ES2840923T3

ES2840923T3 - Anticuerpo anti-Siglec-15

Info

Publication number: ES2840923T3
Application number: ES10761710T
Authority: ES
Inventors: Yoshiharu Hiruma; Eisuke Tsuda; Maikiko Nakayama; Takeschi Takizawa
Original assignee: Daiichi Sankyo Co Ltd
Current assignee: Daiichi Sankyo Co Ltd
Priority date: 2009-04-09
Filing date: 2010-04-07
Publication date: 2021-07-07
Anticipated expiration: 2030-04-07
Also published as: IL213943A; MY152033A; EP2377932A1; RU2539790C2; JP6210966B2; BRPI1006134A2; CO6420359A2; IL252561B; MX343049B; MX2011007342A; US8575316B2; SG172419A1; CA2750836C; NZ605450A; CN106317224A; EP2377932A4; US9751944B2; AU2010235453B2; ZA201104545B; RU2014147188A

Abstract

Un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a un polipéptido que consiste en los restos de aminoácidos 39 a 165 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 2 e inhibe la formación de osteoclastos y/o la reabsorción ósea osteoclástica, en el que el anticuerpo comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 20 a 140 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 51 y una secuencia de cadena ligera que contiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 21 a 133 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 61; o (b) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 20 a 140 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 53 y una secuencia de cadena ligera que contiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 21 a 133 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 63; o (c) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 20 a 140 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 55 y una secuencia de cadena ligera que contiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 21 a 133 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 65; o (d) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 20 a 140 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 55 y una secuencia de cadena ligera que contiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 21 a 132 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 67; o (e) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 20 a 140 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 57 y una secuencia de cadena ligera que contiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 21 a 133 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 69; o (f) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 20 a 140 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 59 y una secuencia de cadena ligera que contiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 21 a 133 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 71; o (g) una secuencia de cadena pesada que comprende los restos de aminoácidos 20 a 470 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 51 y una secuencia de cadena ligera que comprende los restos de aminoácidos 21 a 238 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 61; o (h) una secuencia de cadena pesada que comprende los restos de aminoácidos 20 a 470 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 53 y una secuencia de cadena ligera que comprende los restos de aminoácidos 21 a 238 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 63; o (i) una secuencia de cadena pesada que comprende los restos de aminoácidos 20 a 470 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 55 y una secuencia de cadena ligera que comprende los restos de aminoácidos 21 a 238 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 65; o (j) una secuencia de cadena pesada que comprende los restos de aminoácidos 20 a 470 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 55 y una secuencia de cadena ligera que comprende los restos de aminoácidos 21 a 237 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 67; o (k) una secuencia de cadena pesada que comprende los restos de aminoácidos 20 a 470 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 57 y una secuencia de cadena ligera que comprende los restos de aminoácidos 21 a 238 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 69; o (l) una secuencia de cadena pesada que comprende los restos de aminoácidos 20 a 470 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 59 y una secuencia de cadena ligera que comprende los restos de aminoácidos 21 a 238 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 71; o (m) una secuencia de región variable de cadena pesada que comprende los restos de aminoácidos 20 a 140 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 41 y una secuencia de región variable de cadena ligera que comprende los restos de aminoácidos 21 a 132 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 43.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpo anti-Siglec-15

Campo técnico

La presente invención se refiere a una sustancia útil como agente terapéutico y/o preventivo para el metabolismo óseo anómalo y se refiere a una sustancia para su uso en el tratamiento y/o la prevención del metabolismo óseo anómalo.

Antecedentes de la técnica

Se sabe que el hueso es un órgano dinámico que se remodela continuamente mediante la formación y reabsorción repetidas para cambiar su propia morfología y mantener los niveles de calcio en sangre. El hueso sano mantiene un equilibrio entre la formación ósea por osteoblastos y la reabsorción ósea por osteoclastos, y la masa ósea se mantiene constante. Por el contrario, cuando se pierde el equilibrio entre la formación ósea y la reabsorción ósea, se produce metabolismo óseo anómalo tal como osteoporosis (documento WO 07/093042 y Endocrinological Review, (1992) 13, págs. 66-80).

Como factores que regulan el metabolismo óseo, se ha informado de muchas hormonas sistémicas y citocinas locales, y estos factores colaboran entre sí para formar y mantener el hueso (documento WO 07/093042 y Endocrinological Review, (1996) 17, págs. 308-332). Como cambio en el tejido óseo debido al envejecimiento, es ampliamente conocida la aparición de osteoporosis, pero el mecanismo de su aparición abarca diversos factores, tales como una disminución de la secreción de hormonas sexuales y una anomalía en los receptores de las hormonas; variación en la expresión de citocinas localmente en el hueso; expresión de genes envejecidos; e insuficiencia o disfunción de la diferenciación de osteoclastos u osteoblastos, y por tanto es difícil considerarlo como un simple fenómeno fisiológico relacionado con la edad. La osteoporosis primaria se divide en gran medida en osteoporosis posmenopáusica debida a una disminución de la secreción de estrógenos y osteoporosis senil debida al envejecimiento, pero el avance de la investigación básica sobre los mecanismos de regulación de la formación ósea y la reabsorción ósea es esencial para dilucidar el mecanismo de su aparición y desarrollar un agente terapéutico para ella.

Los osteoclastos son células multinucleadas procedentes de células madre hematopoyéticas y, al liberar iones cloruro e iones hidrógeno en una superficie ósea a la que se adhieren los osteoclastos, los osteoclastos acidifican un espacio entre la superficie ósea y los osteoclastos y también secretan catepsina K, que es una proteasa ácida o similar (American Journal of Physiology, (1991) 260, C1315-C1324). Esto provoca la degradación de fosfato de calcio, activación de proteasas ácidas y degradación de proteínas de la matriz ósea, lo que da lugar a reabsorción ósea.

Se ha descubierto que las células precursoras de osteoclastos se diferencian en osteoclastos mediante estimulación con RANKL (activador receptor del ligando NF-kB) expresado en la membrana celular de los osteoblastos/células estromales presentes en la superficie del hueso (Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America, (1998) 95, págs. 3597-3602 y Cell, (1998) 93, págs. 165-176). Se ha revelado que RANKL es una proteína de membrana producida por osteoblastos/células estromales, su expresión está regulada por un factor de reabsorción ósea, RANKL induce la diferenciación de células precursoras de osteoclastos en osteoclastos multinucleados maduros y similares (Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America, (1998) 95, págs. 3597 3602 y Journal of Bone and Mineral Research, (1998) 23, S222). Además, se ha descubierto que los ratones con genes inactivados que carecen de RANKL desarrollan una enfermedad similar a la osteopetrosis y, por lo tanto, se ha demostrado que RANKL es un factor inductor fisiológico de diferenciación de osteoclastos (Nature, (1999) 397, págs.

315-323).

Como preparaciones farmacéuticas para tratar enfermedades del metabolismo óseo o acortar la duración del tratamiento, se usan bisfosfonatos, vitamina D3 activa, calcitonina y derivados de la misma, hormonas tales como estradiol, MSRE (moduladores selectivos de los receptores de estrógenos), ipriflavona, vitamina K2 (menatetrenona), PTH, preparaciones de calcio y similares. Sin embargo, estos agentes medicinales no siempre son satisfactorios con respecto al resultado terapéutico y se ha exigido el desarrollo de un agente medicinal con un efecto terapéutico más potente.

Las membranas celulares de células inmunitarias están cubiertas con una densa capa de diversos glucanos, tales como glucanos sialilados, que son reconocidos por diversas proteínas de unión a glucano. Las lectinas de tipo inmunoglobulina que se unen al ácido siálico (denominadas en lo sucesivo "siglecs") son una familia de proteínas de membrana de tipo I que reconocen los glucanos sialilados y se unen a los mismos. Muchas siglecs se expresan en las membranas celulares de células inmunitarias y reconocen el ácido siálico presente de manera similar en las membranas celulares de células inmunitarias y regulan la interacción celular o la función celular y se considera que están implicadas en las respuestas inmunitarias (Nature Reviews Immunology, (2007) 7, págs. 255-266). Sin embargo, también hay muchas moléculas siglec cuyas funciones fisiológicas aún no se han dilucidado. Siglec-15 (lectina 15 de tipo inmunoglobulina de unión a ácido siálico) es una molécula que se ha informado recientemente que pertenece a las Siglecs (véase, por ejemplo, documento no de patente 10) y es idéntica a una molécula denominada CD33L3 (molécula de tipo c D333). Esta molécula está muy conservada evolutivamente desde peces hasta seres humanos y se ha descubierto que se expresa en gran medida en células dendríticas y/o macrófagos del bazo y de los ganglios linfáticos humanos. Además, como resultado de una prueba de unión con una sonda de ácido siálico, también se ha descubierto que Siglec-15 humana se une a Neu5Aca2-6GalNAc y que Siglec-15 de ratón se une además a Neu5Aca2-3Galp1-4Glc, y similares (véase, por ejemplo, Glycobiology, (2007) 17, págs. 838-846). Hasta hace poco, no se había revelado el papel fisiológico de Siglec-15, sin embargo, se ha informado de que la expresión de Siglec-15 aumenta con la diferenciación y maduración de los osteoclastos y la diferenciación de los osteoclastos se inhibe al disminuir la expresión de Siglec-15 por interferencia de ARN (véase, por ejemplo, documento WO 07/093042). Además, se ha revelado por primera vez el efecto de un anticuerpo anti-Siglec-15 sobre la diferenciación de osteoclastos en el documento Wo 09/48072 (publicado el 16 de abril de 2009), sin embargo, aún no se ha dilucidado una secuencia de anticuerpo que se pueda administrar a seres humanos.

Sumario de la invención

Problemas que la invención debe resolver

Un objeto de la invención es proporcionar un gen que se expresa específicamente en diversas formas de metabolismo óseo anómalo que se observan en la osteoporosis, la artritis reumatoide, la metástasis del cáncer en huesos o similares, una sustancia que inhibe la diferenciación y maduración de los osteoclastos y la actividad de los mismos y un agente terapéutico y/o preventivo del metabolismo óseo anómalo.

Medios para resolver los problemas

Los presentes inventores estudiaron para dilucidar el mecanismo de diferenciación, maduración y activación de osteoclastos para encontrar una sustancia que tenga un efecto terapéutico y/o preventivo sobre el metabolismo óseo anómalo. Como resultado, los presentes inventores descubrieron que la expresión del gen de Siglec-15 aumenta con la diferenciación y maduración de los osteoclastos y también descubrieron que la diferenciación de los osteoclastos es inhibida por un anticuerpo que se une específicamente a Siglec-15. Además, los presentes inventores humanizaron un anticuerpo obtenido de rata anti-Siglec-15 de ratón y completaron de este modo la invención. Es decir, la invención incluye las siguientes invenciones.

(1) Un anticuerpo, o un fragmento funcional del mismo, que se une a un polipéptido que consiste en los restos de aminoácidos 39 a 165 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 2 e inhibe la formación de osteoclastos y/o la reabsorción ósea osteoclástica, en el que el anticuerpo comprende

(a) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 20 a 140 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 51 y una secuencia de cadena ligera que contiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 21 a 133 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ iD NO: 61; o

(b) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 20 a 140 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 53 y una secuencia de cadena ligera que contiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 21 a 133 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ iD NO: 63; o

(c) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 20 a 140 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 55 y una secuencia de cadena ligera que contiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 21 a 133 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ iD NO: 65; o

(d) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 20 a 140 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 55 y una secuencia de cadena ligera que contiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 21 a 132 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ iD NO: 67; o

(e) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 20 a 140 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 57 y una secuencia de cadena ligera que contiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 21 a 133 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 69; o

(f) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 20 a 140 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 59 y una secuencia de cadena ligera que contiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 21 a 133 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ iD NO: 71; o

(g) una secuencia de cadena pesada que comprende los restos de aminoácidos 20 a 470 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 51 y una secuencia de cadena ligera que comprende los restos de aminoácidos 21 a 238 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 61; o

(h) una secuencia de cadena pesada que comprende los restos de aminoácidos 20 a 470 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 53 y una secuencia de cadena ligera que comprende los restos de aminoácidos 21 a 238 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 63; o

(i) una secuencia de cadena pesada que comprende los restos de aminoácidos 20 a 470 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 55 y una secuencia de cadena ligera que comprende los restos de aminoácidos 21 a 238 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 65; o

(j) una secuencia de cadena pesada que comprende los restos de aminoácidos 20 a 470 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 55 y una secuencia de cadena ligera que comprende los restos de aminoácidos 21 a 237 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 67; o

(k) una secuencia de cadena pesada que comprende los restos de aminoácidos 20 a 470 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 57 y una secuencia de cadena ligera que comprende los restos de aminoácidos 21 a 238 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 69; o

(l) una secuencia de cadena pesada que comprende los restos de aminoácidos 20 a 470 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 59 y una secuencia de cadena ligera que comprende los restos de aminoácidos 21 a 238 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 71; o

(m) una secuencia de región variable de cadena pesada que comprende los restos de aminoácidos 20 a 140 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 41 y una secuencia de región variable de cadena ligera que comprende los restos de aminoácidos 21 a 132 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 43.

(2) Un fragmento de unión a antígeno del anticuerpo según (1) que se selecciona del grupo que consiste en Fab, F(ab')2, Fab' y Fv.

(3) El anticuerpo según (1) o (2), caracterizado por ser un scFv.

(4) El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, según una cualquiera de (1) a (3), caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo quimérico.

(5) El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, según (4), caracterizado por comprender una secuencia de cadena pesada que comprende los restos de aminoácidos 20 a 470 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 41 y una secuencia de cadena ligera que comprende los restos de aminoácidos 21 a 237 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 43.

(6) El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, según uno cualquiera de (1) a (3), caracterizado porque el anticuerpo está humanizado y en el que la cadena pesada tiene una región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina G2 humana y la cadena ligera tiene una región constante de una cadena ligera de inmunoglobulina k humana.

(7) Una composición farmacéutica, caracterizada por comprender al menos uno de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los anticuerpos según (1) a (6).

(8) Un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, según uno cualquiera de (1) a (6) para su uso en un procedimiento de tratamiento y/o prevención del metabolismo óseo anómalo, en el que el metabolismo óseo anómalo se selecciona del grupo que consiste en osteoporosis, destrucción ósea que acompaña a la artritis reumatoide, destrucción ósea que acompaña a la metástasis del cáncer al hueso, preferentemente osteoporosis, más preferentemente osteoporosis posmenopáusica, osteoporosis senil, osteoporosis secundaria debida al uso de un agente terapéutico, tal como un esteroide o un inmunosupresor, u osteoporosis que acompaña a la artritis reumatoide.

(9) Un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, según uno cualquiera de (1) a (6) para su uso en un procedimiento de tratamiento y/o prevención del metabolismo óseo anómalo, caracterizado por administrar simultánea o sucesivamente al menos uno del anticuerpo o fragmentos de unión al antígeno del anticuerpo y al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en bisfosfonatos, vitamina D3 activa, calcitonina y derivados de la misma, hormonas tales como estradiol, MSRE (moduladores selectivos de los receptores de estrógenos), ipriflavona, vitamina K2 (menatetrenona), preparaciones de calcio, PTH (hormona paratiroidea), agentes antiinflamatorios no esteroideos, receptores de TNF solubles, anticuerpos anti-TNF-a o fragmentos de unión a antígeno de los anticuerpos, anticuerpos anti-PTHrP (proteína relacionada con la hormona paratiroidea) o fragmentos de unión a antígeno de los anticuerpos, antagonistas del receptor de IL-1, anticuerpos anti-receptor de IL-6 o fragmentos de unión a antígeno de los anticuerpos, anticuerpos anti-RANKL o fragmentos funcionales de los anticuerpos y FIOC (factor inhibidor de la osteoclastogénesis, en el que el metabolismo óseo anómalo se selecciona del grupo que consiste en osteoporosis, destrucción ósea que acompaña a la artritis reumatoide y destrucción ósea que acompaña a la metástasis del cáncer al hueso, preferentemente osteoporosis, más preferentemente osteoporosis posmenopáusica, osteoporosis senil, osteoporosis secundaria debida al uso de un agente terapéutico, tal como un esteroide o un inmunosupresor, u osteoporosis que acompaña a la artritis reumatoide.

(10) Un polinucleótido que codifica el anticuerpo según uno cualquiera de (1) a (5).

(11) El polinucleótido según (10), caracterizado por contener una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 420 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 40 y una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 396 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 42.

(12) El polinucleótido según (11), caracterizado por contener una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 1410 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 40 y una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 711 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 42.

(13) El polinucleótido según (10), caracterizado por contener:

(a) un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las siguientes secuencias de nucleótidos:

a1) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 420 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 50;

a2) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 420 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 52;

a3) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 420 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 54;

a4) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 420 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 56;

a5) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 420 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 58;

a6) una secuencia de nucleótidos de un polinucleótido que se hibrida con un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos complementaria de una cualquiera de las secuencias de nucleótidos seleccionadas de a1) a a5) en condiciones rigurosas; y

a7) una secuencia de nucleótidos que incluye una sustitución, supresión o adición de uno a varios nucleótidos en una cualquiera de las secuencias de nucleótidos seleccionadas de a1) a a5); y

(b) un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las siguientes secuencias de nucleótidos:

b1) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 399 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 60;

b2) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 399 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 62;

b3) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 399 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 64;

b4) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 396 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 66;

b5) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 399 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 68;

b6) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 399 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 70;

b7) una secuencia de nucleótidos de un polinucleótido que se hibrida con un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos complementaria de una cualquiera de las secuencias de nucleótidos seleccionadas de b1) a b6) en condiciones rigurosas; y

b8) una secuencia de nucleótidos que incluye una sustitución, supresión o adición de uno a varios nucleótidos en una cualquiera de las secuencias de nucleótidos seleccionadas de b1) a b6).

(14) El polinucleótido según (13), caracterizado por contener:

(a) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 420 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 50 y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 399 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID No : 60; o

(b) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 420 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 52 y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 399 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID No : 62; o

(c) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 420 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 54 y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 399 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID No : 64; o

(d) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 420 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 54 y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 396 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID No : 66; o

(e) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 420 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 56 y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 399 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID No : 68; o

(f) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 420 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 58 y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 399 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 70; o

(g) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 1410 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 50 y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 714 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 60; o

(h) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 1410 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 52 y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 714 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID No : 62; o

(i) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 1410 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 54 y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 714 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID No : 64; o

(j) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 1410 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 54 y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 711 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID No : 66; o

(k) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 1410 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 56 y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 714 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID No : 68; o

(l) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 1410 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 58 y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 714 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID No : 70.

(15) Un vector, que comprende uno cualquiera de los polinucleótidos según (10) a (14).

(16) Una célula huésped transformada, que comprende uno cualquiera de los polinucleótidos según (10) a (14) o el vector según (18).

(17) Un procedimiento para producir el anticuerpo según una cualquiera de (1) a (5), que comprende cultivar la célula huésped según (16) y purificar un anticuerpo del producto de cultivo resultante.

Ventaja de la invención

Según la invención, se puede obtener un agente terapéutico y/o preventivo para el metabolismo óseo anómalo cuyo mecanismo de acción es inhibir la diferenciación y maduración de los osteoclastos y la actividad de reabsorción ósea de los mismos.

Breve descripción de los dibujos

[Fig. 1] La fig. 1 muestra los resultados de la evaluación de la pureza de Siglec-15-His de ratón purificada por cromatografía en columna HisTrap HP y cromatografía en columna Resource Q mediante electroforesis de poliacrilamida-SDS y tinción con plata.

[Fig. 2] La fig. 2 muestra los resultados de la detección de las características de Siglec-15-His de ratón purificada por cromatografía en columna HisTrap HP y cromatografía en columna Resource Q mediante electroforesis de poliacrilamida-SDS y transferencia de Western usando un anticuerpo anti-V5-HRP.

[Fig. 3] La fig. 3 muestra los resultados de la evaluación de la pureza de Siglec-15-Fc de ratón purificada por cromatografía en columna de Proteína A HiTrap mediante electroforesis de poliacrilamida-SDS y tinción con plata.

[Fig. 4] La fig. 4 muestra los resultados de la prueba de la unión de un anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón a una placa que tiene Siglec-15-Fc de ratón inmovilizada sobre ella mediante un procedimiento de ELISA. El símbolo (♦) indica el anticuerpo #1A1, El símbolo (■) indica el anticuerpo #3A1, El símbolo (A ) indica el anticuerpo #8A1, el símbolo (*) indica el anticuerpo #24A1, el símbolo (•) indica el anticuerpo #32A1, el símbolo (O) indica el anticuerpo #34A1, el símbolo (+) indica el anticuerpo #39A1, el símbolo (-) indica el anticuerpo #40A1, el símbolo (__) indica el anticuerpo #41B1, el símbolo (0) indica el anticuerpo #61A1, y el símbolo (□) indica IgG de control.

[Fig. 5] La fig. 5 muestra los resultados de la prueba del efecto de la adición de un anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón (#3A1, #8A1 o #32A1) sobre la diferenciación de osteoclastos (estimulación con RANKL) de células no adherentes de la médula ósea de ratón. En relación con esto, la IgG de control de rata en el dibujo es un control negativo común a las figs. 5 y 6.

[Fig. 6] La fig. 6 muestra los resultados de la prueba del efecto de la adición de un anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón (#34A1, #39A1 o #40A1) sobre la diferenciación de osteoclastos (estimulación con RANKL) de células no adherentes de la médula ósea de ratón. En relación con esto, el anticuerpo policlonal n.° 3 de conejo anti-Siglec-15 de ratón en el dibujo es un control positivo común a las figs. 5 y 6.

[Fig. 7] La fig. 7 muestra los resultados de la evaluación de la pureza de Siglec-15-His humana purificada por cromatografía en columna HisTrap HP y cromatografía en columna Resource Q mediante electroforesis de poliacrilamida-SDS y tinción con plata.

[Fig. 8] La fig. 8 muestra los resultados de la evaluación de la pureza de Siglec-15-Fc humana purificada por cromatografía en columna de proteína A mediante electroforesis de poliacrilamida-SDS.

[Fig. 9] La fig. 9 muestra los resultados de la prueba de la unión de un anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón a una placa que tiene Siglec-15-Fc humana inmovilizada sobre ella mediante un procedimiento de ELISA. El símbolo (♦) indica el anticuerpo #1A1, El símbolo (■) indica el anticuerpo #3A1, el símbolo (▲) indica el anticuerpo #8A1, el símbolo (*) indica el anticuerpo #24A1, el símbolo (•) indica el anticuerpo #32A1, el símbolo (O) indica el anticuerpo #34A1, el símbolo (+) indica el anticuerpo #39A1, el símbolo (-) indica el anticuerpo #40A1, el símbolo (__) indica el anticuerpo #41B1, el símbolo (0) indica el anticuerpo #61A1, y el símbolo (□) indica IgG de control.

[Fig. 10] La fig. 10 muestra microfotografías que representan, por tinción de TRAP, la inhibición de la formación de osteoclastos gigantes a partir de células precursoras de osteoclastos humanos normales mediante la adición de un anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón.

[Fig. 11] La fig. 11 muestra microfotografías que representan, por tinción de TRAP, la inhibición de la formación de osteoclastos gigantes a partir de células precursoras de osteoclastos humanos normales mediante la adición de un anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón (anticuerpo #32A1).

[Fig. 12] La fig. 12 es un gráfico que muestra la inhibición de la actividad de reabsorción ósea de los osteoclastos humanos normales mediante la adición de un anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón (anticuerpo #32A1) (N = 6).

[Fig. 13] La fig. 13A es un gráfico que muestra el efecto del aumento de la densidad mineral ósea de la columna lumbar cuando se administró un anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón a ratas ovariectomizadas durante 4 semanas; y la fig. 13B es un gráfico que muestra el efecto de disminuir la eliminación urinaria de desoxipiridinolina cuando se administró un anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón a ratas ovariectomizadas durante 4 semanas.

[Fig. 14] La fig. 14 es un gráfico que muestra que un anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón #32A1 se une al dominio del conjunto V de Siglec-15 humana mediante ELISA competitivo.

[Fig. 15] La fig. 15 es un gráfico que muestra que un anticuerpo de rata n° 32A1 y un anticuerpo quimérico humano del mismo tienen sustancialmente la misma afinidad por Siglec-15-Fc de ratón mediante ELISA competitivo. [Fig. 16] La fig. 16 muestra gráficos que representan, por la actividad enzimática de TRAP, la inhibición de la formación de osteoclastos de ratón mediante la adición de un anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón (anticuerpo #32A1) y un anticuerpo quimérico del mismo (N = 3).

[Fig. 17] La fig. 17 muestra microfotografías que representan, por tinción de TRAP, la inhibición de la formación de osteoclastos gigantes a partir de células precursoras de osteoclastos humanos normales mediante la adición de un anticuerpo quimérico humano de un anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón #32A1.

[Fig. 18] La fig. 18 es una vista en la que se confirmó que 6 tipos de anticuerpos humanizados de rata anti-Siglec-15 de ratón se unen a la proteína Siglec-15 de ratón de una manera dependiente de la concentración de anticuerpos mediante un procedimiento ELISA utilizando una placa que tiene Siglec-15-Fc de ratón inmovilizada sobre la misma.

[Fig. 19] La fig. 19 es una vista en la que se confirmó que 6 tipos de anticuerpos humanizados de rata anti-Siglec-15 de ratón se unen a la proteína Siglec-15 humana de una manera dependiente de la concentración de anticuerpos mediante un procedimiento ELISA utilizando una placa que tiene Siglec-15-Fc humana inmovilizada sobre la misma.

[Fig. 20] La fig. 20 muestra microfotografías que representan, por tinción de TRAP, la inhibición de la formación de osteoclastos gigantes de ratón con estimulación con TNFa mediante la adición de un anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón (anticuerpo #32A1) o un anticuerpo quimérico del mismo.

[Fig. 21] La fig. 21 muestra gráficos que representan, por la actividad enzimática de TRAP, la inhibición de la formación de osteoclastos de ratón con estimulación con TNFa mediante la adición de un anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón (anticuerpo #32A1) o un anticuerpo quimérico del mismo (N = 3).

[Fig. 22] La fig. 22 muestra gráficos que representan, por la actividad enzimática de TRAP, la inhibición de la formación de osteoclastos de rata mediante la adición de un anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón (anticuerpo #8A1 o #32A1) (N = 3).

[Fig. 23] La fig. 23 muestra una secuencia de nucleótidos clonada de una cadena pesada de #32A1 de rata y una secuencia de aminoácidos de la misma.

[Fig. 24] La fig. 24 muestra una secuencia de nucleótidos clonada de una cadena ligera de #32A1 de rata y una secuencia de aminoácidos de la misma.

[Fig. 25] La fig. 25 muestra una secuencia de nucleótidos de una cadena pesada de anticuerpo quimérico humano #32A1 y una secuencia de aminoácidos de la misma.

[Fig. 26] La fig. 26 muestra una secuencia de nucleótidos de una cadena ligera de anticuerpo quimérico humano #32A1 y una secuencia de aminoácidos de la misma.

[Fig. 27] La fig. 27 muestra una secuencia de nucleótidos de h#32A1-T1H y una secuencia de aminoácidos de la misma.

[Fig. 28] La fig. 28 muestra una secuencia de nucleótidos de h#32A1-T2H y una secuencia de aminoácidos de la misma.

[Fig. 29] La fig. 29 muestra una secuencia de nucleótidos de h#32A1-T3H y una secuencia de aminoácidos de la misma.

[Fig. 30] La fig. 30 muestra una secuencia de nucleótidos de h#32A1-T5H y una secuencia de aminoácidos de la misma.

[Fig. 31] La fig. 31 muestra una secuencia de nucleótidos de h#32A1-T6H y una secuencia de aminoácidos de la misma.

[Fig. 32] La fig. 32 muestra una secuencia de nucleótidos de h#32A1-T1L y una secuencia de aminoácidos de la misma.

[Fig. 33] La fig. 33 muestra una secuencia de nucleótidos de h#32A1-T2L y una secuencia de aminoácidos de la misma.

[Fig. 34] La fig. 34 muestra una secuencia de nucleótidos de h#32A1-T3L y una secuencia de aminoácidos de la misma.

[Fig. 35] La fig. 35 muestra una secuencia de nucleótidos de h#32A1-T4L y una secuencia de aminoácidos de la misma.

[Fig. 36] La fig. 36 muestra una secuencia de nucleótidos de h#32A1-T5L y una secuencia de aminoácidos de la misma.

[Fig. 37] La fig. 37 muestra una secuencia de nucleótidos de h#32A1-T6L y una secuencia de aminoácidos de la misma.

[Fig. 38] La fig. 38 muestra secuencias de aminoácidos de h#32A1-T7H, h#32A1-T8H y h#32A1-T9H.

[Fig. 39] La fig. 39 muestra secuencias de aminoácidos de h#32A1-T10H, h#32A1-T11H y h#32A1-T12H.

[Fig. 40] La fig. 40 muestra secuencias de aminoácidos de h#32A1-T7L, h#32A1-T8L, h#32A1-T9L, h#32A1-T10L y h#32A1-T11L.

[Fig. 41] La fig. 41 muestra secuencias de aminoácidos de h#32A1-T12L, h#32A1-T13L, h#32A1-T14L, h#32A1-T15Ly h#32A1-T16L.

[Fig. 42] La fig. 42 muestra secuencias de aminoácidos de h#32A1-T17L, h#32A1-T18L, h#32A1-T19L, h#32A1-T20Ly h#32A1-T21L.

[Fig. 43] La fig. 43 muestra secuencias de aminoácidos de h#32A1-T22L, h#32A1-T23L, h#32A1-T24L y h#32A1-T25L.

[Fig. 44] La fig. 44 muestra gráficos que representan, por la actividad enzimática de TRAP, la inhibición de la formación de osteoclastos de ratón mediante la adición de un anticuerpo de rata humanizado anti-Siglec-15 de ratón (h#32A1-T1, h#32A1-T2 o h#32A1-T3). En relación con esto, el anticuerpo #32A1 de rata en el dibujo es un control positivo común a las figs. 44 y 45.

[Fig. 45] La fig. 45 muestra gráficos que representan, por la actividad enzimática de TRAP, la inhibición de la formación de osteoclastos de ratón mediante la adición de un anticuerpo de rata humanizado anti-Siglec-15 de ratón (h#32A1-T4, h#32A1-T5 o h#32A1-T6).

[Fig. 46] La fig. 46 muestra gráficos que representan, por la actividad enzimática de TRAP, la inhibición de la formación de osteoclastos de ratón mediante la adición de un anticuerpo de rata humanizado anti-Siglec-15 de ratón (h#32A1-H1-1/L5 o h#32A1-H5/L5). En relación con esto, el anticuerpo #32A1 de rata y el anticuerpo quimérico humano #32A1 del dibujo son controles positivos comunes a las figs. 46 y 47.

[Fig. 47] La fig. 47 muestra gráficos que representan, por la actividad enzimática de TRAP, la inhibición de la formación de osteoclastos de ratón mediante la adición de un anticuerpo de rata humanizado anti-Siglec-15 de ratón (h#32A1-H1-1/L2-16 o h#32A1-H-1/L2-15).

[Fig. 48] La fig. 48 muestra gráficos que representan la inhibición de la actividad de reabsorción ósea de osteoclastos humanos normales mediante la adición de un anticuerpo de rata humanizado anti-Siglec-15 de ratón (h#32A1-T1, h#32A1-T2, h#32A1-T3, h#32A1-T4, h#32A1-T5 o h#32A1-T6). En relación con esto, el anticuerpo #32A1 de rata y el anticuerpo quimérico humano #32A1 del dibujo son controles positivos comunes a las figs. 48 y 49.

[Fig. 49] La fig. 49 muestra gráficos que representan la inhibición de la actividad de reabsorción ósea de osteoclastos humanos normales mediante la adición de un anticuerpo de rata humanizado anti-Siglec-15 de ratón (h#32A1-H1-1/L5, h#32A1-H5/L5, h#32A1-H1-1/L2-16 o h#32A1-H1-1/L2-15).

[Fig. 50] La fig. 50 es un termograma obtenido para determinar la estabilidad térmica del anticuerpo h#32A1-H5/L5.

[Fig. 51] La fig. 51 es un termograma obtenido para determinar la estabilidad térmica del anticuerpo h#32A1-H1-1/L5.

[Fig. 52] La fig. 52 es un termograma obtenido para determinar la estabilidad térmica del anticuerpo h#32A1-H1-1/L2-15.

[Fig. 53] La fig. 53 es un termograma obtenido para determinar la estabilidad térmica del anticuerpo h#32A1-H1-1/L2-16.

[Fig. 54] La fig. 54 muestra una secuencia de nucleótidos de h#32A1-H1-1 y la secuencia de aminoácidos de la misma.

[Fig. 55] La fig. 55 muestra una secuencia de nucleótidos de h#32A1-H5 y la secuencia de aminoácidos de la misma.

[Fig. 56] La fig. 56 muestra una secuencia de nucleótidos de h#32A1-L2-15 y la secuencia de aminoácidos de la misma.

[Fig. 57] La fig. 57 muestra una secuencia de nucleótidos de h#32A1-L2-16 y la secuencia de aminoácidos de la misma.

Modo para llevar a cabo la invención

El término "gen" como se usa en el presente documento incluye no solamente ADN, sino también ARNm, ADNc y ARNc.

El término "polinucleótido" como se usa en el presente documento se usa con el mismo significado que un "ácido nucleico" y también incluye ADN, ARN, sondas, oligonucleótidos y cebadores.

Los términos "polipéptido" y "proteína" como se usan en el presente documento se usan sin distinción.

La expresión "fracción de ARN" como se usa en el presente documento se refiere a una fracción que contiene ARN.

El término "célula", como se usa en el presente documento, también incluye células en un individuo animal y células cultivadas.

El término "Siglec-15" como se usa en el presente documento se usa con el mismo significado que "proteína Siglec-15".

La expresión "formación de osteoclastos" como se usa en el presente documento se usa con el mismo significado que "diferenciación de osteoclastos" o "maduración de osteoclastos".

La expresión "fragmento funcional de un anticuerpo" como se usa en el presente documento se refiere a un fragmento parcial de un anticuerpo que tiene una actividad de unión a antígeno e incluye Fab, F(ab')2, Fv, scFv, diacuerpos, anticuerpos lineales, anticuerpos poliespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos y similares. La expresión también abarca Fab', que es un fragmento monovalente en una región variable de un anticuerpo obtenido tratando F(ab')2 en condiciones reductoras. Sin embargo, la expresión no se limita a estas moléculas siempre que el fragmento tenga una afinidad de unión por un antígeno. Además, estos fragmentos funcionales incluyen no solo un fragmento obtenido al tratar una molécula de longitud completa de una proteína de anticuerpo con una enzima adecuada, sino también una proteína producida en una célula huésped adecuada utilizando un gen de anticuerpo modificado genéticamente.

El término "epítopo" como se usa en el presente documento se refiere a un péptido parcial o una estructura terciaria parcial de Siglec-15 al que se une un anticuerpo anti-Siglec-15 específico. El epítopo mencionado anteriormente que es un péptido parcial de Siglec-15 puede determinarse mediante un procedimiento bien conocido por los expertos en la materia, tal como un inmunoensayo. Sin embargo, se puede emplear el siguiente procedimiento, por ejemplo. Se producen diversas estructuras parciales de Siglec-15. En la producción de las estructuras parciales, se puede utilizar una técnica conocida de síntesis de oligopéptidos. Por ejemplo, se produce una serie de polipéptidos que tienen longitudes apropiadamente reducidas obtenidas acortando secuencialmente Siglec-15 desde el extremo C o el extremo N utilizando una técnica de recombinación genética conocida por los expertos en la materia. A continuación, se examina la reactividad de un anticuerpo contra estos polipéptidos y se determina de forma aproximada un sitio de reconocimiento. A continuación, se sintetizan péptidos que tienen longitudes más cortas y se examina la reactividad con estos péptidos, por lo que se puede determinar el epítopo. Además, el epítopo que es una estructura terciaria parcial de Siglec-15 que se une a un anticuerpo de Siglec-15 específico puede determinarse especificando los restos de aminoácidos de Siglec-15 adyacentes al anticuerpo mediante un análisis estructural de rayos X. Si un segundo anticuerpo anti-Siglec-15 se une a un péptido parcial o una estructura terciaria parcial a la que se une un primer anticuerpo anti-Siglec-15, se puede determinar que el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo comparten el mismo epítopo. Además, al confirmar que el segundo anticuerpo anti-Siglec-15 compite con el primer anticuerpo anti-Siglec-15 por la unión a Siglec-15 (es decir, el segundo anticuerpo inhibe la unión entre Siglec-15 y el primer anticuerpo), se puede determinar que el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo comparten el mismo epítopo incluso si no se ha determinado la secuencia o estructura de un epítopo específico. Además, cuando el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo se unen al mismo epítopo y también el primer anticuerpo tiene un efecto especial, tal como una actividad neutralizadora de antígenos, se puede esperar que el segundo anticuerpo tenga la misma actividad.

Se sabe que cada cadena pesada y ligera de una molécula de anticuerpo tiene tres regiones determinantes de complementariedad (CDR). La región determinante de complementariedad también se denomina dominio hipervariable y está presente en una región variable de cada cadena pesada y ligera de un anticuerpo. Es un sitio que tiene una variabilidad inusualmente alta en su estructura primaria y hay tres CDR separadas en la estructura primaria de cada cadena polipeptídica pesada y ligera. En esta descripción, con respecto a las regiones determinantes de complementariedad de un anticuerpo, las regiones determinantes de complementariedad de la cadena pesada están representadas por CDRH1, CDRH2 y CDRH3 del lado amino terminal de la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada, y las regiones determinantes de complementariedad de la cadena ligera están representadas por CDRL1, CDRL2 y CDRL3 del lado amino terminal de la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera. Estos sitios están próximos entre sí en la estructura terciaria y determinan la especificidad por un antígeno al que se une el anticuerpo.

La expresión "se realiza hibridación en condiciones rigurosas", como se usa en el presente documento, se refiere a la hibridación que se realiza en condiciones en las que se puede lograr identificación realizando hibridación a 68 °C en una solución de hibridación disponible en el mercado, Solución de hibridación ExpressHyb (fabricada por Clontech, Inc.), o realizando hibridación a 68 °C en presencia de NaCl de 0,7 a 1,0M utilizando un filtro que tiene ADN inmovilizado en el mismo, seguido de realizar lavado a 68 °C utilizando solución SSC de 0,1 a 2 x (la solución SSC 1 x está compuesta de NaCl 150 mM y citrato de sodio 15 mM) o en condiciones equivalentes a las mismas.

1. Siglec-15

Los presentes inventores han descubierto que el gen de Siglec-15 se expresa específicamente en tumores de células gigantes y también han descubierto que el nivel de expresión del gen de Siglec-15 aumenta cuando una línea celular derivada de monocitos se diferencia en osteoclastos.

Con respecto a la Siglec-15 que se va a utilizar en la invención, Siglec-15 se purifica directamente a partir de monocitos o células de la médula ósea de un ser humano, mamífero no humano (tal como cobaya, rata, ratón, conejo, cerdo, oveja, ganado bovino o mono) o pollo y se utiliza, o se prepara y puede utilizarse una fracción de membrana celular de las células mencionadas anteriormente. Además, Siglec-15 puede obtenerse mediante síntesis in vitro de los mismos o producción de los mismos en una célula huésped mediante ingeniería genética. En la producción de ingeniería genética, de manera específica, se integra ADNc de Siglec-15 en un vector capaz de expresar ADNc de Siglec-15 y se sintetiza Siglec-15 en una solución que contiene una enzima, un sustrato y una sustancia energética necesaria para la transcripción y traducción, u otra célula huésped procariota o eucariota se transforma para expresar Siglec-15, por lo que se puede obtener la proteína.

La secuencia de nucleótidos de ADNc de Siglec-15 humana se ha registrado en GenBank con un número de referencia de NM_213602 y está representada por la SEQ ID NO: 1 en el listado de secuencias, y su secuencia de aminoácidos está representada por la SEQ ID NO: 2 en el listado de secuencias. La secuencia de nucleótidos de ADNc de Siglec-15 de ratón se ha registrado en GenBank con un número de referencia de XM_884636 y está representada por la SEQ ID NO: 3 en el listado de secuencias, y su secuencia de aminoácidos está representada por la SEQ ID NO: 4 en el listado de secuencias. La Siglec-15 humana madura de la que se ha eliminado la secuencia señal corresponde a una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 21 a 328 de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 2. Además, la Siglec-15 de ratón de la que se ha eliminado la secuencia señal corresponde a una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 21 a 341 de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 4. En relación con esto, Siglec-15 se denomina en ocasiones similar al antígeno CD33 3, similar a la molécula CD33 3, similar a CD33 3 o CD33L3, y todos estos representan la misma molécula.

Se puede obtener ADNc de Siglec-15 mediante, por ejemplo, un procedimiento denominado PCR en el que se realiza una reacción en cadena de la polimerasa (en lo sucesivo, "PCR") utilizando una biblioteca de ADNc que expresa ADNc de Siglec-15 como molde y cebadores que amplifican específicamente ADNc de Siglec-15 (Saiki, R. K., y col., Science, (1988) 239, 487-49).

Además, un polinucleótido que se hibrida con un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos complementaria de al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada de las secuencias de nucleótidos representadas por las SEQ ID NO: 1 y 3 en el listado de secuencias en condiciones rigurosas y codifica una proteína que tiene una actividad biológica comparable a la de Siglec-15 también se considera ADNc de Siglec-15. Además, un polinucleótido que es una variante de corte y empalme transcrita del locus de Siglec-15 humana o de ratón o un polinucleótido que se hibrida con una secuencia complementaria del mismo en condiciones rigurosas y codifica una proteína que tiene una actividad biológica comparable a la de Siglec-15 también se considera ADNc de Siglec-15.

Además, una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que incluye sustitución, supresión o adición de uno o varios aminoácidos en al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NO: 2 y 4 en el listado de secuencias o una secuencia de aminoácidos obtenida eliminando la secuencia señal de cualquiera de estas secuencias y que tiene una actividad biológica comparable a la de Siglec-15 también se considera Siglec-15. Además, una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una variante de corte y empalme transcrita del locus de Siglec-15 humana o de ratón o una secuencia de aminoácidos que incluye una sustitución, supresión o adición de uno o varios aminoácidos en la misma y tiene una actividad biológica comparable a la de Siglec-15 también se considera Siglec-15.

2. Detección de metabolismo óseo anómalo

Un análisis del nivel de expresión del gen de Siglec-15 en un grupo de muestras de prueba de diversos tejidos óseos humanos mostró que el nivel de expresión del gen aumenta significativamente en el tumor de células gigantes (TCG), que es un tumor óseo con una gran cantidad de células gigantes multinucleadas similares a los osteoclastos que surgen y se caracterizan por hallazgos clínicos de destrucción ósea osteolítica (Bullough y col., Atlas of Orthopedic Pathology 2a edición, págs. 17.6-17.8, Lippincott Williams & Wilkins Publishers (1992)).

También se descubrió que el nivel de expresión del gen de Siglec-15 aumenta cuando una línea celular derivada de monocitos se diferencia en osteoclastos.

Por consiguiente, se considera que Siglec-15 está asociada a patologías humanas tales como TCG en las que aumenta la reabsorción ósea. En otras palabras, la medición del nivel de expresión del gen de Siglec-15 y/o Siglec-15 en cada célula y/o cada tejido permite la determinación del estado de metabolismo óseo anómalo acompañado de sobreexpresión de Siglec-15. El metabolismo óseo anómalo, como se usa en el presente documento, se refiere a un trastorno caracterizado por pérdida neta de hueso, y los ejemplos específicos del mismo incluyen, pero sin limitación, osteoporosis (osteoporosis posmenopáusica, osteoporosis senil, osteoporosis secundaria debida al uso de un agente terapéutico, tal como un esteroide o un inmunosupresor, u osteoporosis que acompaña a la artritis reumatoide), destrucción ósea que acompaña a la artritis reumatoide, hipercalcemia cancerosa, destrucción ósea que acompaña al mieloma múltiple o metástasis del cáncer al hueso, tumor de células gigantes, osteopenia, pérdida de dientes debida a periodontitis, osteólisis alrededor de una articulación protésica, destrucción ósea en osteomielitis crónica, enfermedad ósea de Paget, osteodistrofia renal y osteogénesis imperfecta.

En la invención, la "muestra de prueba" que se va a utilizar para examinar el nivel de expresión del gen de Siglec-15 y/o Siglec-15 se refiere a una muestra de un tejido de médula ósea, hueso, próstata, testículo, pene, vejiga, riñón, cavidad bucal, faringe, labio, lengua, encía, nasofaringe, esófago, estómago, intestino delgado, intestino grueso, colon, hígado, vesícula biliar, páncreas, nariz, pulmón, tejido blando, piel, mama, útero, ovario, cerebro, tiroides, ganglio linfático, músculo, tejido graso o similares, o sangre, un líquido corporal, una excreción o similar obtenida de un sujeto de prueba, una muestra clínica, etc., sin embargo, en la invención, se prefiere más sangre o médula ósea.

Con respecto a RANKL, que se sabe que está asociado con la diferenciación de osteoclastos, se ha producido un ratón con genes inactivados y se ha analizado el fenotipo cuando se ha perdido la función de RANKL (Young-Yun Kong, y col., Nature (1999) 397, págs. 315-323). Al producir un ratón con genes inactivados desprovisto de Siglec-15 de la misma manera que antes, se puede analizar el fenotipo cuando se ha perdido la función de Siglec-15.

3. Producción de anticuerpo anti-Siglec-15

El anticuerpo como se desvela en el presente documento, que es contra Siglec-15, puede obtenerse inmunizando un animal con Siglec-15 o un polipéptido arbitrario seleccionado de la secuencia de aminoácidos de Siglec-15 y recogiendo y purificando el anticuerpo producido in vivo según un procedimiento común. La especie biológica de Siglec-15 que se va a utilizar como antígeno no se limita al ser humano y se puede inmunizar un animal con Siglec-15 procedente de un animal distinto de los humanos, tal como un ratón o una rata. En este caso, al examinar la reactividad cruzada entre un anticuerpo que se une a la Siglec-15 heteróloga obtenida y la Siglec-15 humana, se puede seleccionar un anticuerpo aplicable a una enfermedad humana.

Además, se puede obtener un anticuerpo monoclonal fusionando células productoras de anticuerpos que producen un anticuerpo contra Siglec-15 con células de mieloma para establecer un hibridoma según un procedimiento conocido (por ejemplo, Kohler y Milstein, Nature, (1975) 256, págs. 495-497; Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, págs. 365 367, Plenum Press, N.Y. (1980)).

En relación con esto, puede obtenerse Siglec-15 que se va a utilizar como antígeno mediante ingeniería genética para hacer que una célula huésped produzca el gen de Siglec-15.

De manera específica, se produce un vector capaz de expresar el gen de Siglec-15, y el vector resultante se transfecta en una célula huésped para expresar el gen y después se purifica la Siglec-15 expresada. En lo sucesivo en el presente documento, se describirá específicamente un procedimiento para obtener un anticuerpo contra Siglec-15.

(1) Preparación de antígeno

Los ejemplos del antígeno que se va a utilizar para producir el anticuerpo anti-Siglec-15 incluyen Siglec-15, un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos parcial que contiene al menos 6 aminoácidos consecutivos de Siglec-15 y un derivado obtenido añadiendo una secuencia de aminoácidos dada o vehículo al mismo.

Siglec-15 puede purificarse directamente a partir de tejidos tumorales humanos o células tumorales y utilizarse. Además, se puede obtener Siglec-15 sintetizándola in vitro o haciendo que una célula huésped la produzca mediante ingeniería genética.

Con respecto a la ingeniería genética, de manera específica, se integra ADNc de Siglec-15 en un vector capaz de expresar ADNc de Siglec-15 y se sintetiza Siglec-15 en una solución que contiene una enzima, un sustrato y una sustancia energética necesaria para la transcripción y traducción, u otra célula huésped procariota o eucariota se transforma para expresar Siglec-15, por lo que se puede obtener el antígeno.

Además, el antígeno también se puede obtener como una proteína secretora expresando una proteína de fusión obtenida ligando el dominio extracelular de Siglec-15, que es una proteína de membrana, a la región constante de un anticuerpo en un sistema de huésped-vector adecuado.

Se puede obtener ADNc de Siglec-15 mediante, por ejemplo, un procedimiento denominado PCR en el que se realiza una reacción en cadena de la polimerasa (denominado en lo sucesivo en el presente documento "PCR") utilizando una biblioteca de ADNc que expresa ADNc de Siglec-15 como molde y cebadores que amplifican específicamente ADNc de Siglec-15 (Saiki, R. K., y col., Science, (1988) 239, págs. 487-489).

Como la síntesis in vitro del polipéptido, por ejemplo, puede ejemplificarse el sistema de traducción rápida (RTS) fabricado por Roche Diagnostics, Inc., pero sin limitación.

Los ejemplos del huésped procariota incluyen Escherichia coli y Bacillus subtilis. Para transformar la célula huésped con un gen diana, la célula huésped se transforma utilizando un vector plasmídico que contiene un replicón, es decir, un origen de replicación procedente de una especie compatible con el huésped y una secuencia reguladora. Además, el vector tiene preferentemente una secuencia capaz de imponer selectividad fenotípica a la célula transformada.

Los ejemplos de células huéspedes eucariotas incluyen células de vertebrados, células de insectos y células de levadura. Como células de vertebrados, por ejemplo, se utilizan con frecuencia cepas deficientes en dihidrofolato reductasa (Urlaub, G. y Chasin, L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, págs. 4126-4220) de células COS de simio (Gluzman, Y., Cell, (1981) 23, págs. 175-182, ATCC CRL-1650), fibroblastos murinos NIH3T3 (ATCC n.° CRL-1658) y células de ovario de hámster chino (células CHO; ATCC: CCL-61); y similares, sin embargo, no se limitan a las mismas.

El transformante obtenido de este modo se puede cultivar según un procedimiento habitual y, mediante el cultivo del transformante, un polipéptido diana se produce de manera intracelular o extracelular.

Un medio adecuado que se va a utilizar para el cultivo se puede seleccionar entre diversos medios de cultivo utilizados habitualmente, dependiendo de la célula huésped empleada. Si se emplea Escherichia coli, por ejemplo, se puede utilizar un medio LB complementado con un antibiótico tal como ampicilina o IPMG según sea necesario.

Una proteína recombinante producida de manera intracelular o extracelular por el transformante a través de dicho cultivo puede separarse y purificarse mediante cualquiera de diversos procedimientos de separación conocidos utilizando la propiedad física o química de la proteína.

Los ejemplos específicos de los procedimientos incluyen el tratamiento con un precipitante de proteína común, ultrafiltración, diversos tipos de cromatografía líquida, tal como cromatografía de tamiz molecular (filtración en gel), cromatografía de adsorción, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de afinidad, diálisis y una combinación de los mismos.

Además, uniendo un marcador de seis restos de histidina a una proteína recombinante que se va a expresar, la proteína se puede purificar eficazmente con una columna de afinidad de níquel. Como alternativa, uniendo una región Fc de IgG a una proteína recombinante que se va a expresar, la proteína se puede purificar eficazmente con una columna de proteína A.

Combinando los procedimientos anteriormente mencionados, se puede producir fácilmente una gran cantidad de un polipéptido diana con alto rendimiento y alta pureza.

(2) Producción de anticuerpo monoclonal anti-Siglec-15

Los ejemplos del anticuerpo que se une específicamente a Siglec-15 incluyen un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a Siglec-15 y un procedimiento para obtener el anticuerpo es como se describe a continuación.

La producción de un anticuerpo monoclonal requiere en general las siguientes etapas operativas de:

(a) purificar un biopolímero para utilizar como antígeno;

(b) preparar células productoras de anticuerpos inmunizando a un animal mediante inyección del antígeno, recogiendo la sangre, ensayando su título de anticuerpos para determinar cuándo se debe extirpar el bazo; (c) preparar células de mieloma (en lo sucesivo en el presente documento, denominadas "mieloma");

(d) fusionar las células productoras de anticuerpos con el mieloma;

(e) cribar un grupo de hibridomas que producen un anticuerpo diana;

(f) dividir los hibridomas en clones de células individuales (clonación);

(g) opcionalmente, cultivar el hibridoma o criar un animal en el que se ha implantado el hibridoma para producir una gran cantidad de un anticuerpo monoclonal;

(h) examinar el anticuerpo monoclonal producido de este modo para determinar la actividad biológica y la especificidad de unión o analizar las propiedades del mismo como reactivo marcado; y similares.

En lo sucesivo en el presente documento, el procedimiento de producción de un anticuerpo monoclonal se describirá en detalle siguiendo las etapas anteriores, sin embargo, el procedimiento no se limita a ello y, por ejemplo, se pueden utilizar células productoras de anticuerpos y mieloma además de células del bazo.

(a) Purificación de antígeno

Como antígeno, se puede utilizar Siglec-15 preparada mediante el procedimiento descrito anteriormente o un péptido parcial del mismo.

Además, también se puede utilizar como antígeno una fracción de membrana preparada a partir de células recombinantes que expresan Siglec-15, o las mismas células recombinantes que expresan Siglec-15, y también un péptido parcial de la proteína desvelada en el presente documento sintetizada químicamente mediante un procedimiento conocido por los expertos en la materia.

(b) Preparación de células productoras de anticuerpos

El antígeno obtenido en la etapa (a) se mezcla con un adyuvante tal como adyuvante completo o incompleto de Freund, o sulfato de aluminio y potasio y la mezcla resultante se utiliza como inmunógeno para inmunizar un animal experimental. Como animal experimental, puede utilizarse cualquier animal utilizado en un procedimiento conocido de producción de hibridomas sin ningún problema. De manera específica, por ejemplo, puede utilizarse un ratón, una rata, una cabra, oveja, ganado bovino, un caballo o similares. Sin embargo, desde el punto de vista de la facilidad de disponibilidad de las células de mieloma para fusionarlas con las células productoras de anticuerpos extraídas, se utiliza preferentemente un ratón o una rata como animal para inmunizar.

Además, la cepa de ratón o rata que se va a utilizar no está particularmente limitada y, en el caso de un ratón, por ejemplo, se pueden utilizar diversas cepas tales como A, AKR, BALB/c, BDP, BA, CE, c 3h , 57BL, C57BL, C57L, d Ba , FL, HTH, HT1, LP, NZB, NZW, RF, R III, SJL, SWR, WB y 129, y, en el caso de una rata, por ejemplo, se puede utilizar Wistar, Low, Lewis, Sprague, Dawley, ACI, BN, Fischer y similares.

Estos ratones y ratas están disponibles en el mercado de criadores/distribuidores de animales experimentales, por ejemplo, CLEA Japan, Inc. y Charles River Laboratories Japan, Inc.

Entre estos, teniendo en cuenta la compatibilidad de la fusión con células de mieloma como se describe a continuación, en el caso de un ratón, la cepa BALB/c, y, en el caso de una rata, las cepas Wistar y Low, son particularmente preferidas como el animal para inmunizar.

Además, teniendo en cuenta la homología antigénica entre seres humanos y ratones, También se prefiere utilizar un ratón que tenga función biológica disminuida para eliminar autoanticuerpos, es decir, un ratón con una enfermedad autoinmunitaria.

La edad del ratón o la rata en el momento de inmunización es preferentemente de 5 a 12 semanas de edad, más preferentemente de 6 a 8 semanas de edad.

Para inmunizar a un animal con Siglec-15 o un recombinante de la misma, por ejemplo, se puede utilizar un procedimiento conocido descrito en detalle en, por ejemplo, Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E. A. y Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Editor Springfield, Illinois (1964), o similares.

Entre estos procedimientos de inmunización, un procedimiento específico preferido es, por ejemplo, de la siguiente manera.

Es decir, en primer lugar, una fracción de proteína de membrana que actúa como antígeno o células provocadas para expresar el antígeno se administran por vía intradérmica o intraperitoneal a un animal.

Sin embargo, se prefiere la combinación de ambas vías de administración para aumentar la eficacia de inmunización y, cuando se realiza administración intradérmica en la primera mitad y se realiza administración intraperitoneal en la segunda mitad o solo en la última dosis, se puede incrementar en particular la eficacia de inmunización.

La pauta de administración del antígeno varía según el tipo de animal para inmunizar, diferencias individuales o similares. Sin embargo, en general, se prefiere un programa de administración en el que la frecuencia de administración del antígeno es de 3 a 6 veces y el intervalo de dosificación es de 2 a 6 semanas y se prefiere más un programa de administración en el que la frecuencia de administración del antígeno es de 3 a 4 veces y el intervalo de dosificación es de 2 a 4 semanas.

Además, la dosis del antígeno varía según el tipo de animal para inmunizar, diferencias individuales o similares, sin embargo, la dosis se establece en general de 0,05 a 5 mg, preferentemente de aproximadamente 0,1 a 0,5 mg.

Se realiza una vacuna de refuerzo de 1 a 6 semanas, preferentemente de 2 a 4 semanas, más preferentemente de 2 a 3 semanas después de la administración del antígeno como se ha descrito anteriormente.

La dosis del antígeno en el momento de realizar la inmunización de refuerzo varía dependiendo del tipo o tamaño del animal o similar, sin embargo, en el caso de un ratón, la dosis se establece en general entre 0,05 y 5 mg, preferentemente entre 0,1 y 0,5 mg, más preferentemente entre aproximadamente 0,1 y 0,2 mg.

Las células del bazo o los linfocitos, incluyendo células productoras de anticuerpos, se eliminan asépticamente del animal inmunizado de 1 a 10 días, preferentemente de 2 a 5 días, más preferentemente de 2 a 3 días después de la vacuna de refuerzo.

En este momento, se mide el título de anticuerpos y, si se utiliza un animal que tiene un título de anticuerpos suficientemente aumentado como fuente de suministro de las células productoras de anticuerpos, el procedimiento posterior se puede llevar a cabo de manera más eficaz.

Los ejemplos del procedimiento para medir el título de anticuerpos que se va a utilizar aquí incluyen un procedimiento RIA y un procedimiento ELISA, pero el procedimiento no se limita a lo anterior.

Por ejemplo, si se emplea un procedimiento ELISA, la medición del título de anticuerpos puede llevarse a cabo según los procedimientos descritos a continuación.

En primer lugar, un antígeno purificado o parcialmente purificado se adsorbe en la superficie de una fase sólida, tal como una placa de 96 pocillos para ELISA, y la superficie de la fase sólida que no tiene antígeno adsorbido en la misma se cubre con una proteína no relacionada con el antígeno, tal como seroalbúmina bovina (en lo sucesivo en el presente documento denominada "BSA"). Después de lavar la superficie, la superficie se pone en contacto con una muestra diluida en serie (por ejemplo, suero de ratón) como anticuerpo primario para permitir que el anticuerpo de la muestra se una al antígeno.

Además, como anticuerpo secundario, se añade un anticuerpo marcado con una enzima contra un anticuerpo de ratón y se permite que se una al anticuerpo de ratón. Después del lavado, se añade un sustrato para la enzima y se mide un cambio en la absorbancia que se produce debido al desarrollo del color inducido por la degradación del sustrato o similar y se calcula el título de anticuerpos basándose en la medición.

La separación de las células productoras de anticuerpos de las células del bazo o los linfocitos se puede llevar a cabo según un procedimiento conocido (por ejemplo, Kohler y col., Nature (1975), 256, pág. 495; Kohler y col., Eur. J. Immunol. (1977), 6, pág. 511; Milstein y col., Nature (1977), 266, pág. 550; Walsh, Nature (1977), 266, pág. 495).

Por ejemplo, en el caso de esplenocitos, puede emplearse un procedimiento general en el que las células productoras de anticuerpos se separan homogeneizando el bazo para obtener células mediante filtración con una malla de acero inoxidable y suspendiendo las células en medio esencial mínimo de Eagle (MEM).

(c) Preparación de células de mieloma (en lo sucesivo en el presente documento, denominadas "mieloma")

Las células de mieloma que se van a utilizar para la fusión celular no están particularmente limitadas y las células adecuadas se pueden seleccionar de líneas celulares conocidas. Sin embargo, teniendo en cuenta la conveniencia cuando se selecciona un hibridoma de células fusionadas, se prefiere utilizar una cepa deficiente en HGPRT (hipoxantina-guanina fosforribosil transferasa) cuyo procedimiento de selección se ha establecido.

Más específicamente, los ejemplos de la cepa deficiente en HGPRT incluyen X63-Ag8(X63), NS1-ANS/1(NS1), P3X63-Ag8.U1(P3U1), X63-Ag8.653(X63.653), SP2/0-Ag14(SP2/0), MPC11-45.6TG1.7(45.6TG), F0, S149/5XXO y BU.1 procedentes de ratones; 210.RsY3.Ag.1.2.3(Y3) procedente de ratas; y U266a R(SKO-007), GM1500 GTG-A12(GM1500), UC729-6, LICR-LOW-HMy2(HMy2) y 8226AR/NIP4-1(NP41) procedentes de seres humanos.

Estas cepas deficientes en HGPRT están disponibles de, por ejemplo, la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) o similares.

Estas cepas celulares se subcultivan en un medio adecuado tal como un medio de 8-azaguanina [un medio obtenido añadiendo 8-azaguanina a un medio RPMI-1640 complementado con glutamina, 2-mercaptoetanol, gentamicina y suero de ternero fetal (en lo sucesivo en el presente documento, denominado "FCS")]; medio de Dulbecco modificado por Iscove (en lo sucesivo en el presente documento, denominado "IMDM") o medio de Eagle modificado por Dulbecco (en lo sucesivo en el presente documento, denominado "DMEM"). En este caso, 3 a 4 días antes de realizar la fusión celular, las células se subcultivan en un medio normal [por ejemplo, un medio ASF104 (fabricado por Ajinomoto Co., Ltd.) que contiene FCS al 10 %] para obtener no menos de 2 x 107 células el día de la fusión celular.

(d) Fusión celular

La fusión entre las células productoras de anticuerpos y las células de mieloma se puede realizar de forma adecuada según un procedimiento conocido (Weir, D. M. Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E. A. y Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, editor Charles C Thomas, Springfield, Illinois (1964), etc.), en condiciones tales que la tasa de supervivencia de las células no se reduzca excesivamente.

Como dicho procedimiento, un procedimiento químico en el que las células productoras de anticuerpos y las células de mieloma se mezclan en una solución que contiene un polímero tal como polietilenglicol a una concentración alta, se puede utilizar un procedimiento físico que utilice estimulación eléctrica o similar.

Entre estos procedimientos, un ejemplo específico del procedimiento químico es el que se describe a continuación.

Es decir, en el caso de que se utilice polietilenglicol en la solución que contiene un polímero a una alta concentración, las células productoras de anticuerpos y las células de mieloma se mezclan en una solución de polietilenglicol que tiene un peso molecular de 1500 a 6000, más preferentemente de 2000 a 4000 a una temperatura de 30 a 40 °C, preferentemente de 35 a 38 °C durante 1 a 10 minutos, preferentemente de 5 a 8 minutos.

(e) Selección de un grupo de hibridomas

El procedimiento de selección de hibridomas obtenidos mediante la fusión celular mencionada anteriormente no está particularmente limitado. Habitualmente, se utiliza un procedimiento de selección de HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina) (Kohler y col., Nature (1975), 256, pág. 495; Milstein y col., Nature (1977), 266, pág. 550).

Este procedimiento es eficaz cuando se obtienen hibridomas utilizando las células de mieloma de una cepa deficiente en HGPRT que no pueden sobrevivir en presencia de aminopterina.

Es decir, cultivando células no fusionadas e hibridomas en un medio de HAT, solo se permite selectivamente que los hibridomas resistentes a la aminopterina sobrevivan y proliferen.

(f) División en clon unicelular (clonación)

Como procedimiento de clonación para hibridomas, se puede utilizar un procedimiento conocido tal como un procedimiento de metilcelulosa, un procedimiento de agarosa blanda o un procedimiento de dilución limitante (véase, por ejemplo, Barbara, B. M. y Stanley, M. S.: Selected Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman and Company, San Francisco (1980)). Entre estos procedimientos, en particular, se prefiere un procedimiento de dilución limitante.

En este procedimiento, se siembran en una microplaca una cepa de células de fibroblastos procedente de un feto de rata o células alimentadoras tales como células normales del bazo de ratón, células de la glándula del timo o células de ascitis.

Por otra parte, los hibridomas se diluyen en un medio para dar una densidad celular de 0,2 a 0,5 células por cada 0,2 ml. Se añade una alícuota de 0.1 ml de la suspensión de hibridoma diluida a cada pocillo y el cultivo se continúa durante aproximadamente 2 semanas mientras que se reemplaza aproximadamente 1/3 de la solución de cultivo con medio nuevo a intervalos temporales predeterminados (por ejemplo, cada 3 días), por lo que pueden proliferar clones de hibridomas.

Los hibridomas en pocillos para los que se ha confirmado el título de anticuerpos se someten a, por ejemplo, clonación por el procedimiento de dilución limitante repetidamente de 2 a 4 veces. Un hibridoma que se ha confirmado que tiene un título de anticuerpo estable se selecciona como una cepa de hibridoma productora de anticuerpos monoclonales anti-Siglec-15.

Los ejemplos de la cepa de hibridoma clonada de este modo incluyen el hibridoma #32A1 descrito en el documento WO 09/48072. El hibridoma #32A1 se depositó en el Depositario del Organismo Internacional de Patentes del Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada (ubicado en Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japón) el 28 de agosto de 2008, y se le ha otorgado un número de referencia de FERM BP-10999 con el nombre de hibridoma anti-Siglec-15 #32A1. En relación con esto, en esta descripción, el anticuerpo producido por el hibridoma #32A1 se denomina "anticuerpo #32A1" o simplemente "#32A1". Además, los anticuerpos obtenidos en los ejemplos de esta descripción distintos del anticuerpo #32A1 también están representados por los nombres de los anticuerpos de la misma manera. Un fragmento parcial que contiene la región variable de cadena pesada del anticuerpo #32A1 tiene una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 20 a 167 de la SEQ ID NO: 28 en el listado de secuencias. Además, un fragmento parcial que contiene la región variable de cadena pesada del anticuerpo #32A1 tiene una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 21 a 139 de la SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias.

(g) Preparación de anticuerpo monoclonal mediante cultivo de hibridoma

Cultivando el hibridoma seleccionado de este modo, se puede obtener eficazmente un anticuerpo monoclonal. Sin embargo, antes del cultivo, se prefiere realizar el cribado de un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal diana.

En dicho cribado, se puede emplear un procedimiento conocido.

La medición del título de anticuerpos se puede llevar a cabo mediante, por ejemplo, un procedimiento ELISA explicado en el artículo (b) descrito anteriormente.

El hibridoma obtenido mediante el procedimiento descrito anteriormente se puede almacenar en estado congelado en nitrógeno líquido o en un congelador a -80 °C o menos.

Después de completar la clonación, el medio se cambia de un medio HT a un medio normal y se cultiva el hibridoma.

El cultivo a gran escala se realiza mediante cultivo de rotación utilizando un frasco de cultivo grande o mediante cultivo giratorio.

Del sobrenadante obtenido por el cultivo a gran escala, un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a la proteína como se desvela en el presente documento puede obtenerse mediante purificación utilizando un procedimiento conocido por los expertos en la materia, tal como filtración en gel.

Además, el hibridoma se inyecta en la cavidad abdominal de un ratón de la misma cepa que el hibridoma (por ejemplo, la BALB/c anteriormente mencionada) o un ratón Nu/Nu para que prolifere el hibridoma, por lo que se puede obtener la ascitis que contiene una gran cantidad del anticuerpo monoclonal de la invención.

En el caso de que el hibridoma se administre en la cavidad abdominal, si se administra un aceite mineral tal como 2,6,10,14-tetrametilpentadecano (pristano) de 3 a 7 días antes, se puede obtener una mayor cantidad de la ascitis.

Por ejemplo, se ha inyectado previamente un inmunosupresor en la cavidad abdominal de un ratón de la misma cepa que el hibridoma para inactivar linfocitos T. 20 días después, se suspenden de 106 a 107 células de clones de hibridomas en un medio sin suero (0,5 ml) y la suspensión se inyecta en la cavidad abdominal del ratón. En general, cuando el abdomen se expande y se llena de la ascitis, la ascitis se extrae del ratón.

Por este procedimiento, el anticuerpo monoclonal se puede obtener a una concentración que es aproximadamente 100 veces o más superior a la de la solución de cultivo.

El anticuerpo monoclonal obtenido mediante el procedimiento mencionado anteriormente se puede purificar mediante un procedimiento descrito en, por ejemplo, Weir, D. M.: Handbook of Experimental Immunology Vol. I, II, III, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1978).

Es decir, los ejemplos del procedimiento incluyen un procedimiento de precipitación con sulfato de amonio, filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de afinidad.

Como procedimiento de purificación sencillo, también se puede utilizar un equipo de purificación de anticuerpos monoclonales disponible en el mercado (por ejemplo, equipo MAbTrap GII fabricado por Pharmacia, Inc.) o similares.

El anticuerpo monoclonal obtenido de este modo tiene alta especificidad de antígeno para Siglec-15.

(h) Ensayo de anticuerpo monoclonal

El isotipo y la subclase del anticuerpo monoclonal obtenido de este modo se pueden determinar de la siguiente manera.

En primer lugar, los ejemplos del procedimiento de identificación incluyen un procedimiento de Ouchterlony, un procedimiento ELISA y un procedimiento RIA.

Un procedimiento de Ouchterlony es sencillo, pero cuando la concentración del anticuerpo monoclonal es baja, es necesaria una operación de condensación.

Por otro lado, cuando se utiliza un procedimiento ELISA o un procedimiento RIA, haciendo reaccionar directamente el sobrenadante de cultivo con una fase sólida con antígeno adsorbido y utilizando anticuerpos correspondientes a diversos tipos de isotipos y subclases de inmunoglobulinas como anticuerpos secundarios, se pueden identificar el isotipo y la subclase del anticuerpo monoclonal.

Además, como un procedimiento más sencillo, también se puede utilizar un equipo de identificación disponible en el mercado (por ejemplo, equipo Mouse Typer fabricado por Bio-Rad Laboratories, Inc.) o similares.

Además, la determinación cuantitativa de una proteína se puede realizar mediante el procedimiento de Folin Lowry y un procedimiento de cálculo basado en la absorbancia a 280 nm [1,4 (DO 280) = inmunoglobulina 1 mg/ml].

(3) Otros anticuerpos

El anticuerpo desvelado en el presente documento incluye no solo el anticuerpo monoclonal mencionado anteriormente contra Siglec-15, sino también un anticuerpo recombinante obtenido por modificación artificial con el fin de disminuir la antigenicidad heteróloga para seres humanos, tal como un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado y un anticuerpo humano. Estos anticuerpos se pueden producir utilizando un procedimiento conocido.

Como anticuerpo quimérico, un anticuerpo en el que se obtienen regiones variables y constantes del anticuerpo de diferentes especies, por ejemplo, se puede ejemplificar un anticuerpo quimérico en el que una región variable de anticuerpo procedente de ratón o rata está conectada a una región constante procedente de seres humanos (véase Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6851-6855, (1984)). Como ejemplo del anticuerpo quimérico procedente de un anticuerpo de rata anti-ratón #32A1, se puede ejemplificar un anticuerpo que comprende una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 20 a 470 de la SEQ ID NO: 41 en el listado de secuencias y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 21 a 237 de la SEQ ID NO: 43 en el listado de secuencias.

Como anticuerpo humanizado, se puede ejemplificar un anticuerpo obtenido integrando solo una región determinante de complementariedad (CDR) en un anticuerpo procedente de seres humanos (véase Nature (1986) 321, págs. 522 525) y un anticuerpo obtenido injertando una parte de los restos de aminoácidos del marco conservado así como la secuencia de CDR en un anticuerpo humano mediante un procedimiento de injerto de CDR (documento WO 90/07861). Como ejemplo del anticuerpo humanizado de un anticuerpo de rata #32A1, se puede ejemplificar una combinación arbitraria de una cadena pesada que contiene una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 20 a 140 de la SEQ ID NO: 51 en el listado de secuencias, los restos de aminoácidos 20 a 140 de la SEQ ID NO: 53, los restos de aminoácidos 20 a 140 de la SEQ ID NO: 55, los restos de aminoácidos 20 a 140 de la SEQ ID NO: 57, los restos de aminoácidos 20 a 140 de la SEQ ID NO: 59, los restos de aminoácidos 20 a 140 de la SEQ ID NO: 99, los restos de aminoácidos 20 a 140 de la SEQ ID NO: 101 o los restos de aminoácidos 1 a 121 de una cualquiera de las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NO: 72 a 77 y una cadena ligera que contiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 21 a 133 de la SEQ ID NO: 61, los restos de aminoácidos 21 a 133 de la s Eq ID NO: 63, los restos de aminoácidos 21 a 133 de la SEQ ID NO: 65, los restos de aminoácidos 21 a 132 de la SEQ ID NO: 67, los restos de aminoácidos 21 a 133 de la SEQ ID NO: 69, los restos de aminoácidos 21 a 133 de la SEQ ID NO: 71, los restos de aminoácidos 21 a 133 de la SEQ ID NO: 103, los restos de aminoácidos 21 a 133 de la SEQ ID NO: 105 o los restos de aminoácidos 1 a 113 de una cualquiera de las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NO: 78 a 96.

Como combinación preferida, se puede ejemplificar un anticuerpo que comprende una cadena pesada que contiene una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 20 a 140 de la s Eq ID NO: 51 y una cadena ligera que contiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 21 a 133 de la SEQ ID NO: 61, un anticuerpo que comprende una cadena pesada que contiene una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 20 a 140 de la SEQ ID NO: 53 y una cadena ligera que contiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 21 a 133 de la SEQ ID NO: 63, un anticuerpo que comprende una cadena pesada que contiene una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 20 a 140 de la SEQ ID NO: 55 y una cadena ligera que contiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 21 a 133 de la SEQ ID NO: 65, un anticuerpo que comprende una cadena pesada que contiene una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 20 a 140 de la SEQ ID NO: 55 y una cadena ligera que contiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 21 a 132 de la SEQ ID NO: 67, un anticuerpo que comprende una cadena pesada que contiene una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 20 a 140 de la SEQ ID NO: 57 y una cadena ligera que contiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 21 a 133 de la SEQ ID NO: 69, un anticuerpo que comprende una cadena pesada que contiene una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 20 a 140 de la SEQ ID NO: 59 y una cadena ligera que contiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 21 a 133 de la SEQ ID NO: 71, un anticuerpo que comprende una cadena pesada que contiene una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 20 a 140 de la SEQ ID NO: 99 y una cadena ligera que contiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 21 a 133 de la SEQ ID NO: 69, un anticuerpo que comprende una cadena pesada que contiene una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 20 a 140 de la SEQ ID NO: 101 y una cadena ligera que contiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 21 a 133 de la SEQ ID NO: 69, un anticuerpo que comprende una cadena pesada que contiene una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 20 a 140 de la SEQ ID NO: 99 y una cadena ligera que contiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 21 a 133 de la SEQ ID NO: 103 o un anticuerpo que comprende una cadena pesada que contiene una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 20 a 140 de la SEQ ID NO: 99 y una cadena ligera que contiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 21 a 133 de la SEQ ID NO: 105.

Como combinación más preferida, se ejemplifica un anticuerpo que comprende una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 20 a 470 de la SEQ ID NO: 51 y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 21 a 238 de la SEQ ID NO: 61, un anticuerpo que comprende una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 20 a 470 de la SEQ ID NO: 53 y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 21 a 238 de la SEQ ID NO: 63, un anticuerpo que comprende una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 20 a 470 de la SEQ ID NO: 55 y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 21 a 238 de la SEQ ID NO: 65, un anticuerpo que comprende una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 20 a 470 de la SEQ ID NO: 55 y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 21 a 237 de la SEQ ID NO: 67, un anticuerpo que comprende una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 20 a 470 de la SEQ ID NO: 57 y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 21 a 238 de la SEQ ID NO: 69, un anticuerpo que comprende una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 20 a 470 de la SEQ ID NO: 59 y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 21 a 238 de la SEQ ID NO: 71, un anticuerpo que comprende una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 20 a 466 de la SEQ ID NO: 99 y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 21 a 238 de la SEQ ID NO: 69, un anticuerpo que comprende una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 20 a 466 de la SEQ ID NO: 101 y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 21 a 238 de la SEQ ID NO: 69, un anticuerpo que comprende una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 20 a 466 de la SEQ ID NO: 99 y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 21 a 238 de la SEQ ID NO: 103 o un anticuerpo que comprende una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 20 a 466 de la SEQ ID NO: 99 y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácidos 21 a 238 de SEQ ID NO: 105.

Sin embargo, el anticuerpo humanizado procedente del anticuerpo #32A1 no se limita a los anticuerpos humanizados mencionados anteriormente siempre que el anticuerpo humanizado tenga los 6 tipos de secuencias de CDR de #32A1 y tenga una actividad de inhibición de la formación de osteoclastos. En relación con esto, la región variable de cadena pesada del anticuerpo #32A1 tiene CDRH1 (DYFMN) que comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 44, cualquiera de CDRH2 (QIRNKIYTYATFYAESLEG) que comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 45 y CDRH2 (QIRNKIYTYATFy A) representada por la SEQ ID NO: 97 y CDRH3 (SLTGGDYFDY) que comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 46. El CDRH2 representado por la Se Q ID No : 45 está de acuerdo con la definición de Kabat (Se Qu ENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST VOL. I, quinta edición (1991)). La CDRH2 representada por la SEQ ID NO: 97 se hace cinco restos más corta en el extremo C que la definición de Kabat. En la secuencia de la cadena pesada que contiene esta CDRH2, la secuencia de CDR procedente de una rata se acorta y se incorpora más de una secuencia de marco conservado humana y, por lo tanto, cuando se administra a seres humanos, es mucho menos probable que se reconozca como un antígeno heterólogo. Además, la región variable de cadena ligera del anticuerpo #32A1 tiene CDRL1 (RASQSVTISGYSFIH) que comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 47, CDRL2 (RASNLAS) que comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 48 y CDRL3 (QQSRKSPWT) que comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 49.

Además, el anticuerpo desvelado en el presente documento incluye un anticuerpo humano. Un anticuerpo humano anti-Siglec-15 se refiere a un anticuerpo humano que tiene solo una secuencia génica de un anticuerpo procedente de un cromosoma humano. El anticuerpo humano anti-Siglec-15 puede obtenerse mediante un procedimiento que utiliza un ratón productor de anticuerpos humanos que tiene un fragmento de cromosoma humano que contiene genes de cadena pesada y ligera de un anticuerpo humano (véase Tomizuka, K. y col., Nature Genetics (1997) 16, págs.

133-143; Kuroiwa, Y. y col., Nucl. Acids Res. (1998) 26, págs. 3447-3448; Yoshida, H. y col., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol. 10, págs. 69-73 (Kitagawa, Y., Matuda, T. e Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999; Tomizuka, K. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, págs. 722-727, etc.).

Dicho ratón productor de anticuerpos humanos se puede crear específicamente de la siguiente manera. Se crea un animal genéticamente modificado en el que se han alterado loci de genes de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina endógena y, en su lugar, se han introducido loci génicos de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina humana mediante un vector de cromosoma artificial de levadura (YAC) o similar produciendo un animal con genes inactivados y un animal transgénico y apareando estos animales.

Además, según una técnica de ingeniería genética, mediante el uso de ADNc que codifican dicha cadena pesada y cadena ligera de un anticuerpo humano, respectivamente, y preferentemente un vector que contiene los ADNc, se transforman células eucariotas y se cultiva un transformante que produce un anticuerpo monoclonal humano recombinante, por lo que el anticuerpo también puede obtenerse del sobrenadante de cultivo.

En este caso, como huésped, por ejemplo, se pueden utilizar células eucariotas, preferentemente células de mamífero tales como células CHO, linfocitos o células de mieloma.

Además, también se conoce un procedimiento para obtener un anticuerpo humano procedente de presentación en fagos cribado a partir de una biblioteca de anticuerpos humanos (véase Wormstone, I. M. y col., Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43 (7), págs. 2301-2308; Carmen, S. y col., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), págs. 189-203; Siriwardena, D. y col., Opthalmology (2002) 109 (3), págs. 427-431, etc.).

Por ejemplo, se puede utilizar un procedimiento de presentación en fagos en el que se expresa una región variable de un anticuerpo humano en la superficie de un fago como un anticuerpo de cadena sencilla (scFv) y se selecciona un fago que se une a un antígeno (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), págs.1105-1116).

Al analizar el gen del fago seleccionado en función de la unión a un antígeno, se puede determinar una secuencia de ADN que codifica la región variable de un anticuerpo humano que se une a un antígeno.

Si se determina la secuencia de ADN de scFv que se une a un antígeno, se puede obtener un anticuerpo humano preparando un vector de expresión que tenga la secuencia e introduciendo el vector en un huésped adecuado para expresarlo (documentos WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388, Annu. Rev. Immunol (1994) 12, págs. 433-455, Nature Biotechnology (2005) 23 (9), págs. 1105-1116).

Los anticuerpos obtenidos mediante el procedimiento anterior se evalúan para determinar la propiedad de unirse a un antígeno mediante el procedimiento descrito en el ejemplo 25 o similar y se puede seleccionar un anticuerpo preferido. Como ejemplo de otro índice cuando se comparan las propiedades de los anticuerpos, se puede ejemplificar la estabilidad de los anticuerpos. La calorimetría diferencial de barrido (DSC) mostrada en el ejemplo 33 es un instrumento capaz de medir rápidamente y con exactitud una temperatura de punto medio de desnaturalización térmica (Tm) que es un índice favorable de estabilidad estructural relativa de proteínas. Midiendo los valores de Tm utilizando DSC y comparando los valores, se puede comparar una diferencia de la estabilidad térmica. Se sabe que la estabilidad de almacenamiento de los anticuerpos muestra cierta correlación con la estabilidad térmica de los anticuerpos (Lori Burton, y col., Pharmaceutical Development and Technology (2007) 12, págs. 265-273) y se puede seleccionar un anticuerpo preferido utilizando la estabilidad térmica como índice. Los ejemplos de otros índices para seleccionar anticuerpos incluyen los siguientes: el rendimiento en una célula huésped adecuada es alto y la capacidad de agregación en una solución acuosa es baja. Por ejemplo, un anticuerpo que muestra el mayor rendimiento no siempre muestra estabilidad térmica alta y, por lo tanto, es necesario seleccionar un anticuerpo más adecuado para administración a seres humanos realizando una evaluación exhaustiva basada en los índices mencionados anteriormente.

Además, también se conoce un procedimiento en el que las secuencias de cadena ligera y pesada de longitud completa de un anticuerpo se ligan utilizando un conector adecuado, mediante el que se obtiene una inmunoglobulina monocatenaria (Lee, H-S, y col., Molecular Immunology (1999) 36, págs. 61-71; Shirrmann, T. y col., mAbs (2010), 2, (1) págs. 1-4). Al dimerizar dicha inmunoglobulina monocatenaria, el dímero resultante puede tener una estructura y una actividad similares a las de un anticuerpo que es un tetrámero en sí mismo. Además, el anticuerpo como se desvela en el presente documento puede ser un anticuerpo que tiene una única región variable de cadena pesada y no tiene una secuencia de cadena ligera. Dicho anticuerpo se denomina anticuerpo de dominio único (sdAb) o nanocuerpo y, de hecho, se observa en camellos y llamas y se ha informado que tiene una afinidad de unión a antígenos (Muyldemans S. y col., Protein Eng. (1994) 7 (9), 1129-35, Hamers-Casterman C. y col., Nature (1993) 363 (6428) 446-8). Puede entenderse que los anticuerpos mencionados anteriormente son tipos de fragmentos funcionales del anticuerpo según la invención.

Además, controlando la glucosilación en la que un glucano se une al anticuerpo de la invención, es posible potenciar la actividad citotóxica celular dependiente de anticuerpos. En cuanto a las técnicas de control de la glucosilación de anticuerpos, se conocen los documentos WO 99/54342, WO 00/61739, WO 02/31140, etc. Sin embargo, las técnicas no se limitan a las mismas.

En los casos en los que se produzca un anticuerpo aislando en primer lugar un gen de anticuerpo e introduciendo después el gen en un huésped adecuado, se puede utilizar una combinación de un huésped adecuado y un vector de expresión adecuado. Los ejemplos específicos del gen del anticuerpo incluyen una combinación de un gen que codifica una secuencia de cadena pesada de un anticuerpo descrito en esta descripción y un gen que codifica una secuencia de cadena ligera del mismo. Cuando se transforma una célula huésped, es posible insertar el gen de secuencia de cadena pesada y el gen de secuencia de cadena ligera en el mismo vector de expresión y también en diferentes vectores de expresión por separado. En los casos en los que se utilizan células eucariotas como huésped, se pueden utilizar células animales, células vegetales o microorganismos eucariotas. Como células animales, se pueden ejemplificar (1) células de mamíferos, por ejemplo, cepas deficientes en dihidrofolato reductasa (Urlaub, G. y Chasin, L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, págs. 4126-4220) de células COS de simio (Gluzman, Y., Cell, (1981) 23, págs. 175-182, ATCC CRL-1650), fibroblastos murinos NIH3T3 (ATCC n.° CRL-1658) y células de ovario de hámster chino (células CHO; ATCC: CCL-61). Además, en casos en los que se utilicen células procariotas, por ejemplo, se pueden ejemplificar Escherichia coli y Bacillus subtilis. Introduciendo un gen de anticuerpo diana en estas células mediante transformación y cultivando las células transformadas de este modo in vitro, se puede obtener el anticuerpo. En el procedimiento de cultivo mencionado anteriormente, el rendimiento puede variar en ocasiones dependiendo de la secuencia del anticuerpo y, por lo tanto, es posible seleccionar uno que se produzca fácilmente como producto farmacéutico utilizando el rendimiento como índice entre los anticuerpos que tienen una actividad de unión comparable.

No hay limitación sobre el isotipo del anticuerpo de la invención y los ejemplos del mismo incluyen IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA (IgA1, IgA2), IgD e IgE, y los ejemplos preferidos de los mismos incluyen IgG e IgM y, además, los ejemplos más preferidos de los mismos incluyen IgG1 e IgG2.

Además, el anticuerpo de la invención puede ser un fragmento funcional del anticuerpo que tiene un sitio de unión a antígeno del anticuerpo o un fragmento modificado del mismo. El fragmento del anticuerpo puede obtenerse tratando el anticuerpo con una proteasa tal como papaína o pepsina, o modificando el gen del anticuerpo según una técnica de ingeniería genética y expresando el gen modificado en células cultivadas adecuadas. Entre estos fragmentos de anticuerpos, un fragmento que tiene todas o parte de las funciones de la molécula de longitud completa del anticuerpo puede denominarse fragmento funcional del anticuerpo. Como funciones del anticuerpo, en general se puede ejemplificar una actividad de unión a antígeno, una actividad de neutralización de la actividad de un antígeno, una actividad de aumento de la actividad de un antígeno, una actividad citotóxica dependiente de anticuerpos, una actividad citotóxica dependiente del complemento y una actividad citotóxica celular dependiente del complemento. La función del fragmento funcional del anticuerpo según la invención es una actividad de unión a Siglec-15, preferentemente una actividad de inhibición de la formación de osteoclastos, más preferentemente una actividad de inhibición del proceso de fusión celular de osteoclastos.

Los ejemplos del fragmento del anticuerpo incluyen Fab, F(ab')2, Fv, Fv monocatenario (scFv) en el que las moléculas de Fv de la cadena pesada y la cadena ligera se ligan a través de un conector adecuado, un diacuerpo (diacuerpos), un anticuerpo lineal y un anticuerpo poliespecífico compuesto por el fragmento de anticuerpo. Además, Fab', que es un fragmento monovalente en una región variable de un anticuerpo obtenido tratando F(ab')2 en condiciones reductoras, también se considera un fragmento del anticuerpo.

Además, el anticuerpo de la invención puede ser un anticuerpo poliespecífico con especificidad por al menos dos antígenos diferentes. En general, dicha molécula se une a dos antígenos (es decir, un anticuerpo biespecífico), sin embargo, el "anticuerpo poliespecífico" como se usa en el presente documento incluye un anticuerpo que tiene especificidad por dos o más (por ejemplo, tres) antígenos.

El anticuerpo poliespecífico de la invención puede ser un anticuerpo de longitud completa o un fragmento de dicho anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico F(ab')2). El anticuerpo biespecífico puede producirse ligando las cadenas pesadas y ligeras (pares HL) de dos tipos de anticuerpos o también puede producirse fusionando hibridomas que producen diferentes anticuerpos monoclonales para preparar células fusionadas productoras de anticuerpos biespecíficos (Millstein y col., Nature (1983) 305, págs. 537-539).

El anticuerpo de la invención puede ser un anticuerpo monocatenario (también denominado scFv). El anticuerpo monocatenario se puede obtener ligando la región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera de un anticuerpo a través de un conector polipeptídico (Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113 (editado por Rosenburg y Moore, Springer Verlag, Nueva York, págs. 269-315 (1994), Nature Biotechnology (2005), 23, págs. 1126-1136). Además, también se puede utilizar como anticuerpo biespecífico un fragmento BiscFv producido mediante la ligadura de dos moléculas de scFv mediante un conector polipeptídico.

El procedimiento de producción de un anticuerpo monocatenario se conoce en este campo técnico (véase, por ejemplo, patentes de los Estados Unidos n.° 4.946.778, 5.260.203, 5.091.513, 5.455.030, etc.). En este scFv, la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera se ligan mediante un conector que no forma un conjugado, preferentemente a través de un conector polipeptídico (Huston, J. S. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988), 85, págs. 5879-5883). En el scFv, la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera pueden proceder del mismo anticuerpo o de diferentes anticuerpos.

Como conector polipeptídico que se va a utilizar para ligar las regiones variables, por ejemplo, se utiliza un péptido monocatenario dado compuesto por 12 a 19 restos.

Puede obtenerse ADN que codifica scFv realizando amplificación utilizando un ADN que codifica la secuencia de aminoácidos completa, o una secuencia de aminoácidos parcial deseada, seleccionado de la cadena pesada o la región variable de cadena pesada del anticuerpo mencionado anteriormente y la cadena ligera o la región variable de cadena ligera del mismo como molde mediante un procedimiento de PCR utilizando un par de cebadores que define ambos extremos del mismo, y realizando además amplificación al combinar un ADN que codifica una parte de conector polipeptídico y un par de cebadores que define ambos extremos del mismo para ligar ambos extremos a la cadena pesada y la cadena ligera, respectivamente.

Además, una vez que se ha producido ADN que codifica scFv, se puede obtener un vector de expresión que lo contiene y un huésped transformado por el vector de expresión según procedimientos habituales. Además, utilizando el huésped resultante, se puede obtener scFv según procedimientos habituales. Puede producirse un fragmento de anticuerpo del mismo en un huésped obteniendo un gen y expresando el gen de la misma manera que se ha descrito anteriormente.

El anticuerpo de la invención se puede multimerizar para aumentar su afinidad por un antígeno. El anticuerpo que se va a multimerizar puede ser un tipo de anticuerpo o una pluralidad de anticuerpos que reconocen una pluralidad de epítopos del mismo antígeno. Como procedimiento de multimerización del anticuerpo, se puede ejemplificar la unión del dominio CH3 de IgG a dos moléculas de scFv, unión a estreptavidina, introducción de un motivo de hélice-vueltahélice y similares.

El anticuerpo como se describe en el presente documento puede ser un anticuerpo policlonal que es una mezcla de múltiples tipos de anticuerpos anti-Siglec-15 que tienen diferentes secuencias de aminoácidos. Como ejemplo del anticuerpo policlonal, se puede ejemplificar una mezcla de múltiples tipos de anticuerpos que tienen diferentes CDR. Como dicho anticuerpo policlonal, se cultiva una mezcla de células que producen diferentes anticuerpos y se puede utilizar un anticuerpo purificado del cultivo resultante (véase documento WO 2004/061104).

Como anticuerpo modificado, también se puede utilizar un anticuerpo unido a cualquiera de diversos tipos de moléculas tales como polietilenglicol (PEG).

Además, el anticuerpo de la invención puede estar en forma de un conjugado formado entre cualquiera de estos anticuerpos y otro agente medicinal (inmunoconjugado). Los ejemplos de dicho anticuerpo incluyen uno en el que el anticuerpo está conjugado con un material radiactivo o un compuesto que tiene una acción farmacológica (Nature Biotechnology (2005) 23, págs. 1137-1146).

El anticuerpo obtenido se puede purificar hasta su homogeneidad. La separación y purificación del anticuerpo se puede realizar empleando un procedimiento convencional de separación y purificación de proteínas. Por ejemplo, el anticuerpo puede separarse y purificarse seleccionando y combinando adecuadamente la cromatografía en columna, filtración por filtro, ultrafiltración, precipitación con sales, diálisis, electroforesis preparativa en gel de poliacrilamida, electroforesis de isoelectroenfoque y similares (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak y col. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow y David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), pero el procedimiento no se limita a lo anterior.

Los ejemplos de dicha cromatografía incluyen cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrófoba, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de fase inversa y cromatografía de adsorción.

Dicha cromatografía se puede realizar empleando cromatografía líquida tal como HPLC o FPLC.

Como columna para utilizar en cromatografía de afinidad, se pueden ejemplificar una columna de proteína A y una columna de proteína G.

Por ejemplo, como una columna que utiliza una columna de proteína A, se pueden ejemplificar Hyper D, POROS, Sepharose FF (Pharmacia) y similares.

Además, mediante el uso de un vehículo que tiene un antígeno inmovilizado en el mismo, el anticuerpo también puede purificarse utilizando la propiedad de unión del anticuerpo al antígeno.

4. Producto farmacéutico que contiene anticuerpo anti-Siglec-15

De los anticuerpos anti-Siglec-15 obtenidos por el procedimiento descrito en el artículo anterior "3. Producción de anticuerpo anti-Siglec-15", se puede obtener un anticuerpo que neutraliza la actividad biológica de Siglec-15. Dicho anticuerpo que neutraliza la actividad biológica de Siglec-15 inhibe la actividad biológica de Siglec-15 in vivo, es decir, la diferenciación y/o maduración de osteoclastos y, por lo tanto, puede usarse como un agente terapéutico y/o preventivo para el metabolismo óseo anómalo causado por diferenciación anómala y/o maduración de osteoclastos como un producto farmacéutico. El metabolismo óseo anómalo puede ser cualquier trastorno caracterizado por pérdida ósea neta (osteopenia u osteólisis). En general, el tratamiento y/o la prevención con el anticuerpo anti-Siglec-15 se aplican a un caso en el que es necesaria la inhibición de la reabsorción ósea. Los ejemplos del metabolismo óseo anómalo que pueden tratarse y/o prevenirse con el anticuerpo anti-Siglec-15 incluyen osteoporosis (osteoporosis posmenopáusica, osteoporosis senil, osteoporosis secundaria debida al uso de un agente terapéutico, tal como un esteroide o un inmunosupresor, u osteoporosis que acompaña a la artritis reumatoide), destrucción ósea que acompaña a la artritis reumatoide, hipercalcemia cancerosa, destrucción ósea que acompaña al mieloma múltiple o metástasis del cáncer al hueso, tumor de células gigantes, osteopenia, pérdida de dientes debida a periodontitis, osteólisis alrededor de una articulación protésica, destrucción ósea en osteomielitis crónica, enfermedad ósea de Paget, osteodistrofia renal y osteogénesis imperfecta, sin embargo, el metabolismo óseo anómalo no se limita a los mismos siempre que sea una enfermedad acompañada de pérdida ósea neta provocada por osteoclastos. Los ejemplos del anticuerpo anti-Siglec-15 para usar como el producto farmacéutico mencionado anteriormente incluyen un anticuerpo quimérico y un anticuerpo humanizado producido a partir del anticuerpo #32A1 mediante el procedimiento descrito en el artículo 3. "(3) Otros anticuerpos". Además, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado y un anticuerpo humano que comparten el mismo epítopo que el anticuerpo #32A1 también pueden usarse como producto farmacéutico. Se puede confirmar si un determinado anticuerpo anti-Siglec-15 comparte el mismo epítopo que el anticuerpo #32A1 observando si estos anticuerpos se unen o no al mismo péptido parcial específico de Siglec-15. Además, también se puede determinar que si un determinado anticuerpo anti-Siglec-15 compite con el anticuerpo #32A1 por la unión a Siglec-15, estos anticuerpos comparten el mismo epítopo.

La actividad in vitro del anticuerpo anti-Siglec-15 de neutralización de la actividad biológica de Siglec-15 se puede determinar mediante, por ejemplo, la actividad de inhibición de la diferenciación de las células que sobreexpresan Siglec-15 en osteoclastos. Por ejemplo, el anticuerpo anti-Siglec-15 se añade a células RAW 264.7 o células RAW 264 que son una línea celular derivada de monocitos de ratón a diversas concentraciones y se puede determinar la actividad de inhibición de la diferenciación en osteoclastos mediante estimulación con RANKL o TNF-a. Además, el anticuerpo anti-Siglec-15 se añade a células cultivadas primarias procedentes de la médula ósea a diversas concentraciones y se puede determinar la actividad de inhibición de la diferenciación en osteoclastos mediante estimulación con RANKL, TNF-a o vitamina D3 activa. Además, el anticuerpo anti-Siglec-15 se añade a células precursoras de osteoclastos humanos normales (células precursoras de osteoclastos naturales humanos normales, disponible en Sanko Junyaku Co., Ltd., cat. n.° 2T-110) a diversas concentraciones, y se puede determinar la actividad de inhibición de la diferenciación en osteoclastos mediante estimulación con RANKL o M-CSF. Dicho efecto inhibidor sobre la diferenciación de osteoclastos se puede determinar usando la inhibición de la actividad de la fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP) de los osteoclastos como índice. Además, también se puede determinar el efecto inhibidor sobre la diferenciación de osteoclastos mediante el uso de la inhibición de la formación de osteoclastos multinucleados TRAP-positivos, es decir, la inhibición de la fusión celular de los osteoclastos como índice. Además, en un experimento que utiliza un ensayo de fosas (Takada y col., Bone and Mineral, (1992) 17, 347-359) usando células procedentes de fémur y/o tibia, se puede determinar la actividad in vitro de inhibición de la reabsorción ósea por osteoclastos añadiendo el anticuerpo anti-Siglec-15 a células procedentes de fémur y/o tibia a diversas concentraciones, y observando la formación de fosas en un corte de dentina. Como sistema para determinar la actividad in vitro de inhibición de la reabsorción ósea por osteoclastos, también es posible usar una placa recubierta con colágeno humano conjugado con europio. El efecto terapéutico o preventivo in vivo del anticuerpo anti-Siglec-15 sobre el metabolismo óseo anómalo usando un animal experimental puede confirmarse administrando el anticuerpo anti-Siglec-15 a un modelo animal de osteoporosis o un animal transgénico que sobreexpresa Siglec-15 y midiendo cualquier cambio en los osteoclastos.

El anticuerpo obtenido de este modo que neutraliza la actividad biológica de Siglec-15 es útil como producto farmacéutico, en particular como una composición farmacéutica para tratar o prevenir el metabolismo óseo anómalo tal como la osteoporosis, destrucción ósea que acompaña a la artritis reumatoide o destrucción ósea que acompaña a la metástasis del cáncer al hueso, o como anticuerpo para el diagnóstico inmunológico de dicha enfermedad.

En el tratamiento de la artritis reumatoide (AR), un problema importante es la pérdida ósea que acompaña a la aparición de la enfermedad. Se ha informado de que en esta pérdida ósea que acompaña a la AR, los osteoclastos desempeñan una función primordial. Las citocinas consideradas más importantes para la inducción (diferenciación y maduración) y activación de osteoclastos y como causantes de destrucción ósea en la AR son RANKL y TNF-a (Romas E. y col., Bone 30, págs. 340-346, 2002). OCIF/OPG, que es un receptor señuelo para RANKL, puede inhibir la formación de osteoclastos inducida por RANKL pero no inhibe la formación de osteoclastos inducida por TNF-a. Por otro lado, el anticuerpo anti-Siglec-15 según la invención inhibió eficazmente la formación de osteoclastos inducida tanto por RANKL como por TNF-a. Por lo tanto, se espera que el anticuerpo anti-Siglec-15 de la invención pueda inhibir la pérdida ósea y la destrucción ósea inducida por TNF-a en AR o similares con más fuerza que un bloqueador de RANKL (OCIF/OPG, un anticuerpo anti-RANKL o similares).

Como ejemplo, para el tratamiento o la prevención del metabolismo óseo anómalo, el anticuerpo anti-Siglec-15 se puede administrar solo o en combinación con al menos otro agente terapéutico para una enfermedad relacionada con los huesos. Como otro ejemplo, el anticuerpo anti-Siglec-15 se puede administrar en combinación con una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente terapéutico para el metabolismo óseo anómalo. Los ejemplos del agente terapéutico que se pueden administrar en combinación con el anticuerpo anti-Siglec-15 incluyen, pero sin limitación: bisfosfonatos (por ejemplo, alendronato, etidronato, ibandronato, incadronato, pamidronato, risedronato y zoledronato), vitamina D3 activa, calcitonina y derivados de la misma, hormonas tales como estradiol, MSRE (moduladores selectivos de los receptores de estrógenos), ipriflavona, vitamina K2 (menatetrenona), preparaciones de calcio, PTH (hormona paratiroidea), agentes antiinflamatorios no esteroideos (por ejemplo, celecoxib y rofecoxib), receptores de TNF solubles (por ejemplo, etanercept), anticuerpos anti-TNF-a o fragmentos funcionales de los anticuerpos (por ejemplo, infliximab), anticuerpos anti-PTHrP (proteína relacionada con la hormona paratiroidea) o fragmentos funcionales de los anticuerpos, antagonistas del receptor de IL-1 (por ejemplo, anakinra), anticuerpos anti receptor de IL-6 o fragmentos funcionales de los anticuerpos (por ejemplo, tocilizumab), anticuerpos anti-RANKL o fragmentos funcionales de los anticuerpos (por ejemplo, denosumab) y OCIF (factor inhibidor de la osteoclastogénesis). Dependiendo del estado del metabolismo óseo anómalo o del grado de tratamiento y/o prevención previsto, se pueden administrar dos o tres o más tipos de agentes medicinales, y estos agentes medicinales se pueden suministrar todos juntos encapsulándolos en la misma preparación. Estos agentes medicinales y el anticuerpo anti-Siglec-15 se pueden suministrar todos juntos encapsulándolos en la misma preparación. Además, estos agentes medicinales se pueden suministrar todos juntos encapsulándolos como un kit para usar en el tratamiento y/o la prevención. Además, estos agentes medicinales y el anticuerpo anti-Siglec-15 se pueden suministrar por separado. En el caso de la administración en terapia génica, un gen de un agente terapéutico proteico para una enfermedad ósea y un gen del anticuerpo anti-Siglec-15 pueden insertarse corriente abajo de la misma región promotora o diferentes regiones promotoras y pueden introducirse en el mismo vector o en diferentes vectores.

Al conjugar un agente terapéutico para una enfermedad ósea con el anticuerpo anti-Siglec-15 o un fragmento del mismo, puede producirse un conjugado de fármaco dirigido como se describe en M. C. Garnet "Targeted drug conjugates: principles and progress", Advanced Drug Delivery Reviews, (2001) 53, 171-216. Para lograr este fin, aparte de la molécula de anticuerpo, se puede aplicar cualquier fragmento de anticuerpo siempre que no pierda por completo la capacidad de reconocer osteoclastos, y los ejemplos del mismo incluyen fragmentos tales como Fab, F(ab')2 y Fv. En la invención, el anticuerpo y el fragmento se pueden usar de la misma manera. El conjugado formado por el anticuerpo anti-Siglec-15 o un fragmento del mismo y un agente terapéutico para una enfermedad ósea puede ser cualquiera de diversas formas descritas en M. C. Garnet "Targeted drug conjugates: principles and progress", Advanced Drug Delivery Reviews, (2001) 53, 171-216, G. T. Hermanson "Bioconjugate Techniques" Academic Press, California (1996), Putnam y J. Kopecek "Polymer Conjugates with Anticancer Activity" Advances in Polymer Science (1995) 122, 55-123 y similares. Es decir, se puede ejemplificar un conjugado en el que el anticuerpo anti-Siglec-15 y un agente terapéutico para una enfermedad ósea se conjugan entre sí química y directamente o mediante un espaciador tal como un oligopéptido y un conjugado formado mediante un vehículo farmacológico apropiado. Los ejemplos del vehículo farmacológico incluyen un liposoma y un polímero hidrosoluble. Ejemplos más específicos del conjugado formado a través de dicho vehículo farmacológico incluyen un conjugado en el que el anticuerpo y un agente terapéutico para una enfermedad ósea se incorporan en un liposoma y el liposoma y el anticuerpo se conjugan entre sí, y un conjugado en el que un agente terapéutico para una enfermedad ósea se conjuga con un polímero hidrosoluble (un compuesto que tiene un peso molecular de aproximadamente 1000 a 100000) química y directamente o mediante un espaciador, tal como un oligopéptido, y el anticuerpo se conjuga con el polímero hidrosoluble. La conjugación del anticuerpo (o un fragmento del mismo) con un agente terapéutico para una enfermedad ósea o un vehículo farmacológico, tal como un liposoma o un polímero hidrosoluble, se puede realizar mediante un procedimiento conocido por los expertos en la materia, tal como el procedimiento descrito en G. T. Hermanson "Bioconjugate Techniques" Academic Press, California (1996), Putnam y J. Kopecek "Polymer Conjugates with Anticancer Activity" Advances in Polymer Science (1995) 122, 55-123. La incorporación de un agente terapéutico para una enfermedad ósea en un liposoma se puede efectuar mediante un procedimiento conocido por los expertos en la materia, tal como el procedimiento descrito en D. D. Lasic "Liposomes: From Physics to Applications" Elsevier Science Publishers B. V., Ámsterdam (1993) o similares. La conjugación de un agente terapéutico para una enfermedad ósea con un polímero hidrosoluble se puede efectuar mediante un procedimiento conocido por los expertos en la materia, tal como el procedimiento descrito en D. Putnam y J. Kopecek "Polymer Conjugates with Anticancer Activity" Advances in Polymer Science (1995) 122, 55-123. Se puede producir un conjugado del anticuerpo (o un fragmento del mismo) y un agente terapéutico proteico para una enfermedad ósea (o un fragmento del mismo) mediante procedimientos conocidos por los expertos en la materia mediante ingeniería genética diferente al procedimiento mencionado anteriormente.

La invención también proporciona una composición farmacéutica que contiene una cantidad terapéutica y/o preventivamente eficaz del anticuerpo anti-Siglec-15 y un diluyente, vehículo, agente solubilizante, agente emulsionante, conservante y/o adyuvante farmacéuticamente aceptables.

La invención también proporciona una composición farmacéutica que contiene una cantidad terapéutica y/o preventivamente eficaz del anticuerpo anti-Siglec-15, una cantidad terapéutica y/o preventivamente eficaz de al menos un agente terapéutico para una enfermedad ósea y un diluyente, vehículo, agente solubilizante, agente emulsionante, conservante y/o adyuvante farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos del agente terapéutico para una enfermedad ósea incluyen, pero sin limitación, bisfosfonatos (por ejemplo, alendronato, etidronato, ibandronato, incadronato, pamidronato, risedronato y zoledronato), vitamina D3 activa, calcitonina y derivados de la misma, hormonas tales como estradiol, MSRE (moduladores selectivos de los receptores de estrógenos), ipriflavona, vitamina K2 (menatetrenona), preparaciones de calcio, PTH (hormona paratiroidea), agentes antiinflamatorios no esteroideos (por ejemplo, celecoxib y rofecoxib), receptores de TNF solubles (por ejemplo, etanercept), anticuerpos anti-TNF-a o fragmentos funcionales de los anticuerpos (por ejemplo, infliximab), anticuerpos anti-PTHrP (proteína relacionada con la hormona paratiroidea) o fragmentos funcionales de los anticuerpos, antagonistas del receptor de IL-1 (por ejemplo, anakinra), anticuerpos anti-receptor de IL-6 o fragmentos funcionales de los anticuerpos (por ejemplo, tocilizumab), anticuerpos anti-RANKL o fragmentos funcionales de los anticuerpos (por ejemplo, denosumab) y OCIF (factor inhibidor de la osteoclastogénesis).

Una sustancia para utilizar en una preparación aceptable en la composición farmacéutica según la invención es preferentemente no tóxica para una persona a la que se va a administrar la composición farmacéutica en términos de dosis y concentración.

La composición farmacéutica de la invención puede contener una sustancia para uso farmacéutico que sea capaz de cambiar o mantener el pH, la presión osmótica, la viscosidad, la transparencia, el color, la isotonicidad, la condición aséptica, la estabilidad, la solubilidad, la tasa de liberación, la tasa de absorción y la permeabilidad de la misma. Los ejemplos de dicha sustancia para uso farmacéutico incluyen, pero sin limitación, aminoácidos tales como glicina, alanina, glutamina, asparagina, arginina y lisina; agentes antimicrobianos; antioxidantes tales como ácido ascórbico, sulfato de sodio e hidrogenosulfito de sodio; tampones tales como tampones de fosfato, citrato, borato, soluciones de hidrogenocarbonato de sodio y Tris-HCl; cargas tales como manitol y glicina; agentes quelantes tales como tetraacetato de etilendiamina (EDTA); agentes de formación de complejos tales como cafeína, polivinilpirrolidina, pciclodextrina e hidroxipropil-p-ciclodextrina; expansores tales como glucosa, manosa y dextrina; otros hidratos de carbono tales como monosacáridos y disacáridos; agentes colorantes; aromas; diluyentes; agentes emulsionantes; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidina; conservantes tales como polipéptidos de bajo peso molecular, contraiones formadores de sales, cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, alcohol fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico y peróxido de hidrógeno; disolventes tales como glicerina, propilenglicol y polietilenglicol; alcoholes de azúcares tales como manitol y sorbitol; agentes de suspensión; tensioactivos tales como éster de sorbitano, polisorbatos, incluyendo polisorbato 20 y polisorbato 80, Triton, trometamina, lecitina y colesterol; agentes potenciadores de la estabilidad tales como sacarosa y sorbitol; agentes potenciadores de la elasticidad tales como cloruro de sodio, cloruro de potasio, y manitol y sorbitol; agentes de transporte; excipientes; y/o adyuvantes farmacéuticos. La cantidad de estas sustancias añadidas para uso farmacéutico es preferentemente de 0,01 a 100 veces, en particular, preferentemente de 0,1 a 10 veces el peso del anticuerpo anti-Siglec-15. Los expertos en la materia pueden determinar de manera adecuada una formulación preferida de la composición farmacéutica en una preparación dependiendo de la enfermedad a la que se aplique la composición, la vía de administración que se va a aplicar o similares.

El excipiente o vehículo en la composición farmacéutica puede estar en forma de líquido o sólido. Un excipiente o vehículo adecuado puede ser agua inyectable, solución salina fisiológica, un líquido cefalorraquídeo artificial u otra sustancia utilizada habitualmente para administración parenteral. Además, también se puede utilizar como vehículo solución salina fisiológica neutra o solución salina fisiológica que contiene seroalbúmina. La composición farmacéutica puede contener un tampón de Tris de pH 7,0 a 8,5, un tampón de acetato de pH 4,0 a 5,5 o un tampón de citrato de pH 3,0 a 6,2. Además, dicho tampón puede complementarse con sorbitol u otro compuesto. Los ejemplos de la composición farmacéutica de la invención incluyen una composición farmacéutica que contiene el anticuerpo anti-Siglec-15 y una composición farmacéutica que contiene el anticuerpo anti-Siglec-15 y al menos un agente terapéutico para una enfermedad ósea. La composición farmacéutica de la invención se prepara en forma de producto liofilizado o líquido como agente medicinal que tiene una composición seleccionada y una pureza requerida. La composición farmacéutica que contiene el anticuerpo anti-Siglec-15 y la composición farmacéutica que contiene el anticuerpo anti-Siglec-15 y al menos un agente terapéutico para el metabolismo óseo anómalo también se pueden transformar en un producto liofilizado utilizando un excipiente adecuado tal como sacarosa.

La composición farmacéutica de la invención se puede preparar para administración parenteral o para absorción gastrointestinal mediante administración oral. La composición y concentración de una preparación se pueden determinar dependiendo del procedimiento de administración. Cuanto mayor sea la afinidad del anticuerpo anti-Siglec-15 contenido en la composición farmacéutica de la invención por Siglec-15, es decir, cuanto menor sea la constante de disociación (valor Kd) del mismo para Siglec-15, más puede mostrar el anticuerpo anti-Siglec-15 su eficacia farmacológica, incluso cuando se reduce la dosis para seres humanos. Por tanto, la dosis de la composición farmacéutica de la invención para seres humanos también se puede determinar basándose en esta consideración. En cuanto a la dosis, en el caso de que se administre un anticuerpo humano anti-Siglec-15 a seres humanos, el anticuerpo se puede administrar a una dosis de aproximadamente 0,1 a 100 mg/kg una vez cada uno a 180 días.

Los ejemplos de la forma de dosificación de la composición farmacéutica de la invención incluyen inyecciones, incluyendo infusiones, supositorios, agentes transnasales, agentes sublinguales y absorbentes percutáneos.

Ejemplos

En lo sucesivo en el presente documento, la invención se describirá más específicamente con referencia a los ejemplos, sin embargo, la invención no se limita a los mismos. Obsérvese que las operaciones respectivas con respecto a la manipulación génica en los siguientes ejemplos se realizaron según los procedimientos descritos en "Molecular Cloning" (escrito por Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T., publicado por Cold Spring Harbor Laboratory Press en 1989) o, en el caso de utilizar reactivos o equipos disponibles en el mercado, se utilizan de acuerdo con los protocolos adjuntos a ellas a menos que se indique lo contrario.

Ejemplo 1

Producción de construcción de expresión de la proteína Siglec-15 de ratón soluble

Una secuencia de nucleótidos parcial que codifica el dominio extracelular de la proteína Siglec-15 de ratón está representada por la SEQ ID NO: 5 en el listado de secuencias y una secuencia de aminoácidos de la misma está representada por la SEQ ID NO: 6 en el listado de secuencias. Al utilizar dicha secuencia parcial, la proteína Siglec-15 de ratón soluble se puede producir en un sobrenadante de cultivo de una célula animal o similar.

a) Amplificación del gen de Siglec-15 de ratón soluble mediante PCR

Como cebadores para amplificar el ADNc del dominio extracelular de Siglec-15 de ratón mediante PCR, se sintetizaron un oligonucleótido que tiene una secuencia de 5'-ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt caccATGGAG GGGTCCCTCC AACTC-3' (mSiglec-15-ECD-F: SEQ ID NO: 7 en el listado de secuencias); y un oligonucleótido que tiene una secuencia de 5'-ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc TCCGGGGGCG CCGTGGAAGC GGAAC-3' (mSiglec-15-ECD-R: SEQ ID NO: 8 en el listado de secuencias) según un procedimiento habitual. En relación con esto, estos cebadores se diseñaron como cebadores de amplificación para producir un clon de entrada Gateway, de manera que se añade una secuencia attB1 a mSiglec-15-ECD-F y se añade una secuencia attB2 a mSiglec-15-ECD-R. La p Cr se realizó utilizando esta combinación de cebadores y un polinucleótido que contenía una secuencia de marco de lectura abierto de la Siglec-15 de ratón como molde según un procedimiento habitual. Las condiciones para un termociclador se establecieron de la siguiente manera: después de calentar a 94 °C durante 5 minutos, se repitió un ciclo de temperatura de "94 °C durante 0,5 minutos, 55 °C durante 0,5 minutos y 68 °C durante 1,5 minutos" 15 veces, seguido de calentamiento a 68 °C durante 5 minutos e incubación a 4 °C.

b) Producción de clon de entrada por reacción Gateway BP

Se produjo un clon de entrada en el que se integró el ADNc del dominio extracelular de Siglec-15 de ratón mediante la tecnología Gateway (Invitrogen, Inc.) empleando un sistema de recombinación específico de sitio del fago lambda mediante el siguiente procedimiento. En primer lugar, se realizó una reacción de BP usando BP clonasa entre el producto de PCR que tiene una secuencia attB en ambos extremos producida en a) y pDNOR221 (fabricado por Invitrogen, Inc.) que es un vector donante que tiene una secuencia attP. Al usar esta solución de reacción, se transformó Escherichia coli DH10B, se realizó PCR de colonias para clones resistentes a fármacos y se confirmó el tamaño de los insertos. A continuación, para un clon que se ha confirmado que tiene un inserto con el tamaño correcto, se realizó un análisis de secuencia de la secuencia de ADN total del inserto. Como resultado, se obtuvo un clon de entrada que es completamente idéntico a la secuencia de nucleótidos diana (SEQ ID NO: 5 en el listado de secuencias) que codifica el dominio extracelular de la proteína Siglec-15 de ratón.

c) Producción de clon de expresión mediante reacción Gateway LR

Se produjo un clon de expresión en el que se integró el ADNc del dominio extracelular de Siglec-15 de ratón mediante la tecnología Gateway (Invitrogen, Inc.) empleando un sistema de recombinación específico de sitio del fago lambda mediante el siguiente procedimiento. El clon de entrada producido en b) contiene un inserto que tiene una secuencia attL en ambos extremos. Se realizó una reacción LR usando LR clonasa entre este clon de entrada y dos tipos de vectores de destino que tienen una secuencia attR. En relación con esto, como vectores de destino, se usaron dos tipos de vectores de destino: pDONM diseñado de modo que se añaden un marcador de epítopo V5 y un marcador 6 x His al extremo C del inserto; y phIgFc diseñado de modo que se añada un marcador Fc humano al extremo C del inserto. Al utilizar la solución de reacción obtenida por la reacción LR, se transformó Escherichia coli DH10B y se realizó PCR de colonias para los clones resistentes a fármacos obtenidos, y se confirmó el tamaño de los insertos. A continuación, para un clon que se ha confirmado que tiene un inserto con el tamaño correcto, se realizó un análisis de secuencia de ambos extremos desde el lado del inserto hasta el lado del vector.

Secuencias de cebadores para análisis de secuencias:

5'-tgcgtgaagg tgcagggcag-3' (mSiglec-15-ECD-seq-upstm: SEQ ID NO: 9 en el listado de secuencias)

y

5'-cctcgcctgg tcgggtc-3' (mSiglec-15-ECD-seq-dnstm: SEQ ID NO: 10 en el listado de secuencias)

Como resultado del análisis de secuencia, se obtuvieron clones de expresión (Siglec-15/pDONM soluble de ratón y Siglec-15/phIgFc soluble de ratón) en los que se produjo la recombinación correcta tanto para pDONM como para phIgFc, respectivamente. Transfectando el Siglec-15/pDONM soluble de ratón en una célula animal o similar, el ARNm que tiene una secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 11 en el listado de secuencias se transcribe y traduce en una proteína (Siglec-15-His de ratón) que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 12 en el listado de secuencias. Además, transfectando el Siglec-15/phIgFc soluble de ratón en una célula animal o similar, el ARNm que tiene una secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 13 en el listado de secuencias se transcribe y traduce en una proteína (Siglec-15-Fc de ratón) que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 14 en el listado de secuencias.

Ejemplo 2

Preparación a gran escala de solución de cultivo que contiene proteína Siglec-15 soluble de ratón utilizando células 293-F

Los dos tipos de vectores de expresión (Siglec-15/pDONM de ratón soluble y Siglec-15/phIgFc soluble de ratón) obtenidos en el ejemplo 1 se prepararon en una cantidad de aproximadamente 5 mg, respectivamente. En relación con esto, en la purificación de plásmidos de Escherichia coli cultivados a gran escala, se utilizó el equipo Invitrogen PureLink HiPure Plasmid Gigaprep (fabricado por Invitrogen, Inc.). El plásmido preparado de este modo se mezcló con Opti-MEM (fabricado por Invitrogen, Inc.), la mezcla resultante se esterilizó por filtración, se le añadieron 10 ml de un reactivo de transfección 293fectin (fabricado por Invitrogen, Inc.) y la mezcla resultante se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos. Esta mezcla se añadió a células FreeStyle 293-F (fabricadas por Invitrogen, Inc.) cultivadas en matraces de Erlenmeyer de manera que la densidad celular alcanzó 1,1 x 106 células/ml x 5 l (1 l/matraz x 5 matraces) en medio de expresión FreeStyle 293 (fabricado por Invitrogen, Inc.). Después de haber sometido las células a cultivo con agitación (125 rotaciones/min) a una concentración de CO2 de 8,0 % durante 96 horas (4 días) a 37 °C, la solución de cultivo se recogió y se centrifugó para preparar un sobrenadante de cultivo. Se considera que en el sobrenadante de cultivo preparado de este modo, se expresan una proteína en la que se han añadido un marcador epitópico V5 y un marcador 6 x His al lado C-terminal del dominio extracelular de Siglec-15 de ratón (Siglec-15-His de ratón) y una proteína en la que se ha añadido un marcador Fc humano al lado C-terminal del dominio extracelular de Siglec-15 de ratón (Siglec-15-Fc de ratón), respectivamente.

Ejemplo 3

Purificación de Siglec-15-His de ratón

a) Cromatografía en columna HisTrap HP

A 2 l de la solución de cultivo de células 293F que expresan Siglec-15-His de ratón preparada en el ejemplo 2, se añadieron 225 ml de tampón 10 x (Tris 500 mM, NaCl 1,5 M, imidazol 200 mM, pH 8,0) y la mezcla resultante se agitó bien y se filtró a través de un filtro Sterivex-GV (fabricado por Millipore Co., Ltd ). Esta solución de cultivo se aplicó a un caudal de 2 ml/min a una columna que comprendía tres columnas HisTrap HP de 5 ml (fabricadas por Amersham Biosciences, Inc.) conectadas en serie y se trató previamente con un agente de eliminación de pirógenos PyroCLEAN (fabricado por ALerCHEK, Inc.) y se lavó con agua destilada para inyección. Después de lavar la columna con 60 ml de tampón Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) que contenía NaCl 300 mM a un caudal de 1 ml/min, se eluyó una proteína adsorbida en la columna con 50 ml de tampón Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) que contenía NaCl 300 mM e imidazol 500 mM a un caudal de 1 ml/min. El eluido se fraccionó a 1 ml por fracción en tubos Minisorp (fabricados por Nunc, Inc.) a los que se habían añadido previamente 10 pl de Tween 20 al 10 %. Después de concentrarse aproximadamente 20 ml de una solución obtenida al combinar las fracciones (fracciones 14 a 20) y que contenía la proteína eluida a 2,5 ml con un concentrador de membrana centrífuga Amicon Ultra-15 (fabricado por Millipore Co., Ltd.), el concentrado se aplicó a una columna de desalación PD-10 (fabricada por Amersham Biosciences, Inc.) que se había equilibrado previamente con solución salina tamponada con fosfato que contenía Tween 20 al 0,01 % (T-PBS), seguido de elución con T-PBS, de modo que se obtuvieron 3,5 ml de una muestra cuyo disolvente se reemplazó por T-PBS.

b) Cromatografía en columna Resource Q

A 3,5 ml de la muestra que se purificó mediante cromatografía en columna HisTrap HP y cuyo disolvente se reemplazó por T-PBS, se añadieron 22,5 ml de tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) que contenía ChAp S al 0,1 % y se agitó la mezcla resultante. A continuación, la mezcla se centrifugó a 4 °C durante 30 minutos a 3000 rpm y se eliminó el precipitado. Después de filtrar el sobrenadante resultante a través de un filtro Millex-GV (fabricado por Millipore Co., Ltd ), el filtrado se aplicó a un caudal de 1 ml/min a una columna Resource Q de 6 ml (fabricada por Amersham Biosciences, Inc.) que se había equilibrado previamente con tampón de Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) que contenía CHAPS al 0,1 %. A continuación, se lavó la columna con este tampón a un caudal de 1 ml/min y se recogió una fracción de proteína que no se adsorbió en la columna. Se eluyó una proteína adsorbida en la columna con tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) que contenía CHAPS al 0,1 % y NaCl 1 M a un caudal de 1 ml/min. Después de concentrar 26,5 ml de la fracción que no se adsorbió en la columna hasta 2,0 ml con un concentrador de membrana centrífugo Amicon Ultra-15 (fabricado por Millipore Co., Ltd.), el concentrado se centrifugó a 4 °C durante 10 minutos a 3000 rpm y se eliminó el precipitado. El sobrenadante después de la centrifugación se crioconservó a -80 °C hasta su uso. El procedimiento de purificación mencionado anteriormente (cromatografía en columna HisTrap HP y cromatografía en columna Resource Q) se realizó repitiéndolo dos veces.

c) Detección y ensayo de pureza de Siglec-15-His de ratón purificada

Utilizando una muestra preparada mediante el procedimiento de purificación mencionado anteriormente (cromatografía en columna HisTrap HP y cromatografía en columna Resource Q), se realizaron electroforesis de SDS-poliacrilamida en condiciones reductoras y tinción de plata. Es decir, a 5 pl de cada una de las muestras purificadas mediante las etapas de purificación respectivas, se añadió una cantidad equivalente de una solución de tratamiento de SDS y la mezcla resultante se trató térmicamente a 95 °C durante 10 minutos. Se utilizaron 0,3 pl de cada una de las muestras tratadas térmicamente para electroforesis de poliacrilamida-SDS. Como gel para electroforesis, se utilizó un gel en gradiente de poliacrilamida de 8-25 % (fabricado por Amersham Biosciences, Inc.) y la electroforesis se realizó utilizando PhastSystem (fabricado por Amersham Biosciences, Inc.). Además, como marcadores de peso molecular, se utilizaron marcadores de peso molecular Rainbow (fabricados por Amersham Biosciences, Inc.). Después de completar la electroforesis, se realizó tinción de plata utilizando el equipo de plata PhastGel (fabricado por Amersham Biosciences, Inc.) y PhastSystem. Los resultados se muestran en la fig. 1. Se mostró que una proteína que tenía un peso molecular de aproximadamente 35 kDa (Siglec-15-His de ratón) se purificó de manera eficaz y se concentró en la fracción de proteína que no se adsorbió en la columna Resource Q.

Se realizó electroforesis en las mismas condiciones, excepto que se usaron marcadores de transferencia de Western ECL DualVue (fabricados por Amersham Biosciences, Inc.) como marcadores de peso molecular, y la proteína en el gel se transfirió a una membrana de PVDF (Hybond-P, fabricado por Amersham Biosciences, Inc.) utilizando un equipo de transferencia semiseca PhastTransfer (fabricado por Amersham Biosciences, Inc.) y PhastSystem. Esta membrana de PVDF se agitó suavemente en 10 ml de un agente de bloqueo (BlockAce, fabricado por Snow Brand Milk Products, Co., Ltd.) que contiene Tween 20 al 0,1 % a temperatura ambiente durante 1 hora. A esta solución de bloqueo, se añadieron 10 pl de proteína S HRP (fabricada por Amersham Biosciences, Inc.) y 10 pl de un anticuerpo anti-V5-HRP (anticuerpo monoclonal contra Pk-TAG-HRP, fabricado por Acris Antibodies) y la membrana en la solución se agitó suavemente a temperatura ambiente durante 1 hora más. La membrana de PVDF se lavó 4 veces agitándola suavemente en 50 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía Tween 20 al 0,01 % durante 5 minutos. Después del lavado, la membrana de PVDF se trató según el protocolo que acompaña a un equipo de detección de ECL (fabricado por Amersham Biosciences, Inc.) para revelar el color de la banda de la proteína y el color revelado se detectó utilizando una mini-cámara ECL (fabricada por Amersham Biosciences, Inc.) y película Polaroid (Polapan 3200B, fabricada por Polaroid, Inc.). Los resultados se muestran en la fig. 2. También a partir de estos resultados, se pudo confirmar que una proteína que tiene un peso molecular de aproximadamente 35 kDa (Siglec-15-His de ratón) y que reacciona con un anticuerpo anti-V5-HRP se purificó de manera eficaz y se concentró en la fracción de proteína que no se adsorbió en la columna Resource Q.

d) Medición de la concentración de proteínas de Siglec-15-His de ratón purificada

Para la Siglec-15-His de ratón purificada (la fracción de proteína que no se adsorbió en la columna Resource Q), la concentración de proteína se midió con un equipo de ensayo de proteína DC (fabricado por Bio-Rad Laboratories, Inc.) utilizando seroalbúmina bovina como muestra convencional. Como se muestra en la tabla 1, se obtuvo un total de 1,66 mg de proteína Siglec-15-His purificada de ratón realizando el procedimiento de purificación dos veces.

[Tabla 1]

Ejemplo 4

Purificación de Siglec-15-Fc de ratón

a) Cromatografía en columna de proteína A HiTrap

Se filtraron 1,8 l de la solución de cultivo de células 293F que expresan Siglec-15-Fc de ratón preparada en el ejemplo 2 a través de un filtro Sterivex-GV (fabricado por Millipore Co., Ltd.) y después se aplicó el filtrado a una columna de 5 ml de proteína A HiTrap (fabricada por Amersham Biosciences, Inc.) que previamente se había equilibrado con PBS de Dulbecco (D-PBS, fabricado por Invitrogen, Inc.) a un caudal de 5 ml/min. Después de lavar la columna con D-PBS a un caudal de 5 ml/min, se eluyó una proteína adsorbida en la columna con 50 ml de tampón de citrato de sodio 0,1 M (pH 3,0) a un caudal de 5 ml/min. El eluido se fraccionó a 5 ml por fracción en tubos Minisorp (fabricados por Nunc, Inc.) e, inmediatamente después, se añadieron a los mismos 1,3 ml de Tris 1 M para neutralizar el eluato. Después de concentrar una solución obtenida al combinar las fracciones (fracciones 1 y 2) en las que se detectó la proteína eluida a 2,5 ml con un concentrador de membrana centrífuga Amicon Ultra-15 (fabricado por Millipore Co., Ltd.), el concentrado se aplicó a una columna de desalación PD-10 (fabricada por Amersham Biosciences, Inc.) que previamente había sido equilibrada con solución salina fisiológica para inyección de Otsuka (TO-SS, fabricado por Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) que contiene Tween 20 al 0,01 %, seguido de elución con TO-SS, de modo que se obtuvieron 3,5 ml de una muestra cuyo disolvente se reemplazó por TO-SS. Esta muestra se crioconservó a -80 °C hasta su uso. Utilizando 2,9 l de una solución de cultivo de células 293F, se realizó el mismo procedimiento de purificación repitiéndolo una vez más.

b) Detección y ensayo de pureza de Siglec-15-Fc de ratón purificada

Utilizando una muestra preparada mediante el procedimiento de purificación mencionado anteriormente, se realizaron electroforesis de SDS-poliacrilamida en condiciones reductoras y tinción de plata. Es decir, a 5 pl de cada una de las muestras purificadas mediante las etapas de purificación respectivas, se añadió una cantidad equivalente de una solución de tratamiento de SDS y la mezcla resultante se calentó a 95 °C durante 10 minutos. Se usaron 0,3 pl de una muestra obtenida diluyendo cada una de las muestras tratadas térmicamente a 1/300 o 1/900 con la mitad de la concentración de la solución de tratamiento de SDS para electroforesis de poliacrilamida-SDS. La electroforesis y la tinción de plata se realizaron de la misma manera que el ensayo de pureza de Siglec-15-His de ratón descrito en c) del ejemplo 3. Los resultados se muestran en la fig. 3 junto con los resultados del examen de las condiciones de purificación preliminares a pequeña escala (el pH de la solución de cultivo aplicada era 8,9 o 7,0). Se mostró que una proteína que tenía un peso molecular de aproximadamente 55 kDa (Siglec-15-Fc de ratón) se purificó de manera eficaz y se concentró en la fracción de proteína que se eluyó de la columna de proteína A HiTrap.

c) Medición de la concentración de proteínas de Siglec-15-Fc de ratón purificada

Para la Siglec-15-Fc de ratón purificada (la fracción de proteína eluida de la columna de desalación PD-10), la concentración de proteína se midió con un equipo de ensayo de proteína DC (fabricado por Bio-Rad Laboratories, Inc.) utilizando seroalbúmina bovina como muestra convencional. Como se muestra en la tabla 2, se obtuvo un total de 92 mg de proteína Siglec-15-His de ratón purificada realizando el procedimiento de purificación dos veces.

[Tabla 2]

Ejemplo 5

Establecimiento de hibridoma productor de anticuerpos monoclonales de rata anti-Siglec-15 de ratón

a) Preparación de antígeno

La proteína Siglec-15-His de ratón producida en el ejemplo 3 se preparó a 100 pg/0,5 ml, y se añadió a la misma una cantidad equivalente de un adyuvante y se produjo una emulsión utilizando una jeringa de vidrio. Como adyuvante, se utilizó adyuvante completo de Freund (FCA, fabricado por Difco Laboratories, Inc.) solo para la primera inmunización y se utilizó adyuvante incompleto de Freund (FICA, fabricado por Difco Laboratories, Inc.) para la segunda inmunización y en lo sucesivo.

b) Inmunización de rata

Se utilizaron cuatro ratas (Wistar, hembras, 6 semanas de edad, obtenidas de CLEA Japón, Inc.) como animales inmunizados. La emulsión obtenida en a) se inyectó por vía subcutánea e intradérmica utilizando una aguja de inyección de 27 G de modo que la cantidad del antígeno fue de 50 |jg por rata. Se realizó inmunización un total de 4 veces cada 7 días después de la primera inmunización. Se recogió una pequeña cantidad (200 j l) de sangre de la vena de la cola después de 7 días a partir de la fecha de la 4a inmunización y se preparó un antisuero. Para confirmar el título de anticuerpos del antisuero, se realizó ELISA utilizando la proteína Siglec-15-His de ratón que se había utilizado como antígeno, la proteína Siglec-15-Fc de ratón producida en el ejemplo 4 o albúmina de suero bovino (BSA), cada una de las cuales estaba inmovilizada. Como resultado, la reactividad con la proteína Siglec-15-His de ratón y la proteína Siglec-15-Fc de ratón se observó en las cuatro ratas (ratas n.° 1 a 4). Por otro lado, no se observó la reactividad con BSA. A partir de estos resultados, se confirmó que el título de anticuerpos en el suero de cada una de las ratas inmunizadas aumentó y, por lo tanto, la rata n.° 2, que mostró el título de anticuerpos más alto se sometió a un procedimiento de fusión celular.

c) Fusión celular

La fusión celular se realizó según un procedimiento habitual de fusionar células del bazo de ratón (rata) con células de mieloma. Se recogió sangre completa del corazón de la rata con anestesia de éter y se sacrificó la rata, y después se extirpó el bazo. Las células de bazo recogidas y las células P3X63Ag8.653 (ATCC CRL 1580) que son células de mieloma de ratón se sometieron a fusión celular utilizando polietilenglicol (PEG). Las células resultantes se sembraron en una placa de 96 pocillos y se les añadió un medio que contenía hipoxantina (H), aminopterina (A) y timidina (T) (medio de selección de HAT) y, a continuación, las células se cultivaron durante 7 a 10 días. El sobrenadante del cultivo se recogió de 61 pocillos en los que se confirmó la supervivencia de los hibridomas obtenidos por fusión celular. A continuación, el título de anticuerpos se evaluó mediante ELISA utilizando la proteína Siglec-15-His de ratón que se había utilizado como antígeno, la proteína Siglec-15-Fc de ratón producida en el ejemplo 4 o BSA, cada una de las cuales se inmovilizó, y se cribaron hibridomas productores de anticuerpos monoclonales anti-Siglec-15 de ratón. A partir de los resultados del cribado, se seleccionaron 12 pocillos que mostraban un alto título de anticuerpos y los hibridomas contenidos en los pocillos se sometieron a un procedimiento de clonación.

d) Clonación de hibridoma

Para los hibridomas seleccionados de este modo, se realizó una primera etapa de clonación mediante un procedimiento de dilución limitante. Después de la dilución limitante, los hibridomas se cultivaron durante 2 semanas y el título de anticuerpos en el sobrenadante de cultivo se confirmó mediante ELISA utilizando la proteína Siglec-15-Fc de ratón producida en el ejemplo 4 o BSA, cada uno de los cuales estaba inmovilizado. Para 11 clones que se confirmó que eran clones positivos, se realizó una segunda etapa de clonación (de la misma manera que la primera etapa de clonación), mediante la cual se establecieron 10 clones de los hibridomas productores de anticuerpos monoclonales anti-Siglec-15 de ratón (#1A1, #3A1, #8A1, #24A1, #32A1, #34A1, #39A1, #40A1, #41B1, # 61A1) al final. En relación con esto, el hibridoma #32A1 se depositó en el Depositario del Organismo Internacional de Patentes del Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada (ubicado en Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japón) el 28 de agosto de 2008, y se le ha otorgado un número de referencia de FERM BP-10999 con el nombre de hibridoma anti-Siglec-15 #32A1.

Ejemplo 6

Preparación de anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón

a) Preparación de ascitis de ratón desnudo

Los hibridomas establecidos en el ejemplo 5 se cultivaron utilizando medio TIL I (fabricado por Immunobiological Laboratories Co., Ltd.) que contiene FCS al 10 %. Se llevó a cabo subcultivo de las células realizando un procedimiento en el que la solución de cultivo se diluyó hasta aproximadamente un cuarto cada dos o tres días utilizando el punto temporal en el que las células crecieron hasta aproximadamente 5 x 105 células/ml como índice. Cada uno de los hibridomas cultivados de este modo se implantó por vía intraperitoneal en un ratón desnudo al que se le había administrado pristano intraperitonealmente (0,2 ml/ratón) previamente a 1 x 107 células por ratón. En la implantación, se utilizaron tres ratones desnudos para cada uno de los 10 clones de hibridomas. Después de la implantación, la ascitis se recogió cuando se observó acumulación suficiente de ascitis, que se combinó con los recogidos de los otros dos ratones implantados con el mismo hibridoma, se midió la cantidad del ascitis combinada de este modo y se crioconservó la ascitis hasta la purificación del anticuerpo. Las cantidades de la ascitis recogida para los hibridomas respectivos se resumen en la tabla 3.

[Tabla 3]

continuación

b) Purificación de anticuerpo

La cantidad total de la ascitis recogida se sometió a purificación de IgG utilizando una columna de proteína G de 20 ml (fabricada por GE Healthcare, Co., Ltd.). Se ensayó la pureza de la IgG purificada mediante análisis de filtración en gel (cromatografía en columna Superdex 200) y algunos de los anticuerpos se sometieron a concentración de membrana centrífuga. Es decir, entre los anticuerpos monoclonales anti-Siglec-15 de ratón purificados, se concentraron 9 tipos de anticuerpos, excepto para el anticuerpo #24A1, a aproximadamente un sexto a un octavo del volumen original centrifugando los anticuerpos a 3000 rpm durante 30 a 60 minutos a 4 °C utilizando un concentrador de membrana centrífuga Amicon Ultra-15 (fabricado por Millipore Co., Ltd.). Posteriormente, para el anticuerpo #24A1 y los otros 9 tipos de anticuerpos concentrados, la concentración de proteína se midió con un equipo de ensayo de proteína DC (fabricado por Bio-Rad Laboratories, Inc.) utilizando seroalbúmina bovina (BSA) como muestra convencional. Por el procedimiento anteriormente mencionado, se preparó el anticuerpo monoclonal anti-Siglec-15 de ratón.

Ejemplo 7

Evaluación de la propiedad de unión del anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón a la proteína Siglec-15 de ratón

La propiedad de unión del anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón a la proteína Siglec-15 de ratón se evaluó mediante un procedimiento de ELISA. La proteína Siglec-15-Fc de ratón producida en el ejemplo 4 se diluyó a 5 |jg/ml con tampón de carbonato de sodio 0,1 M (pH 9,5) y la solución resultante se añadió a una placa de 96 pocillos (fabricada por Nalge Nunc International, Inc., cat. n.° 430341) a 100 jl/pocillo. Después de dejar la placa a temperatura ambiente durante 1 hora, se retiró la solución y se añadió un tampón de lavado (solución salina tamponada con fosfato que contenía Tween 20 al 0,05 %) a 300 jl/pocillo y después se retiró. Después de realizar este procedimiento de lavado una vez más, se añadió solución salina tamponada con fosfato que contenía BlockAce al 25 % (fabricado por Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) a 200 jl/pocillo y la placa se dejó a temperatura ambiente durante 1 hora, de modo que se realizó el bloqueo. Se eliminó el líquido y se lavó la placa dos veces con 300 jl/pocillo del tampón de lavado. A continuación, cada uno de los anticuerpos monoclonales de rata anti-Siglec-15 de ratón preparados en el ejemplo 6 o IgG de control de rata (fabricado por R&D Systems, Inc.) se diluyó hasta una concentración final de 1,28 a 20000 ng/ml (serie de dilución de 5 veces) con un tampón de ELISA (solución salina tamponada con fosfato que contiene BlockAce al 12,5 % y Tween 20 al 0,05 %) y la solución de anticuerpo diluida resultante se añadió a la placa a 100 jl/pocillo. Después de dejar la placa a temperatura ambiente durante 1 hora, se eliminó el líquido y se lavó la placa 3 veces con 300 jl/pocillo del tampón de lavado. Posteriormente, se añadió un anticuerpo de cabra anti-IgG de rata marcado con HRP (peroxidasa de rábano picante) (fabricado por Beckman Coulter, Inc.) diluido 1000 veces con un tampón de ELISA a 100 jl/pocillo y la placa se dejó a temperatura ambiente durante 1 hora. Se eliminó el líquido y se lavó la placa 3 veces con 300 jl/pocillo del tampón de lavado y, a continuación, mediante el uso de un equipo de revelado de color para peroxidasa (fabricado por Sumitomo Bakelite Co., Ltd.), el color se reveló según el protocolo que acompaña al equipo. Después de revelar el color, se midió una absorbancia a 492 nm utilizando un lector de microplacas (fabricado por Nihon Molecular Devices Corporation). Como resultado, se confirmó que las 10 muestras de prueba examinadas de los anticuerpos monoclonales de rata anti-Siglec-15 de ratón se unen a la proteína Siglec-15 de ratón de una manera dependiente de la concentración de anticuerpos (fig. 4). Por otro lado, en el caso de la IgG de control de rata, no se observó unión a la proteína Siglec-15 de ratón.

Ejemplo 8

Preparación de células no adherentes de médula ósea de ratón

El fémur y la tibia se extirparon de un ratón macho ddY a la edad de 5 a 8 semanas y se extrajeron los tejidos blandos. Se cortaron ambos extremos del fémur o la tibia y se inyectó D-PBS usando una jeringa con una aguja de inyección de calibre 25 para expulsar las células de la médula ósea, que se recogieron en un tubo de centrífuga. Se realizó centrifugación a temperatura ambiente durante 5 minutos a 100 g y se eliminó el sobrenadante. Al sedimento celular resultante, se añadió 1 ml de tampón hemolítico (tampón de lisis de glóbulos rojos, fabricado por Sigma Co., Ltd.) para suspenderlo y la suspensión resultante se dejó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se le añadieron 20 ml de D-PBS y se centrifugó la suspensión a temperatura ambiente durante 5 minutos a 100 g y se eliminó el sobrenadante. Al sedimento celular resultante, se añadieron 10 ml de medio MEM-a (fabricado por Invitrogen, Inc.) que contiene 5 ng/ml de M-CSF (fabricado por R&D Systems, Inc.) y suero bovino fetal (FBS) al 10% para suspenderlo. A continuación, la suspensión resultante se pasó a través de un tamiz celular (nailon de 40 jm , fabricado por BD Falcon) para eliminar los agregados. Las células resultantes se transfirieron a un matraz en T de 75 cm2 (para la unión de células adherentes) y se cultivaron durante una noche en una incubadora de CO2. Después del cultivo durante una noche, las células que no se adhirieron al matraz en T se recuperaron y se utilizaron como células no adherentes de médula ósea de ratón.

Ejemplo 9

Evaluación de la actividad biológica del anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón basada en la prueba de formación de osteoclastos de ratón

Utilizando las 10 muestras de prueba de los anticuerpos monoclonales anti-Siglec-15 de ratón producidos en el ejemplo 6, se examinó un efecto sobre la diferenciación de osteoclastos de células no adherentes de médula ósea de ratón. Las células no adherentes de médula ósea de ratón preparadas por el procedimiento del ejemplo 8 se prepararon a 1,5 x 105 células/ml en medio a-MEM que contenía FBS al 10 % y 10 ng/ml de M-CSF (fabricado por R&D Systems, Inc.) y la preparación celular resultante se sembró en cada pocillo de una placa de 96 pocillos en una cantidad de 200 |jl y las células se cultivaron durante 2 días en una incubadora de CO2. Se retiró la solución de cultivo antigua en la placa de 96 pocillos y se añadieron 100 j l de medio MEM-a a cada pocillo, conteniendo los 100 j l de medio MEM a FBS al 10 % al que se habían añadido RANKL humano (RANKL, fabricado por Peprotech, Inc.) y M-CSF para dar concentraciones finales de 20 ng/ml y 10 ng/ml, respectivamente. A la solución de cultivo celular, se añadió cada uno de los anticuerpos monoclonales de rata anti-Siglec-15 de ratón producidos en el ejemplo 6, una muestra obtenida eliminando azida de sodio de IgG de control de rata disponible en el mercado (IgG de rata purificada, fabricada por R&D Systems, Inc.) o un anticuerpo policlonal de conejo anti-Siglec-15 de ratón (n.° 3) producido por separado a una concentración de 32 a 1000 ng/ml, y las células se cultivaron durante 3 días adicionales en una incubadora de CO2. En relación con esto, el anticuerpo policlonal (n.° 3) es un anticuerpo que ya se ha confirmado que inhibe la formación de osteoclastos en el sistema experimental descrito en este ejemplo. Después de finalizar el cultivo, se midió la actividad de la fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP) de los osteoclastos formados mediante un procedimiento que se describe a continuación. La solución de cultivo en cada pocillo de la placa de 96 pocillos se eliminó por succión y se añadieron a cada pocillo 50 j l de tampón de citrato de sodio 50 mM (pH 6,1) que contenía Triton X-100 al 1 %. A continuación, la placa se agitó durante 5 minutos en un agitador de placas para lisar las células. A cada pocillo, se añadieron 50 j l de una solución de sustrato (tampón de citrato de sodio 50 mM (pH 6,1) que contenía p-nitrofenilfosfato 5 mg/ml y tartrato de sodio al 0,46 %) y la placa se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Después de la incubación, se añadieron 50 j l de una solución de hidróxido de sodio 1 N a cada pocillo de la placa de 96 pocillos para detener la reacción enzimática. Después de detener la reacción enzimática, se midió una absorbancia de cada pocillo a 405 nm y se utilizó la medida obtenida como índice de la actividad de TRAP. Los resultados se muestran en las figs.

5 y 6. No se observó una inhibición significativa de la actividad de TRAP en el caso de la IgG de control de rata disponible en el mercado. Por otro lado, se observó una inhibición significativa de la actividad de TRAP en los casos del anticuerpo #32A1 añadido en el intervalo de 32 ng/ml a 1000 ng/ml y el anticuerpo #8A1 y el anticuerpo policlonal de conejo n.° 3 purificado por afinidad añadidos en el intervalo de 63 ng/ml a 1000 ng/ml. También en los casos del anticuerpo #3A1, anticuerpo #34A1 y anticuerpo #39A1, se observó una inhibición dependiente de la dosis de la actividad de TRAP a una concentración relativamente alta de 500 ng/ml o más. No se observó la inhibición de la formación de osteoclastos de ratón por los otros anticuerpos. A partir de los resultados anteriores, se encontraron anticuerpos que inhiben fuertemente la formación de osteoclastos de ratón (diferenciación y maduración de osteoclastos) entre los anticuerpos monoclonales de rata anti-Siglec-15 de ratón preparados. Además, como una propiedad común al anticuerpo #3A1, anticuerpo #8A1, anticuerpo #32A1, anticuerpo #34A1 y anticuerpo #39A1, se puede ejemplificar la actividad de inhibición de la formación de osteoclastos a una concentración de 1000 ng/ml, es decir, 1 jg/m l o menos.

Ejemplo 10

Producción de construcción de expresión de la proteína Siglec-15 humana soluble

Una secuencia de nucleótidos parcial que codifica el dominio extracelular de la proteína Siglec-15 humana está representada por la SEQ ID NO: 15 en el listado de secuencias y la secuencia de aminoácidos de la misma está representada por la SEQ ID NO: 16 en el listado de secuencias. Al utilizar dicha secuencia parcial, la proteína Siglec-15 humana soluble se puede producir en un sobrenadante de cultivo de una célula animal o similar.

a) Amplificación del gen de Siglec-15 humana soluble mediante PCR

Como cebadores para amplificar el ADNc del dominio extracelular de Siglec-15 humana mediante PCR, se sintetizaron un oligonucleótido que tiene una secuencia de 5'-ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt caccATGGAA AAGTCCATCT GGCTGC-3' (mSiglec-15-ECD-F: SEQ ID NO: 17 en el listado de secuencias); y un oligonucleótido que tiene una secuencia de 5'-ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc CCCGCTGGCG CCATGGa AGc GG-3' (mSiglec-15-ECD-R: SEQ ID NO: 18 en el listado de secuencias) según un procedimiento habitual. En relación con esto, estos cebadores fueron diseñados, como cebadores de amplificación para producir un clon de entrada Gateway, de manera que se añade una secuencia attB1 a hSiglec-15-ECD-F y se añade una secuencia attB2 a hSiglec-15-ECD-R. La PCR se realizó utilizando esta combinación de cebadores y un polinucleótido que contenía una secuencia de marco de lectura abierto de la Siglec-15 humana como molde según un procedimiento habitual. La solución de reacción de PCR resultante se purificó utilizando el equipo de purificación de PCR PureLink (fabricado por Invitrogen, Inc.).

b) Producción de clon de entrada por reacción Gateway BP

Se produjo un clon de entrada en el que se integró el ADNc del dominio extracelular de Siglec-15 humana mediante la tecnología Gateway (Invitrogen, Inc.) empleando un sistema de recombinación específico de sitio del fago lambda mediante el siguiente procedimiento. En primer lugar, se realizó una reacción de BP usando BP clonasa entre el producto de PCR que tiene una secuencia attB en ambos extremos producida en a) y pDNOR221 (fabricado por Invitrogen, Inc.) que es un vector donante que tiene una secuencia attP. Al usar esta solución de reacción, se transformó Escherichia coli TOP10, se realizó PCR de colonias para clones resistentes a fármacos y se confirmó el tamaño de los insertos. A continuación, para un clon que se ha confirmado que tiene un inserto con el tamaño correcto, se realizó un análisis de secuencia de la secuencia de ADN total del inserto. Como resultado, se obtuvo un clon de entrada que es completamente idéntico a la secuencia de nucleótidos diana (SEQ ID NO: 15 en el listado de secuencias) que codifica el dominio extracelular de la proteína Siglec-15 humana.

c) Producción de clon de expresión mediante reacción Gateway LR

Se produjo un clon de expresión en el que se integró el ADNc del dominio extracelular de Siglec-15 humana mediante la tecnología Gateway (Invitrogen, Inc.) empleando un sistema de recombinación específico de sitio del fago lambda mediante el siguiente procedimiento. El clon de entrada producido en b) contiene un inserto que tiene una secuencia attL en ambos extremos. Se realizó una reacción LR usando LR clonasa entre este clon de entrada y dos tipos de vectores de destino que tienen una secuencia attR. En relación con esto, como vectores de destino, se usaron dos tipos de vectores de destino: pDONM diseñado de modo que se añaden un marcador de epítopo V5 y un marcador 6 x His al extremo C del inserto; y phIgFc diseñado de modo que se añada un marcador Fc humano al extremo C del inserto. Al utilizar la solución de reacción obtenida por la reacción LR, se transformó Escherichia coli TOP10 y se realizó un análisis de secuencia para los clones resistentes al fármaco resultantes para confirmar si se produjo la recombinación correcta.

Como resultado del análisis de secuencia, se obtuvieron clones de expresión (Siglec-15/pDONM soluble humano y Siglec-15/phIgFc soluble humano) en los que se produjo la recombinación correcta tanto para pDONM como para phIgFc, respectivamente. Transfectando el Siglec-15/pDONM soluble humano en una célula animal o similar, el ARNm que tiene una secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 19 en el listado de secuencias se transcribe y traduce en una proteína (Siglec-15-His humana) que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 20 en el listado de secuencias. Además, transfectando el Siglec-15/phIgFc soluble humano en una célula animal o similar, el ARNm que tiene una secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 21 en el listado de secuencias se transcribe y traduce en una proteína (Siglec-15-Fc humana) que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 22 en el listado de secuencias.

Ejemplo 11

Preparación a gran escala de solución de cultivo que contiene proteína Siglec-15 soluble humana utilizando células 293-F

a) Preparación de una solución de cultivo que contiene Siglec-15-His humana

El Siglec-15/pDONM humano soluble obtenido en el ejemplo 10 se preparó en una cantidad de aproximadamente 25 mg. En relación con esto, en la purificación de plásmidos de Escherichia coli cultivados a gran escala, se utilizó el equipo Invitrogen PureLink HiPure Plasmid Gigaprep (fabricado por Invitrogen, Inc.). El plásmido preparado de este modo se mezcló con Opti-MEM (fabricado por Invitrogen, Inc.), se le añadieron 50 ml de reactivo de transfección 293fectin (fabricado por Invitrogen, Inc.) y la mezcla resultante se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos. Esta mezcla se añadió a células FreeStyle 293-F (fabricadas por Invitrogen, Inc.) cultivadas en medio de expresión FreeStyle 293 (fabricado por Invitrogen, Inc.) que contenía penicilina-estreptomicina al 1 % de manera que la densidad celular alcanzó de 1,0 a 3,4 x 106 células/ml utilizando un aparato de cultivo de bioprocesos de 25 l (WAVe Bioreactor). Después de haber sometido las células a cultivo con agitación (30 rotaciones/min) a una concentración de CO2 de 6 a 12% durante 96 horas (4 días) a 37 °C, la solución de cultivo se recogió y se centrifugó para preparar un sobrenadante de cultivo. Se observa que en el sobrenadante de cultivo preparado de este modo, se expresa una proteína en la que se han añadido un marcador de epítopo V5 y un marcador 6 x His al lado C-terminal del dominio extracelular de Siglec-15 humana (Siglec-15-His humana).

b) Preparación de una solución de cultivo que contiene Siglec-15-Fc humana

El Siglec-15/phIgFc humano soluble obtenido en el ejemplo 10 se preparó en una cantidad de aproximadamente 5 mg. En relación con esto, en la purificación de plásmidos de Escherichia coli cultivados a gran escala, se utilizó el equipo Invitrogen PureLink HiPure Plasmid Gigaprep (fabricado por Invitrogen, Inc.). El plásmido preparado de este modo se mezcló con Opti-MEM (fabricado por Invitrogen, Inc.), seguido de esterilización por filtración. A continuación, se le añadieron 10 ml de un reactivo de transfección 293fectin (fabricado por Invitrogen, Inc.) y la mezcla resultante se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos. Esta mezcla se añadió a células FreeStyle 293-F (fabricadas por Invitrogen, Inc.) cultivadas en matraces de Erlenmeyer de manera que la densidad celular alcanzó 1,0 a 3,0 x 106 células/ml x 5 l (1 l/matraz x 5 matraces) en medio de expresión FreeStyle 293 (fabricado por Invitrogen, Inc.). Después de haber sometido las células a cultivo con agitación (125 rotaciones/min) a una concentración de CO2 de 8,0% durante 96 horas (4 días) a 37 °C, la solución de cultivo se recogió y se centrifugó para preparar un sobrenadante de cultivo. Se observa que en el sobrenadante de cultivo preparado de este modo, se expresa una proteína en la que se ha añadido un marcador Fc humano al lado C-terminal del dominio extracelular de Siglec-15 humana (Siglec-15-Fc humana).

Ejemplo 12

Purificación de la proteína Siglec-15 humana soluble

a) Purificación de Siglec-15-His humana soluble

a-i) Cromatografía en columna HisTrap HP

A 12 l de la solución de cultivo de células 293F que expresan Siglec-15-His humana preparada en a) del ejemplo 11, se añadieron 1350 ml de tampón 10 x (Tris 500 mM, NaCl 1,5 M, imidazol 200 mM, pH 8,0) y la mezcla resultante se agitó bien y se filtró a través de un filtro MilliPak-60 (fabricado por Millipore Co., Ltd.). Esta solución de cultivo se aplicó a un caudal de 10 ml/min a una columna de 100 ml de Ni-Sepharose HP (fabricada por Amersham Biosciences, Inc.) que se había lavado previamente con agua pura (agua Milli-Q). Después de haber lavado la columna con 400 ml de tampón Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) que contenía NaCl 300 mM a un caudal de 8 ml/min, se eluyó una proteína adsorbida en la columna con 200 ml de tampón Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) que contenía NaCl 300 mM e imidazol 500 mM a una caudal de 2,5 ml/min y el eluido se fraccionó en tubos mini-sorp (fabricado por Nunc, Inc.). Para evitar la precipitación de la proteína, se añadieron 8 ml de una solución de NaCl 5 M a aproximadamente 40 ml de una fracción que contenía la proteína eluida, seguido de agitación, y después se concentró la mezcla resultante hasta aproximadamente 20 ml con un concentrador de membrana centrífuga Amicon Ultra-15 (fabricado por Millipore Co., Ltd.). La materia insoluble generada durante la concentración se eliminó mediante centrifugación a 3000 rpm durante 30 minutos a 4 °C y se aplicaron 2,5 ml del sobrenadante resultante a una columna de desalación PD-10 (fabricada por Amersham Biosciences, Inc.) que previamente había sido equilibrada con solución salina tamponada con fosfato que contenía NaCl 1 M (N-PBS), seguido de elución con N-PBS, de modo que se obtuvieron 3,5 ml de una muestra cuyo disolvente se reemplazó por N-PBS. Este procedimiento se realizó repitiéndolo 7 veces más y se obtuvieron aproximadamente 28 ml de una solución de Siglec-15-His humana parcialmente purificada.

a-ii) Cromatografía en columna Resource Q

Se dializaron 12 ml de la muestra que se había purificado mediante cromatografía en columna de Ni-Sepharose HP y cuyo disolvente se había reemplazado por N-PBs durante la noche a 4 °C frente a tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) que contenía CHAPS al 0,1 % (1 l, 3 veces) y el dializado resultante se centrifugó a 3000 rpm durante 30 minutos a 4 °C y se eliminó el precipitado. Después de haberse filtrado el sobrenadante resultante a través de un filtro Millex-GV (fabricado por Millipore Co., Ltd.), el filtrado se aplicó a un caudal de 1 ml/min a una columna Resource Q de 6 ml (fabricada por Amersham Biosciences, Inc.) que se había equilibrado previamente con tampón de Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) que contenía CHAPS al 0,1 %. A continuación, se lavó la columna con este tampón a un caudal de 1 ml/min y se recogió una fracción de proteína que no se adsorbió en la columna. Se eluyó una proteína adsorbida en la columna con tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) que contenía CHAPS al 0,1 % y NaCl 1 M a un caudal de 1 ml/min. Después de concentrar 26,5 ml de la fracción que no se había adsorbido en la columna hasta 3,0 ml con un concentrador de membrana centrífugo Amicon Ultra-15 (fabricado por Millipore Co., Ltd.), el concentrado se centrifugó a 3000 rpm durante 10 minutos a 4 °C y se eliminó el precipitado. Se aplicaron 2,5 ml del sobrenadante resultante a una columna de desalación PD-10 (fabricada por Amersham Biosciences, Inc.) que se había equilibrado previamente con solución salina tamponada con fosfato que contenía clorhidrato de arginina 50 mM (pH 7,0, A-PBS), seguido de elución con A-PBS, de modo que se obtuvieron 3,5 ml de una muestra cuyo disolvente se reemplazó por A-PBS. Se añadió el clorhidrato de arginina en el disolvente de la muestra preparada para evitar que precipitara Siglec-15-His humana soluble. El sobrenadante después de la centrifugación se crioconservó a -80 °C hasta su uso. El procedimiento de purificación mencionado anteriormente (cromatografía en columna Resource Q) se realizó repitiéndolo dos veces.

a-iii) Detección y ensayo de pureza de Siglec-15-His humana purificada

Utilizando una muestra preparada mediante el procedimiento de purificación mencionado anteriormente (cromatografía en columna Ni-Sepharose HP y cromatografía en columna Resource Q), se realizaron electroforesis de SDS-poliacrilamida en condiciones reductoras y tinción de plata. Es decir, a 5 pl de cada una de las muestras purificadas mediante las etapas de purificación respectivas, se añadió una cantidad equivalente de una solución de tratamiento de SDS y la mezcla resultante se trató térmicamente a 95 °C durante 10 minutos. Se utilizaron 0,3 pl de cada una de las muestras tratadas térmicamente para electroforesis de poliacrilamida-SDS. El procedimiento de electroforesis se realizó de la misma manera que en el ejemplo 3, excepto que se utilizaron marcadores de peso molecular Rainbow (fabricados por Amersham Biosciences, Inc.) como marcadores de peso molecular. Después de completar la electroforesis, se realizó tinción de plata utilizando un equipo de plata PhastGel (fabricado por Amersham Biosciences, Inc.) y PhastSystem. Los resultados se muestran en la fig. 7. Se mostró que una proteína que tenía un peso molecular de aproximadamente 35 kDa (Siglec-15-His humana) se purificó de manera eficaz y se concentró en la fracción de proteína que no se adsorbió en la columna Resource Q.

a-iv) Medición de la concentración de proteínas de Siglec-15-His humana purificada

Para la Siglec-15-His humana purificada (la fracción de proteína que no se adsorbió en la columna Resource Q), la concentración de proteína se midió con un equipo de ensayo de proteína DC (fabricado por Bio-Rad Laboratories, Inc.) utilizando seroalbúmina bovina como muestra convencional. Al realizar el procedimiento de purificación dos veces, se obtuvo un total de 1,66 mg de Siglec-15-His humana purificada.

b) Purificación de Siglec-15-Fc humana soluble

b-i) Cromatografía en columna de proteína A HiTrap

Se filtraron 1,5 l de la solución de cultivo de células 293F que expresan Siglec-15-Fc humana preparada en b) del ejemplo 11 a través de un filtro Sterivex-GV (fabricado por Millipore Co., Ltd.) y después se aplicó el filtrado a un caudal de 5 ml/min a una columna de 5 ml de proteína A HiTrap (fabricada por Amersham Biosciences, Inc.) que previamente se había equilibrado con PBS de Dulbecco (D-PBS, fabricado por Invitrogen, Inc.). Después de lavar la columna con 70 ml de D-PBS a un caudal de 5 ml/min, se eluyó una proteína adsorbida en la columna con 24 ml de tampón de citrato de sodio 0,1 M (pH 3,0) a un caudal de 1,2 ml/min. El eluido se fraccionó a 1,2 ml por fracción en tubos Minisorp (fabricados por Nunc, Inc.) e, inmediatamente después, se añadieron a los mismos 0,31 ml de Tris 1 M para neutralizar el eluato. Una alícuota de 2,5 ml de una solución (aproximadamente 7,5 ml) obtenida mediante la combinación de las fracciones de proteínas eluidas (fracciones 5 a 9) se aplicó a una columna de desalación PD-10 (fabricada por Amersham Biosciences, Inc.) que había sido previamente equilibrada con solución salina tamponada con fosfato que contiene clorhidrato de arginina 50 mM (pH 7,0, A-PBS), seguido de elución con A-PBS, de modo que se obtuvieron 3,5 ml de una muestra cuyo disolvente se reemplazó por A-PBS. Este procedimiento se realizó repitiéndolo dos veces. Se añadió el clorhidrato de arginina en el disolvente para evitar que precipitara Siglec-15-His humana soluble. Se aplicaron 2,5 ml de la solución restante de las fracciones de proteína eluidas (fracciones 5 a 9) a una columna de desalación PD-10 (fabricada por Amersham Biosciences, Inc.) que se había equilibrado previamente con solución salina tamponada con fosfato que contenía NaCl 1 M (pH 6,7, N-PBS), seguido de elución con N-PBS, de modo que se obtuvieron 3,5 ml de una muestra cuyo disolvente se reemplazó por N-PBS. Se añadió NaCl en el disolvente de la muestra preparada para evitar que la Siglec-15-Fc humana soluble precipitara sin añadir un compuesto que contenga un grupo amino, tal como arginina. Las muestras preparadas mediante el procedimiento mencionado anteriormente se crioconservaron a -80 °C hasta su uso.

b-ii) Detección y ensayo de pureza de Siglec-15-Fc de humana purificada

Utilizando las muestras preparadas mediante el procedimiento de purificación mencionado anteriormente, se realizaron electroforesis de SDS-poliacrilamida en condiciones reductoras y tinción de plata. Es decir, a 5 pl de cada una de las muestras purificadas mediante las etapas de purificación respectivas, se añadió una cantidad equivalente de una solución de tratamiento de SDS y la mezcla resultante se calentó a 95 °C durante 10 minutos. Se usaron 0,3 pl de una muestra obtenida diluyendo cada una de las muestras tratadas térmicamente a 1/100 o 1/300 con la mitad de la concentración de la solución de tratamiento de SDS para electroforesis de poliacrilamida-SDS. La electroforesis y la tinción de plata se realizaron de la misma manera que el ensayo de pureza de Siglec-15-His humana descrito en aiii). Los resultados se muestran en la fig. 8. Se mostró que una proteína que tenía un peso molecular de aproximadamente 55 kDa (Siglec-15-Fc humana) se purificó de manera eficaz y se concentró en la fracción de proteína que se eluyó de la columna de proteína A HiTrap.

b-iii) Medición de la concentración de proteínas de Siglec-15-Fc humana purificada

Para la Siglec-15-Fc humana purificada (la fracción de proteína eluida de la columna de desalación PD-10), la concentración de proteína se midió con un equipo de ensayo de proteína DC (fabricado por Bio-Rad Laboratories, Inc.) utilizando seroalbúmina bovina como muestra convencional. Como se muestra en la tabla 4, se obtuvo un total de 25,2 mg de Siglec-15-His humana purificada realizando el procedimiento de purificación dos veces.

[Tabla 4]

Ejemplo 13

Evaluación de la propiedad de unión del anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón a la proteína Siglec-15 humana

La propiedad de unión del anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón a la proteína Siglec-15 humana se evaluó mediante un procedimiento de ELISA. La proteína Siglec-15-Fc humana (sometida a reemplazo con A-PBS) producida en b) del ejemplo 12 se diluyó a 5 pg/ml con tampón de carbonato de sodio 0,1 M (pH 9,5) y la solución resultante se añadió a una placa de 96 pocillos (fabricada por Nalge Nunc International, Inc., cat. n.° 430341) a 100 pl/pocillo. Después de haber dejado la placa a temperatura ambiente durante 1 hora, se retiró la solución y se añadió un tampón de lavado (solución salina tamponada con fosfato que contenía Tween 20 al 0,05 %) a 300 pl/pocillo y después se retiró. Después de haber realizado este procedimiento de lavado una vez más, se añadió solución salina tamponada con fosfato que contenía BlockAce al 25% (fabricado por Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) a 200 pl/pocillo y la placa se dejó a temperatura ambiente durante 1 hora, de modo que se realizó el bloqueo. Se eliminó el líquido y se lavó la placa dos veces con 300 pl/pocillo del tampón de lavado. A continuación, cada uno de los anticuerpos monoclonales de rata anti-Siglec-15 de ratón preparados en el ejemplo 6 o IgG de control de rata (fabricado por R&D Systems, Inc.) se diluyó hasta una concentración final de 1,28 a 20000 ng/ml (serie de dilución de 5 veces) con un tampón de ELISA (solución salina tamponada con fosfato que contiene BlockAce al 12,5 % y Tween 20 al 0,05 %) y la solución de anticuerpo diluida resultante se añadió a la placa a 100 pl/pocillo. Después de dejar la placa a temperatura ambiente durante 1 hora, se eliminó el líquido y se lavó la placa 3 veces con 300 pl/pocillo del tampón de lavado. Posteriormente, se añadió un anticuerpo de cabra anti-IgG de rata marcado con HRP (peroxidasa de rábano picante) (fabricado por Beckman Coulter, Inc.) diluido 1000 veces con un tampón de ELISA a 100 pl/pocillo y la placa se dejó a temperatura ambiente durante 1 hora. Se eliminó el líquido y se lavó la placa 3 veces con 300 pl/pocillo del tampón de lavado y, a continuación, mediante el uso de un equipo de revelado de color para peroxidasa (fabricado por Sumitomo Bakelite Co., Ltd.), el color se reveló según el protocolo que acompaña al equipo. Después de revelar el color, se midió una absorbancia a 492 nm utilizando un lector de microplacas (fabricado por Nihon Molecular Devices Corporation). Como resultado, se confirmó que las 10 muestras de prueba examinadas de los anticuerpos monoclonales de rata anti-Siglec-15 de ratón se unen a la proteína Siglec-15 humana de una manera dependiente de la concentración de anticuerpos (fig. 9). En particular, la actividad de unión de 5 muestras de prueba, a saber, #1A1, #3A1, #24A1, #32A1 y #61A1, era alta y la actividad de unión de 3 muestras de prueba, a saber, #8A1, #34A1 y #39A1, era relativamente baja. Por otro lado, en el caso de la IgG de control de rata, no se observó unión a la proteína Siglec-15 humana. A partir de los resultados anteriores, se mostró que los anticuerpos monoclonales de rata anti-Siglec-15 de ratón preparados en el ejemplo 6 se unen no solo a Siglec-15 de ratón, sino también a Siglec-15 humana y, por otra parte, se descubrió que algunos anticuerpos se unen fuertemente a Siglec-15 humana.

Ejemplo 14

Efecto de la adición de anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón sobre la fusión celular y la actividad de reabsorción ósea de células precursoras de osteoclastos humanos normales (evaluación de la actividad biológica in vitro)

Ya que se confirmó que los anticuerpos monoclonales de rata anti-Siglec-15 de ratón se unen también a Siglec-15 humana en el ejemplo 13, se examinaron los efectos de estos anticuerpos sobre la formación de osteoclastos humanos y la actividad de reabsorción ósea.

a) Efecto de la adición de anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón sobre la fusión celular de osteoclastos de células precursoras de osteoclastos humanos normales (tinción TRAP)

Se sembraron células precursoras de osteoclastos humanos normales (células precursoras de osteoclastos naturales humanos normales, adquiridas de Sanko Junyaku Co., Ltd., cat. n.° 2T-110) en una placa de 96 pocillos a 1 x 104 células/pocillo según el protocolo que acompaña a las células. Como medio, se utilizó un medio esencial mínimo para células precursoras de osteoclastos (OPBM, adquirido de Sanko Junyaku Co., Ltd., cat. n.° PT-8201) complementado con un conjunto de complementos OPGM (adquirido de Sanko Junyaku Co., Ltd., cat. n.° PT-9501) que contiene suero fetal bovino (concentración final: 10%), RANKL humano (concentración final: 66 ng/ml), M-CSF humano (concentración final: 33 ng/ml) y similares. Al sobrenadante de cultivo resultante, se añadió cada uno de los anticuerpos monoclonales de rata anti-Siglec-15 de ratón preparados en el ejemplo 6 o IgG de control de rata (fabricado por R&D Systems, Inc.) para dar una concentración final de 30 pg/ml y las células se cultivaron durante 4 días en una incubadora de CO2. Después del cultivo, se eliminó el sobrenadante y se añadió formalina neutra al 10 % para fijar las células. Después de fijar las células, las células se lavaron dos veces con agua destilada, se añadió una solución de tinción TRAP (fosfato de naftol AS-MX 0,27 mM (fabricado por Sigma Co., Ltd.), sal LB violeta roja rápida 1,6 mM (fabricada por Sigma Co., Ltd.), dimetilformamida al 1 %, tartrato de sodio 50 mM, tampón de acetato de sodio 0,1 M (pH 5,0)) a 100 pl/pocillo y se permitió que la reacción se produjera a temperatura ambiente durante 5 minutos. Después de la reacción, las células se lavaron dos veces con agua destilada y después se observaron mediante microscopia (fig.

10). Como resultado, la formación de osteoclastos gigantes resultantes de un alto grado de fusión celular fue inhibida casi por completo por la adición del anticuerpo #32A1. Además, en el caso del anticuerpo #41B1, también se inhibió de forma significativa la formación de osteoclastos gigantes resultantes de un alto grado de fusión celular. Por otro lado, en el caso de los otros anticuerpos monoclonales de rata anti-Siglec-15 de ratón (el anticuerpo #1A1 y otros) y la IgG de control de rata, no se observó una inhibición tan significativa de la fusión de células de osteoclastos. De esta manera, se reveló que la multinucleación y la fusión celular de osteoclastos positivos para TRAP de células precursoras de osteoclastos humanos normales son inhibidas por anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a la proteína Siglec-15.

b) Efecto de la adición de anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón (#32A1) sobre la fusión celular de osteoclastos de células precursoras de osteoclastos humanos normales (tinción TRAP)

Se sembraron células precursoras de osteoclastos humanos normales (células precursoras de osteoclastos naturales humanos normales, adquiridas de Sanko Junyaku Co., Ltd., cat. n.° 2T-110) en una placa de 96 pocillos a 1 x 104 células/pocillo según el protocolo que acompaña a las células. Como medio, se utilizó un medio esencial mínimo para células precursoras de osteoclastos (OPBM, adquirido de Sanko Junyaku Co., Ltd., cat. n.° PT-8201) complementado con un conjunto de complementos OPGM (adquirido de Sanko Junyaku Co., Ltd., cat. n.° PT-9501) que contiene suero fetal bovino (concentración final: 10%), RANKL humano (concentración final: 68,4 ng/ml), M-CSF humano (concentración final: 33 ng/ml) y similares. Al sobrenadante de cultivo resultante, se añadió el anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón (anticuerpo #32A1) preparado en el ejemplo 6 para dar una concentración final de 0,1, 0,3, 1 o 3 |jg/ml y las células se cultivaron durante 3 días en una incubadora de CO2. Después del cultivo, se eliminó el sobrenadante y se añadió formalina neutra al 10 % para fijar las células. Después de fijar las células, las células se lavaron dos veces con agua destilada y se añadió una solución de tinción TRAP (fosfato de naftol AS-MX 0,27 mM (fabricado por Sigma Co., Ltd.), sal LB violeta roja rápida 1,6 mM (fabricada por Sigma Co., Ltd.), dimetilformamida al 1 %, tartrato de sodio 50 mM, tampón de acetato de sodio 0,1 M (pH 5,0)) a 100 jl/pocillo y se permitió que la reacción se produjera a temperatura ambiente durante 5 minutos. Después de la reacción, las células se lavaron dos veces con agua destilada y, a continuación, se observaron mediante microscopia (fig. 11). Como resultado, la formación de osteoclastos multinucleados positivos para TRAP se inhibió de una manera dependiente de la concentración de anticuerpo #32A1 dentro del intervalo de 0,3 jg/m l a 3 jg/ml.

c) Efecto de la adición de anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón (#32A1) sobre la actividad de reabsorción ósea de células precursoras de osteoclastos humanos normales (evaluación usando placa recubierta de colágeno)

Se sabe que los osteoclastos liberan una proteasa tal como catepsina K y degradan el colágeno de tipo I, que es un componente constitutivo del tejido óseo. El equipo de ensayo OsteoLyse (fabricado por Lonza, Inc., cat. n.° PA-1500) proporciona una placa de 96 pocillos recubierta con colágeno humano conjugado con europio (placa de cultivo celular OsteoLyse de 96 pocillos) y es posible evaluar la actividad de reabsorción ósea de los osteoclastos in vitro midiendo la cantidad de fragmentos de colágeno fluorescente liberados en el sobrenadante cuando los osteoclastos se cultivan en la placa. Se sembraron células precursoras de osteoclastos humanos normales (células precursoras de osteoclastos naturales humanos normales, adquiridas de Sanko Junyaku Co., Ltd., cat. n.° 2T-110) en una placa de cultivo celular OsteoLyse de 96 pocillos a 1 x 104 células/pocillo según el protocolo que acompaña a las células. Como medio, se utilizó un medio esencial mínimo para células precursoras de osteoclastos (OPBM, adquirido de Sanko Junyaku Co., Ltd., cat. n.° PT-8201) complementado con un conjunto de complementos OPGM (adquirido de Sanko Junyaku Co., Ltd., cat. n.° PT-9501) que contiene suero fetal bovino (concentración final: 10%), RANKL humano (concentración final: 68,4 ng/ml), M-CSF humano (concentración final: 33 ng/ml) y similares. Al sobrenadante de cultivo resultante, se añadió el anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón (anticuerpo #32A1) preparado en el ejemplo 6 para dar una concentración final de 0,1, 0,3, 1 o 3 jg/m l y las células se cultivaron durante 3 días en una incubadora de CO2. Se recogió una alícuota de 10 j l del sobrenadante del cultivo y se le añadieron 200 j l del reactivo liberador de fluoróforo incluido en el kit de ensayo OsteoLyse, y se midió una intensidad de fluorescencia (excitación: 340 nm, emisión: 615 nm) utilizando un lector de placas de fluorescencia (ARVO MX, fabricado por Perkin Elmer Inc.), de modo que se determinó la cantidad de fragmentos de colágeno fluorescente libres liberados en el sobrenadante de cultivo (fig. 12). Como resultado, la cantidad de fragmentos de colágeno fluorescente aumentada por la adición de RANKL fue reducida por el anticuerpo #32A1 de una manera dependiente de la concentración dentro del intervalo de 0,3 jg/m l a 3 jg/ml. A partir de este resultado, se reveló que la actividad de reabsorción ósea de los osteoclastos humanos es inhibida por el anticuerpo monoclonal estudiado que se une específicamente a la proteína Siglec-15.

Ejemplo 15

Evaluación de la actividad biológica del anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón utilizando ratas ovariectomizadas

a) Protocolo de experimentación animal

Se extrajeron los ovarios de ambos lados de ratas hembra F344 (obtenidas de Charles River Laboratories Japan, Inc.) a la edad de 12 semanas y las ratas se dividieron en tres grupos: un grupo de administración de vehículo; un grupo de administración de anticuerpo monoclonal #8A1 de rata anti-Siglec-15 de ratón; y un grupo de administración de anticuerpo monoclonal #32A1 de rata anti-Siglec-15 de ratón. Además, se preparó un grupo como un grupo de operación simulada. En los grupos de administración de anticuerpos, el anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón #8A1 o el anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón #32A1 preparado en el ejemplo 6 se administró por vía intraperitoneal a una dosis de 1 mg/kg tres veces a la semana repetidamente durante 4 semanas desde el día siguiente de la operación. En el grupo de administración de vehículo y el grupo de operación simulada, Se administró por vía intraperitoneal PBS que contenía Tween 20 al 0,01 % como vehículo. A las 4 semanas después del inicio de la administración, se recogió orina durante 24 horas en ayunas y las muestras de orina se almacenaron a -80 °C hasta la medición. Después de completar la recogida de orina, las ratas se sacrificaron y se extirpó la columna lumbar de cada rata.

b) Medición de la densidad mineral ósea de la columna lumbar

Se extrajeron tejidos blandos adheridos a la columna lumbar extirpada y se extrajeron las vértebras lumbares 4a a 6a. Las vértebras lumbares extraídas se desgrasaron y deshidrataron agitándolas en etanol y después se secaron al aire y se midió la densidad mineral ósea utilizando un densitómetro óseo (DCS-600EX, fabricado por Aloka Co., Ltd.). Los resultados se muestran en la fig. 13(A). Se observó una disminución significativa de la densidad mineral ósea de la columna lumbar en el grupo ovariectomizado en comparación con el grupo de operación simulada, sin embargo, en los grupos de administración de anticuerpos #8A1 y #32A1, se inhibió significativamente una disminución de la densidad mineral ósea debido a la ovariectomía.

c) Medición de la excreción urinaria de desoxipiridinolina

Diversos metabolitos reticulados de colágeno de tipo I reflejan claramente el recambio metabólico óseo, en particular, la reabsorción ósea. Sobre todo, se localiza desoxipiridinolina principalmente en colágeno óseo y, por lo tanto, se considera muy fiable como índice de reabsorción ósea.

La muestra de orina crioconservada se descongeló y la materia insoluble se precipitó mediante una operación de centrifugación, de modo que se obtuvo un sobrenadante. La cantidad de desoxipiridinolina contenida en este sobrenadante se midió utilizando Osteolinks "DPD" (fabricado por DS Pharma Biomedical Co., Ltd.). Además, utilizando la prueba de creatinina Wako (fabricada por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), también se midió el contenido de creatinina en el sobrenadante y se calculó la cantidad de desoxipiridinolina corregida por creatinina. Los resultados se muestran en la fig. 13(B). La excreción urinaria de desoxipiridinolina aumentó significativamente en el grupo ovariectomizado en comparación con el grupo simulado y, por lo tanto, se indicó que, en las ratas ovariectomizadas, aumenta la reabsorción ósea osteoclástica. Por otro lado, en los grupos de administración de anticuerpos #8A1 y #32A1, se inhibió un aumento de la excreción de desoxipiridinolina debido a la ovariectomía de modo que el nivel de excreción de desoxipiridinolina fue comparable al del grupo de operación simulada. A partir de este resultado, también se confirmó en los modelos animales que los anticuerpos monoclonales estudiados que se unen específicamente a Siglec-15 inhiben la reabsorción ósea osteoclástica y se indicó claramente que, debido al efecto inhibidor sobre la reabsorción ósea, se inhibió una disminución de la densidad mineral ósea de la columna lumbar en las ratas ovariectomizadas.

Ejemplo 16

Determinación del sitio de unión (epítopo) del anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón

a) Expresión y purificación del dominio del conjunto V de Siglec-15 humana

Un ADN que codificaba una proteína en la que se unieron un marcador de His y una secuencia de reconocimiento de trombina al lado N-terminal de un dominio del conjunto V de Siglec-15 humana (un polipéptido que comprende de 39 a 165 restos de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos en la base de datos de proteínas del NCBI con el número de referencia de NP_998767 o una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 2 en el listado de secuencias) se integró en un vector pDEST14 (Invitrogen, Inc., cat. n.° 11801-016). Al usar este plásmido, se transformó Escherichia coli Rosetta-gamiB (DE3) (Novagen, Inc., cat. n.° 71136-4) y se cultivó en medio t B (Invitrogen, Inc., cat. n.° 22711-022). Después de cultivar, las células bacterianas fueron homogeneizadas por ultrasonido, el homogeneizado resultante se centrifugó y el sobrenadante se purificó con una columna HisTrap HP (GE Healthcare, Co., Ltd., cat. n.° 17-5247-01). A continuación, el marcador de His se escindió con trombina y después se purificó el dominio del conjunto V de Siglec-15 humana utilizando una columna Mono S5/50 GL (GE Healthcare, Co., Ltd., cat. n.° 17-5168-01) y una columna Superdex 75 10/300 (GE Healthcare, Co., Ltd., cat. n.° 17-5174-01) hasta que se obtuvo por electroforesis una única banda con un peso molecular de 14 kDa.

b) Purificación de Siglec-15-Fc humana soluble

La Siglec-15-Fc humana soluble se purificó mediante el procedimiento descrito en el ejemplo 12.

c) ELISA competitivo del dominio de conjunto V humano y el anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón #32A1

En una placa maxi-sorp de 96 pocillos (fabricada por Nunc, Inc., número de modelo: 442404), se añadieron 100 pl de un anticuerpo de cabra anti-Fc humano (Jackson ImmunoResearch, Inc., número de modelo: 109-005-098) (1,25 pg/ml) a cada pocillo y se inmovilizó durante una noche a 4 °C. Después de lavar la placa maxi-sorp de 96 pocillos dos veces con PBS, se añadieron 100 pl de Siglec-15-Fc humana soluble (1 pg/ml) a cada pocillo y se inmovilizó a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, se añadieron 300 pl de una solución de leche desnatada al 5 %/PBS a cada pocillo y se realizó el bloqueo de los pocillos a temperatura ambiente durante 3 horas. Mientras tanto, se mezclaron 2 pg/ml del anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón #32A1 con una cantidad equivalente de 0, 0,032, 0,16, 0,8, 4 o 20 pg/ml del dominio del conjunto V de Siglec-15 humana y se permitió que se produjera una reacción a temperatura ambiente durante 1,5 horas. Después de lavar la placa maxi-sorp de 96 pocillos dos veces con PBS, se le añadieron 100 pl de la solución mixta del anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón #32A1 y el dominio del conjunto V de Siglec-15 humana, y se permitió que se produjera una reacción a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de haberse lavado la placa maxi-sorp de 96 pocilios 5 veces con una solución de Tween 20 0,05 % (Bio-Rad Laboratories, Inc., cat. n.° 170-6531)/PBS (en lo sucesivo en el presente documento, "solución PBST"), se le añadieron 100 j l de un anticuerpo IgG de cabra anti-rata marcado con HRP (Beckman Coulter, Inc., cat. n.° 732664, diluido hasta 2000 veces) y se permitió que se produjera una reacción a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de haberse lavado la placa 5 veces con la solución de PBST, se le añadieron 100 j l de un líquido revelador de color del equipo de sustrato ABTS de ELISA POD (Nacalai Tesque Co., Ltd., cat. n.° 14351-80) y se permitió que se produjera una reacción durante 30 minutos. A continuación, se le añadieron 100 j l de una solución de parada de reacción y se midió una absorbancia a 405 nm. Los resultados del ELISA competitivo mostraron que la unión del anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón #32A1 a la Siglec-15 humana inmovilizada se inhibe de una manera dependiente de la concentración del dominio del conjunto V humano. Por consiguiente, se mostró que el epítopo para el anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón #32A1 es el dominio del conjunto V de Siglec-15 humana (un dominio que comprende de 39 a 165 restos de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos en la base de datos de proteínas del NCBI con el número de referencia de NP_998767 o una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 2 en el listado de secuencias) (fig. 14).

Ejemplo 17

Amplificación de ADNc que codifica la región variable del anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón #32A1 y análisis de la secuencia de bases del mismo

a) Preparación de ARNm

El hibridoma #32A1 se cultivó según a) del ejemplo 6. A partir de 4 x 107 células del hibridoma #32A1, se prepararon aproximadamente 65 jg de ARNm utilizando un equipo de purificación de ARNm QuickPrep (GE Healthcare, Co., Ltd.).

b) Síntesis de ADNc (ADNc preparado para 5'-RACE)

La síntesis de ADNc (ADNc preparado para 5'-RACE) se realizó utilizando 0,3 jg del ARNm preparado en a) con transcriptasa inversa PrimeScript (TaKaRa Bio, Inc.) y equipo de amplificación de ADNc SMART RACE (Clontech Co., Ltd.).

c) Amplificación de ADNc de la región variable de cadena pesada del gen de #32A1 mediante PCR 5'-RACE

Como cebadores para amplificar el ADNc de la región variable del gen de cadena pesada de #32A1 mediante PCR, se utilizaron UPM (mezcla universal de cebadores A, adjunto al equipo de amplificación de ADNc SMART RACE) y un oligonucleótido que tiene una secuencia de 5'-GGCCGGGTGGGCTACGTTGCAGGTGACGGTCTG-3' (RG2AR2: SEQ ID NO: 23 en el listado de secuencias). Como UPM, se utilizó una adjunta al equipo de amplificación de ADNc SMART RACE (Clontech Co., Ltd.) y el RG2AR2 se diseñó a partir de la secuencia de la región constante de cadena pesada de rata (IgG2a) en la base de datos y se sintetizó según un procedimiento habitual.

El ADNc de la región variable del gen de cadena pesada de #32A1 se amplificó mediante PCR 5'-RACE utilizando esta combinación de cebadores y el ADNc sintetizado en b) (ADNc preparado para 5'-RACE) como molde. La PCR se realizó utilizando el equipo de PCR Advantage 2 (Clontech Co., Ltd.) y las condiciones para un termociclador se establecieron de la siguiente manera: después de calentar a 94 °C durante 1 minuto, se repitió un ciclo de temperatura de "94 °C durante 0,5 minutos y 72 °C durante 3 minutos" 5 veces, a continuación, se repitió un ciclo de temperatura de "94 °C durante 0,5 minutos, 70 °C durante 0,5 minutos y 72 °C durante 3 minutos" 5 veces y, además, se repitió un ciclo de temperatura de "94 °C durante 0,5 minutos, 68 °C durante 0,5 minutos y 72 °C durante 3 minutos" 20 veces, seguido de incubación a 4 °C.

d) Amplificación de ADNc de la región variable del gen de cadena ligera de #32A1 mediante PCR 5'-RACE

Como cebadores para amplificar el ADNc de la región variable del gen de cadena ligera de #32A1 mediante PCR, se utilizaron UPM (mezcla universal de cebadores A, adjunto al equipo de amplificación de ADNc SMART RACE) y un oligonucleótido que tiene una secuencia de 5'-CATGCTGTACGTGCTGTCTTTGCTGTCCTGATCAG-3' (RKR2: Se Q ID NO: 24 en el listado de secuencias). Como UPM, se utilizó una adjunta al equipo de amplificación de ADNc SMART RACE (Clontech Co., Ltd.) y el RKR2 se diseñó a partir de la secuencia de la región constante de cadena ligera de rata (cadena k) en la base de datos y se sintetizó según un procedimiento habitual.

El ADNc de la región variable del gen de cadena ligera de #32A1 se amplificó mediante PCR 5'-RACE utilizando esta combinación de cebadores y el ADNc sintetizado en b) (ADNc preparado para 5'-RACE) como molde. La PCR se realizó utilizando el equipo de PCR Advantage 2 (Clontech Co., Ltd.) y las condiciones para un termociclador se establecieron de la siguiente manera: después de calentar a 94 °C durante 1 minuto, se repitió un ciclo de temperatura de "94 °C durante 0,5 minutos y 72 °C durante 3 minutos" 5 veces, a continuación, se repitió un ciclo de temperatura de "94 °C durante 0,5 minutos, 70 °C durante 0,5 minutos y 72 °C durante 3 minutos" 5 veces y, además, se repitió un ciclo de temperatura de "94 °C durante 0,5 minutos, 68 °C durante 0,5 minutos y 72 °C durante 3 minutos" 20 veces, seguido de incubación a 4 °C.

e) Determinación de secuencias de bases de ADNc de regiones variables de cadena pesada y ligera

El ADNc de la región variable de cadena pesada amplificado en c) se purificó utilizando el equipo de purificación de PCR MinElute (QIAGEN Inc.) y después se realizó el análisis de secuencia de la secuencia de ADN. Como cebador de secuenciación, se diseñó un oligonucleótido que tenía una secuencia de 5'-CTCCAGAGTTCCAGGTCACGGTGACTGGC-3' (RG2AR3: SEQ ID NO: 25 en el listado de secuencias) a partir de la secuencia de la región constante de cadena pesada de rata (IgG2a) en la base de datos y se sintetizó según un procedimiento habitual.

El ADNc de la región variable de cadena ligera amplificado en d) se purificó utilizando el equipo de purificación de PCR MinElute (QIAGEN Inc.) y después se realizó el análisis de secuencia de la secuencia de ADN. Como cebador de secuenciación, se diseñó un oligonucleótido que tenía una secuencia de 5-TCCAGTTGCTAACTGTTCCG-3' (sqRK: SEQ ID NO: 26 en el listado de secuencias) a partir de la secuencia de la región constante de cadena ligera de rata (cadena k) en la base de datos y se sintetizó según un procedimiento habitual.

El ADNc que contiene la región variable de cadena pesada obtenida por el análisis de secuencia tiene una secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 27 en el listado de secuencias y codifica la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 28 en el listado de secuencias. La secuencia de aminoácidos representada por los números de aminoácidos 1 a 19 de la SEQ ID NO: 28 corresponde a una señal secretora, la secuencia de aminoácidos representada por los números de aminoácidos 20 a 140 de la misma corresponde a una región variable de cadena pesada y la secuencia de aminoácidos representada por los números de aminoácidos 141 a 167 de la misma corresponde a una región constante de cadena pesada (parcial). La región variable de cadena pesada mencionada anteriormente contiene CDRH1 (DYFMN) que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 44, CDRH2 (QIRNKIYTYATFYAESLe G) que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 45 y CDRH3 (SLTGGDYFDY) que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 46. Además, el ADNc que contiene la región variable de cadena ligera tiene una secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 29 en el listado de secuencias y codifica la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias. La secuencia de aminoácidos representada por los números de aminoácidos 1 a 20 de la SEQ ID NO: 30 corresponde a una señal secretora, la secuencia de aminoácidos representada por los números de aminoácidos 21 a 132 de la misma corresponde a una región variable de cadena ligera y la secuencia de aminoácidos representada por los números de aminoácidos 133 a 139 de la misma corresponde a una región constante de cadena ligera (parcial). La región variable de cadena ligera mencionada anteriormente contiene CDRL1 (RASQSVTISGYSFIH) que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 47, CDRL2 (RASNLAS) que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 48 y CDRL3 (QQSRKSPWT) que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 49.

Ejemplo 18

Producción de construcción de expresión génica de anticuerpo quimérico humano del anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón #32A1

a) Producción de vectores de expresión universal pEF1/FCCU-1 y pEF6KCL

a)-i) Construcción del vector de expresión de cadena ligera humana pEF6KCL

Al realizar PCR utilizando un plásmido pEF6/V5-HisB (Invitrogen) como molde y también utilizando los siguientes cebadores, un fragmento de ADN de inmediatamente cadena abajo de BGHpA (2174) a SmaI (2958) (un fragmento de ADN que contiene el origen de replicación f1 y el promotor y origen de SV40, en lo sucesivo en el presente documento denominado "fragmento A").

5'-CCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGC-3' (cebador EFF1: SEQ ID NO: 31 en el listado de secuencias) 5'-AAACCCGGGAGCTTTTTGCAAAAGCCTAGG-3' (cebador EFsmaR: SEQ ID NO: 32)

El fragmento A obtenido y un fragmento de ADN (SEQ ID NO: 33, en lo sucesivo en el presente documento denominado "fragmento B") que contiene una secuencia de ADN que codifica una señal secretora de cadena k humana, una región constante de cadena k humana y una señal adicional de poli-A humana se ligaron mediante PCR solapante. El fragmento de ADN obtenido de este modo en el que se ligaron el fragmento A y el fragmento B (en lo sucesivo en el presente documento denominado "fragmento A+B") se digirió con las enzimas de restricción KpnI y SmaI, que se ligó a un plásmido pEF6/V5-HisB (Invitrogen) que se digirió con las enzimas de restricción KpnI y SmaI, de modo que se construyó un vector de expresión de cadena ligera humana pEF6KCL que tiene una secuencia señal, un sitio de clonación, una región constante de cadena k humana y una secuencia señal adicional poli-A humana cadena abajo del promotor EF1.

a)-ii) Construcción de pEF1/KCL

Un fragmento de ADN obtenido escindiendo el pEF6KCL obtenido por el procedimiento mencionado anteriormente con las enzimas de restricción KpnI y SmaI se ligó a pEF1/myc-HisB (Invitrogen, Inc.) que se digirió con KpnI y SmaI, de modo que se construyó un plásmido pEF1/KCL.

a) -iii) Construcción del vector de expresión de cadena pesada humana pEF1/FCCU-1

Un fragmento de ADN (SEQ ID NO: 34 en el listado de secuencias) que contiene una secuencia de ADN que codifica una secuencia señal de IgG1 humana y una secuencia de aminoácidos de región constante se digirió con las enzimas de restricción NheI y PmeI y se ligó al plásmido pEF1/KCL que se digirió con NheI y PmeI, de modo que se construyó un vector de expresión de cadena pesada humana pEF1/FCCU-1 que tiene una secuencia señal, un sitio de clonación, una región constante de cadena pesada humana y una secuencia señal adicional poli-A humana cadena abajo del promotor EF1.

b) Producción de la construcción de expresión de cadena pesada del anticuerpo quimérico humano #32A1

Como cebadores para amplificar el ADNc de la región variable de cadena pesada de #32A1 mediante PCR, se sintetizaron un oligonucleótido que tiene una secuencia de 5'-aaagctgagcGAGGTGCAAATTTTGGAGACTGGAGGAGGC-3' (32A1HF: SEQ ID NO: 35 en el listado de secuencias) y un oligonucleótido que tiene una secuencia de 5'-aaagctgagctGACTGTGACCATGACTCCTTGGCCCCAG-3' (32A1HR: SEQ ID NO: 36 en el listado de secuencias) según un procedimiento habitual.

En relación con esto, para integrar un producto de PCR en pEF1/FCCU-1, estos cebadores se diseñaron de manera que se añadió una secuencia de reconocimiento para la enzima de restricción BlpI. La PCR se realizó según un procedimiento habitual utilizando esta combinación de cebadores y el ADNc de la región variable de cadena pesada purificada en e) del ejemplo 17 como molde. El producto de p Cr resultante se purificó utilizando el equipo de purificación de PCR MinElute (QIAGEN, Inc.) y después se insertó un fragmento de ADN obtenido al digerir el producto de PCR con la enzima de restricción BlpI (n Ew ENGLAND BIOLABS, Inc.) en el pEF1/FCCU-1 en el sitio escindido con la enzima de restricción BlpI, de modo que se construyó una construcción de expresión de cadena pesada de anticuerpo quimérico humano #32A1. La secuencia del inserto se confirmó mediante un análisis de secuencia. Como cebador para secuenciación, un oligonucleótido que tiene una secuencia de 5-TAATACGACTCACTATAGGG-3' (F11: SEQ ID NO: 37 en el listado de secuencias) se sintetizó según un procedimiento habitual. Un vector de expresión en el que se podría insertar correctamente el inserto se denominó "32A1H/pEF1/FCCU".

c) Producción de la construcción de expresión de cadena ligera del anticuerpo quimérico humano #32A1

Como cebadores para amplificar el ADNc de la región variable de cadena ligera de #32A1 mediante PCR, un oligonucleótido que tiene una secuencia de 5'-aaacatatggcGACATTGTCTTGACCCAGTCTCCTGCTTTGG-3' (32A1LF: SEQ ID NO: 38 en el listado de secuencias) y un oligonucleótido que tiene una secuencia de 5'-aaacgtacgTCTCAATTCCAGCTTGGTGCCTCCAGCG-3' (32A1LR SEQ ID NO: 39 en el listado de secuencias) se sintetizaron según un procedimiento habitual.

En relación con esto, para integrar un producto de PCR en pEF6KCL, estos cebadores se diseñaron de modo que se añadió una secuencia de reconocimiento para la enzima de restricción NdeI a 32A1LF y se añadió una secuencia de reconocimiento para la enzima de restricción BsiWI a 32A1LR. La PCR se realizó según un procedimiento habitual utilizando esta combinación de cebadores y el ADNc de la región variable de cadena ligera purificada en e) del ejemplo 17 como molde. El producto de PCR resultante se purificó utilizando el equipo de purificación de PCR MinElute (QIAGEN, Inc.) y, a continuación, se insertó un fragmento de ADN obtenido al digerir el producto de PCR con las enzimas de restricción NdeI (TaKaRa Bio, Inc.) y BsiWI (NEW ENGLAND BIOLABS, Inc.) en el pEF6KCL en el sitio escindido con las enzimas de restricción NdeI (TaKaRa Bio, Inc.) y BsiWI (NEW ENGLAND BIOLABS, Inc.), de modo que se construyó una construcción de expresión de cadena ligera de anticuerpo quimérico humano #32A1. La secuencia del inserto se confirmó mediante un análisis de secuencia. Como cebador para secuenciación, se usó un cebador F11 representado por la SEQ ID NO: 37 en el listado de secuencias. Un vector de expresión en el que se podría insertar correctamente el inserto se denominó "32A1L/pEF6KCL".

El gen de la cadena pesada del anticuerpo quimérico humano #32A1 producido en b) tiene la secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 40 en el listado de secuencias y codifica la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 41 en el listado de secuencias. La secuencia de aminoácidos representada por los números de aminoácidos 1 a 19 de la SEQ ID NO: 41 corresponde a una señal secretora, la secuencia de aminoácidos representada por los números de aminoácidos 20 a 140 de la misma corresponde a una región variable de cadena pesada y la secuencia de aminoácidos representada por los números de aminoácidos 141 a 470 de la misma corresponde a una región constante de cadena pesada. Además, el gen de la cadena ligera del anticuerpo quimérico humano #32A1 producido en c) tiene la secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 42 en el listado de secuencias y codifica la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 43 en el listado de secuencias. La secuencia de aminoácidos representada por los números de aminoácidos 1 a 20 de la SEQ ID NO: 43 corresponde a una señal secretora, la secuencia de aminoácidos representada por los números de aminoácidos 21 a 132 de la misma corresponde a una región variable de cadena ligera y la secuencia de aminoácidos representada por los números de aminoácidos 133 a 237 de la misma corresponde a una región constante de cadena ligera.

Ejemplo 19

Preparación de anticuerpo quimérico humano de anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón #32A1 a) Producción de anticuerpo quimérico humano

Se sembraron 3 x 107 células de células 293 FreeStyle en fase de crecimiento logarítmico en 30 ml de medio de expresión FreeStyle 293 nuevo (Invitrogen, Inc.) (se prepararon cuatro lotes, en los que el cultivo de 30 ml se tomó como un lote) y se sometieron a cultivo con agitación (125 rpm) a 37 °C en una incubadora de CO2 al 8%. Se disolvieron 300 |jg de polietilenimina (fabricada por Polyscience, Inc. n.° 24765) en 1 ml de medio Opti-Pro SFM (fabricado por Invitrogen, Inc.) y la solución resultante se dejó a temperatura ambiente durante 5 minutos. El vector de expresión de cadena pesada del anticuerpo quimérico humano #32A1 32A1H/pEF1/FCCU y el vector de expresión de cadena ligera del anticuerpo quimérico humano #32A1 32A1L/pEF6KCL producido en el ejemplo 18 se prepararon utilizando el equipo de plásmido PureLink HiPure (Invitrogen, Inc.). El 32AlH/pEF1/FCCU (15 jg ) y el 32AlL/pEF6KCL (45 jg ) se suspendieron en 1 ml de medio Opti-Pro SFM (Invitrogen, Inc.) y la suspensión resultante se añadió a 1 ml del líquido mixto de polietilenimina/Opti-Pro SFM que se había dejado a temperatura ambiente durante 5 minutos y la mezcla resultante se dejó a temperatura ambiente durante 5 minutos más. Posteriormente, se añadieron 2 ml del líquido mixto de polietilenimina/los vectores de expresión/Opti-Pro SFM a cada lote de la suspensión de células 293 FreeStyle y se continuó el cultivo con agitación. Después de cultivar las células durante 7 días a 37 °C en CO2 al 8 %, se recogió el sobrenadante del cultivo de cada lote.

b) Purificación de anticuerpo quimérico humano

Se filtraron 90 ml del sobrenadante de cultivo (para tres lotes) obtenido anteriormente a través de un filtro (fabricado por NALGENE, Inc., #295-4545) y se añadieron 0,5 ml de MabSelect SuRe (fabricado por GE Healthcare Bio-science Co., Ltd., n.° 17-5438-01) equilibrado con PBS al filtrado y la mezcla resultante se agitó durante una noche a 80 rpm y 10 °C. Al día siguiente, el vehículo se recogió y se lavó con PBS y, a continuación, el anticuerpo se eluyó con una solución de arginina 1 M (pH 4,0). El eluido se aplicó a una columna PD-10 (fabricada por GE Healthcare Bio-science Co., Ltd., n.° 17-0851-01) para reemplazar el líquido con PBS y después se concentró con Amicon Ultra-4 (fabricado por Millipore Co., Ltd., n.° UFC805008), de modo que se obtuvieron 1,2 ml de un anticuerpo quimérico humano (0,98 mg/ml). La concentración del anticuerpo se calculó a partir de la medición a 280 nm obtenida utilizando el biofotómetro de red de diodos Hitachi U-0080D.

Ejemplo 20

Evaluación de la propiedad de anticuerpo quimérico humano del anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón #32A1 que se une a la proteína Siglec-15 de ratón

La inhibición competitiva del anticuerpo de rata #32A1 contra el anticuerpo quimérico humano purificado preparado en el ejemplo 19 se determinó mediante el siguiente procedimiento. El Siglec-15-Fc de ratón purificado en el ejemplo 4 se diluyó a 1 jg/m l con PBS, la solución diluida se distribuyó a 100 jl/pocillo en una inmunoplaca (fabricada por Nunc, Inc., n.° 437111) y la placa se dejó reposar durante una noche a 4 °C, por lo que la proteína se adsorbió en la placa. Al día siguiente, cada pocillo se lavó dos veces con una solución de PBS-T (PBS, Tween 200,05 % (v/v)), una solución obtenida diluyendo leche desnatada (fabricada por Morinaga Milk Industry Co., Ltd.) al 5 % con PBS se distribuyó a 350 jl/pocillo y la placa se dejó reposar a temperatura ambiente durante 2 horas. Se eliminó el líquido de cada pocillo y se lavó cada pocillo 3 veces con la solución de PBS-T. A continuación, una solución mixta (una solución de PBS que contiene leche desnatada en una concentración final de 0,5 %) que contenía el anticuerpo quimérico humano a 0,25 jg/m l y el anticuerpo #32A1 o un anticuerpo IgG de control de rata (fabricado por R&D Systems, Inc., n.° 6-001-A) a una concentración diferente (0 jg/ml, 0,016 jg/ml, 0,05 jg/ml, 0,16 jg/ml, 0,5 jg/ml, 1,66 jg/m l o 5 jg/m l) se distribuyó a 100 jl/pocillo y la placa se dejó reposar a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de lavar cada pocillo 3 veces con la solución de PBS-T, se añadió IgG de cabra antihumano AffiniPure conjugado con fosfatasa alcalina (fabricado por Jackson ImmunoResearch, Inc., n.° 109-055-097) diluido a 2500 veces con una solución de TBS-T (TBS, Tween 20 al 0,05 % (v/v)) a 100 jl/pocillo y la placa se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 hora. Se eliminó el líquido de cada pocillo y se lavó cada pocillo 5 veces con la solución de TBS-T. A continuación, se añadió una solución de sustrato fluorescente (fabricada por Roche Co., Ltd., n.° 11681982001) a 100 jl/pocillo y se permitió que se produjera una reacción de fluorescencia. A los 10 minutos de la adición de la solución de sustrato fluorescente, la intensidad de la fluorescencia se midió utilizando un lector de placas. Como resultado, se mostró que el anticuerpo #32A1 inhibe la unión del anticuerpo quimérico humano a la Siglec-15-Fc de ratón de una manera dependiente de la concentración. Además, cuando el anticuerpo #32A1 y el anticuerpo quimérico humano se mezclaron a la misma concentración (1:1), se presentó aproximadamente 40 % de inhibición competitiva. Por lo tanto, se considera que el anticuerpo #32A1 y el anticuerpo quimérico humano tienen sustancialmente la misma afinidad por la Siglec-15-Fc de ratón. Por otro lado, la IgG de control de rata no mostró inhibición competitiva (fig. 15).

Ejemplo 21

Evaluación de la actividad biológica de anticuerpo quimérico humano del anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón #32A1 basada en la prueba de formación de osteoclastos de ratón y la prueba de formación de osteoclastos humanos

a) Prueba de formación de osteoclastos de ratón

Utilizando el anticuerpo quimérico humano del anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón #32A1 preparado en el ejemplo 19, se examinó el efecto sobre la diferenciación de osteoclastos de células no adherentes de médula ósea de ratón. Las células no adherentes de médula ósea de ratón preparadas por el procedimiento del ejemplo 8 se prepararon a 1,5 x 105 células/ml en medio a-MEM que contenía FBS al 10 % y 10 ng/ml de M-CSF (fabricado por R&D Systems, Inc.), la preparación celular resultante se sembró en cada pocillo de una placa de 96 pocillos en una cantidad de 200 pl y las células se cultivaron durante 2 días en una incubadora de CO2. Se retiró la solución de cultivo antigua en la placa de 96 pocillos y se añadieron 100 pl de medio MEM-a a cada pocillo, conteniendo los 100 pl de medio MEM-a FBS al 10 % al que se habían añadido RANKL humano (RANKL, fabricado por Peprotech, Inc.) y M-CSF para dar concentraciones finales de 20 ng/ml y 10 ng/ml, respectivamente. A la solución de cultivo celular, se añadió el anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón #32A1 producido en el ejemplo 6 o el anticuerpo quimérico humano del anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón #32A1 preparado en el ejemplo 19 a una concentración de 3 a 100 ng/ml y las células se cultivaron durante 3 días adicionales en una incubadora de CO2. Después de finalizar el cultivo, se midió la actividad de la fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP) de los osteoclastos formados mediante el procedimiento descrito en el ejemplo 9. Después de detener la reacción enzimática, se midió una absorbancia de cada pocillo a 405 nm y se utilizó la medida obtenida como índice de la actividad de TRAP. Los resultados se muestran en la fig. 16. Se observó una inhibición dependiente de la dosis de la actividad TRAP a una concentración de 50 ng/ml o superior en el caso del anticuerpo #32A1 y el anticuerpo quimérico humano del anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón #32A1. A partir de este resultado, se mostró que el anticuerpo quimérico humano del anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón #32A1 tiene una actividad de inhibición de la formación de osteoclastos (diferenciación y maduración de osteoclastos) sustancialmente comparable a la del anticuerpo de rata #32A1.

b) Evaluación utilizando células precursoras de osteoclastos humanos normales (tinción TRAP)

Se sembraron células precursoras de osteoclastos humanos normales (células precursoras de osteoclastos naturales humanos normales, adquiridas de Sanko Junyaku Co., Ltd., cat. n.° 2T-110) en una placa de 96 pocillos a 1 x 104 células/pocillo según el protocolo adjunto a las células. Como medio, se utilizó un medio esencial mínimo para células precursoras de osteoclastos (OPBM, adquirido de Sanko Junyaku Co., Ltd., cat. n.° PT-8201) complementado con un conjunto de complementos OPGM (adquirido de Sanko Junyaku Co., Ltd., cat. n.° PT-9501) que contiene suero fetal bovino (concentración final: 10 %), RANKL humano (concentración final: 66 ng/ml), M-CSF humano (concentración final: 33 ng/ml) y similares. Al sobrenadante de cultivo resultante, se añadió el anticuerpo quimérico humano del anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón #32A1 preparado en el ejemplo 19 a una concentración final de 0,3, 1, 3 o 10 pg/ml y las células se cultivaron durante 3 días en una incubadora de CO2. Después del cultivo, se eliminó el sobrenadante y se añadió formalina neutra al 10 % para fijar las células. Después de fijar las células, las células se lavaron dos veces con agua destilada, una solución de tinción TRAP (fosfato de naftol AS-MX 0,27 mM (fabricado por Sigma Co., Ltd.), sal LB violeta roja rápida 1,6 mM (fabricada por Sigma Co., Ltd.), dimetilformamida al 1 %, tartrato de sodio 50 mM, Se añadió tampón de acetato de sodio 0,1 M (pH 5,0)) a 100 pl/pocillo y se permitió que se produjera una reacción a temperatura ambiente durante 5 minutos. Después de la reacción, las células se lavaron dos veces con agua destilada y después se observaron mediante microscopia (fig. 17). Como resultado, la formación de osteoclastos multinucleados positivos para TRAP se inhibió mediante la adición del anticuerpo quimérico humano de #32A1 dentro del intervalo de 0,3 pg/ml a 10 pg/ml.

Ejemplo 22

Diseño de anticuerpo humanizado de anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 ratón #32A1 (1)

a) Diseño de versión humanizada de #32A1

a)-i) Modelado molecular de la región variable de #32A1

El modelado molecular de la región variable de #32A1 se realizó mediante un procedimiento conocido en general como modelado de homología (Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991)). Las secuencias primarias (están disponibles estructuras tridimensionales procedentes de las estructuras cristalinas de rayos X) de las regiones variables de inmunoglobulina humana registradas en el banco de datos de proteínas (Nuc. Acid Res. 35, D301-D303 (2007)) se compararon con la región variable de #32A1 determinada anteriormente. Como resultado, Se seleccionó 1LK3 por tener la mayor homología de secuencia con la región variable de la cadena ligera de #32A1 entre anticuerpos que tienen una supresión similar en el marco conservado. Además, Se seleccionó 1AD0 por tener la mayor homología de secuencia con la región variable de la cadena pesada de #32A1. La estructura tridimensional de la región marco conservada se generó obteniendo el "modelo de marco conservado" combinando las coordenadas de 1LK3 y 1AD0 correspondientes a las cadenas ligera y pesada de #32A1. Las CDR de #32A1 se clasificaron según la clasificación de Thornton y col. (J. Mol. Biol., 263, 800-815, (1996)) de la siguiente manera: CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1 y CDRH2 se asignaron a los grupos 15A, 7A, 9A, 10A y 12B, respectivamente. CDRH3 se clasificó en k(8)C según las normas H3 (FEBS letter 399, 1-8 (1996)). A continuación, las conformaciones representativas de las CDR respectivas se integraron en el modelo de marco conservado.

Finalmente, para obtener un modelo molecular probable de la región variable de #32A1 en términos de energía, se realizó un cálculo de energía para excluir el contacto interatómico desventajoso. El procedimiento anterior se realizó utilizando el programa de predicción de la estructura proteica tridimensional disponible en el mercado Prime y el programa de búsqueda de coordenadas MacroModel (Schrodinger, LLC).

a) -ii) Diseño de secuencia de aminoácidos de #32A1 humanizado

Un anticuerpo humanizado #32A1 se construyó según un procedimiento conocido en general como injerto de CDR (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)). Se seleccionó un anticuerpo aceptor de dos formas basándose en la homología de aminoácidos dentro de la región marco conservada. La secuencia de la región marco conservada de #32A1 se comparó con las secuencias de todos los marcos conservados humanos en la base de datos de Kabat (Nuc. Acid Res. 29, 205-206 (2001)) que implicaban secuencias de aminoácidos de anticuerpos. Como resultado, se seleccionó un anticuerpo M37GO37'Cl como aceptor basándose en una homología de secuencia del 73 % en la región marco conservada. Los restos de aminoácidos en la región marco conservada de M37GO37'CL se alinearon con los restos de aminoácidos de #32A1 y se identificaron las posiciones en las que se usaron aminoácidos diferentes. Las posiciones de estos restos se analizaron usando el modelo tridimensional de #32A1 construido anteriormente. A continuación, se seleccionaron restos de donantes para injertar en el aceptor según los criterios proporcionados por Queen y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)).

La secuencia de la región marco conservada de #32A1 se comparó con las secuencias de todos los marcos conservados humanos en la IgBLAST (Nuc. Acid Res.36, D25-D30 (2007)). Como resultado, para la cadena L, se seleccionó AAB34430 como aceptor basándose en una homología de secuencia del 79 % en la región marco conservada. En cuanto a la cadena H, se seleccionó CAF31288 como aceptor basándose en una homología de secuencia del 78 % en la región marco conservada. Con respecto a la cadena L, los restos de aminoácidos en la región marco conservada de AAB34430, y, con respecto a la cadena H, los restos de aminoácidos en la región marco conservada de CAF31288, se alinearon con los restos de aminoácidos de #32A1 y se identificaron las posiciones en las que se utilizaron diferentes aminoácidos. Las posiciones de estos restos se analizaron usando el modelo tridimensional de #32A1 construido anteriormente. A continuación, los restos de donantes para injertar en el aceptor se seleccionaron según los criterios proporcionados por Queen y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)). En estos procedimientos, transfiriendo algunos restos de donantes seleccionados al anticuerpo aceptor, se construyeron secuencias humanizadas de #32A1 como se describe en los siguientes ejemplos.

b) Humanización de la cadena pesada de #32A1

b)-i) Cadena pesada de tipo h#32A1-T1H:

Una cadena pesada de #32A1 humanizada diseñada sustituyendo los números de aminoácidos 23 (isoleucina), 24 (leucina), 26 (treonina), 32 (lisina), 43 (treonina), 61 (ácido glutámico), 89 (valina), 95 (ácido aspártico), 96 (serina), 97 (ácido glutámico), 98 (serina), 100 (valina), 104 (valina), 105 (serina), 114 (isoleucina), 118 (treonina), 134 (valina), 135 (metionina) y 140 (leucina) de la cadena pesada de #32A1 representada por la SEQ ID NO: 28 en el listado de secuencias por leucina, valina, serina, glutamina, alanina, glicina, fenilalanina, asparagina, alanina, lisina, asparagina, leucina, metionina, asparagina, valina, alanina, treonina, leucina y serina, respectivamente, se denominó "cadena pesada de tipo h#32A1-T1H".

La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de tipo h#32A1-T1H está representada por la SEQ ID NO: 51 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los restos de aminoácidos 1 a 19 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 51, la secuencia que comprende los restos de aminoácidos 20 a 140 de la misma y la secuencia que comprende los restos de aminoácido 141 a 470 de la misma corresponden a la secuencia señal, la región variable de cadena pesada y la región constante de cadena pesada, respectivamente. Una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 51 está representada por la SEQ ID NO: 50 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los nucleótidos 1 a 57 de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 50, la secuencia que comprende los nucleótidos 58 a 420 de la misma y la secuencia que comprende los nucleótidos 421 a 1410 de la misma codifican la secuencia señal, la secuencia de región variable de cadena pesada y la secuencia de región constante de cadena pesada, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 50 y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 51 también se muestran en la fig. 27.

b)-ii) Cadena pesada de tipo h#32A1-T2H:

Una cadena pesada de #32A1 humanizada diseñada sustituyendo los números de aminoácidos 23 (isoleucina), 24 (leucina), 26 (treonina), 32 (lisina), 43 (treonina), 95 (ácido aspártico), 96 (serina), 97 (ácido glutámico), 98 (serina), 100 (valina), 104 (valina), 114 (isoleucina), 118 (treonina), 134 (valina), 135 (metionina) y 140 (leucina) de la cadena pesada de #32A1 representada por la SEQ ID NO: 28 en el listado de secuencias por leucina, valina, serina, glutamina, alanina, asparagina, alanina, lisina, asparagina, leucina, metionina, valina, alanina, treonina, leucina y serina, respectivamente, se denominó "cadena pesada de tipo h#32A1-T2H".

La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de tipo h#32A1-T2H está representada por la SEQ ID NO: 53 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los restos de aminoácidos 1 a 19 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 53, la secuencia que comprende los restos de aminoácidos 20 a 140 de la misma y la secuencia que comprende los restos de aminoácido 141 a 470 de la misma corresponden a la secuencia señal, la región variable de cadena pesada y la región constante de cadena pesada, respectivamente. Una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 53 está representada por la SEQ ID NO: 52 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los nucleótidos 1 a 57 de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 52, la secuencia que comprende los nucleótidos 58 a 420 de la misma y la secuencia que comprende los nucleótidos 421 a 1410 de la misma codifican la secuencia señal, la secuencia de región variable de cadena pesada y la secuencia de región constante de cadena pesada, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 52 y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 53 también se muestran en la fig. 28.

b)-iii) Cadena pesada de tipo h#32A1-T3H:

Una cadena pesada de #32A1 humanizada diseñada sustituyendo los números de aminoácidos 24 (leucina), 26 (treonina), 32 (lisina), 104 (valina), 114 (isoleucina), 134 (valina), 135 (metionina) y 140 (leucina) de la cadena pesada de #32A1 representada por la SEQ ID NO: 28 en el listado de secuencias por valina, serina, glutamina, metionina, valina, treonina, leucina y serina, respectivamente, se denominó "cadena pesada de tipo h#32A1-T3H".

La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de tipo h#32A1-T3H está representada por la SEQ ID NO: 55 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los restos de aminoácidos 1 a 19 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 55, la secuencia que comprende los restos de aminoácidos 20 a 140 de la misma y la secuencia que comprende los restos de aminoácido 141 a 470 de la misma corresponden a la secuencia señal, la región variable de cadena pesada y la región constante de cadena pesada, respectivamente. La secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 55 está representada por la SEQ ID NO: 54 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los nucleótidos 1 a 57 de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 54, la secuencia que comprende los nucleótidos 58 a 420 de la misma y la secuencia que comprende los nucleótidos 421 a 1410 de la misma codifican la secuencia señal, la secuencia de región variable de cadena pesada y la secuencia de región constante de cadena pesada, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 54 y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 55 también se muestran en la fig. 29.

b)-iv) Cadena pesada de tipo h#32A1-T5H:

Una cadena pesada de #32A1 humanizada diseñada sustituyendo los números de aminoácidos 23 (isoleucina), 24 (leucina), 26 (treonina), 32 (lisina), 61 (ácido glutámico), 89 (valina), 95 (ácido aspártico), 97 (ácido glutámico), 99 (serina), 104 (valina), 105 (serina), 114 (isoleucina), 134 (valina), 135 (metionina) y 140 (leucina) de la cadena pesada de #32A1 representada por la SEQ ID NO: 28 en el listado de secuencias por valina, valina, serina, glutamina, glicina, fenilalanina, asparagina, lisina, treonina, metionina, asparagina, valina, treonina, leucina y serina, respectivamente, se denominó "cadena pesada de tipo h#32A1-T5H".

La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de tipo h#32A1-T5H está representada por la SEQ ID NO: 57 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los restos de aminoácidos 1 a 19 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 57, la secuencia que comprende los restos de aminoácidos 20 a 140 de la misma y la secuencia que comprende los restos de aminoácido 141 a 470 de la misma corresponden a la secuencia señal, la región variable de cadena pesada y la región constante de cadena pesada, respectivamente. Una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 57 está representada por la SEQ ID NO: 56 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los nucleótidos 1 a 57 de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 56, la secuencia que comprende los nucleótidos 58 a 420 de la misma y la secuencia que comprende los nucleótidos 421 a 1410 de la misma codifican la secuencia señal, la secuencia de región variable de cadena pesada y la secuencia de región constante de cadena pesada, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 56 y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 57 también se muestran en la fig. 30.

b)-v) Cadena pesada de tipo h#32A1-T6H:

Una cadena pesada de #32A1 humanizada diseñada sustituyendo los números de aminoácidos 23 (isoleucina), 24 (leucina), 26 (treonina), 32 (lisina), 95 (ácido aspártico), 97 (ácido glutámico), 99 (serina), 104 (valina), 114 (isoleucina), 134 (valina), 135 (metionina) y 140 (leucina) de la cadena pesada de #32A1 representada por la SEQ ID NO: 28 en el listado de secuencias por valina, valina, serina, glutamina, asparagina, lisina, treonina, metionina, valina, treonina, leucina y serina, respectivamente, se denominó "cadena pesada de tipo h#32A1-T6H".

La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de tipo h#32A1-T6H está representada por la SEQ ID NO: 59 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los restos de aminoácidos 1 a 19 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 59, la secuencia que comprende los restos de aminoácidos 20 a 140 de la misma y la secuencia que comprende los restos de aminoácido 141 a 470 de la misma corresponden a la secuencia señal, la región variable de cadena pesada y la región constante de cadena pesada, respectivamente. Una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 59 está representada por la SEQ ID NO: 58 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los nucleótidos 1 a 57 de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 58, la secuencia que comprende los nucleótidos 58 a 420 de la misma y la secuencia que comprende los nucleótidos 421 a 1410 de la misma codifican una secuencia señal, la secuencia de región variable de cadena pesada y la secuencia de región constante de cadena pesada, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 58 y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 59 también se muestran en la fig. 31.

b)-vi) Cadena pesada de tipo h#32A1-T7H:

Una cadena pesada de #32A1 humanizada diseñada sustituyendo los números de aminoácidos 23 (isoleucina), 24 (leucina), 26 (treonina), 32 (lisina), 43 (treonina), 89 (valina), 95 (ácido aspártico), 96 (serina), 97 (ácido glutámico), 98 (serina), 100 (valina), 104 (valina), 105 (serina), 114 (isoleucina), 118 (treonina), 134 (valina), 135 (metionina) y 140 (leucina) de la cadena pesada de #32A1 representada por la SEQ ID NO: 28 en el listado de secuencias por leucina, valina, serina, glutamina, alanina, fenilalanina, asparagina, alanina, lisina, asparagina, leucina, metionina, asparagina, valina, alanina, treonina, leucina y serina, respectivamente, se denominó "cadena pesada de tipo h#32A1-T7H".

La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de tipo h#32A1-T7H está representada por la SEQ ID NO: 72 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los restos de aminoácidos 1 a 121 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 72 y la secuencia que comprende los restos de aminoácidos 122 a 451 de la misma corresponden a la región variable de cadena pesada y la región constante de cadena pesada, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 72 también se muestra en la fig. 38.

b)-vii) Cadena pesada de tipo h#32A1-T8H:

Una cadena pesada de #32A1 humanizada diseñada sustituyendo los números de aminoácidos 23 (isoleucina), 24 (leucina), 26 (treonina), 32 (lisina), 43 (treonina), 61 (ácido glutámico), 95 (ácido aspártico), 96 (serina), 97 (ácido glutámico), 98 (serina), 100 (valina), 104 (valina), 105 (serina), 114 (isoleucina), 118 (treonina), 134 (valina), 135 (metionina) y 140 (leucina) de la cadena pesada de #32A1 representada por la SEQ ID NO: 28 en el listado de secuencias por leucina, valina, serina, glutamina, alanina, glicina, asparagina, alanina, lisina, asparagina, leucina, metionina, asparagina, valina, alanina, treonina, leucina y serina, respectivamente, se denominó "cadena pesada de tipo h#32A1-T8H".

La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de tipo h#32A1-T8H está representada por la SEQ ID NO: 73 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los restos de aminoácidos 1 a 121 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 73 y la secuencia que comprende los restos de aminoácidos 122 a 451 de la misma corresponden a la región variable de cadena pesada y la región constante de cadena pesada, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 73 también se muestra en la fig. 38.

b)-viii) Cadena pesada de tipo h#32A1-T9H:

Una cadena pesada de #32A1 humanizada diseñada sustituyendo los números de aminoácidos 23 (isoleucina), 24 (leucina), 26 (treonina), 32 (lisina), 43 (treonina), 61 (ácido glutámico), 89 (valina), 95 (ácido aspártico), 96 (serina), 97 (ácido glutámico), 98 (serina), 100 (valina), 104 (valina), 114 (isoleucina), 118 (treonina), 134 (valina), 135 (metionina) y 140 (leucina) de la cadena pesada de #32A1 representada por la SEQ ID NO: 28 en el listado de secuencias por leucina, valina, serina, glutamina, alanina, glicina, fenilalanina, asparagina, alanina, lisina, asparagina, leucina, metionina, valina, alanina, treonina, leucina y serina, respectivamente, se denominó "cadena pesada de tipo h#32A1-T9H".

La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de tipo h#32A1-T9H está representada por la SEQ ID NO: 74 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los restos de aminoácidos 1 a 121 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 74 y la secuencia que comprende los restos de aminoácidos 122 a 451 de la misma corresponden a la región variable de cadena pesada y la región constante de cadena pesada, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 74 también se muestra en la fig. 38.

b)-ix) Cadena pesada de tipo h#32A1-T10H:

Una cadena pesada de #32A1 humanizada diseñada sustituyendo los números de aminoácidos 23 (isoleucina), 24 (leucina), 26 (treonina), 32 (lisina), 43 (treonina), 95 (ácido aspártico), 96 (serina), 97 (ácido glutámico), 98 (serina), 100 (valina), 104 (valina), 105 (serina), 114 (isoleucina), 118 (treonina), 134 (valina), 135 (metionina) y 140 (leucina) de la cadena pesada de #32A1 representada por la SEQ ID NO: 28 en el listado de secuencias por leucina, valina, serina, glutamina, alanina, asparagina, alanina, lisina, asparagina, leucina, metionina, asparagina, valina, alanina, treonina, leucina y serina, respectivamente, se denominó "cadena pesada de tipo h#32A1-T10H".

La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de tipo h#32A1-T10H está representada por la SEQ ID NO: 75 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los restos de aminoácidos 1 a 121 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 75 y la secuencia que comprende los restos de aminoácidos 122 a 451 de la misma corresponden a la región variable de cadena pesada y la región constante de cadena pesada, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 75 también se muestra en la fig. 39.

b)-x) Cadena pesada de tipo h#32A1-T11H:

Una cadena pesada de #32A1 humanizada diseñada sustituyendo los números de aminoácidos 23 (isoleucina), 24 (leucina), 26 (treonina), 32 (lisina), 43 (treonina), 89 (valina), 95 (ácido aspártico), 96 (serina), 97 (ácido glutámico), 98 (serina), 100 (valina), 104 (valina), 114 (isoleucina), 118 (treonina), 134 (valina), 135 (metionina) y 140 (leucina) de la cadena pesada de #32A1 representada por la SEQ ID NO: 28 en el listado de secuencias por leucina, valina, serina, glutamina, alanina, fenilalanina, asparagina, alanina, lisina, asparagina, leucina, metionina, valina, alanina, treonina, leucina y serina, respectivamente, se denominó "cadena pesada de tipo h#32A1 -T11H".

La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de tipo h#32A1-T11H está representada por la SEQ ID NO: 76 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los restos de aminoácidos 1 a 121 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 76 y la secuencia que comprende los restos de aminoácidos 122 a 451 de la misma corresponden a la región variable de cadena pesada y la región constante de cadena pesada, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 76 también se muestra en la fig. 39.

b) -xi) Cadena pesada de tipo h#32A1-T12H:

Una cadena pesada de #32A1 humanizada diseñada sustituyendo los restos de aminoácidos 23 (isoleucina), 24 (leucina), 26 (treonina), 32 (lisina), 43 (treonina), 61 (ácido glutámico), 95 (ácido aspártico), 96 (serina), 97 (ácido glutámico), 98 (serina), 100 (valina), 104 (valina), 114 (isoleucina), 118 (treonina), 134 (valina), 135 (metionina) y 140 (leucina) de la cadena pesada de #32A1 representada por la SEQ ID NO: 28 en el listado de secuencias por leucina, valina, serina, glutamina, alanina, glicina, asparagina, alanina, lisina, asparagina, leucina, metionina, valina, alanina, treonina, leucina y serina, respectivamente, se denominó "cadena pesada de tipo h#32A1-T12H".

La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de tipo h#32A1-T12H está representada por la SEQ ID NO: 77 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los restos de aminoácidos 1 a 121 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 77 y la secuencia que comprende los restos de aminoácidos 122 a 451 de la misma corresponden a la región variable de cadena pesada y la región constante de cadena pesada, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 77 también se muestra en la fig. 39.

c) Humanización de cadena ligera de #32A1

c)-i) Cadena ligera de tipo h#32A1-T1L:

Una cadena ligera de #32A1 humanizada diseñada sustituyendo los números de aminoácidos 24 (leucina), 29 (alanina), entre 29 y 30 (es decir, insertando un resto ausente en el armazón de rata), 36 (glutamina), 41 (serina), 66 (glutamina), 68 (arginina), 81 (isoleucina), 99 (asparagina), 100 (prolina), 101 (valina), 104 (ácido aspártico), 106 (isoleucina), 108 (treonina), 110 (fenilalanina), 122 (alanina), 127 (leucina), 129 (leucina), 130 (arginina) y 132 (alanina) de la cadena ligera de #32A1 representada por la SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias por metionina, ácido aspártico, serina, ácido glutámico, asparagina, prolina, lisina, valina, serina, serina, leucina, ácido glutámico, valina, valina, tirosina, glicina, valina, isoleucina, lisina y treonina, respectivamente, se denominó "cadena ligera de tipo h#32A1-T1L".

La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo h#32A1-T1L está representada por la SEQ ID NO: 61 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los restos de aminoácidos 1 a 20 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 61, la secuencia que comprende los restos de aminoácidos 21 a 133 de la misma y la secuencia que comprende los restos de aminoácido 134 a 238 de la misma corresponden a la secuencia señal, la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. Una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 61 está representada por la SEQ ID NO: 60 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los nucleótidos 1 a 60 de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 60, la secuencia que comprende los nucleótidos 61 a 399 de la misma y la secuencia que comprende los nucleótidos 400 a 714 de la misma codifican la secuencia señal, la secuencia de región variable de cadena ligera y la secuencia de región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 60 y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 61 también se muestran en la fig. 32.

c)-ii) Cadena ligera de tipo h#32A1-T2L:

Una cadena ligera de #32A1 humanizada diseñada sustituyendo los números de aminoácidos 24 (leucina), 29 (alanina), entre 29 y 30 (es decir, insertando un resto ausente en el armazón de rata), 36 (glutamina), 66 (glutamina), 81 (isoleucina), 99 (asparagina), 100 (prolina), 101 (valina), 104 (ácido aspártico), 106 (isoleucina), 108 (treonina), 127 (leucina), 129 (leucina), 130 (arginina) y 132 (alanina) de la cadena ligera de #32A1 representada por la SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias por metionina, ácido aspártico, serina, ácido glutámico, prolina, valina, serina, serina, leucina, ácido glutámico, valina, valina, valina, isoleucina, lisina y treonina, respectivamente, se denominó "cadena ligera de tipo h#32A1-T2L".

La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo h#32A1-T2L está representada por la SEQ ID NO: 63 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los restos de aminoácidos 1 a 20 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 63, la secuencia que comprende los restos de aminoácidos 21 a 133 de la misma y la secuencia que comprende los restos de aminoácido 134 a 238 de la misma corresponden a la secuencia señal, la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. Una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 63 está representada por la SEQ ID NO: 62 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los nucleótidos 1 a 60 de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 62, la secuencia que comprende los nucleótidos 61 a 399 de la misma y la secuencia que comprende los nucleótidos 400 a 714 de la misma codifican la secuencia señal, la secuencia de región variable de cadena ligera y la secuencia de región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 62 y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 63 también se muestran en la fig. 33.

c)-iii) Cadena ligera de tipo h#32A1-T3L:

Una cadena ligera de #32A1 humanizada diseñada sustituyendo los números de aminoácidos 29 (alanina), entre 29 y 30 (es decir, insertando un resto ausente en el armazón de rata), 36 (glutamina), 99 (asparagina), 100 (prolina), 101 (valina), 104 (ácido aspártico), 106 (isoleucina), 127 (leucina), 129 (leucina), 130 (arginina) y 132 (alanina) de la cadena ligera de #32A1 representada por la SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias por ácido aspártico, serina, ácido glutámico, serina, serina, leucina, ácido glutámico, valina, valina, isoleucina, lisina y treonina, respectivamente, se denominó "cadena ligera de tipo h#32A1-T3L".

La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo h#32A1-T3L está representada por la SEQ ID NO: 65 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los restos de aminoácidos 1 a 20 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 65, la secuencia que comprende los restos de aminoácidos 21 a 133 de la misma y la secuencia que comprende los restos de aminoácido 134 a 238 de la misma corresponden a la secuencia señal, la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. Una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 65 está representada por la SEQ ID NO: 64 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los nucleótidos 1 a 60 de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 64, la secuencia que comprende los nucleótidos 61 a 399 de la misma y la secuencia que comprende los nucleótidos 400 a 714 de la misma codifican la secuencia señal, la secuencia de región variable de cadena ligera y la secuencia de región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 64 y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 65 también se muestran en la fig. 34.

c)-iv) Cadena ligera de tipo h#32A1-T4L:

Una cadena ligera de #32A1 humanizada diseñada sustituyendo los números de aminoácidos 36 (glutamina), 99 (asparagina), 100 (prolina), 101 (valina), 104 (ácido aspártico), 106 (isoleucina), 129 (leucina), 130 (arginina) y 132 (alanina) de la cadena ligera de #32A1 representada por la SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias por ácido glutámico, serina, serina, leucina, ácido glutámico, valina, isoleucina, lisina y treonina, respectivamente, se denominó "cadena ligera de tipo h#32A1-T4L".

La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo h#32A1-T4L está representada por la SEQ ID NO: 67 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los restos de aminoácidos 1 a 20 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 67, la secuencia que comprende los restos de aminoácidos 21 a 132 de la misma y la secuencia que comprende los restos de aminoácido 133 a 237 de la misma corresponden a la secuencia señal, la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. Una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 67 está representada por la SEQ ID NO: 66 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los nucleótidos 1 a 60 de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 66, la secuencia que comprende los nucleótidos 61 a 396 de la misma y la secuencia que comprende los nucleótidos 397 a 711 de la misma codifican la secuencia señal, la secuencia de región variable de cadena ligera y la secuencia de región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 66 y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 67 también se muestran en la fig. 35.

c)-v) Cadena ligera de tipo h#32A1-T5L:

Una cadena ligera de #32A1 humanizada diseñada sustituyendo los números de aminoácidos 29 (alanina), entre 29 y 30 (es decir, insertando un resto ausente en el armazón de rata), 36 (glutamina), 41 (serina), 66 (glutamina), 68 (arginina), 99 (asparagina), 100 (prolina), 101 (valina), 104 (ácido aspártico), 106 (isoleucina), 110 (fenilalanina), 122 (alanina), 123 (glicina), 127 (leucina), 129 (leucina), 130 (arginina) y 132 (alanina) de la cadena ligera de #32A1 representada por la SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias por ácido aspártico, serina, ácido glutámico, asparagina, prolina, lisina, serina, serina, leucina, ácido glutámico, valina, tirosina, glicina, glutamina, valina, isoleucina, lisina y treonina, respectivamente, se denominó "cadena ligera de tipo h#32A1-T5L".

La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo h#32A1-T5L está representada por la SEQ ID NO: 69 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los restos de aminoácidos 1 a 20 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 69, la secuencia que comprende los restos de aminoácidos 21 a 133 de la misma y la secuencia que comprende los restos de aminoácido 134 a 238 de la misma corresponden a la secuencia señal, la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. Una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 69 está representada por la SEQ ID NO: 68 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los nucleótidos 1 a 60 de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 68, la secuencia que comprende los nucleótidos 61 a 399 de la misma y la secuencia que comprende los nucleótidos 400 a 714 de la misma codifican la secuencia señal, la secuencia de región variable de cadena ligera y la secuencia de región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 68 y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 69 también se muestran en la fig. 36.

c)-vi) Cadena ligera de tipo h#32A1-T6L:

Una cadena ligera de #32A1 humanizada diseñada sustituyendo los números de aminoácidos 29 (alanina), entre 29 y 30 (es decir, insertando un resto ausente en el armazón de rata), 36 (glutamina), 66 (glutamina), 99 (asparagina), 100 (prolina), 101 (valina), 104 (ácido aspártico), 106 (isoleucina), 127 (leucina), 129 (leucina), 130 (arginina) y 132 (alanina) de la cadena ligera de #32A1 representada por la SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias por ácido aspártico, serina, ácido glutámico, prolina, serina, serina, leucina, ácido glutámico, valina, valina, isoleucina, lisina y treonina, respectivamente, se denominó "cadena ligera de tipo h#32A1-T6L".

La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo h#32A1-T6L está representada por la SEQ ID NO: 71 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los restos de aminoácidos 1 a 20 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 71, la secuencia que comprende los restos de aminoácidos 21 a 133 de la misma y la secuencia que comprende los restos de aminoácido 134 a 238 de la misma corresponden a la secuencia señal, la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. Una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 71 está representada por la SEQ ID NO: 70 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los nucleótidos 1 a 60 de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 70, la secuencia que comprende los nucleótidos 61 a 399 de la misma y la secuencia que comprende los nucleótidos 400 a 714 de la misma codifican la secuencia señal, la secuencia de región variable de cadena ligera y la secuencia de región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 70 y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 71 también se muestran en la fig. 37.

c)-vii) Cadena ligera de tipo h#32A1-T7L:

Una cadena ligera de #32A1 humanizada diseñada sustituyendo los números de aminoácidos 24 (leucina), 29 (alanina), entre 29 y 30 (es decir, insertando un resto ausente en el armazón de rata), 36 (glutamina), 66 (glutamina), 68 (arginina), 81 (isoleucina), 99 (asparagina), 100 (prolina), 101 (valina), 104 (ácido aspártico), 106 (isoleucina), 108 (treonina), 110 (fenilalanina), 122 (alanina), 127 (leucina), 129 (leucina), 130 (arginina) y 132 (alanina) de la cadena ligera de #32A1 representada por la SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias por metionina, ácido aspártico, serina, ácido glutámico, prolina, lisina, valina, serina, serina, leucina, ácido glutámico, valina, valina, tirosina, glicina, valina, isoleucina, lisina y treonina, respectivamente, se denominó "cadena ligera de tipo h#32A1-T7L".

La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo h#32A1-T7L está representada por la SEQ ID NO: 78 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los restos de aminoácidos 1 a 113 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 78 y la secuencia que comprende los restos de aminoácidos 114 a 218 de la misma corresponden a la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 78 también se muestra en la fig. 40.

c)-viii) Cadena ligera de tipo h#32A1-T8L:

Una cadena ligera de #32A1 humanizada diseñada sustituyendo los números de aminoácidos 24 (leucina), 29 (alanina), entre 29 y 30 (es decir, insertando un resto ausente en el armazón de rata), 36 (glutamina), 41 (serina), 66 (glutamina), 81 (isoleucina), 99 (asparagina), 100 (prolina), 101 (valina), 104 (ácido aspártico), 106 (isoleucina), 108 (treonina), 110 (fenilalanina), 122 (alanina), 127 (leucina), 129 (leucina), 130 (arginina) y 132 (alanina) de la cadena ligera de #32A1 representada por la SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias por metionina, ácido aspártico, serina, ácido glutámico, asparagina, prolina, valina, serina, serina, leucina, ácido glutámico, valina, valina, tirosina, glicina, valina, isoleucina, lisina y treonina, respectivamente, se denominó "cadena ligera de tipo h#32A1-T8L".

La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo h#32A1-T8L está representada por la SEQ ID NO: 79 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los restos de aminoácidos 1 a 113 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 79 y la secuencia que comprende los restos de aminoácidos 114 a 218 de la misma corresponden a la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 79 también se muestra en la fig. 40.

c)-ix) Cadena ligera de tipo h#32A1-T9L:

Una cadena ligera de #32A1 humanizada diseñada sustituyendo los números de aminoácidos 24 (leucina), 29 (alanina), entre 29 y 30 (es decir, insertando un resto ausente en el armazón de rata), 36 (glutamina), 41 (serina), 66 (glutamina), 68 (arginina), 81 (isoleucina), 99 (asparagina), 100 (prolina), 101 (valina), 104 (ácido aspártico), 106 (isoleucina), 108 (treonina), 122 (alanina), 127 (leucina), 129 (leucina), 130 (arginina) y 132 (alanina) de la cadena ligera de #32A1 representada por la SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias por metionina, ácido aspártico, serina, ácido glutámico, asparagina, prolina, lisina, valina, serina, serina, leucina, ácido glutámico, valina, valina, glicina, valina, isoleucina, lisina y treonina, respectivamente, se denominó "cadena ligera de tipo h#32A1-T9L".

La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo h#32A1-T9L está representada por la SEQ ID NO: 80 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los restos de aminoácidos 1 a 113 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 80 y la secuencia que comprende los restos de aminoácidos 114 a 218 de la misma corresponden a la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 80 también se muestra en la fig. 40.

c)-x) Cadena ligera de tipo h#32A1-T10L:

Una cadena ligera de #32A1 humanizada diseñada sustituyendo los números de aminoácidos 24 (leucina), 29 (alanina), entre 29 y 30 (es decir, insertando un resto ausente en el armazón de rata), 36 (glutamina), 41 (serina), 66 (glutamina), 68 (arginina), 81 (isoleucina), 99 (asparagina), 100 (prolina), 101 (valina), 104 (ácido aspártico), 106 (isoleucina), 108 (treonina), 110 (fenilalanina), 127 (leucina), 129 (leucina), 130 (arginina) y 132 (alanina) de la cadena ligera de #32A1 representada por la SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias por metionina, ácido aspártico, serina, ácido glutámico, asparagina, prolina, lisina, valina, serina, serina, leucina, ácido glutámico, valina, valina, tirosina, valina, isoleucina, lisina y treonina, respectivamente, se denominó "cadena ligera de tipo h#32A1-T10L".

La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo h#32A1-T10L está representada por la SEQ ID NO: 81 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los restos de aminoácidos 1 a 113 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 81 y la secuencia que comprende los restos de aminoácidos 114 a 218 de la misma corresponden a la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 81 también se muestra en la fig. 40.

c)-xi) Cadena ligera de tipo h#32A1-T11L:

Una cadena ligera de #32A1 humanizada diseñada sustituyendo los números de aminoácidos 24 (leucina), 29 (alanina), entre 29 y 30 (es decir, insertando un resto ausente en el armazón de rata), 36 (glutamina), 66 (glutamina), 81 (isoleucina), 99 (asparagina), 100 (prolina), 101 (valina), 104 (ácido aspártico), 106 (isoleucina), 108 (treonina), 110 (fenilalanina), 122 (alanina), 127 (leucina), 129 (leucina), 130 (arginina) y 132 (alanina) de la cadena ligera de #32A1 representada por la SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias por metionina, ácido aspártico, serina, ácido glutámico, prolina, valina, serina, serina, leucina, ácido glutámico, valina, valina, tirosina, glicina, valina, isoleucina, lisina y treonina, respectivamente, se denominó "cadena ligera de tipo h#32A1-T11L".

La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo h#32A1-T11L está representada por la SEQ ID NO: 82 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los restos de aminoácidos 1 a 113 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 82 y la secuencia que comprende los restos de aminoácidos 114 a 218 de la misma corresponden a la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 82 también se muestra en la fig. 40.

c)-xii) Cadena ligera de tipo h#32A1-T12L:

Una cadena ligera de #32A1 humanizada diseñada sustituyendo los números de aminoácidos 24 (leucina), 29 (alanina), entre 29 y 30 (es decir, insertando un resto ausente en el armazón de rata), 36 (glutamina), 66 (glutamina), 68 (arginina), 81 (isoleucina), 99 (asparagina), 100 (prolina), 101 (valina), 104 (ácido aspártico), 106 (isoleucina), 108 (treonina), 122 (alanina), 127 (leucina), 129 (leucina), 130 (arginina) y 132 (alanina) de la cadena ligera de #32A1 representada por la SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias por metionina, ácido aspártico, serina, ácido glutámico, prolina, lisina, valina, serina, serina, leucina, ácido glutámico, valina, valina, glicina, valina, isoleucina, lisina y treonina, respectivamente, se denominó "cadena ligera de tipo h#32A1-T12L".

La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo h#32A1-T12L está representada por la SEQ ID NO: 83 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los restos de aminoácidos 1 a 113 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 83 y la secuencia que comprende los restos de aminoácidos 114 a 218 de la misma corresponden a la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 83 también se muestra en la fig. 41.

c)-xiii) Cadena ligera de tipo h#32A1-T13L:

Una cadena ligera de #32A1 humanizada diseñada sustituyendo los números de aminoácidos 24 (leucina), 29 (alanina), entre 29 y 30 (es decir, insertando un resto ausente en el armazón de rata), 36 (glutamina), 66 (glutamina), 68 (arginina), 81 (isoleucina), 99 (asparagina), 100 (prolina), 101 (valina), 104 (ácido aspártico), 106 (isoleucina), 108 (treonina), 110 (fenilalanina), 127 (leucina), 129 (leucina), 130 (arginina) y 132 (alanina) de la cadena ligera de #32A1 representada por la SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias por metionina, ácido aspártico, serina, ácido glutámico, prolina, lisina, valina, serina, serina, leucina, ácido glutámico, valina, valina, tirosina, valina, isoleucina, lisina y treonina, respectivamente, se denominó "cadena ligera de tipo h#32A1-T13L".

La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo h#32A1-T13L está representada por la SEQ ID NO: 84 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los restos de aminoácidos 1 a 113 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 84 y la secuencia que comprende los restos de aminoácidos 114 a 218 de la misma corresponden a la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 84 también se muestra en la fig. 41.

c)-xiv) Cadena ligera de tipo h#32A1-T14L:

Una cadena ligera de #32A1 humanizada diseñada sustituyendo los números de aminoácidos 24 (leucina), 29 (alanina), entre 29 y 30 (es decir, insertando un resto ausente en el armazón de rata), 36 (glutamina), 41 (serina), 66 (glutamina), 81 (isoleucina), 99 (asparagina), 100 (prolina), 101 (valina), 104 (ácido aspártico), 106 (isoleucina), 108 (treonina), 122 (alanina), 127 (leucina), 129 (leucina), 130 (arginina) y 132 (alanina) de la cadena ligera de #32A1 representada por la SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias por metionina, ácido aspártico, serina, ácido glutámico, asparagina, prolina, valina, serina, serina, leucina, ácido glutámico, valina, valina, glicina, valina, isoleucina, lisina y treonina, respectivamente, se denominó "cadena ligera de tipo h#32A1-T14L".

La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo h#32A1-T14L está representada por la SEQ ID NO: 85 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los restos de aminoácidos 1 a 113 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 85 y la secuencia que comprende los restos de aminoácidos 114 a 218 de la misma corresponden a la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 85 también se muestra en la fig. 41.

c)-xv) Cadena ligera de tipo h#32A1-T15L:

Una cadena ligera de #32A1 humanizada diseñada sustituyendo los números de aminoácidos 24 (leucina), 29 (alanina), entre 29 y 30 (es decir, insertando un resto ausente en el armazón de rata), 36 (glutamina), 41 (serina), 66 (glutamina), 81 (isoleucina), 99 (asparagina), 100 (prolina), 101 (valina), 104 (ácido aspártico), 106 (isoleucina), 108 (treonina), 110 (fenilalanina), 127 (leucina), 129 (leucina), 130 (arginina) y 132 (alanina) de la cadena ligera de #32A1 representada por la SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias por metionina, ácido aspártico, serina, ácido glutámico, asparagina, prolina, valina, serina, serina, leucina, ácido glutámico, valina, valina, tirosina, valina, isoleucina, lisina y treonina, respectivamente, se denominó "cadena ligera de tipo h#32A1-T15L".

La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo h#32A1-T15L está representada por la SEQ ID NO: 86 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los restos de aminoácidos 1 a 113 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 86 y la secuencia que comprende los restos de aminoácidos 114 a 218 de la misma corresponden a la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 86 también se muestra en la fig. 41.

c)-xvi) Cadena ligera de tipo h#32A1-T16L:

Una cadena ligera de #32A1 humanizada diseñada sustituyendo los números de aminoácidos 24 (leucina), 29 (alanina), entre 29 y 30 (es decir, insertando un resto ausente en el armazón de rata), 36 (glutamina), 41 (serina), 66 (glutamina), 68 (arginina), 81 (isoleucina), 99 (asparagina), 100 (prolina), 101 (valina), 104 (ácido aspártico), 106 (isoleucina), 108 (treonina), 127 (leucina), 129 (leucina), 130 (arginina) y 132 (alanina) de la cadena ligera de #32A1 representada por la SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias por metionina, ácido aspártico, serina, ácido glutámico, asparagina, prolina, lisina, valina, serina, serina, leucina, ácido glutámico, valina, valina, valina, isoleucina, lisina y treonina, respectivamente, se denominó "cadena ligera de tipo h#32A1-T16L".

La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo h#32A1-T16L está representada por la SEQ ID NO: 87 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los restos de aminoácidos 1 a 113 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 87 y la secuencia que comprende los restos de aminoácidos 114 a 218 de la misma corresponden a la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 87 también se muestra en la fig. 41.

c)-xvii) Cadena ligera de tipo h#32A1-T17L:

Una cadena ligera de #32A1 humanizada diseñada sustituyendo los números de aminoácidos 24 (leucina), 29 (alanina), entre 29 y 30 (es decir, insertando un resto ausente en el armazón de rata), 36 (glutamina), 66 (glutamina), 81 (isoleucina), 99 (asparagina), 100 (prolina), 101 (valina), 104 (ácido aspártico), 106 (isoleucina), 108 (treonina), 122 (alanina), 127 (leucina), 129 (leucina), 130 (arginina) y 132 (alanina) de la cadena ligera de #32A1 representada por la SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias por metionina, ácido aspártico, serina, ácido glutámico, prolina, valina, serina, serina, leucina, ácido glutámico, valina, valina, glicina, valina, isoleucina, lisina y treonina, respectivamente, se denominó "cadena ligera de tipo h#32A1-T17L".

La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo h#32A1-T17L está representada por la SEQ ID NO: 88 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los restos de aminoácidos 1 a 113 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 88 y la secuencia que comprende los restos de aminoácidos 114 a 218 de la misma corresponden a la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 88 también se muestra en la fig. 42.

c)-xviii) Cadena ligera de tipo h#32A1-T18L:

Una cadena ligera de #32A1 humanizada diseñada sustituyendo los números de aminoácidos 24 (leucina), 29 (alanina), entre 29 y 30 (es decir, insertando un resto ausente en el armazón de rata), 36 (glutamina), 66 (glutamina), 81 (isoleucina), 99 (asparagina), 100 (prolina), 101 (valina), 104 (ácido aspártico), 106 (isoleucina), 108 (treonina), 110 (fenilalanina), 127 (leucina), 129 (leucina), 130 (arginina) y 132 (alanina) de la cadena ligera de #32A1 representada por la SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias por metionina, ácido aspártico, serina, ácido glutámico, prolina, valina, serina, serina, leucina, ácido glutámico, valina, valina, tirosina, valina, isoleucina, lisina y treonina, respectivamente, se denominó "cadena ligera de tipo h#32A1-T18L".

La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo h#32A1-T18L está representada por la SEQ ID NO: 89 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los restos de aminoácidos 1 a 113 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 89 y la secuencia que comprende los restos de aminoácidos 114 a 218 de la misma corresponden a la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 89 también se muestra en la fig. 42.

c)-xix) Cadena ligera de tipo h#32A1-T19L:

Una cadena ligera de #32A1 humanizada diseñada sustituyendo los números de aminoácidos 24 (leucina), 29 (alanina), entre 29 y 30 (es decir, insertando un resto ausente en el armazón de rata), 36 (glutamina), 66 (glutamina), 68 (arginina), 81 (isoleucina), 99 (asparagina), 100 (prolina), 101 (valina), 104 (ácido aspártico), 106 (isoleucina), 108 (treonina), 127 (leucina), 129 (leucina), 130 (arginina) y 132 (alanina) de la cadena ligera de #32A1 representada por la SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias por metionina, ácido aspártico, serina, ácido glutámico, prolina, lisina, valina, serina, serina, leucina, ácido glutámico, valina, valina, valina, isoleucina, lisina y treonina, respectivamente, se denominó "cadena ligera de tipo h#32A1-T19L".

La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo h#32A1-T19L está representada por la SEQ ID NO: 90 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los restos de aminoácidos 1 a 113 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 90 y la secuencia que comprende los restos de aminoácidos 114 a 218 de la misma corresponden a la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 90 también se muestra en la fig. 42.

c)-xx) Cadena ligera de tipo h#32A1-T20L:

Una cadena ligera de #32A1 humanizada diseñada sustituyendo los números de aminoácidos 24 (leucina), 29 (alanina), entre 29 y 30 (es decir, insertando un resto ausente en el armazón de rata), 36 (glutamina), 41 (serina), 66 (glutamina), 81 (isoleucina), 99 (asparagina), 100 (prolina), 101 (valina), 104 (ácido aspártico), 106 (isoleucina), 108 (treonina), 127 (leucina), 129 (leucina), 130 (arginina) y 132 (alanina) de la cadena ligera de #32A1 representada por la SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias por metionina, ácido aspártico, serina, ácido glutámico, asparagina, prolina, valina, serina, serina, leucina, ácido glutámico, valina, valina, valina, isoleucina, lisina y treonina, respectivamente, se denominó "cadena ligera de tipo h#32A1-T20L".

La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo h#32A1-T20L está representada por la SEQ ID NO: 91 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los restos de aminoácidos 1 a 113 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 91 y la secuencia que comprende los restos de aminoácidos 114 a 218 de la misma corresponden a la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 91 también se muestra en la fig. 42.

c)-xxi) Cadena ligera de tipo h#32A1-T21L:

Una cadena ligera de #32A1 humanizada diseñada sustituyendo los números de aminoácidos 21 (ácido aspártico), 24 (leucina), entre 29 y 30 (es decir, insertando un resto ausente en el armazón de rata), 31 (alanina), 32 (valina), 34 (leucina), 36 (glutamina), 40 (isoleucina), 66 (glutamina), 99 (asparagina), 100 (prolina), 101 (valina), 102 (glutamina), 103 (alanina), 104 (ácido aspártico), 106 (isoleucina), 108 (treonina), 110 (fenilalanina), 122 (alanina), 123 (glicina), 127 (leucina), 129 (leucina), 130 (arginina) y 132 (alanina) de la cadena ligera de #32A1 representada por la SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias por ácido glutámico, metionina, treonina, serina, leucina, prolina, ácido glutámico, leucina, alanina, serina, serina, leucina, ácido glutámico, prolina, ácido glutámico, fenilalanina, leucina, tirosina, glicina, glutamina, valina, isoleucina, lisina y treonina, respectivamente, se denominó "cadena ligera de tipo h#32A1-T21L".

La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo h#32A1-T21L está representada por la SEQ ID NO: 92 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los restos de aminoácidos 1 a 113 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 92 y la secuencia que comprende los restos de aminoácidos 114 a 218 de la misma corresponden a la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 92 también se muestra en la fig. 42.

c)-xxii) Cadena ligera de tipo h#32A1-T22L:

Una cadena ligera de #32A1 humanizada diseñada sustituyendo los números de aminoácidos 21 (ácido aspártico), 24 (leucina), entre 29 y 30 (es decir, insertando un resto ausente en el armazón de rata), 31 (alanina), 32 (valina), 34 (leucina), 36 (glutamina), 40 (isoleucina), 66 (glutamina), 99 (asparagina), 100 (prolina), 101 (valina), 102 (glutamina), 103 (alanina), 104 (ácido aspártico), 106 (isoleucina), 108 (treonina), 123 (glicina), 127 (leucina), 129 (leucina), 130 (arginina) y 132 (alanina) de la cadena ligera de #32A1 representada por la SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias por ácido glutámico, metionina, treonina, serina, leucina, prolina, ácido glutámico, leucina, alanina, serina, serina, leucina, ácido glutámico, prolina, ácido glutámico, fenilalanina, leucina, glutamina, valina, isoleucina, lisina y treonina, respectivamente, se denominó "cadena ligera de tipo h#32A1-T22L".

La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo h#32A1-T22L está representada por la SEQ ID NO: 93 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los restos de aminoácidos 1 a 113 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 93 y la secuencia que comprende los restos de aminoácidos 114 a 218 de la misma corresponden a la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 93 también se muestra en la fig. 43.

c)-xxiii) Cadena ligera de tipo h#32A1-T23L:

Una cadena ligera de #32A1 humanizada diseñada sustituyendo los números de aminoácidos 24 (leucina), entre 29 y 30 (es decir, insertando un resto ausente en el armazón de rata), 31 (alanina), 32 (valina), 34 (leucina), 36 (glutamina), 40 (isoleucina), 66 (glutamina), 99 (asparagina), 100 (prolina), 101 (valina), 102 (glutamina), 103 (alanina), 104 (ácido aspártico), 106 (isoleucina), 108 (treonina), 127 (leucina), 129 (leucina), 130 (arginina) y 132 (alanina) de la cadena ligera de #32A1 representada por la SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias por metionina, treonina, serina, leucina, prolina, ácido glutámico, leucina, alanina, serina, serina, leucina, ácido glutámico, prolina, ácido glutámico, fenilalanina, leucina, valina, isoleucina, lisina y treonina, respectivamente, se denominó "cadena ligera de tipo h#32A1-T23L".

La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo h#32A1-T23L está representada por la SEQ ID NO: 94 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los restos de aminoácidos 1 a 113 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 94 y la secuencia que comprende los restos de aminoácidos 114 a 218 de la misma corresponden a la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 94 también se muestra en la fig. 43.

c)-xxiv) Cadena ligera de tipo h#32A1-T24L:

Una cadena ligera de #32A1 humanizada diseñada sustituyendo los números de aminoácidos 21 (ácido aspártico), entre 29 y 30 (es decir, insertando un resto ausente en el armazón de rata), 31 (alanina), 32 (valina), 34 (leucina), 36 (glutamina), 40 (isoleucina), 66 (glutamina), 99 (asparagina), 100 (prolina), 101 (valina), 102 (glutamina), 103 (alanina), 104 (ácido aspártico), 106 (isoleucina), 108 (treonina), 110 (fenilalanina), 122 (alanina), 123 (glicina), 127 (leucina), 129 (leucina), 130 (arginina) y 132 (alanina) de la cadena ligera de #32A1 representada por la SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias por ácido glutámico, treonina, serina, leucina, prolina, ácido glutámico, leucina, alanina, serina, serina, leucina, ácido glutámico, prolina, ácido glutámico, fenilalanina, leucina, tirosina, glicina, glutamina, valina, isoleucina, lisina y treonina, respectivamente, se denominó "cadena ligera de tipo h#32A1-T24L".

La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo h#32A1-T24L está representada por la SEQ ID NO: 95 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los restos de aminoácidos 1 a 113 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 95 y la secuencia que comprende los restos de aminoácidos 114 a 218 de la misma corresponden a la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 95 también se muestra en la fig. 43.

c)-xxv) Cadena ligera de tipo h#32A1-T25L:

Una cadena ligera de #32A1 humanizada diseñada reemplazando números de aminoácidos entre 29 y 30 (es decir, insertando un resto ausente en el armazón de rata), 31 (alanina), 32 (valina), 34 (leucina), 36 (glutamina), 40 (isoleucina), 99 (asparagina), 100 (prolina), 101 (valina), 102 (glutamina), 103 (alanina), 104 (ácido aspártico), 106 (isoleucina), 110 (fenilalanina), 127 (leucina), 129 (leucina), 130 (arginina) y 132 (alanina) de la cadena ligera de #32A1 representada por la SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias por treonina, serina, leucina, prolina, ácido glutámico, leucina, serina, serina, leucina, ácido glutámico, prolina, ácido glutámico, fenilalanina, tirosina, valina, isoleucina, lisina y treonina, respectivamente, se denominó "cadena ligera de tipo h#32A1-T25L".

La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo h#32A1-T25L está representada por la SEQ ID NO: 96 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los restos de aminoácidos 1 a 113 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 96 y la secuencia que comprende los restos de aminoácidos 114 a 218 de la misma corresponden a la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 96 también se muestra en la fig. 43.

Ejemplo 23

Producción de gen de anticuerpo humanizado del anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón #32A1

a) Construcción de vectores de expresión de cadena ligera de tipo h#32A1-T1L, h#32A1-T2L, h#32A1-T3L, h#32A1-T4L, h#32A1-T5L y h#32A1-T6L

Se sintetizaron ADN cada uno de los cuales contiene un gen que codifica una región variable de cadena ligera de tipo h#32A1-T1L, h#32A1-T2L, h#32A1-T3L, h#32A1-T4L, h#32A1-T5L o h#32A1-T6L fusionada con una señal secretora representada por: los números de aminoácidos 1 a 133 de la SEQ ID NO: 61 en el listado de secuencias; los números de aminoácidos 1 a 133 de la SEQ ID NO: 63; los números de aminoácidos 1 a 133 de la SEQ ID NO: 65; los números de aminoácidos 1 a 132 de la SEQ ID NO: 67; los números de aminoácidos 1 a 133 de la SEQ ID NO: 69; o los números de aminoácidos 1 a 133 de la SEQ ID NO: 71 (Medical & Biological Laboratories Co., Ltd., Artificial Gene Synthesis Service). A continuación, cada uno de los fragmentos de ADN obtenidos al escindir los ADN sintetizados con las enzimas de restricción NheI y BsiWI se insertó en un vector de expresión de cadena ligera de anticuerpo humanizado universal (pEF6KCL) en el sitio escindido con las enzimas de restricción NheI y BsiWI, de modo que se construyeron vectores de expresión de cadena ligera de tipo h#32A1-T1L, h#32A1-T2L, h#32A1-T3L, h#32A1-T4L, h#32A1-T5L y h#32A1-T6L. Los vectores de expresión obtenidos de este modo se denominaron "pEF6KCL/h#32A1-T1L", "pEF6KCL/h#32A1-T2L", "pEF6KCL/h#32A1-T3L", "pEF6KCL/h#32A1-T4L", "pEF6KCL/h#32A1-T5L" y "pEF6KCL/h#32A1-T6L", respectivamente.

b) Construcción de vectores de expresión de cadena pesada de h#32A1-T1H, h#32A1-T2H, h#32A1-T3H, h#32A1-T5H y h#32A1-T6H

Se sintetizaron ADN cada uno de los cuales contiene uno un gen que codifica una región variable de cadena pesada de tipo #32A1-T1H, h#32A1-T2H, h#32A1-T3H, h#32A1-T5H o h#32A1-T6H fusionada a una señal secretora representada por los números de aminoácidos 1 a 140 de las SEQ ID NO: 51, 53, 55, 57 o 59 en el listado de secuencias (Medical & Biological Laboratories Co., Ltd., Artificial Gene Synthesis Service). A continuación, cada uno de los fragmentos de ADN obtenidos al escindir los ADN sintetizados con la enzima de restricción BlpI se insertó en un vector de expresión de cadena pesada de anticuerpo humanizado universal (pEF1/FCCU-1) en el sitio escindido con la enzima de restricción BlpI, de modo que se construyeron vectores de expresión de cadena pesada de h#32A1-T1H, h#32A1-T2H, h#32A1-T3H, h#32A1-T5H y h#32A1-T6H. Los vectores de expresión obtenidos de este modo se denominaron "pEF1/FCCU/h#32A1-T1H", "pEF1/FCCU/h#32A1-T2H", "pEF1/FCCU/h#32A1-T3H", "pEF1/FCCU/h#32A1-T5H" y "pEF1/FCCU/h#32A1-T6H", respectivamente.

Ejemplo 24

Preparación de anticuerpo humanizado de anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón #32A1

a) Producción de anticuerpo humanizado

Se sembraron 1,5 x 108 células de células 293 FreeStyle en fase de crecimiento logarítmico en 100 ml de medio de expresión FreeStyle 293 nuevo (Invitrogen, Inc.) y se sometieron a cultivo con agitación (125 rpm) a 37 °C en una incubadora de CO2 al 8 %. Se disolvió 1 mg de polietilenimina (fabricada por Polyscience, Inc. n.° 24765) en 4 ml de medio Opti-Pro SFM (fabricado por Invitrogen, Inc.) y la solución resultante se dejó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se suspendieron un plásmido de expresión de cadena pesada (0,05 mg) y un plásmido de expresión de cadena ligera (0,15 mg) preparados utilizando el equipo de plásmido PureLink HiPure (Invitrogen, Inc.) en 4 ml de medio Opti-Pro SFM (Invitrogen, Inc.). A continuación, se añadieron 4 ml del líquido mixto de plásmidos de expresión/Opti-Pro SFM resultante a 4 ml del líquido mixto de polietilenimina/Opti-Pro SFM que se había dejado a temperatura ambiente durante 5 minutos y la mezcla resultante se dejó a temperatura ambiente durante 5 minutos más. Posteriormente, se añadieron 8 ml del líquido mixto de polietilenimina/los plásmidos de expresión/Opti-Pro SFM a la suspensión de células 293 FreeStyle y se continuó el cultivo con agitación. Después de cultivar las células durante 7 días a 37 °C en CO2 al 8 %, se recogió el sobrenadante de cultivo.

b) Purificación de anticuerpo humanizado

El sobrenadante de cultivo obtenido en el apartado a) anterior se purificó mediante cromatografía de afinidad de proteína A. Se pusieron 100 ml del sobrenadante de cultivo en un matraz con tapón de 500 ml y se le añadió 1 ml de una suspensión (pasta al 50 %) de MabSelect SuRe (fabricado por GE Healthcare Bio-science Co., Ltd.) equilibrado con PBS. La mezcla resultante se agitó durante una noche a 100 rpm en una incubadora a 10 °C. A continuación, se aplicó el sobrenadante de cultivo 293F/suspensión MabSelect SuRe a columna de centrifugación Zeba vacía de 5 ml (PIERCE, Inc.). Después de verter toda la resina en la columna, la columna se lavó con 10 ml de NaCl 1 M. Posteriormente, se aplicó a la columna 1 ml de solución de arginina 1 M (pH 4,0) y se recogió una fracción que contenía el anticuerpo. La fracción se añadió a un dispositivo de filtro centrífugo (Amicon Ultra-4, peso molecular fraccional: 50 K, Millipore Co., Ltd.) y se realizó reemplazo de líquido con un tampón de citrato y condensación. El volumen final se completó hasta 200 pl, que se utilizó como muestra purificada.

Un anticuerpo humanizado de #32A1 obtenido por una combinación de pEF6KCL/h#32A1-T1L y pEF1/FCCU/h#32A1-T1H se denominó "h#32A1-T1"; un anticuerpo humanizado de #32A1 obtenido por una combinación de pEF6KCL/h#32A1 -T2L y pEF1/FCCU/h#32A1-T2H se denominó "h#32A1-T2"; un anticuerpo humanizado de #32A1 obtenido por una combinación de pEF6KCL/h#32A1-T3L y pEF1/FCCU/h#32A1-T3H se denominaron "h#32A1-T3"; un anticuerpo humanizado de #32A1 obtenido por una combinación de pEF6KCL/h#32A1-T4L y pEF1/FCCU/h#32A1-T3H se denominó "h#32A1-T4"; un anticuerpo humanizado de #32A1 obtenido por una combinación de pEF6KCL/h#32A1 -T5L y pEF1/FCCU/h#32A1-T5H se denominó "h#32A1-T5"; y un anticuerpo humanizado de #32A1 obtenido por una combinación de pEF6KCL/h#32A1-T6L y pEF1/FC-CU/h#32A1-T6H se denominó "h#32A1-T6".

Ejemplo 25

Evaluación de la propiedad de unión de anticuerpo humanizado del anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón #32A1 a la proteína Siglec-15 de ratón

La propiedad de unión de los anticuerpos humanizados del #32A1 de rata anti-Siglec-15 de ratón T1 a T6 a Siglec-15-Fc de ratón y Siglec-15-Fc humana se evaluó mediante el siguiente procedimiento. La Siglec-15-Fc de ratón purificada en el ejemplo 4 o la Siglec-15-Fc humana purificada en el ejemplo 12 se diluyó a 1 pg/ml con PBS y la solución diluida se distribuyó a 100 pl/pocillo en una inmunoplaca (fabricada por Nunc, Inc., n.° 437111) y la placa se dejó reposar durante una noche a 4 °C, por lo que cada proteína se adsorbió en la placa. Al día siguiente, cada pocilio se lavó 5 veces con una solución de PBS-T (PBS, Tween 200,05 % (v/v)) y una solución obtenida diluyendo leche desnatada (fabricada por Morinaga Milk Industry Co., Ltd.) al 5 % con PBS se distribuyó a 350 pl/pocillo y la placa se dejó reposar a temperatura ambiente durante 2 horas. Se eliminó el líquido de cada pocillo y se lavó cada pocillo 5 veces con la solución de PBS-T. A continuación, cada uno de los anticuerpos humanizados purificados del #32A1 de rata anti-Siglec-15 de ratón T1 a T6 preparado en el ejemplo 24 o el anticuerpo quimérico humano preparado en el ejemplo 19 se diluyó hasta una concentración final de 1 a 0,004 pg/ml (serie de diluciones cuádruples) con una solución de PBS que contiene leche desnatada al 0,5 %, la solución diluida se distribuyó a 100 pl/pocillo y la placa se dejó reposar a temperatura ambiente durante 2 horas. En este momento, la concentración de cada anticuerpo se determinó realizando una medición a 280 nm utilizando un espectrofotómetro DU-7400 (fabricado por Beckman Coulter, Inc.) y realizando cálculos basados en un coeficiente de extinción molecular molar de cada anticuerpo. Después de haber lavado cada pocillo 5 veces con la solución de PBS-T, se añadió IgG de cabra antihumano AffiniPure conjugado con fosfatasa alcalina (fabricado por Jackson ImmunoResearch, Inc., n.° 109-055-097) diluido a 2500 veces con una solución de TBS-T (TBS, Tween 20 al 0,05 % (v/v)) a 100 pl/pocillo y la placa se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 hora. Se eliminó el líquido de cada pocillo y se lavó cada pocillo 5 veces con la solución de TBS-T. A continuación, se añadió una solución de sustrato fluorescente (fabricada por Roche Co., Ltd., n.° 11681982001) a 100 pl/pocillo y se permitió que se produjera una reacción de fluorescencia. Después de 10 minutos desde la adición de la solución de sustrato fluorescente en el caso de la placa que tiene la Siglec-15-Fc de ratón adsorbido en ella y después de 15 minutos en el caso de la placa que tiene la Siglec-15-Fc humana adsorbido en ella, se midió una intensidad de fluorescencia utilizando Spectra Max M5 (fabricado por Molecular Devices, Inc.). Como resultado, se confirmó que los seis anticuerpos humanizados examinados de rata anti-Siglec-15 de ratón se unen a la proteína Siglec-15 de ratón (fig.18) y la proteína Siglec-15 humana (fig.19) de una manera dependiente de la concentración de anticuerpos.

Ejemplo 26

Efecto de la adición de anticuerpo quimérico de anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón #32A1 sobre la diferenciación de osteoclastos de células no adherentes de médula ósea de ratón (estimulación con TNFa)

Usando el anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón #32A1 preparado en el ejemplo 6 y el anticuerpo quimérico del anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón #32A1 preparado en el ejemplo 19, se examinó un efecto sobre la diferenciación de osteoclastos de células no adherentes de médula ósea de ratón mediante estimulación con TNFa. Las células no adherentes de médula ósea de ratón preparadas por el procedimiento del ejemplo 8 se prepararon a 1,5 x 105 células/ml en medio a-MEM que contenía suero bovino fetal (FBS) al 10%, 10 ng/ml de M-CSF y 2 ng/ml de TGF-p (fabricado por R&D Systems, Inc.), la preparación celular resultante se sembró en cada pocillo de una placa de 96 pocillos en una cantidad de 200 pl y las células se cultivaron durante 2 días en una incubadora de CO2. Se retiró la solución de cultivo antigua en la placa de 96 pocillos y se añadieron 100 pl de medio MEM-a a cada pocillo, conteniendo los 100 pl de medio MEM-a FBS al 10 % al que se habían añadido TNFa humano (fabricado por R&D Systems, Inc.) y M-CSF para dar concentraciones finales de 30 ng/ml y 10 ng/ml, respectivamente. A la solución de cultivo celular, se añadió el anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón #32A1 preparado en el ejemplo 6 o el anticuerpo quimérico del anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón #32A1 preparado en el ejemplo 19 a una concentración de 0,125 a 4 pg/ml y las células se cultivaron durante 3 días adicionales en una incubadora de CO2. Al mismo tiempo, también se preparó un pocillo en el que se cultivaron las células añadiendo OCIF/OPG humano recombinante preparado mediante el procedimiento descrito en la descripción de la publicación de solicitud de patente n.° WO 96/26217 a una concentración de 100 ng/ml. Después de finalizar el cultivo, se realizó tinción con TRAp utilizando un equipo de fosfatasa ácida leucocitaria (fabricado por Sigma Co., Ltd.) según el protocolo que acompaña al kit y se observó la formación de osteoclastos multinucleados positivos para TRAP. Como resultado, la formación de osteoclastos gigantes multinucleados positivos para TRAP se inhibió mediante la adición del anticuerpo policlonal anti-Siglec-15 de ratón (fig. 20). Aunque se formaron osteoclastos mononucleares pequeños incluso en el caso en el que se añadió el anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón #32A1 o el anticuerpo quimérico del mismo, la formación de osteoclastos multinucleados grandes inducida por TNFa se inhibió casi por completo. Por otro lado, incluso cuando se añadió una cantidad suficiente de OCIF/o Pg , que es un bloqueador de RANKL, la formación de osteoclastos multinucleados grandes se inhibió sólo un poco. Además, de la misma manera, se midió la actividad de la fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP) de los osteoclastos formados mediante el procedimiento descrito en el ejemplo 9. Después de detener la reacción enzimática, se midió una absorbancia de cada pocillo a 405 nm y se utilizó la medida obtenida como índice de la actividad de TRAP. Los resultados se muestran en la fig. 21. Se observó una inhibición significativa de la actividad de TRAP en el caso del anticuerpo #32A1 y el anticuerpo quimérico de #32A1 dentro del intervalo de 125 ng/ml a 4 pg/ml. A partir de estos resultados, se mostró que el anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón y el anticuerpo quimérico del mismo inhiben fuertemente el proceso de fusión celular en la diferenciación y maduración de osteoclastos inducida por TNFa.

Ejemplo 27

Evaluación de la actividad biológica de los anticuerpos monoclonales de rata anti-Siglec-15 #8A1 #32A1 de ratón basada en la prueba de formación de osteoclastos de rata

Utilizando los anticuerpos monoclonales de rata anti-Siglec-15 de ratón #8A1 y #32A1 preparados en el ejemplo 6, se examinó un efecto sobre la diferenciación de osteoclastos de células no adherentes de médula ósea de rata. Se prepararon células no adherentes de médula ósea de rata modificando el procedimiento del ejemplo 8. Es decir, se extirpó el fémur de ambas patas de una rata hembra F344 a la edad de 12 semanas y se extrajeron los tejidos blandos. Se cortaron ambos extremos del fémur y se inyectó medio MEM-a usando una jeringa con una aguja de inyección de calibre 23 para expulsar las células de la médula ósea, que se recogieron en un tubo de centrífuga. Se realizó centrifugación a temperatura ambiente durante 5 minutos a 100 g y se eliminó el sobrenadante. Al sedimento celular resultante, se añadió 1 ml de tampón hemolítico (tampón de lisis de glóbulos rojos, fabricado por Sigma Co., Ltd.) para suspenderlo y la suspensión resultante se dejó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se le añadieron 20 ml de D-PBS, la suspensión se centrifugó a temperatura ambiente durante 5 minutos a 100 g y se eliminó el sobrenadante. Al sedimento celular resultante, se añadieron 10 ml de medio MEM-a (fabricado por Invitrogen, Inc.) que contiene 5 ng/ml de M-CSF (fabricado por R&D Systems, Inc.) y suero bovino fetal (FBS) al 10% para suspenderlo. A continuación, la suspensión resultante se pasó a través de un tamiz celular (nailon de 40 pm, fabricado por BD Falcon) para eliminar los agregados. Las células resultantes se transfirieron a un matraz en T de 75 cm2 (para la unión de células adherentes) y se cultivaron durante una noche en una incubadora de CO2. Después del cultivo durante una noche, las células que no se adhirieron al matraz en T se recuperaron y se utilizaron como células no adherentes de médula ósea de rata.

Las células no adherentes de médula ósea de rata preparadas mediante este procedimiento se cultivaron y se realizó una prueba para la formación de osteoclastos de rata según el procedimiento del ejemplo 9. Es decir, las células no adherentes de médula ósea de rata preparadas de este modo se prepararon a 1,5 x 105 células/ml en medio a-MEM que contenía FBS al 10 % y 10 ng/ml de M-CSF (fabricado por R&D Systems, Inc.) y la preparación celular resultante se sembró en cada pocillo de una placa de 96 pocillos en una cantidad de 200 pl y las células se cultivaron durante 2 días en una incubadora de CO2. Se retiró la solución de cultivo antigua en la placa de 96 pocillos y se añadieron 100 pl de medio MEM-a a cada pocillo, conteniendo los 100 pl de medio MEM-a FBS al 10 % al que se habían añadido RANKL humano (RANKL, fabricado por Peprotech, Inc.) y M-CSF para dar concentraciones finales de 20 ng/ml y 10 ng/ml, respectivamente. A la solución de cultivo celular, se añadió el anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón #8A1 o #32A1 producido en el ejemplo 6 a una concentración de 31 a 1000 ng/ml y las células se cultivaron durante 3 días adicionales en una incubadora de CO2. Después de finalizar el cultivo, se midió la actividad de la fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP) de los osteoclastos formados mediante el procedimiento descrito en el ejemplo 9. Después de detener la reacción enzimática, se midió una absorbancia de cada pocillo a 405 nm y se utilizó la medida obtenida como índice de la actividad de TRAP. Los resultados se muestran en la fig. 22. En el caso del anticuerpo #8A1, se observó una inhibición dependiente de la dosis de la actividad de TRAP a una concentración de 63 ng/ml o superior y, en el caso del anticuerpo #32A1, se observó una inhibición dependiente de la dosis de la actividad de TRAP a una concentración de 31 ng/ml o más. A partir de estos resultados, se mostró que los anticuerpos monoclonales de rata anti-Siglec-15 de ratón #8A1 y #32A1 inhiben fuertemente la formación de osteoclastos de rata de la misma manera que la formación de osteoclastos de ratón y la actividad in vitro de inhibición de la formación de osteoclastos de rata del anticuerpo #32A1 es mayor que la del anticuerpo #8A1.

Ejemplo 28

Diseño de anticuerpo humanizado de anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 ratón #32A1 (2)

a) Diseño de versión humanizada de #32A1

a)-i) Diseño de secuencia de aminoácidos de #32A1 humanizado

Un anticuerpo humanizado #32A1 se construyó según un procedimiento conocido en general como injerto de CDR (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)). En cuanto a las definiciones de regiones CDR, se usaron las definiciones de Kabat (SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST VOL. I, quinta edición (1991)) para todos excepto para CDRH2. En cuanto a CDRH2, la secuencia de la misma se hizo cinco restos más corta en el extremo C que la definición de Kabat usando una definición propia. En la secuencia de cadena pesada que contiene la CDRH2 definida de este modo, la secuencia de CDR procedente de una rata se acorta y se incorpora más de una secuencia de marco conservado humana y, por lo tanto, cuando se administra a seres humanos, es mucho menos probable que se reconozca como un antígeno heterólogo. Se seleccionó un anticuerpo aceptor basándose en la homología de aminoácidos dentro de la región marco conservada. La secuencia de la región marco conservada de #32A1 se comparó con las secuencias de todos los marcos conservados humanos en la base de datos de Kabat (Nuc. Acid Res. 29, 205-206 (2001)) que implicaban secuencias de aminoácidos de anticuerpos. Como resultado, para la cadena L, se seleccionó GF4/1.1'CL como aceptor basándose en una homología de secuencia del 71 % en la región marco conservada. En cuanto a la cadena H, se seleccionó M37GO37'CL como aceptor basándose en una homología de secuencia del 73 % en la región marco conservada. Con respecto a la cadena L, los restos de aminoácidos en la región marco conservada de GF4/1.1'CL, y, con respecto a la cadena H, los restos de aminoácidos en la región marco conservada de M37GO37'CL se alinearon con los restos de aminoácidos de #32A1 y se identificaron las posiciones en las que se usaron aminoácidos diferentes. Las posiciones de estos restos se analizaron usando el modelo tridimensional de #32A1 construido en a)-i) del ejemplo 22. A continuación, los restos de donantes para injertar en el aceptor se seleccionaron según los criterios proporcionados por Queen y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029 10033 (1989)). Transfiriendo algunos restos de donantes seleccionados al anticuerpo aceptor, se construyeron secuencias humanizadas de #32A1 como se describe en los siguientes ejemplos.

a)-ii) Humanización de la cadena pesada de #32A1

a)-ii)-i) Cadena pesada de tipo h#32A1-H1-1:

Una cadena pesada de 32A1 humanizada diseñada sustituyendo los números de aminoácidos 23 (isoleucina), 24 (leucina), 26 (treonina), 32 (lisina), 43 (treonina), 61 (ácido glutámico), 83 (ácido glutámico), 85 (leucina), 86 (ácido glutámico), 89 (valina), 95 (ácido aspártico), 96 (serina), 97 (ácido glutámico), 98 (serina), 100 (valina), 104 (valina), 105 (serina), 114 (isoleucina), 118 (treonina), 134 (valina), 135 (metionina) y 140 (leucina) de 32A1 representada por la SEQ ID NO: 28 en el listado de secuencias por leucina, valina, serina, glutamina, alanina, glicina, alanina, valina, lisina, fenilalanina, asparagina, alanina, lisina, asparagina, leucina, metionina, asparagina, valina, alanina, treonina, leucina y serina, respectivamente, se denominó "cadena pesada de tipo h#32A1-H1-1".

La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de tipo h#32A1-H1-1 está representada por la SEQ ID NO: 99 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los restos de aminoácidos 1 a 19 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 99, la secuencia que comprende los restos de aminoácidos 20 a 140 de la misma y la secuencia que comprende los restos de aminoácido 141 a 466 de la misma corresponden a la secuencia señal, la región variable de cadena pesada y la región constante de cadena pesada, respectivamente. Una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 99 está representada por la SEQ ID NO: 98 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los nucleótidos 1 a 57 de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 98, la secuencia que comprende los nucleótidos 58 a 420 de la misma y la secuencia que comprende los nucleótidos 421 a 1398 de la misma codifican la secuencia señal, la secuencia de región variable de cadena pesada y la secuencia de región constante de cadena pesada, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 98 y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 99 también se muestran en la fig. 54.

a)-iii) Humanización de cadena ligera de #32A1

a)-iii)-i) Cadena ligera de tipo h#32A1-L2-15:

Una cadena ligera de 32A1 humanizada diseñada sustituyendo los números de aminoácidos 21 (ácido aspártico), 23 (valina), 24 (leucina), entre 29 y 30 (es decir, insertando un resto ausente en el armazón de rata), 31 (alanina), 32 (valina), 34 (leucina), 36 (glutamina), 40 (isoleucina), 66 (glutamina), 99 (asparagina), 100 (prolina), 101 (valina), 102 (glutamina), 103 (alanina), 104 (ácido aspártico), 106 (isoleucina), 108 (treonina), 110 (fenilalanina), 122 (alanina), 123 (glicina), 127 (leucina), 129 (leucina), 130 (arginina) y 132 (alanina) de 32A1 representada por la SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias por ácido glutámico, leucina, metionina, treonina, serina, leucina, prolina, ácido glutámico, leucina, alanina, serina, serina, leucina, ácido glutámico, prolina, ácido glutámico, fenilalanina, leucina, tirosina, glicina, glutamina, valina, isoleucina, lisina y treonina, respectivamente, se denominó "cadena ligera de tipo h#32A1-L2-15".

La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo h#32A1-L2-15 está representada por la SEQ ID NO: 103 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los restos de aminoácidos 1 a 20 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 103, la secuencia que comprende los restos de aminoácidos 21 a 133 de la misma y la secuencia que comprende los restos de aminoácido 134 a 238 de la misma corresponden a la secuencia señal, la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. Una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 103 está representada por la SEQ ID NO: 102 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los nucleótidos 1 a 60 de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 102, la secuencia que comprende los nucleótidos 61 a 399 de la misma y la secuencia que comprende los nucleótidos 400 a 714 de la misma codifican la secuencia señal, la secuencia de región variable de cadena ligera y la secuencia de región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 102 y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 103 también se muestran en la fig. 56.

a)-iii)-ii) Cadena ligera de tipo h#32A1-L2-16:

Una cadena ligera de 32A1 humanizada diseñada sustituyendo los números de aminoácidos 21 (ácido aspártico), 23 (valina), 24 (leucina), entre 29 y 30 (es decir, insertando un resto ausente en el armazón de rata), 31 (alanina), 32 (valina), 34 (leucina), 36 (glutamina), 40 (isoleucina), 66 (glutamina), 99 (asparagina), 100 (prolina), 101 (valina), 102 (glutamina), 103 (alanina), 104 (ácido aspártico), 106 (isoleucina), 108 (treonina), 123 (glicina), 127 (leucina), 129 (leucina), 130 (arginina) y 132 (alanina) de 32A1 representada por la SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias por ácido glutámico, leucina, metionina, treonina, serina, leucina, prolina, ácido glutámico, leucina, alanina, serina, serina, leucina, ácido glutámico, prolina, ácido glutámico, fenilalanina, leucina, glutamina, valina, isoleucina, lisina y treonina, respectivamente, se denominó "cadena ligera de tipo h#32A1-L2-16".

La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo h#32A1-L2-16 está representada por la SEQ ID NO: 105 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los restos de aminoácidos 1 a 20 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 105, la secuencia que comprende los restos de aminoácidos 21 a 133 de la misma y la secuencia que comprende los restos de aminoácido 134 a 238 de la misma corresponden a la secuencia señal, la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. Una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 105 está representada por la SEQ ID NO: 104 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los nucleótidos 1 a 60 de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 104, la secuencia que comprende los nucleótidos 61 a 399 de la misma y la secuencia que comprende los nucleótidos 400 a 714 de la misma codifican la secuencia señal, la secuencia de región variable de cadena ligera y la secuencia de región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 104 y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 105 también se muestran en la fig. 57.

b) Producción de gen de anticuerpo humanizado del anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón #32A1

b)-i) Construcción del vector de expresión de cadena pesada humana universal pEG2

Se sintetizó un fragmento de ADN que contiene una secuencia de ADN que codifica los aminoácidos de la secuencia señal y la región constante de IgG2 humana representada por la SEQ ID NO: 106 (Medical & Biological Laboratories Co., Ltd., Artificial Gene Synthesis Service) y se digirió con las enzimas de restricción NheI y PmeI, de modo que se obtuvo un fragmento de ADN de aproximadamente 1100 pb. Este fragmento de ADN se ligó a un fragmento de ADN de aproximadamente 6200 pb obtenido al digerir pEF1/FCCU-1 con NheI y PmeI y eliminar un fragmento de ADN de aproximadamente 1100 pb, de modo que se construyó un vector de expresión de cadena pesada de anticuerpo humanizado universal (tipo hIgG2) pEG2.

b)-ii) Construcción del vector de expresión de cadena pesada h#32A1-H1-1

Un fragmento de ADN obtenido al sintetizar un ADN que contiene un gen que codifica la región variable de cadena pesada de h#32A1-H1-1 fusionada con una señal secretora representada por los números de aminoácidos 1 a 140 de la SEQ ID NO: 99 en el listado de secuencias (Invitrogen) y escindir el ADN con la enzima de restricción BlpI se insertó en el vector de expresión de cadena pesada del anticuerpo universal humanizado (tipo hIgG2) (pEG2) en el sitio escindido con la enzima de restricción BlpI, de modo que se construyó un vector de expresión de cadena pesada de #32A1-H1-1. El vector de expresión obtenido de este modo se denominó "pEG2/h#32A1-H1-1".

b)-iii) Construcción del vector de expresión de cadena pesada h#32A1-H5

Una cadena pesada de 32A1 humanizada en la que la secuencia señal y la región constante de cadena pesada de tipo h#32A1-T5H diseñada en b)-iv) del ejemplo 22 se cambiaron por las de tipo IgG2 se denominó "cadena pesada de tipo h#32A1-H5".

La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de tipo h#32A1-H5 está representada por la SEQ ID NO: 101 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los restos de aminoácidos 1 a 19 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 101, la secuencia que comprende los restos de aminoácidos 20 a 140 de la misma y la secuencia que comprende los restos de aminoácido 141 a 466 de la misma corresponden a la secuencia señal, la región variable de cadena pesada y la región constante de cadena pesada, respectivamente. Una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 101 está representada por la SEQ ID NO: 100 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los nucleótidos 1 a 57 de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 100, la secuencia que comprende los nucleótidos 58 a 420 de la misma y la secuencia que comprende los nucleótidos 421 a 1398 de la misma codifican la secuencia señal, la secuencia de región variable de cadena pesada y la secuencia de región constante de cadena pesada, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 100 y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 101 también se muestran en la fig. 55.

Un fragmento de ADN obtenido escindiendo el pEF1/FCCU/h#32A1-T5H producido en el ejemplo 23 con la enzima de restricción BlpI se insertó en el vector de expresión de cadena pesada del anticuerpo universal humanizado (tipo hIgG2) (pEG2) en el sitio escindido con la enzima de restricción BlpI, de modo que se construyó un vector de expresión de cadena pesada de #32A1-H5. El vector de expresión obtenido de este modo se denominó "pEG2/h#32A1-H5".

b) -iv) Construcción de vectores de expresión de cadena ligera de tipo h#32A1-L2-15 y h#32A1-L2-16

Se sintetizaron ADN cada uno de los cuales contiene un gen que codifica una región variable de cadena ligera de tipo h#32A1-L2-15 o h#32A1-L2-16 fusionada con una señal secretora representada por los números de aminoácidos 1 a 133 de la SEQ ID NO: 103 en el listado de secuencias o los números de aminoácidos 1 a 133 de la SEQ ID NO: 105 (Invitrogen) y se construyeron vectores de expresión de cadena ligera de tipo h#32A1-L2-15 y h#32A1-L2-16 de la misma manera que en el ejemplo 23. Los vectores de expresión obtenidos de este modo se denominaron "pEF6KCL/h#32A1-L2-15" y "pEF6KCL/h#32A1-L2-16", respectivamente.

c) Preparación de anticuerpo humanizado de anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón #32A1

c)-i) Producción de anticuerpo humanizado

Se sembraron 1,2 x 109 células de células FreeStyle 293F (Invitrogen) en fase de crecimiento logarítmico en 1,2 l de medio de expresión FreeStyle 293 nuevo (Invitrogen) y se sometieron a cultivo con agitación a 37 °C en una incubadora de CO2 al 8 % a 90 rpm durante 1 hora. Se disolvieron 3,6 mg de polietilenimina (Polyscience, n.° 24765) en 20 ml de medio Opti-Pro SFM (Invitrogen). Posteriormente, se suspendieron un plásmido de expresión de cadena H (0,4 mg) y un plásmido de expresión de cadena L (0,8 mg) preparados utilizando el equipo de plásmido PureLink HiPure (Invitrogen, Inc.) en 20 ml de medio Opti-Pro SFM. A continuación, se añadieron 20 ml de los plásmidos de expresión resultantes/líquido mixto Opti-Pro SFM a 20 ml del líquido mixto de polietilenimina/Opti-Pro SFM y la mezcla resultante se agitó suavemente y después se dejó durante 5 minutos. A continuación, la mezcla se añadió a las células FreeStyle 293F y se realizó cultivo con agitación durante 7 días a 37 °C en una incubadora de CO2 al 8 % a 90 rpm. El sobrenadante de cultivo resultante se filtró a través de un filtro de cápsula desechable (Advantec n.° CCS-045-E1H).

Un anticuerpo humanizado de #32A1 obtenido por una combinación de pEF6KCL/h#32A1-T5L y pEG2/h#32A1-H5 se denominó "h#32A1-H5/L5"; un anticuerpo humanizado de #32A1 obtenido por una combinación de pEF6KCL/h#32A1-T5L y pEG2/h#32A1-H1-1 se denominó "h#32A1-H1-1/L5"; un anticuerpo humanizado de #32A1 obtenido por una combinación de pEF6KCL/h#32A1-L2-15 y pEG2/h#32A1-H1-1 se denominó "h#32A1-H1-1/L2-15"; y Un anticuerpo humanizado de #32A1 obtenido por una combinación de pEF6KCL/h#32A1-L2-16 y pEG2/h#32A1-H1-1 se denominó "h#32A1-H1-1/L2-16".

c)-ii) Purificación de anticuerpo humanizado

El sobrenadante de cultivo obtenido en el c)-i) anterior se purificó mediante un procedimiento de dos etapas que incluía cromatografía de afinidad de rProteína A (de 4 a 6 °C) e hidroxiapatita cerámica (a temperatura ambiente). Se realizó una etapa de sustitución del tampón después de la purificación por cromatografía de afinidad de rProteína A y después de la purificación por hidroxiapatita cerámica a temperatura ambiente. En primer lugar, se aplicaron de 1100 a 1200 ml del sobrenadante de cultivo a MabSelect SuRe (fabricado por GE Healthcare Bioscience Co., Ltd., 2 columnas HiTrap de 1 ml en serie) equilibrado con PBS. Después de verter toda la solución de cultivo en la columna, la columna se lavó con 15 a 30 ml de PBS. Posteriormente, se realizó elución con una solución de clorhidrato de arginina 2 M (pH 4,0) y se recogió una fracción que contenía el anticuerpo. La fracción se aplicó a una columna de desalación (fabricada por GE Healthcare Bioscience Co., Ltd., 2 columnas de desalación HiTrap de 5 ml en serie) y el líquido se reemplazó con un tampón que contenía fosfato de sodio 5 mM, MES 50 mM y NaCl 20 mM a pH 6,5. Además, la solución de anticuerpo sometida a la sustitución con el tampón se aplicó a una columna de hidroxiapatita cerámica (Japan Bio-Rad Laboratories, Inc., columna de hidroxiapatita Bio-Scale CHT2-1 (volumen de 2 ml)) equilibrada con un tampón que contenía NaPi 5 mM, MES 50 mM y NaCl 20 mM a pH 6,5. A continuación, se realizó elución en gradiente de concentración lineal con cloruro de sodio y se recogió una fracción que contenía el anticuerpo. La fracción se aplicó a una columna de desalación (fabricada por GE Healthcare Bioscience Co., Ltd., 2 columnas de desalación HiTrap de 5 ml en serie) y el líquido se reemplazó con CBS (tampón de citrato 10 mM que contenía cloruro de sodio 140 mM, pH 6,0). Finalmente, la solución resultante se concentró utilizando el dispositivo de filtro centrífugo UF VIVASPIN 20 (peso molecular fraccional: 30 K, Sartorius Co., Ltd., a 4 °C), la concentración de IgG se ajustó a 1,0 mg/ml o más y la solución obtenida de este modo se utilizó como muestra purificada. Los volúmenes de las muestras purificadas respectivas fueron los siguientes: h#32A1-H1-1/L5: 2,2 ml, h#32A1-H5/L5: 1,8 ml, h#32A1-H1-1/L2-16: 6,0 ml y h#32A1-H1-1/L2-15: 2,2 ml.

Ejemplo 29

Evaluación de la actividad biológica de anticuerpo humanizado del anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón #32A1 basada en la prueba de formación de osteoclastos de ratón

Se evaluó un efecto inhibidor sobre la formación de osteoclastos de ratón presentado por los anticuerpos humanizados obtenidos en los ejemplos 24 y 28 modificando parcialmente el procedimiento descrito en el ejemplo 9. Las células no adherentes de médula ósea de ratón preparadas por el procedimiento del ejemplo 8 se prepararon a 1 ,5x105 células/ml en medio a-MEM que contenía FBS al 10 % y 10 ng/ml de M-CSF (fabricado por R&D Systems, Inc.), la preparación celular resultante se sembró en cada pocillo de una placa de 96 pocillos en una cantidad de 200 pl y las células se cultivaron durante 2 días en una incubadora de CO2. Se retiró la solución de cultivo antigua en la placa de 96 pocillos y se añadieron 100 pl de medio MEM-a a cada pocillo, conteniendo los 100 pl de medio MEM-a FBS al 10% al que se habían añadido RANKL humano (RANKL, fabricado por Peprotech, Inc.) y M-CSF para dar concentraciones finales de 20 ng/ml y 10 ng/ml, respectivamente. A la solución de cultivo celular, se añadió el anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón (anticuerpo #32A1) preparado en el ejemplo 6 o cada uno de los 6 tipos de anticuerpos humanizados #32A1 (h#32A1-T1, h#32A1-T2, h#32A1-T3, h#32A1-T4, h#32A1-T5 y h#32A1-T6) preparado en el ejemplo 24 a una concentración de 3 a 100 ng/ml y las células se cultivaron durante 3 días más en una incubadora de CO2. Después de finalizar el cultivo, se midió la actividad de la fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP) de los osteoclastos formados mediante el siguiente procedimiento. La solución de cultivo en cada pocillo de la placa de 96 pocillos se eliminó por succión y se añadieron a cada pocillo 50 pl de tampón de citrato de sodio 50 mM (pH 6,1) que contenía Triton X-100 al 1 %. A continuación, la placa se agitó durante 5 minutos en un agitador de placas para lisar las células. A cada pocillo, se añadieron 50 pl de una solución de sustrato (tampón de citrato de sodio 50 mM (pH 6,1) que contenía p-nitrofenilfosfato 5 mg/ml y tartrato de sodio al 0,46 %) y la placa se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de la incubación, se añadieron 50 pl de una solución de hidróxido de sodio 1 N a cada pocillo de la placa de 96 pocillos para detener la reacción enzimática. Después de detener la reacción enzimática, se midió una absorbancia de cada pocillo a 405 nm y se utilizó la medida obtenida como índice de la actividad de TRAP. Los resultados se muestran en las figs. 44 y 45. Además, para el anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón (anticuerpo #32A1) preparado en el ejemplo 6, el anticuerpo quimérico humano del anticuerpo #32A1 preparado en el ejemplo 19 y 4 tipos de los anticuerpos humanizados #32A1 (h#32A1-H1-1/L5, h#32A1-H5/L5, h#32A1-H1-1/L2-16 y h#32A1-H1-1/L2-15) preparados en el ejemplo 28, la actividad biológica se evaluó por el mismo procedimiento que en esta prueba y los resultados se muestran en las figs. 46 y 47. En todos los casos de los 10 tipos de anticuerpos humanizados #32A1 (h#32A1-T1, h#32A1-T2, h#32A1-T3, h#32A1-T4, h#32A1-T5, h#32A1-T6, h#32A1-H1-1/L5, h#32A1-H5/L5, h#32A1-H1-1/L2-16 y h#32A1-H1-1/L2-15) para los que se evaluó la actividad, se observó una fuerte actividad de inhibición de la formación de osteoclastos sustancialmente comparable a la del anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón (anticuerpo #32A1) o el anticuerpo quimérico humano del anticuerpo #32A1.

Ejemplo 30

Efecto de la adición de anticuerpo humanizado de anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón #32A1 sobre la actividad de reabsorción ósea de células precursoras de osteoclastos humanos normales (evaluación usando placa recubierta de colágeno)

Se sembraron células precursoras de osteoclastos humanos normales (células precursoras de osteoclastos naturales humanos normales, adquiridas de Sanko Junyaku Co., Ltd., cat. n.° 2T-110) en una placa de cultivo celular OsteoLyse de 96 pocillos (adquirida de Sanko Junyaku Co., Ltd., cat. n.° PA-1500) a 1 x 104 células/pocillo según el protocolo que acompaña a las células. Como medio, se utilizó un medio esencial mínimo para células precursoras de osteoclastos (OPBM, adquirido de Sanko Junyaku Co., Ltd., cat. n.° PT-8201) complementado con un conjunto de complementos OPGM (adquirido de Sanko Junyaku Co., Ltd., cat. n.° PT-9501) que contiene suero fetal bovino (concentración final: 10%), RANKL humano (concentración final: 63,8 ng/ml), M-CSF humano (concentración final: 33 ng/ml) y similares. Al sobrenadante de cultivo resultante, se añadió cada uno del anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón (anticuerpo #32A1) preparado en el ejemplo 6, el anticuerpo quimérico humano del anticuerpo #32A1 preparado en el ejemplo 19 y los 10 tipos de anticuerpos #32A1 humanizados (h#32A1-T1, h#32A1-T2, h#32A1-T3, h#32A1-T4, h#32A1-T5, h#32A1-T6, h#32A1-H1-1/L5, h#32A1-H5/L5. h#32A1-H1-1/L2-16 y h#32A1-H1-1/L2-15) preparado en los ejemplos 24 y 28 a una concentración final de 4, 20, 100 o 500 ng/ml y las células se cultivaron durante 5 días en una incubadora de CO2. Se recogió una alícuota de 10 pl del sobrenadante de cultivo, se le añadieron 200 pl de reactivo de liberación de fluoróforo incluido en el equipo de ensayo OsteoLyse y, utilizando un lector de placas de fluorescencia (ARVO MX, fabricado por Perkin Elmer Inc.), se realizó fluorimetría de resolución temporal (fluorímetro de fluorescencia de resolución temporal) (excitación: 340 nm, emisión: 615 nm) adecuada para la medición de fluorescencia utilizando europio, de modo que se determinó la cantidad de fragmentos de colágeno fluorescente libres liberados en el sobrenadante de cultivo (figs. 48 y 49). Como resultado, la cantidad de fragmentos de colágeno fluorescente aumentada por la adición de RANKL se redujo por la adición del anticuerpo #32A1 de rata o el anticuerpo #32A1 quimérico humano de una manera dependiente de la concentración. De la misma manera, también por los 10 tipos examinados de anticuerpos #32A1 humanizados, se observó una inhibición dependiente de la concentración. A partir de este resultado, se reveló que la actividad de reabsorción ósea de los osteoclastos humanos es inhibida por los anticuerpos humanizados #32A1 que se unen específicamente a la proteína Siglec-15.

Ejemplo 31

Evaluación biológica del anticuerpo humanizado del anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón #32A1 utilizando ratas ovariectomizadas

Un efecto inhibidor sobre una disminución de la densidad mineral ósea en ratas ovariectomizadas presentado por los anticuerpos humanizados obtenidos en los ejemplos 24 y 28 puede evaluarse mediante el procedimiento descrito en el ejemplo 15.

Ejemplo 32

Evaluación de la actividad biológica de anticuerpo humanizado del anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón #32A1 basada en la prueba de formación de osteoclastos de ratón mediante estimulación con TNFa

Un efecto inhibidor sobre la formación de osteoclastos de ratón por estimulación con TNFa presentado por los anticuerpos humanizados obtenidos en los ejemplos 24 y 28 puede evaluarse mediante el procedimiento descrito en el ejemplo 26.

Ejemplo 33

Determinación de la estabilidad térmica del anticuerpo humanizado mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC)

Para h#32A1-H5/L5, h#32A1-H1-1/L5, h#32A1-H1-1/L2-15 y h#32A1-H1-1/L2-16, se determinó la estabilidad térmica. Cada una de estas muestras se preparó a una concentración de 0,5 mg/ml (en una solución de CBS) y se utilizó una alícuota de 400 pl de la misma como solución de muestra para la medición de DSC. Las condiciones para la medición de DSC se establecieron de la siguiente manera. Es decir, la temperatura inicial se estableció en 20 °C, la temperatura final se estableció en 100 °C, la velocidad de aumento de la temperatura se estableció en 60 °C/hora y el tiempo de filtrado se estableció en 10 segundos. Como solución de referencia, se utilizó CBS. Como instrumento para la medición de DSC, se utilizó la plataforma VP-Capillary DSC fabricada por MicroCal Inc. USA. El valor inicial (una curva de exploración obtenida al cargar la solución de referencia también en una celda de muestra) se restó de una curva de exploración obtenida para cada solución de muestra, de modo que se realizó corrección de valor inicial. La fig. 50 muestra un termograma para h#32A1-H5/L5, La fig. 51 muestra un termograma para h#32A1-H1-1/L5, La fig. 52 muestra un termograma para h#32A1-H1-1/L2-15 y la fig. 53 muestra un termograma para h#32A1-H1-1/L2-16.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a un polipéptido que consiste en los restos de aminoácidos 39 a 165 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 2 e inhibe la formación de osteoclastos y/o la reabsorción ósea osteoclástica, en el que el anticuerpo comprende:

2. Un fragmento de unión a antígeno del anticuerpo según la reivindicación 1 que se selecciona del grupo que consiste en Fab, F(ab')2, Fab' y Fv.

3. El anticuerpo según la reivindicación 1 o 2, caracterizado por ser un scFv.

4. El anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo quimérico.

5. El anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, según la reivindicación 4, caracterizado por comprender una secuencia de cadena pesada que comprende los restos de aminoácidos 20 a 470 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 41 y una secuencia de cadena ligera que comprende los restos de aminoácidos 21 a 237 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 43.

6. El anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el anticuerpo está humanizado, y en el que la cadena pesada tiene una región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina G2 humana y la cadena ligera tiene una región constante de una cadena ligera k de inmunoglobulina humana.

7. Una composición farmacéutica, caracterizada por comprender al menos uno de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los anticuerpos según las reivindicaciones 1 a 6.

8. Un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su uso en un procedimiento de tratamiento y/o prevención del metabolismo óseo anómalo en el que el metabolismo óseo anómalo se selecciona del grupo que consiste en osteoporosis, destrucción ósea que acompaña a la artritis reumatoide y destrucción ósea que acompaña a la metástasis del cáncer al hueso, preferentemente osteoporosis, más preferentemente osteoporosis posmenopáusica, osteoporosis senil, osteoporosis secundaria debida al uso de un agente terapéutico, tal como un esteroide o un inmunosupresor, u osteoporosis que acompaña a la artritis reumatoide.

9. Un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para su uso en un procedimiento de tratamiento y/o prevención del metabolismo óseo anómalo, caracterizado por administrar simultánea o sucesivamente el anticuerpo o fragmentos de unión a antígeno del anticuerpo y al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en bisfosfonatos, vitamina D3 activa, calcitonina y derivados de la misma, hormonas tales como estradiol, MSRE (moduladores selectivos de los receptores de estrógenos), ipriflavona, vitamina K2 (menatetrenona), preparaciones de calcio, PTH (hormona paratiroidea), agentes antiinflamatorios no esteroideos, receptores de TNF solubles, anticuerpos anti-TNF-a o fragmentos de unión a antígeno de los anticuerpos, anticuerpos anti-PTHrP (proteína relacionada con la hormona paratiroidea) o fragmentos de unión a antígeno de los anticuerpos, antagonistas del receptor de IL-1, anticuerpos anti-receptor de IL-6 o fragmentos de unión a antígeno de los anticuerpos, anticuerpos anti-RANKL o fragmentos de unión a antígeno de los anticuerpos, y OCIF (factor inhibidor de la osteoclastogénesis), en el que el metabolismo óseo anómalo se selecciona del grupo que consiste en osteoporosis, destrucción ósea que acompaña a la artritis reumatoide y destrucción ósea que acompaña a la metástasis del cáncer al hueso, preferentemente osteoporosis, más preferentemente osteoporosis posmenopáusica, osteoporosis senil, osteoporosis secundaria debida al uso de un agente terapéutico, tal como un esteroide o un inmunosupresor, u osteoporosis que acompaña a la artritis reumatoide.

10. Un polinucleótido que codifica el anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 5.

11. El polinucleótido según la reivindicación 10, caracterizado por contener una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 420 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 40 y una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 396 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 42.

12. El polinucleótido según la reivindicación 11, caracterizado por contener una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 1410 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 40 y una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 711 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 42.

13. El polinucleótido según la reivindicación 10, caracterizado por contener:

a7) una secuencia de nucleótidos que incluye una sustitución, supresión o adición de un nucleótido en una cualquiera de las secuencias de nucleótidos seleccionadas de a1) a a5); y

b8) una secuencia de nucleótidos que incluye una sustitución, supresión o adición de un nucleótido en una cualquiera de las secuencias de nucleótidos seleccionadas de b1) a b6).

14. El polinucleótido según la reivindicación 13 caracterizado por contener:

(a) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 420 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 50 y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 399 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 60; o

(b) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 420 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 52 y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 399 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 62; o

(c) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 420 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 54 y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 399 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 64; o

(d) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 420 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 54 y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 396 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 66; o

(e) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 420 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 56 y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 399 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 68; o

(h) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 1410 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 52 y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 714 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 62; o

(i) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 1410 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 54 y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 714 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 64; o

(j) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 1410 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 54 y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 711 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 66; o

(k) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 1410 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 56 y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 714 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 68; o

(l) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 1410 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 58 y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 714 de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 70.

15. Un vector, que comprende uno cualquiera de los polinucleótidos según las reivindicaciones 10 a 14.

16. Una célula huésped transformada, que comprende uno cualquiera de los polinucleótidos según las reivindicaciones 10 a 14 o el vector según la reivindicación 15.

17. Un procedimiento para producir el anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 5, que comprende cultivar la célula huésped según la reivindicación 16 y purificar un anticuerpo del producto de cultivo resultante.