CN108912236A - 一种具有抗肿瘤作用的霍山石斛精制多糖及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有抗肿瘤作用的霍山石斛精制多糖及其制备方法，本发明中霍山石斛精制多糖是采用霍山石斛茎为原料，经过都提脱色除杂、水提得水提物、再乙醇醇沉，并通过α‑淀粉酶酶解辅助提取，制备获得，本发明中的霍山石斛精制多糖具有良好抗肿瘤效果，主要能够抑制肿瘤细胞的生长与增殖来发挥其抗肿瘤的作用，没有毒副作用，有利于肿瘤病人的综合治疗，本发明从霍山石斛多糖的性质出发，实现了不含淀粉和蛋白质的高纯度霍山石斛抗肿瘤药剂的制备，本发明仅使用乙醇溶液，减少了对环境的污染；α‑淀粉酶的加入以益和的方式有效水解淀粉，高pH下阴离子树脂对多糖和蛋白质实现了差异化吸附，大大提高了药剂的纯度。

Description

一种具有抗肿瘤作用的霍山石斛精制多糖及其制备方法

技术领域

本发明属于植物药物技术要域，具体涉及一种具有抗肿瘤作用的霍山石斛精制多糖及其制备方法。

背景技术

恶性肿瘤是严重危害人类健康和生命安全的一类重大疾病，随着生态环境遭受破坏，人口老龄化如剧、人类不健康的生活方式等问题凸显，肿瘤发病率及死亡率持续上升，目前已成为人类的主要死因，严重危害人类健康和生命安全。世界卫生组织国际癌症研究所在Globocan发布的数据显示，2012年全球新增癌症病例数14707万例，死亡820万例。其中中国2012年的新增癌症病例数为306.5万例，死亡220.6万例，预计今后20年新发病例数将增加约70％，至 2025年全球癌症新发病例数将达到1900万例。

目前，癌症在世界上仍是一种难治之症，常见的癌症的治疗方法以手术治疗、放射治疗和化学治疗为主，具有毒副作用大、疗效不确定、选择性差、靶向性不强以及癌细胞耐药等许多问题，治疗的效果受到了很大的限制，因此开发长效、缓释和靶向性抗肿瘤药物是当今研究的重点。中药是我国的医学宝库，中药往往具有多靶点、低毒性、作用持久等特点，中药单独或辅助西药治疗肿瘤在提高机体免疫力、延长生存期、降低复发转移率及减轻副作用等方面有着积极的意义。

霍山石斛为兰科石科国多年生草本植物，主产于中国安徽西南部大别山区的霍山县，又名皇帝草，足见之珍贵。其根茎不仅可入药，还是一种名贵的滋补品，具有生津养胃、明目护肝以及抗肿瘤等功效。明代李时珍在《本草纲目》中记载:“石斛甘平无毒。主治伤中，除痹下气，补五脏虚劳贏瘦，强阴益精，久服厚肠胃，补内绝不足，平胃气，长肌肉，逐皮肤邪热痱气，脚膝疼冷痹弱。定志除惊，轻身延年，益气除热，治男子夏脚软弱，健阳。逐皮肤风痹，骨中久冷，补肾益力，壮筋骨，暖水脏，益智清气，治发热自汗。”因此，霍山石斛对人体有着极其重要的保健功效。药理学研究发现，霍山石斛中含有多糖，生物碱、酚类和各种微量元素，其中多糖的活性十分显著，具有抗肿痛、抗氧化、免疫刺激以及抗白内障等多种功能活性。

因此对霍山石斛茎内多糖成分的提取是非常重要的，目前对植物提取的传统技术会出现对环境污染大，提取纯度低以及对提取物内部结构的破坏。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有抗肿瘤作用的霍山石斛精制多糖及其制备方法，用以解决现有技术的肿瘤治疗方法中毒副作用大、疗效不确定、选择性差、靶向性不强，使得治疗效果受到很大限制的问题，同时解决现有技术制备多糖时，对环境污染大、多糖提取纯度低、以及在提取多糖时对多糖内部结构造成破坏的问题。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下，一种具有抗肿瘤作用的霍山石斛精制多糖，其特征在于：所述霍山石斛精制多糖是从兰科斛属植物霍山石斛的茎提取的葡萄糖、甘露糖以T-Glc、1,4-Man、1,4-Glc与1,4,6-Man糖苷键组成的生物大分子，平均分子量为1.2337×107Da，所述葡萄糖与甘露糖比例范围为1:1.6-1:5.3。

优选的，霍山石斛精制多糖可用于制备抗肿瘤药物和辅助抗肿瘤保健品，霍山石斛精制多糖具有广谱抗肿瘤作用，可以作为抗肿瘤药物用于肿瘤病人的治疗。

优选的，所述抗肿瘤药物和辅助抗肿瘤保健品的剂型为浸膏、片剂、胶囊、口服液、颗粒剂或冲剂。

优选的，霍山石斛精制多糖可与用于抗肿瘤常用临床用药药顺铂、紫衫醇、 5-氟尿嘧啶和环磷酰胺联合使用，能够增强抗肿瘤作用，增效作用显著。

一种具有抗肿瘤作用的霍山石斛精制多糖制备方法，包括以下操作步骤：

(1)将新鲜霍山石斛鲜条的茎经干燥后进行粉碎或干燥的茎及其制品进行粉碎，经80目筛网过筛后，以体积浓度为95％的乙醇作为提取溶剂，按1:10的料液比进行脱色脱脂，每次4h，共提取4次，双层中性滤纸抽滤风干后得到脱色脱脂粉末；

(2)将脱色脱脂粉来按照1:40的料液比与蒸馏水混合，80℃搅拌加热浸提 1h,共3次，合并得水提取物；

(3)将步骤(2)获得的水提取物中加入适量α-淀粉酶1μL/120mL，60℃条件下搅拌酶解1h，除去淀粉，得酶解水提取混合物；

(4)将所得酶解水提取物浓缩离心，弃去沉淀物，得酶解提取液；

(5)于酶解提取液中加入95％乙醇，使其终浓度为80％，醇沉12h，离心得醇沉物；

(6)取醇沉物，经适量pH 8.0的Tris·HCI缓冲液溶解后，上阴离子交换树脂DEACellulose DE-52柱，收集缓冲液洗脱部位，洗脱部位适当浓缩后经葡聚糖凝胶SephadG-25蒸馏水脱盐、终浓度80％乙醇醇沉后冷冻干燥得霍山石斛茎精制多糖即为抗肿瘤药剂。

优选的，具体操作参数如下：

步骤(1)的具体操作参数是：打粉机电机转速22000rpm/min，粉碎程度50-300 目，粉碎后将粉末用80目筛网过筛，保存待用；脱色脱脂所用乙醇浓度为95％，其料液比为1:10，脱色次数为4次，每次1h，25℃静置脱色；过滤采用双层中速滤纸抽滤；

步骤(2)的具体操作参数是：脱色脱脂粉末进行水提，其提取料液比为1:40，提取温度为80℃，提取次数为3次，每次1h，搅拌速度为600rpm/min，得水提取物；

步骤(3)的具体操作参数是：水提取物60℃恒温搅拌酶解，搅拌速度为 600rpm/min，α-淀粉酶的添加量为1μL/120mL淀粉醇与水提取混合物的比，酶解时间为1h；

步骤(4)的具体操作参数是：将酶解后的水提取物减压浓缩，温度为60℃，减压浓缩压力为-0.1Pa，浓缩至原体积的1/3。浓缩后，将浓缩液于高速离心机中离心，转速为10000rpm/min，离心时间为10min；

步骤(5)的具体操作参数是：乙醇醇沉的终浓度为80％，醉沉时间为12h；

步骤(6)的具体操作参数是：离心取醇沉物，25℃晾干后用适量PH8.0的 Tris·HCL缓冲液溶解，过中等碱性阴离了交换树脂DEAE cellulose DE-52柱， DE-52装柱的装填高度为12-25cm，醇沉物溶解后的上样体积为10mL，上样浓度为5mg/ml，待上样液体进入柱床后，以0.01mol/L pH 8.0的Tris·HCL缓冲液进行先脱，控制流速为5mL/min，人工收集洗脱液；将收集的洗脱液适当浓缩后过葡聚糖凝胶SephadexG-25脱盐，上样体积为300μL，上样浓度为 100mg/ml，以ddH₂O作为洗脱缓冲液进行洗脱；洗脱液收集加乙醇醇沉，乙醇醇沉的终浓度为80％，醇沉时间为12h；离心，取沉淀，用适量ddH₂O溶解，得乙醇醇沉物，真空冷冻干燥得霍山石斛精制多糖。

与传统技术相比，本发明产生的有益效果：

(1)本发明中霍山石斛精制多糖，具有良好的抗肿瘤效果，能够抑制肿瘤细胞的生长与增殖，同时没有毒副作用，有利于肿瘤病人的综合治疗，具有广阔的应用前景；

(2)本发明从霍山精制多糖的性质出发，利用利用α-淀粉酶酶解淀粉、蛋自质高温变性、阴离字树脂高pH条件下吸附蛋白质的特性，实现了不含淀粉和蛋白质的高纯度霍山石斛精制多糖的制备；

(3)本发明仅使用了乙醇溶液，未大量使用酸碱和其它有机试剂，减少了对环境的污染；

(4)α-淀粉酶的加入以一种比较益和的方式有效的水解淀粉，高pH下阴离子树脂对多糖和蛋白质实现了差异化吸附，大大提高了药剂的纯度；

(5)本发明中霍山石斛精制多糖的制备方法工艺简单，且所得的霍山石斛药剂多糖结构稳定，适合于大批量工业化生产。

附图说明

图1为本发明中霍山石斛精制多糖的制备工艺流程图。

图2为本发明中霍山石斛精制多糖的UV扫描图。

图3为本发明中霍山石斛精制多糖单糖组成分析。

图4为本发明中霍山石斛精制多糖HPGPC图谱。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体实施例对本发明做进一步的阐述。应当理解，此处所描述的具体事例仅仅用于解释本发明，但本发明并不仅限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特殊说明均能从公开商业途径获得。

实施例1

如图1工业流程所示，一种具有抗肿瘤作用的霍山石斛精制多糖，其通过以下方法制备得到：

1)将新鲜霍山石斛鲜条的茎经干燥后进行粉碎或干燥的基及其制品进行粉碎，经80目筛网过筛后，以体积浓度为95％的乙醇作为提取溶剂，按1:10(g/mL) 的料液比进行脱色脱脂，每次4h，共提取4次，双层中性滤纸抽滤风干后得到脱色脱脂粉末；

2)将脱色脱脂粉末按照1:40(g/mL)的料液比与蒸馏水混合，80℃搅拌加热浸提1h，共3次，合并得水提取混合物:

3)水提取混合物中加入适量α-投粉酶(组20mL.)、60℃条件下搅拌酶解1h 除去淀粉。得酶解水提取混合物；

4)将所得酶解水提取物浓缩离心，弃去沉淀物，得酶解提取液；

5)于酶解提取液中加入95％乙醇，使其终浓度为80％，醇沉12h，离心得醇沉物；

6)取醇沉物，经适量pH 8.0的Tris·HCI缓冲液溶解后，上阴离子交换树脂DEACellulose DE-52柱，收集缓冲液洗脱部位，洗脱部位适当浓缩后经葡聚糖凝胶SephadG-25蒸馏水脱盐、终浓度80％乙醇醇沉后冷冻干燥得霍山石斛茎精制多糖即为抗肿瘤药剂。

实施例2霍山石斛精制糖纯度鉴定，如图2

通过UV扫描实施例1所得霍山石斛精制多糖的纯度，具体方法如下：所用仪器：紫外可见分光光度计；糖液浓度：4mg/mL。

经检测，实施例1所得到的精制多糖的UV扫描，其中只有多糖的吸收峰，并没有看到蛋白和核酸的吸收峰。

实施例3霍山石斛精制多糖成分的鉴定，如图3、图4

通过高效液相色谱检测实施例1中的霍山石斛精制多糖组成，具体方法如下：

采取PMP柱前衍生法测定霍山石斛提取物中单糖组成情况。

取干燥后的霍山石斛精制多糖样品5mg，置于10mL安瓿管中，加入4mL 2M 三氟乙酸溶解，封管，110℃下水解4h，水解结束持溶液冷却至室温，将样品游液转移至旋蒸瓶内，减压蒸干，再加入4mL甲醇，减压燕干，重复4-5次以除去三氟乙酸。加入3mL超纯水溶解，得多糖水解液。

取每毫升含有内标盐酸氦基葡萄糖0.24mg的样品溶液400μL，加入0.5mol/L 的PMP甲醇溶液与0.3mol/L的NaOH溶液各400μL，混匀，在70℃条件下水浴反应100min。之后再加0.3mol/L的盐酸溶液500μL。混匀，用三氯甲烷洗涤 3次每次2mL，静置使其分层，弃去三氯甲烷液，水层离心后，上清液过膜，取 20μL注入高效液相色谱中，采用Agilent XDB-C18柱(250mm，4.6nm，0.5μm)，以乙腈-0.02M乙酸铵溶液(20：80)为流动相，在1mL/min、25℃、250nm条件下测定。

经检测，实施例1所得霍山石斛精制多糖主要由甘露糖和葡萄糖组成，甘露糖∶葡萄糖＝2.869∶1。

实施例4霍山石斛精制多糖体外抗肿痛活性分析、实验材料和药物

1.实验材料:DMEM高糖培养基、RPMI 1640培养基、澳洲胎牛血清、 DMSO、胰酶、双抗、MTT。

2.实验仪器：超净工作台、CO₂培养箱、酶标仪

3.受试药物及处理方法：把霍山石斛精制多糖给药前用完全培养基配置成所需浓度。阳性对照药物为5-氟尿嘧啶。

4.肿瘤细胞株：小鼠Lewis肺癌细胞(LLC)、人大细胞肺癌细胞(NC1-H460) 人肝癌细胞(HepG-2)、人结肠癌细胞(HT-29)、人胃腺癌细胞(AGS)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、人言颈癌细胞(Hela)。

二、实验方法

实验步骤为：细胞消化、计数、制成浓度为2×10个/mL的单细胞悬液，按种在96孔细胞培养板上，每孔100μL，96孔板边缘孔用无菌PBS填充，置于含5％CO₂的37℃培养箱中过夜。贴壁生长后，弃去旧培养基，对照组加入新鲜培养基100μL阳性对照组加入含抗肿瘤阳性对照的完全培养基100μL，实验组加入含不同浓度霍山石斛茎抗肿瘤药剂的完全培养基(800、400、200、100、 50、25ug/mL)100μL，设置每组3个复孔，在培养箱中培养48h。取出细胞培养板，每孔加入10μL(5mg/mL)MTT溶液，37℃遮光孵育4h。取出细胞培养板，吸出上清液，加入150μL DMSO终止反应，在避光条件下放置在摇床上震动10min，使紫色结晶物充分溶解。490nm波长下用酶标仪测定其OD值，计算细胞抑制率。

三、实验结果

霍山石斛精制多糖对Lewis肺癌细胞的抑制率及IC₅₀值。

具体实验结果如表1-7所示，由下表1-7可看出霍山石斛精制多糖能抑制小鼠Lewis肺癌细胞(LLC)、人大细胞肺癌细胞(NC1-H460)人肝癌细胞(HepG-2)、人结肠癌细胞(HT-29)、人胃腺癌细胞(AGS)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、人言颈癌细胞(Hela)的增殖，其中体外抗肿瘤作用存在明显的剂量效应或时间效应关系。说明该药剂具有良好的抗肿瘤活性，且具有较好的量效关系。

表1霍山石斛精制多糖对鼠Lowis肺癌细胞LLC的抑制作用

表2霍山石斛精制多糖对人大细胞肺癌细胞N 1-H460的抑制作用

表3霍山石斛精制多糖对人肝癌细胞HepG-2的抑制作用

表4霍山石斛精制多糖对人结肠癌细胞HT-29的抑制作用

表5霍山石斛精制多糖对人胃腺癌细胞AGS的抑制作用

表6霍山石斛精制多糖对人乳腺癌细胞MCF-7的抑制作用

表7霍山石斛精制多糖对宫颈癌细胞Hela的抑制作用

实施例5、霍山石斛精制多糖体内抗肿缩活性分析

实验方法：6周龄C57BL/6J雄性小鼠在SPF级动物实验室适应性喂养一周后，设正常组小鼠(Nomolcontrol)，12只，剩余小鼠接种LLC肺癌细胞，用1mL微量注射器抽取LLC细胞悬液接种于消毒后的C57BL/6J小鼠右腋下(实验最终随机选取肿瘤形态符合标准的小鼠)，每只各接种0.2mL(5x10⁶个/只)，并压迫注射点，防止细胞外漏，继续在SPF级条件下饲养。建模后继续饲养小鼠，除正常组外，10天后瘤块长至100mm³时，排除瘤块过大或过小者，将符合标准的荷瘤小鼠随机分为5组，每组12只，分别为模型组(Model control)阳性组(5-氟尿嘧啶，5-FU,20mg/kg·d)、霍山石斛茎精制多糖高剂量组、霍山石斛茎精制多糖中剂量组以及霍山石斛茎精制多糖低剂最组。开始灌胃给药，共灌胃30d，给药组采用中国药典人正常摄取推荐石斛用量低剂量6g/kg·d为标准，根据抗肿瘤药物药效学指导原则，给药组设高、中、低三个剂量，按5倍、10倍及20倍给药，溶剂为生理盐水。于最后一次给药后的第二天处死小鼠，称重，完整剥取实体瘤并称重，测量长短径。又解剖后肿瘤计算肿瘤体积、肿瘤增长率及抑瘤率:：肿瘤体积V＝1/2ab²；肿瘤增长率％＝肿瘤变化体积/时间·100％；抑制率％＝(1-给药组平均瘤重/对照组平均瘤重)·100％实验结果：霍山石斛精制多糖对C57BL/6J小鼠体内移植性小鼠肺癌LLC肿瘤体内生长抑制作用见表A，结果显示霍山石斛精制多糖能显著性抑制小鼠肺癌移植瘤的生长，具有明显的体内抗肿瘤作用(见表A)。

表A霍山石斛精制多糖对小鼠LLC肺癌转移瘤的体内抑制作用。

*p<0.05 by contrast with normal control mice,**p<0.01 by contrastwith normal control mice.

#p<0.05 by contrast with normal control mice,##p<0.051by contrastwith normal control mice.

通过霍山石斛精制多糖的抗肿瘤体内外实验表明，霍山石斛精制多糖可以提高机体免疫力，对多种肿瘤细胞均具有很好的抑制作用，且长期使用无不良反应，抗肿瘤疗效确切，安全无毒，可作为一种新型抗肿瘤药物，成为预防和治疗恶性肿瘤的辅助药物。

实施例6霍山石斛精制多糖的制备

1、霍山石斛精制多糖制成片剂

将实施例1所得精制多糖取25g与淀粉15g混勺，加10％淀粉浆5g制成软材，

加入硬脂酸镁0.25g，干淀粉4g混匀后压制成120片，即得。每片含总药剂 208mg。

2、霍山石斛精制多糖制成胶囊剂

将实施例1所得精制多糖取10g加10％淀粉浆制成软材，用14目筛制粒后，置60℃～70℃干燥后于12目筛整粒，套入1号空心胶囊中。共装粒500粒，每粒胶囊含总药剂20mg。

3、霍山石斛精制多糖制成口服液

实施例7霍山石斛精制多糖，按照治疗需要，与其他抗肿瘤药物按比例混合制成各种制剂，或在临床使用时联合使用，形成联合抗肿瘤药物组合物，霍山石斛精制多糖与用于抗肿瘤常用临床用药药顺铂、紫衫醇、5-氟尿嘧啶和环磷酰胺联合使用，能够增强抗肿瘤作用，增效作用显著。

以上只通过说明的方式描述了本发明的某些示范性实施例，毋庸置疑，对于本领域的普通技术人员，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以用各种不同的方式对所描述的实施例进行修正。因此，上述附图和描述在本质上是说明性的，不应理解为对本发明权利要求保护范围的限制。

Claims (6)

1.一种具有抗肿瘤作用的霍山石斛精制多糖，其特征在于：所述霍山石斛精制多糖是从兰科斛属植物霍山石斛的茎提取的葡萄糖、甘露糖以T-Glc、1,4-Man、1,4-Glc与1,4,6-Man糖苷键组成的生物大分子，平均分子量为1.2337×10⁷Da，所述葡萄糖与甘露糖比例范围为1:1.6-1:5.3。

2.根据权利要求1所述的一种具有抗肿瘤作用的霍山石斛精制多糖，其特征在于：所述霍山石斛精制多糖可用于制备抗肿瘤药物和辅助抗肿瘤保健品。

3.根据权利要求2所述的一种具有抗肿瘤作用的霍山石斛精制多糖，其特征在于：所述抗肿瘤药物和辅助抗肿瘤保健品的剂型为浸膏、片剂、胶囊、口服液、颗粒剂或冲剂。

4.根据权利要求1所述的一种具有抗肿瘤作用的霍山石斛精制多糖，其特征在于：所述霍山石斛精制多糖可与用于抗肿瘤常用临床用药药顺铂、紫衫醇、5-氟尿嘧啶和环磷酰胺联合使用。

5.一种制备权利要求1～4任一所述具有抗肿瘤作用的霍山石斛精制多糖的方法，其特征在于：包括以下操作步骤：

(1)新鮮的茎经干燥后进行粒碎成干燥的茎及其制品进行粉碎，经80目过筛后，乙醇脱色脱脂，过滤风干后得脱色脱脂粉末；

(2)将脱色脱脂粉末按照预定的料液比与蒸馏水混合，搅拌加热提取，得水提取物；

(3)将水提取物中加入α-淀粉酶，搅拌酶解，得酶解水提取物；

(4)将所得酶解水提取物浓缩离心，弃去沉淀物，得酶解提取液；

(5)于酶解提取液中加入乙醇，得醇沉物；

(6)取醇沉物，经适量缓冲液溶解后，上阴离子交换树脂柱，收集缓冲液洗脱部位，洗脱部位经G-25蒸馏水脱盐、乙醇醉沉得霍山石斛精制多糖。

6.根据权利要求5所述的一种霍山石斛精制多糖的制备方法，其特征在于：具体操作参数如下：

步骤(1)的具体操作参数是：打粉机电机转速22000rpm/min，粉碎程度50-300目，粉碎后将粉末用80目筛网过筛，保存待用；脱色脱脂所用乙醇浓度为95％，其料液比为1:10，脱色次数为4次，每次1h，25℃静置脱色；过滤采用双层中速滤纸抽滤；

步骤(2)的具体操作参数是：脱色脱脂粉末进行水提，其提取料液比为1:40，提取温度为80℃，提取次数为3次，每次1h，搅拌速度为600rpm/min，得水提取物；

步骤(3)的具体操作参数是：水提取物60℃恒温搅拌酶解，搅拌速度为600rpm/min，α-淀粉酶的添加量为1μL/120mL淀粉醇与水提取混合物的比，酶解时间为1h；

步骤(4)的具体操作参数是：将酶解后的水提取物减压浓缩，温度为60℃，减压浓缩压力为-0.1Pa，浓缩至原体积的1/3，浓缩后，将浓缩液于高速离心机中离心，转速为10000rpm/min，离心时间为10min；

步骤(5)的具体操作参数是：乙醇醇沉的终浓度为80％，醉沉时间为12h；

步骤(6)的具体操作参数是：离心取醇沉物，25℃晾干后用适量PH8.0的Tris·HCL缓冲液溶解，过中等碱性阴离了交换树脂DEAE cellulose DE-52柱，DE-52装柱的装填高度为12-25cm，醇沉物溶解后的上样体积为10mL，上样浓度为5mg/ml，待上样液体进入柱床后，以0.01mol/LpH 8.0的Tris·HCL缓冲液进行先脱，控制流速为5mL/min，人工收集洗脱液；将收集的洗脱液适当浓缩后过葡聚糖凝胶SephadexG-25脱盐，上样体积为300μL，上样浓度为100mg/ml，以ddH₂O作为洗脱缓冲液进行洗脱；洗脱液收集加乙醇醇沉，乙醇醇沉的终浓度为80％，醇沉时间为12h；离心，取沉淀，用适量ddH₂O溶解，得乙醇醇沉物，真空冷冻干燥得霍山石斛精制多糖。