CN111254182B

CN111254182B - 石斛多糖抗癌活性分析方法与应用、及石斛多糖的应用

Info

Publication number: CN111254182B
Application number: CN202010235320.0A
Authority: CN
Inventors: 王志才; 王美娜; 陈建兵; 赵美丽; 张佳莹
Original assignee: ORCHID CONSERVATION & RESEARCH CENTER OF SHENZHEN
Current assignee: ORCHID CONSERVATION & RESEARCH CENTER OF SHENZHEN
Priority date: 2020-03-30
Filing date: 2020-03-30
Publication date: 2024-01-02
Anticipated expiration: 2040-03-30
Also published as: CN111254182A

Abstract

本发明公开了一种石斛多糖抗癌活性分析方法与应用、及石斛多糖的应用。本发明的分析方法涉及的石斛多糖具有低、中、高等不同的浓度，癌细胞系包括早、中、晚等不同病理分期的细胞系，评价体系包括石斛多糖对癌细胞增殖、迁移及侵袭三个方面能力的影响；因此本分析方法能够明确判断各病理分期癌细胞对不同药物浓度及不同作用时间的响应，可准确评价石斛多糖对癌细胞进展的影响、指示石斛多糖的作用效果，进而能对石斛多糖的抗癌活性进行明确的分析和研究。此外，由该石斛多糖抗癌活性分析方法进一步明确了此分析方法的应用及石斛多糖的应用。

Description

石斛多糖抗癌活性分析方法与应用、及石斛多糖的应用

技术领域

本发明涉及植物多糖的研究及应用技术领域，具体涉及到一种石斛多糖抗癌活性分析方法与应用、及石斛多糖的应用。

背景技术

石斛属为兰科的第二大属，石斛属的多种植物是我国传统的名贵中药材，其中铁皮石斛、金钗石斛和环草石斛等较为出名。国内外学者对多种石斛属植物进行了深入研究，从中分离鉴定出多种活性成分，如多糖类、生物碱类、甾体类、酚类及挥发油等等，其中主要的活性成分为石斛多糖，其含量是判断多种石斛质量的主要依据。

石斛多糖是一种天然的乙酰化多糖，其在免疫调节和抗氧化作用等方面有显著效果，有部分学者也认为石斛多糖在抗肿瘤方面可能具有生物活性和功能。但到目前为止，缺少专门对石斛多糖抗癌活性进行研究的方法和体系，关于石斛多糖抗癌方面的研究报道也较少，尤其是对膀胱癌的治疗作用尚无相关研究报道。

另一方面，膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率极高，易复发转移。放化疗等传统疗法已经不能满足膀胱癌临床治疗需求，亟需开发新的替代治疗药物。

发明内容

为了对石斛多糖的抗癌活性进行分析和研究，以明确指示石斛多糖的作用效果，本发明提供了一种石斛多糖抗癌活性分析方法与应用，以及由此分析方法所得的石斛多糖的应用。

本发明采用的技术方案如下，一种石斛多糖抗癌活性分析方法，包括如下步骤：

步骤1．提取并制备不同浓度的石斛多糖；

步骤2．培养正常人膀胱细胞、不同病理分期人膀胱癌细胞；

步骤3．不同浓度石斛多糖对不同病理分期癌细胞增殖能力影响的实验；

步骤4．不同浓度石斛多糖对不同病理分期癌细胞侵袭能力影响的实验；

步骤5．不同浓度石斛多糖对不同病理分期癌细胞迁移能力影响的实验；

步骤6．对步骤3~5作数据统计及分析。

本发明的有益效果是：本发明的分析方法涉及的石斛多糖具有低、中、高等不同的浓度，癌细胞系包括早、中、晚等不同病理分期的细胞系，评价体系包括石斛多糖对癌细胞增殖、迁移及侵袭三个方面能力的影响；因此本分析方法能够明确判断各病理分期癌细胞对不同药物浓度及不同作用时间的响应，可准确评价石斛多糖对癌细胞进展的影响、指示石斛多糖的作用效果，进而能对石斛多糖的抗癌活性进行明确的分析和研究。

优选的：所述步骤1中的石斛多糖来自铁皮石斛、金钗石斛、霍山石斛及鼓槌石斛中的一种或多种。

优选的：所述步骤1中的石斛多糖来自金钗石斛。

优选的：所述步骤2中的正常细胞为SVHUC-1细胞，不同病理分期癌细胞分别为5637、T24及SW780细胞。

上述石斛多糖抗癌活性分析方法可应用在：

分析方法的应用一：在评价石斛多糖对膀胱癌的治疗效果中的用途；

分析方法的应用二：在利用石斛多糖对膀胱癌治疗时确认给药剂量过程中的用途；

分析方法的应用三：在癌细胞迁移动物模型的构建中的用途。

由上述石斛多糖抗癌活性分析方法所获得数据可进一步得出：

石斛多糖的应用一：在制备免疫佐剂中的用途，该免疫佐剂用于癌细胞迁移动物模型的构建中；

石斛多糖的应用二：在制备抑制膀胱癌细胞增殖的药物中的用途；

石斛多糖的应用三：在制备抑制膀胱癌细胞侵袭的药物中的用途。

附图说明

图1.低浓度石斛多糖对人膀胱癌细胞增殖的影响。

图2.中浓度石斛多糖对人膀胱癌细胞增殖的影响。

图3.高浓度石斛多糖对人膀胱癌细胞增殖的影响。

图4.石斛多糖对人正常膀胱细胞系SVHUC-1迁移的影响。

图5.石斛多糖对人正常膀胱细胞系SVHUC-1迁移的影响量化统计。

图6.石斛多糖对人中期膀胱癌细胞系5637迁移的影响。

图7.石斛多糖对人中期膀胱癌细胞系5637迁移的影响量化统计。

图8.石斛多糖对人晚期膀胱癌细胞系T24迁移的影响。

图9.石斛多糖对人晚期膀胱癌细胞系T24迁移的影响量化统计。

图10.石斛多糖对人早期膀胱癌细胞系SW780迁移的影响。

图11.石斛多糖对人早期膀胱癌细胞系SW780迁移的影响量化统计。

图12.石斛多糖对人正常膀胱细胞侵袭能力的影响。

图13.石斛多糖对人中期膀胱癌细胞侵袭能力的影响。

图14.石斛多糖对人晚期膀胱癌细胞侵袭能力的影响。

图15.石斛多糖对人早期膀胱癌细胞侵袭能力的影响。

图16.石斛多糖影响膀胱癌进展的评价体系及其在膀胱癌治疗中的应用。

实施方式

下面以人体癌细胞系作为具体实施例，结合附图对本发明作进一步详细说明。

I. 技术方法。

1.1 细胞培养。

人正常膀胱细胞株（SVHUC-1）和膀胱癌细胞株（5637，T24，SW780）均购自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所（上海）。其中，SVHUC-1采用F12K培养基培养（Gibco，ThermoFisherScientific，Waltham，MA，USA），5637细胞采用RPMI-1640培养基（Gibco，ThermoFisherScientific，Waltham，MA，USA）培养，T24及SW780细胞采用DMEM培养基培养（Gibco，ThermoFisherScientific，Waltham，MA，USA）。除非特殊说明，培养基中均添加10%FBS（Gibco，ThermoFisherScientific，Waltham，MA，USA），100U/ml链霉素及100U/ml青霉素（HyClone）。细胞在37℃、5%CO₂培养箱中培养。

本实施例所涉及的膀胱癌细胞系，包括不同病理分期的细胞系。具体的，包括人早期膀胱癌细胞SW780，人中期膀胱癌细胞5637，晚期膀胱癌细胞T24。早期细胞系可以指示早期膀胱癌对石斛多糖的响应；中期细胞系可以指示中期膀胱癌对石斛多糖的响应；晚期细胞系可以指示晚期膀胱癌对石斛多糖的响应。需要说明的是，所选不同病理分期的细胞系包括但不仅限于这几个细胞系，各病理分期的细胞系还可以是其他细胞系，也可以来源于不同病理分期膀胱癌病人肿瘤病灶的原代细胞，但同样适用于本申请所涉及的处理方法及评价体系。

1.2. 细胞消化及浓度测定。

培养正常膀胱细胞SVHUC-1、早期膀胱癌细胞SW780、中期膀胱癌细胞5637及晚期膀胱癌细胞T24至90%以上汇合度。加37℃预热的胰酶消化细胞5-8分钟，用含10%FBS的培养基洗涤细胞以终止消化反应，然后用1×PBS洗涤细胞3次。用3ml培养基重悬细胞，测定及调整细胞浓度。

1.3. 石斛多糖提取及药物处理。

石斛多糖可以来自石斛属的多种植物，如铁皮石斛、金钗石斛、霍山石斛及鼓槌石斛等。其中，不同提取试剂得到的石斛多糖，其主要成分可能存在区别，主要体现在种类及含量上的差别，因而可能具有不同的效果。本实施例的石斛多糖提取自金钗石斛。

将金钗石斛干燥茎粉碎后过80目筛，依次加入正己烷和95%乙醇各浸泡48小时。过滤去除浸泡液，加去离子水于80℃水浴搅拌提取3次，每次2小时（药材/水=1/20，v/v）。合并提取液，离心收集上清液，真空浓缩，然后加入乙醇过夜沉淀。室温5000rpm离心15分钟收集沉淀，再加去离子水溶解。离心取上清后冷冻干燥获得石斛多糖。石斛多糖采用无菌去离子水配制成1mg/ml母液，过滤除菌备用。药品现配现用。药物处理时，按照药物处理浓度取用母液加入对应的细胞培养基中至目标浓度。

金钗石斛水溶性多糖能够明显影响膀胱癌的发生发展，只是一种具体的实施方式。一方面，石斛多糖主要成分及其含量不同，对癌细胞的影响也不同，可以提取自石斛属其他植物，如铁皮石斛、鼓槌石斛等；另一方面，除本实施例涉及的水溶性石斛多糖，不排除还可以采用其他提取方法获得石斛多糖。

1.4. 细胞增殖。

采用CCK-8法测定石斛多糖对不同病理分期膀胱癌细胞增殖的影响。用含不同浓度石斛多糖（0，100，200，400μg/ml）的培养基重悬细胞，将1×10⁴个细胞/孔接种至96孔板中，分别在细胞培养0、24、48和72小时后用100μl含10%CCK-8（北京全式金生物技术有限公司）试剂的新鲜培养基换液并于CO₂培养箱中继续孵育2小时。采用ELISAmicroplatereader（Bio-Rad，USA）读取450nm吸光值。

1.5. 细胞迁移。

采用细胞划痕实验分析石斛多糖对不同病理分期膀胱癌细胞迁移的影响。用含不同浓度石斛多糖（0，100，200，400μg/ml）的培养基重悬细胞，将1×10⁶/孔细胞接种于6孔板中培养至90%以上汇合度。采用200µl无菌枪头垂直于皿底划出清晰一致划痕，然后加入无血清的培养基洗去悬浮细胞。加入含不同浓度石斛多糖（0，100，200，400μg/ml）但不含FBS的培养基继续培养24小时，分别于0和24小时采用倒置显微镜（DMILLED，LeicaMicrosystems，Wetzlar，Germany）观察并拍照。采用ImageJ软件（http://rsbweb.nih.gov/ij/）测量相对迁移数据。

1.6. 细胞侵袭。

收集消化后的细胞，用含有不同浓度石斛多糖（0，100，200，400μg/ml）但不含FBS的新鲜培养基重悬人正常膀胱细胞SVHUC-1、中期膀胱癌细胞5637、晚期膀胱癌细胞T24及早期膀胱癌细胞SW780后分别接种于24孔Transwell板基质胶预包被的上层小室内（BDBiosciences，SanJose，CA，USA），每室接种细胞1×10⁵；下层小室加入500µl含与上层小室对应浓度石斛多糖且含有20%FBS的培养基。药物处理72小时后，用一次性医用棉签轻轻将上层小室内表面底膜上的残余细胞擦除干净。上层小室外表面底膜上的细胞用1×PBS洗涤，甲醇固定20分钟，然后用0.1%结晶紫染色25分钟，最后用1×PBS洗涤细胞3次。上层小室底膜于室温干燥后，采用倒置显微镜观察并拍照（DMILLED，LeicaMicrosystems，Wetzlar，Germany）。

1.7. 统计分析。

采用GraphPadPrism8软件对1.4节、1.5节及1.6节所获取数据进行数据统计分析及作图，结果表示为平均值±标准差。

II. 实验结果。

2.1. 石斛多糖对膀胱癌细胞增殖的影响。

癌细胞增殖会导致癌细胞不断增多，病灶逐渐变大，从而促进癌症进展。选取不同病理分期的人膀胱癌细胞系，包括病理早期膀胱癌细胞SW780、中期膀胱癌细胞5637及晚期膀胱癌细胞T24，评价石斛多糖对不同病理分期膀胱癌进展的影响，正常膀胱细胞SVHUC-1为对照细胞。设定石斛多糖4个处理浓度：0，100，200，400μg/ml。细胞铺板过夜贴壁生长后进行不同浓度石斛多糖处理，采用CCK8法分别于药物处理后0，24，48，72小时测定OD450吸光度值，其数值高低与存活细胞数量呈正相关关系。实验结果如图1~3所示。

结果表明，低浓度（100μg/ml）石斛多糖对正常膀胱细胞增殖无明显影响，对不同病理分期的膀胱癌细胞增殖也无明显影响（图1）。中浓度石斛多糖（200μg/ml）对正常膀胱细胞增殖无明显影响，对中期膀胱癌细胞5637具有抑制作用；对晚期膀胱癌细胞T24和早期膀胱癌细胞SW780没有抑制作用（图2）。高浓度石斛多糖（400μg/ml）对正常膀胱细胞SVHUC- 1增殖也无明显影响，对中期膀胱癌细胞5637增殖有抑制作用，对早期膀胱癌细胞SW780无明显抑制作用，反倒轻微促进晚期膀胱癌细胞T24增殖（图3）。这些结果表明，石斛多糖能够抑制中期膀胱癌细胞增殖，但对早晚期膀胱癌细胞增殖无明显影响。

由此可知，石斛多糖可用于制备抑制中期膀胱癌细胞增殖的药物。

2.2. 石斛多糖对膀胱癌细胞迁移的影响。

中晚期膀胱癌患者除了膀胱癌原位病灶，癌细胞还会向附近或远端转移，进而引发癌细胞扩散。因此，抑制癌细胞迁移也是抑制癌症进展的有效方法。以早期膀胱癌细胞SW780、中期膀胱癌细胞5637及晚期膀胱癌细胞T24三个不同病理分期的癌细胞系及正常膀胱对照细胞SVHUC-1为研究对象，施加不同浓度石斛多糖处理（0，100，200，400μg/ml），处理48小时后拍照观察细胞迁移情况。实验结果如图4~11所示。

结果表明，不同浓度石斛多糖对正常膀胱细胞SVHUC-1迁移无明显影响（图4，图5），但能显著促进中期膀胱癌细胞5637（图6，图7）、晚期膀胱癌细胞T24（图8，图9）、及早期膀胱癌细胞SW780（图10，图11）发生迁移。这些结果进一步表明，石斛多糖可能不能作为抑制膀胱癌向其他器官转移的潜在替代治疗药物。但正因为其对癌细胞迁移具有显著促进作用，因而可以将其开发为免疫佐剂应用于膀胱癌迁移的动物模型构建中。

由此可知，石斛多糖可用于制备在癌细胞迁移动物模型的构建中起作用的免疫佐剂；进一步的，施加水溶性金钗石斛多糖处理能提升人膀胱癌转移的动物模型构建效率，因此本实施例的分析方法可应用在癌细胞迁移动物模型的构建中，以起到提高构建效率的作用。

石斛中的多种植物，如铁皮石斛、鼓槌石斛、金钗石斛等是传统的中药材，也是典型的药食同源植物。特别的，本实施例研究结果提示，膀胱癌病人对于这类保健食材要慎用，其不当使用可能会造成病灶转移等不良后果。

2.3. 石斛多糖对膀胱癌细胞侵袭的影响。

恶性肿瘤会向远端转移，不断侵犯其他组织，导致疾病恶化。因而侵袭性是癌细胞恶性的标志，但其他病理分期的细胞也可能具有侵袭性。本实施例采用Transwell实验分析细胞侵袭性。实验结果如图12~15所示。

实验结果表明，石斛多糖对正常膀胱细胞SVHUC-1的侵袭性无明显影响（图12），但能显著抑制中期膀胱癌细胞5637（图13）、晚期膀胱癌细胞T24（图14）及早期膀胱癌细胞SW780（图15）细胞侵袭能力。这些结果进一步证明，石斛多糖对正常膀胱细胞无明显影响，表明其没有明显毒副作用。石斛多糖对不同病理分期膀胱癌细胞侵袭性有不同程度抑制作用，其中对中期癌细胞的抑制作用最强，对早晚期癌细胞侵袭的抑制作用稍弱。

由此可知，石斛多糖可用于制备抑制膀胱癌细胞侵袭的药物。

2.4. 石斛多糖影响膀胱癌进展的评价体系及其应用。

癌细胞增殖使得细胞增多，病灶不断扩大；癌细胞迁移使得癌细胞向邻近或远端组织器官转移扩散；癌细胞侵袭性增强使得癌细胞对周围组织进行侵犯，从而加快疾病进展。本实施例针对癌细胞的这三个主要特性设计了石斛多糖对膀胱癌进展的分析检测体系，分别由CCK8法细胞增殖检测、细胞划痕迁移检测及Transwell细胞侵袭性检测三个部分构成。由于不同病理分期癌细胞对治疗药物的响应可能不同，本实施例涉及的癌细胞包括早期膀胱癌细胞SW780、中期膀胱癌细胞5637及晚期膀胱癌细胞T24，以正常膀胱细胞SVHUC-1作为对照，能够全面评价癌细胞对药物的响应。由不同病理分期膀胱癌细胞对石斛多糖的响应可以推断，石斛多糖对不同病理分期膀胱癌病人具有不同治疗效果（图16）。

在上述评价体系中，石斛多糖抗癌活性分析方法能明确判断各病理分期膀胱癌细胞对不同药物浓度及不同作用时间的响应，从而准确评价石斛多糖对膀胱癌的治疗效果。进一步的，上述方法及体系也可用于确定不同病理分期利用石斛多糖治疗时的治疗方案、给药剂量及给药频次。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为了说明本发明所作的举例，而并非对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷例。而这些属于本发明的实质精神所引申出的显而易见的变化或变动仍属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种石斛多糖的应用，其特征在于：由金钗石斛水溶提取所得石斛多糖，在制备抑制中期膀胱癌细胞增殖的药物中的用途。

2.一种石斛多糖的应用，其特征在于：由金钗石斛水溶提取所得石斛多糖，在制备抑制膀胱癌细胞侵袭的药物中的用途。