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CN118126183A - 抗人tlr7抗体 - Google Patents

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CN118126183A
CN118126183A CN202410248751.9A CN202410248751A CN118126183A CN 118126183 A CN118126183 A CN 118126183A CN 202410248751 A CN202410248751 A CN 202410248751A CN 118126183 A CN118126183 A CN 118126183A
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CN
China
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amino acid
acid sequence
antibody
seq
tlr7
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CN202410248751.9A
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三宅健介
村上祐辅
本井祐二
菅野敦夫
清水敏之
大户梅治
下里隆一
万野笃
明松隆志
石黑纯
中村健介
矶部崇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Daiichi Sankyo Co Ltd
University of Tokyo NUC
Original Assignee
Daiichi Sankyo Co Ltd
University of Tokyo NUC
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Publication date
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Abstract

本发明公开了抗人TLR7抗体。本发明提供药物组合物等，所述药物组合物含有与人TLR7或猴TLR7特异性结合且不与小鼠TLR7或大鼠TLR7结合、具有抑制人TLR7或猴TLR7的功能的活性的抗体。

Description

抗人TLR7抗体
本申请是申请日为2019年5月30日，申请号为201980036556.7，发明名称为“抗人TLR7抗体”的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及用于治疗障碍及疾病的抗人Toll样受体(Toll-like receptor：TLR)7抗体。
背景技术
已知作为模式识别分子的TLR在人类中存在10种且形成了一个家族。其中，TLR7(变体1)为包含1049个氨基酸的单次跨膜型蛋白，识别单链RNA，介导I型干扰素、细胞因子的产生等而承担生物体防御反应，另一方面表明其很可能在各种炎症性疾病、自身免疫疾病的疾病形成中发挥着重要作用(非专利文献1)。另外，在TLR7(变体2)中，还已知包含1049个氨基酸的作为单次跨膜型蛋白的变体，已知与上述TLR7(变体1)具有相同的功能(非专利文献2)。特别地，多个报道指出TLR7可能与银屑病、系统性红斑狼疮等疾病有关，期待通过抑制TLR7的功能来治疗疾病(非专利文献3)。
另外，根据暗示了TLR7缺损会使疾病模型的症状减轻、而TLR9缺损会导致疾病恶化的报道，我们认为能够特异性抑制TLR7的药剂有望治疗炎症性疾病等(非专利文献4)。
目前，虽然尝试了以抑制人TLR7为目标的核酸、低分子化合物等的研究开发，但是难以通过核酸、低分子化合物来实现人TLR7特异性抑制，另外，作为TLR7抗体，已知小鼠抗小鼠TLR7抗体(专利文献1)，但是需要研究开发新的人TLR7特异性抑制剂。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:WO2014/174704
非专利文献
非专利文献1:Takeuchi O,Akira S.Cell.2010 Mar 19；140(6):805-2
非专利文献2:HYPERLINK"https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/？term＝Chuang％20TH％5BAuthor％5D&cauthor＝true&cauthor#uid＝11022120"Chuang TH,HYPERLINK"https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/？term＝Ulevitch％20RJ％5BAuthor％5D&cauthor＝true&cauthor#uid＝11022120"Ulevitch RJ,HYPERLINK"https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11022120"\o"European cytokine network."Eur Cytokine Netw.2000 Sep；11(3):372-8
非专利文献3:Lyn-Cook BD,Xie C,Oates J,Treadwell E,Word B,Hammons G,Wiley K.Mol Immunol.2014 Sep；61(1):38-43.
非专利文献4:Christensen SR,Shupe J,Nickerson K,Kashgarian M,FlavellRA,Shlomchik MJ Immunity.2006 Sep；25(3):417-28.
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的在于，提供免疫炎症相关疾病、变态反应性疾病、感染症、癌症的治疗和/或预防剂。
用于解决问题的方案
为了解决上述课题，本发明人们找到了具有免疫炎症相关疾病、变态反应性疾病、感染症、癌症的治疗和/或预防效果的物质，取得了小鼠抗人TLR7抗体。将得到的小鼠抗人TLR7抗体人源化，进一步对该人源化抗体的CDR、框架及可变区进行了修饰，从而完成了本发明。
即，本发明包括以下发明。
(1)一种抗体或该抗体的抗原结合性片段，其特征在于，其具有以下特性：
(a)与人TLR7或猴TLR7特异性结合且不与小鼠TLR7或大鼠TLR7结合；及
(b)抑制人TLR7或猴TLR7的功能。
(2)根据上述(1)所述的抗体或该抗体的抗原结合性片段，其中，人TLR7为由序列号2或序列号4记载的氨基酸序列构成的分子、猴TLR7为由序列号85记载的氨基酸序列构成的分子、小鼠TLR7为由序列号83记载的氨基酸序列构成的分子、或者大鼠TLR7为由序列号84记载的氨基酸序列构成的分子。
(3)根据上述(1)或(2)所述的抗体或该抗体的抗原结合性片段，其在与人TLR7的结合中与下述抗体具有竞争性抑制活性，所述抗体为：
含有具有由序列号5记载的氨基酸序列构成的重链可变区的重链及具有由序列号11记载的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的抗体、
含有具有由序列号7记载的氨基酸序列构成的重链可变区的重链及具有由序列号13记载的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的抗体、或
含有具有由序列号9记载的氨基酸序列构成的重链可变区的重链及具有由序列号15记载的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的抗体。
(4)根据上述(1)～(3)中的任一项所述的抗体或该抗体的抗原结合性片段，其中，
(a)具有由序列号17记载的氨基酸序列构成的CDRH1、由序列号18记载的氨基酸序列构成的CDRH2及由序列号19记载的氨基酸序列构成的CDRH3作为重链的互补决定区、以及
具有由序列号20记载的氨基酸序列构成的CDRL1、由序列号21记载的氨基酸序列构成的CDRL2及由序列号22记载的氨基酸序列构成的CDRL3作为轻链的互补决定区、
(b)具有由序列号23记载的氨基酸序列构成的CDRH1、由序列号24记载的氨基酸序列构成的CDRH2及由序列号25记载的氨基酸序列构成的CDRH3作为重链的互补决定区、以及
具有由序列号26记载的氨基酸序列构成的CDRL1、由序列号27记载的氨基酸序列构成的CDRL2及由序列号28记载的氨基酸序列构成的CDRL3作为轻链的互补决定区、或
(c)具有由序列号29记载的氨基酸序列构成的CDRH1、由序列号30记载的氨基酸序列构成的CDRH2及由序列号31记载的氨基酸序列构成的CDRH3作为重链的互补决定区、以及
具有由序列号32记载的氨基酸序列构成的CDRL1、由序列号33记载的氨基酸序列构成的CDRL2及由序列号34记载的氨基酸序列构成的CDRL3作为轻链的互补决定区。
(5)根据上述(4)所述的抗体或该抗体的抗原结合性片段，其中，
具有由序列号17记载的氨基酸序列构成的CDRH1、由序列号18记载的氨基酸序列构成的CDRH2及由序列号19记载的氨基酸序列构成的CDRH3作为重链的互补决定区、以及
具有由序列号20记载的氨基酸序列构成的CDRL1、由序列号21记载的氨基酸序列构成的CDRL2及由序列号22记载的氨基酸序列构成的CDRL3作为轻链的互补决定区。
(6)根据上述(1)～(5)中的任一项所述的抗体或该抗体的抗原结合性片段，其具有：
(a)由序列号5记载的氨基酸序列构成的重链可变区及由序列号11记载的氨基酸序列构成的轻链可变区、
(b)由序列号7记载的氨基酸序列构成的重链可变区及由序列号13记载的氨基酸序列构成的轻链可变区、或
(c)由序列号9记载的氨基酸序列构成的重链可变区及由序列号15记载的氨基酸序列构成的轻链可变区。
(7)根据上述(1)～(6)中的任一项所述的抗体或该抗体的抗原结合性片段，其中，恒定区为人源恒定区。
(8)根据上述(7)所述的抗体或该抗体的抗原结合性片段，其具有：
(a)由序列号35记载的氨基酸序列中的第20位至第465位的氨基酸序列构成的重链及由序列号36记载的氨基酸序列中的第21位至第233位的氨基酸序列构成的轻链、
(b)由序列号37记载的氨基酸序列中的第20位至第471位的氨基酸序列构成的重链及由序列号38记载的氨基酸序列中的第21位至第233位的氨基酸序列构成的轻链、或
(c)由序列号39记载的氨基酸序列中的第20位至第470位的氨基酸序列构成的重链及由序列号40记载的氨基酸序列中的第21位至第234位的氨基酸序列构成的轻链。
(9)根据上述(1)～(8)中的任一项所述的抗体或该抗体的抗原结合性片段，其被人源化。
(10)根据上述(9)所述的抗体或该抗体的抗原结合性片段，其具有：
(I)由选自下述(a)、(b)、(c)和(d)组成的组中的氨基酸序列构成的重链可变区、以及由选自下述(e)、(f)、(g)和(h)组成的组中的氨基酸序列构成的轻链可变区，
(a)序列号41记载的氨基酸序列、
(b)序列号42记载的氨基酸序列、
(c)相对于(a)或(b)的序列具有至少95％以上的同源性的氨基酸序列、
(d)在(a)或(b)的序列中缺失、置换或添加了1至10个氨基酸的氨基酸序列；
(e)序列号43记载的氨基酸序列、
(f)序列号44记载的氨基酸序列、
(g)相对于(e)或(f)的序列具有至少95％以上的同源性的氨基酸序列、
(h)在(e)或(f)的序列中缺失、置换或添加了1至10个氨基酸的氨基酸序列；
或者
(II)由选自下述(a)、(b)和(c)组成的组中的氨基酸序列构成的重链可变区、以及由选自下述(d)、(e)和(f)组成的组中的氨基酸序列构成的轻链可变区，
(a)序列号50记载的氨基酸序列、
(b)相对于(a)的序列具有至少95％以上的同源性的氨基酸序列、
(c)在(a)的序列中缺失、置换或添加了1至10个氨基酸的氨基酸序列；
(d)序列号51记载的氨基酸序列、
(e)相对于(d)的序列具有至少95％以上的同源性的氨基酸序列、
(f)在(d)的序列中缺失、置换或添加了1至10个氨基酸的氨基酸序列。
(11)根据上述(10)所述的抗体或抗体的抗原结合性片段，其具有：
(a)由序列号41记载的氨基酸序列构成的重链可变区及由序列号43记载的氨基酸序列构成的轻链可变区、
(b)由序列号41记载的氨基酸序列构成的重链可变区及由序列号44记载的氨基酸序列构成的轻链可变区、
(c)由序列号42记载的氨基酸序列构成的重链可变区及由序列号43记载的氨基酸序列构成的轻链可变区、
(d)由序列号42记载的氨基酸序列构成的重链可变区及由序列号44记载的氨基酸序列构成的轻链可变区、或
(e)由序列号50记载的氨基酸序列构成的重链可变区及由序列号51记载的氨基酸序列构成的轻链可变区。
(12)根据上述(11)所述的抗体或抗体的抗原结合性片段，其具有由序列号42记载的氨基酸序列构成的重链可变区及由序列号44记载的氨基酸序列构成的轻链可变区。
(13)根据上述(11)所述的抗体或该抗体的抗原结合性片段，其具有：
(a)由序列号45记载的氨基酸序列中的第20位至第465位的氨基酸序列构成的重链及由序列号48记载的氨基酸序列中的第21位至第233位的氨基酸序列构成的轻链、
(b)由序列号45记载的氨基酸序列中的第20位至第465位的氨基酸序列构成的重链及由序列号49记载的氨基酸序列中的第21位至第233位的氨基酸序列构成的轻链、
(c)由序列号46记载的氨基酸序列中的第20位至第465位的氨基酸序列构成的重链及由序列号48记载的氨基酸序列中的第21位至第233位的氨基酸序列构成的轻链、
(d)由序列号46记载的氨基酸序列中的第20位至第465位的氨基酸序列构成的重链及由序列号49记载的氨基酸序列中的第21位至第233位的氨基酸序列构成的轻链、
(e)由序列号47记载的氨基酸序列中的第20位至第462位的氨基酸序列构成的重链及由序列号48记载的氨基酸序列中的第21位至第233位的氨基酸序列构成的轻链、
(f)由序列号47记载的氨基酸序列中的第20位至第462位的氨基酸序列构成的重链及由序列号49记载的氨基酸序列中的第21位至第233位的氨基酸序列构成的轻链、
(g)由序列号52记载的氨基酸序列中的第20位至第471位的氨基酸序列构成的重链及由序列号53记载的氨基酸序列中的第21位至第233位的氨基酸序列构成的轻链、或
(h)由序列号54记载的氨基酸序列中的第20位至第468位的氨基酸序列构成的重链及由序列号53记载的氨基酸序列中的第21位至第233位的氨基酸序列构成的轻链。
(14)根据上述(13)所述的抗体或该抗体的抗原结合性片段，其具有由序列号46记载的氨基酸序列中的第20位至第465位的氨基酸序列构成的重链及由序列号49记载的氨基酸序列中的第21位至第233位的氨基酸序列构成的轻链。
(15)一种抗体或该抗体的抗原结合性片段，其特征在于，具有以下特性：
(a)与人TLR7特异性结合、
(b)抑制人TLR7的功能、及
(c)(1)具有由序列号17记载的氨基酸序列构成的CDRH1、由序列号18记载的氨基酸序列构成的CDRH2及由序列号19记载的氨基酸序列构成的CDRH3作为重链的互补决定区、以及具有由序列号20记载的氨基酸序列构成的CDRL1、由序列号21记载的氨基酸序列构成的CDRL2及由序列号22记载的氨基酸序列构成的CDRL3作为轻链的互补决定区、
(2)具有由序列号23记载的氨基酸序列构成的CDRH1、由序列号24记载的氨基酸序列构成的CDRH2及由序列号25记载的氨基酸序列构成的CDRH3作为重链的互补决定区、以及具有由序列号26记载的氨基酸序列构成的CDRL1、由序列号27记载的氨基酸序列构成的CDRL2及由序列号28记载的氨基酸序列构成的CDRL3作为轻链的互补决定区、或
(3)具有由序列号29记载的氨基酸序列构成的CDRH1、由序列号30记载的氨基酸序列构成的CDRH2及由序列号31记载的氨基酸序列构成的CDRH3作为重链的互补决定区、以及具有由序列号32记载的氨基酸序列构成的CDRL1、由序列号33记载的氨基酸序列构成的CDRL2及由序列号34记载的氨基酸序列构成的CDRL3作为轻链的互补决定区。
(16)根据上述(15)所述的抗体或该抗体的抗原结合性片段，其中，
具有由序列号17记载的氨基酸序列构成的CDRH1、由序列号18记载的氨基酸序列构成的CDRH2及由序列号19记载的氨基酸序列构成的CDRH3作为重链的互补决定区、以及
具有由序列号20记载的氨基酸序列构成的CDRL1、由序列号21记载的氨基酸序列构成的CDRL2及由序列号22记载的氨基酸序列构成的CDRL3作为轻链的互补决定区。
(17)根据上述(15)或(16)所述的抗体或该抗体的抗原结合性片段，其具有：
(a)由序列号5记载的氨基酸序列构成的重链可变区及由序列号11记载的氨基酸序列构成的轻链可变区、
(b)由序列号7记载的氨基酸序列构成的重链可变区及由序列号13记载的氨基酸序列构成的轻链可变区、或
(c)由序列号9记载的氨基酸序列构成的重链可变区及由序列号15记载的氨基酸序列构成的轻链可变区。
(18)根据上述(15)～(17)中的任一项所述的抗体或该抗体的抗原结合性片段，其中，恒定区为人源恒定区。
(19)根据上述(18)所述的抗体或该抗体的抗原结合性片段，其具有：
(a)由序列号35记载的氨基酸序列中的第20位至第465位的氨基酸序列构成的重链及由序列号36记载的氨基酸序列中的第21位至第233位的氨基酸序列构成的轻链、
(b)由序列号37记载的氨基酸序列中的第20位至第471位的氨基酸序列构成的重链及由序列号38记载的氨基酸序列中的第21位至第233位的氨基酸序列构成的轻链、或
(c)由序列号39记载的氨基酸序列中的第20位至第470位的氨基酸序列构成的重链及由序列号40记载的氨基酸序列中的第21位至第234位的氨基酸序列构成的轻链。
(20)根据上述(15)～(19)中的任一项所述的抗体或该抗体的抗原结合性片段，其被人源化。
(21)根据上述(20)所述的抗体或该抗体的抗原结合性片段，其具有：
(I)由选自下述(a)、(b)、(c)和(d)组成的组中的氨基酸序列构成的重链可变区、以及由选自下述(e)、(f)、(g)和(h)组成的组中的氨基酸序列构成的轻链可变区，
(a)序列号41记载的氨基酸序列、
(b)序列号42记载的氨基酸序列、
(c)相对于(a)或(b)的序列具有至少95％以上的同源性的氨基酸序列、
(d)在(a)或(b)的序列中缺失、置换或添加了1至10个氨基酸的氨基酸序列；
(e)序列号43记载的氨基酸序列、
(f)序列号44记载的氨基酸序列、
(g)相对于(e)或(f)的序列具有至少95％以上的同源性的氨基酸序列、
(h)在(e)或(f)的序列中缺失、置换或添加了1至10个氨基酸的氨基酸序列；
或者
(II)由选自下述(a)、(b)和(c)组成的组中的氨基酸序列构成的重链可变区、以及由选自下述(d)、(e)和(f)组成的组中的氨基酸序列构成的轻链可变区，
(a)序列号50记载的氨基酸序列、
(b)相对于(a)的序列具有至少95％以上的同源性的氨基酸序列、
(c)在(a)的序列中缺失、置换或添加了1至10个氨基酸的氨基酸序列；
(d)序列号51记载的氨基酸序列、
(e)相对于(d)的序列具有至少95％以上的同源性的氨基酸序列、
(f)在(d)的序列中缺失、置换或添加了1至10个氨基酸的氨基酸序列。
(22)根据上述(21)所述的抗体或抗体的抗原结合性片段，其具有：
(a)由序列号41记载的氨基酸序列构成的重链可变区及由序列号43记载的氨基酸序列构成的轻链可变区、
(b)由序列号41记载的氨基酸序列构成的重链可变区及由序列号44记载的氨基酸序列构成的轻链可变区、
(c)由序列号42记载的氨基酸序列构成的重链可变区及由序列号43记载的氨基酸序列构成的轻链可变区、
(d)由序列号42记载的氨基酸序列构成的重链可变区及由序列号44记载的氨基酸序列构成的轻链可变区、或
(e)由序列号50记载的氨基酸序列构成的重链可变区及由序列号51记载的氨基酸序列构成的轻链可变区。
(23)根据上述(22)所述的抗体或抗体的抗原结合性片段，其具有由序列号42记载的氨基酸序列构成的重链可变区及由序列号44记载的氨基酸序列构成的轻链可变区。
(24)根据上述(22)所述的抗体或该抗体的抗原结合性片段，其具有：
(a)由序列号45记载的氨基酸序列中的第20位至第465位的氨基酸序列构成的重链及由序列号48记载的氨基酸序列中的第21位至第233位的氨基酸序列构成的轻链、
(b)由序列号45记载的氨基酸序列中的第20位至第465位的氨基酸序列构成的重链及由序列号49记载的氨基酸序列中的第21位至第233位的氨基酸序列构成的轻链、
(c)由序列号46记载的氨基酸序列中的第20位至第465位的氨基酸序列构成的重链及由序列号48记载的氨基酸序列中的第21位至第233位的氨基酸序列构成的轻链、
(d)由序列号46记载的氨基酸序列中的第20位至第465位的氨基酸序列构成的重链及由序列号49记载的氨基酸序列中的第21位至第233位的氨基酸序列构成的轻链、
(e)由序列号47记载的氨基酸序列中的第20位至第462位的氨基酸序列构成的重链及由序列号48记载的氨基酸序列中的第21位至第233位的氨基酸序列构成的轻链、
(f)由序列号47记载的氨基酸序列中的第20位至第462位的氨基酸序列构成的重链及由序列号49记载的氨基酸序列中的第21位至第233位的氨基酸序列构成的轻链、
(g)由序列号52记载的氨基酸序列中的第20位至第471位的氨基酸序列构成的重链及由序列号53记载的氨基酸序列中的第21位至第233位的氨基酸序列构成的轻链、或
(h)由序列号54记载的氨基酸序列中的第20位至第468位的氨基酸序列构成的重链及由序列号53记载的氨基酸序列中的第21位至第233位的氨基酸序列构成的轻链。
(25)根据上述(24)所述的抗体或该抗体的抗原结合性片段，其具有由序列号46记载的氨基酸序列中的第20位至第465位的氨基酸序列构成的重链及由序列号49记载的氨基酸序列中的第21位至第233位的氨基酸序列构成的轻链。
(26)一种抗体或该抗体的抗原结合性片段，其具有由序列号45记载的氨基酸序列中的第20位至第465位的氨基酸序列构成的重链及由序列号48记载的氨基酸序列中的第21位至第233位的氨基酸序列构成的轻链。
(27)一种抗体或该抗体的抗原结合性片段，其具有由序列号46记载的氨基酸序列中的第20位至第465位的氨基酸序列构成的重链及由序列号48记载的氨基酸序列中的第21位至第233位的氨基酸序列构成的轻链。
(28)一种抗体或该抗体的抗原结合性片段，其具有由序列号46记载的氨基酸序列中的第20位至第465位的氨基酸序列构成的重链及由序列号49记载的氨基酸序列中的第21位至第233位的氨基酸序列构成的轻链。
(29)一种抗体或该抗体的抗原结合性片段，其具有由序列号47记载的氨基酸序列中的第20位至第462位的氨基酸序列构成的重链及由序列号49记载的氨基酸序列中的第21位至第233位的氨基酸序列构成的轻链。
(30)一种抗体或该抗体的抗原结合性片段，其具有由序列号52记载的氨基酸序列中的第20位至第471位的氨基酸序列构成的重链及由序列号53记载的氨基酸序列中的第21位至第233位的氨基酸序列构成的轻链。
(31)一种抗体或该抗体的抗原结合性片段，其具有由序列号54记载的氨基酸序列中的第20位至第468位的氨基酸序列构成的重链及由序列号53记载的氨基酸序列中的第21位至第233位的氨基酸序列构成的轻链。
(32)根据上述(26)～(31)中的任一项所述的抗体或该抗体的抗原结合性片段，其具有以下特性：(a)与人TLR7特异性结合、及(b)抑制人TLR7的功能。
(33)根据上述(1)～(32)中的任一项所述的抗体的抗原结合性片段，其中，抗原结合性片段选自由Fab、F(ab)2、Fab’及Fv组成的组。
(34)一种多核苷酸，其具有编码上述(1)～(33)中的任一项所述的抗体或该抗体的抗原结合性片段的多核苷酸序列。
(35)根据上述(34)所述的多核苷酸，其具有：
(1)编码由序列号17记载的氨基酸序列构成的CDRH1的多核苷酸序列、编码由序列号18记载的氨基酸序列构成的CDRH2的多核苷酸序列及编码由序列号19记载的氨基酸序列构成的CDRH3的多核苷酸序列、以及
编码由序列号20记载的氨基酸序列构成的CDRL1的多核苷酸序列、编码由序列号21记载的氨基酸序列构成的CDRL2的多核苷酸序列及编码由序列号22记载的氨基酸序列构成的CDRL3的多核苷酸序列、
(2)编码由序列号23记载的氨基酸序列构成的CDRH1的多核苷酸序列、编码由序列号24记载的氨基酸序列构成的CDRH2的多核苷酸序列及编码由序列号25记载的氨基酸序列构成的CDRH3的多核苷酸序列、以及
编码由序列号26记载的氨基酸序列构成的CDRL1的多核苷酸序列、编码由序列号27记载的氨基酸序列构成的CDRL2的多核苷酸序列及编码由序列号28记载的氨基酸序列构成的CDRL3的多核苷酸序列、或
(3)编码由序列号29记载的氨基酸序列构成的CDRH1的多核苷酸序列、编码由序列号30记载的氨基酸序列构成的CDRH2的多核苷酸序列及编码由序列号31记载的氨基酸序列构成的CDRH3的多核苷酸序列、以及
编码由序列号32记载的氨基酸序列构成的CDRL1的多核苷酸序列、编码由序列号33记载的氨基酸序列构成的CDRL2的多核苷酸序列及编码由序列号34记载的氨基酸序列构成的CDRL3的多核苷酸序列。
(36)根据上述(35)所述的多核苷酸，其具有：
(I)选自由下述(a)、(b)和(c)组成的组中的多核苷酸序列、以及选自由下述(d)、(e)和(f)组成的组中的多核苷酸序列，
(a)编码序列号77记载的重链可变区的多核苷酸序列、
(b)编码序列号78记载的重链可变区的多核苷酸序列、
(c)和由与(a)或(b)的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列构成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸所具有的多核苷酸序列；
(d)编码序列号79记载的轻链可变区的多核苷酸序列、
(e)编码序列号80记载的轻链可变区的多核苷酸序列、
(f)和由与(d)或(e)的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列构成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸所具有的多核苷酸序列；
或者
(II)选自由下述(a)和(b)组成的组中的多核苷酸序列、以及选自由下述(c)和(d)组成的组中的多核苷酸序列，
(a)编码序列号81记载的重链可变区的多核苷酸序列、
(b)和由与(a)的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列构成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸所具有的多核苷酸序列；
(c)编码序列号82记载的轻链可变区的多核苷酸序列、
(d)和由与(c)的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列构成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸所具有的多核苷酸序列。
(37)根据上述(36)所述的多核苷酸，其具有：
(a)编码序列号77记载的重链可变区的多核苷酸序列及编码序列号79记载的轻链可变区的多核苷酸序列、
(b)编码序列号77记载的重链可变区的多核苷酸序列及编码序列号80记载的轻链可变区的多核苷酸序列、
(c)编码序列号78记载的重链可变区的多核苷酸序列及编码序列号79记载的轻链可变区的多核苷酸序列、
(d)编码序列号78记载的重链可变区的多核苷酸序列及编码序列号80记载的轻链可变区的多核苷酸序列、或
(e)编码序列号81记载的重链可变区的多核苷酸序列及编码序列号82记载的轻链可变区的多核苷酸序列。
(38)一种表达载体，其含有上述(34)～(37)中的任一项所述的多核苷酸。
(39)一种宿主细胞，其用上述(38)所述的表达载体进行了转化。
(40)根据上述(39)所述的宿主细胞，其中，宿主细胞为真核细胞。
(41)一种抗体或片段的制造方法，其特征在于，其包括培养上述(39)或(40)所述的宿主细胞的工序、及从该工序所得到的培养物中收集目标抗体或该抗体的抗原结合性片段的工序。
(42)一种抗体或该抗体的抗原结合性片段，其特征在于，其是通过上述(41)的制造方法得到的。
(43)根据上述(1)～(32)中的任一项所述的抗体，其含有选自由下述修饰组成的组中的一种或两种以上的修饰：向N-键添加糖链、向O-键添加糖链、N末端的加工、C末端的加工、脱酰胺化、天冬氨酸的异构化、甲硫氨酸的氧化、向N末端添加甲硫氨酸残基、脯氨酸残基的酰胺化及使重链的羧基末端缺失1个或2个氨基酸。
(44)根据上述(43)所述的抗体，其中，2条重链为由以下重链中的任一种或任两种的组合构成的重链，所述重链选自由全长及羧基末端缺失了1个或2个氨基酸的缺失体组成的组。
(45)根据上述(44)所述的抗体，其中，2条重链两者的羧基末端缺失了1个氨基酸。
(46)根据上述(43)～(45)中的任一项所述的抗体，其中，重链的羧基末端的脯氨酸残基进一步被酰胺化。
(47)一种用于疾病的治疗和/或预防的药物组合物，其特征在于，含有上述(1)～(33)及(42)～(46)所述的抗体或该抗体的抗原结合性片段中的至少一种或上述(38)所述的表达载体作为有效成分。
(48)根据上述(47)所述的药物组合物，其用于治疗起因于人TLR7的功能的疾病。
(49)根据上述(48)所述的药物组合物，其中，起因于人TLR7的功能的疾病为免疫炎症相关疾病、变态反应性疾病、感染症、或癌症。
(50)根据上述(49)所述的药物组合物，其中，免疫炎症相关疾病为系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、幼年特发性关节炎、成人斯蒂尔病、强直性脊柱炎、系统性硬皮病、多发性肌炎、皮肌炎、银屑病关节炎、骨关节炎、混合性结缔组织病或肌营养不良。
(51)根据上述(49)或(50)所述的药物组合物，其中，免疫炎症相关疾病为系统性红斑狼疮。
(52)根据上述(47)～(51)中的任一项所述的药物组合物，其用于与免疫抑制剂、抗炎症剂、抗变态反应剂、抗感染症剂、或抗癌症剂组合使用。
(53)一种起因于人TLR7的功能的疾病的治疗方法，其特征在于，向个体给予上述(1)～(33)及(42)～(46)所述的抗体或该抗体的抗原结合性片段中的至少一种。
(54)一种起因于人TLR7的功能的疾病的治疗方法，其特征在于，向个体同时、分别或连续地给予上述(1)～(33)及(42)～(46)所述的抗体或该抗体的抗原结合性片段中的至少一种以及免疫抑制剂、抗炎症剂、抗变态反应剂、抗感染症剂、或抗癌症剂。
(55)根据上述(53)或(54)所述的治疗方法，其中，起因于人TLR7的功能的疾病为免疫炎症相关疾病、变态反应性疾病、感染症、或癌症。
(56)根据上述(55)所述的治疗方法，其中，免疫炎症相关疾病为系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、幼年特发性关节炎、成人斯蒂尔病、强直性脊柱炎、系统性硬皮病、多发性肌炎、皮肌炎、银屑病关节炎、骨关节炎、混合性结缔组织病或肌营养不良。
(57)根据上述(55)或(56)所述的治疗方法，其中，免疫炎症相关疾病为系统性红斑狼疮。
(58)根据上述(1)～(33)及(42)～(46)中任一项所述的抗体或该抗体的抗原结合性片段或上述(38)所述的表达载体，其用于治疗或预防起因于人TLR7的功能的疾病。
(59)根据上述(58)所述的抗体或该抗体的抗原结合性片段或表达载体，其中，起因于人TLR7的功能的疾病为免疫炎症相关疾病、变态反应性疾病、感染症、或癌症。
(60)根据上述(59)所述的抗体或该抗体的抗原结合性片段或表达载体，其中，免疫炎症相关疾病为系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、幼年特发性关节炎、成人斯蒂尔病、强直性脊柱炎、系统性硬皮病、多发性肌炎、皮肌炎、银屑病关节炎、骨关节炎、混合性结缔组织病或肌营养不良。
(61)根据上述(59)或(60)所述的抗体或该抗体的抗原结合性片段或表达载体，其中，免疫炎症相关疾病为系统性红斑狼疮。
(62)根据上述(58)～(61)中的任一项所述的抗体或该抗体的抗原结合性片段或表达载体，其用于与免疫抑制剂、抗炎症剂、抗变态反应剂、抗感染症剂、或抗癌症剂组合使用。
(63)一种上述(1)～(33)及(42)～(46)中任一项所述的抗体或该抗体的抗原结合性片段或上述(38)所述的表达载体的应用，其用于制造起因于人TLR7的功能的疾病的治疗剂或预防剂。
(64)根据上述(63)所述的应用，其中，起因于人TLR7的功能的疾病为免疫炎症相关疾病、变态反应性疾病、感染症、或癌症。
(65)根据上述(64)所述的应用，其中，免疫炎症相关疾病为系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、幼年特发性关节炎、成人斯蒂尔病、强直性脊柱炎、系统性硬皮病、多发性肌炎、皮肌炎、银屑病关节炎、骨关节炎、混合性结缔组织病或肌营养不良。
(66)根据上述(64)或(65)所述的应用，其中，免疫炎症相关疾病为系统性红斑狼疮。
(67)根据上述(63)～(66)中的任一项所述的应用，其中，治疗剂或预防剂与免疫抑制剂、抗炎症剂、抗变态反应剂、抗感染症剂、或抗癌症剂组合使用。
发明的效果
根据本发明，可以得到以抑制TLR7的功能为作用机制的、免疫炎症相关疾病、变态反应性疾病、感染症、癌症的治疗和/或预防剂。
附图说明
图1为示出人TLR7(变体1)的氨基酸序列(序列号2)的图。
图2为示出人TLR7(变体2)的氨基酸序列(序列号4)的图。
图3为示出小鼠TLR7的氨基酸序列(序列号83)的图。
图4为示出大鼠TLR7的氨基酸序列(序列号84)的图。
图5为示出猴TLR7的氨基酸序列(序列号85)的图。
图6为示出AT01抗体、NB7抗体及FAN2抗体以添加浓度依赖性的方式抑制经CL-264处理的人外周血单核细胞(以下记作PBMC)的IL-6产生的图。
图7为示出cAT01抗体的含有信号序列的重链的氨基酸序列(序列号35)及含有信号序列的轻链的氨基酸序列(序列号36)的图。重链氨基酸序列中，第1位至第19位的氨基酸序列为信号序列，第20位至第135位的氨基酸序列为重链可变区，第136位至第465位的氨基酸序列为重链恒定区。轻链氨基酸序列中，第1位至第20位的氨基酸序列为信号序列，第21位至第126位的氨基酸序列为轻链可变区，第127位至第233位的氨基酸序列为轻链恒定区。
图8为示出cNB7抗体的含有信号序列的重链的氨基酸序列(序列号37)及含有信号序列的轻链的氨基酸序列(序列号38)的图。重链氨基酸序列中，第1位至第19位的氨基酸序列为信号序列，第20位至第141位的氨基酸序列为重链可变区，第142位至第471位的氨基酸序列为重链恒定区。轻链氨基酸序列中，第1位至第20位的氨基酸序列为信号序列，第21位至第126位的氨基酸序列为轻链可变区，第127位至第233位的氨基酸序列为轻链恒定区。
图9为示出cFAN2抗体的含有信号序列的重链的氨基酸序列(序列号39)及含有信号序列的轻链的氨基酸序列(序列号40)的图。重链氨基酸序列中，第1位至第19位的氨基酸序列为信号序列，第20位至第140位的氨基酸序列为重链可变区，第141位至第470位的氨基酸序列为重链恒定区。轻链氨基酸序列中，第1位至第20位的氨基酸序列为信号序列，第21位至第127位的氨基酸序列为轻链可变区，第128位至第234位的氨基酸序列为轻链恒定区。
图10为示出作为嵌合抗人TLR7抗体的cAT01、cNB7、cFAN2以添加浓度依赖性的方式抑制经CL-264处理的人PBMC的IL-6产生的图。
图11为示出作为人源化的重链的huAT01_H1_IgG1LALA的、含有信号序列的重链的氨基酸序列(序列号45)的图。该序列中，第1位至第19位的氨基酸序列为信号序列，第20位至第135位的氨基酸序列为可变区，第136位至第465位的氨基酸序列为恒定区。另外，第45位至第54位的氨基酸序列为CDRH1，第69位至第78位的氨基酸序列为CDRH2，第118位至第124位的氨基酸序列为CDRH3。
图12为示出作为人源化的重链的huAT01_H3_IgG1LALA的、含有信号序列的重链的氨基酸序列(序列号46)的图。该序列中，第1位至第19位的氨基酸序列为信号序列，第20位至第135位的氨基酸序列为可变区，第136位至第465位的氨基酸序列为恒定区。另外，第45位至第54位的氨基酸序列为CDRH1，第69位至第78位的氨基酸序列为CDRH2，第118位至第124位的氨基酸序列为CDRH3。
图13为示出作为人源化的重链的huAT01_H3_IgG4Pro的、含有信号序列的重链的氨基酸序列(序列号47)的图。该序列中，第1位至第19位的氨基酸序列为信号序列，第20位至第135位的氨基酸序列为可变区，第136位至第462位的氨基酸序列为恒定区。另外，第45位至第54位的氨基酸序列为CDRH1，第69位至第78位的氨基酸序列为CDRH2，第118位至第124位的氨基酸序列为CDRH3。
图14为示出作为嵌合抗体cAT01的重链的cAT01_H的可变区的氨基酸序列(序列号5)(以下记作cAT01_H)与人源化抗体重链huAT01_H1_IgG1LALA的可变区的氨基酸序列(序列号41)(以下记作huAT01_H1)及huAT01_H3_IgG1LALA的可变区的氨基酸序列(序列号42)(以下记作huAT01_H3)的比较的图。huAT01_H1及huAT01_H3的序列中的“·”表示与cAT01_H相同的氨基酸残基，记载了氨基酸残基的位置表示被置换的氨基酸残基。
图15为示出作为人源化的轻链的huAT01_L1的含有信号序列的轻链的氨基酸序列(序列号48)的图。该序列中，第1位至第20位的氨基酸序列为信号序列，第21位至第126位的氨基酸序列为可变区，第127位至第233位的氨基酸序列为恒定区。另外，氨基酸序号第44位至第54位为CDRL1，氨基酸序号第70位至第76位为CDRL2，氨基酸序号第109位至第116位为CDRL3。
图16为示出作为人源化的轻链的huAT01_L2的含有信号序列的轻链的氨基酸序列(序列号49)的图。该序列中，第1位至第20位的氨基酸序列为信号序列，第21位至第126位的氨基酸序列为可变区，第127位至第233位的氨基酸序列为恒定区。另外，氨基酸序号第44位至第54位为CDRL1，氨基酸序号第70位至第76位为CDRL2，氨基酸序号第109位至第116位为CDRL3。
图17为示出作为嵌合抗体cAT01的轻链的cAT01_L的可变区的氨基酸序列(序列号11)(以下记作cAT01_L)与人源化抗体轻链huAT01_L1的可变区的氨基酸序列(序列号43)(以下记作huAT01_L1)及huAT01_L2的可变区的氨基酸序列(序列号44)(以下记作huAT01_L2)的比较的图。huAT01_L1及huAT01_L2的序列中的“·”表示与cAT01_L相同的氨基酸残基，记载了氨基酸残基的位置表示被置换的氨基酸残基。
图18为示出作为人源化的重链的huNB7_H3_IgG1LALA的含有信号序列的重链的氨基酸序列(序列号52)的图。该序列中，第1位至第19位的氨基酸序列为信号序列，第20位至第141位的氨基酸序列为可变区，第142位至第471位的氨基酸序列为恒定区。另外，氨基酸序号第45位至第55位为CDRH1，氨基酸序号第70位至第78位为CDRH2，氨基酸序号第118位至第130位为CDRH3。
图19为示出作为人源化的重链的huNB7_H3_IgG4Pro的含有信号序列的重链的氨基酸序列(序列号54)的图。该序列中，第1位至第19位的氨基酸序列为信号序列，第20位至第141位的氨基酸序列为可变区，第142位至第468位的氨基酸序列为恒定区。另外，氨基酸序号第45位至第55位为CDRH1，氨基酸序号第70位至第78位为CDRH2，氨基酸序号第118位至第130位为CDRH3。
图20为示出作为嵌合抗体cNB7的重链的cNB7_H的可变区的氨基酸序列(序列号7)(以下记作cNB7_H)与人源化抗体重链huNB7_H3_IgG1LALA的可变区的氨基酸序列(序列号50)(以下记作huNB7_H3)的比较的图。huNB7_H3中的“·”表示与cNB7_H相同的氨基酸残基，记载了氨基酸残基的位置表示被置换的氨基酸残基。
图21为示出作为人源化的轻链的huNB7_L3的含有信号序列的轻链的氨基酸序列(序列号53)的图。该序列中，第1位至第20位的氨基酸序列为信号序列，第21位至第126位的氨基酸序列为可变区，第127位至第233位的氨基酸序列为恒定区。另外，氨基酸序号第44位至第54位为CDRL1，氨基酸序号第70位至第76位为CDRL2，氨基酸序号第109位至第116位为CDRL3。
图22为示出作为嵌合抗体cNB7的轻链的cNB7_L的可变区的氨基酸序列(序列号13)(以下记作cNB7_L)与人源化抗体轻链huNB7_L3的可变区的氨基酸序列(序列号51)(以下记作huNB7_L3)的比较的图。huNB7_L3中的“·”表示与cNB7_L相同的氨基酸残基，记载了氨基酸残基的位置表示被置换的氨基酸残基。
图23为示出人源化抗人TLR7抗体(huAT01_H1L1_IgG1LALA、huAT01_H3L1_IgG1LALA、huAT01_H3L2_IgG1LALA、huAT01_H3L2_IgG4Pro、huNB7_H3L3_IgG1LALA、huNB7_H3L3_IgG4Pro)以添加浓度依赖性的方式抑制经CL-264处理的人PBMC的IL-6产生的图。
图24-1为示出AT01抗体的CDRH1的氨基酸序列(序列号17)、CDRH2的氨基酸序列(序列号18)及CDRH3的氨基酸序列(序列号19)、以及CDRL1的氨基酸序列(序列号20)、CDRL2的氨基酸序列(序列号21)及CDRL3的氨基酸序列(序列号22)的图，图24-2为示出NB7抗体的CDRH1的氨基酸序列(序列号23)、CDRH2的氨基酸序列(序列号24)及CDRH3的氨基酸序列(序列号25)、以及CDRL1的氨基酸序列(序列号26)、CDRL2的氨基酸序列(序列号27)及CDRL3的氨基酸序列(序列号28)的图，图24-3为示出FAN2抗体的CDRH1的氨基酸序列(序列号29)、CDRH2的氨基酸序列(序列号30)及CDRH3的氨基酸序列(序列号31)、以及CDRL1的氨基酸序列(序列号32)、CDRL2的氨基酸序列(序列号33)及CDRL3的氨基酸序列(序列号34)的图。
图25为关于人源化抗人TLR7抗体(huAT01_H3L2_IgG1LALA)与抗原(人TLR7：变体1)结合的流式细胞仪分析结果，为表示与该抗原特异性结合的图。
图26为关于人源化抗人TLR7抗体(huAT01_H3L2_IgG1LALA)与抗原(人TLR7：变体2)结合的流式细胞仪分析结果，为表示与该抗原特异性结合的图。
图27为关于人源化抗人TLR7抗体(huAT01_H3L2_IgG1LALA)与抗原(猴TLR7)结合的流式细胞仪分析结果，为表示与该抗原特异性结合的图。
图28为关于人源化抗人TLR7抗体(huAT01_H3L2_IgG1LALA)与抗原(小鼠TLR7)结合的流式细胞仪分析结果，为表示不与该抗原结合的图。
图29为关于人源化抗人TLR7抗体(huAT01_H3L2_IgG1LALA)与抗原(大鼠TLR7)结合的流式细胞仪分析结果，为表示不与该抗原结合的图。
具体实施方式
本说明书中，“基因”这一术语不仅包括DNA，还包括mRNA、cDNA及cRNA。
本说明书中，“多核苷酸”这一术语以与核酸相同的意思来使用，还包括DNA、RNA、探针、寡核苷酸及引物。
本说明书中，“多肽”和“蛋白质”以无区别的方式来使用。
本说明书中，“RNA级分”是指含有RNA的级分。
本说明书中，“细胞”还包括动物个体内的细胞、培养细胞。
本说明书中，“TLR7”以与TLR7蛋白相同的意思来使用。
本说明书中的“抗体的抗原结合性片段”是指：抗体的、与抗原具有结合活性的部分片段，包括Fab、F(ab’)2、Fv、scFv、双抗体、线性抗体、及由抗体片段形成的多特异性抗体等。另外，抗体的抗原结合性片段还包括在还原条件下处理F(ab’)2而得到的、作为抗体可变区的一价片段的Fab’。但是，只有与抗原具有结合能力，则不限于这些分子。另外，这些抗原结合性片段不仅包括用适当的酶处理抗体蛋白的全长分子而得到的产物，还包括使用经基因工程学方式修饰的抗体基因在适当的宿主细胞中产生的蛋白质。
已知抗体分子的重链及轻链分别有3处互补决定区(CDR：Complementaritydetermining region)。互补决定区也被称为高变区(hypervariable region)，位于抗体的重链及轻链的可变区内，为一级结构的变异性特别高的部位，在重链及轻链的多肽链的一级结构上分别分散在3个位置。本说明书中，关于抗体的互补决定区，将重链的互补决定区从重链氨基酸序列的氨基末端侧起记作CDRH1、CDRH2、CDRH3，将轻链的互补决定区从轻链氨基酸序列的氨基末端侧起记作CDRL1、CDRL2、CDRL3。这些部位在立体结构上相互靠近，决定着对所结合的抗原的特异性。另外，基于AbM的定义(Martin,A.C.R.,Cheetham,J.C.andRees,A.R.(1989)Proc.Natl Acad.Sci.USA,86,9268-9272)来记载各CDR的氨基酸序列。
本发明中，“在严谨条件下杂交”是指在下述条件下或与其同等的条件下杂交，所述条件为：在市售的杂交溶液ExpressHyb Hybridization Solution(CLONTECH公司)中在68℃下进行杂交或用固定有DNA的过滤器在0.7-1.0M NaCl存在下在68℃下进行杂交后，使用0.1-2倍浓度的SSC溶液(1倍浓度SSC是指含有150mM NaCl、15mM柠檬酸钠)在68℃下进行洗涤，由此可以进行鉴定的条件。
1.TLR7
本发明中使用的人TLR7可以从人的B细胞或树突状细胞中直接纯化并使用，或者可以制备上述细胞的细胞膜级分并使用，另外，可以体外合成人TLR7或通过基因操作使宿主细胞产生人TLR7而得到。基因操作具体为：在将人TLR7 cDNA整合到能够表达的载体后在含有转录和翻译所需要的酶、底物及能量物质的溶液中进行合成、或者转化其它原核生物宿主细胞或真核生物宿主细胞而使其表达人TLR7，由此可以得到该蛋白。
同样地，猴TLR7、小鼠TLR7及大鼠TLR7可以分别从猴、小鼠及大鼠的TLR7表达细胞直接纯化并使用，或者制备上述细胞的细胞膜级分并使用，另外，猴TLR7、小鼠TLR7及大鼠TLR7可以通过体外合成或通过基因操作而使宿主细胞中产生来得到。
编码人TLR7(变体1)及人TLR7(变体2)的氨基酸序列的多核苷酸序列分别记载于序列表的序列号1或序列号3，人TLR7(变体1)及人TLR7(变体2)的氨基酸序列分别记载于序列表的序列号2或序列号4。
人TLR7的cDNA可通过所谓的PCR法取得，例如，以表达人TLR7的mRNA的脏器的cDNA文库为模板，使用特异性扩增人TLR7的cDNA的引物进行聚合酶链反应(以下称为“PCR”)(Saiki，R.K.，et al.，Science，(1988)239，487-49)。
需要说明的是，人TLR7的cDNA中还包括：和由与编码人TLR7的核苷酸序列互补的核苷酸序列构成的多核苷酸在严谨条件下杂交、且编码与人TLR7具有同等生物活性的蛋白质的多核苷酸。进一步地，人TLR7的cDNA中还包括：从人TLR7基因座转录的剪接变体或与其在严谨条件下杂交并且编码与人TLR7具有同等生物活性的蛋白质的多核苷酸。
另外，人TLR7中还包括：由在人TLR7的氨基酸序列或从这些序列除去信号序列而成的氨基酸序列中置换、缺失或添加1个、2或3个、或者4或5个氨基酸而成的氨基酸序列构成、并且与人TLR7具有同等生物活性的蛋白质。进一步地，人TLR7中还包括：由人TLR7基因座所转录的剪接变体所编码的氨基酸序列或在该氨基酸序列中置换、缺失或添加1个、2或3个、或者4或5个氨基酸而成的氨基酸序列构成、并且与人TLR7具有同等生物活性的蛋白质。
编码猴TLR7的氨基酸序列的多核苷酸序列记载于序列表的序列号58，猴TLR7的氨基酸序列记载于序列表的序列号85。
猴TLR7的cDNA可以通过PCR法取得，例如，以表达猴TLR7的mRNA的脏器的cDNA文库为模板，使用特异性扩增猴TLR7的cDNA的引物来进行。
需要说明的是，猴TLR7的cDNA中还包括：和由与编码猴TLR7的核苷酸序列互补的核苷酸序列构成的多核苷酸在严谨条件下杂交、且编码与猴TLR7具有同等生物活性的蛋白质的多核苷酸。进一步地，猴TLR7的cDNA中还包括：作为从猴TLR7基因座转录的剪接变体或与其在严谨条件下杂交并且编码与猴TLR7具有同等生物活性的蛋白质的多核苷酸。
另外，猴TLR7中还包括：由在猴TLR7的氨基酸序列或从这些序列除去信号序列而成的氨基酸序列中置换、缺失或添加1个、2或3个、或者4或5个氨基酸而成的氨基酸序列构成、并且与猴TLR7具有同等生物活性的蛋白质。进一步地，猴TLR7中还包括：由猴TLR7基因座转录的剪接变体所编码的氨基酸序列或在该氨基酸序列中置换、缺失或添加1个、2或3个、或者4或5个氨基酸而成的氨基酸序列构成、并且与猴TLR7具有同等生物活性的蛋白质。
编码猴TLR7的氨基酸序列的多核苷酸序列记载于序列表的序列号58，猴TLR7的氨基酸序列记载于序列表的序列号85。
猴TLR7的cDNA可以通过PCR法取得，例如，以表达猴TLR7的mRNA的脏器的cDNA文库为模板，使用特异性扩增猴TLR7的cDNA的引物来进行。
编码小鼠TLR7的氨基酸序列的多核苷酸序列记载于序列表的序列号56，小鼠TLR7的氨基酸序列记载于序列表的序列号83。
小鼠TLR7的cDNA可以通过PCR法取得，例如，以表达小鼠TLR7的mRNA的脏器的cDNA文库为模板，使用特异性扩增小鼠TLR7的cDNA的引物来进行。
编码大鼠TLR7的氨基酸序列的多核苷酸序列记载于序列表的序列号57，大鼠TLR7的氨基酸序列记载于序列表的序列号84。
大鼠TLR7的cDNA可以通过PCR法取得，例如以表达大鼠TLR7的mRNA的脏器的cDNA文库为模板，使用特异性扩增大鼠TLR7的cDNA的引物来进行。
2.抗TLR7抗体及其制造
本发明提供一种抗体或该抗体的抗原结合性片段，其特征在于，其具有以下特性：
(a)与人TLR7或猴TLR7特异性结合且不与小鼠TLR7或大鼠TLR7结合；及
(b)抑制人TLR7或猴TLR7的功能。
本发明的抗体或其抗原结合性片段与人TLR7或猴TLR7特异性结合，抑制其功能。
抗体或其抗原结合性片段对TLR7的结合活性可通过按照常规方法用流式细胞仪进行分析来评价。
另外，本说明书中，抑制TLR7的功能是指：抑制TLR7表达细胞产生IL-6和/或I型干扰素。抑制TLR7的功能的活性可如下评价：在体外，在抗体或其抗原结合性片段存在下孵育TLR7表达细胞(例如PBMC)，测定培养上清中的IL-6或I型干扰素的浓度，从而评价。
本发明的一实施方式中，人TLR7为由序列号2或序列号4记载的氨基酸序列构成的分子，猴TLR7为由序列号85记载的氨基酸序列构成的分子，小鼠TLR7为由序列号83记载的氨基酸序列构成的分子，或者，大鼠TLR7为由序列号84记载的氨基酸序列构成的分子。例如，本发明中，人TLR7可以为由序列号2或序列号4记载的氨基酸序列构成的分子，猴TLR7可以为由序列号85记载的氨基酸序列构成的分子，小鼠TLR7可以为由序列号83记载的氨基酸序列构成的分子，并且，大鼠TLR7可以为由序列号84记载的氨基酸序列构成的分子。
例如，本发明的抗体或其抗原结合性片段可以为针对人TLR7的抗体或其抗原结合性片段，其具有以下特性：
(a)与人TLR7特异性结合且不与小鼠TLR7和/或大鼠TLR7结合；及
(b)抑制人TLR7的功能，
这里，人TLR7为由序列号2或序列号4记载的氨基酸序列构成的分子，小鼠TLR7为由序列号83记载的氨基酸序列构成的分子，并且，大鼠TLR7为由序列号84记载的氨基酸序列构成的分子。
例如，本发明的抗体或其抗原结合性片段可以为针对猴TLR7的抗体或其抗原结合性片段，其具有以下特性：
(a)与猴TLR7特异性结合且不与小鼠TLR7和/或大鼠TLR7结合；及
(b)抑制猴TLR7的功能，这里，猴TLR7为由序列号85记载的氨基酸序列构成的分子，小鼠TLR7为由序列号83记载的氨基酸序列构成的分子，且大鼠TLR7为由序列号84记载的氨基酸序列构成的分子。
以下，以抗人TLR7抗体的情况为例说明本发明的抗TLR7抗体及其制造方法。关于抗猴TLR7抗体，也可以与抗人TLR7抗体同样地制造。
本发明的针对人TLR7的抗体可以如下得到：使用常规方法向动物免疫人TLR7或从人TLR7的氨基酸序列中选择的任意的多肽，收集生物体内产生的抗体并进行纯化，从而得到。
需要说明的是，可以通过利用基因操作使宿主细胞产生人TLR7基因来得到成为抗原的人TLR7。具体而言，制作能够表达TLR7基因的载体、将其导入宿主细胞而使该基因表达并纯化所表达的TLR7即可。
还可以使用DNA免疫法得到本发明的针对人TLR7的抗体。DNA免疫法为如下方法：对小鼠、大鼠等动物个体进行抗原表达质粒的基因导入，使抗原在个体内表达，从而诱导针对抗原的免疫。
基因导入的方法中存在直接将质粒注射到肌肉的方法、静脉注射质粒与脂质体或聚乙烯亚胺等的复合体的方法、使用病毒载体的方法、用基因枪注入附着有质粒的金颗粒的方法、迅速静脉注射大量的质粒溶液的流体力学法等。
关于通过表达质粒的肌注进行的基因导入法，作为提高表达量的方法，已知肌注质粒后在同一部位施加电穿孔的称为活体电穿孔(in vivo electroporation)的技术(Aihara H，Miyazaki J.Nat Biotechnol.1998 Sep；16(9)：867-70或Mir LM，Bureau MF，Gehl J，Rangara R，Rouy D，Caillaud JM，Delaere P，Branellec D，Schwartz B，SchermanD.Proc Natl Acad Sci U S A.1999 Apr 13；96(8)：4262-7.)。本方法通过在质粒的肌注前用透明质酸酶处理肌肉、从而表达量进一步提高(McMahon JM1，Signori E，Wells KE，Fazio VM，Wells DJ.Gene Ther.2001 Aug；8(16)：1264-70)。
另外，还可以按照公知的方法(例如Kohler and Milstein，Nature(1975)256，p.495-497、Kennet，R.ed.，Monoclonal Antibodies，p.365-367，Plenum Press，N.Y.(1980))使产生针对TLR7的抗体的抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合而建立杂交瘤，得到单克隆抗体。这种方法的具体例记载于国际公开第WO09/48072号小册子(2009年4月16日公开)及第WO10/117011号(2010年10月14日公开)小册子。
作为如此建立的小鼠抗人TLR7抗体的实例，可列举AT01抗体、NB7抗体及FAN2抗体。
分别地，AT01抗体的重链可变区的氨基酸序列示于序列表的序列号5，和编码该序列的多核苷酸序列示于序列表的序列号6；NB7抗体的重链可变区的氨基酸序列示于序列表的序列号7，和编码该序列的多核苷酸序列示于序列表的序列号8；以及FAN2抗体的重链可变区的氨基酸序列示于序列表的序列号9，和编码该序列的多核苷酸序列示于序列表的序列号10。
另外，分别地，AT01抗体的轻链可变区的氨基酸序列示于序列表的序列号11，和编码该序列的多核苷酸序列示于序列表的序列号12；NB7抗体的轻链可变区的氨基酸序列示于序列表的序列号13，和编码该序列的多核苷酸序列示于序列表的序列号14；以及FAN2抗体的轻链可变区的氨基酸序列示于序列表的序列号15，和编码该序列的多核苷酸序列示于序列表的序列号16。
AT01抗体的重链可变区具有由序列号17所示的氨基酸序列(GYTFTNNWLH)构成的CDRH1、由序列号18所示的氨基酸序列(DIYPSNGRTN)构成的CDRH2及由序列号19所示的氨基酸序列(ERGYFDY)构成的CDRH3。另外，该抗体的轻链可变区具有由序列号20所示的氨基酸序列(KASQDINKYIA)构成的CDRL1、由序列号21所示的氨基酸序列(YTSTLQP)构成的CDRL2及由序列号22所示的氨基酸序列(LQYDYLLT)构成的CDRL3。需要说明的是，上述的CDR的氨基酸序列还记载于图24-1。
NB7抗体的重链可变区具有由序列号23所示的氨基酸序列(GYSITSDYAWN)构成的CDRH1、由序列号24所示的氨基酸序列(HISYRGNTN)构成的CDRH2及由序列号25所示的氨基酸序列(WNYYGYVDYAMDY)构成的CDRH3。另外，该抗体的轻链可变区具有由序列号26所示的氨基酸序列(RASQDISNYLN)构成的CDRL1、由序列号27所示的氨基酸序列(YTSRLHS)构成的CDRL2及由序列号28所示的氨基酸序列(QQGDTFPT)构成的CDRL3。需要说明的是，上述的CDR的氨基酸序列还记载于图24-2。
FAN2抗体的重链可变区具有由序列号29所示的氨基酸序列(GFSLTGYGVN)构成的CDRH1、由序列号30所示的氨基酸序列(MIWGDGSTD)构成的CDRH2及由序列号31所示的氨基酸序列(DKGYDGYYYAMDY)构成的CDRH3。另外，该抗体的轻链可变区具有由序列号32所示的氨基酸序列(RASENIYSYLA)构成的CDRL1、由序列号33所示的氨基酸序列(DAKTLAE)构成的CDRL2及由序列号34所示的氨基酸序列(QHHYGIPYT)构成的CDRL3。需要说明的是，上述的CDR的氨基酸序列还记载于图24-3。
一实施方式中，在与人TLR7的结合中，本发明的抗体或其抗原结合性片段可能与具有AT01抗体、NB7抗体或FAN2抗体的重链可变区及轻链可变区的氨基酸序列的抗体具有竞争性抑制活性。
另一实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合性片段可以为具有AT01抗体的CDRH1～3作为重链的互补决定区及具有AT01抗体的CDRL1～3作为轻链的互补决定区的抗体或其抗原结合性片段、具有NB7抗体的CDRH1～3作为重链的互补决定区及具有NB7抗体的CDRL1～3作为轻链的互补决定区的抗体或其抗原结合性片段、或具有FAN2抗体的CDRH1～3作为重链的互补决定区及具有FAN2抗体的CDRL1～3作为轻链的互补决定区的抗体或其抗原结合性片段。优选方式中，本发明的抗体或其抗原结合性片段可以为具有AT01抗体的CDRH1～3作为重链的互补决定区及具有AT01抗体的CDRL1～3作为轻链的互补决定区的抗体或其抗原结合性片段。
又一实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合性片段可以为具有AT01抗体、NB7抗体或FAN2抗体的重链可变区及轻链可变区序列的抗体。
本发明的抗体除了包括针对人TLR7的上述单克隆抗体以外，还包括出于降低对人的异种抗原性等目的而进行了人工修饰的基因重组型抗体，例如嵌合(Chimeric)抗体、人源化(Humanized)抗体、人抗体等。这些抗体可以使用已知的方法来制造。
作为嵌合抗体，可列举抗体的可变区和恒定区为异种的抗体，例如，将小鼠源抗体或大鼠源抗体的可变区连接到人源恒定区而成的嵌合抗体(参照Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，81，6851-6855，(1984))。作为小鼠抗人TLR7抗体(AT01抗体)来源的嵌合抗体，可列举由重链和轻链构成且重链具有由序列号5的氨基酸序列构成的重链可变区、轻链具有由序列号11的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗体。作为这样的AT01抗体来源的嵌合抗体的一例，可列举由重链和轻链构成且重链由序列号35的第20位至第465位的氨基酸序列构成、轻链由序列号36的第21位至第233位的氨基酸序列构成的抗体。本说明书中，将上述抗体称为“cAT01”或“cAT01抗体”。
另外，作为小鼠抗人TLR7抗体(NB7抗体)来源的嵌合抗体，可列举由重链和轻链构成且重链具有由序列号7的氨基酸序列构成的重链可变区、轻链具有由序列号13的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗体。作为这样的NB7抗体来源的嵌合抗体的一例，可列举由重链和轻链构成且重链由序列号37的第20位至第471位的氨基酸序列构成、轻链由序列号38的第21位至第233位的氨基酸序列构成的抗体。本说明书中，将上述抗体称为“cNB7”或“cNB7抗体”。
进一步地，作为小鼠抗人TLR7抗体(FAN2抗体)来源的嵌合抗体，可列举由重链和轻链构成且重链具有由序列号9的氨基酸序列构成的重链可变区、轻链具有由序列号15的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗体。作为这样的FAN2抗体来源的嵌合抗体的一例，可列举由重链和轻链构成且重链由序列号39的第20位至第470位的氨基酸序列构成、轻链由序列号40的第21位至第234位的氨基酸序列构成的抗体。本说明书中，将上述抗体称为“cFAN2”或“cFAN2抗体”。
对于上述的针对人TLR7的嵌合抗体的序列，可以出于降低对人的异种抗原性等目的进行人工修饰而制作作为基因重组型抗体的人源化(Humanized)抗体。另外，本发明的抗体中包括对上述人源化抗体的CDR进行修饰而成的抗体。这些抗体可以使用已知的方法来制造。
作为人源化抗体，可列举仅将CDR整合于人源抗体而成的抗体(参照Nature(1986)321，p.522-525)、除了CDR序列以外还将一部分框架氨基酸残基移植到人抗体中而成的抗体(国际公开第WO90/07861号小册子)。
例如，cAT01抗体及cNB7抗体来源的人源化抗体保持了来源于cAT01或cNB7的全部6种CDR序列，具有抑制人TLR7的功能的活性。
作为上述人源化抗体的适宜的例子，作为cAT01抗体来源的人源化抗体(huAT01抗体)，可列举：
由重链和轻链构成且重链包含由序列号41记载的氨基酸序列构成的重链可变区、轻链包含由序列号43记载的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗体；
由重链和轻链构成且重链包含由序列号41记载的氨基酸序列构成的重链可变区、轻链包含由序列号44记载的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗体；
由重链和轻链构成且重链包含由序列号42记载的氨基酸序列构成的重链可变区、轻链包含由序列号43记载的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗体；
由重链和轻链构成且重链包含由序列号42记载的氨基酸序列构成的重链可变区、轻链包含由序列号44记载的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗体。
另外，通过将与上述的huAT01抗体的各重链可变区的氨基酸序列及各轻链可变区的氨基酸序列显示高同源性的序列进行组合，从而能够选择与该抗体具有同等活性的抗体。这样的同源性通常为80％以上的同源性，优选为90％以上的同源性，更优选为95％以上的同源性，最优选为99％以上的同源性(但是，各CDR与上述的各抗体相同)。另外，通过将在上述重链可变区或轻链可变区的氨基酸序列(但是，各CDR的部位除外)中置换、缺失或添加1至数个(例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)氨基酸残基而成的氨基酸序列进行组合，还能够选择与上述的各抗体具有同等活性的抗体。
作为进一步适宜的例子，可列举：
由重链和轻链构成且重链由序列号45记载的氨基酸序列中的第20位至第465位的氨基酸序列构成、轻链由序列号48记载的氨基酸序列中的第21位至第233位的氨基酸序列构成的的抗体；
由重链和轻链构成且重链由序列号45记载的氨基酸序列中的第20位至第465位的氨基酸序列构成、轻链由序列号49记载的氨基酸序列中的第21位至第233位的氨基酸序列构成的抗体；
由重链和轻链构成且重链由序列号46记载的氨基酸序列中的第20位至第465位的氨基酸序列构成、轻链由序列号48记载的氨基酸序列中的第21位至第233位的氨基酸序列构成的抗体；
由重链和轻链构成且重链由序列号46记载的氨基酸序列中的第20位至第465位的氨基酸序列构成、轻链由序列号49记载的氨基酸序列中的第21位至第233位的氨基酸序列构成的抗体；
由重链和轻链构成且重链由序列号47记载的氨基酸序列中的第20位至第462位的氨基酸序列构成、轻链由序列号48记载的氨基酸序列中的第21位至第233位的氨基酸序列构成的抗体；或
由重链和轻链构成且重链由序列号47记载的氨基酸序列中的第20位至第462位的氨基酸序列构成、轻链由序列号49记载的氨基酸序列中的第21位至第233位的氨基酸序列构成的抗体。
另外，作为cNB7抗体来源的人源化抗体(huNB7抗体)，可列举由重链和轻链构成且重链包含由序列号50的氨基酸序列构成的重链可变区、轻链包含由序列号51的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗体。
另外，通过将与上述的huNB7抗体的重链可变区的氨基酸序列及轻链可变区的氨基酸序列显示高同源性的序列进行组合，从而能够选择与该抗体具有同等活性的抗体。这样的同源性通常为80％以上的同源性，优选为90％以上的同源性，更优选为95％以上的同源性，最优选为99％以上的同源性(但是，各CDR与上述的各抗体相同)。另外，通过将在上述重链可变区或轻链可变区的氨基酸序列(但是，各CDR的部位除外)中置换、缺失或添加1至数个(例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)的氨基酸残基而成的氨基酸序列进行组合，也能够选择与上述抗体具有同等活性的抗体。
作为进一步适宜的例子，可列举：
由重链和轻链构成且重链由序列号52记载的氨基酸序列中的第20位至第471位的氨基酸序列构成、轻链由序列号53记载的氨基酸序列中的第21位至第233位的氨基酸序列构成的抗体；或
由重链和轻链构成且重链由序列号54记载的氨基酸序列中的第20位至第468位的氨基酸序列构成、轻链由序列号53记载的氨基酸序列中的第21位至第233位的氨基酸序列构成的抗体。
本发明的抗体可以为向上述的人源化抗体中进一步导入变异而改变了针对人TLR7的结合能力的抗体。这样的方法被称为亲和力成熟(affinity maturation)，作为具体方法，可列举核糖体展示法。核糖体展示法为如下方法：使用借助核糖体将蛋白质与作为其基因信息的mRNA结合而成的三者复合体来分离与目标分子结合的蛋白质的基因序列(Stafford RL.et.al.Protein Eng.Des.Sel.2014(4)：97-109.)。
为了避免对正常的人TLR7表达细胞的细胞损伤，期望抗体的效应物活性低。已知效应物活性根据抗体的亚类而不同。可观察到IgG4的ADCC、CDC活性低、IgG2虽然具有CDC活性但ADCC活性低等特征。由于该特征，能够通过将IgG1的恒定区置换为IgG2或IgG4的恒定区来制作降低了ADCC、CDC活性的抗体。另外，通过参考IgG2或IgG4对IgG1的恒定区的一部分序列进行置换，能够制作降低了ADCC、CDC活性的IgG1抗体。作为一例，Marjan Hezarehet.al.Journal of Virology，75(24)：12161-12168(2001)表明，将IgG1的第234位、第235位的亮氨酸残基(数字为根据Kabat等的EU索引)分别置换为丙氨酸残基则ADCC、CDC活性下降。
本发明还包括抗体或该抗体的抗原结合性片段的修饰体。该修饰体是指：对本发明的抗体或该抗体的抗原结合性片段实施了化学修饰或生物学修饰而成的物质。化学修饰体包括化学部分与氨基酸骨架的结合、N-键合或O-键合烃链的化学修饰体等。生物学修饰体包括经翻译后修饰(例如向N-键合或O-键合添加糖链、N末端或C末端的加工、脱酰胺化、天冬氨酸的异构化、甲硫氨酸的氧化)的修饰体、通过用原核生物宿主细胞表达而在N末端添加有甲硫氨酸残基的修饰体等。另外，为了使本发明的抗体或抗原可检测或可分离而添加标记的修饰体、例如酶标记物、荧光标记物、亲和标记物也包括在所述修饰物的含义之中。这样的本发明的抗体的或该抗体的抗原结合性片段的修饰物在改善原本的本发明的抗体的稳定性及血中停留性、降低抗原性、所述抗体或抗原的检测或分离等中有用。
已知哺乳类培养细胞所生产的抗体的重链的羧基末端的赖氨酸残基会缺失(Journal of Chromatography A，705：129-134(1995))，另外已知同一重链羧基末端的甘氨酸、赖氨酸这两氨基酸残基会缺失，重新出现在羧基末端的脯氨酸残基会被酰胺化(Analytical Biochemistry，360：75-83(2007))。
但是，这些重链序列的缺失及修饰不会对抗体的抗原结合能力及效应物功能(补体激活、抗体依赖性细胞毒作用等)造成影响。
因此，作为本发明的抗体及该抗体的抗原结合性片段的修饰体，可列举重链羧基末端缺失了1或2个氨基酸而成的缺失体、及酰胺化后的该缺失体(例如，羧基末端部位的脯氨酸残基被酰胺化的重链)等。但是，只要保持了抗原结合能力及效应物功能，则本发明的抗体的重链的羧基末端的缺失体不限于上述种类。
构成本发明的抗体的2条重链可以由选自全长及上述缺失体组成的组中的重链中的任一种的组合构成，也可以由任两种的组合构成。各缺失体的量比可能会受到产生本发明的抗体的哺乳类培养细胞的种类及培养条件的影响，但是，作为本发明的抗体的主要成分，可列举2条重链均缺失了羧基末端的1个氨基酸残基的情况。即，在序列表记载的序列号35中第20位至第465位的氨基酸序列、序列号37中第20位至第471位的氨基酸序列、序列号39中第20位至第470位的氨基酸序列、序列号45中第20位至第465位的氨基酸序列、序列号46中第20位至第465位的氨基酸序列、序列号47中第20位至第462位的氨基酸序列、序列号52中第20位至第471位的氨基酸序列及序列号54中第20位至第468位的氨基酸序列所示的各重链序列的羧基末端缺失了1或2个氨基酸的氨基酸序列所构成的重链也可以本发明的抗体来使用。
对于通过以上方法得到的抗体，可以评价对抗原的结合性并选出适宜的抗体。作为比较抗体性质时的其它指标的一例，可列举抗体的稳定性。差示扫描量热法(DSC)为可以快速且准确地测定作为蛋白结构稳定性相对良好的指标的热变性中点(Tm)的方法。通过使用DSC测定Tm值、对该值进行比较，可以比较热稳定性差异。已知抗体的保存稳定性与抗体的热稳定性在一定程度上显示出相关性(Lori Burton，et.al.，PharmaceuticalDevelopment and Technology(2007)12，p.265-273)，可以以热稳定性为指标选出适宜的抗体。作为用于选出抗体的其它指标，可列举在合适的宿主细胞中的收量高及水溶液中的絮凝性低。例如，收量最高的抗体未必会显示最高的热稳定性，因此需要基于以上所述的指标综合判断来选出最适合给予人的抗体。
另外，还已知使用合适的接头将抗体的重链及轻链的全长序列连接而取得单链免疫球蛋白(single chain immunoglobulin)的方法(Lee，H-S，et.al.，MolecularImmunology(1999)36，p.61-71；Shirrmann，T.et.al.，mAbs(2010)，2，(1)p.1-4)。这样的单链免疫球蛋白能够通过二聚体化而具有与原本为四聚体的抗体相类似的结构和活性。另外，本发明的抗体可以为具有单个重链可变区、不具有轻链序列的抗体。这样的抗体被称为单域抗体(single domain antibody：sdAb)或纳米抗体(nanobody)，据报道已实际在骆驼或马中观察到且保持了抗原结合能力(Muyldemans S.et.al.，Protein Eng.(1994)7(9)，1129-35，Hamers-Casterman C.et.al.，Nature(1993)363(6428)446-8)。上述抗体也可以解释为本发明抗体的抗原结合性片段的一种。
另外，通过调节结合在本发明的抗体上的糖链修饰，能够增强抗体依赖性细胞毒活性。作为抗体的糖链修饰的调节技术，已知有WO99/54342、WO00/61739、WO02/31140、WO2007/133855、WO2013/120066等，但是不限于这些。
当在暂时分离抗体基因后导入适当的宿主而制作抗体时，可以使用适当的宿主与表达载体的组合。
作为抗体基因的具体例，可列举本说明书记载的编码抗体的重链序列的基因及编码其轻链序列的基因的组合。更具体而言，作为抗体基因，可列举例如：具有编码本发明的抗体或其抗原结合性片段的多核苷酸序列的多核苷酸、具有编码本发明的抗体或其抗原结合性片段的重链可变区的氨基酸序列的多核苷酸序列的多核苷酸与具有编码轻链可变区的氨基酸序列的多核苷酸序列的多核苷酸的组合等。构成抗体基因的重链序列基因还包括具有以下多核苷酸序列的多核苷酸，所述多核苷酸序列为：和与编码重链可变区的上述多核苷酸序列互补的多核苷酸序列所构成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸所具有的多核苷酸序列。另外，构成抗体基因的轻链序列基因还包括具有以下多核苷酸序列的多核苷酸，所述多核苷酸序列为：和与编码轻链可变区的上述多核苷酸序列互补的多核苷酸序列所构成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸所具有的多核苷酸序列。
转化宿主细胞时，重链序列基因和轻链序列基因可以插入同一表达载体，另外也可以插入不同的表达载体。在使用真核细胞作为宿主时，可以使用动物细胞、植物细胞、真核微生物。作为动物细胞，可列举：(1)哺乳类细胞，例如作为猴细胞的COS细胞(Gluzman，Y.Cell(1981)23，p.175-182、ATCC CRL-1650)、小鼠成纤维细胞NIH3T3(ATCC No.CRL-1658)、中华仓鼠卵巢细胞(CHO细胞、ATCC CCL-61)的二氢叶酸还原酶缺损株(Urlaub，G.and Chasin，L.A.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1980)77，p.4126-4220)。另外，使用原核细胞的情况下，可列举例如大肠杆菌、枯草杆菌。通过转化向这些细胞中导入作为目标的抗体基因，将转化后的细胞在体外进行培养，由此可得到抗体。在以上培养方法中，根据抗体序列而有时收量不同，可以以收量为指标从具有同等结合活性的抗体中选出容易作为药物来生产的抗体。
作为本发明的抗体的同种型，没有限制，可列举例如IgG(IgG1，IgG2，IgG3，IgG4)、IgM、IgA(IgA1，IgA2)、IgD或IgE等，优选列举IgG或IgM，进一步优选列举IgG1或IgG4。
另外，本发明的抗体可以为具有抗体的抗原结合部的抗体的抗原结合性片段或其修饰物。通过用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等蛋白水解酶处理抗体或用基因工程方法修饰抗体基因并在适当的培养细胞中表达，可以得到该抗体的片段。在这样的抗体片段中，保持了全长抗体分子所具有的全部功能或一部分功能的片段可以称为抗体的抗原结合性片段。
作为抗体的功能，通常可列举：抗原结合活性、中和抗原活性的活性、增强抗原活性的活性、抗体依赖性细胞毒活性、补体依赖性细胞毒活性及补体依赖性细胞介导的细胞毒活性。本发明中，抗体的抗原结合性片段所保持的功能为对人TLR7的结合活性，优选为抑制人TLR7的功能的活性，更优选为抑制TLR7表达细胞产生IL-6和/或I型干扰素的活性。
例如，作为抗体的片段，可列举Fab、F(ab’)2、Fv、或用适当的接头连接重链及轻链的Fv而成的单域Fv(scFv)、双抗体(diabodies)、线性抗体、及由抗体片段形成的多特异性抗体等。另外，抗体的片段还包括在还原条件下处理F(ab’)2而成的、作为抗体可变区的一价片段的Fab’。
进一步地，本发明的抗体可以为对至少两种不同的抗原具有特异性的多特异性抗体。通常，这样的分子与两种抗原结合(即，双特异性抗体(bispecific antibody))，本发明的“多特异性抗体”包括对更多种(例如3种)抗原具有特异性的抗体。
本发明的多特异性抗体可以为由全长构成的抗体或这种抗体的片段(例如F(ab’)2双特异性抗体)。双特异性抗体可以通过使两种抗体的重链和轻链(HL对)结合来制作，也可以通过使产生不同单克隆抗体的杂交瘤融合而制作产生双特异性抗体的融合细胞来制作(Millstein et al.，Nature(1983)305，p.537-539)。
本发明的抗体可以为单链抗体(也记作scFv)。单链抗体可通过用多肽接头将抗体的重链可变区和轻链可变区连接来得到(Pluckthun，The Pharmacology of MonoclonalAntibodies，113(Rosenberg及Moore编、Springer Verlag，New York，p.269-315(1994)、Nature Biotechnology(2005)，23，p.1126-1136)。另外，也可以将用多肽接头使2个scFv结合而制作的BiscFv片段用作双特异性抗体。
制作单链抗体的方法在本技术领域中是熟知的(例如，参照美国专利第4,946,778号、美国专利第5,260,203号、美国专利第5,091,513号、美国专利第5,455,030号等)。该scFv中，重链可变区和轻链可变区通过不形成缀合物的接头、优选多肽接头而连接(Huston，J.S.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)，85，p.5879-5883)。scFv中的重链可变区及轻链可变区可以来源于同一抗体，也可以来源于不同抗体。作为用于连接可变区的多肽接头，可使用例如由12～19个残基构成的任意的单链肽。
编码scFv的DNA可如下得到：以编码上述抗体的重链或重链可变区的DNA及编码轻链或轻链可变区的DNA中的、编码上述序列中的全部的或期望的氨基酸序列的DNA部分为模板，使用规定其两端的引物对通过PCR法扩增，接着进一步将编码多肽接头部分的DNA及规定使其两端分别与重链、轻链连接的引物对组合并进行扩增，由此而得到。
另外，如果制作出编码scFv的DNA，则可以按照常规方法得到含有它们的表达载体、及用该表达载体转化而成的宿主，另外，通过使用该宿主，可以按照常规方法得到scFv。关于这些抗体的片段，可以与上述同样地取得基因、使其表达而由宿主产生。
本发明的抗体可以为多聚化而提高了对抗原的亲和性的抗体。作为进行多聚化的抗体，可以为1种抗体，也可以为识别同一抗原的多个表位的多种抗体。作为使抗体多聚化的方法，可列举使IgG CH3结构域与2个scFv结合、与链霉亲和素结合、引入螺旋-转角-螺旋基序等。
本发明的抗体可以是作为氨基酸序列不同的多种抗人TLR7抗体的混合物的多克隆抗体。作为多克隆抗体的一例，可列举CDR不同的多种抗体的混合物。作为这样的多克隆抗体，可以对产生不同抗体的细胞的混合物进行培养并使用由该培养物纯化而得的抗体(参照WO2004/061104号)。
作为抗体的修饰物，还可以使用结合有聚乙二醇(PEG)等各种分子的抗体。
本发明的抗体还可以为这些抗体与其它药剂形成了缀合物的免疫缀合物(Immunoconjugate)。作为这样的抗体的例子，可列举该抗体与放射性物质、具有药理作用的化合物结合而成的物质(Nature Biotechnology(2005)23，p.1137-1146)。
得到的抗体可以纯化至均一。抗体的分离、纯化可以使用通常用于蛋白质的分离、纯化方法。例如，可以适宜地从柱色谱、过滤器过滤、超滤、盐析、透析、制备用聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点电泳等中选择、组合来分离、纯化抗体(Strategies for ProteinPurification and Characterization：A Laboratory Course Manual，Daniel R.Marshaket al.eds.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996)；Antibodies：A LaboratoryManual.Ed Harlow and David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory(1988))，但不限于这些。
作为色谱，可以列举亲和色谱、离子交换色谱、疏水性色谱、凝胶过滤色谱、反相色谱、吸附色谱等。这些色谱可以使用HPLC、FPLC等液相色谱来进行。作为亲和色谱中所用的色谱柱，可列举蛋白A柱、蛋白G柱。例如，作为使用蛋白A柱的色谱柱，可列举Hyper D，POROS，Sepharose F.F.(pharmacia)等。另外，还可以使用固定有抗原的载体、利用对抗原的结合性来纯化抗体。
3.含有抗人TLR7抗体的药物
从通过上述“2.抗TLR7抗体及其制造”项目中记载的方法得到的抗人TLR7抗体中，可以得到抑制人TLR7功能的抗体。这些抑制人TLR7功能的抗体可以抑制生物体内的人TLR7的生物活性，即可以抑制血细胞所代表的人TLR7表达细胞被人TLR7配体活化，因此可以作为药物、作为对起因于这些人TLR7功能的疾病的治疗和/或预防剂使用。
起因于人TLR7的功能的疾病、状态包括免疫炎症相关疾病、变态反应性疾病、感染症或癌症等。
作为免疫炎症相关疾病的例子，可列举结缔组织、肌肉骨骼系统(系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、幼年特发性关节炎、成人斯蒂尔病、强直性脊柱炎、系统性硬皮病、多发性肌炎、皮肌炎、银屑病关节炎、骨关节炎、混合性结缔组织病、肌营养不良等)、血液系统(自身免疫性溶血性贫血、再生障碍性贫血、特发性血小板减少性紫癜等)、消化系统(克罗恩病、溃疡性结肠炎、回肠炎等)、肝胆胰及内分泌系统(自身免疫性肝炎、病毒性肝炎、酒精性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、原发性硬化性胆管炎、原发性胆汁性肝硬化、干燥综合征、1型糖尿病、自身免疫性甲状腺炎、巴塞杜氏病、桥本病等)、呼吸系统(慢性阻塞性肺病、嚢性纤维化、间质性肺炎等)、脑神经系统(多发性硬化症、重症肌无力、脑膜炎、脑脊髓炎、自身免疫性脑炎等)、视觉系统(葡萄膜炎、沙眼、眼内炎等)、心血管系统(血管炎综合征、肉芽肿多血管炎、韦格纳肉芽肿病、心肌炎、缺血性心脏病、动脉粥样硬化等)、皮肤表皮系统(银屑病、天胞疮、白癜风、接触性皮炎、湿疹等)、肾系统(肾小球肾炎、糖尿病性肾病、IgA肾病、紫癜性肾炎、肾病、间质性膀胱炎等)、内分泌系统(1型糖尿病、自身免疫性甲状腺炎、巴塞杜氏病、桥本病等)、全身性炎症(白塞病、抗磷脂抗体综合征、IgG4相关疾病、败血症、出血、超敏反应、移植排斥、起因于癌症化学疗法等的休克症状等)等。
作为变态反应性疾病的例子，可列举特应性皮炎、哮喘、过敏反应(Anaphylaxie)、类过敏反应、食物过敏、鼻炎、中耳炎、药物反应、昆虫刺伤反应、植物反应、乳胶过敏、结膜炎、荨麻疹等。
作为感染症的例子，可列举起因于感染病毒(单链RNA病毒、双链RNA病毒、单链DNA病毒、双链DNA病毒等)、细菌(革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、耐酸菌、放线菌、螺旋体、螺菌、立克次氏体、衣原体、支原体等)、真菌(发癣菌、念珠菌、隐球菌、曲霉菌、肺孢子虫、马拉色菌等)、寄生虫(丝虫、吸虫、绦虫、双盘吸虫、棘球绦虫、痢疾阿米巴、跳蚤、虱子、螨虫、蛔虫、蛲虫等)等的疾病。
作为癌症治疗的例子，可列举淋巴瘤、白血病、乳癌、肺癌、皮肤癌等。
就作为上述药物的抗人TLR7抗体的例子而言，可列举由AT01抗体和/或NB7抗体制作的嵌合抗体、人源化抗体及其CDR修饰体。
关于体外的抗人TLR7抗体的人TLR7功能抑制活性，例如可通过抑制表达人TLR7的血细胞的活化的活性来测定。例如，可以通过向人PBMC中以各种浓度添加抗人TLR7抗体而测定对CL264刺激下的人PBMC的IL-6释放的抑制活性。
在以系统性红斑狼疮为代表的各种免疫炎症相关疾病中人TLR7的配体浓度上升、人TLR7表达亢进、或人TLR7刺激加剧这一点是已经得到实验证明的事实，已经得到广泛认可。人TLR7配体作用于人TLR7表达细胞而产生的白介素6(IL-6)等炎症性细胞因子类所引起的炎症反应和抗体产生增加、活化所致的I型干扰素的释放会导致发生全身性的免疫炎症反应，引起系统性红斑狼疮等自身免疫或导致其恶化。因此，抑制依赖于这些人TLR7刺激的细胞因子类的产生关系到系统性红斑狼疮等的预防、治疗，可以以其抑制活性为指标来判断作为人TLR7抗体的治疗药的有用性。
作为本发明中的适宜的抗体，可列举特征如下的抗体或该抗体的抗原结合性片段：与具有序列号2或4记载的氨基酸序列的人TLR7特异性结合，以添加浓度依赖性的方式抑制经CL264处理的人PBMC所释放的IL-6量。
另外，抗人TLR7抗体对各种疾病的治疗或预防效果还可以利用下述评价系统来确认，所述评价系统为：基于向与抗人TLR7抗体具有交叉性的猴给予该抗体的体内评价系统或体外评价系统；或者，基于向转入人TLR7基因且敲除了小鼠TLR7的小鼠给予抗人TLR7抗体的、以下的体内评价系统。
对于炎症性细胞因子的产生的效果可以如下评价：对于向小鼠的腹腔内、静脉内给予TLR7配体而诱发的炎症，在抗TLR7抗体组和非给予组间比较外周血中的细胞因子产生能力，由此进行评价。
对于特应性皮炎的效果可以如下评价：利用佩戴在小鼠的两脚背的磁性和掻痒行动测定装置测定掻痒次数、检查皮肤·外周血·脊髓组织的病理特征而将起因于特应性皮炎的行为定量化，并且在抗人TLR7抗体组与非给予组间进行比较而进行评价，其中，所述特应性皮炎是通过在耳廓或背部每隔3天～2周重复涂布螨虫抗原膏且重复涂布3～6次、在耳廓或腹部或背部每天～每周1次地涂布半抗原类、或者向耳廓皮内或背部皮下或蛛网膜下腔内给予掻痒诱发物质、或者使用作为自然发病特应性小鼠的NC/Nga小鼠等方法诱发或自然发病的。
对于银屑病的效果可如下评价：通过测定炎症部位的重量、厚度、浸润该部位的嗜中性粒细胞的髓过氧化物酶活性、浸润细胞的流式细胞仪分析、基因分析、细胞因子浓度等对银屑病样皮炎进行定量化，在抗人TLR7抗体组与非给予组之间进行比较而进行评价，所述银屑病是通过将咪喹莫特或R848涂布在耳廓及剃毛后的背部、将IL-23等细胞因子给予至小鼠耳廓皮内等方法诱导的。
对于关节炎的效果可以如下评价：对于关节炎，在抗人TLR7抗体组与非给予组之间比较后文的关节肿胀评分、脚掌厚度测定、血液或组织中的抗体·细胞因子·血中生物标志物浓度、由外周血·脾脏·淋巴结·骨髓·关节部位得到的细胞的增殖活性·细胞因子产生能力·表面抗原等而进行评价，其中，所述关节炎是通过向小鼠的尾根部皮内给予将牛II型胶原蛋白溶液与弗氏完全佐剂混合并乳化而成的物质且在2～3周后给予将牛II型胶原蛋白溶液与弗氏的不完全佐剂混合并乳化而成的物质、或者给予抗牛II型胶原蛋白抗体和TLR配体等方法诱导的。
对于结肠炎的效果可如下评价：诱导结肠炎，在抗人TLR7抗体组与非给予组之间比较观察期内的体重、通过试验结束后的解剖得到的肠道增厚/息肉的个数和大小/病理组织学特征、血液或组织中的抗体/细胞因子·血中生物标志物浓度、从肠道/外周血/胸腺/脾脏/淋巴结/骨髓/淋巴集结得到的细胞的增殖活性/细胞因子产生能力/表面抗原等，从而进行评价，所述结肠炎是通过下述方法等诱导的：由将三硝基苯磺酸给予至断食24小时的小鼠肠道内且使其由供水瓶自由饮用1-10％的葡聚糖硫酸钠水溶液4天至2周的人TLR7转基因小鼠的淋巴结和脾脏收集、纯化CD4+CD25-CD45RBhi T细胞，将该CD4+CD25-CD45RBhi T细胞移植到Rag2缺损小鼠的腹腔内。
对系统性红斑狼疮的效果是如下评价的：通过在抗人TLR7抗体组与非给予组之间比较：从作为自然发病模型的NZB/WF1小鼠、MRL/lpr小鼠、BXSB小鼠中经时收集的血液、组织中的抗体/细胞因子/血中生物标志物浓度、尿中的抗体效价、生物标志物浓度；从试验结束后收集的脾脏/淋巴结等脏器制备细胞并移植到无处置小鼠中而诱发的症状等。
对肝炎的效果通过诱导肝炎、在抗人TLR7抗体组与非给予组之间比较给予炎性物质1小时～1周后收集的血液中的AST及ALT浓度、细胞因子浓度、肝病变的组织病理学状态来进行评价，其中，所述肝炎是通过将D-半乳糖胺单独或与脂多糖组合给予至小鼠腹腔内、将伴刀豆球蛋白A单独给予至尾静脉内等方法而诱导的。
如此而得到的抑制人TLR7的生物活性的抗体作为药物、特别是用于预防或治疗以系统性红斑狼疮为代表的免疫炎症相关疾病、变态反应性疾病、感染症、或癌症等的抗体是有用的。
作为抗人TLR7抗体的一个例子，对于免疫炎症相关疾病、变态反应性疾病、感染症、或癌症的治疗或预防而言，可以将该抗体单独或与至少一种其它治疗剂组合使用进行给予。作为可以与抗人TLR7抗体组合使用而给予的其它治疗剂，可列举肾上腺皮质激素剂、非甾体类抗炎药、核酸代谢拮抗剂、核酸合成抑制剂、叶酸代谢拮抗剂、钙调磷酸酶抑制剂、抗疟疾药、抗胸腺细胞球蛋白剂、以细胞表面抗原为靶的生物制剂、或者以细胞因子/干扰素或细胞因子/干扰素受体为靶的生物制剂等，但不限于这些。
作为上述治疗剂的具体例，作为肾上腺皮质激素剂，可列举甲泼尼龙(Methylprednisolone)；作为非甾体类抗炎药，可列举洛索洛芬钠(Loxoprofen SodiumHydrate)、双氯灭痛(Diclofenac sodium)、消炎痛(Indomethacin)、乙酰水杨酸(Acetylsalicylic acid)；作为核酸代谢拮抗剂，可列举霉酚酸酯(Mycophenolate mofetil)；作为核酸合成抑制剂，可列举环磷酰胺(Cyclophosphamide)；作为钙调磷酸酶抑制剂，可列举环孢菌素(Cyclosporin)、他克莫司(Taclorims)；作为抗疟疾药，可列举羟氯喹(Hydroxychloroquine)；作为叶酸代谢拮抗剂，可列举氨甲喋呤(Methotrexate)；作为抗胸腺细胞球蛋白剂，可列举抗人淋巴细胞免疫球蛋白(Zetbulin)、抗淋巴细胞球蛋白(Lymphoglobuline)、兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白(Thymoglobulin)；作为以细胞表面抗原为靶的生物制剂，可列举阿仑单抗(Alemtuzumab)、利妥昔单抗(Rituximab)、阿巴西普单抗(Abatacept)；作为以细胞因子/干扰素或细胞因子/干扰素受体为靶的生物制剂，可列举英夫利昔单抗(Infliximab)、依那西普单抗(Etanercept)、阿达木单抗(Adalimumab)、托珠单抗(Tocilizumab)、贝利单抗(Belimumab)、阿尼鲁单抗(Anifrolumab)等。
既可以根据免疫炎症相关疾病、变态反应性疾病、感染症、或癌症的状态、以何种程度的治疗和/或预防为目标来给予2、3或更多种其它治疗剂，也可以将上述其它治疗剂包封在同一制剂中而同时给予。还可以通过将其它治疗剂与抗人TLR7抗体包封到同一制剂中而同时给予。另外，还可以将抗人TLR7抗体和其它治疗剂包封到不同的制剂中而同时给予。进一步地，还可以将其它治疗剂和抗人TLR7抗体先后地分别进行给予。即，可以在给予其它治疗剂后给予含有抗人TLR7抗体或该抗体的抗原结合性片段作为有效成分的治疗剂、或在给予含有抗人TLR7抗体或该抗体的抗原结合性片段作为有效成分的治疗剂后给予其它治疗剂。在基因治疗中给予的情况下，蛋白质性治疗剂的基因和抗人TLR7抗体的基因可以将插入到不同启动子或同一启动子区域的下游，可以导入不同或同一载体中。
可以通过对抗人TLR7抗体或其片段结合治疗剂来制造M.C.Garnet“Targeteddrug conjugates：principles and progress”，Advanced Drug Delivery Reviews，(2001)53，171-216记载的靶标型药物复合体。在该目的之下，除了抗体分子之外，只要不会使T细胞的识别性完全消失则还能应用任意抗体片段，可列举例如Fab、F(ab’)2、Fv等片段作为例子，本发明也同样地可以使用抗体及其片段。抗人TLR7抗体或该抗体的片段与治疗剂的结合方式可以为M.C.Garnet“Targeted drug conjugates：principles andprogress”，Advanced Drug Delivery Reviews，(2001)53，171-216、G.T.Hermanson“Bioconjugate Techniques”Academic Press，California(1996)、Putnam and J.Kopecek“Polymer Conjugates with Anticancer Activity”Advances in Polymer Science(1995)122，55-123等中记载的各种方式。即，可列举抗人TLR7抗体与治疗剂直接化学键合或借助寡肽等间隔物而结合的方式、借助适当的药物载体而结合的方式。作为药物载体的例子，可列举脂质体、水溶性高分子。作为这些药物载体的存在方式，更具体地可列举抗体和治疗剂包裹于脂质体且该脂质体与抗体结合的方式、及治疗剂直接化学键合或借助寡肽等间隔物而结合于水溶性高分子(分子量为1000至10万左右的化合物)且抗体与该水溶性高分子结合的方式作为例子。抗体(或其片段)与治疗剂、脂质体及水溶性高分子等药物载体的结合可以通过G.T.Hermanson“Bioconjugate Techniques”Academic Press，California(1996)、Putnam and J.Kopecek“Polymer Conjugates with AnticancerActivity”Advances in Polymer Science(1995)122，55-123记载的方法等本领域技术人员熟知的方法来实施。治疗剂向脂质体中的包裹可以通过D.D.Lasic“Liposomes：FromPhysics to Applications”，Elsevier Science Publishers B.V.，Amsterdam(1993)等记载的方法等本领域技术人员熟知的方法来实施。治疗剂与水溶性高分子的结合可以通过D.Putnam and J Kopecek“Polymer Conjugates with Anticancer Activity”Advancesin Polymer Science(1995)122，55-123记载的方法等本领域技术人员熟知的方法来实施。抗体(或其片段)与蛋白质性治疗剂(或其片段)的复合体除了可以用上述方法制作以外，还可以通过基因工程学方式利用本领域技术人员熟知的方法来制作。
本发明还提供一种药物组合物，其含有对于疾病的治疗和/或预防为有效量的抗人TLR7抗体或该抗体的抗原结合性片段中的至少一种或者含有具有编码它们的多核苷酸序列的多核苷酸的表达载体作为有效成分、并且含有药学上允许的稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或辅助剂。
本发明还提供一种药物组合物，其含有：含有对于疾病的治疗和/或预防为有效的量的抗人TLR7抗体或该抗体的抗原结合性片段中的至少一种或者具有编码它们的多核苷酸序列的多核苷酸的表达载体；对于疾病的治疗和/或预防为有效量的至少一种治疗剂；以及药学上允许的稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或辅助剂。
作为治疗剂，可列举此前所述的叶酸代谢拮抗剂、钙调磷酸酶抑制剂、肾上腺皮质激素剂、抗胸腺细胞球蛋白剂、核酸代谢拮抗剂、核酸合成抑制剂、以细胞表面抗原为靶的生物制剂、或者以细胞因子或细胞因子受体为靶的生物制剂等，但不限于这些。
作为本发明的药物组合物中允许的制剂中所用的物质，优选在给药量、给予浓度时对于给予药物组合物的个体而言无毒性。
本发明的药物组合物可以含有用于改变或保持pH、渗透压、粘度、透明度、颜色、等渗性、无菌性、稳定性、溶解率、缓释率、吸收率、渗透率的制剂用物质。作为制剂用物质，可列举以下的物质，但不限于这些：甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸等氨基酸类；抗菌剂；抗坏血酸、硫酸钠或亚硫酸氢钠等抗氧化剂；磷酸、柠檬酸、硼酸缓冲液、碳酸氢钠、Tris-盐酸(Tris-Hcl)溶液等缓冲剂；甘露醇、甘氨酸等填充剂；乙二胺四乙酸(EDTA)等螯合剂；咖啡因、聚乙烯基吡咯烷、β-环糊精、羟丙基-β-环糊精等络合剂；葡萄糖、甘露糖或糊精等增量剂；单糖类、二糖类等其它碳水化合物；着色剂；香味剂；稀释剂；乳化剂；聚乙烯基吡咯烷等亲水聚合物；低分子量多肽；成盐的抗衡离子；苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、洗必泰、山梨酸或过氧化氢等防腐剂；甘油、丙二醇或聚乙二醇等溶剂；甘露醇或山梨醇等糖醇；悬浮剂；失水山梨醇酯、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80等聚山梨醇酯；曲通(triton)、氨基丁三醇(tromethamine)、卵磷脂或胆甾醇等表面活性剂；蔗糖、山梨醇等稳定化增强剂；氯化钠、氯化钾、甘露醇·山梨醇等弹性增强剂；输送剂；赋形剂；和/或药学上的辅助剂。这些制剂用物质的添加量相对于抗人TLR7抗体的重量优选以0.01～100倍、特别是0.1～10倍来添加。制剂中的适宜的药物组合物的组成可以由本领域技术人员根据所应用的疾病、所应用的给药途径等来适宜地决定。
药物组合物中的赋形剂、载体可以为液体，也可以为固体。合适的赋形剂、载体可以为注射用水或生理盐水、人工脑脊液或非经口给药中通常使用的其它物质。也可以使用中性的生理盐水、包含血清白蛋白的生理盐水作为载体。药物组合物中可以包含pH7.0-8.5的Tris缓冲液、pH4.0-5.5的乙酸缓冲液、pH3.0-6.2的柠檬酸缓冲液。另外，这些缓冲液中还可以包含山梨醇、其它化合物。作为本发明的药物组合物，可列举含有抗人TLR7抗体的药物组合物、以及含有抗人TLR7抗体及至少一种治疗剂的药物组合物，可以制成具有所选择的组成和必要纯度的药剂且以冷冻干燥品或液体形式来准备本发明的药物组合物。含有抗人TLR7抗体的药物组合物以及含有抗人TLR7抗体及至少一种骨代谢异常治疗药的药物组合物还可以以使用蔗糖之类的合适赋形剂的冷冻干燥品形式进行成型。
本发明的药物组合物可以制备成非经口给药用，也可以制备成经口的消化道吸收用。制剂的组成及浓度可以根据给药方法来决定，对于本发明的药物组合物中所含的抗人TLR7抗体对人TLR7的亲和性、即相对于人TLR7的解离常数(Kd值)而言，亲和性越高(Kd值越低)越在减少对人的给药量时也能够发挥药效，因此也可以基于该结果来决定本发明的药物组合物对人的给药量。关于本发明中的给药量，在将抗人TLR7抗体给予人时，每1～180天将约0.1～100mg/kg给予1次即可。
作为本发明的药物组合物的形态，可列举包括输液剂在内的注射剂、栓剂、经鼻剂、舌下剂、经皮吸收剂等。
已得到批准的抗体制剂大多为静脉内给药，但是在医疗现场则更希望皮下给药。这种情况下体积会被限制在1.0～1.5mL，因此根据给药量会需要高浓度的抗体溶液。但是，若高浓度化则药液的粘性增加，因此该高粘性可能会引起通过常用粗细的注射针无法进行注射的情况。即，在选择注射剂作为药物组合物的形态时，粘度低这一性质应优先考虑且具有重要意义，可以以粘度为指标来选择合适的抗体。
实施例
以下，通过实施例具体地说明本发明，但是本发明不受这些例子限定。需要说明的是，在下述实施例中，只要没有特别声明则涉及基因操作的各操作通过“MolecularCloning”(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.及Maniatis，T.著，Cold Spring HarborLaboratory Press于1989年出版)中记载的方法来进行，或者，在使用市售的试剂、试剂盒时按照市售品的说明书来使用。
[实施例1]小鼠抗人TLR7抗体的制作
1)-1免疫
1)-1-1强制表达人TLR7-Flag-His×6/人Unc93B1-HA×2的Ba/F3细胞株的建立
使用In Fusion(注册商标)酶(宝生物公司制)向对基因的C末端侧添加Flag-His×6的逆转录病毒载体pMXs(Cell Biolabs，Inc.)中整合人TLR7(变体2)基因(序列号3)。使用转染试剂Fugene(注册商标)6(Roche)将该逆转录病毒载体向HEK293细胞来源的包装细胞株Plat-E(Cell Biolabs，Inc.)进行基因导入。24小时后回收培养上清，作为病毒悬浮液。将该病毒悬浮液与作为转染试剂的DOTAP(Roche)混和，添加于Ba/F3细胞株(RIKEN，BRC)，进行2000rpm、1小时的高速离心，从而建立表达人TLR7-Flag-His×6的Ba/F3细胞株。
人TLR7(变体2)基因(序列号3)所编码的人TLR7具有序列号4的氨基酸序列。将该序列示于图2。
使用In Fusion(注册商标)酶(宝生物公司制)向对基因的C末端侧添加HA×2的逆转录病毒载体pMXs(Cell Biolabs，Inc.)中整合人Unc93B1基因(序列号55)。使用转染试剂Fugene(注册商标)6(Roche)将该逆转录病毒载体向HEK293细胞来源的包装细胞株Plat-E(Cell Biolabs，Inc.)进行基因导入。24小时后回收培养上清，作为病毒悬浮液。将该病毒悬浮液与作为转染试剂的DOTAP(Roche)混和，添加于上述所建立的表达人TLR7-Flag-His×6的Ba/F3细胞株，进行2000rpm、1小时的高速离心，从而建立强制表达人TLR7-Flag-His×6/人Unc93B1-HA×2的Ba/F3细胞株。
1)-1-2免疫小鼠
将1)-1-1所建立的强制表达人TLR7-Flag-His×6/人Unc93B1-HA×2的Ba/F3细胞株与作为佐剂的TiterMAX(注册商标)Gold(TiterMax USA公司制)混合而作为抗原，对于东京大学医科学研究所制作的BALB/c背景的TLR9缺损小鼠每周合计3次给予至足底部、尾根部、腹腔内。
第4次时，将用1×PBS悬浮的强制表达人TLR7-Flag-His×6/人Unc93B1-HA×2的Ba/F3细胞株给予至腹腔内。
在末次免疫起第5天摘出脾脏，用于制作杂交瘤。
1)-2制作杂交瘤
将免疫后的脾脏细胞和Sp2/o细胞株(ATCC)混合，使用HVJ-E细胞融合试剂盒(石原产业)进行细胞融合。从细胞融合操作的次日起，为了筛选杂交瘤而用含有HAT(ThermoFisher Scientific)的培养液(含有10％FBS、50μM 2-巯基乙醇(Life Technologies)、50U/mL青霉素及50μg/mL链霉素(Life Technologies)的RPMI1640(Life Technologies)进行培养，回收出现的杂交瘤集落，由此制作单克隆杂交瘤。
1)-3通过流式细胞仪分析筛选人TLR7结合抗体
在显微镜下从形成了集落的杂交瘤收集培养上清用于筛选。对于用0.1％的皂苷(Sigma-Aldrich)进行了细胞膜渗透处理的强制表达hTLR7-Flag-His×6/hUnc93B1-HA×2的Ba/F3细胞株和完全不进行表达的Ba/F3细胞，在培养上清中分别染色，用流式细胞仪(LSRFortessaTMX-20，Becton,Dickinson and Company)进行分析而筛选产生抗hTLR7抗体的杂交瘤。
1)-4利用流式细胞仪筛选抑制人TLR7功能的抗体
使用逆转录病毒向Ba/F3细胞株(RIKEN，BRC)导入人TLR7(变体2)基因(序列号3)及人Unc93B1 D34A mutant-HA×2基因(序列号86)。进一步地，通过电穿孔法向该细胞导入NF-κB-绿色荧光蛋白(GFP)报告质粒(STRATAGENE)，建立能够分析NF-κB的活化的强制表达hTLR7/hUnc93B1 D34A mutant-HA×2的Ba/F3细胞株，向该细胞株添加杂交瘤的培养上清。4小时后，用作为TLR7配体的R848(InvivoGen)25ng/ml进行刺激。24小时后，用流式细胞仪测定GFP的荧光度，分析人TLR7应答的抑制效果，结果选出了3个产生小鼠抗人TLR7抗体的杂交瘤，分别命名为AT01、NB7及FAN2。
本申请说明书中，将杂交瘤AT01、NB7及FAN2所产生的抗体分别称为AT01抗体、NB7抗体及FAN2抗体。
1)-5确定抗体的同种型
使用IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit(Merck)确定1)-4所取得的各产生小鼠抗人TLR7抗体的杂交瘤(AT01、NB7及FAN2)所产生的抗体的同种型。其结果是，表明AT01抗体、NB7抗体及FAN2抗体的同种型分别为IgG1/κ链。
1)-6制备小鼠抗人TLR7抗体
将杂交瘤腹腔内给予至用姥鲛烷(SIGMA-ALDRICH、现在的Merck)进行了前处理的ICR-CD1-Foxn1裸小鼠(ICR-nu、CHARLES RIVER LABORATORIES JAPAN)，约10天后从回收的腹水中纯化小鼠抗人TLR7单克隆抗体。
首先，将姥鲛烷腹腔内给予至ICR-nu，饲养7天以上。然后，用含有10％FBS、50μM2-巯基乙醇(Life Technologies)、50U/mL青霉素及50μg/mL链霉素(Life Technologies)的RPMI1640(Life Technologies)培养产生AT01、NB7、FAN2的杂交瘤，使其增殖到充分量后悬浮于1×PBS，腹腔内给予至ICR-nu。
10天后回收腹水，用高速离心机使血细胞沉降，回收上清。用1×PBS将腹水稀释10倍后，使其通过0.45μm的过滤器(Millipore)。
从上述腹水中，使用AKTAprime plus(GE Healthcare Japan)用蛋白G柱(GEHealthcare Japan)纯化抗体。
接着，用PD-10(GE Healthcare Japan)将缓冲液置换为生理盐水同时进行浓缩，将抗体浓度调整为1.0mg/mL以上。
最后用Millex-GV 0.22μm(Millipore)灭菌，作为纯化样品。
[实施例2]小鼠抗人TLR7抗体的体外评价
2)-1小鼠抗人TLR7抗体的结合选择能力评价
2)-1-1强制表达小鼠TLR7-Flag-His×6的Ba/F3细胞株的建立
用In Fusion(注册商标)酶(宝生物公司制)使小鼠TLR7基因(序列号56)整合到向基因的C末端侧添加Flag-His×6的逆转录病毒载体pMXs(Cell Biolabs，Inc.)。将该逆转录病毒载体用作为转染试剂的Fugene(注册商标)6(Roche)基因导入HEK293细胞来源的包装细胞株Plat-E(Cell Biolabs，Inc.)。24小时后回收培养上清，作为病毒悬浮液。将该病毒悬浮液与作为转染试剂的DOTAP(Roche)混和，添加于Ba/F3细胞株(RIKEN，BRC)，进行2000rpm、1小时的高速离心，由此建立强制表达小鼠TLR7-Flag-His×6的Ba/F3细胞株。
小鼠TLR7基因(序列号56)所编码的小鼠TLR7具有序列号83的氨基酸序列。将该序列示于图3。
2)-1-2强制表达大鼠TLR7-Flag-His×6的Ba/F3细胞株的建立
使用In Fusion(注册商标)酶(宝生物公司制)将大鼠TLR7基因(序列号57)整合到向基因的C末端侧添加Flag-His×6的逆转录病毒载体pMXs(Cell Biolabs，Inc.)。使用作为转染试剂的Fugene(注册商标)6(Roche)将该逆转录病毒载体基因导入HEK293细胞来源的包装细胞株Plat-E(Cell Biolabs，Inc.)。24小时后回收培养上清，作为病毒悬浮液。将该病毒悬浮液与作为转染试剂的DOTAP(Roche)混和，添加于Ba/F3细胞株(RIKEN，BRC)，进行2000rpm、1小时的高速离心，从而建立强制表达大鼠TLR7-Flag-His×6的Ba/F3细胞株。
大鼠TLR7基因(序列号57)所编码的大鼠TLR7具有序列号84的氨基酸序列。将该序列示于图4。
2)-1-3强制表达猴TLR7-Flag-His×6的Ba/F3细胞株的建立
使用In Fusion(注册商标)酶(宝生物公司制)将猴TLR7基因(序列号58)整合到向基因的C末端侧添加Flag-His×6的逆转录病毒载体pMXs(Cell Biolabs，Inc.)。将该逆转录病毒载体使用作为转染试剂的Fugene(注册商标)6(Roche)基因导入HEK293细胞来源的包装细胞株Plat-E(Cell Biolabs，Inc.)。24小时后回收培养上清，作为病毒悬浮液。将该病毒悬浮液与作为转染试剂的DOTAP(Roche)混和，添加于Ba/F3细胞株(RIKEN，BRC)，进行2000rpm、1小时的高速离心，从而构建强制表达猴TLR7-Flag-His×6的Ba/F3细胞株。
猴TLR7基因(序列号58)所编码的猴TLR7具有序列号85的氨基酸序列。将该序列示于图5。
2)-1-4利用流式细胞仪评价小鼠抗人TLR7抗体的结合选择能力
将1)-1-1中建立的强制表达人TLR7-Flag-His×6/人Unc93B1-HA×2的Ba/F3细胞株、2)-1-1中建立的强制表达小鼠TLR7-Flag-His×6的Ba/F3细胞株、2)-1-2中建立的强制表达大鼠TLR7-Flag-His×6×2的Ba/F3细胞株、及2)-1-3中建立的强制表达猴TLR7-Flag-His×6的Ba/F3细胞株用0.1％皂苷进行细胞膜渗透处理，使用AT01抗体、NB7抗体及FAN2抗体和作为第二抗体的Goat anti-mouse IgG(H+L)-PE(eBioscience)染色。关于各抗体的结合选择能的评价，用流式细胞仪进行分析并比较平均荧光强度(MFI)。
其结果是，AT01抗体、NB7抗体及FAN2抗体与人TLR7或猴TLR7特异性结合，不与小鼠TLR7或大鼠TLR7结合。
2)-2小鼠抗人TLR7抗体的结合能力评价
将1)-1-1中建立的强制表达人TLR7-Flag-His×6/人Unc93B1-HA×2的Ba/F3细胞株用0.1％皂苷进行细胞膜渗透处理，用AT01抗体、NB7抗体及FAN2抗体的稀释系列和作为第二抗体的Goat anti-mouse IgG(H+L)-PE(eBioscience)染色。关于各抗体的结合活性的评价，使用流式细胞仪进行分析并比较平均荧光强度(MFI)。
其结果是，结合活性由强到弱依次为AT01抗体、NB7抗体、FAN2抗体。
2)-3小鼠抗人TLR7抗体的细胞因子产生抑制作用
从Cellular Technology公司以冷冻品形式购入人PBMC，按照说明书解冻后使用。
将用含有10％FBS、1mM丙酮酸钠(Life Technologies公司)、0.1mM MEM Non-Essential Amino Acids(Life Technologies公司)、50μM 2-巯基乙醇(LifeTechnologies公司)、50U/mL青霉素及50μg/mL链霉素(Life Technologies公司)的RPMI1640(Life Technologies公司)调整为2.5×106细胞/mL的浓度的PBMC向96孔细胞培养平板中各接种100μL，以80μL/孔添加作为小鼠抗人TLR7抗体的AT01抗体、NB7抗体、FAN2抗体、或小鼠IgG对照抗体(Biolegend公司)，在37℃培养箱内进行4小时前处理。
然后，以20μL/孔添加1mg/mL的CL-264(InvivoGen公司)，充分搅拌后，在37℃、5％CO2下培养约20小时。对平板进行充分搅拌后，以1500rpm离心5分钟，通过FRET法(Cisbio公司)测定上清中所含的白介素-6(IL-6)浓度。
将结果示于图6。小鼠抗人TLR7抗体以添加浓度依赖性的方式抑制经CL-264处理的人PBMC产生IL-6。AT01抗体、NB7抗体及FAN2抗体以添加浓度依赖性的方式抑制人PBMC的IL-6产生。由夹持50％抑制活性的两点间的浓度和添加该浓度时的抑制活性计算AT01抗体、NB7抗体及FAN2抗体的半抑制浓度(IC50)，分别为192ng/mL、771ng/mL、8389ng/mL。
另一方面，小鼠IgG对照抗体即使在10μg/mL的浓度时也未观察到抑制。
[实施例3]编码小鼠抗人TLR7抗体的可变区的cDNA的核苷酸序列及氨基酸序列的确定
3)-1cDNA合成
使用TRIzol Reagent(Ambion)，由AT01、NB7、FAN2的杂交瘤回收总RNA。接着，使用PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TAKARA)合成cDNA。
3)-2小鼠免疫球蛋白重链及轻链的可变区基因片段的扩增及序列确定
由GENESCRIPT公司来解读所合成的cDNA中所含的编码抗体的可变区的核苷酸序列。
3)-2-1小鼠抗人TLR7抗体(AT01)
将所确定的编码AT01抗体的重链可变区的cDNA的核苷酸序列所编码的氨基酸序列示于序列表的序列号5。
将所确定的编码AT01抗体的轻链可变区的cDNA的核苷酸序列所编码的氨基酸序列示于序列表的序列号11。
3)-2-2小鼠抗人TLR7抗体(NB7)
将所确定的编码NB7抗体的重链可变区的cDNA的核苷酸序列所编码的氨基酸序列示于序列表的序列号7。
将所确定的编码NB7抗体的轻链可变区的cDNA的核苷酸序列所编码的氨基酸序列示于序列表的序列号13。
3)-2-3小鼠抗人TLR7抗体(FAN2)
将所确定的编码FAN2抗体的重链可变区的cDNA的核苷酸序列所编码的氨基酸序列示于序列表的序列号9。
将所确定的编码FAN2抗体的轻链可变区的cDNA的核苷酸序列所编码的氨基酸序列示于序列表的序列号15。
[实施例4]嵌合抗人TLR7抗体的制作
4)-1嵌合抗TLR7抗体的表达载体的构建
4)-1-1表达嵌合轻链的载体pCMA-LK的构建
将用限制性内切酶XbaI及PmeI消化质粒pcDNA3.3-TOPO/LacZ(Invitrogen公司)而得到的约5.4kb的片段以及含有编码人轻链信号序列及人kappa链恒定区的DNA序列的DNA片段(序列号59)用In-Fusion HD PCR克隆试剂盒(Clontech公司)连接，从而制作pcDNA3.3/LK。从pcDNA3.3/LK除去新霉素表达单元，从而构建pCMA-LK。
4)-1-2嵌合IgG1型重链表达载体pCMA-G1的构建
将用XbaI及PmeI消化pCMA-LK而除去了轻链信号序列及人kappa链恒定区的DNA片段以及含有编码人重链信号序列及人IgG1恒定区的DNA序列的DNA片段(序列号60)用In-Fusion HD PCR克隆试剂盒(Clontech公司)连接，从而构建pCMA-G1。
4)-1-3AT01嵌合抗人TLR7抗体表达载体的构建
合成含有核苷酸序列的DNA片段(GENEART公司)，所述核苷酸序列编码序列号61所示的核苷酸序列的核苷酸序号36至422所示的cAT01抗体重链可变区。使用In-Fusion HDPCR克隆试剂盒(Clontech公司)，将所合成的DNA片段插入将pCMA-G1用限制性内切酶BlpI切断的位置处，从而构建cAT01抗体重链表达载体。cAT01抗体的重链含有信号序列，具有序列号35的氨基酸序列。将该序列示于图7。
合成了含有编码cAT01抗体轻链的DNA序列的DNA片段(序列号62)(GENEART公司)。使用实施例4)-1-1所制作的pCMA-LK，通过与上述同样的方法构建cAT01抗体轻链表达载体。cAT01抗体的轻链含有信号序列，具有序列号36的氨基酸序列。将该序列示于图7。
4)-1-4NB7嵌合抗人TLR7抗体表达载体的构建
合成了含有核苷酸序列的DNA片段(GENEART公司)，所述核苷酸序列编码序列号63所示的核苷酸序列的核苷酸序号36至440所示的cNB7抗体重链可变区。通过与实施例4)-1-3同样的方法构建cNB7重链表达载体。cNB7抗体的重链含有信号序列，具有序列号37的氨基酸序列。将该序列示于图8。
合成了含有编码cNB7轻链的DNA序列的DNA片段(序列号64)(GENEART公司)。使用实施例4)-1-1所制作的pCMA-LK，通过与实施例4)-1-3同样的方法构建cNB7轻链表达载体。cNB7抗体的轻链含有信号序列，具有序列号38的氨基酸序列。将该序列示于图8。
4)-1-5FAN2嵌合抗人TLR7抗体表达载体的构建
合成了含有核苷酸序列的DNA片段(GENEART公司)，所述核苷酸序列编码序列号65所示的核苷酸序列的核苷酸序号36至437所示的cFAN2抗体重链可变区。通过与实施例4)-1-3同样的方法构建cFAN2重链表达载体。cFAN2抗体的重链含有信号序列，具有序列号39的氨基酸序列。将该序列示于图9。
合成了含有编码cFAN2轻链的DNA序列的DNA片段(序列号66)(GENEART公司)。使用实施例4)-1-1所制作的pCMA-LK，通过与实施例4)-1-3同样的方法构建cFAN2轻链表达载体。cFAN2抗体的轻链含有信号序列，具有序列号40的氨基酸序列。将该序列示于图9。
4)-2嵌合抗人TLR7抗体的制造
4)-2-1嵌合AT01抗体的制造
对于FreeStyle 293F细胞(Invitrogen公司)，按照手册进行传代、培养。将处于对数生长期的1.2×109个FreeStyle 293F细胞(Invitrogen公司)接种于3L FernbachErlenmeyer Flask(CORNING公司)，用FreeStyle293 expression medium(Invitrogen公司)稀释而调整为2.0×106细胞/mL。向40mL的Opti-Pro SFM培养基(Invitrogen公司)中加入0.24mg的上述4)-1-3中构建的重链表达载体和0.36mg的上述4)-1-3中构建的轻链表达载体和1.8mg的聚乙烯亚胺(Polyscience#24765)，稳定地进行搅拌，进一步在放置5分钟后添加于FreeStyle 293F细胞。在37℃、8％CO2培养箱中以90rpm进行4小时振荡培养后，添加600ml的EX-CELL VPRO培养基(SAFC Biosciences公司)、18ml的GlutaMAX I(GIBCO公司)、及30mL的Yeastolate Ultrafiltrate(GIBCO公司)，在37℃、8％CO2培养箱中以90rpm振荡培养7天，将得到的培养上清用一次性囊式过滤器(Advantec#CCS-045-E1H)过滤，从而制造嵌合AT01抗体。
4)-2-2嵌合NB7抗体的制造
使用上述4)-1-4中构建的重链表达载体及轻链表达载体，通过与上述4)-2-1的方法制造嵌合NB7抗体。
4)-2-3嵌合FAN2抗体的制造
使用上述4)-1-5中构建的重链表达载体及轻链表达载体，通过与上述4)-2-1的方法制造嵌合FAN2抗体。
4)-3嵌合抗人TLR7抗体的纯化
从实施例4)-2中得到的各培养上清中，通过rProtein A亲和色谱的一阶段工序纯化目标抗体。将培养上清上样到经PBS平衡化的填充有MabSelectSuRe的色谱柱(GEHealthcare Bioscience公司制)后，用色谱柱体积的2倍以上的PBS洗涤色谱柱。接着用2M精氨酸盐酸盐溶液(pH4.0)洗脱，收集含有抗体的级分。对该级分进行透析(ThermoScientific公司、Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)，从而进行缓冲液置换而置换为PBS(-)。用Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20(分级分子量UF10K，Sartorius公司)浓缩抗体，将IgG浓度调整为10mg/mL以上。最后，用Minisart-Plus filter(Sartorius公司)过滤，制成纯化样品。
[实施例5]嵌合抗人TLR7抗体的体外活性
5)-1利用流式细胞仪得到的嵌合抗人TLR7抗体的抗原结合活性
将强制表达人TLR7-Flag-His×6/hUnc93B1-HA×2的Ba/F3细胞株用0.1％皂苷进行细胞膜渗透处理，用实施例4中得到的嵌合的AT01抗体、NB7抗体、及FAN2抗体的抗体浓度稀释系列和作为第二抗体的Goat anti-human IgG Fc-PE(eBioscience)染色。关于抗体的结合活性的评价，用流式细胞仪进行分析且比较MFI。其结果是，结合活性由强到弱依次为嵌合AT01抗体(cAT01)、嵌合NB7抗体(cNB7)、嵌合FAN2抗体(cFAN2)。
5)-2嵌合抗人TLR7抗体的细胞因子产生抑制作用
从Cellular Technology公司以冷冻品形式购入人PBMC，按照说明书解冻后使用。将用含有10％FBS、1mM丙酮酸钠(Life Technologies公司)、0.1mM MEM Non-EssentialAmino Acids(Life Technologies公司)、50μM 2-巯基乙醇(Life Technologies公司)、50U/mL青霉素及50μg/mL链霉素(Life Technologies公司)的RPMI1640(LifeTechnologies公司)调整为2.5×106细胞/mL的浓度的PBMC向96孔细胞培养平板中各接种100μL，以80μL/孔添加作为嵌合抗人TLR7抗体的cAT01、cNB7、cFAN2、或人IgG对照抗体(EUREKA Therapeutics公司)，在37℃培养箱内进行4小时前处理。然后，以20μL/孔添加1mg/mL CL-264(InvivoGen公司)，充分搅拌后，在37℃、5％CO2下培养约20小时。对平板进行充分搅拌后，在1500rpm下离心5分钟，通过FRET法(Cisbio公司)测定上清中所含的IL-6的浓度。
图10示出嵌合抗人TLR7抗体以添加浓度依赖性的方式抑制经CL-264处理的人PBMC的IL-6产生。cAT01、cNB7、cFAN2以添加浓度依赖性的方式抑制人PBMC的IL-6产生。由夹持50％抑制活性的两点间的浓度和添加该浓度时的抑制活性计算cAT01、cNB7、cFAN2的半抑制浓度(IC50)，分别为35ng/mL、196ng/mL、10000ng/mL以上。
另一方面，人IgG对照抗体即使在10μg/mL的浓度时也未观察到抑制。
[实施例6]人源化抗人TLR7抗体的制造
6)-1抗人TLR7抗体的人源化体设计
6)-1-1抗体可变区的分子模拟
可变区的分子模拟利用作为同源性模拟而公知的方法(Methods in Enzymology,203,121-153,(1991))、且使用市售的蛋白质立体结构分析程序BioLuminate(Schrodinger公司制)来进行。模板使用了相对于重链和轻链的可变区具有高序列同源性的、ProteinData Bank(Nuc.Acid Res.35,D301-D303(2007))中所登录的结构。
6)-1-2人源化氨基酸序列的设计
使用作为CDR嫁接(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029-10033(1989))而众所周知的方法来人源化。从Kabat et al.(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,5th Ed.Public Health Service National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))所定义的共有序列、IMGT(THE INTERNATIONAL IMMUNOGENETICS INFORMATIONSYSTEM(注册商标),http://www.imgt.org)中登录的人类种系序列中选择同源性高的受体，通过参考Queen et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029-10033(1989))所提供的基准等对三维模型进行分析来选择要移入到受体上的供体残基。
6)-1-3AT01抗体的人源化氨基酸序列的设计
人的gamma链亚类1及kappa链亚类1的共有序列相对于cAT01的框架区具有高同源性，因此可选择其作为cAT01的受体。在可变区的分子模拟中，以已知结构(PDB ID:1E4W)为模板。
6)-1-3-1AT01抗体重链的人源化
(1)将设计的重链命名为huAT01_H1_IgG1LALA。huAT01_H1_IgG1LALA作为重链全长氨基酸序列，具有含有信号序列的序列号45记载的氨基酸序列。将该序列示于图11。该序列中，第1位至第19位的氨基酸序列为信号序列，第20位至第135位的氨基酸序列为可变区，第136位至第465位的氨基酸序列为恒定区。另外，第45位至第54位的氨基酸序列为CDRH1，第69位至第78位的氨基酸序列为CDRH2，第118位至第124位的氨基酸序列为CDRH3。
编码序列号45的氨基酸序列的核苷酸序列具有序列号67记载的序列。另外，编码重链可变区的核苷酸序列具有序列号77记载的序列。
(2)将设计的重链命名为huAT01_H3_IgG1LALA。huAT01_H3_IgG1LALA作为重链全长氨基酸序列，具有含有信号序列的序列号46记载的氨基酸序列。将该序列示于图12。该序列中，第1位至第19位的氨基酸序列为信号序列，第20位至第135位的氨基酸序列为可变区，第136位至第465位的氨基酸序列为恒定区。另外，第45位至第54位的氨基酸序列为CDRH1，第69位至第78位的氨基酸序列为CDRH2，第118位至第124位的氨基酸序列为CDRH3。
编码序列号46的氨基酸序列的核苷酸序列为序列号68记载的序列。另外，编码重链可变区的核苷酸序列具有序列号78记载的序列。
(3)将设计的重链命名为huAT01_H3_IgG4Pro。huAT01_H3_IgG4Pro作为重链全长氨基酸序列，具有含有信号序列的序列号47记载的氨基酸序列。将该序列示于图13。该序列中，第1位至第19位的氨基酸序列为信号序列，第20位至第135位的氨基酸序列为可变区，第136位至第462位的氨基酸序列为恒定区。另外，第45位至第54位的氨基酸序列为CDRH1，第69位至第78位的氨基酸序列为CDRH2，第118位至第124位的氨基酸序列为CDRH3。
编码序列号47的氨基酸序列的核苷酸序列具有序列号69记载的序列。另外，编码重链可变区的核苷酸序列具有序列号78记载的序列。
将作为嵌合抗体cAT01的重链的cAT01_H的可变区的氨基酸序列(序列号5)(以下记作cAT01_H)与人源化抗体重链huAT01_H1_IgG1LALA的可变区的氨基酸序列(序列号41)(以下记作huAT01_H1)及huAT01_H3_IgG1LALA的可变区的氨基酸序列(序列号42)(以下记作huAT01_H3)的比较示于图14。huAT01_H1及huAT01_H3的序列中的“·”表示与cAT01_H相同的氨基酸残基，记载了氨基酸残基的位置表示被置换的氨基酸残基。
6)-1-3-2AT01抗体轻链的人源化
将设计的轻链命名为huAT01_L1。huAT01_L1作为轻链全长氨基酸序列，具有含有信号序列的序列号48记载的氨基酸序列。将该序列示于图15。该序列中，第1位至第20位的氨基酸序列为信号序列，第21位至第126位的氨基酸序列为可变区，第127位至第233位的氨基酸序列为恒定区。另外，氨基酸序号第44位至第54位为CDRL1，氨基酸序号第70位至第76位为CDRL2，氨基酸序号第109位至第116位为CDRL3。
编码序列号48的氨基酸序列的核苷酸序列具有序列号70记载的序列。另外，编码轻链可变区的核苷酸序列具有序列号79记载的序列。
将设计的轻链命名为huAT01_L2。huAT01_L2作为轻链全长氨基酸序列，具有含有信号序列的序列号49记载的氨基酸序列。将该序列示于图16。该序列中，第1位至第20位的氨基酸序列为信号序列，第21位至第126位的氨基酸序列为可变区，第127位至第233位的氨基酸序列为恒定区。另外，氨基酸序号第44位至第54位为CDRL1，氨基酸序号第70位至第76位为CDRL2，氨基酸序号第109位至第116位为CDRL3。
将编码序列号49的氨基酸序列的核苷酸序列记载于序列号71。另外，编码轻链可变区的核苷酸序列具有序列号80记载的序列。
将作为嵌合抗体cAT01的轻链的AT01_L的可变区的氨基酸序列(序列号11)(以下记作cAT01_L)与人源化抗体轻链huAT01_L1的可变区的氨基酸序列(序列号43)(以下记作huAT01_L1)及huAT01_L2的可变区的氨基酸序列(序列号44)(以下记作huAT01_L2)的比较示于图17。huAT01_L1及huAT01_L2的序列中的“·”表示与cAT01_L相同的氨基酸残基，记载了氨基酸残基的位置表示被置换的氨基酸残基。
6)-1-4NB7的人源化氨基酸序列的设计
人类种系序列IGHV4-30-4*02和IGHJ6*01相对于cNB7的框架区具有高同源性，因此可选择其作为cNB7的受体。在可变区的分子模拟中，以已知结构(PDB ID:3CDF)为模板。
6)-1-4-1NB7抗体重链的人源化
(1)将设计的重链命名为huNB7_H3_IgG1LALA。huNB7_H3_IgG1LALA作为重链全长氨基酸序列，具有含有信号序列的序列号52记载的氨基酸序列。将该序列示于图18。该序列中，第1位至第19位的氨基酸序列为信号序列，第20位至第141位的氨基酸序列为可变区，第142位至第471位的氨基酸序列为恒定区。另外，氨基酸序号第45位至第55位为CDRH1，氨基酸序号第70位至第78位为CDRH2，氨基酸序号第118位至第130位为CDRH3。
将编码序列号52的氨基酸序列的核苷酸序列记载于序列号72。另外，编码重链可变区的核苷酸序列具有序列号81记载的序列。
(2)将设计的重链命名为huNB7_H3_IgG4Pro。huNB7_H3_IgG4Pro作为重链全长氨基酸序列，具有含有信号序列的序列号54记载的氨基酸序列。将该序列示于图19。该序列中，第1位至第19位的氨基酸序列为信号序列，第20位至第141位的氨基酸序列为可变区，第142位至第468位的氨基酸序列为恒定区。另外，氨基酸序号第45位至第55位为CDRH1，氨基酸序号第70位至第78位为CDRH2，氨基酸序号第118位至第130位为CDRH3。
将编码序列号54的氨基酸序列的核苷酸序列记载于序列号73。另外，编码重链可变区的核苷酸序列具有序列号81记载的序列。
将作为嵌合抗体cNB7的重链的cNB7_H的可变区的氨基酸序列(序列号7)(以下记作cNB7_H)与人源化抗体重链huNB7_H3_IgG1LALA的可变区的氨基酸序列(序列号50)(以下记作huNB7_H3)的比较示于图20。huNB7_H3中的“·”表示与cNB7_H相同的氨基酸残基，记载了氨基酸残基的位置表示被置换的氨基酸残基。
6)-1-4-2NB7抗体轻链的人源化
将设计的轻链命名为huNB7_L3。huNB7_L3作为轻链全长氨基酸序列，具有含有信号序列的序列号53记载的氨基酸序列。将该序列示于图21。该序列中，第1位至第20位的氨基酸序列为信号序列，第21位至第126位的氨基酸序列为可变区，第127位至第233位的氨基酸序列为恒定区。另外，氨基酸序号第44位至第54位为CDRL1，氨基酸序号第70位至第76位为CDRL2，氨基酸序号第109位至第116位为CDRL3。
将编码序列号53的氨基酸序列的核苷酸序列记载于序列号74。另外，编码轻链可变区的核苷酸序列具有序列号82记载的序列。
将作为嵌合抗体cNB7的轻链的cNB7_L的可变区的氨基酸序列(序列号13)(以下记作cNB7_L)与人源化抗体轻链huNB7_L3的可变区的氨基酸序列(序列号51)(以下记作huNB7_L3)的比较示于图22。huNB7_L3中的“·”表示与cNB7_L相同的氨基酸残基，记载了氨基酸残基的位置表示被置换的氨基酸残基。
6)-2通过组合重链与轻链来设计人源化抗体
6)-2-1人源化AT01抗TLR7抗体的设计
(1)将具有由序列号45的第20位至第465位的氨基酸序列构成的huAT01_H1_IgG1LALA作为重链及具有由序列号48的第21位至第233位的氨基酸序列构成的huAT01_L1作为轻链的抗体命名为“huAT01_H1L1_IgG1LALA抗体”或“huAT01_H1L1_IgG1LALA”。
(2)将具有由序列号46的第20位至第465位的氨基酸序列构成的huAT01_H3_IgG1LALA作为重链及具有由序列号48的第21位至第233位的氨基酸序列构成的huAT01_L1作为轻链的抗体命名为“huAT01_H3L1_IgG1LALA抗体”或“huAT01_H3L1_IgG1LALA”。
(3)将具有由序列号46的第20位至第465位的氨基酸序列构成的huAT01_H3_IgG1LALA作为重链及具有由序列号49的第21位至第233位的氨基酸序列构成的huAT01_L2作为轻链的抗体命名为“huAT01_H3L2_IgG1LALA抗体”或“huAT01_H3L2_IgG1LALA”。
(4)将具有由序列号47的第20位至第462位的氨基酸序列构成的huAT01_H3_IgG4Pro作为重链及具有由序列号49的第21位至第233位的氨基酸序列构成的huAT01_L2作为轻链的抗体命名为“huAT01_H3L2_IgG4Pro抗体”或“huAT01_H3L2_IgG4Pro”。
6)-2-2人源化NB7抗TLR7抗体的设计
(1)将具有由序列号52的第20位至第471位的氨基酸序列构成的huNB7_H3_IgG1LALA作为重链及具有由序列号53的第21位至第233位的氨基酸序列构成的huNB7_L3作为轻链的抗体命名为“huNB7_H3L3_IgG1LALA抗体”或“huNB7_H3L3_IgG1LALA”。
(2)将具有由序列号54的第20位至第468位的氨基酸序列构成的huNB7_H3_IgG4Pro作为重链及具有由序列号53的第21位至第233位的氨基酸序列构成的huNB7_L3作为轻链的抗体命名为“huNB7_H3L3_IgG4Pro抗体”或“huNB7_H3L3_IgG4Pro”。
6)-3人源化抗人TLR7抗体的制作
6)-3-1人源化IgG1LALA型重链表达载体pCMA-G1LALA的构建
使用含有编码人重链信号序列及人IgG1LALA恒定区的氨基酸序列的核苷酸序列的DNA片段(序列号75)，通过与实施例4)-1-2相同的方法构建pCMA-G1LALA。
6)-3-2人源化IgG4Pro型重链表达载体pCMA-G4Pro的构建
使用含有编码人重链信号序列及人IgG4Pro恒定区的氨基酸序列的核苷酸序列的DNA片段(序列号76)，通过与实施例4)-1-2相同的方法构建pCMA-G4Pro。
6)-3-3AT01人源化重链表达载体的构建
6)-3-3-1huAT01_H1_IgG1LALA表达载体的构建
合成序列号46示出的huAT01_H1_IgG1LALA的核苷酸序列的核苷酸序号第36位至第422位所示的DNA片段(GENEART公司)。使用In-Fusion HD PCR克隆试剂盒(Clontech公司)，将所合成的DNA片段插入将pCMA-G1LALA用限制性内切酶BlpI切断的位置处，由此构建huAT01_H1_IgG1LALA表达载体。
6)-3-3-2huAT01_H3_IgG1LALA表达载体的构建
合成序列号68示出的huAT01_H3_IgG1LALA的核苷酸序列的核苷酸序号第36位至第422位所示的DNA片段(GENEART公司)。通过与实施例6)-3-3-1相同的方法构建huAT01_H3_IgG1LALA表达载体。
6)-3-3-3huAT01_H3_IgG4Pro表达载体的构建
合成序列号69示出的huAT01_H3_IgG4Pro的核苷酸序列的核苷酸序号第36位至第422位所示的DNA片段(GENEART公司)。使用In-Fusion HD PCR克隆试剂盒(Clontech公司)，将所合成的DNA片段插入将pCMA-G4Pro用限制性内切酶BlpI切断的位置处，由此构建huAT01_H3_IgG4Pro表达载体。
6)-3-4AT01人源化轻链表达载体的构建
6)-3-4-1huAT01_L1表达载体的构建
合成序列号70示出的huAT01_L1的核苷酸序列的核苷酸序号第37位至第399位所示的DNA片段(GENEART公司)。使用In-Fusion HD PCR克隆试剂盒(Clontech公司)将所合成的DNA片段插入将pCMA-LK用限制性内切酶BsiWI切断的位置处，从而构建huAT01_L1表达载体。
6)-3-4-2huAT01_L2表达载体的构建
合成序列号71示出的huAT01_L2的核苷酸序列的核苷酸序号第37位至第399位所示的DNA片段(GENEART公司)。使用In-Fusion HD PCR克隆试剂盒(Clontech公司)，通过与实施例6)-3-4-1相同的方法构建huAT01_L1表达载体。
6)-3-5NB7人源化重链表达载体的构建
6)-3-5-1huNB7_H3_IgG1LALA表达载体的构建
合成序列号72示出的huNB7_H3_IgG1LALA的核苷酸序列的核苷酸序号第36位至第440位所示的DNA片段(GENEART公司)。通过与实施例6)-3-3-1相同的方法构建huNB7_H3_IgG1LALA表达载体。
6)-3-5-2huNB7_H3_IgG4Pro表达载体的构建
合成序列号73示出的huNB7_H3_IgG4Pro的核苷酸序列的核苷酸序号第36位至第440位所示的DNA片段(GENEART公司)。通过与实施例6)-3-3-3相同的方法构建huNB7_H3_IgG4Pro表达载体。
6)-3-6NB7人源化轻链表达载体的构建
6)-3-6-1huNB7_L3表达载体的构建
合成序列号74所示的huNB7_L3的核苷酸序列的核苷酸序号第37位至第399位所示的DNA片段(GENEART公司)。使用In-Fusion HD PCR克隆试剂盒(Clontech公司)，通过与实施例6)-3-4-1相同的方法构建huNB7_L3表达载体。
6)-3-7人源化抗体的制备
6)-3-7-1人源化抗体的制造
通过实施例6)-2中设计的重链与轻链的组合，对于huAT01_H1L1_IgG1LALA、huAT01_H3L1_IgG1LALA、huAT01_H3L2_IgG1LALA、huAT01_H3L2_IgG4Pro、huNB7_H3L3_IgG1LALA、及huNB7_H3L3_IgG4Pro，使用实施例6)-3-1至6)-3-6中构建的各表达载体通过与实施例4)-2相同的方法制造各人源化抗体。
6)-3-7-2人源化抗体的纯化
通过rProtein A亲和色谱和陶瓷羟基磷灰石的两阶段工序，对实施例6)-3-7-1中得到的培养上清进行纯化。
将培养上清上样到用PBS平衡化的填充有MabSelectSuRe的色谱柱(GEHealthcareBioscience公司制)后，用色谱柱体积的2倍以上的PBS洗涤色谱柱。接着用2M精氨酸盐酸盐溶液(pH4.0)洗脱抗体。
通过透析(Thermo Scientific公司、Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)，对含有抗体的级分进行缓冲液置换而置换为PBS，用5mM磷酸钠/50mM MES/pH7.0缓冲液稀释5倍后，上样到用5mM NaPi/50mM MES/30mM NaCl/pH7.0缓冲液平衡化的陶瓷羟基磷灰石(Japan Bio-Rad Laboratories,Inc.、Bio-Scale CHT Type-1 Hydroxyapatite Column)。
利用氯化钠实施线性浓度梯度洗脱，收集含有抗体的级分。通过透析(ThermoScientific公司、Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)，对该级分进行缓冲液置换而置换为HBSor(25mM组氨酸/5％山梨醇、pH6.0)。利用Centrifugal UF Filter DeviceVIVASPIN20(分级分子量UF10K，Sartorius公司)浓缩抗体，将IgG浓度调整为50mg/mL。最后，用Minisart-Plus filter(Sartorius公司)过滤，作为纯化样品。
[实施例7]人源化抗人TLR7抗体的体外活性
7)-1人源化抗人TLR7抗体的细胞因子产生抑制作用
从Cellular Technology公司以冷冻品形式购入人PBMC，按照说明书解冻后使用。
将用含有10％FBS、1mM丙酮酸钠(Life Technologies公司)、0.1mM MEM Non-Essential Amino Acids(Life Technologies公司)、50μM 2-巯基乙醇(LifeTechnologies公司)、50U/mL青霉素及50μg/mL链霉素(Life Technologies公司)的RPMI1640(Life Technologies公司)调整为2.5×106细胞/mL的浓度的PBMC向96孔细胞培养平板中各接种100μL，以80μL/孔添加作为人源化抗人TLR7抗体的huAT01_H1L1_IgG1LALA、huAT01_H3L1_IgG1LALA、huAT01_H3L2_IgG1LALA、huAT01_H3L2_IgG4Pro、huNB7_H3L3_IgG1LALA、huNB7_H3L3_IgG4Pro或人IgG对照抗体(EUREKA Therapeutics公司)，在37℃培养箱内进行4小时前处理。
然后，以20μL/孔添加1mg/mL CL-264(InvivoGen公司)，充分搅拌后，在37℃、5％CO2下培养约20小时。
对平板进行充分搅拌后，在1500rpm下离心5分钟，用FRET法(Cisbio公司)测定上清中所含的IL-6浓度。
图23示出人源化抗人TLR7抗体以添加浓度依赖性的方式抑制经CL-264处理的人PBMC的IL-6产生。
huAT01_H1L1_IgG1LALA、huAT01_H3L1_IgG1LALA、huAT01_H3L2_IgG1LALA、huAT01_H3L2_IgG4Pro、huNB7_H3L3_IgG1LALA、huNB7_H3L3_IgG4Pro以添加浓度依赖性的方式抑制人PBMC的IL-6产生。
huAT01_H1L1_IgG1LALA、huAT01_H3L1_IgG1LALA、huAT01_H3L2_IgG1LALA、huAT01_H3L2_IgG4Pro、huNB7_H3L3_IgG1LALA、huNB7_H3L3_IgG4Pro的半抑制浓度(IC50)由夹持50％抑制活性的两点间的浓度和添加该浓度时的抑制活性来计算，分别为74ng/mL、138ng/mL、38ng/mL、24ng/mL、307ng/mL、31ng/mL。
[实施例8]人源化抗人TLR7抗体的抗原结合确认
8)-1强制表达人TLR7(变体1)-Flag的HEK293细胞的制备
将Lenti-X(注册商标)HEK293T细胞(Clontech公司)以4.5×106细胞/瓶的浓度接种于75cm2培养瓶(Sumitomo Bakelite Co.,Ltd.制)，在含有10％FBS及50U/mL青霉素及50μg/mL链霉素(Life Technologies公司制)的DMEM培养基(FUJIFILM Wako Pure ChemicalCorporation制)中，在37℃、5％CO2的条件下培养一晚。
次日，使用作为转染试剂的Lipofectamine(注册商标)2000(Life Technologies公司制)将Genscript公司制作的pcDNA3.1-人TLR7(变体1)-Flag表达质粒基因导入Lenti-X(注册商标)HEK293T细胞(Clontech公司)中，在37℃、5％CO2的条件下再培养一晚。
次日，将导入了表达质粒的细胞用TrypLE Express(Life Technologies公司制)处理，将处理后的细胞用流式细胞术染色缓冲液(Life Technologies公司制)洗涤后，悬浮于流式细胞术染色缓冲液(Life Technologies公司制)。将得到的细胞悬浮液用于流式细胞仪分析。
通过使用抗Flag-PE抗体(Biolegend公司)或作为阴性对照的同种型对照抗体(Biolegend公司)利用流式细胞仪(Miltenyi Biotec K.K.)进行检测，由此对导入pcDNA3.1-人TLR7(变体1)-Flag表达质粒的细胞表达人TLR7这一点进行确认。
将人TLR7(变体1)的氨基酸序列及编码该氨基酸序列的多核苷酸序列分别记载于序列表的序列号2及序列号1。
8)-2强制表达人TLR7(变体2)-Flag的HEK293细胞的制备
将Lenti-X(注册商标)HEK293T细胞(Clontech公司)以4.5×106细胞/瓶的浓度接种于75cm2培养瓶(Sumitomo Bakelite Co.,Ltd.制)，在含有10％FBS及50U/mL青霉素及50μg/mL链霉素(Life Technologies公司制)的DMEM培养基(FUJIFILM Wako Pure ChemicalCorporation制)中，在37℃、5％CO2的条件下培养一晚。
次日，使用作为转染试剂的Lipofectamine(注册商标)2000(Life Technologies公司制)，将Genscript公司制作的pcDNA3.1-人TLR7(变体2)-Flag表达质粒导入Lenti-X(注册商标)HEK293T细胞(Clontech公司)，在37℃、5％CO2的条件下进一步培养一晚。
次日，将导入了表达载体的细胞用TrypLE Express(Life Technologies公司制)进行处理，将处理后的细胞用流式细胞术染色缓冲液(Life Technologies公司制)洗涤后，悬浮于流式细胞术染色缓冲液(Life Technologies公司制)。将得到的细胞悬浮液用于流式细胞仪分析。
通过使用抗Flag-PE抗体(Biolegend公司)或作为阴性对照的同种型对照抗体(Biolegend公司)利用流式细胞仪(Miltenyi Biotec K.K.)进行检测，由此对导入pcDNA3.1-人TLR7(变体2)-Flag表达质粒的细胞表达人TLR7这一点进行确认。
8)-3强制表达猴TLR7-Flag的HEK293细胞的制备
将Lenti-X(注册商标)HEK293T细胞(Clontech公司)以4.5×106细胞/瓶的浓度接种于75cm2培养瓶(Sumitomo Bakelite Co.,Ltd.制)，在含有10％FBS及50U/mL青霉素及50μg/mL链霉素(Life Technologies公司制)的DMEM培养基(FUJIFILM Wako Pure ChemicalCorporation制)中，在37℃、5％CO2的条件下培养一晚。
次日，使用作为转染试剂的Lipofectamine(注册商标)2000(Life Technologies公司制)将Genscript公司制作的pcDNA3.1-猴TLR7-Flag表达质粒导入Lenti-X(注册商标)HEK293T细胞(Clontech公司)，在37℃、5％CO2的条件下进一步培养一晚。
次日，将导入了表达载体的细胞用TrypLE Express(Life Technologies公司制)进行处理，将处理后的细胞用流式细胞术染色缓冲液(Life Technologies公司制)洗涤后，悬浮于流式细胞术染色缓冲液(Life Technologies公司制)。将得到的细胞悬浮液用于流式细胞仪分析。
使用抗Flag-PE抗体(Biolegend公司)或作为阴性对照的同种型对照抗体(Biolegend公司)利用流式细胞仪(Miltenyi Biotec K.K.)进行检测，由此对导入pcDNA3.1-猴TLR7-Flag表达质粒的细胞表达猴TLR7这一点进行确认。
8)-4强制表达小鼠TLR7-Flag的HEK293细胞的制备
将Lenti-X(注册商标)HEK293T细胞(Clontech公司)以4.5×106细胞/瓶的浓度接种于75cm2培养瓶(Sumitomo Bakelite Co.,Ltd.制)，在含有10％FBS及50U/mL青霉素及50μg/mL链霉素(Life Technologies公司制)的DMEM培养基(FUJIFILM Wako Pure ChemicalCorporation制)中，在37℃、5％CO2的条件下培养一晚。
次日，使用作为转染试剂的Lipofectamine(注册商标)2000(Life Technologies公司制)将Genscript公司制作的pcDNA3.1-小鼠TLR7-Flag表达质粒导入Lenti-X(注册商标)HEK293T细胞(Clontech公司)，在37℃、5％CO2的条件下进一步培养一晚。
次日，将导入了表达载体的细胞用TrypLE Express(Life Technologies公司制)进行处理，将处理后的细胞用流式细胞术染色缓冲液(Life Technologies公司制)洗涤后，悬浮于流式细胞术染色缓冲液(Life Technologies公司制)。将得到的细胞悬浮液用于流式细胞仪分析。
使用抗Flag-PE抗体(Biolegend公司)或作为阴性对照的同种型对照抗体(Biolegend公司)利用流式细胞仪(Miltenyi Biotec K.K.)进行检测，由此对导入pcDNA3.1-小鼠TLR7-Flag表达质粒的细胞表达小鼠TLR7这一点进行确认。
8)-5强制表达大鼠TLR7-Flag的HEK293细胞的制备
将Lenti-X(注册商标)HEK293T细胞(Clontech公司)以4.5×106细胞/瓶的浓度接种于75cm2培养瓶(Sumitomo Bakelite Co.,Ltd.制)，在含有10％FBS及50U/mL青霉素及50μg/mL链霉素(Life Technologies公司制)的DMEM培养基(FUJIFILM Wako Pure ChemicalCorporation制)中，在37℃、5％CO2的条件下培养一晚。
次日，使用作为转染试剂的Lipofectamine(注册商标)2000(Life Technologies公司制)将Genscript公司制作的pcDNA3.1-大鼠TLR7-Flag表达质粒导入Lenti-X(注册商标)HEK293T细胞(Clontech公司)，在37℃、5％CO2的条件下进一步培养一晚。
次日，将导入了表达载体的细胞用TrypLE Express(Life Technologies公司制)进行处理，将处理后的细胞用流式细胞术染色缓冲液(Life Technologies公司制)洗涤后，悬浮于流式细胞术染色缓冲液(Life Technologies公司制)。将得到的细胞悬浮液用于流式细胞仪分析。
使用抗Flag-PE抗体(Biolegend公司)或作为阴性对照的同种型对照抗体(Biolegend公司)利用流式细胞仪(Miltenyi Biotec K.K.)进行检测，由此对导入pcDNA3.1-大鼠TLR7-Flag表达质粒的细胞表达大鼠TLR7这一点进行确认。
8)-6利用流式细胞仪评价人源化抗人TLR7抗体的结合选择能力
将8)-1中制备的强制表达人TLR7(变体1)-Flag的HEK293细胞、8)-2中制备的强制表达人TLR7(变体2)-Flag的HEK293细胞、8)-3中制备的强制表达猴TLR7-Flag的HEK293细胞、8)-4中制备的强制表达小鼠TLR7-Flag的HEK293细胞、及8)-5中制备的强制表达大鼠TLR7-Flag的HEK293细胞用固定和透明溶液(Fixation and Permeabilization Solution)(Becton,Dickinson and Company制)进行固定/细胞膜渗透处理后，使用作为人源化抗人TLR7抗体之一的huAT01_H3L2_IgG1LALA及作为第二抗体的Alexa Fluor(注册商标)647AffiniPure Goat anti-human IgG+IgM(H+L)(Jackson ImmunoResearch Inc.公司制)进行染色。
用流式细胞仪(Miltenyi Biotec K.K.)检测人源化抗人TLR7抗体与人TLR7的结合，使用分析流式细胞仪数据的软件Flowjo分析数据。
其结果是，作为人源化抗人TLR7抗体之一的huAT01_H3L2_IgG1LALA与人TLR7(变体1)、人TLR7(变体2)或猴TLR7特异性结合，不与小鼠TLR7或大鼠TLR7结合。将结果示于图25～29。
产业上的可利用性
本发明的人源化抗TLR7抗体具有抑制人TLR7功能抑制活性的作用，能够成为免疫炎症相关疾病等的治疗或预防剂。
序列号1：编码人TLR7(变体1)的核苷酸序列
序列号2：人TLR7(变体1)的氨基酸序列
序列号3：编码人TLR7(变体2)的核苷酸序列
序列号4：人TLR7(变体2)的氨基酸序列
序列号5：AT01抗体的重链可变区的氨基酸序列
序列号6：编码cAT01抗体的重链可变区的核苷酸序列
序列号7：NB7抗体的重链可变区的氨基酸序列
序列号8：编码cNB7抗体的重链可变区的核苷酸序列
序列号9：FAN2抗体的重链可变区的氨基酸序列
序列号10：编码cFAN2抗体的重链可变区的核苷酸序列
序列号11：AT01抗体的轻链可变区的氨基酸序列
序列号12：编码cAT01抗体的轻链可变区的核苷酸序列
序列号13：NB7抗体的轻链可变区的氨基酸序列
序列号14：编码cNB7抗体的轻链可变区的核苷酸序列
序列号15：FAN2抗体的轻链可变区的氨基酸序列
序列号16：编码cFAN2抗体的轻链可变区的核苷酸序列
序列号17：AT01抗体的CDRH1的氨基酸序列
序列号18：AT01抗体的CDRH2的氨基酸序列
序列号19：AT01抗体的CDRH3的氨基酸序列
序列号20：AT01抗体的CDRL1的氨基酸序列
序列号21：AT01抗体的CDRL2的氨基酸序列
序列号22：AT01抗体的CDRL3的氨基酸序列
序列号23：NB7抗体的CDRH1的氨基酸序列
序列号24：NB7抗体的CDRH2的氨基酸序列
序列号25：NB7抗体的CDRH3的氨基酸序列
序列号26：NB7抗体的CDRL1的氨基酸序列
序列号27：NB7抗体的CDRL2的氨基酸序列
序列号28：NB7抗体的CDRL3的氨基酸序列
序列号29：FAN2抗体的CDRH1的氨基酸序列
序列号30：FAN2抗体的CDRH2的氨基酸序列
序列号31：FAN2抗体的CDRH3的氨基酸序列
序列号32：FAN2抗体的CDRL1的氨基酸序列
序列号33：FAN2抗体的CDRL2的氨基酸序列
序列号34：FAN2抗体的CDRL3的氨基酸序列
序列号35：AT01嵌合抗人TLR7抗体(cAT01)的重链的氨基酸序列
序列号36：AT01嵌合抗人TLR7抗体(cAT01)的轻链的氨基酸序列
序列号37：NB7嵌合抗人TLR7抗体(cNB7)的重链的氨基酸序列
序列号38：NB7嵌合抗人TLR7抗体(cNB7)的轻链的氨基酸序列
序列号39：FAN2嵌合抗人TLR7抗体(cFAN2)的重链的氨基酸序列
序列号40：FAN2嵌合抗人TLR7抗体(cFAN2)的轻链的氨基酸序列
序列号41：huAT01_H1_IgG1LALA的重链可变区的氨基酸序列
序列号42：huAT01_H3_IgG1LALA的重链可变区的氨基酸序列
序列号43：huAT01_L1的轻链可变区的氨基酸序列
序列号44：huAT01_L2的轻链可变区的氨基酸序列
序列号45：huAT01_H1_IgG1LALA的氨基酸序列
序列号46：huAT01_H3_IgG1LALA的氨基酸序列
序列号47：huAT01_H3_IgG4Pro的氨基酸序列
序列号48：huAT01_L1的氨基酸序列
序列号49：huAT01_L2的氨基酸序列
序列号50：huNB7_H3_IgG1LALA的重链可变区的氨基酸序列
序列号51：huNB7_L3的轻链可变区的氨基酸序列
序列号52：huNB7_H3_IgG1LALA的氨基酸序列
序列号53：huNB7_L3的氨基酸序列
序列号54：huNB7_H3_IgG4Pro的氨基酸序列
序列号55：人Unc93B1基因的核苷酸序列
序列号56：小鼠TLR7基因的核苷酸序列
序列号57：大鼠TLR7基因的核苷酸序列
序列号58：猴TLR7基因的核苷酸序列
序列号59：含有编码人轻链信号序列及人kappa链恒定区的核苷酸序列的DNA片段的核苷酸序列
序列号60：含有编码人重链信号序列及人IgG1恒定区的核苷酸序列的DNA片段的核苷酸序列
序列号61：编码cAT01抗体的重链的核苷酸序列
序列号62：含有编码cAT01抗体的轻链的核苷酸序列的DNA片段的核苷酸序列
序列号63：编码cNB7抗体的重链的核苷酸序列
序列号64：含有编码cNB7抗体的轻链的核苷酸序列的DNA片段的核苷酸序列
序列号65：编码cFAN2抗体的重链的核苷酸序列
序列号66：含有编码cFAN2抗体的轻链的核苷酸序列的DNA片段的核苷酸序列
序列号67：编码huAT01_H1_IgG1LALA的核苷酸序列
序列号68：编码huAT01_H3_IgG1LALA的核苷酸序列
序列号69：编码huAT01_H3_IgG4Pro的核苷酸序列
序列号70：编码huAT01_L1的核苷酸序列
序列号71：编码huAT01_L2的核苷酸序列
序列号72：编码huNB7_H3_IgG1LALA的核苷酸序列
序列号73：编码huNB7_H3_IgG4Pro的核苷酸序列
序列号74：编码huNB7_L3的核苷酸序列
序列号75：含有编码人重链信号序列及人IgG1LALA恒定区的核苷酸序列的DNA片段的核苷酸序列
序列号76：含有编码人重链信号序列及人IgG4Pro恒定区的核苷酸序列的DNA片段的核苷酸序列
序列号77：编码huAT01_H1的重链可变区的核苷酸序列
序列号78：编码huAT01_H3的重链可变区的核苷酸序列
序列号79：编码huAT01_L1的轻链可变区的核苷酸序列
序列号80：编码huAT01_L2的轻链可变区的核苷酸序列
序列号81：编码huNB7_H3的重链可变区的核苷酸序列
序列号82：编码huNB7_L3的轻链可变区的核苷酸序列
序列号83：小鼠TLR7的氨基酸序列
序列号84：大鼠TLR7的氨基酸序列
序列号85：猴TLR7的氨基酸序列
序列号86：人Unc93B1 D34A突变-HA×2基因的核苷酸序列

Claims (32)

1.一种抗体或该抗体的抗原结合性片段，其特征在于，具有以下特性：
(a)与人TLR7特异性结合、
(b)抑制人TLR7的功能、及
(c)具有由序列号23记载的氨基酸序列构成的CDRH1、由序列号24记载的氨基酸序列构成的CDRH2及由序列号25记载的氨基酸序列构成的CDRH3作为重链的互补决定区、以及具有由序列号26记载的氨基酸序列构成的CDRL1、由序列号27记载的氨基酸序列构成的CDRL2及由序列号28记载的氨基酸序列构成的CDRL3作为轻链的互补决定区。
2.一种抗体或该抗体的抗原结合性片段，其特征在于，其具有以下特性：
(a)与人TLR7或猴TLR7特异性结合且不与小鼠TLR7或大鼠TLR7结合；
(b)抑制人TLR7或猴TLR7的功能；及
(c)具有由序列号23记载的氨基酸序列构成的CDRH1、由序列号24记载的氨基酸序列构成的CDRH2及由序列号25记载的氨基酸序列构成的CDRH3作为重链的互补决定区、以及
具有由序列号26记载的氨基酸序列构成的CDRL1、由序列号27记载的氨基酸序列构成的CDRL2及由序列号28记载的氨基酸序列构成的CDRL3作为轻链的互补决定区。
3.根据权利要求2所述的抗体或该抗体的抗原结合性片段，其中，人TLR7为由序列号2或序列号4记载的氨基酸序列构成的分子、猴TLR7为由序列号85记载的氨基酸序列构成的分子、小鼠TLR7为由序列号83记载的氨基酸序列构成的分子、或者大鼠TLR7为由序列号84记载的氨基酸序列构成的分子。
4.根据权利要求1或2所述的抗体或该抗体的抗原结合性片段，其在与人TLR7的结合中与下述抗体具有竞争性抑制活性，所述抗体为含有具有由序列号7记载的氨基酸序列构成的重链可变区的重链及具有由序列号13记载的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的抗体。
5.根据权利要求1或2所述的抗体或该抗体的抗原结合性片段，其具有由序列号7记载的氨基酸序列构成的重链可变区及由序列号13记载的氨基酸序列构成的轻链可变区。
6.根据权利要求1或2所述的抗体或该抗体的抗原结合性片段，其中，恒定区为人源恒定区。
7.根据权利要求6所述的抗体或该抗体的抗原结合性片段，其具有由序列号37记载的氨基酸序列中的第20位至第471位的氨基酸序列构成的重链及由序列号38记载的氨基酸序列中的第21位至第233位的氨基酸序列构成的轻链。
8.根据权利要求1或2所述的抗体或该抗体的抗原结合性片段，其被人源化。
9.根据权利要求8所述的抗体或该抗体的抗原结合性片段，其具有：由选自下述(a)、(b)组成的组中的氨基酸序列构成的重链可变区、以及由选自下述(c)、(d)组成的组中的氨基酸序列构成的轻链可变区，
(a)序列号50记载的氨基酸序列、
(b)在(a)的序列中缺失、置换或添加了1至10个氨基酸的氨基酸序列；
(c)序列号51记载的氨基酸序列、
(d)在(c)的序列中缺失、置换或添加了1至10个氨基酸的氨基酸序列。
10.根据权利要求8所述的抗体或该抗体的抗原结合性片段，其具有由序列号50记载的氨基酸序列构成的重链可变区及由序列号51记载的氨基酸序列构成的轻链可变区。
11.根据权利要求10所述的抗体或该抗体的抗原结合性片段，其具有：
(a)由序列号52记载的氨基酸序列中的第20位至第471位的氨基酸序列构成的重链及由序列号53记载的氨基酸序列中的第21位至第233位的氨基酸序列构成的轻链、或
(b)由序列号54记载的氨基酸序列中的第20位至第468位的氨基酸序列构成的重链及由序列号53记载的氨基酸序列中的第21位至第233位的氨基酸序列构成的轻链。
12.一种抗体或该抗体的抗原结合性片段，其具有由序列号52记载的氨基酸序列中的第20位至第471位的氨基酸序列构成的重链及由序列号53记载的氨基酸序列中的第21位至第233位的氨基酸序列构成的轻链。
13.一种抗体或该抗体的抗原结合性片段，其具有由序列号54记载的氨基酸序列中的第20位至第468位的氨基酸序列构成的重链及由序列号53记载的氨基酸序列中的第21位至第233位的氨基酸序列构成的轻链。
14.根据权利要求12或13所述的抗体或该抗体的抗原结合性片段，其具有以下特性：(a)与人TLR7特异性结合、及(b)抑制人TLR7的功能。
15.根据权利要求1、2、3、12及13中任一项所述的抗体或该抗体的抗原结合性片段，其中，抗原结合性片段选自由Fab、F(ab)2、Fab’及Fv组成的组。
16.一种多核苷酸，其具有编码权利要求1～15中任一项所述的抗体或该抗体的抗原结合性片段的多核苷酸序列。
17.根据权利要求16所述的多核苷酸，其具有编码序列号81记载的重链可变区的多核苷酸序列及编码序列号82记载的轻链可变区的多核苷酸序列。
18.一种表达载体，其含有权利要求16或17所述的多核苷酸。
19.一种宿主细胞，其用权利要求18所述的表达载体进行了转化。
20.根据权利要求19所述的宿主细胞，其中，宿主细胞为真核细胞。
21.一种抗体或片段的制造方法，其特征在于，其包括培养权利要求19或20所述的宿主细胞的工序、及从该工序所得到的培养物中收集目标抗体或该抗体的抗原结合性片段的工序。
22.一种抗体或该抗体的抗原结合性片段，其特征在于，其是通过权利要求21的制造方法得到的。
23.根据权利要求1、2、3、12及13中任一项所述的抗体，其含有选自由下述修饰组成的组中的一种或两种以上的修饰：向N-键添加糖链、向O-键添加糖链、N末端的加工、C末端的加工、脱酰胺化、天冬氨酸的异构化、甲硫氨酸的氧化、向N末端添加甲硫氨酸残基、脯氨酸残基的酰胺化及使重链的羧基末端缺失1个或2个氨基酸。
24.根据权利要求23所述的抗体，其中，2条重链为由以下重链中的任一种或任两种的组合构成的重链，所述重链选自由全长及羧基末端缺失了1个或2个氨基酸的缺失体组成的组。
25.根据权利要求24所述的抗体，其中，2条重链两者的羧基末端缺失了1个氨基酸。
26.根据权利要求25所述的抗体，其中，重链的羧基末端的脯氨酸残基进一步被酰胺化。
27.一种用于疾病的治疗和/或预防的药物组合物，其特征在于，含有权利要求1～15及22中任一项所述的抗体或该抗体的抗原结合性片段或权利要求23～26中任一项所述的抗体中的至少一种或权利要求18所述的表达载体作为有效成分。
28.权利要求1～15及22中任一项所述的抗体或该抗体的抗原结合性片段或权利要求23～26中任一项所述的抗体中的至少一种在制造起因于人TLR7的功能的疾病的治疗剂中的应用。
29.权利要求1～15及22中任一项所述的抗体或该抗体的抗原结合性片段或权利要求23～26中任一项所述的抗体中的至少一种以及免疫抑制剂、抗炎症剂、抗变态反应剂、抗感染症剂、或抗癌症剂在制造起因于人TLR7的功能的疾病的治疗剂中的应用。
30.根据权利要求28或29所述的应用，其中，起因于人TLR7的功能的疾病为免疫炎症相关疾病、变态反应性疾病、感染症、或癌症。
31.根据权利要求30所述的应用，其中，免疫炎症相关疾病为系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、幼年特发性关节炎、成人斯蒂尔病、强直性脊柱炎、系统性硬皮病、多发性肌炎、皮肌炎、银屑病关节炎、骨关节炎、混合性结缔组织病或肌营养不良。
32.根据权利要求30所述的应用，其中，免疫炎症相关疾病为系统性红斑狼疮。
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