서, 바이알은 약 0.1 mL 초과의 부피를 지닐 수 있으며, 예를 들어 바이알은 약 0.1 mL, 약 0.5 mL, 약 0.75 mL, 약 1 mL, 약 1.5 mL, 약 2 mL, 약 2.5 mL, 약 4.5 mL, 약 10 mL, 약 15 mL, 약 20 mL, 약 25 mL, 또는 약 50 mL의 부피를 지닐 수 있다. 또한, 용기는 약 30 mL, 약 50 mL, 약 100 mL, 약 150 mL, 약 200 mL, 약 300 mL, 약 400 mL, 또는 약 500 mL의 부피를 지닐 수 있는 크라이오백일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "크라이오백"은, 액체 배지를 수용할 수 있고, 약 -130℃ 내지 약 -196℃에서 세포를 저장하기에 적절하며, 컨넥터, 포트, 어댑터 및 가요성 배관을 추가로 포함할 수 있는, 무균 챔버이다. 크라이오백은, 중합체, 예를 들어, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 플루오르화 에틸렌 프로필렌(FEP), 폴리올레핀, 및 에틸렌 비닐 아세테이트(EVA)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 적절한 재료로 제작될 수 있다. 예시적인 크라이오백은, KryoSure® 저온보존 백(Saint-Gobain), PermaLife™ 백(OriGen Biomedical), 크라이오스토어(CryoStore) 동결 백(OriGen Biomedical), Freeze-Pak™ 생물용기(Biocontainer)(Charter Medical), 및 전체 내용이 참조로 본 명세서에 포함되는 미국 가출원 제62/037,181호(Merial Ltd., a Sanofi company)에 기재된 백을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 크라이오백은 폐쇄 상(closed phase) 세포 뱅킹 시스템을(예를 들어, 백의 "폐쇄 시스템" 충전을 가능하게 하는 적어도 2개의 무균의 용접 가능한 도관의 사용을 통해) 지탱할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "진탕 플라스크"는, 인큐베이션 동안 배지 및 세포 배양물이 일정하게 교반되는 배양 플라스크로서 사용되는 용기를 지칭할 것이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "진탕 플라스크 시드 트레인(seed train)"은, 세포의 분취량이 먼저 진탕 플라스크에서 배양되고(시딩되고), 그 안에서 성장되는, 세포 증식 방법을 지칭할 것이다. 세포는 이의 성장 속도에 따라 배양되고, 바이오매스(biomass)가 생물반응기를 접종하기에 충분한 수준에 도달할 때까지 이의 성장 동안 통상 더 큰 용기 및/또는 다수의 용기 내로 분할된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "시드 밀도"는 플라스크 또는 생물반응기가 접종되는 최초 세포 밀도를 지칭할 것이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "치료적으로 관련된 단백질"은, 포유동물, 예를 들어 마우스, 래트, 원숭이, 유인원 및 인간을 포함하는, 동물의 질병 또는 장애에 대한 치료제를 생성시키기 위해 또는 그러한 질병 또는 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있는 임의의 단백질을 지칭할 것이다. 이러한 단백질은 결합성 폴리펩티드, 예를 들어 단클론 항체, Fc 융합 단백질, 항응고제, 혈액 인자, 골 형태형성 단백질(bone morphogenetic protein), 조작된 단백질 골격(engineered protein scaffold), 효소, 성장 인자, 호르몬, 인터페론, 인터류킨, 및 혈전용해제를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "결합성 폴리펩티드" 또는 "결합성 폴리펩티드"는 관심 표적 항원(예를 들어, 인간 항원)에 선택적으로 결합하는 것을 담당하는 적어도 하나의 결합 부위를 함유하는 폴리펩티드(예를 들어, 항체)를 지칭할 것이다. 예시적인 결합 부위는 항체 가변 도메인, 수용체의 리간드 결합 부위, 또는 리간드의 수용체 결합 부위를 포함한다. 특정 양태에서, 결합성 폴리펩티드는 다수의(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 또는 그 초과의) 결합 부위를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 관심 항원(예를 들어, 종양-관련 항원)에 대해 유의할 만한 공지된 특이적 면역반응 활성을 지닌 그러한 조립체(assembly)(예를 들어, 무손상 항체 분자, 항체 단편, 또는 이의 변이체)를 지칭한다. 항체 및 면역글로불린은 경쇄 및 중쇄를 포함하는데, 이들 사이에는 사슬간 공유 결합이 존재하거나 부재한다. 척추동물 계통의 기본적 면역글로불린 구조는 비교적 잘 이해되어 있다.
일반 용어 "항체"는 생화학적으로 구별될 수 있는 5개의 별개의 항체 부류를 포함한다. 모든 5개의 항체 부류가 명확히 본 명세서의 범위에 속하지만, 하기 논의는 대체로 면역글로불린 분자의 IgG 부류에 관한 것일 것이다. IgG에 관하여, 면역글로불린은 분자량이 대략 23,000 돌턴인 2개의 동일한 경쇄, 및 분자량이 53,000 내지 70,000인 2개의 동일한 중쇄를 포함한다. 4개의 사슬은 "Y" 배열로 이황화물 결합에 의해 연결되어 있는데, 여기서 경쇄는, "Y"의 입구(mouth)에서 시작하여 가변 영역을 통해 이어지는 중쇄를 감싼다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "용존 산소" 또는 "DO"는 공기 포화도에 기반하여 주어진 액체(예를 들어, 세포 배양 배지) 내에 존재하는 용존 산소 가스의 백분율이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "세포 특이적 관류 속도"(CSPR)은, 세포 배양 배지가 세포 배양물에 공급되는 속도를 지칭할 것이며, 일당 생존 세포 당 첨가되는 배지의 부피로서 표현된다(Ozturk, SS. Engineering challenges in high density culture systems. Cytotechnology. 1996; 22:3-16).
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 명시된 값을 중심으로 10%의 공차 범위를 지칭할 것이다. 따라서, 용어 "약"이 명시된 값을 수식하기 위해 사용되는 경우, 지시된 범위는 명시된 값의 ±0.01%, 0.02%, 0.05%, 0.1%, 0.2%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 또는 10% 내의 임의의 수치를 포함할 것이다.
II. 관류 세포 배양
전통적인 세포 배양은 "회분식" 배양 공정을 수반한다. 이러한 유형의 배양에서, 일정량의 신선한 배지에 대수 성장기로 신속히 진입하는 세포가 접종된다. 이들 세포가 성장하고 분열함에 따라, 이들은 배지로부터 이용 가능한 영양분을 소비하고, 유해한 폐생성물을 배출한다. 시간이 지남에 따라, 배양물은 정체 성장기에 진입하고, 최종적으로 쇠퇴기로 진입할 것이다. "회분식" 배양 공정에 대한 변형은 시간이 지남에 따라 이를 더욱 효율적이 되게 하지만, 결과적인 변형된 회분식 배양 프로토콜은 여전히 신속한 성장 및 쇠퇴 주기를 초래한다. 또한, "회분식" 배양 공정은, 고밀도 세포 뱅킹을 가능하게 하는데 필요한 세포 밀도의 수준에 도달하는 데에 있어서 제한된 능력을 지닌다.
"유가식" 배양 공정은 전통적인 "회분식" 배양 기술에 비해 세포 배양 기술에 있어서의 추가의 개선을 지칭한다. 이러한 공정은 더 높은 세포 밀도 성장을 가능하게 하지만, 고밀도 세포 배양물의 효율적인 성장을 가능하게 하고, 이에 따라 고밀도 세포 뱅킹을 위해 효율적으로 세포를 발생시키는, 이의 능력에 있어서는 여전히 제한적이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 관류 배양 공정을 사용한다. 관류 배양은, 일정량의 신선한 배지에 대수 성장기에 신속히 진입하는 세포가 접종되고(상기와 같음), 성장 배지가 배양물로부터 연속적으로 제거되어 신선한 배지로 대체되는, 세포를 성장시키기 위한 방법이다. 이러한 방식으로, 배양물은 높은 수준의 영양분을 지닌 신선한 배지를 일정하게 수용하는 한편, 폐생성물을 함유하고 낮은 수준의 영양분을 지닌 배지는 제거된다. 이러한 유형의 배양은, 적어도 절반의 배양 부피가 하루마다 교환되고, 세포 밀도가 전통적 또는 변형된 회분식 배양으로 달성되는 것보다 훨씬 높을(2배 내지 10배 초과의 증가) 수 있는, 세포의 대수 성장의 유지를 가능하게 한다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 세포 특이적 관류 속도(CSPR)는 약 0.02 nL 세포-1일-1 내지 약 0.5 nL 세포-1일-1일 수 있고, 예를 들어, 이것은 약 0.02 nL 세포-1일-1, 0.025 nL 세포-1일-1, 0.05 nL 세포-1일-1, 0.1 nL 세포-1일-1, 0.2 nL 세포-1일-1, 0.3 nL 세포-1일-1, 0.4 nL 세포-1일-1, 또는 0.5 nL 세포-1일-1일 수 있다. 본 발명의 또 다른 구현에에서, 관류 속도는 일당 반응기 부피로 측정될 수 있으며, 일당 0 내지 15 반응기 부피일 수 있고, 예를 들어, 이것은 일당 약 0 반응기 부피, 일당 약 0.5 반응기 부피, 일당 약 1 반응기 부피, 일당 약 2 반응기 부피, 일당 약 3 반응기 부피, 일당 약 4 반응기 부피, 일당 약 5 반응기 부피, 일당 약 6 반응기 부피, 일당 약 7 반응기 부피, 일당 약 8 반응기 부피, 일당 약 9 반응기 부피, 일당 약 10 반응기 부피, 일당 약 11 반응기 부피, 일당 약 12 반응기 부피, 일당 약 13 반응기 부피, 일당 약 14 반응기 부피, 또는 일당 약 15 반응기 부피일 수 있다. 특정 구현예에서, 관류 배양은 최소 1개의 딥 튜브(dip tube)를 지닌 생물반응기에서 수행될 수 있다.
특정 구현예에서, 배양물의 pH, 온도, 용존 산소 농도(DO), 및 오스몰농도(osmolarity)는 배양물 활력(health) 및 생산성을 최대화시키기 위해 조정될 수 있다. 배양물의 DO 및 pH를 제어하는 하나의 방법은 자동화된 피드백 제어기를 통해 이루어진다. 이러한 유형의 자동화된 제어기는, 배양물의 pH 및 DO를 모니터링 및 조정하고 이에 의해 세포 성장을 위한 최적 조건을 유지시키기 위해, 마이크로프로세서-기반 컴퓨터를 사용하여 작동한다. 그러나, 이러한 자동화된 피드백 제어 시스템은 비용이 많이 든다. 따라서, 특정 구현예에서, 이러한 파라미터들을 제어하는 비자동화된 방법이 사용될 수 있다. 하나의 예시적 구현예에서, 배양물에 걸쳐 유동하는 가스 혼합물의 조정, WAVE® 로크 속도의 조정, 또는 배양물의 로크 각도의 조정 중 어느 것이, 선택된 파라미터(예를 들어, pH 또는 DO)를 제어하기 위해 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 자동화된 피드백 제어 및 비자동 제어 둘 모두가 적용될 수 있다.
일 구현예에서, 이산화탄소 가스의 시작 수준은 약 10%이고 산소 가스의 시작 수준은 약 20%이며, 공기 유량은 분 당 약 0.2 리터(lpm)이다. pH가 약 6.9 이하인 경우, CO2 설정점은 10%로부터 5%로 감소될 수 있다. pH가 이후 시점에서 여전히 약 6.9 이하인 경우, CO2 설정점은 5%로부터 0%로 추가로 감소될 수 있다. pH가 여전히 약 6.9 이하인 경우, 관류 속도가 증가될 수 있다. DO가 약 45% 이하인 경우, O2 설정점은 20%로부터 30%로 상승되어야 한다. DO가 이후 시점에서 약 45% 이하인 경우, O2 수준은 30%로부터 40%로 상승되어야 하고, 로크 속도는 약 25 rpm로 증가되어야 하고, 로크 각도는 약 12°로 변경되어야 한다.
i. 세포 배양 배지
세포의 배양에 적합한 임의의 유형의 세포 배양 배지가 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 적절한 세포 배지를 선택하기 위한 지침은 당 분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌[Chapters 8 and 9 of Freshney, R.I. Culture of Animal Cells(a manual of basic techniques), 4th edition 2000, Wiley-Liss] 및 문헌[Doyle, A.,Griffiths, J.B., Newell, D.G. Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures 1993, John Wiley & Sons]에 제공되어 있다. 이들 참고문헌 각각은 그 전체 내용이 본 명세서에 포함된다. 국제 특허 출원 번호 WO 97/05240호, WO 96/26266호, 및 WO 00/11102호, 및 미국 특허 제6,100,061호, 미국 특허 제6,475,725호, 및 미국 특허 제8,084,252호에서 발견되는 것과 같은 동물 유래 성분이 없고 단백질이 없는 조건하에서 세포 배양물을 제조하고 유지하기 위한 추가의 방법(CHO 세포와 관련된 방법을 포함함)이 당 분야에 존재한다. 전술한 문헌들 각각은 그 전체 내용이 참조로 본 명세서에 포함된다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 동물 유래 성분(ADC)이 없는 배지가 사용될 수 있다. 통상적인 합성 최소 배지는 무기 염, 아미노산, 비타민, 탄수화물 공급원, 및 물을 함유할 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에서, 사용될 수 있는 배지는 CD-CHO(GIBCO, Invitrogen Corp.; 화학적으로 규정되고, 단백질, 가수분해물, 또는 기원이 알려져 있지 않은 성분을 함유하지 않는, 동물 기원 성분이 없는 배지)이다. 또한, 배지는 글루타민 및/또는 메토트렉세이트 또는 성장 또는 부착에서 도움을 줄 수 있는 다른 인자를 포함하는 추가 성분을 지닐 수 있다. 특정 구현예에서, 추가 성분은 약 2 mM 내지 약 8 mM, 예를 들어, 약 2 mM, 약 3 mM, 약 4 mM, 약 5 mM, 약 6 mM, 약 7 mM, 또는 약 8 mM로 첨가되는 GLUTAMAX-1 또는 L-글루타민일 수 있다.
ii. 숙주 세포 및 발현 벡터
특정 구현예에서, 본 발명의 세포 뱅킹 공정에서 사용되는 세포는, 치료적으로 관련된 단백질 또는 다른 관심 폴리펩티드의 발현을 위한 발현 작제물(construction)을 지닌 숙주 세포이다. 관심 폴리펩티드(예를 들어, 결합성 폴리펩티드)를 발현시키기 위해 사용될 수 있는 임의의 세포가 본 명세서에 기재된 방법에 따라 사용될 수 있다. 세포는 천연 핵산 서열 또는 재조합 핵산 서열, 예를 들어, 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 발현 벡터를 선택적으로 함유할 수 있다. 발현 벡터는 적절한 전사 및 번역 제어부를 선택적으로 함유할 수 있고, 당 분야에 공지된 재조합 DNA 기술을 사용하여 작제될 수 있다. 발현 벡터는 당 분야에 공지된 기술에 의해 임의의 숙주 세포로 전달될 수 있고, 이후 형질전환된 세포는 고밀도 세포 뱅크를 생성시키기 위해 본 발명의 방법에 따라 배양될 수 있다. 또한, 이후 고밀도 세포 뱅크는 인코딩되는 관심 단백질을 생성시키기 위해 당 분야에 공지된 기술에 따라 해동되고 배양될 수 있고, 요망되는 경우, 이러한 단백질은 후속하여 정제될 수 있다.
특정 구현예에서, 치료적으로 관련된 단백질을 생성시키기 위해 다양한 숙주 발현 시스템이 사용될 수 있다. 또한, 숙주 발현 시스템은 포유류 세포의 유전체로부터 유래된 프로모터를 함유하는 재조합 발현 작제물을 지닌 포유류 세포 시스템(예를 들어, CHO, CHO-DBX11, CHO-DG44, CHO-S, CHO-K1, Vero, BHK, HeLa, COS, MDCK, HEK-293, NIH-3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20, T47D, NS0, CRL7030, HsS78Bst 세포, PER.C6, SP2/0-Agl4, 및 하이브리도마 세포)일 수 있다. 포유류 세포와 함께 바이러스-기반 발현 시스템이 또한 사용될 수 있다(예를 들어, 전체 내용이 참조로 본 명세서에 포함되는 문헌[Logan et al, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:355-359] 참조). 발현의 효율은 적절한 전사 인핸서 요소 및 전사 종료자를 포함하는(이에 제한되지는 않음) 요소들을 포함함으로써 향상될 수 있다(예를 들어, 전체 내용이 참조로 본 명세서에 포함되는 문헌[Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:516-544] 참조).
다른 구현예에서, 삽입된 서열의 발현을 조절하거나, 요망되는 특정 방식으로 유전자 생성물을 변형시키고 가공하는 숙주 세포주가 선택될 수 있다. 다양한 숙주 세포는 단백질 및 유전자 생성물의 번역 후 가공 및 변형을 위한 특징적이고 특이적인 메커니즘을 지닌다. 발현되는 폴리펩티드(예를 들어, 결합성 폴리펩티드)의 정확한 변형 및 가공을 보장하기 위해 적절한 세포주 또는 숙주 시스템이 선택될 수 있다. 이러한 세포는, 예를 들어, 확립된 포유류 세포주 및 동물 세포뿐만 아니라 곤충 세포주, 진균 세포, 및 효모 세포를 포함한다.
iii. 생물반응기
관류 배양 조건하에서 세포를 배양하기에 적합한 임의의 생물반응기가 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 생물반응기는 적절한 시드 밀도의 세포의 분취량(예를 들어, 세포 또는 종균 배양물로부터의 세포의 바이알, 예를 들어, 이러한 밀도까지 배양된 진탕 플라스크 또는 진탕 플라스크 시드 트레인)을 사용하여 접종될 수 있다. 배양물에 대한 적절한 시드 밀도는 사용되는 세포의 유형 및 접종되는 생물반응기를 포함하는 여러 인자에 좌우된다. 적절한 시드 밀도는 당 분야에서 이용 가능한 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
특정 구현예에서, 생물반응기는 일회성일 수 있고, 예를 들어, 생물반응기는 가요성 배관에 의해 세포 보유 장치에 연결되는 가요성 백 또는 플라스틱 플라스크일 수 있다. 디자인은, 진핵 세포의 공급원에 무균적으로 용접되거나 연결될 수 있는, 유입 도관 및 유출구 또는 접종 도관을 포함할 수 있지만, 이들을 포함하도록 요구되지 않는다. 특정 구현예에서, 생물반응기는 적어도 약 1 L, 예를 들어, 약 1 L, 2 L, 5 L, 10 L, 20 L, 50 L, 75 L, 85 L, 100 L, 150 L 또는 400 L의 부피를 지닌다. 본 발명의 특정 구현예에서, 생물반응기는, 배지 또는 생성물을 분리하기 위해 사용되는 1개 또는 2개의 딥 튜브를 지니도록 맞춤 제작된 10 L 가요성 백이다. 예시적 일회용 생물반응기는 WAVE® 세포 백 생물반응기(GE Healthcare, Pittsburgh, PA), 예를 들어, 20 L WAVE® 생물반응기이다. 이들은, 다른 문헌들 중에서, 전체 내용이 참조로 본 명세서에 포함되는 문헌[Singh ,1999, Disposable bioreactor for cell culture using wave-induced agitation, Cytotechnology, p.149-158]에 기재된 관류 생물반응기 시스템이다.
반응기의 유효 부피는 배양물이 차지하는 부피이다. 유효 부피는, 예를 들어 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 그 초과의 배양물일 수 있지만, 바람직하게는 약 75% 이하의 배양물일 수 있다.
대안적으로, 생물반응기는 일회성이 아닐 수 있다. 예를 들어, 생물반응기는 스테인리스 스틸 또는 유리로 제조될 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 대안적 생물반응기는 진탕 플라스크, 교반형 탱크 용기, 에어리프트(airlift) 용기, 및 로킹, 진탕, 또는 교반에 의해 혼합될 수 있는 일회용 백을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
일 구현예에서, 생물반응기는, 빌트-인 필터, 스핀 배스킷(spin basket), 접선 유동 여과(TFF) 시스템, 및 교번식 접선 유동 여과(ATF) 시스템을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 세포 보유 시스템에 커플링될 수 있다.
III. 세포 보유
관류 배양은, 세포에 대한 손상을 최소화하면서 영양분이 고갈되고 폐생성물이 함유된 배지를 배양물로부터 제거하는 능력에 좌우된다. 고갈된 배지를 배양된 세포로부터 분리했던 초기의 세포 보유 방법은, 예를 들어 전단력의 생성을 통해 빈번하게 세포를 손상시켰다. 이러한 세포 손상은 필터 막힘 및 관류 장치의 고장을 초래하였는데, 이들 중 다수는 배양 시스템의 내부에 존재하였다. 따라서, 하나의 양태에서, 본 명세서는 배지 교환을 가능하게 하는 "세포 보유 시스템"을 사용하는 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 사용되는 세포 보유 시스템의 유형은 "빌트-인"형 필터이며, 이러한 필터는 생물반응기의 챔버 내에 위치하고 챔버 내에서 이동이 자유롭다. 필터는 챔버로부터 이어지는 튜브들 중 하나에 커플링될 수 있고, 이에 의해 여과된 배지가 배양물로부터 배출될 수 있게 한다. "빌트-인"형 필터의 하나의 예는, 전체 내용이 참조로 본 명세서에 포함되는 미국 특허 제6,544,788호에서 발견될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 사용되는 세포 보유 시스템은 접선 유동 여과(TFF) 시스템이다. TFF 시스템에서, 배양 배지는 여과 모듈을 통해 배양 용기로부터 순환되고, 이후 여과 모듈과 배양 용기 사이의 배관에 부착된 펌프에 의해 배양 용기로 복귀하여, 필터 모듈에 걸쳐 접선 유동을 생성시킨다. 제2 펌프는 필터 모듈의 여과물 측에 위치하고, 여과물이 제거되는 속도를 제어하기 위해 사용된다. 중공 섬유 막 필터를 사용하는 것이 이러한 시스템에서 바람직한데, 이는 이것이 살균하기가 더 쉽고 필터 모듈에 걸쳐 균일한 유동을 유지하는 것을 가능하게 하기 때문이다. 그러나, 중공 섬유 필터가 이러한 시스템에서 사용되는 경우, 이것은 막히기 쉬운데, 이는 단일방향성(monodirectional) 유동이 루멘 입구에서 미립자 물질의 응집을 유도하기 때문이다.
특정 구현예에서, 사용되는 세포 보유 시스템의 유형은 교번식 접선 유동(ATF) 시스템이다. ATF 유형의 세포 보유 시스템에서, 여과 구획은 한 쪽 단부에서 저장 용기에 연결되고, 다른 쪽에서는 다이어프램(diaphragm) 펌프에 연결된다. 펌프는 먼저 배지를 용기로부터 필터 요소를 통해 펌프로 이동시키고, 이후 배지를 펌프로부터 필터를 통해 다시 용기로 보내도록 반대로 바뀌어서, 양방향성 또는 교번식 유동을 생성시킨다. 이것은 교번식 접선 유동(ATF)으로 지칭되는데, 이는 필터 모듈에서 교번식 접선 유동이 존재하기 때문인데, 즉, 필터 모듈의 막 표면과 동일한 방향으로(그러한 표면에 대해 접선인) 하나의 유동이 존재하고 그러한 표면에 실질적으로 수직인 또 다른 유동이 존재한다. 이러한 유형의 여과는 2000년 이래로 문헌에 존재해 왔으며, 신속하고 저전단이고 균일한 유동을 초래한다. ATF 여과는, 전체 내용이 참조로 본 명세서 포함되는 미국 특허 제6,544,424호에 기재된 바와 같은 당 분야에 공지된 방법에 의해 수득될 수 있다. 또한, 교번식 접선 유동 시스템은 Refine Technology와 같은 제조업체로부터 구매 가능하고, 다양한 모델, 예를 들어 ATF2, ATF4, ATF6, ATF8, 및 ATF10 시스템을 포함한다.
본 발명의 또 다른 특정 구현예에서, 필터는 관형 막 필터이고, 또한 중공 섬유 필터일 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 방법은 초고밀도로의 세포의 효율적인 성장을 가능하게 한다. 본 발명의 특정 구현예에서, 배양물은 적어도 약 1 x 10^8개 세포/mL의 밀도, 예를 들어 약 1 x 10^8개 세포/mL, 약 1.1 x 10^8개 세포/mL, 약 1.2 x 10^8개 세포/mL, 약 1.3 x 10^8개 세포/mL, 약 1.4 x 10^8개 세포/mL, 약 1.5 x 10^8개 세포/mL, 약 1.6 x 10^8개 세포/mL, 약 1.7 x 10^8개 세포/mL, 약 1.8 x 10^8개 세포/mL, 약 1.9 x 10^8개 세포/mL, 또는 약 2 x 10^8개 세포/mL의 밀도로 성장된다. 이러한 고농도로 배양물을 성장시키는 것은, 원심분리 또는 비원심분리 방법을 통한 세포 집단의 추가 농축없이 고밀도 스톡의 즉각적인 저온보존을 가능하게 한다.
IV. 저온보존 및 세포 뱅킹
저온보존은, 시간에 의해 또는 효소적 또는 화학적 활성에 의해 야기되는 손상에 민감한, 세포, 조직, 또는 임의의 다른 물질을 영하의 온도까지 냉각시키고 저장함으로써 이들이 보존되게 하는 공정을 지칭한다. 중요한 세포주의 저온보존의 중요성은 과소평가될 수 없는데, 이는(다른 중요한 장점 중에서) 이것이 이러한 세포주를 일정한 배양으로 유지시킴이 없이 이러한 세포주의 유지를 가능하게 하고, 오염의 위험을 감소시키고, 유전적 부동(genetic drift)의 위험을 감소시키기 때문이다.
저온보존 방법을 사용하는 경우, 동결 공정 동안 얼음의 형성을 통한 추가 손상을 야기시킴이 없이 이러한 낮은 온도에 도달하고 머무르는 것이 필수적이다. 당 분야의 방법은 전통적으로, 동결보호제로 일컬어지는, 세포에 대한 동결 손상을 감소시키는 물질을 사용한다. 동결보호제는 동결 공정 전에 세포 배양 배지에 첨가될 수 있다. 특정 구현예에서, 사용되는 동결보호제는 글리세롤 또는 디메틸 설폭사이드(DMSO) 중 하나 이상일 수 있다. 또한, 동결보호제는 하이드록시에틸 전분(HES)와 함께 또는 HES 없이 첨가될 수 있다. 추가의 특정한 구현예에서, DMSO는 적어도 약 5%의 농도로 첨가될 수 있고, 예를 들어, 이것은 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 또는 약 20%의 농도로 첨가될 수 있다.
동결보호제가 첨가된 배양물은 이후 저온보존 조건하에서 저장하기에 적절한 용기 내로 분배될 수 있다. 하나의 구현예에서, 이러한 용기는 중합체, 예를 들어, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 또는 폴리프로필렌을 포함(그러나 이에 제한되지는 않음)할 수 있는 재료로 제조된 바이알일 수 있다. 특정 구현예에서, 바이알은 저온보존 조건을 개선시키기 위해 추가의 표면 처리(예를 들어, 흡착 및 변성을 감소시키는 친수성 코팅)를 지닐 수 있다. 예시적 구현예에서, 바이알은 약 0.1 mL 초과의 부피를 지닐 수 있으며, 예를 들어, 바이알은 약 0.1 mL, 약 0.5 mL, 약 0.75 mL, 약 1 mL, 약 1.5 mL, 약 2 mL, 약 2.5 mL, 약 4.5 mL, 약 10 mL, 약 15 mL, 약 20 mL, 약 25 mL, 또는 약 50 mL의 부피를 지닐 수 있다. 또 다른 구현예에서, 용기는 또한 약 30 mL 초과의 부피를 지닌 크라이오백일 수 있으며, 예를 들어 크라이오백은 약 30 mL, 약 50 mL, 약 100 mL, 약 150 mL, 약 200 mL, 약 300 mL, 약 400 mL, 또는 약 500 mL의 부피를 지닐 수 있다. 크라이오백은 중합체, 예를 들어, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 플루오르화 에틸렌 프로필렌(FEP), 폴리올레핀 및 에틸렌 비닐 아세테이트(EVA)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 임의의 적절한 재료로 제조될 수 있다. 예시적 일회용 생물반응기는 KryoSure® 저온보존 백, PermaLife™ 백(OriGen Biomedical), CryoStore 동결 백(OriGen Biomedical), Freeze-Pak™ 생물용기(Charter Medical), 및 전체 내용이 참조로 본 명세서에 포함되는 미국 가출원 제62/037,181호(Merial Ltd., a Sanofi company)에 기재된 백을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
이러한 용기는 이후 낮은 온도, 전형적으로 약 -130℃ 내지 약 -196℃에서 저장되기 전에 당 분야에 널리 공지된 기술 및 장치를 사용하여 동결된다. 하나의 구현예에서, 사용되는 동결 기술은 속도제어(control-rate) 및 완만 동결(완만하고 프로그램가능한 동결, 또는 SPF로도 일컬어짐)일 수 있다. 이러한 공정에 의해 수득된 세포의 수집물이 세포 뱅크이다.
일 구현예에서, 세포 뱅크는 초고밀도 세포 뱅크, 마스터 세포 뱅크, 작업용 세포 뱅크, 또는 미니 뱅크일 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
V. 세포 생존률의 결정
상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 방법은 고밀도로 세포 뱅킹을 가능하게 하면서 추후 사용을 위해 우수한 세포 생존률을 보유한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "세포 생존률"은 주어진 샘플 내의 활력 있는 세포의 수 또는 백분율로 정의될 수 있다. 세포의 생존률은, 기재된 초고밀도 세포 뱅킹 공정의 임의의 지점에서 당 분야에서 이용 가능한 임의의 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 세포 생존률의 결정을 위해 통상적으로 사용되는 방법은 주로, 살아 있는 세포가 특정 염료, 예를 들어, 트립판 블루(디아조 염료), 에오신(Eosin), 또는 프로피듐을 차단시키는 무손상 세포막을 지니는 반면 죽은 세포는 그렇지 않다는, 원리를 기반으로 한다.
하나의 구현예에서, 트립판 블루는, 일정량의 세포를 염색시키고, 이에 의해 무손상 막을 지닌 세포의 존재(착색되지 않음) 및 파열된 막을 지닌 세포의 존재(청색)를 나타내기 위해 사용될 수 있다. 이후 이들 세포는 배양물 내의 살아있는 세포 및 죽은 세포 둘 모두의 수를 결정하기 위해 계수될 수 있고, 배양물의 상대적 활력을 나타내기 위해 백분율로 제시될 수 있다.
특정 구현예에서, 세포 생존률은, 초고밀도로 성장되었지만 아직 동결되지 않은, 배양물(즉, 동결 전 또는 해동 전 배양물)을 사용하여 결정될 수 있다. 특정 구현예에서, 세포 생존률은, 동결되고, 이후 해동된, 배양물(즉, 동결 후 또는 해동 후 배양물)을 사용하여 결정될 수 있다.
특정 구현예에서, 세포 생존률은 적어도 약 60%, 예를 들어, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%이다. 특정 구현예에서, 세포의 해동 후 생존률은 적어도 약 80%이며, 예를 들어 적어도 약 85%, 90%, 또는 95%이고 100%까지를 포함한다.
VI. 치료적으로 관련된 단백질
본 발명의 초고밀도 세포 크라이오뱅킹 방법으로부터 유래된 세포는 단백질의 제조를 위한 이후의 생산 시기에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 생물반응기에서 증식되고 고밀도 뱅크 분취량으로 동결된 세포는, 치료적으로 관련된 단백질을 포함하는 생물학적 물질의 생성을 위해 사용될 수 있다. 이러한 생물학적 물질은 바이러스(예를 들어, WO200138362호 참조), 결합성 폴리펩티드, 예를 들어, 항체, 예를 들어, 단클론 항체, 및 이의 단편, 예를 들어, Fab 단편; Fc 융합 단백질, 항응고제, 혈액 인자, 골 형태형성 단백질, 조작된 단백질 골격, 효소, 성장 인자, 호르몬, 인터페론, 인터류킨, 및 혈전용해제를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 이러한 생물학적 물질은 당 분야에서 이용 가능한 임의의 방법을 사용하여 수거될 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명은 생물학적 물질의 생성에 적합한 조건하에서 생물학적 물질을 발현할 수 있는 세포를 배양하는 단계를 포함하여 생물학적 물질을 생성시키는 방법을 제공하며, 이러한 세포는 관류 배양을 사용하여 생성된 초고밀도의 동결된 세포 뱅크로부터 수득되었다. 생물학적 물질은 단백질(예를 들어, 임의의 치료적으로 관련된 단백질)일 수 있다(그러나 이에 제한되지 않음).
실시예
본 발명은, 추가로 제한하는 것으로 해석되지 않아야 하는 하기 실시예에 의해 추가로 예시된다. 본 출원 전체에 걸쳐 인용된 수치 및 모든 참고문헌, 특허, 및 공개된 특허 출원의 내용은 그 전체 내용이 참조로 본 명세서에 명백히 포함된다.
실시예 1: 일반적인 방법
다음 조건은 하기 실시예 3 내지 실시예 6에 제시된 실험에 공통적이었다.
pH 설정점은 7.0 ± 0.1이었다. 배양물의 pH는 WAVE POD 제어기에 의한 자동 피드백 제어를 통해 설정점으로 유지되었다. 자동 제어기는 가스 내의 CO2 농도를 헤드스페이스(headspace)로 변경시켰고, 염기의 첨가(CO2/염기 제어 계획)를 추가로 조절하였다. 제어기가 선택된 pH 설정점 미만의 pH를 검출한 경우, CO2 수준을 낮춤으로써 설정된 pH 값에 도달하게 하려는 시도가 먼저 이루어졌다. 지정된 시간 내에 요구되는 pH 수준에 도달하지 못한 경우, 염기가 첨가되었다. 선택된 pH 설정점 보다 높은 pH에서는, CO2 농도가 증가되었다.
DO(용존 산소) 설정점은 40% 이상이었다. 배양물의 DO는 WAVE POD 제어기에 의한 자동 피드백 제어를 통해 설정점으로 유지되었다. 산소 농도는 21%로부터 50%로 자동적으로 변경되었다(O2 농도 제어 계획). DO를 40% 이상으로 유지하기 위해, 로킹 조건의 수동 조정과 함께 추가의 순수한 산소 가스를 헤드스페이스에 수동으로 공급하였다. 구체적으로, 온라인 DO가 대략 40%이고, POD 제어기로부터의 O2 농도가 21%로부터 30% 초과로 증가한 경우, wave 로크 속도 및 각도를 22 rpm/10°로부터 25 rpm/12°로 증가시켰다. POD O2가 다시 30%를 초과하게 된 경우, wave 로크 속도 및 각도를 25 rpm/12°로부터 30 rpm/12°로 증가시키거나 순수한 O2를 헤드스페이스에 공급하였다(후자가 바람직함). 최종적으로, 가스 내의 순수한 O2의 부피 백분율은 점차 증가하여 총 O2를 헤드스페이스로 증가시켰다. 수동 첨가 전략은, POD 산소 가스(21% 내지 50%, POD 제어기에 의해 공급됨)와 추가의 순수한 산소 가스(100%, 로타미터(rotameter)에 의해 제어됨) 사이의 부피 제어 비를 조정함으로써 하루에 대략 10%의 증가를 초래하였다. 총 가스 유량은, 가스 전달을 용이하게 하기 위해 약간 증가하였다.
배양물의 CSPR(세포 특이적 관류 속도)는, 측정된 세포 밀도를 기반으로 하여 관류 속도를 매일 증가시킴으로써 거의 일정하게 유지되었다.
실시예 2: 초고밀도 세포 뱅킹 프로토콜의 디자인 및 실행
본 초고밀도 세포 크라이오뱅킹 프로토콜을 2.0 내지 2.4 x 10^7개의 생존 세포/mL의 근사 밀도(정상적인 세포 저온보존 조건)의 세포의 2 mL 마스터 세포 뱅크 바이알(유효 부피 1.5 mL)로 시작하였다. 후속하여, 세포를 관류 배양으로 성장시켰다. 세포 배양물에 DMSO를 첨가한 후, 초고밀도 세포 뱅크(적어도 약 10 x 10^7 세포/mL)로서 저온보존하고 저장하기에 적절한 별개의 5 mL 바이알(대략 4.5 mL의 유효 부피) 또는 크라이오백(대략 100 mL의 유효 부피) 내로 이러한 초고밀도 세포 배양물을 분배하였다. 이러한 프로토콜의 개략적인 표현은 도 1에 도시되어 있다.
실시예 3: rCHO 1을 사용한 초고밀도 세포 배양 및 세포 뱅크 성능.
하기 실험에 대한 파라미터는 다음과 같았다:
1) Xv가 약 3×107개 생존 세포/mL(vc/mL) 이상인 경우, CO2를 0%로 감소(9일째에)시킨 다음, 필요한 경우 이후 염기를 첨가하였음;
2) WAVE 로크 속도 & 각도: 초기에 22 rpm/10°였고(0일째 부터 8일째까지); POD O2가 21%로부터 30% 초과로 증가하는 경우 25 rpm/12°로 증가시켰고(8일째에), 이후 30 rpm/12°로 증가시켜서(9일째에), 가스 전달(O2를 공급하고 CO2를 제거함)을 용이하게 하였음;
3) 추가의 순수한 O2(100%): POD O2가 30%를 초과하고 Xv가 약 6×107개 vc/mL 이상인 경우(11일째에), 헤드스페이스에 수동 공급됨;
4) 총 가스 유량: 0일째부터 10일째까지 0.2 lpm(분당 리터)이었고, Xv가 4×107개 vc/mL를 초과하는 경우 10일째에 0.4 lpm로 증가시켰고, 이후 11일째에 약 0.5 lpm로 증가시켰음(POD O2: 순수한 O2 = 3:1, 총 O2: 약 62%); 그리고
5) 세포 특이적 관류 속도: 초기에 약 0.2 nL/세포-일 이상을 목표로 하였고; 관류 속도를 12 RV/일(주: RV는 반응기 부피로서 규정됨)까지 단계적으로 증가시켰음. 최종일의 CSPR는 0.1 nL/세포-일 내지 0.2 nL/세포-일이었음.
6) 시드 트레인 및 생물반응기 배지: 4 mM L-글루타민을 함유한 CD CHO
7) 생물반응기: 2개의 딥 튜브를 지닌 GE custom 10 L 셀백(Cellbag) 관류 생물반응기; 유효 부피: 5L;
8) 생물반응기 접종물: 진탕 플라스크 시드 트레인; 시드 밀도: 약 5×105개 vc/mL
9) 세포 보유 방법: ATF4(0.2 μm 포어 크기)
10) 세포 배양물의 온도: 37℃
11) 동결: CryoMed™ 속도제어형 동결기
초고밀도(UHD) 세포 배양 및 세포 뱅크 성능(동결 후 및 해동 후)을 rCHO 세포주 1에 대해 시험하였다. 관류 배양물은 높은 생존률(전체 공정에 걸쳐 97% 초과)을 지니면서 12일째에 약 1.11 ×108개 vc/mL의 Xv에 도달하였다. 생존 세포 밀도(세포/mL), 반응기 부피/일로 표현되는 관류 속도, 및 초고밀도 관류 배양물의 10X CSPR(nL/세포-일로 표현되는 10X 세포 특이적 관류 속도)가 도 2에 도시되어 있다. 도 3은 배양물의 오프라인 pH 프로파일을 도시한다. 배양물을 농축없이 직접 수거하여 2가지 DMSO 보유 온도, 즉, 4℃ 재킷 스피너(jacketed spinner)를 사용한 잘 제어되는 냉온 및 빙수 배쓰에 의해 냉각되는 스피너를 사용한 비제어되는 냉온에서 5 mL 바이알에 2개의 UHD 뱅크를 생성시켰다. 도 4a 내지 도 4c는 앞서 언급된 세포 배양 조건으로부터 생성된 5 mL UHD 바이알의 동결 후 성능을 도시한다. 둘 모두의 UHD 뱅크는 신속한 동결 후 세포 성장, 매우 높은 생존률, 및 낮은 비율의 아폽토시스를 지녔다. 그러나, 재킷 스피너에서의 온도의 더욱 능동적인 제어는, 빙수 배쓰에서의 더욱 수동적인 온도 제어와 비교하여, 약간 개선된 뱅크 후 회복 및 성장을 초래하였다.
실시예 4: rCHO 2를 사용한 초고밀도 세포 배양 및 세포 뱅크 성능.
하기 실험에 대한 파라미터는 다음과 같았다:
1) Xv가 약 5×107개 vc/mL 이상인 경우, CO2를 0%로 감소(9일째에)시킨 다음, 필요한 경우 이후 염기를 첨가하였다.
2) WAVE 로크 속도 & 각도: 초기에 22 rpm/10°였고(0일째부터 7일째까지); POD O2가 21%로부터 30% 초과로 증가하는 경우 25 rpm/12°로 증가시켜서(7일째에), 가스 전달(O2를 공급하고 CO2를 제거함)을 용이하게 하였다.
3) POD O2가 30%를 초과하고 Xv가 약 3×107개 vc/mL 이상인 경우, 추가의 순수한 O2(100%)를 헤드스페이스에 수동 공급하였다(8일째에).
4) 총 가스 유량은 초기에 0.2 lpm이었고(0일째부터 8일째까지), Xv가 3×107개 vc/mL 이상인 경우 8일째에 0.4 lpm로 증가시켰고(POD O2: 순수한 O2 = 3:1, 총 O2: 약 62%), 이후 9일째에 약 0.5 lpm로 증가시켰다(POD O2: 순수한 O2 = 1:1, 총 O2: 약 75%).
5) 세포 특이적 관류 속도: 처음에는 약 0.2 nL/세포-일 이상을 목표로 하였지만, 관류 속도를 12 RV/일까지 단계적으로 증가시켰다. 최종일에, CSPR는 0.1 nL/세포-일보다 크고 0.2 nL/세포-일보다 작았다.
6) 시드 트레인 및 생물반응기 배지: 4 mM L-글루타민을 함유한 CD CHO
7) 생물반응기: 1개의 딥 튜브를 지닌 GE custom 10 L 셀백 관류 생물반응기; 유효 부피: 5 L;
8) 생물반응기 접종물: 진탕 플라스크 시드 트레인; 시드 밀도: 약 5×105개 vc/mL
9) 세포 보유 방법: ATF4(0.2 μm 포어 크기)
10) 세포 배양물의 온도: 37℃
11) 동결: CryoMed™ 속도제어형 동결기
초고밀도 세포 배양 및 세포 뱅크 성능(동결 후 및 해동 후)을 rCHO 세포주 2에 대해 시험하였다. 생존 세포 밀도(세포/mL), 반응기 부피/일로 표현되는 관류 속도, 및 초고밀도 관류 배양물에 대한 10X CSPR(nL/세포-일로 표현되는 10X 세포 특이적 관류 속도)가 도 5에 도시되어 있다. 도 6은 배양물의 오프라인 pH 프로파일을 도시한다. 배양물을 수거하여 2가지 상이한 DMSO 보유 온도, 즉, 1) 실온(RT, 대략 22 내지 25℃) 및 2) 제어되는 냉온(CT, 4℃의 재킷 스피너를 사용하여 대략 5℃)에서의 저온보존을 위한 UHD(초고밀도) 5 mL 바이알 및 100 mL UHD 크라이오백을 생성시켰다.
도 7 및 도 8은 실온에서 그리고 잘 제어되는 저온 보유 조건에서(각각 RT 및 CT) 앞서 언급된 세포 배양 조건으로부터 생성된 UHD 바이알 및 백에 대한 250 mL 및 3 L 진탕 플라스크에서의 세포 성장(Xv: 실선) 및 생존률(점선) 프로파일을 나타내는 그래프를 도시한다. 이러한 UHD 바이알 및 백은, 250 mL 및 3 L 진탕 플라스크 내에 0.5 x 10^6개 vc/mL 및 1.0 x 10^6개 vc/mL로 시딩된 경우, 신속한 동결 후 세포 성장, 높은 생존률, 낮은 아폽토시스, 및 유사한 생산성을 지니면서 잘 회복되었다. 해동 후 성장, 생존률, 아폽토시스, 및 생산성에 관하여 각각의 보유 조건에서 UHD 크라이오백과 크라이오바이알(cryovial) 사이에 차이점은 관찰되지 않았다. 그러나, 4℃ 재킷 스피너에 의해 잘 제어되는 낮은 온도에서 생성된 바이알 및 백은, 실온에서 생성된 것들과 비교하여 더 신속한 성장, 더 높은 생존률 및 더 낮은 아폽토시스를 지녔다. 도 9 및 도 10은 각각 0.5 x 10^6개 vc/mL 및 1.0 x 10^6개 vc/mL로 시딩된 경우 UHD 뱅크의 해동 후 아폽토시스의 프로파일을 도시하고, 도 11 및 도 12는 특이적 생성 속도(SPR, RT- 실온; CT- 잘 제어되는 냉온)를 도시한다.
실시예 5: rCHO 2를 사용한 20 L WAVE 생물반응기에서의 초고밀도 세포 뱅크 성능.
하기 실험에 대한 파라미터는 다음과 같았다:
1) 세포 뱅크: 실시예 2에서 생성된 100 mL UHD 크라이오백
2) 생물반응기 배지: 4 mM L-글루타민을 함유한 CD CHO.
3) 동결 후 생물반응기: GE 20 L 셀백; 유효 부피: 10 L.
4) 생물반응기 접종물: 해동된 크라이오백으로부터의 해동 후 배양물; 시드 밀도: 약 5×105개 vc/mL.
5) 생물반응기 온도: 37℃, O2: 20%, CO2: 5%, 로크 속도 & 각도: 22 rpm/8°
하나의 100 mL UHD 크라이오백을 해동시켰다. 50 mL의 해동된 배양물을 총 10 L의 유효 부피를 지닌 하나의 20 L WAVE 생물반응기(A) 내로 직접 접종하였다. 또 다른 50 mL를 먼저 차가운 배지로 서서히 희석시켜서 큰 삼투압 구배에 의해 유도되는 잠재적인 세포 손상을 감소시키고, 이후 총 10 L의 유효 부피를 지닌 제2 20 L WAVE 생물반응기(B) 내로 접종시켰다. 둘 모두의 생물반응기를 동일한 조건에서 작동시켰다. 성장 비교를 위해 둘 모두의 생물반응기로부터의 분취량을 새털라이트(satellite) 진탕 플라스크(60 mL의 유효 부피)로 옮겼다. 생물반응기 배양물을, 또 다른 해동된 100 mL 크라이오백으로부터의 접종물을 지닌 진탕 플라스크 배양물(60 mL/250 mL 진탕 플라스크 및 1.5 L/3 L 진탕 플라스크)과 또한 비교하였다.
2개 WAVE 배양물은 해동 후 세포 성장, 생존률, 및 아폽토시스에 관하여 매우 유사한 성능을 나타내었다. 그리고, 둘 모두의 생물반응기 내의 배양물은 새털라이트 진탕 플라스크 내의 배양물뿐만 아니라 진탕 플라스크 내에서 해동되고 성장된 배양물과도 매우 유사하였다. 이러한 데이터는, 하나의 UHD 크라이오백이 진탕 플라스크와 유사한 성능을 지니며 차가운 배지 느린 희석없이 2x 20 L WAVE 생물반응기 내로 직접 해동될 수 있고, 이는 시드 트레인 공정이 백 해동부터 WAVE 생물반응기 증식까지 완전히 폐쇄되어 있게 할 것임을 제시한다.
도 13은 실시예 2에 나타나 있는 실온에서 앞서 언급된 세포 배양 조건에 따라 생성된 rCHO 세포주 2의 UHD 크라이오백에 대한 20 L WAVE 백에서의 세포 성장(Xv; 실선) 및 생존률(점선) 프로파일을 나타내는 그래프를 도시한다.
실시예 6: rCHO 3을 사용한 초고밀도 세포 배양 및 세포 뱅크 성능.
하기 실험에 대한 파라미터는 다음과 같았다:
1) Xv가 약 2×107개 vc/mL 이상인 경우, CO2를 0%로 감소(8일째에)시킨 다음, 필요한 경우 이후 염기를 첨가하였다;
2) WAVE 로크 속도 & 각도: 초기에 22 rpm/10°였고(0일째 부터 7일째까지); POD O2가 21%로부터 30% 초과로 증가하는 경우 25 rpm/12°로 증가시켜서(7일째에), 가스 전달(O2를 공급하고 CO2를 제거함)을 용이하게 하였다;
3) POD O2가 30%를 초과하고 Xv가 약 3×107개 vc/mL 이상인 경우, 추가의 순수한 O2(100%)를 헤드스페이스에 수동 공급하였다(9일째에).
4) 총 가스 유량: 초기에 0.2 lpm이었고(0일째부터 9일째까지), Xv가 약 3×107개 vc/mL 이상인 경우 9일째에 0.4 lpm로 증가시켰고(POD O2: 순수한 O2 = 3:1, 총 O2: 약 62%), 이후 10일째에 약 0.5 lpm로 증가시켰고(POD O2: 순수한 O2 = 1:1, 총 O2: 약 75%), 12일째에 약 0.6 lpm로 증가시켰다(POD O2: 순수한 O2 = 1:2, 총 O2: 약 83%).
5) 세포 특이적 관류 속도: 2일째에 0.5 RV/일에서 관류를 시작하였고, 단계적으로 증가시켜서 0.05 nL/세포-일 이상의 낮은 CSPR을 유지시켰다.
6) 시드 트레인 및 생물반응기 배지: 4mM L-글루타민을 함유한 CD CHO
7) 생물반응기: 1개의 딥 튜브를 지닌 GE custom 10 L 셀백 관류 생물반응기; 유효 부피: 5L;
8) 생물반응기 접종물: 진탕 플라스크 시드 트레인; 시드 밀도: 약 5×105개 vc/mL
9) 세포 보유 방법: ATF4(0.2 μm 포어 크기)
10) 세포 배양물의 온도: 37℃
11) 동결: CryoMed™ 속도제어형 동결기
12) 뱅킹 후 평가: 진탕 플라스크(2회 계대) 및 20 L WAVE(1회 계대), Xv, 생존률, 아폽토시스, 생산성을 평가하였다.
13) 뱅킹 후 평가 배지: 4 mM L-글루타민을 함유한 CD CHO
초고밀도 세포 배양 및 세포 뱅크 성능(동결 후 및 해동 후)을 rCHO 세포주 3에 대해 시험하였다. 생존 세포 밀도(세포/mL), 반응기 부피/일로 표현되는 관류 속도, 및 초고밀도 관류 배양물에 대한 10X CSPR(nL/세포-일로 표현되는 10X 세포 특이적 관류 속도)가 도 15에 도시되어 있다. 도 16은 배양물의 오프라인 pH 프로파일을 도시한다. 2가지 상이한 DMSO 보유 온도, 즉, 1) 실온(RT, 대략 22 내지 25℃) 및 2) 제어되는 냉온(CT, 4℃의 재킷 스피너를 사용하여 대략 5℃)에서 초고밀도 관류 배양을 사용하여 UHD(초고밀도) 5 mL 바이알 및 100 mL UHD 백을 생성시켰다.
UHD 바이알 및 UHD 백으로부터의 모든 해동 후 배양물은, 신속한 성장, 낮은 아폽토시스, 및 유사한 생산성을 지니면서 잘 회복되었다. 잘 제어되는 저온 보유 조건에서 생성된 UHD 백 및 바이알은 유사하였는데, 실온에서 생성된 것들보다 제1 계대에서 약간 더 신속한 성장 및 더 높은 생존률(95% 초과)을 나타내었다. UHD 백은 진탕 플라스크 및 WAVE 생물반응기에서 유사한 해동 후 성능을 지녔다. 이것은 이후 또한 하나의 UHD 크라이오백이 2x 20 L WAVE 생물반응기 내로 직접 해동될 수 있고, 이는 시드 트레인 공정이 백 해동부터 WAVE 생물반응기 증식까지 완전히 폐쇄되어 있게 할 것임을 제시한다. 도 17a는 실온에서 그리고 잘 제어되는 저온 보유 조건(각각 RT 및 CT)에서 앞서 언급된 세포 배양 조건으로부터 생성된 UHD 바이알 및 백에 대한 250 mL 및 3 L 진탕 플라스크 및 20 L WAVE에서의 세포 성장(Xv 실선) 및 생존률(점선) 프로파일을 나타내는 그래프를 도시한다. 도 17b 및 도 17c는 해동 후 아폽토시스 및 특이적 생성 속도(SPR)의 프로파일을 도시한다.
실시예 7: rCHO 3을 사용한 초고밀도 관류 배양 공정에서의 배지 사용량의 감소.
rCHO 세포주 3를, 인-하우스 개발된 배지를 사용하여 0.025 nL/세포-일 이상의 낮은 세포 특이적 관류 속도(CSPR)에서 성장시켰다. ATF4와 커플링된 10 L custom WAVE 셀백을, 관류 배양을 위해 사용하였다. 배양물은, 일당 3 이하의 반응기 부피의 관류 속도를 사용하여 11일째에 약 1.25 ×108개 vc/mL의 생존 세포 밀도에 도달하였다. 배양물 생존률은 생물반응기 배양 공정 전체에 걸쳐 97% 초과였다. 배지 사용량은 상업용 배지를 사용하는 동일한 배양 조건과 비교하여 약 50%로 감소하였다. 그러나, 세포 성장은 상업용 CD CHO 배지를 사용하는 경우보다 약간 더 신속한 것으로 관찰되었다. 배양물을 직접(그리고 농축없이) 수거하여, 4℃ 재킷 스피너를 사용함으로써 잘 제어되는 차가운 DMSO 보유 온도에서 5 mL 바이알 및 100 mL 크라이오백 내에 UHD 뱅크를 생성시켰다. 뱅킹 후 연구는, 바이알 및 크라이오백 UHD 뱅크 둘 모두가 신속한 성장, 높은 생존률(95% 초과), 및 유사한 생산성을 지니면서 진탕 플라스크에서 해동 후 잘 회복되었음을 나타내었다. 또한, 하나의 크라이오백을 2개의 20 L WAVE 생물반응기 내로 해동시켰고, 이는 진탕 플라스크와 유사한 세포 성장 및 생존률을 나타내었다. 도 18은 예시적인 rCHO 세포주 3의 배양물에서 인-하우스 배지(검정색) 및 CD CHO 배지(회색)에 따른 생존 세포 밀도(세포/mL, 실선) 및 생존률(점선)을 비교한 그래프를 도시한다. 도 19는 예시적인 rCHO 세포주 3의 배양물에서 인-하우스 배지(검정색) 및 CD CHO 배지(회색)에 따른 관류 속도(원형, 실선) 및 세포 특이적 관류 속도(삼각형, 점선)를 비교한 그래프를 도시한다.
실시예 8: rCHO 1을 사용한 초고밀도 관류 배양 공정에서의 배지 사용량의 감소.
rCHO 세포주 1을, 이피션트 피드 B(EFB)가 보충된 상업용 CD CHO 배지를 사용하여 성장시키고, 0.04 nL/세포-일 이상의 낮은 세포 특이적 관류 속도(CSPR)에서 유지시켰다. 빌트-인 필터를 지닌 GE 10 L WAVE 관류 셀백을 관류 배양 생물반응기로서 사용하였다. 비교를 위해, 어떠한 영양 보충물도 없는 상업용 CD CHO 배지를 또한 시험하였다. EFB 첨가가 없는 배양물은, 일당 8 이하의 반응기 부피의 관류 속도를 사용하여 13일째에 약 1.0 ×108개 vc/mL의 생존 세포 밀도에 도달하였다. 5일째부터 10일째까지는 10% EFB를 그리고 10일째부터 14일째까지는 20% EFB를 CD CHO 배지 내로 첨가함으로써, 배양물은 일당 4 이하의 반응기 부피의 관류 속도를 사용하여 14일째에 약 1.03 ×108개 vc/mL의 생존 세포 밀도에 도달하였다. 따라서, EFB 첨가의 경우, 배지 사용량의 대략 50% 감소로 유사한 UHD 관류 세포 배양이 달성되었다. 도 20은 예시적인 rCHO 세포주 1의 배양물에서 이피션트 피드 B가 보충된 CD CHO 배지(검정색) 및 CD CHO 배지(회색)에 따른 생존 세포 밀도(세포/mL, 실선) 및 생존률(점선)을 비교한 그래프를 도시한다. 도 21은 예시적인 rCHO 세포주 1의 배양물에서 이피션트 피드 B가 보충된 CD CHO 배지(검정색) 및 CD CHO 배지(회색)에 따른 관류 속도(원형, 실선) 및 세포 특이적 관류 속도(삼각형, 점선)를 비교한 그래프를 도시한다.
실시예 9: rCHO 3를 사용한 초고밀도 관류 공정의 스케일 업(scaling up).
10 L UHD 관류 배양을 지탱하기 위해 ATF4와 커플링되도록 20 L WAVE 셀백을 맞춤 제작하였다. 상업용 CD CHO 배지에서의 rCHO 세포주 3 성장을 시험하였다. 배양물은, 일당 5 이하의 반응기 부피의 관류 속도를 사용하여 14일째에 약 1.1 ×108개 vc/mL의 생존 세포 밀도에 도달하였다. 세포 특이적 관류 속도(CSPR)를 0.04 nL/세포-일 이상으로 유지시켰고, 생존률은 97% 초과였다. 세포 성장은 5 L의 유효 부피를 지닌 10 L WAVE 셀백을 사용한 것과 유사하였다. 도 22는 예시적인 rCHO 세포주 3의 배양물에서 20 L WAVE 생물반응기(10 L의 유효 부피, 검정색) 및 10 L WAVE 생물반응기(5 L의 유효 부피, 회색)을 사용한 생존 세포 밀도(세포/mL, 실선) 및 생존률(점선)을 도시한다. 배양물은 약 90x 100 mL의 크라이오백을 생성시키기 위해 직접 수거될 수 있었다.
실시예 10: rCHO 2 및 rCHO 3를 사용한 증기상 액체 질소 저장 동결기에서의 1년 저장 후 초고밀도 크라이오백 뱅크의 평가.
rCHO 세포주 2 및 rCHO 세포주 3으로부터의 100 mL UHD 크라이오백(약 1.0×108개 vc/mL, 크라이오백 당 100 mL)을 해동 후 성능에 대해 시험하였고, 시점 0(뱅크가 동결되어 밤새 증기상 액체 N2 저장소로 옮겨졌을 때)과 비교하였다. 시점 0 및 1년째의 세포에 대해 유사한 해동 후 성장, 생존률, 및 생산성이 관찰되었다.

Claims (29)

  1. a) 관류 생물반응기에서 세포를 배양하여 적어도 1.0 x 108개 세포/mL의 농도를 지닌 초고밀도(ultra-high density) 세포 집단을 수득하는 단계이며, 상기 관류 생물반응기는 필터를 포함하는 교번식(alternating) 접선 유동 여과(ATF) 시스템을 포함하는 세포 보유 시스템에 커플링되어 있고, 제1 시기 동안 로크(rock) 각도 10° 및 로크 속도 22 rpm으로 설정하고 제2 시기 동안 로크 각도 12° 및 로크 속도 25 rpm으로 수동 설정함으로써 상기 관류 생물반응기 내의 용존 산소(DO)를 30% 이상으로 유지하는 것인 단계, 및
    b) 상기 초고밀도 세포 집단에 동결보호제(cryoprotectant)를 첨가하여 초고밀도의 동결된 세포 뱅크(cell bank)를 생성시키는 단계이며, 초고밀도의 동결된 세포 뱅크가 적어도 1.0 x 108개 세포/mL의 농도 및 적어도 95%의 해동 후 생존률을 지니는 것인 단계
    를 포함하는, 배양된 세포의 집단으로부터 직접 초고밀도의 동결된 세포 뱅크를 생성시키는 방법이며,
    세포를 배양하는 단계와 초고밀도 세포 집단에 동결보호제를 첨가하는 단계 사이에 추가의 농축 단계가 수행되지 않는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 필터가 적어도 0.08 m2의 표면적을 지니는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 필터가 0.3 m2 내지 0.5 m2, 0.5 m2 내지 1.0 m2, 0.7 m2 내지 0.8 m2, 1.0 m2 내지 2.0 m2, 2.0 m2 내지 3.0 m2, 3.0 m2 내지 4.0 m2, 또는 4.0 m2 내지 5.5 m2의 표면적을 지니는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 필터가 0.7 μm, 1.2 μm, 및 7 μm로 구성된 군으로부터 선택된 포어 크기를 지니는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 초고밀도 세포 집단이, 1.1 x 108개 세포/mL, 1.2 x 108개 세포/mL, 1.3 x 108개 세포/mL, 1.4 x 108개 세포/mL, 1.5 x 108개 세포/mL, 1.6 x 108개 세포/mL, 1.7 x 108개 세포/mL, 1.8 x 108개 세포/mL, 1.9 x 108개 세포/mL, 및 2.0 x 108개 세포/mL으로 구성된 군으로부터 선택된 세포 밀도를 지니는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동결보호제의 첨가가, 초고밀도 세포 집단에 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 5% 내지 10%(부피/부피)의 최종 농도로 첨가하는 것을 포함하는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 초고밀도의 동결된 세포 뱅크의 생성이, 저온보존 조건하에서 저장하기에 적절한 용기 내에서 초고밀도 세포 집단의 적어도 일부를 동결시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  8. 제7에 있어서, 용기가 바이알(vial)인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 초고밀도의 동결된 세포 뱅크가 4.5 x 108개 세포/바이알을 포함하는 것인 방법.
  10. 제7항에 있어서, 용기가 크라이오백(cryobag)인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 초고밀도의 동결된 세포 뱅크가 100 x 108개 세포/크라이오백을 포함하는 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 초고밀도의 동결된 세포 뱅크가 적어도 1.1 x 108개 세포/mL의 세포 밀도를 지니는 것인 방법.
  13. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 관류 생물반응기 내의 관류 속도가 0.02 nL/세포/일(day) 내지 0.5 nL/세포/일인 방법.
  14. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 관류 생물반응기 내의 관류 속도가 일(day)당 0 내지 15 반응기 부피인 방법.
  15. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 관류 생물반응기 세포 배양물이 6.8 내지 7.2의 pH를 지니는 것인 방법.
  16. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 생물반응기가 가요성 백(flexible bag) 생물반응기인 방법.
  17. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 포유류 세포인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 포유류 세포가, CHO, CHO-DBX11, CHO-DG44, CHO-S, CHO-K1, Vero, BHK, HeLa, COS, MDCK, HEK-293, NIH-3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20, T47D, NS0, CRL7030, HsS78Bst 세포, PER.C6, SP2/0-Agl4, 및 하이브리도마 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  19. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 트랜스펙션(transfection)된 세포인 방법.
  20. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 치료용 단백질을 발현하는 것인 방법.
  21. 제1항에 있어서,
    a) 관류 생물반응기는 가요성 백 생물반응기를 포함하고,
    b) 필터는, 적어도 0.08 m2의 필터 표면적 및 적어도 50 kDa의 분자량 컷오프(MWCO) 크기를 지니고,
    c) 초고밀도 세포 집단에 첨가되는 동결보호제는 DMSO이고,
    d) 초고밀도의 동결된 세포 뱅크는 5% 내지 10%(부피/부피)의 DMSO를 포함하는 것인
    방법.
  22. 제1항 내지 제3항 및 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 배양물의 pH 및 DO가 자동화 방법에 의해 제어되는 것인 방법.
  23. 제1항 내지 제3항 및 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 배양물의 pH 및 DO가 비자동화(non-automated) 방법에 의해 제어되는 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, pH 및 DO가, 배양물에 도입되는 가스 혼합물의 조정, 생물반응기의 로크(rock) 속도의 조정, 또는 생물반응기의 로크 각도의 조정 중 어느 하나 이상을 통해 제어되는 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 생물반응기가, 12°의 로크 각도로 로크 속도 25 rpm 이후에 로크 속도 30 rpm 및 로크 각도 12°로 추가로 로킹(rocking)되는 것인 방법.
  26. 제1항 내지 제3항 및 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 동결보호제의 첨가 전과 그 동안, 초고밀도 세포 집단이 4℃의 온도까지 냉각되고 그 온도에서 유지되는 것인 방법.
  27. 제1항 내지 제3항 및 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 동결보호제의 첨가 전과 그 동안, 초고밀도 세포 집단이 20℃ 내지 26℃의 온도에서 유지되는 것인 방법.
  28. 제1항 내지 제3항 및 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 동결보호제의 첨가 전과 그 동안, 초고밀도 세포 집단이, 빙수 배쓰(ice-water bath)를 사용함으로써 비제어되는(uncontrolled) 냉온에서 유지되는 것인 방법.
  29. 제1항 내지 제3항 및 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 생물반응기가 빌트-인(built-in) 필터를 포함하는 것인 방법.
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