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TWI468177B - 抗ｓｉｇｌｅｃ－１５抗體 - Google Patents

抗ｓｉｇｌｅｃ－１５抗體 Download PDF

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TWI468177B
TWI468177B TW99110882A TW99110882A TWI468177B TW I468177 B TWI468177 B TW I468177B TW 99110882 A TW99110882 A TW 99110882A TW 99110882 A TW99110882 A TW 99110882A TW I468177 B TWI468177 B TW I468177B
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seq
antibody
nucleotide sequence
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TW99110882A
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Inventor
Yoshiharu Hiruma
Eisuke Tsuda
Takeshi Takizawa
Makiko Nakayama
Original Assignee
Daiichi Sankyo Co Ltd
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Publication date
Application filed by Daiichi Sankyo Co Ltd filed Critical Daiichi Sankyo Co Ltd
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Description

抗SIGLEC-15抗體
本發明係關於有用於作為骨代謝異常之治療及/或預防藥的物質，以及骨代謝異常之治療及/或預防方法。
已知為了維持本身的形態變化或血中鈣濃度，骨頭為經常重複進行形成與吸收而再構築的動態器官。正常的骨頭於經由骨芽細胞的骨形成與經由破骨細胞的骨吸收上為平衡關係，骨含量保持一定。另一方面，骨形成與骨吸收之平衡關係一旦崩解，會造成骨質疏鬆症等之骨代謝異常(國際公開第WO07/093042號及Endocrinological Review，(1992)13，p66-80)。
作為調節骨代謝的因子，有許多全身性之荷爾蒙或局部性之胞激素(cytokinin)的報告，經由此等因子之共同作用，來運作骨之形成與維持(國際公開第WO07/093042號及Endocrinological Review，(1996)17，p308-332)。因老化的骨組織變化，已廣泛知悉有骨質疏鬆症之發病，但其發病機制有許多分歧的原因如性荷爾蒙之分泌降低或其受體異常、骨局部之胞激素表現之變動、老化基因之表現、破骨細胞或骨芽細胞之分化或機能不全等，將其理解為因老化的單純生理現象有困難。原發性骨質疏鬆症可大致區分為由於雌激素分泌降低的停經後骨質疏鬆症與由於老化的老人性骨質疏鬆症，為了此發病機制之了解與治療藥之開發，關於骨吸收與骨形成之調節機制之基礎的研究之進展係有必要的。
破骨細胞為來自造血幹細胞的多核細胞，經由與骨之接著面釋放氯離子與氫離子，使細胞與骨之接著面之間隙酸性化的同時，分泌為酸性蛋白酶的組織蛋白酶K(cathepsin K)等(American Journal of Physiology，(1991)260，C1315-C1324)。此結果，引起磷酸鈣之分解、酸性蛋白酶之活性化與骨基質蛋白質之分解，而進行骨吸收。
已知破骨細胞之前驅細胞受到骨表面之骨芽細胞/基質細胞之細胞膜上表現的RANKL(NF-κB配位體之受體活化子)之刺激，會分化為破骨細胞(Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America，(1998)95，p3597-3602、及Cell，(1998)93，p165-176)。RANKL為骨芽細胞/基質細胞產生的膜蛋白質，已知其表發現經由骨吸收因子來調節，及RANKL誘導由破骨細胞前驅細胞至成熟多核破骨細胞之分化等(Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America，(1998)95，p3597-3602；及Journal of Bone and Mineral Research，(1998)23，S222)。再者，發現剔除(knock-out)RANKL的小鼠會產生大理石骨病樣之病態，證明RANKL為生理上的破骨細胞分化誘導因子(Nature，(1999)397，p315-323)。
作為圖謀骨代謝疾病之治療或治療期間之縮短的醫藥品，已使用雙膦酸酯(bisphosphonate)、活性型維生素D3 、抑鈣素(calcitonin)及其衍生物、雌二醇(estradiol)等之荷爾蒙、SERMs(選擇性雌激素受體調節劑(Selective estrogen receptor modulators))、依普黃酮(ipriflavone)、維生素K2(四烯甲萘醌(menatetrenone))、PTH及鈣製劑等。然而，此等藥劑於治療結果上未必可滿足，而冀望更高治療效果之藥劑之開發。
免疫系細胞之細胞膜上被含唾液酸的糖鏈等之多種糖鏈高度地覆蓋，而被各式各樣的糖鏈結合蛋白質辨識。唾液酸結合免疫球蛋白樣親醣蛋白(Sialic-acid-binding immunoglobulin-like lectins，以下稱為「Siglecs」)為辨識含唾液酸的糖鏈而結合的I型膜蛋白質家族。Siglecs於免疫系細胞之細胞膜上有許多表現，被認為會辨識存在於相同的免疫系細胞之細胞膜上的唾液酸而調節細胞間相互作用或細胞機能，參與免疫反應(Nature Reviews Immunology，(2007)7，p255-266)，但生理的機能尚未明瞭的Siglecs分子亦多。Siglec-15(Sialic-acid binding immunoglobulin-like lectin 15)為屬於Siglecs之被新報告的分子(例如，參照非專利文獻10)，與稱為CD33L3(類CD33分子3(CD33 molecule-like 3))的分子為同一分子。此分子於魚類至人類之進化的保存度高，於人類脾臟及淋巴節中，已知於樹狀細胞/巨噬細胞系之細胞中強烈地表現。又使用唾液酸探針的結合試驗之結果，亦已知人類Siglec-15會與Neu5Acα2-6GalNAc結合，又小鼠Siglec-15與Neu5Acα2-3Galβ1-4Glc結合等(例如，參照Glycobiology，(2007)17，p838-846)。迄今，Siglec-15之生理的任務尚未明瞭，但已報告伴隨破骨細胞之分化、成熟，Siglec-15之表現會亢進，經由RNA干擾使Siglec-15表現降低時會抑制破骨細胞之分化(例如，參照國際公開第WO07/093042號)。再者，關於抗Siglec-15抗體於影響破骨細胞分化的作用上，首次由國際公開第WO09/48072號(2009年4月16日公開)得知，但關於可投與人類的抗體序列，則迄今尚未明瞭。
本發明之目的係提供抑制骨質疏鬆症、關節類風濕、癌之骨轉移等所見的各種骨代謝異常時專一性表現的基因、破骨細胞之分化成熟及活性的物質、及骨代謝異常之治療及/或預防劑。
本發明者們於探索具有骨代謝異常之治療及/或預防效果的物質的目的，針對破骨細胞之分化、成熟及活性化之機制(mechanism)之解明進行研究的結果，發現伴隨破骨細胞之分化、成熟而Siglec-15基因之表現會上升。又，本發明者們發現經由與Siglec-15專一性結合的抗體，破骨細胞之分化被抑制。再者，本發明者們，將獲得的大鼠抗小鼠Siglec-15抗體人類化，遂而完成本發明。
即，本發明包含以下之發明。
(1)一種抗體或該抗體之機能性片段，其結合序列編號2所示的胺基酸序列之第39至165號之胺基酸殘基而成的多胜肽，而抑制破骨細胞之形成及/或經由破骨細胞的骨吸收。
(2)如(1)項記載之抗體或該抗體之機能性片段，其重鏈序列含有具CDRH1、CDRH2、CDRH3的可變區，前述CDRH1由序列編號44所示的胺基酸序列而成，前述CDRH2由序列編號45或序列編號97所示任一者之胺基酸序列而成，前述CDRH3由序列編號46所示的胺基酸序列而成；及 輕鏈序列含有具CDRL1、CDRL2、CDRL3的可變區，前述CDRL1由序列編號47所示的胺基酸序列而成，前述CDRL2由序列編號48所示的胺基酸序列而成，前述CDRL3由序列編號49所示的胺基酸序列而成。
(3)如(2)項記載之抗體或該抗體之機能性片段，其含有序列編號41所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基而成的重鏈可變區序列及序列編號43所示的胺基酸序列之第21至132號之胺基酸殘基而成的輕鏈可變區序列。
(4)如(1)至(3)項中任一項記載之抗體之機能性片段，為由Fab、F(ab’)2、Fab’及Fv組成之群。
(5)如(1)至(3)項中任一項記載之抗體，為scFv。
(6)如(1)至(4)項中任一項記載之抗體或該抗體之機能性片段，其為嵌合抗體。
(7)如(6)項記載之抗體或該抗體之機能性片段，其係由序列編號41所示的胺基酸序列之第20至470號之胺基酸殘基而成的重鏈序列及序列編號43所示的胺基酸序列之第21至237號之胺基酸殘基而成的輕鏈序列所構成。
(8)如(1)至(4)或(6)項中任一者記載之抗體或該抗體之機能性片段，其經人類化。
(9)如(7)或(8)項記載之抗體，其中重鏈含人類免疫球蛋白G2重鏈之恆定區，輕鏈含人類免疫球蛋白κ輕鏈之恆定區。
(10)一種抗體或該抗體之機能性片段，其為抑制破骨細胞之形成及/或經由破骨細胞的骨吸收的抗體或該抗體之機能性片段，其特徵為包含
(a)選自以下之胺基酸序列組成之群的重鏈可變區：
a1)由序列編號51所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列；
a2)由序列編號53所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列；
a3)由序列編號55所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列；
a4)由序列編號57所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列；
a5)由序列編號59所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列；
a6)由序列編號99所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列(指定為H1-1重鏈可變區)；
a7)由序列編號101所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列；
a8)具有與選自a1)至a7)任一個胺基酸序列至少95%之相同性的胺基酸序列；
a9)具有與選自a1)至a7)任一個胺基酸序列至少99%之相同性的胺基酸序列；a10)於選自a1)至a7)任一個胺基酸序列中1至數個胺基酸殘基經取代、刪除或添加的胺基酸序列；及(b)選自以下之胺基酸序列組成之群的輕鏈可變區：b1)由序列編號61所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列；b2)由序列編號63所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列；b3)序列編號65所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列；b4)序列編號67所示的胺基酸序列之第21至132號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列；b5)序列編號69所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列；b6)序列編號71所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列；b7)序列編號103所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列(指定為L2-15輕鏈可變區)；b8)序列編號105所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列(指定為L2-16輕鏈可變區)；b9)具有與選自b1)至b8)任一個胺基酸序列至少95%之相同性的胺基酸序列；b10)具有與選自b1)至b8)任一個胺基酸序列至少99%之相同性的胺基酸序列；
b11)於選自b1)至b8)任一個胺基酸序列中1至數個胺基酸殘基經取代、刪除或添加的胺基酸序列。
(11)如(10)項記載之抗體或該抗體之機能性片段，其含有序列編號51所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的重鏈可變區的重鏈序列及含有由序列編號61所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的輕鏈可變區的輕鏈序列。
(12)如(10)項記載之抗體或該抗體之機能性片段，其包含序列編號53所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的重鏈可變區的重鏈序列及包含由序列編號63所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的輕鏈可變區的輕鏈序列。
(13)如(10)項記載之抗體或該抗體之機能性片段，其包含序列編號55所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的重鏈可變區的重鏈序列及包含由序列編號65所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的輕鏈可變區的輕鏈序列。
(14)如(10)項記載之抗體或該抗體之機能性片段，其包含序列編號55所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的重鏈可變區的重鏈序列及包含序列編號67所示的胺基酸序列之第21至132號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的輕鏈可變區的輕鏈序列。
(15)如(10)項記載之抗體或該抗體之機能性片段，其包含序列編號57所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的重鏈可變區的重鏈序列及包含序列編號69所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的輕鏈可變區的輕鏈序列。
(16)如(10)項記載之抗體或該抗體之機能性片段，其包含序列編號59所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的重鏈可變區的重鏈序列及包含序列編號71所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的輕鏈可變區的輕鏈序列。
(17)如(10)項記載之抗體或該抗體之機能性片段，其包含序列編號99所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的重鏈可變區的重鏈序列及包含序列編號69所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的輕鏈可變區的輕鏈序列。
(18)如(10)項記載之抗體或該抗體之機能性片段，其包含序列編號101所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的重鏈可變區的重鏈序列及包含序列編號69所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的輕鏈可變區的輕鏈序列。
(19)如(10)項記載之抗體或該抗體之機能性片段，其包含序列編號99所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的重鏈可變區的重鏈序列及包含序列編號103所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的輕鏈可變區的輕鏈序列。
(20)如(10)項記載之抗體或該抗體之機能性片段，其包含序列編號99所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的重鏈可變區的重鏈序列及包含序列編號105所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的輕鏈可變區的輕鏈序列。
(21)如(10)項記載之抗體或該抗體之機能性片段，其包含序列編號51所示的胺基酸序列之第20至470號之胺基酸殘基而成的重鏈序列及序列編號61所示的胺基酸序列之第21至238號之胺基酸殘基而成的輕鏈序列。
(22)如(10)項記載之抗體或該抗體之機能性片段，其包含序列編號53所示的胺基酸序列之第20至470號之胺基酸殘基而成的重鏈序列及序列編號63所示的胺基酸序列之第21至238號之胺基酸殘基而成的輕鏈序列。
(23)如(10)項記載之抗體或該抗體之機能性片段，其包含序列編號55所示的胺基酸序列第20至470號之之胺基酸殘基而成的重鏈序列及序列編號65所示的胺基酸序列之第21至238號之胺基酸殘基而成的輕鏈序列。
(24)如(10)項記載之抗體或該抗體之機能性片段，其包含序列編號55胺基酸序列之所示的第20至470號胺基酸殘基而成的重鏈序列及序列編號67所示的胺基酸序列之第21至237號之胺基酸殘基而成的輕鏈序列。
(25)如(10)項記載之抗體或該抗體之機能性片段，其包含序列編號57所示的胺基酸序列之第20至470號之胺基酸殘基而成的重鏈序列及序列編號69所示的胺基酸序列之第21至238號之胺基酸殘基而成的輕鏈序列。
(26)如(10)項記載之抗體或該抗體之機能性片段，其包含序列編號59所示的胺基酸序列之第20至470號之胺基酸殘基而成的重鏈序列及序列編號71所示的胺基酸序列之第21至238號之胺基酸殘基而成的輕鏈序列。
(27)如(10)項記載之抗體或該抗體之機能性片段(指定為H1-1/L5之重鏈、輕鏈之組合)，其包含序列編號99所示的胺基酸序列之第20至466號之胺基酸殘基而成的重鏈序列及序列編號69所示的胺基酸序列之第21至238號之胺基酸殘基而成的輕鏈序列。
(28)如(10)項記載之抗體或該抗體之機能性片段(指定為H5/L5之重鏈、輕鏈之組合)，其包含序列編號101所示的胺基酸序列之第20至466號之胺基酸殘基而成的重鏈序列及序列編號69所示的胺基酸序列之第21至238號之胺基酸殘基而成的輕鏈序列。
(29)如(10)項記載之抗體或該抗體之機能性片段(指定為H1-1/L12-15之重鏈、輕鏈之組合)，其包含序列編號99所示的胺基酸序列之第20至466號之胺基酸殘基而成的重鏈序列及序列編號103所示的胺基酸序列之第21至238號之胺基酸殘基而成的輕鏈序列。
(30)如(10)項記載之抗體或該抗體之機能性片段(指定為H1-1/L12-16之重鏈、輕鏈之組合)，其包含序列編號99所示的胺基酸序列之第20至466號之胺基酸殘基而成的重鏈序列及序列編號105所示的胺基酸序列之第21至238號之胺基酸殘基而成的輕鏈序列。
(31)一種醫藥組成物，其含有(1)至(30)項記載之抗體或該抗體之機能性片段之至少任一者。
(32)如(31)項記載之醫藥組成物，其為骨代謝異常之治療及/或預防劑。
(33)一種骨代謝異常之治療及/或預防用醫藥組成物，其特徵為包含如(1)至(30)項記載之抗體或該抗體之機能性片段之至少任一者，以及雙膦酸酯、活性型維生素D3 、抑鈣素及其衍生物、雌二醇等之荷爾蒙、SERMs(選擇性雌激素受體調節劑(selective estrogen receptor modulators))、依普黃酮、維生素K2 (四烯甲萘醌)、鈣製劑、PTH(副甲狀腺荷爾蒙(parathyroid hormone))、非類固醇性抗炎症劑、可溶性TNF受體、抗TNFα抗體或該抗體之機能性片段、抗PTHrP(副甲狀腺荷爾蒙相關蛋白質(parathyroid hormone-related protein))抗體或該抗體之機能性片段、IL-1受體拮抗劑、抗IL-6受體抗體或該抗體之機能性片段、抗RANKL抗體或該抗體之機能性片段、及OCIF(破骨生成抑制因子(osteoclastogenesis inhibitory factor))組成之群。
(34)如(32)或(33)項記載之醫藥組成物，其中骨代謝異常選自骨質疏鬆症、伴隨關節類風濕之骨破壞、癌性高鈣血症、伴隨多發性骨髓瘤或癌之骨轉移之骨破壞、巨細胞瘤、骨減少症、由於齒根膜炎之齒之喪失、人工關節周圍之骨融解、慢性骨髓炎之骨破壞、骨貝西氏病(Behcet disease)、腎性骨營養不良、及骨形成不全症組成之群。
(35)如(34)項記載之醫藥組成物，其中骨代謝異常為骨質疏鬆症、伴隨關節類風濕之骨破壞、或伴隨癌之骨轉移的骨破壞。
(36)如(35)項記載之醫藥組成物，其中骨代謝異常為骨質疏鬆症。
(37)如(36)項記載之醫藥組成物，其中骨質疏鬆症為停經後骨質疏鬆症、老人性骨質疏鬆症、由於類固醇或免疫抑制劑等之治療用藥劑之使用的繼發性骨質疏鬆症、或伴隨關節類風濕之骨質疏鬆症。
(38)一種骨代謝異常之治療及/或預防方法，其特徵為投與(1)至(30)項記載之抗體或該抗體之機能性片段之至少任一者。
(39)一種骨代謝異常之治療及/或預防方法，其特徵為同時或連續投與(1)至(30)項記載之抗體或該抗體之機能性片段之至少任一者，以及選自雙膦酸酯、活性型維生素D3 、抑鈣素及其衍生物、雌二醇等之荷爾蒙、SERMs(選擇性雌激素受體調節劑)、依普黃酮、維生素K2 (四烯甲萘醌)、鈣製劑、PTH(副甲狀腺荷爾蒙)、非類固醇性抗炎症劑、可溶性TNF受體、抗TNFα抗體或該抗體之機能性片段、抗PTHrP(副甲狀腺荷爾蒙相關蛋白質)抗體或該抗體之機能性片段、IL-1受體拮抗劑、抗IL-6受體抗體或該抗體之機能性片段、抗RANKL抗體或該抗體之機能性片段、及OCIF(破骨生成抑制因子)組成之群。
(40)如(38)或(39)項記載之治療及/或預防方法，其中骨代謝異常為骨質疏鬆症、伴隨關節類風濕之骨破壞、或伴隨癌之骨轉移的骨破壞。
(41)如(40)項記載之治療及/或預防方法，其中骨代謝異常為骨質疏鬆症。
(42)如(41)項記載之治療及/或預防方法，其中骨質疏鬆症為停經後骨質疏鬆症、老人性骨質疏鬆症、由於類固醇或免疫抑制劑等之治療用藥劑之使用的繼發性骨質疏鬆症、或伴隨關節類風濕之骨質疏鬆症。
(43)一種多核苷酸，其編碼如(3)、(7)或(10)至(30)項中任一項記載之抗體。
(44)如(43)項記載之多核苷酸，其特徵為包含序列編號40所示的核苷酸序列之第58至420號之核苷酸而成的核苷酸序列及序列編號42所示的核苷酸序列之第61至396號之核苷酸而成的核苷酸序列。
(45)如(44)項記載之多核苷酸，其包含序列編號40所示的核苷酸序列之第58至1410號之核苷酸而成的核苷酸序列及序列編號42所示的核苷酸序列之第61至711號之核苷酸而成的核苷酸序列。
(46)如(43)項記載之多核苷酸，其包含：(a)選自以下之核苷酸序列組成之群的多核苷酸：a1)序列編號50所示的核苷酸序列之第58至420號之核苷酸而成的核苷酸序列；a2)序列編號52所示的核苷酸序列之第58至420號之核苷酸而成的核苷酸序列；a3)序列編號54所示的核苷酸序列之第58至420號之核苷酸而成的核苷酸序列；a4)序列編號56所示的核苷酸序列之第58至420號之核苷酸而成的核苷酸序列；a5)序列編號58所示的核苷酸序列之第58至420號之核苷酸而成的核苷酸序列；a6)序列編號98所示的核苷酸序列之第58至420號之核苷酸而成的核苷酸序列(指定為編碼H1-1可變區的核苷酸序列)；a7)序列編號100所示的核苷酸序列之第58至420號之核苷酸而成的核苷酸序列；a8)保有於嚴格條件下與選自a1)至a7)任一個核苷酸序列互補的核苷酸序列而成的多核苷酸雜交的多核苷酸的核苷酸序列；a9)於選自a1)至a7)任一個核苷酸序列上1至數個核苷酸經取代、刪除或添加的核苷酸序列；及(b)選自以下之核苷酸序列組成之群的多核苷酸：
b1)序列編號60所示的核苷酸序列之第61至399號之核苷酸而成的核苷酸序列；
b2)序列編號62所示的核苷酸序列之第61至399號之核苷酸而成的核苷酸序列；
b3)序列編號64所示的核苷酸序列之第61至399號之核苷酸而成的核苷酸序列；
b4)序列編號66所示的核苷酸序列之第61至396號之核苷酸而成的核苷酸序列；
b5)序列編號68所示的核苷酸序列之第61至399號之核苷酸而成的核苷酸序列；
b6)序列編號70所示的核苷酸序列之第61至399號之核苷酸而成的核苷酸序列；
b7)序列編號102所示的核苷酸序列之第61至399號之核苷酸而成的核苷酸序列(指定編碼L2-15可變區的核苷酸序列)；
b8)序列編號104所示的核苷酸序列之第61至399號之核苷酸而成的核苷酸序列(指定編碼L2-16可變區的核苷酸序列)；
b9)保有於嚴格條件下與選自b1)至b8)任一個核苷酸序列互補的核苷酸序列而成的多核苷酸雜交的多核苷酸的核苷酸序列；
b10)於選自b1)至b8)任一個核苷酸序列上1至數個核苷酸經取代、刪除或添加的核苷酸序列。
(47)如(46)項記載之多核苷酸，其包含序列編號50所示的核苷酸序列之第58至420號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸及序列編號60所示的核苷酸序列之第61至399號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸。
(48)如(46)項記載之多核苷酸，其包含序列編號52所示的核苷酸序列之第58至420號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸及序列編號62所示的核苷酸序列之第61至399號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸。
(49)如(46)項記載之多核苷酸，其包含序列編號54所示的核苷酸序列之第58至420號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸及序列編號64所示的核苷酸序列之第61至399號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸。
(50)如(46)項記載之多核苷酸，其包含序列編號54所示的核苷酸序列之第58至420號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸及序列編號66所示的核苷酸序列之第61至396號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸。
(51)如(46)項記載之多核苷酸，其包含序列編號56所示的核苷酸序列之第58至420號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸及序列編號68所示的核苷酸序列之第61至399號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸。
(52)如(46)項記載之多核苷酸，其包含序列編號58所示的核苷酸序列之第58至420號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸及序列編號70所示的核苷酸序列之第61至399號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸。
(53)如(46)項記載之多核苷酸，其包含序列編號98所示的核苷酸序列之第58至420號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸及序列編號68所示的核苷酸序列之第61至399號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸。
(54)如(46)項記載之多核苷酸，其包含序列編號100所示的核苷酸序列之第58至420號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸及序列編號68所示的核苷酸序列之第61至399號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸。
(55)如(46)項記載之多核苷酸，其包含序列編號98所示的核苷酸序列之第58至420號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸及序列編號102所示的核苷酸序列之第61至399號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸。
(56)如(46)項記載之多核苷酸，其包含序列編號98所示的核苷酸序列之第58至420號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸及序列編號104所示的核苷酸序列之第61至399號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸。
(57)如(46)項記載之多核苷酸，其包含序列編號50所示的核苷酸序列之第58至1410號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸及序列編號60所示的核苷酸序列之第61至714號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸。
(58)如(46)項記載之多核苷酸，其包含序列編號52所示的核苷酸序列之第58至1410號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸及序列編號62所示的核苷酸序列之第61至714號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸。
(59)如(46)項記載之多核苷酸，其包含序列編號54所示的核苷酸序列之第58至1410號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸及序列編號64所示的核苷酸序列之第61至714號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸。
(60)如(46)項記載之多核苷酸，其包含序列編號54所示的核苷酸序列之第58至1410號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸及序列編號66所示的核苷酸序列之第61至711號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸。
(61)如(46)項記載之多核苷酸，其包含序列編號56所示的核苷酸序列之第58至1410號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸及序列編號68所示的核苷酸序列之第61至714號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸。
(62)如(46)項記載之多核苷酸，其包含序列編號58所示的核苷酸序列之第58至1410號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸及序列編號70所示的核苷酸序列之第61至714號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸。
(63)如(46)項記載之多核苷酸，其包含序列編號98所示的核苷酸序列之第59至1398號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸及序列編號68所示的核苷酸序列之第61至714號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸。(指定編碼H1-1/L5的多核苷酸之組合)
(64)如(46)項記載之多核苷酸，其包含序列編號100所示的核苷酸序列之第59至1398號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸及序列編號68所示的核苷酸序列之第61至714號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸。(指定編碼H5/L5的多核苷酸之組合)
(65)如(46)項記載之多核苷酸，其包含序列編號98所示的核苷酸序列之第58至1398號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸及序列編號102所示的核苷酸序列之第61至714號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸。(指定編碼H1-1/L2-15的多核苷酸之組合)
(66)如(46)項記載之多核苷酸，其包含序列編號98所示的核苷酸序列之第58至1398號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸及序列編號104所示的核苷酸序列之第61至714號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸。(指定編碼H1-1/L2-16的多核苷酸之組合)
(67)一種載體，其包含如(43)至(66)項記載之任一個多核苷酸。
(68)一種轉形宿主細胞，其包含如(43)至(66)項記載之任一個。
(69)一種轉形宿主細胞，其包含如(67)項記載之載體。
(70)一種如(3)、(7)或(10)至(30)項記載之抗體之生產方法，其包含培養如(68)或(69)項記載之宿主細胞並自培養產物純化抗體的步驟。
依據本發明，可獲得作為破骨細胞之分化成熟、及產生骨吸收活性之抑制的作用機製之骨代謝異常之治療劑及/或預防劑。
 用以實施發明之形態
於本說明書中，所謂「基因」之用語，不僅指DNA，亦包含mRNA、cDNA及cRNA。
於本說明書中，所謂「多核苷酸」之用語係以相同於核酸的意義來使用，亦包含DNA、RNA、探針、寡核苷酸、及引子。
於本說明書中，「多胜肽」與「蛋白質」係未區別地使用。
於本說明書中，「RNA份」為包含RNA的部分。
於本說明書中，「細胞」係指動物個體內之細胞，亦包含培養細胞。
於本說明書中，「Siglec-15」係以與Siglec-15蛋白質相同的意義使用。
於本說明書中，「破骨細胞之形成」係以與「破骨細胞之分化」或「破骨細胞之成熟」相同的意義使用。
本說明書中之「抗體之機能性片段」係指與抗原具有結合活性的抗體之部分片段，包含Fab、F(ab’)2、Fv、scFv、diabody、線狀抗體、及由抗體片段形成的多專一性抗體等。又，F(ab’)2於還原條件下處理的抗體之可變區之一價的片段的Fab’亦包含於抗體之機能性片段。惟，只要具有與抗原之結合能即可，並未限定於此等分子。又，此等之機能性片段不僅包含以適當酵素處理抗體蛋白質之全長分子者，亦包含使用經基因工程改變的抗體基因而於適當宿主細胞中產生的蛋白質。
本說明書中之「抗原決定位(epitoe)」係指特定之抗Siglec-15抗體之結合的Siglec-15之部分胜肽或部分立體構造。前述之Siglec-15之部分胜肽的抗原決定位可經由免疫試驗法等本項技術領域者熟知的方法來決定，例如可經由以下之方法進行。製作Siglec-15之各式各樣的部分構造。於部分構造之製作，可使用公知之寡胜肽合成技術。例如，由Siglec-15之C末端或N末端以適當長度依序縮短的一系列多胜肽使用本項技術領域者周知之基因隀重組技術製作後，檢討抗此等之抗體之反應性，決定粗略的辨識部位後，進而合成短的胜肽並經由檢討與此等胜肽之反應性，可決定抗原決定位。又，特定之Siglec-15抗體之結合的Siglec-15之部分立體構造的抗原決定位，可經由X射線構造解析特定與前述之抗體鄰接的Siglec-15之胺基酸殘基來決定。若第二之抗Siglec-15抗體結合於第一之抗Siglec-15抗體之結合的部分胜肽或部分立體構造，第一抗體與第二抗體可判定為具有共通的抗原決定位。又，經由確認第一之抗Siglec-15抗體之對Siglec-15的結合而第二之抗Siglec-15抗體為競合(即，第二抗體會妨礙第一抗體與Siglec-15之結合)，即便未決定具體的抗原決定位之序列或構造，仍可判定第一抗體與第二抗體具有共通之抗原決定位。再者，第一抗體與第二抗體結合於共通之抗原決定位，且第一抗體具有抗原之中和活性等特殊效果的情形，可期待第二抗體亦具有同樣活性。
已知抗體分子之重鏈及輕鏈各自有3處互補決定區(CDR：Complemetarity deterring region)。互補決定區亦稱為超可變區(hypervariable domain)，於抗體之重鏈及輕鏈之可變區內，係一次構造之變異性特高的部位，於重鏈及輕鏈之多胜肽鏈之一次構造上，各自於3處分離。於本說明書中，於抗體之互補決定區，將重鏈之互補決定區由重鏈胺基酸序列之胺基末端側表記為CDRH1、CDRH2、CDRH3，輕鏈之互補決定區由輕鏈胺基酸序列之胺基末端側表記為CDRL1、CDRL2、CDRL3。此等部位決定了對於立體構造上互相近接、結合的抗原的專一性。
於本發明，所謂「於嚴格條件下雜交」係指於市售之雜交溶液ExpressHyb雜交溶液(Clontech公司製)中，於68℃下雜交、或使用固定DNA的過濾器，於0.7-1.0M之NaCl存在下於68℃進行雜交後，使用0.1-2倍濃度之SSC溶液(所謂1倍濃度SSC係由150 mM NaCl、15 mM檸檬酸鈉而成)，經由於68℃下洗淨而可鑑定的條件或與此等相同之條件作雜交。
1.Siglec-15
經由本發明者們，發現Siglec-15基因於巨細胞瘤中專一性地表現。又，由本發明者們，亦發現Siglec-15基因於來自單核球的細胞株分化為破骨細胞之際表現量會增加。
本發明所使用的Siglec-15，可由人類、人類以外之哺乳動物(例如，豚鼠、大鼠、小鼠、兔、豬、綿羊、牛、猴等)或雞之單核球細胞或骨髓細胞直接純化使用，或可調製上述細胞之細胞膜份來使用，又，於活體外盒成Siglec-15、或經由基因操作可於宿主細胞中產生。基因操作具體而言，將Siglec-15 cDNA與可表現的載體組合後，於含轉錄與轉譯所必要的酵素、基質及能量物質的溶液中合成、或經由使其他原核生物、或真核生物之宿主細胞轉形，而經由使Siglec-15表現，可獲得該蛋白質。
人類Siglec-15之cDNA之核苷酸序列登錄於GenBank 中目錄編號：NM_213602，亦示於序列表之序列編號1，其胺基酸序列示於序列表之序列編號2。小鼠Siglec-15之cDNA之核苷酸序列，登錄於GenBank中目錄編號：XM_884636，亦示於序列表之序列編號3，其胺基酸序列示於序列表之序列編號4。除去訊號序列的成熟人類Siglec-15相當於序列編號2所示的胺基酸序列之第21號至328號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列。又，除去訊號序列的小鼠Siglec-15相當於序列編號4所示的胺基酸序列之第21號至341號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列。又，Siglec-15稱為類CD33抗原3、類CD33分子3、CD33-like 3或CD33L3，此等全部表示相同的分子。
Siglec-15之cDNA，例如，以表現Siglec-15之cDNA的cDNA庫作為模板，使用專一性增幅Siglec-15之cDNA的引子來進行聚合酶鏈反應(以下稱為「PCR」)(Saiki,R. K. et al.,Science,(1988)239,487-49)，可經由所謂的PCR法取得。
又，由序列表之序列編號1及3所選擇的至少一者所示的核苷酸序列與互補的核苷酸序列而成的多核苷酸於嚴格條件雜交，且編碼具有與Siglec-15同等生物活性的蛋白質的多核苷酸亦包含於Siglec-15之cDNA。再者，由人類或小鼠Siglec-15基因座轉錄的剪接變異體(splicing variant)或其於嚴格條件雜交的多核苷酸，且編碼具有與Siglec-15同等生物活性的蛋白質的多核苷酸亦包含於Siglec-15之cDNA。
又，選自序列表之序列編號2及4之至少一個所示的胺基酸序列、或由此等之序列除去訊號序列的胺基酸序列中，1或數個胺基酸經取代、刪除、或添加的胺基酸序列而成，具有與Siglec-15同等生物活性的蛋白質亦包含於Siglec-15。再者，由人類或小鼠Siglec-15基因座轉錄的剪接變異體所編碼的胺基酸序列或該胺基酸序列中，1或數個胺基酸經取代、刪除、或添加的胺基酸序列而成，且具有與Siglec-15同等之生物活性的蛋白質亦包含於Siglec-15。
2.骨代謝異常之檢測
發現由於人類各種骨組織檢體群中解析基因之表現量時，破骨細胞樣之多核巨細胞會大多數出現的骨髓瘤，臨床上所見特徵為骨溶解性之骨破壞(Bullough et al.，Atlas of Orthopedic Pathology 2nd edition，pp17.6-17.8，Lippincott Williams & Wilkins Publishers(1992))的巨細胞瘤(Giant cell tumor；GCT)中，Siglec-15基因會有意義地增加表現量。
又，Siglec-15基因亦由來自單核球的細胞株分化成破 骨細胞之際表現量增加而被發現。
因而，Siglec-15被認為參與GCT之類的骨吸收會亢進的人類病態。即，Siglec-15基因及/或Siglec-15之各細胞、及/或各組織中測量表現量，可判定伴隨Siglec-15之過度表現的骨代謝異常之狀態。又，本說明書中的骨代謝異常係指特徵為由於真實數量的骨喪失的失調，具體而言，可舉例為骨質疏鬆症(停經後骨質疏鬆症、老人性骨質疏鬆症、經由類固醇或免疫抑制劑等之治療用藥劑之使用的繼發性骨質疏鬆症、伴隨關節類風濕之骨質疏鬆症)、伴隨關節類風濕之骨破壞、癌性高鈣血症、伴隨多發性骨髓瘤或癌之骨轉移的骨破壞、巨細胞瘤、骨減少症、由於齒根膜炎之齒之喪失、人工關節周圍之骨融解、慢性骨髓炎中的骨破壞、骨貝西氏病、腎性骨營養不良、骨形成不全症等，但未限定於此等。
於本發明作為調查Siglec-15基因及/或Siglec-15之表現量的對象的「檢體」，係指獲自被驗者或臨床檢體等之骨髓、骨、前列腺、精巢、陰莖、膀胱、腎臓、口腔、咽頭、口唇、舌、齒肉、鼻咽頭、食道、胃、小腸、大腸、結腸、肝臓、胆囊、胰臓、鼻、肺、軟部組織、皮膚、乳房、子宮、卵巢、腦、甲狀腺、淋巴節、肌肉、脂肪組織等之組織、血液、體液或排泄物等之試料，但於本發明較佳為血液或骨髓。
關於參與破骨細胞之分化上已知的RANKL，製作剔除小鼠，RANKL之機能喪失的場合之表現型已被解析(Young-Yun Kong et.al.,Nature(1999)397,p.315-323)。於Siglec-15，經由亦同樣地製作剔除小鼠，可進行Siglec-15之機能喪失的場合之表現型之解析。
3.抗Siglec-15抗體之製造
使用通常方法，以由Siglec-15或Siglec-15之胺基酸序列選擇的任意多胜肽來免疫動物，採取活體內產生的抗體，經由純化可獲得本發明之抗Siglec-15之抗體。成為抗原的Siglec-15之生物種未限於人類，亦可以來自小鼠、大鼠等之人類以外之動物之Siglec-15來免疫動物。此場合，經由試驗結合所取得的異種Siglec-15之抗體與人類Siglec-15之交叉性，可選擇可適用於人類疾病之抗體。
又，依公知之方法(例如，Kohler and Milstein,Nature(1975)256，p.495-497；Kennet,R.ed.,Monoclonal Antibody,p.365-367,Prenum Press,N.Y.(1980))，經由產生抗Siglec-15之抗體的抗體產生細胞與骨髓瘤細胞融合而建立融合瘤，亦可獲得單株抗體。
又，成為抗原之Siglec-15可經由將Siglec-15基因作基因操作使於宿主細胞產生而獲得。
具體而言，製作可表現Siglec-15基因之載體，將其導入宿主細胞使該基因表現，而純化表現的Siglec-15為宜。以下，具體說明抗Siglec-15之抗體之取得方法。
(1)抗原之調製
作為製造抗Siglec-15抗體用之抗原，可舉例Siglec-15或其至少6個連續部分胺基酸序列而成的多胜肽、或於此等附加任意之胺基酸序列或担體的衍生物。
Siglec-15可由人類腫瘤組織或腫瘤細胞直接純化使用，又，可於活體外合成Siglec-15，或經基因操作使於宿主細胞產生而獲得。
基因操作，具體而言，將Siglec-15之cDNA併入可表現載體後，於含有轉錄與轉譯必要的酵素、基質及能量物質的溶液中合成，或經由使其他原核生物、或真核生物之宿主細胞轉形，經由使Siglec-15表現可獲得抗原。
又，經由使為膜蛋白質之Siglec-15之細胞外區域與抗體之恆定區域連結的融合蛋白質於適切宿主‧載體系統中表現，亦可獲得為分泌蛋白質之抗原。
Siglec-15之cDNA，例如，進行Siglec-15之cDNA作為表現cDNA庫之模板，使用專一性增幅Siglec-15 cDNA之引子的聚合酶鏈反應(以下稱為「PCR」)(參照Saiki,R. K. et al.,Science(1988) 239,p.487-489)，經由所謂PCR法可取得。
多胜肽之活體外(in vitro)合成可舉例如Roche Diagnostic公司製之快速轉譯系統(Rapid Translation System(RTS))，但未限於此等。
原核細胞之宿主可舉例如大腸菌(Escherichia coli)或枯草桿菌(Bacillus subtilis)等。為使於此等宿主細胞內轉形目的基因，於含有與宿主適合之種由來的複製子(即複製起點)及調節序列的質體載體中使宿主細胞轉形。又，作為載體，具有可賦予轉形細胞表現形質(表現型)之選擇性的序列者為較佳。
真核細胞之宿主細胞包含脊椎動物、昆蟲、酵母等之細胞，作為脊椎動物細胞經常使用例如為猴細胞的COS細胞(Gluzman,Y.Cell(1981) 23,p.175-182，ATCC CRL-1650)、小鼠纖維母細胞NIH3T3(ATCC No.CRL-1658)或中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞，ATCC CCL-61)之二氫葉酸還原酵素缺損株(Urlaub，G. and Chasin,L.A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1980) 77,p.4126-4220)等，但未限於此等。
如上述所得轉形體，可依通常方法培養，自該培養於細胞內、或細胞外產生目的多胜肽。
作為該培養所用培養基，可視採用之宿主細胞適宜選擇慣用的各種培養基，若為大腸菌，例如，視必要於LB培養基添加安比西林等抗生素或IPMG而使用。
經由上述培養，轉形體之細胞內或細胞外產生的重組蛋白質可經由利用該蛋白質之物理性質或化學性質等的各種公知分離操作法而分離‧純化。
作為該方法，具體而言可以例如，由通常之蛋白質沈澱劑處理、超過濾、分子篩層析(凝膠過濾)、吸著層析法、離子交換層析法、親和性層析法等之各種液體層析法、透析法、此等之組合等。
又，經由經表現的重組蛋白質中連繫6個殘基而成的組胺酸，可以鎳親和性管柱有效率地純化。或，經由經表現的重組蛋白質中連繫IgG之Fc區域，以蛋白質A管柱可有效率地純化
經由組合上述方法可容易地以高產率、高純度大量製造目的多胜肽。
(2)抗Siglec-15單株抗體之製造
作為與Siglec-15專一性結合的抗體之例，可列舉與Siglec-15專一性結合的單株抗體，其取得方法如以下記載。
於製造單株抗體時，一般言而如下述之作業步驟為必要。
即，
(a)作為抗原使用的活體高分子之純化、
(b)經由注射抗原於動物免疫後，採取血液而檢定此抗體力價而決定脾臟摘出之時期後，調製抗體產生細胞的步驟、
(c)骨髓瘤細胞(以下稱為「骨髓瘤」)之調製、
(d)抗體產生細胞與骨髓瘤之細胞融合、
(e)產生目的抗體之融合瘤群之選別、
(f)單一細胞選殖株之分離(選殖)、
(g)依場合，大量製造單株抗體用之融合瘤之培養、或移植融合瘤之動物之飼育、
(h)如此製造的單株抗體之生理活性、及其結合專一性之檢討、或標識試藥之特性之檢定等。
以下，沿上述步驟詳述單株抗體之製作法，但該抗體之製作法未限於此等，例如亦可使用脾細胞以外之抗體產生細胞及骨髓瘤。
(a)抗原之純化
作為抗原，可使用如前述方法調製的Siglec-15或其一部分。
又，由Siglec-15表現重組體細胞調製的膜份、或Siglec-15表現重組體細胞自身，進而使用本項技藝者周知之方法，亦可將化學合成的本發明蛋白質之部分胜肽作為抗原使用。
(b)抗體產生細胞之調製
將步驟(a)所得抗原與弗氏完全或不完全佐劑、或鉀鋁明礬之類的助劑混合，作為免疫原免疫實驗動物。於實驗動物可自由地使用用於公知融合瘤製作法的動物。具體而言，例如可使用小鼠、大鼠、山羊、綿羊、牛、馬等。惟，由與摘出的抗體產生細胞融合的骨髓瘤細胞之取得容易性等之觀點，較佳以小鼠或大鼠作為被免疫動物。
又，實際使用的小鼠及大鼠之系統並未特別限制，於小鼠之場合，可使用例如各系統：A、AKR、BALB/c、BDP、BA、CE、C3H、57BL、C57BL、C57L、DBA、FL、HTH、HT1、LP、NZB、NZW、RF、R III、SJL、SWR、WB、129等，又於大鼠之場合，例如，可使用Wistar、Low、Lewis、Sprague、Dawley、ACI、BN、Fischer等。
此等小鼠及大鼠可獲自例如日本CLEA、日本Charles River等實驗動物飼育販賣業者。
其中，若探索與後述骨髓瘤細胞之融合適合性，小鼠中以BALB/c系統，大鼠以Wistar及Low系統作為被免疫動物為特佳。
又，考慮抗原之人類與小鼠之相同性，降低除去自體抗體的活體機構的小鼠，即使用自體免疫疾病小鼠亦較佳。
又，此等小鼠或大鼠之免疫時之週齡較佳為5～12週齡，更佳為6～8週齡。
經由Siglec-15或其重組體免疫動物上，可使用詳細記載於例如，Weir,D.M.,Handbook of Experimental Immunology Vol.I.II.III.，Blackwell Scientific Publications,Oxford(1987)；Kabat,E.A. and Mayer,M.M.,Experimental Immunochemistry,Charles C Thomas Publisher Spigfield,Illinosis(1964)等之公知方法。
此等免疫法中，若具體顯示本發明之較佳方法，例如以下所述。
即，首先，投與為抗原之膜蛋白質份、或表現抗原之細胞於動物之皮內或腹腔內。
惟，為提高免疫效率兩者之併用為較佳，前半段進行皮內投與，後半段或僅最終回進行腹腔內投與，可特別地提高免疫效率。
抗原之投與行程，依被免疫動物之種類、個體差等而異，一般而言，抗原投與次數3～6次、投與間隔2～6週間為較佳，投與次數3～4次、投與間隔2～4週間為更佳。
又，抗原之投與量依動物之種類、個體差等而異，一般而言為0.05～5mg，較佳為0.1～0.5mg左右。
追加免疫如以上之抗原投與1～6週後進行，較佳為2～4週後，更佳為2～3週後。
又，進行追加免疫之際的抗原投與量依動物種類、大小等而異，一般而言，例如於小鼠之場合為0.05～5mg，較佳為0.1～0.5mg，更佳為0.1～0.2mg左右。
自上述追加免疫1～10日後，較佳為2～5日後，更佳為2～3日後，由被免疫動物無菌取出含有抗體產生細胞之脾臟細胞或淋巴球。
又，此時測定抗體力價，若使用抗體力價非常高的動物作為抗體產生細胞之供給源，可提高之後操作的效率。
作為此處使用的抗體力價之測定法，例如，可列舉RIA法或ELISA法，但未限於此等方法。
本發明之抗體力價之測定，例如由ELISA法，可如以下記載順序進行。
首先，將純化或部分純化的抗原吸附於ELISA用96孔平盤等之固相表面，進而未吸附抗原的固相表面覆蓋與抗原無關係的蛋白質，例如牛血清白蛋白(以下稱為「BSA」)，洗淨該表面後，與作為第一抗體之階段稀釋的試料(例如小鼠血清)接觸，使上述抗原結合試料中之抗體。
又加入作為第二抗體之經酵素標識抗小鼠抗體之抗體而結合小鼠抗體，洗淨後添加該酵素之基質，基於基質分解的發色而測定吸光度之變化等，算出抗體力價。
自此等脾臟細胞或淋巴球之抗體產生細胞之分離可依公知方法(例如，Kohler et al.，Nature(1975)256,p.495；Kohler et al.,Eur.J.Immnol.(1977)6,p.511；Milstein et al.,Nature(1977),266,p.550，；Walsh,Nature,(1977)266,p.495)進行。
例如，脾臟細胞之場合，可採用細切脾臟以不鏽鋼網過濾細胞後，浮游於Eagle最小必須培養基(MEM)而分離抗體產生細胞的一般方法。
(c)骨髓瘤細胞(以下，稱為「骨髓瘤」)之調製
細胞融合所用骨髓瘤細胞未特別限制，可自公知細胞株適宜選擇使用。惟，考慮自融合細胞選擇融合瘤時之便利性，使用確立此選擇手續的HGPRT(次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(Hipoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase))缺損株為較佳。
即，來自小鼠之X63-Ag8(X63)、NS1-ANS/1(NS1)、P3X63-Ag8.U1(P3U1)、X63-Ag8.653(X63.653)、SP2/0-Ag14(SP2/0)、MPC11-45.6TG1.7(45.6TG)、FO、S149/5XXO、BU.1等；來自大鼠之210.RSY3.Ag.1.2.3(Y3)等；來自人類之U266AR(SKO-007)、GM1500‧GTG-A12(GM1500)、UC729-6、LICR-LOW-HMy2(HMy2)、8226AR/NIP4-1(NP41)等。
此等HGPRT缺損株可獲自例如，American Type Culture Collection(ATCC)等。
此等細胞株，於適當培養基，例如於8-氮鳥嘌呤培養基[於RPMI-1640培養基加入麩醯胺酸、2-巰基乙醇、慶大黴素(gentamycin)、及胎牛血清(以下稱為「FCS」)的培養基中加入8-氮鳥嘌呤的培養基]、Iscove改變Dulbecco培養基(Iscove’ s Modified Dulbecco’ s Medium；以下稱為「IMDM」)、或Dulbecco改變Eagle培養基(Dulbecco’ s Modified Eagle Medium；以下稱為「DMEM」)中繼代培養，細胞融合之3至4日前以正常培養基[例如，含10% FCS之ASF104培養基(味之素(股)公司製)]繼代培養，融合當日確保有2×107 以上個細胞數。
(d)細胞融合
抗體產生細胞與骨髓瘤細胞之融合，依公知方法(Weir,D.M.,Handbook of Experimental Immunology Vol.I.II.III.,Blackwell Scientific Publications,Oxford(1987)；Kabat,E.A. and Mayer，M.M.,Experimental Immunochemistry,Charles C Thomas Publisher Spigfield,Illinosis(1964)等)，可於未極度降低細胞生存率的程度的條件下適宜實施。
此等方法可使用例如，聚乙二醇等之高濃度聚合物溶液中混合抗體產生細胞及骨髓瘤細胞之化學方法、利用電氣刺激之物理方法等。
其中，顯示上述化學方法之具體例如以下所述。
即，使用作為高濃度聚合物溶液之聚乙二醇的場合，於分子量1500～6000、較佳為2000～4000之聚乙二醇溶液中，在30～40℃、較佳為35～38℃之溫度下混合抗體產生細胞與骨髓瘤細胞1～10分鐘，較佳為5～8分鐘。
(e)融合瘤群之選擇
由上述細胞融合所得融合瘤之選擇方法並未特別限制，通常使用HAT(次黃嘌呤‧胺基喋呤‧胸腺嘧啶)選擇法(Kohler et al.,Nature(1975)256,p.495；Milstein et al.,Nature(1977)266,p.550)。
此方法使用於胺基喋呤中無法生存的HGPRT缺損株之骨髓瘤細胞獲得融合瘤的場合為有效的。
即，經由於HAT培養基中培養未融合細胞及融合瘤，使選擇性殘留僅現存對胺基喋呤具耐性的融合瘤，並可使其增殖。
(f)單一細胞選殖株之分離(選殖)
作為融合瘤之選殖法，例如可使用甲基纖維素法、軟洋菜膠法、限界稀釋法等之公知方法(例如參照Barbara,B. M. and Stanley,M. S.：Selected Methods in Cellular Immunology,W. H. Freeman and Company,San Francisco(1980))。此等方法中，特別是限界稀釋法為較佳。
以此方法，於微量盤中接種來自大鼠胎兒的纖維母細胞株、或正常小鼠脾臟細胞、胸腺細胞、腹水細胞等供應細胞(feeder)。
另一方面，預先將融合瘤以0.2~0.5個/0.2ml的方式於培養基中稀釋，此經稀釋的融合瘤之游離液於各別孔中每孔放入0.1ml，每隔一定期間(例如每3日)一邊將約1/3培養基以新的培養基交換一邊繼續培養2週左右，可使融合瘤之選殖株增殖。
於被認為有抗體力價之孔，例如經限界稀釋法重複2～4次選殖，選擇安定地被認為有抗體力價者作為抗Siglec-15單株抗體產生融合瘤株。
作為如此選殖的融合瘤株之例，可舉例WO09/48072記載之融合瘤#32A1。融合瘤#32A1於2008年8月28日寄存於日本國獨立行政法人產業技術總合研究所特許生物寄存中心(所在地：郵遞區號305-8566日本國茨城縣市東1丁目1番地1中央第6)，以抗-Siglec-15融合瘤#32A1之名稱賦與寄存編號FERM BP-10999。亦以編號BCRC 960381寄存於台灣食品工業發展研究所。又，本說明書中，融合瘤#32A1所產生的抗體記載為「#32A1抗體」或簡單記載為「#32A1」。又，於本說明書之實施例，#32A1抗體以外所取得的抗體亦以同樣方法記載抗體名。含#32A1抗體之重鏈可變區的部分片段係具有序列表之序列編號28之第20至167號的胺基酸殘基而成的胺基酸序列。又，含#32A1抗體之輕鏈可變區序列的部分片段係具有序列表之序列編號30之第21至139號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列。
(g)由融合瘤之培養調製單株抗體
如此經選擇的融合瘤，可經由培養，有效率地獲得單株抗體，但培養之前，先篩選產生作為目的的單株抗體的融合瘤為所欲的。
於此篩選可採用其本身既知之方法。
本發明中抗體力價之測定可依據例如上述(b)之項目中說明的ELISA法進行。
依據如以上之方法所獲得的融合瘤，可於液態氮中或-80℃以下之冷凍庫中以凍結狀態保存。
完成選殖之融合瘤，將培養基由HT培養基換成正常培養基培養。
使用大型培養瓶的旋轉培養、或旋轉器培養進行大量培養。
自此大量培養之上清液，經由使用凝膠過濾等本項技術領域者眾所皆知之方法純化，可獲得專一性結合本發明蛋白質之單株抗體。
又，於同系統之小鼠(例如上述之BALB/c)、或Nu/Nu小鼠之腹腔內注射融合瘤，經由使該融合瘤增殖，可獲得含大量本發明單株抗體的腹水。
腹腔內投與時，事前(3～7日前)投與2,6,10,14-四甲基十五烷(2,6,10,14-tetramethyl pentadecane)(降植烷(PRISTANE))等之礦物油，可獲得較多量腹水。
例如，融合瘤與同系統之小鼠之腹腔內預先注射免疫抑制劑，使T細胞不活性化後，於20日後將106 ～107 個融合瘤‧選殖株細胞於不含血清的培養基中使游離(0.5ml)而投與至腹腔內，通常腹部會膨脹，以積存腹水的程度自小鼠採取腹水。
依據此方法，獲得與培養液中相比約100倍以上濃度之單株抗體。
由上述方法獲得的單株抗體，可例如以記載於Weir,D. M.：Handbook of Experimental Immunology,Vol. I,II,III,Blackwell Scientific Publications,Oxford(1978)之方法純化。
即，硫銨鹽析法、凝膠過濾法、離子交換層析法、親和性層析法等。
作為純化之簡便方法，亦可利用市售單株抗體純化套組(例如，MAbTrap GII套組；Pharmacia公司製)。
如此所得單株抗體具有抗Siglec-15之高抗原專一性。
(h)單株抗體之檢定
如此所得單株抗體之異型及亞群之決定可如以下進行。
首先，可列舉奧克特洛尼平板雙向擴散法(Ouchterlony)法、ELISA法、或RIA法作為鑑定法。
奧克特洛尼平板雙向擴散法雖為簡便，但單株抗體濃度低的場合有濃縮操作的必要。
另一方面，使用ELISA法或RIA法的場合，使培養上清液直接與抗原吸附固相反應，進一步經由使用作為第二次抗體的對應各種免疫球蛋白異型、亞群的抗體，可鑑定單株抗體之異型、亞群。
又，作為更簡便的方法，亦可利用市售鑑定用套組(例如，小鼠typer套組；Bio-Rad公司製)等。
又，蛋白質之定量，可依據Folin-Lowry法，及由280nm之吸光度[1.4(OD280)=免疫球蛋白1mg/ml]算出的方法進行。
(3)其他抗體
本發明之抗體，除了上述抗Siglec-15之單株抗體外，亦包含以降低抗人類之異種抗原性等為目的之人為改變的基因重組型抗體，例如，嵌合(Chimeric)抗體、人化(Humanized)抗體、人類抗體等。此等抗體可使用既知方法製造。
作為嵌合抗體，可舉例抗體可變區與恆定區互為異種的抗體，例如，可舉例來自小鼠或大鼠抗體之可變區接合來自人類之恆定區的嵌合抗體(參照Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81,6851-6855,(1984))。作為來自大鼠抗小鼠抗體# 32A1之嵌合抗體之一例，可舉例由具有序列表之序列編號41之第20至470號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列的重鏈、及具有序列編號43之第21至237號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列的輕鏈而成的抗體。
作為人化抗體，僅將互補性決定區(CDR；complementarity determining region)組合至來自人類之抗體的抗體(參照Nature(1986)321,p.522-525)，可舉例依據CDR移植法，除CDR之序列外亦有一部份框架區之胺基酸殘基移植到人類抗體的抗體(國際公開小冊WO90/07861)。作為大鼠抗體# 32A1之人類化抗體之實例，可舉例序列表之序列編號51之第20至140號之胺基酸殘基、序列編號53之第20至140號之胺基酸殘基、序列編號55之第20至140號之胺基酸殘基、序列編號57之第20至140號之胺基酸殘基、序列編號59之第20至140號之胺基酸殘基、序列編號99之第20至140號之胺基酸殘基、序列編號101之第20至140號之胺基酸殘基、或含序列編號72至77中記載之任一個胺基酸序列之1至121號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的重鏈可變區的重鏈、及序列編號61之第21至133號之胺基酸殘基、序列編號63之第21至133號之胺基酸殘基、序列編號65之第21至133號之胺基酸殘基、序列編號67之第21至132號之胺基酸殘基、序列編號69之第21至133號之胺基酸殘基、序列編號71之第 21至133號之胺基酸殘基、序列編號103之第21至133號之胺基酸殘基、序列編號105之第21至133號之胺基酸殘基、或含序列編號78至96之任一者記載之胺基酸序列之1至113號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的輕鏈可變區的輕鏈之任意之組合。
作為適合的組合，可舉例含序列編號51之第20至140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的重鏈可變區的重鏈及含序列編號61之第21至133號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的輕鏈可變區的輕鏈而成的抗體；含序列編號53之第20至140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的重鏈可變區的重鏈及含序列編號63之第21至133號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的輕鏈可變區的輕鏈而成的抗體；含序列編號55之第20至140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的重鏈可變區的重鏈及含序列編號65之第21至133號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的輕鏈可變區的輕鏈而成的抗體；含序列編號55之第20至140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的重鏈可變區的重鏈及含序列編號67之第21至132號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的輕鏈可變區的輕鏈而成的抗體；含序列編號57之第20至140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的重鏈可變區的重鏈及含序列編號69之第21至133號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的輕鏈可變區的輕鏈而成的抗體；含序列編號59之第20至140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的重鏈可變區的重鏈及含序列編號71之第21至133號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的輕鏈可變區的輕鏈而成的抗體；含序列編號99之第20至140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的重鏈可變區的重鏈及含序列編號69之第21至133號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的輕鏈可變區的輕鏈而成的抗體；含序列編號101之第20至140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的重鏈可變區的重鏈及含序列編號69之第21至133號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的輕鏈可變區的輕鏈而成的抗體；含序列編號99之第20至140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的重鏈可變區的重鏈及含序列編號103之第21至133號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的輕鏈可變區的輕鏈而成的抗體；或含序列編號99之第20至140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的重鏈可變區的重鏈及含序列編號105之第21至133號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的輕鏈可變區的輕鏈而成的抗體。
作為更適合的組合，可舉例具有序列編號51之第20至470號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列的重鏈及具有序列編號61之第21至238號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列的輕鏈而成的抗體；具有序列編號53之第20至470號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列的重鏈及具有序列編號63之第21至238號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列的輕鏈而成的抗體；具有序列編號55之第20至470號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列的重鏈及具有序列編號65之第21至238號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列的輕鏈而成的抗體；具有序列編號55之第20至470號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列的重鏈及具有序列編號67之第21至237號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列的輕鏈而成的抗體；具有序列編號57之第20至470號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列的重鏈及具有序列編號69之第21至238號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列的輕鏈而成的抗體；具有序列編號59之第20至470號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列的重鏈及具有序列編號71之第21至238號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列的輕鏈而成的抗體；具有序列編號99之第20至466號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列的重鏈及具有序列編號69之第21至238號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列的輕鏈而成的抗體；具有序列編號101之第20至466號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列的重鏈及具有序列編號69之第21至238號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列的輕鏈而成的抗體；具有序列編號99之第20至466號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列的重鏈及具有序列編號103之第21至238號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列的輕鏈而成的抗體；或具有序列編號99之第20至466號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列的重鏈及具有序列編號105之第21至238號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列的輕鏈而成的抗體。
惟，作為來自#32A1抗體之人類化抗體，只要保持#32A1之6種全部的CDR序列且具有抑制破骨細胞形成的活性即可，並未限於上述人類化抗體。又，#32A1抗體之重鏈可變區保有由序列編號44所示的胺基酸序列而成的CDRH1(DYFMN)、序列編號45所示的胺基酸序列而成的CDRH2(QIRNKIYTYATFYAESLEG)或序列編號97所示的CDRH2(QIRNKIYTYATFYA)之任一者，及序列編號46所示的胺基酸序列而成的CDRH3(SLTGGDYFDY)。序列編號45所示的CDRH2係經由Kabat之定義(SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST VOL.1，FIFTH EDTION(1991))者。序列編號97所示的CDRH2，C末端較Kabat之定義短縮5個殘基。於含此CDRH2的重鏈序列，因減去來自大鼠之CDR序列而併入較多人類框架(framewor)序列，投與人類之際，較難被進一步辨識為異種抗原。又，＃32A1抗體之輕鏈可變區，保有由序列編號47所示的胺基酸序列而成的CDRL1(RASQSVTISGYSFIH)、序列編號48所示的胺基酸序列而成的CDRL2(RASNLAS)、及序列編號49所示的胺基酸序列而成的CDRL3(QQSRKSPWT)。
作為本發明之抗體，可進一步舉例人類抗體。所謂抗Siglec-15人類抗體係指僅具有來自人類染色體之抗體之基因序列的人類抗體。抗Siglec-15人類抗體係使用具有含人類抗體之重鏈與輕鏈之基因的人類染色體片段的人類抗體產生小鼠的方法(參照Tomizuka,K. et al.,Nature Genetics(1997) 16,p.133-143；Kuroiwa,Y.et.al.,Nuc. Acids Res.(1998) 26,p.3447-3448；Yoshida,H. et.al.,Animal Cell Technology：Basic and Applied Aspects vol. 10,p.69-73(Kitagawa,Y.,Matuda,T. and Iijima,S. eds.),KluwerAcademic Publishers,1999；Tomizuka,K. et.al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2000)97,p.722-727等)而取得。
如此之產生人類抗體的小鼠，具體而言，將內在性免疫球蛋白重鏈及輕鏈的基因座被破壞，替代性地將藉由酵母人工染色體(Yeast artificial chromosome,YAC)載體等導入人類免疫球蛋白重鏈及輕鏈的基因座的基因重組動物，經由基因剔除動物及轉基因動物之製作、及此等動物彼此雜交可製作得到。
又，經由基因重組技術，個別編碼此等人類抗體之重鏈及輕鏈之的cDNA，較佳為經由含該cDNA的載體將真核細胞轉形，經由培養產生基因重組人類單株抗體的轉形細胞，亦可自培養上清液中獲得此抗體。
其中，作為宿主，可使用例如真核細胞，較佳為CHO細胞、淋巴球或骨髓瘤等哺乳動物細胞。
又，亦已知取得由人類抗體庫選別的噬菌體表現(phage display)由來之人類抗體的方法(參照Wormstone,I. M. et.al,Investigative Ophthalmology & Visual Science.(2002)43(7),p.2301-2308；Carmen,S. et.al.,Briefings in Functional Genomics and Proteomics(2002),1(2),p.189-203；Siriwardena,D. et.al.,Opthalmology(2002)109(3),p.427-431)。
例如，可使用將人類抗體之可變區作為一單鏈抗體(scFv)於噬菌體表面上表現，選擇結合抗原的噬菌體的噬菌體表現法(Nature Biotechnology(2005),23,(9),p.1105-1116)。
經由解析以結合抗原所選擇的噬菌體之基因，可決定編碼結合抗原的人類抗體之可變區的DNA序列。
若已知結合抗原的scFv之DNA序列，可製作具有該序列的表現載體，且經由導入適當宿主使其表現取得人類抗體(WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438、WO95/15388；Annu.Rev.Immunol(1994)12,p.433-455；Nature Biotechnology(2005)23(9),p.1105-1116)。
由以上方法所獲得的抗體，可經由實施例25所示方法等評價對抗原的結合性，而選擇適合的抗體。作為比較抗體性質之際之其他指標之一例，可舉例抗體之安定性。實施例33所示的示差掃描熱量計(DSC)，可很快或正確地測量為蛋白之相對的構造安定性之良好指標的熱變性中點(Tm)的裝置。使用DSC測量Tm值，經由比較此值，可比較熱安定性之差異。抗體之保存安定性，顯示與抗體熱安定性有某程度之相關為已知(Lori Burton et. al.,Pharmaceutical Development and Technology(2007)12,p.265-273)，以熱安定性為指標，可選擇適合的抗體。作為選擇抗體用之其他指標，可舉例於適切的宿主細胞中的產量高、及水溶液中之凝集性低。例如產量最高的抗體未必亦顯示最高熱安定性，故有必要基於以上所述指標作綜合的判斷，來選擇投與人類最適合的抗體。
又，亦已知將抗體之重鏈及輕鏈之全長序列使用適切的聯結物連結，而取得單鏈免疫球蛋白(single chain immunoglobulin)的方法(Lee,H-S,et.al.,Molecular Immunology(1999) 36,p.61-71；Shirrmann,T.et.al.,mAbs(2010),2,(1) p.1-4)。此類單鏈免疫球蛋白經由二聚物化，可保持與原本為四聚物抗體類似的構造與活性。
又，經由調節結合本發明之抗體的糖鏈修飾，可增強抗體依存性細胞障害活性。作為抗體之糖鏈修飾之調節技術，已知有WO99/54342、WO00/61739、WO02/31140等，但未限定於此等。
一旦單離抗體基因後，於導入適當宿主而製作抗體的場合，可使用適當宿主與表現載體之組合。作為抗體基因之具體例，可舉例組合編碼本說明書記載的抗體之重鏈序列的基因、及編碼輕鏈序列的基因者。轉形宿主細胞之際，重鏈序列基因與輕鏈序列基因可插入相同表現載體，又亦可插入各別的表現載體。使用真核細胞作為宿主的場合，可使用動物細胞、植物細胞、真核微生物。作為動物細胞，可舉例(1)哺乳類細胞，例如，猴細胞的COS細胞(Gluzman,Y.Cell(1981) 23,p.175-182,ATCC CRL-1650)、小鼠纖維母細胞NIH3T3(ATCC No. CRL-1658)或中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞、ATCC CCL-61)之二氫葉酸還原酵素缺損株(Urlaub,G.and Chasin,L.A. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1980) 77,p.4126-4220)。又，使用原核細胞的場合，例如，可舉例大腸菌、枯草桿菌。經由於此等細胞中轉形而導入作為目的的抗體基因，轉形的細胞經由於活體外培養而獲得抗體。於以上之培養法，由依抗體序列而產量相異的情形，由具有同等結合活性的抗體中以產量為指標可生產容易選別者。
本發明之抗體之異型無限制，例如可舉例IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA(IgA1、IgA2)、IgD或IgE等，較佳為IgG或IgM。
又本發明之抗體可具有抗體之抗原結合部的抗體之機能性片段或其修飾物。以木瓜酵素、胃蛋白酶等蛋白質分解酵素處理抗體，或經由基因工程技術將抗體基因改變的適當培養細胞中使其表現，可獲得該抗體之片段。此等抗體片段中，保持具有抗體全長分子機能之全部或一部分的片段可稱為抗體之機能性片段。作為抗體之機能，一般而言可列舉抗原結合活性、中和抗原活性之活性、增強抗原活性之活性、抗體依存性細胞抑制活性、補體依存性細胞傷害活性及補體依存性細胞性細胞傷害活性。本發明之抗體之機能性片段所保持的機能，為對Siglec-15之結合活性，較佳為抑制破骨細胞形成之活性，更佳為抑制破骨細胞之細胞融合之過程的活性。
例如，作為抗體之片段，可列舉Fab、F(ab’)2、Fv、或以適當連結物連結重鏈及輕鏈之Fv之單鏈Fv(scFv)、雙功能抗體(diabodies)、線狀抗體、及抗體片段所形成的多專一性抗體等。又，於還原F(ab’)2之條件處理的抗體之可變區之一價片段的Fab’亦包含於抗體之片段。
再者，本發明抗體亦可為對至少2種類相異抗原具有專一性的多專一性抗體。通常此等分子為結合2個抗原者(即，雙專一性抗體(bispecific antibody))，本發明之「多專一性抗體」為包含對此等以上(例如，3種類)抗原具有專一性的抗體者。
本發明之多專一性抗體係由全長構成的抗體、或此等抗體之片段(例如，F(ab’)2雙專一性抗體)。雙專一性抗體亦可為結合2種類抗體之重鏈與輕鏈(HL對)而製作者，亦可經由使產生相異單株抗體的融合瘤融合而製作出雙專一性抗體產生融合細胞，製作本發明之抗體(Millstein et al.,Nature(1983)305,p.537-539)。
本發明之抗體可為單鏈抗體(亦記載為scFv)。單鏈抗體可經由以多胜肽連結物連結抗體之重鏈可變區與輕鏈可變區而得(Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,113(Rosenburg及Moore編,Springer Verlag,New York,p.269-315(1994)；Nature Biotechnology(2005),23,p.1126-1136)。又，2個scFv以胜肽連結物結合而製作的BiscFv片段亦可作為二重專一性抗體使用。
製作單鏈抗體之方法為該技術領域中眾所皆知(例如，參照美國專利第4,946,778號、美國專利第5,260,203號、美國專利第5,091,513號、美國專利第5,455,030號等)。此scFv中,重鏈可變區與輕鏈可變區為不作成共軛物的方式的連結物，較佳為藉由多胜肽連結物連結(Huston,J. S. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.(1988),85,p.5879-5883)。scFv之重鏈可變區及輕鏈可變區可來自同一抗體，亦可來自別的抗體。
作為連結可變區的胜肽連結物，例如使用12～19個殘基所構成的任意一條鏈胜肽。
編碼scFv的DNA可由下述方式獲得，於編碼前述抗體之重鏈或重鏈可變區的DNA、及編碼輕鏈或輕鏈可變區的DNA中，以編碼此等序列中之全部或所冀望之胺基酸序列的DNA部分為模板，經由使用規定此兩端的引子對的PCR法增幅，其次，又經由組合編碼胜肽連結物部分的DNA、及其兩端各別連結重鏈、輕鏈的方式規定的引子對增幅而被獲得。
又，一旦編碼scFv的DNA被製作，含有此等的表現載體、及經該表現載體轉形的宿主可依據通常方法獲得，又，經由使用此宿主，可依通常方法獲得scFv。此等抗體片段可與前述相同樣地取得基因使其表現，而由宿主產生。
本發明之抗體可為多量化而對抗原提高親和性者。作為多量化的抗體，可為1種類抗體，亦可為認識相同抗原之複數個抗原決定位的複數個抗體。作為將抗體多量化之方法，可舉例IgG CH3功能域與2個scFv之結合、與鏈黴抗生物素之結合、helix turn-helix motif之導入等。
本發明之抗體可為胺基酸序列為相異的複數種類之抗Siglec-15抗體之混合物，亦可為多株抗體。作為多株抗體之一例，可列舉CDR為相異的複數種類之抗體之混合物。作為此等多株抗體，可培養產生相異抗體的細胞之混合物，使用自該培養物純化的抗體而完成(參照WO2004/061104號)
作為抗體之修飾物，亦可使用與聚乙二醇(PEG)等各種分子結合的抗體。
本發明之抗體，亦可進一步將此等抗體與其他藥劑形成免疫共軛物(Immunoconjugate)。作為此等抗體之例，可列舉該抗體為與具有放射性物質或藥理作用的化合物結合之物(Nature Biotechnology(2005)23,p.1137-1146)。
所得抗體可純化至均一。抗體之分離、純化可使用通常蛋白質使用的分離、純化方法。例如可適宜選擇層析管柱、過濾器過濾、超過濾、鹽析、透析、調製用聚丙烯醯胺膠體電泳、等電點電泳等，組合此等，可將抗體分離、純化(Strategies for Protein Purification and Charcterization：A Laboratoy Course Manual,Daniel R. Marshak et al. eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996)；Antibodies：A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988))，但未限於此等。
作為層析，可舉例親和性層析、離子交換層析、疏水性層析、凝膠過濾、逆相層析、吸附層析等。
此等之層析可使用HPLC或FPLC等液相層析進行。
作為親和性層析所用的管柱，可舉例蛋白質A管柱、蛋白質G管柱。
例如使用蛋白質A作為管柱，可舉例Hyper D、POROS、Sepharose F. F.(Pharmacia)等。
又使用固定化抗原的載體，利用對抗原的結合性亦可純化抗體。
4.含有抗Siglec-15抗體之醫藥
於上述之「3.抗Siglec-15抗體之製造」項目中記載之方法所得抗Siglec-15抗體中，可獲得中和Siglec-15之生物活性的抗體。此等中和Siglec-15之生物活性的抗體，由抑制活體內之Siglec-15之生物活性，即抑制破骨細胞之分化及/或成熟，可使用作為醫藥，作為對破骨細胞之分化及/或成熟異常所造成之骨代謝異常的治療劑。骨代謝異常可為由實質骨喪失(骨減少症或骨溶解症)所賦予特徵的任一障礙。一般而言，以抗Siglec-15抗體治療及/或預防，適用於抑制骨吸收為必要的場合。作為以抗Siglec-15抗體可治療及/或預防的骨代謝異常，可舉例骨質疏鬆症(閉經後骨質疏鬆症、老人性骨質疏鬆症、類固醇或免疫抑制劑等治療用藥劑之使用而之續發性骨質疏鬆症、伴隨關節類風濕之骨質疏鬆症)、伴隨關節類風濕之骨破壞、癌性高鈣血症、多發性骨髓瘤或伴隨癌之骨轉移之骨破壞、巨細胞瘤、骨減少症由齒根膜造成的齒喪失、人工關節周圍之骨融解、慢性骨髓炎之骨破壞、骨貝西氏病、腎性骨異營養症、骨形成不全症等，但只要是伴隨破骨細胞之實質骨喪失的疾病即可，未限於此等。作為上述醫藥之抗Siglec-15抗體之例，可舉例自# 32A1抗體之3.(3)「其他抗體」所記載之方法而製作的嵌合抗體或人化抗體。又，具有與# 32A1抗體相同抗原決定位的嵌合抗體、人化抗體及人類抗體亦可作為醫藥使用。有些抗Siglec-15抗體，具有與# 32A1抗體相同的抗原決定位者指對於Siglec-15之特定部分胜肽，可經由觀察此等抗體是否共通地結合而確認。又，有些抗Siglec-15抗體若於與Siglec-15之結合而與#32A1抗體競爭，可判定此等抗體具有共通的抗原決定位。
經由活體外之抗Siglec-15抗體之Siglec-15的生物活性之中和活性，例如，可對過度表現Siglec-15之細胞測定破骨細胞分化之抑制活性。例如，來自小鼠單核球之細胞株RAW264.7細胞或RAW264細胞中添加各種濃度之抗Siglec-15抗體，經由RANKL或TNF-α刺激，可測定對破骨細胞之分化之抑制活性。又，來自骨髓之初代培養細胞中添加各種濃度之抗Siglec-15抗體，由RANKL、TNF-α或活性型維生素D3 刺激，可測定對破骨細胞分化之抑制活性。又，於正常人類破骨前驅細胞(Normal Human Natural Osteoclast Precursor Cells，可購自三光純藥，目錄編號2T-110)添加各種濃度之抗Siglec-15抗體，經由RANKL及M-CSF刺激，可測定向破骨細胞分化之抑制活性。此等破骨細胞之分化抑制效果，可以破骨細胞之酒石酸耐性酸性磷酸酶(TRAP)活性之抑制作為指標測定。又，TRAP陽性多核破骨細胞之形成之抑制，即破骨細胞之細胞融合之抑制作為指標，可測定破骨細胞之分化抑制效果。又，於使用來自大腿骨及/或脛骨之細胞的凹洞形成分析法(Takada et al.,Bone and Mineral,(1992)17,347-359)實驗，來自大腿骨及/或脛骨之細胞中添加各種濃度之抗Siglec-15抗體於象牙切片上觀察凹洞形成，可於活體外測定經由破骨細胞之骨吸收之抑制活性。作為活體外中由於破骨細胞之骨吸收的抑制活性的測定系統，亦可使用塗布結合銪的人類膠原蛋白的平盤。利用活體內之實驗動物抗Siglec-15抗體對骨代謝異常之治療效果，例如，於骨質疏鬆症模式動物或過度表現Siglec-15之轉基因動物投與抗Siglec-15抗體，可測定破骨細胞之變化而確認。
如此所得中和Siglec-15生物活性之抗體，作為醫藥，特別是作為骨質疏鬆症、伴隨關節類風濕之骨破壞、伴隨癌之骨轉移之骨破壞等之骨代謝異常之治療為目的醫藥組成物，或此等疾病之免疫學的診斷用之抗體為有用的。
於關節類風濕(RA)之治療，伴隨疾病發作而發生的骨喪失成為大課題。關於伴隨RA之骨喪失，已報告破骨細胞為中心作用的結果。認為是作為RA之破骨細胞之誘導(分化、成熟)、活性化、及骨破壞之原因最重要的胞激素為RANKL與TNF-α(Romas E et al.,Bone 30,p340-346,2002)。為RANKL之誘騙受體的OCIF/OPG以RANKL誘導的破骨細胞形成可抑制，但以TNF-α誘導的破骨細胞形成未被抑制。另一方面，依據本發明之抗Siglec-15抗體，以RANKL誘導的破骨細胞形成與以TNF-α誘導的破骨細胞形成兩者皆被有效果地抑制。因此，依據本發明之抗Siglec-15抗體，於RA等經TNF-α誘導的骨喪失與骨破壞破壞可期待為RANKL阻斷劑(OCIF/OPG、抗RANKL抗體等)以上而強力地抑制。
抗Siglec-15抗體，其一例為對骨代謝異常之治療或預防，可以該抗體單獨或至少一種骨疾病治療劑一起投與。又其一例為抗Siglec-15抗體可與治療上有效量之抗骨代謝異常治療藥劑一起投與。可與抗Siglec-15抗體併用投與的治療劑可舉例雙膦酸酯(例如，alendronate、etidronate、ibandronate、incadronate、pamidronate、risedronate、或zoledronate)、活性型維生素D3 、抑鈣素及其衍生物、雌二醇等之荷爾蒙製劑、SERMs(選擇性雌激素受體調節劑)、依普黃酮、維生素K2 (四烯甲萘醌)、鈣製劑、PTH(副甲狀腺荷爾蒙(parathyroid hormone))、非類固醇性抗炎症劑(例如，賽來昔布(celecoxib)或羅非考昔(rofecoxib))、可溶性TNF受體(例如，etanercept)、抗TNFα抗體或該抗體之機能性片段(例如，infliximab)、抗PTHrP(副甲狀腺荷爾蒙相關蛋白質)抗體或該抗體之機能性片段、IL-1受體拮抗劑(例如anakinra)、抗IL-6受體抗體或該抗體之機能性片段(例如，tocilizumab)、抗RANKL抗體或該抗體之機能性片段(例如，denosumab)、及OCIF(破骨生成抑制因子)等但未限於此等例。針對骨代謝異常之狀態或何種程度之治療及/或預防，亦可投與2、3或以上種類之藥劑，經由將此等藥劑封入相同製劑中可一起供給。經由將此等藥劑與抗Siglec-15抗體封入相同製劑中亦可一起供給。又，此等藥劑可經由封入作為治療及/或預防用套組而同時供給。又，此等之藥劑與抗Siglec-15抗體亦可分別供給。於基因治療投與的場合，蛋白質性之骨疾病治療劑之基因與抗Siglec-15抗體之基因可插入各別或相同啟動子區的下游，可導入分別或相同的載體。
經由使骨疾病治療劑結合抗Siglec-15抗體、或其片段，可製造M. C. Garnet「Targeted Drug conjugates:principles and progress」,Advanced DrugDe1ivery Reviews,(2001)53,171-216記載之標的型藥物複合體。於此目的，抗體分子方面只要破骨細胞之認識性未完全消失，任一抗體片段亦可適用，例如，可舉例Fab、F(ab’)2、Fv等片段，於本發明亦同樣地，可使用抗體及該片段。抗Siglec-15抗體或該抗體之片段與骨疾病治療劑之結合樣式，可有M.C.Garnet「Targeted Drug conjugates:principles and progress」，Advanced DrugDelivery Reviews,(2001)53,171-216、G.T.Hermanson「Bioconjugate Techniques」Academic Press,California(1996)、Putnam and J.Kopecek「Polymer Conjugates with Anticancer Activity」Advances in Polymer Science(1995)122,55-123等記載之各種形態。即，可列舉抗Siglec-15抗體與骨疾病治療劑以化學性直接或隔著寡胜肽等間隔物結合的樣式，或隔著適當藥物載體結合的樣式。作為藥物載體之例，可列舉微脂體(liposome)或水溶性高分子。作為隔著此等藥物載體的樣式，更具體而言，可舉抗體與骨疾病治療劑包含於微脂體，該微脂體與抗體結合的樣式、及骨疾病治療劑與水溶性高分子(分子量1000至10萬左右之化合物)化學性直接或隔著寡胜肽等間隔物結合，該水溶性高分子結合抗體的樣式為例。抗體(或該片段)與骨疾病治療劑、微脂體及水溶性高分子等之藥物載體之結合可經由G.T.Hermanson「Bioconjugate Techniques」Academic Press,CaliforniA(1996)、Putnam and J. Kopecek「Polymer Conjugates with Anticancer Activity」Advances in Polymer Science(1995) 122,55-123記載之方法等本項業者周知之方法實施。將骨疾病治療劑包含於微脂體者可經由D.D.Lasic「Liposomes：From Physics to Applications」，Elsevier Science Publishers B.V.,Amsterdam(1993)等記載之方法等本項業者周知之方法實施。骨疾病治療劑之結合水溶性高分子者，可經由D.Putnam and J Kopecek「Polymer Conjugates with anticancer Activity」Advances in Polymer Science(1995) 122,55-123記載之方法等本項業者周知之方法可實施。抗體(或該片段)與蛋白質性之骨疾病治療劑(或該片段)之複合體，於上述方法者，可經由基因工程之本項業者周知之方法製作。
本發明亦提供包含治療及/或預防上有效量之抗Siglec-15抗體與藥學上容許的稀釋劑、載劑、可溶化劑、乳化劑、保存劑及/或輔助劑之醫藥組成物。
本發明亦提供包含治療及/或預防上有效量之抗Siglec-15抗體與治療及/或預防上有效量之至少一種骨疾病治療劑與藥學上容許的稀釋劑、載劑、可溶化劑、乳化劑、保存劑及/或輔助劑。作為骨疾病治療劑，可列舉雙膦酸酯、活性型維生素D3 、抑鈣素及其衍生物、雌二醇等之荷爾蒙製劑、SERMs(selective estrogen receptor modulators)、依普黃酮、維生素K2 (四烯甲萘醌)、鈣製劑、PTH(副甲狀腺荷爾蒙)、非類固醇性抗炎症劑、可溶性TNF受體、抗TNFα抗體或該抗體之機能性片段、抗PTHrP(副甲狀腺荷爾蒙相關蛋白質)抗體或該抗體之機能性片段、IL-1受體拮抗劑、抗IL-6受體抗體或該抗體之機能性片段、抗RANKL抗體或該抗體之機能性片段及OCIF(破骨生成抑制因子)等，但未限於此等。
本發明之醫藥組成物中作為容許製劑使用之物質較佳為於投與量或投與濃度中對投與醫藥組成物者為非毒性者為較佳。
本發明之醫藥組成物可包含用以將pH、浸透壓、黏度、透明度、顏色、等張性、無菌性、安定性、溶解率、徐放率、吸收率、浸透率改變、或保持之製劑用物質。製劑用物質可舉例以下之物，但未限於此等：甘胺酸、丙胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、精胺酸或離胺酸等之胺基酸類、抗菌劑、抗壞血酸、硫酸鈉或亞硫酸氫鈉等之抗氧化劑、磷酸、檸檬酸、硼酸緩衝液、碳酸氫鹽、Tris-鹽酸(Tris-Hcl)溶液等之緩衝劑、甘露糖醇或甘胺酸等之填充劑、乙二胺四乙酸(EDTA)等之螯合劑、咖啡因、聚乙烯吡咯啶、β-環糊精或羥基丙基-β-環糊精等錯化劑、葡萄糖、甘露糖或糊精等增量劑、單糖類、二糖類等其他碳水化合物、著色劑、香味劑、稀釋劑、乳化劑或聚乙烯吡咯啶等親水聚合物、低分子量多胜肽、鹽形成對離子、氯化苄烷銨、苯甲酸、柳酸、硫柳汞、苯乙醇、對羥苯甲酸甲酯、對羥苯甲酸丙酯、醋酸氯己啶(Chlorhexidine)、山梨酸或過氧化氫等防腐劑、甘油、丙二醇或聚乙二醇等溶劑、甘露糖醇或山梨糖醇等糖醇、懸浮劑、山梨糖醇酐酯、聚山梨酸酯20或聚山梨酸酯80等聚山梨酸酯、三硝基甲苯(triton)、胺基丁三醇(tromethamine)、卵磷脂或膽固醇等界面活性劑、蔗糖或山梨糖醇等安定化增強劑、氯化鈉、氯化鉀或甘露糖醇‧山梨糖醇等彈性增強劑、輸送劑、賦形劑、及/或藥學上之輔助劑。此等之製劑用物質之添加量，相對於抗Siglec-15抗體之重量為0.01～100倍，尤其以0.1~10倍添加較佳。製劑中適宜醫藥組成物之組成可由業者依適用疾病、適用投與路徑等適宜決定。
醫藥組成物中之賦形劑或載劑可為液體亦可為固體。適當賦形劑或載劑可為注射用之水或生理食鹽液、人工腦脊髓液或非經口投與通常用之其他物質。亦可使用含有中性之生理食鹽液或血清蛋白素之生理食鹽液為載劑。於醫藥組成物亦可含有pH 7.0-8.5之Tris緩衝液或pH 4.0-5.5之乙酸緩衝液、pH 3.0-6.2之檸檬酸緩衝液。又，此等之緩衝液中亦可含有山梨糖醇或其他化合物者。本發明之醫藥組成物可舉例為含有抗Siglec-15抗體之醫藥組成物以及含有Siglec-15抗體及至少一種骨疾病治療劑之醫藥組成物。本發明之醫藥組成物作為具有經選擇的組成及必要純度的藥劑，準備成凍乾品或液體。含抗Siglec-15抗體之醫藥組成物以及含抗Siglec-15抗體及至少一種骨代謝異常治療藥劑之醫藥組成物亦可使用蔗糖等適當賦形劑成型為凍乾品。
本發明之醫藥組成物可調製成非經口投與用，亦可調製成經口之消化道吸收用。製劑之組成及濃度可依投與方法來決定，本發明之醫藥組成物所含抗Siglec-15抗體對Siglec-15之親和性，即相對於Siglec-15之解離常數(Kd值)，親和性越高(Kd值低)，即使對人之投與量少仍可發揮藥效，故可基於此結果而決定本發明之醫藥組成物對人之投與量。投與量為將人類型抗Siglec-15抗體投與人之時，以約0.1~100mg/kg於1~180日投與1次為宜。
作為本發明之醫藥組成物之形態，可舉例包括點滴之注射劑、栓劑、經鼻劑、舌下劑、經皮吸收劑等。
實施例
以下，本發明依實施例具體說明，但本發明並未限於此等實施例。又，下述實施例中與基因操作有關的各操作只要未特別指明，則依「分子選殖(Molecular Cloning)」(Sambrook,J.,FritSch,E. F.及Maniatis,T.著,Cold Spring Harbor Laboratory Press於1989年發刊)記載之方法進行，或使用市售試藥或套組時依市售品之指示書使用。
實施例1可溶型小鼠Siglec-15蛋白質之表現構築體之製作
編碼小鼠Siglec-15蛋白質細胞外領域部分之核酸序列為序列表之序列編號5，胺基酸序列為序列表之序列編號6。經由利用此等部分序列，於動物細胞等培養上清液中可產生可溶型小鼠Siglec-15蛋白質。
a)由可溶型小鼠Siglec-15基因之PCR之增幅
以具有PCR增幅用之引子序列的寡核苷酸，依通常方法合成小鼠Siglec-15之細胞外領域cDNA。
5’-ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt caccATGGAGGGGTCCCTCC AACTC-3’(mSiglec-15-ECD-F：序列表之序列編號7)及5’-ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc TCCGGGGGCG CCGTGGAAGC GGAAC-3’(mSiglec-15-ECD-R：序列表之序列編號8)，又，此等引子以作為Gateway Entry選殖株製作用增幅用引子，於mSiglec-15-ECD-F附加attB1序列，於mSiglec-15-ECD-R附加attB2序列的方式設計。使用此引子之組合，與含小鼠Siglec-15之開放讀碼框序列的多核苷酸作為模版，依通常方法進行PCR。溫度循環器之設定條件為，於94℃加熱5分鐘後，重複「94℃0.5分鐘、55℃0.5分鐘、68℃1.5分鐘」之溫度循環15次後，於68℃下加熱5分鐘，於4℃保溫。
b)由Gateway BP反應製作Entry選殖株
由應用λ噬菌體之部位專一性重組系統的Gateway Technology(Invitrogen公司)，以下列方法製作組合小鼠Siglec-15細胞外領域之cDNA的Entry選殖株。首先，a)所製作之於兩端具有attB序列的PCR產物，與具有attP序列的供予者載體的pDNOR221(Invitrogen公司製)之間，進行使用BP Clonase的BP反應。使用此反應液轉形大腸菌DH10B，對藥劑耐性選殖株進行群落PCR(clony PCR)，確認插入物大小。於確認插入物大小為正確的選殖株，實施插入物之全DNA序列之序列解析的結果，獲得與編碼作為目的之小鼠Siglec-15蛋白質之細胞外領域的核酸序列(序列表之序列編號5)完全一致的Entry選殖株。
c)由Gateway LR反應製作表現選殖株
由應用λ噬菌體之部位專一性重組系統的Gateway Technology(Invitrogen公司)，以下列方法製作組合小鼠Siglec-15細胞外領域之cDNA的表現選殖株。b)製作的Entry選殖株於插入物之兩端具有attL序列。此Entry選殖株，與具有attR序列的2種類目的載體之間進行使用LR Clonase之LR反應。又目的載體，使用以插入物之C末側附加V5抗原決定位及6×His標籤的方式設計的pDONM、及插入物之C末側附加人類Fc標籤的方式設計的phIgFc之2種類。使用由LR反應所得反應液轉形大腸菌DH10B，對所得藥劑耐性選殖株進行菌落PCR，確認插入物大小。於確認插入物大小為正確的選殖株，進行由插入物側之載體側兩末端之序列解析。
定序用引子序列：
5’-tgcgtgaagg tgcagggcag-3’(mSiglec-15-ECD-seq-upstm：序列表之序列編號9)及5’-cctcgcctgg tcgggtc-3’(mSiglec-15-ECD-seq-dnstm：序列表之序列編號10)
序列解析之結果，各自獲得pDONM及phIgFc兩者為正確重組的表現選殖株(可溶型小鼠Siglec-15/pDONM及可溶型小鼠Siglec-15/phIgFc)。經由將可溶型小鼠Siglec-15/pDONM轉染於動物細胞等，具有序列表之序列編號11所記載之鹼基序列的mRNA被轉錄，具有序列表之序列編號12所記載之胺基酸序列的蛋白質(小鼠Siglec-15-His)被轉譯。經由將可溶型小鼠Siglec-15/phIgFc轉染於動物細胞等，具有序列表之序列編號13所記載之鹼基序列的mRNA被轉錄，具有序列表之序列編號14所記載之胺基酸序列的蛋白質(小鼠Siglec-15-Fc)被轉譯。
實施例2含有使用293-F細胞的可溶型小鼠Siglec-15蛋白質之培養液之大量調製
各自調製約5mg之實施例1所得的2種類表現載體(可溶型小鼠Siglec-15/pDONM及可溶型小鼠Siglec-15/phIgFc)。又，自大量培養的大腸菌之質體純化上使用Invitrogen PureLink HiPure Plasmid Gigaprep Kit (Invitrogen公司製)。經調製的質體與Opti-MEM(Invitrogen公司製)混合，經過濾器滅菌後，添加10ml轉染試藥293fectin(Invitrogen公司製)，於室溫培育20分鐘。將此混和液於FreeStyle 293表現培養基(Invitrogen公司製)中以1.1×106 細胞/ml×5L(1L/燒瓶為5瓶)的方式添加於愛倫美氏燒瓶(Erlenmeyer flask)中培養的FreeStyle 293-F細胞(Invitrogen公司製)。於8.0% CO2 濃度、37℃下旋轉培養(125次旋轉/分鐘)96小時(4日)後回收培養液，調製離心分離後之培養上清液。於如此調製的培養上清液中，小鼠Siglec-15之細胞外領域C末側附加V5抗原決定位及6×His標籤的蛋白質(小鼠Siglec-15-His)及C末側附加人類Fc標籤的蛋白質(小鼠Siglec-15-Fc)被認為各自表現。
實施例3小鼠Siglec-15-His之純化
a) HisTrap HP管柱層析
於實施例2調製的小鼠Siglec-15-His表現293F細胞之培養液2L中添加225ml之10x緩衝液(500mM TriS，1.5M NaCl，200mM咪唑，pH8.0)充分攪拌後以Sterivex GV過濾器(Millipore公司製)過濾。於預先致熱質除去劑‧PyroCLEAN(ALerCHEK公司製)處理並以注射用蒸餾水洗淨的HisTrap HP 5ml之3根直列管柱(Amersham Bioscience公司製)中，以流速2ml/min注入此培養液。使用60ml含300mM NaCl的50mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)以流速1ml/min洗淨管柱後，使用50ml含有300mM NaCl、500mM咪唑之50mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)以流速1ml/min將吸附管柱的蛋白質溶出。溶出液於預先添加10μl之10%Tween 20的Mini-sorp tube(Nunc公司製)以1ml/Fr.分取。將含溶出的蛋白質的部份約20ml(Fr.14-20)以離心膜濃縮器Amicon Ultra-15(Millipore公司製)濃縮為2.5ml後，加在以含0.01% Tween 20的磷酸鹽緩衝生理食鹽水(T-PBS)平衡化的PD-10脫鹽管柱(Amersham Bioscience公司製)上，以T-PBS溶出，獲得溶劑置換為T-PBS的樣品3.5ml。
b) Resource Q管柱層析
以HisTrap HP層析柱純化的TBS-P置換樣品3.5ml中添加22.5ml含有0.1%CHAPS的50mM Tris-HCl緩衝液(pH7.5)並攪拌後，於4℃以3,000r.p.m.離心30分鐘除去沈澱物。此上清液以Millex GV過濾器(Millipore公司製)過濾後以流速1ml/min加到含有0.1% CHAPS的50mM Tris-HCl緩衝液(pH7.5)預先平衡化的Resource Q 6ml管柱(Amersham Bioscience公司製)中，連續使用此緩衝液以流速1ml/min洗淨管柱，收集未吸附於管柱的蛋白質部份。吸附於管柱的蛋白質，使用含有0.1%CHAPS，1M NaCl的50mM Tris-HCl緩衝液(pH7.5)以流速1ml/min溶出。將未吸附管柱的部份26.5ml，以離心膜濃縮器Amicon Ultra-15(Millipore公司製)濃縮為2.0ml後，於4℃以3,000r.p.m.離心10分鐘而除去沈澱物。離心後之上清液於使用前凍結保存於-80℃。重複2次如上之純化操作(HisTrap HP層析柱、Resource Q層析柱)來實施。
c)純化的小鼠Siglec-15-His之檢出與純度檢定
使用於上述之純化操作(HisTrap HP層析柱、Resource Q層析柱)調製的樣品於還原條件下進行SDS-聚丙烯醯胺電泳及銀染色。即，於各純化階段之樣品5μl添加同量之SDS-處理液，於95℃熱處理10分鐘。使用經熱處理的各樣品0.3μ1於SDS-聚丙烯醯胺電泳。使用8-25%聚丙烯醯胺梯度膠體(Amersham Bioscience公司製)作為電泳凝膠，電泳使用PhastSystem(Amersham Bioscience公司製)來實施。又使用Rainbow分子量標記(Amersham Bioscience公司製)作為分子量標記。電泳終了後，使用PhastGel Silver Kit(Amersham Bioscience公司製)及PhastSystem進行銀染色，此結果示於第1圖。顯示未吸附於Resource Q管柱之蛋白質部份中分子量約35kDa之蛋白質(小鼠Siglec-15-His)被有效率地純化濃縮。
除使用作為分子量標記之ECL DuA/Vue Western Blotting Markers(Amersham Bioscience公司製)之外，於相同於上述條件下將經電泳的凝膠中的蛋白質使用PhastTransfer Semi-dry Transfer Kit(Amersham Bioscience公司製)及PhastSystem轉移(墨漬(blot))於PVDF膜(Hybond-P，Amersham Bioscience公司製)。將此PVDF膜移至含0.1% Tween 20之阻斷劑(BlockAce，雪印乳業公司製)10ml中，於室溫緩慢振動1小時。於此阻斷溶液添加S-protein HRP溶液(Amersham Bioscience公司製)10μl及抗V5-HRP抗體(Monoclonal Antibody to Pk-TAG-HRP；Acris Antibodies公司製)10μl，於室溫進一步緩慢振動1小時。此PVDF膜於含0.01% Tween 20之磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)50ml中一邊緩慢振動5分鐘一邊洗淨4次。洗淨後，將PVDF膜依ECL偵測套組(ECL Western blotting detection reagents and analysis system，Amersham Bioscience公司製)之指示書處理而此蛋白質之帶發色使用ECL mini-camera(Amersham Bioscience公司製)及Polaroid Film(Polapan 3200B，Polaroid公司)檢出。結果示於第2圖。由此結果可確認對抗V5-HRP抗體反應的分子量約35kDa之蛋白質(小鼠Siglec-15-His)並未吸附於ResourceQ管柱的蛋白質部份被有效率地純化濃縮。
d)經純化小鼠Siglec-15-His之蛋白質濃度之測定
於純化小鼠Siglec-15-His(未吸附於Resource Q管柱的蛋白質部份)，使用牛血清蛋白作為標準樣品，以DC-蛋白質試驗套組(BioRad公司製)測量蛋白質濃度。如表1所示，2次純化操作獲得合計1.66mg之純化小鼠Siglec-15-His蛋白質。
實施例4小鼠Siglec-15-Fc之純化
a)HiTrap蛋白質A管柱層析
將實施例2所調製的小鼠Siglec-15-Fc表現293F細胞之培養液1.8L以Sterivex GV過濾器(Millipore公司製)過濾後以流速5ml/min加到預先以Dulbecco PBS(D-PBS，Invitrogen公司製)平衡化的HiTrap蛋白質A 5ml管柱(Amersham Bioscience公司製)。使用D-PBS以流速5ml/min洗淨管柱後，使用50ml 0.1M檸檬酸鈉緩衝液(pH3.0)以流速5ml/min將吸附於管柱的蛋白質溶出。溶出液於Mini-sorp tube(Nunc公司製)以5ml/Fr.分取後，直接加入1M Tris1.3ml中和。經溶出的蛋白質為被檢出的部份(Fr.1，2)，以離心膜濃縮器Amicon Ultra-15(Millipore公司製)濃縮為2.5ml後，於含0.01% Tween 20的大塚注射用生理食鹽水(TO-SS，大塚製藥公司製)平衡化的PD-10脫鹽管柱(Amersham Bioscience公司製)以TO-SS溶出，獲得將溶劑置換為TO-SS的樣品3.5ml。此樣品於使用前凍結保存於-80℃。使用2.9L之293F細胞培養液，再實施1次重複相同之純化操作。
b)經純化小鼠Siglec-15-Fc之檢出及純度檢定
使用上述純化操作所調製的樣品進行還原條件下之SDS-聚丙烯醯胺電泳及銀染色。即，於各純化步驟之樣品5μl添加同量之SDS-處理液，於95℃加熱10分鐘。使用經熱處理的各樣品以1/2濃度之SDS-處理液稀釋1/300或1/900倍的樣品0.3μl於SDS-聚丙烯醯胺電泳。電泳及銀染色以相同於實施例3之c)記載之小鼠Siglec-15-His之純度檢定的方法實施，此結果與以小規模之預備純化條件檢討之結果(應用的培養液之pH為8.9或7.0)一起示於第3圖。顯示自HiTrap蛋白質A管柱溶出的蛋白質部份中分子量約55kDa之蛋白質(小鼠Siglec-15-Fc)被有效率地純化濃縮。
c)經純化小鼠Siglec-15-Fc之蛋白質濃度之測定
於經純化小鼠Siglec-15-Fc(自PD-10脫鹽管柱溶出的蛋白質部份)，使用牛血清白蛋白作為標準樣品，以DC-蛋白質試驗套組(BioRad公司製)測定蛋白質濃度。如表2所示，2次純化操作獲得合計92mg之經純化小鼠Siglec-15-Fc蛋白質。
實施例5大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體產生融合瘤之建立
a)抗原之調製
實施例3製作之小鼠Siglec-15-His蛋白質以成為100μg/0.5ml的方式調製，添加同量佐劑於玻璃注射器而製作成乳劑。又佐劑僅於初次免疫時使用弗式完全佐劑(Freund’s Complete Adjuvant)(FCA，DIFCO公司製)，第2次以後使用弗式不完全佐劑(Freund’s Incomplete Adjuvant)(FICA，DIFCO公司製)。
b)對大鼠之免疫
使用4隻大鼠(Wistar，雌性，6週齡，購自日本CLEA公司)作為免疫動物。a)所得乳劑以抗原量為50μg/大鼠的方式使用27G注射針注射於皮下及皮內。以後每7日實施合計實施4次之免疫。自第4次免疫7日後由尾靜脈採少量(200μ l)血，調製抗血清。為確認抗血清之抗體力價，使用小鼠Siglec-15-His蛋白質作為抗原，實施將實施例4所製作的小鼠Siglec-15-Fc蛋白質、或牛血清白蛋白(BSA)固相化的ELISA。由此結果認為4隻大鼠(大鼠No.1～4)任一者皆對小鼠Siglec-15-His蛋白質及小鼠Siglec-15-Fc蛋白質有反應性。另一方面，不認為對BSA有反應性。由以上結果，因確認經免疫的大鼠血清中之抗體力價上昇，於抗體力價最高的No.2大鼠進行細胞融合操作。
c)細胞融合
細胞融合一般依據小鼠(大鼠)脾臟細胞與骨髓瘤細胞之融合法實施。大鼠以乙醚麻醉下自心臟全採血而安樂死，之後摘出脾臟。將經採取的脾臟細胞與為小鼠骨髓瘤細胞的P3X63Ag8.653細胞(ATCC CRL 1580)，使用聚乙二醇(PEG)使細胞融合。將細胞接種於96孔平盤，添加含有次黃嘌呤(hypoxanthine(H))‧胺基喋呤(Aminopterin(A)).胸腺嘧啶(thymidine(T))之培養基(HAT選擇培養基)培養7～10日。採取經細胞融合的融合瘤之生存被確認的61孔培養上清液，使用作為抗原之小鼠Siglec-15-His蛋白質、實施例4所製作的小鼠Siglec-15-Fc蛋白質、或將BSA固相化的ELISA評價抗體力價，篩選抗小鼠Siglec-15單株抗體產生融合瘤。由篩選結果，選出抗體力價高的12孔，進一步進行選殖其中之融合瘤的操作。
d)融合瘤之選殖
於選出的融合瘤，以限界稀釋法作1次選殖。限界稀釋後之培養進行2週，培養上清液中之抗體力價之確認以實施例4製作的小鼠Siglec-15-Fc蛋白質或固相化BSA之ELISA實施。於認為是陽性選殖株的11選殖株中，經由進一步實施2次選殖(與1次選殖相同的作業)，最終建立10個選殖株之抗小鼠Siglec-15單株抗體產生融合瘤(#1A1、#3A1、#8A1、#24A1、#32A1、#34A1、#39A1、#40A1、#41B1、#61A1)。又，融合瘤#32A1已於2008年8月28日寄存於日本國獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄存中心(所在地：郵遞區號305-8566日本國茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6)，以抗-Siglec-15融合瘤#32A1之名稱賦予寄存編號FERM BP-10999。
實施例6大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體之調製
a)　裸鼠腹水之調製
將實施例5建立的融合瘤使用含有10% FCS之TIL培養基I((股)免疫生物研究所製)培養基培養。又，細胞之繼代係每2～3日實施1次以約5×105 細胞/ml時增殖的時點為目標稀釋4分之1左右的作業。於投與降植烷(Pristane)於腹腔內之前(0.2ml/小鼠)的裸鼠，將培養的融合瘤以成為1×107 細胞/小鼠的方式移植到腹腔內。於移植，使用10個選殖株之融合瘤各自接種的各3隻裸鼠。移植後，於腹水蓄積非常明顯的時點採取腹水，收集各融合瘤3種成為1種而測定採取量後，凍結保存至抗體之純化。於各融合瘤之腹水採取量摘述於表3。
b)抗體之純化
將採取腹水之全量供給於使用20ml之蛋白質G管柱(GE Healthcare公司製)的IgG之純化。經純化IgG以凝膠過濾分析(Superdex 200層析柱)進行純度檢定，一部份以離心膜濃縮。即，經純化抗小鼠Siglec-15單株抗體中，將除了#24A1抗體外之9種類抗體使用離心膜濃縮器Amicon Ultra-15(Millipore公司製)於3000r.p.m.、4℃下30～60分鐘離心而濃縮為約6倍～8倍。接著，於#24A1抗體及經濃縮的其他9種類抗體，使用牛血清白蛋白(BSA)作為標準樣品，以DC-蛋白質試驗套組(BioRad公司製)測定蛋白質濃度。經由以上操作，調製抗小鼠Siglec-15單株抗體。
實施例7大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體之對小鼠Siglec-15蛋白質的結合性評價
大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體對小鼠Siglec-15蛋白質之結合性由ELISA法評價。實施例4所製作的小鼠Siglec-15-Fc蛋白質以成為5μg/ml的方式以0.1M碳酸鈉緩衝液(pH 9.5)稀釋，於96孔平盤(NalgeNunc公司製，目錄編號：430341)以100μl/孔添加。於室溫放置1小時後除去溶液，添加300μl/孔之洗淨緩衝液(含有0.05% Tween 20之磷酸鹽緩衝生理食鹽水)並除去。此洗淨作業再進行1次後，以200μl/孔添加含有25% Blockace(大日本住友製藥公司製)之磷酸鹽緩衝生理食鹽水，經由於室溫放置1小時進行阻斷。除去液體而以300μl/孔之洗淨緩衝液2次洗淨後，將實施例6所調製的大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體或大鼠對照組IgG(R ＆ D Systems公司製)使用ELISA緩衝液(含12.5% Blockace、0.05% Tween 20的磷酸鹽緩衝生理食鹽水)，將終濃度稀釋為1.28～20,000ng/ml(5倍稀釋系列)，以100μl/孔添加。於室溫放置1小時後去除液體，以300μl/孔之洗淨緩衝液洗淨3次。接著使用ELISA緩衝液而以100μl/孔添加經1,000倍稀釋的HRP(西洋山葵過氧化物酶)標識山羊抗大鼠IgG抗體(Beckman Coulter公司製)，於室溫放置1小時。去除液體，以300μl/孔之洗淨緩衝液洗淨3次後，使用過氧化物酶用發色套組(住友Bakelite公司製)，依套組添附的說明書使其發色。發色後，使用微量平盤讀數機(日本Molecular Devices公司製)於492nm測定吸光度。由此結果，於檢討的大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體10個檢體全部，確認依存於抗體濃度之對小鼠Siglec-15蛋白質之結合(第24圖)。另一方面，於大鼠對照組IgG，不認為有對小鼠Siglec-15蛋白質之結合。
實施例8小鼠骨髓非附著細胞之調製
由5～8週齡之雄ddY小鼠取出大腿骨與脛骨，除去軟組織。切除大腿骨或脛骨兩端，使用具有25口徑注射針之注射筒將D-PBS注入而將骨髓細胞押出，於離心管中回收。於室溫下以100g離心5分鐘而去掉上清液後，於細胞小團塊中添加溶血緩衝液1ml(RED BLOOD CELL LYSING緩衝液，Sigma公司製)使懸浮，於室溫放置5分鐘。添加20ml之D-PBS並於室溫下以100g離心5分鐘，丟棄上清液後於細胞小團塊中添加10ml含有5ng/ml M-CSF(R&D Systems公司製)、10%胎牛血清(FBS)的MEM-α培養基(Invitrogen 公司製)而使懸浮，通過細胞過濾網(cell strainer)(40μm NyloN，BD Falcon公司製)去除凝集物。將此細胞移至75cm2 -T燒瓶(附著細胞用)，於CO2 培養箱中培養1晚。培養1晚後，回收未附著T-燒瓶的細胞，作為小鼠骨髓非附著細胞使用。
實施例9大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體之小鼠破骨細胞形成試驗中的生物活性評價
使用實施例6所製作的全部10個檢體之抗小鼠Siglec-15單株抗體，檢討對小鼠骨髓非附著細胞之向破骨細胞分化的影響。將實施例8之方法所調製的小鼠骨髓非附著細胞以含有10%FBS及10ng/ml M-CSF(R&D Systems公司製)的α-MEM培養基調製為1.5×105 細胞/ml，並將其以200μl接種於96孔平盤之各孔中，於CO2 培養箱中培養2日。除去96孔平盤中之舊培養液，添加100μl之將人類RANKL(RANKL、PeproTech公司製)以終濃度成為20ng/ml、M-CSF成為10ng/ml的方式添加於含有10%　FBS之MEM-α培養基。於此細胞培養液，以成為32～1,000ng/ml之濃度的方式添加實施例6所製作的大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體、自市售之大鼠對照組IgG(Purified Rat IgG、R&D Systems公司製)除去疊氮化鈉的樣品、及以其他方法製作的兔抗小鼠Siglec-15多株抗體(No.3)，於CO2 培養箱中另培養3日。又，多株抗體(No.3)為已經被確認於本實施例記載之實驗系統中抑制破骨細胞形成的抗體。培養終了後，形成的破骨細胞之酒石酸耐性酸性磷酸酶(TRAP)活性以下列操作測定。吸除96孔平盤之各孔培養液，各孔添加50μl之含有1% Triton X-100的50mM檸檬酸鈉緩衝液(pH6.1)，於平盤振動機振盪5分鐘可溶化細胞。於此等各孔中添加50μl基質溶液(含有5mg/ml p-硝基苯基磷酸酯及0.46%酒石酸鈉的50mM檸檬酸鈉緩衝液(pH6.1))並於室溫下培育5分鐘。培育後於96孔平盤各孔中添加50μl之1N氫氧化鈉溶液而停止酵素反應。酵素反應停止後測定各孔之405nm吸光度作為TRAP活性之指標。結果示於第5及6圖。市售之大鼠對照IgG不被認為有顯著TRAP活性之抑制。另一方面，#32A1抗體於32ng/m1至1000ng/ml之範圍內，#8A1抗體與親和性純化兔多株No.3抗體於63ng/ml至1000ng/ml之範圍，認為有顯著的TRAP活性之抑制。又即使#3A1抗體、#34A1抗體、#39A1抗體，於500ng/ml以上之比較高的濃度上認為有TRAP活性用量依存的抑制。不認為經由其他抗體有小鼠破骨細胞形成之抑制。由以上之結果，發現於調製的大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體中，強烈抑制小鼠之破骨細胞形成(破骨細胞之分化與成熟)的抗體。又，作為#3A1抗體、#8A1抗體、#32A1抗體、#34A1抗體、#39A1抗體中共通的性質，可舉例於1000ng/ml以下，即1μg/ml以下之濃度抑制破骨細胞形成的作用。
實施例10　可溶型人類Siglec-15蛋白質之表現構築體之製作
編碼人類Siglec-15蛋白質之細胞外領域的部分之核酸序列為序列表之序列編號15，胺基酸序列為序列表之序列編號16。經由利用此等部分序列，於動物細胞等之培養上清液中可產生可溶型人類Siglec-15蛋白質。
a)經由可溶型人類Siglec-15基因之PCR的增幅
以具有下列序列的寡核苷酸作為PCR增幅用之引子，依通常方法合成人類Siglec-15之細胞外領域cDNA。
5’-ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt caccATGGAA AAGTCCATCT GGCTGC-3’(hSiglec-15-ECD-F：序列表之序列編號17)及5’-ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc CCCGCTGGCG CCATGGAAGC GG-3’(hSiglec-15-ECD-R：序列表之序列編號18)。
又，此等引子以hSiglec-15-ECD-F附加attB1序列，而hSiglec-15-ECD-R上附加attB2序列的方式設計作為Gateway Entry選殖株製作用增幅用引子。使用此引子之組合，與含人類Siglec-15之開放讀碼序列的多核苷酸作為模板，依通常方法進行PCR。所得PCR反應液使用PureLink PCR純化套組(Invitrogen公司製)純化。
b)經由Gateway BP反應製作Entry選殖株
經由應用λ噬菌體之部位專一性重組系統的Gateway Technology(Invitrogen公司)，以下方法製作組合人類Siglec-15細胞外領域之cDNA的Entry選殖株。首先，於a)所製作之兩端具有attB序列的PCR產物，及具有attP序列的供予者載體的pDNOR221(Invitrogen公司製)之間，使用BPC lonase進行BP反應。使用此反應液轉形大腸菌TOP10，對耐藥性選殖株進行菌落PCR，確認插入物大小。於確認插入物之大小為正確的選殖株，實施插入物之全DNA序列之序列解析的結果，獲得與編碼作為目的的人類Siglec-15蛋白質之細胞外領域的核酸序列(序列表之序列編號15)完全一致的Entry選殖株。
c)由Gateway LR反應之表現選殖株之製作
經由應用λ噬菌體之部位專一性重組系統的Gateway Technology(Invitrogen公司)，以下方法製作組合人類Siglec-15細胞外領域之cDNA的表現選殖株。b)製作的Entry選殖株於插入物兩端具有attL序列。此Entry選殖株與具有attR序列的2種類之目的載體之間使用LR Clonase進行LR反應。又目的載體使用2種類，為於插入物之C末側附加V5抗原決定位及6×His標籤的方式所設計的pDONM、及於插入物之C末側附加人類Fc標籤的方式所設計的phIgFc。使用由LR反應所得反應液而轉形大腸菌TOP10，對所得耐藥性選殖株進行序列解析，確認重組正確進行。
序列解析之結果各自獲得pDONM及phIgFc兩者為正確重組的表現選殖株(可溶型人類Siglec-15/pDONM及可溶型人類Siglec-15/phIgFc)。經由將可溶型人類Siglec-15/pDONM轉染於動物細胞等，轉錄具有序列表之序列編號19所記載的鹼基序列的mRNA，而具有序列表之序列編號20所記載的胺基酸序列的蛋白質(人類Siglec-15-His)被轉譯。經由將可溶型人類Siglec-15/phIgFc轉染於動物細胞等，具有序列表之序列編號21所記載的鹼基序列的mRNA被轉錄，具有序列表之序列編號22記載的胺基酸序列的蛋白質(人類Siglec-15-Fc)被轉譯。
實施例11　含有使用293-F細胞的可溶型人類Siglec-15蛋白質培養液之大量調製
a)　含有人類Siglec-15-His之培養液之調製
將實施例10所得可溶型人類Siglec-15/pDONM調製為約25mg。又，自大量培養的大腸菌之質體純化上使用Invitrogen PureLink HiPure Plasmid Gigaprep Kit(Invitrogen公司製)。將調製的質體與Opti-MEM(Invitrogen公司製)混合，添加50ml為轉染試藥的293fectin(Invitrogen公司製)，於室溫20分鐘培育。此混和液於含有1%盤尼西林-鏈黴素的FreeStyle 293表現培養基(Invitrogen公司製)中成為1.0～3.4×106 細胞/ml的方式添加於使用25L生物處理(Bioprocess)培養裝置(WAVE BioreActor)培養的FreeStyle 293-F細胞中(Invitrogen公司製)。於6～12% CO2 濃度、37℃ 96小時(4日)攪拌培養(30旋轉/分鐘)後回收培養液，離心分離而調製培養上清液。認為如此調製的培養上清液中，表現於人類Siglec-15之細胞外領域C末側上添加V5抗原決定位及6×His標籤的蛋白質(人類Siglec-15-His)。
b)含有人類Siglec-15-Fc培養液之調製
調製約5mg之實施例10所得可溶型人類Siglec-15/phIgFc。又，自大量培養的大腸菌之質體純化上使用Invitrogen PureLink HiPure Plasmid Gigaprep Kit (Invitrogen公司製)。將調製的質體與Opti-MEM(Invitrogen公司製)混合，過濾器滅菌後添加10ml為轉染試藥的293fectin(Invitrogen公司製)而於室溫培育20分鐘。此混和液於FreeStyle 293表現培養基(Invitrogen公司製)中以成為1.0～3.0×106 細胞/ml×5L(1L/燒瓶5瓶)的方式添加於愛倫美氏燒瓶中培養的FreeStyle 293-F細胞(Invitrogen公司製)。於8.0%CO2 濃度、37℃下96小時(4日間)旋轉培養(125旋轉/分鐘)後回收培養液，離心分離而調製培養上清液。如此調製的培養上清液中，認為有表現人類Siglec-15之細胞外領域C末側上附加人類Fc標籤的蛋白質(人類Siglec-15-Fc)。
實施例12可溶型人類Siglec-15蛋白質之純化
a)可溶型人類Siglec-15-His之純化
a-i)HisTrap HP管柱層析
於使實施例11之a)所調製的人類Siglec-15-His表現的293F細胞之培養液12L中添加1350ml之10x緩衝液(500mM TriS，1.5M NaCl，200mM咪唑，pH8.0)並充分攪拌後，以MilliPaK 60過濾器(Millipore公司製)過濾。將此培養液以流速10ml/min注加於已以預備純水(Milli Q水)洗淨的Ni-Sepharose HP(Amersh am Bioscience公司製)100ml管柱。使用含300mM NaCl的50mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)400ml以流速8ml/min洗淨管柱後，使用含有300mM NaCl，500mM咪唑的50mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)200ml以流速2.5ml/min溶出吸附於管柱的蛋白質，於Mini-sorp tube(Nunc公司製)分取。為防止蛋白質沈澱的目的，於含溶出蛋白質的部份約40ml中添加5M NaCl溶液8ml，攪拌後，以離心膜濃縮器Amicon Ultra-15(Millipore公司製)濃縮為約20ml。濃縮時發生的不溶物以3000r.p.m.、4℃下30分鐘離心去除，將此上清液2.5ml注加到預先以含1M NaCl的磷酸鹽緩衝生理食鹽水(N-PBS)平衡化的PD-10脫鹽管柱(Amersham Bioscience公司製)，以N-PBS溶出，獲得將溶劑置換為N-PBS的樣品3.5ml。此操作進一步重複進行7次，獲得約28ml之人類Siglec-15-His粗純化溶液。
a-ii)Resource Q管柱層析
將以Ni-Sepharose HP層析柱純化的N-PBS置換樣品12ml以含有0.1% CHAPS的50mM Tris-HCl緩衝液(pH7.5)於4℃下透析一晚(1L、3次)後，於4℃、3,000r.p.m.進行30分鐘離心而去除沈澱物。此上清液以Millex GV過濾器(Millipore公司製)過濾後，以流速1ml/min注加於以含有0.1% CHAPS的50mM Tris-HCl緩衝液(pH7.5)預先平衡化的Resource Q 6ml管柱(Amersham Bioscience公司製)，持續使用此緩衝液以流速1ml/min洗淨管柱，收集未吸附於管柱的蛋白質部份。吸附於管柱的蛋白質使用含有0.1%CHAPS、1M NaCl的50mM Tris-HCl緩衝液(pH7.5)以流速1ml/min溶出。將未吸附於管柱的部份26.5ml以離心膜濃縮器Amicon Ultra-15(Millipore公司製)濃縮為3.0ml後，於4℃、3,000r.p.m.10分鐘離心而去除沈澱物。此上清液2.5ml注加到以預先含50mM精胺酸鹽酸鹽的磷酸鹽緩衝生理食鹽水(pH7.0、A-PBS)平衡化的PD-10脫鹽管柱(Amersham Bioscience公司製)，以A-PBS溶出，溶劑置換為A-PBS的樣品3.5ml。所調製樣品之溶劑中之精胺酸鹽酸鹽係為防止可溶型人類Siglec-15-His的沈澱而添加。離心後之上清液迄使用前凍結保存於-80℃。重複以上之純化操作(Resource Q層析柱)2次來實施。
a-iii)純化人類Siglec-15-His之檢出及純度檢定
使用上述之純化操作(Ni-Sepharose HP層析柱，Resource Q層析柱)所調製的樣品於還原條件下進行SDS-聚丙烯醯胺電泳及銀染色。即，於各純化步驟之5μ l樣品添加同量之SDS-處理液，於95℃下熱處理10分鐘。將0.3μ l熱處理的各樣品用於SDS-聚丙烯醯胺電泳。除了電泳之操作使用作為分子量標記之Rainbow分子量標記(Amersham Bioscience公司製)以外，以相同於實施例3之方法實施。電泳終了後使用PhastGel Silver Kit(Amersham Bioscience公司製)及Phast System進行銀染色，此結果示於第7圖。未吸附於Resource Q管柱的蛋白質部份中分子量約35kDa之蛋白質(人類Siglec-15-His)被有效率地純化濃縮。
a-iv)經純化的人類Siglec-15-His之蛋白質濃度之測定
於純化人類Siglec-15-His(未吸附於Resource Q管柱的蛋白質部份)，使用牛血清白蛋白作為標準樣品，以DC-蛋白質試驗套組(BioRad公司製)測定蛋白質濃度。2次純化操作獲得合計1.66mg之純化人類Siglec-15-His。
b)可溶型人類Siglec-15-Fc之純化
b-i)HiTrap蛋白質A層析柱
使實施例11之b)所調製的人類Siglec-15-Fc表現的293F細胞之培養液1.5L以Sterivex GV過濾器(Millipore公司製)過濾後，以流速5ml/min注加到預先Dulbecco PBS(D-PBS，Invitrogen公司製)平衡化的HiTrap蛋白質A 5ml管柱(Amersham Bioscience公司製)。使用D-PBS 70ml以流速5ml/min洗淨管柱後，使用24l1之0.1M檸檬酸鈉緩衝液(pH3.0)以流速1.2ml/min溶出吸附於管柱的蛋白質。溶出液於Mini-sorp tube(Nunc公司製)以1.2ml/Fr.分取後，直接添加1M Tris 0.31ml中和。將溶出的蛋白質部份(Fr.5～9)約7.5ml中之2.5ml注加到以含50mM精胺酸鹽酸鹽的磷酸鹽緩衝生理食鹽水(pH7.0，A-PBS)平衡化的PD-10脫鹽管柱(Amersham Bioscience公司製)以A-PBS溶出，獲得溶劑置換為A-PBS的樣品3.5ml。重複實施此作業2次。溶劑中之精胺酸鹽酸鹽係為了防止可溶型人類Siglec-15-Fc沈澱而添加。將溶出的蛋白質部份(Fr.5～9)中殘餘的2.5ml注加到以含1M NaCl的磷酸鹽緩衝生理食鹽水(pH6.7，N-PBS)平衡化的PD-10脫鹽管柱(Amersham Bioscience公司製)而以N-PBS溶出，獲得溶劑置換為N-PBS的樣品3.5ml。調製的樣品之溶劑中，不添加精胺酸等之含胺基化合物，而以防止可溶型人類Siglec-15-Fc沈澱的目的上添加NaCl。以上之操作所調製的樣品，迄使用為止凍結保存於-80℃。
b-ii)經純化的人類Siglec-15-Fc之檢出及純度檢定
使用上述純化操作所調製的樣品於還原條件下進行SDS-聚丙烯醯胺電泳及銀染色。即，於5μl各純化步驟之樣品添加同量之SDS-處理液，於95℃下熱處理10分鐘。將熱處理的各樣品以1/2濃度之SDS-處理液稀釋1/100或1/300倍的樣品0.3μl使用於SDS-聚丙烯醯胺電泳。以相同於a-iii)記載之人類Siglec-15-His之純度檢定的方法實施電泳及銀染色，此結果示於第8圖。顯示自HiTrap蛋白質A管柱溶出的蛋白質部份中分子量約55kDa之蛋白質(人類Siglec-15-Fc)被有效率地純化濃縮。
b-iii)純化人類Siglec-15-Fc之蛋白質濃度之測定
於純化人類Siglec-15-Fc(自PD-10脫鹽管柱溶出的蛋白質部份)，使用牛血清白蛋白作為標準樣品，以DC-蛋白質試驗套組(BioRad公司製)測定蛋白質濃度。如表4所示，以2次純化操作獲得合計25.2mg之純化人類Siglec-15-Fc。
實施例13 大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體之對人類Siglec-15蛋白質的結合性評價
大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體對人類Siglec-15蛋白質的結合性依ELISA法評價。實施例12之b)所製作的人類Siglec-15-Fc蛋白質(經A-PBS取代者)以成為5μg/ml的方式以0.1M碳酸鈉緩衝液(pH9.5)稀釋，以100μl/孔添加於96孔平盤(NalgeNunc公司製、目錄編號：430341)。於室溫放置1小時後除去溶液，添加300μ1/孔之洗淨緩衝液(含有0.05% Tween 20磷酸鹽緩衝生理食鹽水)、並除去。此洗淨作業再進行1次後，以200μ1/孔添加含有25%Blockace(大日本住友製藥公司製)的磷酸鹽緩衝生理食鹽水，經由於室溫放置1小時來進行阻斷。除去液體以300μ1/孔之洗淨緩衝液2次洗淨後，將實施例6調製的大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體或大鼠對照組IgG(R&D Systems公司製)，使用ELISA緩衝液(含12.5%Blockace、0.05% Tween 20之磷酸鹽緩衝生理食鹽水)將終濃度稀釋為1.28～20,000ng/ml(5倍稀釋系列)，以100μ1/孔添加。於室溫放置1小時後去除液體，以300μl/孔之洗淨緩衝液洗淨3次。接著，使用ELISA緩衝液，以100μ1/孔添加1,000倍稀釋的HRP(西洋山癸過氧化物酶)標識山羊抗大鼠IgG抗體(Beckman Coulter公司製)，於室溫放置1小時。去除液體，以300μ1/孔之洗淨緩衝液洗淨3次後，使用過氧化物酶用發色套組(住友Bakelite公司製)，依套組中添附的說明書使發色。發色後，使用微量平盤讀數機(日本MolecularDevices公司製)於492nm測定吸光度。此結果，檢討的大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體10個檢體全部中，確認依存抗體濃度的對人類Siglec-15蛋白質之結合(第9圖)。尤其結合活性強者為#1A1、#3A1、#24A1、#32A1、#61A1之5檢體，#8A1、#34A1、#39A1之3檢體為比較上結合活性為弱的。另一方面，大鼠對照組IgG未認為有對人類Siglec-15蛋白質之結合。由以上結果得知，於實施例6調製的大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體，顯示不僅結合小鼠Siglec-15亦結合人類Siglec-15，而且一部份抗體對人類Siglec-15為強烈結合。
實施例14　經由大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體添加而對正常人類破骨前驅細胞之細胞融合、及骨吸收活性的影響(活體外生物活性評價)
於實施例13，因確認大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體亦結合人類Siglec-15，故檢討此等抗體對人類破骨細胞形成及骨吸收活性的效果。
a)由大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體添加對正常人類破骨前驅細胞之破骨細胞融合的影響(TRAP染色)
將正常人類破骨前驅細胞(Normal Human Natural Osteoclast Precursor Cells，購自三光純藥，目錄編號2T-110)，依細胞添附之指示書以1×104 細胞/孔的方式接種於96孔平盤。又，培養基使用添加含有胎牛血清(終濃度10%)、人類RANKL(終濃度66ng/ml)及人類M-CSF(終濃度33ng/ml)等的OPGM添加因子套組(購自三光純藥，目錄編號PT-9501)的破骨前驅細胞用基礎培養基(OPBM、購自三光純藥、目錄編號PT-8201)。於此培養上清液中，以終濃度30μg/ml的方式添加實施例6所調製的大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體及大鼠對照組IgG(R & D Systems公司製)，於CO2 培養箱中培養4日。培養後除去上清液，添加10%中性福馬林進行細胞固定。細胞固定後，以蒸餾水洗淨2次，以100μl/孔添加TRAP染色液(0.27mM萘酚AS-MX磷酸(Sigma公司製)、1.6mM固紅紫LB鹽(Fast red violet LB salt)(Sigma公司製)、1%二甲基甲醯胺、50mM酒石酸鈉、0.1M乙酸鈉緩衝液(pH5.0))，於室溫反應5分鐘。以蒸餾水洗淨2次，於顯微鏡下觀察細胞(第10圖)。此結果顯示，經由＃32A1抗體添加，幾乎完全抑制了高度細胞融合的巨大破骨細胞之形成。又，即使＃41B1抗體，亦顯示顯著抑制高度細胞融合的巨大破骨細胞之形成。另一方面，此以外之大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體(其他＃1A1抗體)及大鼠對照組IgG，未認為有此等破骨細胞融合之顯著抑制。如此可知，自正常人類破骨前驅細胞之TRAP陽性破骨細胞之多核化‧細胞融合，經由與Siglec-15蛋白質專一性結合的單株抗體而被抑制。
b)經由大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體(＃32A1)之添加對正常人類破骨前驅細胞之破骨細胞融合的影響(TRAP染色)
將正常人類破骨前驅細胞(Normal Human Natural Osteoclast Precursor Cells，購自三光純藥，目錄編號2T-110)，依細胞所添附之指示書以1×104 細胞/孔的方式接種於96孔平盤。又培養基使用添加含有胎牛血清(終濃度10%)、人類RANKL(終濃度68.4ng/ml)及人類M-CSF(終濃度33ng/ml)等的OPGM添加因子套組(購自三光純藥，目錄編號PT-9501)的破骨前驅細胞用基礎培養基(OPBM、購自三光純藥，目錄編號PT-8201)。於此培養上清液中，將實施例6所調製的大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體(＃32A1抗體)以終濃度0.1、0.3、1、3μg/ml的方式添加，於CO2 培養箱中培養3日。培養後除去上清液，添加10%中性福馬林進行細胞固定。細胞固定後，以蒸餾水洗淨2次，以100μl/孔添加TRAP染色液(0.27mM萘酚AS-MX磷酸(Sigma公司製)、1.6mM固紅紫LB鹽(Sigma公司製)、1%二甲基甲醯胺、50mM酒石酸鈉、0.1M乙酸鈉緩衝液(pH5.0))，於室溫反應5分鐘。以蒸餾水洗淨2次，於顯微鏡下觀察細胞(第11圖)。此結果顯示，於＃32A1抗體為0.3μg/ml至3μg/ml之範圍下，TRAP陽性多核破骨細胞形成係濃度依存性被抑制。
c)經由大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體(＃32A1)添加對正常人類破骨前驅細胞之骨吸收活性的影響(使用塗布膠原蛋白的平盤之評價)
已知破骨細胞經由放出組織蛋白酶K等蛋白酶，會分解骨組織之構成成分的I型膠原蛋白。Osteolyse Assay Kit(Lonza公司製，目錄編號PA-1500)提供塗布結合銪的人類膠原蛋白的96孔平盤(96-well Osteolyse Cell culture plate)，於同一平盤上培養破骨細胞時，經由測定上清液中游離的螢光膠原蛋白片段量，可於活體外評價破骨細胞之骨吸收活性。
將正常人類破骨前驅細胞(Normal Human Natural Osteoclast Precursor Cells，購自三光純藥，目錄編號2T-110)，依細胞添附之指示書以1×104 細胞/孔之方式接種於96孔破骨細胞培養盤。又培養基使用添加含有胎牛血清(終濃度10%)、人類RANKL(終濃度68.4ng/ml)及人類M-CSF(終濃度33ng/ml)等的OPGM添加因子套組(購自三光純藥，目錄編號PT-9501)的破骨前驅細胞用基礎培養基(OPBM，購自三光純藥，目錄編號PT-8201)。此培養上清液中，將實施例6所調製的大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體(#32A1抗體)以終濃度成為0.1、0.3、1、3μg/ml的方式添加，於CO2 培養箱中培養3日。採取培養上清液10μl中，添加200μl Osteolyse試驗套組所附之螢光團釋放試劑(Fluorophore Releasing Reagent)，經由使用螢光平盤讀數機(ALVO MX，PerkinElmer公司製)測定螢光強度(激發：340nm、放射：615nm)，定量培養上清液中放出的游離螢光膠原蛋白片段量(第12圖)。由此結果得知，經由RANKL添加所增加的螢光膠原蛋白片段量，由#32A1抗體於0.3μg/ml至3μg/ml之範圍內濃度依存性被抑制。據此得知，人類破骨細胞之骨吸收活性，經由與Siglec-15蛋白質專一性結合的單株抗體而被抑制。
實施例15　大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體使用卵巢摘出大鼠的生物活性評價
a)動物實驗之實驗步驟
於12週齡雌性F344大鼠(獲自日本Charlesriver公司)施予雙側卵巢摘除術，分成溶劑投與組、大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體#8A1抗體投與組及#32A1抗體投與組之3群。又亦設定1組偽手術組。於抗體投與組，以各1mg/kg之用量投與實施例6所調製的大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體#8A1抗體及#32A1抗體於腹腔內每週3次，自手術翌日起4週間反復投與。於溶劑投與群及偽手術群則腹腔內投與作為溶劑之含有0.01% Tween 20 PBS。投與開始4週後，禁食下進行24小時採尿，尿檢體至測定為止保存於-80℃。採尿終了後將大鼠安樂死，摘出腰椎。
b)腰椎骨密度之測定
除去附著於摘出的腰椎的軟組織，切出第4～6腰椎。經於乙醇中振盪後風乾作脫脂及脫水，使用骨密度測定裝置(DCS-600EX，ALOKA公司製)測量骨密度。結果示於第13圖(A)。相對於偽手術組，卵巢摘除組被認為有意義的腰椎骨密度減少，但#8A1及#32A1抗體投與組有意義地抑制經由卵巢摘除之骨密度之減少。
c)尿中去氫吡啶啉排泄量之測定
I型膠原蛋白交聯之各種代謝產物敏銳地反映骨之代謝回轉，尤其是骨吸收，特別是去氫吡啶啉為主之由侷限於骨之膠原蛋白的骨吸收之指標可謂為信頼性高者。
融解凍結保存的尿檢體，經離心操作使不溶物質沈澱而獲得上清液。使用Osteolinks「DPD」(DS Pharma Biomedical公司製)測量此上清液中所含的去氫吡啶啉量。又，使用肌酸酐-Test Wako(和光純藥工業公司製)亦測量上清液中之肌酸酐含量，算出進行肌酸酐補正的去氫吡啶啉量。結果示於第13圖(B)。相對於偽手術群，於卵巢摘除群中尿中去氫吡啶啉排泄量為有意義地增加，而暗示卵巢摘除大鼠經由破骨細胞的骨吸收會亢進。另一方面，#8A1及#32A1抗體投與群，經由卵巢摘除的去氫吡啶啉排泄量之增加係被抑制至偽手術群同程度。由此可知，專一性結合Siglec-15的單株抗體抑制破骨細胞之骨吸收亦於動物模式中確認，強烈暗示經由此骨吸收抑制作用，抑制卵巢摘除大鼠之腰椎骨密度減少。
實施例16　大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體之結合部位(抗原決定位)之決定
a)人類Siglec-15V-set功能域之表現純化
將編碼人類Siglec-15V-set功能域(NCBI之蛋白質資料庫之ACCESSION編號NP_998767之胺基酸序列或序列表之序列編號2記載之胺基酸序列之第39至165號之胺基酸殘基而成的多胜肽)之N末端側上連結His標籤、及連結凝血酶(Thrombin)辨識序列的蛋白質之DNA併入載體pDEST14(Invitrogen公司，目錄編號：11801-016)。使用此質體，轉形大腸菌Rosetta-gamiB(DE3)(Novagen公司，目錄編號：71136-4)，於TB培養基(Invitrogen公司，目錄編號：22711-022)培養。培養後，離心分離超音波破碎的菌體，上清液以HisTrap HP管柱(GE Healthcare公司，目錄編號：17-5247-01)純化。之後，以凝血酶切斷His標籤後，使用Mono S5/50 GL管柱(GE Healthcare公司，目錄編號：17-5168-01)，再使用Superdex 75 10/300管柱(GE Healthcare公司，目錄編號：17-5174-01)，以電泳至分子量14kDa成為單一帶為止純化人類Siglec-15V-set功能域。
b)可溶型人類Siglec-15-Fc之純化
可溶型人類Siglec-15-Fc以實施例12之方法純化
c)人類V-set功能域與大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體#32A1之競爭性ELISA
於96孔Maxi-sorp盤(Nunc公司製，型號：442404)中添加100μL之1.25μg/mL之山羊抗人類Fc抗體(Jackson Immuno Research公司，型號：109-005-098)，於4℃固相化一晚。96孔Maxi-sorp盤以PBS洗淨2次後，添加100μL之1μg/mL之可溶型人類Siglec-15-Fc，於室溫固相化1小時。之後，添加300μL之5%脫脂乳/PBS溶液，於室溫3小時，實施孔之阻斷(blocking)。另一方面，各別等量混合2μg/mL之大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體#32A1與0、0.032、0.16、0.8、4、20μg/mL之人類Siglec-15 V-set功能域，於室溫反應1.5小時。將96孔Maxi-sorp盤以PBS洗淨2次後，添加100μL大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體#32A1與人類Siglec-15 V-set功能域之混合溶液，於室溫反應1小時。以0.05% Tween-20(Bio-Rad公司，目錄編號：170-6531)/PBS溶液(以下，為PBST溶液)將96孔Maxi-sorp盤洗淨5次後，加100μL之HRP標識山羊抗大鼠IgG抗體(Beckman Coulter公司，目錄編號：732664，2,000倍稀釋)，於室溫反應1小時。以PBST溶液洗淨5次後，添加100μL之ELISA POD基質A.B.T.S.套組(Nacalai公司，目錄編號：14351-80)之發色液使反應30分鐘。添加100μL反應停止液後，測量405nm之吸光度。競爭性ELISA之結果顯示人類V-set功能域之濃度依存性大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體#32A1之對固相化的人類Siglec-15之結合被抑制。因此，大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體#32A1之抗原決定位顯示於人類Siglec-15 V-set功能域(NCBI之蛋白質資料庫之ACCESSION編號NP_998767之胺基酸序列或序列表之序列編號2記載之胺基酸序列之第39至165號之胺基酸殘基而成的功能域)(第14圖)。
實施例17　編碼大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體#32A1之可變區的cDNA之增幅與鹼基序列之解析
a)mRNA之調製
融合瘤#32A1依據實施例6之a)培養。自4x107 個融合瘤#32A1，使用QuickPrep mRNA純化套組(GE Healthcare公司)，調製約65μg之mRNA。
b)cDNA(5’-RACE-Ready cDNA)之合成
cDNA(5’-RACE-Ready cDNA)之合成使用0.3μg之a)合成的mRNA，使用PrimeScript反轉錄酶(TAKARA公司)與SMART RACE cDNA增幅套組(Clontech公司)來實施。
c)經由5’-RACE PCR之#32A1基因之重鏈可變區之cDNA之增幅
#32A1重鏈基因之可變區之cDNA，使用UPM(Universal Primer A Mix：附屬於SMART RACE cDNA增幅套組)及具有5’-GGCCGGGTGGGCTACGTTGCAGGTGACGGTCTG-3’(RG2AR2：序列表之序列編號23)之序列的寡核苷酸作為PCR增幅用引子。UPM為使用附屬於SMART RACE cDNA增幅套組(Clontech公司)，RG2AR2由資料庫之大鼠重鏈(IgG2a)之恆定區之序列設計後，依據通常方法合成。
以此引子之組合，與b)合成的cDNA(5’-RACE-Ready cDNA)作為模板，經由5’-RACE PCR來增幅#32A1重鏈基因之可變區之cDNA。PCR使用Advantage 2 PCR套組(Clontech公司)，溫度循環器(Thermal Cycler)之設定條件為94℃加熱1分鐘後，重複5次「於94℃ 0.5分鐘、72℃3分鐘」之溫度循環，接著重複5次「94℃ 0.5分鐘、70℃ 0.5分鐘、72℃ 3分鐘」之溫度循環，再重複20次「94℃ 0.5分鐘、68℃ 0.5分鐘、72℃ 3分鐘」之溫度循環後，於4℃保溫。
d)經由5’-RACE PCR之#32A1輕鏈基因之可變區之cDNA的增幅
以PCR增幅用之引子，使用UPM(Universal Primer A Mix：附屬於SMART RACE cDNA增幅套組)及具有5’-CATGCTGTACGTGCTGTCTTTGCTGTCCTGATCAG-3’(RKR2：序列表之序列編號24)之序列的寡核苷酸，UPM係使用附屬於SMART RACE cDNA增幅套組者(Clontech公司)，RKR2由資料庫之大鼠輕鏈(κ鏈)之恆定區序列設計後，依據通常方法合成作為#32A1輕鏈基因之可變區之cDNA。
此引子之組合與b)合成的cDNA(5’-RACE-Ready cDNA)作為模板，經5’-RACEPCR增幅#32A1輕鏈基因之可變區之cDNA。PCR使用Advantage 2 PCR套組(Clontech公司)，溫度循環器之設定條件為94℃加熱1分鐘後，重複5次「94℃0.5分鐘、72℃3分鐘」之溫度循環，接著重複5次「94℃0.5分鐘、70℃0.5分鐘、72℃3分鐘」之溫度循環，再重複20次「94℃0.5分鐘、68℃0.5分鐘、72℃3分鐘」之溫度循環後，於4℃保溫。
e)重鏈及輕鏈可變區之cDNA之鹼基序列之決定
於c)增幅的重鏈之可變區之cDNA使用MinElute PCR純化套組(QIAGEN公司)純化後，實施DNA序列之定序解析。作為定序引子，具有5’-CTCCAGAGTTCCAGGTCACGGTGACTGGC-3’(RG2AR3：序列表之序列編號25)之序列的寡核苷酸自資料庫之大鼠重鏈(IgG2a)之恆定區之序列設計後，依通常方法合成。
於d)增幅的輕鏈之可變區之cDNA使用MinElute PCR純化套組(QIAGEN公司)進行純化後，實施DNA序列之定序解析。作為定序引子，具有5’-TCCAGTTGCTAACTGTTCCG-3’(sqRK：序列表之序列編號26)之序列的寡核苷酸，由資料庫之大鼠輕鏈(κ鏈)之恆定區之序列設計後，依通常方法合成。
含經定序解析所獲得的重鏈可變區的cDNA具有序列表之序列編號27記載之鹼基序列，編碼序列表之序列編號28記載之胺基酸序列。序列編號28之胺基酸編號1至19所示的胺基酸序列為分泌訊號，胺基酸編號20至140所示的胺基酸序列為重鏈可變區，而胺基酸編號141至167所示的胺基酸序列相當於重鏈恆定區(部分)。上述重鏈可變區保有由序列編號44所示的胺基酸序列而成的CDRH1(DYFMN)、序列編號45所示的胺基酸序列而成的CDRH2(QIRNKIYTYATFYAESLEG)、及序列編號46所示的胺基酸序列而成的CDRH3(SLTGGDYFDY)。又，含輕鏈可變區之cDNA具有序列表之序列編號29記載之鹼基序列，編碼序列表之序列編號30記載之胺基酸序列。序列編號30之胺基酸編號1至20所示的胺基酸序列為分泌訊號，胺基酸編號21至132所示的胺基酸序列為輕鏈可變區，而胺基酸編號133至139所示胺基酸序列相當於輕鏈恆定區(部分)。上述輕鏈可變區保有由序列編號47所示的胺基酸序列而成的CDRL1(RASQSVTISGYSFIH)、由序列編號48所示的胺基酸序列而成的CDRL2(RASNLAS)、及由序列編號49所示的胺基酸序列而成的CDRL3(QQSRKSPWT)。
實施例18 大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體# 32A1之人類嵌合抗體基因表現構築體之製作
a)廣泛使用之表現載體pEF1/FCCU-1及pEF6KCL之製作
a)-i)人類輕鏈表現載體pEF6KCL之構築
經由質體pEF6/V5-HisB(Invitrogen)作為模板使用下述引子進行PCR，取得自BGHpA之正後(2174)至Sma I(2958)為止之DNA片段(含f1複製起源(f1 origin of replication)及SV40起動子及起源的DNA片段，以下，作為「片段A」)。
5’-CCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGC-3’(引子EFF1：序列表之序列編號31)
5’-AAACCCGGGAGCTTTTTGCAAAAGCCTAGG-3’(引子EFsmaR：序列編號32)
所獲得的片段A，與含有編碼人類κ鏈分泌訊號、人類κ鏈恆定區及人類polyA添加訊號的DNA序列的DNA片段(序列編號33)，以下作為「片段B」)，經由重疊PCR(overlap PCR)而結合。所獲得的片段A與片段B結合的DNA片段(以下，作為「片段A+B」)以限制酵素KpnI及SmaI消化，與以限制酵素KpnI及SmaI消化的質體pEF6/V5-HisB(Invitrogen)連接，EF1啟動子之下游具有訊號序列、選殖位、人類κ鏈恆定區、及人類polyA添加訊號序列，構築人類輕鏈表現載體pEF6KCL。
a)-ii)pEF1/KCL之構築
由以上述方法所獲得的pEF6KCL，以限制酵素KpnI及SmaI切出的DNA片段，與以KpnI及SmaI消化的pEF1/myc-HisB(Invitrogen公司)連接，而構築質體pEF1/KCL。
a)-iii)人類重鏈表現載體pEF1/FCCU-1之構築
含編碼人類IgG1訊號序列及恆定區之胺基酸的DNA序列的DNA片段(序列表之序列編號34)以限制酵素NheI及PmeI消化，與以NheI及PmeI消化的質體pEF1/KCL結合，構築於EF1啟動子之下游具有訊號序列、選殖位、人類重鏈恆定區、及人類polyA添加訊號序列的人類重鏈表現載體pEF1/FCCU-1。
b)# 32A1人類嵌合抗體重鏈表現構築體之製作
以PCR增幅用之引子，具有5’-aaagctgagcGAGGTGCAAATTTTGGAGACTGGAGGAGGC-3’(32A1HF：序列表之序列編號35)
及5’-aaagctgagctGACTGTGACCATGACTCCTTGGCCCCAG-3’(32A1HR：序列表之序列編號36)之序列的寡核苷酸，依通常方法合成作為# 32A1重鏈可變區之cDNA。
又，此等之引子，係為了將PCR產物併入pEF1/F CCU-1，以添加限制酵素BlpI辨識序列的方式來設計的。依通常方法，使用此引子之組合與作為模板之實施例17、e)純化的重鏈可變區之cDNA來進行PCR。PCR產物使用MinElute PCR純化套組(QIAGEN公司)純化後，經由 將以限制酵素BlpI(NEW ENGLAND BIOLABS公司)消化的DNA片段插入pEF1/FCCU-1以限制酵素BlpI(NEW ENGLAND BIOLABS公司)切斷的位置，來構築# 32A1人類嵌合抗體重鏈表現構築體。插入的序列經由定序解析確認。
依通常方法合成具有5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’(F11：序列表之序列編號37)之序列的寡核苷酸作為定序用之引子。將可插入正確的插入物的表現載體命名為「32A1H/pEF1/FCCU」。
c)# 32A1人類嵌合抗體輕鏈表現構築體之製作
具有5’-aaacatatggcGACATTGTCTTGACCCAGTCTCCTGCTTTGG-3’(32A1LF：序列表之序列編號38)
及5’-aaacgtacgTCTCAATTCCAGCTTGGTGCCTCCAGCG-3’(32A1LR：序列表之序列編號39)之序列的寡核苷酸作為PCR增幅用之引子，依據通常方法合成# 32A1輕鏈可變區之cDNA。
又，為了將PCR產物併入pEF6KCL，於32A1LF添加限制酵素NdeI辨識序列、32A1LR添加限制酵素BsiWI辨識序列的方式設計此等引子。使用此引子之組合與作為模板之實施例17、e)純化的輕鏈可變區之cDNA，依據通常方法進行PCR 。PCR產物使用MinElute PCR純化套組(QIAGEN公司)純化後，經由將以限制酵素NdeI(TAKARA公司)及BsiWI(NEW ENGLAND BIOLABS公司)消化的DNA片段 插入pEF6KCL以限制酵素NdeI(TAKARA公司)及以BsiWI(NEW ENGLAND BIOLABS公司)切斷的位置而築構# 32A1人類嵌合抗體輕鏈表現構築體。插入物的序列經由定序解析確認。作為定序用之引子，使用於序列表之序列編號37記載之引子F11。將可插入正確插入物的表現載體命名為「32A1L/pEF6KCL」。
於b)製作的# 32A1人類嵌合抗體重鏈基因係具有序列表之序列編號40記載之核苷酸序列，並為編碼序列表之序列編號41記載之胺基酸序列。序列編號41之胺基酸編號第1至19號所示的胺基酸序列為分泌訊號、胺基酸編號第20至140號所示的胺基酸序列為重鏈可變區、而胺基酸編號第141至470號所示的胺基酸序列相當於重鏈恆定區。又，於c)製作的# 32A1人類嵌合抗體輕鏈基因具有序列表之序列編號42記載之核苷酸序列，編碼序列表之序列編號43記載之胺基酸序列。序列編號43之胺基酸編號第1至20號所示的胺基酸序列為分泌訊號、胺基酸編號第21至132號所示的胺基酸序列為輕鏈可變區、而胺基酸編號第133至237號所示的胺基酸序列相當於輕鏈恆定區。
實施例19 大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體# 32A1之人類嵌合抗體之調製
a)人類嵌合抗體之生產
將對數增殖期之293 FreeStyle細胞3×107 個接種於新鮮的30mL(以30mL培養為1組而製作4組)之FreeStyle 293表現培養基(Invitrogen公司)，於37℃、8% CO2 培養箱中 振盪培養(125rpm)。將300μg之聚乙烯亞胺(Polyscience公司製# 24765)溶解於1mL之Opti-ProSFM培養基(Invitrogen公司製)，於室溫放置5分鐘。於實施例18製作的# 32A1人類嵌合抗體重鏈表現載體32A1H/pEF1/FCCU及# 32A1人類嵌合抗體輕鏈表現載體32A1L/pEF6KCL使用PureLink HiPure Plasmid套組(Invitrogen公司)。將32A1H/pEF1/FCCU(15μg)及32A1L/pEF6KCL(45μg)懸浮於1mL之Opti-ProSFM培養基(Invitrogen公司)，於室溫放置5分鐘的聚乙烯亞胺/OptiProSFM混合液1mL，再於室溫放置5分鐘。其次，將聚乙烯亞胺/表現載體/OptiProSFM混合液2mL加到293FreeStyle細胞懸浮液之1組，繼續振盪培養。37℃、8% CO2 中培養7日後，培養上清液以組回收。
b)人類嵌合抗體之純化
將上述所得的培養上清液90mL(3組分)以過濾器過濾(NALGENE公司製# 295-4545)後，加入以PBS平衡化的Mab SelectSuRe 0.5mL(GE Healthcare Bio-science公司製# 17-5438-01)，於80rpm、10℃震盪一晚。翌日，回收担體以PBS洗淨後，於1M精胺酸溶液(pH4.0)溶出抗體。溶出液於PD10管柱(GE Healthcare Bioscience公司製# 17-0851-01)以PBS取代後，獲得於Amicon Ultra 4(Millipore公司製# UFC805008)濃縮的人類嵌合抗體1.2mL(0.98mg/mL)。抗體之濃度於日立二極體陣列型生物光度計U-0080D測定280nm並算出的單株抗體。
實施例20 大鼠抗小鼠Siglec-15 # 32A1之人類嵌合抗體之對小鼠Siglec-15蛋白質的結合性評價
對於實施例19調製的純化人類嵌合抗體之大鼠# 32A1抗體之競合阻害以以下之方法測定。實施例4純化的小鼠Siglec-15-Fc以PBS稀釋為1μg/ml後，以100μl/孔分注於免疫平盤(Nunc公司製# 437111)，於4℃靜置一晚使蛋白質吸附於平盤。翌日，孔以PBS-T液(PBS、0.05%(v/v)Tween 20)洗淨2次後，以350μl/孔分注脫脂乳(森永乳業公司製)以PBS稀釋為5%的溶液，於室溫靜至2小時。除去孔中之液體並以PBS-T液洗淨3次後，各自以100μl/孔分注0.25μg/ml之人類嵌合抗體與各種濃度(0μg/ml、0.016μg/ml、0.05μg/ml、0.16μg/ml、0.5μg/ml、1.66μg/ml、5μg/ml)之# 32A1抗體或大鼠對照組IgG抗體(R & D systems公司製# 6-001-A)之混合溶液(最終濃度0.5%之含有脫脂乳的PBS液)，於室溫靜置2小時。以PBS-T液洗淨孔3次後，以100μl/孔添加以TBS-T液(TBS、0.05%(v/v)Tween 20)稀釋2500倍的Alkaline Phosphatase-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG(Jackson ImmunoResearch公司製# 109-055-097)，於室溫靜置1小時。除去孔中之液體，以TBS-T液將孔洗淨5次後，以100μl/孔添加螢光基質液(Roche公司製# 11681982001)進行螢光反應。螢光基質液添加10分鐘後，於平盤讀取機上測量螢光強度。此結果顯示# 32A1抗體對人類嵌合抗體之小鼠Siglec-15-Fc的結合為濃度依存性抑制。又# 32A1抗體與人類嵌合抗體以同濃度(1：1)混合時， 顯示約40%之競爭抑制。因此，# 32A1抗體與人類嵌合抗體被認為對小鼠Siglec-15-Fc具有大約同等之親和性。另一方面，大鼠對照組IgG未顯示競爭抑制(第15圖)。
實施例21 大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體# 32A1之人類嵌合抗體之小鼠破骨細胞形成試驗、以及以人類破骨細胞形成試驗之生物活性評價
a)小鼠破骨細胞形成試驗
使用於實施例19調製的大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體# 32A1之人類嵌合抗體，檢討小鼠骨髓非附著細胞向破骨細胞分化之影響。將以實施例8之方法調製的小鼠骨髓非附著細胞以含10% FBS與10ng/ml M-CSF(R & D Systems公司製)的α-NEM培養基調製為1.5×105 細胞/ml，並將其以200μ l接種於96孔平盤之各孔中，於CO2 培養箱中培養2日。除去96孔平盤中之舊培養液，添加100μ l之將人類RANKL(RANKL、PeproTech公司製)以終濃度成為20ng/ml、M-CSF成為10ng/ml的方式添加於含有10% FBS之MEM-α 培養基。於此細胞培養液，以成為3~100ng/ml之濃度的方式添加實施例6所製作的大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體#32A1與實施例19所製作的大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體，再於CO2 培養箱中培養3日。培養終了後，形成的破骨細胞之酒石酸耐性酸性磷酸酶(TRAP)活性以實施例9記載之方法測定。酵素反應停止後於各孔測定405nm吸光度作為TRAP活性之指標。結果示於第16圖。於# 32A1抗體及大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體# 32A1之人類嵌合抗體，以50ng/ml以上濃度認為有用量依存性的TRAP活性之 抑制。由此結果，大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體# 32A1之人類嵌合抗體顯示具有與大鼠# 32A1抗體大略同等之小鼠之破骨細胞形成(破骨細胞之分化與成熟)抑制活性。
b)使用正常人類破骨前驅細胞的評價(TRAP染色)
將正常人類破骨前驅細胞(Normal Human Natural Osteoclast Precursor Cells，購自三光純藥，目錄編號2T-110)，依據所附說明書以1×104 細胞/孔的方式添加細胞於96孔盤。又培養基係使用添加含胎牛血清(終濃度10%)、人類RANKL(終濃度66ng/ml)及人類M-CSF(終濃度33ng/ml)等OPGM添加因子套組(購自三光純藥，目錄編號PT-9501)的破骨前驅細胞用基礎培養基(OPBM，購自三光純藥，目錄編號PT-8201。於此培養上清液中，以終濃度0.3、1、3、10μg/ml的方式添加實施例19調製的大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體# 32A1之人類嵌合抗體，於CO2 培養箱中培養3日。培養後除去上清液，添加10%中性福馬林進行細胞固定。細胞固定後，以蒸餾水洗淨2次，以100μl/孔添加TRAP染色液(0.27mM萘酚AS-MX磷酸(Sigma公司製)、1.6mM固紅紫LB鹽(Sigma公司製)、1%二甲基甲醯胺、50mM酒石酸鈉、0.1M乙酸鈉緩衝液(pH5.0))，於室溫反應5分鐘。以蒸餾水洗淨2次，顯微鏡下觀察細胞(第17圖)。其結果，經由添加# 32A1之人類嵌合抗體，TRAP陽性多核破骨細胞形成以0.3μg/ml至10μg/ml之範圍被抑制。
實施例22 大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體# 32A1之人類化抗體之設計(1)
a)#32Al之人類化版本之設計
a)-i)#32Al之可變區之分子模式
#32Al之可變區之分子模式依一般性公知之方法(Methods in Enzymology，203，121-153，(1991))實施作為相同性模式。將登錄於蛋白質資料庫(Nuc.Acid Res.35，D301-D303(2007))的人類免疫球蛋白之可變區之1次序列(可由X射線結晶構造所衍生的三次元構造獲得)，與基於此決定的#32A1之可變區比較。結果為，1LK3係，相對於#32A1之輕鏈之可變區同樣地於框架中有缺損的抗體之中，選擇具有最高序列相同性。又，1AD0係相對於#32Al之重鏈之可變選擇具有最高序列相同性。框架領域之三次元構造係經由組合對應#32Al之輕鏈及重鏈的1LK3及1AD0之座標，獲得「框架模式」而被製作。#32Al之CDR依據Thornton etal.(J.Mol.Biol.，263，800-815，(1996))之分類，CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1及CDRH2各自分配於15A、7A、9A、10A、12B群。CDRH3使用H3 rule(FEBS letter 399，1-8(1996))被分類於k(8)C。其次，於各自CDR代表的構形被併入框架模型中。
最後，於能量之觀點為了獲得#32Al之可變區之可能性的分子模型，進行除去不利的原子間接觸用之能量計算。上述順序，使用市售之蛋白質立體構造預測程式Prime及配座探索程式MacroModel(Schrodinger，LLC)來進行。
a)-ii)對人類化#32Al的胺基酸序列之設計
人類化#32Al抗體之構築依據一般公知的方法進行CDR移植(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，10029-10033(1989)。接受者抗體基於框架領域內之胺基酸相同性選擇2種。將#32A1之框架領域之序列，與抗體之胺基酸序列之Kabat資料庫(Nuc.Acid Res.29，205-206(2001))之全部人類框架比較，結果為M37GO37‘CL抗體由於框架領域之73%之序列相同性，選擇作為接受者。於M37GO37‘CL之框架領域之胺基酸殘基，使與於#32A1之胺基酸殘基併排，鑑定使用不同胺基酸的位置。此等殘基之位置，於其上使用構築的#32A1之三次元模式分析，之後於接受者上應移植的供予者殘基依Queen et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，10029-10033(1989))提供之基準來選擇。
將#32A1之框架領域之序列與IgBLAST(Nuc.Acid Res.36，D25-D30(2007))全部的人類框架比較，結果為，L鏈係由於AAB34430於框架領域之79%序列相同性而被選擇作為接受者。H鏈係由於CAF31288於框架領域之78%之序列相同性，而被選擇作為接受者。將L鏈於AAB34430，H鏈於CAF31288之框架領域之胺基酸殘基，與於#32A1之胺基酸殘基併排，鑑定使用不同的胺基酸的位置。此等之殘基之位置，於其上使用構築的#32A1之三次元模式分析，之後於接受者上應移植的供予者殘基依Queen et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，10029-10033(1989))提供之基準來選擇。以任一種方法，將經選擇的幾個供予者殘基移入接受者抗體，以下之實施例記載的方式構築人類化#32A1序列。
b)#32A1重鏈之人類化
b)-i)h#32A1-T1H型重鏈：
伴隨將序列表之序列編號28所示的#32A1重鏈之胺基酸編號23(異白胺酸)、24(白胺酸)、26(蘇胺酸)、32(離胺酸)、43(蘇胺酸)、61(麩胺酸)、89(纈胺酸)、95(天冬胺酸)、96(絲胺酸)、97(麩胺酸)、98(絲胺酸)、100(纈胺酸)、104(纈胺酸)、105(絲胺酸)、114(異白胺酸)、118(蘇胺酸)、134(纈胺酸)、135(甲硫胺酸)、140(白胺酸)各自置換為白胺酸、纈胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、丙胺酸、甘胺酸、苯基丙胺酸、天冬醯胺酸、丙胺酸、離胺酸、天冬醯胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、天冬醯胺酸、纈胺酸、丙胺酸、蘇胺酸、白胺酸、絲胺酸的設計的人類化#32A1重鏈命名為「h#32A1-T1H型重鏈」。
h#32A1-T1H型重鏈之胺基酸序列記載於序列表之序列編號51。序列編號51之胺基酸序列之第1至19號之胺基殘基而成的序列、第20至140號之胺基酸殘基而成的序列、第141至470號之胺基酸殘基而成的序列各自相當於訊號序列、重鏈可變區、重鏈恆定區。編碼序列編號51之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列表之序列編號50。序列編號50之核苷酸序列之第1至57號核苷酸而成的序列、第58至420號之核苷酸而成的序列、第421至1410號之核苷酸而成的序列各自編碼訊號序列、重鏈可變區序列、重鏈恆定區序列。序列編號50之核苷酸序列及序列編號51之胺基酸序列亦記載於第27圖。
b)-ii)h#32A1-T2H型重鏈：
伴隨將序列表之序列編號28所示的#32A1重鏈之胺基酸編號23(異白胺酸)、24(白胺酸)、26(蘇胺酸)、32(離胺酸)、43(蘇胺酸)、95(天冬胺酸)、96(絲胺酸)、97(麩胺酸)、98(絲胺酸)、100(纈胺酸)、104(纈胺酸)、114(異白胺酸)、118(蘇胺酸)、134(纈胺酸)、135(甲硫胺酸)、140(白胺酸)各自置換為白胺酸、纈胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、丙胺酸、天冬醯胺酸、丙胺酸、離胺酸、天冬醯胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、纈胺酸、丙胺酸、蘇胺酸、白胺酸、絲胺酸的設計的人類化#32A1重鏈命名為「h#32A1-T2H型重鏈」。
h#32A1-T2H型重鏈之胺基酸序列記載於序列表之序列編號53。序列編號53之胺基酸序列之第1至19號之胺基殘基而成的序列、第20至140號胺基酸殘基而成的序列、第141至470號胺基酸殘基而成的序列各自相當於訊號序列、重鏈可變區、重鏈恆定區。編碼序列編號53之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列表之序列編號52。序列編號52之核苷酸序列之第1至57號之核苷酸而成的序列、第58至420號之核苷酸而成的序列、第421至1410號之核苷酸而成的序列各自編碼訊號序列、重鏈可變區序列、重鏈恆定區序列。序列編號52之核苷酸序列及序列編號53之胺基酸序列亦記載於第28圖。
b)-iii)h#32A1-T3H型重鏈：
伴隨將序列表之序列編號28所示的#32A1重鏈之胺基酸編號24(白胺酸)、26(蘇胺酸)、32(離胺酸)、104(纈胺酸)、114(異白胺酸)、134(纈胺酸)、135(甲硫胺酸)、140(白胺酸)各自置換為纈胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、甲硫胺酸、纈胺酸、蘇胺酸、白胺酸、絲胺酸的設計的人類化＃32A1重鏈命名為「h＃32A1-T3H型重鏈」。
h＃32A1-T3H型重鏈之胺基酸序列記載於序列表之序列編號55。序列編號55之胺基酸序列之第1至19號之胺基殘基而成的序列、第20至140號之胺基酸殘基而成的序列、第141至470號之胺基酸殘基而成的序列各自相當於訊號序列、重鏈可變區、重鏈恆定區。編碼序列編號55之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列表之序列編號54。序列編號54之核苷酸序列之第1至57號之核苷酸而成的序列、第58至420號之核苷酸而成的序列、第421至1410號之核苷酸而成的序列各自編碼訊號序列、重鏈可變區序列、重鏈恆定區序列。序列編號54之核苷酸序列及序列編號55之胺基酸序列亦記載於第29圖。
b)-iv)h＃32A1-T5H型重鏈：
將伴隨序列表之序列編號28所示的＃32A1重鏈之胺基酸編號23(異白胺酸)、24(白胺酸)、26(蘇胺酸)、32(離胺酸)、61(麩胺酸)、89(纈胺酸)、95(天冬胺酸)、97(麩胺酸)、99(絲胺酸)、104(纈胺酸)、105(絲胺酸)、114(異白胺酸)、134(纈胺酸)、135(甲硫胺酸)、140(白胺酸)各自置換為纈胺酸、纈胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、苯基丙胺酸、天冬醯胺酸、離胺酸、蘇胺酸、甲硫胺酸、天冬醯胺酸、纈胺酸、蘇胺酸、白胺酸、絲胺酸的設計的人類化＃32A1重鏈命名為「h＃32A1-T5H型重鏈」。
h＃32A1-T5H型重鏈之胺基酸序列記載於序列表之序列編號57。序列編號57之胺基酸序列之第1至19號之胺基殘基而成的序列、第20至140號之胺基酸殘基而成的序列、第141至470號之胺基酸殘基而成的序列各自相當於訊號序列、重鏈可變區、重鏈恆定區。編碼序列編號57之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列表之序列編號56。序列編號56之核苷酸序列之第1至57號之核苷酸而成的序列、第58至420號之核苷酸而成的序列、第421至1410號之核苷酸而成的序列各自編碼訊號序列、重鏈可變區序列、重鏈恆定區序列。序列編號56之核苷酸序列及序列編號57之胺基酸序列亦記載於第30圖。
b)-v)h＃32A1-T6H型重鏈：
將伴隨序列表之序列編號28所示之＃32A1重鏈之胺基酸編號23(異白胺酸)、24(白胺酸)、26(蘇胺酸)、32(離胺酸)、95(天冬胺酸)、97(麩胺酸)、99(絲胺酸)、104(纈胺酸)、114(異白胺酸)、134(纈胺酸)、135(甲硫胺酸)、140(白胺酸)各自置換為纈胺酸、纈胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、離胺酸、蘇胺酸、甲硫胺酸、纈胺酸、蘇胺酸、白胺酸、絲胺酸所設計的人類化＃32A1重鏈命名為「h＃32A1-T6H型重鏈」。
h＃32A1-T6H型重鏈之胺基酸序列記載於序列表之序列編號59。序列編號59之胺基酸序列之第1至19號之胺基殘基而成的序列、第20至140號之胺基酸殘基而成的序列、第141至470號之胺基酸殘基而成的序列各自相當於訊號序列、重鏈可變區、重鏈恆定區。編碼序列編號59之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列表之序列編號58。序列編號58之核苷酸序列之第1至57號之核苷酸而成的序列、第58至420號之核苷酸而成的序列、第421至1410號之核苷酸而成的序列各自編碼訊號序列、重鏈可變區序列、重鏈恆定區序列。序列編號58之核苷酸序列及序列編號59之胺基酸序列亦記載於第31圖。
b) -vi) h#32A1-T7H型重鏈：
將伴隨序列表之序列編號28所示的#32A1重鏈之胺基酸編號23(異白胺酸)、24(白胺酸)、26(蘇胺酸)、32(離胺酸)、43(蘇胺酸)、89(纈胺酸)、95(天冬胺酸)、96(絲胺酸)、97(麩胺酸)、98(絲胺酸)、100(纈胺酸)、104(纈胺酸)、105(絲胺酸)、114(異白胺酸)、118(蘇胺酸)、134(纈胺酸)、135(甲硫胺酸)、140(白胺酸)各自置換為白胺酸、纈胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、丙胺酸、苯基丙胺酸、天冬醯胺酸、丙胺酸、離胺酸、天冬醯胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、天冬醯胺酸、纈胺酸、丙胺酸、蘇胺酸、白胺酸、絲胺酸設計的人類化#32A1重鏈命名為「h#32A1-T7H型重鏈」。
h#32A1-T7H型重鏈之胺基酸序列記載於序列表之序列編號72。序列編號72之胺基酸序列之第1至121號之胺基殘基而成的序列、第122至451號之胺基酸殘基而成的序列各自相當於重鏈可變區、重鏈恆定區。序列編號72之胺基酸序列亦記載於第38圖。
b)-vii)h#32A1-T8H型重鏈：
將伴隨序列表之序列編號28所示的#32A1重鏈之胺基酸編號23(異白胺酸)、24(白胺酸)、26(蘇胺酸)、32(離胺酸)、43(蘇胺酸)、61(麩胺酸)、95(天冬胺酸)、96(絲胺酸)、97(麩胺酸)、98(絲胺酸)、100(纈胺酸)、104(纈胺酸)、105(絲胺酸)、114(異白胺酸)、118(蘇胺酸)、134(纈胺酸)、135(甲硫胺酸)、140(白胺酸)各自置換為白胺酸、纈胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、丙胺酸、甘胺酸、天冬醯胺酸、丙胺酸、離胺酸、天冬醯胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、天冬醯胺酸、纈胺酸、丙胺酸、蘇胺酸、白胺酸、絲胺酸設計的人類化#32A1重鏈命名為「h#32A1-T8H型重鏈」。
h#32A1-T8H型重鏈之胺基酸序列記載於序列表之序列編號73。序列編號73之胺基酸序列之第1至121號之胺基殘基而成的序列、第122至451號之胺基酸殘基而成的序列各自相當於重鏈可變區、重鏈恆定區。序列編號73之胺基酸序列亦記載於第38圖。
b-viii)h#32A1-T9H型重鏈：
將伴隨序列表之序列編號28所示的#32A1重鏈之胺基酸編號23(異白胺酸)、24(白胺酸)、26(蘇胺酸)、32(離胺酸)、43(蘇胺酸)、61(麩胺酸)、89(纈胺酸)、95(天冬胺酸)、96(絲胺酸)、97(麩胺酸)、98(絲胺酸)、100(纈胺酸)、104(纈胺酸)、114(異白胺酸)、118(蘇胺酸)、134(纈胺酸)、135(甲硫胺酸)、140(白胺酸)各自置換為白胺酸、纈胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、丙胺酸、甘胺酸、苯基丙胺酸、天冬醯胺酸、丙胺酸、離胺酸、天冬醯胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、纈胺酸、丙胺酸、蘇胺酸、白胺酸、絲胺酸所設計的人類化#32A1重鏈命名為「h#32A1-T9H型重鏈」。
h#32A1-T9H型重鏈之胺基酸序列記載於序列表之序列編號74。序列編號74之胺基酸序列之第1至121號之胺基殘基而成的序列、第122至451號之胺基酸殘基而成的序列各自相當於重鏈可變區、重鏈恆定區。序列編號74之胺基酸序列亦記載於第38圖。
b)-ix)h#32A1-T10H型重鏈：
將伴隨序列表之序列編號28所示的#32A1重鏈之胺基酸編號23(異白胺酸)、24(白胺酸)、26(蘇胺酸)、32(離胺酸)、43(蘇胺酸)、95(天冬胺酸)、96(絲胺酸)、97(麩胺酸)、98(絲胺酸)、100(纈胺酸)、104(纈胺酸)、105(絲胺酸)、114(異白胺酸)、118(蘇胺酸)、134(纈胺酸)、135(甲硫胺酸)、140(白胺酸)各自置換為白胺酸、纈胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、丙胺酸、天冬醯胺酸、丙胺酸、離胺酸、天冬醯胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、天冬醯胺酸、纈胺酸、丙胺酸、蘇胺酸、白胺酸、絲胺酸所設計的人類化#32A1重鏈命名為「h#32A1-T10H型重鏈」。
h#32A1-T10H型重鏈之胺基酸序列記載於序列表之序列編號75。序列編號75之胺基酸序列之第1至121號之胺基殘基而成的序列、第122至451號之胺基酸殘基而成的序列各自相當於重鏈可變區、重鏈恆定區。序列編號75之胺基酸序列亦記載於第39圖。
b)-x)h＃32A1-T11H型重鏈：
將伴隨序列表之序列編號28所示的＃32A1重鏈之胺基酸編號23(異白胺酸)、24(白胺酸)、26(蘇胺酸)、32(離胺酸)、43(蘇胺酸)、89(纈胺酸)、95(天冬胺酸)、96(絲胺酸)、97(麩胺酸)、98(絲胺酸)、100(纈胺酸)、104(纈胺酸)、114(異白胺酸)、118(蘇胺酸)、134(纈胺酸)、135(甲硫胺酸)、140(白胺酸)各自置換為白胺酸、纈胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、丙胺酸、苯基丙胺酸、天冬醯胺酸、丙胺酸、離胺酸、天冬醯胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、纈胺酸、丙胺酸、蘇胺酸、白胺酸、絲胺酸所設計的人類化＃32A1重鏈命名為「h＃32A1-T11H型重鏈」。
h＃32A1-T11H型重鏈之胺基酸序列記載於序列表之序列編號76。序列編號76之胺基酸序列之第1至121號之胺基殘基而成的序列、第122至451號之胺基酸殘基而成的序列各自相當於重鏈可變區、重鏈恆定區。序列編號76之胺基酸序列亦記載於第39圖。
b)-xi)h＃32A1-T12H型重鏈：
將伴隨序列表之序列編號28所示的＃32A1重鏈之胺基酸編號23(異白胺酸)、24(白胺酸)、26(蘇胺酸)、32(離胺酸)、43(蘇胺酸)、61(麩胺酸)、95(天冬胺酸)、96(絲胺酸)、97(麩胺酸)、98(絲胺酸)、100(纈胺酸)、104(纈胺酸)、114(異白胺酸)、118(蘇胺酸)、134(纈胺酸)、135(甲硫胺酸)、140(白胺酸)各自置換為白胺酸、纈胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、丙胺酸、甘胺酸、天冬醯胺酸、丙胺酸、離胺酸、天冬醯胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、纈胺酸、丙胺酸、蘇胺酸、白胺酸、絲胺酸所設計的人類化#32A1重鏈命名為「h#32A1-T12H型重鏈」。
h#32A1-T12H型重鏈之胺基酸序列記載於序列表之序列編號77。序列編號77之胺基酸序列之第1至121號之胺基殘基而成的序列、第122至451號之胺基酸殘基而成的序列各自相當於重鏈可變區、重鏈恆定區。序列編號77之胺基酸序列亦記載於第39圖。
c) #32A1輕鏈之人類化
c) -i) h#32A1-T1L型輕鏈：
將伴隨序列表之序列編號30所示的#32A1輕鏈之胺基酸編號24(白胺酸)、29(丙胺酸)、29-30之間(缺損殘基)、36(麩醯胺酸)、41(絲胺酸)、66(麩醯胺酸)、68(精胺酸)、81(異白胺酸)、99(天冬醯胺酸)、100(脯胺酸)、101(纈胺酸)、104(天冬胺酸)、106(異白胺酸)、108(蘇胺酸)、110(苯基丙胺酸)、122(丙胺酸)、127(白胺酸)、129(白胺酸)、130(精胺酸)、132(丙胺酸)各自置換為甲硫胺酸、天冬胺酸、絲胺酸、麩胺酸、天冬醯胺酸、脯胺酸、離胺酸、纈胺酸、絲胺酸、絲胺酸、白胺酸、麩胺酸、纈胺酸、纈胺酸、酪胺酸、甘胺酸、纈胺酸、異白胺酸、離胺酸、蘇胺酸所設計的人類化#32A1輕鏈命名為「h#32A1-T1L型輕鏈」。
h#32A1-T1L型輕鏈之胺基酸序列記載於序列表之序列編號61。序列編號61之胺基酸序列之第1至20號之胺基殘基而成的序列、第21至133號之胺基酸殘基而成的序列、第134至238號之胺基酸殘基而成的序列各自相當於訊號序列、輕鏈可變區、輕鏈恆定區。編碼序列編號61之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列表之序列編號60。序列編號60之核苷酸序列之第1至60號之核苷酸而成的序列、第61至399號之核苷酸而成的序列、第400至714號之核苷酸而成的序列各自編碼訊號序列、輕鏈可變區序列、輕鏈恆定區序列。序列編號60之核苷酸序列及序列編號61之胺基酸序列亦記載於第32圖。
c)-ii)h#32A1-T2L型輕鏈：
將伴隨序列表之序列編號30所示的#32A1輕鏈之胺基酸編號24(白胺酸)、29(丙胺酸)、29-30之間(缺損殘基)、36(麩醯胺酸)、66(麩醯胺酸)、81(異白胺酸)、99(天冬醯胺酸)、100(脯胺酸)、101(纈胺酸)、104(天冬胺酸)、106(異白胺酸)、108(蘇胺酸)、127(白胺酸)、129(白胺酸)、130(精胺酸)、132(丙胺酸)各自置換為甲硫胺酸、天冬胺酸、絲胺酸、麩胺酸、脯胺酸、纈胺酸、絲胺酸、絲胺酸、白胺酸、麩胺酸、纈胺酸、纈胺酸、纈胺酸、異白胺酸、離胺酸、蘇胺酸所設計的人類化#32A1輕鏈命名為「h#32A1-T2L型輕鏈」。
h＃ 32A1-T2L型輕鏈之胺基酸序列記載於序列表之序列編號63。序列編號63之胺基酸序列之第1至20號之胺基殘基而成的序列、第21至133號之胺基酸殘基而成的序列、第134至238號之胺基酸殘基而成的序列各自相當於訊號序列、輕鏈可變區、輕鏈恆定區。編碼序列編號63之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列表之序列編號62。序列編號62之核苷酸序列之第1至60號之核苷酸而成的序列、第61至399號之核苷酸而成的序列、第400至714號之核苷酸而成的序列各自編碼訊號序列、輕鏈可變區序列、輕鏈恆定區序列。序列編號62之核苷酸序列及序列編號63之胺基酸序列亦記載於第33圖。
c) -iii) h＃32A1-T3L型輕鏈：
將伴隨序列表之序列編號30所示的＃32A1輕鏈之胺基酸編號29(丙胺酸)、29-30之間(缺損殘基)、36(麩醯胺酸)、99(天冬醯胺酸)、100(脯胺酸)、101(纈胺酸)、104(天冬胺酸)、106(異白胺酸)、127(白胺酸)、129(白胺酸)、130(精胺酸)、132(丙胺酸)各自置換為天冬胺酸、絲胺酸、麩胺酸、絲胺酸、絲胺酸、白胺酸、麩胺酸、纈胺酸、纈胺酸、異白胺酸、離胺酸、蘇胺酸所設計的人類化＃32A1輕鏈命名為「h＃ 32A1-T3L型輕鏈」。
h＃ 32A1-T3L型輕鏈之胺基酸序列記載於序列表之序列編號65。序列編號65之胺基酸序列之第1至20號之胺基殘基而成的序列、第21至133號之胺基酸殘基而成的序列、第134至238號之胺基酸殘基而成的序列各自相當於訊號序列、輕鏈可變區、輕鏈恆定區。編碼序列編號65之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列表之序列編號64。序列編號64之核苷酸序列之第1至60號之核苷酸而成的序列、第61至399號之核苷酸而成的序列、第400至714號之核苷酸而成的序列各自編碼訊號序列、輕鏈可變區序列、輕鏈恆定區序列。序列編號64之核苷酸序列及序列編號65之胺基酸序列亦記載於第34圖。
c)-iv)h # 32A1-T4L型輕鏈：
將伴隨序列表之序列編號30所示的# 32A1輕鏈之胺基酸編號36(麩醯胺酸)、99(天冬醯胺酸)、100(脯胺酸)、101(纈胺酸)、104(天冬胺酸)、106(異白胺酸)、129(白胺酸)、130(精胺酸)、132(丙胺酸)各自置換為麩胺酸、絲胺酸、絲胺酸、白胺酸、麩胺酸、纈胺酸、異白胺酸、離胺酸、蘇胺酸所設計的人類化# 32A1輕鏈命名為「h # 32A1-T4L型輕鏈」。
h # 32A1-T4L型輕鏈之胺基酸序列記載於序列表之序列編號67。序列編號67之胺基酸序列之第1至20號之胺基殘基而成的序列、第21至132號之胺基酸殘基而成的序列、第133至237號之胺基酸殘基而成的序列各自相當於訊號序列、輕鏈可變區、輕鏈恆定區。編碼序列編號67之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列表之序列編號66。序列編號66之核苷酸序列之第1至60號之核苷酸而成的序列、第61至396號之核苷酸而成的序列、第397至711號之核苷酸而成的序列各自編碼訊號序列、輕鏈可變區序列、輕鏈恆定區序列。序列編號66之核苷酸序列及序列編號67之胺基酸序列亦記載於第35圖。
c)-v)h＃32A1-T5L型輕鏈：
將伴隨序列表之序列編號30所示的＃32A1輕鏈之胺基酸編號29(丙胺酸)、29-30之間(缺損殘基)、36(麩醯胺酸)、41(絲胺酸)、66(麩醯胺酸)、68(精胺酸)、99(天冬醯胺酸)、100(脯胺酸)、101(纈胺酸)、104(天冬胺酸)、106(異白胺酸)、110(苯基丙胺酸)、122(丙胺酸)、123(甘胺酸)、127(白胺酸)、129(白胺酸)、130(精胺酸)、132(丙胺酸)各自置換為天冬胺酸、絲胺酸、麩胺酸、天冬醯胺酸、脯胺酸、離胺酸、絲胺酸、絲胺酸、白胺酸、麩胺酸、纈胺酸、酪胺酸、甘胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸、離胺酸、蘇胺酸所設計的人類化＃32A1輕鏈命名為「h＃32A1-T5L型輕鏈」。
h＃32A1-T5L型輕鏈之胺基酸序列記載於序列表之序列編號69。序列編號69之胺基酸序列之第1至20號之胺基殘基而成的序列、第21至133號之胺基酸殘基而成的序列、第134至238號之胺基酸殘基而成的序列各自相當於訊號序列、輕鏈可變區、輕鏈恆定區。編碼序列編號69之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列表之序列編號68。序列編號68之核苷酸序列之第1至60號之核苷酸而成的序列、第61至399號之核苷酸而成的序列、第400至714號之核苷酸而成的序列各自編碼訊號序列、輕鏈可變區序列、輕鏈恆定區序列。序列編號68之核苷酸序列及序列編號69之胺基酸序列亦記載於第36圖。
c)-vi)h#32A1-T6L型輕鏈：
將伴隨序列表之序列編號30所示的#32A1輕鏈之胺基酸編號29(丙胺酸)、29-30之間(缺損殘基)、36(麩醯胺酸)、66(麩醯胺酸)、99(天冬醯胺酸)、100(脯胺酸)、101(纈胺酸)、104(天冬胺酸)、106(異白胺酸)、127(白胺酸)、129(白胺酸)、130(精胺酸)、132(丙胺酸)各自置換為天冬胺酸、絲胺酸、麩胺酸、脯胺酸、絲胺酸、絲胺酸、白胺酸、麩胺酸、纈胺酸、纈胺酸、異白胺酸、離胺酸、蘇胺酸所設計的人類化#32A1輕鏈命名為「h#32A1-T6L型輕鏈」。
h#32A1-T6L型輕鏈之胺基酸序列記載於序列表之序列編號71。序列編號71之胺基酸序列之第1至20號胺基殘基而成的序列、第21至133號之胺基酸殘基而成的序列、第134至238號之胺基酸殘基而成的序列個字相當於訊號序列、輕鏈可變區、輕鏈恆定區。編碼序列編號71之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列表之序列編號70。序列編號70之核苷酸序列之第1至60號之核苷酸而成的序列、第61至399號之核苷酸而成的序列、第400至714號之核苷酸而成的序列各自編碼訊號序列、輕鏈可變區序列、輕鏈恆定區序列。序列編號70之核苷酸序列及序列編號71之胺基酸序列亦記載於第37圖。
c)-vii)h#32A1-T7L型輕鏈：
將伴隨序列表之序列編號30所示的#32A1輕鏈之胺基酸編號24(白胺酸)、29(丙胺酸)、29-30之間(缺損殘基)、36(麩醯胺酸)、66(麩醯胺酸)、68(精胺酸)、81(異白胺酸)、99(天冬醯胺酸)、100(脯胺酸)、101(纈胺酸)、104(天冬胺酸)、106(異白胺酸)、108(蘇胺酸)、110(苯基丙胺酸)、122(丙胺酸)、127(白胺酸)、129(白胺酸)、130(精胺酸)、132(丙胺酸)各自置換為甲硫胺酸、天冬胺酸、絲胺酸、麩胺酸、脯胺酸、離胺酸、纈胺酸、絲胺酸、絲胺酸、白胺酸、麩胺酸、纈胺酸、纈胺酸、酪胺酸、甘胺酸、纈胺酸、異白胺酸、離胺酸、蘇胺酸的設計的人類化#32A1輕鏈命名為「h#32A1-T7L型輕鏈」。
h#32A1-T7L型輕鏈胺基酸序列記載於序列表之序列編號78。序列編號78之胺基酸序列之第1至113號胺基殘基而成的序列、第114至218號之胺基酸殘基而成的序列各自相當於輕鏈可變區、輕鏈恆定區。序列編號78之胺基酸序列亦記載於第40圖。
c)-viii)h#32A1-T8L型輕鏈：
將伴隨序列表之序列編號30所示的#32A1輕鏈之胺基酸編號24(白胺酸)、29(丙胺酸)、29-30之間(缺損殘基)、36(麩醯胺酸)、41(絲胺酸)、66(麩醯胺酸)、81(異白胺酸)、99(天冬醯胺酸)、100(脯胺酸)、101(纈胺酸)、104(天冬胺酸)、106(異白胺酸)、108(蘇胺酸)、110(苯基丙胺酸)、122(丙胺酸)、127(白胺酸)、129(白胺酸)、130(精胺酸)、132(丙胺酸)各自置換為甲硫胺酸、天冬胺酸、絲胺酸、麩胺酸、天冬醯胺酸、脯胺酸、纈胺酸、絲胺酸、絲胺酸、白胺酸、麩胺酸、纈胺酸、纈胺酸、酪胺酸、甘胺酸、纈胺酸、異白胺酸、離胺酸、蘇胺酸的設計的人類化＃32A1輕鏈命名為「h＃32A1-T8L型輕鏈」。
又，h＃32A1-T8L型輕鏈之胺基酸序列記載於序列表之序列編號79。序列編號79之胺基酸序列之第1至113號之胺基殘基而成的序列、第114至218號之胺基酸殘基而成的序列各自相當於輕鏈可變區、輕鏈恆定區。序列編號79之胺基酸序列亦記載於第40圖。
c)-ix)h＃32A1-T9L型輕鏈：
將伴隨序列表之序列編號30所示的＃32A1輕鏈之胺基酸編號24(白胺酸)、29(丙胺酸)、29-30之間(缺損殘基)、36(麩醯胺酸)、41(絲胺酸)、66(麩醯胺酸)、68(精胺酸)、81(異白胺酸)、99(天冬醯胺酸)、100(脯胺酸)、101(纈胺酸)、104(天冬胺酸)、106(異白胺酸)、108(蘇胺酸)、122(丙胺酸)、127(白胺酸)、129(白胺酸)、130(精胺酸)、132(丙胺酸)各自置換為甲硫胺酸、天冬胺酸、絲胺酸、麩胺酸、天冬醯胺酸、脯胺酸、離胺酸、纈胺酸、絲胺酸、絲胺酸、白胺酸、麩胺酸、纈胺酸、纈胺酸、甘胺酸、纈胺酸、異白胺酸、離胺酸、蘇胺酸的設計的人類化＃32A1輕鏈命名為「h＃32A1-T9L型輕鏈」。
又，h＃32A1-T9L型輕鏈之胺基酸序列記載於序列表之序列編號80。序列編號80之胺基酸序列之第1至113號之胺基殘基而成的序列、第114至218號之胺基酸殘基而成的序列各自相當於輕鏈可變區、輕鏈恆定區。序列編號80之胺基酸序列亦記載於第40圖。
c) -x) h#32A1-T10L型輕鏈：
將伴隨序列表之序列編號30所示的#32A1輕鏈之胺基酸編號24(白胺酸)、29(丙胺酸)、29-30之間(缺損殘基)、36(麩醯胺酸)、41(絲胺酸)、66(麩醯胺酸)、68(精胺酸)、81(異白胺酸)、99(天冬醯胺酸)、100(脯胺酸)、101(纈胺酸)、104(天冬胺酸)、106(異白胺酸)、108(蘇胺酸)、110(苯基丙胺酸)、127(白胺酸)、129(白胺酸)、130(精胺酸)、132(丙胺酸)各自置換為甲硫胺酸、天冬胺酸、絲胺酸、麩胺酸、天冬醯胺酸、脯胺酸、離胺酸、纈胺酸、絲胺酸、絲胺酸、白胺酸、麩胺酸、纈胺酸、纈胺酸、酪胺酸、纈胺酸、異白胺酸、離胺酸、蘇胺酸的設計的人類化#32A1輕鏈命名為「h#32A1-T10L型輕鏈」。
又，h#32A1-T10L型輕鏈之胺基酸序列記載於序列表之序列編號81。序列編號81之胺基酸序列之第1至113號之胺基殘基而成的序列、第114至218號之胺基酸殘基而成的序列各自相當於輕鏈可變區、輕鏈恆定區。序列編號81之胺基酸序列亦記載於第40圖。
c) -xi) h#32A1-T11L型輕鏈：
將伴隨序列表之序列編號30所示的#32A1輕鏈之胺基酸編號24(白胺酸)、29(丙胺酸)、29-30之間(缺損殘基)、36(麩醯胺酸)、66(麩醯胺酸)、81(異白胺酸)、99(天冬醯胺酸)、100(脯胺酸)、101(纈胺酸)、104(天冬胺酸)、106(異白胺酸)、108(蘇胺酸)、110(苯基丙胺酸)、122(丙胺酸)、127(白胺酸)、129(白胺酸)、130(精胺酸)、132(丙胺酸)各自置換為甲硫胺酸、天冬胺酸、絲胺酸、麩胺酸、脯胺酸、纈胺酸、絲胺酸、絲胺酸、白胺酸、麩胺酸、纈胺酸、纈胺酸、酪胺酸、甘胺酸、纈胺酸、異白胺酸、離胺酸、蘇胺酸的設計的人類化＃32A1輕鏈命名為「h＃32A1-T11L型輕鏈」。
又，h＃32A1-T11L型輕鏈之胺基酸序列記載於序列表之序列編號82。序列編號82之胺基酸序列之第1至113號之胺基殘基而成的序列、第114至218號之胺基酸殘基而成的序列各自相當於輕鏈可變區、輕鏈恆定區。序列編號82之胺基酸序列亦記載於第40圖。
c)-xii)h＃32A1-T12L型輕鏈：
將伴隨序列表之序列編號30所示的＃32A1輕鏈之胺基酸編號24(白胺酸)、29(丙胺酸)、29-30之間(缺損殘基)、36(麩醯胺酸)、66(麩醯胺酸)、68(精胺酸)、81(異白胺酸)、99(天冬醯胺酸)、100(脯胺酸)、101(纈胺酸)、104(天冬胺酸)、106(異白胺酸)、108(蘇胺酸)、122(丙胺酸)、127(白胺酸)、129(白胺酸)、130(精胺酸)、132(丙胺酸)各自置換為甲硫胺酸、天冬胺酸、絲胺酸、麩胺酸、脯胺酸、離胺酸、纈胺酸、絲胺酸、絲胺酸、白胺酸、麩胺酸、纈胺酸、纈胺酸、甘胺酸、纈胺酸、異白胺酸、離胺酸、蘇胺酸的設計的人類化＃32A1輕鏈命名為「h＃32A1-T12L型輕鏈」。
又，h＃32A1-T12L型輕鏈之胺基酸序列記載於序列表之序列編號83。序列編號83之胺基酸序列之第1至113號之胺基殘基而成的序列、第114至218號之胺基酸殘基而成的序列各自相當於輕鏈可變區、輕鏈恆定區。序列編號83之胺基酸序列亦記載於第41圖。
c)-xiii)h#32A1-T13L型輕鏈：
將伴隨序列表之序列編號30所示的#32A1輕鏈之胺基酸編號24(白胺酸)、29(丙胺酸)、29-30之間(缺損殘基)、36(麩醯胺酸)、66(麩醯胺酸)、68(精胺酸)、81(異白胺酸)、99(天冬醯胺酸)、100(脯胺酸)、101(纈胺酸)、104(天冬胺酸)、106(異白胺酸)、108(蘇胺酸)、110(苯基丙胺酸)、127(白胺酸)、129(白胺酸)、130(精胺酸)、132(丙胺酸)各自置換為甲硫胺酸、天冬胺酸、絲胺酸、麩胺酸、脯胺酸、離胺酸、纈胺酸、絲胺酸、絲胺酸、白胺酸、麩胺酸、纈胺酸、纈胺酸、酪胺酸、纈胺酸、異白胺酸、離胺酸、蘇胺酸的設計的人類化#32A1輕鏈命名為「h#32A1-T13L型輕鏈」。
又，h#32A1-T13L型輕鏈之胺基酸序列記載於序列表之序列編號84。序列編號84之胺基酸序列之第1至113號之胺基殘基而成的序列、第114至218號之胺基酸殘基而成的序列各自相當於輕鏈可變區、輕鏈恆定區。序列編號84之胺基酸序列亦記載於第41圖。
c)-xiv)h#32A1-T14L型輕鏈：
將伴隨序列表之序列編號30所示的#32A1輕鏈之胺基酸編號24(白胺酸)、29(丙胺酸)、29-30之間(缺損殘基)、36(麩醯胺酸)、41(絲胺酸)、66(麩醯胺酸)、81(異白胺酸)、99(天冬醯胺酸)、100(脯胺酸)、101(纈胺酸)、104(天冬胺酸)、106(異白胺酸)、108(蘇胺酸)、122(丙胺酸)、127(白胺酸)、129(白胺酸)、130(精胺酸)、132(丙胺酸)各自置換為甲硫胺酸、天冬胺酸、絲胺酸、麩胺酸、天冬醯胺酸、脯胺酸、纈胺酸、絲胺酸、絲胺酸、白胺酸、麩胺酸、纈胺酸、纈胺酸、甘胺酸、纈胺酸、異白胺酸、離胺酸、蘇胺酸的設計的人類化＃32A1輕鏈命名為「h＃32A1-T14L型輕鏈」。
又，h＃32A1-T14L型輕鏈之胺基酸序列記載於序列表之序列編號85。序列編號85之胺基酸序列之第1至113號之胺基殘基而成的序列、第114至218號之胺基酸殘基而成的序列各自相當於輕鏈可變區、輕鏈恆定區。序列編號85之胺基酸序列亦記載於第41圖。
c)-xv)h＃32A1-T15L型輕鏈：
將伴隨序列表之序列編號30所示的＃32A1輕鏈之胺基酸編號24(白胺酸)、29(丙胺酸)、29-30之間(缺損殘基)、36(麩醯胺酸)、41(絲胺酸)、66(麩醯胺酸)、81(異白胺酸)、99(天冬醯胺酸)、100(脯胺酸)、101(纈胺酸)、104(天冬胺酸)、106(異白胺酸)、108(蘇胺酸)、110(苯基丙胺酸)、127(白胺酸)、129(白胺酸)、130(精胺酸)、132(丙胺酸)各自置換為甲硫胺酸、天冬胺酸、絲胺酸、麩胺酸、天冬醯胺酸、脯胺酸、纈胺酸、絲胺酸、絲胺酸、白胺酸、麩胺酸、纈胺酸、纈胺酸、酪胺酸、纈胺酸、異白胺酸、離胺酸、蘇胺酸所設計的人類化#32Al輕鏈命名為「h#32Al-T15L型輕鏈」。
又，h#32Al-T15L型輕鏈之胺基酸序列記載於序列表之序列編號86。序列編號86之胺基酸序列之第1至113號之胺基殘基而成的序列、第114至218號之胺基酸殘基而成的序列各自相當於輕鏈可變區、輕鏈恆定區。序列編號86之胺基酸序列亦記載於第41圖。
c)-xvi)h#32Al-T16L型輕鏈：
將伴隨序列表之序列編號30所示的#32Al輕鏈之胺基酸編號24(白胺酸)、29(丙胺酸)、29-30之間(缺損殘基)、36(麩醯胺酸)、41(絲胺酸)、66(麩醯胺酸)、68(精胺酸)、81(異白胺酸)、99(天冬醯胺酸)、100(脯胺酸)、101(纈胺酸)、104(天冬胺酸)、106(異白胺酸)、108(蘇胺酸)、127(白胺酸)、129(白胺酸)、130(精胺酸)、132(丙胺酸)各自置換為甲硫胺酸、天冬胺酸、絲胺酸、麩胺酸、天冬醯胺酸、脯胺酸、離胺酸、纈胺酸、絲胺酸、絲胺酸、白胺酸、麩胺酸、纈胺酸、纈胺酸、纈胺酸、異白胺酸、離胺酸、蘇胺酸所設計的人類化#32Al輕鏈命名為「h#32Al-T16L型輕鏈」。
又，h#32Al-T16L型輕鏈之胺基酸序列記載於序列表之序列編號87。序列編號87之胺基酸序列之第1至113號之胺基殘基而成的序列、第114至218號之胺基酸殘基而成的序列各自相當於輕鏈可變區、輕鏈恆定區。序列編號87之胺基酸序列亦記載於第41圖。
c) -xvii) h#32A1-T17L型輕鏈：
將伴隨序列表之序列編號30所示的#32A1輕鏈之胺基酸編號24(白胺酸)、29(丙胺酸)、29-30之間(缺損殘基)、36(麩醯胺酸)、66(麩醯胺酸)、81(異白胺酸)、99(天冬醯胺酸)、100(脯胺酸)、101(纈胺酸)、104(天冬胺酸)、106(異白胺酸)、108(蘇胺酸)、122(丙胺酸)、127(白胺酸)、129(白胺酸)、130(精胺酸)、132(丙胺酸)各自置換為甲硫胺酸、天冬胺酸、絲胺酸、麩胺酸、脯胺酸、纈胺酸、絲胺酸、絲胺酸、白胺酸、麩胺酸、纈胺酸、纈胺酸、甘胺酸、纈胺酸、異白胺酸、離胺酸、蘇胺酸所設計的人類化#32A1輕鏈命名為「h#32A1-T17L型輕鏈」。
又，h#32A1-T17L型輕鏈之胺基酸序列記載於序列表之序列編號88。序列編號88之胺基酸序列之第1至113號之胺基殘基而成的序列、第114至218號之胺基酸殘基而成的序列各自相當於輕鏈可變區、輕鏈恆定區。序列編號88之胺基酸序列亦記載於第42圖。
c) -xviii) h#32A1-T18L型輕鏈：
將伴隨序列表之序列編號30所示的#32A1輕鏈之胺基酸編號24(白胺酸)、29(丙胺酸)、29-30之間(缺損殘基)、36(麩醯胺酸)、66(麩醯胺酸)、81(異白胺酸)、99(天冬醯胺酸)、100(脯胺酸)、101(纈胺酸)、104(天冬胺酸)、106(異白胺酸)、108(蘇胺酸)、110(苯基丙胺酸)、127(白胺酸)、129(白胺酸)、130(精胺酸)、132(丙胺酸)各自置換為甲硫胺酸、天冬胺酸、絲胺酸、麩胺酸、脯胺酸、纈胺酸、絲胺酸、絲胺酸、白胺酸、麩胺酸、纈胺酸、纈胺酸、酪胺酸、纈胺酸、異白胺酸、離胺酸、蘇按酸所設計的人類化#32A1輕鏈命名為「h#32A1-T18L型輕鏈」。
又，h#32A1-T18L型輕鏈之胺基酸序列記載於序列表之序列編號89。序列編號89之胺基酸序列之第1至113號之胺基殘基而成的序列、第114至218號之胺基酸殘基而成的序列各自相當於輕鏈可變區、輕鏈恆定區。序列編號89之胺基酸序列亦記載於第42圖。
c)-xix)h#32A1-T19L型輕鏈：
將伴隨序列表之序列編號30所示的#32A1輕鏈之胺基酸編號24(白胺酸)、29(丙胺酸)、29-30之間(缺損殘基)、36(麩醯胺酸)、66(麩醯胺酸)、68(精胺酸)、81(異白胺酸)、99(天冬醯胺酸)、100(脯胺酸)、101(纈胺酸)、104(天冬胺酸)、106(異白胺酸)、108(蘇胺酸)、127(白胺酸)、129(白胺酸)、130(精胺酸)、132(丙胺酸)各自置換為甲硫胺酸、天冬胺酸、絲胺酸、麩胺酸、脯胺酸、離胺酸、纈胺酸、絲胺酸、絲胺酸、白胺酸、麩胺酸、纈胺酸、纈胺酸、纈胺酸、異白胺酸、離胺酸、蘇胺酸所設計的人類化#32A1輕鏈命名為「h#32A1-T19L型輕鏈」。
又，h#32A1-T19L型輕鏈之胺基酸序列記載於序列表之序列編號90。序列編號90之胺基酸序列之第1至113號之胺基殘基而成的序列、第114至218號之胺基酸殘基而成的序列各自相當於輕鏈可變區、輕鏈恆定區。序列編號90之胺基酸序列亦記載於第42圖。
c)-xx)h＃32A1-T20L型輕鏈：
將伴隨序列表之序列編號30所示的＃32A1輕鏈之胺基酸編號24(白胺酸)、29(丙胺酸)、29-30之間(缺損殘基)、36(麩醯胺酸)、41(絲胺酸)、66(麩醯胺酸)、81(異白胺酸)、99(天冬醯胺酸)、100(脯胺酸)、101(纈胺酸)、104(天冬胺酸)、106(異白胺酸)、108(蘇胺酸)、127(白胺酸)、129(白胺酸)、130(精胺酸)、132(丙胺酸)各自置換為甲硫胺酸、天冬胺酸、絲胺酸、麩胺酸、天冬醯胺酸、脯胺酸、纈胺酸、絲胺酸、絲胺酸、白胺酸、麩胺酸、纈胺酸、纈胺酸、纈胺酸、異白胺酸、離胺酸、蘇胺酸所設計的人類化＃32A1輕鏈命名為「h＃32A1-T20L型輕鏈」。
又，h＃32A1-T20L型輕鏈之胺基酸序列記載於序列表之序列編號91。序列編號91之胺基酸序列之第1至113號之胺基殘基而成的序列、第114至218號之胺基酸殘基而成的序列各自相當於輕鏈可變區、輕鏈恆定區。序列編號91之胺基酸序列亦記載於第42圖。
c)-xxi)h＃32A1-T21L型輕鏈：
將伴隨序列表之序列編號30所示的＃32A1輕鏈之胺基酸編號21(天冬胺酸)、24(白胺酸)、29-30之間(缺損殘基)、31(丙胺酸)、32(纈胺酸)、34(白胺酸)、36(麩醯胺酸)、40(異白胺酸)、66(麩醯胺酸)、99(天冬醯胺酸)、100(脯胺酸)、101(纈胺酸)、102(麩醯胺酸)、103(丙胺酸)、104(天冬胺酸)、106(異白胺酸)、108(蘇胺酸)、110(苯基丙胺酸)、122(丙胺酸)、123(甘胺酸)、127(白胺酸)、129(白胺酸)、130(精胺酸)、132(丙胺酸)各自置換為麩胺酸、甲硫胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、白胺酸、脯胺酸、麩胺酸、白胺酸、丙胺酸、絲胺酸、絲胺酸、白胺酸、麩胺酸、脯胺酸、麩胺酸、苯基丙胺酸、白胺酸、酪胺酸、甘胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸、離胺酸、蘇胺酸所設計的人類化＃32A1輕鏈命名為「h＃32A1-T21L型輕鏈」。
又，h＃ 32A1-T21L型輕鏈之胺基酸序列記載於序列表之序列編號92。序列編號92之胺基酸序列之第1至113號之胺基殘基而成的序列、第114至218號之胺基酸殘基而成的序列各自相當於輕鏈可變區、輕鏈恆定區。序列編號92之胺基酸序列亦記載於第42圖。
c) -xxii) h＃32A1-T22L型輕鏈：
將伴隨序列表之序列編號30所示的＃32A1輕鏈之胺基酸編號21(天冬胺酸)、24(白胺酸)、29-30之間(缺損殘基)、31(丙胺酸)、32(纈胺酸)、34(白胺酸)、36(麩醯胺酸)、40(異白胺酸)、66(麩醯胺酸)、99(天冬醯胺酸)、100(脯胺酸)、101(纈胺酸)、102(麩醯胺酸)、103(丙胺酸)、104(天冬胺酸)、106(異白胺酸)、108(蘇胺酸)、123(甘胺酸)、127(白胺酸)、129(白胺酸)、130(精胺酸)、132(丙胺酸)各自置換為麩胺酸、甲硫胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、白胺酸、脯胺酸、麩胺酸、白胺酸、丙胺酸、絲胺酸、絲胺酸、白胺酸、麩胺酸、脯胺酸、麩胺酸、苯基丙胺酸、白胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸、離胺酸、蘇胺酸所設計的人類化＃32A1輕鏈命名為「h＃32A1-T22L型輕鏈」。
又，h#32A1-T22L型輕鏈之胺基酸序列記載於序列表之序列編號93。序列編號93之胺基酸序列之第1至113號之胺基殘基而成的序列、第114至218號之胺基酸殘基而成的序列各自相當於輕鏈可變區、輕鏈恆定區。序列編號93之胺基酸序列亦記載於第43圖。
c)-xxiii)h#32A1-T23L型輕鏈：
將伴隨序列表之序列編號30所示的#32A1輕鏈之胺基酸編號24(白胺酸)、29-30之間(缺損殘基)、31(丙胺酸)、32(纈胺酸)、34(白胺酸)、36(麩醯胺酸)、40(異白胺酸)、66(麩醯胺酸)、99(天冬醯胺酸)、100(脯胺酸)、101(纈胺酸)、102(麩醯胺酸)、103(丙胺酸)、104(天冬胺酸)、106(異白胺酸)、108(蘇胺酸)、127(白胺酸)、129(白胺酸)、130(精胺酸)、132(丙胺酸)各自置換為甲硫胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、白胺酸、脯胺酸、麩胺酸、白胺酸、丙胺酸、絲胺酸、絲胺酸、白胺酸、麩胺酸、脯胺酸、麩胺酸、苯基丙胺酸、白胺酸、纈胺酸、異白胺酸、離胺酸、蘇胺酸所設計的人類化#32A1輕鏈命名為「h#32A1-T23L型輕鏈」。
又，h#32A1-T23L型輕鏈之胺基酸序列記載於序列表之序列編號94。序列編號94之胺基酸序列之第1至113號之胺基殘基而成的序列、第114至218號之胺基酸殘基而成的序列各自相當於輕鏈可變區、輕鏈恆定區。序列編號94之胺基酸序列亦記載於第43圖。
c)-xxiv)h＃32A1-T24L型輕鏈：
將伴隨序列表之序列編號30所示的＃32A1輕鏈之胺基酸編號21(天冬胺酸)、29-30之間(缺損殘基)、31(丙胺酸)、32(纈胺酸)、34(白胺酸)、36(麩醯胺酸)、40(異白胺酸)、66(麩醯胺酸)、99(天冬醯胺酸)、100(脯胺酸)、101(纈胺酸)、102(麩醯胺酸)、103(丙胺酸)、104(天冬胺酸)、106(異白胺酸)、108(蘇胺酸)、110(苯基丙胺酸)、122(丙胺酸)、123(甘胺酸)、127(白胺酸)、129(白胺酸)、130(精胺酸)、132(丙胺酸)各自置換為麩胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、白胺酸、脯胺酸、麩胺酸、白胺酸、丙胺酸、絲胺酸、絲胺酸、白胺酸、麩胺酸、脯胺酸、麩胺酸、苯基丙胺酸、白胺酸、酪胺酸、甘胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸、離胺酸、蘇胺酸所設計的人類化＃32A1輕鏈命名為「h＃32A1-T24L型輕鏈」。
又，h＃32A1-T24L型輕鏈之胺基酸序列記載於序列表之序列編號95。序列編號95之胺基酸序列之第1至113號之胺基殘基而成的序列、第114至218號之胺基酸殘基而成的序列各自相當於輕鏈可變區、輕鏈恆定區。序列編號95之胺基酸序列亦記載於第43圖。
c)-xxv)h＃32A1-T25L型輕鏈：
將伴隨序列表之序列編號30所示的＃32A1輕鏈之胺基酸編號29-30之間(缺損殘基)、31(丙胺酸)、32(纈胺酸)、34(白胺酸)、36(麩醯胺酸)、40(異白胺酸)、99(天冬醯胺酸)、100(脯胺酸)、101(纈胺酸)、102(麩醯胺酸)、103(丙胺酸)、104(天冬胺酸)、106(異白胺酸)、110(苯基丙胺酸)、127(白胺酸)、129(白胺酸)、130(精胺酸)、132(丙胺酸)各自置換為蘇胺酸、絲胺酸、白胺酸、脯胺酸、麩胺酸、白胺酸、絲胺酸、絲胺酸、白胺酸、麩胺酸、脯胺酸、麩胺酸、苯基丙胺酸、酪胺酸、纈胺酸、異白胺酸、離胺酸、蘇胺酸所設計的人類化#32A1輕鏈命名為「h#32A1-T25L型輕鏈」。
又，h#32A1-T25L型輕鏈之胺基酸序列記載於序列表之序列編號96。序列編號96之胺基酸序列之第1至113號之胺基殘基而成的序列、第114至218號之胺基酸殘基而成的序列各自相當於輕鏈可變區、輕鏈恆定區。序列編號96之胺基酸序列亦記載於第43圖。
實施例23　大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體#32A1之人類化抗體基因之製作
a) h#32A1-T1L、h#32A1-T2L、h#32A1-T3L、h#32A1-T4L、h#32A1-T5L及h#32A1-T6L型輕鏈表現載體之構築
合成含有編碼各自顯示於序列表之序列編號61胺基酸編號1至133、序列編號63之胺基酸編號1至133、序列編號65之胺基酸編號1至133、序列編號67之胺基酸編號1至132、序列編號69之胺基酸編號1至133及序列編號71之胺基酸編號1至133之與分泌訊號融合的h#32A1-T1L、h#32A1-T2L、h#32A1-T3L、h#32A1-T4L、h#32A1-T5L及h#32A1-T6L型輕鏈可變區的基因的DNA(MBL公司，人工基因合成服務)，經由將以限制酵素NheI及BsiWI所切出的DNA片段插入將人類化抗體輕鏈表現泛用之載體(pEF6KCL)以限制酵素NheI及BsiWI切斷的位置，而構築h#32A1-T1L、h#32A1-T2L、h#32A1-T3L、h#32A1-T4L、h#32A1-T5L及h#32A1-T6L型輕鏈表現載體。將所得的表現載體個別命名為「pEF6KCL/h#32A1-T1L」、「pEF6KCL/h#32A1-T2L」、「pEF6KCL/h#32A1-T3L」、「pEF6KCL/h#32A1-T4L」、「pEF6KCL/h#32A1-T5L」及「pEF6KCL/h#32A1-T6L」。
b)h#32A1-T1H、h#32A1-T2H、h#32A1-T3H、h#32A1-T5H及h#32A1-T6H重鏈表現載體之構築
合成含有編碼各自顯示於序列表之序列編號51、53、55、57及59之胺基酸編號1至140之與分泌訊號融合的h#32A1-T1H、h#32A1-T2H、h#32A1-T3H、h#32A1-T5H及h#32A1-T6H重鏈可變區的基因之DNA(MBL公司，人工基因合成服務)，經由將以限制酵素BlpI切出的DNA片段插入將人類化抗體重鏈表現泛用之載體(pEF1/FCCU-1)以限制酵素BlpI切斷的位置，構築h#32A1-T1H、h#32A1-T2H、h#32A1-T3H、h#32A1-T5H及h#32A1-T6H重鏈表現載體。將所獲得的表現載體各自命名為「pEF1/FCCU/h#32A1-T1H」、「pEF1/FCCU/h#32A1-T2H」「pEF1/FCCU/h#32A1-T3H」「pEF1/FCCU/h#32A1-T5H」及「pEF1/FCCU/h#32A1-T6H」。
實施例24大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體#32A1之人類化抗體之調製
a)人類化抗體之生產
將對數增殖期之293FreeStyle細胞1.5×108 接種於新鮮的100Ml之FreeStyle293表現培養基(Invitrogen公司)，於37℃、8%CO2 培養箱中振盪培養(125rpm)。將聚乙烯亞胺(Polyscience#24765)1mg溶解於4mL之Opti-ProSFM培養基(Invitrogen公司製)，於室溫放置5分鐘。將使用PureLink HiPure Plasmid套組(Invitrogen公司)調製的重鏈表現質體(0.05mg)及輕鏈表現質體(0.15mg)懸浮於4mL之Opti-ProSFM培養基(Invitrogen公司)。將表現質體/OptiProSFM混合液4mL加到於室溫放置5分鐘的4mL之聚乙烯亞胺/OptiProSFM混合液，再於室溫放置5分鐘。其次，將聚乙烯亞胺/表現質體/OptiProSFM混合液8mL加到293FreeStyle細胞懸浮液中，繼續振盪培養。於37℃、8%CO2 中培養7日後，回收培養上清液。
b)人類化抗體之純化
上述a)所獲得的培養上清液以Protein A親和性層析純化。將培養上清100mL放入500mL附容器蓋燒瓶，添加1mL以PBS平衡化的MabSelectSuRe(GE Healthcare Bio-science公司製)懸浮液(50%漿液)。於10℃之培養箱中、100rpm。將293F培養上清液/MabSelectSuRe懸浮液塗敷於ZebaSpinColumn，empty 5mL(PIERCE公司)。樹脂完全放入管柱中，以10mL之1M NaCl洗淨。其次，將1M精胺酸溶液(pH4.0)1mL塗敷，收集含抗體之份。將此份添加到離心過濾器裝置(Centrifugal Filter Device)(AmiconUltra4，分劃分子量50K、Millipore公司)，進行向檸檬酸緩衝之液取代及濃縮。將最終容量作成200μL，成為純化樣品。
將經由pEF6KCL/h#32A1-T1L與pEF1/FCCU/h#32A1-T1H之組合所取得的#32A1之人類化抗體命名為「h#32A1-T1」，將pEF6KCL/h#32A1-T2L 與pEF1/FCCU/h#32A1-T2H之組合所取得的#32A1之人類化抗體命名為「h#32A1-T2」，將pEF6KCL/h#32A1-T3L 與pEF1/FCCU/h#32A1-T3H之組合所取得的#32A1之人類化抗體命名為「h#32A1-T3」，將pEF6KCL/h#32A1-T4L與pEF1/FCCU/h#32A1-T3H之組合所取得的#32A1之人類化抗體命名為「h#32A1-T4」，將pEF6KCL/h#32A1-T5L 與pEF1/FCCU/h#32A1-T5H之組合所取得的#32A1之人類化抗體命名為「h#32A1-T5」，將pEF6KCL/h#32A1-T6L 與pEF1/FCCU/h#32A1-T6H之組合所取得的#32A1之人類化抗體命名為「h#32A1-T6」。
實施例25大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體#32A1之人類化抗體之對小鼠Siglec-15蛋白質的結合性評價
大鼠抗小鼠Siglec-15#32A1人類化抗體T1-T6之對小鼠Siglec-15-Fc及人類Siglec-15-Fc的結合性以下列方法評價。將實施例4所純化的小鼠Siglec-15-Fc、或實施例12所純化的人類Siglec-15-Fc以PBS稀釋為1μg/ml後，以100μl/孔分注於免疫盤(Nunc公司製#437111)，於4℃靜置一晚下使各蛋白質吸附於平盤。翌日，孔以PBS-T液(PBS、0.05%(v/v)Tween 20)洗淨5次後，以350μl/孔分注脫脂乳(森永乳業公司製)以PBS稀釋為5%的溶液，於室溫靜置2小時。除去孔中之液而以PBS-T液洗淨5次後，實施例24所調製的純化大鼠抗小鼠Siglec-15 # 32A1人類化抗體T1-T6或實施例19所調製的人類嵌合抗體，使用含有0.5%脫脂乳之PBS液稀釋為終濃度1~0.004μg/ml(4倍稀釋系列)後，以100μl/孔分注，室溫下靜置2小時。此時，於光譜儀DU7400(Beckman公司製)測定280nm，基於各抗體之莫耳分子吸光係數決定各抗體濃度。以PBS-T液洗淨孔5次後，以100μl/孔添加以TBS-T液(TBS、0.05%(v/v)Tween 20)稀釋為2500倍的Alkaline Phosphatase-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG(Jackson ImmunoResearch公司製# 109-055-097)，於室溫靜置1小時。除去孔中之液，以TBS-T液洗淨孔5次後，以100μl/孔添加螢光基質液(Roche公司製# 11681982001)進行螢光反應。於小鼠Siglec-15-Fc吸附平盤添加螢光基質液添加10分鐘後，人類Siglec-15-Fc平盤15分鐘後，分別於Spectra Max M5(Molecular Devices公司製)測量螢光強度。此結果，於全部檢討的大鼠抗小鼠Siglec-15人類化抗體6檢體，確認抗體之濃度上依存的小鼠Siglec-15蛋白質(第18圖)及人類Siglec-15蛋白質(第19圖)之結合。
實施例26 經由大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體# 32A1之嵌合抗體之添加，小鼠骨髓非附著細胞向破骨細胞分化之影 響(TNFα刺激)
使用於實施例6所調製的大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體# 32A1及實施例19所調製的大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體# 32A1之嵌合抗體，檢討經由小鼠骨髓非附著細胞之TNFα刺激而向破骨細胞分化的影響。將以實施例8之方法調製的小鼠骨髓非附著細胞，以含10%胎牛血清(FBS)、10ng/ml M-CSF、及2ng/ml TGF-β(R & D Systems公司製)的α-MEM培養基調製為1.5×105 細胞/ml者接種各200μl於96孔平盤之各孔，於CO2 培養箱中培養2日。除去96孔平盤中之舊培養液，添加將人類基因重組型TNFα(R & D Systems公司製)以成為終濃度30ng/ml、M-CSF成為10ng/ml的方式添加的含10% FBS之MEM-α培養基100μl。於此細胞培養液中，將實施例6製作的大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體# 32A1及實施例19製作的大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體# 32A1之嵌合抗體以成為0.125~4μg/ml之濃度的方式添加，再於CO2 培養箱中培養3日。同時亦準備以專利案WO96/26217之說明書所記載之方法調製的人類基因重組型OCIF/OPG成為100ng/ml之濃度的方式添加而培養的孔。培養終了後，使用白血球酸性磷酸酶套組(Leukocyte Acid Phosphatase kit)(Sigma公司製)，依據套組所附之說明進行TRAP染色，觀察TRAP陽性多核破骨細胞之形成。結果經由添加抗小鼠Siglec-15多株抗體而抑制TRAP陽性之巨大多核破骨細胞之形成(第20圖)。即使添加大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體# 32A1及其嵌合抗體時亦形成單核之小破骨細胞，但TNFα所誘導的大型多核之破骨細胞之形成幾乎完全被抑制。另一方面，即使添加充份量之RANKL團塊OCIF/OPG，大型之多核破骨細胞之形成幾乎未被抑制。又同樣地，形成的破骨細胞之酒石酸耐性酸性磷酸酶(TRAP)活性以實施例9記載之操作測定。酵素反應停止後，測定各孔之405nm之吸光度作為TRAP活性之指標。結果示於第21圖。於#32A1抗體及#32A1之嵌合體，於125ng/ml至4μg/ml之範圍，被認為有顯著的TRAP活性之抑制。由此等結果顯示，大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體及其嵌合體強裂抑制於以TNFα誘導的破骨細胞之分化成熟中細胞融合之過程。
實施例27　大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體#8A1、#32A1於大鼠破骨細胞形成試驗之生物活性評價
使用於實施例6調製的大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體#8A1、#32A1，檢討大鼠骨髓非附著細胞向破骨細胞分化之影響。改變實施例8之方法來調製大鼠骨髓非附著細胞。即，由12週齡之雌F344大鼠的雙腳摘出大腿骨，除去軟組織。將此大腿骨兩端切斷，由附23規之注射針的注射器將MEM-α培養基注入而將骨髓細胞押出，於離心管中回收。室溫下以100g離心5分鐘，去除上清液後，於細胞團塊加入Hemolytic Buffer 1ml(RED BLOOD CELL LYSING BUFFER，Sigma公司製)成為懸浮，於室溫放置5分鐘。加入20ml之D-PBS，於室溫下離心100g，5分鐘，去除上清液後，於細胞團塊加入10ml含有5ng/ml M-CSF(R & D Systems公司製)、10%胎牛血清(FBS)的MEM-α培養基(Invitrogen公司製)成為懸浮，通過細胞篩子(40μm Nylon，BDFALCON公司製)而除去凝集物。將此細胞移到75cm2 -T燒瓶(附著細胞用)，於CO2 培養箱中培養1晚。培養1晚後，回收未附著於T-燒瓶的細胞，作為大鼠骨髓非附著細胞來使用。
以此方法調製的大鼠骨髓非附著細胞，依據實施例9之方法培養而實施大鼠破骨細胞形成試驗。即，將調製的大鼠骨髓非附著細胞以含10%FBS與10ng/ml M-CSF(R&D Systems公司製)的α-MEM培養基調製為1.5×105 細胞/ml者接種200μl於96孔盤之各孔，於CO2 培養箱中培養2日。除去96孔盤中之舊培養液，添加100μl之將人類RANKL(RANKL，Peprotech公司製)以終濃度20ng/ml、M-CSF成為10ng/ml的方式添加的含10%FBS的MEM-α培養基。於此細胞培養液中，以實施例6製作的大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體＃8A1、＃32A1成為31～1000ng/ml之濃度的方式添加，再於CO2 培養箱中培養3日。培養終了後，形成的破骨細胞之酒石酸耐性酸性磷酸酶(TRAP)活性以實施例9記載之方法測定。酵素反應停止後，測量各孔之405nm之吸光度作為TRAP活性之指標。結果示於第22圖。＃8A1抗體，被認為於63ng/ml以上之濃度有用量依存的TRAP活性之抑制。又＃32A1抗體，被認為於31ng/ml以上之濃度有用量依存的TRAP活性之抑制。由此等結果顯示，大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體＃8A1、＃32A1亦與抑制小鼠之破骨細胞形成同樣地強烈抑制大鼠之破骨細胞形成，及#32A1抗體之活體外之大鼠破骨細胞形成抑制活性較#8A1抗體更強。
實施例28大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體#32Al之人類化抗體之設計(2)
a)#32Al之人類化版本之設計
a)-i)對應人類化#32Al之胺基酸序列之設計
人類化#32Al抗體之構築以一般公知之方法作為CDR移植(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，10029-10033(1989))來進行。CDR領域之定義除了CDRH2以外，全部使用Kabat之定義(SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST VOL.I，FIFTH EDTION(1991))。於CDRH2，使用獨自定義而將C末端自Kabat之定義縮短5個殘基。含有如此定義的CDRH2的重鏈序列，較來自大鼠之CDR序列縮短的人類框架序列放入較多，投與人類時，更難辨識為異種抗原。接受者抗體，基於框架領域內之胺基酸相同性而被選擇。將#32Al之框架領域之序列，與抗體之胺基酸序列之Kabat資料庫(Nuc.Acid Res.29，205-206(2001))之全部人類框架作比較，結果，L鏈係起因於GF4/1.1‘CL於框架領域之71%序列相同性，被選擇作為接受者。H鏈係起因於M37GO37’CL於框架領域之73%之序列相同性，而被選擇作為接受者。L鏈於GF4/1.1‘CL，H鏈於M37GO37’CL之框架領域之胺基酸殘基，使與於#32Al之胺基酸殘基並列，鑑定所使用之相異胺基酸的位置。
此等殘基之位置使用實施例22a)-i)所構築的#32A1之三次元模式來分析，而於接受者上應移植的供與者殘基依據Queen et a1.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，10029-10033(1989))所給與的基準被選擇。經由將幾個選擇的供與者殘基移到接受者抗體，人類化#32A1序列以下列實施例記載的方式構築。
a)-ii)#32A1重鏈之人類化
a)-ii)-i)h#32A1-H1-1型重鏈：
伴隨將序列表之序列編號28所示的32A1之胺基酸編號23(異白胺酸)、24(白胺酸)、26(蘇胺酸)、32(離胺酸)、43(蘇胺酸)、61(麩胺酸)、83(麩胺酸)、85(白胺酸)、86(麩胺酸)、89(纈胺酸)、95(天冬胺酸)、96(絲胺酸)、97(麩胺酸)、98(絲胺酸)、100(纈胺酸)、104(纈胺酸)、105(絲胺酸)、114(異白胺酸)、118(蘇胺酸)、134(纈胺酸)、135(甲硫胺酸)、140(白胺酸)各自置換為白胺酸、纈胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、丙胺酸、甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、離胺酸、苯基丙胺酸、天冬醯胺酸、丙胺酸、離胺酸、天冬醯胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、天冬醯胺酸、纈胺酸、丙胺酸、蘇胺酸、白胺酸、絲胺酸所設計的人類化32A1重鏈命名為「h#32A1-H1-1型重鏈」。
h#32A1-H1-1型重鏈之胺基酸序列記載於序列表之序列編號99。序列編號99之胺基酸序列之第1至19號之胺基殘基而成的序列、第20至140號之胺基酸殘基而成的序列、第141至466號之胺基酸殘基而成的序列各自相當於訊號序列、重鏈可變區、重鏈恆定區。編碼序列編號99之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列表之序列編號98。序列編號98之核苷酸序列之第1至57號之核苷酸而成的序列、第58至420號之核苷酸而成的序列、第421至1398號之核苷酸而成的序列各自編碼訊號序列、重鏈可變區序列、重鏈恆定區序列。序列編號98之核苷酸序列及序列編號99之胺基酸序列亦記載於第54圖。
a) -iii) ＃32A1輕鏈之人類化
a) -iii) -i) h＃ 32A1-L2-15型輕鏈：
將伴隨序列表之序列編號30所示的32A1之胺基酸編號21(天冬胺酸)、23(纈胺酸)、24(白胺酸)、29-30之間(缺損殘基)、31(丙胺酸)、32(纈胺酸)、34(白胺酸)、36(麩醯胺酸)、40(異白胺酸)、66(麩醯胺酸)、99(天冬醯胺酸)、100(脯胺酸)、101(纈胺酸)、102(麩醯胺酸)、103(丙胺酸)、104(天冬胺酸)、106(異白胺酸)、108(蘇胺酸)、110(苯基丙胺酸)、122(丙胺酸)、123(甘胺酸)、127(白胺酸)、129(白胺酸)、130(精胺酸)、132(丙胺酸)各自置換為麩胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、白胺酸、脯胺酸、麩胺酸、白胺酸、丙胺酸、絲胺酸、絲胺酸、白胺酸、麩胺酸、脯胺酸、麩胺酸、苯基丙胺酸、白胺酸、酪胺酸、甘胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸、離胺酸、蘇胺酸所設計的人類化32A1輕鏈命名為「h＃ 32A1-L2-15型輕鏈」。
h＃ 32A1-L2-15型輕鏈之胺基酸序列記載於序列表之序列編號103。序列編號103之胺基酸序列之第1至20號之胺基殘基而成的序列、第21至133號之胺基酸殘基而成的序列、第134至238號之胺基酸殘基而成的序列各自相當於訊號序列、輕鏈可變區、輕鏈恆定區。編碼序列編號103之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列表之序列編號102。序列編號102之核苷酸序列之第1至60號之核苷酸而成的序列、第61至399號之核苷酸而成的序列、第400至714號之核苷酸而成的序列各自編碼訊號序列、輕鏈可變區序列、輕鏈恆定區序列。序列編號102之核苷酸序列及序列編號103之胺基酸序列亦記載於第56圖。
a)-iii)-ii)h#32A1-L2-16型輕鏈：
將伴隨序列表之序列編號30所示的32A1之胺基酸編號21(天冬胺酸)、23(纈胺酸)、24(白胺酸)、29-30之間(缺損殘基)、31(丙胺酸)、32(纈胺酸)、34(白胺酸)、36(麩醯胺酸)、40(異白胺酸)、66(麩醯胺酸)、99(天冬醯胺酸)、100(脯胺酸)、101(纈胺酸)、102(麩醯胺酸)、103(丙胺酸)、104(天冬胺酸)、106(異白胺酸)、108(蘇胺酸)、123(甘胺酸)、127(白胺酸)、129(白胺酸)、130(精胺酸)、132(丙胺酸)各自置換為麩胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、白胺酸、脯胺酸、麩胺酸、白胺酸、丙胺酸、絲胺酸、絲胺酸、白胺酸、麩胺酸、脯胺酸、麩胺酸、苯基丙胺酸、白胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸、離胺酸、蘇胺酸所設計的人類化32A1輕鏈命名為「h#32A1-L2-16型輕鏈」。
h# 32A1-L2-16型輕鏈之胺基酸序列記載於序列表之序列編號105。序列編號105之胺基酸序列之第1至20號之胺基殘基而成的序列、第21至133號之胺基酸殘基而成的序列、第134至238號之胺基酸殘基而成的序列各自相當於訊號序列、輕鏈可變區、輕鏈恆定區。編碼序列編號105之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列表之序列編號104。序列編號104之核苷酸序列之第1至60號之核苷酸而成的序列、第61至399號之核苷酸而成的序列、第400至714號之核苷酸而成的序列各自編碼訊號序列、輕鏈可變區序列、輕鏈恆定區序列。序列編號104之核苷酸序列及序列編號105之胺基酸序列亦記載於第57圖。
b)大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體#32A1之人類化抗體基因之製作
b)-i)人類重鏈表現泛用載體pEG2之構築
合成含有編碼序列編號106所示人類IgG2訊號序列及恆定區之胺基酸的DNA序列的DNA片段(MBL公司，人工基因合成服務)，以限制酵素NheI及PmeI消化，獲得約1100bp之DNA片段。此DNA片段，與經由將pEF1/FCCU-1以NheI及PmeI消化，取出約1100bp之DNA片段獲得約6200bp之DNA片段結合，構築人類化抗體(hIgG2型)重鏈表現泛用載體pEG2。
b)-ii) h# 32A1-H1-1重鏈表現載體之構築
合成含有編碼與序列表之序列編號99之胺基酸編號1至140所示分泌訊號融合的h# 32A1-H1-1重鏈可變區的基因的DNA(Invitrogen)，將以限制酵素BlpI切出的DNA片段，插入人類化抗體(hIgG2型)重鏈表現泛用載體(pEG2)以限制酵素BlpI切斷的位置，而構築h#32A1-H1-1重鏈表現載體。將所獲得的表現載體命名為「pEG2/h#32A1-H1-1」。
b) -iii) h#32A1-H5重鏈表現載體之構築
將實施例22、b) -iv)設計的h#32A1-T5H型重鏈之訊號序列及恆定區變更為IgG2型的人類化32A1重鏈命名為「h#32A1-H5型重鏈」。
h#32A1-H5型重鏈之胺基酸序列記載於序列表之序列編號101。序列編號101之胺基酸序列之第1至19號之胺基殘基而成的序列、第20至140號之胺基酸殘基而成的序列、第141至466號之胺基酸殘基而成的序列各自相當於訊號序列、重鏈可變區、重鏈恆定區。編碼序列編號101之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列表之序列編號100。序列編號100之核苷酸序列之第1至57號之核苷酸而成的序列、第58至420號之核苷酸而成的序列、第421至1398號之核苷酸而成的序列各自編碼訊號序列、重鏈可變區序列、重鏈恆定區序列。序列編號100之核苷酸序列及序列編號101之胺基酸序列亦記載於第55圖。
將自實施例23製作的pEF1/FCCU/h#32A1-T5H以限制酵素BlpI切出的DNA片段插入人類化抗體(hIgG2型)重鏈表現泛用載體(pEG2)以限制酵素BlpI切斷的位置，而構築h#32A1-H5重鏈表現載體。所得的表現載體命名為「pEG2/h#32A1-H5」。
b)-iv)h#32A1-L2-15及h#32A1-L2-16型輕鏈表現載體之構築
合成含有編碼各自於序列表之序列編號103之胺基酸編號1至133及序列編號105之胺基酸編號1至133所示之與分泌訊號融合的h#32A1-L2-15及h#32A1-L2-16型輕鏈可變區的基因的DNA(Invitrogen)，依與實施例23同樣之方法，構築h#32A1-L2-15及h#32A1-L2-16型輕鏈表現載體。所得的表現載體各自命名為「pEF6KCL/h#32A1-L2-15」及「pEF6KCL/h#32A1-L2-16」。
c)大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體#32A1之人類化抗體之調製
c)-i)人類化抗體之生產
將1.2×109 個之對數增殖期之FreeStyle 293F細胞(Invitrogen)接種於新鮮1.2L之FreeStyle293表現培養基(Invitrogen)，於37℃、8% CO2 培養箱內以90rpm震盪培養1小時。將聚乙烯亞胺(Polyscience#24765)3.6mg溶解於Opti-Pro SFM培養基(Invitrogen)20mL，其次，將使用PureLink HiPure Plasmid套組(Invitrogen公司)調製的H鏈表現質體(0.4mg)及L鏈表現質體(0.8mg)懸浮於20mL之Opti-Pro SFM培養基。於聚乙烯亞胺/Opti-Pro SFM混合液20mL中，穩定加入表現質體/Opti-Pro SFM混合液20mL並攪拌，再放置5分鐘後加到FreeStyle 293F細胞中。37℃、8% CO2 培養箱中於90rpm下振盪培養7日所得的培養上清液以可抛棄式小盒(過濾器Disposable Capsule Filter)(Advantec ＃CCS-045-E1H)過濾。
經由組合pEF6KCL/h＃32A1-T5L 與 pEG2/h＃32A1-H5所取得的＃32A1之人類化抗體命名為「h＃32A1-H5/L5」、組合pEF6KCL/h＃32A1-T5L與pEG2/h＃32A1-H1-1所取得的＃32A1之人類化抗體命名為「h＃32A1-H1-1/L5」、組合pEF6KCL/h＃32A1-L2-15與pEG2/h＃32A1-H1-1所取得的＃32A1之人類化抗體命名為「h＃32A1-H1-1/L2-15」、組合pEF6KCL/h＃32A1-L2-16與pEG2/h＃32A1-H1-1而取得的＃32A1之人類化抗體命名為「h＃32A1-H1-1/L2-16」。
c)-ii)人類化抗體之純化
將上述c)-i)所獲得的培養上清液以rProtein A親和性層析(4-6℃下)與陶瓷羥基磷灰石(室溫下)之2階段工程純化。rProteinA親和性層析純化後與陶瓷羥基磷灰石純化後之緩衝液取代工程於室溫下實施。最初，將培養上清液1100-1200mL應用於以PBS平衡化的Mab SelectSuRe(GE Healthcare Bioscience公司製、HiTrap管柱：容積1mL×2連結)。培養液完全進入管柱後，以15-30mL之PBS洗淨管柱。其次，以2M精胺酸鹽酸鹽溶液(pH4.0)溶出，收集含抗體之部份。此部份以脫鹽管柱(GE Healthcare Bioscience公司製、HiTrap Desalting管柱：容積5mL×2連結)進行對5mM磷酸鈉/50mM MES/20mM NaCl/pH6.5之緩衝液取代。再將此取代的抗體溶液，應用於以5mM NaPi/50mM MES/20mM NaCl/pH6.5之緩衝液平衡化的陶瓷羥基磷灰石管柱(日本Bio-Rad、Bio-Scale CHT2-1 Hydroxyapatite Column：容積2mL)。實施經由氯化鈉的直線的濃度梯度溶出，收集含抗體之部份。此部份以脫鹽管柱(GE Healthcare Bioscience公司製、HiTrap Desalting管柱：容積5mLx2連結)進行向CBS(10mM檸檬酸緩衝液/140mM氯化鈉、pH6.0)之液取代。最後，於離心UF過濾器裝置(Centrifugal UF Filter Device)VIVASPIN20(分劃分子量30K，Sartorius公司，4℃下)濃縮，將IgG濃度調製為1.0mg/mL以上的純化作為樣品。各純化樣品之容量為h＃32A1-H1-1/L5：2.2mL，h＃32A1-H5/L5：1.8mL、h＃32A1-H1-1/L2-16：6.0mL、h＃32A1-H1-1/L2-15：2.2mL。
實施例29　大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體＃32A1之人類化抗體於小鼠破骨細胞形成試驗之生物活性評價
由實施例24及28所取得的人類化抗體之所示小鼠破骨細胞形成抑制效果，以部份改變實施例9記載之方法作評價。將以實施例8之方法調製的小鼠骨髓非附著細胞以含10% FBS與10ng/ml M-CSF(R＆D Systems公司製)的α-MEM培養基接種調製為5×105 細胞/ml而接種200μl於96孔盤之各孔，於CO2 培養箱中培養2日。除去96孔盤中之舊培養液，添加人類RANKL(RANKL，Peprotech公司製)以成為終濃度20ng/ml、M-CSF為10ng/ml的方式添加的含10% FBS的MEM-α培養基100μl。於此細胞培養液中，以實施例6調製的大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體(＃32A1抗體)及實施例24調製的6種類之人類化＃32A1抗體(h＃32A1-T1、h# 32A1-T2、h # 32A1-T3、h # 32A1-T4、h # 32A1-T5、h # 32A1-T6)成為3~100ng/ml之濃度的方式添加，再於CO2 培養箱中培養3日。培養終了後，形成的破骨細胞之酒石酸耐性酸性磷酸醇(TRAP)活性以下列操作測定。將96孔盤之各孔之培養液吸引除去，於各孔添加含有1% Triton X-100之50mM檸檬酸鈉緩衝液(pH6.1)50μl，以平盤振盪機振盪5分鐘可溶化細胞。於此等之各孔中添加50μl基質溶液(含有5mg/ml p-硝基苯基磷酸酯及0.46%酒石酸鈉之50mM檸檬酸鈉緩衝液(pH6.1))，於室溫培育10分鐘。培育後，於96孔盤之各孔中添加1N氫氧化鈉溶液50μl，而停止酵素反應。酵素反應停止後，測定各孔之405nm之吸光度，作為TRAP活性之指標。結果示於第44及45圖。又以與此試驗相同之方法，評價以實施例6調製的大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體(# 32A1抗體)、實施例19調製的# 32A1抗體之人類嵌合抗體、及實施例28調製的4種類之人類化# 32A1抗體(h # 32A1-H1-1/L5、h # 32A1-H5/L5、h # 32A1-H1-1/L2-16、h # 32A1-H1-1/L2-15)之生物活性，其結果示於第46及47圖。評價活性的10種類之人類化# 32A1抗體(h # 32A1-T1、h # 32A1-T2、h # 32A1-T3、h # 32A1-T4、h # 32A1-T5、h # 32A1-T6、h # 32A1-H1-1/L5、h # 32A1-H5/L5、h # 32A1-H1-1/L2-16、h # 32A1-H1-1/L2-15)的全部中，認為大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體(# 32A1抗體)、或# 32A1抗體有與人類嵌合抗體大略同等強的破骨細胞形成抑制活性。
實施例30 經由鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體# 32A1之人類化抗體添加對正常人類破骨前驅細胞之骨吸收活性之影響(使用膠原蛋白盤的評價)
將正常人類破骨前驅細胞(Normal Human Natural Osteoclast Precursor Cells，購自三光純藥，目錄編號2T-110)，於細胞依據所附之說明書以1×104 細胞/孔的方式接種96-孔OsteoLyse細胞培養盤(購自三光純藥，目錄編號PA-1500)。又培養基，使用添加胎牛血清(終濃度10%)、人類RANKL(終濃度63.8ng/ml)及人類M-CSF(終濃度33ng/ml)等的OPGM添加因子套組(購自三光純藥，目錄編號PT-9501)的破骨前驅細胞用基礎培養基(OPBM，購自三光純藥，目錄編號PT-8201)。於此培養上清液中，於終濃度4、20、100、500ng/ml的方式添加實施例6調製的大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體(# 32A1抗體)、實施例19調製的# 32A1抗體之人類嵌合抗體、及實施例24及28調製的10種類之人類化# 32A1抗體(h # 32A1-T1、h # 32A1-T2、h # 32A1-T3、h # 32A1-T4、h # 32A1-T5、h # 32A1-T6、h # 32A1-H1-1/L5、h # 32A1-H5/L5、h # 32A1-H1-1/L2-16、h # 32A1-H1-1/L2-15)，於CO2 培養箱中培養5日。採取10μl培養上清液，添加200μl附屬於OsteoLyse試驗套組之螢光團釋放劑，使用螢光盤讀數機(ARVO MX，PerkinElmer公司製)，以適合經由銪之螢光測定的時差式螢光測定(Time-resolved fluorecence fluorimeter)(激發：340nm、放射：615nm)，定量於培養上清液中放出的游離螢光膠原蛋 白片段量(第48及49圖)。此結果為，經由RANKL添加所增加的螢光膠原蛋白片段量，經由大鼠# 32A1抗體或人類嵌合抗體# 32A1抗體添加而濃度依存性被抑制。同樣地，即使經檢討的10種類全部人類化# 32A1抗體，被認為濃度依存性的抑制。由此等結果可知，人類破骨細胞之骨吸收活性經由與Siglec-15蛋白質專一性結合的人類化# 32A1抗體而被抑制。
實施例31 大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體# 32A1之人類化抗體使用卵巢摘出大鼠的生物學評價
經由實施例24及28所取得的人類化抗體所示之對於卵巢摘出大鼠中的骨密度減少的抑制效果，可以實施例15記載之方法評價。
實施例32 大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體# 32A1之人類化抗體之經由TNFα刺激的小鼠破骨細胞形成試驗之生物活性評價
經由實施例24及28所取得的人類化抗體所示之經由TNFα刺激的小鼠破骨細胞形成抑制效果可以實施例26記載之方法評價。
實施例33 使用示差掃描熱析法(DSC)之人類化抗體之熱安定性測定
於h # 32A1-H5/L5、h # 32A1-H1-1/L5、h # 32A1-H1-1/L2-15、h # 32A1-H1-1/L2-16，進行熱安定性之測定。將此等之樣品調製為0.5mg/mL之濃度(CBS溶液)，每400μL作為試料溶液使用於DSC測定。DSC測定條件如 以下設定。即，初期溫度為20℃，最終溫度為100℃，昇溫速度為60℃/1小時，過濾時間10秒。參照液使用CBS。作為DSC測定裝置，使用美國MicroCal公司製VP-Capillary DSC Platform。由試料溶液所獲得的掃描曲線減去基線(試料盒亦填充參照溶液所獲得的掃描曲線)來進行基線校正。第50圖為h # 32A1-H5/L5之溫譜圖，第51圖為h # 32A1-H1-1/L5之溫譜圖，第52圖為h # 32A1-H1-1/L2-15之溫譜圖，第53圖為h # 32A1-H1-1/L2-16之溫譜圖。各自的峰頂值作為Fab領域之熱變性中點Tm，h # 32A1-H5/L5之Tm值為81.2℃，h # 32A1-H1-1/L5之Tm值為84.1℃，h # 32A1-H1-1/L2-15之Tm值為80.0℃，h # 32A1-H1-1/L2-16(IgG2)之Tm值為77.9℃。
產業上之利用可能性
本發明之嵌合抗體或人類化抗Siglec-15抗體具有破骨細胞之分化或骨吸收活性之抑制能力，含該抗Siglec-15抗體的醫藥組成物可成為骨代謝異常疾病之治療或預防劑。
<110>　第一三共股份有限公司
<120>　抗Siglec-15抗體
<130>　DSPCT-FP1021
<150>　JP2009-94613
<151>　2009-04-09
<160>　106
<170>　PatentIn版本3.4
<210>　1
<211>　987
<212>　DNA
<213>　人類
<220>
<221>　CDS
<222>　(1)..(987)
<223>　發明者：Hiruma,Yoshiharu;Tsuda,Eisuke
<223>　發明者：Takizawa,Takeshi;Nakayama,Makiko
<400>　1
<210>　2
<211>　328
<212>　PRT
<213>　人類
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<212>　DNA
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<220>
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<222>　(1)..(1026)
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<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　可溶性小鼠Siglec-15 cDNA之PCR引子
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<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　可溶性小鼠Siglec-15 cDNA之PCR引子
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<212>　DNA
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<223>　可溶性小鼠Siglec-15 cDNA之定序引子
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<212>　DNA
<213>　人工序列
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<223>　可溶性小鼠Siglec-15 cDNA之定序引子
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<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　His-標示的小鼠Siglec-15 cDNA
<220>
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<220>
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<213>　人工序列
<220>
<223>　Fc-稠合的小鼠Siglec-15 cDNA
<220>
<221>　CDS
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<213>　人工序列
<220>
<223>　合成構築體
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<220>
<221>　CDR
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<221>　CDS
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<213>　人工序列
<220>
<223>　可溶性人類Siglec-15cDNA之PCR引子
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<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　可溶性人類Siglec-15cDNA之PCR引子
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<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　His-標示的人類Siglec-15 cDNA
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<221>　CDS
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<212>　PRT
<213>　人工序列
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<223>　合成構築體
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<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　Fc-稠合的人類Siglec-15 cDNA
<220>
<221>　CDS
<222>　(1)..(1518)
<400>　21
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<212>　PRT
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<220>
<223>　合成構築體
<400>　22
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<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　大鼠#32A1抗體之重鏈cDNA之PCR引子
<400>　23
<210>　24
<211>　35
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　鼠#32A1抗體之輕鏈cDNA之PCR引子
<400>　24
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<212>　DNA
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<220>
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<212>　DNA
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<220>
<223>　大鼠#32A1抗體之輕鏈cDNA之定序啟動子
<400>　26
<210>　27
<211>　501
<212>　DNA
<213>　大鼠
<220>
<221>　CDA
<222>　(1)..(501)
<220>
<221>　CDS
<222>　(1)..(501)
<400>　27
<210>　28
<211>　167
<212>　PRT
<213>　大鼠
<400>　28
<210>　29
<211>　417
<212>　DNA
<213>　大鼠
<220>
<221>　CDS
<222>　(1)..(417)
<400>　29
<210>　30
<211>　139
<212>　PRT
<213>　大鼠
<400>　30
<210>　31
<211>　28
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　引子EFF1
<400>　31
<210>　32
<211>　30
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　引子EFsmaR
<400>　32
<210>　33
<211>　1704
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　片段B
<400>　33
<210>　34
<211>　1120
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人類IgGl訊號+人類IgGl構築體
<400>　34
<210>　35
<211>　40
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　#32A1抗體重鏈可變區cDNA之PCR引子
<400>　35
<210>　36
<211>　39
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　#32A1抗體重鏈可變區cDNA之PCR引子
<400>　36
<210>　37
<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　#32A1抗體重鏈可變區cDNA之定序引子
<400>　37
<210>　38
<211>　42
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　#32A1抗體之輕鏈可變區cDNA之PCR引子
<400>　38
<210>　39
<211>　37
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　#32A1抗體之輕鏈可變區cDNA之PCR引子
<400>　39
<210>　40
<211>　1413
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　#32A1之嵌合體重鏈
<220>
<221>　CDS
<222>　(1)..(1413)
<400>　40
<210>　41
<211>　470
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成構築體
<400>　41
<210>　42
<211>　714
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　#32A1之嵌合體輕鏈
<220>
<221>　CDS
<222>　(1)..(714)
<400>　42
<210>　43
<211>　237
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成構築體
<400>　43
<210>　44
<211>　5
<212>　PRT
<213>　大鼠
<400>　44
<210>　45
<211>　19
<212>　PRT
<213>　大鼠
<400>　45
<210>　46
<211>　10
<212>　PRT
<213>　大鼠
<400>　46
<210>　47
<211>　15
<212>　PRT
<213>　大鼠
<400>　47
<210>　48
<211>　7
<212>　PRT
<213>　大鼠
<400>　48
<210>　49
<211>　9
<212>　PRT
<213>　大鼠
<400>　49
<210>　50
<211>　1410
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　h#32A1-T1H
<220>
<221>　CDS
<222>　(1)..(1410)
<400>　50
<210>　51
<211>　470
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成構築體
<400>　51
<210>　52
<211>　1410
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　h#32A1-T2H
<220>
<221>　CDS
<222>　(1)..(1410)
<400>　52
<210>　53
<211>　470
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成構築體
<400>　53
<210>　54
<211>　1410
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　h#32A1-T3H
<220>
<221>　CDS
<222>　(1)..(1410)
<400>　54
<210>　55
<211>　470
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成構築體
<400>　55
<210>　56
<211>　1410
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　h#32A1-T5H
<220>
<221>　CDS
<222>　(1)..(1410)
<400>　56
<210>　57
<211>　470
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成構築體
<400>　57
<210>　58
<211>　1410
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　h#32A1-T6H
<220>
<221>　CDS
<222>　(1)..(1410)
<400>　58
<210>　59
<211>　470
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成構築體
<400>　59
<210>　60
<211>　714
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　h#32A1-T1L
<220>
<221>　CDS
<222>　(1)..(714)
<400>　60
<210>　61
<211>　238
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成構築體
<400>　61
<210>　62
<211>　714
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　h#32A1-T2L
<220>
<221>　CDS
<222>　(1)..(714)
<400>　62
<210>　63
<211>　238
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成構築體
<400>　63
<210>　64
<211>　714
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　h#32A1-T3L
<220>
<221>　CDS
<222>　(1)..(714)
<400>　64
<210>　65
<211>　238
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成構築體
<400>　65
<210>　66
<211>　711
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　h#32A1-T4L
<220>
<221>　CDS
<222>　(1)..(711)
<400> 66
<210>　67
<211>　237
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成構築體
<400>　67
<210>　68
<211>　714
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　h#32A1-T5L
<220>
<221>　CDS
<222>　(1)..(714)
<400>　68
<210>　69
<211>　238
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成構築體
<400>　69
<210>　70
<211>　714
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　h#32A1-T6L
<220>
<221>　CDS
<222>　(1)..(714)
<400>　70
<210>　71
<211>　238
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成構築體
<400>　71
<210>　72
<211>　451
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　h#32A1-T7H
<400>　72
<210>　73
<211>　451
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　h#32A1-T8H
<400>　73
<210>　74
<211>　451
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　h#32A1-T9H
<400>　74
<210>　75
<211>　451
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　h#32A1-T10H
<400>　75
<210>　76
<211>　451
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　h#32A1-T11H
<400>　76
<210>　77
<211>　451
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　h#32A1-T12H
<400>　77
<210>　78
<211>　218
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　h#32A1-T7L
<400>　78
<210>　79
<211>　218
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　h#32A1-T8L
<400>　79
<210>　80
<211>　218
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　h#32A1-T9L
<400>　80
<210>　81
<211>　218
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　h#32A1-T10L
<400>　81
<210>　82
<211>　218
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　h#32A1-T11L
<400>　82
<210>　83
<211>　218
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　h#32A1-T12L
<400>　83
<210>　84
<211>　218
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　h#32A1-T13L
<400>　84
<210>　85
<211>　218
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　h#32A1-T14L
<400>　85
<210>　86
<211>　218
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　h#32A1-T15L
<400>　86
<210>　87
<211>　218
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　h#32A1-T16L
<400>　87
<210>　88
<211>　218
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　h#32A1-T17L
<400>　88
<210>　89
<211>　218
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　h#32A1-T18L
<400>　89
<210>　90
<211>　218
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　h#32A1-T19L
<400>　90
<210>　91
<211>　218
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　h#32A1-T20L
<400>　91
<210>　92
<211>　218
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　h#32A1-T21L
<400>　92
<210>　93
<211>　218
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　h#32A1-T22L
<400>　93
<210>　94
<211>　218
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　h#32A1-T23L
<400>　94
<210>　95
<211>　218
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　h#32A1-T24L
<400>　95
<210>　96
<211>　218
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　h#32A1-T25L
<400>　96
<210>　97
<211>　14
<212>　PRT
<213>　大鼠
<400>　97
<210>　98
<211>　1398
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　h#32A1-H1-1
<220>
<221>　CDS
<222>　(1)..(1398)
<400>　98
<210>　99
<211>　466
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成構築體
<400>　99
<210>　100
<211>　1398
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　h#32A1-H5
<220>
<221>　CDS
<222>　(1)..(1398)
<400>　100
<210>　101
<211>　466
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成構築體
<400>　101
<210>　102
<211>　714
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　h#32A1-L2-15
<220>
<221>　CDS
<222>　(1)..(714)
<400>　102
<210>　103
<211>　238
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成構築體
<400>　103
<210>　104
<211>　714
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　h#32A1-L2-16
<220>
<221>　CDS
<222>　(1)..(714)
<400>　104
<210>　105
<211>　238
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成構築體
<400>　105
<210>　106
<211>　1111
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　編碼人類IgG2重鏈訊號胜肽及構築體區域之核酸序列
<400>　106
第1圖為以HisTrap HP管柱層析與Resource Q管柱層析純化的小鼠Siglec-15-His之純度以SDS-聚丙烯醯胺電泳與銀染色評價的結果。
第2圖為以HisTrap HP管柱層析與Resource Q管柱層析純化的小鼠Siglec-15-His之舉動，使用SDS-聚丙烯醯胺電泳與抗V5-HRP抗體的西方墨漬法檢測的結果。
第3圖為以HiTrap蛋白質A管柱層析純化的小鼠Siglec-15-Fc之純度，以SDS-聚丙烯醯胺電泳與銀染色評價的結果。
第4圖為大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體對小鼠Siglec-15-Fc固相化盤之結合以ELISA法試驗的結果。符號(◆)表示＃1A1抗體、符號(■)表示＃3A1抗體、符號(▲)表示＃8A1抗體、符號(×)表示＃24A1抗體、符號(●)表示＃32A1抗體、符號(○)表示＃34A1抗體、符號(+)表示＃39A1抗體、符號(-)表示＃40A1抗體、符號(-)表示＃41B1抗體、符號(◇)表示＃61A1抗體、符號(□)表示對照組IgG。
第5圖為經由大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體(＃3A1、＃8A1或＃32A1)之添加，試驗對小鼠骨髓非附著細胞向破骨細胞分化(RANKL刺激)之影響的結果。又，圖中之大鼠對照組IgG係第5及6圖中共通的陰性對照組。
第6圖為經由大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體(＃34A1、＃39A1或＃40A1)之添加，試驗對小鼠骨髓非附著細胞向破骨細胞分化(RANKL刺激)之影響的結果。又，圖中之兔抗小鼠Siglec-15多株抗體No.3係第5及6圖中共通的陰性對照組。
第7圖為將以HisTrap HP管柱層析與Resource Q管柱層析純化的人類Siglec-15-His之純度以SDS-聚丙烯醯胺電泳與銀染色評價的結果。
第8圖為將蛋白質A管柱層析純化的人類Siglec-15-Fc之純度以SDS-聚丙烯醯胺電泳評價的結果。
第9圖為大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體對人類Siglec-15-Fc固相化盤的結合以ELISA法試驗的結果。符號(◆)表示# 1A1抗體、符號(■)表示# 3A1抗體、符號(▲)表示# 8A1抗體、符號(×)表示# 24A1抗體、符號(●)表示#32A1抗體、符號(￮)表示# 34A1抗體、符號(+)表示# 39A1抗體、符號(-)表示# 40A1抗體、符號(-)表示# 41B1抗體、符號(◇)表示# 61A1抗體、符號(□)表示對照組IgG。
第10圖為經由大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體之添加，以TRAP染色顯示由正常人類破骨前驅細胞之巨大破骨細胞形成之抑制的顯微鏡照片。
第11圖為經由大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體(# 32A1抗體)之添加，以TRAP染色顯示由正常人類破骨前驅細胞之巨大破骨細胞形成之抑制的顯微鏡照片。
第12圖為經由大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體(# 32A1抗體)之添加，顯示正常人類破骨細胞之骨吸收活性之抑制的圖(N=6)。
第13圖為顯示將大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體投與卵巢摘除大鼠4週之際，腰椎骨密度之增加作用(A)及尿中去氫吡啶啉排泄量之降低作用(B)的圖。
第14圖為大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體# 32A1結合人類Siglec-15之V-set功能域以競爭性ELISA顯示的圖。
第15圖為大鼠# 32A1抗體與其人類嵌合抗體相對於小鼠Siglec-15-Fc具有大略同等之親和性者經由競爭性ELISA 所示之圖。
第16圖為經由大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體(# 32A1抗體)及其嵌合抗體之添加，小鼠破骨細胞形成之抑制以TRAP酵素活性所示之圖(N=3)。
第17圖為經由大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體# 32A1之人類嵌合抗體之添加，自正常人類破骨前驅細胞之巨大破骨細胞形成之抑制以TRAP染色所示的顯微鏡照片。
第18圖為6種大鼠抗小鼠Siglec-15人類化抗體依存抗體之濃度而結合於小鼠Siglec-15蛋白質者，經由使用小鼠Siglec-15-Fc固相化盤的ELISA法所確認的圖。
第19圖為6種大鼠抗小鼠Siglec-15人類化抗體依存抗體之濃度而結合於人類Siglec-15蛋白質者，經由使用人類Siglec-15-Fc固相化盤的ELISA法所確認的圖。
第20圖為經由大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體(# 32A1抗體)及其嵌合抗體之添加，以TRAP染色顯示TNFα刺激下之小鼠巨大破骨細胞形成之抑制的顯微鏡照片。
第21圖為經由大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體(# 32A1抗體)及其嵌合抗體之添加，於TNFα刺激下，以TRAP酵素活性顯示小鼠破骨細胞形成之抑制的圖(N=3)。
第22圖為經由大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體(# 8A1及# 32A1抗體)之添加，以TRAP酵素活性顯示大鼠破骨細胞形成之抑制的圖(N=3)。
第23圖為顯示經選殖的大鼠# 32A1重鏈之核苷酸序列及胺基酸序列的圖。
第24圖為顯示經選殖的大鼠# 32A1輕鏈之核苷酸序列及胺基酸序列的圖。
第25圖為顯示# 32A1人類嵌合抗體重鏈之核苷酸序列及胺基酸序列的圖。
第26圖為顯示# 32A1人類嵌合抗體輕鏈之核苷酸序列及胺基酸序列的圖。
第27圖為顯示h # 32A1-T1H之核苷酸序列及胺基酸序列的圖。
第28圖為顯示h # 32A1-T2H之核苷酸序列及胺基酸序列的圖。
第29圖為顯示h # 32A1-T3H之核苷酸序列及胺基酸序列的圖。
第30圖為顯示h # 32A1-T5H之核苷酸序列及胺基酸序列的圖。
第31圖為顯示h # 32A1-T6H之核苷酸序列及胺基酸序列的圖。
第32圖為顯示h # 32A1-T1L之核苷酸序列及胺基酸序列的圖。
第33圖為顯示h # 32A1-T2L之核苷酸序列及胺基酸序列的圖。
第34圖為顯示h # 32A1-T3L之核苷酸序列及胺基酸序列的圖。
第35圖為顯示h # 32A1-T4L之核苷酸序列及胺基酸序列的圖。
第36圖為顯示h#32Al-T5L之核苷酸序列及胺基酸序列的圖。
第37圖為顯示h#32Al-T6L之核苷酸序列及胺基酸序列的圖。
第38圖為顯示h#32Al-T7H、h#32Al-T8H、及h#32Al-T9H之胺基酸序列的圖。
第39圖為顯示h#32Al-T10H、h#32Al-T11H、及h#32Al-T12H之胺基酸序列的圖。
第40圖為顯示h#32Al-T7L、h#32Al-T8L、h#32Al-T9L、h#32Al-T10L、及h#32Al-T11L之胺基酸序列的圖。
第41圖為顯示h#32Al-T12L、h#32Al-T13L、h#32Al-T14L、h#32Al-T15L、及h#32Al-T16L之胺基酸序列的圖。
第42圖為顯示h#32Al-T17L、h#32Al-T18L、h#32Al-T19L、h#32A1-T20L、及h#32Al-T21L之胺基酸序列的圖。
第43圖為顯示h#32Al-T22L、h#32Al-T23L、h#32Al-T24L、及h#32Al-T25L之胺基酸序列的圖。
第44圖為經由大鼠抗小鼠Siglec-15人類化抗體(h#32Al-T1、h#32Al-T2、h#32Al-T3)之添加，以TRAP酵素活性顯示小鼠破骨細胞形成之抑制的圖。又，圖中之大鼠#32Al抗體係於第44圖及第45圖為共通的陽性對照組。
第45圖為經由大鼠抗小鼠Siglec-15人類化抗體(h#32A1-T4、h # 32A1-T5、h # 32A1-T6)之添加，以TRAP酵素活性顯示小鼠破骨細胞形成之抑制的圖。
第46圖為經由大鼠抗小鼠Siglec-15人類化抗體(h # 32A1-H1-1/L5、h # 32A1-H5/L5)之添加，以TRAP酵素活性顯示小鼠破骨細胞形成之抑制的圖。又，圖中之大鼠# 32A1抗體及# 32A1人類嵌合抗體係第46圖及第47圖中共通的陽性對照組。
第47圖為顯示經由大鼠抗小鼠Siglec-15人類化抗體(h # 32A1-H1-1/L2-16、h # 32A1-H-1/L2-15)之添加，以TRAP酵素活性顯示小鼠破骨細胞形成之抑制的圖。
第48圖為顯示經由大鼠抗小鼠Siglec-15人類化抗體(h # 32A1-T1、h # 32A1-T2、h # 32A1-T3、h # 32A1-T4、h # 32A1-T5、h # 32A1-T6)之添加，正常人類破骨細胞之骨吸收活性之抑制的圖。又，圖中之大鼠# 32A1抗體及# 32A1人類嵌合抗體係第48圖及第49圖中共通的陽性對照組。
第49圖為顯示經由大鼠抗小鼠Siglec-15人類化抗體(h # 32A1-H1-1/L5、h # 32A1-H5/L5、h #32A1-H1-1/L2-16、h # 32A1-H1-1/L2-15)之添加之正常人類破骨細胞之骨吸收活性的抑制的圖。
第50圖為測定h # 32A1-H5/L5抗體之熱安定性的溫譜圖。
第51圖為測定h # 32A1-H1-1/L5抗體之熱安定性的溫譜圖。
第52圖為測定h # 32A1-H1-1/L2-15抗體之熱安定性的溫譜圖。
第53圖為測定h# 32A1-H1-1/L2-16抗體之熱安定性的溫譜圖。
第54圖為表示h# 32A1-H1-1之核苷酸序列及胺基酸序列的圖。
第55圖為表示h# 32A1-H5之核苷酸序列及胺基酸序列的圖。
第56圖為表示h# 32A1-L2-15之核苷酸序列及胺基酸序列的圖。
第57圖為表示h# 32A1-L2-16之核苷酸序列及胺基酸序列的圖。
[寄存編號]
FERM BP-10999
BCRC 960381

Claims (64)

  1. 一種抗體或該抗體之機能性片段，其結合序列編號2所示的胺基酸序列之第39至165號之胺基酸殘基而成的多胜肽，其重鏈序列含有具CDRH1、CDRH2、CDRH3的可變區，該CDRH1由序列編號44所示的胺基酸序列而成，該CDRH2由序列編號45或序列編號97所示任一者之胺基酸序列而成，該CDRH3由序列編號46所示的胺基酸序列而成；及輕鏈序列含有具CDRL1、CDRL2、CDRL3的可變區，該CDRL1由序列編號47所示的胺基酸序列而成，該CDRL2由序列編號48所示的胺基酸序列而成，該CDRL3由序列編號49所示的胺基酸序列而成，而抑制人類破骨細胞之形成及/或經由人類破骨細胞的骨吸收。
  2. 如申請專利範圍第1項之抗體或該抗體之機能性片段，其含有序列編號41所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基而成的重鏈可變區序列及序列編號43所示的胺基酸序列之第21至132號之胺基酸殘基而成的輕鏈可變區序列。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之抗體之機能性片段，其選自由Fab、F(ab’)2、Fab’及Fv組成之群。
  4. 如申請專利範圍第1或2項之抗體，其為scFv。
  5. 如申請專利範圍第1項之抗體或該抗體之機能性片段，其 為嵌合抗體。
  6. 如申請專利範圍第5項之抗體或該抗體之機能性片段，其係由序列編號41所示的胺基酸序列之第20至470號之胺基酸殘基而成的重鏈序列及序列編號43所示的胺基酸序列之第21至237號之胺基酸殘基而成的輕鏈序列所構成。
  7. 如申請專利範圍第1項之抗體或該抗體之機能性片段，其經人類化。
  8. 如申請專利範圍第6或7項之抗體，其中重鏈含人類免疫球蛋白G2重鏈之恆定區，輕鏈含人類免疫球蛋白κ輕鏈之恆定區。
  9. 一種抗體或該抗體之機能性片段，其為抑制人類破骨細胞之形成及/或經由人類破骨細胞的骨吸收的抗體或該抗體之機能性片段，其特徵為包含(a)選自以下之胺基酸序列組成之群的重鏈可變區：a1)由序列編號51所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列；a2)由序列編號53所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列；a3)由序列編號55所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列；a4)由序列編號57所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列；a5)由序列編號59所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列； a6)由序列編號99所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列；a7)由序列編號101所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列；a8)具有與選自a1)至a7)任一個胺基酸序列至少95%之相同性的胺基酸序列；a9)具有與選自a1)至a7)任一個胺基酸序列至少99%之相同性的胺基酸序列；a10)於選自a1)至a7)任一個胺基酸序列中1個胺基酸殘基經取代、刪除或添加的胺基酸序列；及(b)選自以下之胺基酸序列組成之群的輕鏈可變區：b1)由序列編號61所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列；b2)由序列編號63所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列；b3)序列編號65所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列；b4)序列編號67所示的胺基酸序列之第21至132號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列；b5)序列編號69所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列；b6)序列編號71所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列；b7)序列編號103所示的胺基酸序列之第21至133號之 胺基酸殘基而成的胺基酸序列；b8)序列編號105所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列；b9)具有與選自b1)至b8)任一個胺基酸序列至少95%之相同性的胺基酸序列；b10)具有與選自b1)至b8)任一個胺基酸序列至少99%之相同性的胺基酸序列；b11)於選自b1)至b8)任一個胺基酸序列中1個胺基酸殘基經取代、刪除或添加的胺基酸序列。
  10. 如申請專利範圍第9項之抗體或該抗體之機能性片段，其包含含有序列編號51所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的重鏈可變區的重鏈序列及含有序列編號61所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的輕鏈可變區的輕鏈序列。
  11. 如申請專利範圍第9項之抗體或該抗體之機能性片段，其包含含有序列編號53所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的重鏈可變區的重鏈序列及含有序列編號63所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的輕鏈可變區的輕鏈序列。
  12. 如申請專利範圍第9項之抗體或該抗體之機能性片段，其包含含有序列編號55所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的重鏈可變區的重 鏈序列及含有序列編號65所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的輕鏈可變區的輕鏈序列。
  13. 如申請專利範圍第9項之抗體或該抗體之機能性片段，其包含含有序列編號55所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的重鏈可變區的重鏈序列及含有序列編號67所示的胺基酸序列之第21至132號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的輕鏈可變區的輕鏈序列。
  14. 如申請專利範圍第9項之抗體或該抗體之機能性片段，其包含含有序列編號57所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的重鏈可變區的重鏈序列及含有序列編號69所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的輕鏈可變區的輕鏈序列。
  15. 如申請專利範圍第9項之抗體或該抗體之機能性片段，其包含含有序列編號59所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的重鏈可變區的重鏈序列及含有序列編號71所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的輕鏈可變區的輕鏈序列。
  16. 如申請專利範圍第9項之抗體或該抗體之機能性片段，其包含含有序列編號99所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的重鏈可變區的重 鏈序列及含有序列編號69所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的輕鏈可變區的輕鏈序列。
  17. 如申請專利範圍第9項之抗體或該抗體之機能性片段，其包含含有序列編號101所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的重鏈可變區的重鏈序列及含有序列編號69所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的輕鏈可變區的輕鏈序列。
  18. 如申請專利範圍第9項之抗體或該抗體之機能性片段，其包含含有序列編號99所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的重鏈可變區的重鏈序列及含有序列編號103所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的輕鏈可變區的輕鏈序列。
  19. 如申請專利範圍第9項之抗體或該抗體之機能性片段，其包含含有序列編號99所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的重鏈可變區的重鏈序列及含有序列編號105所示的胺基酸序列之第21至133號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列而成的輕鏈可變區的輕鏈序列。
  20. 如申請專利範圍第9項之抗體或該抗體之機能性片段，其包含序列編號51所示的胺基酸序列之第20至470號之胺基酸殘基而成的重鏈序列及序列編號61所示的胺基酸序 列之第21至238號之胺基酸殘基而成的輕鏈序列。
  21. 如申請專利範圍第9項之抗體或該抗體之機能性片段，其包含序列編號53所示的胺基酸序列之第20至470號之胺基酸殘基而成的重鏈序列及序列編號63所示的胺基酸序列之第21至238號之胺基酸殘基而成的輕鏈序列。
  22. 如申請專利範圍第9項之抗體或該抗體之機能性片段，其包含序列編號55所示的胺基酸序列之第20至470號之胺基酸殘基而成的重鏈序列及序列編號65所示的胺基酸序列之第21至238號之胺基酸殘基而成的輕鏈序列。
  23. 如申請專利範圍第9項之抗體或該抗體之機能性片段，其包含序列編號55之胺基酸序列所示的第20至470號之胺基酸殘基而成的重鏈序列及序列編號67所示的胺基酸序列之第21至237號之胺基酸殘基而成的輕鏈序列。
  24. 如申請專利範圍第9項之抗體或該抗體之機能性片段，其包含序列編號57所示的胺基酸序列之第20至470號之胺基酸殘基而成的重鏈序列及序列編號69所示的胺基酸序列之第21至238號之胺基酸殘基而成的輕鏈序列。
  25. 如申請專利範圍第9項之抗體或該抗體之機能性片段，其包含序列編號59所示的胺基酸序列之第20至470號之胺基酸殘基而成的重鏈序列及序列編號71所示的胺基酸序列之第21至238號之胺基酸殘基而成的輕鏈序列。
  26. 如申請專利範圍第9項之抗體或該抗體之機能性片段，其包含序列編號99所示的胺基酸序列之第20至466號之胺基酸殘基而成的重鏈序列及序列編號69所示的胺基酸序 列之第21至238號之胺基酸殘基而成的輕鏈序列。
  27. 如申請專利範圍第9項之抗體或該抗體之機能性片段，其包含序列編號101所示的胺基酸序列之第20至466號之胺基酸殘基而成的重鏈序列及序列編號69所示的胺基酸序列之第21至238號之胺基酸殘基而成的輕鏈序列。
  28. 如申請專利範圍第9項之抗體或該抗體之機能性片段，其包含序列編號99所示的胺基酸序列之第20至466號之胺基酸殘基而成的重鏈序列及序列編號103所示的胺基酸序列之第21至238號之胺基酸殘基而成的輕鏈序列。
  29. 如申請專利範圍第9項之抗體或該抗體之機能性片段，其包含序列編號99所示的胺基酸序列之第20至466號之胺基酸殘基而成的重鏈序列及序列編號105所示的胺基酸序列之第21至238號之胺基酸殘基而成的輕鏈序列。
  30. 一種醫藥組成物，其含有至少一種如申請範圍第1至29項中任一項之抗體或該抗體之機能性片段。
  31. 如申請專利範圍第30項之醫藥組成物，其為骨代謝異常之治療及/或預防劑。
  32. 一種骨代謝異常之治療及/或預防用醫藥組成物，其含有如申請專利範圍第1至29項中任一項之抗體或該抗體之機能性片段之至少任一者，而且，含有選自雙膦酸酯、活性型維生素D3 、抑鈣素及其衍生物、雌二醇等之荷爾蒙、SERMs(選擇性雌激素受體調節劑(selective estrogen receptor modulators))、依普黃酮、維生素K2 (四烯甲萘醌)、鈣製劑、PTH(副甲狀腺荷爾蒙)、非類固醇性抗炎 症劑、可溶性TNF受體、抗TNFα抗體或該抗體之機能性片段、抗PTHrP(與副甲狀腺相關之蛋白質(parathyroid hormone-related protein))抗體或該抗體之機能性片段、IL-1受體拮抗劑、抗IL-6受體抗體或該抗體之機能性片段、抗RANKL抗體或該抗體之機能性片段、及OCIF(破骨生成抑制因子)組成之群之至少任一者。
  33. 如申請專利範圍第31或32項之醫藥組成物，其中骨代謝異常係選自骨質疏鬆症、伴隨關節類風濕之骨破壞、癌性高鈣血症、多發性骨髓瘤或伴隨癌之骨轉移的骨破壞、巨細胞瘤、骨減少症、由於齒根膜炎之齒之喪失、人工關節周圍之骨融解、慢性骨髓炎中的骨破壞、骨貝西氏病、腎性骨營養不良、及骨形成不全症組成之群。
  34. 如申請專利範圍第33項之醫藥組成物，其中骨代謝異常為骨質疏鬆症、伴隨關節類風濕之骨破壞、或伴隨癌之骨轉移的骨破壞。
  35. 如申請專利範圍第34項之醫藥組成物，其中骨代謝異常為骨質疏鬆症。
  36. 如申請專利範圍第35項之醫藥組成物，其中骨質疏鬆症為停經後骨質疏鬆症、老人性骨質疏鬆症、由於使用類固醇或免疫抑制劑等之治療用藥劑之繼發性骨質疏鬆症、或伴隨關節類風濕之骨質疏鬆症。
  37. 一種多核苷酸，其編碼如申請專利範圍第2、6或9至29項中任一項之抗體。
  38. 如申請專利範圍第37項之多核苷酸，其含有序列編號40 所示的核苷酸序列之第58至420號之核苷酸而成的核苷酸序列及序列編號42所示的核苷酸序列之第61至396號之核苷酸而成的核苷酸序列。
  39. 如申請專利範圍第38項之多核苷酸，其含有序列編號40所示的核苷酸序列之第58至1410號之核苷酸而成的核苷酸序列及序列編號42所示的核苷酸序列之第61至711號之核苷酸而成的核苷酸序列。
  40. 如申請專利範圍第37項之多核苷酸，其包含(a)選自以下之核苷酸序列組成之群之多核苷酸：a1)序列編號50所示的核苷酸序列之第58至420號之核苷酸而成的核苷酸序列；a2)序列編號52所示的核苷酸序列之第58至420號之核苷酸而成的核苷酸序列；a3)序列編號54所示的核苷酸序列之第58至420號之核苷酸而成的核苷酸序列；a4)序列編號56所示的核苷酸序列之第58至420號之核苷酸而成的核苷酸序列；a5)序列編號58所示的核苷酸序列之第58至420號之核苷酸而成的核苷酸序列；a6)序列編號98所示的核苷酸序列之第58至420號之核苷酸而成的核苷酸序列；a7)序列編號100所示的核苷酸序列之第58至420號之核苷酸而成的核苷酸序列；a8)保有於嚴格條件下與選自a1)至a7)任一者之核苷酸 序列互補的核苷酸序列而成的多核苷酸雜交的多核苷酸的核苷酸序列；a9)於選自a1)至a7)任一者之核苷酸序列中1個核苷酸經取代、刪除或添加的核苷酸序列；及(b)選自以下之核苷酸序列組成之群的多核苷酸：b1)序列編號60所示的核苷酸序列之第61至399號之核苷酸而成的核苷酸序列；b2)序列編號62所示的核苷酸序列之第61至399號之核苷酸而成的核苷酸序列；b3)序列編號64所示的核苷酸序列之第61至399號之核苷酸而成的核苷酸序列；b4)序列編號66所示的核苷酸序列之第61至396號之核苷酸而成的核苷酸序列；b5)序列編號68所示的核苷酸序列之第61至399號之核苷酸而成的核苷酸序列；b6)序列編號70所示的核苷酸序列之第61至399號之核苷酸而成的核苷酸序列；b7)序列編號102所示的核苷酸序列之第61至399號之核苷酸而成的核苷酸序列；b8)序列編號104所示的核苷酸序列之第61至399號之核苷酸而成的核苷酸序列；b9)保有於嚴格條件下與選自b1)至b8)任一種核苷酸序列互補的核苷酸序列而成的多核苷酸雜交的多核苷酸的核苷酸序列； b10)於選自b1)至b8)任一個核苷酸序列上1個核苷酸經取代、刪除或添加的核苷酸序列。
  41. 如申請專利範圍第40項之多核苷酸，其包含序列編號50所示的核苷酸序列之第58至420號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸及序列編號60所示的核苷酸序列之第61至399號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸。
  42. 如申請專利範圍第40項之多核苷酸，其包含序列編號52所示的核苷酸序列之第58至420號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸及序列編號62所示的核苷酸序列之第61至399號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸。
  43. 如申請專利範圍第40項之多核苷酸，其包含序列編號54所示的核苷酸序列之第58至420號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸及序列編號64所示的核苷酸序列之第61至399號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸。
  44. 如申請專利範圍第40項之多核苷酸，其包含序列編號54所示的核苷酸序列之第58至420號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸及序列編號66所示的核苷酸序列之第61至396號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸。
  45. 如申請專利範圍第40項之多核苷酸，其包含序列編號56所示的核苷酸序列之第58至420號之核苷酸而成的核苷 酸序列而成的多核苷酸及序列編號68所示的核苷酸序列之第61至399號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸。
  46. 如申請專利範圍第40項之多核苷酸，其包含序列編號58所示的核苷酸序列之第58至420號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸及序列編號70所示的核苷酸序列之第61至399號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸。
  47. 如申請專利範圍第40項之多核苷酸，其包含序列編號98所示的核苷酸序列之第58至420號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸及序列編號68所示的核苷酸序列之第61至399號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸。
  48. 如申請專利範圍第40項之多核苷酸，其包含序列編號100所示的核苷酸序列之第58至420號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸及序列編號68所示的核苷酸序列之第61至399號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸。
  49. 如申請專利範圍第40項之多核苷酸，其包含序列編號98所示的核苷酸序列之第58至420號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸及序列編號102所示的核苷酸序列之第61至399號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸。
  50. 如申請專利範圍第40項之多核苷酸，其包含序列編號08 所示的核苷酸序列之第58至420號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸及序列編號104所示的核苷酸序列之第61至399號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸。
  51. 如申請專利範圍第40項之多核苷酸，其包含序列編號50所示的核苷酸序列之第58至1410號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸及序列編號60所示的核苷酸序列之第61至714號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸。
  52. 如申請專利範圍第40項之多核苷酸，其包含序列編號52所示的核苷酸序列之第58至1410號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸及序列編號62所示的核苷酸序列之第61至714號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸。
  53. 如申請專利範圍第40項之多核苷酸，其包含序列編號54所示的核苷酸序列之第58至1410號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸及序列編號64所示的核苷酸序列之第61至714號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸。
  54. 如申請專利範圍第40項之多核苷酸，其包含序列編號54所示的核苷酸序列之第58至1410號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸及序列編號66所示的核苷酸序列之第61至711號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸。
  55. 如申請專利範圍第40項之多核苷酸，其包含序列編號56所示的核苷酸序列之第58至1410號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸及序列編號68所示的核苷酸序列之第61至714號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸。
  56. 如申請專利範圍第40項之多核苷酸，其包含序列編號58所示的核苷酸序列之第58至1410號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸及序列編號70所示的核苷酸序列之第61至714號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸。
  57. 如申請專利範圍第40項之多核苷酸，其包含序列編號98所示的核苷酸序列之第58至1398號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸及序列編號68所示的核苷酸序列之第61至714號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸。
  58. 如申請專利範圍第40項之多核苷酸，其包含序列編號100所示的核苷酸序列之第58至1398號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸及序列編號68所示的核苷酸序列之第61至714號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸。
  59. 如申請專利範圍第40項之多核苷酸，其包含序列編號98所示的核苷酸序列之第58至1398號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸及序列編號102所示的核苷酸序列之第61至714號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核 苷酸。
  60. 如申請專利範圍第40項之多核苷酸，其包含序列編號98所示的核苷酸序列之第58至1398號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸及序列編號104所示的核苷酸序列之第61至714號之核苷酸而成的核苷酸序列而成的多核苷酸。
  61. 一種載體，其包含如申請專利範圍第37至60項中任一項之多核苷酸。
  62. 一種轉形宿主細胞，其包含如申請專利範圍第37至60項中任一項之多核苷酸。
  63. 一種轉形宿主細胞，其包含如申請專利範圍第61項之載體。
  64. 一種如申請專利範圍第2、6或9至29項中任一項之抗體之生產方法，其包含培養如申請專利範圍第62或63項之宿主細胞，由培養產物純化抗體的步驟。
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