TWI488636B - 藥用植物霍山石斛〈dendrobium huoshanense〉多醣體及寡聚物之結構及生物活性 - Google Patents

Description

藥用植物霍山石斛( DENDROBIUM HUOSHANENSE )多醣體及寡聚物之結構及生物活性 相關申請案

本申請案主張美國臨時專利申請案第61/028,143號之優先權(2008年2月12日申請，發明名稱為「藥用植物霍山石斛多醣之結構及生物活性(Structure and Bioactivity of the Polysaccharides in Medicinal PlantDendrobium huoshanense )」)，並將其納入作為參考。

本揭示內容係關於測定在霍山石斛中所發現之多醣，以及投與該多醣以啟動免疫調控活性之作用，包括有益細胞激素之正調節。

霍山石斛是一種源自於中國之珍貴及瀕臨絕種之藥用植物。在此研究中，使用各種技術測定從霍山石斛之葉及莖細胞壁以及黏液所萃取之多醣的詳細結構，這些技術包括層析、光譜、化學及酵素方法。目前已經推論出單醣的組成及其在細胞壁與黏液中的鍵結。除了先前報導的甘露糖、葡萄糖、及半乳糖之外，首次在霍山石斛中發現的新穎單醣組成份有鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖醛酸、葡萄醣醛酸、4-O -甲基葡萄醣醛酸、及2-O -甲基葡萄醣醛酸。葉及莖的果膠區份被發現主要含有高半乳糖醛酸聚醣(HGA)及半乳甘露聚醣，並含有較小部分的鼠李半乳糖醛酸聚醣(RG)。鹼性可萃取區份主要係由葡醣醛酸阿拉伯木聚醣(GAXs)、岩藻糖基化木葡聚醣(XGs)及葡甘露聚醣所組成。相對的，由莖及葉所萃取的黏液多醣則由2-及3-O -乙醯基葡甘露聚醣構成。該黏液多醣具特定功能，可活化鼠類脾臟細胞而產生數種細胞激素，包括IFN-γ、IL-10、IL-6及IL-1α，以及造血生長因子GM-CSF及G-CSF。然而，由鹼處裡而取得的去乙醯化黏液則無法誘發細胞激素生成。

以陰離子交換DEAE-纖維素及丙烯葡聚醣凝膠(Sephacryl)大小排除層析法進一步分級黏液的萃取物。具有約10KDa平均分子量的生物活性多醣級份B是由β-(1→4)葡甘露聚醣所組成，其在甘露糖苷之2-及3-位置具有部分乙醯基化。鍵結β-(1→4)-D-Glcp 及β-(1→4)-D-Manp 是用NOE光譜和酵素方法予以確認。使用一系列之2D NMR光譜計數指定個別質子及碳原子之化學位移。

此為首見研究，提出霍山石斛多醣之結構及活性關係的明確證據。

另外，以酸水解或酵素消化而自霍山石斛取得之寡醣片段，不論是否具有化學修飾，亦可誘發有益蛋白之表現，諸如，G-CSF，其顯示具有潛在之治療用途。

基於上述發現，使用各種方法之組合，包括酸水解、酵素消化、萃取、透析、層析及化學修飾，自高分子量甘露聚醣製備生物活性甘露糖寡聚物。含有六個或六個以上甘露糖苷之寡醣可依時間及劑量依賴的方式，誘發有益蛋白之表現，諸如，細胞激素及生長因子。

本發明揭示關於使用霍山石斛之區份、多醣及寡醣的組合物及方法。該等級份、多醣及寡醣可造成有益細胞激素及趨化因子之增加。

根據本發明之特徵，此處揭示一種組合物，其包含霍山石斛萃取物。該萃取物至少包含級份B，且至少一種多醣，可用於投藥，以對有益蛋白產生正調節。

根據本發明之特徵，此處揭示一種方法，其包含自霍山石斛分離至少一種多醣，製備包含該至少一種多醣以及醫藥可接受性載體之製備物，並提供該製備物，供動物投藥，以對該動物體內之有益蛋白產生正調節。

根據本發明之特徵，此處揭示一種組合物，其至少包含霍山石斛之級份B，以及醫藥可接受性之載體。

根據本發明之特徵，此處揭示一種組合物，其包含在甘露糖苷之2-及3-位置有部分乙醯基化之β-(1→4)葡甘露聚醣，以及醫藥可接受性之載體。

根據本發明之特徵，此處揭示一種方法，其包含使用半纖維素酶製備具有生物活性甘露糖寡聚物之霍山石斛萃取物。

在下列關於本發明實施之詳細敘述中，可參照附呈的圖式，其中相似的參照說明表示相似的元件，且其顯示方式係用以說明實施本發明之特定實施方式。此等實施方式之說明充份詳細，足使熟習技藝者實施本發明，且應明瞭可使用其他實施方式，且進行邏輯、機械、生物、電學、功能及其他變化，但不偏離本發明之範圍。因此，下列詳細敘述並非做為限制，本發明之範圍僅由附呈之申請專利範圍定義。在本文中，應明瞭辭彙「或(or)」為定義邏輯之分斷，不應表示排除性之分斷，除非有明確指明或是註記為「異或(xor)」。

本發明發現，霍山石斛之細胞壁及莖中的多醣主要係由單醣Xyl、Ara、Man、Glc、Gal及GalA構成，並具有小部分之Rha、Fuc、GlcA及4-O -甲基GalA。本發明測定此等單醣殘基之糖基鍵結，以深入剖析多醣之結構。本發明發現取自細胞壁及莖之多醣的CDTA(環己烷-1,2-二胺四乙酸)萃取物之果膠級份含有半乳甘露聚醣、半乳聚醣、阿拉伯糖聚醣及鼠李半乳糖醛酸聚醣I，而異木聚醣、葡醣醛酸阿拉伯木聚醣及木葡聚醣則存在於KOH級份中。部分的木葡聚醣經末端岩藻糖及Gal側鏈之修飾。莖的黏液於β-(1→4)-D-Glcp 及β-(1→4)-D-Manp 鍵結含有葡甘露聚醣，其具有在2-及3-位置有部分乙醯基化之甘露糖苷。該黏液多醣對於小鼠之脾細胞具有特定之功能。該黏液誘發數種細胞激素，包括IFN-γ、IL-10、IL-6及IL-1α，以及造血生長因子GM-CSF及G-CSF。然而，由鹼處裡而取得之去乙醯化黏液無法誘發細胞激素生成。

以陰離子交換DEAE-纖維素及丙烯葡聚醣凝膠大小排除層析法進一步將黏液萃取物分成不同級份。生物活性多醣級份B經測定具有約10KDa之平均分子量，且其組成及結構亦經由化學、酵素及光譜方法之組合予以精確測定。此係針對霍山石斛之多醣的結構與活性之關係提出明確證據之首見研究。

霍山石斛之植物材料係取自永豐餘生技公司(臺灣)。圖1說明自霍山石斛分離多醣之流程。在4℃，從葉及莖收集含有非木質化的初生細胞壁。以豬胰澱粉酶處理醇不可溶性殘餘物(AIR)以除去澱粉。使用CDTA、Na₂ CO₃ 、1M KOH及4M KOH進行一系列之萃取，使得去除澱粉的細胞壁分成不同級份。剩餘之不可溶性殘餘物為α-纖維素區份。如碘化鉀之試驗所示，從葉及莖所收集之該黏液多醣並不含有任何澱粉顆粒。

根據實例，發明人發現取自霍山石斛之寡醣的骨架含有β-1,4-鍵結的葡萄糖及甘露糖，比例為1:10。當細胞經由取自霍山石斛之寡醣處理時，可觀察到有益蛋白之誘發/表現。

霍山石斛之片段可根據本文所示實例而製備。舉例而言，可以酸水解或酵素消化而獲得來自霍山石斛之寡醣片段，圖2顯示製備流程圖。所得霍山石斛片段(有或無化學修飾)可誘發有益蛋白之表現，諸如，G-CSF(如表1所述)。

^a 樣本依圖2所示製備。 ^b 乙醯化百分比係由¹ H NMR分析估計。 ^c 聚合度(DP)係由MALDI-MS分析中所觀察到的信號推論。 ^d +表示顯著的G-CSF表現；-表示未經誘發的G-CSF表現；±表示表現量僅略高於控制組細胞，無法明確判斷。

根據實例，可使用各種方法之組合降解高分子量的甘露聚醣(圖3)。舉例而言，酸水解、酵素消化、萃取、透析、層析及化學修飾皆可產製具生物活性之甘露糖寡聚物(表2)。

^a 由高分子量甘露聚醣之降解取得各種不同的甘露糖寡聚物(參見圖3)。 ^b 乙醯化百分比係根據乙醯化劑之化學計量，並以乙醯化產物之MS及¹ H NMR分析估計。 ^c 聚合度(DP)係由MALDI-MS分析中所觀察到之信號推論。 ^d ++表示G-CSF之表現高於石斛多醣(DHPS)；+表示顯著之G-CSF表現；-表示未經誘發之G-CSF表現；±表示表現量僅略高於控制組細胞，無法明確判斷。

根據實例，含有六個或六個以上的甘露糖苷單元之寡醣(例如，以β-1,4-鍵結者)(有或無乙醯化)，經顯示可誘發有益蛋白之表現，諸如，G-CSF(表2)。此外，根據實例，含有六個或六 個以上甘露糖苷單元之寡醣可依時間及劑量依賴的方式(如圖7所示)誘發有益蛋白之表現，諸如，細胞激素及生長因子(圖4至8)。

另外，根據實例，以酵素降解、透析及層析而自高分子量甘露聚醣取得的甘露糖寡聚物，經顯示具有誘發有益蛋白(諸如，G-CSF)之強效活性(如圖8所示)。根據實例，半纖維素酶係用以製備具生物活性之甘露糖寡聚物的有效酵素。熟習技藝者知道並可辨識具有類似半纖維素酶活性之等同酵素，以完成相同或類似之結果。

自霍山石斛製備之多醣(DHPS)在誘發有益蛋白(諸如，集落刺激因子)方面之活性(參見圖8及11)，有各種應用方式。舉例而言，根據實例，粒細胞集落刺激因子(G-CSF)是一種造血生長因子，其名稱來自於其在骨髓譜系細胞之增殖及分化中所扮演之角色。G-CSF之投藥可使造血幹細胞(HSCs)自骨髓移動進入周圍血液中，因而對於臨床實施採取自體周血幹細胞移植而言是非常重要的。另外，G-CSF在嗜中性細胞生成之基礎調控中亦扮演重要角色，其能夠修復阿茲海默症動物模式中之記憶缺損，或是對自體免疫疾病及神經性病症具有潛在的治療應用。已發現G-CSF或組合的細胞激素療法會造成移動性骨髓細胞之心肌歸向，修復梗塞之心肌，並改良左心室之結構與功能參數以及存活率。

G-CSF及其受體可能是在中樞神經系統中擔任一種自分泌適應系統。生長因子，諸如，G-CSF及粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，可改善高劑量組合性化療療程之血液耐受性。粒細胞生成刺激因子，諸如，粒細胞集落刺激因子(G-CSF)及粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，亦可增加身體之白血球生成，進而可降低接受淋巴瘤化療之病患的感染風險。

根據實例，此種應用明確預期可將取自霍山石斛之活性寡醣用於口服或注射性醫藥組合物中，舉例而言。類似地，該等活性甘露糖寡聚物可以口服或注射方式投藥。

細胞壁之單醣組成

以三氟乙酸對於細胞壁之AIR製備物(alcohol-insoluble residue)以及個別級份進行水解，以釋出單醣，其接著以NaBH₄ 還原並以Ac₂ O進行乙醯化而產生對應的過乙酸醛醣醇。以GC-MS分析判定，中性單醣之組成與過乙酸醛醣醇之組成有相關性(表3)。葉之非木質化初生細胞壁中的主要組成份係Ara、Man、Glc及Gal，並具有小部分的Xyl、Rha及Fuc。另一方面，莖之非木質化初生細胞壁中主要含有Xyl、Glc、Man及Gal，小部分的Ara及Rha，以及微量之Fuc。有注意到的是，在細胞壁水解物中，莖的Xyl比例(28mol%)高於葉(7mol%)，而莖的Ara比例(9mol%)則低於葉(22mol%)。在葉及莖之細胞壁製備物中，醣醛酸含量分別為11%及4%。發現有三種糖醛酸之存在：半乳糖醛酸(GalA)、葡萄糖醛酸(GlcA)及4-O -甲基葡萄糖醛酸(Me-GlcA)，其中主要是GalA(75-87%)。

以CDTA、Na₂ CO₃ (+25mM NaBH₄ )、1M KOH(+25mM NaBH₄ )及4M KOH(+25mM NaBH₄ )進一步萃取細胞壁之AIR製備物，以產生對應的級份以及α-纖維素殘餘物。表3顯示此等級份之中性單醣及糖醛酸的組成。

取自葉及莖之細胞壁的CDTA級份及Na₂ CO₃ 級份兩者皆含有高比例之Man、Gal及Ara。相較於CDTA級份及Na₂ CO₃ 級份，在1M KOH級份中，葉(28mol%)及莖(65mol%)含有更大量的Xyl。在葉(28mol%)及莖(41mol%)之4M KOH級份中，主要組成份則是葡萄糖。發現有三種糖醛酸之存在，其中CDTA級份及Na₂ CO₃ 級份，主要含有半乳糖醛酸(GalA)。在葉之1M及4M KOH級份中，葡萄糖醛酸(GlcA)之含量高於4-O -甲基葡萄糖醛酸(Me-GlcA)，而在莖中則觀察到相反之情形。

GalA係果膠多醣存在之特徵，且GlcA及4-O -GlcA兩者典型存在於異木聚醣。結果指出，高比例之果膠多醣存在於CDTA及Na₂ CO₃ 兩種級份中，而大量異木聚醣則存在於KOH級份中。

細胞壁級份之鍵結分析

單醣殘基間的糖基鍵結可提供有關多醣結構之資訊。表4摘述霍山石斛的葉及莖的細胞壁級份之糖基鍵結。

在葉及莖之細胞壁製備物的CDTA級份中，4-Manp 及4,6-Manp 形式之甘露糖最多量。除了具有高比例之t-Galf 、4-Galf 、t-Araf 及5-Araf 之外，CDTA級份之組成特徵為半乳甘露聚醣、半乳聚醣及阿拉伯聚醣(其中"t"表示糖位於非還原端之終端位置)。CDTA級份中所發現之少量2-Rhap 可能是由於鼠李二半乳糖醛酸聚醣I(RGI)之存在所致。

Na₂ CO₃ 級份中之糖基鍵結組成與CDTA級份中之糖基鍵結組成相似，但具有更高比例之4-Galp 及較小比例之4-Manp 及4,6-Manp 。在霍山石斛細胞壁製備物之果膠級份(CDTA＋Na₂ CO₃ 萃取)中觀察到半乳甘露聚醣。銀合歡(Leucaena leucocephala )之半乳甘露聚醣可與二價金屬離子(如，Co²⁺ 、Mn²⁺ 、Ni²⁺ 、及Zn²⁺ )形成複合物。因此，霍山石斛葉及莖之細胞壁製備物可能含有該等半乳甘露聚醣與金屬離子之複合物，其可在後續由CDTA及Na₂ CO₃ 處理萃取並予以確認。

在霍山石斛初生細胞壁製備物之1M KOH級份中觀察到t-Xylp 、4-Xylp 及t-Araf 糖基鍵結。除了具有高比例GlcA及4-O -GlcA之外(參見表3)，亦觀察到微量之葡醣醛酸阿拉伯木聚醣(GAXs)。霍山石斛GAXs中主要是非支鏈之4-Xylp 鍵結。相較而言，在玉米(Zea mays ,Poaceae)及鳳梨(Ananas comosus ,Bromeliaceae)之初生細胞壁中所發現之GAXs含有高比例之支鏈2,4-Xylp 及3,4-Xylp 糖基鍵結。另外，相較於禾草及鳳梨，霍山石斛之GAXs不同處在於不具有酯鍵結性羥基肉桂酸。

主要的t-Xylp 、2-Xylp 、4-Glcp 及4,6-Glcp 糖基鍵結表示葉及莖之KOH級份中有木葡聚醣存在。t-Fucp 之存在表示該等木葡聚醣可能經岩藻糖基化。大量的4-Manp 糖基鍵結可能形成甘露聚醣或葡甘露聚醣。

CDTA級份中果膠多醣之分析

上述糖醛酸組成及糖基鍵結分析指出CDTA級份中有果膠多醣之存在。以酵素消化及光譜研究探索此等果膠多醣之結構。以聚半乳醣醛酸聚醣酶處理葉及莖之細胞壁製備物的CDTA級份，以對果膠進行酶切消化。該等酶切消化物之質譜分析指出，有寡半乳醣醛酸苷之存在，其為4-15聚合度(DP)及含不同程度之甲基。此等寡半乳醣醛酸苷可衍生自高半乳糖醛酸聚醣(HGAs)，其係由GalA之甲酯構成。由當歸(Angelica auctiloba )及大車前草(plantogo major )所分離之果膠顯示有抗補體效應。含有高含量HGA之植物諾麗果(檄樹，Morinda citrifolia )及三七(Panax notoginseng )具有醫藥用途。因此，霍山石斛果膠組成份中之高含量HGA提供具生物活性。

CDTA級份中多醣之¹ H NMR光譜(600MHz)出現代表甲酯(CO₂ CH₃ )之位於δ3.7之明顯單峰以及由GalA中C-4質子或其甲酯產生之位於δ4.3的寬多重峰，其符合結構上的推論。在¹³ C NMR光譜中，甲酯之信號出現在δ52.7(CH₃ )及170.6(C=O)，而GalA之對應羧基信號出現在δ172.6。該等果膠多醣之¹ H NMR光譜亦出現位於δ1.29之雙重峰微弱信號，其由鼠李糖中之甲基所產生，組成及糖基鍵結之分析試驗亦已顯示其存在(表3及4)。

1M KOH級份中異木聚醣之分析

以酵素內切-(1→4)-β-D-木聚醣酶將葉細胞壁製備物之1M KOH級份予以水解，並以質譜分析所釋出之寡醣。位於m /z 877、1009、1141及1273之特徵信號係與Pen₅ GlcA、Pen₆ GlcA、Pen₇ GlcA及Pen₈ GlcA之[M＋Na]⁺ 離子相關(其中Pen代表戊糖苷)，而位於m/z 1023及1155之信號則由Pen₆ MeGlcA及Pen₇ MeGlcA之[M＋Na]⁺ 離子產生。此等結果與糖醛酸分析試驗中觀察到之高含量GlcA及MeGlcA(表3)相符。類似者，莖細胞壁製備物之1M KOH級份的酶切消化及MS分析發現有戊糖苷寡聚物Pen_x GlcA(x=5-9)、Pen_y MeGlcA(y=4-9)及Pen_z (MeGlcA)₂ (z=5-11)之存在。具有(MeGlcA)₂ 雙醣取代之戊糖苷寡聚物僅見於莖中，並未在葉中發現。

以α-L-阿拉伯糖苷酶處理，在寡醣之終端可觀察到L-阿拉伯糖。再以酵素移除阿拉伯糖基殘基後，該等GlcA-及MeGlcA-取代性戊糖苷寡聚物之整體質量內容並未改變，但所有之[M＋Na]⁺ 離子皆顯示相較於未經α-L-阿拉伯糖苷酶處理樣本之原始質量信號減少132道耳吞。此實驗明確指出在該終端有單取代之阿拉伯糖基殘基之存在，此係葡醣醛酸阿拉伯木聚醣(GAXs)之特徵。

4M KOH級份中木葡聚醣之分析

以內切-(1→4)-β-D-葡聚醣酶，對葉細胞壁製備物之4M KOH級份進行酵素降解。以高pH陰離子交換層析-脈衝安培偵測(HPAEC-PAD)及MALDI-TOF MS分析該水解物(如圖8所示)，以顯示木葡聚醣(XGs)之存在。[M＋Na]⁺ 離子在該MS光譜中對應於XXG(m/z 791)、XXGG(m/z 953)、XXXG(m/z 1085)、XLXG/XXLG(m/z 1247)、XXFG(m/z 1393)、XLLG(m/z 1409)及XLFG(m/z 1555)，其中G代表β1,4-鍵結形式之骨架Glc，X代表Xyl(α1,6)Glc單元，L代表Gαl(β1,2)Xyl(α1,6)Glc，且F代表Fuc(α1,2)Gal(β1,2)Xyl(α1,6)Glc。在霍山石斛之莖細胞壁製備物中發現有類似的XGs組成。結果顯示，霍山石斛之XGs同時具有XXGG及XXXG兩種骨架，並具有岩藻糖基化之XG寡醣XXFG及XLFG。具有終端Fuc及Gal側鏈之XGs已經顯示在細胞基礎分析中可誘發抗腫瘤活性。

莖黏液中多醣之分析

使用葡甘露聚醣分析套組確認葡甘露聚醣之存在。發現去澱粉之黏液多醣水解物含有Man(79%)及Glc(21%)，其與GC-MS分析中對應的乙酸醛醣醇所推論的結果相同。因此，該黏液多醣之內切-(1→4)-β-D-甘露聚醣酶水解物之質譜顯示了導致部分乙醯化及3-9聚合度(DP)之葡甘露-寡醣的分子離子。

異位性碳原子分別出現於δ102.8(次要組成份)及100.6(主要組成份)，符合β-(1→4)-D-Glcp 及β-(1→4)-D-Manp 之結構分配。甘露糖之乙醯化程度約為25%。除2-O -乙醯基-β-(1→4)-D-甘露糖之乙醯基在δ_H 2.20/δ_C 20.3及δ_C 173.5之信號外，出現於δ_H 2.05/δ_C 20.5及δ_C 174.0之次要信號(~5%)可能來自3-O -乙醯基-β-(1→4)-D-甘露糖。另外，以3M NaOH(或1M NaOH＋1% NaBH₄ )處理該黏液多醣，以除去乙醯基。在透析後，根據文獻指定在異核單量子相干(HSQC)光譜中顯示¹ H-¹³ C信號之去乙醯化多醣。該HSQC光譜明確指出，該去乙醯化黏液多醣係由(β1→4)-鍵結性D-Manp 及(β1→4)-鍵結性D-Glcp 組成(如圖10所示)。

取自黏液製備物之多醣及去乙醯化多醣之生物活性

使用MTS分析，以測定取自不同霍山石斛結構物之多醣級份的細胞增殖效應。如表5所示，與黏液級份共同培育之小鼠脾細胞的生長素度顯著高於未經處理之細胞(莖黏液之154%及葉黏液之141%，相對於控制組細胞之100%)。

相較於取自蒟蒻之葡甘露聚醣以及來自於象牙果仁之甘露聚醣，其效應更為明顯。細胞激素內容分析指出數種細胞激素有較高表現，包括IFN-γ、IL-10、IL-6及IL-1α。其亦誘發顯著量之造血生長因子GM-CSF及G-CSF。檢驗莖黏液多醣對於G-CSF及GM-CSF誘發之劑量相關性效應。如圖11所示，對於該兩種因子生成之刺激效應具有劑量相關性(一直到250μg/mL)。

最有趣的是，發明人研究在莖黏液多醣進行2-O -乙醯基葡甘露聚醣之去乙醯化的結構修飾，是否會影響其對於細胞激素生成之刺激效應。發現以去乙醯化之莖黏液多醣處理細胞，可維持細胞增殖，但無法誘發細胞激素生成(參見表5)。

經由黏液組成份之分級分離而驗證結構及生物活性

以DEAE-纖維素(NH₂ ^- 形式)之陰離子交換層析對黏液萃取物進行分級分離。以蒸餾水沖提會產生中性多醣，而以水性NaCl緩衝液之後續沖提則產生含有多醣之糖醛酸及醛糖酸。取得六個級份，並對各個級份進行透析(分子量截斷值=500)，以除去鹽。在Sephacryl S-200上，以大小排除層析法，將細胞激素表現最強之級份(6%之重量)進一步分離為級份A(31%)、B(13%)、C(18%)、D(17%)、E(8%)及F(13%)。由RT-PCR分析推論此等多醣級份之細胞激素表現，如圖12所示。儘管G-CSF並未由Con A誘發(第2道)，但其確認了以取自黏液(第3道)及級份B-F(第5-9道)進行之多醣處理，可導致細胞激素表現。

以化學、酵素及光譜方法之組合，精確測定級份B多醣之組成及結構。以三氟乙酸對級份B之多醣進行水解，以釋出其單醣組成份，其接著以NaBH₄ 還原並以Ac₂ O乙醯化而產生對應之醛醣醇全乙酸酯。此等醛醣醇全乙酸酯之GC-MS分析相關於級份B多醣之組成，為具有10:1比例的甘露糖及葡萄糖。另一方面，對級份B之多醣進行甲基化、酸催化性水解、還原及乙醯化，則產生對應之甲基化醛醣醇全乙酸酯，其經GC-MS分析測定而顯示其糖基鍵結。藉由此種方法，推論級份B之多醣具有由(1→4)-鍵結之Manp 及Glcp 所構成的骨架。

以NMR分析測定級份B多醣之乙醯化程度，如圖13所示。NMR光譜顯示分別位於δ4.64-4.74、4.93-4.82及4.74-4.81之未乙醯化吡喃甘露糖苷(Man)、2-O -AcManp (Man₂₄ )及3-O -AcManp (Man₃₄ )之特徵異位性質子(H-1)，其比例由級份B多醣中個別信號之積分推論為66:19:15。

使用高效大小排除層析法(HPSEC)結合RI及UV，估計級份B多醣之均質性及分子量。如圖14所示，測量兩種不同HPLC管柱(Thermo BioBasic SEC-1000及TSK-GEL G3000管柱)之停滯時間，以普魯蘭多醣(pullulan)標準物校正，該主要組成份之分子量估計為~10KDa。

在替代方法中，使用擴散排序NMR光譜技術(DOSY)實驗，根據方程式1評估多醣之分子量，其中D係擴散係數，MW係經檢驗多醣之分子量。

D=8.2×10^-9 MW^-0.50 (m² s^-1 )　(1)

如圖15所示，-10.08之測量D值對應於9.7KDa之平均分子量，與HPSEC分析推論的結果相符。因此，級份B包含有部分乙醯化之葡甘露聚醣多醣(~60DP)。

基於相近質子交互作用之核奧弗豪澤增強(NOE)，可提供有關分子構形及質子指定之評估的有用資訊。一般而言，在吡喃糖環中具有1,3-二軸或鄰赤道軸關係配置之質子對中，觀察分子間之NOE信號。因此，β-D-甘露糖苷之異位性質子(H-1)可對H-2、H-3及H-5產生NOEs，而α-D-甘露糖苷則僅可顯示H-1及H-2間之強NOE。因此，可判定級份B之多醣含有β-鍵結性組態之甘露糖苷。因此，選擇未乙醯化甘露吡喃糖基殘基(其係連結甘露吡喃糖基或葡吡喃糖基殘基)之H-1共振進行輻射照射，以產生示差NOE光譜(圖16)。觀察到在甘露吡喃糖苷中有關於H-2、H-3及H-5之殘基內NOEs，以及在葡吡喃糖苷中有關於H-3之殘基間NOE。此一結果符合葡甘露聚醣中甘露糖苷之β-鍵結性組態。

以3M NaOH處理而移除級份B多醣中之乙醯基。接著對該去酯化葡甘露聚醣進行酶切消化以判定糖苷鍵。在以內切-β-甘露聚糖酶或β-甘露糖苷酶進行酶切消化後，相較於HPAEC-PAD分析之標準物，發現該水解物含有一系列顯著量之甘露糖及寡甘露糖苷。相對的，以α-甘露糖苷酶處理該去乙醯化葡甘露聚醣，並不會釋出自由之甘露糖。因此，此等酵素分析確認級份B多醣中甘露糖苷之β-鍵結。

該2D-NMR光譜進一步提供有關結構指定之資訊。由於乙醯基之去遮蔽效應，在δ5.45、5.42及5.36處出現三組2-O -乙醯化β-Manp 單元之H-2，而兩組3-O -乙醯化β-Manp 單元之H-2則出現在δ 5.05及4.99。以相關光譜法(COSY)、全相關光譜法(TOCSY)、HSQC、異核多鍵相關(HMBC)及旋轉座標系奧弗豪澤效應光譜(ROESY)分析，發現該等質子與碳原子信號間之相關性。位在α-Manp 殘基還原端之異位性質子及碳原子可輕易在級份B之HSQC光譜中於δ_H 5.14及δ_C 94.4予以辨識。(1→4)-鍵結性β-Glc殘基之特徵則為HSQC光譜中於δ_H 4.48及δ_C 102.8間之交叉峰。

除質子及碳原子信號之糖苷內相關性之外，如圖17所示之HMBC光譜顯示異位性質子(H-1)與毗鄰糖單元之C-4間經由³ J-偶合之殘基間交叉峰。因此，該HMBC光譜顯示雙醣單元ManGlc、ManMan、ManMan₃₄ 、Man₂₄ Man₂₄ 、Man₂₄ Man₃₄ 、Man₃₄ Man及GlcMan之存在。

在ROESY光譜中，如圖18所示，乙醯化β-Manp 之異位性質子(H-1)因其短空間距離而顯示三個殘基內之交叉峰，亦即H-1/H-2、H-1/H-3及H-1/H-5，類似見於NOE光譜中者，如圖15所示。另外，序列殘基間相關性，諸如，“H-1(Man)/H-3(Man₃₄ )”(δ 4.68/5.05)及“H-1(Man₂₄ )/H-3(Man₃₄ )”(δ 4.84/4.99)，亦表示有大量之片段的ManMan₃₄ 及Man₂₄ Man₃₄ 。

根據前述1D-及2D-NMR光譜研究並依此類推先前之相關報告，將級份B多醣之¹ H及¹³ C NMR光譜數據摘述於表6。

在圖19中試驗性描述乙醯基-葡甘露聚醣之部分結構，以說明葡糖苷對甘露糖苷之比例(~1:10)以及乙醯化程度(~35%)。

DHPS可誘發G-CSF之表現

如圖4及5中所示，RT-PCR分析指出，霍山石斛多醣之粗萃取物(DHPS，第3道)以及含有66%(Man)₆ ＋34%(Man)_n 之1,4-β-D-甘露寡醣混合物(M003 )(，第8道)可誘發G-CSF之表現，而低聚合度()之甘露糖或半乳糖基甘露糖寡聚物則相對為無活性(第4-7及9-11道)。在圖6及7中，ELISA分析確認甘露寡醣混合物M003 可依時間及劑量依賴之方式誘發G-CSF之表現，其活性略高於DHPS。比較實驗(圖8)進一步支持DHPS及甘露寡醣混合物M003 ()之高活性。以高分子量甘露聚糖之酵素(半纖維素酶)降解所取得之另一甘露寡醣M013 (DP=5-10)係誘發G-CSF表現之最強效成分。

發現自霍山石斛之黏液分離之具有β-(1→4)鍵結及部分乙醯化的葡甘露聚醣可誘發G-CSF、IL-6或其他本文所示細胞激素之表現。然而，由鹼處裡而取得之去乙醯化黏液則無法誘發細胞激素生成。此外，分別相較於其乙醯化前體DH006、DH020、M013 及Man018 ，在皂化產物DH007、DH023、Man020 及Man021 中發現活性喪失。另一方面，該研究亦指出，甘露寡醣混合物M003 之過量乙醯化可降低其誘發G-CSF表現之活性(比較表2之條目3與條目4-9)。其意謂，具有之甘露寡醣係誘發細胞激素表現之真正活化劑。就霍山石斛中(葡)甘露聚糖之高分子量而言(如，～60DP，揭示於本文)，適當之乙醯化程度可改良其在生理條件下之溶解度及吸收，以協助誘發細胞激素。

醫藥組合物或類藥劑營養品 (Nutraceutica1)組合物

根據另一態樣，霍山石斛之多醣或其級份可結合熟習技藝者在閱讀本揭示內容時所能辨識之其他活性劑、載體、載劑、賦形劑、或佐劑，而包含於醫藥組合物或類藥劑營養品組合物中。

該等醫藥組合物或類藥劑營養品組合物較佳包含至少一種醫藥可接受之載體。在此等醫藥組合物中，霍山石斛之多醣或其級份形成「活性化合物」，亦稱為「活性劑」。在本文中，名辭「醫藥可接受之載體」包括溶劑、分散基質、塗層、抗菌或抗真菌劑、等滲透及吸收延遲劑、及其類似者，其可與醫藥投與相容。亦可將補充的活性化合物納入該等組合物中。醫藥組合物可調配成任何相容於投與途徑之形式。投與途徑之實例包括腸外，如，靜脈內、皮內、皮下、口服(如，吸入)、穿皮(局部)、穿黏膜及直腸投藥。用於腸外、皮內、或皮下應用之溶液或懸浮液可包括下列組成份：無菌稀釋劑，諸如，注射用水、鹽水溶液、非揮發性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗菌劑，諸如，苯甲醇或對羥苯甲酸甲酯；抗氧化劑，諸如，抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，諸如，乙二胺四乙酸；緩衝劑，諸如，醋酸、檸檬酸或磷酸；以及用以調整滲透壓之試劑，諸如，氯化鈉或葡萄糖。可使用酸或鹼調整pH，諸如，鹽酸或氫氧化鈉。腸外製備物可裝載於安瓿、拋棄式針筒、或是玻璃或塑膠製之多劑量小瓶中。

在本文中，對象係指人類及非人類靈長類(如，大猩猩、彌猴、狨猿)、家畜(如，羊、牛、馬、驢及豬)、寵物(如，狗、貓)、實驗室試驗動物(如，小鼠、兔、大鼠、天竺鼠、倉鼠)、圈飼野生動物(如，狐狸、鹿)、及任何其他可由本揭示內容之試劑受益之生物體。可由本文所述試劑受益之動物類型並無限制。不論其是否為人類或非人類生物體，對象可被稱為病患、個體、動物、宿主或接受者。

適於注射用途之醫藥組合物包括無菌水性溶液(其係水溶性)或分散液，以及用以即時製備無菌可注射性溶液或分散液之無菌粉末。就靜脈內之投與而言，適當之載體包括生理鹽水、制菌水、Cremophor EL.TM.(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸緩衝鹽水(PBS)。在所有情形下，該溶液應為無菌，且應為流動性達可輕易注射程度之液態。其在製造及貯存條件下應具安定性，且應可對抗微生物(諸如，細菌及真菌)之感染作用而予以保存。該載體可為溶劑或分散基質，其含有，例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、及液態聚乙二醇、及其類似者)，以及其適當混合物。可維持適當之流度，例如，藉由使用塗層(諸如，卵磷脂)、藉由維持所需之顆粒大小(就分散液之情形而言)、以及藉由使用界面活性劑而達成。微生物作用之預防可藉由各種抗菌及抗真菌劑而達成，例如，對羥苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、乙汞硫柳酸鈉、及其類似者。在諸多情形下，較佳是在該組合物中納入等滲透劑，例如，糖、多元醇(諸如，甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化鈉。可注射性組合物之延長吸收可藉著在該組合物中納入可延遲吸收之試劑而達成，例如，單硬脂酸鋁及明膠。

無菌可注射性溶液可藉著將所需量之活性化合物納入適當之溶劑中，如所需結合上述成分中之一者或組合，再進行過濾滅菌而製備。一般而言，分散液係藉著將活性化合物納入含有基礎分散基質及選自其他上述所需成分的無菌載劑中而製備。就用以製備無菌可注射性溶液之無菌粉末而言，製備方法包括真空乾燥或冷凍乾燥，其可從先前經無菌過濾之溶液產生含有活性成分加上任何其他所欲成份的粉末。

口服組合物一般而言包括鈍性稀釋劑或可食載體。就口服治療性投與之目的而言，可使活性化合物與賦形劑混合，並以錠劑、片劑或膠囊(如，明膠膠囊)之形式使用。亦可使用液態載體製備口服組合物以作為漱口液。醫藥可相容性黏合劑或佐劑材料可納入作為組合物之部分。錠劑、丸劑、膠囊、片劑及其類似者可含有任何下列成分，或是具有類似性質之化合物：黏合劑，諸如，微晶纖維素、黃著膠或明膠；賦形劑，諸如，澱粉或乳糖；崩解劑，諸如，藻酸、Primogel或玉米澱粉；潤滑劑，諸如，硬脂酸鎂或Sterotes；助流劑，諸如，膠體二氧化矽；甜味劑，諸如，蔗糖或糖精；或是調味劑，諸如，薄荷、水楊酸甲酯、或柑橘調味劑。

就吸入之投與途徑而言，化合物係以氣溶膠噴霧之形式，由含有適當推進劑(如，氣體，諸如，二氧化碳)之加壓容器或分配器中，或是由噴霧器傳遞。

全身性之投與亦可為穿黏膜或穿皮者。就穿黏膜或穿皮投與而言，其在調配物中使用適用於該待穿透屏障之穿透劑。此等穿透劑係技藝中一般已知者，且包括，例如，就穿黏膜投與而言，清潔劑、膽鹽及梭鏈孢酸衍生物。穿黏膜之投與可經由使用鼻噴霧或栓劑而完成。就穿皮投與而言，可將活性化合物調配為油膏、軟膏、凝膠或乳霜，如技藝中一般已知者。亦可將該等化合物製備為栓劑形式(如，以習知之栓劑基體，諸如，可可脂或其他甘油酯)或是保留灌腸劑以進行直腸傳遞。

根據實例，該等化合物係與可保護該化合物使其不會自體內快速排除之載體而共同製備，諸如，控釋調配物，包括植入物及微膠囊傳遞系統。可使用具生物可降解性、生物可相容性之聚合物，諸如，乙烯-醋酸乙烯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯及聚乳酸。用以製備此等調配物之方法對於熟習技藝者是明顯可知的。該等材料亦可自Alza Corporation及Nova Pharmaceuticals,Inc.以商業方式取得。亦可使用脂質體懸浮液(包括可靶向感染細胞之具有對抗細胞專一性抗原之單株抗體的脂質體)作為醫藥可接受之載體。此等懸浮液可根據熟習技藝者已知之方法製備，例如，美國專利第4,522,811號所述方法，其於此併入本文作為參考。

將口服或腸外組合物調配成劑量單元形式，有利於方便投與及統一劑量。在本文中，劑量單元形式係指物理不連續性之單元，其適合作為該待治療對象之單一劑量；各個單位含有預定量之活性化合物(該量係經計算以產生所欲之治療效應)，並結合所需之醫藥載體。

此等化合物之毒性及治療功效可依標準之醫藥流程，在細胞培養物或實驗動物體內測定，如，測定LD50(可使50%之群體致死之劑量)以及ED50(對於50%之群體具治療有效性之劑量)。毒性及治療功效間之劑量比例為治療指數，且其可表示為LD50/ED50之比例。具有高治療指數之化合物係較佳者。儘管可使用具有毒性副作用之化合物，但應小心設計可使此等化合物靶向至受影響位置之傳遞系統，以使對於未經感染細胞之潛在損傷降至最低，並因而減少副作用。

可使用取自細胞培養分析及動物實驗之數據而調配用於人體之劑量範圍。此等化合物之劑量較佳係落在某一循環濃度範圍內，該範圍包括ED50並具有極小毒性或無毒性。劑量可在此範圍內根據所用之劑形及所用之投與途徑而變化。就任何用於本揭示內容方法中之化合物而言，最初可自細胞培養分析估計治療有效劑量。可在動物模式中調配某一劑量，以達成某一循環血漿濃度範圍，該範圍包括在細胞培養物中所測定之IC50(亦即，可達成最大症狀抑制之一半的試驗化合物濃度)。此等資訊可用以更精確判定人體內之可用劑量。可藉由，例如，高效液相層析，測量血漿中之含量。

如本文所定義，活性化合物之治療有效量(亦即，有效劑量)可介於自約0.001至100g/kg體重之範圍，或是熟習技藝者在不須過度實驗情形下即明顯可知且可明瞭之其他範圍。熟習技藝者將可明瞭，某些因子可影響有效治療對象所需之劑量及時機，其包括，但不限於，該疾病或病症之嚴重性、先前之治療、該對象之一般健康情形或年齡、以及其他存在之疾病。

根據另一態樣，熟習技藝者可預期一或多種部件套組，該部件套組可執行至少一種本文所揭示之方法，該部件套組包含二或多種組合物，該等組合物包含根據至少一種上述方法之有效量的霍山石斛多醣或級份(單獨或組合)。

該等套組可能亦包括包含非為霍山石斛多醣或級份之活性劑、生物事件辨識劑、或是其他可由熟習技藝者在閱讀本揭示內容時所辨識之化合物的組合物。名辭「辨識劑」係指一種分子、代謝物或其他化合物，諸如，抗體、DNA或RNA寡核苷酸，其可在可由熟習技藝者所辨識之流程下，發現或判定生物事件之存在或事實，或是以其他方式偵測之；例示性之流程係西方點漬分析、亞硝酸鹽分析、及RT-PCR，或是其他述於實例中之流程。例示性之生物事件係細胞激素表現或其他免疫調節事件；其中一種並非霍山石斛多醣或級份之例示性活性劑係LPS。

套組亦可包含至少一種包含有效量之霍山石斛多醣或級份或是細胞系的組合物。該等部件套組之組合物及細胞系可根據可由熟習技藝者所辨識之流程而用以執行至少一種本文所揭示之方法。

根據實例，霍山石斛之多醣或級份可用於草藥、食品或膳食補充劑(包括維他命及其他相關調配物)，以誘發蛋白之分泌，諸如，細胞激素或生長因子，舉例而言。此等補充劑係與上述之載體共同製備，並如上述進行投與。根據實例，霍山石斛之多醣或級份可誘發或正調節有益之蛋白，或是可壓抑或負調節非所欲之蛋白，如熟習技藝者可明瞭者。

實例 實例1：材料

霍山石斛品種YFY-HS1(美國專利第PP16,746號)係取自永豐餘生技公司(臺灣)。羅望子XG寡醣標準物、蒟蒻葡甘露聚醣、象牙果仁甘露聚醣、取自黑麴菌(Aspergillus niger )之聚半乳醣醛酸酶(EC 3.2.1.15)、取自瘤胃微生物之內切 -(1→4)-β-D-木聚醣酶(EC 3.2.1.8)、取自黑麴菌之內切 -(1→4)-β-D-甘露聚醣酶(EC 3.2.1.78)、取自木黴屬(Trichoderma sp. )之內切 -(1→4)-β-D-葡聚醣酶(EC 3.2.1.4)及取自黑麴菌之αL-阿拉伯糖苷酶(EC 3.2.1.55)，以及葡甘露聚醣分析套組係購自Megazyme International Ireland Ltd(Wicklow,Ireland)。胰澱粉酶(3.2.1.1)係購自Sigma-Aldrich(St. Louis,MO 63103,USA)。XG標準物XXG、XXGG、XXFG、及XLFG係Philip J. Harris博士(University of Auckland,NZ)所贈。取自白鳳豆(Canavalia ensiformis )(巨豆(Jack bean))之刀豆球蛋白A(Con A,C5275)及脂多醣(LPS,L6529)係得自Sigma Chemical Co. (Sigma,St. Louis,MO)。脾細胞培養物之完全培養基係添加10% FCS(Hyclone,Logan,UT)、0.05mM 2-巰基乙醇及1%青黴素-鏈黴素(Sigma)之RPMI 1640(GIBCO,Grand Island,NY)。Sephacryl S-200係購自GE Healthcare，DEAE-纖維素係購自Sigma-Aldrich，而透析膜係購自SPECTRUM。

實例2：葉及莖切片之組織化學分析

使用剃刀切割葉及莖之切片，並進行組織化學檢驗。使用顯色劑間苯三酚-HCl偵測木質化次生細胞壁。使用包埋於H₂ O及0.1M氫氧化銨之切片及分離細胞壁，檢驗細胞壁在UV照射下之自體螢光。使用碘化鉀偵測細胞壁及黏液製備物中之澱粉，並以麗春紅(Ponceau Red)偵測其中之蛋白。

實例3：細胞壁醇不可溶性殘餘物及黏液之分離

根據實例且如圖1所示，在4℃下，分別自葉及莖取得細胞壁製備物。切除含有木質化次生細胞壁之組織，以增加含有非木質化初生細胞壁之組織比例。使收集之組織(30g)在含有0.05%2-巰基乙醇之50mM HEPES-KOH緩衝液(pH 7.2)中進行均質化。使該均質物通過Miracloth過濾，並以相同之HEPES-KOH緩衝液清洗。加入液態氮，並將該殘餘物研磨成細粉。以麗春紅2R使自細胞釋出之蛋白顯像。接著使該等細粉與冰水混合，進行超音波處理(1分鐘)，離心，再小心移除上清液。另外重複此流程3次。通過Miracloth過濾以回收沈澱物，再以水及70%乙醇徹底清洗，直到濾液變得澄清為止。接著以100%乙醇清洗殘餘物，再以甲醇及正戊烷清洗，再在真空下於矽膠上隔夜乾燥。

溫和刮擦解凍之葉及莖的表面以收集黏液，接著在含有0.05% 2-巰基乙醇之70%乙醇中進行均質化。對該均質物進行超音波處理(2分鐘)，再於4℃下對水進行透析24小時。接著以凍乾回收黏多醣。以鹼處理完成該黏液多醣之去乙醯化。在其中一種方法中，其係在室溫下，於1% NaBH₄ 之存在下，以1M NaOH處理樣本而除去乙醯基，接著再以冰醋酸將懸浮液中和至pH 5。以透析及凍乾收集去乙醯化之黏液多醣。

實例4：污染性澱粉之移除

將乾燥之細胞壁製備物(200mg)懸浮於5mM tris-馬來酸緩衝液(pH 6.9)中，並加熱(85℃，5min)以使澱粉顆粒成為膠狀。在冷卻至40℃後，加入在含有2mM CaCl₂ 之15mM tris-馬來酸緩衝液(pH 6.9，25mL)中的豬胰澱粉酶(6300單位，Sigma)，再使該懸浮液在40℃下共置1小時。以500g離心該混合物，並除去上清液。使該沈澱物懸浮於5mM tris-馬來酸緩衝液中，進行音波處理，過濾至尼龍網上(孔洞大小11μm)，再以Milli-Q水清洗，直到濾液變得澄清為止。以一滴KI試驗小部分之殘餘物，以指出無澱粉之存在。以乙醇、甲醇、及正戊烷清洗，使用溶劑交換，使細胞壁之沈澱物在尼龍網上乾燥。

實例5：細胞壁聚合物之系列萃取

如前所述，使用50mM CDTA(pH 6.5)、Na₂ CO₃ ＋25mM NaBH₄ 、1M KOH＋25mM NaBH₄ 、及4M KOH＋25mM NaBH₄ 進行一系列之萃取，對去澱粉之細胞壁(50mg)進行分級分離。剩餘之不可溶性殘餘物係為α-纖維素級份。

實例6：霍山石斛多醣(DHPS)之製備

根據實例且如圖2a所示，在95%乙醇(100mL)中研磨霍山石斛之葉及莖。過濾該混合物，並以乙醇(100mL)清洗該固體部分。在4℃下，於冷蒸餾水(100mL)中攪拌該殘餘物1小時。離心(4000rpm，30分鐘)除去剩餘之沈澱物，再以另一份之水(100mL)再次進行萃取。對結合之上清液進行凍乾以產生DHPS，其係霍山石斛之部分乙醯化黏液葡甘露聚糖。

實例7：DH002、DH005、及DH015-DH019之製備

根據實例且如圖2a所示，將DHPS(1g)溶於蒸餾水(2mL)中，並在Sephadex G-50管柱上(2.5×60cm)以水沖提而進行分級分離。如圖2a所示，“NP”代表正相，SiO₂ 管柱；“RP”代表反相C18管柱。收集活性最強之級份DH002 (0.66g)，並在反相C18管柱上(2.5×20cm)以H₂ O/MeOH梯度(0%、20%、50%、及100%)沖提而進一步分級分離。在凍乾後取得樣本DH005 及DH015-DH019 。

實例8：DH006、DH007、及DH020-DH022之製備

根據實例且如圖2b所示，在100% MeOH(50mL)中研磨取自霍山石斛之莖及葉的乾燥DHPS粉末(1g)。震盪該混合物30分鐘，接著以3000rpm離心10分鐘，以進行過濾。重複此流程兩次。在減壓條件下濃縮該上清液以產生固體DH020 樣本。以50%MeOH/H₂ O萃取該殘餘物；接著對該萃取液進行酵素(半纖維素酶)水解並凍乾以產生DH021 。將該殘餘物溶於水中，再對其進行酵素(半纖維素酶)水解並凍乾以產生DH022 。樣本DH006 係DH021 及DH022 之組合。在室溫下，於甲醇水溶液中，以NaOH對DH006 進行皂化30分鐘，產生DH007 ，其在反相C18管柱上純化後產生DH023 。

實例9：Man011-Man022之製備

圖3說明甘露糖寡聚物Man011-Man022供活性分析之製備的實例。對高分子量甘露聚糖進行酵素(半纖維素酶)萃取、大小排除(Sephadex G-10)及層析分離。在室溫下，於甲醇水溶液中，以NaOH進行皂化30分鐘。在室溫下，於吡啶中，以Ac₂ O進行乙醯化4小時。

實例10：霍山石斛多醣(DHPS)之酵素水解

在37℃下，於100mL蒸餾水中，以半纖維素酶(終濃度0.05%)，對乾燥之DHPS(1.6g)進行酶切消化12小時。煮沸2分鐘以中止反應。在4℃下以8000rpm對該粗製混合物進行離心10分鐘。收集上清液並凍乾以產生水解產物(1.47g)。

實例11：甘露糖寡聚物Man013之製備

在室溫下攪拌16小時後，高分子量甘露聚糖之粉末(Manolo ,2g)稍微溶解於100mL之蒸餾水中。在4℃下，以10,000rpm對此混合物進行離心10分鐘，接著拋棄沈澱物。在該上清液中，加入半纖維素酶以達到終濃度0.05%。在37℃下共置該混合物12至16小時，接著煮沸2分鐘以中止該酵素反應。在離心後(10,000rpm，10分鐘，4℃)，以具有1K道耳吞之分子量截斷值(MWCO)的膜，在水中進行透析。在使用前，將該凍乾之寡甘露糖苷Man013 (以質譜分析估計含有5-10聚合度)貯存在4℃下。

實例12：寡醣及多醣之去乙醯化

在室溫下，於蒸餾水中，以化學計量含量之NaOH(或MeONa)，處理取自霍山石斛之寡醣及多醣或是甘露聚糖30分鐘。對該皂化產物進行純化(如，在反相C18管柱上)並凍乾以產生所欲之去乙醯化寡醣及多醣，諸如，DH007 及Man020 。

實例13：寡-及多醣之乙醯化

在室溫下，根據預期之理論乙醯化程度(10%、20%、最多100%)，使甘露聚糖寡醣與適當量之醋酸酐在吡啶中一同攪拌4小時。在減壓條件下濃縮該混合物，再對該乙醯化產物進行純化(如，在反相C18管柱上)並凍乾以產生所欲之(部分)乙醯化寡醣。

實例14：細胞壁及黏液之中性單醣組成

在121℃下，以4M三氟乙酸(TFA)，分別對去澱粉之細胞壁製備物(10mg)或個別之細胞壁級份(5mg)或黏液製備物(5mg)進行水解1小時。冷卻混合物，再在減壓條件下除去TFA。以50%甲醇水溶液清洗該酸水解物，接著在真空下進行乾燥。在室溫下，於MeOH中，使用NaBH₄ (80mg)處理30分鐘，使該水解物中之單醣進行還原。重複此流程3至5次以確保單醣完全還原為醛醣醇。以濃HCl及MeOH清洗該混合物，接著在真空下進行乾燥。在80℃下，使用乙酸酐(於吡啶中)(1:2)，對該還原產物醛醣醇進行乙醯化2小時，接著在25℃下共置16小時。以氯仿/2M HCl(2:1)萃取該等過乙酸醛醣醇，再以飽和NaHCO₃ 小心清洗。在除去氯仿後，以GC-MS分析判定過乙酸醛醣醇之組成。

實例15：細胞壁多醣之鍵結分析

將各個細胞壁級份(10mg)溶於DMSO(2mL)中，以NaH處理2分鐘並持續攪拌，再加入冰MeI(1mL)。在室溫下攪拌16小時後，添加氯仿/水(2:1)以分離懸浮液中之甲基化多醣。以10% Na₂ S₂ O₃ 及水清洗有機相，接著在減壓條件下濃縮，以產生甲基化多醣之粗製產物。IR及¹ H NMR分析指出並無羥基之存在。根據上述之流程，以TFA對該甲基化多醣產物進行類似之消化，以NaBH₄ 還原，再以Ac₂ O/吡啶進行乙醯化，以產生甲基化醛醣醇全乙酸酯。以GC-MS分析判定甲基醛醣醇全乙酸酯之組成。

實例16：細胞壁及細胞壁級份之糖醛酸組成

使用間-羥基二苯醚作為色素原，根據先前報導之方法測定細胞壁及各個細胞壁級份中之總糖醛酸含量。以HPAEC-PAD(Dionex,Sunnyvale,CA,USA)，在CarboPAC-1管柱上，以含有100mM NaOH之150mM NaOAc均等溶液梯度溶析，使用0.25mL min^-1 之流速，分離並定量酸水解物中之半乳糖醛酸(GalA)、葡萄糖醛酸(GlcA)及4-O -甲基葡萄糖醛酸(MeGlcA)。

實例17：酵素水解

以不同之酵素處理該等多醣級份，以釋出寡醣進行進一步之分析。煮沸2分鐘以中止酵素反應。在50℃下，以取自黑麴菌之聚半乳醣醛酸酶(50U)(EC 3.2.1.15)及100mM NaOAc(pH 4.0,200μL)，對葉及莖壁級份之CDTA級份(2mg)處理16小時。在60℃下，以內切 -(1→4)-β-D-木聚醣酶(45U，EC 3.2.1.8)及100mM NaOAc(pH 6.0，200μL)，對葉及莖壁製備物之1M KOH級份(2mg)處理1小時。在37℃下，以內切 -(1→4)-β-D-葡聚醣酶(EC 3.2.1.4，5U)及50mM甲酸銨(pH 5.0，200μL)，對葉及莖壁製備物之4M KOH級份(2mg)處理16小時。藉由取自黑麴菌之α-L-阿拉伯糖苷酶(EC 3.2.1.55)的處理，在木聚醣酶之酶切消化物中(壁製備物之1M KOH級份)，使阿拉伯糖基殘基自木寡醣中移除，且對該內切-(1→4)-β-D-木聚醣酶之酶切消化物進行凍乾，將其溶於100mM NaOAc(pH 6)中，再在40℃下與α-L-阿拉伯糖苷酶(10U)共置24小時。

在40℃下，以內切 -(1→4)-β-D-甘露聚醣酶(EC 3.2.1.78，5U)及100mM NaOAc(pH4，200μL)，對莖黏液製備物處理16小時。在37℃下，於醋酸鈉緩衝液(100mM，pH 4.5)中，以內切-(1→4)-β-D-甘露聚醣酶(黑麴菌，Megazyme)，對級份B之去乙醯化葡甘露聚醣進行酶切消化24小時，對每1mg之去乙醯化葡甘露聚醣使用5μL之酵素。在37℃下，於馬來酸鈉緩衝液(100mM，pH 6.5)中，以對β-1,4-甘露糖基鍵結具有專一性之β-甘露糖苷酶(糞肥纖維單胞菌(C. fimi )，Megazyme)進行酶切消化24小時，對每1mg之去乙醯化葡甘露聚醣使用5μL之酵素。在37℃下，於乙酸銨緩衝液(50mM，＋1mM ZnCl₂ ，pH 5.5)中，以α-1,2,3,6-甘露糖苷酶(巨豆，Sigma)進行酶切消化24小時，對每1mg之去乙醯化葡甘露聚醣使用5μL之酵素。

實例18：GC-MS分析

以BPX-70管柱(SGE Analytical Science Pty Ltd.,Victoria 3134,Australia)，在PolarisQ離子阱GC-MS/MS系統(Thermo Fisher Scientific,Inc,Waltham,MA 024253,USA)上，分離乙酸醛醣醇及部分甲基化之乙酸醛醣醇。以每分鐘50℃之速度使烤箱溫度自38℃增加至150℃，接著以每分鐘3℃之速度使其增加至230℃，再增加至260℃ 5分鐘，其載體氣體(He)之流速為1mL/min。將峰區域校正至mol%而完成定量。

實例19：HPAEC-PAD分析

根據實例，圖8說明自霍山石斛葉細胞壁製備物之4M KOH級份以內切 -(1→4)-β-D-葡聚醣酶處理而釋出之XG寡醣的HPAEC-PAD層析圖譜(左側組)數據。峰之指定係根據XG寡醣標準物之停滯時間。G:Glc；X:Xyl-Glc；L:Gal-Xyl-Glc；F:Fuc-Gal-Xyl-Glc；DH-Ac亦稱為DH023。

分離XG寡醣，並使用Dionex BioLC系統(Dionex,Sunnyvale,CA,USA)，以已知之標準物，由HPAEC-PAD定性。使用CarboPac PA1分析管柱(4mm×250mm)以及CarboPac PA1保護管柱(4mm×50mm)。在110分鐘內，以1mL/min之流速，使用50mM NaOAc＋100mM NaOH(溶劑A)至100mM NaOAc＋100mM NaOH(溶劑B)之線性梯度，分離XG寡醣。在各輪操作之後，以溶劑B清洗該管柱10分鐘，以300mM NaOH(溶劑C)清洗5分鐘，再以溶劑A清洗30分鐘。

實例20：質譜分析

根據實例，圖9說明自霍山石斛葉細胞壁製備物之4M KOH級份，以內切 -(1→4)-β-D-葡聚醣酶之處理釋出之XG寡醣的MALDI-TOFMS質譜(右側組)數據。峰之指定係根據XG寡醣標準物之停滯時間。G:Glc；X:Xyl-Glc；L:Gal-Xyl-Glc；F:Fuc-Gal-Xyl-Glc。

使用BioTOF Ultraflex II(Bruker Daltonics,Billeriaca,MA 01821,USA)測定寡醣鈉加成物[M＋Na]⁺ 之分子量。使含有寡醣之酵素水解物與10mM之2,5-二羥基苯甲酸及10mM之NaCl以5:5:3之比例混合。在MS模式中，該光譜係由平均2000-3000次拍攝而累積。

根據實例，圖20說明含有66%(Man)₆ ＋34%(Man)_n ()之甘露寡醣的例示性質譜。

實例21：NMR光譜分析

以5mm Cryoprobe DCI¹ H/¹³ C，在Bruker ADVANCE 600MHz NMR光譜儀上(Bruker BioSpin GmbH,Rheinstetten,Germany)記錄NMR光譜。將樣本溶於1mL之D₂ O中。以相對HOD信號(δ_H 4.8於25℃下)或是甘露吡喃糖之H-1/C-1信號(δ_H 4.71/δ_C 100.6)的δ值提供化學位移。在50℃下記錄HSQC光譜，以使HOD相高磁場位移約0.2ppm，因此揭露(1→4)-鍵結性未乙醯化β-Manp 殘基之隱藏信號。以100及70ms之混合時間，以及3及2s之弛豫延遲，分別記錄ROESY及TOCSY光譜。

根據實例，圖13係級份B多醣在D₂ O中之光譜，其顯示Manp /2-O -AcManp /3-O -AcManp 之比例=66:19:15。

根據實例，圖21顯示自霍山石斛製備之樣本DH018 的例示性¹ H NMR(400MHz，D₂ O)。圖22顯示部分乙醯化甘露寡醣Man018 的例示性¹ H NMR(400MHz，D₂ O)。圖23顯示甘露寡醣Man020 的¹ H NMR(400MHz，D₂ O)。

實例22：相關NMR

根據使用相關分析之實例，圖17係級份B之異核多鍵相關(HMBC)光譜的說明數據圖。組群(a)顯示δ 5.55-4.45區域中之交叉峰，而組群(b)顯示δ 4.30-3.30區域中之交叉峰。交叉峰1，H-2(Man)/C-3(Man)；2，H-2(Man₃₄ )/C-3(Man₃₄ )；3，H-4(Man₃₄ )/C-5(Man₃₄ )；4，H-2(Man)/C-4(Man)；5，H-4(Man₃₄ )/C-3(Man₃₄ )；6，H-3(Man₂₄ )/C-5(Man₂₄ )；7，H-4(Man₂₄ )/C-3(Man₂₄ )；8，H-4(Man)/C-3(Man)；9，H-3(Man₂₄ )/C-2(Man₂₄ )；10，H-4(Man)/C-5(Man)；11，H-3(Man)/C-4(Man)；12，H-4(Glc)/C-3(Glc)；13，H-3(Glc)/C-4(Glc)；14，H-5(Man₃₄ )/C-4(Man₃₄ )；15，H-2(Glc)/C-3(Glc)。所有之該等醣皆在骨架中以β-(1→4)鍵結相連。Man₂₄ 代表2-O -乙醯化Man，而Man₃₄ 代表3-O -乙醯化Man。

根據實例，圖18說明級份B之旋轉核奧弗豪澤效應光譜檢驗(ROESY)的光譜數據，其顯示葡甘露聚醣中之糖苷內及糖苷間相關性(以引號標示)。

實例23：HPSEC分析

根據實例，圖14說明級份B中多醣在SEC-1000管柱(組群a)及G-3000管柱(組群b)上所取得之HPSEC分析折射率分佈數據。

實例24：以DOSY測定分子量

將級份B之樣本(1mg)溶於400μL之D₂ O中，再以DOSY測定多醣組成份之平均分子量。自普魯蘭多醣標準物測定其流體動力學半徑值。DOSY實驗係使用納入雙極性正弦梯度脈衝之經激發回波序列而進行。另外，藉由預飽和而抑制HOD信號。梯度強度係使用32個步驟，自2%以對數增量至95%之最大梯度強度。將擴散時間設定在100及700ms間。將梯度脈衝及縱向渦流分別設定為3ms及25ms。

根據實例，圖15係級份B之DOSY光譜檢驗的說明數據圖。9.7KDa之分子量係自方程式D=8.2×10^-9 MW^-0.50 (m² s^-1 )，以-10.08之擴散係數推論產生。

實例25：級份B多醣結構

根據實例，圖19說明級份B多醣之試驗性部分結構數據。

實例26：SpMC(小鼠脾單核細胞)之製備

自國家實驗動物中心(台北，台灣)購買六至八週齡之公Balb/c小鼠，並以斷頸致死。使脾臟壓過無菌之不鏽鋼網(100網目)，在以紅血球裂解緩衝液(Sigma)消耗紅血球後，再以HBSS(GIBCO)清洗該研壓通過之懸浮液3次。最後，使用台盼藍拒染法，以血球計數器計數活細胞。在37℃，於溼潤之5% CO₂ 下，在10% RPMI-1640中培養單細胞懸浮液(每毫升5×10⁶ 個細胞)。

實例27：細胞毒性/增殖分析

在96孔組織培養盤中，以ConA(2μg/mL)、市售之甘露聚糖類似物(蒟蒻葡甘露聚醣或象牙果仁甘露聚糖)、或是不同之多醣級份(50μg/mL)直接對小鼠脾細胞(每孔5×10⁵ 個細胞)進行刺激60小時。隨後，使用Celltiter 96水性單一溶液細胞增殖分析套組(Promega,Madison,WI)，根據製造商之指示，以MTS分析檢驗細胞增殖。簡言之，將20μL之MTS溶液加至各孔中。在37℃下共置4小時後，使用試驗盤視讀器(SpectraMax M2,Molecular Device,Sunnyvale,California)取得490nm之吸收值。將控制組細胞在490nm之光學密度(OD₄₉₀ )定義為100%。以LAL試驗(PyrochromeKit,Cape Cod Associates,Falmouth,MA)對多醣製備物進行例行篩選，以確保無內毒素之污染。其顯示各個多醣級份之內毒素強度(EU/mg)()遠低於具脂多醣之細胞培養物()。

實例28：以ELISA測定細胞激素

使用Quantikine小鼠ELISA套組(R&D Systems,Minneapolis,MN)，根據製造商之操作流程，分析細胞培養物上清液中之IL-1a、IL-6、IL-10、IFN-γ、G-CSF及GM-CSF濃度。在24孔組織培養盤中，於50μg/mL濃度之甘露聚糖、葡甘露聚糖、或不同多醣級份的存在下，培養小鼠脾細胞(5×10⁶ 細胞/孔)。使用終濃度2μg/mL之Con A作為陽性控制組。在激發48小時後，收集培養物上清液，並貯存在-80℃下直到進行ELISA分析為止。在此實驗中，所有之數據點皆係三重獨立實驗之平均值，且所示之值為平均值±標準差。

實例29：由RT-PCR評估推論細胞激素表現

自BALB/c小鼠(公鼠，6-8週齡)取出脾細胞，並以級份A-F(各100μg/mL)處理12小時。在共置期結束時，收集細胞沈澱物及上清液兩者。自細胞沈澱物中萃取RNA，並將其轉化成為cDNA。在2%凝膠上進行凝膠電泳分析取自PCR之產物以顯像經表現之細胞激素。

實例30：細胞激素之RT-PCR評估

根據圖4所示之實例，其顯示以RT-PCR評估經不同樣本處理12h之培養小鼠巨噬細胞RAW264.7之細胞激素(IFN-γ、TNF-α、IL-10、G-CSF、GM-CSF、及M-CSF)的說明數據圖。各道之內容如下：第1道，未處理細胞；第2道，Con A(4μg/ml)；第3道，霍山石斛多醣粗萃取物(DHPS，100μg/ml)；第4道，1,4-β-D-甘露雙醣((Man)₂ ，100μg/ml)；第5道，1,4-β-D-甘露三醣((Man)₃ ，100μg/ml)；第6道，1,4-β-D-甘露四醣((Man)₄ ，100μg/ml)；第7道，1,4-β-D-甘露五醣((Man)₅ ，100μg/ml)；第8道，含有66%(Man)₆ ＋34%(Man)_n 之1,4-β-D-甘露寡醣混合物(n，100μg/ml)；第9道，半乳糖基-甘露雙醣(100μg/ml)；第10道，半乳糖基-甘露三醣(100μg/ml)；第11道，二-半乳糖基-甘露五醣(100μg/ml)。

實例31：G-CSF之評估

根據實例且如圖5所示，以RT-PCR評估經不同樣本處理12小時之小鼠脾細胞的G-CSF。第1道，未處理細胞；第2道，Con A(4μg/ml)；第3道，霍山石斛多醣粗萃取物(DHPS，100μg/ml)；第4道，1,4-β-D-甘露雙醣((Man)₂ ，100μg/ml)；第5道，1,4-β-D-甘露三醣((Man)₃ ，100μg/ml)；第6道，1,4-β-D-甘露四醣((Man)₄ ，100μg/ml)；第7道，1,4-β-D-甘露五醣((Man)₅ ，100μg/ml)；第8道，含有66%(Man)₆ ＋34%(Man)_n 之1,4-β-D-甘露寡醣混合物(，100μg/ml)；第9道，半乳糖基-甘露雙醣(100μg/ml)；第10道，半乳糖基-甘露三醣(100μg/ml)；第11道，二-半乳糖基-甘露五醣(100μg/ml)。

根據實例，圖6係評估G-CSF蛋白表現量之數據。以個別樣本對小鼠巨噬細胞RAW264.7進行處理12小時。收集培養基，並使用ELISA套組分析G-CSF生產。下列者係各道之敘述：第1道，未處理細胞；第2道，霍山石斛多醣粗萃取物(DHPS，100μg/ml)；第3道，1,4-β-D-甘露雙醣((Man)₂ ，100μg/ml)；第4道，1,4-β-D-甘露三醣((Man)₃ ，100μg/ml)；第5道，1,4-β-D-甘露四醣((Man)₄ ，100μg/ml)；第6道，1,4-β-D-甘露五醣((Man)₅ ，100μg/ml)；第7道，含有66%(Man)₆ ＋34%(Man)_n 之1,4-β-D-甘露寡醣混合物(，100μg/ml)；第8道，半乳糖基-甘露雙醣(100μg/ml)；第9道，半乳糖基-甘露三醣(100μg/ml)；第10道，二-半乳糖基-甘露五醣(100μg/ml)。

根據實例，圖7說明甘露糖寡聚物對於G-CSF生產之劑量及時間依賴的反應。左側組顯示經不同濃度之含有66%(Man)₆ ＋34%(Man)_n 之1,4-β-D-甘露寡醣(1-50μg/ml)處理6小時的小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞。收集培養基，並使用ELISA套組分析G-CSF生產。右側組顯示經30μg/ml之含有66%(Man)₆ ＋34%(Man)_n 之1,4-β-D-甘露糖寡聚物處理0至3小時的小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞。處理後，加工細胞以進行G-CSF基因表現之RT-PCR偵測。

根據實例，圖8說明G-CSF蛋白表現量之評估數據。以代表性樣本對小鼠巨噬細胞RAW264.7進行處理12小時。收集培養基，並使用ELISA套組分析G-CSF生產。最強效之樣本Man013 係以酵素(半纖維素酶)水解、透析(分子量截斷值=1000)、以及Sephadex G-10管柱上之層析而自Man010 (具有平均15DP之甘露聚糖)取得。

根據實例，圖11說明黏液多醣對於細胞激素及造血生長因子生成之劑量-反應關係數據。以Con A(2μg/mL)或莖黏液多醣(2-250μg/mL)激發小鼠脾細胞(5×10⁶ 個細胞)。在48小時之培育後，收集細胞培養物上清液，並使用ELISA套組分析(a)G-CSF及(b)GM-CSF生產。

儘管本發明之裝置及方法已以目前視為最為實際較佳之實例進行敘述，但須明瞭，該揭示內容並不須限於所揭示之實例。其係欲涵括申請專利範圍之精神及範圍內所包括之各種不同修飾及類似安排，該申請專利範圍之範圍應符合其最廣釋義，以使其涵括所有此等修飾及類似結構。本揭示內容包括下述申請專利範圍之任何及所有實例。

本專利或專利申請檔案含有至少一張以彩色製成之圖式。含彩色圖式之本專利或專利申請公開案之影本將在請求及交付必要費用後提供與智財局。本揭示內容之上述特徵及目的將可在參照下列之敘述並結合附呈之圖式閱讀時更為明瞭，該等圖式中之類似之參照數目代表類似之元件，且其中：

圖1說明自霍山石斛分離多醣之實例流程；

圖2說明製備DH001-DH023 以進行活性分析之實例流程；

圖3說明製備甘露糖寡聚物Man001-Man022 以進行活性分析之實例流程；

圖4顯示以RT-PCR針對經不同樣本處理12小時之培養小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞評估細胞激素(IFN-γ、TNF-α、IL-10、G-CSF、GM-CSF、及M-CSF)的實驗數據之實例圖；

圖5顯示以RT-PCR針對經不同樣本處理12小時之小鼠脾細胞評估G-CSF的實驗數據之實例圖；

圖6顯示評估G-CSF蛋白表現量之說明性數據之實例圖；

圖7顯示評估甘露糖寡聚物對於G-CSF生產之劑量及時間依賴反應之說明性數據之實例圖；

圖8顯示評估G-CSF蛋白表現量之說明性數據之實例圖；

圖9顯示以內切 -(1→4)-β-D-葡聚醣酶處理而自霍山石斛葉細胞壁製備物之4M KOH級份釋出之XG寡醣的HPAEC-PAD層析圖(左側組)及MALDI-TOF MS光譜(右側組)之說明性數據之實例圖；

圖10顯示取自莖黏液之葡甘露聚醣去乙醯化產物的HSQC光譜之說明性數據之實例圖；

圖11顯示黏液多醣對於細胞激素及造血生長因子生成之劑量-反應關係的說明性數據之實例圖；

圖12顯示以RT-PCR針對經不同藥物處理12h之小鼠脾細胞評估細胞激素(G-CSF、IL-10、IFN-γ、IL-6、GM-CSF、及M-CSF)的說明性數據之實例圖；

圖13顯示級份B多醣在D₂ O中之¹ H NMR光譜的說明性數據之實例圖，其顯示Manp /2-O -AcManp /3-O -AcManp 之比例=66:19:15；

圖14顯示級份B多醣在SEC-1000管柱(組群a)及G3000管柱(組群b)上之HPSEC分析折射率分佈的說明性數據之實例圖；

圖15顯示級份B之DOSY光譜檢驗的說明性數據之實例圖。9.7KDa之分子量係自方程式D=8.2×10^-9 MW^-0.50 (m² s^-1 )，以-10.08之擴散係數推論產生；

圖16顯示級份B之示差NOE光譜的說明性數據之實例圖，其顯示β-糖苷鍵結形式之甘露糖苷單元；

圖17顯示級份B之HMBC光譜的說明性數據之實例圖；

圖18顯示級份B之ROESY的說明性數據之實例圖，其顯示葡甘露聚醣中之糖苷內及糖苷間相關性(以引號標示)；

圖19顯示級份B多醣之試驗性部分結構的說明性數據之實例圖；

圖20顯示含有66%(Man)₆ ＋34%(Man)_n ()之甘露寡醣的質譜之實例圖；

圖21顯示自霍山石斛製備之樣本DH018 的¹ H NMR(400MHz，D₂ O)之實例圖；

圖22顯示部分乙醯化甘露寡醣Man018 的¹ H NMR(400MHz，D₂ O)之實例圖；及

圖23顯示甘露寡醣Man020 的¹ H NMR(400MHz，D₂ O)之實例圖。

Claims (14)

1. 一種具有免疫調節功效之霍山石斛(D.huoshanense)多醣組合物，其包含具有β -(1→4)-D-Glcp及β -(1→4)-D-Manp之葡甘露聚醣，且甘露糖之2-或3-位置有部分乙醯基化，其中該葡甘露聚醣具有大於或等於6之聚合度。
2. 根據請求項1之多醣組合物，其具有如下式之部分結構：
3. 根據請求項1或2之多醣組合物，其中該免疫調節功效係指誘發有益生長因子之表現。
4. 根據請求項1或2之多醣組合物，其中該免疫調節功效係指誘發細胞激素之表現。
5. 一種霍山石斛多醣組合物用於製備具有免疫調節功效之藥物的用途，其中該霍山石斛多醣組合物如請求項1或2所定義。
6. 根據請求項5之用途，其中該免疫調節功效係指誘發有益生長因子之表現。
7. 根據請求項5之用途，其中該免疫調節功效係指誘發細胞激素之表現。
8. 一種醫藥組合物，其至少包含如請求項1或2所定義之霍山石斛多醣組合物以及醫藥可接受之載體。
9. 根據請求項8之醫藥組合物，其中該組合物係經口服投予。
10. 根據請求項8之醫藥組合物，其中該組合物係經注射投 予。
11. 根據請求項8之醫藥組合物，其中該組合物可造成有益生長因子或細胞激素之增加。
12. 根據請求項11之醫藥組合物，其中該細胞激素係選自IFN-γ、IL-10、IL-6及IL-1α。
13. 根據請求項11之醫藥組合物，其中該有益生長因子係為GM-CSF或G-CSF。
14. 一種製備如請求項1之葡甘露聚醣之方法，其係包含使用半纖維素酶水解霍山石斛多醣(DHPS)，其中該DHPS係經由以水萃取霍山石斛的莖及葉的乙醇不可溶部分而得。