JP5864267B2 - ピリピロペン生合成遺伝子群およびマーカー遺伝子を含む核酸構築物 - Google Patents
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Description
本特許出願は、２０１０年１月２６日に出願された日本出願特願２０１０−１４７００号および２０１０年１１月１１日に出願された日本出願特願２０１０−２５３１８３号に基づく優先権の主張を伴うものであり、この日本出願の全開示内容は、引用することにより本願の開示の一部とされる。
技術分野
本発明は、ピリピロペン生合成遺伝子群と、マーカー遺伝子とを含む核酸構築物に関する。
本発明は、ピリピロペン生合成遺伝子群と、マーカー遺伝子とを含む核酸構築物に関する。
背景技術
ピリピロペンは、これまで側鎖の構造の違いにより、ピリピロペンＡ〜Ｒまでの１８種の類縁体が天然に存在することが明らかとされている（非特許文献１）。
ピリピロペンは、これまで側鎖の構造の違いにより、ピリピロペンＡ〜Ｒまでの１８種の類縁体が天然に存在することが明らかとされている（非特許文献１）。
ピリピロペンは、ACAT阻害活性を有することが開示されており（特許文献１）、コレステロール蓄積に起因する疾患の治療等への応用が期待されている。また、 ピリピロペンが、オオタバコガ幼虫（非特許文献２）、コナガ幼虫（特許文献２）、チャイロコメムシダマシ（特許文献２）、アブラムシ（特許文献３）に対して殺虫活性を有することが開示されており、殺虫剤への応用が期待されている。
ピリピロペンは糸状菌により二次代謝物として生産されることが知られており、例えば、ペニシリウム コピロビウムPF1169株（特許文献４）、アスペルギルス フミガタスIFO-1289株（特許文献５）、ユーペニシリウム レティキュロスポラムNRRL-3446株（非特許文献２）、ペニシリウム グリセオフルバムF1959株（特許文献２）が、それぞれピリピロペンを生産する事が開示されている。
ピリピロペンの工業生産は、前記の生産菌を培養しピリピロペンを採取することにより実施される。一般に、天然から分離された微生物の生産する二次代謝産物の量は微量であり、これを産業的に利用するためには、これら目的物の生産性を向上させる必要がある。
目的物の生産性を向上させるためには、目的物生産微生物の培養方法の検討、培地成分の検討、および前駆体の添加などの発酵条件の改良、並びに紫外線照射または突然変異誘発剤による突然変異を利用した菌株の改良が行われている。さらに近年では、これらの方法に加えて遺伝子組換えを利用した生産性の向上も行われるようになってきた。
目的物の生産性を向上させるためには、目的物生産微生物の培養方法の検討、培地成分の検討、および前駆体の添加などの発酵条件の改良、並びに紫外線照射または突然変異誘発剤による突然変異を利用した菌株の改良が行われている。さらに近年では、これらの方法に加えて遺伝子組換えを利用した生産性の向上も行われるようになってきた。
遺伝子組換えによる生産性向上における一般的な手法は、生合成遺伝子の発現増強であり、例えば、本手法によりアゴノマイセタレスの生産するPF1022物質の生産性を向上させる方法が開示されている（特許文献６）。この手法を適応するためには、目的物の生合成遺伝子が単離されており、かつその生産微生物において形質転換法が確立されていることが必要である。
ピリピロペンについては生合成遺伝子群を単離した報告はこれまでなく、また、ピリピロペン生産菌を宿主とした形質転換法も確立されていなかった。従って、これまでピリピロペンの生合成遺伝子群をその生産微生物に導入することが困難であり、遺伝子組換えによる生産性向上が実現できない状況であった。
Journal of Antibiotics (1996)、49(3)、292‐298
Applied and Environmental Microbiology (1995)、61 (12)、 4429-4435
本発明者らは、今般、ピリピロペン生合成遺伝子群と、マーカー遺伝子とを含む核酸構築物を宿主で発現させることにより、ピリピロペンの生産性が顕著に向上することを見出した。本発明は、かかる知見に基づくものである。
従って、本発明の目的は、ピリピロペン生合成遺伝子群と、マーカー遺伝子とを含む核酸構築物を提供することにある。
そして、本発明の一つの態様によれば、ピリピロペン生合成遺伝子群と、マーカー遺伝子とを含む核酸構築物が提供される。
また、本発明の別の態様によれば、前記核酸構築物を、宿主に導入することにより得られる形質転換体が提供される。
さらに、本発明の別の態様によれば、前記ピリピロペン生合成遺伝子群を含む核酸構築物と、前記マーカー遺伝子を含む核酸構築物とを、同時にまたは別々に、宿主に導入することにより得られる形質転換体が提供される。
また、本発明の別の態様によれば、前記形質転換体を培養し、培養物からピリピロペンを採取することを含んでなるピリピロペンの製造法が提供される。
微生物の寄託
プラスミドｐＣＣ１−ＰＰ１で形質転換された大腸菌（Escherichia coli ＥＰＩ３００ＴＭ−Ｔ１Ｒ）は、２００８年１０月９日（原寄託日）付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託 センター（〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−１１１３３（国内寄託ＦＥＲＭ Ｐ−２１７０４より移管）（寄託者が付した識別のための表示：Escherichia coli ＥＰＩ３００ＴＭ−Ｔ１Ｒ／ｐＣＣ１−ＰＰ１）として寄託されている。
プラスミドｐＣＣ１−ＰＰ１で形質転換された大腸菌（Escherichia coli ＥＰＩ３００ＴＭ−Ｔ１Ｒ）は、２００８年１０月９日（原寄託日）付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託 センター（〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−１１１３３（国内寄託ＦＥＲＭ Ｐ−２１７０４より移管）（寄託者が付した識別のための表示：Escherichia coli ＥＰＩ３００ＴＭ−Ｔ１Ｒ／ｐＣＣ１−ＰＰ１）として寄託されている。
プラスミドｐＰＹＲＩ０２で形質転換された大腸菌は、平成２１（２００９）年１２月１４日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−１１２０３（寄託者が付した識別のための表示：XL1-Blue MRA/pPYRI02）として寄託されている。
コスミドｐＰＹＲＩ０７で形質転換された大腸菌は、平成２２（２０１０）年１２月１日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−１１３１６（寄託者が付した識別のための表示：XL1-Blue MRA/pPYRI07）として寄託されている。
ピリピロペン生合成遺伝子群
本発明におけるピリピロペン生合成遺伝子群とは、後述するマーカー遺伝子と宿主において発現可能な状態で核酸構築物中に配置されるものであり、ピリピロペンの生合成に関与する遺伝子群であれば特に限定されないが、好ましくは、下記の(I)〜(IV)に記載されたヌクレオチド配列から選択された少なくとも１個のヌクレオチド配列の全長もしくはその一部を含んでなる構築物が提供される：
(I)配列番号２６６における2911番から27797番までのヌクレオチド配列、
(II)配列番号２６６における2911番から27797番までのヌクレオチド配列の相補配列と厳密な条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であり、かつ配列番号２６６における2911番から27797番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
(III) 配列番号２６６における2911番から27797番までのヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつ配列番号２６６における2911番から27797番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および
(IV) 配列番号２６６における2911番から27797番までのヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつ配列番号２６６における2911番から27797番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
本発明におけるピリピロペン生合成遺伝子群とは、後述するマーカー遺伝子と宿主において発現可能な状態で核酸構築物中に配置されるものであり、ピリピロペンの生合成に関与する遺伝子群であれば特に限定されないが、好ましくは、下記の(I)〜(IV)に記載されたヌクレオチド配列から選択された少なくとも１個のヌクレオチド配列の全長もしくはその一部を含んでなる構築物が提供される：
(I)配列番号２６６における2911番から27797番までのヌクレオチド配列、
(II)配列番号２６６における2911番から27797番までのヌクレオチド配列の相補配列と厳密な条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であり、かつ配列番号２６６における2911番から27797番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
(III) 配列番号２６６における2911番から27797番までのヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつ配列番号２６６における2911番から27797番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および
(IV) 配列番号２６６における2911番から27797番までのヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつ配列番号２６６における2911番から27797番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
本発明におけるピリピロペン生合成遺伝子群のさらに好ましい態様によれば、目的遺伝子と、発現調節領域とを含んでなる遺伝子群である。ここで、目的遺伝子とは、ピリピロペンの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子を一またはそれ以上有するものである。また、発現調節領域とは、宿主で前記目的遺伝子の発現を調節するために必要なヌクレオチド配列を有するものであれば特に限定されないが、例えば、目的遺伝子の宿主内での転写量を調節するヌクレオチド配列であるプロモーターやターミネーターなどが含まれる。また、ピリピロペンの生合成に関与するタンパク質とは、例えば、下記スキーム１で表される生合成経路のいずれかに関与するタンパク質である。
本発明の目的遺伝子の好ましい態様によれば、配列番号２６７〜２７５から選択される少なくとも一つのアミノ酸配列またはそれと実質的に同等なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物が提供される。
本発明の目的遺伝子のさらに好ましい態様によれば、下記の(１)〜(４)に記載されたヌクレオチド配列から選択された少なくとも１個のヌクレオチド配列を含む核酸構築物が提供される：
(１) 下記(a)-(i)に記載されたヌクレオチド配列:
(a)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の3342番から5158番までのヌクレオチド配列、
(b)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の5382番から12777番までのヌクレオチド配列、
(c)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の13266番から15144番までのヌクレオチド配列、
(d)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の16220番から18018番までのヌクレオチド配列、
(e)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の18506番から19296番までのヌクレオチド配列、
(f)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の19779番から21389番までのヌクレオチド配列、
(g)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の21793番から22877番までのヌクレオチド配列、
(h)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の23205番から24773番までのヌクレオチド配列、および
(i)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の25824番から27178番までのヌクレオチド配列、
(２) （１）において記載されたヌクレオチド配列の相補配列と厳密な条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
(３）（１）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
(４）（１）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
(１) 下記(a)-(i)に記載されたヌクレオチド配列:
(a)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の3342番から5158番までのヌクレオチド配列、
(b)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の5382番から12777番までのヌクレオチド配列、
(c)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の13266番から15144番までのヌクレオチド配列、
(d)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の16220番から18018番までのヌクレオチド配列、
(e)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の18506番から19296番までのヌクレオチド配列、
(f)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の19779番から21389番までのヌクレオチド配列、
(g)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の21793番から22877番までのヌクレオチド配列、
(h)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の23205番から24773番までのヌクレオチド配列、および
(i)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の25824番から27178番までのヌクレオチド配列、
(２) （１）において記載されたヌクレオチド配列の相補配列と厳密な条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
(３）（１）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
(４）（１）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
本発明の目的遺伝子のさらに一層好ましい態様によれば、下記の(１)〜(４)に記載されたヌクレオチド配列から選択された少なくとも１個のヌクレオチド配列を含む核酸構築物が提供される：
(１) 上記(a)-(i)または(a)-(h)に記載されたヌクレオチド配列の全長を全て含むヌクレオチド配列、
(２) （１）において記載されたヌクレオチド配列の相補配列と厳密な条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であり、かつそのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
(３）（１）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつそのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
(４）（１）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつそのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
(１) 上記(a)-(i)または(a)-(h)に記載されたヌクレオチド配列の全長を全て含むヌクレオチド配列、
(２) （１）において記載されたヌクレオチド配列の相補配列と厳密な条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であり、かつそのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
(３）（１）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつそのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
(４）（１）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつそのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
本発明の発現調節領域の好ましい態様によれば、下記の(１)〜（４)に記載されたヌクレオチド配列から選択された少なくとも１個ヌクレオチド配列を含む核酸構築物が提供される：
(１) 下記(j)-(s)に記載されたヌクレオチド配列の全長もしくは一部:
(j)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の2911番から3341番までのヌクレオチド配列
(k)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の5159番から5381番までのヌクレオチド配列
(l)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の12778番から13265番までのヌクレオチド配列
(m)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の15145番から16219番までのヌクレオチド配列
(n)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の18019番から18505番までのヌクレオチド配列
(o)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の19297番から19778番までのヌクレオチド配列
(p)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の21390番から21792番までのヌクレオチド配列
(q)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の22878番から23204番までのヌクレオチド配列
(r)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の24774番から25823番までのヌクレオチド配列
(s)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の27179番から27797番までのヌクレオチド配列
(２）（１）において記載されたヌクレオチド配列と厳密な条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列と実質的に同等な機能を有するヌクレオチド配列、
(３）（１）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列と実質的に同等な機能を有するヌクレオチド配列、
(４）（１）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列と実質的に同等な機能を有するヌクレオチド配列。
(１) 下記(j)-(s)に記載されたヌクレオチド配列の全長もしくは一部:
(j)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の2911番から3341番までのヌクレオチド配列
(k)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の5159番から5381番までのヌクレオチド配列
(l)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の12778番から13265番までのヌクレオチド配列
(m)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の15145番から16219番までのヌクレオチド配列
(n)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の18019番から18505番までのヌクレオチド配列
(o)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の19297番から19778番までのヌクレオチド配列
(p)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の21390番から21792番までのヌクレオチド配列
(q)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の22878番から23204番までのヌクレオチド配列
(r)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の24774番から25823番までのヌクレオチド配列
(s)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の27179番から27797番までのヌクレオチド配列
(２）（１）において記載されたヌクレオチド配列と厳密な条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列と実質的に同等な機能を有するヌクレオチド配列、
(３）（１）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列と実質的に同等な機能を有するヌクレオチド配列、
(４）（１）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列と実質的に同等な機能を有するヌクレオチド配列。
本発明の発現調節領域のより好ましい態様によれば、下記の(１)〜（４)に記載されたヌクレオチド配列から選択された少なくとも１個ヌクレオチド配列を含む核酸構築物が提供される：
(１) 前記(j)-(s)または(j)-(r)に記載されたヌクレオチド配列の全長を全て含むヌクレオチド配列、
(２）（１）において記載されたヌクレオチド配列と厳密な条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列と実質的に同等な機能を有するヌクレオチド配列、
(３）（１）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列と実質的に同等な機能を有するヌクレオチド配列、
(４）（１）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列と実質的に同等な機能を有するヌクレオチド配列。
(１) 前記(j)-(s)または(j)-(r)に記載されたヌクレオチド配列の全長を全て含むヌクレオチド配列、
(２）（１）において記載されたヌクレオチド配列と厳密な条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列と実質的に同等な機能を有するヌクレオチド配列、
(３）（１）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列と実質的に同等な機能を有するヌクレオチド配列、
(４）（１）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列と実質的に同等な機能を有するヌクレオチド配列。
本発明においてピリピロペン生合成遺伝子群としては、ピリピロペン生産菌に由来する生合成遺伝子クラスターの全長もしくは一部を単離して使用することができ、好ましくは、配列番号２６６で示されるペニシリウム コピロビウムＰＦ1169株に由来するピリピロペン生合成遺伝子クラスターの全長または一部を用いることができ、さらに好ましくは、配列番号２６６で示されるペニシリウム コピロビウムＰＦ1169株に由来するピリピロペン生合成遺伝子クラスターの全長を用いることができる。
本発明において「実質的に同等なアミノ酸配列」とは、一つ若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、付加、または挿入による改変を有するが、ポリペプチドの活性に影響を与えないアミノ酸配列を意味する。アミノ酸の置換、欠失、付加、または挿入によって改変されたアミノ酸配列は、改変等される前のアミノ酸配列に対して、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに一層好ましくは９８％以上の配列同一性を有することが好ましい。また、改変されるアミノ酸残基の数は、好ましくは1〜40個、より好ましくは1〜20個、さらに好ましくは1〜10個、さらに一層好ましくは1〜8個、最も好ましくは1〜4個である。
そして、活性に影響を与えない改変の例としては、保存的置換が挙げられる。「保存的置換」とは、ポリペプチドの活性を実質的に変化しないように、好ましくは1〜40個、より好ましくは1〜20個、さらに好ましくは1〜10個、さらに一層好ましくは1〜8個、最も好ましくは1〜4個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基によって置き換えることを意味する。例えば、ある疎水性アミノ酸残基を別の疎水性アミノ酸残基によって置換する場合、ある極性アミノ酸残基を同じ電荷を有する別の極性アミノ酸残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似したアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。具体例を挙げると、非極性(疎水性)アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン等が挙げられる。極性(中性)アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システイン等が挙げられる。陽電荷をもつ(塩基性)アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジン等が挙げられる。また、負電荷をもつ(酸性)アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられる。
本発明において「厳密な条件」とは、ハイブリダイゼーション後のメンブレンの洗浄操作を、高温度低塩濃度溶液中で行うことを意味し、当業者であればその条件は適宜決定できるものであるが、例えば、２×ＳＳＣ濃度（１×ＳＳＣ：１５ｍＭクエン酸３ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）、０．５％ＳＤＳ溶液中で６０℃、２０分間の洗浄条件、または０．２×ＳＳＣ濃度（１×ＳＳＣ：１５ｍＭクエン酸３ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ溶液中で６０℃、１５分間の洗浄条件を意味する。
ハイブリダイゼーションは、公知の方法に従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
本願明細書において、ヌクレオチド配列についての「同一性」（相同性という場合もある）とは、比較される配列間において、各々の配列を構成する塩基の一致の程度の意味で用いられる。このとき、ギャップの存在およびアミノ酸の性質が考慮される。本明細書において示した「同一性」の数値はいずれも、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であればよく、例えばＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ等においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いることにより、容易に算出することができる。
本願明細書において、ヌクレオチド配列についての「同一性」は９０％以上であり、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。
本願明細書において、「ポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の方法により、または天然に生じ得る程度の複数個のヌクレオチドの置換等により改変がなされたことを意味する。ヌクレオチドの改変の個数は、１個または複数個（例えば、１個ないし数個あるいは１、２、３、または４個）である。
「そ（れぞれ）のヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列」とは、「そ（れぞれ）のヌクレオチド配列がコードするタンパク質」と同等な活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を意味する。
配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の３３４２番から５１５８番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質は、CoA ligase（CoAリガーゼ）活性を有することが好ましい。
配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の５３８２番から１２７７７番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質は、LovB-like polyketide synthase（LovB様ポリケチド合成酵素）(PKS)活性を有することが好ましい。
配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の１３２６６番から１５１４４番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質は、Cytochrome P450 monooxygenase（シトクロームP450モノオキシゲナーゼ）（１）(P450-1)活性を有することが好ましい。
配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の１６２２０番から１８０１８番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質は、Cytochrome P450 monooxygenase（２）(P450-2)活性を有することが好ましい。
配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の１８５０６番から１９２９６番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質は、Cyclase（シクラーゼ）(IMP: Integral membrane protein)活性を有することが好ましい。
配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の１９７７９番から２１３８９番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質は、FAD-dependent monooxygenase（FAD依存性モノオキシゲナーゼ）(FMO)活性を有することが好ましい。
配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の２１７９３番から２２８７７番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質は、UbiA-like prenyltransferase（UbiA様プレニルトランスフェラーゼ）(UbiAPT)活性を有することが好ましい。
配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の２３２０５番から２４７７３番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質は、Acetyltransferase（アセチルトランスフェラーゼ）(AT)活性を有することが好ましい。
配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の２５８２４番から２７１７８番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質は、Acetyltransferase-2(AT-2)活性を有することが好ましい。
「それぞれヌクレオチド配列と実質的に同等な機能を有するヌクレオチド配列」とは、「それぞれヌクレオチド配列」と同等の機能を有する限り特に限定されないが、例えば目的遺伝子の発現を調節する機能が同等であることを意味し、詳細には、例えば、プロモーター活性やターミネーター活性などの機能が同等であることを意味する。
前記の目的遺伝子、発現調節領域は、前記のヌクレオチド配列を基に適当なプライマーを合成し、それを用いてピリピロペン生産菌等に由来するゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅または化学的に全合成することにより取得することができる。
ピリピロペン
本発明において、ピリピロペンとは、ピリピロペンＡからＲまでを含む意味で用いられるものとし、好ましくは、ピリピロペンＡ、Ｅ、およびＯであり、さらに好ましくはピリピロペンＡである。
本発明において、ピリピロペンとは、ピリピロペンＡからＲまでを含む意味で用いられるものとし、好ましくは、ピリピロペンＡ、Ｅ、およびＯであり、さらに好ましくはピリピロペンＡである。
ピリピロペン生合成遺伝子群の単離方法
ピリピロペン生合成遺伝子群は、例えば、以下の方法で単離することができる。例えば、ピリピロペン生産菌のゲノムＤＮＡを抽出し、適当な制限酵素にて切断後、コスミドベクターを用いて、ゲノムＤＮＡからなるライブラリーを作製する。続いて、実施例１２の記載に従ってcytochrome P450等のピリピロペン生合成遺伝子群に含まれるヌクレオチド配列を基に、適当なプライマーを合成し、それを用いてピリピロペン生産菌由来のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法を実施し、生合成遺伝子群の一部からなるＤＮＡ断片を増幅する。このＤＮＡ断片をプローブとして用い、ゲノムライブラリーのスクリーニングを行い、ピリピロペン生合成遺伝子群の全長もしくは一部を単離することができる。
ピリピロペン生合成遺伝子群は、例えば、以下の方法で単離することができる。例えば、ピリピロペン生産菌のゲノムＤＮＡを抽出し、適当な制限酵素にて切断後、コスミドベクターを用いて、ゲノムＤＮＡからなるライブラリーを作製する。続いて、実施例１２の記載に従ってcytochrome P450等のピリピロペン生合成遺伝子群に含まれるヌクレオチド配列を基に、適当なプライマーを合成し、それを用いてピリピロペン生産菌由来のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法を実施し、生合成遺伝子群の一部からなるＤＮＡ断片を増幅する。このＤＮＡ断片をプローブとして用い、ゲノムライブラリーのスクリーニングを行い、ピリピロペン生合成遺伝子群の全長もしくは一部を単離することができる。
本発明における、宿主で発現されるピリピロペン生合成遺伝子群は、前記の方法以外に、目的遺伝子に、宿主で機能する発現調節領域を連結させることにより得ることができる。目的遺伝子と発現調節領域の連結様式は、目的遺伝子が宿主で発現すればどの様な方法でも構わないが、例えば、目的遺伝子の上流にプロモーターを、また下流にターミネーターをそれぞれ作動可能に連結する方法がある。本発明による目的遺伝子と発現調節領域の連結は、公知の方法に従って行うことができる。
マーカー遺伝子
本発明によるマーカー遺伝子は、上述したピリピロペン生合成遺伝子群と宿主において発現可能な状態で核酸構築物中に配置されるものであり、形質転換体の選択手法に応じて適宜選択できるが、例えば、薬剤耐性をコードする遺伝子や栄養要求性を相補する遺伝子を使用することができる。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、デストマイシン、ハイグロマイシン、ベノミル、オリゴマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ビアラホス、ブラストサイジンＳ、フレオマイシン、フォスフィノスリシン、アンピシリン、カナマイシン等の薬剤に対する遺伝子が挙げられ、好ましくはデストマイシン耐性遺伝子またはハイグロマイシン耐性遺伝子が挙げられる。栄養要求性を相補する遺伝子としては、例えば、ａｍｄＳ、ｐｙｒＧ、ａｒｇＢ、ｔｒｐＣ、ｎｉａＤ、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３等の遺伝子が挙げられる。
本発明によるマーカー遺伝子は、上述したピリピロペン生合成遺伝子群と宿主において発現可能な状態で核酸構築物中に配置されるものであり、形質転換体の選択手法に応じて適宜選択できるが、例えば、薬剤耐性をコードする遺伝子や栄養要求性を相補する遺伝子を使用することができる。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、デストマイシン、ハイグロマイシン、ベノミル、オリゴマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ビアラホス、ブラストサイジンＳ、フレオマイシン、フォスフィノスリシン、アンピシリン、カナマイシン等の薬剤に対する遺伝子が挙げられ、好ましくはデストマイシン耐性遺伝子またはハイグロマイシン耐性遺伝子が挙げられる。栄養要求性を相補する遺伝子としては、例えば、ａｍｄＳ、ｐｙｒＧ、ａｒｇＢ、ｔｒｐＣ、ｎｉａＤ、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３等の遺伝子が挙げられる。
これらのマーカー遺伝子は、例えば、ピリピロペン生合成遺伝子群と同様な方法で単離、増幅、もしくは合成し、使用することができる。
核酸構築物
本発明における核酸構築物は、宿主の遺伝子に導入できればどのような形態のものでもよいが、好ましくは、宿主への導入の際に、ベクター中に組み込まれた形態で用いることができる。従って、本発明好ましい態様によれば、本発明による核酸構築物を含んでなる組換えベクターが提供される。
本発明における核酸構築物は、宿主の遺伝子に導入できればどのような形態のものでもよいが、好ましくは、宿主への導入の際に、ベクター中に組み込まれた形態で用いることができる。従って、本発明好ましい態様によれば、本発明による核酸構築物を含んでなる組換えベクターが提供される。
本発明による組換えベクターは、適当なベクターに宿主で発現されるピリピロペン生合成遺伝子群およびマーカー遺伝子を導入することで調製できる。
組換えベクターの構築の手順および方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる。
本発明において使用できるベクターとしては、宿主に導入できればいずれも使用できるが、例えば、コスミド、ファージベクター、ｐＵＣ系プラスミド、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系プラスミド、およびｐＢＲ３２２プラスミドなどが挙げられる。
宿主
本発明において使用できる宿主としては、本発明の核酸構築物を導入してピリピロペンを生産できる宿主であれば特に限定されないが、本発明の核酸構築物を導入しない状態でもピリピロペンを生産できる微生物が好ましく、より好ましくは糸状菌が挙げられ、さらに好ましくはペニシリウム属、ユーペニシリウム属、またはアスペルギルス属に属する微生物が挙げられ、さらに一層好ましくはペニシリウム コピロビウム、ペニシリウム グリセオフルバム、ユーペニシリウム レティキュロスポラム、またはアスペルギルス フミガタスが挙げられ、その中でもペニシリウム コピロビウムが好ましく、最も好ましくはペニシリウム コピロビウムＰＦ１１６９株が挙げられる。
本発明において使用できる宿主としては、本発明の核酸構築物を導入してピリピロペンを生産できる宿主であれば特に限定されないが、本発明の核酸構築物を導入しない状態でもピリピロペンを生産できる微生物が好ましく、より好ましくは糸状菌が挙げられ、さらに好ましくはペニシリウム属、ユーペニシリウム属、またはアスペルギルス属に属する微生物が挙げられ、さらに一層好ましくはペニシリウム コピロビウム、ペニシリウム グリセオフルバム、ユーペニシリウム レティキュロスポラム、またはアスペルギルス フミガタスが挙げられ、その中でもペニシリウム コピロビウムが好ましく、最も好ましくはペニシリウム コピロビウムＰＦ１１６９株が挙げられる。
形質転換体の造出
本発明によれば、前記宿主を、前記核酸構築物を用いて形質転換することにより、ピリピロペン生合成遺伝子群が導入された形質転換体が提供される。核酸構築物の宿主への導入方法は、宿主へ導入されれば特に限定されないが、例えば組換えベクターを用いた以下の方法により核酸構築物を宿主へ導入することができる。
本発明によれば、前記宿主を、前記核酸構築物を用いて形質転換することにより、ピリピロペン生合成遺伝子群が導入された形質転換体が提供される。核酸構築物の宿主への導入方法は、宿主へ導入されれば特に限定されないが、例えば組換えベクターを用いた以下の方法により核酸構築物を宿主へ導入することができる。
宿主への組換えベクターを用いた核酸構築物の導入は、常法に従って行うことができる。導入法としては、例えば、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、アグロバクテリウム法、リチウム法または塩化カルシウム法等が挙げられ、宿主細胞にとって効率の良い手法が選択される。ペニシリウム コピロビウムを宿主として用いる場合、好ましくはポリエチレングリコール法である。
本発明の好ましい態様によれば、プラスミドｐＰＹＲＩ０２（プラスミドｐＰＹＲＩ０２で形質転換された大腸菌の受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２０３）またはコスミドｐＰＹＲＩ０７（コスミドｐＰＹＲＩ０７で形質転換された大腸菌の受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３１６）を宿主に導入することにより得られる形質転換体が提供される。
形質転換体の培養とピリピロペンの製造
本発明によれば、前記で造出された形質転換体を培養し、その培養物からピリピロペンを採取することを含んでなるピリピロペンの製造法、好ましくはピリピロペンの大量製造法が提供される。
本発明によれば、前記で造出された形質転換体を培養し、その培養物からピリピロペンを採取することを含んでなるピリピロペンの製造法、好ましくはピリピロペンの大量製造法が提供される。
形質転換体の培養は常法に従って、培地、培養条件等を適宜選択することにより行うことができる。培地としては、慣用の成分、例えば炭素源としては、グルコース、シュークロース、セルロース、水飴、デキストリン、澱粉、グリセロール、糖蜜、動・植物油等が使用できる。また、窒素源としては、大豆粉、小麦胚芽、ファーマメディア、コーン・スティープ・リカー、綿実粕、ブイヨン、ペプトン、ポリペプトン、マルトエキス、イーストエキス、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素等が使用できる。その他必要に応じ、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、塩素、リン酸、硫酸およびその他のイオンを生成することのできる無機塩類、例えば塩化カリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素２カリウム、硫酸マグネシウム、リン酸１カリウム、硫酸亜鉛、硫酸マンガン、硫酸銅を添加することも有効である。また、必要に応じてチアミン（チアミン塩酸塩等）等の各種ビタミン、グルタミン酸（グルタミン酸ナトリウム等）、アスパラギン（ＤＬ−アスパラギン等）等のアミノ酸、ヌクレオチド等の微量栄養素、抗生物質等の選抜薬剤を添加することもできる。さらに、菌の発育を助け、ピリピロペンの生産を促進するような有機物および無機物を適当に添加することができる。
培養法としては、好気的条件での振とう培養法、通気撹拌培養法または深部好気培養法により行うことができるが、特に通気撹拌培養法が最も適している。培地のｐＨは、例えばｐＨ６〜ｐＨ８程度である。培養に適当な温度は、１５℃〜４０℃であるが、多くの場合２６℃〜３７℃付近で生育する。ピリピロペンの生産は、培地および培養条件、または使用した宿主により異なるが、いずれの培養法においても通常２日〜２５日間でその蓄積が最高に達する。
培養中のピロピロペンの量が最高になった時に培養を停止し、培養物からピロピロペンを採取し、必要に応じて単離、精製を行う。複数の種類のピロピロペンが製造された場合には、複数種のピロピロペンを同時に採取して必要に応じて単離、精製を行ってもよいし、複数種のピロピロペンを別々に採取して、必要に応じて単離、精製を行ってもよい。
以下に実施例により本発明を詳述するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１：ペニシリウム コピロビウムPF1169株のゲノムＤＮＡの調製
三角フラスコ（１L）に滅菌したNB培地 500mlを入れ、1/2CMMY寒天培地において、28℃で、4日間前培養していたペニシリウム コピロビウムPF1169株（公開技報2008-500997号（特許文献4））を上記の培地に加え、28℃で、4日間液体培養した。ミラクロスで濾過により、菌体５ｇを得た。この菌体よりゲノムＤＮＡ精製キット Genomic-tip 100/G（キアゲン株式会社製）を、添付のマニュアルに従い、30μgのゲノムＤＮＡを取得した。
三角フラスコ（１L）に滅菌したNB培地 500mlを入れ、1/2CMMY寒天培地において、28℃で、4日間前培養していたペニシリウム コピロビウムPF1169株（公開技報2008-500997号（特許文献4））を上記の培地に加え、28℃で、4日間液体培養した。ミラクロスで濾過により、菌体５ｇを得た。この菌体よりゲノムＤＮＡ精製キット Genomic-tip 100/G（キアゲン株式会社製）を、添付のマニュアルに従い、30μgのゲノムＤＮＡを取得した。
実施例２：ポリケチド合成酵素(PKS)増幅用縮重プライマーとその増幅断片
種々の糸状菌ポリケチド合成酵素に保存されているアミノ酸配列より増幅用縮重プライマーとして 下記プライマーをデザインし、合成した：
ＬＣ１ ： ＧＡＹＣＣＩＭＧＩＴＴＹＴＴＹＡＡＹＡＴＧ（配列番号１）
ＬＣ２ｃ： ＧＴＩＣＣＩＧＴＩＣＣＲＴＧＣＡＴＹＴＣ（配列番号２）
（ただし、R=A/G、Y=C/T、M=A/C、I=イノシン）。
この縮重プライマーを使用して、実施例１において調製したゲノムＤＮＡと、ExTaqポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社製）とを、添付のマニュアルに従い反応させ、約700bpの増幅断片を検出した（図１）。そして、前記増幅断片を解析し、その内部500bpの配列を特定した（配列番号３）。
種々の糸状菌ポリケチド合成酵素に保存されているアミノ酸配列より増幅用縮重プライマーとして 下記プライマーをデザインし、合成した：
ＬＣ１ ： ＧＡＹＣＣＩＭＧＩＴＴＹＴＴＹＡＡＹＡＴＧ（配列番号１）
ＬＣ２ｃ： ＧＴＩＣＣＩＧＴＩＣＣＲＴＧＣＡＴＹＴＣ（配列番号２）
（ただし、R=A/G、Y=C/T、M=A/C、I=イノシン）。
この縮重プライマーを使用して、実施例１において調製したゲノムＤＮＡと、ExTaqポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社製）とを、添付のマニュアルに従い反応させ、約700bpの増幅断片を検出した（図１）。そして、前記増幅断片を解析し、その内部500bpの配列を特定した（配列番号３）。
実施例３：ゲノムＤＮＡの大量シークエンスとアミノ酸配列相同性検索
実施例１において得られたペニシリウム コピロビウムPF1169株のゲノムＤＮＡを大量シークエンスと、アミノ酸配列の相同性検索とに供した。具体的にはゲノムＤＮＡ 50μgの一部を前処理の後、Roche社４５４FLX ＤＮＡシークエンサーに供し、約250bp、10.3万本のフラグメント配列（総計49Mbの配列）を取得した。
実施例１において得られたペニシリウム コピロビウムPF1169株のゲノムＤＮＡを大量シークエンスと、アミノ酸配列の相同性検索とに供した。具体的にはゲノムＤＮＡ 50μgの一部を前処理の後、Roche社４５４FLX ＤＮＡシークエンサーに供し、約250bp、10.3万本のフラグメント配列（総計49Mbの配列）を取得した。
この配列に対し、ポリケチド合成酵素およびプレニルトランスフェラーゼで既知である配列として、下記の五種の配列（ポリケチド合成酵素：Aspergillus(A.) fumigatus PKS 2146a.a.およびPenicillium(P.) griseofluvum 6-methylsalycilic acid synthase 1744a.a.、プレニルトランスフェラーゼ：Aspergillus (A.) fumigatus Prenyltransferase、Aspergillus(A.) fumigatus Prenyltransferase（4-hydroxybezoate octaprenyltransferase）、およびPenicillium(P.) marneffei Prenyltransferase由来の配列）を選定し、相同配列検索ソフトblastxによる検索を実施した。それぞれ８９本、８６本、２本、１本、および３本の相同配列を取得した（表２参照）。さらに、A. fumigatus PKS 2146a.a.およびP. griseofluvum 6-methylsalycilic acid synthase 1744a.a.の相同配列から、それぞれ１９本、２３本のコンティグ配列を取得した（A. fumigatus PKS 2146a.a.のコンティグ配列：配列番号１７９〜１９７、P. griseofluvum 6-methylsalycilic acid synthase 1744a.a.のコンティグ配列：配列番号１９８〜２２０）（表２参照）。
実施例４：ゲノムＤＮＡからのPCR増幅
実施例３において取得したblastxの検索結果より、ポリケチド合成酵素に対して、配列番号２２７〜２５２に示す１３種のプライマー対を合成した。同様に、プレニルトランスフェラーゼに対して、配列番号２５３〜２６２に示す５種のプライマー対を合成した。これらのプライマーを用いて、ゲノムＤＮＡに対するPCRを行ったところ、全プライマー対について期待される大きさの増幅断片を認めた（図１および図２参照）。
実施例３において取得したblastxの検索結果より、ポリケチド合成酵素に対して、配列番号２２７〜２５２に示す１３種のプライマー対を合成した。同様に、プレニルトランスフェラーゼに対して、配列番号２５３〜２６２に示す５種のプライマー対を合成した。これらのプライマーを用いて、ゲノムＤＮＡに対するPCRを行ったところ、全プライマー対について期待される大きさの増幅断片を認めた（図１および図２参照）。
実施例５：ファージゲノムライブラリーの作製
ペニシリウム コピロビウムPF1169株のλファージゲノムライブラリーを、λBlueSTAR Xho I Half-site Arms Kit ( タカラバイオ株式会社製 Cat. No. 69242-3)を用いて、添付のマニュアルに従い、構築した。すなわち、ゲノムＤＮＡを、制限酵素Sau3A1を用いて部分分解し、約20kbのＤＮＡ断片0.5μgをキットに添付されたλBlueSTAR ＤＮＡ0.5μgに連結した。このライゲーション溶液をLambda INN Packaging kit(株式会社ニッポンジーン製)を用い、キットに添付のマニュアルに基づいてin vitroパッケージングを行い、1mlの溶液を取得した。このパッケージングされたファージ溶液１０μlを大腸菌ER1647株100μlに感染させ、プラーク形成培地において、37℃で、一晩培養後、約500クローンのプラークを得た。このように感染により10〜20kbのペニシリウム コピロビウムPF1169株のゲノム ＤＮＡ が導入されたファージ約50000クローンからなるゲノムライブラリーを作製した。
ペニシリウム コピロビウムPF1169株のλファージゲノムライブラリーを、λBlueSTAR Xho I Half-site Arms Kit ( タカラバイオ株式会社製 Cat. No. 69242-3)を用いて、添付のマニュアルに従い、構築した。すなわち、ゲノムＤＮＡを、制限酵素Sau3A1を用いて部分分解し、約20kbのＤＮＡ断片0.5μgをキットに添付されたλBlueSTAR ＤＮＡ0.5μgに連結した。このライゲーション溶液をLambda INN Packaging kit(株式会社ニッポンジーン製)を用い、キットに添付のマニュアルに基づいてin vitroパッケージングを行い、1mlの溶液を取得した。このパッケージングされたファージ溶液１０μlを大腸菌ER1647株100μlに感染させ、プラーク形成培地において、37℃で、一晩培養後、約500クローンのプラークを得た。このように感染により10〜20kbのペニシリウム コピロビウムPF1169株のゲノム ＤＮＡ が導入されたファージ約50000クローンからなるゲノムライブラリーを作製した。
実施例６：ファージライブラリーからのスクリーニング
実施例５において調製したファージライブラリー10000クローンに対して、上記で調製したLC1−LC2cプライマー対により増幅させたPCR産物をプローブとして、プラークハイブリダイゼーションによる１次スクリーニングを行った。プローブの標識と検出にはAlkPhos Direct Labelling and Detection System with CDP-Star（GEヘルスケア株式会社製 Cat. No. RPN3690）を用いた。前記ハイブリダイゼーションは、添付のマニュアルに従い、実施した。
実施例５において調製したファージライブラリー10000クローンに対して、上記で調製したLC1−LC2cプライマー対により増幅させたPCR産物をプローブとして、プラークハイブリダイゼーションによる１次スクリーニングを行った。プローブの標識と検出にはAlkPhos Direct Labelling and Detection System with CDP-Star（GEヘルスケア株式会社製 Cat. No. RPN3690）を用いた。前記ハイブリダイゼーションは、添付のマニュアルに従い、実施した。
１次スクリーニングにより、６クローンが候補として残った。さらに、プラークハイブリダイゼーションによる２次スクリーニングの結果、４クローンを取得した。これらの陽性クローンは大腸菌BM25.8株に感染させ、添付のマニュアルに従いファージをプラスミドに変換させ、目的領域を含む４種のプラスミドを取得した。
実施例７：フォスミドゲノムライブラリーの作製
ペニシリウム コピロビウムPF1169株のゲノムライブラリーは、CopyControl Fosmid Library Production Kit（EPICENTRE社製、Cat. No.CCFOS110）を、添付のマニュアルに従い、構築した。すなわち、約40 kbのゲノムＤＮＡ0.25μgのＤＮＡ断片を末端の平滑化を行った後、フォスミドベクターpCCFOS（Epicentre社製）に組み込んだ。このライゲーション溶液を同キット添付のMaxPlaxLambda Packaging Extractを用い、キットに添付のマニュアルに基づいて、in vitroパッケージングを行った。このパッケージングされたウィルス溶液10μlを大腸菌EPI300TM-T1R株100μlに感染させ、クロラムフェニコール含有培地において、37℃で、一晩培養し選抜したところ、300クローンのコロニーを得た。このように感染により40kbのペニシリウム コピロビウムPF1169株のゲノムＤＮＡ が導入されたフォスミド約30000クローンを取得した。1wellあたり約50クローンとなるように96wellプレートに分注し、つまり、９６のプール、約4800クローンからなるゲノムライブラリーを作製した。
ペニシリウム コピロビウムPF1169株のゲノムライブラリーは、CopyControl Fosmid Library Production Kit（EPICENTRE社製、Cat. No.CCFOS110）を、添付のマニュアルに従い、構築した。すなわち、約40 kbのゲノムＤＮＡ0.25μgのＤＮＡ断片を末端の平滑化を行った後、フォスミドベクターpCCFOS（Epicentre社製）に組み込んだ。このライゲーション溶液を同キット添付のMaxPlaxLambda Packaging Extractを用い、キットに添付のマニュアルに基づいて、in vitroパッケージングを行った。このパッケージングされたウィルス溶液10μlを大腸菌EPI300TM-T1R株100μlに感染させ、クロラムフェニコール含有培地において、37℃で、一晩培養し選抜したところ、300クローンのコロニーを得た。このように感染により40kbのペニシリウム コピロビウムPF1169株のゲノムＤＮＡ が導入されたフォスミド約30000クローンを取得した。1wellあたり約50クローンとなるように96wellプレートに分注し、つまり、９６のプール、約4800クローンからなるゲノムライブラリーを作製した。
実施例８：フォスミドライブラリースクリーニング
フォスミド添付のマニュアルに従い、実施例７において作成したライブラリーの９６プールより各プラスミドＤＮＡを調製した。実施例２で合成したポリケチド合成酵素増幅用縮重プライマーを用いて、この９６プールのプラスミドＤＮＡサンプルに対して、PCRを行った。その結果、約700bpのＤＮＡ断片が、９プールより増幅した。さらにこのポジティブプールから、約３００クローン以上のコロニーを含むシャーレを作製し、コロニーハイブリダイゼーションにより再スクリーニングした。その結果、LC1-LC2cプライマー対を用いて、約4800クローンより９種のフォスミドを取得した。
フォスミド添付のマニュアルに従い、実施例７において作成したライブラリーの９６プールより各プラスミドＤＮＡを調製した。実施例２で合成したポリケチド合成酵素増幅用縮重プライマーを用いて、この９６プールのプラスミドＤＮＡサンプルに対して、PCRを行った。その結果、約700bpのＤＮＡ断片が、９プールより増幅した。さらにこのポジティブプールから、約３００クローン以上のコロニーを含むシャーレを作製し、コロニーハイブリダイゼーションにより再スクリーニングした。その結果、LC1-LC2cプライマー対を用いて、約4800クローンより９種のフォスミドを取得した。
実施例９：ゲノムＤＮＡの大量シークエンスとアミノ酸配列相同性検索
実施例１において得られたペニシリウム コピロビウムPF1169株のゲノムＤＮＡを大量シークエンスと、アミノ酸配列の相同性検索とに供した。具体的にはゲノムＤＮＡ 50μgの一部を前処理の後、Roche社４５４FLX ＤＮＡシークエンサーに供し、平均コンティグ長19.621kb、1405本のフラグメント配列（総塩基長27.568160Mbの配列）を取得した。
この配列に対し、ポリケチド合成酵素およびプレニルトランスフェラーゼで既知である配列として、下記の五種の配列（ポリケチド合成酵素： Penicillium(P.) griseofluvum 6-methylsalycilic acid synthase 1744a.a.(P22367) およびAspergillus(A.) fumigatus PKS 2146a.a.(Q4WZA8)、プレニルトランスフェラーゼ：Penicillium(P.) marneffei Prenyltransferase(Q0MRO8)、Aspergillus(A.) fumigatus Prenyltransferase(Q4WBI5)、およびAspergillus(A.) fumigatus Prenyltransferase（4-hydroxybezoate octaprenyltransferase）(Q4WLD0)由来の配列)を選定し、相同配列検索ソフトblastxによる検索を実施した。それぞれ２２本(P22367)、２１本(Q4WZA8)、２本(Q0MRO8)、３本(Q4WBI5)、および３本(Q4WLD0)の相同配列を取得した。
実施例１において得られたペニシリウム コピロビウムPF1169株のゲノムＤＮＡを大量シークエンスと、アミノ酸配列の相同性検索とに供した。具体的にはゲノムＤＮＡ 50μgの一部を前処理の後、Roche社４５４FLX ＤＮＡシークエンサーに供し、平均コンティグ長19.621kb、1405本のフラグメント配列（総塩基長27.568160Mbの配列）を取得した。
この配列に対し、ポリケチド合成酵素およびプレニルトランスフェラーゼで既知である配列として、下記の五種の配列（ポリケチド合成酵素： Penicillium(P.) griseofluvum 6-methylsalycilic acid synthase 1744a.a.(P22367) およびAspergillus(A.) fumigatus PKS 2146a.a.(Q4WZA8)、プレニルトランスフェラーゼ：Penicillium(P.) marneffei Prenyltransferase(Q0MRO8)、Aspergillus(A.) fumigatus Prenyltransferase(Q4WBI5)、およびAspergillus(A.) fumigatus Prenyltransferase（4-hydroxybezoate octaprenyltransferase）(Q4WLD0)由来の配列)を選定し、相同配列検索ソフトblastxによる検索を実施した。それぞれ２２本(P22367)、２１本(Q4WZA8)、２本(Q0MRO8)、３本(Q4WBI5)、および３本(Q4WLD0)の相同配列を取得した。
実施例１０：フォスミドライブラリースクリーニングおよびクラスター遺伝子の配列解析 フォスミドキット（EPICENTRE社製 CopyControl Fosmid Library Production Kit）に添付されているマニュアルに従い、実施例７において作成したライブラリーの９６プールより各プラスミドDNAを調製した。Roche社４５４FLX ＤＮＡシークエンサーにより決定された塩基配列に基づいてアミノ酸配列の相同性検索を行い、ポリケチド合成酵素とプレニルトランスフェラーゼが近接する領域を検索した。得られた領域のプレニルトランスフェラーゼ塩基配列より400bpのDNA断片を増幅しうるプライマー対（No.27）を合成した。このプライマーを用いて、この４８プールのプラスミドDNAサンプルに対して、PCRを行った。その結果期待される約400bpのDNA断片（配列番号２６３）が、１１プールより増幅した（図３参照）。さらに、このポジティブプールのうち６プールから、約３００クローン以上のコロニーを含むシャーレを作製し、コロニーハイブリダイゼーションにより再スクリーニングした。その結果、27F + 27Rのプライマー対（27Fプライマー：配列番号２６４）、27Rプライマー：配列番号２６５））を用いて、約4800クローンより４種のフォスミドを取得した。この内の一つをpCC1-PP1と命名し、挿入断片の全配列を決定した（配列番号２６６））。
得られたpCC1-PP1により大腸菌Escherichia coli EPI300TM-T1R株（フォスミドキットに付属）を形質転換することにより大腸菌Escherichia coli EPI300TM-T1R株／pCC1-PP1（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１３３）を得た。
なお、前記配列番号２６６の配列とCoA ligase、LovB-like polyketide synthase(PKS)、水酸化酵素であるCytochrome P450 monooxygenase、Cyclase、FAD-dependent monooxygenase(FMO)、UbiA-like prenyltransferase(UbiAPT)、アセチル化酵素であるAcetyltransferase(AT)、Acetyltransferase-2(AT-2)、およびCation transporting ATPase（上記酵素は、いずれもAspergillus fumigatus Af293株由来）との、相同性検索をそれぞれ行ったところ、いずれも７０％以上の高い相同性を示した。
配列番号２６６のヌクレオチド３３４２−５１５８は、CoA ligaseをコードし、その対応するポリペプチドは、配列番号２６７に記載したアミノ酸配列で示され、配列番号２６６のヌクレオチド５３８２−１２７７７は、LovB-like polyketide synthase(PKS)をコードし、対応するポリペプチドは、配列番号２６８に記載したアミノ酸配列で示され、配列番号２６６のヌクレオチド１３２６６−１５１４４（以下、このポリヌクレオチド配列（P450-1）によりコードされるタンパク質をCytochrome P450 monooxygenase（１）とする）および１６２２０−１８０１８（以下、このポリヌクレオチド配列（P450-2）によりコードされるタンパク質をCytochrome P450 monooxygenase（２）とする）は、Cytochrome P450 monooxygenaseをコードし、対応するポリペプチドは、それぞれ、配列番号２６９、２７０に記載したアミノ酸配列で示され、配列番号２６６のヌクレオチド１８５０６−１９２９６は、Cyclaseをコードし、対応するポリペプチドは、配列番号２７１に記載したアミノ酸配列で示され、配列番号２６６のヌクレオチド１９７７９−２１３８９は、FAD-dependent monooxygenase(FMO)をコードし、対応するポリペプチドは、配列番号２７２に記載したアミノ酸配列で示され、配列番号２６６のヌクレオチド２１７９３−２２８７７は、UbiA-like prenyltransferase(UbiAPT)をコードし、対応するポリペプチドは、配列番号２７３に記載したアミノ酸配列で示され、配列番号２６６のヌクレオチド２３２０５−２４７７３は、Acetyltransferase(AT)をコードし、対応するポリペプチドは、配列番号２７４に記載したアミノ酸配列で示され、配列番号２６６のヌクレオチド２５８２４−２７１７８は、Acetyltransferase-2(AT-2)をコードし、対応するポリペプチドは、配列番号２７５に記載したアミノ酸配列で示され、配列番号２６６のヌクレオチド２７７９８−３１８５５は、Cation transporting ATPaseをコードし、対応するポリペプチドは、配列番号２７６に記載したアミノ酸配列で示された。
得られたpCC1-PP1により大腸菌Escherichia coli EPI300TM-T1R株（フォスミドキットに付属）を形質転換することにより大腸菌Escherichia coli EPI300TM-T1R株／pCC1-PP1（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１３３）を得た。
なお、前記配列番号２６６の配列とCoA ligase、LovB-like polyketide synthase(PKS)、水酸化酵素であるCytochrome P450 monooxygenase、Cyclase、FAD-dependent monooxygenase(FMO)、UbiA-like prenyltransferase(UbiAPT)、アセチル化酵素であるAcetyltransferase(AT)、Acetyltransferase-2(AT-2)、およびCation transporting ATPase（上記酵素は、いずれもAspergillus fumigatus Af293株由来）との、相同性検索をそれぞれ行ったところ、いずれも７０％以上の高い相同性を示した。
配列番号２６６のヌクレオチド３３４２−５１５８は、CoA ligaseをコードし、その対応するポリペプチドは、配列番号２６７に記載したアミノ酸配列で示され、配列番号２６６のヌクレオチド５３８２−１２７７７は、LovB-like polyketide synthase(PKS)をコードし、対応するポリペプチドは、配列番号２６８に記載したアミノ酸配列で示され、配列番号２６６のヌクレオチド１３２６６−１５１４４（以下、このポリヌクレオチド配列（P450-1）によりコードされるタンパク質をCytochrome P450 monooxygenase（１）とする）および１６２２０−１８０１８（以下、このポリヌクレオチド配列（P450-2）によりコードされるタンパク質をCytochrome P450 monooxygenase（２）とする）は、Cytochrome P450 monooxygenaseをコードし、対応するポリペプチドは、それぞれ、配列番号２６９、２７０に記載したアミノ酸配列で示され、配列番号２６６のヌクレオチド１８５０６−１９２９６は、Cyclaseをコードし、対応するポリペプチドは、配列番号２７１に記載したアミノ酸配列で示され、配列番号２６６のヌクレオチド１９７７９−２１３８９は、FAD-dependent monooxygenase(FMO)をコードし、対応するポリペプチドは、配列番号２７２に記載したアミノ酸配列で示され、配列番号２６６のヌクレオチド２１７９３−２２８７７は、UbiA-like prenyltransferase(UbiAPT)をコードし、対応するポリペプチドは、配列番号２７３に記載したアミノ酸配列で示され、配列番号２６６のヌクレオチド２３２０５−２４７７３は、Acetyltransferase(AT)をコードし、対応するポリペプチドは、配列番号２７４に記載したアミノ酸配列で示され、配列番号２６６のヌクレオチド２５８２４−２７１７８は、Acetyltransferase-2(AT-2)をコードし、対応するポリペプチドは、配列番号２７５に記載したアミノ酸配列で示され、配列番号２６６のヌクレオチド２７７９８−３１８５５は、Cation transporting ATPaseをコードし、対応するポリペプチドは、配列番号２７６に記載したアミノ酸配列で示された。
実施例１１：ゲノムＤＮＡライブラリーの作成
カビの形質転換が可能なコスミドベクターpMFCOS1を以下のようにして構築した。プラスミドpMKD01（特許第3593134号公報）よりカビの形質転換用マーカー遺伝子であるデストマイシン耐性遺伝子を含む約3.0kbのXbaI断片を調製し、T4ポリメラーゼを使用して末端を平滑化した。この断片を制限酵素SmaIおよびStuIで二重消化した市販のコスミドベクターSuperCos1（ストラタジーン社）と連結してコスミドベクターpMFCOS1を構築した。
カビの形質転換が可能なコスミドベクターpMFCOS1を以下のようにして構築した。プラスミドpMKD01（特許第3593134号公報）よりカビの形質転換用マーカー遺伝子であるデストマイシン耐性遺伝子を含む約3.0kbのXbaI断片を調製し、T4ポリメラーゼを使用して末端を平滑化した。この断片を制限酵素SmaIおよびStuIで二重消化した市販のコスミドベクターSuperCos1（ストラタジーン社）と連結してコスミドベクターpMFCOS1を構築した。
次に、ピリピロペンＡ生産菌であるペニシリウム コピロビウム PF1169株（公開技報2008-500997号（特許文献４））を液体培地（３％グリセリン、０．８％ニュートリエントブロス、０．３％麦芽エキス、０．２％酵母エキス、０．１％グルタミン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）に植菌し、２６℃、４８時間培養した。培養終了後、遠心により菌体を集め、これらの菌体より染色体ＤＮＡを調製した。染色体ＤＮＡを制限酵素Sau3AIで部分消化した後、アルカリフォスファターゼ処理を行い、ＤＮＡ末端を脱リン酸化した。このＤＮＡ断片を、予め制限酵素XbaIで消化しアルカリフォスファターゼ処理によって脱リン酸化した後、更に制限酵素BamHIで消化したコスミドベクターpMFCOS1に連結し、組換えコスミドベクターを作製した。この組換えコスミドベクターについて、エピセンター社製のMAXPLAXラムダパッケージングエキストラクトを用いてインビトロパッケージし、大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ ＭＲＡに感染させることによりゲノムＤＮＡライブラリーを作製した。
実施例１２：ゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニング
実施例１で作製したゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして、ピリピロペンＡ生合成遺伝子の一つであるcytochrome P450遺伝子を使用することとし、以下に示すようにＰＣＲによって調製した。
実施例１で作製したゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして、ピリピロペンＡ生合成遺伝子の一つであるcytochrome P450遺伝子を使用することとし、以下に示すようにＰＣＲによって調製した。
実施例１に示したゲノムＤＮＡを鋳型とし、5’-ATGATCGAGCTCAAAGATGC-3’ （配列番号２７７）と5’-CTTCTTTCCAGTCAATACCT-3’（配列番号２７８）のオリゴＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼとしてPrime STAR HS DNA polymerase（タカラバイオ株式会社）を使用し、ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００を用いて行った。反応液は、ゲノムＤＮＡを０．５μｌ（０．５μｇ相当量）、酵素に添付の２倍濃度反応用緩衝液を２５μｌ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ溶液を４μｌ、１００ｐｍｏｌ／μｌの濃度に調整した上記プライマーを各０．５μｌずつ、酵素を０．５μｌ、滅菌水を１９μｌ加えて５０μｌとした。反応は、９４℃、５分間の前処理後、９８℃で１０秒間、５０℃で５秒間、７２℃で２分間のインキュベーションを２５サイクル行った。反応終了後、反応液の一部をアガロースゲル電気泳動に供した結果、約１．８ｋｂｐのＤＮＡ断片が特異的に増幅されている事が確認された。そこで、残りの反応液をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で抽出し、エタノール沈殿を行った。沈殿物を滅菌水に再溶解し、アガロースゲル電気泳動を行い、約１．８ｋｂｐのバンドを定法に従って切り出してＤＮＡ断片を回収した。
上記ＤＮＡ断片をプローブにし、ＥＣＬダイレクトＤＮＡ／ＲＮＡラベリング・検出システム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を使用してコロニーハイブリダイゼーションを行い、約５０００個のコロニーをスクリーニングした。複数個の陽性クローンが得られ、このうちの１クローンよりプラスミドｐＰＹＲＩ０２を単離した。また、このプラスミドｐＰＹＲＩ０２の挿入断片末端の塩基配列を解析した結果、配列番号２６６の１〜２５０００およびその上流域を含むことが確認された。
実施例１３：形質転換体の造出
ピリピロペン生産菌であるペニシリウム コピロビウム PF1169株を液体培地（３％グリセリン、０．８％ニュートリエントブロス、０．３％麦芽エキス、０．２％酵母エキス、０．１％グルタミン酸ナトリウム、２．０％グリシン、ｐＨ７．０）に植菌し、２６℃、２４時間培養した後、遠心により菌体を集めた。得られた菌体を１．０Ｍ ＫＣｌで洗浄し、０．４５μｍのフィルターで濾過したプロトプラスト化酵素溶液（３ｍｇ／ｍＬ β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ、１ｍｇ／ｍＬ Ｃｈｉｔｉｎａｓｅ、３ｍｇ／ｍＬ Ｌｙｓｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ、１．０Ｍ ＫＣｌ）１０ｍＬに懸濁した。３０℃で６０〜９０分間振盪し、菌糸をプロトプラスト化させた。この懸濁液を濾過した後、遠心してプロトプラストを回収し、ＳＵＴＣ緩衝液（０．５ｍｏｌ／Ｌシュークロース、１０ｍＭ 塩化カルシウム、１０ｍＭ トリス塩酸［ｐＨ７．５］）で洗浄した。
ピリピロペン生産菌であるペニシリウム コピロビウム PF1169株を液体培地（３％グリセリン、０．８％ニュートリエントブロス、０．３％麦芽エキス、０．２％酵母エキス、０．１％グルタミン酸ナトリウム、２．０％グリシン、ｐＨ７．０）に植菌し、２６℃、２４時間培養した後、遠心により菌体を集めた。得られた菌体を１．０Ｍ ＫＣｌで洗浄し、０．４５μｍのフィルターで濾過したプロトプラスト化酵素溶液（３ｍｇ／ｍＬ β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ、１ｍｇ／ｍＬ Ｃｈｉｔｉｎａｓｅ、３ｍｇ／ｍＬ Ｌｙｓｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ、１．０Ｍ ＫＣｌ）１０ｍＬに懸濁した。３０℃で６０〜９０分間振盪し、菌糸をプロトプラスト化させた。この懸濁液を濾過した後、遠心してプロトプラストを回収し、ＳＵＴＣ緩衝液（０．５ｍｏｌ／Ｌシュークロース、１０ｍＭ 塩化カルシウム、１０ｍＭ トリス塩酸［ｐＨ７．５］）で洗浄した。
調製したプロトプラストを１ｍＬのＳＵＴＣ緩衝液に懸濁し、この１００μＬに対し１０μｇのｐＰＹＲＩ０２ＤＮＡ溶液（２０μＬ）を加え、氷中に５分間静置した。次に、４００μＬのＰＥＧ溶液（６０％ ＰＥＧ４０００、１０ｍＭ 塩化カルシウム、１０ｍＭ トリス塩酸[ｐＨ７．５]）を加え混合し、氷中に２０分間静置した後、１０ｍＬのＳＵＴＣ緩衝液を加え、遠心しプロトプラスト化した菌体を回収した。得られた菌体を１ｍＬのＳＵＴＣ緩衝液に懸濁した後、４０００ｒｐｍで５分間遠心して、最終的に１００μＬのＳＵＴＣ緩衝液に懸濁した。
以上の処理を加えた菌体を、２００μｇ／ｍＬハイグロマイシンＢ、１．０Ｍ シュークロース含ポテトデキストロースアガー上に、軟１．０Ｍ シュークロース含ポテトデキストロースアガー培地とともに重層し、２６℃、４日間培養後、形成したコロニーを形質転換体とした。
実施例１４：形質転換体の培養、および培養液中のピリピロペンの定量
形質転換体の培養には、種培地として２．０％でんぷん（スターチ）、１．０％ぶどう糖（グルコース）、０．５％ポリペプトン、０．６％小麦胚芽、０．３％酵母エキス、０．２％大豆粕および炭酸カルシウム０．２％の組成からなる培地(殺菌前ｐＨ７．０)を用いた。また、生産培地としては、１０．０％グルコース、１．３％脱脂大豆、０．３％グルタミン酸ナトリウム、０．８％小麦胚芽、０．１２５％塩化ナトリウム、０．１５％炭酸カルシウム、０．２％ニコチンアミドの組成からなる培地（殺菌前ｐＨ７．０）を用いた。
形質転換体の培養には、種培地として２．０％でんぷん（スターチ）、１．０％ぶどう糖（グルコース）、０．５％ポリペプトン、０．６％小麦胚芽、０．３％酵母エキス、０．２％大豆粕および炭酸カルシウム０．２％の組成からなる培地(殺菌前ｐＨ７．０)を用いた。また、生産培地としては、１０．０％グルコース、１．３％脱脂大豆、０．３％グルタミン酸ナトリウム、０．８％小麦胚芽、０．１２５％塩化ナトリウム、０．１５％炭酸カルシウム、０．２％ニコチンアミドの組成からなる培地（殺菌前ｐＨ７．０）を用いた。
前記の種培地４０ｍｌを分注した２５０ｍｌ容三角フラスコを１２２℃で２０分間殺菌し、これに実施例１３に記載した形質転換体を1白金耳の菌を植菌後、２６℃で３日間振盪培養した。次いで、生産培地２０ｍｌを分注した２５０ｍｌ容三角フラスコを１２２℃で２０分間殺菌し、これに上記種培養液０．５ｍｌを無菌的に移植し、２６℃で８日間振盪培養した。得られた培養液０．５ｍｌにメタノール９.５ｍｌを添加しピリピロペンを抽出、濾過すると抽出液が得られた。このうち１０μｌをＨＰＬＣ分析に供した。ＨＰＬＣ分析は、ＨＰＬＣシステムＬＣ−２０１０Ｃ（島津製作所）を用いて分析した。分析条件は、カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３ ４．６ Ｘ ２５０ｍｍ、移動相：アセトニトリル：水＝６０：４０、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度：４０℃、ＵＶ波長：３２０ｎｍとした。得られたパターンをピリピロペン標準品と比較し、ピリピロペンに由来するピークを特定し、その面積からピリピロペンの定量を行った。尚、定量を行ったピリピロペン類縁体は、本菌において産生されているピリピロペンＡ、Ｅ、Ｏとした。
同時に形質転換体の親株であるペニシリウム コピロビウム PF1169株についても、同様に培養および培養液中のピリピロペンの定量を行った。
その結果、下表３に示したとおり、形質転換体のピリピロペン生産性は、親株の約２．６倍に向上し、全長のピリピロペン生合成遺伝子クラスターを含まないｐＰＹＲＩ０２により形質転換させた形質転換体であっても、ピリピロペン生産性が向上することが明らかとなった。
実施例１５：アグロバクテリウム ツメファシエンスを用いたペニシリウム コピロビウムの形質転換
1/2CMMY寒天培地でペニシリウム コピロビウムPF1169株を28℃で3日間培養し、分生糸をかきとり回収した。滅菌ミラクロス（Carbiochem社製、Cat, No. 475855）で濾過して胞子を取得し、IM液体培地(1.74 g/L K2HPO4、1.36 g/L KH2PO4、0.14 g/L NaCl、0.49 g/L MgSO4・7H2O、0.10 g/L CaCl2・2H2O、100 μL/L 9 ｍM FeSO4、0.53 g/l (NH4)2SO2、1.8 g/L グルコース、8.53 g/L MES (2-Morpholinoethanesulfonic acid)、5 mL/L グリセリン、pH 5.3)で103 /mlに希釈し、これをペニシリウム コピロビウム胞子懸濁液とした。
1/2CMMY寒天培地でペニシリウム コピロビウムPF1169株を28℃で3日間培養し、分生糸をかきとり回収した。滅菌ミラクロス（Carbiochem社製、Cat, No. 475855）で濾過して胞子を取得し、IM液体培地(1.74 g/L K2HPO4、1.36 g/L KH2PO4、0.14 g/L NaCl、0.49 g/L MgSO4・7H2O、0.10 g/L CaCl2・2H2O、100 μL/L 9 ｍM FeSO4、0.53 g/l (NH4)2SO2、1.8 g/L グルコース、8.53 g/L MES (2-Morpholinoethanesulfonic acid)、5 mL/L グリセリン、pH 5.3)で103 /mlに希釈し、これをペニシリウム コピロビウム胞子懸濁液とした。
図４に示すpBI-AnGPD-EGFP (独立行政法人理化学研究所)を導入したアグロバクテリウム ツメファシエンスEHA105株を50 ppmのカナマイシン(Km)を含むIM液体培地に植菌し、28℃で１晩培養した。これを660nmの透過光の吸収が0.3 〜 0.45になるように50 ppmのKmを含むIM液体培地で希釈し、終濃度が500 μMとなるようにアセトシリンゴン(AS)を添加し、さらに28°Cで6時間培養し、これをアグロバクテリウム培養液とした。50 ppmのKmおよび500 μMのASを含むco-cultivation寒天培地(1.74 g/L K2HPO4、1.36 g/L KH2PO4、0.14 g/L NaCl、0.49 g/L MgSO4・7H2O、0.10 g/L CaCl2・2H2O、100 μL/L 9 ｍM FeSO4、0.53 g/l (NH4)2SO2、0.9 g/L グルコース、8.53 g/L MES (2-Morpholinoethanesulfonic acid)、5 mL/L グリセリン、15 g/L Agar、pH 5.3)にhybond-N+ (GEヘルスサイエンス社製、直径82 mm、Cat. No. RPN82B)を敷き、上記の方法で得られた100 μLのペニシリウム コピロビウム胞子懸濁液と、100 μLのアグロバクテリウム培養液とを混合し、hybond-N+上に均一に広げた。これを、25℃で2日間共存培養した後、50 ppmのハイグロマイシンおよび25 ppmのメロペネム(住友製薬社製)を含むMM寒天培地(1.74 g/L K2HPO4、1.36 g/L KH2PO4、0.14 g/L NaCl、0.49 g/L MgSO4・7H2O、0.10 g/L CaCl2・2H2O、100 μL/L 9 ｍM FeSO4、0.53 g/l (NH4)2SO2、1.8 g/L グルコース、15 g/L Agar)に移し4日間選択培養した。得られたコロニーを25 ppmのハイグロマイシンおよび25 ppmのメロペネムを含む1/2CMMY寒天培地に移し、生育した形質転換体を取得した。取得したハイグロマイシン耐性コロニーとGFP蛍光観察結果を図５Ａに示したとおり、得られたハイグロマイシン耐性コロニーのほとんどから蛍光を検出した。一方、図５Ｂに示したとおり、対照としたアグロバクテリウムを感染させていないペニシリウム コピロビウムPF1169株からは蛍光を検出しなかった。また、ハイグロマイシン耐性コロニーのゲノムPCR実験により、ハイグロマイシン耐性遺伝子およびGFP遺伝子の導入も確認した(データ省略)。
実施例１６：ゲノムDNAライブラリーのスクリーニング２
実施例１２で得たｐＰＹＲＩ０２の挿入断片末端の塩基配列は、配列番号２６６の１〜２５０００およびその上流域を含む配列である。さらにピリピロペン生合成遺伝子クラスターの下流部分を加えた全長のピリピロペン生合成遺伝子クラスターを得るために、別途クローニングした生合成遺伝子クラスターの下流部分と、上記ｐＰＹＲＩ０２の挿入断片と連結させることにより、全長の生合成遺伝子クラスターを構築することとした。
実施例１２で得たｐＰＹＲＩ０２の挿入断片末端の塩基配列は、配列番号２６６の１〜２５０００およびその上流域を含む配列である。さらにピリピロペン生合成遺伝子クラスターの下流部分を加えた全長のピリピロペン生合成遺伝子クラスターを得るために、別途クローニングした生合成遺伝子クラスターの下流部分と、上記ｐＰＹＲＩ０２の挿入断片と連結させることにより、全長の生合成遺伝子クラスターを構築することとした。
全長の生合成遺伝子クラスターの構築方法としては、実施例１１で作製したゲノムDNA ライブラリーより、ｐＰＹＲＩ０２には含まれていないピリピロペンＡ生合成遺伝子であるO-acetyltransferase遺伝子をプローブとして、本クラスターの下流部分をクローニングした。
実施例１１に示したゲノムDNAを鋳型とし、プローブとして使用するDNA 断片を増幅する際のプライマーとして5'-ATGGATTCCCTATTGACGAG-3’（配列番号２７９）及び5’-TTAAATCTCCCCACCAACCG-3’（配列番号２８０）を用いた以外は、実施例１２の場合と同様の条件で実施した。
本DNA 断片をプローブとして、ECL ダイレクトDNA／RNA ラベリング・検出システムを使用してコロニーハイブリダイゼーションを行い、約5000 個のコロニーをスクリーニングした。複数個の陽性クローンが得られ、このうちの１クローンよりプラスミドｐＰＹＲＩ０３を単離した。本クローンに対するPCR解析の結果、生合成遺伝子クラスターの下流域は充分有しており、上流部については、Cytochrome P450 monooxygenaseまでは有していること、またAdenylate forming enzyme(CoA ligase)は含まれていないことを確認した。
実施例１２で得たｐＰＹＲＩ０２の挿入断片と、前記ｐＰＹＲＩ０３の挿入断片を用い、生合成遺伝子クラスター全長を有するコスミドを構築することとした。それぞれのコスミドの塩基配列の解析よりクラスター上に有する制限酵素部位が明らかにでき、生合成遺伝子クラスターの上流領域としてpPYRI02のBsiWI断片（約20.2kb）を、下流領域としてpPYRI03のBsiWI〜AflII断片（約4.9kb）を連結することにより、全長の生合成遺伝子クラスーが構築できることが明らかとなった。
そこでまず、放線菌の接合伝達用プラスミドpSET152［ビアマン（Bierman，M．）ら著，「ジーン（Gene）」，（蘭国），1992年，第116巻，p．43−49］をSphI 消化し、T4 DNA ポリメラーゼで平滑化した後、HindIII リンカー（5’-CCCAAGCTTGGG-3’（配列番号２８１）、宝酒造株式会社製）を連結してプラスミドpSET153 を構築した。pSET153のマルチクローニングサイトをHindIII−NotI−BsiWIAflII−NotI−EcoRI に変更するため、合成オリゴヌクレオチドHin-Not-Bsi-Afl-Not-Eco-1（5’-AGCTTGCGGCCGCGTACGCTTAAGGCGGCCGCG-3’）（配列番号２８２）およびHin-Not-Bsi-Afl-Not-Eco-2（5’-AATTCGCGGCCGCCTTAAGCGTACGCGGCCGCA-3’）（配列番号２８３）をアニールした後、HindIII 及びEcoRI で二重消化したpSET153 と連結してプラスミドpSET201 を構築した。pSET201 のBsiWI−AflII 部位に、pPYRI03 由来の約4.9kb のBsiWI−AflII 断片を挿入してプラスミドpPYRI05 を得た。pPYRI05 のBsiWI 部位に、pPYRI02由来の約20.2kb のBsiWI 断片を挿入し、BsiWI 断片が天然の生合成遺伝子クラスターと同向きに挿入されたクローンを選抜し、プラスミドpPYRI06 を得た。pPYRI06 は生合成遺伝子クラスター全長を含むプラスミドであるが、カビの形質転換マーカーを有していないことから、挿入断片のコスミドベクターpMFCOS1 への繋ぎ換えを行った。即ち、pPYRI02由来の約8.5kb のコスミドベクター部分のNotI 断片と、pPYRI06 由来の約25.1kb のNotI断片を連結してコスミドpPYRI07（翻訳領域：配列番号２８４、非翻訳領域：配列番号２８５）を得た。pPYRI07 は生合成遺伝子クラスター全長を含むとともにカビの形質転換マーカー遺伝子も有するコスミドである。
pPYRI07 の挿入断片末端の塩基配列を解析した結果、配列番号２６６の２４４６〜２７５０５およびその上流にベクター部分の塩基配列を含んでおり、全長のピリピロペン生合成遺伝子クラスターを含むことが確認された。
実施例１２で得たｐＰＹＲＩ０２の挿入断片と、前記ｐＰＹＲＩ０３の挿入断片を用い、生合成遺伝子クラスター全長を有するコスミドを構築することとした。それぞれのコスミドの塩基配列の解析よりクラスター上に有する制限酵素部位が明らかにでき、生合成遺伝子クラスターの上流領域としてpPYRI02のBsiWI断片（約20.2kb）を、下流領域としてpPYRI03のBsiWI〜AflII断片（約4.9kb）を連結することにより、全長の生合成遺伝子クラスーが構築できることが明らかとなった。
そこでまず、放線菌の接合伝達用プラスミドpSET152［ビアマン（Bierman，M．）ら著，「ジーン（Gene）」，（蘭国），1992年，第116巻，p．43−49］をSphI 消化し、T4 DNA ポリメラーゼで平滑化した後、HindIII リンカー（5’-CCCAAGCTTGGG-3’（配列番号２８１）、宝酒造株式会社製）を連結してプラスミドpSET153 を構築した。pSET153のマルチクローニングサイトをHindIII−NotI−BsiWIAflII−NotI−EcoRI に変更するため、合成オリゴヌクレオチドHin-Not-Bsi-Afl-Not-Eco-1（5’-AGCTTGCGGCCGCGTACGCTTAAGGCGGCCGCG-3’）（配列番号２８２）およびHin-Not-Bsi-Afl-Not-Eco-2（5’-AATTCGCGGCCGCCTTAAGCGTACGCGGCCGCA-3’）（配列番号２８３）をアニールした後、HindIII 及びEcoRI で二重消化したpSET153 と連結してプラスミドpSET201 を構築した。pSET201 のBsiWI−AflII 部位に、pPYRI03 由来の約4.9kb のBsiWI−AflII 断片を挿入してプラスミドpPYRI05 を得た。pPYRI05 のBsiWI 部位に、pPYRI02由来の約20.2kb のBsiWI 断片を挿入し、BsiWI 断片が天然の生合成遺伝子クラスターと同向きに挿入されたクローンを選抜し、プラスミドpPYRI06 を得た。pPYRI06 は生合成遺伝子クラスター全長を含むプラスミドであるが、カビの形質転換マーカーを有していないことから、挿入断片のコスミドベクターpMFCOS1 への繋ぎ換えを行った。即ち、pPYRI02由来の約8.5kb のコスミドベクター部分のNotI 断片と、pPYRI06 由来の約25.1kb のNotI断片を連結してコスミドpPYRI07（翻訳領域：配列番号２８４、非翻訳領域：配列番号２８５）を得た。pPYRI07 は生合成遺伝子クラスター全長を含むとともにカビの形質転換マーカー遺伝子も有するコスミドである。
pPYRI07 の挿入断片末端の塩基配列を解析した結果、配列番号２６６の２４４６〜２７５０５およびその上流にベクター部分の塩基配列を含んでおり、全長のピリピロペン生合成遺伝子クラスターを含むことが確認された。
実施例１７：pPYRI07を用いた形質転換体の造出
実施例１６で得たpPYRI07を用いた以外は、実施例１３の場合と同様の条件で形質転換体の造出を行った。
実施例１６で得たpPYRI07を用いた以外は、実施例１３の場合と同様の条件で形質転換体の造出を行った。
実施例１８：形質転換体の培養および培養液中のピリピロペンの定量
実施例１７で得られ形質転換体の培養および培養液中のピリピロペンの定量方法は、実施例１４で示した方法にて行った。定量を行ったピリピロペン類縁体は、本菌において産生されているピリピロペンＡ、Ｅ、Ｏとした。また同時に形質転換体の親株であるペニシリウム コピロビウム PF1169株についても、同様に培養及び培養液中のピリピロペンの定量を行った。
その結果、下表４に示したとおり、形質転換体のピリピロペン生産性は、親株の３．６倍に向上していた。以上の結果から、全長のピリピロペン生合成遺伝子クラスターの導入により、ペニシリウム コピロビウム PF1169株の生産性が向上することが示された。
実施例１７で得られ形質転換体の培養および培養液中のピリピロペンの定量方法は、実施例１４で示した方法にて行った。定量を行ったピリピロペン類縁体は、本菌において産生されているピリピロペンＡ、Ｅ、Ｏとした。また同時に形質転換体の親株であるペニシリウム コピロビウム PF1169株についても、同様に培養及び培養液中のピリピロペンの定量を行った。
その結果、下表４に示したとおり、形質転換体のピリピロペン生産性は、親株の３．６倍に向上していた。以上の結果から、全長のピリピロペン生合成遺伝子クラスターの導入により、ペニシリウム コピロビウム PF1169株の生産性が向上することが示された。
実施例１９：ペニシリウム コピロビウムを用いた形質転換体の造出
ペニシリウム コピロビウム PF1169株以外のペニシリウム コピロビウムにおいても全長のピリピロペン生合成遺伝子クラスターを導入により、その生産性が向上することを確認するために、ペニシリウム コピロビウムＡＴＣＣ５８６１５株（Studies in Mycology(2004), 49 p84-85参照）について形質転換を行った。
ペニシリウム コピロビウム PF1169株以外のペニシリウム コピロビウムにおいても全長のピリピロペン生合成遺伝子クラスターを導入により、その生産性が向上することを確認するために、ペニシリウム コピロビウムＡＴＣＣ５８６１５株（Studies in Mycology(2004), 49 p84-85参照）について形質転換を行った。
方法は、実施例１６で得たpPYRI07を用いた以外は、実施例１３に示した方法と同様の方法にて形質転換体の造出を行った。
実施例２０：形質転換体の培養および培養液中のピリピロペンの定量
実施例１９で得られ形質転換体の培養および培養液中のピリピロペンの定量方法は、培養時間が４日間であることを除き、実施例１４で示した方法にて行った。定量を行ったピリピロペン類縁体は、本菌において産生されているピリピロペンＡ、Ｅ、Ｏとした。また同時に形質転換体の親株であるペニシリウム コピロビウムＡＴＣＣ５８６１５株についても、同様に培養および培養液中のピリピロペンの定量を行った。
その結果、下表５に示したとおり、形質転換体のピリピロペン生産性は、親株の２．５倍に向上していた。以上の結果から、全長のピリピロペン生合成遺伝子クラスターの導入により、PF1169株以外のペニシリウム コピロビウムについても、その生産性が向上することが示された。また、ペニシリウム コピロビウムPF1169株の方が、ペニシリウム コピロビウムＡＴＣＣ５８６１５株に比べ、生産性がより向上するが明らかとなった。
実施例１９で得られ形質転換体の培養および培養液中のピリピロペンの定量方法は、培養時間が４日間であることを除き、実施例１４で示した方法にて行った。定量を行ったピリピロペン類縁体は、本菌において産生されているピリピロペンＡ、Ｅ、Ｏとした。また同時に形質転換体の親株であるペニシリウム コピロビウムＡＴＣＣ５８６１５株についても、同様に培養および培養液中のピリピロペンの定量を行った。
その結果、下表５に示したとおり、形質転換体のピリピロペン生産性は、親株の２．５倍に向上していた。以上の結果から、全長のピリピロペン生合成遺伝子クラスターの導入により、PF1169株以外のペニシリウム コピロビウムについても、その生産性が向上することが示された。また、ペニシリウム コピロビウムPF1169株の方が、ペニシリウム コピロビウムＡＴＣＣ５８６１５株に比べ、生産性がより向上するが明らかとなった。
ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１３３
ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２０３
ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３１６
ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２０３
ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３１６
Claims (13)
- ピリピロペン生合成遺伝子群と、マーカー遺伝子とを含む核酸構築物であって、該ピリピロペン生合成遺伝子群が、下記の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）に記載されたヌクレオチド配列から選択された少なくとも１個のヌクレオチド配列を含んでなる、核酸構築物：
（Ｉ）配列番号２６６における２９１１番から２７７９７番までのヌクレオチド配列、
（ＩＩ）配列番号２６６における１番から２５０００番までのヌクレオチド配列、および
（ＩＩＩ）配列番号２６６における２４４６番から２７５０５番までのヌクレオチド配列。 - 前記ピリピロペン生合成遺伝子群が、目的遺伝子と、発現調節領域とを含んでなる、請求項１に記載の核酸構築物。
- 前記マーカー遺伝子が、薬剤耐性遺伝子または栄養要求性遺伝子である、請求項１または２に記載の核酸構築物。
- 前記マーカー遺伝子が、デストマイシン耐性遺伝子またはハイグロマイシン耐性遺伝子である、請求項１または２に記載の核酸構築物。
- 請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸構築物を、宿主に導入することにより得られる、形質転換体。
- ピリピロペン生合成遺伝子群を含む核酸構築物と、マーカー遺伝子を含む核酸構築物とを、同時にまたは別々に、宿主に導入することにより得られる、形質転換体であって、
ここで、該ピリピロペン生合成遺伝子群が、下記の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）に記載されたヌクレオチド配列から選択された少なくとも１個のヌクレオチド配列を含んでなる、形質転換体：
（Ｉ）配列番号２６６における２９１１番から２７７９７番までのヌクレオチド配列、
（ＩＩ）配列番号２６６における１番から２５０００番までのヌクレオチド配列、および
（ＩＩＩ）配列番号２６６における２４４６番から２７５０５番までのヌクレオチド配列。 - プラスミドｐＰＹＲＩ０２またはコスミドｐＰＹＲＩ０７を宿主に導入することにより得られる、請求項５に記載の形質転換体。
- 前記宿主がピロピロペンを生産する糸状菌である、請求項５〜７のいずれか一項に記載の形質転換体。
- 前記ピリピロペンを生産する糸状菌が、ペニシリウム属、ユーペニシリウム属、またはアスペルギルス属である、請求項８に記載の形質転換体。
- 前記ピリピロペンを生産する糸状菌が、ペニシリウム コピロビウム、ペニシリウム グリセオフルバム、ユーペニシリウム レティキュロスポラム、またはアスペルギルス フミガタスである、請求項８に記載の形質転換体。
- 前記ピリピロペンを生産する糸状菌がペニシリウム コピロビウムである、請求項８に記載の形質転換体。
- 前記ピリピロペンを生産する糸状菌がペニシリウム コピロビウムＰＦ１１６９株またはペニシリウム コピロビウムＡＴＣＣ５８６１５株である、請求項８に記載の形質転換体。
- 請求項５〜１２のいずれか一項に記載の形質転換体を培養し、培養物からピリピロペンを採取することを含んでなる、ピリピロペンの製造法。
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