TWI633185B

TWI633185B - 比利比洛邊（ｐｙｒｉｐｙｒｏｐｅｎｅ）生物合成基因群及含有標識基因的核酸構築物

Info

Publication number: TWI633185B
Application number: TW100102059A
Authority: TW
Inventors: 相原智; 隅田奈緒美; 村島弘一郎; 矢內耕二; 安西弘行; 山本憲太朗
Original assignee: 明治製果藥業股份有限公司
Priority date: 2010-01-26
Filing date: 2011-01-19
Publication date: 2018-08-21
Also published as: BR112012019458A2; BR112012019458B1; TW201139669A; CN102884187B; CA2788080A1; CN102884187A; AU2011210968B2; EP2530149B1; EP2530149A1; JPWO2011093186A1; ES2655615T3; US9090924B2; IL221129B; KR20170125947A; PL2530149T3; KR20120107519A; US20130017581A1; RU2576001C2; KR101831121B1; MX2012008687A

Abstract

本發明提供比利比洛邊生物合成基因群與含有標識基因之核酸構築物。本發明的核酸構築物為提供一種便宜且生產性高之比利比洛邊的製造法。

Description

比利比洛邊(pyripyropene)生物合成基因群及含有標識基因的核酸構築物

本發明係關於比利比洛邊生物合成基因群與含有標識基因之核酸構築物。

已知比利比洛邊為至今因側鏈結構之相異，存在著18種類似體的比利比洛邊A～R(非專利文獻1)。

已知比利比洛邊具有ACAT阻礙活性(專利文獻1)，期待應用於對於膽固醇蓄積所引起的疾病治療等。又，比利比洛邊對於玉米穗夜蛾幼蟲(非專利文獻2)、小菜蛾幼蟲(專利文獻2)、黃粉蟲幼蟲(專利文獻2)、蚜蟲(專利文獻3)具有殺蟲活性，期待應用於殺蟲劑上。

已知比利比洛邊可藉由絲狀菌作為二次代謝物生產，例如已揭示Penicillium可比洛比PF1169株(專利文獻4)、Aspergillus fumigatusIFO-1289株(專利文獻5)、Eupenicillium reticulisporumNRRL-3446株(非專利文獻2)、Penicillium griseofulvum F1959株(專利文獻2)各可生產比利比洛邊。

比利比洛邊的工業生產為藉由培養前述生產菌後採取比利比洛邊而實施。一般由天然所分離之微生物所生產之二次代謝產物量為微量，欲將此利用於產業上時，必須提高這些目的物之生產性。

欲提高目的物之生產性，進行目的物生產微生物之培養方法的檢討、培養基成分之檢討、及前驅物之添加等發酵條件的改良、以及利用紫外線照射或突然變異誘發劑所引起的突然變異之菌株改良。且近年來，除這些方法以外，利用基因重組之生產性的提高亦正發展著。

藉由基因重組提高生產性之一般手法，係為生物合成基因之表現增強，例如已揭示藉由本手法提高生產無孢子菌目(Agonomycetales)之PF1022物質的生產性之方法(專利文獻6)。欲適應該手法，必須分離目的物之生物合成基因，且該生產微生物中之轉形法必須被確立。

對於比利比洛邊，至今未有分離生物合成基因群之報告，又將比利比洛邊生產菌作為宿主之轉形法亦未被確立。因此，至今將比利比洛邊的生物合成基因群導入該生產微生物係為困難，且藉由基因重組之生產性提高尚未被實現為現狀。

[先行技術文獻]

[專利文獻]

[專利文獻1]　特開平6-184158號公報

[專利文獻2] W02004/060065號公報

[專利文獻3] W02006/129714號公報

[專利文獻4]　公開技報2008-500997號

[專利文獻5]　特開平4-360895號公報

[專利文獻6]　專利3961289號

[非專利文獻]

[非專利文獻1] Journal of Antibiotics(1996)、49(3)、292-298

[非專利文獻2] Applied and Environmental Microbiology(1995)、61(12)、4429-4435

本發明者們發現將比利比洛邊生物合成基因群與含有標識基因之核酸構築物在宿主使其表現時，可顯著提高比利比洛邊之生產性。本發明係基於此所成者。

因此，本發明的目的為提供一種含有比利比洛邊生物合成基因群與標識基因之核酸構築物。

而本發明的其中一型態為提供一種含有比利比洛邊生物合成基因群與標識基因之核酸構築物。

又，本發明的另一型態為提供一種將前述核酸構築物導入於宿主後所得之轉形體。

且本發明的另一型態為提供一種將含有前述比利比洛邊生物合成基因群之核酸構築物與前述標識基因的核酸構築物，藉由同時或各別導入於宿主後所得之轉形體。

又，本發明的另一型態為提供一種含有培養前述轉形體，由培養物採取比利比洛邊所成的比利比洛邊的製造法。

發明之具體說明

微生物的寄存

以質體pCC1-PP1進行轉形之大腸菌(Escherichia coli EPI300^TM-T1^R)於2008年10月9日(原寄存日)在獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物寄存　中心(305-8566日本國茨城縣筑波市東1丁目1號地1中央第6)以寄存號碼為FERM BP-11133(由國內寄存FERM P-21704移管)(寄存者所給予的識別表示：Escherichia coli EPI300^TM-T1^R/pCC1-PP1)進行寄存。

以質體pPYRI02進行轉形之大腸菌於平成21(2009)年12月14日在獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物寄存中心(305-8566日本國茨城縣筑波市東1丁目1號地1中央第6)以寄存號碼為FERM BP-11203(寄存者所給予的識別表示：XL1-Blue MRA/pPYRI02)進行寄存。

以黏接質體(cosmid)pPYRI07進行轉形之大腸菌於平成22(2010)年12月1日在獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物寄存中心(305-8566日本國茨城縣筑波市東1丁目1號地1中央第6)以寄存號碼為FERM BP-11316(寄存者所給予的識別表示：XL1-Blue MRA/pPYRI07)進行寄存。

比利比洛邊生物合成基因群

所謂本發明中之比利比洛邊生物合成基因群為如後述標識基因與宿主中可表現的狀態下被配置於核酸構築物中者，與比利比洛邊的生物合成相關的基因群即可，並無特別限定，較佳為提供一種含有選自下述(I)~(IV)所記載之核苷酸序列的至少1個核苷酸序列的全長或其一部份所成之構築物：(I)序列號碼266中之2911號至27797號為止的核苷酸序列、(II)與序列號碼266中之2911號至27797號為止的核苷酸序列之互補序列在嚴謹條件下可雜交之核苷酸序列，且編碼與序列號碼266中之2911號至27797號為止的核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質的核苷酸序列、(III)對於由序列號碼266中之2911號至27797號為止的核苷酸序列所成之多核苷酸，1或複數個核苷酸經缺失、取代、插入或加成的核苷酸序列，且編碼與序列號碼266中之2911號至27797號為止的核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質的核苷酸序列、及(IV)具有與由序列號碼266中之2911號至27797號為止的核苷酸序列所成的多核苷酸為至少90%以上的相同性之核苷酸序列，且編碼與序列號碼266中之2911號至27797號為止的核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質的核苷酸序列。

所為本發明中之比利比洛邊生物合成基因群的更佳型態為，含有目的基因與表現調節區域而成的基因群。其中，所謂目的基因為，具有1個或1個以上編碼與比利比洛邊之生物合成相關的蛋白質之基因者。又，所謂表現調節區域為，具有調節在宿主之前述目的基因的表現時為必要的核苷酸序列者即可，並無特別限定，例如含有調節在目的基因之宿主內的轉印量之核苷酸序列的啟動子或終止子等。又，所謂與比利比洛邊之生物合成相關的蛋白質，例如下述流程1所示生物合成經路中任一相關蛋白質。

所謂本發明的目的基因之較佳型態，提供一種含有編碼選自序列號碼267～275的至少1個胺基酸序列或與此為實質上之同等胺基酸序列的核苷酸序列之核酸構築物。

所謂本發明之目的基因的更佳型態，提供一種含有選自下述(1)～(4)所記載之核苷酸序列的至少1個核苷酸序列之核酸構築物：

(1)下述(a)-(i)所記載之核苷酸序列：(a)序列號碼266所示核苷酸序列的3342號至5158號為止的核苷酸序列、(b)序列號碼266所示核苷酸序列的5382號至12777號為止的核苷酸序列、(c)序列號碼266所示核苷酸序列的13266號至15144號為止的核苷酸序列、(d)序列號碼266所示核苷酸序列的16220號至18018號為止的核苷酸序列、(e)序列號碼266所示核苷酸序列的18506號至19296號為止的核苷酸序列、(f)序列號碼266所示核苷酸序列的19779號至21389號為止的核苷酸序列、(g)序列號碼266所示核苷酸序列的21793號至22877號為止的核苷酸序列、(h)序列號碼266所示核苷酸序列的23205號至24773號為止的核苷酸序列、及(i)序列號碼266所示核苷酸序列的25824號至27178號為止的核苷酸序列、(2)與(1)中所記載的核苷酸序列之互補序列在嚴謹條件下可雜交之核苷酸序列，且編碼與各核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質的核苷酸序列、(3)對於(1)中所記載的核苷酸序列所成多核苷酸，1或複數個核苷酸經缺失、取代、插入或加成的核苷酸序列，且編碼與各核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質的核苷酸序列、(4)具有與(1)中所記載的核苷酸序列所成多核苷酸為至少90%以上相同性之核苷酸序列，且編碼與各核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質的核苷酸序列。

本發明的目的基因之更一層較佳型態為，提供一種含有選自下述(1)~(4)所記載之核苷酸序列的至少1個核苷酸序列之核酸構築物：(1)含有上述(a)-(i)或(a)-(h)所記載之核苷酸序列的全長全部之核苷酸序列、(2)與(1)中所記載的核苷酸序列之互補序列在嚴謹條件下可雜交之核苷酸序列，且編碼與該核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質的核苷酸序列、(3)對於(1)中所記載的核苷酸序列所成多核苷酸，1或複數個核苷酸經缺失、取代、插入或加成的核苷酸序列，且編碼與該核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質的核苷酸序列、 (4)具有與(1)中所記載的核苷酸序列所成多核苷酸為至少90%以上相同性之核苷酸序列，且編碼與該核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質的核苷酸序列。

所謂本發明的表現調節區域之較佳型態為，提供含有選自下述(1)~(4)所記載之核苷酸序列的至少1個核苷酸序列之核酸構築物：

(1)下述(j)-(s)所記載之核苷酸序列的全長或一部：

(j)序列號碼266所示核苷酸序列的2911號至3341號為止的核苷酸序列

(k)序列號碼266所示核苷酸序列的5159號至5381號為止的核苷酸序列

(l)序列號碼266所示核苷酸序列的12778號至13265號為止的核苷酸序列

(m)序列號碼266所示核苷酸序列的15145號至16219號為止的核苷酸序列

(n)序列號碼266所示核苷酸序列的18019號至18505號為止的核苷酸序列

(o)序列號碼266所示核苷酸序列的19297號至19778號為止的核苷酸序列

(p)序列號碼266所示核苷酸序列的21390號至21792號為止的核苷酸序列

(q)序列號碼266所示核苷酸序列的22878號至23204號為止的核苷酸序列

(r)序列號碼266所示核苷酸序列的24774號至25823號為止的核苷酸序列

(s)序列號碼266所示核苷酸序列的27179號至27797號為止的核苷酸序列

(2)與(1)中所記載的核苷酸序列在嚴謹條件下可雜交之核苷酸序列，且具有與各核苷酸序列為實質上同等之功能的核苷酸序列、

(3)對於(1)中所記載的核苷酸序列所成多核苷酸，1或複數個核苷酸經缺失、取代、插入或加成的核苷酸序列，且具有與各核苷酸序列為實質上同等之功能的核苷酸序列、

(4)具有與(1)中所記載的核苷酸序列所成多核苷酸為至少90%以上相同性之核苷酸序列，且具有與各核苷酸序列為實質上同等之功能的核苷酸序列。

所謂藉由本發明之表現調節區域的較佳型態為，提供一種含有選自下述(1)～(4)所記載之核苷酸序列的至少1個核苷酸序列之核酸構築物：

(1)含有前述(j)-(s)或(j)-(r)所記載之核苷酸序列的全長全部之核苷酸序列、

作為本發明中之比利比洛邊生物合成基因群，可分離來自比利比洛邊生產菌的生物合成基因集群之全長或一部後使用，較佳為可使用來自序列號碼266所示青黴可比洛比PF1169株的比利比洛邊生物合成基因集群之全長或一部份，更佳為可使用來自序列號碼266所示青黴可比洛比PF1169株的比利比洛邊生物合成基因集群之全長。

本發明中所謂「實質上同等之胺基酸序列」表示具有一個或複數個胺基酸藉由取代、缺失、加成、或插入的改變，不會影響到聚肽活性之胺基酸序列。藉由胺基酸之取代、缺失、加成、或插入而改變之胺基酸序列，對於經改變等前的胺基酸序列，具有70%以上，80%以上為佳，較佳為90%以上，更佳為95%以上，進一步更佳為98%以上的序列相同性者為佳。又，經改變之胺基酸殘基的數目以1～40個為佳，較佳為1～20個，更佳為1～10個，進一步更佳為1～8個，最佳為1～4個。

而作為不影響活性之改變例子，可舉出保存性取代。所謂「保存性取代」為，實質上不變化聚肽之活性下，將1～40個為佳，較佳為1～20個，更佳為1～10個，進一步更佳為1～8個，最佳為1～4個的胺基酸殘基，藉由其他化學性類似的胺基酸殘基進行取代的意思。例如可舉出將某疏水性胺基酸殘基藉由其他疏水性胺基酸殘基進行取代時，將某極性胺基酸殘基藉由具有相同電荷之其他極性胺基酸殘基進行取代的情況等。可進行如此取代之功能性類似的胺基酸在胺基酸之該技術領域中為公知。若要舉出具體例，作為非極性(疏水性)胺基酸可舉出丙胺酸、纈胺酸、異亮胺酸、亮胺酸、脯胺酸、色胺酸、苯基丙胺酸、甲硫胺酸等。作為極性(中性)胺基酸，可舉出甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、麩胺酸、天冬醯胺、半胱胺酸等。作為具有陽電荷之(鹼性)胺基酸，可舉出精胺酸、組胺酸、賴胺酸等。又，作為持有負電荷之(酸性)胺基酸，可舉出天冬醯胺酸、麩胺酸等。

本發明中所謂「嚴謹條件」表示將雜交後之膜的洗淨操作在高溫度低鹽濃度溶液中進行的意思，若為斯業者該條件可適宜地決定，例如表示在2×SSC濃度(1×SSC：15mM檸檬酸3鈉，150mM氯化鈉)、0.5% SDS溶液中，以60℃且20分鐘之洗淨條件，或在0.2×SSC濃度(1×SSC：15mM檸檬酸3鈉、150mM氯化鈉)、0.1% SDS溶液中，以60℃且15分鐘之洗淨條件的意思。

雜交可依據公知方法進行。又，使用購買的基因庫時，可依據所添付的使用說明書所記載的方法進行。

本案說明書中，所謂對於核苷酸序列之「相同性」表示對於經比較的序列間，構成各序列之鹼基的一致程度的意思。此時，考慮到差異性存在及胺基酸的性質。本說明書中所示「相同性」之數值皆由、斯業者使用公知相同性檢索程式所算出的數值即可，例如於FASTA、BLAST等藉著使用預設(初期設定)之參數可容易地算出。

本案說明書中，對於核苷酸序列之「相同性」以90%以上為佳，較佳為95%以上，更佳為98%以上，進一步更佳為99%以上。

本案說明書中，所謂「對於多核苷酸，1或複數個的核苷酸經缺失、取代、插入或加成」表示藉由部位專一性突然變異誘發法等周知方法，或天然所產生程度之複數個核苷酸的取代等而改變所成的意思。核苷酸之改變個數為1個或複數個(例如1個至數個或1、2、3、或4個)。

所謂「編碼與各核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質的核苷酸序列」表示編碼具有與「與各核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質」為同等活性的蛋白質之核苷酸序列的意思。

與序列號碼266所示核苷酸序列的3342號至5158號為止的核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質具有CoA ligase(CoA連接酶)活性者為佳。

與序列號碼266所示核苷酸序列的5382號至12777號為止的核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質具有擬LovB聚酮合酶(擬LovB聚酮合酶)(PKS)活性者為佳。

與序列號碼266所示核苷酸序列的13266號至15144號為止的核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質具有細胞色素(cytochrome)P450 monooxygenase(細胞色素P450單加氧酶)(1)(P450-1)活性者為佳。

與序列號碼266所示核苷酸序列的16220號至18018號為止的核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質具有細胞色素P450單加氧酶(2)(P450-2)活性者為佳。

與序列號碼266所示核苷酸序列的18506號至19296號為止的核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質具有Cyclase(環化酶)(IMP：膜主體蛋白(Integral membrane protein))活性者為佳。

與序列號碼266所示核苷酸序列的19779號至21389號為止的核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質具有FAD依賴型單加氧酶(FAD-依賴型單加氧酶)(FMO)活性者為佳。

與序列號碼266所示核苷酸序列的21793號至22877號為止的核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質具有UbiA-擬異戊二烯轉移酶(UbiA樣異戊二烯基轉移酶)(UbiAPT)活性者為佳。

與序列號碼266所示核苷酸序列的23205號至24773號為止的核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質具有Acetyltransferase(乙醯基轉移酶)(AT)活性者為佳。

與序列號碼266所示核苷酸序列的25824號至27178號為止的核苷酸序列所編碼之蛋白質為實質上同等之蛋白質具有乙醯基轉移酶-2(AT-2)活性者為佳。

所謂「具有與各核苷酸序列為實質上同等之功能的核苷酸序列」為具有與「各核苷酸序列」之同等功能者即可，並無特別限定，例如表示調節目的基因之表現的功能為同等者，詳細表示例如啟動子活性或終止子活性等功能為同等者。

前述目的基因、表現調節區域係以前述的核苷酸序列為準，合成適當引子，使用此將來自比利比洛邊生產菌等的基因組DNA作為鑄型並藉由PCR法以DNA增幅或化學性進行全合成而取得。

比利比洛邊

本發明中，所謂比利比洛邊表示使用含有自比利比洛邊A至R的意思，較佳為比利比洛邊A、E、及O，更佳為比利比洛邊A。

比利比洛邊生物合成基因群的分離方法

比利比洛邊生物合成基因群，例如可藉由以下方法分離。例如萃取比利比洛邊生產菌的基因組DNA，藉由適當限制酶切斷後，使用黏接質體(cosmid)載體，製作自基因組DNA所成的基因庫。繼續依據實施例12的記載，以含於細胞色素(cytochrome)P450等比利比洛邊生物合成基因群的核苷酸序列為準，合成適當引子，使用此將來自比利比洛邊生產菌的基因組DNA作為鑄型，實施PCR法，增幅由生物合成基因群的一部份所成的DNA片段。將該DNA片段作為探測物使用，進行基因組基因庫之篩選，可分離比利比洛邊生物合成基因群的全長或一部份。

本發明中在宿主表現之比利比洛邊生物合成基因群，除前述方法以外，可藉由於目的基因連結在宿主具有功能之表現調節區域而得到。目的基因與表現調節區域之連結樣式，若目的基因在宿主可表現即可，可為任意方法，例如目的基因之上游上將啟動子，又於下游將終止子以可作用下連結的方。本發明的目的基因與表現調節區域之連結可依據公知方法進行。

標識基因

本發明之標識基因，係為上述比利比洛邊生物合成基因群與宿主中可表現之狀態下配置於核酸構築物中者，可對應轉形體之選擇手法而做適宜選擇，例如可使用編碼藥劑耐性之基因或互補營養要求性之基因。作為藥劑耐性基因，例如可舉出對於得黴素、濕黴素、免賴得(Benomyl)、寡霉素(oligomycin)、G418、bleomycin、雙丙胺磷、保米黴素(Blasticidin-S)、腐草黴素、抗草丁膦(phosphinothricin)、安比西林、卡納黴素等藥劑之基因，較佳可舉出得黴素耐性基因或濕黴素耐性基因。作為互補營養要求性之基因，例如可舉出amdS、pyrG、argB、trpC、niaD、TRP1、LEU2、URA3等基因。

這些標識基因，例如可使用於藉由與比利比洛邊生物合成基因群之同樣方法進行分離、增幅、或合成後。

核酸構築物

本發明中之核酸構築物可導入於宿主之基因即可，可為任意形態，較佳為對於宿主進行導入時，可在組入於載體中之形態下使用。因此，所謂本發明之較佳型態為提供一種含有本發明之核酸構築物而成之重組載體。

本發明的重組載體係由於適當載體導入在宿主可表現之比利比洛邊生物合成基因群及標識基因而調製。

重組載體的構築之順序及方法，可使用基因工學領域中常用的方法。

作為本發明中可使用之載體，若可導入於宿主者即可使用，例如可舉出黏接質體(cosmid)、噬菌體載體、pUC系質體、pBluescript系質體、及pBR322質體等。

宿主

作為本發明中可使用的宿主，若為導入本發明的核酸構築物，可生產比利比洛邊的宿主即可，並無特別限定，即使不導入本發明的核酸構築物之狀態下亦可生產比利比洛邊的微生物為佳，較佳可舉出絲狀菌，更佳可舉出青黴屬、Eupenicillium屬、或麴菌屬之微生物，進一步更佳可舉出青黴可比洛比、Penicillium griseofulvum、Eupenicillium reticulisporum、或Aspergillus fumigatus，其中亦以青黴可比洛比為佳，最佳為青黴可比洛比PF1169株。

轉形體之製造

所謂本發明為提供一種將前述宿主使用前述核酸構築物藉由進行轉形，導入比利比洛邊生物合成基因群之轉形體。對核酸構築物之宿主的導入方法，可導入於宿主即可，並無特別限定，例如可藉由使用重組載體的以下方法，將核酸構築物導入於宿主。

使用對宿主的重組載體之核酸構築物的導入，可依據常法進行。作為導入法，例如可舉出電穿孔法、聚乙二醇法、土壤肝菌法、鋰法或氯化鈣法等，選擇對於宿主細胞為效率良好之方法。將青黴可比洛比作為宿主使用時，較佳為聚乙二醇法。

所謂本發明的較佳型態提供一種將質體pPYRI02(以質體pPYRI02進行轉形之大腸菌的寄存號碼：FERM BP-11203)或黏接質體(cosmid)pPYRI07(以黏接質體(cosmid)pPYRI07進行轉形之大腸菌的寄存號碼：FERM BP-11316)導入於宿主後所得之轉形體。

轉形體之培養與比利比洛邊的製造

所謂本發明提供一種含有培養在前述所製造的轉形體，由該培養物採出比利比洛邊所成之比利比洛邊的製造法，較佳為提供比利比洛邊之大量製造法。

轉形體的培養為依據常法，可藉由適宜地選擇培養基、培養條件等而進行。作為培養基，可用慣用成分，例如作為碳源，可使用葡萄糖、蔗糖、纖維素、水飴、糊精、澱粉、甘油、糖蜜、動‧植物油等。又，作為氮源，可使用大豆粉、小麥胚芽、Pharmamedia、玉米浸漬液(Corn steep liquor)、綿實粕、肉類萃取物(Bouillon)、蛋白腖、多價蛋白腖、麥芽萃取物、酵母萃取物、硫酸銨、硝酸鈉、尿素等。其他視必要可添加可生成鈉、鉀、鈣、鎂、鈷、氯、磷酸、硫酸及其他離子之無機鹽類，例如可添加氯化鉀、碳酸鈣、磷酸氫2鉀、硫酸鎂、磷酸1鉀、硫酸亜鉛、硫酸錳、硫酸銅亦為有效。又，視必要可添加硫胺(硫胺鹽酸鹽等)等各種維他命、麩胺酸(麩胺酸鈉等)、天冬醯胺(DL-天冬醯胺等)等胺基酸、核苷酸等微量營養素、抗生物質等選擇性藥劑。且欲幫助菌之發育，可適當地添加如可促進比利比洛邊之生產的有機物及無機物。

作為培養法，可藉由在好氣性條件之振動培養法、通氣攪拌培養法或深部好氣培養法進行，特別以通氣攪拌培養法為最適合。培養基的pH，例如為pH6～pH8之程度。對於培養之適當溫度為15℃～40℃，大多在26℃～37℃附近下生長。比利比洛邊之生產依培養基及培養條件、或使用之宿主而相異，對於所有培養法一般皆為2天～25天可達到最高蓄積量。

培養中之比利比洛邊的量達到最高量時停止培養，由培養物中採出比利比洛邊，視必要進行分離、純化。製造複數種類之比利比洛邊時，同時採取複數種比利比洛邊，視必要可進行分離、純化，或個別採取複數種比利比洛邊，視必要可進行分離、純化。

[實施例]

以下藉由實施例詳述本發明，但本發明並未限定於此等。

實施例1：青黴可比洛比PF1169株的基因組DNA之調製

於三角燒杯(1L)放入經滅菌的NB培養基500ml，對於1/2CMMY寒天培養基，將在28℃進行4天前培養的青黴可比洛比PF1169株(公開技報2008-500997號(專利文獻4))加入於上述培養基，進行在28℃之4天液體培養。藉由以Miracross進行過濾，得到菌體5g。藉由該菌體將基因組DNA純化套組Genomic-tip 100/G(QIAGEN股份有限公司製)依據添付手冊，取得30μg之基因組DNA。

實施例2：聚酮合酶(PKS)增幅用縮聚引子與其增幅片段

作為藉由保存於種種絲狀菌聚酮合酶之胺基酸序列的增幅用縮聚引子，設計下述引子並合成：

LC1：GAYCCIMGITTYTTYAAYATG(序列號碼1)

LC2c：GTICCIGTICCRTGCATYTC(序列號碼2)

(但，R=A/G、Y=C/T、M=A/C、I=肌苷)。

使用該縮聚引子，將實施例1中所調製之基因組DNA與ExTaq聚合酶(Takarabio股份有限公司製)，依據添付手冊進行反應，檢測約700bp之增幅片段(圖1)。然後解析前述增幅片段，特定該內部500bp之序列(序列號碼3)。

實施例3：基因組DNA之大量排序與胺基酸序列相同性檢索

大量排序實施例1中所得之青黴可比洛比PF1169株的基因組DNA、與提供於胺基酸序列的相同性檢索。具體將基因組DNA 50μg之一部份進行前處理後，提供於Roche公司454FLX DNA排序機，取得約250bp、10.3萬條之片段序列(總計49Mb之序列)。

對於此序列，作為以聚酮合酶及異戊二烯基轉移酶為既知之序列，選定下述五種序列(聚酮合酶：來自Aspergillus(A.) fumigatus PKS 2146a.a.及Penicillium(P.)griseofluvum 6-methylsalycilic acid synthase 1744a.a.、異戊二烯基轉移酶：Aspergillus(A.) fumigatus Prenyltransferase、Aspergillus(A.) fumigatus Prenyltransferase(4-hydroxybezoate octaprenyltransferase)、及Penicillium(P.) marneffei Prenyltransferase之序列)，實施藉由相同序列檢索軟體blastx之檢索。各取得89條、86條、2條、1條、及3條之相同序列(參照表2)。進一步由A. fumigatus PKS 2146a.a.及P. griseofluvum 6-methylsalycilic acid synthase 1744a.a.之相同序列，各取得19條、23條之contig序列(A. fumigatus PKS 2146a.a.之contig序列：序列號碼179～197、P. griseofluvum 6-methylsalycilic acid synthase 1744a.a.之contig序列：序列號碼198～220)(參照表2)。

實施例4：由基因組DNA之PCR增幅

藉由實施例3所取得之blastx的檢索結果，對於聚酮合酶合成序列號碼227～252所示13種引子對。同樣地對於異戊二烯基轉移酶，合成序列號碼253～262所示5種引子對。使用這些引子，進行對於基因組DNA之PCR後，確認對於全引子對為期待尺寸的增幅片段(參照圖1及圖2)。

實施例5：噬菌體基因組基因庫的製作

將青黴可比洛比PF1169株之λ噬菌體基因組基因庫使用λBlueSTAR Xho I Half-site Arms Kit(Takarabio股份有限公司製Cat. No. 69242-3)，依據添付手冊進行構築。即，將基因組DNA使用限制酶Sau3A1進行部分分解，將約20kb之DNA片段0.5μg連結於套組中所添付之λBlueSTAR DNA0.5μg。將該接合溶液使用Lambda INN Packaging kit(NIPPON GENE股份有限公司製)，依據套組所添付之手冊，進行活體外封包(packaging)，取得1ml之溶液。將該經封包(packaging)之噬菌體溶液10μl感染於大腸菌ER1647株100μl，對於溶菌斑形成培養基，在37℃進行一晚培養後，得到約500克隆之溶菌斑。藉由如此感染，製造出導入10～20kb之青黴可比洛比PF1169株的基因組DNA之噬菌體約50000克隆所成的基因組基因庫。

實施例6：由噬菌體基因庫之篩選

對於實施例5所調製之噬菌體基因庫10000克隆，將藉由上述所調製之LC1-LC2c引子對進行增幅的PCR產物作為探測物，藉由溶菌斑雜交進行1次篩選。於探測物之標識與檢測使用AlkPhos Direct Labelling and Detection System with CDP-Star(GEHealth caTe股份有限公司製Cat. No. RPN3690)。前述雜交依據添付手冊實施。

藉由1次篩選，6克隆作為候補而殘留。且藉由溶菌斑雜交之2次篩選結果取得4克隆。這些陽性克隆感染於大腸菌BM25.8株，依據添付手冊，將噬菌體轉換於質體，取得含有目的區域之4種質體。

實施例7：F黏粒(fosmid)基因組基因庫的製作

青黴可比洛比PF1169株之基因組基因庫為將CopyControl Fosmid Library Production Kit(EPICENTRE公司製、Cat. No.CCFOS110)依據添付手冊進行構築。即，將約40 kb之基因組DNA0.25μg的DNA片段進行末端平滑化後，組入於F黏粒(fosmid)載體pCCFOS(Epicentre公司製)。將該接合溶液使用同套組添付之MaxPlaxLambda Packaging Extract，依據套組所添付之手冊，進行活體外封包(packaging)。將該經封包(packaging)之病毒溶液10μl感染於大腸菌EPI300^TM-T1^R株100μl，對於含有氯霉素(Chloramphenicol)之培養基，在37℃進行一晚培養並篩選後，得到300克隆之菌落。藉由如此感染，取得導入40kb之青黴可比洛比PF1169株的基因組DNA之F黏粒(fosmid)約30000克隆。分注成每1well為約50克隆之96well培養盤，換言之製作出96槽的約4800克隆所成之基因組基因庫。

實施例8：F黏粒(fosmid)基因庫篩選

依據F黏粒(fosmid)添付之手冊，藉由實施例7所作成之基因庫的96槽調製出各質體DNA。使用在實施例2所合成之聚酮合酶增幅用縮聚引子，對於該96槽之質體DNA樣品，進行PCR。其結果約700bp之DNA片段藉由9槽增幅。且由該正型槽，製造出含有約300克隆以上之菌落的培養皿，藉由菌落雜交進行再篩選。其結果使用LC1-LC2c引子對，藉由約4800克隆取得9種F黏粒(fosmid)。

實施例9：基因組DNA之大量排序與胺基酸序列相同性檢索

大量排序實施例1中所得之青黴可比洛比PF1169株的基因組DNA、與提供於胺基酸序列的相同性檢索。具體為將基因組DNA 50μg之一部份進行前處理後，提供於Roche公司454FLX DNA排序機，取得平均contig長19.621kb、1405條之片段序列(總鹼基長27.568160Mb之序列)。

對於該序列，作為以聚酮合酶及異戊二烯基轉移酶為既知之序列，選定下述五種序列(聚酮合酶：來自Penicillium(P.) griseofluvum 6-methylsalycilic acid synthase 1744a.a.(P22367)及Aspergillus(A.) fumigatus PKS 2146a.a.(Q4WZA8)、異戊二烯基轉移酶：Penicillium(P.) marneffei Prenyltransferase(Q0MRO8)、Aspergillus(A.) fumigatus Prenyltransferase(Q4WBI5)、及Aspergillus(A.) fumigatus Prenyltransferase(4-hydroxybezoate octaprenyltransferase)(Q4WLD0)之序列)，藉由相同序列檢索軟體blastx之檢索實施。各取得22條(P22367)、21條(Q4WZA8)、2條(Q0MRO8)、3條(Q4WBI5)、及3條(Q4WLD0)之相同序列。

實施例10：F黏粒(fosmid)基因庫篩選及集群基因之序列解析

依據F黏粒(fosmid)套組(EPICENTRE公司製CopyControl Fosmid Library Production Kit)所添付之手冊，藉由實施例7中所作成之基因庫的96槽調製出各質體DNA。依據藉由Roche公司454FLX DNA排序機所決定之鹼基序列，進行胺基酸序列的相同性檢索，檢索聚酮合酶與異戊二烯基轉移酶之鄰近區域。藉由所得之區域的異戊二烯基轉移酶鹼基序增幅400bp之DNA片段，合成引子對(No.27)。使用該引子，對於該48槽之質體DNA樣品進行PCR。其結果所期待之約400bp的DNA片段(序列號碼263)藉由11槽增幅(參照圖3)。且，由該正型槽中之6槽，製造出含有約300克隆以上之菌落的培養皿，藉由菌落雜交進行再篩選。其結果，使用27F+27R的引子對(27F引子：序列號碼264)、27R引子：序列號碼265))，藉由約4800克隆取得4種F黏粒(fosmid)。將此內的一個命名為pCC1-PP1，決定插入片段之全序列(序列號碼266))。

藉由所得之pCC1-PP1轉型大腸菌Escherichia coli EPI300^TM-T1^R株(附於F黏粒(fosmid)套組)而得到大腸菌Escherichia coli EPI300^TM-T1^R株/pCC1-PP1(寄存號碼FERM BP-11133)。

且，進行各前述序列號碼266之序列與CoA ligase、擬LovB聚酮合酶(PKS)、氫氧化酶之細胞色素P450單加氧酶、環化酶、FAD-依賴型單加氧酶(FMO)、UbiA-擬異戊二烯轉移酶(UbiAPT)、乙醯基化酶之乙醯基轉移酶(AT)、乙醯基轉移酶-2(AT-2)、及Cation transporting ATPase(來自上述酶皆為薰煙色麴菌(Aspergillus fumigatus)Af293株)的相同性檢索後，皆表示70%以上之高相同性。

序列號碼266的核苷酸3342-5158為編碼CoA ligase，該對應之聚肽為編碼序列號碼267所記載之胺基酸序列所示，序列號碼266的核苷酸5382-12777為編碼擬LovB聚酮合酶(PKS)，對應之聚肽為序列號碼268所記載之胺基酸序列所示，序列號碼266的核苷酸13266-15144(以下將藉由該多核苷酸序列(P450-1)所編碼之蛋白質作為細胞色素P450單加氧酶(1))及16220-18018(以下將藉由該多核苷酸序列(P450-2)所編碼之蛋白質作為細胞色素P450單加氧酶(2))為編碼細胞色素P450單加氧酶，對應之聚肽各為序列號碼269、270所記載之胺基酸序列所示，序列號碼266的核苷酸18506-19296為編碼Cyclase，對應之聚肽為序列號碼271所記載之胺基酸序列所示，序列號碼266的核苷酸19779-21389為編碼FAD-依賴型單加氧酶(FMO)，對應之聚肽為序列號碼272所記載之胺基酸序列所示，序列號碼266的核苷酸21793-22877為編碼UbiA-擬異戊二烯轉移酶(UbiAPT)，對應之聚肽為序列號碼273所記載之胺基酸序列所示，序列號碼266的核苷酸23205-24773為編碼乙醯基轉移酶(AT)，對應之聚肽為序列號碼274所記載之胺基酸序列所示，序列號碼266的核苷酸25824-27178為編碼乙醯基轉移酶-2(AT-2)，對應之聚肽為序列號碼275所記載之胺基酸序列所示，序列號碼266的核苷酸27798-31855為編碼Cation transporting ATPase，對應之聚肽為序列號碼276所記載之胺基酸序列所示。

實施例11：基因組DNA基因庫之作成

將可黴菌之轉形的黏接質體(cosmid)載體pMFCOS1如以下構築。藉由質體pMKD01(專利第3593134號公報)，調製出含有黴菌之轉形用標識基因的得黴素耐性基因之約3.0kb的XbaI片段，使用T4聚合酶使末端平滑化。將該片段以限制酶SmaI及StuI做雙重消化與購得黏接質體載體SuperCos1(Stratagene Corporation)連結，構築黏接質體載體pMFCOS1。

其次，將比利比洛邊A生產菌之青黴可比洛比PF1169株(公開技報2008-500997號(專利文獻4))植菌於液體培養基(3%甘油、0.8%營養培養液(Nutrient Broth)、0.3%麥芽萃取物、0.2%酵母萃取物、0.1%麩胺酸鈉、pH7.0)，在26℃進行48小時培養。培養終了後藉由離心而收集菌體，藉由彼等菌體調製出染色體DNA。將染色體DNA以限制酶Sau3AI進行部分消化後，進行鹼磷酸酶處理，使DNA末端進行脫磷酸化。將該DNA片段預先以限制酶XbaI消化，藉由鹼磷酸酶處理使其脫磷酸化後，進一步連結於以限制酶BamHI消化之黏接質體(cosmid)載體pMFCOS1，製作出重組黏接質體載體。對於該重組黏接質體載體，使用Epicenter公司製之MAXPLAXλ封包萃取物區域(Lambda Packaging Extract tract)進行活體外包裝，藉由感染於大腸菌XLI-Blue MRA後製作出基因組DNA基因庫。

實施例12：基因組DNA基因庫之篩選

作為使用於篩選在實施例1所製作之基因組DNA基因庫的探測物，使用比利比洛邊A生物合成基因之一的細胞色素(cytochrome)P450基因，藉由以下所示經PCR而調製。

將實施例1所示基因組DNA作為鑄型，將5’-ATGATCGAGCTCAAAGATGC-3’(序列號碼277)與5’-CTTCTTTCCAGTCAATACCT-3’(序列號碼278)的寡DNA作為引子進行PCR。PCR為使用DNA聚合酶之Prime STAR HS DNA polymerase(Takarabio股份有限公司)，並使用PERKIN ELMER GeneAmp PCR System 9700進行。反應液為基因組DNA為0.5μl(0.5μg相當量)、附加於酶之2倍濃度反應用緩衝液為25μl、2.5mM dNTP溶液為4μl，調整至100pmol/μl之濃度的上述引子各0.5μl，加入酶0.5μl、滅菌水19μl使其成為50μl。反應在94℃進行5分鐘之前處理後，再在98℃進行10秒，在50℃進行5秒，在72℃進行2分鐘之恆溫培養，進行25次循環。反應終了後，將反應液的一部份提供於瓊脂凝膠電泳上，結果確認約1.8kbp之DNA片段進行專一性增幅。然後將殘留的反應液以酚：氯仿：異戊基醇(25：24：1)進行萃取，進行乙醇沈澱。將沈澱物以滅菌水再溶解後進行瓊脂凝膠電泳，將約1.8kbp之band依據定法切出並回收DNA片段。

將上述DNA片段作為探測物，使用ECL直接DNA/RNA標識‧檢測系統(Amersham Pharmacia Biotech公司製)進行菌落雜交，篩選出約5000個菌落。得到複數個陽性克隆，藉由其中1克隆分離質體pPYRI02。又，解析該質體pPYRI02之插入片段末端之鹼基序列的結果確認含有序列號碼266之1～25000及其上游區域。

實施例13：轉形體之製造

將比利比洛邊生產菌之青黴可比洛比PF1169株植菌於液體培養基(3%甘油、0.8%營養培養液(Nutrient Broth)、0.3%麥芽萃取物、0.2%酵母萃取物、0.1%麩胺酸鈉、2.0%甘胺酸、pH7.0)，並在26℃進行24小時培養後，藉由離心收集菌體。將所得之菌體以1.0M KCl洗淨，懸浮於以0.45μm之過濾器進行過濾之原生質體化酶溶液(3mg/mL β-glucuronidase、1mg/mL Chitinase、3mg/mL Lysing enzyme、1.0M KCl)10mL。在30℃進行60～90分鐘振盪，將菌紗進行原生質體化。將該懸浮液經過濾後經離心回收原生質體，以SUTC緩衝液(0.5mol/L蔗糖、10mM氯化鈣、10mM參鹽酸[pH7.5])洗淨。

將所調製之原生質體懸浮於1mL之SUTC緩衝液，對於該100μL加入10μg之pPYRI02DNA溶液(20μL)，冰中靜置5分鐘。其次加入400μL之PEG溶液(60% PEG4000、10mM氯化鈣、10mM參鹽酸[pH7.5])並混合，於冰中靜置20分鐘後，加入10mL之SUTC緩衝液，經離心後回收經原生質體化之菌體。將所得之菌體懸浮於1mL之SUTC緩衝液後，在4000rpm進行5分鐘離心，最終懸浮於100μL之SUTC緩衝液。

將經以上處理的菌體，在200μg/mL濕黴素B、1.0M蔗糖含馬鈴薯葡萄糖洋菜膠上，與軟1.0M蔗糖含馬鈴薯葡萄糖洋菜膠培養基重疊，進行26℃之4天培養後，將形成之菌落作為轉形體。

實施例14：轉形體之培養、及培養液中之比利比洛邊的定量

轉形體的培養為，作為種培養基使用2.0%澱粉、1.0%葡萄糖(葡萄糖)、0.5%多價蛋白腖、0.6%小麥胚芽、0.3%酵母萃取物、0.2%大豆粕及碳酸鈣0.2%的組成所成之培養基(殺菌前pH7.0)。又，作為生產培養基，使用10.0%葡萄糖、1.3%脫脂大豆、0.3%麩胺酸鈉、0.8%小麥胚芽、0.125%氯化鈉、0.15%碳酸鈣、0.2%煙醯胺之組成所成的培養基(殺菌前pH7.0)。

將前述種培養基40ml分注之250ml容三角燒杯在122℃進行20分鐘殺菌，於此植菌於實施例13所記載之轉形體1植菌環量的菌後，在26℃進行3天振盪培養。其次，將生產培養基20ml分注之250ml容量三角燒杯在122℃進行20分鐘殺菌，於此將上述種培養液0.5ml以無菌地移植，在26℃進行8天振盪培養。將於所得之培養液0.5ml上添加甲醇9.5ml的比利比洛邊經萃取、過濾後得到萃取液。其中10μl提供於HPLC分析。HPLC分析為使用HPLC系統LC-2010C(島津製作所)進行分析。分析條件為管柱：Inertsil ODS-34.6×250mm、移動相：乙：水=60：40、流速：1.0ml/min、管柱溫度：40℃、UV波長：320nm。將所得之圖型與比利比洛邊標準品比較，特定來自比利比洛邊之波峰，由該面積進行比利比洛邊之定量。且，進行定量之比利比洛邊類緣體，作為於本菌中所產生之比利比洛邊A、E、O。

同時對於轉形體之親株的青黴可比洛比PF1169株，亦同樣地進行培養及培養液中之比利比洛邊的定量。

其結果，如下表3所示，轉形體之比利比洛邊生產性提高至親株之約2.6倍，即使為藉由未含全長比利比洛邊生物合成基因集群之pPYRI02進行轉形的轉形體，亦顯示提高比利比洛邊生產性。

實施例15：使用Agrobacterium tumefaciens之青黴可比洛比的轉形

在1/2CMMY寒天培養基將青黴可比洛比PF1169株在28℃進行3天培養，刮取分生絲而回收。以滅菌Miracross(Carbiochem公司製、Cat,No. 475855)進行過濾並取得胞子，以IM液體培養基(1.74 g/L K₂HPO₄、1.36 g/L KH₂PO₄、0.14 g/L NaCl、0.49 g/L MgSO₄‧7H₂O、0.10 g/L CaCl₂‧2H₂O、100μL/L 9 mM FeSO₄、0.53 g/l(NH₄)₂SO₂、1.8 g/L葡萄糖、8.53 g/L MES(2-Morpholinoethanesulfonic acid)、5 mL/L甘油、pH 5.3)稀釋至10³/ml，將此作為青黴可比洛比胞子懸浮液。

將導入圖4所示pBI-AnGPD-EGFP(獨立行政法人理化學研究所)之Agrobacterium tumefaciens EHA105株植菌於含有50 ppm之卡納黴素(Km)的IM液體培養基，在28℃進行1晚培養。將此以含有50 ppm之Km的IM液體培養基稀釋至660nm的透過光之吸收為0.3～0.45，添加乙醯丁香酮(AS)至最終濃度為500μM，且在28℃進行6小時培養，將此作為土壤肝菌培養液。於含有50 ppm之Km及500μM的AS之co-cultivation寒天培養基(1.74 g/L K₂HPO₄、1.36 g/L KH₂PO₄、0.14 g/L NaCl、0.49 g/L MgSO₄‧7H₂O、0.10 g/L CaCl₂‧2H₂O、100μL/L 9 mM FeSO₄、0.53 g/l(NH₄)₂SO₂、0.9 g/L葡萄糖、8.53 g/L MES(2-Morpholinoethanesulfonic acid)、5 mL/L甘油、15 g/L Agar、pH 5.3)覆蓋hybond-N+(GEHealth Science公司製之直徑82 mm、Cat. No. RPN82B)，混合上述方法所得之100μL的青黴可比洛比胞子懸浮液與100μL之土壤肝菌培養液，於hybond-N+上均勻地擴展，將此在25℃進行2天共存培養後，移至含有50 ppm之濕黴素及25 ppm之meropenem(住友製藥公司製)的MM寒天培養基(1.74 g/L K₂HPO₄、1.36 g/L KH₂PO₄、0.14 g/L NaCl、0.49 g/L MgSO₄‧7H₂O、0.10 g/L CaCl₂‧2H₂O、100μL/L 9 mM FeSO₄、0.53 g/l(NH₄)₂SO₂、1.8 g/L葡萄糖、15 g/L Agar)並進行4天選擇培養。將所得之菌落移至含有25 ppm之濕黴素及25 ppm之meropenem的1/2CMMY寒天培養基，取得經生長的轉形體。將取得之濕黴素耐性菌落與GFP螢光觀察結果如圖5A所示，幾乎所得之濕黴素耐性菌落皆檢測到螢光。另一方面，如圖5B所示，作為對照之未感染土壤肝菌之青黴可比洛比PF1169株並未檢測到螢光。又，藉由濕黴素耐性菌落之基因組PCR實驗，亦確認濕黴素耐性基因及GFP基因之導入(數據省略)。

實施例16：基因組DNA基因庫之篩選2

實施例12所得之pPYRI02的插入片段末端之鹼基序列為含有序列號碼266之1～25000及該上游區域之序列。且欲得到加入比利比洛邊生物合成基因集群的下游部分之全長的比利比洛邊生物合成基因集群，藉由連結另外選殖之生物合成基因集群的下游部分與上述pPYRI02的插入片段，構築全長之生物合成基因集群。

作為全長之生物合成基因集群的構築方法，藉由實施例11所製作之基因組DNA基因庫，將未含於pPYRI02之比利比洛邊A生物合成基因之O-乙醯基轉移酶基因作為探測物，選殖本集群之下游部分。

將實施例11所示基因組DNA作為鑄型，增幅作為探測物所使用的DNA片段時的引子使用5’-ATGGATTCCCTATTGACGAG-3’(序列號碼279)及5’-TTAAATCTCCCCACCAACCG-3’(序列號碼280)以外，與實施例12之相同條件下實施。

將本DNA片段作為探測物，使用ECL直接DNA/RNA標識‧檢測系統進行菌落雜交，篩選約5000個菌落。得到複數個陽性克隆，由其中1克隆分離質體pPYRI03。對於本克隆進行PCR解析之結果，確認具有充分生物合成基因集群的下游區域，對於上游部份僅有至細胞色素P450單加氧酶，又未含有腺苷酸化酶(CoAligase)。

使用實施例12所得之pPYRI02的插入片段與前述pPYRI03的插入片段，構築具有生物合成基因集群全長之黏接質體(cosmid)。藉由各黏接質體之鹼基序列解析，顯示集群上所具有的限制酶部位，作為生物合成基因集群之上游區域，藉由將pPYRI02的BsiWI片段(約20.2kb)連結於作為下游區域之pPYRI03的BsiWI~AflII片段(約4.9kb)，可構築全長之生物合成基因簇。

首先將放線菌之接合傳達用質體pSET152[Bierman,M.著，「Gene」，(荷蘭國)，1992年，第116卷，p.43-49]進行SphI消化，以T4 DNA聚合酶使其平滑化後，連結HindIII接合體(5’-CCCAAGCTTGGG-3’(序列號碼281)、寶酒造股份有限公司製)，構築質體pSET153。欲將pSET153的多克隆位點變更為HindIII-NotI-BsiWIAflII-NotI-EcoRI，連結合成寡核苷酸Hin-Not-Bsi-Afl-Not-Eco-1(5’-AGCTTGCGGCCGCGTACGCTTAAGGCGGCCGCG-3’)(序列號碼282)及Hin-Not-Bsi-Afl-Not-Eco-2(5’-AATTCGCGGCCGCCTTAAGCGTACGCGGCCGCA-3’)(序列號碼283)後，連結以HindIII及EcoRI進行雙重消化之p9ET153而構築質體pSET201。於pSET201的BsiWI-AflII部位上，插入來自pPYRI03之約4.9kb的BsiWI-AflII片段後得到質體pPYRI05。於pPYRI05之BsiWI部位插入來自pPYRI02之約20.2kb的BsiWI片段，選出BsiWI片段與天然生物合成基因集群為相同方向插入之克隆，得到質體pPYRI06。pPYRI06為含有生物合成基因集群全長之質體，但不具有黴菌之轉形標識體，故進行插入片段之黏接質體載體pMFCOS1的繫換。即，連結來自pPYRI02之約8.5kb的黏接質體載體部分之NotI片段與來自pPYRI06之約25.1kb的NotI片段，得到黏接質體pPYRI07(翻譯區域：序列號碼284、非翻譯區域：序列號碼285)。pPYRI07為含有生物合成基因集群全長之同時亦具有黴菌之轉形標識基因的黏接質體。

pPYRI07的插入片段末端之鹼基序列經解析結果，確認序列號碼266之2446～27505及其上游上含有載體部分之鹼基序列，含有全長比利比洛邊生物合成基因集群。

實施例17：使用pPYRI07之轉形體的製造

使用實施例16所得之pPYRI07以外，與實施例13之情況的同樣條件下製造轉形體。

實施例18：轉形體之培養及培養液中的比利比洛邊之定量

實施例17所得之轉形體的培養及培養液中之比利比洛邊的定量方法，如實施例14所示方法進行。進行定量之比利比洛邊類緣體作為本菌中所產生之比利比洛邊A、E、O。又，同時對於轉形體之親株的青黴可比洛比PF1169株，亦同樣地進行培養及培養液中之比利比洛邊的定量。

其結果，如下表4所示，轉形體之比利比洛邊生產性提高至親株之3.6倍。由以上結果得知藉由全長比利比洛邊生物合成基因集群的導入，可提高青黴可比洛比PF1169株之生產性。

實施例19：使用青黴可比洛比之轉形體的製作

對於青黴可比洛比PF1169株以外之青黴可比洛比，亦欲確認導入全長比利比洛邊生物合成基因集群，提高該生產性，對於青黴可比洛比ATCC58615株(參照Studies in Mycology(2004),49 p84-85)進行轉形。

方法使用實施例16所得之pPYRI07以外，與實施例13所示相同方法進行轉形體之製作。

實施例20：轉形體之培養及培養液中的比利比洛邊之定量

實施例19所得之轉形體的培養及培養液中之比利比洛邊的定量方法，除培養時間為4天以外，其他依據實施例14所示方法進行。進行定量之比利比洛邊類緣體作為本菌中所產生之比利比洛邊A、E、O。又，同時對於轉形體的親株之青黴可比洛比ATCC58615株，進行同樣培養及培養液中之比利比洛邊的定量。

其結果，如下表5所示，轉形體的比利比洛邊生產性提高至親株之2.5倍。由以上結果得知，藉由全長比利比洛邊生物合成基因集群之導入，對於PF1169株以外之青黴可比洛比亦顯示其生產性之提高。又，顯示青黴可比洛比PF1169株比青黴可比洛比ATCC58615株更提高生產性。

[圖1]表示藉由PCR產物之瓊脂凝膠的電泳圖。電泳為使用以下引子使其增幅之PCR產物。M：分子量標識體(100bp梯度)、路線1：序列號碼1及2的引子、路線2：序列號碼239及240的引子、路線3：序列號碼237及238的引子、路線4：序列號碼241及242的引子、路線5：序列號碼247及248的引子、路線6：序列號碼251及252的引子、路線7：序列號碼245及246的引子、路線8：序列號碼243及244的引子、路線9：序列號碼249及250的引子、路線10：序列號碼235及236的引子、路線11：序列號碼233及234的引子、路線12：序列號碼227及228的引子、路線13：序列號碼229及230的引子、路線14：序列號碼231及232的引子。

[圖2]表示與圖1同樣地PCR產物藉由瓊脂凝膠之電泳圖。電泳為使用以下引子使其增幅之PCR產物。M：分子量標識體(100bp梯度)、路線1：序列號碼253及254的引子、路線2：序列號碼257及258的引子、路線3：序列號碼259及260的引子、路線4：序列號碼255及256的引子、路線5：序列號碼261及262的引子。

[圖3]表示與圖1同樣地PCR產物藉由瓊脂凝膠之電泳圖。電泳為使用以下引子使其增幅之PCR產物。路線1：分子量標識體(100bp梯度)、路線2：序列號碼264及265的引子(400bp增幅片段)。

[圖4]表示所使用的絲狀菌用質體載體pBI-AnGPD-EGFP之地圖。圖中，RB表示右側境界(right border)，HYG^r表示編碼濕黴素耐性之區域(Hygromycin resistance coding region)，PAngpdA表示巢狀麴菌甘油三磷酸脫氫酶啟動子(Aspergillus nidulans glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase promoter)，EGFP表示編碼強化綠色螢光蛋白質之區域(enhanced green fluorescent protein coding region)，TAngpdA表示小巢狀麴菌　甘油三磷酸脫氫酶終止子(Aspergillus nidulans glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase terminater)，LB表示左側之境界(left border)。

[圖5A]左圖表示土壤肝菌感染區的濕黴素耐性菌落，右圖表示該GFP螢光觀察結果。

[圖5B]左圖表示未含濕黴素之培養基中未感染土壤肝菌之青黴可比洛比PF1169株的菌落，右圖表示該GFP螢光觀察之結果。

<210>　277

<211>　20

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　a primer sequence for PCR

<400>　277

atgatcgagc tcaaagatgc　20

<210>　278

<211>　20

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　a primer sequence for PCR

<400>　278

cttctttcca gtcaatacct　20

<210>　279

<211>　20

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　a primer sequence for PCR

<400>　279

atggattccc tattgacgag　20

<210>　280

<211>　20

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　a primer sequence for PCR

<400>　280

ttaaatctcc ccaccaaccg　20

<210>　281

<211>　12

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　a primer sequence for PCR

<400>　281

<210>　282

<211>　33

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　a primer sequence for PCR

<400>　282

<210>　283

<211>　33

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　a primer sequence for PCR

<400>　283

<210>　284

<211>　8465

<212>　DNA

<213>　Penicillium coprobium PF1169

<400>　284

<210>　285

<211>　25059

<212>　DNA

<213>　Penicillium coprobium PF1169

<400>　285

Claims

一種核酸構築物，其特徵為含有比利比洛邊生物合成基因群與標識基因；前述比利比洛邊生物合成基因群含有選自下述(I)~(IV)所記載之核苷酸序列的至少1個核苷酸序列的全長；(I)序列號碼266中之2911號至27797號為止的核苷酸序列、(II)與序列號碼266中之2911號至27797號為止的核苷酸序列之互補序列在嚴謹條件下可雜交之核苷酸序列，且編碼與序列號碼266中之2911號至27797號為止的核苷酸序列所編碼之蛋白質為活性同等之蛋白質的核苷酸序列、(III)對於序列號碼266中之2911號至27797號為止的核苷酸序列所成的多核苷酸，1~4個核苷酸經缺失、取代、插入或加成的核苷酸序列，且編碼與序列號碼266中之2911號至27797號為止的核苷酸序列所編碼之蛋白質為活性同等之蛋白質的核苷酸序列、及(IV)具有與序列號碼266中之2911號至27797號為止的核苷酸序列所成多核苷酸為至少90%以上的相同性之核苷酸序列，且編碼與序列號碼266中之2911號至27797號為止的核苷酸序列所編碼之蛋白質為活性同等之蛋白質的核苷酸序列。
如申請專利範圍第1項之核酸構築物，其中前述比利比洛邊生物合成基因群為含有目的基因與表現調節區域所成。
如申請專利範圍第1或2項之核酸構築物，其中前述標識基因為藥劑耐性基因或營養要求性基因。
如申請專利範圍第1或2項之核酸構築物，其中前述標識基因為得黴素耐性基因或濕黴素耐性基因。
一種轉形體，其特徵為藉由將如申請專利範圍第1項至第4項中任一項之核酸構築物導入於宿主所得者。
一種轉形體，其特徵為藉由將含有比利比洛邊生物合成基因群的核酸構築物、與含有標識基因之核酸構築物，同時或各別導入於宿主所得者；前述比利比洛邊生物合成基因群含有選自下述(I)~(IV)所記載之核苷酸序列的至少1個核苷酸序列的全長；(I)序列號碼266中之2911號至27797號為止的核苷酸序列、(II)與序列號碼266中之2911號至27797號為止的核苷酸序列之互補序列在嚴謹條件下可雜交之核苷酸序列，且編碼與序列號碼266中之2911號至27797號為止的核苷酸序列所編碼之蛋白質為活性同等之蛋白質的核苷酸序列、(III)對於序列號碼266中之2911號至27797號為止的核苷酸序列所成的多核苷酸，1~4個核苷酸經缺失、取代、插入或加成的核苷酸序列，且編碼與序列號碼266中之2911號至27797號為止的核苷酸序列所編碼之蛋白質為活性同等之蛋白質的核苷酸序列、及(IV)具有與序列號碼266中之2911號至27797號為止的核苷酸序列所成多核苷酸為至少90%以上的相同性之核苷酸序列，且編碼與序列號碼266中之2911號至27797號為止的核苷酸序列所編碼之蛋白質為活性同等之蛋白質的核苷酸序列。
如申請專利範圍第5項之轉形體，其為藉由將質體pPYRI02(BCRC940636)或黏接質體(cosmid)pPYRI07(BCRC940637)導入於宿主所得者。
如申請專利範圍第5項至第7項中任一項之轉形體，其中前述宿主為生產比利比洛邊的絲狀菌。
如申請專利範圍第8項之轉形體，其中生產前述比利比洛邊之絲狀菌為青黴屬、Eupenicillium屬、或麴菌屬。
如申請專利範圍第8項之轉形體，其中生產前述比利比洛邊的絲狀菌為青黴可比洛比、Penicillium griseofulvum、Eupenicillium reticulisporum、Aspergillus fumigatus。
如申請專利範圍第8項之轉形體，其中生產前述比利比洛邊之絲狀菌為青黴可比洛比。
如申請專利範圍第8項之轉形體，其中生產前述比利比洛邊的絲狀菌為青黴可比洛比PF1169株或青黴可比洛比ATCC58615株。
一種比利比洛邊的製造法，其特徵為含有培養如申請專利範圍第5項至第12項中任一項之轉形體，由培養物採出比利比洛邊所成者。