[go: up one dir, main page]

MD3554552T2 - Conjugați oligomeri de omitere a exonilor pentru distrofie musculară - Google Patents

Conjugați oligomeri de omitere a exonilor pentru distrofie musculară Download PDF

Info

Publication number
MD3554552T2
MD3554552T2 MDE20191200T MDE20191200T MD3554552T2 MD 3554552 T2 MD3554552 T2 MD 3554552T2 MD E20191200 T MDE20191200 T MD E20191200T MD E20191200 T MDE20191200 T MD E20191200T MD 3554552 T2 MD3554552 T2 MD 3554552T2
Authority
MD
Moldova
Prior art keywords
dystrophin
antisense oligomer
exon
antisense
skipping
Prior art date
Application number
MDE20191200T
Other languages
English (en)
Inventor
Marco A Passini
Gunnar J Hanson
Original Assignee
Sarepta Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sarepta Therapeutics Inc filed Critical Sarepta Therapeutics Inc
Publication of MD3554552T2 publication Critical patent/MD3554552T2/ro

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6807—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug or compound being a sugar, nucleoside, nucleotide, nucleic acid, e.g. RNA antisense
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/645—Polycationic or polyanionic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. polylysine, polyarginine, polyglutamic acid or peptide TAT
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Sunt descrise conjugatele de oligomeri antisens complementare unui situs ţintă selectat în gena distrofinei umane pentru a induce omiterea exonului 53.

Description

INFORMAŢII UTILE
Această cerere de brevet revendică beneficiul din cererea provizorie de brevet din US seria nr. 62/436.223, depusă la 19 decembrie 2016, cererea provizorie de brevet din US seria nr. 62/443.484, depusă la 6 ianuarie 2017, cererea provizorie de brevet din US seria nr. 62/479.178, depusă la 30 martie 2017 şi cererea provizorie de brevet din US seria nr. 62/562.146, depusă la 22 septembrie 2017.
DOMENIUL DEZVĂLUIRII
Prezenta descriere se referă la noii conjugaţi oligomerici antisens adecvaţi pentru exonul 53 sărind peste gena distrofinei umane şi compoziţiile farmaceutice ale acestora. Dezvăluirea oferă, de asemenea, conjugaţi şi compoziţii pentru utilizare în inducerea omiterii exonului 53, producând distrofină la un subiect care are o mutaţie a genei distrofinei care poate fi supusă omiterii exonului 53 şi tratând un subiect care are o mutaţie a genei distrofinei care poate fi supusă omiterii exonului 53.
CONTEXTUL DEZVĂLUIRII
Tehnologiile antisens sunt dezvoltate folosind o serie de chimii pentru a afecta expresia genelor la o varietate de niveluri diferite (transcriere, splicare, stabilitate, translaţie). O mare parte din această cercetare s-a concentrat pe utilizarea compuşilor antisens pentru a corecta sau compensa genele anormale sau asociate bolilor într-o gamă largă de indicaţii. Moleculele antisens sunt capabile să inhibe expresia genică cu specificitate şi, din acest motiv, multe eforturi de cercetare privind oligomerii ca modulatori ai expresiei genice s-au concentrat pe inhibarea expresiei genelor vizate sau a funcţiei elementelor care acţionează cis. Oligomerii antisens sunt de obicei îndreptaţi împotriva ARN-ului, fie asupra catenei de sens (de ex., ARNm), fie asupra catenei minus în cazul unor ţinte de ARN viral. Pentru a obţine efectul dorit de reglare descendentă a genei specifice, oligomerii promovează, în general, fie dezintegrarea ARNm vizat, fie blochează translaţia ARNm sau blochează funcţia elementelor ARN cu acţiune cis, prevenind astfel în mod eficient fie sinteza de novo a proteinei ţintă, fie replicarea ARN-ului viral.
Cu toate acestea, astfel de tehnici nu sunt utile în cazul în care obiectul este de a regla ascendent producţia de proteine native sau de a compensa mutaţiile care induc încetarea prematură a translaţiei, cum ar fi mutaţii non-sens sau de schimbare a cadrului. În aceste cazuri, transcriptul genei defecte nu trebuie supus degradării ţintite sau inhibării sterice, astfel încât chimia oligomerului antisens nu trebuie să promoveze descompunerea ARNm ţintă sau translaţia blocului.
Într-o varietate de boli genetice, efectele mutaţiilor asupra exprimării eventuale a unei gene pot fi modulate printr-un proces de omitere a exonului vizat în timpul procesului de splicare. Procesul de splicare este condus de maşinării complexe multicomponente care aduc joncţiunile exon-intron adiacente în pre-ARNm în imediata apropiere şi efectuează scindarea legăturilor fosfodiesterice la capetele intronilor cu reformarea lor ulterioară între exonii care urmează să fie splicaţi. Acest proces complex şi foarte precis este mediat de motive secvenţiale în pre-ARNm, care sunt segmente de ARN relativ scurte, semi-conservate, la care se leagă diverşi factori nucleari de splicare, care sunt apoi implicaţi în reacţiile de splicare. Prin schimbarea modului în care maşinăriile de splicare citesc sau recunosc motivele implicate în procesarea pre-ARNm, este posibil să se creeze molecule de ARNm îmbinate diferenţiat. S-a recunoscut acum că majoritatea genelor umane sunt îmbinate alternativ în timpul exprimării normale a genelor, deşi mecanismele implicate nu au fost identificate. Bennett şi colab. (Brevetul US nr. 6.210.892) descrie modularea antisens a procesării ARNm celular de tip sălbatic utilizând analogi de oligomer antisens care nu induc clivajul ARNază mediat de H al ARN-ului ţintă. Acest lucru este util pentru a putea genera mARN-uri îmbinate alternativ care nu au exoni specifici (vezi, de ex., aşa cum este descris de Sazani, Kole şi colab. 2007 pentru generarea de receptori solubili din superfamilia TNF cărora le lipsesc exonii care codifică domeniile de întindere a membranei).
În cazurile în care o proteină funcţională în mod normal este terminată prematur din cauza mutaţiilor acesteia, un mijloc de restabilire a unei producţii de proteine funcţionale prin tehnologia antisens s-a dovedit a fi posibil prin intervenţie în timpul proceselor de splicare şi dacă exonii asociaţi cu mutaţii cauzatoare de boală pot fi şterşi în mod specific din unele gene, uneori poate fi produs un produs proteic scurtat care are proprietăţi biologice similare cu ale proteinei native sau are o activitate biologică suficientă pentru a ameliora boala cauzată de mutaţiile asociate exonului (vezi, de ex., Sierakowska, Sambade şi colab. 1996; Wilton, Lloyd şi colab. 1999; van Deutekom, Bremmer-Bout şi colab. 2001; Lu, Mann şi colab. 2003; Aartsma-Rus, Janson şi colab. 2004). Kole şi colab. (Brevetele US nr.: 5.627.274; 5.916.808; 5.976.879; şi 5.665.593) dezvăluie metode de combatere a îmbinării aberante utilizând analogi oligomeri antisens modificaţi care nu promovează descompunerea pre-mARN-ului vizat. Bennett şi colab. (Brevetul US nr. 6.210.892) descrie modularea antisens a procesării ARNm celular de tip sălbatic utilizând analogi de oligomer antisens care nu induc clivajul ARNază mediat de H al ARN-ului ţintă.
Procesul de omitere a exonului vizat este probabil să fie deosebit de util în gene lungi în care există mulţi exoni şi introni, în cazul în care există redundanţă în constituţia genetică a exonilor sau în cazul în care o proteină este capabilă să funcţioneze fără unul sau mai mulţi exoni speciali. Eforturile de redirecţionare a procesării genelor pentru tratamentul bolilor genetice asociate trunchierilor cauzate de mutaţii în diferite gene s-au concentrat asupra utilizării oligomerilor antisens care: (1) se suprapun total sau parţial cu elementele implicate în procesul de splicare; sau (2) se leagă de pre-ARNm într-o poziţie suficient de apropiată de element pentru a perturba legarea şi funcţia factorilor de splicare care ar media în mod normal o anumită reacţie de splicare care apare la acel element.
Distrofia musculară Duchenne (DMD) este cauzată de un defect în exprimarea distrofinei proteice. Gena care codifică proteina conţine 79 de exoni răspândiţi pe mai mult de 2 milioane de nucleotide de ADN. Orice mutaţie exonică care modifică cadrul de citire al exonului sau introduce un codon de stopare sau se caracterizează prin îndepărtarea unui exon sau exoni întreg din cadru sau duplicări ale unuia sau mai multor exoni, are potenţialul de a perturba producţia de distrofină funcţională, ducând la DMD.
O formă mai puţin severă de distrofie musculară, distrofia musculară Becker (DMO) s-a constatat că apare în cazul în care o mutaţie, de obicei o deleţie a unuia sau mai multor exoni, are ca rezultat un cadru corect de citire de-a lungul întregii transcripţii a distrofinei, astfel încât translaţia ARNm în proteine nu este încheiată prematur. Dacă unirea exonilor din amonte şi din aval în procesarea unui pre-ARNm de distrofină mutant menţine cadrul corect de citire a genei, rezultatul este un ARNm care codifică o proteină cu o deleţie internă scurtă care păstrează o anumită activitate, rezultând un fenotip Becker.
De mulţi ani se ştie că deleţiile unui exon sau exoni care nu modifică cadrul de citire al unei proteine de distrofină ar da naştere unui fenotip BMD, în timp ce o deleţie a exonului care provoacă o schimbare a cadrului va da naştere DMD (Monaco, Bertelson şi colab.1965. În general, mutaţiile distrofinei, inclusiv mutaţiile punctiforme şi deleţiile exonului, care schimbă cadrul de citire şi, prin urmare, întrerup translaţia corectă a proteinelor, au ca rezultat DMD. De asemenea, trebuie remarcat faptul că unii pacienţi cu DMO şi DMD prezintă deleţii de exonice care acoperă mai mulţi exoni.
Modularea splicării distrofinei mutante cu oligoribonucleotide antisens a fost raportată atât in vitro, cât şi in vivo (vezi, de ex., Matsuo, Masumura şi colab. 1991; Takeshima, Nishio şi colab. 1995; Pramono, Takeshima şi colab. 1996; Dunckley, Eperon şi colab. 1997; Dunckley, Manoharan şi colab. 1996; Wilton, Lloyd şi colab. 1999; Mann, Honeyman şi colab. 2002; Errington, Mann şi colab. 2003).
Oligomerii antisens au fost concepuţi special pentru a viza regiuni specifice ale pre-ARNm, de obicei exoni pentru a induce omiterea unei mutaţii a genei DMD, restaurând astfel aceste mutaţii în cadru pentru a permite producerea unei proteine distrofină scurtată intern, dar funcţională. Se ştie că astfel de oligomeri antisens ţintesc complet în exon (aşa-numitele secvenţe interne ale exonului) sau la un donator de splicare sau la o joncţiune a acceptorului de splicare care traversează din exon într-o porţiune a intronului.
Descoperirea şi dezvoltarea unor astfel de oligomeri antisens pentru DMD a fost un domeniu de cercetare prealabilă. Aceste evoluţii le includ pe cele de la: (1) Universitatea Australiei de Vest şi Sarepta Therapeutics (cesionar al acestei cereri): WO 2006/000057; WO 2010/048586; WO 2011/057350; WO 2014/100714; WO 2014/153240; WO 2014/153220; (2) Academisch Ziekenhuis Leiden/Prosensa Technologies (acum BioMarin Pharmaceutical): WO 02/24906; WO 2004/083432; WO 2004/083446; WO 2006/112705; WO 2007/133105; WO 2009/139630; WO 2009/054725; WO 2010/050801; WO 2010/050802; WO 2010/123369; WO 2013/112053; WO 2014/007620; (3) Carolinas Medical Center: WO 2012/109296; (4) Royal Holloway brevete şi cereri în beneficiul acestuia, şi incluzând US nr. 61/096.073 şi 61/164.978; precum şi US 8.084.601 şi US 2017-0204413(4) JCR Pharmaceuticals şi Matsuo: US 6.653.466; brevete şi cereri care revendică beneficiul acestora, şi incluzând, JP 2000-125448, precum US 6.653.467; brevete şi cereri care revendică beneficiul acestora, şi incluzând, JP 2000-256547, precum US 6.727.355; WO 2004/048570; (5) Nippon Shinyaku: WO 2012/029986; WO 2013/100190; WO 2015/137409; WO 2015/194520; şi (6) Association Institut de Myologie/Universite Pierre et Marie Curie/Universität Bern/Centre national de la Recherche Scientifique/Synthena AG: WO 2010/115993; WO 2013/053928.
Descoperirea şi dezvoltarea oligomerilor antisens conjugaţi cu peptidele care penetrează celulele pentru DMD a fost, de asemenea, un domeniu de cercetare (vezi publicaţia PCT nr. WO 2010/048586; Wu, B. şi colab., The American Journal of Pathology, Vol. 181 (2): 392-400, 2012; Wu, R. şi colab., Nucleic Acids Research, Vol. 35 (15): 5182-5191, 2007; Mulders, S. şi colab., 19th International Congress of the World Muscle Society, Poster Presentation Berlin, October 2014; Bestas, B. şi colab., The Journal of Clinical Investigation, doi: 10.1172/JCI76175, 2014; Jearawiriyapaisarn, N. şi colab., Molecular Therapy, Vol. 16(9): 1624-1629, 2008; Jearawiriyapaisarn, N. şi colab., Cardiovascular Research, Vol. 85: 444-453, 2010; Moulton, H.M. şi colab., Biochemical Society Transactions, Vol. 35 (4): 826-828, 2007; Yin, H. şi colab., Molecular Therapy, Vol. 19 (7): 1295-1303, 2011; Abes, R. şi colab., J. Pept. Sci., Vol. 14: 455-460, 2008; Lebleu, B. şi colab., Advanced Drug Delivery Reviews, Vol. 60: 517-529, 2008; McClorey, G. şi colab., Gene Therapy, Vol. 13: 1373-1381, 2006; Alter, J. şi colab., Nature Medicine, Vol. 12 (2): 175-177, 2006; şi Youngblood, D. şi colab., American Chemical Society, Bioconjugate Chem., 2007, 18 (1), pp. 50-60).
Peptidele care penetrează celulele (CPP), de exemplu, un fragment de transport de peptide bogate în arginină, poate fi eficient pentru a spori penetrarea, de exemplu, a unui oligomer antisens conjugat cu CPP, într-o celulă.
În ciuda acestor eforturi, rămâne necesară îmbunătăţirea oligomerilor antisens care vizează exonul 53 şi compoziţiile farmaceutice corespunzătoare care sunt potenţial utile pentru metodele terapeutice de producere a distrofinei şi de tratare a DMD.
REZUMATUL DEZVĂLUIRII
Prezenta descriere furnizează conjugaţi oligomerici antisens cu Formula (IV):
sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestora.
Într-un alt aspect, dezvăluirea furnizează conjugaţi oligomerici antisens cu Formula (IVA):
Într-un alt aspect, dezvăluirea furnizează compoziţii farmaceutice care includ conjugaţii oligomerului antisens ai dezvăluirii şi un purtător acceptabil farmaceutic. În unele variante de realizare, purtătorul acceptabil farmaceutic este o soluţie salină care include un tampon fosfat.
Într-un alt aspect, dezvăluirea furnizează conjugaţi oligomerici antisens ca mai sus şi compoziţii ale acestora pentru utilizare în tratarea distrofiei musculare Duchenne (DMD) la un subiect care are nevoie de aceasta, în care subiectul are o mutaţie a genei distrofinei care este susceptibilă la omiterea peste exonul 53.
Într-un alt aspect, dezvăluirea furnizează conjugaţi oligomerici antisens ca mai sus şi compoziţii ale acestora pentru utilizare în restaurarea unui cadru de citire a ARNm pentru a induce producţia de distrofină la un subiect care are o mutaţie a genei distrofinei care poate fi supusă omiterii exonului 53. Într-un alt aspect, dezvăluirea oferă conjugaţi oligomerici antisens ca mai sus şi compoziţii ale acestora pentru utilizare în excluderea exonului 53 din pre-ARNm de distrofină în timpul procesării ARNm la un subiect care are o mutaţie a genei distrofinei care poate fi supusă omiterii exonului 53. Într-un alt aspect, dezvăluirea furnizează conjugaţi oligomerici antisens ca mai sus şi compoziţii ale acestora pentru utilizare în legarea exonului 53 al distrofinei pre-ARNm la un subiect care are o mutaţie a genei distrofinei care este susceptibilă la omiterea exonului 53.
Într-un alt aspect, dezvăluirea oferă un conjugat oligomer antisens al dezvăluirii de aici pentru utilizare în terapie. Într-un alt aspect, dezvăluirea oferă, de asemenea, kituri pentru tratarea distrofiei musculare Duchenne (DMD) la un subiect care are nevoie de aceasta, în care subiectul are o mutaţie a genei distrofinei care poate fi supusă omiterii exonului 53, care cuprinde cel puţin un conjugat oligomer antisens din prezenta dezvăluire, ambalat într-un recipient adecvat şi instrucţiuni pentru utilizarea acestuia.
Acestea şi alte obiecte şi caracteristici vor fi mai bine înţelese atunci când următoarea descriere detaliată a dezvăluirii este citită împreună cu figurile.
SCURTĂ DESCRIERE A FIGURILOR
Figura 1 prezintă o secţiune de distrofină normală pre-mARN şi ARNm matur.
Figura 2 prezintă o secţiune de distrofină anormală pre-ARNm (exemplu de DMD) şi rezultând distrofina instabilă, nefuncţională.
Figura 3 (care nu face parte din prezenta invenţie) descrie eteplirsen, conceput pentru a sări peste exonul 51, restaurarea citirii "în cadru" a pre-ARNm.
Figura 4 oferă un grafic cu bare al procentului de omisiune a exonului 53 în mioblastele umane sănătoase prin PMO#1 şi PPMO#1 la diferite concentraţii la 96 de ore după tratament, măsurate prin RT-PCR. Barele de eroare reprezintă media ± SD.
Figurile 5A-5D (care nu fac parte din prezenta invenţie) oferă imagini reprezentative ale analizei Western Blot care măsoară proteina distrofină în cvadricepsul şoarecilor mdx trataţi cu PMO (PMO4225) sau PPMO (PPMO4225) pentru diferite momente de timp [7 zile (5A), 30 zile (5B), 60 zile (5C) şi 90 zile (5D)].
Figura 6A (care nu face parte din prezenta invenţie) oferă un grafic liniar care prezintă procentul de distrofină de tip sălbatic indusă de PMO (PMO4225) sau PPMO (PPMO4225) la cvadricepsul şoarecilor mdx pe o perioadă de 90 de zile după injectare, determinat prin analiza Western Blot.
Figura 6B (care nu face parte din prezenta invenţie) prezintă un grafic liniar care prezintă procentul de omitere a exonului 23 indusă de PMO (PMO4225) sau PPMO (PPMO4225) la cvadricepsul şoarecilor mdx pe o perioadă de 90 de zile post-injectare, determinată prin RT-PCR.
Figurile 7A-7D (care nu fac parte din prezenta invenţie) oferă imagini reprezentative ale analizei Western Blot care măsoară proteina distrofină în diafragma şoarecilor mdx trataţi cu PMO (PMO4225) sau PPMO (PPMO4225) pentru diferite momente de timp [7 zile (7A), 30 zile (7B), 60 zile (7C) şi 90 zile (7D)].
Figura 8A (care nu face parte din prezenta invenţie)oferă un grafic liniar care prezintă procentul de distrofină de tip sălbatic indusă de PMO (PMO4225) sau PPMO (PPMO4225) în diafragma şoarecilor mdx pe o perioadă de 90 de zile după injectare, determinat prin analiza Western Blot.
Figura 8B (care nu face parte din prezenta invenţie) prezintă un grafic liniar care descrie procentul de omitere a exonului 23 indus de PMO (PMO4225) sau PPMO (PPMO4225) în diafragma şoarecilor mdx pe o perioadă de 90 de zile după injectare, determinată prin RT-PCR.
Figura 9A-9D (care nu face parte din prezenta invenţie) oferă imagini reprezentative ale analizei Western Blot care măsoară proteina distrofină în inima şoarecilor mdx trataţi cu PMO (PMO4225) sau PPMO (PPMO4225) pentru diferite momente de timp [7 zile (9A), 30 zile (9B), 60 zile (9C) şi 90 zile (9D)].
Figura 10A (care nu face parte din prezenta invenţie) prezintă un grafic liniar care prezintă procentul de distrofină de tip sălbatic indusă de PMO (PMO4225) sau PPMO (PPMO4225) în inima şoarecilor mdx pe o perioadă de 90 de zile după injectare, determinat prin analiza Western Blot.
Figura 10B (care nu face parte din prezenta invenţie) prezintă un grafic liniar care descrie procentul de omitere a exonului 23 indusă de PMO (PMO4225) sau PPMO (PPMO4225) în inima şoarecilor mdx pe o perioadă de 90 de zile după injectare, determinată prin RT-PCR.
Figura 11 (care nu face parte din prezenta invenţie) furnizează analiza imunohistochimică care arată distrofina la cvadricepsul stâng de şoarece mdx indusă de PMO (PMO4225) sau PPMO (PPMO4225).
Figura 12A-B (nu face parte din prezenta invenţie) oferă imagini reprezentative ale analizei Western Blot care măsoară proteina distrofină în inima şoarecilor mdx trataţi cu PMO (PMO4225) sau PPMO (PPMO4225) pentru diferite doze: 40 mg/kg, 80 mg/kg şi 120 mg/kg.
Figura 13 (care nu face parte din prezenta invenţie) oferă un grafic cu bare care prezintă procentul de distrofină de tip sălbatic indusă de PMO (PMO4225) sau PPMO (PPMO4225) în inima şoarecilor mdx, determinat prin analiza Western Blot la 30 de zile după injectare la diferite doze: 40 mg/kg, 80 mg/kg şi 120 mg/kg.
Figura 14A-B (care nu face parte din prezenta invenţie) oferă imagini reprezentative ale analizei Western Blot care măsoară proteina distrofină în diafragma şoarecilor mdx trataţi cu PMO (PMO4225) sau PPMO (PPMO4225) pentru diferite doze de 40 mg/kg, 80 mg/kg şi 120 mg/kg.
Figura 15 (care nu face parte din prezenta invenţie) oferă un grafic cu bare care descrie procentul de distrofină de tip sălbatic indusă de PMO (PMO4225) sau PPMO (PPMO4225) în diafragma şoarecilor mdx, determinat prin analiza Western Blot la 30 de zile după injectare la diferite doze: 40 mg/kg, 80 mg/kg şi 120 mg/kg.
Figura 16A-B (care nu face parte din prezenta invenţie) oferă imagini reprezentative ale analizei Western Blot care măsoară proteina distrofină în cvadricepsul şoarecilor mdx trataţi cu PMO (PMO4225) sau PPMO (PPMO4225) la diferite doze: 40 mg/kg, 80 mg/kg şi 120 mg/kg.
Figura 17 (care nu face parte din prezenta invenţie) oferă un grafic cu bare care descrie procentul de distrofină de tip sălbatic indusă de PMO (PMO4225) sau PPMO (PPMO4225) în cvadricepsul şoarecilor mdx, determinat prin analiza Western Blot la 30 de zile după injectare la diferite doze: 40 mg/kg, 80 mg/kg şi 120 mg/kg.
Figura 18 prezintă ciclurile de cuplare efectuate prin metoda de sinteză B a PMO.
Figura 19 (care nu face parte din prezenta invenţie) prezintă analiza imunohistochimică care arată distrofina şi laminina la diafragma şoarecelui mdx şi inima indusă de PPMO (PPMO4225) comparativ cu soluţia salină la şoareci mdx şi şoareci de tip sălbatic.
Figura 4 oferă un grafic cu bare al procentului de omitere a exonului 53 în mioblastele umane sănătoase prin PMO#1 şi PPMO#1 la diferite concentraţii la 96 de ore după tratament, măsurate prin RT-PCR. Barele de eroare reprezintă media ± SD.
DESCRIEREA DETALIATĂ A DEZVĂLUIRII
Exemplele de realizare ale prezentei descrieri se referă, în general, la conjugaţi oligomeri antisens îmbunătăţiţi şi utilizările acestora, care sunt special concepute pentru a induce omiterea exonului în gena distrofinei umane. Distrofina joacă un rol vital în funcţia musculară, iar diferitele boli musculare sunt caracterizate prin forme mutante ale acestei gene. Prin urmare, în anumite exemple de realizare, conjugaţii oligomeri antisens îmbunătăţiţi descrişi aici induc omiterea exonului în forme mutante ale genei distrofinei umane, cum ar fi genele distrofinei mutante găsite în distrofia musculară Duchenne (DMD) şi distrofia musculară Becker (BMD).
Datorită evenimentelor aberante de splicare a ARNm cauzate de mutaţii, aceste gene de distrofină umană mutante fie exprimă o proteină de distrofină defectă, fie nu exprimă deloc o distrofină măsurabilă, o afecţiune care duce la diferite forme de distrofie musculară. Pentru a remedia această condiţie, conjugaţii oligomerului antisens din prezenta dezvăluire hibridizează cu regiunile selectate ale unui ARNm pre-procesat al unei gene de distrofină umană mutantă, induc omiterea exonului şi splicarea diferenţială în acel ARNm de distrofină altfel îmbinat aberant şi, astfel, permit celulelor musculare să producă un transcript al ARNm care codifică o proteină distrofină funcţională. În anumite exemple de realizare, proteina distrofină rezultată nu este neapărat forma "sălbatică" a distrofinei, ci este mai degrabă o formă trunchiată, dar funcţională, de distrofină.
Prin creşterea nivelurilor de proteină distrofină funcţională în celulele musculare, acestea şi variantele de realizare aferente sunt utile în profilaxia şi tratamentul distrofiei musculare, în special acele forme de distrofie musculară, cum ar fi DMD şi BMD, care sunt caracterizate prin exprimarea proteinelor de distrofină defecte datorită îmbinării aberante a ARNm.
Conjugaţii oligomeri antisens specifici descrişi aici oferă în continuare o mai bună direcţionare specifică a distrofinei faţă de alţi oligomeri şi, prin urmare, oferă avantaje semnificative şi practice faţă de tratamentele alternative ale formelor relevante de distrofie musculară.
Astfel, dezvăluirea se referă la conjugaţii oligomerului antisens cu Formula (IV):
sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestora.
Situsul de reinelare este H53A(+36+60).
Cu excepţia cazului în care se defineşte altfel, toţi termenii tehnici şi ştiinţifici folosiţi aici au aceeaşi semnificaţie ca în mod obişnuit înţeles de către o persoană de specialitate în domeniul din care face parte această invenţie.
Deşi metode şi materiale similare sau echivalente cu cele descrise aici pot fi utilizate în practica sau testarea prezentei invenţii, metodele şi materialele adecvate sunt descrise mai jos. În sensul prezentei dezvăluiri, următorii termeni sunt definiţi mai jos.
I. Definiţii
Prin "aproximativ" se înţelege o cantitate, nivel, valoare, număr, frecvenţă, procent, dimensiune, mărime, cantitate, greutate sau lungime care variază cu până la 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 sau 1% la o cantitate de referinţă, nivel, valoare, număr, frecvenţă, procent, dimensiune, mărime, cantitate, greutate sau lungime.
"Posibilitatea de a sări peste exonul 53", aşa cum este utilizat aici, în ceea ce priveşte un subiect sau pacient, este destinată să includă subiecţi şi pacienţi care au una sau mai multe mutaţii în gena distrofinei care, în absenţa omiterii exonului 53 al distrofinei pre-ARNm, determină cadrul de citire să fie în afara cadrului, perturbând astfel translaţia pre-ARNm, ducând la incapacitatea subiectului sau a pacientului de a produce distrofină funcţională sau semi-funcţională. Exemple de mutaţii ale genei distrofinei care sunt susceptibile la omiterea exonului 53, include, de exemplu, deleţia: exonilor 42 până la 52, exonilor 45 până la 52, exonilor 47 până la 52, exonilor 48 până la 52, exonilor 49 până la 52, exonilor 50 până la 52 sau exonului 52. Determinarea dacă un pacient are o mutaţie în gena distrofinei care poate fi supusă săririi exonului este bine în sfera de competenţă a unui specialist în domeniu (vezi, de ex., Aartsma-Rus şi colab.(2009) Hum Mutat. 30:293-299; Gurvich şi colab., Hum Mutat. 2009; 30(4) 633-640; şi Fletcher şi colab. (2010) Molecular Therapy 18(6) 1218-1223.).
Termenul "oligomer" aşa cum este utilizat aici se referă la o secvenţă de subunităţi conectate prin legături între subunităţi. În anumite cazuri, termenul "oligomer" este utilizat cu referire la un "oligomer antisens". Pentru "oligomerii antisens", fiecare subunitate constă din: (i) un zahar riboză sau un derivat al acestuia; şi (ii) o nucleobază legată de acesta, astfel încât ordinea fragmentelor de împerechere a bazei formează o secvenţă de bază care este complementară unei secvenţe ţintă într-un acid nucleic (de obicei un ARN) prin împerecherea de bază Watson-Crick, pentru a forma un acid nucleic:oligomer heteroduplex în cadrul secvenţei ţintă cu precizarea că fie subunitatea, fie legătura dintre subunităţi, fie ambele nu apar în mod natural. Oligomerul antisens este un PMO.. Exemple de realizare suplimentare sunt descrise aici.
Termenii "complementar" şi "complementaritate" se referă la doi sau mai mulţi oligomeri (adică fiecare cuprinzând o secvenţă nucleobază) care sunt legaţi unul de celălalt prin regulile de împerechere a bazei Watson-Crick. De exemplu, secvenţa de nucleobază "T-G-A (5'→3')" este complementară secvenţei nucleobazei "A-C-T (3'→5')". Complementaritatea poate fi "parţială", în care mai puţin decât toate nucleobazele dintr-o anumită secvenţă de nucleobază sunt potrivite cu cealaltă secvenţă de nucleobază în conformitate cu regulile de împerechere de bază. De exemplu, în unele variante de realizare, complementaritatea dintre o anumită secvenţă de nucleobază şi cealaltă secvenţă de nucleobază poate fi de aproximativ 70%, aproximativ 75%, aproximativ 80%, aproximativ 85%, aproximativ 90% sau aproximativ 95%. Sau, poate exista o complementaritate "completă" sau "perfectă" (100%) între o anumită secvenţă de nucleobază şi cealaltă secvenţă de nucleobază pentru a continua exemplul. Gradul de complementaritate între secvenţele nucleobazice are efecte semnificative asupra eficienţei şi puterii hibridizării între secvenţe.
Termenii "cantitate eficientă" şi "cantitate eficientă terapeutic" sunt utilizaţi interschimbabil aici şi se referă la o cantitate de compus terapeutic, cum ar fi un oligomer antisens, administrat unui subiect mamifer, fie ca o singură doză, fie ca parte a unei serii de doze, care este eficientă pentru a produce un efect terapeutic dorit. Pentru un oligomer antisens, acest efect este de obicei cauzat de inhibarea translaţiei sau a procesării naturale a îmbinării unei secvenţe ţintă selectate sau de producerea unei cantităţi semnificative clinic de distrofină (semnificaţie statistică).
În unele variante de realizare, o cantitate eficientă este de cel puţin 10 mg/kg sau cel puţin 20 mg/kg dintr-o compoziţie care include un oligomer antisens pentru o perioadă de timp pentru tratarea subiectului. În unele variante de realizare, o cantitate eficientă este de cel puţin 20 mg/kg dintr-o compoziţie care include un oligomer antisens pentru a creşte numărul de fibre pozitive în distrofină la un subiect la cel puţin 20% din normal. În anumite variante de realizare, o cantitate eficientă este de 10 mg/kg sau cel puţin 20 mg/kg dintr-o compoziţie care include un oligomer antisens pentru a stabiliza, menţine sau îmbunătăţi distanţa de mers de la un deficit de 20%, de exemplu într-un 6 MWT, la un pacient, în raport cu un coleg sănătos. În diverse variante de realizare, o cantitate eficientă este de cel puţin 10 mg/kg până la aproximativ 30 mg/kg, cel puţin 20 mg/kg până la aproximativ 30 mg/kg, aproximativ 25 mg/kg până la aproximativ 30 mg/kg sau aproximativ 30 mg/kg până la aproximativ 50 mg/kg. În unele variante de realizare, o cantitate eficientă este de aproximativ 10 mg/kg, aproximativ 20 mg/kg, aproximativ 30 mg/kg sau aproximativ 50 mg/kg. Într-un alt aspect, o cantitate eficientă este de cel puţin 10 mg/kg, aproximativ 20 mg/kg, aproximativ 25 mg/kg, aproximativ 30 mg/kg sau aproximativ 30 mg/kg până la aproximativ 50 mg/kg, timp de cel puţin 24 de săptămâni, cel puţin 36 de săptămâni sau cel puţin 48 de săptămâni, pentru a creşte astfel numărul de fibre pozitive la distrofină la un subiect la cel puţin 20%, aproximativ 30%, aproximativ 40%, aproximativ 50%, aproximativ 60%, aproximativ 70%, aproximativ 80%, aproximativ 90%, aproximativ 95% din normal şi pentru a stabiliza sau îmbunătăţi distanţa de mers de la un deficit de 20%, de exemplu la un 6 MWT, la un pacient relativ la un egal sănătos. În unele variante de realizare, tratamentul creşte numărul de fibre pozitive de distrofină la 20-60% sau 30-50% din normal la pacient.
Prin "a spori" sau "sporire" sau "a creşte" sau "creştere" sau "a stimula" sau "stimulare" se referă, în general, la capacitatea unuia sau mai multor conjugaţi de oligomeri antisens sau compoziţii farmaceutice de a produce sau de a provoca un răspuns fiziologic mai mare (adică efecte în aval) într-o celulă sau un subiect, în comparaţie cu răspunsul cauzat fie de lipsa unui conjugat de oligomeri antisens, fie a unui compus de control. Un răspuns fiziologic mai mare poate include expresia crescută a unei forme funcţionale a unei proteine distrofină sau activitatea biologică crescută a distrofinei în ţesutul muscular, printre alte răspunsuri evidente din înţelegerea în domeniu şi descrierea de aici. De asemenea, poate fi măsurată creşterea funcţiei musculare, inclusiv creşteri sau îmbunătăţiri ale funcţiei musculare cu aproximativ 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% sau 100%. Procentul de fibre musculare care exprimă o distrofină funcţională poate fi, de asemenea, măsurat, inclusiv expresia crescută a distrofinei în aproximativ 1%, 2%, 5%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% sau 100% din fibrele musculare. De exemplu, s-a arătat că aproximativ 40% din îmbunătăţirea funcţiei musculare poate apărea dacă 25-30% din fibre exprimă distrofină (vezi, de ex., DelloRusso şi colab., Proc Natl Acad Sci usa 99: 12979-12984, 2002). O cantitate "crescută" sau "îmbunătăţită" este de obicei o cantitate "semnificativă statistic" şi poate include o creştere care este de 1,1, 1,2, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50 sau mai multe ori (de ex., de 500, 1000 de ori, inclusiv toate numerele întregi şi zecimalele dintre şi peste 1), de ex., 1,5, 1,6, 1,7, 1,8 etc.) cantitatea produsă de un conjugat oligomer non antisens (absenţa unui agent) sau de un compus de control.
Aşa cum sunt utilizaţi aici, termenii "funcţie" şi "funcţional" şi alţii asemenea se referă la o funcţie biologică, enzimatică sau terapeutică.
O proteină distrofină "funcţională" se referă în general la o proteină de distrofină care are o activitate biologică suficientă pentru a reduce degradarea progresivă a ţesutului muscular care este altfel caracteristică distrofiei musculare, de obicei în comparaţie cu forma modificată sau "defectă" a proteinei distrofină care este prezentă la anumiţi subiecţi cu DMD sau BMD. În anumite exemple de realizare, o proteină distrofină funcţională poate avea aproximativ 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% sau 100% (inclusiv toate numerele întregi între ele) din activitatea biologică in vitro sau in vivo a distrofinei de tip sălbatic, măsurată conform tehnicilor de rutină din domeniu. Ca un exemplu, activitatea legată de distrofină în culturile musculare in vitro poate fi măsurată în funcţie de dimensiunea miotubului, organizarea miofibrilului (sau dezorganizarea), activitatea contractilă şi gruparea spontană a receptorilor de acetilcolină (vezi, de ex., Brown şi colab., Journal of Cell Science. 112:209-216, 1999).
Modelele animale sunt, de asemenea, resurse valoroase pentru studierea patogenezei bolii şi oferă un mijloc de testare a activităţii legate de distrofină. Două dintre cele mai utilizate modele animale pentru cercetarea DMD sunt şoarecele mdx şi câinele cu distrofie musculară Golden Retriever (GRMD), ambele fiind negative în ceea ce priveşte distrofina (vezi, de ex., Collins & Morgan, Int J Exp Pathol 84: 165-172, 2003).
Acestea şi alte modele animale pot fi utilizate pentru a măsura activitatea funcţională a diferitelor proteine de distrofină. Sunt incluse formele trunchiate de distrofină, cum ar fi acele forme care sunt produse în urma administrării anumitor conjugaţi oligomerici antisens ai exonului din prezenta descriere.
Termenii "neconcordanţă" sau "neconcordanţe" se referă la una sau mai multe nucleobaze (fie contigue, fie separate) într-o secvenţă de nucleobază oligomerică care nu sunt potrivite cu un pre-mARN ţintă în conformitate cu regulile de împerechere de bază. În timp ce complementaritatea perfectă este adesea dorită, unele variante de realizare pot include una sau mai multe, dar preferabil 6, 5, 4, 3, 2 sau 1 neconcordanţe în ce priveşte pre-mARN ţintă. Sunt incluse variaţii în orice locaţie din cadrul oligomerului. În anumite exemple de realizare, conjugaţii oligomerului antisens din dezvăluire includ variaţii în secvenţa nucleobazei în apropierea variaţiilor terminale din interior şi dacă sunt prezenţi sunt de obicei în aproximativ 6, 5, 4, 3, 2 sau 1 subunităţi ale terminusului 5' şi/sau 3'.
Termenii "morfolino", "oligomer morfolino" şi "PMO" se referă la un oligomer morfolino fosforodiamidat cu următoarea structură generală:
şi aşa cum este descris în figura 2 din Summerton, J. şi colab., Antisense & Nucleic Acid Drug Development, 7: 187-195 (1997). Morfolinele aşa cum sunt descrise aici includ toţi stereoizomerii şi tautomerii structurii generale de mai sus. Sinteza, structurile şi caracteristicile de legare ale oligomerilor morfolino sunt detaliate în brevetele US nr.: 5.698.685; 5.217.866; 5.142.047; 5.034.506; 5.166.315; 5.521.063; 5.506.337; 8.076.476; şi 8.299.206.
Morfolino din prezenta invenţie este conjugat la capătul 5' al oligomerului cu o fracţiune "coadă" pentru a-i creşte stabilitatea şi/sau solubilitatea. Fracţiunea coadă este fracţiunea coadă de mai sus este, de asemenea, menţionată ca "TEG" sau "EG3".
Aşa cum se utilizează aici, termenii "-G- R6" şi "-G- R6-Ac" sunt utilizaţi interschimbabil şi se referă la o parte peptidică conjugată cu un oligomer antisens al dezvăluirii. În diverse variante de realizare, "G" reprezintă un reziduu de glicină conjugat la "R6" printr-o legătură amidică şi fiecare "R" reprezintă un reziduu de arginină conjugat împreună prin legături amidice, astfel încât "R6" înseamnă şase (6) reziduuri de arginină conjugate împreună prin legături amidice. Reziduurile de arginină sunt reziduuri de L-arginină. "-G- R6" sau "-G-R6-Ac" este conjugat cu azotul inelar de morfolină din subunitatea 3' cea mai morfolino a unui oligomer antisens PMO al dezvăluirii. "-G- R6" sau "-G- R6-Ac" este conjugat la capătul 3'al unui oligomer antisens al dezvăluirii şi are următoarea formulă:
sau
Termenii "nucleobază" (Nu), "grupare de bază" sau "bază" sunt utilizaţi interschimbabil pentru a se referi la o bază purinică sau pirimidină care se găseşte în mod natural sau ADN sau ARN "nativ" (de ex., uracil, timină, adenină, citozină şi guanină).
Sintagmele "administrare parenterală" şi "administrată parenteral" aşa cum sunt utilizate aici înseamnă alte moduri de administrare decât administrarea enterică şi topică, de obicei prin injecţie şi include, fără limitare, injecţii şi perfuzii intravenoase, intraspinale, intramusculare, intraorbitale, intracardiace, intradermice, intraperitoneale, transtraheale, subcutanate, subcuticulare, intraarticulare, subcapsulare, subarahnoidiene, intraspinale şi intrasternale.
Pentru claritate, structurile dezvăluirii, inclusiv, de exemplu, Formula (IV), sunt continue de la 5' la 3' şi, pentru a descrie întreaga structură într-o formă compactă, au fost incluse diferite pauze de ilustrare etichetate "PAUZA A", "PAUZA B" şi "PAUZA C". După cum ar înţelege, specialistul calificat, de exemplu, fiecare indicaţie a "PAUZA A" arată o continuare a ilustrării structurii în aceste puncte. Specialistul calificat înţelege că acelaşi lucru este valabil pentru fiecare caz de "PAUZĂ B"» şi pentru "PAUZĂ C" în structurile de mai sus. Cu toate acestea, niciuna dintre pauzele ilustrate nu este menită să indice şi nici nu ar înţelege specialistul calificat că acestea înseamnă o întrerupere efectivă a structurii de mai sus.
Aşa cum este utilizat aici, un set de paranteze utilizate într-o formulă structurală indică faptul că se repetă caracteristica structurală dintre paranteze. În unele variante de realizare, parantezele utilizate pot fi "[" şi "]", iar în anumite variante de realizare, parantezele utilizate pentru a indica repetarea caracteristicilor structurale pot fi "(" şi ")". În unele variante de realizare, numărul de iteraţii repetate ale caracteristicii structurale între paranteze este numărul indicat în afara parantezelor, cum ar fi 2, 3, 4, 5, 6, 7 şi aşa mai departe. În diverse variante de realizare, numărul de iteraţii repetate ale caracteristicii structurale între paranteze este indicat de o variabilă indicată în afara parantezelor, cum ar fi "Z".
Aşa cum este utilizat aici, o legătură liniară sau o legătură ondulată atrasă la un carbon chiral sau un atom de fosfor într-o formulă structurală indică faptul că stereochimia carbonului chiral sau a fosforului este nedefinită şi este destinată să includă toate formele centrului chiral. Exemple de astfel de ilustraţii sunt prezentate mai jos.
Expresia "acceptabil farmaceutic" înseamnă că substanţa sau compoziţia trebuie să fie compatibilă, chimic şi/sau toxicologic, cu celelalte ingrediente care cuprind o formulare şi/sau subiectul tratat cu acestea.
Expresia "purtător acceptabil farmaceutic" aşa cum este utilizată aici înseamnă un agent de umplere, diluant, material încapsulat sau auxiliar de formulare netoxic, solid, semisolid sau lichid de orice tip. Câteva exemple de materiale care pot servi drept purtători acceptabili farmaceutic sunt: zaharuri cum ar fi lactoza, glucoza şi zaharoza; amidonuri cum ar fi amidonul de porumb şi amidonul din cartofi; celuloză şi derivaţii săi cum ar fi carboximetilceluloza sodică, etilceluloza şi acetatul de celuloză; tragacant pudră; malţ; gelatină; talc; excipienţi cum ar fi untul de cacao şi cerurile supozitoare; uleiuri cum ar fi uleiul de arahide, uleiul din seminţe de bumbac, uleiul de şofrănaş, uleiul de susan, uleiul de măsline, uleiul de porumb şi uleiul de soia; glicoli cum ar fi propilenglicol; esteri cum ar fi oleat de etil şi etilurat; agar; agenţi de tamponare cum ar fi hidroxidul de magneziu şi hidroxidul de aluminiu; acidul alginic; apa fără pirogen; izotonice; soluţia Ringer; alcool etilic; soluţii tampon; lubrifianţi compatibili netoxici, cum ar fi lauril sulfat de sodiu şi stearat de magneziu; agenţi de colorare; agenţi de eliberare; agenţi de acoperire; agenţi de îndulcire; agenţi de aromatizare; agenţi de parfumare; conservanţi; şi antioxidanţi; în acord cu gândirea formulatorului. \tabTermenul "restaurare" cu privire la sinteza sau producţia distrofinei se referă, în general, la producerea unei proteine de distrofină, inclusiv forme trunchiate de distrofină la un pacient cu distrofie musculară în urma tratamentului cu un conjugat oligomer antisens descris aici. În unele variante de realizare, tratamentul are ca rezultat o creştere a producţiei de distrofină nouă la un pacient cu 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% sau 100% (inclusiv toate numerele întregi între ele). În unele variante de realizare, tratamentul creşte numărul de fibre pozitive la distrofină la cel puţin aproximativ 20%, aproximativ 30%, aproximativ 40%, aproximativ 50%, aproximativ 60%, aproximativ 70%, aproximativ 80% sau aproximativ 95% până la 100% din normal în subiect. În alte variante de realizare, tratamentul creşte numărul de fibre pozitive la distrofină la aproximativ 20% până la aproximativ 60% sau aproximativ 30% până la aproximativ 50% din normal în subiect. Procentul de fibre distrofină-pozitive la un pacient după tratament poate fi determinat printr-o biopsie musculară utilizând tehnici cunoscute. De exemplu, o biopsie musculară poate fi prelevată dintr-un muşchi adecvat, cum ar fi muşchiul biceps brahial la un pacient. Analiza procentului de fibre de distrofină pozitive poate fi efectuată înainte de tratament şi/sau după tratament sau la momente de timp pe parcursul tratamentului.
În unele variante de realizare, se efectuează o biopsie post-tratament din muşchiul contralateral din biopsia anterioară tratamentului. Analiza de expresie a distrofinei înainte şi după tratament poate fi efectuată utilizând orice test adecvat pentru distrofină. În unele variante de realizare, detectarea imunohistochimică se efectuează pe secţiuni de ţesut din biopsia musculară utilizând un anticorp care este un marker pentru distrofină, cum ar fi un anticorp monoclonal sau policlonal. De exemplu, se poate utiliza anticorpul MANDYS106, care este un marker extrem de sensibil pentru distrofină. Se poate utiliza orice anticorp secundar adecvat.
În unele variante de realizare, procentul de fibre pozitive la distrofină se calculează împărţind numărul de fibre pozitive la numărul total de fibre numărate. Probele musculare normale au fibre 100% pozitive la distrofină. Prin urmare, procentul de fibre pozitive la distrofină poate fi exprimat ca procent din normal. Pentru a controla prezenţa urmelor de distrofină în muşchiul anterior tratamentului, precum şi a fibrelor reversibile, se poate stabili o linie de bază utilizând secţiuni de muşchi anterior tratamentului de la un pacient atunci când se numără fibrele pozitive la distrofină în muşchii post-tratament. Acesta poate fi utilizat ca prag pentru numărarea fibrelor cu distrofină pozitivă în secţiunile muşchiului post-tratament la acel pacient. În alte exemple de realizare, secţiunile de ţesut colorate cu anticorpi pot fi, de asemenea, utilizate pentru cuantificarea distrofinei utilizând software-ul de analiză a imaginii Bioquant (Bioquant Image Analysis Corporation, Nashville, TN). Intensitatea totală a semnalului de fluorescenţă a distrofinei poate fi raportată ca procent din normal. În plus, analiza Western blot cu anticorpi monoclonali sau policlonali anti-distrofină poate fi utilizată pentru a determina procentul de fibre pozitive la distrofină. De exemplu, poate fi utilizat anticorpul anti-distrofină NCL-Dys1 de la Leica Biosystems. Procentul de fibre pozitive la distrofină poate fi, de asemenea, analizat prin determinare expresiei componentelor de complex sarcoglican (β,γ) şi/sau neuronal NOS).
În unele variante de realizare, tratamentul cu un conjugat oligomer antisens al dezvăluirii încetineşte sau reduce disfuncţia musculară respiratorie progresivă şi/sau eşecul la pacienţii cu DMD care ar fi de aşteptat fără tratament. În unele variante de realizare, tratamentul cu un conjugat oligomer antisens al dezvăluirii poate reduce sau elimina nevoia de asistenţă de ventilaţie care ar fi de aşteptat fără tratament. În unele variante de realizare, măsurătorile funcţiei respiratorii pentru urmărirea evoluţiei bolii, precum şi evaluarea potenţialelor intervenţii terapeutice includ presiunea inspiratorie maximă (MIP), presiunea expiratorie maximă (MEP) şi capacitatea vitală forţată (FVC).
MIP şi MEP măsoară nivelul de presiune pe care o persoană îl poate genera în timpul inhalării şi, respectiv, expiraţiei şi sunt măsuri sensibile ale forţei muşchilor respiratori.
MIP este o măsură a slăbiciunii muşchilor diafragmei.
În unele variante de realizare, MEP poate scădea înainte de modificările altor teste ale funcţiei pulmonare, inclusiv MIP şi FVC. În anumite exemple de realizare, MEP poate fi un indicator precoce al disfuncţiei respiratorii. În anumite variante de realizare, FVC poate fi utilizat pentru a măsura volumul total de aer expulzat în timpul expiraţiei forţate după inspiraţie maximă. La pacienţii cu DMD, FVC creşte concomitent cu creşterea fizică până la începutul adolescenţei. Cu toate acestea, pe măsură ce creşterea încetineşte sau este împiedicată de progresia bolii, iar slăbiciunea musculară progresează, capacitatea vitală intră într-o fază descendentă şi scade cu o rată medie de aproximativ 8 până la 8,5% pe an după vârsta de 10 până la 12 ani. În anumite variante de realizare, procentul MIP estimat (MIP ajustat în funcţie de greutate), procentul MEP estimat (MEP ajustat în funcţie de vârstă) şi procentul FVC estimat (FVC ajustat în funcţie de vârstă şi înălţime) sunt analize susţinut.
Termenii "subiect" şi "pacient" aşa cum sunt utilizaţi aici includ orice animal care prezintă un simptom sau este expus riscului de a prezenta un simptom, care poate fi tratat cu un conjugat oligomer antisens al dezvăluirii, cum ar fi un subiect (sau pacient) care are sau este expus riscului de a avea DMD sau BMD sau oricare dintre simptomele asociate cu aceste afecţiuni (de ex., pierderea fibrelor musculare). Subiecţii adecvaţi (sau pacienţii) includ animale de laborator (cum ar fi şoareci, şobolani, iepuri sau cobai), animale de fermă şi animale domestice sau animale de companie (cum ar fi o pisică sau un câine). Sunt incluse primatele neumane şi, de preferinţă, pacienţii umani (sau subiecţii). De asemenea, sunt incluse metode de producere a distrofinei la un subiect (sau pacient) care are o mutaţie a genei distrofinei care poate fi supusă omiterii exonului 51.
Expresiile "administrare sistemică", "administrare sistematică", "administrare periferică" şi "administrată periferic" aşa cum sunt utilizate aici înseamnă administrarea unui compus, medicament sau alt material decât direct în sistemul nervos central, astfel încât intră în sistemul pacientului şi, astfel, este supus metabolismului şi altor procese similare, de exemplu, administrarea subcutanată.
Faza "secvenţă de ţintire" se referă la o secvenţă de nucleobaze ale unui oligomer care este complementară unei secvenţe de nucleotide într-un pre-mARN ţintă. În unele variante de realizare a dezvăluirii, secvenţa de nucleotide în pre-mARN ţintă este un situs de reinelare a exon 53 în pre-mARN de distrofină desemnat ca H53A(+36+60).
"Tratamentul" unui subiect (de ex., un mamifer, cum ar fi un om) sau o celulă este orice tip de intervenţie utilizată într-o încercare de a modifica cursul natural al subiectului sau al celulei. Tratamentul include, dar nu se limitează la administrarea unui oligomer sau a unei compoziţii farmaceutice a acestuia şi poate fi efectuat fie profilactic, fie ulterior iniţierii unui eveniment patologic sau contactului cu un agent etiologic. Tratamentul include orice efect dezirabil asupra simptomelor sau patologiei unei boli sau afecţiuni asociate cu proteina distrofină, ca în cazul anumitor forme de distrofie musculară, şi poate include, de exemplu, modificări sau ameliorări minime ale unuia sau mai multor markeri măsurabili ai bolii sau afecţiunii tratate. De asemenea, sunt incluse tratamentele "profilactice", care pot fi direcţionate către reducerea ratei de progresie a bolii sau afecţiunii tratate, întârzierea apariţiei bolii sau afecţiunii respective sau reducerea severităţii apariţiei acesteia. "Tratamentul" sau "profilaxia" nu indică neapărat eradicarea completă, vindecarea sau prevenirea bolii sau a afecţiunii sau a simptomelor asociate acesteia.
În unele variante de realizare, tratamentul cu un conjugat oligomer antisens al dezvăluirii creşte producţia de distrofină nouă, întârzie progresia bolii, încetineşte sau reduce pierderea mersului, reduce inflamaţia musculară, reduce deteriorarea musculară, îmbunătăţeşte funcţia musculară, reduce pierderea funcţiei pulmonare şi/sau îmbunătăţeşte regenerarea musculară care ar fi de aşteptat fără tratament. În unele variante de realizare, tratamentul menţine, întârzie sau încetineşte progresia bolii. În unele variante de realizare, tratamentul menţine mersul sau reduce pierderea mersului. În unele variante de realizare, tratamentul menţine funcţia pulmonară sau reduce pierderea funcţiei pulmonare. În unele variante de realizare, tratamentul menţine sau creşte o distanţă de mers stabil pe jos la un pacient, măsurată, de exemplu, prin testul de mers de 6 minute (6MWT). În unele variante de realizare, tratamentul menţine sau reduce timpul de mers/rulare la 10 metri (adică testul de mers/rulare la 10 metri). În unele variante de realizare, tratamentul menţine sau reduce timpul de stat în picioare de la decubit dorsal (adică testul timpului de stat în picioare). În unele variante de realizare, tratamentul menţine sau reduce timpul de urcare a patru scări standard (adică testul de urcare cu patru trepte). În unele variante de realizare, tratamentul menţine sau reduce inflamaţia musculară la pacient, măsurată, de exemplu, prin IRM (de exemplu, IRM-ul muşchilor piciorului). În unele variante de realizare, IRM măsoară T2 şi/sau fracţia de grăsime pentru a identifica degenerarea musculară. IRM-ul poate identifica modificări ale structurii musculare şi compoziţiei cauzate de inflamaţie, edem, leziuni musculare şi infiltrarea grăsimilor.
În unele variante de realizare, tratamentul cu un conjugat oligomer antisens al dezvăluirii creşte producţia de distrofină nouă şi încetineşte sau reduce pierderea mersului care ar fi de aşteptat fără tratament. De exemplu, tratamentul poate stabiliza, menţine, îmbunătăţi sau creşte capacitatea de mers (de ex., stabilizarea mersului) la subiect. În unele variante de realizare, tratamentul menţine sau creşte o distanţă stabilă de mers pe jos la un pacient, măsurată, de exemplu, prin testul de mers de 6 minute (6MWT), descris de McDonald şi colab. (Muscle Nerve, 2010; 42:966-74). O modificare a distanţei parcurse prin mers pe jos timp de 6 minute (6MWD) poate fi exprimată ca valoare absolută, o modificare procentuală sau o modificare a valorii % prevăzute. În unele variante de realizare, tratamentul menţine sau îmbunătăţeşte o distanţă stabilă de mers pe jos într-un 6MWT de la un deficit de 20% la subiect comparativ cu un coleg sănătos. Performanţa unui pacient cu DMD în 6MWT în raport cu performanţa tipică a unui coleg sănătos poate fi determinată prin calcularea unei valori % prevăzute. De exemplu, procentul de 6MWD prevăzut poate fi calculat utilizând următoarea ecuaţie pentru bărbaţi: 196,72 + (39,81 × vârstă) - (1,36 × vârstă2) + (132,28 × înălţime în metri). Pentru femei, valoarea % 6MWD prognozată poate fi calculată utilizând următoarea ecuaţie: 188,61 + (51,50 x vârsta) - (1,86 x vârsta2) + (86,10 x înălţimea în metri) (Henricson şi colab. PLoS Curr., 2012, versiunea 2). În unele variante de realizare, tratamentul cu un oligomer antisens creşte distanţa stabilă de mers pe jos la pacient de la intrarea în studiu la mai mult de 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30 sau 50 de metri (inclusiv toate numerele întregi între ele). \tabPierderea funcţiei musculare la pacienţii cu DMD poate apărea pe fondul creşterii şi dezvoltării normale a copilăriei. Într-adevăr, copiii mai mici cu DMD pot prezenta o creştere a distanţei parcurse pe jos în timpul 6MWT pe parcursul a aproximativ 1 an, în ciuda insuficienţei musculare progresive. În unele variante de realizare, 6MWD de la pacienţii cu DMD este comparat cu subiecţii de control care dezvoltă în mod tipic şi cu datele normative existente de la subiecţii cu vârsta şi sexul potrivite. În unele variante de realizare, creşterea şi dezvoltarea normală pot fi luate în considerare utilizând o ecuaţie bazată pe vârstă şi înălţime, adaptată datelor normative. O astfel de ecuaţie poate fi utilizată pentru a converti 6MWD la o valoare procentuală anticipată (% anticipată) la subiecţii cu DMD. În anumite exemple de realizare, analiza datelor 6MWD prognozate reprezintă o metodă pentru a ţine cont de creşterea şi dezvoltarea normală şi poate arăta că câştigurile în funcţie la vârste fragede (de ex., mai mici sau egale cu vârsta de 7 ani) reprezintă abilităţi stabile, mai degrabă decât îmbunătăţirea abilităţilor la pacienţii cu DMD (Henricson şi colab. PLoS Curr., 2012, versiunea 2). A fost propus şi publicat un sistem de nomenclatură antisens molecular pentru a distinge între diferitele molecule antisens (vezi Mann şi colab., (2002) J Gen Med 4, 644-654). Această nomenclatură a devenit deosebit de relevantă atunci când se testează mai multe molecule antisens uşor diferite, toate îndreptate spre aceeaşi regiune ţintă, după cum se arată mai jos:
Prima literă desemnează specia (de ex., H: uman, M: murin, C: canin). "#" desemnează numărul exonului distrofinei ţintă. "A/D" indică locul de splicare al acceptorului sau donatorului la începutul şi, respectiv, la sfârşitul exonului. (x y) reprezintă coordonatele de reinelare unde "-" sau "+" indică secvenţe intronice sau, respectiv, exonice. De exemplu, A(-6+18) ar indica ultimele 6 baze ale intronului care preced exonul ţintă şi primele 18 baze ale exonului ţintă. Cel mai apropiat loc de splicare ar fi acceptorul, astfel încât aceste coordonate ar fi precedate de un "A". Descrierea coordonatelor de reinelare la situsul îmbinării donatorului ar putea fi D(+2-18) unde ultimele 2 baze exonice şi primele 18 baze intronice corespund situsului de reinelare al moleculei antisens. Coordonate de reinelare complet exonice care ar fi reprezentate de A(+65+85), adică locul dintre nucleotida 65 şi 85 de la începutul acelui exon.
II. Oligomeri antisens
A. Conjugaţi de oligomer antisens concepuţi pentru a induce omiterea Exonului 53
Conjugaţii oligomerului antisens din dezvăluire sunt de Formula (IV) şi sunt complementari unei regiuni ţintă a exonului 53 a genei distrofinei şi induc omiterea exonului 53. În special, comunicarea se referă la conjugaţii oligomerului antisens care sunt complementari unei regiuni-ţintă exon 53 a pre-mARN de distrofină desemnată ca situs de reinelare. Locaţia de reinelare este H53A(+36+60).
Conjugaţii oligomerului antisens ai distrofinei ţintă pre-mARN şi induce omiterea exonului 53, astfel încât este exclusă sau omisă din transcriptul ARNm-ului matur îmbinat. Sărind peste exonul 53, cadrul de citire perturbat este restabilit la o mutaţie în cadru. În timp ce DMD este alcătuit din diferite subtipuri genetice, conjugaţii oligomerului antisens ai dezvăluirii au fost concepuţi special pentru a sări peste exonul 53 al pre-mARN distrofinei. Mutaţiile DMD predispuse la omiterea exonului 53 cuprind un subgrup de pacienţi cu DMD (8%).
Oligomeri morfolino
B. Caracteristicile chimice ale oligomerului
Conjugatul oligomerului antisens din prezenta invenţie este cu Formula (IV):
sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.
În unele variante de realizare, un conjugat oligomer antisens cu formula (IV) este o sare de HCl (acid clorhidric) a acestuia. În anumite variante de realizare, sarea HCl este o sare 6HCl.
În unele variante de realizare, inclusiv, de exemplu, variante de oligomer conjugat antisens cu Formula (IV), un conjugat antisens oligomer al dezvăluirii este în conformitate cu Formula (IVA):
Săruri acceptabile farmaceutic ale conjugaţilor oligomerului antisens
Anumite exemple de realizare ale conjugaţilor oligomerului antisens descrişi aici pot conţine o grupare funcţională de bază, cum ar fi amino sau alchilamino, şi sunt, astfel, capabile să formeze săruri acceptabile farmaceutic cu acizi acceptabili farmaceutic. Termenul « săruri acceptabile farmaceutic» în acest sens se referă la sărurile de adiţie acidă relativ netoxice, anorganice şi organice ale conjugaţilor oligomerului antisens din prezenta descriere. Aceste săruri pot fi preparate in situ în vehiculul de administrare sau în procesul de fabricaţie a formei de dozare sau prin reacţia separată a unui conjugat de oligomer antisens purificat al prezentării sub formă de bază liberă cu un acid organic sau anorganic adecvat şi prin izolarea sării astfel formate în timpul purificării ulterioare. Sărurile reprezentative includ sărurile de bromhidrat, clorhidrat, sulfat, bisulfat, fosfat, nitrat, acetat, valerat, oleat, palmitat, stearat, laurat, benzoat, lactat, tosilat, citrat, maleat, fumarat, succinat, tartrat, naftilat, mesilat, glucoheptonat, lactobionat şi laurilsulfonat. (Vezi, de ex., Berge şi colab. (1977) Pharmaceutical Salts, J. Pharm. Sci. 66: 1-19).
Sărurile acceptabile farmaceutic ale conjugaţilor oligomerului antisens subiect includ sărurile convenţionale netoxice sau sărurile cuaternare de amoniu ale conjugaţilor oligomerului antisens, de exemplu, din acizi organici sau anorganici netoxici. De exemplu, astfel de săruri netoxice convenţionale le includ pe cele derivate din acizi anorganici precum acid clorhidric, bromhidric, sulfuric, sulfamic, fosforic şi nitric; şi sărurile preparate din acizi organici precum acetic, propionic, succinic, glicolic, stearic, lactic, malic, tartric, citric, ascorbic, palmitic, maleic, hidroximaleic, fenilacetic, glutamic, benzoic, salicilic, sulfanilic, 2-acetoxibenzoic, fumaric, toluensulfonic, metansulfonic, etan disulfonic, oxalic şi izotionic.
În anumite variante de realizare, conjugaţii oligomerului antisens din prezenta dezvăluire pot conţine una sau mai multe grupări funcţionale acide şi, astfel, sunt capabili să formeze săruri acceptabile farmaceutic cu baze acceptabile farmaceutic. Termenul "săruri acceptabile farmaceutic" în aceste cazuri se referă la sărurile de adiţie de bază relativ netoxice, anorganice şi organice ale conjugaţilor oligomerului antisens din prezenta descriere. Aceste săruri pot fi, de asemenea, preparate in situ în vehiculul de administrare sau în procesul de fabricaţie a formei de dozare sau prin reacţia separată a conjugatului oligomerului antisens purificat în forma sa de acid liber cu o bază adecvată, cum ar fi hidroxidul, carbonatul sau bicarbonatul unui cation metalic acceptabil farmaceutic, cu amoniac sau cu o amină primară, secundară sau terţiară organică acceptabilă farmaceutic. Sărurile reprezentative de pământuri alcaline sau alcaline includ sărurile de litiu, sodiu, potasiu, calciu, magneziu şi aluminiu. Aminele organice reprezentative utile pentru formarea sărurilor de adiţie de bază includ etilamină, dietilamină, etilendiamină, etanolamină, dietanolamină şi piperazină. (Vezi, de ex., Berge şi colab., supra).
III. Formulări şi moduri de administrare
În anumite exemple de realizare, prezenta descriere furnizează formulări sau compoziţii farmaceutice adecvate pentru livrarea terapeutică a conjugaţilor oligomerului antisens, aşa cum este descris aici.
Prin urmare, în anumite exemple de realizare, prezenta descriere oferă compoziţii acceptabile farmaceutic care cuprind o cantitate eficientă terapeutic a unuia sau mai multor conjugaţi oligomeri antisens descrişi aici, formulaţi împreună cu unul sau mai mulţi purtători acceptabili farmaceutic (aditivi) şi/sau diluanţi. Deşi este posibil ca un conjugat oligomer antisens din prezenta descriere să fie administrat singur, este de preferat să se administreze conjugatul oligomer antisens ca o formulare farmaceutică (compoziţie). Conjugatul oligomer antisens al formulării este conform Formulei (IV) sau o sare acceptabilă farmaceutic a acesteia.
Metodele de livrare a moleculelor de acid nucleic, care pot fi aplicabile conjugaţilor oligomerului antisens din prezenta descriere, sunt descrise, de exemplu, în: Akhtar şi colab., 1992, Trends Cell Bio., 2:139; Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akhtar, 1995, CRC Press; şi Sullivan şi colab., pct WO 94/02595. Acestea şi alte protocoale pot fi utilizate pentru livrarea oricărei molecule de acid nucleic, inclusiv conjugaţii oligomerului antisens din prezenta dezvăluire.
Compoziţiile farmaceutice din prezenta descriere pot fi special formulate pentru administrare în formă solidă sau lichidă, inclusiv cele adaptate pentru următoarele: (1) administrare orală, de exemplu, prin stropire (soluţii sau suspensii apoase sau neapoase), tablete (destinate pentru absorbţie bucală, sublinguală sau sistemică), bolusuri, pulberi, granule, paste pentru aplicare pe limbă; (2) administrare parenterală, de exemplu, prin injecţie subcutanată, intramusculară, intravenoasă sau epidurală ca, de exemplu, o soluţie sau suspensie sterilă sau o formulare cu eliberare susţinută; (3) aplicare topică, de exemplu, ca o cremă, unguent sau un plasture sau spray cu eliberare controlată aplicat pe piele; (4) injecţie intravaginală sau intrarectală, de exemplu, ca pesarii, cremă sau spumă; (5) sublingual; (6) ocular; (7) transdermic; sau (8) nazal.
Unele exemple de materiale care pot servi drept purtători acceptabili farmaceutic includ, fără limitare: (1) zaharuri, cum ar fi lactoza, glucoza şi zaharoza; (2) amidon, cum ar fi amidon de porumb şi amidon de cartofi; (3) celuloză şi derivaţii săi, cum ar fi carboximetilceluloză de sodiu, etilceluloză şi acetat de celuloză; (4) tragacant praf; (5) malţ; (6) gelatină; (7) talc; (8) excipienţi, cum ar fi unt de cacao şi ceara de supozitoare; (9) uleiuri, cum ar fi ulei de arahide, ulei de bumbac, ulei de şofrănel, ulei de susan, ulei de măsline, ulei de porumb şi ulei de soia; (10) glicoli, cum ar fi propilenglicol; (11) polimeri, cum ar fi glicerina, sorbitol, manitol şi polietilenglicol; (12) esteri, cum ar fi oleat de etil şi laurat de etil; (13) agar; (14) agenţi de tamponare, cum ar fi hidroxid de magneziu şi hidroxid de aluminiu; (15) acid alginic; (16) apă apirogenă; (17) ser fiziologic izotonic; (18) soluţie Ringer; (19) alcool etilic; (20) soluţii cu pH tamponat; (21) poliesteri, policarbonaţi şi/sau polianhidride; şi (22) alte substanţe compatibile netoxice utilizate în formulările farmaceutice.
Exemple suplimentare nelimitate de agenţi adecvaţi pentru formulare cu conjugaţii oligomerului antisens din dezvăluirea prezentă includ: acizi nucleici conjugaţi PEG; acizi nucleici conjugaţi fosfolipidici; acizi nucleici care conţin fragmente lipofile; fosforotioaţi; inhibitori ai glicoproteinei P (cum ar fi Pluronic p85) care pot spori pătrunderea medicamentelor în diferite ţesuturi; polimeri biodegradabili, cum ar fi microsfere de poli (D,L-lactidcoglicolidă) pentru eliberare susţinută după implantare (Emerich, D F şi colab., 1999, Cell Transplant, 8, 47-58) Alkermes, Inc. Cambridge, Massachusetts; şi nanoparticule încărcate, cum ar fi cele fabricate din polibutilcianoacrilat, care pot livra medicamente prin bariera hematoencefalică şi pot modifica mecanismele de absorbţie neuronală (Psihiatria Biol Prog Neuropsychopharmacol Biol, 23, 941-949, 1999).
Dezvăluirea prezintă, de asemenea, utilizarea compoziţiei cuprinzând lipozomi modificaţi la suprafaţă care conţin poli(etilenglicol) ("PEG") lipide (PEG-modificate, ramificate şi neramificate sau combinaţii ale acestora sau lipozomi cu circulaţie lungă sau lipozomi ascunşi). Aceste formulări oferă o metodă de creştere a acumulării de medicamente în ţesuturile ţintă. Această clasă de purtători de medicamente rezistă la opsonizare şi eliminare de către sistemul fagocitar mononuclear (MPS sau RES), permiţând astfel timpi mai lungi de circulaţie ăn sânge şi o expunere tisulară sporită pentru medicamentul încapsulat (Lasic şi colab.Chem. Rev. 1995, 95, 2601-2627; Ishiwata şi colab., Chem. Pharm. Bull. 1995, 43, 1005-1011). S-a demonstrat că astfel de lipozomi se acumulează selectiv în tumori, probabil prin extravazare şi captare în ţesuturile ţintă neovascularizate (Lasic şi colab., Science 1995, 267, 1275-1276; Oku şi colab., 1995, Biochim. Biophys. Acta, 1238, 86-90). Lipozomii cu circulaţie lungă îmbunătăţesc farmacocinetica şi farmacodinamica ADN-ului şi ARN-ului, în special în comparaţie cu lipozomii cationici convenţionali despre care se ştie că se acumulează în ţesuturile MPS (Liu et al., J. Biol. Chem.1995, 42, 24864-24870; Choi şi colab., Publicaţia internaţională PCT Nr. WO 96/10391; Ansell şi colab., Publicaţia internaţională PCT Nr. WO 96/10390; Olanda şi colab., Publicaţia internaţională PCT Nr. WO 96/10392). Lipozomii cu circulaţie lungă sunt, de asemenea, susceptibili la a proteja medicamentele împotriva degradării nucleazei într-o măsură mai mare comparativ cu lipozomii cationici, pe baza capacităţii lor de a evita acumularea în ţesuturile MPS agresive din punct de vedere metabolic, cum ar fi ficatul şi splina.
Într-o altă realizare, prezenta dezvăluire include compoziţii farmaceutice conjugate de oligomer antisens preparate pentru livrare aşa cum este descris în brev. US. Nr.: 6.692.911; 7.163.695; şi 7.070.807. În acest sens, într-o formă de realizare, prezenta descriere oferă un conjugat antisens al prezentei descrieri într-o compoziţie cuprinzând copolimeri de lizină şi histidină (HK) (aşa cum este descris în brev. US Nr.: 7.163.695; 7.070.807; şi 6.692.911), fie singure, fie în combinaţie cu PEG (de ex., PEG ramificat sau neramificat sau un amestec din ambele), în combinaţie cu PEG şi un fragment de ţintire sau cu oricare dintre cele de mai sus în combinaţie cu un agent de reticulare. În anumite exemple de realizare, prezenta descriere furnizează conjugaţi oligomerici antisens în compoziţii farmaceutice cuprinzând polistidină modificată cu acid gluconic sau polihistidină modificată cu acid gluconic/transferină-polilizină. Un specialist în domeniu va recunoaşte, de asemenea, că aminoacizii cu proprietăţi similare cu His şi Lys pot fi înlocuiţi în compoziţie.
Agenţii de umectare, emulgatorii şi lubrifianţii (cum ar fi laurilsulfatul de sodiu şi stearatul de magneziu), agenţii coloranţi, agenţii de eliberare, agenţii de acoperire, agenţii de îndulcire, agenţii aromatizanţi, agenţii de parfumare, conservanţii şi antioxidanţii pot fi, de asemenea, prezenţi în compoziţii.
Exemplele de antioxidanţi acceptabili farmaceutic includ: (1) antioxidanţi solubili în apă, cum ar fi acidul ascorbic, clorhidratul de cisteină, bisulfatul de sodiu, metabolizulfitul de sodiu şi sulfitul de sodiu; (2) antioxidanţi solubili în ulei, cum ar fi palmitat de ascorbil, hidroxianisol butilic (BHA), hidroxitoluen butilat (BHT), lecitină, galat de propil şi alfa-tocoferol; şi (3) agenţi de chelare metalici, cum ar fi acid citric, acid etilendiaminic tetraacetic (EDTA), sorbitol, acid tartric şi acid fosforic.
Formulările prezentei descrieri le includ pe cele potrivite pentru administrare orală, nazală, topică (inclusiv bucală şi sublinguală), rectală, vaginală şi/sau parenterală. Compoziţiile pot fi prezentate convenabil sub formă de dozare unitară şi pot fi preparate prin oricare dintre metodele bine cunoscute în domeniul farmaciei. Cantitatea de ingredient activ care poate fi combinată cu un material purtător pentru a produce o singură formă de dozare va varia în funcţie de subiectul tratat şi de modul particular de administrare. Cantitatea de ingredient activ care poate fi combinată cu un material purtător pentru a produce o singură formă de dozare va fi, în general, cantitatea de ingredient activ care produce un efect terapeutic. În general, această cantitate va varia de la aproximativ 0,1 la sută până la aproximativ nouăzeci şi nouă la sută din ingredientul activ, de preferinţă de la aproximativ 5 la sută până la aproximativ 70 la sută, cel mai preferabil de la aproximativ 10 la sută până la aproximativ 30 la sută. \tabÎn anumite variante de realizare, o formulare a prezentei descrieri cuprinde un excipient selectat dintre ciclodextrine, celuloze, lipozomi, agenţi de formare a micelilor, de ex., acizi biliari şi purtători polimerici, de ex., poliesteri şi polianhidride; şi un conjugat oligomer antisens din prezenta descriere. Conjugatul oligomer antisens al formulării este conform Formulei (IV) sau o sare acceptabilă farmaceutic a acesteia. În anumite exemple de realizare, o formulare menţionată anterior face biodisponibil pe cale orală un conjugat oligomer antisens din prezenta descriere. Metodele de preparare a acestor formulări sau compoziţii farmaceutice includ etapa de asociere a unui conjugat oligomer antisens al prezentei dezvăluiri cu purtătorul şi, opţional, unul sau mai multe ingrediente accesorii. În general, formulările sunt preparate prin asocierea uniformă şi intimă a unui conjugat oligomer antisens din prezenta dezvăluire cu purtători lichizi sau purtători solizi divizaţi fin sau ambii şi apoi, dacă este necesar, modelarea produsului. Formulările adecvate ale dezvăluirii pentru administrare orală pot fi sub formă de capsule, caşete, pastile, tablete, pastile (folosind o bază aromatizată, de obicei zaharoză şi acacia sau tragacant), pulberi, granule sau ca soluţie sau suspensie într-un lichid apos sau neapos sau ca emulsie lichidă în apă sau apă în ulei sau ca elixir sau sirop sau ca pastile (folosind o bază inertă, cum ar fi gelatină şi glicerină sau zaharoză şi acacia) şi/sau ca spălături de gură, fiecare conţinând o cantitate predeterminată de conjugat oligomer antisens din prezenta dezvăluire ca ingredient activ. Un conjugat oligomer antisens din prezenta descriere poate fi, de asemenea, administrat ca bolus, excipient sau pastă. În forme de dozare solide ale dezvăluirii pentru administrare orală (capsule, tablete, pastile, drajeuri, pulberi, granule, truciuri), ingredientul activ poate fi amestecat cu unul sau mai mulţi purtători acceptabili farmaceutic, cum ar fi citrat de sodiu sau fosfat dicalcic şi/sau oricare dintre următoarele: (1) umpluturi sau diluanţi, cum ar fi amidon, lactoză, zaharoză, glucoză, manitol şi/sau acid silicic; (2) lianţi, cum ar fi, de exemplu, carboximetilceluloză, alginaţi, gelatină, polivinil pirolidonă, zaharoză şi/sau acacia; (3) umectanţi, cum ar fi glicerol; (4) agenţi de dezintegrare, cum ar fi agar-agar, carbonat de calciu, amidon din cartofi sau tapioca, acid alginic, anumiţi silicaţi şi carbonat de sodiu; (5) agenţi de întârziere a soluţiei, cum ar fi parafina; (6) acceleratori de absorbţie, cum ar fi compuşi de amoniu cuaternar şi agenţi tensioactivi, cum ar fi poloxamer şi lauril sulfat de sodiu; (7) agenţi de umectare, cum ar fi, de exemplu, alcool cetilic, monostearat de glicerină şi agenţi tensioactivi neionici; (8) absorbanţi, cum ar fi caolina şi argila bentonitică; (9) lubrifianţi, cum ar fi talc, stearat de calciu, stearat de magneziu solid, polietilenglicoli, laurilsulfat de sodiu, stearat de zinc, stearat de sodiu, acid stearic şi amestecuri ale acestora; (10) agenţi coloranţi; şi (11) agenţi cu eliberare controlată, cum ar fi crospovidona sau etilceluloza. În cazul capsulelor, tabletelor şi pastilelor, compoziţiile farmaceutice pot cuprinde, de asemenea, agenţi de tamponare. Compoziţii farmaceutice solide de tip similar pot fi, de asemenea, utilizate ca materiale de umplutură în capsule gelatinoase moi şi cu înveliş tare, utilizând excipienţi precum lactoza sau zaharurile din lapte, precum şi polietilenglicoli cu greutate moleculară mare. O tabletă poate fi făcută prin compresie sau turnare, opţional cu unul sau mai multe ingrediente accesorii. Tabletele comprimate pot fi preparate utilizând liant (de ex. gelatină sau hidroxipropilmetilceluloză), lubrifiant, diluant inert, conservant, dezintegrant (de ex. amidonglicolat de sodiu sau carboximetilceluloză sodică reticulată), agent de suprafaţă sau de dispersie. Tabelele turnate pot fi realizate prin turnare într-o maşină adecvată unui amestec de compus pulverulent umezit cu un diluant lichid inert. Tabletele şi alte forme de dozare solide ale compoziţiilor farmaceutice din prezenta descriere, cum ar fi drajeuri, capsule, pastile şi granule, pot fi opţional marcate sau preparate cu acoperiri şi învelişuri, cum ar fi acoperirile enterice şi alte acoperiri bine cunoscute în domeniul farmaceutic. Acestea pot fi, de asemenea, formulate astfel încât să asigure eliberarea lentă sau controlată a ingredientului activ din acestea utilizând, de exemplu, hidroxipropilmetilceluloză în proporţii diferite pentru a furniza profilul de eliberare dorit, alte matrice polimerice, lipozomi şi/sau microsfere. Acestea pot fi formulate pentru eliberare rapidă, de exemplu, liofilizate. Acestea pot fi sterilizate, de ex., prin filtrare printr-un filtru de reţinere a bacteriilor sau prin încorporarea agenţilor de sterilizare sub formă de compoziţii farmaceutice solide sterile care pot fi dizolvate în apă sterilă sau într-un alt mediu injectabil steril imediat înainte de utilizare. Aceste compoziţii farmaceutice pot conţine, de asemenea, opţional agenţi opacifianţi şi pot avea o compoziţie care eliberează ingredientul(ele) activ(i) numai sau, de preferinţă, într-o anumită porţiune a tractului gastro-intestinal, opţional, într-o manieră întârziată. Exemplele de compoziţii de înglobare care pot fi utilizate includ substanţe polimerice şi ceruri. Substanţa activă poate fi, de asemenea, sub formă de microcapsule, dacă este cazul, cu unul sau mai mulţi dintre excipienţii descrişi mai sus. Formele de dozare lichide pentru administrarea orală a conjugaţilor oligomerului antisens din dezvăluire includ emulsii, microemulsii, soluţii, suspensii, siropuri şi elixiruri acceptabile farmaceutic. În plus faţă de compuşii activi, formele de dozare lichide pot conţine diluanţi inerţi utilizaţi în mod obişnuit în domeniu cum ar fi, de exemplu, apă sau alţi solvenţi, agenţi de solubilizare şi emulgatori cum ar fi alcool etilic, alcool izopropilic, carbonat de etil, acetat de etil, alcool benzilic, benzoat de benzil, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamidă, uleiuri (în special seminţe de bumbac, arahide, porumb, germeni, ulei de măsline, ricin şi susan), glicerol, alcool tetrahidrofurfurilic, polietilenglicoli şi esteri ai acizilor graşi de sorbitan şi amestecuri ale acestora. \tabPe lângă diluanţii inerţi, compoziţiile farmaceutice orale pot include, de asemenea, adjuvanţi, cum ar fi agenţi de umectare, agenţi de emulsionare şi suspendare, de îndulcire, aromatizare, colorare, parfumare şi agenţi de conservare. \tabSuspensiile, pe lângă compuşii activi, pot conţine agenţi de suspendare, de exemplu, alcooli izostearilici etoxilaţi, esteri de polioxietilenă sorbitol şi sorbitan, celuloză microcristalină, metahidroxid de aluminiu, bentonită, agar-agar şi tragacant şi amestecuri ale acestora. Formulările pentru administrarea rectală sau vaginală pot fi prezentate ca un supozitor, care poate fi preparat prin amestecarea unuia sau mai multor compuşi ai descrierii cu unul sau mai mulţi excipienţi sau purtători neiritanţi adecvaţi cuprinzând, de ex., unt de cacao, polietilenglicol, o ceară de supozitor sau un salicilat şi care este solidă la temperatura camerei, dar lichidă la temperatura corpului şi, prin urmare, se va topi în cavitatea rectală sau vaginală şi va elibera compusul activ. Formulările sau formele de dozare pentru administrarea topică sau transdermică a unui oligomer aşa cum s-a prezentat aici includ pulberi, spray-uri, unguente, paste, creme, loţiuni, geluri, soluţii, plasturi şi inhalanţi. Conjugaţii oligomeri activi pot fi amestecaţi în condiţii sterile cu un purtător acceptabil farmaceutic şi cu orice conservanţi, tampoane sau propulsori care pot fi necesari. Unguentele, pastele, cremele şi gelurile pot conţine, în plus faţă de un compus activ din prezenta dezvăluire, excipienţi precum grăsimi animale şi vegetale, uleiuri, ceruri, parafine, amidon, tragacant, derivaţi de celuloză, polietilenglicoli, siliconi, bentonite, acid silicic, talc şi oxid de zinc sau amestecuri ale acestora. Pulberile şi spray-urile pot conţine, în plus faţă de un conjugat oligomer antisens din prezenta descriere, excipienţi cum ar fi lactoză, talc, acid silicic, hidroxid de aluminiu, silicaţi de calciu şi pulbere de poliamidă sau amestecuri ale acestor substanţe. Pulverizatoarele pot conţine, de asemenea, propulsori obişnuiţi, cum ar fi lorofluorohidrocarburi şi hidrocarburi volatile nesubstituite, cum ar fi butanul şi propanul. \tabPlasturii transdermici au avantajul suplimentar de a oferi livrarea controlată a unui conjugat oligomer antisens al prezentei dezvăluiri către organism. Astfel de forme de dozare pot fi realizate prin dizolvarea sau dispersarea oligomerului în mediul adecvat. Inhibitorii de absorbţie pot fi, de asemenea, utilizaţi pentru a creşte fluxul compusului pe piele. Rata unui astfel de flux poate fi controlată fie prin furnizarea unei membrane de control al vitezei, fie prin dispersarea agentului într-o matrice sau gel de polimer, printre alte metode cunoscute în domeniu. Compoziţiile farmaceutice adecvate pentru administrare parenterală pot cuprinde unul sau mai mulţi conjugaţi oligomerici ai dezvăluirii în combinaţie cu una sau mai multe soluţii apoase sau neapoase izotonice sterile acceptabile farmaceutic, dispersii, suspensii sau emulsii sau pulberi sterile care pot fi reconstituite în soluţii injectabile sterile sau dispersii chiar înainte de utilizare, care pot conţine zaharuri, alcooli, antioxidanţi, tampoane, bacteriostatice, solute care fac formularea izotonă cu sângele destinatarului sau agenţi de suspendare sau îngroşare. Exemple de purtători apoşi şi neapoşi adecvaţi care pot fi utilizaţi în compoziţiile farmaceutice din prezenta includ apa, etanolul, poliolii (cum ar fi glicerolul, propilenglicolul şi polietilenglicolul) şi amestecurile adecvate ale acestora, uleiurile vegetale, cum ar fi uleiul de măsline şi esterii organici injectabili, cum ar fi oleatul de etil. Fluiditatea adecvată poate fi menţinută, de exemplu, prin utilizarea unor materiale de acoperire, cum ar fi lecitina, prin menţinerea dimensiunii necesare a particulelor în cazul dispersiilor şi prin utilizarea agenţilor tensioactivi. Conjugatul oligomer antisens al compoziţiei farmaceutice este conform Formulei (IV) sau o sare acceptabilă farmaceutic a acesteia. \tabAceste compoziţii farmaceutice pot conţine, de asemenea, adjuvanţi, cum ar fi conservanţi, agenţi de umectare, agenţi de emulsionare şi agenţi de dispersie. Prevenirea acţiunii microorganismelor asupra conjugaţilor oligomerului obiect poate fi asigurată prin includerea diferiţilor agenţi antibacterieni şi antifungici, de ex., parabenul, clorbutanolul şi acidul sorbic fenolic. De asemenea, poate fi de dorit includerea în compoziţii a agenţilor izotonici, cum ar fi zaharurile şi clorura de sodiu. În plus, absorbţia prelungită a formei farmaceutice injectabile poate fi determinată de includerea unor agenţi care întârzie absorbţia, cum sunt monostearatul de aluminiu şi gelatina. \tabÎn unele cazuri, pentru a prelungi efectul unui medicament, este de dorit să se încetinească absorbţia medicamentului din injecţia subcutanată sau intramusculară. Acest lucru se poate realiza prin utilizarea unei suspensii lichide de material cristalin sau amorf cu solubilitate scăzută în apă, printre alte metode cunoscute în domeniu. Rata de absorbţie a compusului depinde apoi de viteza de dizolvare care, la rândul său, poate depinde de dimensiunea cristalului şi de forma cristalină. În mod alternativ, absorbţia întârziată a formei compuşilor administraţi parenteral se realizează prin dizolvarea sau suspendarea compusului într-un vehicul uleios. Formele de depozit injectabile pot fi realizate prin formarea matricelor de microîncapsulare ale conjugaţilor oligomerului subiect în polimeri biodegradabili, cum ar fi polilactida-poliglicolidă. În funcţie de raportul oligomer la polimer şi de natura polimerului particular utilizat, viteza de eliberare a oligomerului poate fi controlată. Exemple de alţi polimeri biodegradabili includ poli(ortoesteri) şi poli(anhidride). Depozitele de formulări injectabile sunt, de asemenea, preparate prin prinderea medicamentului în lipozomi sau microemulsii care sunt compatibile cu ţesuturile corpului. Când conjugaţii oligomerului antisens din prezenta descriere sunt administraţi ca produse farmaceutice oamenilor şi animalelor, aceştia pot fi administraţi per se sau ca o compoziţie farmaceutică conţinând, de exemplu, 0,1 până la 99% (mai preferabil, 10 până la 30%) din conjugatul oligomer antisens în combinaţie cu un purtător acceptabil farmaceutic. Formulările sau preparatele prezentei descrieri pot fi administrate oral, parenteral, topic sau rectal. Acestea sunt, de obicei, prezentate în forme adecvate pentru fiecare cale de administrare. De exemplu, acestea sunt administrate sub formă de tablete sau capsule, prin injectare, inhalare, loţiune pentru ochi, unguent, supozitor sau perfuzie; local prin loţiune sau unguent; sau rectal prin supozitoare. Indiferent de calea de administrare selectată, conjugaţii oligomerului antisens din prezenta dezvăluire, care pot fi utilizaţi într-o formă hidratată adecvată şi/sau compoziţiile farmaceutice din prezenta dezvăluire, pot fi formulate în forme de dozare acceptabile farmaceutic prin metode convenţionale cunoscute specialiştilor în domeniu. Nivelurile de dozare reale ale ingredientelor active din compoziţiile farmaceutice ale acestei descrieri pot fi variate, astfel încât să se obţină o cantitate de ingredient activ care este eficientă pentru a obţine răspunsul terapeutic dorit pentru un anumit pacient, compoziţie şi mod de administrare, fără a fi inacceptabil de toxic pentru pacient. \tabNivelul de dozare selectat va depinde de o varietate de factori, inclusiv de activitatea conjugatului oligomerului antisens special al prezentei dezvăluiri utilizate sau de esterul, sarea sau amida acestuia, calea de administrare, momentul administrării, rata de excreţie sau metabolismul oligomerului particular care este utilizat, rata şi gradul de absorbţie, durata tratamentului, alte medicamente, compuşi şi/sau materiale utilizate în combinaţie cu oligomerul special utilizat, vârsta, sexul, greutatea, starea generală de sănătate şi istoricul medical al pacientului tratat şi factori similari bine cunoscuţi în domeniul medical. Un medic sau un medic veterinar care are o calificare obişnuită în domeniu poate determina şi prescrie cu uşurinţă cantitatea eficientă de compoziţie farmaceutică necesară. De exemplu, medicul sau medicul veterinar ar putea începe cu doze de conjugaţi oligomer antisens din divulgare utilizate în compoziţia farmaceutică la niveluri mai mici decât cele necesare pentru a atinge efectul terapeutic dorit şi creşte treptat doza până când este atins efectul dorit. În general, o doză zilnică adecvată a unui conjugat oligomer antisens al dezvăluirii va fi acea cantitate de conjugat oligomer antisens care este cea mai mică doză eficientă pentru a produce un efect terapeutic. O astfel de doză eficace va depinde, în general, de factorii descrişi aici. În general, dozele orale, intravenoase, intracerebroventriculare şi subcutanate ale conjugaţilor oligomerului antisens din această dezvăluire pentru un pacient, atunci când sunt utilizate pentru efectele indicate, vor varia între aproximativ 0,0001 şi aproximativ 100 mg pe kilogram de greutate corporală pe zi. În unele variante de realizare, conjugaţii oligomerului antisens din prezenta descriere sunt administraţi în doze în general de la aproximativ 10-160 mg/kg sau 20-160 mg/kg. În unele cazuri, pot fi necesare doze mai mari de 160 mg/kg. În unele variante de realizare, dozele pentru administrarea i.v. sunt de la aproximativ 0,5 mg până la 160 mg/kg. În unele variante de realizare, conjugaţii oligomerului antisens sunt administraţi în doze de aproximativ 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg sau 10 mg/kg. În unele variante de realizare, conjugaţii oligomerului antisens sunt administraţi în doze de aproximativ 10 mg/kg, 11 mg/kg, 12 mg/kg, 15 mg/kg, 18 mg/kg, 20 mg/kg, 21 mg/kg, 25 mg/kg, 26 mg/kg, 27 mg/kg, 28 mg/kg, 29 mg/kg, 30 mg/kg, 31 mg/kg, 32 mg/kg, 33 mg/kg, 34 mg/kg, 35 mg/kg, 36 mg/kg, 37 mg/kg, 38 mg/kg, 39 mg/kg, 40 mg/kg, 41 mg/kg, 42 mg/kg, 43 mg/kg, 44 mg/kg, 45 mg/kg, 46 mg/kg, 47 mg/kg, 48 mg/kg, 49 mg/kg 50 mg/kg, 51 mg/kg, 52 mg/kg, 53 mg/kg, 54 mg/kg, 55 mg/kg, 56 mg/kg, 57 mg/kg, 58 mg/kg, 59 mg/kg, 60 mg/kg, 65 mg/kg, 70 mg/kg, 75 mg/kg, 80 mg/kg, 85 mg/kg, 90 mg/kg, 95 mg/kg, 100 mg/kg, 105 mg/kg, 110 mg/kg, 115 mg/kg, 120 mg/kg, 125 mg/kg, 130 mg/kg, 135 mg/kg, 140 mg/kg, 145 mg/kg, 150 mg/kg, 155 mg/kg, 160 incluzând toate numerele întregi. În unele variante de realizare, oligomerul se administrează la 10 mg/kg. În unele variante de realizare, oligomerul se administrează la 20 mg/kg. În unele variante de realizare, oligomerul se administrează la 30 mg/kg. În unele variante de realizare, oligomerul se administrează la 40 mg/kg. În unele variante de realizare, oligomerul se administrează la 60 mg/kg. În unele variante de realizare, oligomerul se administrează la 80 mg/kg. În unele variante de realizare, oligomerul se administrează la 160 mg/kg. În unele variante de realizare, oligomerul se administrează la 50 mg/kg. În unele variante de realizare, conjugatul oligomer antisens cu Formula (IV) sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia este administrat în doze în general de la aproximativ 10-160 mg/kg sau 20-160 mg/kg. În unele variante de realizare, dozele de conjugat oligomer antisens cu Formula (IV) sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia pentru administrare i.v. sunt de la aproximativ 0,5 mg la 160 mg/kg. În unele variante de realizare, conjugatul oligomer antisens cu formula (IV) sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia este administrat la doze de aproximativ 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg sau 10 mg/kg. În unele variante de realizare, conjugatul oligomer antisens cu formula (IV) sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia este administrat în doze de aproximativ 10 mg/kg, 11 mg/kg, 12 mg/kg, 15 mg/kg, 18 mg/kg, 20 mg/kg, 21 mg/kg, 25 mg/kg, 26 mg/kg, 27 mg/kg, 28 mg/kg, 29 mg/kg, 30 mg/kg, 31 mg/kg, 32 mg/kg, 33 mg/kg, 34 mg/kg, 35 mg/kg, 36 mg/kg, 37 mg/kg, 38 mg/kg, 39 mg/kg, 40 mg/kg, 41 mg/kg, 42 mg/kg, 43 mg/kg, 44 mg/kg, 45 mg/kg, 46 mg/kg, 47 mg/kg, 48 mg/kg, 49 mg/kg 50 mg/kg, 51 mg/kg, 52 mg/kg, 53 mg/kg, 54 mg/kg, 55 mg/kg, 56 mg/kg, 57 mg/kg, 58 mg/kg, 59 mg/kg, 60 mg/kg, 65 mg/kg, 70 mg/kg, 75 mg/kg, 80 mg/kg, 85 mg/kg, 90 mg/kg, 95 mg/kg, 100 mg/kg, 105 mg/kg, 110 mg/kg, 115 mg/kg, 120 mg/kg, 125 mg/kg, 130 mg/kg, 135 mg/kg, 140 mg/kg, 145 mg/kg, 150 mg/kg, 155 mg/kg, 160 mg/kg, inclusiv toate numerele întregi intermediare. În unele variante de realizare, conjugatul oligomer antisens cu formula (IV) sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia este administrat la 10 mg/kg. În unele variante de realizare, conjugatul oligomer antisens cu formula (IV) sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia este administrat la 20 mg/kg. În unele variante de realizare, conjugatul oligomer antisens cu formula (IV) sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia este administrat la 30 mg/kg. În unele variante de realizare, conjugatul oligomer antisens cu formula (IV) sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia este administrat la 40 mg/kg. În unele variante de realizare, conjugatul oligomer antisens cu formula (IV) sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia este administrat la 60 mg/kg. În unele variante de realizare, conjugatul oligomer antisens cu formula (IV) sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia este administrat la 80 mg/kg. În unele variante de realizare, conjugatul oligomer antisens cu formula (IV) sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia este administrat la 160 mg/kg. În unele variante de realizare, conjugatul oligomer antisens cu formula (IV) sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia este administrat la 50 mg/kg. Dacă se doreşte, doza zilnică efectivă a compusului activ poate fi administrată în două, trei, patru, cinci, şase sau mai multe sub-doze administrate separat la intervale adecvate pe tot parcursul zilei, opţional, sub formă de doze unitare. În anumite situaţii, doza este de o administrare pe zi. În anumite variante de realizare, doza este de una sau mai multe administrări la fiecare 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 zile sau la fiecare 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 săptămâni sau la fiecare 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 luni, după cum este necesar, pentru a menţine expresia dorită a unei proteine de distrofină funcţionale. În anumite variante de realizare, doza este de una sau mai multe administrări o dată la două săptămâni. În unele variante de realizare, doza de administrare se face o dată la două săptămâni. În diverse variante de realizare, doza este de una sau mai multe administrări în fiecare lună. În anumite variante de realizare, doza este de o administrare pe lună. În diferite variante de realizare, conjugaţii oligomerului antisens sunt administraţi săptămânal la 10 mg/kg. În diverse variante de realizare, conjugaţii oligomerului antisens sunt administraţi săptămânal la 20 mg/kg. În diverse variante de realizare, conjugaţii oligomerului antisens sunt administraţi săptămânal la 30 mg/kg. În diverse variante de realizare, conjugaţii oligomerului antisens sunt administraţi săptămânal la 40 mg/kg. În unele variante de realizare, conjugaţii oligomerului antisens sunt administraţi săptămânal la 60 mg/kg. În unele variante de realizare, conjugaţii oligomerului antisens sunt administraţi săptămânal la 80 mg/kg. În unele variante de realizare, conjugaţii oligomerului antisens sunt administraţi săptămânal la 100 mg/kg. În unele variante de realizare, conjugaţii oligomerului antisens sunt administraţi săptămânal la 160 mg/kg. Aşa cum este utilizat aici, săptămânal se înţelege că are semnificaţia acceptată în domeniu în fiecare săptămână. În diferite variante de realizare, conjugaţii oligomerului antisens sunt administraţi de două ori pe săptămână la 10 mg/kg. În diverse variante de realizare, conjugaţii oligomerului antisens sunt administraţi de două ori pe săptămână la 20 mg/kg. În diverse variante de realizare, conjugaţii oligomerului antisens sunt administraţi de două ori pe săptămână la 30 mg/kg. În diverse variante de realizare, conjugaţii oligomerului antisens sunt administraţi de două ori pe săptămână la 40 mg/kg. În unele variante de realizare, conjugaţii oligomerului antisens sunt administraţi de două ori pe săptămână la 60 mg/kg. În unele variante de realizare, conjugaţii oligomerului antisens sunt administraţi de două ori pe săptămână la 80 mg/kg. În unele variante de realizare, conjugaţii oligomerului antisens sunt administraţi de două ori pe săptămână la 100 mg/kg. În unele variante de realizare, conjugaţii oligomerului antisens sunt administraţi de două ori pe săptămână la 160 mg/kg. Aşa cum este utilizat aici, de două ori pe săptămână se înţelege că are semnificaţia acceptată în domeniu la fiecare două săptămâni. În diferite variante de realizare, conjugaţii oligomerului antisens sunt administraţi la fiecare a treia săptămână la 10 mg/kg. În diverse variante de realizare, conjugaţii oligomerului antisens sunt administraţi la fiecare a treia săptămână la 20 mg/kg. În diverse variante de realizare, conjugaţii oligomerului antisens sunt administraţi la fiecare a treia săptămână la 30 mg/kg. În diverse variante de realizare, conjugaţii oligomerului antisens sunt administraţi la fiecare a treia săptămână la 40 mg/kg. În unele variante de realizare, conjugaţii oligomerului antisens sunt administraţi la fiecare a treia săptămână la 60 mg/kg. În unele variante de realizare, conjugaţii oligomerului antisens sunt administraţi la fiecare a treia săptămână la 80 mg/kg. În unele variante de realizare, conjugaţii oligomerului antisens sunt administraţi la fiecare a treia săptămână la 100 mg/kg. În unele variante de realizare, conjugaţii oligomerului antisens sunt administraţi la fiecare a treia săptămână la 160 mg/kg. Aşa cum este utilizat aici, se înţelege că fiecare a treia săptămână are semnificaţia acceptată în domeniu o dată la trei săptămâni. În diferite variante de realizare, conjugaţii oligomerului antisens sunt administraţi lunar la 10 mg/kg. În diverse variante de realizare, conjugaţii oligomerului antisens sunt administraţi lunar la 20 mg/kg. În diverse variante de realizare, conjugaţii oligomerului antisens sunt administraţi lunar la 30 mg/kg. În diverse variante de realizare, conjugaţii oligomerului antisens sunt administraţi lunar la 40 mg/kg. În unele variante de realizare, conjugaţii oligomerului antisens sunt administraţi lunar la 60 mg/kg. În unele variante de realizare, conjugaţii oligomerului antisens sunt administraţi lunar la 80 mg/kg. În unele variante de realizare, conjugaţii oligomerului antisens sunt administraţi lunar la 100 mg/kg. În unele variante de realizare, conjugaţii oligomerului antisens sunt administraţi lunar la 160 mg/kg. Aşa cum este utilizat aici, lunar se înţelege că are semnificaţia acceptată în domeniu a fiecărei luni. Aşa cum s-ar înţelege în domeniu, săptămânal, de două ori pe săptămână, o dată la trei săptămâni sau administrările lunare pot fi în una sau mai multe administrări sau sub-doze aşa cum s-a discutat aici. Moleculele de acid nucleic şi conjugaţii oligomerului antisens descrişi aici pot fi administraţi celulelor printr-o varietate de metode cunoscute celor familiari în domeniu, inclusiv, dar fără a se limita la încapsularea în lipozomi, prin iontoforeză sau prin încorporare în alte vehicule, cum ar fi hidrogeluri, ciclodextrine, nanocapsule biodegradabile şi microsfere bioadezive, aşa cum este descris aici şi cunoscut în domeniu. În anumite variante de realizare, tehnologia de microemulsionare poate fi utilizată pentru a îmbunătăţi biodisponibilitatea agenţilor farmaceutici lipofili (insolubili în apă). Exemplele includ Trimetrine (Dordunoo, K. S. şi colab., Drug Development and Industrial Pharmacy, 17(12), 1685-1713, 1991) şi REV 5901 (Sheen, P. C. şi colab., J Pharm Sci 80(7), 712-714, 1991). Printre alte beneficii, microemulsionarea asigură o biodisponibilitate crescută prin direcţionarea preferenţială a absorbţiei către sistemul limfatic în locul sistemului circulator, care astfel ocoleşte ficatul şi previne distrugerea compuşilor în circulaţia hepatobiliară. Într-un aspect al dezvăluirii, formulările conţin micele formate dintr-un oligomer aşa cum s-a prezentat aici şi cel puţin un purtător amfifilic, în care micelele au un diametru mediu mai mic de aproximativ 100 nm. Mai multe variante de realizare preferate oferă micele având un diametru mediu mai mic de aproximativ 50 nm şi chiar mai multe variante de realizare preferate oferă micele având un diametru mediu mai mic de aproximativ 30 nm sau chiar mai mic de aproximativ 20 nm. În timp ce toţi purtătorii amfifilici adecvaţi sunt avuţi în vedere, purtătorii preferaţi în prezent sunt, în general, cei care au statutul general recunoscut ca fiind sigur (GRAS) şi care pot solubiliza atât un conjugat oligomer antisens din prezenta descriere, cât şi microemulsionarea acestuia într-o etapă ulterioară, atunci când soluţia intră în contact cu o fază complexă a apei (cum ar fi cea găsită în tractul gastro-intestinal uman). De obicei, ingredientele amfifile care satisfac aceste cerinţe au valori ale HLB (echilibru hidrofil - lipofil) de 2-20, iar structurile lor conţin radicali alifatici cu catenă liniară în intervalul C-6 - C-20. Exemple sunt gliceridele grase polietilen-glicolizate şi polietilen-glicolii.
[0116 Exemple de purtători amfifilici includ gliceride saturate şi mononesaturate de acid gras polietilenglicolizat, cum ar fi cele obţinute din diferite uleiuri vegetale hidrogenate integral sau parţial. Astfel de uleiuri pot consta în mod avantajos din gliceride acide tri-, di- şi mono-grase şi esteri di- şi mono-poli (etilenglicol) ai acizilor graşi corespunzători, cu o compoziţie de acizi graşi deosebit de preferată, compoziţia incluzând acid capric 4-10%, acid capric 3-9%, acid lauric 40-50%, acid miristic 14-24%, acid palmitic 4-14% şi acid stearic 5-15%. O altă clasă utilă de purtători amfifilici include sorbitan parţial esterificat şi/sau sorbitol, cu acizi graşi saturaţi sau mononesaturaţi (seria SPAN) sau analogi etoxilaţi corespunzători (seria TWEEN).
Purtătorii amfifilici disponibili pe piaţă pot fi deosebit de utili, inclusiv seriile Gelucire, Labrafil, Labrasol sau Lauroglycol (toate fabricate şi distribuite de Gattefosse Corporation, Saint Priest, Franţa), Peg-mono-oleat, PEG-di-oleat, PEG-mono-laurat şi di-laurat, Lecitină, Polisorbat 80 etc. (produse şi distribuite de o serie de companii din SUA şi din întreaga lume).
În anumite variante de realizare, livrarea poate avea loc prin utilizarea lipozomilor, nanocapsulelor, microparticulelor, microsferelor, particulelor lipidice şi veziculelor, pentru introducerea compoziţiilor farmaceutice ale prezentei descrieri în celule gazdă adecvate. În special, compoziţiile farmaceutice din prezenta dezvăluire pot fi formulate pentru livrare fie încapsulate într-o particulă lipidică, fie într-un lipozom, o veziculă, o nanosferă, o nanoparticulă sau altele asemenea. Formularea şi utilizarea unor astfel de vehicule de livrare pot fi efectuate folosind tehnici cunoscute şi convenţionale. \tabPolimerii hidrofili adecvaţi pentru utilizare în prezenta descriere sunt cei care sunt uşor solubili în apă, pot fi ataşaţi covalent la o lipidă care formează vezicule şi care sunt toleraţi in vivo fără efecte toxice (adică sunt biocompatibili). Polimerii adecvaţi includ poli(etilenglicol) (PEG), acid polilactic (denumit şi polilactidă), acid poliglicolic (denumit şi poliglicolidă), un copolimer de acid polilactic-poliglicolic şi alcool polivinilic.
În anumite variante de realizare, polimerii au o greutate moleculară medie de la aproximativ 100 sau 120 daltoni până la aproximativ 5.000 sau 10.000 daltoni sau de la aproximativ 300 daltoni până la aproximativ 5.000 daltoni. În alte variante de realizare, polimerul este poli(etilenglicol) având o greutate moleculară medie de la aproximativ 100 la aproximativ 5.000 de daltoni sau având o greutate moleculară medie de la aproximativ 300 la aproximativ 5.000 de daltoni. În anumite variante de realizare, polimerul este un poli(etilenglicol) având o greutate moleculară medie de aproximativ 750 daltoni, de exemplu PEG(750). Polimerii pot fi, de asemenea, definiţi prin numărul de monomeri din acesta; o variantă preferată a prezentei descrieri utilizează polimeri din cel puţin aproximativ trei monomeri, astfel de polimeri de polietilenă constând din trei monomeri au o greutate moleculară de aproximativ 132 daltoni.
Alţi polimeri hidrofili care pot fi adecvaţi pentru utilizare în prezenta descriere includ polivinilpirolidonă, polimetoxazolină, polietiloxazolină, polihidroxipropil metacrilamidă, polimetacrilamidă, polidimetilacrilamidă şi celuloze derivate, cum ar fi hidroximetilceluloză sau hidroxietilceluloză.
În anumite variante de realizare, o formulare a prezentei descrieri cuprinde un polimer biocompatibil selectat din grupa constând din poliamide, policarbonaţi, polialchileni, polimeri din esteri acrilici şi metacrilici, polimeri polivinilici, poliglicolide, polisiloxani, poliuretani şi copolimeri ai acestora, celuloze, polipropilenă, polietilene, polistiren, polimeri ai acidului lactic şi ai acidului glicolic, polianhidride, poli(orto)esteri, poli(acid butic), poli(acid valeric), poli(lactidă-cocaprolactonă), polizaharide, proteine, acizi polihialuronici, policianoacrilaţi şi amestecuri, amestecuri, mixturi, polimeri sau copolimeri ai acestora.
Ciclodextrinele sunt oligozaharide ciclice, constând din 6, 7 sau 8 unităţi de glucoză, desemnate de litera greacă α, β sau γ, respectiv. Unităţile de glucoză sunt legate prin legături α-1,4-glucozidice. Ca urmare a conformaţiei scaun ale unităţilor de zaharid, toate grupările hidroxil secundare (la C-2, C-3) sunt situate pe o parte a inelului, în timp ce toate grupările hidroxil primare la C-6 sunt situate pe cealaltă parte.
Ca urmare, feţele exterioare sunt hidrofile, ceea ce face ciclodextrinele solubile în apă.
În schimb, cavităţile ciclodextrinelor sunt hidrofobe, deoarece sunt căptuşite de hidrogenul atomilor C-3 şi C-5 şi de oxigeni eterici. Aceste matrice permit complexarea cu o varietate de compuşi relativ hidrofobi, inclusiv, de exemplu, compuşi steroizi, cum ar fi 17α-estradiol (vezi, de ex., van Uden şi colab. Plant Cell Tiss. Org. Cult 38:1-3-113 (1994)). Complexarea are loc prin interacţiuni Van der Waals şi prin formarea legăturii de hidrogen. Pentru o trecere în revistă generală a chimiei ciclodextrinelor, vezi, Wenz, Agnew. Chem. Int. Ed. Engl., 33:803-822 (1994).
Proprietăţile fizico-chimice ale derivaţilor ciclodextrinei depind puternic de tipul şi gradul de substituţie. De exemplu, solubilitatea lor în apă variază de la insolubil (de ex., triacetil-beta-ciclodextrină) la 147% solubil (g/v) (G-2-beta-ciclodextrină). În plus, acestea sunt solubile în mulţi solvenţi organici. Proprietăţile ciclodextrinelor permit controlul asupra solubilităţii diferitelor componente ale formulării prin creşterea sau scăderea solubilităţii acestora.
Au fost descrise numeroase ciclodextrine şi metode pentru prepararea lor. De exemplu, Parmeter (I) şi colab. (Brev. US Nr. 3.453.259) şi Gramera, şi colab. (Brev. US Nr. 3.459.731) au descris ciclodextrine electroneutrale. Alte derivate includ ciclodextrine cu proprietăţi cationice [Parmeter (II), brev. US Nr. 3.453.257], ciclodextrine reticulate insolubile (Solms, brev. US Nr. 3.420.788) şi ciclodextrine cu proprietăţi anionice [Parmeter (III), brev. US Nr. 3.426.011]. Printre derivaţii de ciclodextrină cu proprietăţi anionice, acizii carboxilici, acizii fosforoşi, acizii fosfinici, acizii fosfonici, acizii fosforici, acizii tiofosfonici, acizii tiosulfinici şi acizii sulfonici au fost adăugaţi la ciclodextrina parentală [vezi, Parmeter (III), supra]. În plus, derivaţii de ciclodextrină ai eterului sulfoalchilic au fost descrişi de Stella şi colab. (Brev. US Nr. 5.134.127).
Lipozomii constau din cel puţin o membrană lipidică bistratificată care înconjoară un compartiment intern apos. Lipozomii pot fi caracterizaţi prin tipul membranei şi prin mărime. Veziculele mici unilamelare (SUV) au o singură membrană şi de obicei variază între 0,02 şi 0,05 µm în diametru; veziculele mari unilamelare (LUVS) sunt de obicei mai mari de 0,05 µm. Veziculele oligolamelare mari şi veziculele multilamelare au mai multe straturi, de obicei concentrice, cu membrană şi sunt, de obicei, mai mari de 0,1 µm. Lipozomii cu mai multe membrane nonconcentrice, adică mai multe vezicule mai mici conţinute într-o veziculă mai mare, sunt numite vezicule multiveziculare. \tabUn aspect al prezentei descrieri se referă la formulările care cuprind lipozomi care conţin un conjugat oligomer antisens din prezenta descriere, în care membrana lipozomală este formulată pentru a furniza un lipozom cu capacitate portantă crescută.
Alternativ sau suplimentar, conjugatul oligomer antisens din prezenta descriere poate fi conţinut sau adsorbit pe stratul lipozomal bilateral al lipozomului. Un conjugat oligomer antisens din prezenta descriere poate fi agregat cu un surfactant lipidic şi transportat în spaţiul intern al lipozomului; în aceste cazuri, membrana lipozomală este formulată pentru a rezista efectelor perturbatoare ale agregatului agent-surfactant activ.
Conform unei variante de realizare a prezentei descrieri, bistratul lipidic al unui lipozom conţine lipide derivate cu poli(etilenglicol) (PEG), astfel încât lanţurile de PEG se extind de la suprafaţa interioară a bistratului lipidic în spaţiul interior încapsulat de lipozom şi se extind de la exteriorul bistratului lipidic în mediul înconjurător.
Agenţii activi conţinuţi în lipozomii prezentei descrieri sunt în formă solubilă. Agregatele de agent tensioactiv şi agent activ (cum ar fi emulsiile sau micelele care conţin agentul activ de interes) pot fi prinse în spaţiul interior al lipozomilor în conformitate cu prezenta descriere. Un agent tensioactiv acţionează pentru a dispersa şi solubiliza agentul activ şi poate fi selectat dintre orice agent tensioactiv alifatic, cicloalifatic sau aromatic adecvat, inclusiv, dar fără a se limita la lizofosfatidilcoline biocompatibile (GPL) cu lanţuri de diferite lungimi (de exemplu, de la aproximativ C14 la aproximativ C20). Lipidele polimerizate, cum ar fi PEG-lipidele, pot fi, de asemenea, utilizate pentru formarea miceliilor, deoarece acestea vor acţiona pentru a inhiba fuziunea miceliilor/membranelor şi, deoarece adăugarea unui polimer la moleculele de surfactant scade CMC al surfactantului şi ajută la formarea miceliilor. Sunt preferaţi agenţii tensioactivi cu CMO în intervalul micromolar; agenţii tensioactivi CMC mai mari pot fi utilizaţi pentru a prepara micelii prinse în lipozomii din prezenta descriere.
Lipozomii conform prezentei descrieri pot fi preparaţi printr-o varietate de tehnici cunoscute în domeniu. Vezi, de ex., brev. US. Nr. 4.235.871; cerere PCT publicată WO 96/14057; New RRC, Liposomes: A practical approach, IRL Press, Oxford (1990), pag. 33-104; şi Lasic DD, Liposomes from physics to applications, Elsevier Science Publishers BV, Amsterdam, 1993. De exemplu, lipozomii din prezenta descriere pot fi preparaţi prin difuzarea unei lipide derivate cu un polimer hidrofil în lipozomi preformaţi, cum ar fi prin expunerea lipozomilor preformaţi la micelii compuse din polimeri grefaţi cu lipide, la concentraţii de lipide corespunzătoare procentului final de moli al lipidelor derivate care este dorit în lipozomi. Lipozomii care conţin un polimer hidrofil pot fi, de asemenea, formaţi prin omogenizare, hidratare a câmpului lipidic sau tehnici de extrudare, aşa cum sunt cunoscute în domeniu.
Într-o altă procedură de formulare exemplară, agentul activ este mai întâi dispersat prin sonicare în lizofosfatidilcolină sau alt agent tensioactiv CMC scăzut (inclusiv lipide grefate cu polimeri) care solubilizează cu uşurinţă moleculele hidrofobe.
Suspensia micelară rezultată de agent activ este apoi utilizată pentru a rehidrata o probă de lipide uscate care conţine un procent molar adecvat de lipide obţinute prin polimerizare sau colesterol. Suspensia de lipide şi de agent activ este apoi formată în lipozomi utilizând tehnici de extrudare cunoscute în domeniu, iar lipozomii rezultaţi sunt separaţi de soluţia neîncapsulată prin separare pe coloană standard.
Într-un aspect al prezentei descrieri, lipozomii sunt preparaţi să aibă dimensiuni substanţial omogene într-un interval de dimensiuni selectat. O metodă eficientă de dimensionare implică extrudarea unei suspensii apoase a lipozomilor printr-o serie de membrane din policarbonat având o dimensiune a porilor uniform selectată; dimensiunea porilor membranei va corespunde aproximativ cu cele mai mari dimensiuni ale lipozomilor produşi prin extrudare prin membrana respectivă. Vezi, de ex., brev. US Nr. 4.737.323 (12 aprilie 1988). În anumite variante de realizare, reactivi precum DharmaFECT® şi Lipofectamine® pot fi utilizaţi pentru a introduce polinucleotide sau proteine în celule.
Caracteristicile de eliberare ale unei formulări a prezentei dezvăluiri depind de materialul încapsulat, de concentraţia medicamentului încapsulat şi de prezenţa modificatorilor de eliberare. De exemplu, eliberarea poate fi manipulată pentru a fi dependentă de pH, de exemplu, folosind un înveliş sensibil la pH care eliberează numai la un pH scăzut, ca în stomac sau la un pH mai mare, ca în intestin. Un strat de acoperire enterică poate fi utilizat pentru a preveni eliberarea de la care apar până după trecerea prin stomac. Acoperiri multiple sau amestecuri de cianamidă încapsulate în diferite materiale pot fi utilizate pentru a obţine o eliberare iniţială în stomac, urmată de o eliberare ulterioară în intestin. Eliberarea poate fi, de asemenea, manipulată prin includerea sărurilor sau a agenţilor de formare a porilor, care pot creşte absorbţia de apă sau eliberarea medicamentului prin difuzia din capsulă. Excipienţii care modifică solubilitatea medicamentului pot fi, de asemenea, utilizaţi pentru a controla viteza de eliberare. De asemenea, pot fi încorporaţi agenţi care sporesc degradarea matricei sau eliberarea din matrice. Acestea pot fi adăugate la medicament, adăugate ca o fază separată (adică sub formă de particule) sau pot fi codizolate în faza de polimer, în funcţie de compus. În majoritatea cazurilor, cantitatea trebuie să fie între 0,1 şi 30 la sută (g/g polimer). Tipurile de factori de stimulare a degradării includ sărurile anorganice, cum ar fi sulfatul de amoniu şi clorura de amoniu, acizii organici, cum ar fi acidul citric, acidul benzoic şi acidul ascorbic, bazele anorganice, cum ar fi carbonatul de sodiu, carbonatul de potasiu, carbonatul de calciu, carbonatul de zinc şi hidroxidul de zinc şi bazele organice, cum ar fi sulfatul de protamină, spermina, colina, etanolamina, dietanolamina şi trietanolamina şi agenţii tensioactivi, cum ar fi Tween® şi Pluronic®. Agenţii de formare a porilor care adaugă microstructură la matrice (adică compuşii solubili în apă, cum ar fi sărurile anorganice şi zaharurile) se adaugă ca particule. Intervalul este de obicei între unu şi treizeci la sută (g/g polimer).
Absorbţia poate fi, de asemenea, manipulată prin modificarea timpului de rezidenţă a particulelor din intestin. Acest lucru poate fi realizat, de exemplu, prin acoperirea particulei cu un polimer adeziv al mucoasei sau prin selectarea acestuia ca material de încapsulare. Exemplele includ majoritatea polimerilor cu grupări carboxil libere, cum ar fi chitosan, celuloză şi în special poliacrilaţi (aşa cum sunt utilizaţi aici, poliacrilaţii se referă la polimeri, inclusiv grupări acrilate şi grupări acrilate modificate, cum ar fi cianoacrilaţi şi metacrilaţi).
Un conjugat oligomer antisens poate fi formulat pentru a fi conţinut sau adaptat pentru a fi eliberat de un dispozitiv sau implant chirurgical sau medical. În anumite aspecte, un implant poate fi acoperit sau tratat în alt mod cu un oligomer conjugat antisens. De exemplu, hidrogelurile sau alţi polimeri, cum ar fi polimerii biocompatibili şi/sau biodegradabili, pot fi utilizaţi pentru a acoperi un implant cu compoziţiile farmaceutice din prezenta descriere (adică compoziţia poate fi adaptată pentru utilizare cu un dispozitiv medical prin utilizarea unui hidrogel sau a altui polimer). Polimerii şi copolimerii pentru acoperirea dispozitivelor medicale cu un agent sunt bine-cunoscuţi în domeniu. Exemplele de implanturi includ, dar nu se limitează la, stenturi, stenturi care eliberează medicamente, suturi, proteze, catetere vasculare, catetere de dializă, grefe vasculare, valve cardiace protetice, stimulatoare cardiace, defibrilatoare cardioverter implantabile, ace IV, dispozitive pentru fixarea şi formarea oaselor, cum ar fi ace, şuruburi, plăci şi alte dispozitive şi matrice de ţesut artificial pentru vindecarea rănilor. \tabÎn plus faţă de metodele furnizate aici, conjugaţii oligomerului antisens pentru utilizare conform descrierii pot fi formulaţi pentru administrare în orice mod convenabil pentru utilizare în medicina umană sau veterinară, prin analogie cu alte produse farmaceutice. Conjugaţii oligomerului antisens şi formele lor farmaceutice corespunzătoare pot fi administraţi singuri sau în asociere cu alte strategii terapeutice în tratamentul distrofiei musculare, cum sunt transplantul de mioblaste, terapiile cu celule stem, administrarea de antibiotice aminoglicozidice, inhibitori de proteazom şi terapiile de reglare ascendentă (de exemplu, creşterea dozei de utrofină, un paralog autozomal al distrofinei). În unele variante de realizare, terapia suplimentară poate fi administrată înainte, concomitent sau ulterior administrării conjugatului oligomer antisens din prezenta dezvăluire. De exemplu, conjugaţii oligomerului antisens pot fi administraţi în combinaţie cu un steroid şi/sau antibiotic. În anumite variante de realizare, conjugaţii oligomerului antisens sunt administraţi unui pacient care se află în terapia steroizilor de fond (de ex., terapie cu steroizi de fond intermitentă sau cronică/continuă). De exemplu, în unele variante de realizare, pacientul a fost tratat cu un corticosteroid înainte de administrarea unui oligomer antisens şi continuă să primească terapia cu steroizi. În unele variante de realizare, steroidul este glucocorticoid sau prednison. Căile de administrare descrise sunt destinate doar ca un ghid, deoarece un practician calificat va putea determina cu uşurinţă calea optimă de administrare şi orice doză pentru orice animal şi condiţie particulară. Au fost încercate mai multe abordări pentru introducerea în celule a noului material genetic funcţional, atât in vitro, cât şi in vivo (Friedmann (1989) Science, 244:1275-1280). Aceste abordări includ integrarea genei care urmează să fie exprimată în retrovirusuri modificate (Friedmann (1989) supra; Rosenberg (1991) Cancer Research 51(18), supl.: 5074S-5079S); integrarea în vectori non-retrovirus (de ex., vectori virali adeno-asociaţi) (Rosenfeld şi colab. (1992) Cell, 68: 143-155; Rosenfeld şi colab. (1991) Science, 252:431-434); sau livrarea unei transgene legate de un element de potenţator promotor heterolog prin lipozomi (Friedmann (1989), supra; Brigham şi colab. (1989) Am. J. Med. Sci., 298: 278-281; Nabel şi colab.(1990) Science, 249: 1285-1288; Hazinski şi colab.(1991) Am. J. Resp. Cell Molec. Biol., 4:206-209; şi Wang şi Huang (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. (SUA), 84: 7851-7855); cuplat la ligand specific, sisteme de transport pe bază de cationi [Wu şi Wu (1988) J. Biol. Chem., 263:14621-14624) sau utilizarea ADN-ului gol, vectorilor de expresie (Nabel şi colab. (1990), supra; Wolff şi colab. (1990) Science, 247:1465-1468). Injectarea directă a transgenelor în ţesut produce numai expresie localizată (Rosenfeld (1992) supra; Rosenfeld şi colab. (1991) supra; Brigham şi colab. (1989) supra; Nabel (1990) supra; şi Hazinski şi colab. (1991) supra). Grupul Brigham şi colab. (Am. J. Med. Sci. (1989) 298:278-281 şi Clinical Research (1991) 39 (abstract)) au raportat numai transfecţia in vivo a plămânilor de şoareci după administrarea intravenoasă sau intratraheală a unui complex de lipozomi ADN. Un exemplu de articol de revizuire a procedurilor de terapie genică umană este: Anderson, Science (1992) 256:808-813. Într-o altă realizare, compoziţiile farmaceutice ale descrierii pot cuprinde suplimentar un carbohidrat aşa cum este prevăzut în Han şi colab., Nat. Comms. 7, 10981 (2016). În unele variante de realizare, compoziţiile farmaceutice ale dezvăluirii pot cuprinde 5% dintr-un carbohidrat de hexoză. De exemplu, compoziţia farmaceutică a dezvăluirii poate cuprinde 5% glucoză, 5% fructoză sau 5% manoză. În anumite variante de realizare, compoziţiile farmaceutice ale dezvăluirii pot cuprinde 2,5% glucoză şi 2,5% fructoză. În unele variante de realizare, compoziţiile farmaceutice din dezvăluire pot cuprinde un carbohidrat selectat dintre: arabinoză prezentă într-o cantitate de 5% în volum, glucoză prezentă într-o cantitate de 5% în volum, sorbitol prezent într-o cantitate de 5% în volum, galactoză prezentă într-o cantitate de 5% în volum, fructoză prezentă într-o cantitate de 5% în volum, xilitol prezent într-o cantitate de 5% în volum, manoză prezentă într-o cantitate de 5% în volum, o combinaţie de glucoză şi fructoză fiecare prezentă într-o cantitate de 2,5% în volum şi o combinaţie de glucoză prezentă într-o cantitate de 5,7% în volum, fructoză prezentă într-o cantitate de 2,86% în volum şi xilitol prezentă într-o cantitate de 1,4% în volum.
IV. Utilizări
Restaurarea cadrului de citire a distrofinei folosind omiterea Exon
O abordare terapeutică potenţială a tratamentului DMD cauzată de mutaţii în afara cadrului în gena distrofinei este sugerată de forma mai uşoară a distrofinopatiei cunoscută sub numele de BMD, care este cauzată de mutaţii în cadru. Capacitatea de a converti o mutaţie în afara cadrului într-o mutaţie în cadru ar păstra ipotetic cadrul de citire a ARNm şi ar produce o proteină distrofină scurtată intern, dar funcţională. Conjugaţii oligomerului antisens ai dezvăluirii au fost concepuţi pentru a realiza acest lucru.
Hibridizarea PMO cu secvenţa pre-mARN vizată interferează cu formarea complexului de splicare pre-mARN şi şterge exonul 53 din ARNm matur. Structura şi conformaţia conjugaţilor oligomeri antisens ai descrierii permit împerecherea de bază specifică secvenţei cu secvenţa complementară. Printr-un mecanism similar, eteplirsen, de exemplu, care este un PMO conceput pentru a sări peste exonul 51 pre-mARN al distrofinei, permite asocierea de bază specifică secvenţei la secvenţa complementară conţinută în exonul 51 al pre-mARN distrofinei.
ARN-ul distrofinei normale care conţine toţi cei 79 exoni va produce proteină distrofină normală. Graficul din Fig. 1 prezintă o secţiune mică a pre-mARN distrofinei şi ARNm matur, de la exonul 47 la exonul 53. Forma fiecărui exon descrie modul în care codonii sunt împărţiţi între exoni; de notat, un codon este format din trei nucleotide. Exonii de formă dreptunghiulară încep şi se termină cu codoni compleţi. Exonii în formă de săgeată încep cu un codon complet, dar se termină cu un codon divizat, care conţine doar nucleotida #1 a codonului. Nucleotidele #2 şi #3 ale acestui codon sunt conţinute în exonul ulterior, care va începe cu o formă de braţ.
ARNm de la distrofina la care lipsesc exoni întregi din gena distrofinei duce de obicei la DMD. Graficul din Fig. 2 ilustrează un tip de mutaţie genetică (deleţia exonului 50) despre care se ştie că are ca rezultat DMD. Deoarece exonul 49 se termină într-un codon complet şi exonul 51 începe cu a doua nucleotidă a unui codon, cadrul de citire după exonul 49 este deplasat, rezultând cadrul de citire a ARNm în afara cadrului şi încorporarea aminoacizilor incorecţi în aval de mutaţie. Absenţa ulterioară a unui domeniu funcţional de legare a distroglicanului C-terminal are ca rezultat producerea unei proteine de distrofină instabile.
Eteplirsen sare peste exonul 51 pentru a restabili cadrul de citire a ARNm. Deoarece exonul 49 se termină într-un codon complet şi exonul 52 începe cu prima nucleotidă a unui codon, ştergerea exonului 51 restabileşte cadrul de citire, rezultând producţia unei proteine distrofină scurtată intern cu un situs de legare a distroglicanului intact, similar cu o mutaţie BMD "în cadru" (Fig. 3).
Fezabilitatea ameliorării fenotipului DMD utilizând omiterea exonului pentru a restabili cadrul deschis de citire a ARNm distrofinei este susţinută de cercetări non-clinice. Numeroase studii pe modele animale distrofice de DMD au arătat că restaurarea distrofinei prin omiterea exonului duce la îmbunătăţiri fiabile ale forţei şi funcţiei musculare (Sharp 2011; Yokota 2009; Wu 2008; Wu 2011; Barton-Davis 1999; Goyenvalle 2004; Gregorevic 2006; Yue 2006; Welch 2007; Kawano 2008; Reay 2008; van Putten 2012). Un exemplu convingător în acest sens provine dintr-un studiu în care nivelurile de distrofină după omiterea exonului (utilizând un PMO) au fost comparate cu funcţia musculară în acelaşi ţesut. La şoarecii distrofici mdx, muşchii tibiali anteriori (TA) trataţi cu un PMO specific şoarecilor şi-au menţinut ~75% din capacitatea forţei maxime după contracţiile care induc stresul, în timp ce muşchii contralaterali TA netrataţi şi-au menţinut doar ~25% din capacitatea forţei maxime (p <0,05) (Sharp 2011). Într-un alt studiu, 3 câini CXMD distrofici au primit, la vârsta de 2-5 luni, terapie de omitere de exon- utilizând un PMO specific pentru mutaţia lor genetică o dată pe săptămână timp de 5 până la 7 săptămâni sau o dată la două săptămâni timp de 22 de săptămâni. În urma terapiei de omitere de exoni, toţi cei 3 câini au demonstrat o expresie extensivă, la nivelul întregului corp, a distrofinei în muşchiul scheletic, precum şi o deplasare menţinută sau îmbunătăţită (test de mers 15 m) faţă de momentul iniţial. În schimb, câinii CXMD netrataţi, corespunzători vârstei, au prezentat o scădere semnificativă a mersului pe parcursul studiului (Yokota 2009).
S-a demonstrat că PMO au o activitate mai mare de omitere a exonului la concentraţii echimolare decât fosforotioaţii atât la şoarecii mdx, cât şi în modelul de şoarece DMD umanizat (hDMD), care exprimă întreaga transcriere DMD umană (Heemskirk 2009). Experimentele in vitro care au utilizat reacţia de polimerizare în lanţ cu transcripţie inversă (RT-PCR) şi Western blot (WB) în celulele musculare scheletice umane normale sau în celulele musculare de la pacienţii cu DMD cu diferite mutaţii sensibile la exonul 51 la omitere au identificat eteplirsenul (un PMO) ca fiind un inductor puternic al săririi exonului 51. Omiterea exonului 51 indusă de eteplirsen a fost confirmată in vivo pe modelul de şoarece hDMD (Arechavala-Gomeza 2007).
Rezultatele clinice pentru analizarea efectului unui conjugat oligomer antisens care este complementar unei regiuni ţintă a exonului 53 pre-mARN al distrofinei umane şi induce omiterea exonului 53 includ fibrele pozitive la distrofină (PDPF), testul de mers de şase minute (6MWT), pierderea mersului (LOA), evaluarea ambulatorie North Star (NSAA), testele funcţiei pulmonare (PFT), capacitatea de a creşte (dintr-o poziţie supină) fără suport extern, producţia de distrofină de novo şi alte măsuri funcţionale.
În unele variante de realizare, prezenta descriere furnizează conjugaţi oligomerici antisens aşa cum este descris aici şi compoziţii ale acestora pentru utilizare în producerea distrofinei la un subiect care are o mutaţie a genei distrofinei care poate fi supusă săririi exonului 53. În anumite exemple de realizare, prezenta descriere furnizează conjugaţi oligomerici antisens aşa cum este descris aici şi compoziţii ale acestora pentru utilizare în restaurarea unui cadru de citire a ARNm pentru a induce producţia de proteine distrofină la un subiect cu distrofie musculară Duchenne (DMD) care are o mutaţie a genei distrofinei care este susceptibilă de a sări peste exonul 53.
Producţia de proteine poate fi măsurată prin transcripţia inversă a reacţiei de polimerizare în lanţ (RT-PCR), prin analiza Western Blot sau prin imunohistochimie (IHC).
În unele variante de realizare, prezenta descriere furnizează conjugaţi oligomerici antisens aşa cum este descris aici şi compoziţii ale acestora pentru utilizare în tratarea DMD la un subiect care are nevoie de acestea, în care subiectul are o mutaţie a genei distrofinei care este susceptibilă de a sări exonul 53. În diverse variante de realizare, tratamentul subiectului este măsurat prin întârzierea progresiei bolii. În unele variante de realizare, tratamentul subiectului este măsurat prin menţinerea mersului la subiect sau prin reducerea pierderii mersului la subiect. În unele variante de realizare, mersul este măsurat utilizând testul de mers de 6 minute (6MWT). În anumite variante de realizare, mersul este măsurat utilizând Evaluarea în ambulatoriul North Start (AESN).
În diverse variante de realizare, prezenta descriere furnizează conjugaţi oligomerici antisens aşa cum este descris aici şi compoziţii ale acestora pentru utilizare în menţinerea funcţiei pulmonare sau reducerea pierderii funcţiei pulmonare la un subiect cu DMD, în care subiectul are o mutaţie a genei DMD care poate fi supusă omiterii exonului 53. În unele variante de realizare, funcţia pulmonară este măsurată ca Presiune expiratorie maximă (MEP). În anumite variante de realizare, funcţia pulmonară este măsurată ca Presiune inspiratorie maximă (MIP). În unele variante de realizare, funcţia pulmonară este măsurată ca Capacitate vitală forţată (FVC).
Într-o altă realizare, compoziţiile farmaceutice ale dezvăluirii pot fi co-administrate cu un carbohidrat în metodele dezvăluirii, fie în aceeaşi formulare, fie este o formulare separată, aşa cum este prevăzut în Han şi colab., Nat. Comms.7, 10981 (2016). În unele variante de realizare, compoziţiile farmaceutice din dezvăluire pot fi administrate concomitent cu 5% dintr-un carbohidrat de hexoză. De exemplu, compoziţiile farmaceutice ale dezvăluirii pot fi administrate concomitent cu 5% glucoză, 5% fructoză sau 5% manoză. În anumite variante de realizare, compoziţiile farmaceutice din dezvăluire pot fi co-administrate cu 2,5% glucoză şi 2,5% fructoză. În unele variante de realizare, compoziţia farmaceutică din dezvăluire poate fi administrată concomitent cu un carbohidrat selectat dintre: arabinoză prezentă într-o cantitate de 5% în volum, glucoză prezentă într-o cantitate de 5% în volum, sorbitol prezent într-o cantitate de 5% în volum, galactoză prezentă într-o cantitate de 5% în volum, fructoză prezentă într-o cantitate de 5% în volum, xilitol prezent într-o cantitate de 5% în volum, manoză prezentă într-o cantitate de 5% în volum, o combinaţie de glucoză şi fructoză, fiecare prezentă într-o cantitate de 2,5% în volum şi o combinaţie de glucoză prezentă într-o cantitate de 5,7% în volum, fructoză prezentă într-o cantitate de 2,86% în volum şi xilitol prezent într-o cantitate de 1,4% în volum.
În diverse variante de realizare, un conjugat oligomer antisens al dezvăluirii este administrat concomitent cu o cantitate eficientă terapeutic dintr-un compus antiinflamator nesteroidian. În unele variante de realizare, compusul antiinflamator nesteroidian este un inhibitor al NF-kB. De exemplu, în unele variante de realizare, inhibitorul NF-kB poate fi CAT-1004 sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia. În diverse variante de realizare, inhibitorul NF-kB poate fi un conjugat de salicilat şi DHA. În unele variante de realizare, inhibitorul NF-kB este CAT-1041 sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia. În anumite variante de realizare, inhibitorul NF-kB este un conjugat de salicilat şi EPA. În diverse variante de realizare, inhibitorul NF-kB este
sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.
În unele variante de realizare, compusul antiinflamator nesteroidian este un inhibitor al TGF-b. De exemplu, în anumite variante de realizare, inhibitorul TGF-b este HT-100.
În anumite variante de realizare, este descris un conjugat oligomer antisens aşa cum este descris aici pentru utilizare în terapie.
V. Kituri
Dezvăluirea oferă, de asemenea, kituri pentru tratamentul unui pacient cu o boală genetică care cuprinde cel puţin oligomer conjugat antisens cu Formula (IV), ambalat într-un recipient adecvat, împreună cu instrucţiunile de utilizare. Kiturile pot conţine, de asemenea, reactivi periferici, cum ar fi tampoane, stabilizatori etc. Cei cu abilităţi obişnuite în domeniu ar trebui să aprecieze că aplicaţiile metodei de mai sus au o aplicaţie largă pentru identificarea moleculelor antisens adecvate pentru utilizarea în tratamentul multor altor boli. Kitul cuprinde un conjugat oligomer antisens conform Formulei (IV) sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.
Exemple
Materiale şi metode
Condiţii de tratament pentru culturi de celule şi ţesuturi
Miocitele umane diferenţiate (ZenBio, Inc.) au fost utilizate pentru a măsura omiterea exonului. Mai exact, mioblastele (ZenBio, Inc., SKB-F) au crescut la 80-90% confluenţă la 37 0C şi 5% CO2 în mediile de creştere (SKB-M; ZenBio, Inc.). Diferenţierea a fost iniţiată prin înlocuirea mediilor de creştere cu medii de diferenţiere (SKM-D; ZenBio, Inc.). Pentru a testa omiterea exonului 53, 1×104 celule diferenţiate au fost placate într-o placă cu 24 de godeuri şi 1 ml de mediu de diferenţiere (SKM-D; ZenBio, Inc.) conţinând diferite concentraţii de PMO sau PPMO au fost adăugate în fiecare godeu şi incubate timp de 96 de ore.
Analiza Western Blot
Pentru analiza Western blot, ţesutul a fost omogenizat cu tampon de omogenizare (4% SDS, 4 M uree, 125 mM tris-HCI (pH 6,8)) la un raport de 9 până la 18 x 20 µm secţiuni de ţesut la aproximativ 5 mm în diametru în 133 µl de tampon. Lizatul corespunzător a fost colectat şi supus cuantificării proteinelor utilizând kitul de testare a proteinelor RC DC conform instrucţiunilor producătorului (BioRad Cat. 500-0122). Probele de extracte tisulare au fost diluate 1:10 folosind tampon de omogenizare pentru a se încadra în intervalul curbei standard BSA. Probele au fost pregătite astfel încât 35 µl de probă să conţină cantitatea dorită de proteină folosind 25 µl de lizat de proteină, tampon de probă 7 µl NuPAGE LDS(Life Technologies Cat. NP0008, Carlsbad, California, SUA) şi 3 μl agent de reducere NuPAGE (10×) (Life Technologies Cat. NP0004). După încălzirea probelor de proteine timp de 5 minute la 95 0C, probele au fost centrifugate şi supernatantul a fost încărcat pe 10 godeuri NuPAGE Novex, 1 mm, mini 3-8% gel tris-acetat de poliacrilamidă (Life Technologies Cat. EA0375) la o doză maximă de 50 µg încărcătură totală de proteine pe bandă. Gelul a fost rulat la 150 de volţi la temperatura camerei până când partea frontală a colorantului a rămas fără gel. Gelurile proteice rezultate au fost transferate în membranele PVDF (Life Technologies Cat. LC2007) timp de 75 de minute la temperatura camerei cu 30 de volţi folosind tampon de transfer NuPAGE (Life Technologies NP006-1), 10% metanol şi 0,1% antioxidant NuPAGE (Life Technologies NP0005). \tabDupă transferul de proteine, membranele PVDF au fost scufundate în tampon TTBS (IX TBS (Amresco Cat. J640-4L), 0,1% (v/v) tween-20). Membranele au fost transferate în tampon de blocare (5% (g/v) lapte uscat degresat (Lab Scientific Cat. M0841) în TTBS) şi înmuiate peste noapte la 4 °C cu o agitare uşoară. După blocare, membranele au fost incubate fie timp de 60 de minute la temperatura camerei DYS1 (Leica Cat. NCL-DYS1) diluat 1:20 utilizând tampon de blocare sau 20 de minute la temperatura camerei în anticorp anti-α-actinină (Sigma-Aldrich Cat. NA931V) diluat 1:100.000 cu tampon de blocare, urmat de şase spălări (cinci minute fiecare cu TTBS). Conjugat IgG anti-şoarece cu peroxidază din hrean (GE Healthcare Cat. NA931V) a fost diluat 1:40.000 folosind tampon de blocare şi adăugat în membrane timp de 45 de minute (DYS1) sau 15 minute (α-actinină), urmate din nou de şase spălări. Utilizarea kitului de detectare ECL Prime Western (GE Healthcare Cat. RPN2232), filmul a fost expus la gel şi dezvoltat în consecinţă. Filmul dezvoltat a fost scanat şi analizat utilizând software-ul ImageQuant TL Plus (versiunea 8.1), iar analiza de regresie liniară a fost efectuată utilizând software-ul Graphpad. Fiecare gel Western blot include o curbă standard de distrofină în 4 sau 5 puncte preparată utilizând proteina totală extrasă din ţesutul normal (cvadriceps de şoarece, diafragmă sau inimă) diluată la, de exemplu, 64%, 16%, 4%, 1% şi 0,25% (vezi. de exemplu. Figurile 5A şi 5B) şi îmbogăţit în ţesutul DMD (de exemplu, cvadriceps de şoarece mdx, diafragmă sau inimă sau cvadriceps NHP, diafragmă sau extract de muşchi neted (GI)). Probele curbei standard au fost prelucrate conform descrierii de mai sus. Nivelurile proteinei distrofină ca procent din nivelurile distrofinei de tip sălbatic (%WT) au fost determinate prin compararea intensităţilor benzii de distrofină cu curba standard a gelului.
Analiza RT-PCR
Pentru analiza RT-PCR, ARN-ul a fost izolat din celule utilizând kitul de centrifugare Illustra GE, urmând protocolul producătorului. Concentraţia şi puritatea ARN-ului au fost determinate utilizând un NanoDrop. Omiterea exonului 53 a fost măsurată prin RT-PCR cu o amorsă frontală care leagă joncţiunea exonului 51/52 şi 54 SECV ID NR: 5 (5'-CATCAAGCAGAAGGCAACAA-3') şi un primer invers care leagă joncţiunea exonului 51/52 şi 54 SECV ID NR: 6 (5'-GAAGTTTCAGGGCCAAGTCA-3'). Un exon 53 sărit a avut ca rezultat un amplicon de 201 bp şi un exon 53 nesărit a avut ca rezultat un amplicon 413 bp.
Omiterea exonului 23 de şoarece a fost măsurată prin RT-PCR cu un primer DE AVANS-SECV ID NR: 7 (5'-CACATCTTTGATGGTGTGAGG-3') şi un primer invers SECV ID NR: 8 (5'-CAACTTCAGCCATCCATTTCTG-3').
După ce ARN-ul a fost supus RT-PCR, probele au fost analizate folosind un aparat etrier, care utilizează electroforeză capilară în gel. Saltul procentual al exonului a fost calculat folosind următoarea ecuaţie: (aria de sub curbă pentru benzile omise)/(suma ariei de sub curbă pentru benzile sărite şi nesărite)x100.
Imunohistochimie: colorare cu distrofină:
Secţiuni de ţesut îngheţat de 10 microni ale cvadricepsului de şoarece au fost utilizate pentru a detecta distrofina prin anticorpul primar al distrofinei (diluţie 1:250, iepure, Abcam, cat#ab 15277) în 10% ser de capră + 1% BSA în PBS şi anticorpul secundar Alexa-Fluoro 488 anti-crab de capră (diluţie de 1:1000) în 10% ser de capră + 1% BSA.
Pregătirea subunităţilor Morfolino
Referitor la schema 1, în care B reprezintă o parte de împerechere de bază, subunităţile morfolino pot fi preparate din ribonucleozida corespunzătoare (1) aşa cum se arată. Subunitatea morfolino (2) poate fi protejată opţional prin reacţie cu un precursor adecvat al grupării protectoare, de exemplu clorura de tritil. Gruparea de protecţie 3' este, în general, eliminată în timpul sintezei oligomerului în stare solidă, aşa cum este descris mai detaliat mai jos. Fragmentul de împerechere de bază poate fi protejat corespunzător pentru sinteza oligomerului în fază solidă. Grupările de protecţie adecvate includ benzoil pentru adenină şi citozină, fenilacetil pentru guanină şi pivaloiloximetil pentru hipoxantină (I). Grupul pivaloiloximetil poate fi introdus în poziţia N1 a bazei heterociclice hipoxantină. Deşi poate fi utilizată o subunitate neprotejată de hipoxantină, randamentele reacţiilor de activare sunt mult superioare atunci când baza este protejată. Alte grupări de protecţie adecvate includ pe cele dezvăluite în brevetul US nr. 8.076.476.
Reacţia lui 3 cu compusul de fosfor activat 4 are ca rezultat subunităţile morfolino având fracţiunea de legătură dorită 5.
Compuşii structurii 4 pot fi preparaţi utilizând orice număr de metode cunoscute de specialiştii în domeniu. Cuplarea cu fragmentul morfolino se face după cum s-a subliniat mai sus.
Compuşii cu structură 5 pot fi utilizaţi în sinteza oligomerului în fază solidă pentru prepararea oligomerilor cuprinzând legăturile între subunităţi. Astfel de metode sunt bine-cunoscute în domeniu. Pe scurt, un compus cu structura 5 poate fi modificat la capătul 5' pentru a conţine un linker către un suport solid. Odată susţinut, grupul protector 5 (de exemplu, tritil la capătul 3'-) este îndepărtat şi amina liberă reacţionează cu o fracţiune de fosfor activată dintr-un al doilea compus cu structura 5. Această secvenţă se repetă până când se obţine lungimea oligo dorită. Grupul de protecţie din capătul terminal 3 poate fi îndepărtat sau lăsat dacă se doreşte o modificare la 3 '. Oligo poate fi îndepărtat de pe suportul solid folosind orice număr de metode, sau exemplu de tratament cu o bază pentru a scinda legătura la suportul solid. \tabPrepararea oligomerilor morfolino în general şi a oligomerilor morfolino specifici din dezvăluire este descrisă mai detaliat în exemple.
Prepararea oligomerilor morfolino
Prepararea compuşilor dezvăluirii se efectuează utilizând următorul protocol conform Schemei 2:
Prepararea carbamatului de fenil tritil piperazină 35: La o suspensie răcită a compusului 11 în diclormetan (6 ml/g 11) s-a adăugat o soluţie de carbonat de potasiu (3,2 eq) în apă (4 ml/g carbonat de potasiu). La acest amestec bifazic s-a adăugat lent o soluţie de cloroformiat de fenil (1,03 eq) în diclormetan (2 g/g cloroformiat de fenil).
Amestecul de reacţie a fost încălzit la 20 °C. La finalizarea reacţiei (1-2 h), straturile au fost separate. Stratul organic a fost spălat cu apă şi uscat pe carbonat de potasiu anhidru. Produsul 35 a fost izolat prin cristalizare din acetonitril.
Prepararea alcoolului carbamat 36: Hidrura de sodiu (1,2 eq) a fost suspendată în 1-metil-2-pirolidinonă (32 ml/g hidrură de sodiu). La această suspensie s-au adăugat trietilenglicol (10,0 eq) şi compusul 35 (1,0 eq). Suspensia rezultată a fost încălzită la 95 °C. La finalizarea reacţiei (1-2 ore), amestecul a fost răcit la 20 °C. La acest amestec s-au adăugat 30% diclormetan/metil terţ-butil eter (v:v) şi apă. Stratul organic care conţine produsul a fost spălat succesiv cu NaOH apos, acid succinic apos şi clorură de sodiu apoasă saturată. Produsul 36 a fost izolat prin cristalizare din diclormetan/metil terţ-butil eter/heptan.
Prepararea acidului coadă 37: La o soluţie de compus 36 în tetrahidrofuran (7 ml/g 36) s-a adăugat anhidridă succinică (2,0 eq) şi DMAP (0,5 eq). Amestecul a fost încălzit la 50 °C. La finalizarea reacţiei (5 ore), amestecul a fost răcit la 20 °C şi ajustat la pH 8,5 cu NaHCO3 apos. S-a adăugat metil terţ-butil eter şi produsul a fost extras în stratul apos. S-a adăugat diclormetan şi amestecul a fost ajustat la pH 3 cu acid citric apos. Stratul organic care conţine produsul a fost spălat cu un amestec de pH=3 soluţie tampon de citrat şi clorură de sodiu apoasă saturată. Această soluţie de diclormetan de 37 a fost utilizată fără izolare în prepararea compusului 38.
Prepararea 38: La soluţia compusului 37 s-a adăugat imidă a acidului N-hidroxi-5-norbornen-2,3-dicarboxilic (HONB) (1,02 eq), 4-dimetilaminopiridină (DMAP) (0,34 eq) şi apoi clorhidrat de 1-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimidă (EDC) (1,1 eq). Amestecul a fost încălzit la 55 °C. La finalizarea reacţiei (4-5 ore), amestecul a fost răcit la 20 °C şi spălat succesiv cu 1:1 0,2 M acid citric/saramură şi saramură. Soluţia de diclormetan a fost supusă schimbului de solvenţi cu acetonă şi apoi cu N,N-dimetilformamidă, iar produsul a fost izolat prin precipitare din acetonă/ N,N-dimetilformamidă în clorură de sodiu apoasă saturată. Produsul brut a fost resuscitat de mai multe ori în apă pentru a îndepărta reziduurile de N,N-dimetilformamidă şi sărurile.
Metoda A de sinteză a PMO: Utilizarea ancorei pentru disulfură
Introducerea "cozii" activate pe răşina încărcată cu ancoră a fost efectuată în dimetil imidazolidinonă (DMI) prin procedura utilizată pentru încorporarea subunităţilor în timpul sintezei fazei solide.
Această procedură a fost efectuată într-un vas de peptidă cu manta, silanizat, (ChemGlass, NJ, SUA) cu o porozitate grosieră (40-60 µm) de sticlă, agitator deasupra şi robinet de închidere din teflon cu 3 căi pentru a permite N2 să facă barboteze prin frită sau extracţie în vid. Etapele de tratare/spălare a răşinii în următoarea procedură constau în două operaţiuni de bază: fluidizarea răşinii sau agitarea reactorul în pat şi extracţia solventului/soluţiei. Pentru fluidizarea răşinii, robinetul a fost poziţionat pentru a permite curgerea N2 prin frită şi tratamentul răşinii/spălarea specificate au fost adăugate la reactor şi lăsate să permeeze şi să se ude complet răşina. Amestecarea a fost apoi începută şi pasta de răşină a fost amestecată pentru perioada de timp specificată. Pentru extragerea solventului/soluţiei, amestecarea şi debitul de N2 au fost oprite şi pompa de vid a fost pornită şi apoi robinetul a fost poziţionat pentru a permite evacuarea răşinii de tratament/spălare la deşeuri. Toate volumele de tratament a răşinii/spălare au fost la 15 ml/g de răşină, cu excepţia cazului în care se specifică altfel. \tabLa răşina de aminometilpolistiren (100-200 mesh; ∼1, 0 mmol/g sarcină bazată pe substituţia azotului; 75 g, 1 echivalent, Polymer Labs, Marea Britanie, partea nr. 1464-X799) într-un vas de peptidă silanizat, cu manta, s-a adăugat 1-metil-2-pirolidinonă (NMP; 20 ml/g răşină) şi răşina a fost lăsată să se umfle cu amestecare timp de 1-2 h. După evacuarea solventului de umflare, răşina a fost spălată cu diclormetan (2 x 1-2 min), 5% diizopropiletilamină în 25% izopropanol/diclormetan (2 x 3-4 min) şi diclormetan (2 x 1-2 min). După evacuarea spălării finale, răşina a fost tratată cu o soluţie de ancoră disulfurică 34 în 1-metil-2-pirolidinonă (0,17 M; 15 ml/g răşină, 2,5 eq), şi amestecul răşină/reactiv a fost încălzit la 45 °C timp de 60 h. La finalizarea reacţiei, încălzirea a fost întreruptă şi soluţia de ancorare a fost evacuată, iar răşina a fost spălată cu 1-metil-2-pirolidinonă (4 x 3-4 min) şi diclormetan (6 x 1-2 min). Răşina a fost tratată cu o soluţie de dicarbonat de dietil 10% (v/v) în diclormetan (16 ml/g; 2 x 5-6 min) şi apoi spălată cu diclormetan (6 x 1-2 min). Răşina 39 a fost uscată sub un curent de N2 timp de 1-3 h şi apoi sub vid până la o greutate constantă (± 2%). Randament: 110-150% din greutatea iniţială a răşinii. Determinarea încărcării răşinii aminometilpolistiren-disulfură: Încărcarea răşinii (numărul de situsuri reactive potenţial disponibile) este determinată printr-un test spectrometric pentru numărul de grupări de trifenilmetil (tritil) per gram de răşină. \tabO greutate cunoscută de răşină uscată (25 ± 3 mg) se transferă într-un balon volumetric de 25 ml silanizat şi se adaugă 5 ml de acid trifluoracetic 2% (v/v) în diclormetan. Conţinutul se amestecă prin rotire uşoară şi apoi se lasă în repaus timp de 30 min. Volumul este adus până la 25 ml cu acid trifluoracetic suplimentar 2% (v/v) în diclormetan şi conţinutul este amestecat bine. Folosind o pipetă de deplasare pozitivă, o parte alicotă din soluţia care conţine tritil (500 µl) este transferată într-un balon gradat de 10 ml, iar volumul este adus până la 10 ml cu acid metansulfonic. \tabConţinutul de cationi tritilici în soluţia finală se măsoară prin absorbţia UV la 431,7 nm şi încărcarea răşinii calculată în grupe tritil per gram de răşină (µmol/g) utilizând volumele, diluţiile, coeficientul de extincţie (ε: 41 µmol-1cm-1) şi greutatea răşinii corespunzătoare. Testul se efectuează în triplicat şi se calculează o încărcare medie. Procedura de încărcare a răşinii din acest exemplu va furniza răşină cu o încărcare de aproximativ 500 µmol/g. O încărcare de 300-400 µmol/g a fost obţinută dacă etapa de încorporare a ancorei cu disulfură este efectuată timp de 24 h la temperatura camerei. Încărcarea cozii: Folosind aceeaşi configuraţie şi aceleaşi volume ca şi pentru prepararea răşinii aminometilpolistiren-disulfură, coada poate fi introdusă în suport solid. Răşina încărcată cu ancoră a fost mai întâi deprotejată în stare acidă, şi materialul rezultat a fost neutralizat înainte de cuplare. Pentru etapa de cuplare s-a utilizat o soluţie de 38 (0,2 M) în DMI conţinând 4-etilmorfolină (NEM, 0,4 M) în locul soluţiei de ancoră pentru disulfură. După 2 h la 45 °C, răşina 39 a fost spălată de două ori cu 5% diizopropiletilamină în 25% izopropanol/diclormetan şi o dată cu DCM. La răşină s-a adăugat o soluţie de anhidridă benzoică (0,4 M) şi NEM (0,4 M). După 25 de minute, mantaua reactorului a fost răcită la temperatura camerei, iar răşina a fost spălată de două ori cu 5% diizopropiletilamină în 25% izopropanol/diclormetan şi de opt ori cu DCM. Răşina 40 a fost filtrată şi uscată sub vid înalt. Încărcarea răşinii 40 este definită ca fiind încărcarea răşinii iniţiale de aminometilpolistiren-disulfură 39 utilizată la încărcarea cozii. Sinteza fazei solide: Oligomerii morfolino au fost preparaţi pe un sintetizator automat de peptide Gilson AMS-422 în 2 ml de coloane de reacţie din polipropilenă Gilson (Partea # 3980270). Un bloc de aluminiu cu canale pentru debitul de apă a fost plasat în jurul coloanelor în timp ce se aşezau pe sintetizator. AMS-422 va adăuga alternativ soluţii de reactiv/spălare, va menţine un timp specific şi va evacua coloanele utilizând vid. Pentru oligomerii cu o lungime de până la aproximativ 25 de subunităţi, se preferă răşina aminometilpolistiren-disulfură cu încărcare de aproape 500 µmol/g de răşină. Pentru oligomerii mai mari, se preferă răşina aminometilpolistiren-disulfură cu încărcare de 300-400 µmol/g de răşină. Dacă se doreşte o moleculă cu coadă 5', răşina care a fost încărcată cu coadă este aleasă cu aceleaşi reguli de încărcare. \tabAu fost preparate următoarele soluţii de reactivi:
Soluţie de dezmembrare: 10% acid cianoacetic (m/v) în 4:1 diclormetan/acetonitril;
Soluţie de neutralizare: 5% diizopropiletilamină în 3:1 diclormetan/izopropanol; şi Soluţie de cuplare: 0,18 M (sau 0,24 M pentru oligomerii care au crescut mai mult de 20 de subunităţi) subunitate morfolino activată de tipul de bază şi de legătură dorit şi 0,4 M N etilmorfolină în 1,3-dimetilimidazolidinonă.
Diclormetanul (DCM) a fost utilizat ca o spălare tranzitorie care separa diferitele spălări cu soluţii de reactivi.
Pe sintetizator, cu blocul setat la 42 °C, în fiecare coloană conţinând 30 mg de răşină de aminometilpolistiren-disulfură (sau răşină de coadă) s-a adăugat 2 ml de 1-metil-2-pirolidinonă şi s-a lăsat să stea la temperatura camerei timp de 30 min.
După spălarea cu 2 ml de diclormetan, s-a folosit următorul ciclu de sinteză:
Etapa Volum Livrare Timp de retenţie Detritilare 1,5 ml Colector 15 secunde Detritilare 1,5 ml Colector 15 secunde Detritilare 1,5 ml Colector 15 secunde Detritilare 1,5 ml Colector 15 secunde Detritilare 1,5 ml Colector 15 secunde Detritilare 1,5 ml Colector 15 secunde Detritilare 1,5 ml Colector 15 secunde DCM 1,5 ml Colector 30 de secunde Neutralizare 1,5 ml Colector 30 de secunde Neutralizare 1,5 ml Colector 30 de secunde Neutralizare 1,5 ml Colector 30 de secunde Neutralizare 1,5 ml Colector 30 de secunde Neutralizare 1,5 ml Colector 30 de secunde Neutralizare 1,5 ml Colector 30 de secunde DCM 1,5 ml Colector 30 de secunde Cuplaj 350-500µl Seringă 40 minute DCM 1,5 ml Colector 30 de secunde Neutralizare 1,5 ml Colector 30 de secunde Neutralizare 1,5 ml Colector 30 de secunde DCM 1,5 ml Colector 30 de secunde DCM 1,5 ml Colector 30 de secunde DCM 1,5 ml Colector 30 de secunde
Secvenţele oligomerilor individuali au fost programaţi în sintetizator, astfel încât fiecare coloană să primească soluţia de cuplare corespunzătoare (A,C,G,T,I) în secvenţa corectă. Când oligomerul dintr-o coloană a finalizat încorporarea subunităţii sale finale, coloana a fost scoasă din bloc şi un ciclu final a fost efectuat manual cu o soluţie de cuplare compusă din clorură de 4-metoxitrifenilmetil (0,32 M în DMI) conţinând 0,89 M 4-etilmorfolină.
Desprinderea din răşină şi îndepărtarea bazelor şi a grupărilor de protecţie a scheletului: După metoxitritilare, răşina a fost spălată de 8 ori cu 2 ml 1-metil-2-pirolidinonă. S-a adăugat un ml de soluţie de clivaj constând din 0,1 M 1,4-ditiotreitol (DTT) şi 0,73 M trietilamină în 1-metil-2-pirolidinonă, coloana s-a acoperit şi s-a lăsat la temperatura camerei timp de 30 min. După această perioadă, soluţia a fost drenată într-un flacon Wheaton de 12 ml. Răşina foarte strânsă a fost spălată de două ori cu 300 µl de soluţie de clivaj. La soluţie s-a adăugat 4,0 ml amoniac apos conc. (păstrat la - 20 °C), flaconul a fost închis ermetic (cu capac filetat căptuşit cu teflon), iar amestecul s-a agitat pentru a amesteca soluţia. Flaconul a fost introdus într-un cuptor la 45°C timp de 16-24 h pentru a produce scindarea grupărilor de protecţie a bazei şi a scheletului.
Purificarea produsului brut: Soluţia viabilă de amonoliză a fost scoasă din cuptor şi lăsată să se răcească la temperatura camerei. Soluţia a fost diluată cu 20 ml de amoniac apos 0,28% şi s-a trecut printr-o coloană de 2,5x10 cm conţinând răşină Macroprep HQ (BioRad). Un gradient de sare (A: 0,28% amoniac cu B: 1 M clorură de sodiu în 0,28% amoniac; 0-100% B în 60 min) a fost utilizat pentru a elua vârful care a conţinut metoxitritil. Fracţiunile combinate au fost puse în comun şi prelucrate ulterior în funcţie de produsul dorit.
Demetoxitritilarea oligomerilor morfolino: Fracţiunile cumulate din purificarea Macroprep au fost tratate cu 1 M H3PO4 pentru a reduce pH-ul la 2,5. După amestecarea iniţială, probele au fost aşezate la temperatura camerei timp de 4 min, moment în care sunt neutralizate la pH 10-11 cu 2,8% amoniac/apă. Produsele au fost purificate prin extracţie în fază solidă (SPE).
Coloană de ambalare şi condiţionare SPE: Chihlimbar CG-300M (Rohm şi Haas; Philadelphia, PA) (3 ml) este ambalat în coloane de 20 ml (BioRad Econo-Pac Chromatography Columns (732-1011)) şi răşina clătită cu 3 ml din următoarele: 0,28% NH4OH/80% acetonitril; 0,5 M NaOH/20% etanol; apă; 50 mM H3PO4/ 80% acetonitril; apă; 0,5 NaOH/20% etanol; apă; 0,28% NH4OH.
Purificare SPE: Soluţia din demetoxitritilare a fost încărcată pe coloană şi răşina a fost clătită de trei ori cu 3-6 ml de amoniac apos 0,28%. Un flacon Wheaton (12 ml) a fost plasat sub coloană şi produsul a fost eluat prin două spălări cu 2 ml de 45% acetonitril în 0,28% amoniac apos.
Izolarea produsului: Soluţiile au fost îngheţate în gheaţă uscată şi flacoanele au fost introduse într-un uscător de gheaţă pentru a produce o pulbere albă pufoasă. Probele au fost dizolvate în apă, filtrate printr-un filtru de 0,22 microni (Pall Life Sciences, filtru seringă Acrodisc 25 mm, cu membrană de 0,2 microni HT Tuffryn) folosind o seringă, şi densitatea optică (OD) a fost măsurată pe un spectrofotometru UV pentru a determina unităţile OD ale oligomerului prezent, precum şi pentru a distribui proba pentru analiză. Soluţiile au fost apoi puse înapoi în flacoanele Wheaton pentru liofilizare.
Analiza oligomerilor morfolino prin MALDI: spectrometria de masă MALDI-TOF a fost utilizată pentru a determina compoziţia fracţiunilor în purificări, precum şi pentru a furniza dovezi pentru identitatea (greutatea moleculară) a oligomerilor. Probele au fost rulate după diluarea cu soluţie de acid 3,5-dimetoxi-4-hidroxicinamic (acid sinapinic), 3,4,5-trihidoxiacetofenonă (THAP) sau acid alfa-ciano-4-hidoxicinamic (HCCA) ca matrice.
Metoda de sinteză B a PMO: utilizarea ancorei NCP2
Sinteza ancorei NCP2:
1. Prepararea 4-fluoro-3-nitrobenzoatului de metil (1)
Într-un balon de 100 l s-au încărcat 12,7 kg de acid 4-fluoro-3-nitrobenzoic, s-au adăugat 40 kg de metanol şi 2,82 kg de acid sulfuric concentrat. Amestecul a fost agitat la reflux (65 °C) timp de 36 h. Amestecul de reacţie a fost răcit la 0 °C. Cristale formate la 38 °C. Amestecul a fost menţinut la 0° C timp de 4 h, apoi filtrat sub azot. Balonul de 100 l a fost spălat şi turta de filtrare a fost spălată cu 10 kg de metanol care a fost răcit la 0 °C. Turta de filtrare solidă a fost uscată pe pâlnie timp de 1 oră, transferată în tăvi şi uscată într-un cuptor vidat la temperatura camerei la o greutate constantă de 13,695 kg de 4-fluoro-3-nitrobenzoat de metil (randament 100%; HPLC 99%).
2. Prepararea acidului 3-nitro-4- (2-oxopropil)benzoic
A. 4-(3-hidroxi-1-metoxi-1-oxobut-2-en-2-il)-3-nitrobenzoat de (Z)-metil (2)
La un balon de 100 l s-au încărcat 3,98 kg de 4-fluoro-3-nitrobenzoat de metil (1) din etapa anterioară, 9,8 kg DMF, 2,81 kg de acetoacetat de metil. Amestecul a fost agitat şi răcit la 0 °C. La acesta s-a adăugat 3,66 kg DBU timp de aproximativ 4 ore, în timp ce temperatura a fost menţinută la sau sub 5 °C. Amestecul a fost agitat încă 1 oră. La balonul de reacţie s-a adăugat o soluţie de 8,15 kg de acid citric în 37,5 kg de apă purificată, în timp ce temperatura de reacţie a fost menţinută la sau sub 15 °C. După adăugare, amestecul de reacţie a fost agitat 30 de minute, apoi filtrat sub azot. Turta de filtrare umedă a fost returnată în balonul de 100 l împreună cu 14,8 kg de apă purificată. Pasta a fost agitată timp de 10 minute, apoi filtrată. Turta umedă a fost din nou returnată în balonul de 100 l, şlamată cu 14,8 kg de apă purificată timp de 10 minute şi filtrată dând 4-(3-hidroxi-1-metoxi-1-oxobut-2-en-2-il)-3-nitrobenzoat de (Z) -metil.
B. Acid 3-nitro-4- (2-oxopropil)benzoic
4-(3-hidroxi-1-metoxi-1-oxobut-2-en-2-il)-3-nitrobenzoat de (Z)-metil a fost încărcat într-un balon de reacţie de 100 l sub azot. La acesta s-au adăugat 14,2 kg de 1,4-dioxan şi s-au agitat. La amestec s-a adăugat o soluţie de 16,655 kg HCl concentrat şi 13,33 kg apă purificată (6 M HCl) timp de 2 ore, în timp ce temperatura amestecului de reacţie a fost menţinută sub 15 °C. Când adăugarea a fost completă, amestecul de reacţie a fost încălzit la reflux (80 °C) timp de 24 de ore, răcit la temperatura camerei şi filtrat sub azot. Turta de filtrare solidă a fost triturată cu 14,8 kg de apă purificată, filtrată, triturată din nou cu 14,8 kg de apă purificată şi filtrată. Solidul a fost reintrodus în balonul de 100 l cu 39,9 kg de DCM şi agitat din nou timp de o oră. S-au adăugat 1,5 kg de apă purificată pentru a dizolva restul de solide. Stratul organic de jos a fost împărţit într-un balon de 72 l preîncălzit, apoi a fost returnat într-un balon de 100 l curat şi uscat. Soluţia a fost răcită la 0 °C, ţinută timp de 1 oră, apoi filtrată. Turta de filtrare solidă a fost spălată de două ori fiecare cu o soluţie de 9,8 kg DCM şi 5 kg heptan, apoi uscată pe pâlnie. Solidul a fost transferat în tăvi şi uscat la o greutate constantă de 1,855 kg de acid 3-nitro-4-(2-oxopropil)benzoic. Randament total 42% din compusul 1. HPLC 99,45%.
3. Prepararea de succinat de N-tritilpiperazină (NTP)
La un balon acoperit de 72 l a fost încărcat cu azot, 1,805 kg clorură de trifenilmetil şi 8,3 kg de toluen (soluţie TPC). Amestecul a fost agitat până la dizolvarea solidelor. Într-un balon de reacţie cu manta de 100 l s-au adăugat sub azot 5,61 kg piperazină, 19,9 kg toluen şi 3,72 kg metanol. Amestecul a fost agitat şi răcit la 0 °C. La acesta s-a adăugat încet, în porţiuni, soluţia de TPC timp de 4 ore, în timp ce temperatura de reacţie a fost menţinută la sau sub 10 °C. Amestecul a fost agitat timp de 1,5 ore la 10 °C, apoi lăsat să se încălzească la 14°C. 32,6 kg de apă purificată au fost încărcate în balonul de 72 l, apoi transferate în balonul de 100 l, în timp ce temperatura internă a lotului a fost menţinută la 20 ± 5 °C. Straturile au fost lăsate să se divizeze, şi stratul apos inferior a fost separat şi depozitat. Stratul organic a fost extras de trei ori cu 32 kg de apă purificată fiecare, şi straturile apoase au fost separate şi combinate cu soluţia apoasă depozitată.
Stratul organic rămas a fost răcit la 18 °C şi o soluţie de 847 g de acid succinic în 10,87 kg de apă purificată a fost adăugată încet în porţiuni la stratul organic. Amestecul a fost agitat timp de 1,75 h la 20 ± 5 °C. Amestecul a fost filtrat, şi solidele au fost spălate cu 2 kg TBME şi 2 kg de acetonă, apoi uscate pe pâlnie. Turta de filtrare a fost triturată de două ori cu 5,7 kg de acetonă fiecare şi a fost filtrată şi spălată cu 1 kg de acetonă între trituraţii. Solidul a fost uscat pe pâlnie, apoi transferat în tăvi şi uscat într-un cuptor cu vid la temperatura camerei, la o greutate constantă de 2,32 kg de NTP. Randament 80%.
4. Prepararea (4-(2-hidroxipropil)-3-nitrofenil)(4-tritilpiperazin-1-il)metanonei
A. Preparat de 1-(2-nitro-4(4-tritilpiperazin-1-carbonil)fenil)propan-2-onă
Într-un balon acoperit cu cămaşă de 100 l s-a încărcat 2 kg de acid 3-nitro-4- (2-oxopropil)benzoic (3), 18,3 kg DCM şi 1,845 kg clorhidrat de N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimidă (EDC.HCl). Soluţia a fost agitată până la formarea unui amestec omogen. 3,048 kg de NTP au fost adăugate timp de 30 de minute la temperatura camerei şi agitate timp de 8 ore. La amestecul de reacţie s-au adăugat 5,44 kg de apă purificată şi s-au agitat timp de 30 de minute. Straturile au fost lăsate să se separe, iar stratul organic inferior care conţinea produsul a fost drenat şi depozitat. Stratul apos a fost extras de două ori cu 5,65 kg de DCM. Straturile organice combinate au fost spălate cu o soluţie de 1,08 kg clorură de sodiu în 4,08 kg apă purificată. Straturile organice au fost uscate pe 1,068 kg de sulfat de sodiu şi filtrate. Sulfatul de sodiu a fost spălat cu 1,3 kg de DCM. Straturile organice combinate au fost suspendate cu 252 g de silicagel şi filtrate printr-o pâlnie de filtrare conţinând un strat de 252 g de silicagel. Patul de silicagel a fost spălat cu 2 kg de DCM. Straturile organice combinate s-au evaporat pe un rotovap. 4,8 kg de THF s-au adăugat reziduului şi apoi s-au evaporat pe rotovap până când s-au atins 2,5 volume de 1-(2-nitro-4(4-tritilpiperazin-1-carbonil)fenil)propan-2-onă brută în THF.
B. Prepararea (4-(2-hidroxipropil)-3-nitrofenil)(4-tritilpiperazin-1-il)metanonei (5)
Într-un balon acoperit cu cămaşă de 100 l s-au încărcat cu azot 3600 g de 4 din etapa anterioară şi 9800 g de THF. Soluţia agitată a fost răcită la ≤ 5 °C. Soluţia a fost diluată cu 11525 g etanol şi 194 g borohidrură de sodiu au fost adăugate pe parcursul a aproximativ 2 ore la ≤ 5 °C. Amestecul de reacţie a fost agitat timp de încă 2 ore la ≤ 5 °C. Reacţia a fost stinsă cu o soluţie de aproximativ 1,1 kg de clorură de amoniu în aproximativ 3 kg de apă prin adăugare lentă pentru a menţine temperatura la ≤ 10 °C. Amestecul de reacţie s-a agitat încă 30 de minute, s-a filtrat pentru a îndepărta substanţele anorganice şi s-a reîncărcat într-un balon acoperit de 100 l şi s-a extras cu 23 kg de DCM. Stratul organic a fost separat, iar apa a mai fost de două ori extrasă cu 4,7 kg de DCM fiecare. Straturile organice combinate au fost spălate cu o soluţie de aproximativ 800 g de clorură de sodiu în aproximativ 3 kg de apă, apoi uscate pe 2,7 kg de sulfat de sodiu. Suspensia a fost filtrată şi turta de filtrare a fost spălată cu 2 kg de DCM. Filtratele combinate au fost concentrate la 2,0 volume, diluate cu aproximativ 360 g de acetat de etil şi s-au evaporat. Produsul brut a fost încărcat într-o coloană de silicagel de 4 kg de siliciu ambalat cu DCM sub azot şi eluată cu 2,3 kg acetat de etil în 7,2 kg de DCM. Fracţiunile combinate au fost evaporate şi reziduul a fost preluat în 11,7 kg de toluen. Soluţia de toluen a fost filtrată şi turta de filtrare a fost spălată de două ori cu 2 kg de toluen fiecare. Turta de filtrare a fost uscată la o greutate constantă de 2,275 kg de compus 5 (randament 46% din compusul 3) HPLC 96,99%.
5. Prepararea de 2,5-dioxopirolidin-1-il(1-(2-nitro-4-(4-trifenilmetilpiperazin-1 carbonil)fenil)propan-2-il) carbonat (ancoră NCP2)
La un balon acoperit cu manta de 100 l cu azot a fost încărcat 4,3 kg de compus 5 (greutate ajustată pe baza toluenului rezidual de H1 RMN; toţi reactivii de aici au fost scalaţi în mod corespunzător) şi 12,7 kg piridină. În acest scop, s-a încărcat 3,160 kg de DSC (78,91% în greutate din H1 RMN), în timp ce temperatura internă a fost menţinută la ≤ 35 °C. Amestecul de reacţie a fost îmbătrânit timp de aproximativ 22 de ore la ambianţă, apoi a fost filtrat. Turta de filtrare a fost spălată cu 200 g de piridină. În două loturi, fiecare conţinând 1⁄2 din volumul de filtrat, filtratul s-a spălat, încărcat lent într-un balon acoperit, cu manta, de 100 l care conţine o soluţie de aproximativ 11 kg de acid citric în aproximativ 50 kg de apă şi s-a agitat timp de 30 de minute pentru a permite precipitarea în stare solidă. Solidul a fost colectat cu o pâlnie de filtrare, spălat de două ori cu 4,3 kg de apă la fiecare spălare şi uscat pe pâlnia de filtrare sub vid.
Solidele combinate au fost încărcate într-un balon acoperit, cu manta, de 100 l şi dizolvate în 28 kg de DCM şi spălate cu o soluţie de 900 g de carbonat de potasiu în 4,3 kg de apă. După 1 oră, straturile au fost lăsate să se separe şi stratul apos a fost îndepărtat. Stratul organic a fost spălat cu 10 kg de apă, separat şi uscat pe 3,5 kg de sulfat de sodiu. DCM a fost filtrat, evaporat şi uscat sub vid la 6,16 kg de ancoră NCP2 (randament 114%).
Sinteza răşinii încărcate cu ancoră NCP2
La un reactor de sinteză în fază solidă de 75 l cu un robinet de oprire din teflon a fost încărcaţi aproximativ 52 L de NMP şi 2300 g de răşină de polistiren aminometil. Răşina a fost agitată în NMP pentru a se umfla timp de aproximativ 2 ore, apoi a fost drenată. Răşina a fost spălată de două ori cu aproximativ 4 l DCM per spălare, apoi de două ori cu 39 l soluţie de neutralizare per spălare, apoi de două ori cu 39 l DCM per spălare. Soluţia de ancorare NCP2 a fost adăugată încet la soluţia de răşină agitată, agitată timp de 24 de ore la temperatura camerei şi drenată. Răşina a fost spălată de patru ori cu 39 l de NMP per spălare şi de şase ori cu 39 l de DCM per spălare. Răşina a fost tratată şi agitată cu 1⁄2 din soluţia de acoperire DEDC timp de 30 de minute, drenată şi a fost tratată şi agitată cu cea de a doua jumătate din soluţia de acoperire DEDC timp de 30 de minute şi drenată. Răşina a fost spălată de şase ori cu 39 l de DCM per spălare, apoi uscată într-un cuptor la o greutate constantă de 3573,71 g de răşină încărcată cu ancoră.
Prepararea oligomerului morfolino utilizând ancora NCP2
Referinţa 50 L Sinteza în fază solidă a substanţei Golodirsen (PMO#1) Substanţă medicamentoasă brută
1. Materiale
Tabelul 2: Materiale de bază
Denumire Material Denumire chimică Număr CAS Formulă chimică Masă moleculară Subunitate A activată Acid fosforamidocloridat, ester N,N-dimetil-,[6-[6-(benzoilamino)-9H-purin-9-il]-4-(trifenilmetil)-2-morfolinil]metil 1155373-30-0 C38H37CIN704P 722,2 Subunitate C activată Acid fosforamidocloridat, ester N,N-dimetil-,[6-[4-(benzoilamino)-2-oxo-1 (2H)-pirimidinil]-4-(trifenilmetil)-2-morfolinil]metil 1155373-31-1 C37H37ClN5O5P 698,2 Subunitate DPG activată Acid propanoic, 2,2-dimetil-,4-[[[9-[6-[[[cloro(dimetilamino)fosfinil]oxi]metil]-4-(trifenilmetil)-2-morfolinil]-2-[(2- fenilacetil)amino]-9H-purin-6-il]oxi]metil]fenil ester 1155309-89-9 C51H53cin7O7P 942,2 Subunitate T activată Acid fosforamidocloridat, ester N,N-dimetil-,[6-(3,4-dihidro-5-metil-2,4-dioxo-1(2H)-pirimidinil)]-4-(trifenilmetil)-2-morfolinil]metil 1155373-34-4 C31H34ClN4O5P 609,1 Coadă EG3 activată Acid butandioic, ester de 1-[3aR,4S,7R,7aS)-1,3,3a,4,7,7a-hexahidro-1,3-dioxo-4,7-metano-2H-izoindol-2-il]4-[2-[2-[2-[[[4-(trifenilmetil)-1-piperazinil]carbonil] oxi]etoxi] etoxi]etil] 1380600-06-5 C43H47N3O10 765,9
Structuri chimice ale materialelor de bază:
A. Coadă EG3 activată
B. Subunitate C activată (pentru preparare, vezi brevetul US nr. 8.067.571)
C. Subunitate activată (pentru preparare, vezi brevetul US nr. 8.067.571)
D. Subunitate DPG activată (pentru preparare, vezi WO 2009/064471)
E. Subunitate T activată (pentru preparare, vezi WO 2013/082551)
F. Răşină încărcată cu ancoră
în care R1 este un mediu de sprijin.
Tabelul 3: Descrierea soluţiilor pentru sinteza oligomerului în fază solidă din substanţa Golodirsen sub formă de medicament brut
Denumirea soluţiei Compoziţia soluţiei Soluţie de ancorare NCP2 37,5 L NMP şi 1292 g ancoră NCP2 Soluţie de plafonare DEDC 4,16 l dicarbonat de dietil (DEDC), 3,64 l NEM şi 33,8 l DCM Soluţie CYTFA 2,02 kg 4-cianopiridină, 158 l DCM, 1,42 l TFA, 39 l TFE şi 2 l apă purificată Soluţie de neutralizare 35,3 l IPA, 7,5 l DIPEA şi 106,5 l DCM Soluţie de decolteu 1.530,04 g DTT, 6,96 l NMP şi 2,98 l DBU
2. Sinteza de referinţă a substanţei medicamentoase brute Golodirsen
A. Umflarea răşinii
750 g de răşină încărcată cu ancoră şi 10,5 l de NMP au fost încărcate la un reactor silanizat de 50 l şi agitate timp de 3 ore. NMP a fost drenat şi răşina încărcată cu ancoră a fost spălată de două ori cu 5,5 l fiecare de DCM şi de două ori cu 5,5 l fiecare de 30% TFE/DCM.
B. Ciclul 0: cuplarea cozii EG3
Răşina încărcată cu ancoră a fost spălată de trei ori cu 5,5 l fiecare de 30% TFE/DCM şi drenată, spălată cu 5,5 l de soluţie CYFTA timp de 15 minute şi drenată şi din nou spălată cu 5,5 l de soluţie CYTFA timp de 15 minute fără drenare la care 122 ml de 1:1 NEM/DCM a fost încărcată şi suspensia a fost agitată timp de 2 minute şi drenată. Răşina a fost spălată de două ori cu 5,5 l de soluţie de neutralizare timp de 5 minute şi drenată, apoi de două ori cu 5,5 l fiecare de DCM şi drenată. O soluţie de 706,2 g de EG3 coadă activat (MW 765,85) şi 234 ml de NEM în 3 l de DMI a fost încărcată pe răşină şi agitată timp de 3 ore la temperatura camerei şi drenată. Răşina a fost spălată de două ori cu 5,5 l fiecare de soluţie de neutralizare timp de 5 minute pentru fiecare spălare şi o dată cu 5,5 l de DCM şi drenată. O soluţie de 374,8 g de anhidridă benzoică şi 195 ml de NEM în 2680 ml NMP a fost încărcată şi agitată timp de 15 minute şi drenată. Răşina a fost agitată cu 5,5 l de soluţie de neutralizare timp de 5 minute, apoi spălată o dată cu 5,5 l de DCM şi de două ori cu 5,5 l fiecare de 30% TFE/DCM. Răşina a fost suspendată în 5,5 l de 30% TFE/DCM şi a fost păstrată timp de 14 ore.
C. Ciclurile de cuplare ale subunităţilor 1-30
i. Tratamente de pre-cuplare
Înainte de fiecare ciclu de cuplare, aşa cum este descris în Figura 18, răşina a fost: 1) spălată cu 30% TFE/DCM; 2) a) tratată cu soluţie CYTFA 15 minute şi drenată şi b) tratată cu soluţie CYTFA timp de 15 minute la care s-a adăugat 1:1 NEM/DCM, agitată şi drenată; 3) agitată de trei ori cu soluţie de neutralizare; şi 4) spălată de două ori cu DCM. Vezi Figura 18.
ii. Tratamente post-cuplare
După ce fiecare soluţie de subunitate a fost drenată aşa cum este descris în Figura 18, răşina a fost: 1) spălată cu DCM; şi 2) spălată de două ori cu 30% TFE/DCM.
Dacă răşina a fost păstrată o perioadă de timp înainte de următorul ciclu de cuplare, a doua spălare TFE/DCM nu a fost drenată şi răşina a fost reţinută în soluţia de spălare TFE/DCM menţionată. Vezi Figura 18.
iii. Cicluri de cuplare subunităţi activate
Ciclurile de cuplare au fost efectuate aşa cum este descris în Figura 18.
iv. Spălare finală IPA
După efectuarea etapei finale de cuplare aşa cum este descris în Figura 18, răşina a fost spălată de 8 ori cu 19,5 l fiecare de IPA şi uscată sub vid la temperatura camerei timp de aproximativ 63,5 ore la o greutate uscată de 4857,9 g.
C. Clivaj
Substanţa medicamentoasă brută Golodirsen legată de răşina de mai sus a fost împărţită în două loturi, fiecare lot a fost tratat după cum urmează. Un lot de răşină de 1619,3 g a fost: 1) agitat cu 10l de NMP timp de 2 ore, apoi NMP a fost drenat; 2) spălare de trei ori cu 10 l fiecare de 30% TFE/DCM; 3) tratat cu 10 l de soluţie CYTFA timp de 15 minute; şi 4) 10 l de soluţie CYTFA timp de 15 minute la care 130 ml de 1:1 NEM/DCM a fost apoi adăugat şi agitat timp de 2 minute şi drenat. Răşina a fost tratată de trei ori cu 10 l fiecare de soluţie de neutralizare, spălată de şase ori cu 10 l de DCM şi de opt ori cu 10 l fiecare de NMP. Răşina a fost tratată cu o soluţie de clivare de 1530,4 g DTT şi 2980 DBU în 6,96 l NMP timp de 2 ore pentru a desprinde substanţa medicamentoasă brută Golodirsen de răşină. Soluţia de clivare a fost drenată şi păstrată într-un vas separat. Reactorul şi răşina au fost spălate cu 4,97 l de NMP care a fost combinat cu soluţia de clivare.
D. Deprotejare
Soluţia combinată de clivare şi spălarea NMP au fost transferate într-un recipient sub presiune la care s-a adăugat 39,8 l de NH4OH (NH3•H2O) care a fost răcit la o temperatură de -10 °C până la -25 °C într-un congelator. Recipientul sub presiune a fost sigilat şi încălzit la 45 °C timp de 16 ore, apoi lăsat să se răcească la 25 °C. Această soluţie de deprotejare care conţine substanţa medicamentoasă brută Golodirsen a fost diluată 3:1 cu apă purificată şi pH ajustat la 3,0 cu acid fosforic 2 M, apoi la pH 8,03 cu NH4OH. HPLC: C18 77,552 % şi SCX-10 73,768 %.
Purificarea de referinţă a substanţei medicamentoase Golodirsen (PMO#1) brută
Soluţia de deprotejare de partea D de mai sus, care conţine substanţa medicamentoasă brută Golodirsen, a fost încărcată într-o coloană de răşină schimbătoare de anioni ToyoPearl Super-Q 650S (Tosoh Bioscience) şi eluată cu un gradient de 0-35% B peste volumul de 17 coloane (tampon A: 10 mM hidroxid de sodiu; tampon B: 1 M clorură de sodiu în 10 mM hidroxid de sodiu) şi fracţiuni de puritate acceptabilă (C18 şi SCX HPLC) au fost combinate într-o soluţie de produs medicamentos purificat. HPLC: 93,571% (C18) 88,270% (SCX).
Soluţia de substanţă medicamentoasă purificată a fost desalinizată şi liofilizată la 1450,72 g substanţă medicamentoasă Golodirsen purificată.
Randament 54,56%; HPLC: 93,531% (C18) 88,354% (SCX).
Tabelul 5. Acronime
Acronim Denumire DBU 1,8-Diazabicicloundec-7-enă DCM Diclorometan DIPEA: N,N-Diizopropiletilamină DMI 1,3-Dimetil-2-imidazolidinonă DTT Ditiotreitol IPA Izopropanol MW Masă moleculară medie Nu N-Etilmorfolină NMP: N-metil-2-pirolidonă; RT Temperatura camerei TFA Acid 2,2,2-trifluoracetic ETF 2,2,2-Trifluoroetanol
Proceduri analitice: Spectrele de masă ale timpului de zbor de ionizare (MALDI-TOF-MS) de desorbţie laser asistată de matrice au fost înregistrate pe o viteză Bruker AutoflexTM, utilizând o matrice de acid sinapinic (SA). SCX-HPLC a fost efectuat pe un sistem Thermo Dionex UltiMate 3000 echipat cu un detector cu matrice de diode 3000 şi o coloană ProPacTM SCX-20 (250 x 4 mm), utilizând un debit de 1,0 ml/min (pH = 2; temperatura coloanei 30 °C). Fazele mobile au fost A (25% acetonitril în apă conţinând 24 mM H3PO4) şi B (25% acetonitril în apă conţinând 1 M KCl şi 24 mM H3PO4). Eluţia gradientului a fost utilizată: 0 min, 35% B; 2 min, 35% B; 22 min, 80% B; 25 min, 80% B; 25,1 min, 35% B; 30 min, 35% B. La un amestec de PMO#1 (1,82 g, 0,177 mmol, proaspăt uscat prin liofilizare timp de două zile), Ac-L-Arg-L-Arg-L-Arg-L-Arg-L-Arg-L-Arg-Gly-OH hexatrifluoroacetat (614,7 mg, 0,354 mmol) şi 1-[Bis(dimetilamino)metilen]-1H -1,2,3-triazolo [4,5-b]piridiniu 3-oxid hexafluorofosfat (HATU, 134,4 mg, 0,354 mmol) s-a adăugat sulfoxid de dimetil (DMSO, 20 ml). Amestecul a fost agitat la temperatura camerei timp de 3 minute, apoi s-a adăugat N,N-diizopropiletilamină (DIPEA, 68,5 mg, 0,530 mmol). După 5 minute, amestecul tulbure a devenit o soluţie limpede. Reacţia a fost monitorizată prin SCX-HPLC. După 2 ore, s-au adăugat 20 ml soluţie de hidroxid de amoniu 10% (2,8% NH3). Amestecul a fost agitat la temperatura camerei timp de 2 ore. Reacţia a fost încheiată prin adăugarea a 400 ml de apă. La soluţie s-a adăugat trifluoroetanol (2,0 ml). Soluţia a fost împărţită în două porţii şi fiecare porţie a fost purificată printr-o coloană WCX (10 g răşină pe coloană). Fiecare coloană WCX a fost spălată mai întâi cu 20% acetonitril în apă (v/v) pentru a îndepărta materialul de bază PMO#1. Spălările (225 ml pentru fiecare coloană) au fost oprite atunci când analiza spectrului de masă MALDI-TOF a arătat absenţa semnalului PMO#1. Fiecare coloană a fost apoi spălată cu apă (100 ml pe coloană). Produsul dorit, PPMO #1, a fost eluat cu 2,0 M de guanidină HCl (140 ml pentru fiecare coloană). Soluţiile purificate de PPMO #1 au fost reunite şi apoi împărţite în două porţii şi fiecare a fost desalinizată printr-o coloană SPE (10 g răşină pentru fiecare coloană). Coloana SPE a fost spălată mai întâi cu soluţie apoasă de NaCI 1,0 M (100 ml pentru fiecare coloană) pentru a genera sarea hexahidroclorură a PPMO#1. Fiecare coloană SPE a fost apoi spălată cu apă (200 ml pentru fiecare coloană). PPMO #1 final desalinizat a fost eluat cu 50% acetonitril în apă (v/v, 150 ml pentru fiecare coloană). Acetonitrilul a fost îndepărtat prin evacuare la presiune redusă. Soluţia apoasă rezultată a fost liofilizată pentru a obţine hexahidroclorura conjugată dorită PPMO #1 (1,93 g, randament 94,5%).
Exemplul de referinţă 1: PMO#1
Folosind protocolul B al metodei de sinteză PMO descris mai sus, PMO#1 a fost sintetizat:
unde fiecare Nu de la 1 la 25 şi 5' la 3' este:
Poziţia nr. 5'-3' NU Poziţia nr. 5'-3' NU Poziţia nr. 5'-3' NU Poziţia nr. 5'-3' NU Poziţia nr. 5'-3' NU 1 G 6 C 11 G 16 G 21 T 2 T 7 T 12 T 17 A 22 G 3 T 8 C 13 T 18 A 23 T 4 G 9 C 14 C 19 G 24 T 5 C 10 G 15 T 20 G 25 C
în care A este
HPLC: 71,85%; Condiţii: Dionex ADNPac (DNX #97) Gradient: 75%A + 20%B + 5%C la 0 min; 50%A la 20 min; 25%A + 75%C la 21 min; Faza mobilă A: 10mM NaOH/20mM NaCI; C: 10mM NaOH/0,5 M NaCI. Temperatura coloanei: 45C; Debit 1,0 ml/min.
Exemplul 2: PPMO#1
Folosind protocolul descris mai sus, PPMO #1 a fost sintetizat din PMO#1:
în care fiecare Nu de la 1 la 25 şi 5' la 3' este:
Poziţia nr. 5'-3' Nu Poziţia nr. 5'-3' Nu Poziţia nr. 5'-3' Nu Poziţia nr. 5'-3' Nu Poziţia nr. 5'-3' Nu 1 G 6 C 11 G 16 G 21 T 2 T 7 T 12 T 17 A 22 G 3 T 8 C 13 T 18 A 23 T 4 G 9 C 14 C 19 G 24 T 5 C 10 G 15 T 20 G 25 C
în care A este
Exemplul 3: Exon 53 omiterea in vitro (mioblaste)
Doi compuşi care vizează distrofina umană (DMD) exonul 53 aşa cum este descris în tabelul de mai jos, PMO#1 şi PPMO # 1 care conţin aceeaşi secvenţă, au fost evaluaţi pentru exonul DMD 53 sărind peste mioblastele umane sănătoase.
Secvenţe de PMO#1 şi PPMO#1 pentru DMD uman exonul 53.
Denumire Secvenţă de direcţionare (TS) SECV ID NR. 5' 3' PMO#1 1 EG3 H PPMO#1 1 EG3 -G-R6
În mod specific, mioblastele umane sănătoase (pasaj 5-6, SKB-F-SL achiziţionate de la Zen-Bio, Inc.) au fost placate∼40% la confluenţă atunci când au fost tratate cu PMO#1 sau PPMO #1 la diferite concentraţii (adică 40 µm, 20 µm, 10 µm, 5 µm, 2,5 µm şi 1,25 µm) în medii SKM-M (Zen-Bio, Inc.). După nouăzeci şi şase de ore de incubare, mioblastele au fost spălate cu PBS şi lizate cu tampon de liză RA1 în kitul Illustra GE ARNspin 96 (Cat# 25-055-75, GE Healthcare Bio-Sciences). ARN-ul total a fost izolat conform recomandărilor producătorului, cu excepţia faptului că pentru eluarea ARN-ului a fost utilizată apă fără RNază de 40 µl.
Pentru a determina sărirea exonului 53 de către ambii compuşi, s-a efectuat RT-PCR în două etape. Mai exact, unsprezece microlitri de ARN total au fost transcrişi pentru prima dată la cADN de kitul de sinteză din primul lanţ SuperScript IV (Cat# 18091200, Invitrogen) folosind hexameri aleatorii conform instrucţiunilor producătorului. PCR a fost efectuată prin adăugarea a 9 µl cADN în polimeraza ADN Platinum Taq PCR Supermix High Fidelity (cat# 12532024, Invitrogen) cu primeri care au vizat exonii DMD uman joncţiunea exonilor 51/52 şi 54 (primer de sens: (SECV ID NR: 5): CATCAAGCAGAAGGCAACAA; primer antisens: (SECV ID NR: 6): GAAGTTTCAGGGCCAAGTCA). Amplificarea PCR a fost efectuată utilizând un termociclu în timp real BioRad CFX96 utilizând programul prezentat în Tabelul 2. Exprimarea produselor PCR omise sau nesalvate a fost evaluată prin încărcarea produsului PCR de 32 µl în sistemul LabChip GX folosind kitul de reactiv de înaltă sensibilitate a ADN (CLS760672, Perkin Elmer). Procentul de omisiune al exonului 53 DMD se calculează ca procentul de molaritate (nmol/1) pentru banda omisă a exonului 53 (201 bp) în comparaţie cu molaritatea totală pentru benzile omise (201 bp) şi neomise (413 bp).
Testul t Student cu două cozi, fără pereche (homoscedastic) a fost utilizat pentru a evalua dacă mediile celor 2 grupuri sunt diferite statistic unul de celălalt la fiecare doză. Valoarea P < 0,05 este considerată semnificativă statistic. Program de termociclare utilizat pentru amplificarea ampliconilor DMD cu sau fără omiterea exonului 53.
Pas Temperatura Timp 1. Denaturare 94°C 2 min. 2. Denaturare 94°C 0 secunde 3. Anneal 61,2°C 0 secunde 4. Extindere 68°C 1 min. 5. Repetare etapa 2-4 34 cicluri 6. Extindere finală 68°C 5 min 7. Depozitare 4 °C ∞
Rezultatele sunt prezentate în tabelul de mai jos şi în Figura 4.
În Figura 4, barele de eroare prezintă media ± SD, "[Numărul] x" deasupra barelor indică schimbarea relativă a pliului în procentul de omitere a exonului de către PPMO #1 în comparaţie cu PMO#1 la fiecare concentraţie, iar "." indică o diferenţă semnificativă între PMO#1 şi PPMO #1 cu valoarea p < 0,05.
Procentul de exon 53 DMD care sare peste PMO#1 şi PPMO#1 în mioblastele umane.
Compus/ Doză (µm) Procentajul omiterii exonului (medie ± SD) 1.25 2.5 5 10 20 40 PMO#1 1,27±0,24 2,19±0,44 3,58±0,91 6,56±1,32 11,06±2,08 19,57±4,23 PPMO#1 2,03±0,48 3,73±0,70 6,57±1,47 10,27±2,78 17,08±4,61 26,90±4,78
Datele din tabelul de mai sus şi din Figura 4 arată în mod surprinzător că omiterea semnificativ mai mare a exonului 53 are ca rezultat mioblaste atunci când celulele sunt tratate cu PPMO #1 în comparaţie cu PMO#1 la toate concentraţiile, al căror grad este neaşteptat. Este probabil ca această îmbunătăţire semnificativă să fie demonstrată în continuare într-un test comparativ in vivo, cum ar fi studiul pe primate neumane (NHP) din Exemplul 5, în care NHP sunt tratate cu PPMO #1 sau PMO#1, iar omiterea exonului 53 este măsurată în diferite ţesuturi musculare relevante (vezi Exemplul 5 pentru detalii). În plus, deoarece PPMO #1 se descompune în mediile SKM-M utilizate în acest exemplu (datele nu sunt prezentate) pe scara de timp a acestui studiu, studiul PNH poate demonstra o îmbunătăţire chiar mai mare decât cea demonstrată în acest exemplu.
Exemplul de referinţă 4: Studiul cu şoarece MDX
Şoarecele mdx este un model animal acceptat şi bine caracterizat pentru distrofia musculară Duchene (DMD) care conţine o mutaţie în exonul 23 al genei distrofinei. Se ştie că secvenţa antisens M23D (SECV ID NR: 2) induce omiterea exonului 23 şi restabilirea expresiei distrofinei funcţionale. Şoarecii MDX la vârsta de 6-7 săptămâni, când li se administrează o singură injecţie în vena cozii fie de PPMO4225, fie PMO4225 din tabelul de mai jos, la o doză de 40 mg/kg, fie cu ser fiziologic.
Denumire Secvenţă de ţintire (TS) SECV ID NR. 5' 3' PMO4225 GGCCAAACCTCGCTTACCTGAAAT 2 EG3 H PPMO4225 GGCCAAACCTCGCTTACCTGAAAT 2 EG3 -G-R6
PMO4225 şi PPMO4225 au fost fiecare preparate prin metodele de conjugare PMO A şi CPP descrise mai sus.
Şoarecii trataţi au fost sacrificaţi la 7, 30, 60 şi 90 de zile după injectarea unei doze unice (n=6 per grup). Diafragma, cordul şi cvadricepsul drept au fost procesate pentru analiza Western Blot pentru a măsura producţia de proteină distrofină şi analiza RT-PCR pentru a măsura procentul de omitere a exonului, iar cvadricepsul stâng a fost procesat pentru imunohistochimie şi colorare H/E aşa cum este descris mai sus.
Restaurarea proteinei distrofină a fost cuantificată prin Western Blot, iar procentul de omitere a exonului 23 a fost măsurat prin RT-PCR fiecare aşa cum este descris mai sus.
Rezultatele RT-PCR şi Western Blot sunt prezentate în Figurile 5A-10B şi în tabelele de mai jos. În mod surprinzător, PPMO4225 a indus niveluri semnificativ mai mari şi susţinute de restaurarea distrofinei şi de omitere a exonului 23 comparativ cu PMO4225, cele mai mari niveluri apărând la 30 de zile după injectare. Chiar şi mai surprinzător, PPMO4225 a crescut nivelurile de distrofină în inimă atunci când PMO4225 nu a făcut-o; distrofina şi omiterea exonului nu au fost observate în inimă în toate momentele de timp cu PMO4225.
Cuantificarea proteinei distrofină ca procent de proteină de tip sălbatic (%WT) prin Western Blot Compus PMO4225 PPMO4225 Zi 7 30 60 90 7 30 60 90 Ţesut Cvadriceps 1,1 2,3 1,6 0,7 20,7 28,1 20,8 8,2 Diafragmă 1,4 1,9 1,3 0,6 14,5 15,2 9,8 2,3 Inimă 0 0 0 0 2,0 1,0 0,9 0,1 Procentul de omitere a exonului măsurată prin RT-PCR Compus PMO4225 PPMO4225 Zi 7 30 60 90 7 30 60 90 Ţesut Cvadriceps 21,2 5,5 7,9 2,8 61,5 42,02 28,8 6,9 Diafragmă 29,9 2,6 0,5 0 51,6 36,76 3,05 0 Inimă 0 0 0 0 13,15 2,64 0 0
Rezultatele imunohistochimice sunt prezentate în Figura 11.
Aici, PPMO4225 restabileşte distrofina de-a lungul cvadricepsului, în timp ce 4225 produce un model de expresie « neuniform». Distribuţia uniformă a distrofinei în timpul tratamentului cu PPMO4225 indică faptul că se poate obţine o ţintire pe scară largă a muşchilor scheletici. PPMO4225 a îmbunătăţit semnificativ livrarea prin PMO4225 in vivo.
Exemplul 5: Omiterea Exonului 53 în NHP
Pentru a demonstra în continuare eficacitatea omiterii exonului oligomerilor antisens PPMO, sunt utilizate primate non-umane. În mod specific, maimuţele cynomolgus care au ţesuturile musculare intacte sunt injectate intravenos, cu PPMO#1, PMO#1 (din Exemplul 3) sau ser fiziologic conform schemei de dozare din tabelul de mai jos:
Schema de dozare pentru Cynomolgus
Grup Compus Doza mg/kg Număr per grup Strategia de livrare 1 PPMO#1 20 3 2 PPMO#1 40 3 3 PPMO#1 80 3 4 PPMO#1 160 3 O dată pe săptămână, 4 doze totale Animalele sunt sacrificate după 48 de ore de la administrarea ultimei doze, în ziua 22. 5 PMO#1 40 3 6 ser fiziologic 0 2 7 PPMO#1 40 2 Doză unică în ziua 1 cu recuperare la 4 săptămâni 8 PPMO#1 40 2 Doză unică în ziua 1 cu recuperare la 8 săptămâni
Animalele vor fi observate pe parcursul studiului, inclusiv observaţii clinice (de exemplu, evaluarea pielii şi a blănii, efecte respiratorii) şi măsurători ale greutăţii corporale. Probele de sânge şi urină vor fi recoltate cel puţin înainte de începerea testării şi la 24 de ore după prima doză şi ultima doză (dacă este cazul).
La fiecare necropsie programată sau eutanasiată în extremis, se colectează secţiuni ale diafragmei, muşchi neted al duodenului, esofagului şi aortei, cvadricepsului, deltoidului, bicepsului şi inimii şi se îngheaţă. Procentul de omitere a exonului 53 este determinat utilizând RT-PCR aşa cum este descris mai sus.
Exemplul de referinţă 6: Studiul răspunsului la doză la şoarece MDX
Şoareci MDX la vârsta de 6-7 săptămâni, când li s-a administrat o singură injecţie în vena cozii fie un PPMO4225, fie un PMO4225 descris mai sus, la o doză de 40 mg/kg, 80 mg/kg sau 120 mg/kg (n=6 per grup).
Şoarecii trataţi au fost sacrificaţi la 30 de zile după injectare. Diafragma, cvadricepsul şi inima au fost prelucrate pentru analiza Western Blot pentru a măsura producţia de proteină distrofină pe baza protocolului Western Blot descris mai sus (utilizat, de exemplu, în Exemplul 4) cu următoarele modificări:
Parametru Protocolul Western Blot din Exemplul 4 Modificări ale protocolului Western Blot Cuantificarea proteinelor Kit de testare a proteinelor RC DC Metoda BCA Pasul de blocare Peste noapte la 4°C 1 oră la RT Incubarea anticorpilor primari 1 oră la RT Peste noapte la 4°C Concentraţia anticorpilor primari 1:20 1 500
Restaurarea proteinei distrofină ca % tip sălbatic este prezentată în tabelul de mai jos şi în Figurile 12-15.
*Cuantificarea proteinei distrofină ca procent de proteină de tip sălbatic (%WT) prin Western Blot Compus PMO4225 PPMO4225 Doza mg/kg 40 80 120 40 80 120 Ţesut Diafragmă 0,80 0,97 1,83 8.02 26.03 42,77 Inimă 0,13 0,24 0,34 0,61 6,34 19,48 Cvadriceps 3.5 2,6 3,0 43 90 144
În mod surprinzător, datele arată că o singură doză de PPMO4225 creşte nivelurile de distrofină în funcţie de doză la şoarecii mdx într-o măsură semnificativ şi substanţial mai mare decât la PMO4225.
Exemplul de referinţă 7: Studiul IHC pe diafragmă şi inimă de şoareci MDX
Şoareci MDX la vârsta de 6-7 săptămâni, la care s-a administrat o singură injecţie în vena cozii de PPMO4225 la o doză de 80 mg/kg sau ser fiziologic, şi şoareci de tip sălbatic la vârsta de 6-7 săptămâni, la care s-a administrat o singură injecţie cu ser fiziologic. Şoarecii mdx trataţi, şoarecii mdx cu ser fiziologic şi şoarecii sălbatici au fost sacrificaţi la 30 de zile după injectarea unei doze unice (n=4 per grup). Rezultatele imunohistochimice sunt prezentate în Figura 19. Aici, rezultatele arată o creştere uniformă a distrofinei în ţesuturile asociate cu morbiditatea şi mortalitatea în DMD la şoarecii cu DMD trataţi cu PPMO4225.
Exemplul 8: Omiterea exonului 53 in vitro (Miotubuli)
Doi compuşi care vizează distrofina umană (DMD) exonul 53 aşa cum este descris în tabelul de mai jos, PMO#1 şi PPMO# 1 care conţin aceeaşi secvenţă, au fost evaluaţi pentru exonul 53 DMD sărind peste miotubulii umani sănătoşi.
Secvenţe de PMO#1 şi PPMO#1 pentru DMD uman exonul 53.
Denumire Secvenţă compus ID NR secvenţă de ţintire 5' 3' PMO#1 H53(+36+60) EG3 H PPMO#1 H53(+36+60 R6G) EG3 GR6Ac
În mod specific, mioblastele umane sănătoase (pasajul 5-6, SKB-F-SL achiziţionate de la Zen-Bio, Inc.) au fost cultivate pentru a atinge o confluenţă de 80-90% în mediile SKM-M înainte de iniţierea diferenţierii prin incubarea în medii serice scăzute (SKM-D, Zen-Bio, Inc.) La cinci zile după diferenţiere, miotubulii maturi au fost incubaţi cu compuşii de mai sus la diferite concentraţii (adică 40 µm, 20 µm, 10 µm, 5 µm, 2,5 µm şi 1,25 µm). După nouăzeci şi şase de ore de incubare, miotubulii au fost spălaţi cu PBS şi lizaţi de tamponul de liză RLT din kitul RNază Micro (Cat#74004, Qiagen). ARN-ul total a fost izolat conform recomandărilor producătorului, cu excepţia faptului că pentru eluarea ARN-ului a fost utilizată apă fără RNază de 20 µl. \tabPentru a determina omiterea exonului 53 de către ambii compuşi, s-a efectuat RT-PCR în două etape. Mai exact, şapte microlitri de ARN total au fost mai întâi transcrişi în ADNc transcris antisens de către kitul de sinteză din primul lanţ SuperScript IV (Cat# 18091200, Invitrogen) folosind hexameri aleatorii conform instrucţiunilor producătorului. PCR a fost efectuată prin adăugarea a 5µl cADN în Platinum Taq ADN polimerază PCR Supermix High Fidelity (Cat# 12532024, Invitrogen) cu primeri care au vizat joncţiunea exonilor DMD umani 51/52 şi 54 (primer de sens: CAT CAA GCA GAA GGC AAC AA; primer antisens: GAA GTT TCA GGG CCA AGT CA). Amplificarea PCR a fost efectuată utilizând un termociclu în timp real BioRad CFX96 utilizând programul prezentat în Tabelul 2. Exprimarea produselor PCR omise sau nesalvate a fost evaluată prin încărcarea produsului PCR de 32 µl în sistemul LabChip GX folosind kitul de reactiv de înaltă sensibilitate a ADN (CLS760672, Perkin Elmer). Procentul de omisiune al exonului 53 DMD se calculează ca procentul de molaritate (nmol/1) pentru banda omisă a exonului 53 (201 bp) în comparaţie cu molaritatea totală pentru benzile omise (201 bp) şi neskipped (413 bp). Testul t Student cu două cozi, fără pereche (homoscedastic) a fost utilizat pentru a evalua dacă mediile celor 2 grupuri sunt diferite statistic unul de celălalt la fiecare doză. Valoarea p < 0,05 este considerată semnificativă din punct de vedere statistic. Program de termociclare utilizat pentru amplificarea ampliconilor DMD cu sau fără omiterea exonului 53.
[0259]
Etapa Temperatura Timp 8. Denaturare 94°C 2 min. 9. Denaturare 94°C 0 secunde 10. Anneal 61,2°C 0 secunde 11. Extindere 68°C 1 min. 12. Repetare etapa 2-4 34 cicluri 13. Extinderea finală 68°C 5 min 14. Depozitare 4 °C ∞
Rezultatele sunt prezentate în tabelul de mai jos şi în Figura 20.
În Figura 20, barele de eroare prezintă media ± SD, "[Numărul] x" indică schimbarea relativă a pliului în procente de omitere a exonului de către PPMO #1 în comparaţie cu PMO#1 la fiecare concentraţie şi, respectiv, "indică o diferenţă semnificativă între PMO#1 şi PPMO#1 cu valoarea p < 0,05 sau, respectiv, 0,005.
Procentul de exon 53 DMD care sare peste PMO#1 şi PPMO#1 în miotubulii umani.
Compus/ Doză (µm) Procentajul omiterii exonului (medie ± SD) 1,25 2,5 5 10 20 40 PMO#1 1,45±0,39 2,63±0,50 3,33±0,47 4,78±0,88 8,40±0,53 12,98±1,21 PPMO#1 3,10±1,67 2,45±0,52 4,73±1,01 7,08±0,48 9,45±1,03 12,08±1,30
Datele din tabelul de mai sus şi din Figura 20 arată în mod surprinzător că omiterea semnificativ mai mare a exonului 53 duce la miotubuli atunci când celulele sunt tratate cu PPMO #1 comparativ cu PMO#1 cel puţin la concentraţii de 5 µm şi 10 µm, gradul cărora este neaşteptat. Este probabil ca această îmbunătăţire semnificativă să fie demonstrată în continuare într-un test comparativ in vivo, cum ar fi studiul pe primate neumane (NHP) din Exemplul 5, în care NHP sunt tratate cu PPMO #1 sau PMO#1, iar omiterea exonului 53 este măsurată în diferite ţesuturi musculare relevante (vezi Exemplul 5 pentru detalii). În plus, deoarece PPMO #1 se descompune în mediile SKM-M utilizate în acest exemplu (datele nu sunt prezentate) pe scara de timp a acestui studiu, studiul PNH poate demonstra o îmbunătăţire chiar mai mare decât cea demonstrată în acest exemplu.
BIBLIOGRAFIE
Aartsma-Rus, A., A. A. Janson, şi colab. (2004). "Antisense-induced multiexon skipping for Duchenne muscular dystrophy makes more sense." Am J Hum Genet 74(1): 83-92. Abes, R., şi colab. (2008). "Arginine-rich cell penetrating peptides: design, structure-activity, and applications to alter pre-mRNA splicing by steric-block oligonucleotides." J Pept. Sci. 14: 455-460.
Alter, J., şi colab. (2006). "Systemic delivery of morpholino oligonucleotide restores dystrophin expression bodywide and improves dystrophic pathology."Nat. Med. 12(2): 175-177.
Bestas, B. şi colab. (2014). "Splice-correcting ligonucleotides restore BTK function in X-linked agammaglobulinemia model." J. Clin. Invest.
Cirak, S., V. Arechavala-Gomeza, şi colab. (2011). "Exon skipping and dystrophin restoration in patients with Duchenne muscular dystrophy after systemic phosphorodiamidate morpholino oligomer treatment: an open-label, phase 2, dose-escalation study." Lancet 378(9791): 595-605.
Dunckley, M. G., I. C. Eperon, i colab. (1997). "Modulation of splicing in the DMD gene by antisense oligoribonucleotides." Nucleosides & Nucleotides 16(7-9): 1665-1668.
Dunckley, M. G., M. Manoharan şi colab. (1998). "Modification of splicing in the dystrophin gene in cultured Mdx muscle cells by antisense oligoribonucleotides."
Hum Mol Genet 7(7): 1083-90.
Errington, S. J., C. J. Mann şi colab. (2003). "Target selection for antisense oligonucleotide induced exon skipping in the dystrophin gene." J Gene Med 5(6): 518-27.
Goemans, N. M., M. Tulinius şi colab. (2011). "Systemic Administration of PR0051 in Duchenne's Muscular Dystrophy." N Engl J Med.
Jearawiriyapaisarn, N., H. M. Moulton şi colab. 31. Qbot (2014). "Sustained Dystrophin Expression Induced by Peptide-conjugated Morpholino Oligomers in the Muscles of mdx Mice." Mol Ther.
Jearawiriyapaisarn, N. şi colab. (2010). "Long-term improvement in mdx cardiomyopathy after therapy with peptide-conjugated morpholino oligomers." Cardiovascular Research 85: 444-453.
Kinali, M., V. Arechavala-Gomeza şi colab. (1974). "Local restoration of dystrophin expression with the morpholino oligomer AVI-4658 in Duchenne muscular dystrophy: a single-blind, placebo-controlled, dose-escalation, proof-of-concept study."
Lancet Neurol 8(10): 918-28.
Leblue, B. şi colab. 31. Qbot (2014). "Cell penetrating peptide conjugates of steric block oligonucleotides." Adv. Drug Deliv. Rev. 60: 517-529.
Lu, Q. L., C. J. Mann şi colab. (2003). "Functional amounts of dystrophin produced by skipping the mutated exon in the mdx dystrophic mouse." Nat Med 9(8): 1009-14.
Mann, C. J., K. Honeyman şi colab. (2002). "Improved antisense oligonucleotide induced exon skipping in the mdx mouse model of muscular dystrophy." J Gene Med 4(6): 644-54.
Marshall, N. B., S. K. Oda şi colab. 2007). "Arginine-rich cell-penetrating peptides facilitate delivery of antisense oligomers into murine leukocytes and alter pre-mRNA splicing." Journal of Immunological Methods 325(1-2): 114-126.
Matsuo, M., T. Masumura şi colab. (1991). "Exon skipping during splicing of dystrophin mRNA precursor due to an intraexon deletion in the dystrophin gene of Duchenne muscular dystrophy kobe." J Clin Invest 87(6): 2127-31.
McClory, G. şi colab. (2006). "Antisense oligonucleotide-induced exon skipping restored dystrophin expression in vitro in a canine model of DMD." Gene Therapy 13: 1373-1381.
Monaco, A. P., C. J. Bertelson şi colab. (1988). "An explanation for the phenotypic differences between patients bearing partial deletions of the DMD locus."
Genomics 2(1): 90-5.
Moulton, H.M., (2007). "Cell-penetrating peptide-morpholino conjugates alter pre-mRNA splicing of DMD (Duchenne muscular dystrophy) and inhibit murine coronavirus replication in vivo." Biochem. Society Trans 35(4): 826-828.
Pramono, Z. A., Y. Takeshima şi colab. ( 1996 ) "Induction of exon skipping of the dystrophin transcript in lymphoblastoid cells by transfecting an antisense oligodeoxynucleotide complementary to an exon recognition sequence." Biochem Biophys Res Commun 226(2): 445-9.
Sazani, P., R. Kole şi colab. 2007). Splice switching oligomers for the TNF superfamily receptors and their use in treatment of disease. PCT WO2007058894, University of North Carolina.
Sierakowska, H., M. J. Sambade şi colab. ( 1996 ) "Repair of thalassemic human beta-globin mRNA in mammalian cells by antisense oligonucleotides." Proc Natl Acad Sci U S A 93(23): 12840-4.
Summerton, J. şi D. Weller (1997). "Morpholino antisense oligomers: design, preparation, and properties." Antisense Nucleic Acid Drug Dev 7(3): 187-95.
Takeshima, Y., H. Nishio şi colab. (1995). "Modulation of in vitro splicing of the upstream intron by modifying an intra-exon sequence which is deleted from the dystrophin gene in dystrophin Kobe." J Clin Invest 95(2): 515-20.
van Deutekom, J. C., M. Bremmer-Bout şi colab. (2001). "Antisense-induced exon skipping restores dystrophin expression in DMD patient derived muscle cells."
Hum Mol Genet 10(15): 1547-54.
van Deutekom, J. C., A. A. Janson şi colab. 2007). "Local dystrophin restoration with antisense oligonucleotide PRO051." N Engl J Med 357(26): 2677-86.
Wilton, S. D., A. M. Fall şi colab. 2007). "Antisense oligonucleotide-induced exon skipping across the human dystrophin gene transcript." Mol Ther 15(7): 1288-96 \tabWilton, S. D., F. Lloyd şi colab. (2000). "Specific removal of the nonsense mutation from the mdx dystrophin mRNA using antisense oligonucleotides." Neuromuscul Disord 9(5): 330-8. Wu, B., H. M. Moulton şi colab. 31. Qbot (2014). "Effective rescue of dystrophin improves cardiac function in dystrophin-deficient mice by a modified morpholino oligomer." Proc Natl Acad Sci S U A 105(39): 14814-9. Wu, B. şi colab. (2012). "Long-term rescue of dystrophin expression and improvement in muscle pathology and function in dystrophic mdx mice by peptide-conjugated morpholino." The Am. J. Pathol. 181(2): 392-400. Wu, P. şi colab. (2007) (2007) "Cell-penetrating peptides as transporters for morpholino oligomers: effects of amino acid composition on intracellular delivery and cytotoxicity." Nucleic Acids Research 35(15): 5182-5191. Yin, H., H. M. Moulton şi colab. 31. Qbot (2014). "Cell-penetrating peptide-conjugated antisense oligonucleotides restore systemic muscle and cardiac dystrophin expression and function." Hum Mol Genet 17(24): 3909-18. Yin, H. şi colab. (2011). "Pip5 transduction peptides direct high efficiency oligonucleotide-mediated dystrophin exon skipping in heart and phenotypic correction in mdx mice." Mol. Ther 19(7): 1295-1303. Youngblood, D. şi colab. (2006). "Stability of cell-penetrating peptide- morpholino oligomer conjugates in human serum and in cells." Am. Chem. Soc.

Claims (13)

1. Conjugat al oligomerului antisens cu Formula (IV):
sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia. 2. Conjugatul oligomerului antisens conform revendicării 1, în care oligomerul antisens este cu Formula (IVA):
3. Compoziţie farmaceutică, cuprinzând un conjugat al oligomerului antisens din revendicarea 1 sau 2 sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia şi un purtător acceptabil farmaceutic.
4. Conjugatul oligomerului antisens sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia conform revendicării 1 sau 2, pentru utilizare în terapie.
5. Conjugatul oligomerului antisens sau sare acceptabilă farmaceutic a acestuia conform revendicării 1 sau 2 sau compoziţia farmaceutică conform revendicării 3, pentru utilizare în tratarea distrofiei musculare Duchenne (DMD) la un subiect care are nevoie de aceasta, în care subiectul are o mutaţie a genei distrofinei care poate fi supusă omiterii exonului 53.
6. Conjugatul oligomerului antisens sau sarea acceptabilă farmaceutic a acestuia conform revendicării 1 sau 2 sau compoziţia farmaceutică conform revendicării 3, pentru utilizare în restaurarea unui cadru de citire a ARNm pentru a induce producţia de distrofină la un subiect care are o mutaţie a genei distrofinei care poate fi supusă omiterii exonului 53.
7. Conjugatul oligomerului antisens sau sarea acceptabilă farmaceutic a acestuia sau compoziţia farmaceutică, pentru utilizare conform revendicării 5 sau 6, în care utilizarea cuprinde administrarea săptămânală a conjugatului oligomerului antisens.
8. Conjugatul oligomerului antisens sau sarea acceptabilă farmaceutic a acestuia sau compoziţia farmaceutică, pentru utilizare conform revendicării 5 sau 6, în care utilizarea cuprinde administrarea conjugatului oligomerului antisens de două ori pe săptămână.
9. Conjugatul oligomerului antisens sau sarea acceptabilă farmaceutic a acestuia sau compoziţia farmaceutică, pentru utilizare conform revendicării 5 sau 6, în care utilizarea cuprinde administrarea conjugatului oligomerului antisens la fiecare a treia săptămână.
10. Conjugatul oligomerului antisens sau sarea acceptabilă farmaceutic a acestuia sau compoziţia farmaceutică, pentru utilizare conform revendicării 5 sau 6, în care utilizarea cuprinde administrarea lunară a conjugatului oligomerului antisens.
11. Conjugatul oligomerului antisens sau sare acceptabilă farmaceutic a acestuia sau compoziţia farmaceutică, pentru utilizare conform oricăreia dintre revendicările 4-10, în care utilizarea cuprinde administrarea conjugatului oligomerului antisens la o doză selectată dintre (i) aproximativ 30 mg/kg; (ii) aproximativ 40 mg/kg; (iii) aproximativ 60 mg/kg; (iv) aproximativ 80 mg/kg; şi (v) aproximativ 160 mg/kg.
12. Compoziţia farmaceutică conform revendicării 3 pentru utilizare la omiterea exonului 53 din pre-mARN de distrofină în timpul prelucrării ARNm la un subiect care are o mutaţie a genei distrofinei care poate fi supusă omiterii exonului 53.
13. Compoziţia farmaceutică conform revendicării 3 pentru utilizare în exonul 53 de legare a pre-mARN distrofinei la un subiect care are o mutaţie a genei distrofinei care poate fi supusă omiterii exonului 53.
MDE20191200T 2016-12-19 2017-12-14 Conjugați oligomeri de omitere a exonilor pentru distrofie musculară MD3554552T2 (ro)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662436223P 2016-12-19 2016-12-19
US201762443484P 2017-01-06 2017-01-06
US201762479178P 2017-03-30 2017-03-30
US201762562146P 2017-09-22 2017-09-22
PCT/US2017/066509 WO2018118662A1 (en) 2016-12-19 2017-12-14 Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy

Publications (1)

Publication Number Publication Date
MD3554552T2 true MD3554552T2 (ro) 2022-12-31

Family

ID=60953960

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MDE20191200T MD3554552T2 (ro) 2016-12-19 2017-12-14 Conjugați oligomeri de omitere a exonilor pentru distrofie musculară

Country Status (27)

Country Link
US (3) US11000600B2 (ro)
EP (2) EP3554552B1 (ro)
JP (3) JP7160807B2 (ro)
KR (2) KR102646318B1 (ro)
CN (1) CN110636866B (ro)
AU (1) AU2017382773B2 (ro)
BR (1) BR112019012664A2 (ro)
CA (1) CA3047010A1 (ro)
CO (1) CO2019007399A2 (ro)
DK (1) DK3554552T3 (ro)
ES (2) ES2928486T3 (ro)
HR (1) HRP20221155T1 (ro)
HU (1) HUE059905T2 (ro)
IL (2) IL267246B2 (ro)
LT (1) LT3554552T (ro)
MD (1) MD3554552T2 (ro)
MX (1) MX2019006879A (ro)
MY (1) MY205772A (ro)
NZ (1) NZ755438A (ro)
PL (1) PL3554552T3 (ro)
PT (1) PT3554552T (ro)
RS (1) RS63621B1 (ro)
SA (1) SA519402226B1 (ro)
SG (1) SG10202100557UA (ro)
SM (1) SMT202200403T1 (ro)
TW (2) TW202332470A (ro)
WO (1) WO2018118662A1 (ro)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI541024B (zh) 2010-09-01 2016-07-11 日本新藥股份有限公司 反義核酸
US11472824B2 (en) 2016-05-24 2022-10-18 Sarepta Therapeutics, Inc. Processes for preparing phosphorodiamidate morpholino oligomers
MX384727B (es) 2016-05-24 2025-03-14 Sarepta Therapeutics Inc Procesos para preparar oligómeros
AU2017270975B2 (en) 2016-05-24 2021-04-15 Sarepta Therapeutics, Inc. Processes for preparing phosphorodiamidate morpholino oligomers
MD3554554T2 (ro) 2016-12-19 2022-12-31 Sarepta Therapeutics Inc Conjugați de oligomeri de omitere a exonului, pentru distrofie musculară
MD3554552T2 (ro) 2016-12-19 2022-12-31 Sarepta Therapeutics Inc Conjugați oligomeri de omitere a exonilor pentru distrofie musculară
EA201991450A1 (ru) * 2017-09-22 2019-12-30 Сарепта Терапьютикс, Инк. Конъюгаты олигомеров для пропуска экзона при мышечной дистрофии
US10758629B2 (en) 2018-05-29 2020-09-01 Sarepta Therapeutics, Inc. Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
GB201821269D0 (en) 2018-12-28 2019-02-13 Nippon Shinyaku Co Ltd Myostatin signal inhibitor
EP3987029A1 (en) * 2019-06-19 2022-04-27 Sarepta Therapeutics, Inc. Methods for treating muscular dystrophy
US20230174979A1 (en) * 2019-10-09 2023-06-08 Children’S Medical Center Corporation Methods and compositions for treating ataxia telangiectasia
IL294271A (en) 2019-12-26 2022-08-01 Nippon Shinyaku Co Ltd Antisense nucleic acid that induces skipping of exon 50
BR112022017066A2 (pt) 2020-02-28 2022-11-16 Nippon Shinyaku Co Ltd Ácido nucleico antissentido indutor de salto do éxon 51
AU2021427595A1 (en) * 2021-02-12 2023-09-28 Oxford University Innovation Limited Cell-penetrating peptide conjugates and methods of their use
JP2024519451A (ja) 2021-04-30 2024-05-14 サレプタ セラピューティクス， インコーポレイテッド 筋ジストロフィーのための治療法
EP4361269A4 (en) 2021-06-23 2026-01-14 Nippon Shinyaku Co Ltd ANTISENSE OLIGOMER COMBINATION
CN118201606A (zh) 2021-07-08 2024-06-14 日本新药株式会社 肾毒性减轻剂
CA3225454A1 (en) 2021-07-08 2023-01-12 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Nephrotoxicity reducing agent
US20240285770A1 (en) 2021-07-08 2024-08-29 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Precipitation suppressing agent
EP4491728A1 (en) 2022-03-10 2025-01-15 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Antiviral antisense oligomer
JP2025509438A (ja) 2022-03-17 2025-04-11 サレプタ セラピューティクス， インコーポレイテッド ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーコンジュゲート

Family Cites Families (106)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH445129A (fr) 1964-04-29 1967-10-15 Nestle Sa Procédé pour la préparation de composés d'inclusion à poids moléculaire élevé
US3459731A (en) 1966-12-16 1969-08-05 Corn Products Co Cyclodextrin polyethers and their production
US3453257A (en) 1967-02-13 1969-07-01 Corn Products Co Cyclodextrin with cationic properties
US3426011A (en) 1967-02-13 1969-02-04 Corn Products Co Cyclodextrins with anionic properties
US3453259A (en) 1967-03-22 1969-07-01 Corn Products Co Cyclodextrin polyol ethers and their oxidation products
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US5521063A (en) 1985-03-15 1996-05-28 Antivirals Inc. Polynucleotide reagent containing chiral subunits and methods of use
US5506337A (en) 1985-03-15 1996-04-09 Antivirals Inc. Morpholino-subunit combinatorial library and method
EP0216860B1 (en) 1985-03-15 1992-10-28 SUMMERTON, James Stereoregular polynucleotide-binding polymers
US5217866A (en) 1985-03-15 1993-06-08 Anti-Gene Development Group Polynucleotide assay reagent and method
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US4737323A (en) 1986-02-13 1988-04-12 Liposome Technology, Inc. Liposome extrusion method
KR0166088B1 (ko) 1990-01-23 1999-01-15 . 수용해도가 증가된 시클로덱스트린 유도체 및 이의 용도
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
JPH07509133A (ja) 1992-07-17 1995-10-12 リボザイム・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 動物疾患の処置のための方法および剤
ES2290951T3 (es) 1993-05-11 2008-02-16 The University Of North Carolina At Chapel Hill Oligonucleotidos antisentido que combaten el corte y empalme aberrante y metodos de uso de los mismos.
US5885613A (en) 1994-09-30 1999-03-23 The University Of British Columbia Bilayer stabilizing components and their use in forming programmable fusogenic liposomes
US5753613A (en) 1994-09-30 1998-05-19 Inex Pharmaceuticals Corporation Compositions for the introduction of polyanionic materials into cells
US5820873A (en) 1994-09-30 1998-10-13 The University Of British Columbia Polyethylene glycol modified ceramide lipids and liposome uses thereof
IL115849A0 (en) 1994-11-03 1996-01-31 Merz & Co Gmbh & Co Tangential filtration preparation of liposomal drugs and liposome product thereof
US7572582B2 (en) 1997-09-12 2009-08-11 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
WO1999042091A2 (en) 1998-02-19 1999-08-26 Massachusetts Institute Of Technology Use of polycations as endosomolytic agents
US6683173B2 (en) 1998-04-03 2004-01-27 Epoch Biosciences, Inc. Tm leveling methods
US6210892B1 (en) 1998-10-07 2001-04-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Alteration of cellular behavior by antisense modulation of mRNA processing
JP2000125448A (ja) 1998-10-14 2000-04-28 Yazaki Corp 電気接続箱
JP2000256547A (ja) 1999-03-10 2000-09-19 Sumitomo Dow Ltd 耐熱性プラスチックカード用樹脂組成物
US7084125B2 (en) 1999-03-18 2006-08-01 Exiqon A/S Xylo-LNA analogues
AU776362B2 (en) 1999-05-04 2004-09-09 Roche Innovation Center Copenhagen A/S L-ribo-LNA analogues
JP2000325085A (ja) 1999-05-21 2000-11-28 Masafumi Matsuo デュシェンヌ型筋ジストロフィー治療剤
US7070807B2 (en) 1999-12-29 2006-07-04 Mixson A James Branched histidine copolymers and methods for using same
US7163695B2 (en) 1999-12-29 2007-01-16 Mixson A James Histidine copolymer and methods for using same
US6653467B1 (en) 2000-04-26 2003-11-25 Jcr Pharmaceutical Co., Ltd. Medicament for treatment of Duchenne muscular dystrophy
US6727355B2 (en) 2000-08-25 2004-04-27 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Pharmaceutical composition for treatment of Duchenne muscular dystrophy
EP1191097A1 (en) 2000-09-21 2002-03-27 Leids Universitair Medisch Centrum Induction of exon skipping in eukaryotic cells
WO2003020739A2 (en) 2001-09-04 2003-03-13 Exiqon A/S Novel lna compositions and uses thereof
KR100464261B1 (ko) 2002-01-24 2005-01-03 주식회사 파나진 Ｐｎａ 올리고머를 합성하기 위한 신규한 단량체 및 그의제조방법
KR20030084444A (ko) 2002-04-26 2003-11-01 주식회사 파나진 Ｐｎａ 올리고머를 합성하기 위한 신규한 단량체 및 그의제조방법
US7569575B2 (en) 2002-05-08 2009-08-04 Santaris Pharma A/S Synthesis of locked nucleic acid derivatives
WO2004044140A2 (en) 2002-11-05 2004-05-27 Isis Pharmaceticals, Inc. 2’-substituted oligomeric compounds and compositions for use in gene modulations
EP2374885A3 (en) 2002-11-25 2012-02-15 Masafumi Matsuo ENA nucleic acid drugs modifying splicing in mRNA precursor
WO2004083432A1 (en) 2003-03-21 2004-09-30 Academisch Ziekenhuis Leiden Modulation of exon recognition in pre-mrna by interfering with the secondary rna structure
ES2500921T3 (es) 2003-04-29 2014-10-01 Sarepta Therapeutics, Inc. Composiciones para potenciar el transporte y la eficacia antisentido de análogos de ácidos nucleicos en células
US7211668B2 (en) 2003-07-28 2007-05-01 Panagene, Inc. PNA monomer and precursor
DK1766010T3 (da) 2004-06-28 2011-06-06 Univ Western Australia Antisense-oligonukleotider til induktion af exon-skipping og fremgangsmåder til anvendelse deraf
JP2008538500A (ja) 2005-04-22 2008-10-30 アカデミス ツィーケンホイス ライデン ＳＲタンパク質の結合に対する干渉とＲＮＡ二次構造に対する干渉による、ｍＲＮＡ前駆体におけるエクソン認識の調節
US8067571B2 (en) 2005-07-13 2011-11-29 Avi Biopharma, Inc. Antibacterial antisense oligonucleotide and method
KR20170119730A (ko) 2005-11-10 2017-10-27 더 유니버시티 오브 노쓰 캐롤라이나 엣 채플 힐 Ｔｎｆ 수퍼패밀리 수용체에 대한 스플라이스 스위칭 올리고머 및 질환 치료에 있어서의 그의 용도
EP2019011A1 (en) 2006-05-17 2009-01-28 Svetlana Anatolevna Sokolova Transport means
US20100016215A1 (en) 2007-06-29 2010-01-21 Avi Biopharma, Inc. Compound and method for treating myotonic dystrophy
CA2691673A1 (en) 2007-06-29 2009-01-08 Avi Biopharma, Inc. Tissue specific peptide conjugates and methods
WO2009008725A2 (en) 2007-07-12 2009-01-15 Prosensa Technologies B.V. Molecules for targeting compounds to various selected organs, tissues or tumor cells
ES2639852T3 (es) 2007-10-26 2017-10-30 Academisch Ziekenhuis Leiden Medios y métodos para contrarrestar los trastornos musculares
US8299206B2 (en) 2007-11-15 2012-10-30 Avi Biopharma, Inc. Method of synthesis of morpholino oligomers
US8076476B2 (en) 2007-11-15 2011-12-13 Avi Biopharma, Inc. Synthesis of morpholino oligomers using doubly protected guanine morpholino subunits
EP2207779B1 (en) 2007-11-15 2014-04-09 Sarepta Therapeutics, Inc. Method of synthesis of morpholino oligomers
WO2009127230A1 (en) 2008-04-16 2009-10-22 Curevac Gmbh MODIFIED (m)RNA FOR SUPPRESSING OR AVOIDING AN IMMUNOSTIMULATORY RESPONSE AND IMMUNOSUPPRESSIVE COMPOSITION
EP2119783A1 (en) 2008-05-14 2009-11-18 Prosensa Technologies B.V. Method for efficient exon (44) skipping in Duchenne Muscular Dystrophy and associated means
US8084601B2 (en) * 2008-09-11 2011-12-27 Royal Holloway And Bedford New College Royal Holloway, University Of London Oligomers
IL313162A (en) 2008-10-24 2024-07-01 Sarepta Therapeutics Inc Antisense compounds for inducing axon termination and preparations containing them for the treatment of muscular dystrophy
PT2607484E (pt) 2008-10-27 2016-03-09 Academisch Ziekenhuis Leiden Métodos e meios para o salto eficiente do exão 45 no pré-mrna de distrofia muscular de duchenne
JP5645840B2 (ja) 2008-12-02 2014-12-24 株式会社Ｗａｖｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｊａｐａｎ リン原子修飾核酸の合成方法
DK2417257T3 (da) 2009-04-10 2016-06-06 Ass Inst De Myologie Tricyclo-dna-antisense-oligonukleotider, sammensætninger, og fremgangsmåder til behandlingen af sygdom
JP2012524540A (ja) 2009-04-24 2012-10-18 プロセンサ テクノロジーズ ビー．ブイ． Ｄｍｄを処置するためのイノシンを含むオリゴヌクレオチド
EP2451461A4 (en) 2009-07-06 2013-05-29 Ontorii Inc NOVEL NUCLEIC ACID PRODRUGS AND METHOD OF USE THEREOF
US8470987B2 (en) 2009-09-16 2013-06-25 Chiralgen, Ltd. Protective group for synthesis of RNA and derivative
KR20230137491A (ko) 2009-11-12 2023-10-04 더 유니버시티 오브 웨스턴 오스트레일리아 안티센스 분자 및 이를 이용한 질환 치료방법
TWI541024B (zh) 2010-09-01 2016-07-11 日本新藥股份有限公司 反義核酸
EP3118316A1 (en) * 2010-09-02 2017-01-18 Université de Mons Agents useful in treating facioscapulohumeral muscular dystrophy
US10428019B2 (en) 2010-09-24 2019-10-01 Wave Life Sciences Ltd. Chiral auxiliaries
CA2826836A1 (en) 2011-02-08 2012-08-16 The Charlotte-Mecklenburg Hospital Authority D/B/A Carolinas Medical Center Antisense oligonucleotides
CA3092114A1 (en) * 2011-05-05 2012-11-08 Sarepta Therapeutics, Inc. Peptide oligonucleotide conjugates
US9161948B2 (en) * 2011-05-05 2015-10-20 Sarepta Therapeutics, Inc. Peptide oligonucleotide conjugates
US9607308B2 (en) 2011-06-29 2017-03-28 American Express Travel Related Services Company, Inc. Spend based digital ad targeting and measurement
PL2581448T3 (pl) 2011-10-13 2015-08-31 Association Inst De Myologie Tricyklo-tiofosforanowy DNA
CA2857664A1 (en) 2011-11-30 2013-06-06 Sarepta Therapeutics, Inc. Antisense oligonucleotides targeting within the smn2 pre-mrna for use ininduced exon inclusion in spinal muscle atrophy
CA2861247C (en) 2011-12-28 2021-11-16 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Antisense nucleic acids
CN118581086A (zh) 2012-01-27 2024-09-03 比奥马林技术公司 用于治疗杜兴型肌营养不良症和贝克型肌营养不良症的具有改善特性的rna调节性寡核苷酸
DE102012101676A1 (de) 2012-02-29 2013-08-29 Klaus-Dieter Rösler Verfahren und Vorrichtung zum Bearbeiten von Formularen mit einer Datenverarbeitungsanlage
EP3608407A1 (en) 2012-07-03 2020-02-12 BioMarin Technologies B.V. Oligonucleotide for the treatment of muscular dystrophy patients
RU2693381C2 (ru) 2012-07-13 2019-07-02 Уэйв Лайф Сайенсес Лтд. Асимметричная вспомогательная группа
SG11201500232UA (en) 2012-07-13 2015-04-29 Wave Life Sciences Pte Ltd Chiral control
CA2922005A1 (en) 2012-09-27 2014-04-03 Population Diagnostics, Inc. Methods and compositions for screening and treating developmental disorders
CN106414739A (zh) 2012-12-20 2017-02-15 萨雷普塔医疗公司 用于治疗肌营养不良症的改良的外显子跳跃组合物
WO2014153240A2 (en) * 2013-03-14 2014-09-25 Sarepta Therapeutics, Inc. Exon skipping compositions for treating muscular dystrophy
KR20230116945A (ko) 2013-03-14 2023-08-04 사렙타 쎄러퓨틱스 인코퍼레이티드 근육 이영양증의 치료를 위한 엑손 스키핑 조성물
KR20150133768A (ko) * 2013-03-15 2015-11-30 사렙타 쎄러퓨틱스 인코퍼레이티드 근육 이영양증의 치료를 위한 개선된 조성물
JPWO2015108047A1 (ja) 2014-01-15 2017-03-23 株式会社新日本科学 免疫誘導活性を有するキラル核酸アジュバンド及び免疫誘導活性剤
WO2015108046A1 (ja) 2014-01-15 2015-07-23 株式会社新日本科学 抗アレルギー作用を有するキラル核酸アジュバンド及び抗アレルギー剤
JPWO2015108048A1 (ja) 2014-01-15 2017-03-23 株式会社新日本科学 抗腫瘍作用を有するキラル核酸アジュバンド及び抗腫瘍剤
ES2917473T3 (es) 2014-01-16 2022-07-08 Wave Life Sciences Ltd Diseño quiral
US20150329609A1 (en) 2014-03-03 2015-11-19 Sujata Acharjee Chimeric dystrophin proteins to treat dystrophinopathies
MY193708A (en) 2014-03-12 2022-10-26 Nippon Shinyaku Co Ltd Antisense nucleic acids
ES2765463T3 (es) 2014-06-17 2020-06-09 Nippon Shinyaku Co Ltd Acido nucleico antisentido para usar en el tratamiento de la distrofia muscular de Duchenne
CA2966527C (en) 2014-11-02 2024-02-06 Arcturus Therapeutics, Inc. Messenger una molecules and uses thereof
MA43072A (fr) 2015-07-22 2018-05-30 Wave Life Sciences Ltd Compositions d'oligonucléotides et procédés associés
KR20180056766A (ko) 2015-10-09 2018-05-29 웨이브 라이프 사이언시스 리미티드 뉴클레오티드 조성물 및 이의 방법
EP3359668A4 (en) * 2015-10-09 2019-06-05 Sarepta Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATING DUCHENNE MUSCLE DYSTROPHY AND ASSOCIATED ILLNESSES THEREOF
MA45290A (fr) 2016-05-04 2019-03-13 Wave Life Sciences Ltd Procédés et compositions d'agents biologiquement actifs
MA45270A (fr) 2016-05-04 2017-11-09 Wave Life Sciences Ltd Compositions d'oligonucléotides et procédés associés
MD3554552T2 (ro) 2016-12-19 2022-12-31 Sarepta Therapeutics Inc Conjugați oligomeri de omitere a exonilor pentru distrofie musculară
DK3554553T3 (da) * 2016-12-19 2022-09-19 Sarepta Therapeutics Inc Exon-overspringnings-oligomerkonjugat til muskeldystrofi
EA201991450A1 (ru) * 2017-09-22 2019-12-30 Сарепта Терапьютикс, Инк. Конъюгаты олигомеров для пропуска экзона при мышечной дистрофии

Also Published As

Publication number Publication date
US20210338830A1 (en) 2021-11-04
US20180271993A1 (en) 2018-09-27
PL3554552T3 (pl) 2022-11-21
US11395855B2 (en) 2022-07-26
CN110636866A (zh) 2019-12-31
JP2023171961A (ja) 2023-12-05
KR20240006057A (ko) 2024-01-12
SG10202100557UA (en) 2021-02-25
TW201828995A (zh) 2018-08-16
SMT202200403T1 (it) 2022-11-18
HUE059905T2 (hu) 2023-01-28
EP3554552A1 (en) 2019-10-23
CN110636866B (zh) 2024-10-18
IL297528A (en) 2022-12-01
AU2017382773A1 (en) 2019-08-01
SA519402226B1 (ar) 2023-01-22
TW202332470A (zh) 2023-08-16
AU2017382773B2 (en) 2025-01-30
LT3554552T (lt) 2022-10-10
US11000600B2 (en) 2021-05-11
PT3554552T (pt) 2022-10-03
EP4115908B1 (en) 2025-08-20
NZ755438A (en) 2023-05-26
WO2018118662A1 (en) 2018-06-28
HRP20221155T1 (hr) 2022-12-09
TWI794197B (zh) 2023-03-01
ES3051834T3 (en) 2025-12-30
EP3554552B1 (en) 2022-08-17
JP2020511943A (ja) 2020-04-23
CA3047010A1 (en) 2018-06-28
KR20190099002A (ko) 2019-08-23
DK3554552T3 (da) 2022-10-24
MY205772A (en) 2024-11-12
RS63621B1 (sr) 2022-10-31
ES2928486T3 (es) 2022-11-18
MX2019006879A (es) 2019-08-01
CO2019007399A2 (es) 2019-10-09
IL267246A (en) 2019-08-29
US20250064959A1 (en) 2025-02-27
IL267246B2 (en) 2023-03-01
JP2022185140A (ja) 2022-12-13
IL267246B (en) 2022-11-01
JP7160807B2 (ja) 2022-10-25
JP7465320B2 (ja) 2024-04-10
EP4115908A1 (en) 2023-01-11
KR102646318B1 (ko) 2024-03-12
BR112019012664A2 (pt) 2020-01-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7728923B2 (ja) 筋ジストロフィーに対するエクソンスキッピングオリゴマーコンジュゲート
JP7691462B2 (ja) 筋ジストロフィーに対するエクソンスキッピングオリゴマーコンジュゲート
JP7465320B2 (ja) 筋ジストロフィーに対するエクソンスキッピングオリゴマーコンジュゲート
HK40087674B (en) Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
HK40087674A (en) Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
HK40014131A (en) Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
HK40014131B (en) Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
HK40015449B (en) Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
HK40015449A (en) Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
HK40009617A (en) Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
HK40009617B (en) Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
EA044076B1 (ru) Конъюгаты олигомеров для пропуска экзона при мышечной дистрофии