TWI541024B - 反義核酸 - Google Patents

Description

反義核酸

本發明係關於可使人類肌萎縮蛋白(dystrophin)基因之第53號外顯子跳讀之反義寡聚物及含有該寡聚物之醫藥組成物。

裘馨氏肌肉萎縮症(Duchenne muscular dystrophy，簡稱DMD，亦稱為杜顯型肌肉營養不良症)，出生男子約3,500人中就有1人發病，為發病頻率最高的遺傳性進行性肌肉萎縮症。該症雖然在乳幼兒期呈現與正常人幾乎無差異之運動功能，然而從4至5歲左右出現肌力降低。隨後肌力持續降低，至12歲左右變得不能走路，20歲時因心臟衰竭或呼吸器官衰竭而至死亡，為嚴重的疾病。現在尚無對DMD之有效治療方法，因而強烈地企求新治療藥物之開發。

已知DMD之原因為肌萎縮蛋白基因之變異。肌萎縮蛋白基因存在於X染色體，為由220萬個鹼基對之DNA所構成之巨大基因。從DNA轉錄為mRNA前驅體，再藉由剪接(splicing)除去內含子(intron)，合成由79個外顯子結合而成之mRNA。從該mRNA轉譯為3,685個胺基酸，生成肌萎縮蛋白質。肌萎縮蛋白質與肌肉細胞之膜安定性之維持有關，為使肌肉細胞不易被破壞所必需。由於DMD患者之肌萎縮蛋白基因有變異，在肌肉細胞中具有功能之肌萎縮蛋白質幾乎不表現。因此，在DMD患者之體內，變得無法維持肌肉細胞之構造，大量鈣離子流入肌肉細胞內。結果，產生類似炎症之反應，由於進行纖維化，使肌肉細胞再生變得困難。

貝克型肌肉萎縮症(Becker muscular dystrophy)(BMD)之原因雖亦為肌萎縮蛋白基因之變異，然而就其症狀而言，肌肉萎縮所造成之肌力降低一般比DMD輕微，肌力降低之進行亦較遲緩，多數病例係於成人期發病。DMD與BMD之臨床症狀不同，研判係因肌萎縮蛋白之mRNA被轉譯成肌萎縮蛋白質時，胺基酸讀取模板由於變異而被破壞，或者該胺基酸讀取模板仍被維持而造成(非專利文獻1)。亦即，就DMD而言，胺基酸讀取模板由於具有移碼變異，因此具有功能之肌萎縮蛋白質幾乎不會表現，然而就BMD而言，雖然變異造成外顯子之一部分缺失，然而胺基酸讀取模板仍被維持，因此產生雖不完全但仍具有功能之肌萎縮蛋白質。

就DMD之治療法而言，外顯子跳讀法(exon skipping)受到期待。此方法為藉由改變剪接(splicing)而修復肌萎縮蛋白之mRNA之胺基酸讀取模板，誘導部分回復功能之肌萎縮蛋白質之表現之方法(非專利文獻2)。為外顯子跳讀法對象之胺基酸序列部分變成缺失。因此，藉由此治療所表現之肌萎縮蛋白質雖比正常者短，但由於維持胺基酸讀取模板，所以部分地保有安定化肌細胞之功能。因此，藉由外顯子跳讀法，可期待DMD呈現與較輕症之BMD同樣之症狀。外顯子跳讀法已經過小鼠與狗之動物實驗，現正進行對於人類DMD患者之臨床試驗。

外顯子跳讀可藉由與以5’或3’剪接部位之任一者或兩者、或者以外顯子之內部為標的之反義核酸結合來誘導。在某些情況，外顯子係包含於二側剪接部位只由剪接複合體(簡稱為剪接體(spliceosome))辨識之mRNA中。藉由反義核酸標定(targeting)該等剪接部位，可誘導外顯子跳讀。又，為了使外顯子被剪接機構辨識，SR蛋白質必須與外顯子剪接增強子(exon splicing enhancer，簡稱ESE)結合；藉由標定ESE，亦可誘導外顯子之跳讀。

由於肌萎縮蛋白基因之變異隨DMD患者而異，所以反義核酸必須視基因變異之情況或種類來選擇。迄今為止，西澳洲大學之Steve Wilton等對於全部79個外顯子已製作出誘導外顯子跳讀之反義核酸(非專利文獻3)；荷蘭之Annemieke Aartsma-Rus等對於39種外顯子已製作出誘導外顯子跳讀之反義核酸(非專利文獻4)。

全部DMD患者之8%左右可藉由跳讀第53號外顯子(以下稱為「外顯子53」)而治療。近年，有關以跳讀肌萎縮蛋白基因之外顯子53為目標之研究，已有多個研究機關提出報告(專利文獻1至4；非專利文獻5)。然而，高效率跳讀外顯子53之技術迄今尚未確立。

專利文獻1：國際公開公報WO 2006/000057

專利文獻2：國際公開公報WO 2004/048570

專利文獻3：美國專利公開公報US 2010/0168212

專利文獻4：國際公開公報WO 2010/048586

非專利文獻1：Monaco A.P. et al.,Genomics 1988;2: p. 90-95

非專利文獻2：Matsuo M.,Brain Dev 1996;18: p. 167-172

非專利文獻3：Wilton S.D.,et al.,Molecular Therapy 2007: 15: p. 1288-96

非專利文獻4：Annemieke Aartsma-Rus et al.,(2002) Neuromuscular Disorders 12: S71-S77

非專利文獻5：Linda J. Popplewell et al.,(2010) Neuromuscular Disorders vol. 20,no. 2,p. 102-10

[發明之揭示]

在如上述之狀況中，期望強力誘導肌萎縮蛋白基因之外顯子53跳讀之反義寡聚物，及含有該寡聚物之肌萎縮治療藥。

本發明人等，詳細地研究肌萎縮蛋白基因之構造之結果，發現藉由將從肌萎縮蛋白基因之mRNA前驅體(以下稱為「前體-mRNA(pre-mRNA)」中之外顯子53之5’末端至第32至56號週邊之核苷酸所構成之序列以反義寡聚物標定，可高效率地誘導外顯子53之跳讀。本發明人等基於此種見解，於是完成本發明。

亦即，本發明如以下所述。

[1]一種反義寡聚物，其為可使人類肌萎縮蛋白基因之第53號外顯子跳讀之反義寡聚物，係由與下述序列之任一者互補之鹼基序列所構成：從人類肌萎縮蛋白基因之第53號外顯子之5’末端開始算起，第31至53號、第31至54號、第31至55號、第31至56號、第31至57號、第31至58號、第32至53號、第32至54號、第32至55號、第32至56號、第32至57號、第32至58號、第33至53號、第33至54號、第33至55號、第33至56號、第33至57號、第33至58號、第34至53號、第34至54號、第34至55號、第34至56號、第34至57號、第34至58號、第35至53號、第35至54號、第35至55號、第35至56號、第35至57號、第35至58號、第36至53號、第36至54號、第36至55號、第36至56號、第36至57號或第36至58號之核苷酸所構成之序列。

[2]如上述[1]記載之反義寡聚物，其係寡核苷酸。

[3]如上述[1]記載之反義寡聚物，其中構成上述寡核苷酸之至少1個核苷酸之糖部分及/或磷酸鍵結部分經過修飾。

[4]如上述[3]記載之反義寡聚物，其中構成上述寡核苷酸之至少1個核苷酸之糖部分為核糖，且該核糖之2’位之-OH基係被選自OR、R、R’OR、SH、SR、NH₂、NHR、NR₂、N₃、CN、F、Cl、Br及I所構成之群中之任一基置換(上述R表示烷基或芳基，上述R’表示伸烷基)。

[5]如上述[3]或[4]記載之反義寡聚物，其中構成上述寡核苷酸之至少1個核苷酸之磷酸鍵結部分為選自硫代磷酸酯(phosphorothioate)鍵結、二硫代磷酸酯(phosphorodithioate)鍵結、烷基膦酸酯鍵結、胺基磷酸酯(phosphoroamidate)鍵結、及硼烷基磷酸酯(boranophosphate)鍵結所構成之群中之任一者。

[6]如上述[1]記載之反義寡聚物，其為嗎啉寡聚物(morpholino oligomer)。

[7]如上述[6]記載之反義寡聚物，其為二胺基磷酸基嗎啉寡聚物(phosphodiamidate morpholino oligomer)。

[8]如上述[1]至[7]項之任一項記載之反義寡聚物，其中5’末端為具下列化學式(1)至(3)之任一者之基。

[9]如上述[1]至[8]項之任一項記載之反義寡聚物，其係由與下述序列互補之鹼基序列所構成：從人類肌萎縮蛋白基因第53號之外顯子之5’末端開始算起第32至56號、或第36至56號之核苷酸所構成之序列。

[10]如上述[1]至[8]項之任一項記載之反義寡聚物，其係由選自序列編號2至37所構成之群中之任一鹼基序列所構成。

[11]如上述[1]至[8]項之任一項記載之反義寡聚物，其係由選自序列編號11、17、23、29及35所構成之群中之任一鹼基序列所構成。

[12]如上述[1]至[8]項之任一項記載之反義寡聚物，其係由序列編號11或35之任一鹼基序列所構成。

[13]一種肌萎縮治療用醫藥組成物，其係以上述[1]至[12]項之任一項記載之反義寡聚物、其醫藥上可容許之鹽或水合物做為有效成分。

藉由本發明之反義寡聚物，可高效率地誘導人類肌萎縮蛋白基因之外顯子53之跳讀。又，藉由投予本發明之醫藥組成物，可有效地減輕裘馨氏肌肉萎縮症之症狀。

以下，詳細地說明本發明。以下之實施態樣為說明本發明之範例，不過本發明之目的並非限於此等實施態樣。本發明，只要在不脫離其要點之範圍內，可以各種態樣實施。

再者，本說明書中所引用之所有文獻、以及公開公報、專利公報及其他專利文獻均被納入本說明書中做為參考。又，本說明書包含於2010年9月1日提出申請，做為本申請案優先權主張基礎之日本專利申請案(特願2010-196032號)之說明書及圖式所記載之內容。

1.　反義寡聚物

本發明提供一種反義寡聚物(以下稱為「本發明之寡聚物」)，其為可使人類肌萎縮蛋白基因之第53號外顯子跳讀之反義寡聚物，其係由與下述序列之任一者互補之鹼基序列所構成：從人類肌萎縮蛋白基因之第53號外顯子之5’末端開始算起，第31至53號、第31至54號、第31至55號、第31至56號、第31至57號、第31至58號、第32至53號、第32至54號、第32至55號、第32至56號、第32至57號、第32至58號、第33至53號、第33至54號、第33至55號、第33至56號、第33至57號、第33至58號、第34至53號、第34至54號、第34至55號、第34至56號、第34至57號、第34至58號、第35至53號、第35至54號、第35至55號、第35至56號、第35至57號、第35至58號、第36至53號、第36至54號、第36至55號、第36至56號、第36至57號或第36至58號之核苷酸所構成之序列(以下亦稱為「標的序列」)。

[人類肌萎縮蛋白基因第53號之外顯子]

本說明書中，「基因」係除基因組(genome)基因以外，亦包含cDNA、mRNA前驅體及mRNA。基因係以mRNA前驅體，亦即前體-mRNA為較佳。

人類基因組中，人類肌萎縮蛋白基因存在於基因座Xp21.2。人類肌萎縮蛋白基因具有3.0Mbp之大小，就已知之人類基因而言，為最大之基因。但是，人類肌萎縮蛋白基因之編碼區域，僅不過14kb，該編碼區域以79個外顯子分散於人類肌萎縮蛋白基因內(Roberts,RG.,et al.,Genomics,16: 536-538(1993))。為人類肌萎縮蛋白基因之轉錄物之前體-mRNA經剪接(splicing)後，生成14kb之成熟mRNA。人類之野生型肌萎縮蛋白基因之鹼基序列為公知(基因銀行登錄編號：NM_004006)。

人類之野生型肌萎縮蛋白基因之外顯子53之鹼基序列如序列編號1所示。

本發明之寡聚物，係以「藉由人類肌萎縮蛋白基因之外顯子53之跳讀，而將由DMD型肌萎縮蛋白基因所編碼之蛋白質改變為BMD型肌萎縮蛋白質」為目的而製作者。因此，成為本發明寡聚物之外顯子所跳讀對象之肌萎縮蛋白基因之外顯子53，不僅可為野生型，亦包含變異型。

變異型人類肌萎縮蛋白基因之外顯子53，具體而言為下述(a)或(b)所記載之聚核苷酸。

(a)可與下述特定聚核苷酸於嚴苛條件下雜交(hybridization)之聚核苷酸，該特定聚核苷酸為由與序列編號1之鹼基序列互補之鹼基序列所構成之聚核苷酸。

(b)由與序列編號1之鹼基序列具有90%相同性之鹼基序列所構成之聚核苷酸。

本說明書中，「聚核苷酸」意指DNA或RNA。

本說明書中，「於嚴苛條件下雜交之聚核苷酸」意指例如將由與序列編號1之鹼基序列互補之鹼基序列所構成之聚核苷酸之全部或一部分做為探針(probe)，藉由使用菌落雜交法(colony hybridization)、噬菌斑雜交法(plaque hybridization)、南方氏雜交法(Southern hybridization)等方法所得到之聚核苷酸。就雜交之方法而言，可利用例如“Sambrook and Russell,Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3,Cold Spring Habor,Laboratory Press 2001”，及“Ausubel,CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,1987-1997”等所記載之方法。

本說明書中「互補之鹼基序列」並不限定於與作為對象之鹼基序列形成瓦特森-克里克對(Watson-Crick pair)之鹼基序列，亦包含形成不穩定鹼基對(Wobble base pair)之鹼基序列。該瓦特森-克里克對意指在腺嘌呤-胸腺嘧啶、腺嘌呤-尿嘧啶、腺嘌呤-胞嘧啶之間形成氫鍵之鹼基對，不穩定鹼基對意指在鳥嘌呤-尿嘧啶、肌苷(inosine)-尿嘧啶、肌苷-腺嘌呤及肌苷-胞嘧啶之間形成氫鍵之鹼基對。又，「互補之鹼基序列」與對象鹼基序列亦可不具有100%互補性，例如可含有1至3個、1至2個、或1個與對象之鹼基序列不互補之鹼基。

本說明書中，「嚴苛條件」可為低度嚴苛條件、中度嚴苛條件及高度嚴苛條件之任一種。「低度嚴苛條件」為例如5×SSC，5×鄧哈特溶液(Denhardt’s solution)，0.5% SDS，50%甲醯胺，32℃之條件。又，「中度嚴苛條件」為例如5×SSC，5×鄧哈特溶液，0.5% SDS，50%甲醯胺，42℃；或5×SSC，1% SDS，50mM Tris-HCl(pH7.5)，50%甲醯胺，42℃之條件。「高度嚴苛條件」為例如5×SSC，5×鄧哈特溶液，0.5% SDS，50%甲醯胺，50℃；或者0.2×SSC，0.1% SDS，65℃之條件。於此等條件，將溫度升得越高，可期待越有效率地得到具有相同性之聚核苷酸。不過，就影響雜交之嚴苛性之要素而言，溫度、探針濃度、探針長度、離子強度、時間、鹽濃度等複數個要素皆在考慮之列，本項技術人士可適當地選擇此等要素而實現同樣之嚴苛性。

再者，於雜交時使用市售套組之情況，可使用例如Alkphos Direct Labelling and Detection System(GE Healthcare)。此時，依照隨附於套組之操作程序(protocol)，與經標識之探針一起培育一晚後，將膜於55℃之條件下用含有0.1%(w/v)SDS之一次洗淨緩衝液洗淨後，可檢測出經雜交之聚核苷酸。或者，根據與序列編號1之鹼基序列互補之鹼基序列之全部或一部分製作探針時，使用市售之試藥(例如，PCR Labeling Mix(Roche Diagnostics公司)等)將該探針以洋地黃毒苷(digoxigenin)(DIG)標記時，使用DIG核酸檢測套組(Roche Diagnostics公司)即可檢測出雜交。

就上述可雜交之聚核酸苷以外之聚核酸苷而言，藉由類似性檢索軟體BLAST，並使用系統內定參數(default parameter)計算時，可列舉出與序列編號1之聚核苷酸具有90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上、或99.9%以上相同性之聚核苷酸。

再者，鹼基序列之相同性可使用Karlin-Altschul之演算法BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268,1990;Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873,1993)來決定。根據BLAST之演算法開發出被稱為BLASTN、BLASTX之程式(Altschul SF,et al: J Mol Biol 215: 403,1990)。使用BLASTN解析鹼基序列時，參數為例如：計分(score)=100，字長(wordlength)=12。使用BLAST及Gapped BLAST程式時，使用各程式之系統內定參數。

與下述序列互補之鹼基序列之實例示於下表：從外顯子53之5’末端開始算起，第31至53號、第31至54號、第31至55號、第31至56號、第31至57號、第31至58號、第32至53號、第32至54號、第32至55號、第32至56號、第32至57號、第32至58號、第33至53號、第33至54號、第33至55號、第33至56號、第33至57號、第33至58號、第34至53號、第34至54號、第34至55號、第34至56號、第34至57號、第34至58號、第35至53號、第35至54號、第35至55號、第35至56號、第35至57號、第35至58號、第36至53號、第36至54號、第36至55號、第36至56號、第36至57號及第36至58號核苷酸所構成之序列。

本發明之寡聚物較佳係由與下述序列之任一者互補之鹼基序列(例如，序列編號11、序列編號17、序列編號23、序列編號29、序列編號35)所構成：從人類肌萎縮蛋白基因之第53號外顯子之5’末端算起第32至56號、第33至56號、第34至56號、第35至56號或第36至56號之核苷酸所構成之序列。

本發明之寡聚物更佳係由與下述序列之任一者互補之鹼基序列(例如序列編號11或序列編號35)所構成：從人類肌萎縮蛋白基因之第53號外顯子之5’末端算起，第32至56號或第36至56號之核苷酸所構成之序列。

「可使人類肌萎縮蛋白基因之第53號外顯子跳讀」意指藉由本發明之寡聚物結合在相當於人類肌萎縮蛋白基因轉錄物(例如前體-mRNA)之外顯子53部位上，當該轉錄物接受剪接時，例如在缺失外顯子52之DMD患者之情況，相當於外顯子54之5’末端之鹼基序列將連結於相當於外顯子51之3’末端之鹼基序列之3’側，形成未發生密碼子(codon)移碼(frameshift)之成熟mRNA。

因此，本發明之寡聚物，在可使人類肌萎縮蛋白基因之第53號外顯子跳讀之範圍內，亦可不具有與標定序列100%互補之鹼基序列。例如，本發明之寡聚物可含有1至3個、1至2個、或1個與標定序列非互補之鹼基。

其中，上述「結合」意指將本發明之寡聚物與人類肌萎縮蛋白基因之轉錄物混合時，在生理條件下兩者會雜交，形成雙鏈。上述「生理條件下」意指被調節成與身體內類似之pH、鹽組成、溫度之條件。例如，25至40℃(以37℃為較佳)，pH5至8(以pH7.4為較佳)，氯化鈉濃度為150mM之條件。

人類肌萎縮蛋白基因之外顯子53之跳讀發生與否，可藉由將本發明之寡聚物導入肌萎縮蛋白表現細胞(例如，人類橫紋肌肉瘤細胞)，然後從上述肌萎縮蛋白表現細胞之全部RNA，令人類肌萎縮蛋白基因之mRNA之外顯子53之周邊區域進行RT-PCR增幅，再對該PCR增幅產物進行巢式PCR(nested PCR)或序列解析而確認。

關於跳讀效率，可將人類肌萎縮蛋白基因之mRNA從被檢測細胞回收，測定該mRNA中外顯子53經跳讀帶(band)之聚核苷酸量[A]，及外顯子53未跳讀帶之聚核苷酸量[B]，根據此等[A]及[B]之測定值，依照下述公式計算。

跳讀效率(%)=A/(A+B)×100

就本發明之寡聚物而言，可為例如具有18至28個鹼基長度之：聚核苷酸、嗎啉寡聚物、或肽核酸(Peptide Nucleic Acid：PNA)寡聚物。其中以21至25個鹼基之長度為較佳，以嗎啉寡聚物為更佳。

上述寡核苷酸(以下稱為「本發明之寡核苷酸」)係以核苷酸做為構成單元之本發明寡聚物，該核苷酸可為核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸、或修飾核苷酸。

修飾核苷酸意指構成核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸之核酸鹼基、糖部分及磷酸鍵結部分之全部或一部份經過修飾者。

就核酸鹼基而言，可列舉例如腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤(hypoxanthine)、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶或此等之修飾鹼基。就該修飾鹼基而言，可列舉例如假尿嘧啶(pseudouracil)、3-甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、5-烷基胞嘧啶(例如5-甲基胞嘧啶)、5-烷基尿嘧啶(例如5-乙基尿嘧啶)、5-鹵素尿嘧啶(例如5-溴尿嘧啶)、6-氮雜嘧啶、6-烷基嘧啶(例如6-甲基尿嘧啶)、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、4-乙醯基胞嘧啶、5-(羧基羥基甲基)尿嘧啶、5’-羧基甲基胺基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧基甲基胺基甲基尿嘧啶、1-甲基腺嘌呤、1-甲基次黃嘌呤、2,2-二甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5一甲氧基胺基甲基-2-硫尿嘧啶、5-甲基胺基甲基尿嘧啶、5-甲基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸、2-硫胞嘧啶、嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、異鳥嘌呤、吲哚、咪唑、黃嘌呤(xanthine)等，然而並不限於此等。

就糖部份之修飾而言，可列舉例如核糖之2’位之修飾及糖之其他部分之修飾。就核糖之2’位之修飾而言，可列舉如將核糖之2’位之-OH基以OR、R、R’OR、SH、SR、NH₂、NHR、NR₂、N₃、CN、F、Cl、Br、I置換之修飾。其中，R表示烷基或芳基，R’表示伸烷基。

就糖之其他部分之修飾而言，可列舉如核糖或去氧核糖之4’位之O置換成S者、將糖之2’位及4’位交聯者、例如LNA(locked nucleic acid(鎖核酸))或ENA(2’-0,4’-C-ethytene-bridged-nucleic acids(2’-O,4’-C-伸乙基-橋接-核酸))等，然而並不限於此等。

就磷酸鍵結部分之修飾而言，可列舉例如將磷酸二酯鍵結置換成硫代磷酸酯鍵結、二硫代磷酸酯鍵結、烷基膦酸酯鍵結、胺基磷酸酯鍵結、及硼烷基磷酸酯鍵結(Enya et a1：Bioorganic & Medicinal Chemistry,2008,18,9154-9160)之修飾(參考例如日本專利再公表公報第2006/129594號及第2006/038608號)。

就烷基而言，以直鏈狀或分枝狀之碳數1至6之烷基為較佳。具體而言，可列舉如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、二級丁基、三級丁基、正戊基、異戊基、新戊基、三級戊基、正己基、異己基。該烷基可經取代，就該取代基而言，可列舉如鹵素、烷氧基、氰基、硝基，此等烷基可經1至3個取代基取代。

就環烷基而言，以碳數5至12之環烷基為較佳。具體而言，可列舉如環戊基、環己基、環庚基、環辛基、環癸基、環十二基。

就鹵素而言，可列舉氟、氯、溴、碘。

就烷氧基而言，以直鏈狀或分枝狀之碳數1至6之烷氧基為較佳，可列舉如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、二級丁氧基、三級丁氧基、正戊氧基、異戊氧基、新戊氧基、三級戊氧基、正己氧基、異己氧基等。尤其，以碳數1至3之烷氧基為特佳。

就芳基而言，以碳數6至10之芳基為較佳。具體而言，可列舉如苯基、α-萘基、β-萘基。尤其以苯基為特佳。該芳基可經取代，就該取代基而言，可列舉如烷基、鹵素、烷氧基、氰基、硝基，此等芳基可經1至3個取代基取代。

就伸烷基而言，以直鏈狀或分枝鏈狀之碳數6至10之伸烷基為較佳。具體而言，可列舉例如亞甲基、伸乙基、三亞甲基、四亞甲基、五亞甲基、六亞甲基、2-(乙基)三亞甲基、1-(甲基)四亞甲基。

就醯基而言，可列舉直鏈狀或分枝鏈狀之烷醯基、或芳醯基(aroyl)。就烷醯基而言，可列舉如甲醯基、乙醯基、2-甲基乙醯基、2,2-二甲基乙醯基、丙醯基、丁醯基、異丁醯基、戊醯基、2,2-二甲基丙醯基、己醯基。就芳醯基而言，可列舉如苯甲醯基、甲基苯甲醯基、萘甲醯基。該芳醯基在可取代之位置可經取代，如可經烷基取代。

本發明之寡核苷酸係以下述通式所示之基做為構成單元之本發明寡聚物為較佳，其中核糖2’位之-OH基被甲氧基置換，磷酸鍵結部分為硫代磷酸酯鍵結。

(式中，Base表示核酸鹼基)。

本發明之寡核苷酸可藉由使用各種自動合成裝置(例如，AKTA oligopilot plus 10/100(GE Healthcare))而容易地合成，或者，亦可委託於第三者機關(例如，Promega公司或Takara公司)等來製作。

本發明之嗎啉寡聚物係以下述通式所示之基做為構成單元之本發明寡聚物。

(式中，Base與上述同義，W表示下述任一式所示之基：

(式中，X表示-CH₂R¹、-O-CH₂R¹、-S-CH₂R¹、-NR²R³或F；R¹表示H、烷基；R²及R²為相同或互異，表示H、烷基、環烷基或芳基；Y₁表示O、S、CH₂或NR¹；Y₂表示O、S或NR¹；Z表示O或S))。

本發明之嗎啉寡聚物較佳為以下述通式所示之基做為構成單元之寡聚物(二胺基磷酸嗎啉寡聚物(以下稱為「PMO」))。

(式中，Base、R²、R³與上述同義)

嗎啉寡聚物可依照國際公開公報第1991/009033號公報、或國際公開公報第2009/064471號公報製造。尤其，PMO可依照國際公開公報第2009/064471號公報記載之方法製造，或依照以下所示之方法製造。

[PMO之製法]

就PMO之一態樣而言，可列舉如下述通式(I)所示之化合物(以下稱為「PMO(I)」)。

[式中，Base、R²、R³與上述同義；n為1至99範圍內之任何整數，而以18至28範圍內之任何整數為較佳]。

PMO(I)可依照公知之方法製造，例如，可藉由實施下述步驟之操作而製造。

下述步驟中所使用之化合物及試藥，只要為PMO之製造中一般所使用者，即無任何特別限定。

又，下述所有步驟，可藉由液相法或固相法(手工操作或使用市售之固相自動合成機)實施。以固相法製造PMO時，從操作順序之簡便化及合成之正確性之觀點而言，以使用自動合成機之方法為較佳。

(1)步驟A：

藉由使酸作用於下述通式(II)所示之化合物(以下稱為化合物(II))，而製造下述通式(III)所示之化合物(以下稱為化合物(III))之步驟。

[式中，n、R²、R³與上述同義；各B^p獨立地表示可經保護之核酸鹼基；T表示三苯甲基(trityl)、單甲氧基三苯甲基、或二甲氧基三苯甲基；L表示氫、醯基、或下述通式(IV)所示之基(以下稱為基(IV))。

就B^P相關之「核酸鹼基」而言，可列舉與Base相同之「核酸鹼基」。但是，B^P相關之核酸鹼基之胺基或羥基可經保護。

就該胺基之保護基而言，只要可做為核酸之保護基使用者即可，並無特別限制，具體而言，可列舉如苯甲醯基、4-甲氧基苯甲醯基、乙醯基、丙醯基、丁醯基、異丁醯基、苯基乙醯基、苯氧基乙醯基、4-三級丁基苯氧基乙醯基、4-異丙基苯氧基乙醯基、(二甲基胺基)亞甲基。就羥基之保護基而言，可列舉例如2-氰基乙基、4-硝基苯乙基、苯磺醯基乙基、甲磺醯基乙基、三甲基矽烷基乙基、在可取代之任何位置經1至5個電子吸引性基取代之苯基、二苯基胺甲醯基、二甲基胺甲醯基、二乙基胺甲醯基、甲基苯基胺甲醯基、1-吡咯啶基胺甲醯基、N-嗎啉基胺甲醯基、4-(三級丁基羧基)苯甲基、4-[(二甲基胺基)羧基]苯甲基、4-(苯基羧基)苯甲基(參照例如國際公開公報第2009/064471號公報)。

就「固相承載體(solid carrier)」而言，雖然只要可使用於核酸之固相反應之承載體即可，並無特別限制，不過期望具有例如下列特性：(i)幾乎不溶解於合成嗎啉核酸衍生物時所使用之試藥(例如二氯甲烷、乙腈、四唑、N-甲基咪唑、吡啶、乙酸酐、光澤汀(lucidin)、三氟乙酸)，(ii)對於合成嗎啉核酸衍生物時所使用之試藥在化學上為安定，(iii)可進行化學修飾，(iv)可裝填期望之嗎啉核酸衍生物，(v)具有耐處理中高壓之充分強度，(vi)分布於一定粒徑範圍。具體而言，可列舉膨潤性聚苯乙烯(例如經1%二(苯甲基)苯交聯之胺基甲基聚苯乙烯樹脂(200至400網孔)(2.4至3.0mmol/g)(東京化成公司製)、胺甲基化聚苯乙烯樹脂鹽酸鹽[二(苯甲基)苯1%，100至200網孔](胜肽研究所公司製))、非膨潤性聚苯乙烯(例如Primer Support(GE Healthcare公司製)、PEG鏈鍵結型聚苯乙烯(例如NH₂-PEG樹脂(渡邊化學公司製)、TentaGel樹脂)、定孔玻璃(controlled pore glass；CPG)(例如CPG公司製)、草醯基化-定孔玻璃(例如參照Alul等，Nucleic Acids Research,Vol. 19,1527(1991))、TentaGel支持體-胺基聚乙二醇衍生物化支持體(例如參照Wright等，Tetrahedron Letters,Vol. 34,3373(1993))、Poros-聚苯乙烯/二乙烯基苯之共聚物。

就「連結基」而言，可使用公知將核酸、嗎啉核酸衍生物連結所通常使用者，可列舉例如3-胺基丙基、琥珀醯基、2,2’-二乙醇磺醯基、長鏈烷基胺基(LCAA)。

本步驟可藉由使酸作用於化合物(II)而實施。

就本步驟中可使用之「酸」而言，可列舉如三氟乙酸、二氯乙酸、或三氯乙酸。就酸之使用量而言，例如相對於化合物(II)1莫耳，以在0.1莫耳當量至1000莫耳當量之範圍內為宜，其中以在1莫耳當量至100莫耳當量之範圍內為較佳。

又，可將有機胺與上述酸一起使用。就有機胺而言，並無特別限定，可列舉如三乙基胺。有機胺之使用量，例如相對於酸1莫耳，以在0.01莫耳當量至10莫耳當量之範圍內為宜，其中以在0.1莫耳當量至2莫耳當量之範圍內為較佳。

本步驟中使用酸與有機胺之鹽或混合物時，可列舉如三氟乙酸與三乙基胺之鹽或混合物，更具體而言，可列舉將2當量三氟乙酸與1當量三乙基胺混合者。

可使用於本步驟中之酸，亦可用適當之溶劑，將其稀釋成在0.1%至30%範圍內之濃度而使用。就溶劑而言，只要不參與反應，即無特別限制，可列舉如二氯甲烷、乙腈、醇類(乙醇、異丙醇、三氟乙醇等)、水或此等之混合物。

上述反應之反應溫度，以例如在10℃至50℃之範圍內為較佳，而以在20℃至40℃之範圍內為更佳，以在25℃至35℃之範圍內又更佳。

反應時間隨所使用之酸之種類、反應溫度而異，通常以在0.1分鐘至24小時之範圍內為宜。其中以在1分鐘至5小時之範圍內為較佳。

又，本步驟終了後，視需要可添加鹼以將存在於反應系中之酸中和。就「鹼」而言，無特別限定，可列舉如二異丙基胺。鹼，亦可用適當之溶劑將其稀釋成0.1%(v/v)至30%(v/v)之範圍內之濃度而使用。

就本步驟中所使用之溶劑而言，只要不參與反應，即無特別限制，可列舉如二氯甲烷、乙腈、醇類(乙醇、異丙醇、三氟乙醇等)、水或此等之混合物。反應溫度以例如在10℃至50℃之範圍內為較佳，以在20℃至40℃之範圍內為更佳，以在25℃至35℃之範圍內又更佳。

反應時間隨所使用之鹼之種類、反應溫度而異，通常以在0.1分鐘至24小時之範圍內為宜。其中以在1分鐘至5小時之範圍內為較佳。

再者，化合物(II)中，n=1且L為基(IV)之下述通式(IIa)所示之化合物(以下稱為化合物(IIa))可依照下述方法製造。

[式中，B^P、T、連結基、固相承載體與上述同義]。

步驟1：

藉由使醯化劑作用於下述通式(V)所示之化合物，而製造下述通式(VI)所示之化合物(以下稱為化合物(VI))之步驟。

[式中，B^P、T、連結基與上述同義；R⁴表示羥基、鹵素、或胺基]。

本步驟可用化合物(V)做為起始原料，並藉由公知之連結基導入反應而實施。

尤其，下述通式(VIa)所示之化合物，可藉由使用化合物(V)及琥珀酸酐進行酯化反應之已知方法來製造。

[式中，B^P、T與上述同義]。

步驟2：

藉由使縮合劑等作用於化合物(VI)，並與固相承載體反應，而製造化合物(IIa)之步驟。

[式中，B^P、T、連結基、固相承載體與上述同義。]

本步驟可藉由使用化合物(VI)及固相承載體進行縮合反應之已知方法來製造。

化合物(II)中，n=2至99且L為基(IV)之下述通式(IIa2)所示之化合物，可藉由以化合物(IIa)做為起始原料，依期望之次數重複實施本說明書所記載之PMO製法中之步驟A及步驟B而製造。

[式中，B^P、R²、R³、T、連結基、固相承載體與上述同義；n’表示1至98]。

又，化合物(II)中，n=1且L為氫之下述通式(IIb)所示之化合物，可藉由例如國際公開公報第1991/009033號所記載之方法製造。

[式中，B^P、T與上述同義]。

化合物(II)中，n=2至99且L為氫之下述通式(IIb2)所示之化合物，可藉由以化合物(IIb)做為起始原料，依期望之次數重複實施本說明書所記載之PMO製法中之步驟A及步驟B而製造。

[式中，B^P、n’、R²、R³、T與上述同義]。

又，化合物(II)中，n=1且L為醯基之下述通式(IIc)所示之化合物，可藉由實施對化合物(IIb)進行醯化反應之已知方法而製造。

[式中，B^P、T與上述同義；R⁵表示醯基]。

化合物(II)中，n=2至99且L為醯基之下述通式(IIc2)所示之化合物，可藉由以化合物(IIc)做為起始原料，依期望之次數重複實施本說明書所記載之PMO製法中之步驟A及步驟B而製造。

[式中，B^P、n’、R²、R³、R⁵、T與上述同義]。

(2)步驟B：

藉由於鹼存在下使嗎啉單體化合物作用於化合物(III)，而製造下述通式(VII)所示之化合物(以下稱為化合物(VII))之步驟。

[式中，各B^p、L、n、R²、R³、T與上述同義。]

本步驟可藉由於鹼存在下使嗎啉單體化合物作用於化合物(III)而實施。

就嗎啉單體化合物而言，可列舉例如下述通式(VIII)所示之化合物。

[式中，B^p、R²、R³、T與上述同義]。

就本步驟中可使用之「鹼」而言，可列舉如二異丙基胺、三乙基胺、或N-乙基嗎啉。就鹼之使用量而言，例如相對於化合物(III)1莫耳，適當者為1莫耳當量至1000莫耳當量之範圍內，其中以10莫耳當量至100莫耳當量之範圍內為較佳。

關於可使用於本步驟中之嗎啉單體化合物及鹼，亦可用適當之溶劑將其稀釋成在0.1%至30%範圍內之濃度而使用。就溶劑而言，只要不參與反應，即無特別限制，可列舉如N,N-二甲基咪唑啶酮、N-甲基哌啶酮、二甲基甲醯胺(DMF)、二氯甲烷、乙腈、四氫呋喃或此等之混合物。

反應溫度，以例如在0℃至100℃之範圍內為較佳，以在10℃至50℃之範圍內為更佳。

反應時間隨所使用之鹼之種類、反應溫度而異，通常以在1分鐘至48小時之範圍內為宜，以在30分鐘至24小時之範圍內為較佳。

再者，本步驟終了後，可視需要添加醯化劑。就「醯化劑」而言，可列舉如乙酸酐、乙醯氯、苯氧基乙酸酐。關於醯化劑，亦可用適當之溶劑將其稀釋成在0.1%至30%範圍內之濃度而使用。就本步驟中所使用之溶劑而言，只要不參與反應，即無特別限制，可列舉如二氯甲烷、乙腈、醇類(乙醇、異丙醇、三氟乙醇等)、水或此等之混合物。

又，視需要亦可將例如吡啶、光澤汀(lucidin)、三甲基吡啶(colidine)、三乙基胺、二異丙基乙基胺、N-乙基嗎啉等鹼與醯化劑一起使用。就醯化劑之使用量而言，以在0.1莫耳當量至10000莫耳當量之範圍內為較佳，以在1莫耳當量至1000莫耳當量之範圍內為更佳。就鹼之使用量而言，例如相對於醯化劑1莫耳，以在0.1莫耳當量至100莫耳當量之範圍內為宜，以在1莫耳當量至10莫耳當量之範圍內為較佳。

本反應之反應溫度，以在10℃至50℃之範圍內為較佳，以在20℃至40℃之範圍內為更佳，以在25℃至35℃之範圍內又更佳。反應時間隨所使用之醯化劑之種類、反應溫度而異，通常以在0.1分鐘至24小時之範圍內為宜，以在1分鐘至5小時之範圍內為較佳。

(3)步驟C：

對於步驟B中所製造之化合物(VII)，使用脫保護劑將保護基脫離，而製造通式(IX)所示之化合物之步驟。

[式中，Base、B^p、L、n、R²、R³、T與上述同義]。

本步驟可藉由使脫保護劑作用於化合物(VII)而實施。

就「脫保護劑」而言，可列舉如濃氨水、甲胺。可使用於本步驟之「脫保護劑」，例如亦可用水、甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、四氫呋喃、DMF、N,N-二甲基咪唑啶酮、N-甲基哌啶酮或此等之混合溶劑稀釋後使用。其中，以乙醇為較佳。就脫保護劑之使用量而言，例如相對於化合物(VII)1莫耳，以在1莫耳當量至100000莫耳當量之範圍內為宜，以在10莫耳當量至1000莫耳當量之範圍內為較佳。

反應溫度，以在15℃至75℃之範圍內為宜，以在40℃至70℃之範圍內為較佳，以在50℃至60℃之範圍內為更佳。脫保護反應時間隨化合物(VII)之種類、反應溫度而異，以在10分鐘至30小時之範圍內為宜，以在30分鐘至24小時之範圍內為較佳，以在5小時至20小時之範圍內為更佳。

(4)步驟D：

藉由使酸作用於步驟C中所製造之化合物(IX)，而製造PMO(I)之步驟。

[式中，Base、n、R²、R³、T與上述同義]。

本步驟可藉由將酸加至化合物(IX)中而實施。

就本步驟中可使用之「酸」而言，可列舉如三氯乙酸、二氯乙酸、乙酸、磷酸及鹽酸等。就酸之使用量而言，例如，宜使用可使溶液之pH成為在0.1至4.0之範圍內，較佳在1.0至3.0之範圍內者。就溶劑而言，只要不參與反應，即無特別限制，可列舉如乙腈、水或此等之混合溶劑。

反應溫度以在10℃至50℃之範圍內為較佳，以在20℃至40℃之範圍內為更佳，以在25℃至35℃之範圍內又更佳。脫保護反應時間隨化合物(IX)之種類、反應溫度而異，以在0.1分鐘至5小時之範圍內為宜，以在1分鐘至1小時之範圍內為較佳，以在1分鐘至30分鐘之範圍內為更佳。

PMO(I)係藉由單獨使用或組合使用通常之分離精製手段而從本步驟所得到之反應混合物中獲得，該通常之分離精製手段例如為萃取、濃縮、中和、過濾、離心、再結晶、C₈至C₁₈之逆相管柱層析法、陽離子交換管柱層析法、陰離子交換管柱層析法、凝膠過濾管柱層析法、高速液體層析法、透析、超過濾(ultrafiltration)等；又，可將期望之PMO(I)單離精製(例如，參照國際公開公報WO1991/09033)。

使用逆相層析法將PMO(I)精製時，可使用例如20mM三乙基胺/乙酸緩衝液與乙腈之混合溶液做為溶出溶劑。

使用離子交換層析法將PMO(I)精製時，可使用例如1M之食鹽水與10mM之氫氧化鈉水溶液之混合溶液。

肽核酸為以下述通式所示之基做為構成單元之本發明之寡聚物：

[式中，Base與上述同義]。

肽核酸可依照例如下述之文獻製造。

1) P.E. Nielsen,M. Egholm,R.H. Berg,O. Buchardt,Science,254,1497(1991)

2) M. Egholm,O. Buchardt,P.E. Nielsen,R.H. Berg,Jacs.,114,1895(1992)

3) K.L. Dueholm,M. Egholm,C. Behrens,L. Christensen,H.F. Hansen,T. Vulpius,K.H. Petersen,R.H. Berg,P.E. Nielsen,O. Buchardt,J. Org. Chem.,59,5767(1994)

4) L. Christensen,R. Fitzpatrick,B. Gildea,K.H. Petersen,H.F. Hansen,T. Koch,M. Egholm,O. Buchardt,P.E. Nielsen,J. Coull,R.H. Berg,J. Pept. Sci.,1,175(1995)

5) T. Koch,H.F. Hansen,P. Andersen,T. Larsen,H.G. Batz,K. Otteson,H. Orum,J. Pept. Res.,49,80(1997)

又，本發明之寡聚物，5’末端亦可為為下述述述化學式(1)至(3)之任一基。以(3)-OH為為較佳。

以下，將上述(1)、(2)及(3)所示之基分別稱為「基(1)」、「基(2)」及「基(3)」。

2.　醫藥組成物

本發明之寡聚物，與先前技術之反義寡聚物相較，可高效率地進行外顯子53之跳讀。因此，藉由將含有本發明之寡聚物之醫藥組成物投予至DMD患者，預測可高效率地緩和肌肉萎縮症之症狀。例如，使用含有本發明之寡聚物之醫藥組成物時，與先前技術之寡聚物相較，即使以較少量之投予量亦可得到相同程度之治療效果，所以可減輕副作用，並且較為經濟。

於是，其他實施態樣為提供以本發明之寡聚物、其醫藥上可容許之鹽或水合物做為有效成分之肌肉萎縮症治療用醫藥組成物(以下稱為「本發明之組成物」)。

就本發明之組成物中所含之本發明之寡聚物之醫藥上可容許鹽之例子而言，可列舉如鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽等鹼金屬鹽；如鈣鹽、鎂鹽等鹼土金屬鹽；鋁鹽、鐵鹽、鋅鹽、銅鹽、鎳鹽、鈷鹽等金屬鹽；銨鹽；三級辛基胺鹽，如二苯甲基胺鹽、嗎啉鹽、葡萄糖胺鹽、苯基甘胺酸烷酯鹽、乙二胺鹽、N-甲基還原葡糖胺鹽(N-methyl glncamine)、胍鹽、二乙基胺鹽、三乙基胺鹽、二環己基胺鹽、N,N’-二苯甲基乙二胺鹽、氯普魯卡因(chloroprocaine)鹽、普魯卡因(procaine)鹽、二乙醇胺鹽、N-苯甲基-苯乙基胺鹽、哌鹽、四甲基銨鹽、參(羥基甲基)胺基甲烷鹽等有機胺鹽；如氫氟酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽等氫鹵酸鹽；如硝酸鹽、過氯酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等無機酸鹽；如甲磺酸鹽、三氟甲磺酸鹽、乙磺酸鹽等低級烷磺酸鹽；如苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽等芳基磺酸鹽；如乙酸鹽、蘋果酸鹽、富馬酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、草酸鹽、馬來酸鹽等有機酸鹽；如甘胺酸鹽、離胺酸鹽、精胺酸鹽、鳥胺酸鹽、麩胺酸鹽、天冬胺酸鹽等胺基酸鹽等。此等鹽可藉由公知之方法製造。或者，本發明之組成物中所含之本發明之寡聚物亦可為其水合物之形態。

本發明之組成物之投予形態，只要為醫藥上可容許之投予形態即可，無特別限制，可依照治療方法而選擇，然而從對肌肉組織之送達容易性之觀點而言，以靜脈內投予、動脈內投予、肌肉內投予、皮下投予、經口投予、組織內投予、經皮投予等為較佳。又，本發明之組成物可採取之劑型，並無特別限制，可列舉如各種注射劑、口服劑、點滴劑、吸入劑、軟膏劑、塗劑(lotion)等。

將本發明之寡聚物投予肌肉萎縮症之患者時，本發明之組成物以含有促進該寡聚物送達肌肉組織之承載體為較佳。此種承載體只要為醫藥上可容許者即可，無特別限制，就其實例而言，可列舉陽離子性微脂體(liposome)、陽離子性聚合物等陽離子性承載體，或利用病毒包膜(virus envelope)之承載體。就陽離子性微脂體而言，可列舉如以2-O-(2-二乙基胺基乙基)胺甲醯基-1,3-O-二油醯基甘油及磷脂質做為必須構成成分所形成之微脂體(以下稱為「微脂體A」)、Oligofectamine(商標)(Invitrogen公司製)、Lipofectin(登錄商標)(Invitrogen公司製)、Lipofectamine(商標)(Invitrogen公司製)、Lipofectamine 2000(登錄商標)(Invitrogen公司製)、DMRIE-C(登錄商標)(Invitrogen公司製)、GeneSilencer(登錄商標)(Gene Therapy Systems公司製)、TransMessenger(登錄商標)(QIAGEN公司製)、TransIT TKO(登錄商標)(Mirus公司製)、Nucleofector II(Lonza)。其中，以微脂體A為較佳。就陽離子性聚合物而言，可列舉例如JetSI(登錄商標)(Qbiogene公司製)、Jet-PEI(登錄商標)(聚伸乙基亞胺，Qbiogene公司製)。就利用病毒包膜之承載體而言，可列舉例如GenomeOne(登錄商標)(HVJ-E微脂體，石原產業公司製)。或者，亦可使用日本專利2924179號記載之醫藥裝置、專利再公表公報第2006/129594號及專利再公表公報第2008/096690號記載之陽離子性承載體。

本發明之組成物中所含之本發明之寡聚物之濃度，雖隨承載體之種類等而異，不過以在0.1nM至100μM之範圍內為宜，以在1nM至10μM之範圍內為較佳，以在10nM至1μM之範圍內為更佳。又，本發明之組成物中所含之本發明之寡聚物與承載體之重量比(承載體/本發明之寡聚物)，雖隨該寡聚物之性質及該承載體之種類等而異，不過以在0.1至100之範圍內為宜，以在1至50之範圍內為較佳，以在10至20之範圍內為更佳。

本發明之組成物中，除本發明之寡聚物及上述承載體以外，可添加任何醫藥上可容許之添加劑。就該添加劑而言，可列舉如乳化輔助劑(例如，碳數6至22之脂肪酸或其醫藥上可容許之鹽、白蛋白、葡萄聚糖)、安定化劑(例如，膽固醇、磷脂酸(phosphatidic acid))、等張化劑(例如，氯化鈉、葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖)、pH調整劑(例如，鹽酸、硫酸、磷酸、乙酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀、三乙醇胺)。可使用一種或二種以上此等添加劑。本發明之組成物中該添加劑之含量，以90重量%以下為宜，以70重量%以下為較佳，以50重量%以下為更佳。

本發明之組成物可藉由將本發明之寡聚物添加於承載體之分散液中，並適當攪拌而調製。又，添加劑可於本發明之寡聚物添加前，或添加後之適當步驟中添加。就添加本發明之寡聚物時可使用之水性溶劑而言，只要為醫藥上可容許者即可，無特別限制，可列舉例如注射用水、注射用蒸餾水、生理食鹽水等電解質液、葡萄糖液、麥芽糖液等糖液。又，關於該情況之pH及溫度等條件，本項技術之人士可適宜地選擇。

本發明之組成物可為例如液劑或其冷凍乾燥製劑。該冷凍乾燥製劑可藉由將具有液劑形態之本發明之組成物依照常法進行冷凍乾燥處理而調製。例如，可將具有液劑形態之本發明之組成物進行適當滅菌後，以設定量分注於小瓶中，於約-40至-20℃之條件下進行約2小時之預備冷凍，於約0至10℃減壓下進行一次乾燥，接著於約15至25℃減壓下進行二次乾燥，即可實施冷凍乾燥。再者，一般將小瓶內部用氮氣置換，並加上栓蓋，可得到本發明之組成物之冷凍乾燥製劑。

本發明之組成物之冷凍乾燥製劑，一般可藉由添加任何適當溶液(再溶解液)使之再溶解而使用。就此等再溶解液而言，可列舉注射用水、生理食鹽水、其他一般輸注液。該再溶解液之液量雖隨用途等而異，無特別限制，不過以冷凍乾燥前液量之0.5至2倍量，或500mL以下為宜。

就投予本發明之組成物時之用量而言，雖以在考量所含之本發明之寡聚物之種類、劑型；年齡及體重等患者狀態；投予路徑；疾病之性質及程度後調製為宜，不過對成人而言，本發明之寡聚物之量一般在每日0.1mg至10g/人之範圍內，以在1mg至1g/人之範圍內為較佳。此數值有時會隨標的疾病之種類、投予形態、標的分子而異。因此，視情況，亦有縱使在該量以下已足夠之情形，或相反地需要該量以上之用量之情形。又，可每日投予1次至數次，或每隔1日至數日投予。

就本發明之組成物之其他態樣而言，可列舉含有能表現本發明之寡核苷酸之載體(vector)以及上述承載體(carrier)之醫藥組成物。該表現載體亦可為能表現複數個本發明之寡核苷酸者。與含有本發明寡聚物之本發明之組成物一樣，該組成物亦可添加醫藥上可容許之添加劑。該組成物所含之表現載體之濃度雖係隨承載體之種類等而異，不過以在0.1nM至100μM之範圍內為宜，以在1nM至10μM之範圍內為較佳，以在10nM至1μM之範圍內為更佳。該組成物中所含之表現載體與承載體之重量比(承載體/表現載體)隨表現載體之性質、承載體之種類等而異，以在0.1至100之範圍內為宜，以在1至50之範圍內為較佳，以在10至20之範圍內為更佳。又，該組成物中所含之承載體之含量，與含有本發明寡聚物之本發明之組成物之情況相同，關於其調製方法，亦與本發明之組成物情況相同。

以下，舉出實施例及試驗例，更詳細地說明本發明，然而本發明並不限定於實施例所示之範圍內。

[實施例] [參考例1] 加載於胺基甲基聚苯乙烯樹脂之4-{[(2S,6R)-6-(4-苯甲醯胺-2-側氧基嘧啶-1-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]甲氧基}-4-側氧基丁酸 步驟1：4-{[(2S,6R)-6-(4-苯甲醯胺-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]甲氧基}-4-側氧基丁酸之製造

在氬氣氛圍下，將N-{1-[(2R,6S)-6-(羥基甲基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]-2-側氧基-1,2-二氫嘧啶-4-基}苯甲醯胺22.0g及4-二甲基胺基吡啶(4-DMAP)7.04g懸浮於二氯甲烷269mL，添加5.76g琥珀酸酐，並於室溫下攪拌3小時。於該反應液中添加40mL甲醇，並減壓濃縮。使用乙酸乙酯及0.5M磷酸二氫鉀水溶液對殘餘物進行萃取操作。將得到之有機層用0.5M磷酸二氫鉀水溶液、水、飽和食鹽水依序洗淨。將得到之有機層用硫酸鈉乾燥，減壓濃縮，得到25.9g之目的物。

步驟2：加載於胺基甲基聚苯乙烯樹脂之4-{[(2S,6R)-6-(4-苯甲醯胺-2-側氧基嘧啶-1-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]甲氧基}-4-側氧基丁酸之製造

將23.5g之4-{[(2S,6R)-6-(4-苯甲醯胺-2一側氧基嘧啶-1(2H)-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]甲氧基}-4-側氧基丁酸溶解於336mL吡啶(脫水)中，添加4.28g之4-DMAP、40.3g之1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽。繼而，添加25.0g之經1%DVB交聯之胺基甲基聚苯乙烯樹脂(東京化成工業公司製，A1543)、24mL之三乙基胺，於室溫下震盪4日。反應後，濾取樹脂。將得到之樹脂依序用吡啶、甲醇、二氯甲烷洗淨，並減壓乾燥。於得到之樹脂中添加150mL之四氫呋喃(脫水)、15mL之乙酸酐、15mL之2,6-光澤汀，於室溫下震盪2小時。濾取樹脂，依序用吡啶、甲醇、二氯甲烷洗淨，並減壓乾燥，得到33.7g之目的物。

關於該目的物之加載(loading)量，係藉由使用公知之方法測定於409nm之UV吸光度來決定每公克樹脂之三苯甲基之莫耳量。樹脂之加載量為397.4μmol/g。

UV測定條件

機器：U-2910(日立製作所)

溶劑：甲磺酸

波長：265nm

ε值：45000

[參考例2] 加載於胺基甲基聚苯乙烯樹脂之4-側氧基-4-{[(2S,6R)-6-(6-側氧基-2-[2-苯氧基乙醯胺]-1H-嘌呤-9-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]甲氧基}丁酸 步驟1：N²-(苯氧基乙醯基)鳥苷之製造

將100g之鳥苷(guanosine)於80℃，減壓下乾燥24小時。添加500mL之吡啶(脫水)、500mL之二氯甲烷(脫水)，於氬氣氛圍、0℃下，滴入401mL之氯三甲基矽烷，並在室溫攪拌3小時。再度冰冷，滴入66.3g之苯氧基乙醯基氯，於冰冷下再攪拌3小時。將500mL之甲醇加入反應液中，於室溫攪拌一整夜後，於減壓下餾去溶劑。將500mL之甲醇加入殘餘物中，並於減壓下進行3次濃縮。將4L之水加入殘餘物中，於冰冷下攪拌1小時，濾取析出物。將該析出物用水，繼而用冷甲醇洗淨，乾燥，得到目的化合物150.2g(產率102%)(參考：Org. Lett. (2004),Vol. 6,No. 15,2555-2557)。

步驟2：N-{9-[(2R,6S)-6-(羥基甲基)-4-嗎啉-2-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}-2-苯氧基乙醯胺對甲苯磺酸鹽

將在步驟1中所得到之化合物30g懸浮於480mL之甲醇中，於冰冷下添加130mL之2N鹽酸。繼而，依此順序添加56.8g之四硼酸銨4水合物、16.2g之過碘酸鈉，並於室溫攪拌3小時。將反應液冰冷，過濾除去不溶物，並將其用甲醇100mL洗淨。合併濾液及洗淨液，並將其冰冷，添加11.52g之2-甲基吡啶硼烷，攪拌20分鐘後，緩慢添加54.6g之對-甲苯磺酸‧1水合物，並於4℃攪拌一整夜。濾取析出物，用500mL之冷甲醇洗淨後，乾燥，得到目的化合物17.7g(產率43.3%)。

¹H NMR(δ,DMSO-d6)：9.9-9.2(2H,br)、8.35(1H,s)、7.55(2H,m)、7.35(2H,m)、7.10(2H,d,J=7.82Hz)、7.00(3H,m)、5.95(1H,dd,J=10.64,2.42Hz)、4.85(2H,s)、4.00(1H,m)、3.90-3,60(2H,m)、3.50-3.20(5H,m)、2.90(1H,m)、2.25(3H,s)

步驟3：N-{9-[(2R,6S)-6-(羥基甲基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}-2-苯氧基乙醯胺之製造

將在步驟2中所得到之化合物2.0g懸浮於30mL之二氯甲烷，於冰冷下添加13.9g之三乙基胺、18.3g之三苯甲基氯，並於室溫攪拌1小時。將反應液用飽和碳酸氫鈉水溶液，繼而用水洗淨後乾燥，將有機層減壓濃縮。於殘餘物中添加0.2M檸檬酸鈉緩衝液(pH3)/甲醇(1：4(v/v))40mL並攪拌，繼而加40mL之水並於冰冷下攪拌1小時。將其濾取，用冷甲醇洗淨，乾燥，得到目的化合物1.84g(產率82.0%)。

步驟4：加載於胺基甲基聚苯乙烯樹脂之4-側氧基-4-{[(2S,6R)-6-(6-側氧基-2-[2-苯氧基乙醯胺]-1H-嘌呤-9-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]甲氧基}丁酸之製造

藉由與參考例1同樣之方法製造標題化合物。但是，在本步驟中使用N-{9-[(2R,6S)-6-(羥基甲基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}-2-苯氧基乙醯胺，代替參考例1之步驟1中所使用之N-{1-[(2R,6S)-6-(羥基甲基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]-2-側氧基-1,2-二氫嘧啶-4-基}苯甲醯胺。

[參考例3] 加載於胺基甲基聚苯乙烯樹脂之4-{[(2S,6R)-6-(5-甲基-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]甲氧基}-4-側氧基丁酸

藉由與參考例1同樣之方法製造標題化合物。但是，在本步驟中使用1-[(2R,6S)-6-(羥基甲基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]-5-甲基嘧啶-2,4-(1H,3H)-二酮，代替參考例1之步驟1中所使用之N-{1-[(2R,6S)-6-(羥基甲基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]-2-側氧基-1,2-二氫嘧啶-4-基}苯甲醯胺。

[參考例4] 加載於胺基甲基聚苯乙烯樹脂之1,12-二側氧基-1-(4-三苯甲基哌-1-基)-2,5,8,11-四氧雜-15-十五酸

藉由與參考例1同樣之方法製造標題化合物。但是，在本步驟中使用4-三苯甲基哌-1-羧酸2-[2-(2-羥基乙氧基)乙氧基]乙酯(國際公開公報第2009/064471號中所記載之化合物)，代替參考例1之步驟1中所使用之N-{1-[(2R,6S)-6-(羥基甲基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]-2-側氧基-1,2-二氫嘧啶-4-基}苯甲醯胺。

依照以下實施例1至12、比較例1至3之記載，合成表2之PMO 1至11號、13至16號所示之各種PMO。將合成之PMO溶解於注射用水(大塚製藥工場公司製)。再者，PMO 12號係從Gene Tools公司購入。

[實施例1] PMO 8號

將加載於胺基甲基聚苯乙烯樹脂之4-{[(2S,6R)-6-(4-苯甲醯胺-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]甲氧基}-4-側氧基丁酸(參考例1)2g(800μmol)移入反應槽，添加30mL之二氯甲烷，靜置30分鐘。再者，以30mL之二氯甲烷洗淨2次後，開始下述合成循環。以可形成標題化合物之鹼基序列之方式，於各循環中添加期望之嗎啉單體化合物。

又，使用三氟乙酸(2當量)與三乙基胺(1當量)之混合物以含有1%(v/v)乙醇及10%(v/v)2,2,2-三氟乙醇之二氯甲烷溶液溶解而成為3%(w/v)者做為去封阻溶液(deblock solution)。使用N,N-二異丙基乙胺以含有25%(v/v)2-丙醇之二氯甲烷溶液溶解而成為5%(v/v)者做為中和溶液。使用嗎啉單體化合物以含有10%(v/v)N,N-二異丙基乙基胺之1,3-二甲基-2-咪唑啶酮溶解而成為0.15M者做為偶合溶液A。使用N,N-二異丙基乙胺以1,3-二甲基-2-咪唑啶酮溶解而成為10%(v/v)者做為偶合溶液B。使用在二氯甲烷中溶解有20%(v/v)乙酸酐及30%(v/v)2,6-光澤汀者做為封端溶液(capping solution)。

將加載上述合成之PMO之胺基甲基聚苯乙烯樹脂從反應容器回收，於室溫減壓乾燥2小時以上。將乾燥之加載於胺基甲基聚苯乙烯樹脂之PMO放入反應容器中，添加28%氨水-乙醇(1/4)200mL，於55℃攪拌15小時。過濾胺基甲基聚苯乙烯樹脂，用水-乙醇(1/4)50mL洗淨。將得到之濾液減壓濃縮。將得到之殘餘物溶解於20mM乙酸-三乙胺緩衝液(TEAA緩衝液)與乙腈之混合溶劑(4/1)100mL中，並用膜過濾器過濾。將得到之濾液藉由逆相HPLC精製。使用之條件如以下所示。

分析各部分(fraction)，用100mL之乙腈-水(1/1)將目的物回收，添加乙醇200mL，並減壓濃縮。然後，減壓乾燥，得到白色固體。於得到之固體中添加300mL之10mM磷酸水溶液，使其懸浮。添加10mL之2M磷酸水溶液，攪拌15分鐘。繼而，添加15mL之2M氫氧化鈉水溶液，進行中和。再添加15mL之2M氫氧化鈉水溶液，調成鹼性，並用膜過濾器(0.45μm)過濾。用100mL之10mM氫氧化鈉水溶液洗淨，得到呈水溶液之目的物。

將得到之含有目的物之水溶液用陰離子交換樹脂管柱精製。使用之條件如以下所示。

分析各部分(HPLC)，得到呈水溶液之目的物。於得到之水溶液中添加225mL之0.1M磷酸緩衝液(pH6.0)，進行中和。用膜過濾器(0.45μm)過濾。繼而，以下列條件進行超過濾以脫鹽。

將濾液濃縮，得到約250mL之水溶液。將得到之水溶液用膜過濾器(0.45μm)過濾。將所得之水溶液冷凍乾燥，得到呈白色綿狀固體之1.5g目的化合物。

ESI-TOF-MS計算值：6924.82

測定值：6923.54

[實施例2] PMO 1號

依照與實施例1同樣之方法，製造標題化合物。

MALDI-TOF-MS計算值：8291.96

測定值：8296.24

[實施例3] PMO 2號

依照與實施例1同樣之方法，製造標題化合物。

ESI-TOF-MS計算值：7310.13

測定值：7309.23

[實施例4] PMO 3號

依照與實施例1同樣之方法，製造標題化合物。

ESI-TOF-MS計算值：8270.94

測定值：8270.55

[實施例5] PMO 4號

依照與實施例1同樣之方法，製造標題化合物。但是，使用加載於胺基甲基聚苯乙烯樹脂之4-(((2S,6R)-6-(5-甲基-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基)甲氧基)-4-側氧基丁酸(參考例3)做為起始原料。

ESI-TOF-MS計算值：7310.13

測定值：7310.17

[實施例6] PMO 5號

依照與實施例1同樣之方法，製造標題化合物。但是，使用加載於胺基甲基聚苯乙烯樹脂之4-(((2S,6R)-6-(5-甲基-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基)甲氧基)-4-側氧基丁酸(參考例3)做為起始原料。

ESI-TOF-MS計算值：8270.94

測定值：8270.20

[實施例7] PMO 6號

依照與實施例1同樣之方法，製造標題化合物。

ESI-TOF-MS計算值：5964.01

測定值：5963.68

[實施例8] PMO 7號

依照與實施例1同樣之方法，製造標題化合物。

ESI-TOF-MS計算值：6609.55

測定值：6608.85

[實施例9] PMO 9號

依照與實施例1同樣之方法，製造標題化合物。但是，使用加載於胺基甲基聚苯乙烯樹脂之4-側氧基-4-(((2S,6R)-6-(6-側氧基-2-(2-苯氧基乙醯胺)-1H-嘌呤-9(6H)-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基)甲氧基)丁酸(參考例2)做為起始原料。

ESI-TOF-MS　計算值：7280.11

測定值：7279.42

[實施例10] PMO 10號

依照與實施例1同樣之方法，製造標題化合物。但是，使用加載於胺基甲基聚苯乙烯樹脂之4-側氧基-4-(((2S,6R)-6-(6-側氧基-2-(2-苯氧基乙醯胺)-1H-嘌呤-9(6H)-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基)甲氧基)丁酸(參考例2)做為起始原料。

ESI-TOF-MS計算值：8295.95

測定值：8295.91

[實施例11] PMO 13號

依照與實施例1同樣之方法，製造標題化合物。但是，使用加載於胺基甲基聚苯乙烯樹脂之1,12-二側氧基-1-(4-三苯甲基哌-1-基)-2,5,8,11-四氧雜-15-十五酸(參考例4)做為起始原料。

ESI-TOF-MS計算值：7276.15

測定值：7276.69

[實施例12] PMO 14號

依照與實施例1同樣之方法，製造標題化合物。但是，使用加載於胺基甲基聚苯乙烯樹脂之1,12-二側氧基-1-(4-三苯甲基哌-1-基)-2,5,8,11-四氧雜-15-十五酸(參考例4)做為起始原料。

ESI-TOF-MS計算值：8622.27

測定值：8622.29

[比較例1] PMO 11號

依照與實施例1同樣之方法，製造標題化合物。

ESI-TOF-MS計算值：10274.63

測定值：10273.71

[比較例2] PMO 15號

依照與實施例1同樣之方法，製造標題化合物。

ESI-TOF-MS計算值：9941.33

測定值：9940.77

[比較例3] PMO 16號

依照與實施例1同樣之方法，製造標題化合物。

ESI-TOF-MS計算值：8238.94

測定值：8238.69

[試驗例1] 試管內分析

使用Amaxa細胞系核轉染套組L(Amaxa Cell Line Nucleofector Kit L)並藉由第II型細胞核轉染儀(Nucleofector II)(Lonza)，將PMO 1至8號之本發明寡聚物及PMO 11號之反義寡聚物10μM導入4×10⁵個RD細胞(人類橫紋肌肉瘤細胞株)中。程式係使用T-030。

導入後，將細胞在2mL之含有10%牛胎兒血清(FCS)(Invitrogen公司製)之伊格爾氏最低限度必需培養基(Eagle’s minimal Essential Medium，簡稱EMEM)(Sigma公司製，以下相同)中，於37℃，5%CO₂條件下培養一晚。將細胞用PBS(Nissui公司製，以下相同)洗淨2次後，於細胞中添加500μl之ISOGEN(Nippon Gene公司製)，在室溫放置數分鐘使細胞溶解，將該溶解物回收於移液管(Eppendorf管)中。依照ISOGEN所附之操作程序萃取全部RNA。所萃取之全部RNA之濃度係使用NanoDrop ND-1000(LMS公司製)來測定。

對於萃取出之全部RNA 400ng，使用Titan One Tube RT-PCR套組(Roche公司製)，進行單步驟RT-PCR。依照套組中所附之操作程序，調製反應液。熱循環(thermal cycle)係使用PTC-100(MJ Research公司製)。所用之RT-PCR方案係如以下所示：

50℃，30分鐘：逆轉錄反應

94℃，2分鐘：熱變性

[94℃，10秒鐘；58℃，30秒鐘；68℃，45秒鐘]×30循環：PCR增幅

68℃，7分鐘：聚合酶之熱失活

使用於RT-PCR之正向引子(forward primer)及反向引子(reverse primer)之鹼基序列如以下所示：

正向引子：5’-AGGATTTGGAACAGAGGCGTC-3’(序列編號40)

反向引子：5’-GTCTGCCACTGGCGGAGGTC-3’(序列編號41)

繼而，對於上述RT-PCR之增幅產物，使用Taq DNA聚合物酶(Roche公司製)進行巢式PCR。所用之PCR方案係如以下所示。

94℃，2分鐘：熱變性

[94℃，15秒鐘；58℃，30秒鐘；68℃，45秒鐘]×30循環：PCR增幅

68℃，7分鐘：聚合酶之熱失活

使用於上述巢式PCR之正向引子及反向引子之鹼基序列係如以下所示：

正向引子：5’-CATCAAGCAGAAGGCAACAA-3’(序列編號42)

反向引子：5’-GAAGTTTCAGGGCCAAGTCA-3’(序列編號43)

將上述巢式PCR之反應產物1μl，使用Bioanalyzer(Agilent公司製)進行解析。

測定外顯子53跳讀帶之聚核苷酸量[A]及外顯子53未跳讀帶之聚核苷酸量[B]。依據此等[A]及[B]之測定值，依照以下公式求取跳讀效率。

跳讀效率(%)=A/(A+B)×100

實驗結果

將結果示於第1圖。依據本實驗，判定PMO 1至8號之本發明之寡聚物，任一者與PMO 11號之反義寡聚物相比，均顯著地以較高效率使外顯子53跳讀。尤其，PMO 3及8號之本發明之寡聚物，與PMO 11號之反義寡聚物相比，展現高4倍以上之外顯子跳讀效率。

[試驗例2] 使用人類纖維母細胞之試管內分析

藉由ZsGreen1共表現逆轉錄病毒載體，將人類myoD基因(序列編號44)導入TIG-119細胞(來自人類正常組織之纖維母細胞，醫藥基盤研究所)或5017細胞(來自人類DMD患者之纖維母細胞，Coriell Institute for Medical Research)。

培育4至5日後，藉由FACS回收ZsGreen陽性之MyoD轉換纖維母細胞，並以成為5×10⁴個/cm²之方式接種於12孔平盤上。增殖培養基係使用1mL之含有10% FCS及1%青黴素/鏈黴素(P/S)(Sigma Aldrich公司)之經杜百可氏改質之伊格爾培養基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)：養分混合物F-12(DMEM/F-12)(Invitrogen公司)。

24小時後，交換為分化培養基(含有2%馬血清(Invitrogen公司)、1% P/S及ITS液體培養基補充劑(Sigma公司)之DMEM/F-12)。每2、3日進行培養基交換，培養12至14日，使細胞分化成肌管。

然後，將分化培養基交換成含有6μM之Endo-Porter(Gene Tools公司)之分化培養基交換，並以使終濃度成為10μM之方式，添加嗎啉寡聚物。培育48小時後，藉由TRIzol(Invitrogen公司製)，從細胞萃取全部RNA。對於萃取之全部RNA 50ng，使用QIAGEN OneStep RT-PCR套組進行RT-PCR。依照所附之操作程序調製反應液。熱循環係使用iCycler(Bio-Rad公司製)。所用之RT-PCR方案係如以下所示：

50℃，30分鐘：逆轉錄反應

95℃，15分鐘：熱變性

[94℃，1分鐘；60℃，1分鐘；72℃，1分鐘]×35循環：PCR增幅

72℃，7分鐘：聚合酶之熱失活

引子係使用hEX51F及hEX55R。

hEX51F：5’-CGGGCTTGGACAGAACTTAC-3’(序列編號45)

hEX55R：5’-TCCTTACGGGTAGCATCCTG-3’(序列編號46)

將上述RT-PCR反應之反應產物藉由2%瓊脂糖凝膠電泳分離，使用GeneFlash(Syngene公司)攝取凝膠照片。藉由Image J(美國國立衛生研究所製)，測定外顯子53跳讀帶之聚核苷酸量[A]以及外顯子53未跳讀帶之聚核苷酸量[B]。依據此等[A]及[B]之測定值，依照以下公式求取跳讀效率。

跳讀效率(%)=A/(A+B)×100

實驗結果

將結果示於第2圖及第3圖。依據本實驗，判定在TIG-119細胞中，PMO 3、8及9號之本發明之寡聚物(第2圖)之任一者與PMO 12號之反義寡聚物相比，均以較高效率使外顯子53跳讀(第2圖)。尤其，PMO 3及8號之本發明之寡聚物，與PMO 12號之反義寡聚物相比，呈現高2倍以上之外顯子跳讀效率(第2圖)。

又，依據本實驗，判定在5017細胞中，PMO 3、8至10號之本發明之寡聚物(第3圖)之任一者與PMO 12號之反義寡聚物相比，均以較高效率使外顯子53跳讀(第3圖)。尤其，PMO 3及8號之本發明之寡聚物，與PMO 12號之反義寡聚物相比，呈現高7倍以上之外顯子跳讀效率(第3圖)。

[試驗例3] 使用人類纖維母細胞之試管內分析

從外顯子45至52缺失之DMD患者或外顯子48至52缺失之DMD患者之左上腕內側採取活檢體，建立皮膚纖維母細胞株(來自人類DMD患者(外顯子45至52或外顯子48至52缺失)之纖維母細胞)。藉由ZsGreen1共表現逆轉錄病毒載體將人類myoD基因(序列編號44)導入纖維母細胞。

培育4至5日後，藉由FACS回收ZsGreen陽性之MyoD轉換纖維母細胞，以成為5×10⁴個/cm²之方式接種於12孔平盤上。增殖培養基係使用1mL之含有10%FCS及1%青黴素/鏈黴素(P/S)(Sigma Aldrich公司)之經杜百可氏改質之伊格爾培養基：養分混合物F-12(DMEM/F-12)(Invitrogen公司)。

24小時後，交換為分化培養基(含有2%馬血清(Invitrogen公司)、1% P/S及ITS液體培養基補充劑(Sigma公司)之DMEM/F-12)。每2、3日進行培養基交換，培養12、14或20日，使分化成肌管細胞。

然後，將分化培養基交換成含有6μM之Endo-Porter(Gene Tools公司)之分化培養基，並以使終濃度成為10μM之方式添加嗎啉寡聚物。培養48小時後，藉由TRIzol(Invitrogen公司製)，從細胞萃取全部RNA。對於萃取之全部RNA 50ng，使用QIAGEN OneStep RT-PCR套組進行RT-PCR。依照所附之操作程序調製反應液。熱循環係使用iCycler(Bio-Rad公司製)。所用之RT-PCR方案係如以下所示：

50℃，30分鐘：逆轉錄反應

95℃，15分鐘：熱變性

[94℃，1分鐘；60℃，1分鐘；72℃，1分鐘]×35循環：PCR增幅

72℃，7分鐘：聚合酶之熱失活

引子係使用hEx44F及hEx55R。

hEx44F：5’-TGTTGAGAAATGGCGGCGT-3’(序列編號48)

hEx55R：5’-TCCTTACGGGTAGCATCCTG-3’(序列編號46)

將上述RT-PCR反應之反應產物藉由2%瓊脂糖凝膠電泳分離，使用GeneFlash(Syngene公司)攝取凝膠照片。藉由Image J(美國國立衛生研究所製)測定外顯子53跳讀帶之聚核苷酸量[A]及外顯子53未跳讀帶之聚核苷酸量[B]。依據此等[A]及[B]之測定值，依照以下公式求取跳讀效率。

跳讀效率(%)=A/(A+B)×100

實驗結果

將結果示於第4圖及第5圖。依據本實驗，判定在來自外顯子45至52缺失(第4圖)或外顯子48至52缺失(第5圖)之DMD患者之細胞中，PMO第3及8號之本發明之寡聚物以80%以上之高效率使外顯子53跳讀。又，判定在來自外顯子45至52缺失之DMD患者之細胞中，PMO 3及8號之本發明之寡聚物，與PMO 15號之反義寡聚物相比，以較高效率使外顯子53跳讀(第4圖)。

[試驗例4] 西方轉漬(Western Bloting)

將PMO 8號之本發明之寡聚物以10μM之濃度添加於細胞中，72小時後，以含有Complete Mini(Roche Applied Science公司製)之RIPA緩衝液(Thermo Fisher Scientific公司製)從該等細胞萃取蛋白質，並藉由BCA蛋白質分析套組(Thermo Fisher Scientific公司製)定量蛋白質。用3至8%之NuPAGE Novex Tris-乙酸鹽凝膠(Invitrogen公司製)於150V進行75分鐘之電泳，並以半亁式轉漬器(semidry blotter)轉錄於PVDF膜(Millipore公司製)。將PVDF膜以5%ECL封阻劑(GE Healthcare公司製)封阻後，將膜於抗肌萎縮蛋白抗體(NCL-Dys 1,Novocastra公司製)溶液中培育。然後，於結合有過氧化酶(peroxidase)之山羊-抗小鼠IgG(型號，Bio-Rad)溶液中培育後，藉由ECL Plus西方轉漬系統(GE Healthcare公司製)顯色。

免疫染色

將PMO 3號或8號之本發明之寡聚物添加於細胞，72小時後用3%多聚甲醛(paraformaldehyde)，經10分鐘將該等細胞固定化。於10% Triton-X中培育10分鐘。用含有10%山羊血清之PBS封阻，將膜於抗肌萎縮蛋白抗體(NCL-Dys 1,Novocastra)溶液中培育，然後將膜於抗小鼠IgG抗體(Invitrogen公司製)溶液中培育。用金抗螢光淬滅試劑(Gold Antifade Reagent)(Invitrogen公司製)固定並用螢光顯微鏡觀察。

實驗結果

將結果示於第6圖及第7圖。根據本實驗，PMO 3號及8號之本發明之寡聚物誘導肌萎縮蛋白質之表現可藉由西方轉漬(第6圖)及免疫染色(第7圖)而確認。

[試驗例5] 使用人類纖維母細胞之試管內分析

依照與試驗例3同樣之方法進行試驗。

實驗結果

將結果示於第8圖。根據本實驗，判定在來自外顯子45至52缺失之DMD患者之細胞中，PMO 3號及8號之本發明之寡聚物，以比PMO 13號及14號之本發明之寡聚物更高之效率使外顯子43跳讀(第8圖)。

[試驗例6] 試管內分析

使用序列編號49至123中記載之2’-O-甲氧基-硫代磷酸酯體(2’-OMe-S-RNA)之反義寡聚物進行實驗。分析中所使用之各種反義寡聚物係從日本Bioservice公司購入。各種反義寡聚物之序列如以下所示。

將3×10⁵個之RD細胞(人類橫紋肌肉瘤細胞株)接種於6孔平盤，在2mL之含有10%牛胎兒血清(FCS)(Invitrogen公司製)之伊格爾氏最低限度必需培養基(EMEM)(Sigma公司製，以下相同)中，於37℃，5% CO₂條件下培養一晚。製成上述外顯子53跳讀用之各種反義寡聚物(日本Bioservice公司製)(1μM)與Lipofectamine 2000(Invitrogen公司製)之複合體，添加200μl於經培養基(1.8mL)交換之RD細胞中，終濃度成為100nM。

添加後，培養一晚。將細胞用PBS(Nissui公司製，以下相同)洗淨2次後，將500μl之ISOGEN(Nippon Gene公司製)添加於細胞中，在室溫放置數分鐘使細胞溶解，將該溶解物回收於移液管(Eppendorf tube)中。依照ISOGEN所附之操作程序萃取全部RNA。所萃取之全部RNA之濃度係使用NanoDrop ND-1000(LMS公司製)來測定。

對於萃取之全部RNA 400ng，使用Titan One Tube RT-PCR Kit(Roche公司製)，進行One-Step RT-PCR。依照套組中所附之操作程序，調製反應液。熱循環係使用PTR-100(MJ Research公司製)。所用之RT-PCR方案係如以下所示：

50℃，30分鐘：逆轉錄反應

94℃，2分鐘：熱變性

[94℃，10秒鐘；58℃，30秒鐘；68℃，45秒鐘]×30循環：PCR增幅

68℃，7分鐘：聚合酶之熱失活

使用於RT-PCR之正向引子及反向引子之鹼基序列如以下所示。

正向引子：5’-CATCAAGCAGAAGGCAACAA-3’(序列編號42)

反向引子：5’-GAAGTTTCAGGGCCAAGTCA-3’(序列編號43)

繼而，對於上述RT-PCR之增幅產物，使用Taq DNA聚合物酶(Roche公司製)，進行巢式PCR。所用之PCR方案係如以下所示：

94℃，2分鐘：熱變性

[94℃，15秒鐘；58℃，30秒鐘；68℃，45秒鐘]×30循環：PCR增幅

68℃，7分鐘：聚合酶之熱失活

使用於上述巢式PCR之正向引子及反向引子之鹼基序列如以下所示：

正向引子：5’-AGGATTTGGAACAGAGGCGTC-3’(序列編號40)

反向引子：5’-GTCTGCCACTGGCGGAGGTC-3’(序列編號41)

將上述巢式PCR之反應產物1μl，使用Bioanalyzer(Agilent公司製)進行解析。

測定外顯子53跳讀帶之聚核苷酸量[A]，及外顯子53未跳讀帶之聚核苷酸量[B]。依據此等[A]及[B]之測定值，依照以下公式，求取跳讀效率。

跳讀效率(%)=A/(A+B)×100

實驗結果

將結果示於第9圖至第17圖。依據本實驗，判定在對於從人類肌萎縮蛋白基因第53號之外顯子之5’末端開始算起之第31至61號，設計反義寡聚物時，可以高效率使外顯子53跳讀。

[試驗例7]

使用Amaxa細胞系核轉染套組L(Amaxa Cell Line Nucleofector Kit L)並藉由第II型細胞核轉染儀(Lonza)，將0.3至30μM之反義寡聚物導入3.5×10⁵個RD細胞(人類橫紋肌肉瘤細胞株)中。方案係使用T-030。

導入後，將細胞在2mL之含有10%牛胎兒血清(FCS)(Invitrogen公司製)之伊格爾氏最低限度必需培養基(EMEM)(Sigma公司製，以下相同)中，於37℃，5% CO₂條件下培養一晚。將細胞用PBS(Nissui公司製，以下相同)洗淨2次後，將500μl之ISOGEN(Nippon Gene公司製)添加於細胞中，在室溫放置數分鐘使細胞溶解，將該溶解物回收於移液管(Eppendorf管)中。依照ISOGEN所附之操作程序萃取全部RNA。所萃取之全部RNA之濃度係使用NanoDrop ND-1000(LMS公司製)來測定。

對於所萃取之全部RNA 400ng，使用QIAGEN OneStep RT-PCR套組(QIAGEN公司製)進行單一步驟RT-PCR。依照套組中所附之操作程序調製反應液。熱循環係使用PTR-100(MJ Research公司製)。所用之RT-PCR方案係如以下所示：

50℃，30分鐘：逆轉錄反應

95℃，15分鐘：熱變性

[94℃，30秒鐘；60℃，30秒鐘；72℃，1分鐘]×35循環：PCR增幅

72℃，10分鐘：聚合酶之熱失活

使用於RT-PCR之正向引子及反向引子之鹼基序列如以下所示：

正向引子：5’-CATCAAGCAGAAGGCAACAA-3’(序列編號42)

反向引子：5’-GAAGTTTCAGGGCCAAGTCA-3’(序列編號43)

將上述PCR之反應產物1μl，使用Bioanalyzer(Agilent公司製)進行解析。

測定外顯子53跳讀帶之聚核苷酸量[A]，及外顯子53未跳讀帶之聚核苷酸量[B]。依據此等[A]及[B]之測定值，依照以下公式求取跳讀效率。

跳讀效率(%)=A/(A+B)×100

實驗結果

將結果示於第18圖及第19圖。依據本實驗，判定PMO 8號之本發明之寡聚物，與PMO 15及16號之反義寡聚物相比，顯著地以較高效率使外顯子53跳讀(第18圖)。又，PMO 3及8號之本發明之寡聚物，比PMO 13及14號之本發明之寡聚物，明顯地以更高效率使外顯子跳讀(第19圖)。從此結果顯示，即使為同一序列，5’末端為-OH基者跳讀效率較高。

[產業上之可利用性]

從試驗例所示之實驗結果，顯示在任何一種細胞環境中，本發明之寡聚物(PMO 1至10號)，與先前技術之寡聚物(PMO 11、12、15及16號)相比，均可顯著地以較高效率使外顯子53跳讀。又，在試驗例2中所使用之5017細胞為從DMD患者採取之細胞，再者，在試驗例3及5中所使用之纖維母細胞亦為來自DMD患者之外顯子53跳讀之對象細胞。尤其，由於在試驗例3及5中，本發明之寡聚物在為外顯子53跳讀對象之來自DMD患者之細胞中呈現90%以上之外顯子53跳讀效率，因此本發明之寡聚物，實際上投予至DMD患者時，可謂亦能以高效率使外顯子53跳讀。

因此，本發明之寡聚物在DMD之治療上非常有用。

<110>　日本新藥股份有限公司獨立行政法人國立精神‧神經醫療研究中心

<120>　反義核酸

<130>　PCT11-0042

<150>　JP 2010-196032

<151>　2010-09-01

<160>　123

<170>　PatentIn version 3.4

<210>　1

<211>　212

<212>　DNA

<213>　人類

<400>　1

<210>　2

<211>　23

<212>　DNA

<213>　人造

<220>

<223>　合成核酸

<400>　2

<210>　3

<211>　24

<212>　DNA

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<223>　合成核酸

<400>　3

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<223>　合成核酸

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<212>　DNA

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<223>　合成核酸

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<223>　合成核酸

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<212>　DNA

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<223>　合成核酸

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<212>　DNA

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<223>　合成核酸

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<212>　DNA

<213>　人造

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<223>　合成核酸

<400>　10

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<212>　DNA

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<223>　合成核酸

<400>　11

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<212>　DNA

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<223>　合成核酸

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<212>　DNA

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<223>　合成核酸

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<212>　DNA

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<223>　合成核酸

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<212>　DNA

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<223>　合成核酸

<400>　15

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<212>　DNA

<213>　人造

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<223>　合成核酸

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<212>　DNA

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<223>　合成核酸

<400>　17

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<212>　DNA

<213>　人造

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<223>　合成核酸

<400>　18

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<223>　合成核酸

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<223>　合成核酸

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<223>　合成核酸

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<211>　22

<212>　DNA

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<223>　合成核酸

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<212>　DNA

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<223>　合成核酸

<400>　23

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<212>　DNA

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<223>　合成核酸

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<212>　DNA

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<223>　合成核酸

<400>　25

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<212>　DNA

<213>　人造

<220>

<223>　合成核酸

<400>　26

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<212>　DNA

<213>　人造

<220>

<223>　合成核酸

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<212>　DNA

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<223>　合成核酸

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<212>　DNA

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<223>　合成核酸

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<212>　DNA

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<223>　合成核酸

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<212>　DNA

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<223>　合成核酸

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<212>　DNA

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<223>　合成核酸

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<212>　DNA

<213>　人造

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<223>　合成核酸

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<212>　DNA

<213>　人造

<220>

<223>　合成核酸

<400>　34

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<211>　21

<212>　DNA

<213>　人造

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<223>　合成核酸

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<212>　DNA

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<223>　合成核酸

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<212>　DNA

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<223>　合成核酸

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<223>　合成核酸

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<212>　DNA

<213>　人造

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<223>　合成核酸

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<223>　合成核酸

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<212>　DNA

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<223>　合成核酸

<400>　42

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<223>　合成核酸

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<213>　人類

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<223>　Synthetic DNA

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<212>　RNA

<213>　人造

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<212>　RNA

<213>　人造

<220>

<223>　合成核酸

<400>　51

<210>　52

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<212>　RNA

<213>　人造

<220>

<223>　合成核酸

<400>　52

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<212>　RNA

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<223>　合成核酸

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<212>　RNA

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<223>　合成核酸

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<212>　RNA

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<212>　RNA

<213>　人造

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<223>　合成核酸

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<223>　合成核酸

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<212>　RNA

<213>　人造

<220>

<223>　合成核酸

<400>　79

<210>　80

<211>　25

<212>　RNA

<213>　人造

<220>

<223>　合成核酸

<400>　80

<210>　81

<211>　25

<212>　RNA

<213>　人造

<220>

<223>　合成核酸

<400>　81

<210>　82

<211>　25

<212>　RNA

<213>　人造

<220>

<223>　合成核酸

<400>　82

<210>　83

<211>　25

<212>　RNA

<213>　人造

<220>

<223>　合成核酸

<400>　83

<210>　84

<211>　25

<212>　RNA

<213>　人造

<220>

<223>　合成核酸

<400>　84

<210>　85

<211>　25

<212>　RNA

<213>　人造

<220>

<223>　合成核酸

<400>　85

<210>　86

<211>　25

<212>　RNA

<213>　人造

<220>

<223>　合成核酸

<400>　86

<210>　87

<211>　25

<212>　RNA

<213>　人造

<220>

<223>　合成核酸

<400>　87

<210>　88

<211>　25

<212>　RNA

<213>　人造

<220>

<223>　合成核酸

<400>　88

<210>　89

<211>　25

<212>　RNA

<213>　人造

<220>

<223>　合成核酸

<400>　89

<210>　90

<211>　25

<212>　RNA

<213>　人造

<220>

<223>　合成核酸

<400>　90

<210>　91

<211>　25

<212>　RNA

<213>　人造

<220>

<223>　合成核酸

<400>　91

<210>　92

<211>　25

<212>　RNA

<213>　人造

<220>

<223>　合成核酸

<400>　92

<210>　93

<211>　25

<212>　RNA

<213>　人造

<220>

<223>　合成核酸

<400>　93

<210>　94

<211>　25

<212>　RNA

<213>　人造

<220>

<223>　合成核酸

<400>　94

<210>　95

<211>　25

<212>　RNA

<213>　人造

<220>

<223>　合成核酸

<400>　95

<210>　96

<211>　25

<212>　RNA

<213>　人造

<220>

<223>　合成核酸

<400>　96

<210>　97

<211>　25

<212>　RNA

<213>　人造

<220>

<223>　合成核酸

<400>　97

<210>　98

<211>　25

<212>　RNA

<213>　人造

<220>

<223>　合成核酸

<400>　98

<210>　99

<211>　25

<212>　RNA

<213>　人造

<220>

<223>　合成核酸

<400>　99

<210>　100

<211>　25

<212>　RNA

<213>　人造

<220>

<223>　合成核酸

<400>　100

<210>　101

<211>　25

<212>　RNA

<213>　人造

<220>

<223>　合成核酸

<400>　101

<210>　102

<211>　25

<212>　RNA

<213>　人造

<220>

<223>　合成核酸

<400>　102

<210>　103

<211>　25

<212>　RNA

<213>　人造

<220>

<223>　合成核酸

<400>　103

<210>　104

<211>　25

<212>　RNA

<213>　人造

<220>

<223>　合成核酸

<400>　104

<210>　105

<211>　25

<212>　RNA

<213>　人造

<220>

<223>　合成核酸

<400>　105

<210>　106

<211>　25

<212>　RNA

<213>　人造

<220>

<223>　合成核酸

<400>　106

<210>　107

<211>　25

<212>　RNA

<213>　人造

<220>

<223>　合成核酸

<400>　107

<210>　108

<211>　25

<212>　RNA

<213>　人造

<220>

<223>　合成核酸

<400>　108

<210>　109

<211>　30

<212>　RNA

<213>　人造

<220>

<223>　合成核酸

<400>　109

<210>　110

<211>　20

<212>　RNA

<213>　人造

<220>

<223>　合成核酸

<400>　110

<210>　111

<211>　20

<212>　RNA

<213>　人造

<220>

<223>　合成核酸

<400>　111

<210>　112

<211>　20

<212>　RNA

<213>　人造

<220>

<223>　合成核酸

<400>　112

<210>　113

<211>　20

<212>　RNA

<213>　人造

<220>

<223>　合成核酸

<400>　113

<210>　114

<211>　20

<212>　RNA

<213>　人造

<220>

<223>　合成核酸

<400>　114

<210>　115

<211>　18

<212>　RNA

<213>　人造

<220>

<223>　合成核酸

<400>　115

<210>　116

<211>　18

<212>　RNA

<213>　人造

<220>

<223>　合成核酸

<400>　116

<210>　117

<211>　18

<212>　RNA

<213>　人造

<220>

<223>　合成核酸

<400>　117

<210>　118

<211>　18

<212>　RNA

<213>　人造

<220>

<223>　合成核酸

<400>　118

<210>　119

<211>　18

<212>　RNA

<213>　人造

<220>

<223>　合成核酸

<400>　119

<210>　120

<211>　15

<212>　RNA

<213>　人造

<220>

<223>　合成核酸

<400>　120

<210>　121

<211>　15

<212>　RNA

<213>　人造

<220>

<223>　合成核酸

<400>　121

<210>　122

<211>　15

<212>　RNA

<213>　人造

<220>

<223>　合成核酸

<400>　122

<210>　123

<211>　18

<212>　RNA

<213>　人造

<220>

<223>　合成核酸

<400>　123

第1圖：係展示人類橫紋肌肉瘤細胞株(RD細胞)中人類肌萎縮蛋白基因之外顯子53之跳讀效率之圖。

第2圖：係展示在藉由將人類myoD基因導入來自人類正常組織之纖維母細胞(TIG-119細胞)而被誘導分化成肌肉細胞之細胞中，人類肌萎縮蛋白基因之外顯子53之跳讀效率之圖。

第3圖：係展示在藉由將人類myoD基因導入來自人類DMD患者之纖維母細胞(5017細胞)而被誘導分化成肌肉細胞之細胞中，人類肌萎縮蛋白基因之外顯子53之跳讀效率之圖。

第4圖：係展示在藉由將人類myoD基因導入來自人類DMD患者(外顯子45至52缺失)之纖維母細胞而被誘導分化成肌肉細胞之細胞中，人類肌萎縮蛋白基因之外顯子53之跳讀效率之圖。

第5圖：係展示在藉由將人類myoD基因導入來自人類DMD患者(外顯子48至52缺失)之纖維母細胞而被誘導分化成肌肉細胞之細胞中，人類肌萎縮蛋白基因之外顯子53之跳讀效率之圖。

第6圖：係展示在藉由將人類myoD基因導入來自人類DMD患者(外顯子48至52缺失)之纖維母細胞而被誘導分化成肌肉細胞之細胞中，人類肌萎縮蛋白基因之外顯子53之跳讀效率之圖。

第7圖：係展示在藉由將人類myoD基因導入來自人類DMD患者(外顯子45至52缺失或外顯子48至52缺失)之纖維母細胞而被誘導分化成肌肉細胞之細胞中，人類肌萎縮蛋白基因之外顯子53之跳讀效率之圖。

第8圖：係展示在藉由將人類myoD基因導入來自人類DMD患者(外顯子45至52缺失)之纖維母細胞而被誘導分化成肌肉細胞之細胞中，人類肌萎縮蛋白基因之外顯子53之跳讀效率之圖。

第9圖：係展示人類橫紋肌肉瘤細胞(RD細胞)中人類肌萎縮蛋白基因之外顯子53之跳讀效率(2’-OMe-S-RNA)之圖。

第10圖：係展示人類橫紋肌肉瘤細胞(RD細胞)中人類肌萎縮蛋白基因之外顯子53之跳讀效率(2’-OMe-S-RNA)之圖。

第11圖：係展示人類橫紋肌肉瘤細胞(RD細胞)中人類肌萎縮蛋白基因之外顯子53之跳讀效率(2’-OMe-S-RNA)之圖。

第12圖：係展示人類橫紋肌肉瘤細胞(RD細胞)中人類肌萎縮蛋白基因之外顯子53之跳讀效率(2’-OMe-S-RNA)之圖。

第13圖：係展示人類橫紋肌肉瘤細胞(RD細胞)中人類肌萎縮蛋白基因之外顯子53之跳讀效率(2’-OMe-S-RNA)之圖。

第14圖：係展示人類橫紋肌肉瘤細胞(RD細胞)中人類肌萎縮蛋白基因之外顯子53之跳讀效率(2’-OMe-S-RNA)之圖。

第15圖：係展示人類橫紋肌肉瘤細胞(RD細胞)中人類肌萎縮蛋白基因之外顯子53之跳讀效率(2’-OMe-S-RNA)之圖。

第16圖：係展示人類橫紋肌肉瘤細胞(RD細胞)中人類肌萎縮蛋白基因之外顯子53之跳讀效率(2’-OMe-S-RNA)之圖。

第17圖：係展示人類橫紋肌肉瘤細胞(RD細胞)中人類肌萎縮蛋白基因之外顯子53之跳讀效率(2’-OMe-S-RNA)之圖。

第18圖：係展示人類橫紋肌肉瘤細胞(RD細胞)中人類肌萎縮蛋白基因之外顯子53之跳讀效率隨寡聚物濃度而變化之圖。

第19圖：係展示人類橫紋肌肉瘤細胞(RD細胞)中人類肌萎縮蛋白基因之外顯子53之跳讀效率隨寡聚物濃度而變化之之圖。

序列表內容

序列編號2：合成核酸

序列編號3：合成核酸

序列編號4：合成核酸

序列編號5：合成核酸

序列編號6：合成核酸

序列編號7：合成核酸

序列編號8：合成核酸

序列編號9：合成核酸

序列編號10：合成核酸

序列編號11：合成核酸

序列編號12：合成核酸

序列編號13：合成核酸

序列編號14：合成核酸

序列編號15：合成核酸

序列編號16：合成核酸

序列編號17：合成核酸

序列編號18：合成核酸

序列編號19：合成核酸

序列編號20：合成核酸

序列編號21：合成核酸

序列編號22：合成核酸

序列編號23：合成核酸

序列編號24：合成核酸

序列編號25：合成核酸

序列編號26：合成核酸

序列編號27：合成核酸

序列編號28：合成核酸

序列編號29：合成核酸

序列編號30：合成核酸

序列編號31：合成核酸

序列編號32：合成核酸

序列編號33：合成核酸

序列編號34：合成核酸

序列編號35：合成核酸

序列編號36：合成核酸

序列編號37：合成核酸

序列編號38：合成核酸

序列編號39：合成核酸

序列編號40：合成核酸

序列編號41：合成核酸

序列編號42：合成核酸

序列編號43：合成核酸

序列編號44：合成核酸

序列編號45：合成核酸

序列編號46：合成核酸

序列編號47：合成核酸

序列編號48：合成核酸

序列編號49：合成核酸

序列編號50：合成核酸

序列編號51：合成核酸

序列編號52：合成核酸

序列編號53：合成核酸

序列編號54：合成核酸

序列編號55：合成核酸

序列編號56：合成核酸

序列編號57：合成核酸

序列編號58：合成核酸

序列編號59：合成核酸

序列編號60：合成核酸

序列編號61：合成核酸

序列編號62：合成核酸

序列編號63：合成核酸

序列編號64：合成核酸

序列編號65：合成核酸

序列編號66：合成核酸

序列編號67：合成核酸

序列編號68：合成核酸

序列編號69：合成核酸

序列編號70：合成核酸

序列編號71：合成核酸

序列編號72：合成核酸

序列編號73：合成核酸

序列編號74：合成核酸

序列編號75：合成核酸

序列編號76：合成核酸

序列編號77：合成核酸

序列編號78：合成核酸

序列編號79：合成核酸

序列編號80：合成核酸

序列編號81：合成核酸

序列編號82：合成核酸

序列編號83：合成核酸

序列編號84：合成核酸

序列編號85：合成核酸

序列編號86：合成核酸

序列編號87：合成核酸

序列編號88：合成核酸

序列編號89：合成核酸

序列編號90：合成核酸

序列編號91：合成核酸

序列編號92：合成核酸

序列編號93：合成核酸

序列編號94：合成核酸

序列編號95：合成核酸

序列編號96：合成核酸

序列編號97：合成核酸

序列編號98：合成核酸

序列編號99：合成核酸

序列編號100：合成核酸

序列編號101：合成核酸

序列編號102：合成核酸

序列編號103：合成核酸

序列編號104：合成核酸

序列編號105：合成核酸

序列編號106：合成核酸

序列編號107：合成核酸

序列編號108：合成核酸

序列編號109：合成核酸

序列編號110：合成核酸

序列編號111：合成核酸

序列編號112：合成核酸

序列編號113：合成核酸

序列編號114：合成核酸

序列編號115：合成核酸

序列編號116：合成核酸

序列編號117：合成核酸

序列編號118：合成核酸

序列編號119：合成核酸

序列編號120：合成核酸

序列編號121：合成核酸

序列編號122：合成核酸

序列編號123：合成核酸

由於本案的圖為實驗數據，並非本案的代表圖。

故本案無指定代表圖。

Claims (9)

1. 一種反義寡聚物，其為可使人類肌萎縮蛋白基因之第53號外顯子跳讀之反義寡聚物，係由序列編號11或35之鹼基序列所構成。
2. 如申請專利範圍第1項所述之反義寡聚物，其係寡核苷酸。
3. 如申請專利範圍第2項所述之反義寡聚物，其中，構成上述寡核苷酸之至少1個核苷酸之糖部分及/或磷酸鍵結部分係經過修飾。
4. 如申請專利範圍第3項所述之反義寡聚物，其中，構成上述寡核苷酸之至少1個核苷酸之糖部分為核糖，且該核糖之2’位之-OH基係被選自OR、R、R’OR、SH、SR、NH₂、NHR、NR₂、N₃、CN、F、Cl、Br及I所構成之群中之任一基置換，其中，上述R表示烷基或芳基，上述R’表示伸烷基。
5. 如申請專利範圍第3或4項所述之反義寡聚物，其中，構成上述寡核苷酸之至少1個核苷酸之磷酸鍵結部分為選自硫代磷酸酯(phosphorothioate)鍵結、二硫代磷酸酯(phosphorodithioate)鍵結、烷基膦酸酯鍵結、胺基磷酸酯(phosphoroamidate)鍵結、及硼烷基磷酸酯(boranophosphate)鍵結所構成之群中之任一者。
6. 如申請專利範圍第1項所述之反義寡聚物，其為嗎啉寡聚物(morpholino oligomer)。
7. 如申請專利範圍第6項所述之反義寡聚物，其為二胺基 磷酸(phosphodiamidate)嗎啉寡聚物。
8. 如申請專利範圍第6或7項所述之反義寡聚物，其中5’末端為下列化學式(1)至(3)之任一基
9. 一種肌萎縮治療用醫藥組成物，其係以如申請專利範圍第1至8項中任一項所述之反義寡聚物、其醫藥上可容許之鹽或水合物做為有效成分。