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CN104507969A - 抗siglec-15抗体 - Google Patents

抗siglec-15抗体 Download PDF

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CN104507969A
CN104507969A CN201380037901.1A CN201380037901A CN104507969A CN 104507969 A CN104507969 A CN 104507969A CN 201380037901 A CN201380037901 A CN 201380037901A CN 104507969 A CN104507969 A CN 104507969A
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M·施图伊伯勒
G·B·特伦布莱
T·苏莱亚
A·N·莫雷蒂斯
M·菲利翁
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Alethia Biotherapeutics Inc
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Abstract

在此描述了特异性地结合Siglec-15的抗体和抗原结合片段。这些抗体或抗原结合片段可具有抑制破骨细胞分化的能力和/或抑制破骨细胞骨再吸收活性的能力。还特此披露了组合物和表达抗Siglec-15抗体或抗原结合片段的细胞。抗Siglec-15抗体还可有用于治疗骨丢失或骨疾病。还描述了用于检测或诊断骨丢失或骨相关疾病的方法。

Description

抗SIGLEC-15抗体
发明领域
本发明涉及特异性结合Siglec-15的抗体及其抗原结合片段。本发明具体地涉及适用于向人给药的抗Siglec-15抗体和/或包含人IgG1恒定区的氨基酸的抗Siglec-15抗体。本发明还涉及抗Siglec-15抗体用于治疗和/或诊断疾病或病状的用途。
本发明的这些抗体可例如用来抑制Siglec-15的活性或功能或将治疗剂递送至表达该蛋白质的细胞。
发明背景
骨是一种动态结缔组织，该动态结缔组织是由支持骨的结构、机械和生物化学完整性和人体矿物质体内平衡所需要的功能相异细胞群体构成。所涉及的主要细胞类型包括负责骨形成和维持骨质量的成骨细胞和负责骨再吸收的破骨细胞。成骨细胞和破骨细胞在称为骨重建的动态过程中起作用。这些细胞从它们祖先的发育和增殖是由在骨微环境中产生的生长因子和细胞因子的网络以及由全身性激素来管控。骨重建贯穿个体一生来进行并且是维持健康骨组织和矿物质体内平衡所必需的。该过程在很大程度上保持平衡并且通过全身性激素、肽和下游信号传导途径蛋白、局部转录因子、细胞因子、生长因子以及基质重建基因的复杂相互作用来管控。
在骨重建过程中出现的干扰或不平衡可以产生骨骼疾病，其中最常见骨骼病症的特征在于骨质量的净减少。此骨质量减少的主要原因是破骨细胞数量和/或活性增加。最常见的此种疾病(并且也许是最著名的)是特别地在开始绝经后的妇女中发生的骨质疏松症。事实上，骨质疏松症是中年后期和老年妇女中骨骼骨折的最重要根本原因。虽然雌激素缺乏被强烈地提示是绝经后骨质疏松症的一个因素，但是存在长期的证据证明重建是发生在整个骨骼的不连续块中的局部控制过程，如由Frost(弗若斯特)四十多年前首次描述(弗若斯特H.M.1964)。
因为骨重建发生在不连续块中，对骨再吸收和正常重建过程的起始而言局部产生的激素和酶可比全身性激素更为重要。此种局部控制是由其中它们运行的微环境中的成骨细胞和破骨细胞来介导。例如，破骨细胞附着至骨基质并且在自身与骨表面之间形成一个单独的区室，该区室是由环绕皱褶缘的肌动蛋白环形成的一个缝合区来界定的。多个小囊泡将酶朝向该骨基质输送并且使部分消化的骨基质内化。该缝合区内的微环境富含溶酶体酶的存在并且与身体的正常生理pH相比是高度酸性的。皱褶缘膜还表达RANKL的受体RANK和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)受体，这两种受体均负责破骨细胞分化；以及能够使该破骨细胞快速灭活的降钙素受体(Baron,R.(巴雄，R)2003)。
在抑制和刺激的一种复杂模式下，生长激素、胰岛素样生长因子-1、性类固醇、甲状腺激素、趋钙激素(calciotrophic hormone)如PTH和前列腺素E2、不同细胞因子，如白细胞介素-1β、白细胞介素-6和肿瘤坏死因子-α以及1,25-二羟基维生素D(骨化三醇)共同在该骨重建过程中起作用(Jilka(吉卡)等人1992；Poli(波利)等人1994；Srivastava(斯里兰卡)等人1998；de Vemejoul(德唯米焦)1996)。
因此，毫无疑问由这些特化细胞形成的独特局部环境是由于不在其他组织中表达的独特基因序列和/或在其他组织中表达的多核苷酸和多肽的剪接变体的表达。对破骨细胞活性有特异性的多核苷酸、多肽以及它们的变体和衍生物的分离和鉴定可容许更清楚地理解该重建过程并且为治疗与骨重建相关的疾病状态提供组织特异性治疗靶标。
对与骨重建相关的许多疾病是理解甚少的、通常不可治疗的或仅可治疗到有限的程度。例如，骨关节炎难以治疗，因为不存在集中于减轻疼痛并且预防受伤关节变形的治愈和治疗方法。非类固醇抗炎药(NSAID)通常被用来减轻疼痛。
另一个实例是骨质疏松症，其中目前仅有的被FDA批准在美国使用的药剂是预防骨损坏的抗再吸收剂。雌激素替代疗法是抗再吸收剂的一个实例。其他实例包括阿仑膦酸盐(alendronate)(福善美(Fosamax)-二膦酸盐抗再吸收剂)、利塞膦酸盐(risedronate)(安妥良(Actonel)-双膦酸盐抗再吸收剂)、雷洛昔芬(raloxifene)(易维特(Evista)-选择性雌激素受体调节剂(SERM))、降钙素(鲑鱼降钙素(Calcimar)-激素)以及甲状旁腺激素/特立帕肽(teriparatide)(骨稳(Forteo)-人激素甲状旁腺激素的合成版，该激素帮助调节钙代谢)。
双膦酸盐如阿仑膦酸盐和利塞膦酸盐永久结合骨的表面并且干扰破骨细胞活性。这允许这些成骨细胞超过再吸收的速率。最常见的副作用是恶心、腹痛和松散的肠运动。然而，据报道阿仑膦酸盐还引起食道刺激和炎症，并且在一些情况下引起食道溃疡。利塞膦酸盐与阿仑膦酸盐在化学上不同并且具有较小的引起食道刺激的可能性。然而，某些食物、钙、铁补充剂、维生素和矿物质或含钙、镁或铝的抗酸剂可减少利塞膦酸盐的吸收，从而导致失去有效性。
雷洛昔芬和其他SERMS(如他莫昔芬(Tamoxifen))的最常见副作用是热潮红。然而，已显示雷洛昔芬和其他激素替代疗法可增加血凝块的风险，包括深静脉血栓形成和肺栓塞、心血管疾病和癌症。
降钙素在增加骨密度和加强骨方面不如雌激素和其他抗再吸收剂有效。注射型或鼻用喷雾降钙素的常见副作用是恶心和面红。患者可以发展鼻腔刺激、流鼻涕或鼻出血。可注射降钙素可以引起注射部位处局部皮肤发红、皮疹和面红。
展示涉及骨重建的若干病症或疾病状态之间联系的情况是使用FDA首次批准治疗佩吉特氏病(Paget's disease)的依替膦酸盐(乙哚乙酸二钠(Didronel))。佩吉特氏病是特征在于无序且加速的重建骨从而导致骨虚弱和疼痛的一种骨疾病。乙哚乙酸二钠已按‘超说明书用药(off-label)’使用并且在一些研究中显示可增加患有已建立的骨质疏松症的绝经后妇女的骨密度。还发现它有效于预防需要长期类固醇药剂(如泼尼松(Prednisone)或可的松(Cortisone))的患者中的骨丢失。然而，高剂量乙哚乙酸二钠或连续使用乙哚乙酸二钠可以引起称为骨软化症的另一种骨疾病。像骨质疏松症一样，骨软化症可以导致弱骨，骨折的风险增加。因为骨软化症问题和尚且缺乏关于减小骨骨折速率的足够研究，美国FDA尚没有批准将乙哚乙酸二钠用于治疗骨质疏松症。
骨质疏松症疗法主要集中于减小骨丢失速率的抗再吸收药物，但新兴疗法在增加骨矿物质密度而不是仅维持它或减缓它的恶化方面显示出前景。骨质疏松症的早期管道主要由新治疗类别中的候选药物组成，具体是组织蛋白酶K抑制剂、骨保护素和钙阻滞剂以及新型双膦酸盐。这些药物中的一些是其中基于更深刻地理解骨生物学来开发利用基因组程序的新型药物并且从长期来看具有改变骨病症治疗面貌的潜力的实例。
本发明具体地涉及适用于向人给药的抗Siglec-15抗体。本发明还具体地涉及包含人IgG1恒定区的氨基酸的抗Siglec-15抗体(例如，包括人源化抗体、嵌合抗体或非人源化抗体)。在一些情况下，本发明的抗体和抗原结合片段可以结合对人Siglec-15蛋白独特并且不存在于其他物种的相应Siglec-15蛋白中(例如，不存在于Siglec-15直向同源物或假定直向同源物中)的一个表位。在其他情况下，本发明的抗体和抗原结合片段可以结合对人Siglec-15蛋白和小鼠Siglec-15蛋白共同的一个表位。而在其他情况下，本发明的抗体和抗原结合片段可以结合对人Siglec-15和其他直向同源物或假定直向同源物共同的一个表位(参见例如，Angata(安格塔)等人，2007)。
本发明描述了特异于Siglec-15的抗体用于诊断、预后和治疗(包括预防)癌症或骨丢失(例如，与骨相关疾病相关联或与破骨细胞分化或活性增加相关联的严重或过度骨丢失)的用途。具体地说，本发明涉及抗Siglec-15抗体用于抑制破骨细胞的分化和/或用于抑制骨再吸收的用途。本发明还涉及这些抗体用于诊断、预防和治疗其中破骨细胞活性增加的其他不同类型疾病的用途。
唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素(Siglec)是具有与唾液酸相互作用能力的免疫球蛋白(Ig)超家族的成员(McMillan(麦克米伦)和Crocker(克洛克尔)，2008；克洛克尔等人，2007)。有若干Siglec族成员均共享特定的结构特征，具体地说，显现出一个结合唾液酸的氨基末端V-组Ig结构域和一个可变数量的C2-组Ig结构域。这些膜受体通常以高度特异性方式表达并且许多这些家族成员在造血细胞中表达(麦克米伦和克洛克尔，2008)。这些蛋白质被认为促进细胞-细胞相互作用、介导信号传导并且通过识别聚糖来调节免疫功能(克洛克尔等人，2007)。唾液酸是典型地位于细胞表面上的复合糖缀合物末端处的九碳糖。它们可以附着至各种各样的蛋白质和脂质上(麦克米伦和克洛克尔，2008)。
Siglec-15是最近描述的与Siglec-14具有高同源性的Siglec家族成员之一(安格塔等人，2007)。这些作者报道该Siglec-15优先结合唾液酸Tn(sialylTn)结构并且它与DAP12和DAP10相互作用。这些相互作用的功能意义尚不可知，但是已提出Siglec-15可能具有一种激活功能(安格塔等人，2007)。尽管对Siglec-15在哺乳动物中的潜在作用有了这些初步了解，但是当将其序列鉴定为用于发现新型破骨细胞分化调节剂的筛选的一部分时，才促成了在理解该蛋白质的生物功能方面的重要进展(Sooknanan(苏库兰)等人2007)。在此专利申请中，显示出在破骨细胞生成的一个小鼠模型中由RNA干扰引起的Siglec-15转录物削减导致了响应于RANKL治疗的前体分化的明显减少。在人破骨细胞中发现类似结果。此外，在此披露中呈现的这些研究还显示，在细胞膜处的Siglec-15定位是它在破骨细胞分化中的功能所必需的。此外，一个最近出版物显示在表面糖缀合物的末端处存在唾液酸是适当破骨细胞分化所需要的并且可能对破骨细胞前体细胞的融合是重要的(Takahata(高畑)等人，2007)。这个最近的观察结果在唾液酸结合与Siglec-15在分化破骨细胞中的表达之间建立了一种直接的功能联系，并且强烈表明Siglec-15在破骨细胞前体的早期分化程序中起作用。
因此，Siglec-15的表达谱、它在破骨细胞分化过程中的强可诱导性、它在膜表面处的定位以及它的结构特征均有助于用单克隆抗体靶向细胞表面处的这种蛋白质的可行性。靶向破骨细胞的基于单克隆抗体的疗法的仅其他实例是地诺单抗(denosumab)，一种特异于RANKL的人单克隆抗体(Ellis(埃利斯)等人2008)。本发明涉及抗Siglec-15抗体或抗原结合片段作为破骨细胞分化和/或骨再吸收的阻断剂在检测或治疗骨丢失中的用途，尤其是在骨相关的疾病背景下或在增加的破骨细胞分化或活性的背景下。本发明还涉及抗体或抗原结合片段在检测或治疗癌症中的用途。
发明概述
本发明涉及有用于治疗(包括预防)、检测和诊断骨丢失或癌症的抗体和抗原结合片段以及试剂盒。具体地涵盖人源化的抗Siglec-15抗体。
本发明的抗体或抗原结合片段可有用于治疗骨丢失或骨再吸收。
这些抗体和抗原结合片段还可具体地有用于检测分化的破骨细胞或正经历分化的破骨细胞。这些抗体和抗原结合片段可另外有用于检测和诊断骨丢失。本发明的抗体或抗原结合片段还可有用于治疗骨丢失。
这些抗体和抗原结合片段还可具体地有用于检测或诊断表达Siglec-15的癌细胞以及具体地具有Siglec-15高表达的癌症。这些抗体和抗原结合片段可进一步具体地有用于检测卵巢癌、肾癌、中枢神经系统癌症、前列腺癌、黑素瘤、乳癌、肺癌或结肠癌。本发明的抗体或抗原结合片段可进一步有用于治疗卵巢癌、肾癌、中枢神经系统癌症、前列腺癌、黑素瘤、乳癌、肺癌或结肠癌。
本发明的抗体或抗原结合片段可结合Siglec-15(SEQ ID NO.:2)的氨基酸20至259或一种Siglec-15变体(例如，与SEQ ID NO.:12具有至少80％序列一致性的变体，包括例如SEQ ID NO.:4)的相应区。更具体地说，本发明的抗体或抗原结合片段可结合Siglec-15(SEQ ID NO.:2)的氨基酸49至165或一种Siglec-15变体(例如，与SEQ ID NO.:12具有至少80％序列一致性的变体，包括例如SEQ ID NO.:4)的相应区。本发明的抗体或抗原结合片段包括可结合对人Siglec-15独特的一个表位的那些，该表位包括例如包含位于SEQ ID NO.:2的位置99上的精氨酸(R99)的一个表位。
该抗体或抗原结合片段可能够抑制该多肽的破骨细胞分化活性和/或骨再吸收。
在此应理解，相比小鼠Siglec-15更优选结合人Siglec-15的抗体可在抑制人破骨细胞的分化或活性上比抑制小鼠破骨细胞更有效。结合存在于人Siglec-15中而不存在于小鼠Siglec-15中的一个表位的抗体可抑制人破骨细胞的分化或活性而不抑制小鼠破骨细胞的分化或活性。食蟹猴的Siglec-15蛋白与人Siglec-15氨基酸的Siglec-15蛋白是非常类似的。因此可在猴中或使用分离自猴的细胞来测试抗Siglec-15抗体的效力。因此，可取决于该抗体的特异性(例如，针对人、猴和/或小鼠Siglec-15)改编效力测定。
根据本发明的一个实施例，该抗体或抗原结合片段可干扰该多肽促进破骨细胞分化和/或骨再吸收的能力。根据本发明的另一个实施例，该抗体或抗原结合片段可干扰该多肽促进肿瘤生长的能力。
本发明的抗体或抗原结合片段可能够干扰(抑制)破骨细胞前体细胞分化成分化的破骨细胞。
根据本发明，该抗体或抗原结合片段可以是例如一种多克隆抗体、一种单克隆抗体、一种嵌合抗体、一种人源化抗体、一种人抗体、一种杂交抗体或其一种片段。
本发明涵盖的抗体的具体实例包括以下这类抗体：具有包含一个人源化的可变结构域的至少一个免疫球蛋白链(轻链或重链)，而其他可变结构域可以是非人源化的(例如，小鼠可变结构域)，从而产生一种杂交抗体。本发明涵盖的抗体的其他实例包括具有包含一个人源化的可变结构域的重链和轻链免疫球蛋白链的抗体。
本发明的其他具体实施例包括一种人源化抗体，其中已经再引入非人氨基酸(例如，来自小鼠抗体配对物的一种或多种氨基酸)。
因此，本发明提供一种能够特异性结合Siglec-15的非人亲本抗体(例如，小鼠抗体)的人源化抗体。
在一个实施例中，杂交抗体或其片段可例如包含一种非人抗体的一个轻链可变区和一种人源化抗体的一个重链可变区。
在另一个实施例中，杂交抗体或其片段可例如包含一种非人抗体的一个重链可变区和一种人源化抗体的一个轻链可变区。
本发明的人源化抗体或杂交抗体可包含一个重链可变区，该重链可变区可包括一种天然人抗体的非人互补决定区氨基酸残基和人框架区氨基酸残基；以及一个互补轻链。
本发明的人源化抗体或杂交抗体可包含一个轻链可变区，该轻链可变区可包括一种天然人抗体的非人互补决定区氨基酸残基和人框架区氨基酸残基；以及一个互补重链。
术语“杂交抗体”是指包含至少一个人源化或人重链或轻链可变区(对Siglec-15具有亲和力)和至少一个非人重链或轻链可变区(例如来自小鼠、大鼠、兔)的抗体。
被选择用于人源化非人亲本抗体的天然人抗体可包含一个可变区，该可变区具有与该非人亲本抗体的一个(建模的)可变区类似(可重叠)的三维结构。因此，该人源化抗体或杂交抗体在具有与该非人亲本抗体类似的三维结构方面有较大的机会。
根据本发明，该人源化抗体或杂交抗体轻链的这些人框架区氨基酸残基是来自一个天然人抗体轻链框架区。被选择用于人源化目的的该天然人抗体的轻链框架区可例如与该非人亲本抗体的一个轻链框架区具有至少70％一致性。优选地，被选择用于人源化目的的该天然人抗体可在它的轻链互补决定区中具有与该非人亲本抗体的一个轻链互补决定区相同数量或大致上相同数量的氨基酸。
在本发明的其他实施例中，该人源化抗体或杂交抗体轻链的这些人框架区氨基酸残基是来自一个天然人抗体轻链框架区，该天然人抗体轻链框架区与该非人亲本抗体的该轻链框架区具有至少70％、75％、80％、85％一致性(或更多)。
还根据本发明，该人源化抗体或杂交抗体重链的这些人框架区氨基酸残基是来自一个天然人抗体重链框架区，该天然人抗体重链框架区与该非人亲本抗体的一个重链框架区具有至少70％一致性。优选地，被选择用于人源化目的的该天然人抗体可在它的重链互补决定区中具有与该非人亲本抗体的一个重链互补决定区相同数量或大致上相同数量的氨基酸。
在本发明的其他实施例中，该人源化抗体或杂交抗体重链的这些人框架区氨基酸残基是来自一个天然人抗体重链框架区，该天然人抗体重链框架区与该非人亲本抗体的该重链框架区具有至少70％、75％、80％、85％一致性。
在本发明的一个实施例中，该人源化抗体或杂交抗体的该重链可变区可因此包含至少一个非人互补决定区。
可替代地，在本发明的其他实施例中，该人源化抗体或杂交抗体的该重链可变区可包含至少两个非人互补决定区或甚至三个非人互补决定区。
在本发明的一个另外实施例中，该轻链可变区可包含至少一个非人互补决定区。
可替代地，在本发明的又另外实施例中，该轻链可变区包含至少两个非人互补决定区或甚至三个非人互补决定区。
因此，该人源化抗体可有利地包含该非人抗体的所有六个CDR。在二价人源化抗体的情况下，所有十二个CDR均可来自该非人抗体。
恒定区或其片段可来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4并且尤其来自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一个更具体的实施例中，该恒定区可来自IgG2(例如，人IgG2)。在一个优选实施例中，该恒定区可来自IgG1(例如，人IgG1)。
该轻链的恒定区可以是λ恒定区或κ恒定区。
可特别有用的抗原结合片段包括例如FV(scFv)、Fab、Fab'或(Fab')2。
该抗体或抗原结合片段可在或从一种分离的哺乳动物细胞(除了杂交瘤细胞以外)中产生或在一种杂交瘤细胞中产生。分离的哺乳动物细胞的一个示例性实施例是人细胞。
在本发明的一个方面中，本发明的抗体或抗原结合片段可干扰(抑制)人破骨细胞前体细胞分化成分化的人破骨细胞。
在一个示例性实施例中，本发明的抗体或抗原结合片段可干扰(抑制)原代人破骨细胞前体细胞分化成分化的人破骨细胞。
本发明的抗体和抗原结合片段还可用来通常靶向表达或过度表达Siglec-15的细胞，包括骨细胞和乳癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌和肾癌细胞以及黑素瘤细胞和中枢神经系统的癌细胞。
更具体地说，这些抗体和抗原结合片段可用来靶向正经历分化的破骨细胞。
本发明在其一个方面中提供一种可能够特异性结合SEQ ID NO:2的抗体或抗原结合片段(例如，分离的或大致上纯化的)。
因此，本发明涵盖对SEQ ID NO:2具有特异性的诊断性和/或治疗性抗体或抗原结合片段。本发明还涵盖与本发明的抗体具有相同表位特异性的抗体或抗原结合片段。一种候选抗体可通过确定它是否将结合在此描述的这些抗体所结合的表位和/或通过执行与已知结合该表位的抗体或抗原结合片段的竞争测定来进行鉴定。
因此，在另一方面本发明提供一种能够与在此描述的该抗体或抗原结合片段竞争的分离的抗体或抗原结合片段。
在另外方面中，本发明提供使用本发明的抗体或抗原结合片段治疗的方法和检测的方法。
术语“抗体”指完整抗体、单克隆抗体或多克隆抗体。术语“抗体”还涵盖多特异性抗体如双特异性抗体。人抗体通常由各自包含可变区和恒定区的两条轻链和两条重链构成。该轻链可变区包含3个CDR，它们在此鉴定为由框架区侧接的CDRL1、CDRL2和CDRL3。该重链可变区包含3个CDR，它们在此鉴定为由框架区侧接的CDRH1、CDRH2和CDRH3。
如在此所用，术语“抗原结合片段”是指保留结合抗原(例如，SEQ IDNO:2或其变体)的能力的抗体的一个或多个片段。已显示抗体的抗原结合功能可以由完整抗体的片段执行。涵盖于术语抗体的“抗原结合片段”内的结合片段的实例包括(i)Fab片段，一种由VL、VH、和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，一种包含由二硫桥联在铰链区连接的两个Fab片段的双价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward(沃德)等人，(1989)Nature(自然)341:544-546)；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)，例如VH CDR3。另外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由独立基因编码，但是使用重组方法，可以将它们通过能够使这两个结构域形成为单条多肽链的合成性接头连接，在该单条多肽链中VL区和VH区配对以形成单价分子(称作单链Fv(scFv)；参见例如Bird(布德)等人(1988)Science(科学)242:423-426；和Huston(休斯顿)等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院院报)85:5879-5883)。这类单链抗体也意在涵盖于术语抗体的“抗原结合片段”内。此外，这些抗原结合片段包括结合结构域免疫球蛋白融合蛋白，这些蛋白包括：(i)融合至免疫球蛋白铰链区多肽的结合结构域多肽(如重链可变区、轻链可变区、或经过接头肽融合至轻链可变区的重链可变区)、(ii)融合至铰链区的免疫球蛋白重链CH2恒定区、以及(iii)融合至CH2恒定区的免疫球蛋白重链CH3恒定区。可通过用丝氨酸残基替代一个或多个半胱氨酸残基来修饰该铰链区，以便防止二聚化。这类结合结构域免疫球蛋白融合蛋白进一步披露于US 2003/0118592和US 2003/0133939中。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并且以与完整抗体相同的方式针对有用性来筛选这些片段。
典型的抗原结合位点由可变区组成，这些可变区是由一个轻链免疫球蛋白和一个重链免疫球蛋白的配对形成。这些抗体可变区的结构是非常一致的并且显示非常相似的结构。这些可变区典型地由相对同源的以称作互补决定区(CDR)的3个高变区间插的框架区(FR)组成。抗原结合片段的总体结合活性经常由CDR的序列决定。这些FR经常在CDR的三个维度的正确定位和对齐方面起作用以获得最佳抗原结合。
本发明的抗体和/或抗原结合片段可源自例如小鼠、大鼠或任何其他哺乳动物或源自其他来源，如通过重组DNA技术。
这些抗体或抗原结合片段可在骨丢失治疗上具有治疗用途。
激素消融疗法(用停止特定激素产生的药物治疗)由于骨丢失而增加骨折的风险。用于患有乳癌的妇女的辅助激素疗法涉及抗雌激素药(例如，他莫昔芬)和芳香酶抑制剂，已显示这些抗雌激素药和芳香酶抑制剂由于雌激素压制而加速骨丢失并且增加骨折风险。另外，许多患前列腺癌的男性在他们的癌症进展时使用雄激素剥夺疗法(ADT)(例如，促性腺激素释放激素[GnRH]激动剂)进行治疗。GnRH激动剂抑制睾酮产生，所述睾酮充当前列腺癌细胞的生长因子。然而，这种治疗也导致骨质量减小，从而由于骨质疏松症而增加骨折的风险。因此，本发明的抗体或抗原结合片段可在与癌症治疗相关联的骨丢失的治疗上具有治疗用途。
这些抗体或抗原结合片段还可在癌症治疗上具有治疗用途。在一个示例性实施例中，这些抗体或片段可在癌症治疗诱导的骨丢失上具有治疗用途。在另一个示例性实施例中，这些抗体或片段可在与骨疾病相关联的骨丢失上具有治疗用途，这些骨疾病例如为其中存在破骨细胞的骨降解活性增加的病状。在某些情况下，这些抗体或抗原结合片段可与表达SEQ ID NO:2的细胞相互作用并且通过介导ADCC诱导免疫反应。在其他情况下，这些抗体和片段可阻断SEQ ID NO:2与它天然配体的相互相用。在又其他情况下，这些抗体和片段可诱导该蛋白质的内化和/或该蛋白质的降解。
本发明的抗体或抗原结合片段可与另一种药物一起(例如，同时、依次)给药，该另一种药物有用于治疗骨丢失、骨再吸收或有用于治疗与骨丢失或骨再吸收相关联的疾病。
能够抑制骨丢失的抗体和抗原结合片段已描述于在2011年4月14日的WO 2011/041894下公开的国际申请号PCT/CA 2010/001586和在2007年2月13日的WO 2007/093042下公开的PCT/CA 2007/000210，这些专利的全部内容通过引用结合在此。
抗体缀合物
虽然并不总是必需的，但是出于检测或治疗目的，本发明的抗体或抗原结合片段可与一个可检测部分(即出于检测或诊断目的)或与一个治疗性部分(出于治疗目的)缀合。
出于检测目的，一个未缀合的抗体(初级抗体)可用于结合抗原并且可添加带有一个可检测部分并能够结合该初级抗体的二级抗体。然而，如上所指示，该抗SIGLEC 15抗体可与一个可检测标记缀合并且因此二级抗体可以不是必需的。
“可检测部分”是通过光谱的、光化学的、生物化学的、免疫化学的、化学的和/或其他物理学手段可检测的部分。可检测部分可使用本领域中众所周知的方法与本发明的抗体及其抗原结合片段直接和/或间接(例如经过键联，如不限于DOTA或NHS键联)偶联。可使用各种各样的可检测部分，其中该选择取决于所需要的灵敏度、缀合简易性、稳定性需求以及可获得的仪器。适合的可检测部分包括但不限于荧光标记、放射性标记(例如不限于125I、In111、Tc99、I131以及包括用于PET扫描仪的正电子发射同位素等)、核磁共振活性标记、发光标记、化学发光标记、发色团标记、酶标记(例如并且不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)、量子点和/或纳米颗粒。可检测部分可引起和/或产生可检测信号，从而允许检测到来自该可检测部分的信号。
在本发明的另一个示例性实施例中，该抗体或其抗原结合片段可与一个治疗性部分(例如药物、细胞毒性部分)偶联(修饰)。
在一些情况下，出于治疗目的，一个未缀合的抗体可本身能够螯合抗原，可阻断该抗原与另一个结合配偶体之间的重要相互作用，可募集效应子细胞等。然而，如上所指示，该抗体可与一个治疗性部分缀合。
在一个示例性实施例中，这些抗体和抗原结合片段可包含一种化学治疗剂或细胞毒性剂。例如，这些抗体和抗原结合片段可缀合至该化学治疗剂或细胞毒性剂。此类化学治疗剂或细胞毒性剂包括但不限于钇-90、钪-47、铼-186、碘-131、碘-125以及本领域技术人员所认可的许多其他化学治疗剂或细胞毒性剂(例如镥(例如Lu177)、铋(例如Bi213)、铜(例如Cu67))。在其他情况下，该化学治疗剂或细胞毒性剂可包含特别是本领域技术人员所已知的5-氟尿嘧啶、阿霉素(adriamycin)、伊立替康(irinotecan)、奥利他汀类(auristatins)、紫杉烷类(taxanes)、假单胞菌内毒素(pseudomonasendotoxin)、蓖麻毒素(ricin)、卡奇霉素(calicheamicin)以及其他毒素。示例性细胞毒性剂可具体包含能够杀死非增殖细胞的一种药剂(agent)。
本发明的抗体或抗原结合片段可尤其与靶向DNA的药剂缀合。靶向DNA的药剂的示例性实施例包括例如烷化剂如多卡米星(duocarmycin)和多卡米星衍生物，如阿多来新(adozelesin)、比折来新(bizelesin)、卡折来新(carzelesin)等。靶向DNA的药剂的其他示例性实施例包括例如卡奇霉素、埃斯波霉素(esperamicin)和衍生物(参见例如披露于美国专利号5,264,586、5,108,192、4,970,198、5,037,651、5,079,233、4,675,187、4,539,203、4,554,162、4,837,206和US 2007213511中的化合物，每个文件的全部内容通过引用结合在此)。
本发明的一个具体实施例包括例如与多卡米星缀合的在此披露的抗体或抗原结合片段。本发明的另一个具体实施例包括例如与卡奇霉素缀合的在此披露的抗体或抗原结合片段。
可替代地，为了进行本发明的方法，并且如在本领域中所知，可将本发明的抗体或抗原结合片段(缀合的或未缀合的)与一种第二分子(例如，二级抗体等)组合使用，该第二分子能够特异性地结合本发明的抗体或抗原结合片段并且可带有一个所希望的可检测的、诊断性或治疗性的部分。
抗体的药物组合物及其用途
本发明还涵盖这些抗体(缀合的或未缀合的)的药物组合物。该药物组合物可包含一种抗体或一种抗原结合片段并且还可含有一种药学上可接受的载体。
本发明的其他方面涉及一种组合物，该组合物可包含在此描述的该抗体或抗原结合片段以及一种载体。
本发明的又其他方面涉及在此描述的该分离的抗体或抗原结合片段在治疗或诊断骨疾病或癌症中的用途。
除了活性成分之外，药物组合物可含有药学上可接受的载体(这些载体包括水、PBS、盐溶液、明胶、油、醇类)以及促进活性化合物加工成药学上可使用的制剂的其他赋形剂和助剂。在其他情况下，此类制剂可以是灭菌的。
如在此所使用，“药物组合物”通常包含治疗有效量的药剂连同药学上可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载体。如在此所使用的“治疗有效量”是指对于给定病状和给药方案而言提供治疗效果的量。此类组合物是液体或冻干的或以另外的方式干燥的配制品并且包含：具有不同缓冲内容物(例如，Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、pH和离子强度的稀释剂；预防吸附至表面的添加剂，如白蛋白或明胶；洗涤剂(例如，吐温(Tween)20、吐温80、普朗尼克(Pluronic)F68、胆汁酸盐)。增溶剂(例如甘油、聚乙二醇)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、焦亚硫酸钠)、防腐剂(例如硫柳汞、苯甲醇、对羟基苯甲酸酯)、増量物质或张度调节剂(例如乳糖、甘露醇)、聚合物(例如聚乙二醇)与蛋白质的共价附接、与金属离子的络合、或材料的结合，所述材料的结合为：该材料结合在聚合化合物如聚乳酸、聚乙醇酸、水溶胶等的微粒制剂中或微粒制剂上或结合在脂质体、微乳液、胶束、单层或多层囊泡、红细胞血影或原生质球上。此类组合物可影响物理状态、溶解度、稳定性、体内释放速率以及体内清除速率。控制释放或持续释放组合物包括在亲脂性储库(例如，脂肪酸、蜡、油)中的配制品。本发明还涵盖用聚合物(例如，泊洛沙姆(poloxamer)或泊洛沙胺(poloxamine))包被的微粒组合物。本发明的组合物的其他实施例结合微粒形式、保护性包衣、蛋白酶抑制剂或渗透促进剂以用于不同的给药途径，包括经肠胃外、肺、鼻、口、阴道、直肠的途径。在一个实施例中，该药物组合物是经肠胃外、癌旁、经粘膜、透皮、肌内、静脉内、皮内、皮下、腹膜内、心室内、颅内以及瘤内给药的。
此外，如在此所使用的“药学上可接受的载体”或“药用载体”是本领域中已知的，并且包括但不限于0.01-0.1M或0.05M磷酸盐缓冲液或0.8％盐水。另外，此类药学上可接受的载体可以是水溶液或非水溶液、混悬液和乳液。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油类如橄榄油以及可注射有机酯类如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或混悬液，包括盐水和缓冲的介质。肠胃外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸化林格氏液或不挥发性油。静脉内媒介物包括流体和营养补充物、电解质补充物，如基于林格氏右旋糖的那些等。也可存在防腐剂和其他添加剂，例如像抗微生物剂、抗氧化剂、整理剂(collating agent)、惰性气体等。
对于任何化合物，可在细胞培养测定中或在动物模型如小鼠、大鼠、兔、狗或猪中初步估算治疗有效剂量。还可使用动物模型来确定浓度范围和给药途径。然后可使用此种信息来确定针对在人类中给药的有用剂量和途径。这些技术是本领域技术人员众所周知的，并且治疗有效剂量是指改善症状或病状的活性成分的量。治疗功效和毒性可通过标准药物程序在细胞培养物中或用实验性动物，如通过计算并对比ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)和LD50(对50％群体具致死性的剂量)统计来测定。可将以上所述的任何治疗组合物应用至对此种治疗有需要的任何受试者，包括但不限于哺乳动物，如狗、猫、牛、马、兔、猴以及人。
可通过任何数目的途径给予在本发明中利用的药物组合物，这些途径包括但不限于经口、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、透皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下或直肠的方式。
本发明的药物组合物可进一步包含例如选自下组的至少一个药物成员，该组由以下各项组成：双膦酸盐、活性维生素D3、降钙素及其衍生物、激素制剂如雌二醇、SERM(选择性雌激素受体调节剂)、依普黄酮(ipriflavone)、维生素K2(四烯甲萘醌(menatetrenone))、钙制剂、PTH(甲状旁腺激素)制剂、非类固醇抗炎剂、可溶性TNF受体制剂、抗TNF-α抗体或这些抗体的功能片段、抗PTHrP(甲状旁腺激素相关的蛋白质)抗体或这些抗体的功能片段、IL-1受体拮抗剂、抗IL-6受体抗体或这些抗体的功能片段、抗RANKL抗体或这些抗体的功能片段以及OCIF(破骨细胞发生抑制因子)。
出于本披露的目的，术语“治疗”是指治疗性治疗和防治性或预防性措施两者，其中目的是为了预防或减缓(减轻)靶向的病理性病状或病症。有治疗需要的那些包括已经患有该病症的那些以及倾向于患有该病症的那些或有待预防该病症的那些。
这些抗体或抗原结合片段可在不同骨丢失或癌症的治疗上具有治疗用途。在一个示例性实施例中，这些抗体或片段可在与骨疾病相关联的骨丢失上具有治疗用途，这些骨疾病例如为其中存在破骨细胞的骨降解活性增加的病状。
在某些情况下，这些抗Siglec-15抗体和片段可与表达Siglec-15的细胞相互作用，这些细胞如破骨细胞或破骨细胞前体。在某些情况下，这些抗体或抗原结合片段可与表达SEQ ID NO:2的细胞相互作用并且通过介导ADCC诱导免疫反应。在其他情况下，这些抗体和片段可阻断SEQ ID NO:2与它天然配体的相互相用。
这些抗Siglec-15抗体或抗原结合片段可在不同骨相关疾病背景下的骨丢失治疗上具有治疗用途，这些疾病包括但不限于：骨质疏松症、骨质减少、骨软化症、甲状旁腺功能亢进、甲状腺功能减退、甲状腺功能亢进、性腺功能减退症、甲状腺毒症、全身性肥大细胞增多症、成人型低磷酸酯酶症、肾上腺皮质功能亢进、成骨不全、佩吉特氏病、库兴氏病/综合征、特纳氏综合征、戈谢病、埃-当二氏综合征、马方氏综合征、门克斯综合征、范科尼氏综合征、多发性骨髓瘤、高钙血症、低钙血症、关节炎、牙周病、软骨病(包括维生素D依赖性I型和II型以及x连锁低血磷佝偻病)、骨成纤维发生不全、骨硬化病症如致密性成骨不全症和由巨噬细胞介导的炎性过程引起的损害。在优选的实施例中，这些抗体和片段在其中普遍存在严重骨丢失的病状、特别是向骨的转移性癌症中具有治疗用途。
这些抗Siglec-15抗体及其抗原结合片段可在由不同骨重建病症引起的或与不同骨重建病症相关联的癌症或骨丢失的治疗上具有治疗用途。具体地说，这些抗Siglec-15抗体和其中的免疫功能片段在其中破骨细胞是活动过强并且促使骨表面降解的病状中具有治疗用途。在某些情况下，这些抗Siglec-15抗体及其抗原结合片段可与针对相同病状给定的其他治疗组合而同时给予。因此，可与本领域技术人员已知的抗再吸收剂(例如，双膦酸盐)一起给予这些抗体。另外，可与以下各项一起给予这些抗体：抗有丝分裂剂(例如紫杉烷类)、基于铂的药剂(例如顺铂)、DNA损伤剂(例如多柔比星(Doxorubicin))以及本领域技术人员已知的其他细胞毒性疗法。在其他情况下，这些抗Siglec-15抗体和其中的免疫功能片段可与其他治疗性抗体一起给予。这些包括但不限于靶向RANKL、EGFR、CD-20和Her2的抗体。
通过下文给出的非限制性详细说明，本发明的另外范围、适用性和优点将变得清楚。然而，应该理解，同时指示本发明的示例性实施例的此详细说明仅通过参考附图以举例的方式给出。
附图简要说明
图1A.鼠25D8可变结构域的分子模型。用箭头将CDR环指示为轻链中的L1、L2和L3以及重链中的H1、H2和H3。
图1B.鼠25E9可变结构域的分子模型。用箭头将CDR环指示为轻链中的L1、L2和L3以及重链中的H1、H2和H3。
图2A.25D8抗体的可变轻链(VL)结构域的小鼠、人源化和选择的人框架序列的序列比对。这些CDR用浅灰色高亮显示并且对应于SEQ ID NO.53、54和55。
图2B.25D8抗体的可变重链(VH)结构域的小鼠、人源化和选择的人框架序列的序列比对。这些CDR用浅灰色高亮显示并且对应于SEQ ID NO.56、57和58。
图3A.25E9抗体的可变轻链(VL)结构域的小鼠、人源化和选择的人框架序列的序列比对。这些CDR用浅灰色高亮显示并且对应于SEQ ID NO.47、48和49。
图3B.25E9抗体的可变重链(VH)结构域的小鼠、人源化和选择的人框架序列的序列比对。这些CDR用浅灰色高亮显示并且对应于SEQ ID NO.50、51和52。
图4A.人源化全长IgG225D8(SEQ ID NO.:23和27)和嵌合全长IgG2(SEQ ID NO.:21和25)25D8抗体的组装序列。
图4B.人源化全长IgG225E9(SEQ ID NO.:7和29)和嵌合全长IgG225E9(SEQ ID NO.:5和30)抗体的组装序列。
图5A.小鼠和人源化25D8IgG2抗体的SPR色谱图。
图5B.小鼠和人源化25E9IgG2抗体的SPR色谱图。
图6A示出25E9小鼠轻链可变结构域与25E9人源化轻链可变结构域变体1之间的比对。通过使用ClustalW2程序进行比对；其中“*”意指该列中的残基在比对的所有序列中是一致的，“:”意指已观察到保守取代并且“.”意指观察到半保守取代。(Larkin M.A.(拉金M.A.)等人，(2007)ClustalW和ClustalX第2版本，生物信息学(Bioinformatics)200723(21):2947-2948)。这些比对用来产生列于SEQ ID NO.:33、34和35中的共有序列。
图6B示出25E9小鼠重链可变结构域与25E9人源化重链可变结构域变体1之间的比对。通过使用ClustalW2程序完成比对；其中“*”意指该列中的残基在比对的所有序列中是一致的，“:”意指已观察到保守取代并且“.”意指观察到半保守取代。(Larkin M.A.(拉金M.A.)等人，(2007)ClustalW和ClustalX第2版本，生物信息学(Bioinformatics)200723(21):2947-2948)。这些比对用来产生列于SEQ ID NO.:36、37和38中的共有序列。
图7A示出25D8小鼠轻链可变结构域与25D8人源化轻链可变结构域之间的比对。通过使用ClustalW2程序完成比对；其中“*”意指该列中的残基在比对的所有序列中是一致的，“:”意指已观察到保守取代并且“.”意指观察到半保守取代。(Larkin M.A.(拉金M.A.)等人，(2007)ClustalW和ClustalX第2版本，生物信息学(Bioinformatics)200723(21):2947-2948)。这些比对用来产生列于SEQ ID NO.:39、40和41中的共有序列。
图7B示出25D8小鼠重链可变结构域与25D8人源化重链可变结构域之间的比对。通过使用ClustalW2程序完成比对；其中“*”意指该列中的残基在比对的所有序列中是一致的，“:”意指已观察到保守取代并且“.”意指观察到半保守取代。(Larkin M.A.(拉金M.A.)等人，(2007)ClustalW和ClustalX第2版本.生物信息学(Bioinformatics)200723(21):2947-2948)。这些比对用来产生列于SEQ ID NO.:42、43和44中的共有序列。
图8.指示25E9以浓度依赖性方式特异性结合在细胞表面上表达的人Siglec-15的流式细胞计量术结果。
图9.示出25E9能够抑制人破骨细胞的分化和再吸收活性的图像。
图10A.示出在抗Siglec-15抗体存在下内化生物素化的Siglec-15的蛋白质印迹。
图10B.通过共聚焦显微镜进行的Siglec-15内吞作用的表征。
图10C.示出Siglec-15蛋白水平的蛋白质印迹
图10D.示出在存在或不存在抗Siglec-15抗体情况下RANKl刺激之后在RAW264.7中的Siglec-15蛋白表达的蛋白质印迹。
图11.由Siglec-15群集诱导的细胞信号传导分析。在4C下，用初级抗体(抗Siglec-15或对照人IgG)处理对照(C)或分化的(Δ)RAW264.7细胞，接着在37C下用二级交联抗体处理指定的时间。用指定的抗体通过蛋白质印迹法分析总裂解液。
图12.示出人源化25E9L1H1IgG1(左图)与人源化25E9L1H1IgG2(右图)之间的结合参数差异的SPR色谱图。固定纯化的Fc-Siglec-15(150RU)并且在指定浓度(100nM、33.3nM、11.1nM、3.70nM和1.23nM)下注射人源化25E9。用1:1比率拟合这些曲线。
图13.示出与人源化25E9IgG2相比，人源化25E9L1H1IgG1用于抑制破骨细胞分化的效力增加的代表性图像。
图14A.人源化全长IgG125D8(SEQ ID NO.:23和46)和嵌合全长IgG125D8(SEQ ID NO.:21和45)抗体的组装序列。
图14B.人源化全长IgG125E9(SEQ ID NO.:7和13)和嵌合全长IgG125E9(SEQ ID NO.:5和11)抗体的组装序列。
图15.指示25E9-ADC以与未缀合抗体非常类似的方式特异性结合在细胞表面上表达的人Siglec-15的流式细胞计量术结果。
图16.示出25E9-ADC对成熟多核破骨细胞的存活曲线。与未缀合的25E9非常不同，该反应强烈抑制破骨细胞活性而不影响它们的存活。
图17示出TRAP染色的破骨细胞的图像，说明25E9-ADC对成熟多核破骨细胞的细胞毒性作用。与未缀合的25E9非常不同，该反应强烈抑制破骨细胞活性而不影响它们的存活。对照ADC对破骨细胞没有作用。
发明详细说明
由本发明所涵盖的变体抗体或抗原结合片段是可包含一种插入、一种缺失或一种氨基酸取代(保守性或非保守性)的那些。这些变体可去除它的氨基酸序列中的至少一个氨基酸残基并且在该氨基酸残基的位置中插入一个不同的残基。
用于取代诱变的感兴趣的位点包括高变区(CDR)，但也涵盖了在框架区中或甚至在恒定区中的修饰。可以通过将来自以下列出的组(1到6组)中之一的(CDR、可变链、抗体等的)氨基酸用相同组的另一个氨基酸交换而产生保守性取代。
通常，与框架区中的突变相比而言这些CDR中的突变可对抗体或抗原结合片段的抗原结合活性具有更大的影响。可进行框架区中的突变以增加抗体的“人性”。由本发明所涵盖的变体抗体或抗原结合片段是具有与在此提出的那些大致上一致的抗原结合能力(包括类似、一致或稍微小于)或具有比在此提出的那些抗原结合能力更好的那些。
保守性取代的其他示例性实施例示于表1A中“优选的取代”标题之下。如果这样的取代导致所不希望的特性，则可引入在表1A中命名为“示例性取代”的、或如下进一步参考氨基酸类别所述的更多实质性改变，并且筛选产物。
本领域中已知的是变体可通过取代诱变来产生，并且保留本发明的多肽的生物活性。这些变体去除它的氨基酸序列中的至少一个氨基酸残基并且在该氨基酸残基的位置中插入一个不同的残基。例如，用于取代诱变的感兴趣的一个位点可包括这样一个位点：在该位点中从不同物种获得的特定残基是一致的。鉴定为“保守性取代”的取代的实例示于表1A中。如果这样的取代导致所不希望的改变，则可引入在表1A中命名为“示例性取代”的、或如下进一步参考氨基酸类别所述的其他类型的取代，并且筛选产物。
通过选择取代来完成在功能或免疫身份方面的实质性修饰，这些取代在它们对维持以下各项的作用方面明显不同：(a)在取代区域中的多肽主链的结构，例如，如片层或螺旋构象。(b)分子在靶位点处的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。基于共同的侧链特性将天然存在的残基分组：
(第1组)疏水性：正亮氨酸、甲硫氨酸(Met)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)
(第2组)中性亲水性：半胱氨酸(Cys)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)
(第3组)酸性：天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)
(第4组)碱性：天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、组氨酸(His)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)
(第5组)影响链取向的残基：甘氨酸(Gly)、脯氨酸(Pro)；以及
(第6组)芳香族：色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)
非保守性取代将需要将这些类别之一的一个成员用另一个交换。
表1A.氨基酸取代
变体抗体或抗原结合片段的氨基酸序列中的变异可包括氨基酸添加、缺失、插入、取代等、主链或侧链中一个或多个氨基酸的一种或多种修饰或向一个或多个氨基酸(侧链或主链)添加一个基团或另一个分子。
与原始抗体或抗原结合片段氨基酸序列相比，变体抗体或抗原结合片段可在它的氨基酸序列中具有大致上的序列相似性和/或序列一致性。两种序列之间的相似性程度是基于一致性(一致的氨基酸)和保守性取代的百分比。
通常，使用Blast2序列程序(Tatiana A.Tatusova(塔蒂亚娜A.塔苏索伐)、Thomas L.Madden(托马斯L.马登)(1999)，“Blast 2sequences-a new tool forcomparing protein and nucleotide sequences(Blast 2序列-一种用于比较蛋白质和核苷酸序列的新工具)”，FEMS Microbiol Lett.(微生物学快报)174:247-250)，使用默认设置(即blastp程序，BLOSUM62矩阵(开放空位11和延伸空位罚分1；空位x下降(dropoff)50、期望值10.0、字长3))和激活的过滤器来在此确定可变链之间的相似性和一致性的程度。
一致性百分比因此可指示与原始肽相比是一致的并且可占据相同或相似位置的氨基酸。
相似性百分比可指示与在相同或相似位置上的原始肽相比是一致的氨基酸和被保守性氨基酸取代替换的那些。
因此，本发明的变体(即类似物)(包括VL变体、VH变体、CDR变体、抗体变体、多肽变体等)包括可与原始序列或原始序列的一部分具有至少70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的那些变体。
根据本发明，SEQ ID NO.:2变体包括具有与SEQ ID NO.:2的氨基酸49-165或与氨基酸20至259至少80％一致的一个区的多肽。SEQ ID NO.:2的变体还包括与SEQ ID NO.:2具有至少80％序列一致性的多肽。SEQ IDNO.:2的优选变体包括能够抑制破骨细胞分化和/或骨再吸收的那些。可例如通过在体外或体内测试它们的破骨细胞分化和/或骨再吸收活性来鉴定此类变体。在此描述可用来测试Siglec-15变体的活性的方法或测定的实例并且提供于国际申请号PCT/CA 2007/001134中。应该理解，用来进行在此描述的测定的破骨细胞可例如优选地源自人，还可以源自小鼠。SEQ ID NO.:2的优选变体可包括例如其中保留了包含SEQ ID NO.:2的精氨酸99(R99)的表位的那些变体。
变体的示例性实施例是与在此描述的序列具有至少81％序列一致性并且与原始序列或原始序列的一部分具有81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相似性的那些变体。
变体的其他示例性实施例是与在此描述的序列具有至少82％序列一致性并且与原始序列或原始序列的一部分具有82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相似性的那些变体。
变体的另外示例性实施例是与在此描述的序列具有至少85％序列一致性并且与原始序列或原始序列的一部分具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相似性的那些变体。
变体的其他示例性实施例是与在此描述的序列具有至少90％序列一致性并且与原始序列或原始序列的一部分具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相似性的那些变体。
变体的另外的示例性实施例是与在此描述的序列具有至少95％序列一致性并且与原始序列或原始序列的一部分具有95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相似性的那些变体。
变体的又另外的示例性实施例是与在此描述的序列具有至少97％的序列一致性并且与原始序列或原始序列的一部分具有97％、98％、99％或100％序列相似性的那些变体。
出于简明的目的，本申请人在此提供了表1B，该表1B示出由本发明所涵盖的并且包含指定的序列一致性％和序列相似性％的单独变体的示例性实施例。每个“X”应理解为定义一种给定的变体。
如在此所使用，术语“一致的”意指一个序列与另一个序列共享100％序列一致性。
如在此所使用，术语“大致上一致的”意指一个序列与另一个序列或另一个序列的一部分共享70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性。
本发明涵盖包含与在此描述的序列的至少70％一致性(包括70％与99％之间的任何范围)的CDR、轻链可变区、重链可变区、轻链、重链、抗体和/或抗原结合片段。
本发明涉及单克隆抗体用于靶向存在于不同骨相关疾病中的破骨细胞的用途，在该疾病中由于这些破骨细胞的活性增加而观察到严重的骨丢失。为了将这些抗体定向至这些破骨细胞，必须进行在细胞的细胞表面处表达的破骨细胞特异性抗原的鉴定。存在可供鉴定细胞特异性抗原使用的若干技术，并且用来鉴定用RANKL处理的分化破骨细胞中的Siglec-15的方法，即称为mRNA的基于消减转录的扩增(STAR)的创新发现平台，描述于公开的专利申请号PCT/CA 2007/000210中。
人破骨细胞STAR文库的分析产生编码分泌蛋白和细胞表面蛋白的许多基因。称为0326-SL109的这些之一含有编码具有328个氨基酸的多肽的开放阅读框，该多肽对应于由987个碱基对的cDNA编码的SEQ ID NO:2，该cDNA的核苷酸序列示于SEQ ID NO:1中。搜索公众可用的数据库显示，0326-SL109核苷酸序列与称为CD33抗原样3(CD33L3)的人基因的核苷酸序列一致。后来发现CD33L3是唾液酸结合蛋白的Siglec家族的一个成员并且基于与其他Siglec的同源性重新命名为Siglec-15(克洛克尔等人，2007)。基于此信息，分离小鼠直向同源物，测序并且发现在氨基酸水平上与人序列大约85％一致。SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4分别示出鼠Siglec-15的cDNA和多肽的序列。生物信息学分析预测了一种I型膜锚定蛋白，该蛋白将它的功能结构域呈现到细胞外区室。如同其他Siglec序列一样，氨基末端信号肽(位于SEQ ID NO:2的氨基酸1与19之间)将该蛋白质靶向至细胞膜，并且经过位于羧基末端(位于SEQ ID NO:2的氨基酸261与283之间)的单个跨膜螺旋将最终加工的蛋白质锚定至膜上。V-组Ig结构域位于SEQ ID NO:2的氨基酸49与165之间，而C2-组Ig结构域位于SEQ ID NO:2的氨基酸178与244之间。
先前的发现(Sooknanan(苏库兰)等人2007)确立：编码人Siglec-15的转录物响应于RANKL而明显上调。在RNA宏阵列上进行此确定，该RNA宏阵列含有来自不同人PBMNC供体的若干不同人破骨细胞分化实验的斑点总RNA样品。此外，这些研究(Sooknanan(苏库兰)等人2007)显示在具有30个人正常组织的大组中仅在一个正常组织中表达Siglec-15转录物，从而表明Siglec-15基因表达的非常高的破骨细胞特异性。使用更灵敏的方法如半定量RT-PCR，在许多破骨细胞样品中在RANKL处理的一天内刺激了Siglec-15mRNA的表达，从而表明在细胞融合开始之前在破骨细胞前体细胞中早期表达该基因。最终，通过半定量RT-PCR评价Siglec-15的组织表达谱并且发现仅在单个正常人组织中表达，从而验证了Sooknanan(苏库兰)等人的宏阵列结果。总之，这些表达结果强调了本申请人的发现方法在鉴定靶标能力上的实力，如通过Siglec-15举例说明，这些靶标高度局限于分化的破骨细胞。
基于Siglec-15在破骨细胞分化早期的表达、它在正常组织中的有限的表达以及Siglec-15在破骨细胞活性中的关键生物作用，选择Siglec-15作为用于开发检测、预防和治疗骨再吸收或骨相关疾病(如癌症诱导的骨丢失、骨质疏松症、与癌症治疗相关联的骨丢失)的单克隆抗体的治疗性靶标。
因此，提供了用于靶向Siglec-15的各种抗Siglec-15抗体及其免疫功能片段，如嵌合的和人源化的单克隆抗体、抗体片段、单链抗体、结构域抗体以及具有一个抗原结合区的多肽。
根据本发明，这些抗体或其抗原结合片段可具体地能够抑制破骨细胞分化。
进一步根据本发明，这些抗体或其抗原结合片段可能够抑制破骨细胞形成。
还根据本发明，这些抗体或其抗原结合片段可能够抑制破骨细胞活性。
进一步根据本发明，这些抗体或其抗原结合片段可能够抑制骨再吸收(例如，破骨细胞的骨再吸收活性)。
因此，在一个方面中，本发明提供一种能够特异性结合Siglec-15的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段可具有与SEQ ID NO.:6至少80％一致的一个轻链可变区和/或与SEQ ID NO.:12至少80％一致的一个重链可变区。该抗体或其抗原结合片段还可包含与SEQ ID NO.:6或SEQ IDNO.:12相比的至少一个氨基酸取代。
在另一个方面中，本发明还提供一种抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段可具有与SEQ ID NO.:22至少80％一致的一个轻链可变区和/或与SEQ ID NO.:26至少80％一致的一个重链可变区。该抗体或其抗原结合片段还可包含与SEQ ID NO.:22或SEQ ID NO.:26相比的至少一个氨基酸取代。
根据本发明，该氨基酸取代可以是出现在天然人抗体中的相应位置上的一个氨基酸。
根据本发明的一个实施例，该氨基酸取代可在互补决定区(CDR)之外。
根据本发明的一个实施例，该抗体的该氨基酸取代可例如位于该轻链可变区中。
根据本发明的一个另外实施例，该抗体或其抗原结合片段可包含至少两个或至少三个氨基酸取代。此类氨基酸取代可位于相同可变区中或可位于相异可变区中。
进一步根据本发明，该抗体或其抗原结合片段可在轻链可变区和/或重链可变区中包含例如从一至二十五个氨基酸取代。更具体地说，该抗体或其抗原结合片段在它的轻链可变区中可具有例如从一至二十二个氨基酸取代，在它的重链可变区中具有从一至二十五个氨基酸取代。
具体涵盖了包含SEQ ID NO.:6的互补决定区和SEQ ID NO.:12的互补决定区并且包含人抗体的框架氨基酸的抗体或抗原结合片段，例如像人源化抗体。
具体涵盖了包含SEQ ID NO.:22的互补决定区和SEQ ID NO.:26的互补决定区并且包含人抗体的框架氨基酸的抗体或抗原结合片段。
本发明的示例性实施例包括例如具有在SEQ ID NO.:33中所列出的轻链可变结构域(一般25E9轻链可变结构域(共有序列1))的抗体或其抗原结合片段。
DIVMTQXXXSXPVTPGEXXSISCRSTKSLLHSNGNTYLYWXLQXPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTXFTLXISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGGGTKXEIK(SEQ ID NO.:33)；
其中由X标识的至少一个氨基酸可以是与列于SEQ ID NO.:6(小鼠VL)中的多肽中的相应氨基酸相比的一个氨基酸取代。该氨基酸取代可以是例如保守性的或非保守性的。根据本发明，该氨基酸取代可以是保守性的。
本发明的另一个示例性实施例包括例如具有在SEQ ID NO.:34中所列出的轻链可变结构域(一般25E9轻链可变结构域(共有序列2))的抗体或其抗原结合片段。
DIVMTQXa1Xa2Xa3SXa4PVTPGEXa5Xa6SISCRSTKSLLHSNGNTYLYWXa7LQXa8PGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTXa9FTLXa10ISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGGGTKXa11EIK(SEQ ID NO.:34)；
其中由X标识的至少一个氨基酸可以是与列于SEQ ID NO.:6(小鼠VL)中的多肽中的相应氨基酸相比的一个氨基酸取代并且；
其中Xa1、Xa4、Xa7、Xa8、Xa10和Xa11可各自独立地是与SEQIDNO.6相比的保守性氨基酸取代；
其中Xa2、Xa5、Xa6可各自独立地是与SEQIDNO.6相比的半保守性氨基酸取代；
其中Xa3可以是P或L；并且
其中Xa9可以是A或D。
本发明的又另一个示例性实施例包括例如具有在SEQ ID NO.:35中所列出的轻链可变结构域(一般25E9轻链可变结构域(共有序列3))的抗体或其抗原结合片段。
DIVMTQXa1Xa2Xa3SXa4PVTPGEXa5Xa6SISCRSTKSLLHSNGNTYLYWXa7LQXa8PGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTXa9FTLXa10ISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGGGTKXa11EIK(SEQ ID NO.:35)；
其中由X(包括Xa1至Xa11)标识的至少一个氨基酸可以是与列于SEQID NO.:6(小鼠VL)中的多肽中的相应氨基酸相比的一个氨基酸取代并且
其中Xa1可以是A或S；
其中Xa2可以是A或P；
其中Xa3可以是P或L；
其中Xa4可以是疏水性氨基酸(例如，V或L)；
其中Xa5可以是S或P；
其中Xa6可以是疏水性氨基酸(例如，V或A)；
其中Xa7可以是芳香族氨基酸(例如F或Y)；
其中Xa8可以是碱性氨基酸(例如，R或K)；
其中Xa9可以是A或D；
其中Xa10可以是碱性氨基酸(例如，R或K)；并且
其中Xa11可以是疏水性氨基酸(例如，L或V)。
在一个另外实施例中，本发明包括例如具有在SEQ ID NO.:36中所列出的重链可变结构域(一般25E9重链可变结构域(共有序列1))的抗体或其抗原结合片段。
EIQLQQSGXEXXXPGXSVXXSCKASGYTFTDYDMHWVXQXPXXGLEWXGTIDPETGGTAYNQKFKGXXTXTADXSXXTAYMELSSLXSEDXAVYYCTSFYYTYSNYDVGFAYWGQGTLVTVSX(SEQ ID NO.:36)；
其中由X标识的至少一个氨基酸可以是与列于SEQ ID NO.:12(小鼠VH)中的多肽中的相应氨基酸相比的一个氨基酸取代。该氨基酸取代可以是例如保守性的或非保守性的。根据本发明，该氨基酸取代可以是保守性的。
本发明的又一个另外实施例包括例如具有在SEQ ID NO.:37中所列出的重链可变结构域(一般25E9重链可变结构域(共有序列2))的抗体或其抗原结合片段。
EIQLQQSGXb1EXb2Xb3Xb4PGXb5SVXb6Xb7SCKASGYTFTDYDMHWVXb8QXb9PXb10Xb11GLEWXb12GTIDPETGGTAYNQKFKGXb13Xb14TXb15TADXb16SXb17Xb18TAYMELSSLXb19SEDXb20AVYYCTSFYYTYSNYDVGFAYWGQGTLVTVSXb21(SEQ ID NO.:37)；
其中由X(包括Xb1至Xb21)标识的至少一个氨基酸可以是与列于SEQID NO.:12(小鼠VH)中的多肽中的相应氨基酸相比的一个氨基酸取代并且
其中Xb2、Xb4、Xb5、Xb7、Xb8、Xb9、Xb11、Xb12、Xb13、b15、Xb16、Xb17、Xb18、Xb20和Xb21可各自独立地是与SEQIDNO.12相比的保守性氨基酸取代；
其中Xb1、Xb6、Xb14可各自独立地是与SEQIDNO.:12(小鼠VH)相比的半保守性氨基酸取代；
其中Xb3可以是V或K；
其中Xb10可以是V或G；并且
其中Xb19可以是T或R。
本发明的另一个实施例包括例如具有在SEQ ID NO.:38中所列出的重链可变结构域(一般25E9重链可变结构域(共有序列3))的抗体或其抗原结合片段。
EIQLQQSGXb1EXb2Xb3Xb4PGXb5SVXb6Xb7SCKASGYTFTDYDMHWVXb8QXb9PXb10Xb11GLEWXb12GTIDPETGGTAYNQKFKGXb13Xb14TXb15TADXb16SXb17Xb18TAYMELSSLXb19SEDXb20AVYYCTSFYYTYSNYDVGFAYWGQGTLVTVSXb21(SEQ ID NO.:38)；
其中由X(包括Xb1至Xb21)标识的至少一个氨基酸可以是与列于SEQID NO.:12(小鼠VH)中的多肽中的相应氨基酸相比的一个氨基酸取代并且；
其中Xb1可以是疏水性氨基酸(例如，V或A)；
其中Xb2可以是疏水性氨基酸(例如，L或V)；
其中Xb3可以是V或K；
其中Xb4可以是碱性氨基酸(例如，R或K)；
其中Xb5可以是A或S；
其中Xb6可以是T或K；
其中Xb7可以是疏水性氨基酸(例如，L或V)；
其中Xb8可以是碱性氨基酸(例如，K或R)；
其中Xb9可以是T或A；
其中Xb10可以是V或G；
其中Xb11可以是碱性氨基酸(例如，H或Q)；
其中Xb12可以是疏水性氨基酸(例如，I或M)；
其中Xb13可以是碱性氨基酸(例如，K或R)；
其中Xb14可以是疏水性氨基酸(例如，A或V)；
其中Xb15可以是疏水性氨基酸(例如，L或I)；
其中Xb16可以是碱性氨基酸(例如，R或K)；
其中Xb17可以是中性亲水性氨基酸(例如，S或T)；
其中Xb18可以是中性亲水性氨基酸(例如，T或S)；
其中Xb19可以是T或R；
其中Xb20可以是中性亲水性氨基酸(例如，S或T)；并且
其中Xb21可以是A或S。
本发明的其他示例性实施例包括例如具有在SEQ ID NO.:39中所列出的轻链可变结构域(一般25D8轻链可变结构域(共有序列1))的抗体或其抗原结合片段。
DIVMTQXXXSXPVTXGXXASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSXSGSGTDFTLXISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKXEIK(SEQ ID NO.:39)；
其中由X标识的至少一个氨基酸可以是与列于SEQ ID NO.:22(小鼠VL)中的多肽中的相应氨基酸相比的一个氨基酸取代。该氨基酸取代可以是例如保守性的或非保守性的。根据本发明，该氨基酸取代可以是保守性的。
本发明的又另一个示例性实施例包括例如具有在SEQ ID NO.:40中所列出的轻链可变结构域(一般25D8轻链可变结构域(共有序列2))的抗体或其抗原结合片段。
DIVMTQXc1Xc2Xc3SXc4PVTXc5GXc6Xc7ASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSXc8SGSGTDFTLXc9ISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKXc10EIK(SEQ ID NO.:40)；
其中由X标识的至少一个氨基酸可以是与列于SEQ ID NO.:22(小鼠VL)中的多肽中的相应氨基酸相比的一个氨基酸取代并且
其中Xc1、Xc3、Xc9和Xc10可各自独立地是与SEQ ID NO.:22相比的保守性氨基酸取代；
其中Xc2、Xc7、Xc8可各自独立地是与SEQ ID NO.:22相比的半保守性氨基酸取代；
其中Xc4可以是N或L；
其中Xc5可以是L或P；并且
其中Xc6可以是T或E。
本发明的一个另外实施例包括例如具有在SEQ ID NO.:41中所列出的轻链可变结构域(一般25D8轻链可变结构域(共有序列3))的抗体或其抗原结合片段。
DIVMTQXc1Xc2Xc3SXc4PVTXc5GXc6Xc7ASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSXc8SGSGTDFTLXc9ISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKXc10EIK(SEQ ID NO.:41)；
其中由X标识的至少一个氨基酸可以是与列于SEQ ID NO.:22(小鼠VL)中的多肽中的相应氨基酸相比的一个氨基酸取代并且
其中Xc1可以是A或T；
其中Xc2可以是A或P；
其中Xc3可以是F或L；
其中Xc4可以是N或L；
其中Xc5可以是L或P；
其中Xc6可以是T或E；
其中Xc7可以是S或P；
其中Xc8可以是S或G；
其中Xc9可以是碱性氨基酸(例如，R或K)；并且
其中Xc10可以是疏水性氨基酸(例如，L或V)。
本发明的又一个另外实施例包括例如具有在SEQ ID NO.:42中所列出的重链可变结构域(一般25D8重链可变结构域(共有序列1))的抗体或其抗原结合片段。
QVQXQQXGAEXXKPGXSVKXSCKASGYTFTSYWMHWVXQXPGQGLEWXGLINPSNARTNYNEKFNTXXTXTXDKSXSTAYMXLSSLXSEDXAVYYCARGGDGDYFDYWGQGTTXTVSS(SEQ ID NO.:42)；
其中由X标识的至少一个氨基酸可以是与列于SEQ ID NO.:26(小鼠VH)中的多肽中的相应氨基酸相比的一个氨基酸取代。该氨基酸取代可以是例如保守性的或非保守性的。根据本发明，该氨基酸取代可以是保守性的。
在一个另外实施例中，本发明包括例如具有在SEQ ID NO.:43中所列出的重链可变结构域(一般25D8重链可变结构域(共有序列2))的抗体或其抗原结合片段。
QVQXd1QQXd2GAEXd3Xd4KPGXd5SVKXd6SCKASGYTFTSYWMHWVXd7QXd8PGQGLEWXd9GLINPSNARTNYNEKFNTXd10Xd11TXd12TXd13DKSXd14STAYMXd15LSSLXd16SEDXd17AVYYCARGGDGDYFDYWGQGTTXd18TVSS(SEQ ID NO.:43)；
其中由X标识的至少一个氨基酸可以是与列于SEQ ID NO.:26(小鼠VH)中的多肽中的相应氨基酸相比的一个氨基酸取代并且；
其中Xd1、Xd3、Xd5、Xd6、Xd7、Xd9、Xd10、Xd12、Xd14、Xd15、Xd17、Xd18可各自独立地是与SEQ ID NO.:26相比的保守性氨基酸取代；
其中Xd2、Xd11、Xd13可各自独立地是与SEQ ID NO.:26相比的半保守性氨基酸取代；
其中Xd4可以是V或K；
其中Xd8可以是R或A；并且；
其中Xd16可以是T或R。
在又一个另外实施例中，本发明包括例如具有在SEQ ID NO.:44中所列出的重链可变结构域(一般25D8重链可变结构域(共有序列3))的抗体或其抗原结合片段。
QVQXd1QQXd2GAEXd3Xd4KPGXd5SVKXd6SCKASGYTFTSYWMHWVXd7QXd8PGQGLEWXd9GLINPSNARTNYNEKFNTXd10Xd11TXd12TXd13DKSXd14STAYMXd15LSSLXd16SEDXd17AVYYCARGGDGDYFDYWGQGTTXd18TVSS(SEQ ID NO.:44)；
其中由X标识的至少一个氨基酸可以是与列于SEQ ID NO.:26(小鼠VH)中的多肽中的相应氨基酸相比的一个氨基酸取代并且；
其中Xd1可以是疏水性氨基酸(例如，V或L)；
其中Xd2可以是P或S；
其中Xd3可以是疏水性氨基酸(例如，L或V)；
其中Xd4可以是V或K；
其中Xd5可以是A或S；
其中Xd6可以是疏水性氨基酸(例如，L或V)；
其中Xd7可以是碱性氨基酸(例如，K或R)；
其中Xd8可以是R或A；
其中Xd9可以是疏水性氨基酸(例如，I或M)；
其中Xd10可以是碱性氨基酸(例如，K或R)；
其中Xd11可以是疏水性氨基酸(例如，A或V)；
其中Xd12可以是疏水性氨基酸(例如，L或I)；
其中Xd13可以是疏水性氨基酸(V或A)；
其中Xd14可以是中性亲水性氨基酸(例如，S或T)；
其中Xd15可以是Q或E；
其中Xd16可以是T或R。
其中Xd17可以是中性亲水性氨基酸(例如，S或T)；并且
其中Xd18可以是疏水性氨基酸(L或V)。
术语“人源化抗体”涵盖完全人源化抗体(即，框架是100％人源化的)和部分人源化抗体(例如，至少一个可变结构域含有来自人抗体的一个或多个氨基酸，而其他氨基酸是非人亲本抗体的氨基酸)。典型地“人源化抗体”含有非人亲本抗体(例如，小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物等)的CDR和与天然人抗体或人抗体共有序列的那些框架一致的框架。在这种情况下，那些“人源化抗体”表征为完全人源化的。“人源化抗体”还可含有一个或多个氨基酸取代，该一个或多个氨基酸取代与该人抗体或人抗体共有序列的那些不对应。此类取代包括例如回复突变(例如，再引入非人氨基酸)，这些回复突变可保存抗体特征(例如，亲和力、特异性等)。此类取代通常在框架区中。“人源化抗体”可任选地还包含一个恒定区(Fc)的至少一部分，该恒定区典型地是人抗体的恒定区。典型地，“人源化抗体”的该恒定区与人抗体的恒定区一致。
当然，本发明涵盖了具有与在此描述的氨基酸序列一致的一个氨基酸序列的任何抗体、其抗原结合部分或抗体部分(轻链或重链可变区)，无关它是否经过人源化技术、杂交瘤技术、转基因小鼠技术或其他技术来获得。
在此应该理解，本发明的抗体的框架氨基酸可与天然人抗体的那些框架氨基酸80％至100％(例如，85％至100％；90％至100％、95％至100％)一致。通常，当一个框架氨基酸不与天然抗体的相应氨基酸一致时，此种氨基酸可保持与原始氨基酸(例如，小鼠氨基酸)一致。
如在此所使用，术语“从一至二十五(1至25)”包括每一个单独的值和范围，例如像1、2、3并且高达至25；1至25；1至24、1至23、1至22、1至21、1至20、1至19、1至18；1至17；1至16；1至15等；2至25、2至24、2至23、2至22、2至21、2至20；2至19；2至18；2至17等；3至25、3至24、3至23、3至22、3至21、3至20；3至19、3至18等；4至25、4至24、4至23、4至22、4至21、4至20；4至19；4至18；4至17；4至16等；5至25、5至24、5至23、5至22、5至21、5至20；5至19、5至18、5至17等；等。
同样，其他范围例如像“从一至二十二(1至22)”包括每一个单独的值和范围，例如像1、2、3并且高达至22；1至22、1至21；1至20、1至19、1至18、1至17、1至16、1至15、1至14、1至13；1至12；1至11；1至10等；2至22、2至21、2至20、2至19、2至18、2至17、2至16、2至15；2至14；2至13；2至12等；3至22、3至21、3至20、3至19、3至18、3至17、3至16、3至15；3至14；3至13等；4至22、4至21、4至20、4至19、4至18、4至17、4至16、4至15；4至14；4至13；4至12；4至11等；5至22、5至21、5至20、5至19、5至18、5至17、5至16、5至15；5至14；5至13；5至12等；等。
在本发明的一个更具体的实施例中，在源自SEQ ID NO.:6的轻链可变区中可以进行的氨基酸取代的数量可以是例如从1至11个氨基酸取代。
在本发明的又一个更具体的实施例中，在源自SEQ ID NO.:12的重链可变区中可以进行的氨基酸取代的数量可以是例如从1至21个氨基酸取代。在一些情况下，当考虑SEQ ID NO.:12时，具有至少三个氨基酸取代可以是适用的。
在本发明的一个另外更具体的实施例中，在源自SEQ ID NO.:22的轻链可变区中可以进行的氨基酸取代的数量可以是例如从1至10个氨基酸取代。
在本发明的又一个另外更具体的实施例中，在SEQ ID NO.:26的重链可变区中可以进行的氨基酸取代的数量可以是例如从1至18个氨基酸取代。
根据本发明的一个实施例，这些酸取代可例如在轻链可变区中。
根据本发明的一个实施例，这些氨基酸取代可例如在重链可变区中。
抗体或抗原结合片段因此可具有一个轻链可变区，该轻链可变区具有与SEQ ID NO.:6或SEQ ID NO.:22相比高达至二十二个氨基酸取代；并且可具有一个重链可变区，该重链可变区具有与SEQ ID NO.:12或SEQ ID NO.:26相比高达至二十五个氨基酸取代。在此应该理解，当该抗体或抗原结合片段具有两个轻链可变区和两个重链可变区时，这些轻链可变区中的每一个可独立地具有高达至二十个氨基酸取代并且这些重链可变区中的每一个可具有高达至二十个氨基酸取代。
如在此所论述，这些氨基酸取代可以是保守性的或非保守性的。在一个示例性实施例中，这些氨基酸取代可以是保守性的。
在此应该了解，本发明的抗体或抗原结合片段如果希望可具有一个轻链可变区和/或重链可变区，该轻链可变区和/或重链可变区与SEQ ID NO.:6、SEQ ID NO.:12、SEQ ID NO.:22和/或SEQ ID NO.:26相比显示一个缺失。这样的缺失可例如发现于轻链可变区和/或重链可变区的氨基或羧基末端处。
本发明的抗体或抗原结合片段的另一个示例性实施例包括例如具有一个轻链可变区的抗体或抗原结合片段，该轻链可变区可包含SEQ ID NO.:33、SEQ ID NO.:34、SEQ ID NO.:35、SEQ ID NO.:8或SEQ ID NO.:10中的任一个的至少90个连续氨基酸。
如在此所使用，术语“SEQ ID NO.:33的至少90个连续氨基酸”还包括术语“至少91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111或至少112个连续氨基酸”。术语“SEQ ID NO.:33的至少90个连续氨基酸”涵盖了具有发现于SEQ IDNO.:33中的至少90个连续氨基酸的任何可能序列，并且尤其是包括SEQ IDNO.:33的3个CDR的那些序列，例如像包含SEQ ID NO.:33的氨基酸6至108、5至109、13至103、14至111的序列等。
如在此所使用，术语“SEQ ID NO.:34的至少90个连续氨基酸”还包括术语“至少91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111或至少112个连续氨基酸”。术语“SEQ ID NO.:34的至少90个连续氨基酸”涵盖了具有发现于SEQ IDNO.:34中的至少90个连续氨基酸的任何可能序列，并且尤其是包括SEQ IDNO.:34的3个CDR的那些序列，例如像包含SEQ ID NO.:34的氨基酸7至109、12至104、22至112、18至112的序列等。
术语“SEQ ID NO.:35的至少90个连续氨基酸”、“SEQ ID NO.:8的至少90个连续氨基酸”或“SEQ ID NO.:10的至少90个连续氨基酸”具有相似的含义。
根据本发明，本发明的抗体或抗原结合片段可例如具有在SEQ ID NO.:8或在SEQ ID NO.:10中所列出的轻链可变区。
本发明的抗体或抗原结合片段包含(或进一步包含)例如一个重链可变区，该重链可变区可包含SEQ ID NO:36、37、38、14、16、18或20中的任一个的至少90个连续氨基酸。
如在此所使用，术语“SEQ ID NO.:36的至少90个连续氨基酸”还包括术语“至少91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111或至少123个连续氨基酸”。术语“SEQ ID NO.:36的至少90个连续氨基酸”涵盖了具有发现于SEQ IDNO.:36中的至少90个连续氨基酸的任何可能序列，并且尤其是包括SEQ IDNO.:36的3个CDR的那些序列，例如像包含SEQ ID NO.:36的氨基酸1至106、2至112、11至113、7至102的序列等。
如在此所使用，术语“SEQ ID NO.:37的至少90个连续氨基酸”还包括术语“至少91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122或至少123个连续氨基酸”。术语“SEQ ID NO.:37的至少90个连续氨基酸”涵盖了具有发现于SEQ ID NO.:37中的至少90个连续氨基酸的任何可能序列，并且尤其是包括SEQ ID NO.:37的3个CDR的那些序列，例如包含SEQ ID NO.:37的氨基酸6至109、8至113、1至102、2至105的序列等。
术语“SEQ ID NO.:38的至少90个连续氨基酸”、“SEQ ID NO.:14的至少90个连续氨基酸”、“SEQ ID NO.:16的至少90个连续氨基酸”、“SEQID NO.:18的至少90个连续氨基酸”或“SEQ ID NO.:20的至少90个连续氨基酸”具有相似的含义。
根据本发明，本发明的抗体或抗原结合片段可例如具有在SEQ IDNO.:14、16、18或20中所列出的重链可变区。
根据本发明，该抗体或抗原结合片段可包含，例如，
a)一个轻链可变区，该轻链可变区可包含SEQ ID NO.:33的至少90个连续氨基酸；和一个重链可变区，该重链可变区可包含SEQ ID NO.:36、SEQID NO.:37、SEQ ID NO.:38、SEQ ID NO.:14、SEQ ID NO.:16、SEQ ID NO.:18或SEQ ID NO.:20中的任一个的至少90个连续氨基酸；
b)一个轻链可变区，该轻链可变区可包含SEQ ID NO.:34的至少90个连续氨基酸；和一个重链可变区，该重链可变区可包含SEQ ID NO.:36、SEQID NO.:37、SEQ ID NO.:38、SEQ ID NO.:14、SEQ ID NO.:16、SEQ ID NO.:18或SEQ ID NO.:20中的任一个的至少90个连续氨基酸；
c)一个轻链可变区，该轻链可变区可包含氨基酸SEQ ID NO.:35的至少90个连续氨基酸；和一个重链可变区，该重链可变区可包含SEQ ID NO.:36、SEQ ID NO.:37、SEQ ID NO.:38、SEQ ID NO.:14、SEQ ID NO.:16、SEQ IDNO.:18或SEQ ID NO.:20中的任一个的至少90个连续氨基酸；
d)一个轻链可变区，该轻链可变区可包含SEQ ID NO.:8的至少90个连续氨基酸；和一个重链可变区，该重链可变区可包含SEQ ID NO.:36、SEQ IDNO.:37、SEQ ID NO.:38、SEQ ID NO.:14、SEQ ID NO.:16、SEQ ID NO.:18或SEQ ID NO.:20中的任一个的至少90个连续氨基酸；或
e)一个轻链可变区，该轻链可变区可包含SEQ ID NO.:10的至少90个连续氨基酸；和一个重链可变区，该重链可变区可包含SEQ ID NO.:36、SEQID NO.:37、SEQ ID NO.:38、SEQ ID NO.:14、SEQ ID NO.:16、SEQ ID NO.:18或SEQ ID NO.:20中的任一个的至少90个连续氨基酸。
根据本发明的一个更具体的实施例，该轻链可变区可包含SEQ ID NO.:8或10的至少90个连续氨基酸并且该重链可变区可包含SEQ ID NO.:14、16、18或20的至少90个连续氨基酸。
根据本发明的一个甚至更具体的实施例，该轻链可变区可如在SEQ IDNO.:8或10中所列出并且该重链可变区可如在SEQ ID NO.:14、16、18或20中所列出。
更具体地说，涵盖了包含列于SEQ ID NO.:8中的轻链可变区和列于SEQID NO.:14中的重链可变区的抗体。
本发明的抗体或抗原结合片段的其他示例性实施例是可包含一个轻链可变区的那些，该轻链可变区可包含SEQ ID No.39、40、41或24中的任一个的至少90个连续氨基酸。
如在此所使用，术语“SEQ ID NO.:39的至少90个连续氨基酸”还包括术语“至少91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111或至少112个连续氨基酸”。术语“SEQ ID NO.:39的至少90个连续氨基酸”涵盖了具有发现于SEQ IDNO.:39中的至少90个连续氨基酸的任何可能序列，并且尤其是包括SEQ IDNO.:39的3个CDR的那些序列，例如包含SEQ ID NO.:39的氨基酸6至102、11至106、1至106、3至95、5至95的序列等。
如在此所使用，术语“SEQ ID NO.:40的至少90个连续氨基酸”还包括术语“至少91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111或至少112个连续氨基酸”。术语“SEQ ID NO.:40的至少90个连续氨基酸”涵盖了具有发现于SEQ IDNO.:40中的至少90个连续氨基酸的任何可能序列，并且尤其是包括SEQ IDNO.:40的3个CDR的那些序列，例如包含SEQ ID NO.:40的氨基酸9至106、10至101、1至98、3至99、7至107的序列等。
术语“SEQ ID NO.:41的至少90个连续氨基酸”或“SEQ ID NO.:24的至少90个连续氨基酸”具有相似的含义。
根据本发明，本发明的抗体或抗原结合片段可例如具有在SEQ IDNO.:24中所列出的轻链可变区。
本发明的抗体或抗原结合片段包含(或进一步包含)例如一个重链可变区，该重链可变区可包含SEQ ID NO.:42、43、44或26中的任一个的至少90个连续氨基酸。
如在此所使用，术语“SEQ ID NO.:42的至少90个连续氨基酸”还包括术语“至少91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117或至少118个连续氨基酸”。术语“SEQ ID NO.:42的至少90个连续氨基酸”涵盖了具有发现于SEQ ID NO.:42中的至少90个连续氨基酸的任何可能序列，并且尤其是包括SEQ ID NO.:42的3个CDR的那些序列，例如像包含SEQ ID NO.:42的氨基酸6至111、1至106、2至104、5至106、10至107的序列等。
如在此所使用，术语“SEQ ID NO.:43的至少90个连续氨基酸”还包括术语“至少91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117或至少118个连续氨基酸”。术语“SEQ ID NO.:43的至少90个连续氨基酸”涵盖了具有发现于SEQ ID NO.:43中的至少90个连续氨基酸的任何可能序列，并且尤其是包括SEQ ID NO.:43的3个CDR的那些序列，例如像包含SEQ ID NO.:43的氨基酸3至107、1至115、1至110、22至116、20至115的序列等。
术语“SEQ ID NO.:44的至少90个连续氨基酸”或“SEQ ID NO.:26的至少90个连续氨基酸”具有相似的含义。
根据本发明，本发明的抗体或抗原结合片段可例如具有在SEQ IDNO.:26中所列出的重链可变区。
根据本发明，该抗体或抗原结合片段可包含，例如，
a)一个轻链可变区，该轻链可变区可包含SEQ ID NO.:39的至少90个连续氨基酸；和一个重链可变区，该重链可变区可包含SEQ ID NO.:42、SEQID NO.:43、SEQ ID NO.:44或SEQ ID NO.:26的任一个的至少90个连续氨基酸；
b)一个轻链可变区，该轻链可变区可包含SEQ ID NO.:40的至少90个连续氨基酸；和一个重链可变区，该重链可变区可包含SEQ ID NO.:42、SEQID NO.:43、SEQ ID NO.:44或SEQ ID NO.:26的任一个的至少90个连续氨基酸；
c)一个轻链可变区，该轻链可变区可包含氨基酸SEQ ID NO.:41的至少90个连续氨基酸；和一个重链可变区，该重链可变区可包含SEQ ID NO.:42、SEQ ID NO.:43、SEQ ID NO.:44或SEQ ID NO.:26的任一个的至少90个连续氨基酸或；
d)一个轻链可变区，该轻链可变区可包含SEQ ID NO.:24的至少90个连续氨基酸；和一个重链可变区，该重链可变区可包含SEQ ID NO.:42、SEQID NO.:43、SEQ ID NO.:44或SEQ ID NO.:26的任一个的至少90个连续氨基酸。
根据本发明的一个更具体的实施例，该轻链可变区可具有SEQ IDNO.:24的至少90个连续氨基酸并且该重链可变区可具有SEQ ID NO.:26的至少90个连续氨基酸。
根据本发明的一个甚至更具体的实施例，该轻链可变区可如在SEQ IDNO.:24中所列出并且该重链可变区可如在SEQ ID NO.:26中所列出。
本发明的实施例更具体地包含选自下组的抗体或抗原结合片段，该组由以下各项组成：
a.包含如在SEQ ID NO.:7中所列出的轻链和如在SEQ ID NO.:13中所列出的重链的抗体或其抗原结合片段；
b.包含如在SEQ ID NO.:7中所列出的轻链和如在SEQ ID NO.:15中所列出的重链的抗体或其抗原结合片段；
c.包含如在SEQ ID NO.:7中所列出的轻链和如在SEQ ID NO.:17中所列出的重链的抗体或其抗原结合片段；
d.包含如在SEQ ID NO.:7中所列出的轻链和如在SEQ ID NO.:19中所列出的重链的抗体或其抗原结合片段；
e.包含如在SEQ ID NO.:7中所列出的轻链和如在SEQ ID NO.:29中所列出的重链的抗体或其抗原结合片段；
f.包含如在SEQ ID NO.:7中所列出的轻链和如在SEQ ID NO.:59中所列出的重链的抗体或其抗原结合片段；
g.包含如在SEQ ID NO.:7中所列出的轻链和如在SEQ ID NO.:60中所列出的重链的抗体或其抗原结合片段；
h.包含如在SEQ ID NO.:7中所列出的轻链和如在SEQ ID NO.:61中所列出的重链的抗体或其抗原结合片段；
i.包含如在SEQ ID NO.:9中所列出的轻链和如在SEQ ID NO.:13中所列出的重链的抗体或其抗原结合片段；
j.包含如在SEQ ID NO.:9中所列出的轻链和如在SEQ ID NO.:15中所列出的重链的抗体或其抗原结合片段；
k.包含如在SEQ ID NO.:9中所列出的轻链和如在SEQ ID NO.:17中所列出的重链的抗体或其抗原结合片段；
l.包含如在SEQ ID NO.:9中所列出的轻链和如在SEQ ID NO.:19中所列出的重链的抗体或其抗原结合片段；
m.包含如在SEQ ID NO.:9中所列出的轻链和如在SEQ ID NO.:29中所列出的重链的抗体或其抗原结合片段；
n.包含如在SEQ ID NO.:9中所列出的轻链和如在SEQ ID NO.:59中所列出的重链的抗体或其抗原结合片段；
o.包含如在SEQ ID NO.:9中所列出的轻链和如在SEQ ID NO.:60中所列出的重链的抗体或其抗原结合片段；
p.包含如在SEQ ID NO.:9中所列出的轻链和如在SEQ ID NO.:61中所列出的重链的抗体或其抗原结合片段；
q.包含如在SEQ ID NO.:23中所列出的轻链和如在SEQ ID NO.:27中所列出的重链的抗体或其抗原结合片段；
r.包含如在SEQ ID NO.:23中所列出的轻链和如在SEQ ID NO.:46中所列出的重链的抗体或其抗原结合片段。
本发明的其他实施例包含选自下组的抗体或抗原结合片段，该组由以下各项组成：
a.包含如在SEQ ID NO.:5中所列出的轻链和如在SEQ ID NO.:13中所列出的重链的抗体或其抗原结合片段；
b.包含如在SEQ ID NO.:5中所列出的轻链和如在SEQ ID NO.:15中所列出的重链的抗体或其抗原结合片段；
c.包含如在SEQ ID NO.:5中所列出的轻链和如在SEQ ID NO.:17中所列出的重链的抗体或其抗原结合片段；
d.包含如在SEQ ID NO.:5中所列出的轻链和如在SEQ ID NO.:19中所列出的重链的抗体或其抗原结合片段；
e.包含如在SEQ ID NO.:5中所列出的轻链和如在SEQ ID NO.:29中所列出的重链的抗体或其抗原结合片段；
f.包含如在SEQ ID NO.:5中所列出的轻链和如在SEQ ID NO.:59中所列出的重链的抗体或其抗原结合片段；
g.包含如在SEQ ID NO.:5中所列出的轻链和如在SEQ ID NO.:60中所列出的重链的抗体或其抗原结合片段；
h.包含如在SEQ ID NO.:5中所列出的轻链和如在SEQ ID NO.:61中所列出的重链的抗体或其抗原结合片段；
i.包含如在SEQ ID NO.:7中所列出的轻链和如在SEQ ID NO.:11中所列出的重链的抗体或其抗原结合片段；
j.包含如在SEQ ID NO.:7中所列出的轻链和如在SEQ ID NO.:30中所列出的重链的抗体或其抗原结合片段；
k.包含如在SEQ ID NO.:9中所列出的轻链和如在SEQ ID NO.:11中所列出的重链的抗体或其抗原结合片段；以及
l.包含如在SEQ ID NO.:9中所列出的轻链和如在SEQ ID NO.:30中所列出的重链的抗体或其抗原结合片段。
本发明的抗体或抗原结合片段可具有如上所述的轻链可变区和/或重链可变区，并且可进一步包含一个恒定区的氨基酸，例如像人抗体恒定区的氨基酸。
在一个示例性实施例中，本发明的抗体或抗原结合片段可包含例如人IgG1恒定区。
具体涵盖了IgG1亚型的抗Siglec-15抗体，这些IgG1亚型与相应的IgG2亚型*或其他类型)相比具有例如至少10倍的活性增加。
基于IgG1的抗Siglec-15抗体的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、100倍或更多的效力增加或它的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、100倍或更多的亲和力增加可以是特别有用的。
效力或亲和力的增加可通过与具有一致或大致上一致的CDR或可变区的一种不同抗体亚型相比，基于IgG1的抗Siglec-15抗体抑制破骨细胞分化或破骨细胞活性的能力来测量。在一些情况下，可能考虑使用低至10ng/ml或100ng/ml的IgG1抗体浓度来尝试在体外抑制破骨细胞分化和/或骨再吸收。在此可应该理解，当例如与相应的基于IgG2的抗Siglec-15抗体相比时，一个更低剂量的基于IgG1的抗Siglec-15抗体可实现所希望的治疗作用。
具体涵盖的抗体包括具有一个κ轻链恒定区和一个IgG1重链恒定区的那些。
本发明的抗体和抗原结合片段包括例如具有在此描述的氨基酸序列的单克隆抗体、多克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体。具体涵盖具有在此鉴定的氨基酸序列的人抗体和人源化抗体。
在此应该理解，由a)列于SEQ ID NO.:6中的轻链可变区和列于SEQ IDNO.:12中的重链可变区或b)列于SEQ ID NO.:22中的轻链可变区和列于SEQ ID NO.:26中的重链可变区组成的抗体或其抗原结合片段的序列被认为是小鼠来源的(即，非人抗体)。
如在此所描绘，可例如通过将多个框架氨基酸取代为天然人抗体的相应氨基酸来进行非人抗体的人源化。通常以不负面影响抗原结合的方式进行取代。
根据本发明的另一个示例性实施例，抗原结合片段可例如是scFv、Fab、Fab'或(Fab')2。
实例
基于重组Siglec-15的结合测定和它们抑制人破骨细胞的分化和活性的能力的评价，选择候选前导抗体25D8和25E9用于人源化。此实验报告描述了计算机人源化程序和所得到的人源化版本的抗体。
实例1.小鼠25D8和25E9单克隆抗体的可变区的3D建模
通过同源性建模来完成此任务。通过针对PDB的blast搜索来鉴定与鼠25D8(SEQ ID NO.:22和SEQ ID NO.:26)和25E9(SEQ ID NO.:6和SEQ IDNO.:12)可变序列最类似的模板结构。为了建立小鼠25D8可变区的初始模型，使用以下模板结构(PDB代码)：3CFC用于轻链并且1NGQ用于重链。为了建立小鼠25E9可变区的初始模型，使用以下模板结构：1AE6用于轻链并且1NMC用于重链。根据鼠25D8和25E9序列，在这些模板结构上操作突变：3CFC轻链中的3个突变(所有均在CDR中)、1NGQ重链中的17个突变(3个在框架中，14个在CDR中)、1AE6轻链中的7个突变(4个在框架中、3个在CDR中)以及1NMC重链中的34个突变(17个在框架中，17个在CDR中)。CDR环并未表现出需要任何长度调节，除了每个抗体中的CDR-H3环(由1NGQ进行25D8的2-残基缺失并且由1NMC进行25E9的1-残基插入)。通过重叠对应的模板结构的重链和轻链将对应于鼠25D8和25E9可变结构域的重链和轻链的突变结构基本上组装到两链抗体结构中。通过用AMBER力场的能量最小化以及约束条件的逐步解除来首先精制组装的25D8和25E9可变结构域的所得结构，该解除的范围是从首先放松的CDR环至仅在最后阶段完全放松的框架区的主链重原子。然后通过蒙特卡罗最小化(Monte-Carlo-minimization)(MCM)构象取样精制每个抗体可变结构域结构中的CDR-H3环，其中在每次MCM循环中对CDR-H3区中的二面角取样，接着进行在CDR-H3环初始构象周围延伸的一个预定区的能量最小化。
小鼠25D8和25E9抗体的所建模可变区的表示分别在图1A和1B中给出。小鼠25D8(图1A)抗体的可变区的同源性3D模型和小鼠25E9(图1B)抗体的可变区的同源性3D模型。标记出CDR(轻链中的L1、L2、L3以及重链中的H1、H2、H3)。被人框架残基替换的小鼠框架残基指示为蓝色球模型。25E9重链中保留的小鼠残基由红色球模型表示并且被标记。
还从PDB中鉴定出与25D8和25E9可变序列各自最类似的人或人源化可变序列的结构，并且然后重叠在鼠25D8和25E9可变结构域的所建模的结构上。这帮助框架区中的侧链突变的建模，以便从所建模的鼠3D结构开始来建立人源化3D结构。
实例2.小鼠25D8和25E9氨基酸序列和所建模的结构的表征。
进行此步骤来评价人性指数、抗原接触倾向指数，以便描绘CDR、规范的残基、链间填充(packing)(VH/VL界面残基)、可变区/恒定区填充(VH/CH和VL/CL界面残基)、不常见的框架残基、潜在的N-糖基化位点和O-糖基化位点、隐蔽残基、游标区残基以及接近CDR的残基。使用互联网可获得的资源和本地软件来评定这些特性。
实例3.选择最好的人轻链和重链框架用于小鼠CDR
通过针对人种系数据库(VBASE)的本地拷贝、针对其他序列文库(Genbank和SwissProt)以及人框架共有序列组进行的标准序列同源性比较来完成这个选择。进行BLAST搜索来检索仅在框架区中具有最高同源性(因此排除CDR)同时匹配CDR环长度的序列匹配。对于25D8和25E9抗体，为重链和轻链鉴定的人框架分别对应于k2和h1类别。保留了若干高度类似的人框架序列，以便评定在用于突变的候选位置上的氨基酸变异性，以及提供适合的框架序列集合作为备用以防在人源化时的亲和力损失。
这些同源人框架序列分别与图2和图3中的鼠25D8和25E9序列进行比对。Kabat编号和抗原接触倾向得分在顶部示出。用灰色高亮显示CDR。根据CDR的接近度、表面暴露以及与配对可变结构域的接触，在序列比对下方高亮显示用于回复突变的候选残基。由箭头指示用于回复突变的初级候选位置。
实例4.鉴定可以影响构象和抗原结合的小鼠框架残基
这是标示应该被特别仔细地突变成相应人序列的氨基酸残基的一个重要步骤。这些残基代表亲和力损失情况下用于回复突变成小鼠序列的初级候选物。这是通过设计，具体地在不存在抗体-抗原复合物的实验结构情况下进行人源化的最困难且不可预测的步骤。它依赖于以一种或多种以下分类对残基的鉴定：规范的残基、CDR-H3残基、游标区残基、不常见的残基、CDR近侧残基(在内)、链间填充残基以及糖基化位点残基。此类残基可能直接或间接地影响抗原结合位点和亲和力。抗原接触倾向指数以及在每个位置处人种系数据库中的氨基酸发生还对决定某一残基是否可以安全地从小鼠序列突变至人序列是极其重要的。25D8和25E9轻链可变序列和重链可变序列的所提出的人源化序列分别在图2和图3中示出。还列出每个人源化序列与它们的供体小鼠序列和若干比对的候选受体人序列之间的框架突变的数量(括弧内以框架百分比形式给出)。还在图1、图2和图3中指示用于回复突变的突变残基和候选残基。如图可以看出，25D8和25E9抗体的轻链分别表现出需要对它们的对应提出的人源化框架进行9个和11个突变。这表示针对轻链的100％框架人源化尝试。每种抗体的重链表现出需要比它们的用于人源化的轻链大致上更多的突变，在25D8情况下18个突变并且在25E9情况下17个突变。另外，针对重链的人源化序列不完全(100％)对应于人框架序列。具体地在25E9重链情况下，所提出的框架人源化的最高水平在第一次尝试中是94％，这意味着在人源化序列中与最接近的人框架序列有5个残基不同。从25E9小鼠序列中保留这些残基中的4个的决定是基于仔细的结果序列和对比序列分析，这些分析表明如果有待在这些位置GluH1、IleH2、ThrH93和SerH94上引入突变，则由于与抗原结合CDR的接近度，存在改变抗原结合亲和力的高可能性(参见图1b)。必须指出，Glu是存在于人框架序列中的H1位置上的常见残基(参见图3)。在人源化序列中与最接近的人框架不同的第五个残基是小鼠序列中的HisH43，该HisH43被突变成人源化序列中的GlnH43(Gln是此位置上常见的而His是罕见的)。在25D8可变重链框架的人源化情况下，人源化达到99％，即，在提出的人源化序列中的框架中相对于最接近的人框架序列有一个残基不同：人源化序列中的GluH81替换了小鼠序列的GlnH81，而不是出现在最接近的人框架中的AspH81。在位置H81上突变成Glu而不是Asp的决定是基于人框架中这两个可能的取代的相对发生(参见图2)。总体上，可以得出结论，25D8抗体的人源化比25E9抗体的人源化简单。
实例5.另外的结构分析
在呈递人源化序列用于重组表达之前，另外的结构分析包括选择信号肽、选择同种型以及分析可变区/恒定区连接点处的结构相容性。此外，小鼠抗体与人源化抗体之间的链间填充和可变区/恒定区填充的对比分析表明在25D8和25E9人源化情况下，产生组合了人源化和嵌合(小鼠可变区)链，即，小鼠/小鼠(M/M)、小鼠/人源化(M/H)、人源化/小鼠(H/M)和人源化/人源化(H/H)作为轻链/重链配对的杂交抗体可以是可行的。针对25D8和25E9全长IgG2抗体的组装的人源化序列和嵌合序列分别在图4A和图4B中示出。针对25D8和25E9全长IgG1抗体的组装的人源化序列和嵌合序列分别在图12A和图12B中示出。
抗体的其他示例性实施例可例如通过将在此披露的每个轻链与在此披露的每个重链变体混合来产生。例如，可通过将分别包含25E9轻链人源化变体2可变结构域(SEQIDNO.:10)和25E9重链人源化可变结构域变体1、2、3或4(SEQ IDNO.:14、16、18或20)的轻链和重链缔合来产生抗体。具体地涵盖通过将分别包含25E9轻链人源化变体1可变结构域(SEQIDNO.:8)和25E9重链人源化可变结构域变体1、2、3或4(SEQ IDNO.:14、16、18或20)的轻链和重链缔合所产生的抗体。已选择了包含轻链人源化变体1可变结构域(SEQIDNO.:8)和重链人源化可变结构域变体1(SEQ ID NO.:14)(亦称，L1H1IgG2变体(SEQ ID NO.:7和29)或L1H1IgG1变体(SEQ IDNO.:7和13))的人源化25E9抗体用于进一步实验。然而，基于在此披露的实验，可以看出包含κ轻链恒定区和IgG1重链恒定区的抗体具有令人感兴趣的特征(例如，L1H1IgG1变体(SEQ ID NO.7和13))。
涵盖了通过将SEQ ID NO.:7的轻链与列于SEQ ID NO.13、15、17、19、29、59、60或61中的任何重链缔合或通过将SEQ ID NO.:9的轻链与列于SEQID NO.13、15、17、19、29、59、60或61中的任何重链缔合所形成的抗体或抗原结合片段。
实例6.人源化的Siglec-15抗体的结合参数的分析
通过瞬时转染产生小批量的小鼠抗体和选择的人源化或嵌合25D8IgG2抗体和人源化25E9(L1H1IgG2、L1H1IgG1、L1H2IgG1、L1H3IgG和L1H1IgG1变体)抗体，并且纯化以允许进行一些对比分析。使用表面等离子体共振(SPR)方法来测量重组Siglec-15与不同抗体的直接结合。如同ELISA方法一样，在SPR实验中使用的Siglec-15在293-6E细胞中表达为Fc-Siglec-15融合蛋白。应该指出，作为一种Fc缀合物，该蛋白质可凭借Fc区中的同源二聚体相互作用表达为二聚体。这种情况可以在不允许直接确定亲和力常数的结合过程中产生亲合力效应。另外，在抗体和Siglec-15蛋白中都存在Fc区不容许直接亲和力确定。因此，每个抗体样品的结合结果仅相对于彼此呈现。
为了进行该研究，直接使用来自嵌合(小鼠可变区)25D8IgG2、嵌合25E9IgG2、人源化25D8IgG2或人源化25E9L1H1IgG2变体的重免疫球蛋白链和轻免疫球蛋白链。为了对比，还测试了全长小鼠抗体的纯化制剂。在纯化批次的抗体情况下，对所有蛋白质样品应用大小排阻色谱法以减小制剂中的聚集体的比例。对于SPR，将Fc-Siglec-15固定在传感器芯片上并且在这些芯片上注射(流动)抗体稀释液。针对25D8和25E9抗体的代表性扫描分别在图5A和图5B中示出。
对于25D8抗体，这些扫描在小鼠、嵌合和人源化版本的抗体之间是非常类似的。这显示在此抗体的人源化过程中动力学参数没有明显改变。虽然在这些色谱图之间存在稍许差异，但鉴于在纯化的抗体与细胞上清液之间进行该比对，这是我们所预期的。
在25E9抗体的情况下，针对嵌合抗体和小鼠抗体的这些色谱图是非常类似的。对于人源化25E9L1H1IgG2变体，与其他版本相比，缔合(on)速率和解离(off)速率显示出稍微不同。这可能是由于来自细胞上清液的干扰。尽管有此差异，仍预期人源化25E9L1H1IgG2变体的实际亲和力常数与小鼠抗体的亲和力常数是非常类似的。
我们测试了人源化抗体与在所培养细胞的表面上表达的人Siglec-15相互作用的能力。使人293-6E细胞生长至大约1.5×106个细胞/毫升的细胞密度并且用编码整个人Siglec-15cDNA的表达质粒转染。二十四小时之后，收获细胞，计数并且在4C下用递增浓度的25E9的人源化IgG1变体孵育1×105个细胞1小时。在用冷PBS进行的洗涤步骤之后，检测到结合的25E9，具有缀合至FITC的抗人κ轻链IgG。将荧光标记的细胞注射到流式细胞仪中以测量完整细胞表面上的荧光信号。如在图8中所示，人源化的25E9L1H1IgG1变体以浓度依赖性方式结合表达人Siglec-15的细胞。平均KD处于低纳摩尔范围中。此外，在存在CHO细胞或293细胞中所产生的人源化25E9L1H1IgG1变体情况下，结合参数是非常类似的。作为对照，用PBS、对照IgG孵育的转染的细胞或未转染的293细胞没有产生荧光信号，从而表明Siglec-15与人源化25E9L1H1IgG1变体之间的相互作用的特异性。使用其他25E9人源化IgG1抗体变体(L1H2IgG1、L1H3IgG1、L1H4IgG1和L1H1IgG2)或使用人源化25D8IgG2抗体获得类似的结果。
实例7.抗体测试
细胞培养
为了诱导破骨细胞分化，刮掉生长于含有10％胎牛血清(Gibco)和1mM丙酮酸钠的DMEM中的小鼠RAW264.7细胞(ATCC，Manassas，VA)并且重悬在PBS中。将细胞以2x 104个细胞/平方厘米铺放在含有100ng/ml小鼠RANKL(R&D系统，Minneapolis，MN)的培养基中。允许细胞分化3天(用于免疫荧光显微术)或4天(用于所有其他实验)。根据制造商的说明，使用CD14微珠和MS柱(Miltenyi Biotec，Cologne，Germany)从正常人PBMC(AllCells，Emeryville，CA)中分离出人破骨细胞前体(CD14+外周血单核细胞(PBMC))。将细胞以3.1x 105个/平方厘米铺放在含有10％胎牛血清(HyClone)、1mM丙酮酸钠(HyClone)、25ng/ml人MCSF和30ng/ml人RANKL(R&D系统)的α-MEM(Gibco)中。允许细胞分化7天，其中在第4天更换一半培养基。
细胞刺激
对于用单一抗体进行的细胞刺激，在不同时间下裂解细胞之前将分化培养基更换为含有指定抗体浓度的新鲜生长培养基(不具有RANKL)。针对用初级抗体和二级(交联)抗体进行的刺激，将分化培养基更换为含有10ug/ml的初级抗体的冷生长培养基，并且在4C下孵育细胞20min。然后将培养基更换为含有山羊抗人IgG多克隆抗体(Jackson Immunoresearch，West Grove，PA)的温生长培养基，并且在裂解之前在37C下孵育细胞指定的时间。
破骨细胞TRAP染色和体外功能测定
为了测试抗体对破骨细胞分化和功能的作用，如上所述在含有指定浓度的抗体的培养基中诱导细胞分化。在培养四天之后通过TRAP染色使破骨细胞可视化：简而言之，将细胞固定在3.7％甲醛中、用0.2％Triton X-100/PBS透化，并且在37C下在TRAP染色缓冲液(100mM乙酸钠(pH 5.2)、50mM酒石酸钠、0.01％萘酚ASMX和0.06％耐晒红紫(Fast Red Violet))中孵育大约30min。TRAP酶在破骨细胞中生成红色反应产物。为了测试破骨细胞再吸收活性，将细胞种于涂覆有磷酸钙底物(Osteologic,BD BioSciences或OsteoAssay,Corning)的孔中并且如上所述诱导分化。7天之后，用漂白剂处理孔以去除细胞，并且通过光显微镜术观察底物再吸收的区域。能够阻断Siglec-15(在破骨细胞中或在破骨细胞前体细胞中)活性的抗体可例如显示更少的TRAP阳性多核细胞，或可产生TRAP阳性多核细胞的改变的形态。这在图9中示出。如在上方图中所示，暴露于1μg/ml人源化25E9抗体(L1H1IgG1变体)的人破骨细胞(右上图)不能适当地形成成熟的多核破骨细胞。相比之下，用等量对照抗体处理的人破骨细胞正常分化(中上图)。随着破骨细胞积极地消化矿化的底物，能够阻断Siglec-15(在破骨细胞中或在破骨细胞前体细胞中)的活性的抗体可例如显示与对照(例如，不结合Siglec-15的抗体、没有抗体等)相比，钙底物已被消化(剥蚀区)的更少区域。当人破骨细胞在磷酸钙底物(该磷酸钙底物充当一个骨样表面)上分化时(参见图9)，用对照抗体处理的细胞(中下图)产生较大的剥蚀磷酸钙区，从而表明破骨细胞表现出再吸收活性。相比之下，用1μg/ml 25E9(L1H1IgG1变体)处理的细胞(右下图)不能再吸收底物，这与未分化的前体细胞是可比的(左下图)。
在人源化之后还保存了25D8抗体抑制破骨细胞的能力，虽然它的效力始终保持低于25E9抗体(无论人源化或嵌合的25E9)的效力。
另一种技术涉及分化成破骨细胞并且铺放在牛皮质骨切片上的CD14+PBMC(分化可在铺放之前、铺放之时或铺放之后进行)。添加抗Siglec-15抗体并且通过反射光显微镜术观察骨切片表面上产生的再吸收凹点。能够阻断Siglec-15(在破骨细胞中或在破骨细胞前体细胞中)的活性的抗体可例如产生较少或较小的再吸收凹点。
我们的结果表明抗Siglec-15人源化抗体能够抑制破骨细胞分化和/或骨再吸收。
内化测定
为了生物素化细胞表面蛋白，用含有1mM CaCl2和1mM MgCl2(PBS/Ca/Mg，HyClone)的冷PBS冲洗分化的RAW264.7来源的破骨细胞两次，并且用在PBS/Ca/Mg中稀释至1mg/ml的生物素化试剂磺基-NHS-SS-生物素(Pierce)在4C下孵育1h。通过用甘氨酸(100mM，在PBS/Ca/Mg中)淬灭未反应的生物素化试剂来停止反应。为了诱导Siglec-15内化，用单独的抗Siglec-15抗体或对照人IgG或与二级交联抗体组合来处理细胞，如上在“细胞刺激”中所述。在抗体处理之后，用冷NT缓冲液(20mM Tris/HCl(pH 8.6)、150mM NaCl、1mM EDTA和0.2％BSA)冲洗细胞两次并且用在冷NT缓冲液中制备成25mM的2-巯基乙烷磺酸钠(MesNa)孵育2x 25min，以便还原磺基-NHS-SS-生物素的二硫键并且因此去除任何剩余的细胞表面生物素。为了计量Siglec-15生物素化的最大可能水平，对于一个对照省略此MesNa处理(这些对照细胞用单独地NT缓冲液孵育2x 25min)。然后用在PBS/Ca/Mg中稀释至5mg/ml的碘乙酰胺淬灭剩余的MesNa持续15min。
为了评价已被破骨细胞内化的生物素化Siglec-15的量，使细胞在mRIPA中裂解。通过链霉抗生素蛋白下拉来收集生物素化的蛋白质：在4C下用50μl的Dynal MyOne链霉抗生素蛋白珠(英杰公司)孵育250μg的裂解液过夜，同时旋转。在彻底洗涤之后，通过蛋白质印迹法在沉淀的材料中检测Siglec-15。
在抗体连接之后Siglec-15被内化并降解
已展示Siglec家族的一些成员的介导结合配体和抗体的内吞作用的能力；事实上，治疗性抗体的细胞摄取是靶向CD22和CD33Siglec的抗体-药物缀合物的作用机理的一个关键方面(O'Reilly(奥赖利)和Paulson(保尔森)，2009)。令人感兴趣地，Siglec-15还在它的胞质结构域中含有一个Yxxф序列(此酪氨酸Y309还是假定ITIM基序的一部分)；基序可以与网格蛋白衔接子AP-2相互作用以调节受体内化(Angata(安格塔)等人，2007；博尼费斯农和特劳伯，2003)。因此，我们研究了抗体连接对破骨细胞中的Siglec-15内吞作用的影响。
我们首先测试Siglec-15抗体(单独地或与二级交联抗体组合)是否可以诱导用生物素标记的Siglec-15从RAW264.7来源的破骨细胞表面的内化。在抗体刺激之后，通过用一种还原剂处理来释放任何剩余的细胞表面生物素。然后使细胞裂解，并且内化，并且用链霉抗生物素蛋白珠收集生物素化的蛋白质。通过蛋白质印迹法在沉淀的材料中检测Siglec-15。令人感兴趣地，我们发现用单独地Siglec-15抗体处理与对照人IgG相比诱导了大量的内化(图10A，比较泳道7和8)，而添加一种二级抗体来诱导受体群集比单一抗体具有更小作用(图10A，泳道5)。
我们继续通过免疫荧光显微镜术进行Siglec-15的抗体诱导的内吞作用表征。在玻璃盖玻片上生长的RAW264.7来源的破骨细胞在4C下，在应容许抗体结合但非内吞作用的条件下用稀释于正常生长培养基中的抗Siglec-15抗体“冷加载”。然后立即固定细胞或在固定之前在无抗体的温培养基中孵育不同的时间。如基于Siglec-15在固定的、透化的破骨细胞中的分布所预期，在完整破骨细胞中，冷加载的Siglec-15抗体牢牢结合在细胞表面上。在37C下孵育10min之后，染色模式明显改变：Siglec-15抗体存在于可能是内体的内孔(punctae)中(图10B，中间的图)。虽然在10min之后Siglec-15信号仍在质膜附近，但是45min之后它大多数变成是核周的，这是典型的溶酶体染色模式(Toyomura(丰村)等人，2003)。通过针对溶酶体标志物LAMP-2共染色这些细胞来证实此观点。事实上，在45min时在核周区中存在Siglec-15和LAMP-2的大量共定位，而在更早的时间点，染色模式是明显分歧的(图10B)。
在内吞作用之后，溶酶体是受体降解的主要部位。为了确定这是否是Siglec-15的命运，我们在延长的时间过程中用抗体处理RAW264.7来源的破骨细胞，并且通过蛋白质印迹法分析总蛋白质提取物。我们的结果表明在添加抗Siglec-15抗体的3h内开始Siglec-15蛋白水平的明显下降(图10C，泳道4和6)。相比之下，使破骨细胞暴露于对照IgG未引起这种信号减少。值得注意地，在存在抗Siglec-15抗体的情况下，在用RANKL分化(4天)的RAW264.7细胞中检测到Siglec-15蛋白水平的类似减少(图10D)。总之，这些结果展示二价抗Siglec-15抗体诱导受体的快速内化，然后该受体靶向溶酶体用于降解。
实例8
细胞裂解液的制备和免疫沉淀
使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(50mM NaF、1mM NaVO4和1x罗氏完全无EDTA磷酸酶抑制剂)的mRIPA溶解缓冲液(50mM Tris/HCl pH 7.4、1％NP-40、0.25％脱氧胆酸盐、150mM NaCl)制备细胞裂解液。通过BCA测定(Pierce)测量裂解液蛋白质浓度。对于总细胞裂解液的蛋白质印迹法，在含有β-巯基乙醇的SDS样品缓冲液中使等量的蛋白质(10-15ug)热变性，在10％或12％SDS-PAGE凝胶上分离，转移至PVDF并且用指定的抗体探测。对于免疫沉淀，在4C下用4μg抗体和15μl蛋白G-琼脂糖珠孵育2mg或1mg的总裂解液4h，同时旋转。在用mRIPA洗涤这些珠粒4次(4x)之后，通过如上所述的蛋白质印迹法分析一半的沉淀材料。
Siglec-15与DAP12之间的相互作用和Siglec-15的多聚化
最近研究展示当在293T细胞中共同过度表达Siglec-15和DAP12的表位标签形式时，可检测到一种复合物，这取决于K273(Angata(安格塔)等人，2007)的存在。我们还能够在类似的过度表达条件(数据未示出)下检测到此复合物，并且我们继续确定该复合物是否也以内源性表达水平存在于破骨细胞中。从分化的RAW264.7来源的破骨细胞以及从非分化的对照细胞制备蛋白质裂解液，并且使用Siglec-15和DAP12抗体进行免疫沉淀。在用抗Siglec-15抗体沉淀的蛋白质复合物中容易地检测到DAP12，并且同样，抗DAP12抗体沉淀了大量的Siglec-15。如所预期，基于Siglec-15蛋白表达水平，此复合物是高度破骨细胞特异性的并且在非分化的细胞中检测不到。值得注意地，在RAW264.7破骨细胞分化过程中DAP12表达没有显著改变。
先前研究显示当在它的ITAM基序上磷酸化时，DAP12能够激活许多信号传导途径，包括PI3K-Akt、PLCg和Grb2-Ras-Erk级联(Turnbull(特恩布尔)和Colonna(科隆纳)，2007)。然而，在特异性背景下DAP12的信号传导输出是高度取决于它缔合的受体(Turnbull(特恩布尔)和Colonna(科隆纳)，2007)。在不存在针对Siglec-15鉴定的天然配体或分子配偶体的情况下，我们使用一种抗体交联方法来评价Siglec-15激活细胞内信号传导的能力。起初，我们用抗Siglec-15抗体处理RAW来源的破骨细胞持续多个时间点高达至30min，但未能观察到Akt、PLCg或Erk的任何激活(数据未示出)。然而，对于若干其他DAP12缔合的受体，需要受体的更高阶群集而不是二价抗体诱导的二聚化，来诱导ITAM依赖型信号传导(Turnbull(特恩布尔)和Colonna(科隆纳)，2007；Underhill(昂德希尔)和Goodridge(顾瑞吉)，2007)。为了诱导多聚化，我们用初级Siglec-15抗体接着用二级交联抗体处理细胞。在这些条件下，我们观察到信号传导效应(图11，泳道5、8和11)，其中在二级抗体交联的数分钟内Akt变成强烈磷酸化的。在用抗Siglec-15抗体处理5min之后达到Akt的最大磷酸化(图11，泳道8)。相比之下，磷酸-Erk(图11)和磷酸-PLCg(未示出)没有受到调节。与Siglec-15的表达缺乏一致，在相同条件下在非分化的RAW264.7细胞中不存在Akt的激活。同样，用对照人IgG取代初级Siglec-15抗体使信号传导反应消除(图11，参见泳道3、6、9和12)。这些结果展示，Siglec-15交联特异性地激活Akt而不影响Erk或PLCg，常见在DAP12下游的两个其他途径(Turnbull(特恩布尔)和Colonna(科隆纳)，2007；Underhill(昂德希尔)和Goodridge(顾瑞吉)，2007)。
如果通过Siglec-15进行的细胞信号传导的诱导取决于DAP12ITAM基序，DAP12的酪氨酸磷酸化应该在Siglec-15群集时可检测到。为了测试此结果，我们免疫沉淀了DAP12并且通过蛋白质印迹法评价了它的磷酸化。在用初级/二级抗体刺激以交联Siglec-15的RAW264.7来源的破骨细胞中(如上所述)，我们在12kDa下检测到一个酪氨酸磷酸化带，这非常可能是DAP12。在以相同方式处理的非分化细胞或用对照人IgG处理的破骨细胞中，检测到很少或检测不到DAP12磷酸化。值得注意地，虽然大量的Siglec-15与DAP12从分化的破骨细胞中共沉淀(如所预期)，但是在它的分子量(37kDa)下检测不到磷酸酪氨酸信号，从而表明Siglec-15的胞质酪氨酸残基(它的假定ITIM基序的一部分)的磷酸化不涉及信号传导反应(数据未示出)。因此，我们的结果与DAP12充当Siglec-15的信号传导模块相一致；DAP12在Siglec-15群集之后变成磷酸化的，从而可能引起信号传导分子募集至它的ITAM基序并且激活Akt途径。
能够抑制Siglec-15的二聚化或多聚化的抗Siglec-15抗体可因此抑制破骨细胞中或破骨细胞前体中的Siglec-15活性。例如，为了确定抗体抑制Siglec-15的二聚化或多聚化的能力，可测试DAP12(例如，DAP12磷酸化)和/或它的下游效应子(Akt途径)的激活水平。
实例9
IgG1和IgG2抗体变体的比较
我们继续进行人源化抗Siglec-15 IgG1抗体变体与相应的人源化抗Siglec-15 IgG2抗体变体(即，这些抗体具有相同可变结构域但重链的人恒定区不同)的比较，并且发现在以下描述的体外实验中，IgG1比相应的IgG2更有活性。
更具体地说，我们使用SPR比较了人源化25E9 L1H1 IgG1(L1H1 IgG1变体)与人源化25E9 L1H1 IgG2(L1H1IgG2变体)的结合活性。使用类似于以上所描述的方法进行分析(参见实例6)。在此情况下，将Fc-Siglec-15固定在芯片上并且注射递减浓度的25E9抗体变体(100nM、33.3nM、11.1nM、3.70nM和1.23nM)。结果显示人源化25E9 L1H1 IgG1变体对Siglec-15的亲和力比人源化25E9 L1H1 IgG2变体高几乎10倍，对比性的KD值分别为0.164nM和1.26nM(参见图12)。结合上的差异主要是由与IgG2相比而言IgG1的较慢解离速率(kd)所致。
还检测了人源化25E9 L1H1 IgG1变体(L1H1 IgG1变体)和IgG2(L1H1IgG2变体)的抑制人破骨细胞分化的能力。在存在递增浓度的抗体情况下，如上所述使人破骨细胞前体细胞富集和分化(参见图13)。在存在人源化25E9L1H1 IgG1变体的情况下，需要小于100ng/ml的抗体来完全抑制此测定中的破骨细胞分化。相比之下，需要10μg/ml的人源化25E9 L1H1 IgG2变体来获得相同程度的抑制。这表示人源化25E9 L1H1 IgG1变体与相应的IgG2变体在效力上具有几乎100倍差异。在对照样品中，暴露于媒介物或10μg/ml对照IgG的破骨细胞的分化不受影响。虽然对于L1H1变体展示出基于IgG1的抗体的效力增加，但是对于其他25E9人源化变体、杂交抗体或小鼠抗体也预期到此种增加。
事实上，我们还观察到另一种Siglec-15人源化抗体25D8的效力如IgG1和IgG2对比是高度增加的。预期其他抗Siglec-15抗体可获益于具有人IgG1恒定区而不是其他类型的恒定区。可通过测量基于IgG1的抗Siglec-15抗体针对表达Siglec-15的细胞或针对重组Siglec-15的亲和力增加，或测试基于IgG1的抗体抑制破骨细胞分化或活性(体外或体内)的能力来鉴定此类抗体。
基于这些结果，基于人IgG1的抗Siglec-15抗体可有利地在更低的剂量下对人类给药。
实例10
靶向Siglec-15的抗体-药物缀合物(ADC)
申请人证实，抗体与在破骨细胞表面上表达的Siglec-15的结合被有效地内化并降解。另外的研究还表明该内化遵循内体途径并且Siglec-15/抗体复合物可以与LAMP2(后期内体/溶酶体的一种标志物)共定位。进行实验以检测用ADC靶向Siglec-15表达细胞的可行性。将人源化25E9 L1H1 IgG1变体缀合至对增殖细胞以及非增殖细胞或完全分化的细胞、具体是破骨细胞有毒性的载荷上。人源化25E9 L1H1 IgG1缀合的抗体命名为25E9-ADC。因为该缀合可能影响25E9与天然Siglec-15相互作用的能力，所以进行流式细胞计量术来测量该25E9-ADC与Siglec-15表达细胞的结合。使用经过编码人Siglec-15的cDNA转染的293-6E细胞，如上所述进行实验。如在图15中所示，未缀合的25E9和25E9-ADC与以非常类似的亲和力与Siglec-15转染的细胞相互作用(参见黑色曲线，h-Siglec-15)。这表明缀合反应没有改变25E9-ADC结合Siglec-15的能力。作为对照，用不含Siglec-15cDNA的质粒转染的细胞(参见图15灰色曲线，载体)不结合25E9，从而表明这些抗体不会非特异性地结合细胞。
接下来检测这些抗体的细胞毒性活性。分离人破骨细胞前体细胞，并且以与先前描述的方式类似的方式，在M-SCF和RANKL存在下种于96孔板中。允许破骨细胞分化7天以便变成完全成熟的、多核的TRAP阳性破骨细胞。分化之后，用未缀合的25E9、25E9-ADC或对照ADC处理细胞持续4天。使用标准量热法确定剩余细胞数量(％存活)。如所预期，未缀合的25E9对人破骨细胞的存活没有作用(参见图16)。此结果与先前结果一致，显示尽管25E9有效地抑制破骨细胞分化，但是抗体不会杀死细胞。相比之下，25E9-ADC显示存活细胞数量的剂量依赖性减少(图16)，结果与递送的毒素的细胞毒性一致。此细胞毒性的IC50值处于亚纳摩尔范围中。不结合人Siglec-15的对照ADC在此测定中显示温和的非特异性活性。在研究结束时，使用描述于实例7中的方法固定细胞并且针对TRAP活性染色，以便目测检查这些抗体对破骨细胞的作用。如在图17中所示，用未缀合的25E9处理(上方图)对破骨细胞的形态具有严重影响，导致小的深度TRAP染色的细胞，我们先前证实的是非功能性和完全没有再吸收活性(参见图9)。用25E9-ADC处理导致破骨细胞死亡并且在1μg/ml下几乎所有细胞死去(参见图17，中间的图)，结果与图16中示出的细胞数量确定一致。最后，对照ADC对成熟破骨细胞没有显示任何毒性作用(参见图17，下方图)，并且甚至在10μg/ml下破骨细胞的数量与用未处理的细胞所观察到的数量类似。这些结果表明用25E9-ADC所观察到的细胞毒性对Siglec-15阳性破骨细胞有特异性。
总之，这些结果显示靶向在破骨细胞表面上表达的Siglec-15的ADC具有细胞毒性活性。
实例11
体内功能测定-小鼠
使用具有快速生长的骨的非常年幼的小鼠，通过Schenk(申克)(Muhlbauer(肯特)等人，1991)所述的方法改编体内功效的评价。简而言之，用PBS、对照小鼠IgG或能够结合小鼠Siglec-15的抗Siglec-15抗体处理3-4周龄的雄性小鼠(5个动物/组)。使用26号针每周两次腹膜内给予这些抗体，持续四周。牺牲小鼠，并且解剖骨并固定于4％多聚甲醛中持续24h。在用PBS洗涤之后，使用PIXImus显像密度计(GE医疗系统)扫描骨，以确定股骨、胫骨和脊椎骨的骨矿物质密度(BMD)。用SkyScan高分辨率显微CT(SkyScan公司，Kontich，Belgium)生成骨的三维图像。
针对这些实验，用抗Siglec-15抗体处理3-4周龄小鼠持续四周并且评定这种处理对长骨和脊椎骨的作用。因为年幼小鼠在此年龄下具有快速生长的骨，所以通过抗再吸收剂进行的破骨细胞活性的扰乱可以在相对短的时间段里引起骨矿物质密度(BMD)的快速、显著增加。在治疗期之后，使动物安乐死，解剖骨并且通过密度测定法扫描以计算BMD。与对照小鼠IgG相比，用抗Siglec-15单克隆抗体处理引起这些小鼠的股骨、胫骨和脊椎骨中的BMD的相当大的剂量依赖性增加。为了进一步检测BMD的变化，使用X-射线显微断层照相术(显微CT)扫描选择的骨样品以分析它们的微结构。与密度测定法结果一致，我们观察到用抗Siglec-15抗体处理的小鼠的股骨和脊椎骨中的小梁体积比对照IgG处理的小鼠和L5脊椎骨显著增加。与这些定性观察一致，显微CT扫描的定量测量结果证实了用Siglec-15抗体处理的动物中的骨矿物质密度的增加。具体地说，存在骨体积、骨表面、小梁数量和连接性密度的统计学显著的增加。相反，小梁分离显著减少，这是与小梁结构密度增加相符的变化。
以下研究的目的是为了确定靶向Siglec-15的抗体在大鼠卵巢切除术(OVX)模型中的作用。
对三十二只斯普拉-道来(Sprague-Dawley)大鼠进行假手术或卵巢切除，并且稍后用PBS(q28d)、Siglec-15抗体(一种抗小鼠Siglec-15抗体，10mg/kg，q28d)或唑来膦酸(ZOL，0.1mg/kg，单次注射)处理12周。在十二周处理之后，通过密度测定法、显微CT、组织形态测定术、3点弯曲(股骨)和轴向压缩(LV4)来分析骨，并且分析血清的TRAP 5b和ALP水平。
如所预期，与假手术的动物相比，骨矿物质密度(BMD)在OVX-PBS组中显著减少，而ZOL处理增加BMD。25B2的给药引起所有部位处的BMD明显增加。这些变化通过显微CT分析来证实，这些分析显示出与对照组相比，骨体积、小梁(Tb)数目的明显增加以及Tb分离的相应减少。对应地，通过生物力学分析观察到用抗小鼠Siglec-15抗体处理的动物中的骨强度改进：最大载荷、刚度和断裂能(energy-to-failure)参数全部增加。胫骨区的检查显示，通过抗小鼠Siglec-15抗体处理使破骨细胞数量明显增加，但是TRAP阳性细胞是更小并且更深度染色。抗小鼠Siglec-15抗体组中的血清TRAP 5b减少，这与破骨细胞对这种酶的分泌减少相一致。令人感兴趣地，ALP的血清水平和组织学染色在抗体处理的动物中没有变化。这与ZOL处理的作用形成对比，该ZOL处理引起ALP染色明显减少。使用双钙黄绿素标记的动态组织形态计量学分析表明与媒介物组和ZOL处理的组相比，在抗体处理组中的骨内膜矿物质沉积速率是更大的，从而表明抗Siglec-15抗体对新骨形成的刺激。
总之，我们的结果展示在病理性骨丢失模型中用单克隆抗体靶向Siglec-15改进了骨品质和强度，这可能归功于抑制破骨细胞功能和维持成骨细胞活性的组合。
体内功能测定-猴
为了探索Siglec-15抑制对灵长类动物中的骨生物标志物的作用，我们向缺乏雌激素的雌性食蟹猴给予靶向Siglec-15的人源化单克隆抗体25E9。
以8周间隔向两个组给予10mg/kg的媒介物(PBS)或25E9的两次静脉内注射，随访期为6个月。在给予25E9之前3个月开始并且贯穿随访期，每4周重复皮下给予促性腺激素释放激素激动剂，来诱导雌激素缺乏。每周收集血清和尿样品来评价骨再吸收和形成生物标志物，确定AB-25E9的PK曲线并监测抗体-药物抗体(ADA)的存在。
用25E9治疗使骨再吸收生物标志物(尿NTx、血清CTx和TRAP5b)快速减少30％至45％，从而展示了25E9的抗再吸收特性。显著地，骨形成生物标志物(骨钙素和BSAP)未快速减少并且受影响程度甚小。骨再吸收生物标志物的水平减少在大约第6周开始减弱，这与ADA的出现相符。令人感兴趣地，在第20周之前在检测到很少或检测不到ADA的动物中未观察到此减弱。与这些发现一致，AB-25E9血清浓度的降低在检测到ADA的动物中更快。在对ADA阴性的猴中，25E9的终末消除半衰期是在5与12天范围之间。
总之，在此呈现的生物标记物谱显示，在雌激素缺乏的食蟹猴中25E9具有抗再吸收活性并且维持骨形成。这些结果强调了25E9的新颖作用机理并且突显了它用于骨相关疾病的破骨细胞靶向疗法的潜力。
我们在小鼠或猴体内的实验还包括用30mg/kg的抗Siglec-15抗体处理的组。令人惊奇地，这种剂量上的增加未引起附加的益处。相反，在一些情况下与10mg/kg剂量相比，在此剂量下的抗体作用存在减小。
参考文献
列于本申请中的参考文献的整个内容通过引用结合在此。
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-
序列
注释：加下划线的序列表示恒定区，加双下划线的序列表示信号序列并且用粗体示出的序列表示互补决定区。
SEQ ID NO:1(人Siglec-15cDNA)
ATGGAAAAGTCCATCTGGCTGCTGGCCTGCTTGGCGTGGGTTCTCCCGACAGGCTCATTTGTGAGAACTAAAATAGATACTACGGAGAACTTGCTCAACACAGAGGTGCACAGCTCGCCAGCGCAGCGCTGGTCCATGCAGGTGCCACCCGAGGTGAGCGCGGAGGCAGGCGACGCGGCAGTGCTGCCCTGCACCTTCACGCACCCGCACCGCCACTACGACGGGCCGCTGACGGCCATCTGGCGCGCGGGCGAGCCCTATGCGGGCCCGCAGGTGTTCCGCTGCGCTGCGGCGCGGGGCAGCGAGCTCTGCCAGACGGCGCTGAGCCTGCACGGCCGCTTCCGGCTGCTGGGCAACCCGCGCCGCAACGACCTCTCGCTGCGCGTCGAGCGCCTCGCCCTGGCTGACGACCGCCGCTACTTCTGCCGCGTCGAGTTCGCCGGCGACGTCCATGACCGCTACGAGAGCCGCCACGGCGTCCGGCTGCACGTGACAGCCGCGCCGCGGATCGTCAACATCTCGGTGCTGCCCAGTCCGGCTCACGCCTTCCGCGCGCTCTGCACTGCCGAAGGGGAGCCGCCGCCCGCCCTCGCCTGGTCCGGCCCGGCCCTGGGCAACAGCTTGGCAGCCGTGCGGAGCCCGCGTGAGGGTCACGGCCACCTAGTGACCGCCGAACTGCCCGCACTGACCCATGACGGCCGCTACACGTGTACGGCCGCCAACAGCCTGGGCCGCTCCGAGGCCAGCGTCTACCTGTTCCGCTTCCATGGCGCCAGCGGGGCCTCGACGGTCGCCCTCCTGCTCGGCGCTCTCGGCTTCAAGGCGCTGCTGCTGCTCGGGGTCCTGGCCGCCCGCGCTGCCCGCCGCCGCCCAGAGCATCTGGACACCCCGGACACCCCACCACGGTCCCAGGCCCAGGAGTCCAATTATGAAAATTTGAGCCAGATGAACCCCCGGAGCCCACCAGCCACCATGTGCTCACCGTGA
SEQ ID NO:2(人Siglec-15多肽：1-328)
MEKSIWLLACLAWVLPTGSFVRTKIDTTENLLNTEVHSSPAQRWSMQVPPEVSAEAGDAAVLPCTFTHPHRHYDGPLTAIWRAGEPYAGPQVFRCAAARGSELCQTALSLHGRFRLLGNPRRNDLSLRVERLALADDRRYFCRVEFAGDVHDRYESRHGVRLHVTAAPRIVNISVLPSPAHAFRALCTAEGEPPPALAWSGPALGNSLAAVRSPREGHGHLVTAELPALTHDGRYTCTAANSLGRSEASVYLFRFHGASGASTVALLLGALGFKALLLLGVLAARAARRRPEHLDTPDTPPRSQAQESNYENLSQMNPRSPPATMCSP
SEQ ID NO:3(小鼠Siglec-15cDNA)
ATGGAGGGGTCCCTCCAACTCCTGGCCTGCTTGGCCTGTGTGCTCCAGATGGGATCCCTTGTGAAAACTAGAAGAGACGCTTCGGGGGATCTGCTCAACACAGAGGCGCACAGTGCCCCGGCGCAGCGCTGGTCCATGCAGGTGCCCGCGGAGGTGAACGCGGAGGCTGGCGACGCGGCGGTGCTGCCCTGCACCTTCACGCACCCGCACCGCCACTACGACGGGCCGCTGACGGCCATCTGGCGCTCGGGCGAGCCGTACGCGGGCCCGCAGGTGTTCCGCTGCACCGCGGCGCCGGGCAGCGAGCTGTGCCAGACGGCGCTGAGCCTGCACGGCCGCTTCCGCCTGCTGGGCAACCCGCGCCGCAACGACCTGTCCCTGCGCGTCGAGCGCCTCGCCCTGGCGGACAGCGGCCGCTACTTCTGCCGCGTGGAGTTCACCGGCGACGCCCACGATCGCTATGAGAGTCGCCATGGGGTCCGTCTGCGCGTGACTGCAGCTGCGCCGCGGATCGTCAACATCTCGGTGCTGCCGGGCCCCGCGCACGCCTTCCGCGCGCTCTGCACCGCCGAGGGGGAGCCCCCGCCCGCCCTCGCCTGGTCGGGTCCCGCCCCAGGCAACAGCTCCGCTGCCCTGCAGGGCCAGGGTCACGGCTACCAGGTGACCGCCGAGTTGCCCGCGCTGACCCGCGACGGCCGCTACACGTGCACGGCGGCCAATAGCCTGGGCCGCGCCGAGGCCAGCGTCTACCTGTTCCGCTTCCACGGCGCCCCCGGAACCTCGACCCTAGCGCTCCTGCTGGGCGCGCTGGGCCTCAAGGCCTTGCTGCTGCTTGGCATTCTGGGAGCGCGTGCCACCCGACGCCGACTAGATCACCTGGTCCCCCAGGACACCCCTCCACGGTCTCAGGCTCAGGAGTCCAATTATGAAAATTTGAGCCAGATGAGTCCTCCAGGCCACCAGCTGCCACGTGTTTGCTGTGAGGAACTCCTCAGCCATCACCATCTAGTCATTCACCATGAGAAATAA
SEQ ID NO:4(小鼠Siglec-15多肽)
MEGSLQLLACLACVLQMGSLVKTRRDASGDLLNTEAHSAPAQRWSMQVPAEVNAEAGDAAVLPCTFTHPHRHYDGPLTAIWRSGEPYAGPQVFRCTAAPGSELCQTALSLHGRFRLLGNPRRNDLSLRVERLALADSGRYFCRVEFTGDAHDRYESRHGVRLRVTAAAPRIVNISVLPGPAHAFRALCTAEGEPPPALAWSGPAPGNSSAALQGQGHGYQVTAELPALTRDGRYTCTAANSLGRAEASVYLFRFHGAPGTSTLALLLGALGLKALLLLGILGARATRRRLDHLVPQDTPPRSQAQESNYENLSQMSPPGHQLPRVCCEELLSHHHLVIHHEK
SEQIDNo.:5
25E9轻(κ)链嵌合的(小鼠可变结构域和人恒定区)
DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSTKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGT ASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQIDNo.:6
25E9轻链小鼠可变结构域(没有示出信号序列：CDR用粗体示出)DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCWFLQRPGQSPQLLIYGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYC FGGGTKLEIK
SEQIDNO.:7
25E9轻(κ)链人源化变体1(亦称：L1)(人源化可变结构域和人恒定区)DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSTKSLLHSNGNTYLYWYLQKPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSG TASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQIDNO.:8
25E9轻链人源化变体1可变结构域(亦称：VL1)(没有示出信号序列)
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSTKSLLHSNGNTYLYWYLQKPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGGGTKVEIK
SEQIDNO.:9
25E9轻(κ)链人源化变体2(亦称：L2)(人源化可变结构域和人恒定区)DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSTKSLLHSNGNTYLYWFLQKPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGT ASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQIDNO.:10
25E9轻链人源化变体2可变结构域(亦称：VL2)(没有示出信号序列)
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSTKSLLHSNGNTYLYWFLQKPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGGGTKVEIK
SEQIDNO.:11
25E9重(Igg1)链嵌合的(小鼠可变结构域和人恒定区)
EIQLQQSGVELVRPGASVTLSCKASGYTFTDYDMHWVKQTPVHGLEWIGTIDPETGGTAYNQKFKGKATLTADRSSTTAYMELSSLTSEDSAVYYCTSFYYTYSNYDVGFAYWGQGTLVTVSAASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTC PPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQIDNO.:12
25E9重链小鼠可变结构域(没有示出信号序列：CDR用粗体示出)
EIQLQQSGVELVRPGASVTLSCKASWVKQTPVHGLEWIGKATLTADRSSTTAYMELSSLTSEDSAVYYCTS WGQGTLVTVSA
SEQIDNO.:13
25E9重(Igg1)链人源化变体1(亦称：H1)(人源化可变结构域和人恒定区)
EIQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYDMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPETGGTAYNQKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTSFYYTYSNYDVGFAYWGQGTLVTVSSASTKGP SVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCS VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQIDNO.:14
25E9重链人源化变体1可变结构域(亦称：VH1)(没有示出信号序列)
EIQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYDMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPETGGTAYNQKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTSFYYTYSNYDVGFAYWGQGTLVTVSS
SEQIDNO.:15
25E9重(Igg1)链人源化变体2(亦称：H2)(人源化可变结构域和人恒定区)
EIQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYDMHWVRQAPGQGLEWIGTIDPETGGTAYNQKFKGRATLTADRSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTSFYYTYSNYDVGFAYWGQGTLVTVSSASTKGP SVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCS VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQIDNO.:16
25E9重链人源化变体2可变结构域(亦称：VH2)(没有示出信号序列)
EIQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYDMHWVRQAPGQGLEWIGTIDPETGGTAYNQKFKGRATLTADRSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTSFYYTYSNYDVGFAYWGQGTLVTVSS
SEQIDNO.:17
25E9重(Igg1)链人源化变体3(亦称：H3)(人源化可变结构域和人恒定区)
EIQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYDMHWVKQAPGQGLEWIGTIDPETGGTAYNQKFKGKATLTADRSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTSFYYTYSNYDVGFAYWGQGTLVTVSSASTKGP SVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCS VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQIDNO.:18
25E9重链人源化变体3可变结构域(亦称：VH3)(没有示出信号序列)
EIQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYDMHWVKQAPGQGLEWIGTIDPETGGTAYNQKFKGKATLTADRSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTSFYYTYSNYDVGFAYWGQGTLVTVSS
SEQIDNO.:19
25E9重(Igg1)链人源化变体4(亦称：H4)(人源化可变结构域和人恒定区)
EIQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYDMHWVKQAPGHGLEWIGTIDPETGGTAYNQKFKGKATLTADRSTSTAYMELSSLTSEDTAVYYCTSFYYTYSNYDVGFAYWGQGTLVTVSSASTKGP SVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCS VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQIDNO.:20
25E9重链人源化变体4可变结构域(亦称：VH4)(没有示出信号序列)
EIQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYDMHWVKQAPGHGLEWIGTIDPETGGTAYNQKFKGKATLTADRSTSTAYMELSSLTSEDTAVYYCTSFYYTYSNYDVGFAYWGQGTLVTVSS
SEQIDNO.:21
嵌合25D8轻(κ)链(小鼠可变结构域和人恒定区)
DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGT ASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQIDNO.:22
25D8轻链小鼠可变结构域(没有示出信号序列)
DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKLEIK
SEQIDNO.:23
人源化25D8轻(κ)链(人源化可变结构域和人恒定区)
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGT ASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQIDNO.:24
人源化25D8轻链可变结构域(没有示出信号序列)
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKVEIK
SEQIDNO.:25
嵌合25D8重(Igg2)链(小鼠可变结构域和人恒定区)
QVQVQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGLINPSNARTNYNEKFNTKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGGDGDYFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPL APCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAP PVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPI EKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSPGK
SEQIDNO.:26
25D8重链小鼠可变结构域(没有示出信号序列)
QVQVQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGLINPSNARTNYNEKFNTKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGGDGDYFDYWGQGTTLTVSS
SEQIDNO.:27
人源化25D8重(Igg2)链(人源化可变结构域和人恒定区)
QVQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGLINPSNARTNYNEKFNTRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGDGDYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFP LAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPA PPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAP IEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSPGK
SEQIDNO.:28
人源化25D8重链可变结构域(没有示出信号序列)
QVQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGLINPSNARTNYNEKFNTRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGDGDYFDYWGQGTTVTVSS
SEQIDNO.29
25E9重(Igg2)链人源化变体1(人源化可变结构域和人恒定区)
EIQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYDMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPETGGTAYNQKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTSFYYTYSNYDVGFAYWGQGTLVTVSSASTKGP SVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECP PCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKG LPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQIDNo.:30
25E9重(Igg2)链嵌合的(小鼠可变结构域和人恒定区)
EIQLQQSGVELVRPGASVTLSCKASGYTFTDYDMHWVKQTPVHGLEWIGTIDPETGGTAYNQKFKGKATLTADRSSTTAYMELSSLTSEDSAVYYCTSFYYTYSNYDVGFAYWGQGTLVTVSAASTKGPS VFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPP CPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLP APIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQIDNO.:31(人IgG1恒定区)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQIDNO.:32(人IgG2恒定区)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQIDNo.33一般25E9轻链可变结构域(共有序列1)
DIVMTQXXXSXPVTPGEXXSISCRSTKSLLHSNGNTYLYWXLQXPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTXFTLXISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGGGTKXEIK
其中由X标识的至少一个氨基酸可以是与列于SEQ ID NO.:6(小鼠VL)中的多肽中的相应氨基酸相比的一个氨基酸取代。该氨基酸取代可以是例如保守性的或非保守性的。根据本发明，该氨基酸取代可以是保守性的。
SEQIDNo.34一般25E9轻链可变结构域(共有序列2)
DIVMTQXa1Xa2Xa3SXa4PVTPGEXa5Xa6SISCRSTKSLLHSNGNTYLYWXa7LQXa8PGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTXa9FTLXa10ISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGGGTKXa11EIK
其中由X标识的至少一个氨基酸可以是与列于SEQ ID NO.:6(小鼠VL)中的多肽中的相应氨基酸相比的一个氨基酸取代并且其中Xa1、Xa4、Xa7、Xa8、Xa10和Xa11可各自独立地是与SEQIDNO.6相比的保守性氨基酸取代；
其中Xa2、Xa5、Xa6可各自独立地是与SEQIDNO.6相比的半保守性氨基酸取代；
其中Xa3可以是P或L；并且
其中Xa9可以是A或D。
SEQIDNO.35一般25E9轻链可变结构域(共有序列3)
DIVMTQXa1Xa2Xa3SXa4PVTPGEXa5Xa6SISCRSTKSLLHSNGNTYLYWXa7LQXa8PGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTXa9FTLXa10ISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGGGTKXa11EIK
其中由X(包括Xa1至Xa11)标识的至少一个氨基酸可以是与列于SEQ IDNO.:6(小鼠VL)中的多肽中的相应氨基酸相比的一个氨基酸取代并且
其中Xa1可以是A或S；
其中Xa2可以是A或P；
其中Xa3可以是P或L；
其中Xa4可以是疏水性氨基酸(例如，V或L)；
其中Xa5可以是S或P；
其中Xa6可以是疏水性氨基酸(例如，V或A)；
其中Xa7可以是芳香族氨基酸(例如F或Y)；
其中Xa8可以是碱性氨基酸(例如，R或K)；
其中Xa9可以是A或D；
其中Xa10可以是碱性氨基酸(例如，R或K)；
并且其中Xa11可以是疏水性氨基酸(例如，L或V)。
SEQIDNO.36一般25E9重链可变结构域(共有序列1)
EIQLQQSGXEXXXPGXSVXXSCKASGYTFTDYDMHWVXQXPXXGLEWXGTIDPETGGTAYNQKFKGXXTXTADXSXXTAYMELSSLXSEDXAVYYCTSFYYTYSNYDVGFAYWGQGTLVTVSX
其中由X标识的至少一个氨基酸可以是与列于SEQ ID NO.:12(小鼠VH)中的多肽中的相应氨基酸相比的一个氨基酸取代。该氨基酸取代可以是例如保守性的或非保守性的。根据本发明，该氨基酸取代可以是保守性的。
SEQIDNO.37一般25E9重链可变结构域(共有序列2)
EIQLQQSGXb1EXb2Xb3Xb4PGXb5SVXb6Xb7SCKASGYTFTDYDMHWVXb8QXb 9PXb10Xb11GLEWXb12GTIDPETGGTAYNQKFKGXb13Xb14TXb15TADXb16SXb17Xb 18TAYMELSSLXb19SEDXb20AVYYCTSFYYTYSNYDVGFAYWGQGTLVTVSXb21
其中由X(包括Xb1至Xb21)标识的至少一个氨基酸可以是与列于SEQ IDNO.:12(小鼠VH)中的多肽中的相应氨基酸相比的一个氨基酸取代并且其中Xb2、Xb4、Xb5、Xb7、Xb8、Xb9、Xb11、Xb12、Xb13、b15、Xb16、Xb17、Xb18、Xb20和Xb21可各自独立地是与SEQIDNO.12相比的保守性氨基酸取代；
其中Xb1、Xb6、Xb14可各自独立地是与SEQIDNO.:12(小鼠VH)相比的半保守性氨基酸取代
其中Xb3可以是V或K；
其中Xb10可以是V或G；并且
其中Xb19可以是T或R。
SEQIDNO.38一般25E9重链可变结构域(共有序列3)
EIQLQQSGXb1EXb2Xb3Xb4PGXb5SVXb6Xb7SCKASGYTFTDYDMHWVXb8QXb 9PXb10Xb11GLEWXb12GTIDPETGGTAYNQKFKGXb13Xb14TXb15TADXb16SXb17Xb 18TAYMELSSLXb19SEDXb20AVYYCTSFYYTYSNYDVGFAYWGQGTLVTVSXb21
其中由X(包括Xb1至Xb21)标识的至少一个氨基酸可以是与列于SEQ IDNO.:12(小鼠VH)中的多肽中的相应氨基酸相比的一个氨基酸取代并且
其中Xb1可以是疏水性氨基酸(例如，V或A)；
其中Xb2可以是疏水性氨基酸(例如，L或V)；
其中Xb3可以是V或K；
其中Xb4可以是碱性氨基酸(例如，R或K)；
其中Xb5可以是A或S；
其中Xb6可以是T或K；
其中Xb7可以是疏水性氨基酸(例如，L或V)；
其中Xb8可以是碱性氨基酸(例如，K或R)；
其中Xb9可以是T或A；
其中Xb10可以是V或G；
其中Xb11可以是碱性氨基酸(例如，H或Q)；
其中Xb12可以是疏水性氨基酸(例如，I或M)；
其中Xb13可以是碱性氨基酸(例如，K或R)；
其中Xb14可以是疏水性氨基酸(例如，A或V)；
其中Xb15可以是疏水性氨基酸(例如，L或I)；
其中Xb16可以是碱性氨基酸(例如，R或K)；
其中Xb17可以是中性亲水性氨基酸(例如，S或T)；
其中Xb18可以是中性亲水性氨基酸(例如，T或S)；
其中Xb19可以是T或R；
其中Xb20可以是中性亲水性氨基酸(例如，S或T)；并且
其中Xb21可以是A或S。
SEQIDNO.39一般25D8轻链可变结构域(共有序列1)
DIVMTQXXXSXPVTXGXXASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSXSGSGTDFTLXISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKXEIK
其中由X标识的至少一个氨基酸可以是与列于SEQ ID NO.:22(小鼠VL)中的多肽中的相应氨基酸相比的一个氨基酸取代。该氨基酸取代可以是例如保守性的或非保守性的。根据本发明，该氨基酸取代可以是保守性的。
SEQIDNO.40一般25D8轻链可变结构域(共有序列2)
DIVMTQXc1Xc2Xc3SXc4PVTXc5GXc6Xc7ASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSXc8SGSGTDFTLXc9ISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKXc10EIK
其中由X标识的至少一个氨基酸可以是与列于SEQ ID NO.:22(小鼠VL)中的多肽中的相应氨基酸相比的一个氨基酸取代并且
其中Xc1、Xc3、Xc9和Xc10可各自独立地是与SEQ ID NO.:22相比的保守性氨基酸取代；
其中Xc2、Xc7、Xc8可各自独立地是与SEQ ID NO.:22相比的半保守性氨基酸取代；
其中Xc4可以是N或L；
其中Xc5可以是L或P；并且
其中Xc6可以是T或E。
SEQIDNO.41一般25D8轻链可变结构域(共有序列3)
DIVMTQXc1Xc2Xc3SXc4PVTXc5GXc6Xc7ASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSXc8SGSGTDFTLXc9ISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKXc10EIK
其中由X标识的至少一个氨基酸可以是与列于SEQ ID NO.:22(小鼠VL)中的多肽中的相应氨基酸相比的一个氨基酸取代并且
其中Xc1可以是A或T；
其中Xc2可以是A或P；
其中Xc3可以是F或L；
其中Xc4可以是N或L；
其中Xc5可以是L或P；
其中Xc6可以是T或E；
其中Xc7可以是S或P；
其中Xc8可以是S或G；
其中Xc9可以是碱性氨基酸(例如，R或K)；并且
其中Xc10可以是疏水性氨基酸(例如，L或V)。
SEQIDNO.42一般25D8重链可变结构域(共有序列1)
QVQXQQXGAEXXKPGXSVKXSCKASGYTFTSYWMHWVXQXPGQGLEWXGLINPSNARTNYNEKFNTXXTXTXDKSXSTAYMXLSSLXSEDXAVYYCARGGDGDYFDYWGQGTTXTVSS
其中由X标识的至少一个氨基酸可以是与列于SEQ ID NO.:26(小鼠VH)中的多肽中的相应氨基酸相比的一个氨基酸取代。该氨基酸取代可以是例如保守性的或非保守性的。根据本发明，该氨基酸取代可以是保守性的。
SEQIDNO.43一般25D8重链可变结构域(共有序列2)
QVQXd1QQXd2GAEXd3Xd4KPGXd5SVKXd6SCKASGYTFTSYWMHWVXd7QXd 8PGQGLEWXd9GLINPSNARTNYNEKFNTXd10Xd11TXd12TXd13DKSXd14STAYMXd15LSSLXd16SEDXd17AVYYCARGGDGDYFDYWGQGTTXd18TVSS
其中由X标识的至少一个氨基酸可以是与列于SEQ ID NO.:26(小鼠VH)中的多肽中的相应氨基酸相比的一个氨基酸取代并且；
其中Xd1、Xd3、Xd5、Xd6、Xd7、Xd9、Xd10、Xd12、Xd14、Xd15、Xd17、Xd18可各自独立地是与SEQ ID NO.:26相比的保守性氨基酸取代；
其中Xd2、Xd11、Xd13可各自独立地是与SEQ ID NO.:26相比的半保守性氨基酸取代；
其中Xd4可以是V或K；
其中Xd8可以是R或A；并且；
其中Xd16可以是T或R。
SEQIDNO.44一般25D8重链可变结构域(共有序列3)
QVQXd1QQXd2GAEXd3Xd4KPGXd5SVKXd6SCKASGYTFTSYWMHWVXd7QXd 8PGQGLEWXd9GLINPSNARTNYNEKFNTXd10Xd11TXd12TXd13DKSXd14STAYMXd15LSSLXd16SEDXd17AVYYCARGGDGDYFDYWGQGTTXd18TVSS
其中由X标识的至少一个氨基酸可以是与列于SEQ ID NO.:26(小鼠VH)中的多肽中的相应氨基酸相比的一个氨基酸取代并且；
其中Xd1可以是疏水性氨基酸(例如，V或L)；
其中Xd2可以是P或S；
其中Xd3可以是疏水性氨基酸(例如，L或V)；
其中Xd4可以是V或K；
其中Xd5可以是A或S；
其中Xd6可以是疏水性氨基酸(例如，L或V)；
其中Xd7可以是碱性氨基酸(例如，K或R)；
其中Xd8可以是R或A；
其中Xd9可以是疏水性氨基酸(例如，I或M)；
其中Xd10可以是碱性氨基酸(例如，K或R)；
其中Xd11可以是疏水性氨基酸(例如，A或V)；
其中Xd12可以是疏水性氨基酸(例如，L或I)；
其中Xd13可以是疏水性氨基酸(V或A)；
其中Xd14可以是中性亲水性氨基酸(例如，S或T)；
其中Xd15可以是Q或E；
其中Xd16可以是T或R。
其中Xd17可以是中性亲水性氨基酸(例如，S或T)；并且
其中Xd18可以是疏水性氨基酸(L或V)。
SEQ ID NO.:45嵌合25D8重(Igg1)链(小鼠可变结构域和人恒定区)
QVQVQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGLINPSNARTNYNEKFNTKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGGDGDYFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO.:46人源化25D8重(Igg1)链(人源化可变结构域和人恒定区)QVQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGLINPSNARTNYNEKFNTRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGDGDYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO.:4725E9轻链小鼠可变结构域的CDR1
RSTKSLLHSNGNTYLY
SEQ ID NO.:4825E9轻链小鼠可变结构域的CDR2
RMSNLAS
SEQ ID NO.:4925E9轻链小鼠可变结构域的CDR3
MQHLEYPFT
SEQ ID NO.:5025E9重链小鼠可变结构域的CDR1
GYTFTDYDMH
SEQ ID NO.:5125E9重链小鼠可变结构域的CDR2
TIDPETGGTAYNQKFKG
SEQ ID NO.:5225E9重链小鼠可变结构域的CDR3
FYYTYSNYDVGFAY
SEQ ID NO.:5325D8轻链小鼠可变结构域的CDR1
RSSKSLLHSNGITYLY
SEQ ID NO.:5425D8轻链小鼠可变结构域的CDR2
QMSNLASG
SEQ ID NO.:5525D8轻链小鼠可变结构域的CDR3
AQNLELPYT
SEQ ID NO.:5625D8重链小鼠可变结构域的CDR1
GYTFTSYWMH
SEQ ID NO.:5725D8重链小鼠可变结构域的CDR2
LINPSNARTNYNEKFNT
SEQ ID NO.:5825D8重链小鼠可变结构域的CDR3
GGDGDYFDY
SEQIDNO.:59
25E9重(Igg2)链人源化变体2(亦称：H2)(人源化可变结构域和人恒定区)
EIQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYDMHWVRQAPGQGLEWIGTIDPETGGTAYNQKFKGRATLTADRSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTSFYYTYSNYDVGFAYWGQGTLVTVSSASTKGP SVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECP PCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKG LPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQIDNO.:60
25E9重(Igg2)链人源化变体3(亦称：H3)(人源化可变结构域和人恒定区)
EIQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYDMHWVKQAPGQGLEWIGTIDPETGGTAYNQKFKGKATLTADRSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTSFYYTYSNYDVGFAYWGQGTLVTVSSASTKGP SVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECP PCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKG LPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQIDNO.:61
25E9重(Igg2)链人源化变体4(亦称：H4)(人源化可变结构域和人恒定区)
EIQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYDMHWVKQAPGHGLEWIGTIDPETGGTAYNQKFKGKATLTADRSTSTAYMELSSLTSEDTAVYYCTSFYYTYSNYDVGFAYWGQGTLVTVSSASTKGP SVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECP PCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKG LPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO.:62(25E9轻链小鼠可变结构域的核苷酸序列)
GATATTGTGATGACCCAGGCTGCACCCTCTGTACCTGTCACTCCTGGAGAGTCAGTATCCATCTCCTGCAGGTCTACTAAGAGTCTCCTGCATAGTAATGGCAACACTTACTTGTATTGGTTCCTGCAGAGGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATATATCGGATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCAGGAACTGCTTTCACACTGAGAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTGTTTATTACTGTATGCAACATCTAGAATATCCTTTCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
SEQ ID NO:63(25E9重链小鼠可变结构域的核苷酸序列)
GAGATCCAGCTGCAGCAGTCTGGAGTTGAGCTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGTGACGCTGTCCTGCAAGGCTTCGGGCTACACATTTACTGACTATGACATGCACTGGGTGAAGCAGACACCTGTTCATGGCCTGGAATGGATTGGAACTATTGATCCTGAAACTGGTGGTACTGCCTACAATCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCGGACAGATCCTCCACCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTACTGTACAAGTTTCTACTATACTTACTCTAATTACGACGTGGGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
SEQ ID NO.:64(人源化25E9轻链可变结构域-变体1的核苷酸序列-没有示出编码信号序列的部分)
gacatcgtgatgacccagtcccccctgtccctgcctgtgacacctggcgagcccgcctccatctcctgccggtccaccaagtccctgctgcactccaacggcaacacctacctgtactggtatctgcagaagcccggccagtcccctcagctgctgatctaccggatgtccaacctggcctccggcgtgcccgacagattctccggctctggctccggcaccgacttcaccctgaagatctcccgggtggaagccgaggacgtgggcgtgtactactgcatgcagcacctggaataccccttcaccttcggcggaggcaccaaggtggaaatcaag
SEQ ID NO.:65(人源化25E9重链可变结构域-变体1的核苷酸序列-没有示出编码信号序列的部分)
gagattcagctgcagcagtcaggagccgaagtgaagaaacccggctccagcgtcaaggtgagttgcaaggcctccggatacactttcaccgactatgatatgcactgggtgagacaggcacctgggcagggtctggagtggatggggaccatcgatccagaaaccggcggaacagcctacaaccagaagtttaaaggtcgagtgacaattactgctgacaagtccaccagcacagcatatatggagctgtctagtctgcgttctgaagatacagccgtctactattgcacttctttctactacacctacagtaactacgacgtggggtttgcttactggggccagggaactctggtcaccgtgtcatcc
SEQ ID NO.:66：用于25D8轻链可变结构域的候选人模型
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGLQTPLTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO.:67：用于25D8轻链可变结构域的候选人模型
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRASQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCMQGLQTPLTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO.:68：用于25D8轻链可变结构域的候选人模型
DIVMTQSPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLLHSDGKTYLYWYLQKPGQPPQLLIYEVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQSIQLPYTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO.:69：用于25D8轻链可变结构域的人模型
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQ
SEQ ID NO.:70：用于25D8轻链可变结构域的候选人模型
DIVMTQPPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQ
SEQ ID NO.:71：用于25D8轻链可变结构域的候选人模型
DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLLHSDGKTYLYWYLQKPGQSPQLLIYEVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQSIQL
SEQ ID NO.:72：用于25D8轻链可变结构域的候选人模型
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSDGNNYLNWYLQKPGQSPQLLIYLVSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQPRXTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO.:73：用于25D8重链可变结构域的候选人模型
QVQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFGSYAISWVRQAPGQGLEWMGRIIPILGIATYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMDLSSLRSEDTAVYYCARGKGEFEGMDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO.:74：用于25D8重链可变结构域的候选人模型
QVQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGRIIPILGIANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDTHSWFAFDIWGQGTMVTVSS
SEQ ID NO.:75：用于25D8重链可变结构域的候选人模型
EVQLVQSGAEMKKPGASVKVSCKASGYSFSIYNIHWVRQAPGQGLEWMGWIHAGTGNRKYSQVFQDRVTITRDTSASTSYMELSSLTSEDTAVYYCARDPNFGDFDSWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.:76：用于25D8重链可变结构域的候选人模型
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARMYNWNFFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.:77：用于25D8重链可变结构域的候选人模型
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGDGYIQAFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.:78：用于25D8重链可变结构域的候选人模型
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR
SEQ ID NO.:79：用于25D8重链可变结构域的候选人模型
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR
SEQ ID NO.:80：用于25D8重链可变结构域的候选人模型
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYAISWVRQAPGQGLEWMGWINPGNGDTNYAQKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGRGDYFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.:81：用于25E9轻链可变结构域的候选人模型
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSTGNNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQFLQTPLTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO.:82：用于25E9轻链可变结构域的候选人模型
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRASQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCMQGLQTPLTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO.:83：用于25E9轻链可变结构域的候选人模型
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQ
SEQ ID NO.:84：用于25E9轻链可变结构域的候选人模型
DIVMTQPPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQ
SEQ ID NO.:85：用于25E9轻链可变结构域的候选人模型
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSDGNNYLNWYLQKPGQSPQLLIYLVSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQPRXTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO.:86：用于25E9重链可变结构域的候选人模型
QVQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYSISWVRQAPGHGLEWMGRIFPLLGVAKYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAVPRSSSYWFDPWGQGTLVTVSS 5
SEQ ID NO.:87：用于25E9重链可变结构域的候选人模型
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGNYDSSGYDDAFDIWGQGTMVTVSS
SEQ ID NO.:88：用于25E9重链可变结构域的候选人模型
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKLSCKASGDTFSSRPVSWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFRTTNYAQKFQGRVTITADESMTTAYLELRGLTSDDTAVYYCATTRMKITVFASTFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.:89：用于25E9重链可变结构域的候选人模型
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYC
SEQ ID NO.:90：用于25E9重链可变结构域的候选人模型
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYC
SEQ ID NO.:91：用于25E9重链可变结构域的候选人模型
EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEWMGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCAT
SEQ ID NO.:92：用于25E9重链可变结构域的候选人模型
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYAISWVRQAPGQGLEWMGWINPGNGDTNYAQKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAPGYGSRGDYXFDYWGQGTLVTVSS

Claims (68)

1.一种抗体或其抗原结合片段，能够特异性地结合Siglec-15并且选自下组，该组由以下各项组成：
a.一种抗体或其抗原结合片段，具有与SEQ ID NO.:6至少80％一致的一个轻链可变区和/或与SEQ ID NO.:12至少80％一致的一个重链可变区，其中所述抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO.:6或SEQ ID NO.:12相比的至少一个氨基酸取代并且其中所述氨基酸取代是在一个互补决定区(CDR)的外面以及；
b.一种抗体或其抗原结合片段，具有与SEQ ID NO.:22至少80％一致的一个轻链可变区和/或与SEQ ID NO.:26至少80％一致的一个重链可变区，其中所述抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO.:22或SEQ ID NO.:26相比的至少一个氨基酸取代并且其中所述氨基酸取代是在一个互补决定区(CDR)的外面。
2.如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中该至少一个氨基酸取代是在该轻链可变区中。
3.如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含至少三个氨基酸取代。
4.如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段在该轻链可变区和/或重链可变区中包含从一至二十五个氨基酸取代。
5.如权利要求4所述的抗体或抗原结合片段，其中该氨基酸取代是在该轻链可变区中。
6.如权利要求4所述的抗体或抗原结合片段，其中该氨基酸取代是在该重链可变区中。
7.如权利要求1至6中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述氨基酸取代是保守性的。
8.如权利要求1至7中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该轻链可变区包含SEQ ID NO.:33的至少90个氨基酸。
9.如权利要求8所述的抗体或抗原结合片段，其中该轻链可变区包含SEQ ID NO.:34的至少90个连续氨基酸。
10.如权利要求9所述的抗体或抗原结合片段，其中该轻链可变区包含SEQ ID NO.:35的至少90个连续氨基酸。
11.如权利要求10所述的抗体或抗原结合片段，其中该轻链可变区包含SEQ ID NO.:8或10的至少90个连续氨基酸。
12.如权利要求11所述的抗体或抗原结合片段，其中该轻链可变区是如在SEQ ID NO.:8或在SEQ ID NO.:10中所列出。
13.如权利要求1至12中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该重链可变区包含SEQ ID NO.:36的至少90个连续氨基酸。
14.如权利要求13所述的抗体或抗原结合片段，其中该重链可变区包含SEQ ID NO.:37的至少90个连续氨基酸。
15.如权利要求14所述的抗体或抗原结合片段，其中该重链可变区包含SEQ ID NO.:38的至少90个连续氨基酸。
16.如权利要求15所述的抗体或抗原结合片段，其中该重链可变区包含SEQ ID NO.:14、SEQ ID NO.:16、SEQ ID NO.:18或SEQ ID NO.:20的至少90个连续氨基酸。
17.如权利要求15所述的抗体或抗原结合片段，其中该重链可变区是如在SEQ ID NO.:14、SEQ ID NO.:16、SEQ ID NO.:18或在SEQ ID NO.:20中所列出。
18.如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中该轻链可变区包含SEQ ID NO.:33的至少90个连续氨基酸并且其中该重链可变区包含SEQ IDNO.:36的至少90个连续氨基酸。
19.如权利要求18所述的抗体或抗原结合片段，其中该轻链可变区包含SEQ ID NO.:34的至少90个连续氨基酸并且其中该重链可变区包含SEQ IDNO.:37的至少90个连续氨基酸。
20.如权利要求19所述的抗体或抗原结合片段，其中该轻链可变区包含氨基酸SEQ ID NO.:35的至少90个连续氨基酸并且其中该重链可变区包含SEQ ID NO.:38的至少90个连续氨基酸。
21.如权利要求20所述的抗体或抗原结合片段，其中该轻链可变区包含SEQ ID NO.:8或SEQ ID NO.:10的至少90个连续氨基酸并且其中该重链可变区包含SEQ ID NO.:14、SEQ ID NO.:16、SEQ ID NO.:18或SEQ ID NO.:20的至少90个连续氨基酸。
22.如权利要求21所述的抗体或抗原结合片段，其中该轻链可变区是如在SEQ ID NO.:8或SEQ ID NO.:10中所列出并且其中该重链可变区是如在SEQ ID NO.:14、SEQ ID NO.:16、SEQ ID NO.:18或SEQ ID NO.:20中所列出。
23.如权利要求1至7中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该轻链可变区包含SEQ ID NO.:39的至少90个氨基酸。
24.如权利要求23所述的抗体或抗原结合片段，其中该轻链可变区包含SEQ ID NO.:40的至少90个连续氨基酸。
25.如权利要求24所述的抗体或抗原结合片段，其中该轻链可变区包含SEQ ID NO.:41的至少90个连续氨基酸。
26.如权利要求25所述的抗体或抗原结合片段，其中该轻链可变区包含SEQ ID NO.:24的至少90个连续氨基酸。
27.如权利要求26所述的抗体或抗原结合片段，其中该轻链可变区是如在SEQ ID NO.:24中所列出。
28.如权利要求1至7或23至27中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该重链可变区包含SEQ ID NO.:42的至少90个连续氨基酸。
29.如权利要求28所述的抗体或抗原结合片段，其中该重链可变区包含SEQ ID NO.:43的至少90个连续氨基酸。
30.如权利要求29所述的抗体或抗原结合片段，其中该重链可变区包含SEQ ID NO.:44的至少90个连续氨基酸。
31.如权利要求30所述的抗体或抗原结合片段，其中该重链可变区包含SEQ ID NO.:26的至少90个连续氨基酸。
32.如权利要求31所述的抗体或抗原结合片段，其中该重链可变区是如在SEQ ID NO.:26中所列出。
33.如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中该轻链可变区包含SEQ ID NO.:39的至少90个连续氨基酸并且其中该重链可变区包含SEQ IDNO.:42的至少90个连续氨基酸。
34.如权利要求33所述的抗体或抗原结合片段，其中该轻链可变区包含SEQ ID NO.:40的至少90个连续氨基酸并且其中该重链可变区包含SEQ IDNO.:43的至少90个连续氨基酸。
35.如权利要求34所述的抗体或抗原结合片段，其中该轻链可变区包含SEQ ID NO.:41的至少90个连续氨基酸并且其中该重链可变区包含SEQ IDNO.:44的至少90个连续氨基酸。
36.如权利要求35所述的抗体或抗原结合片段，其中该轻链可变区包含SEQ ID NO.:24的至少90个连续氨基酸并且其中该重链可变区包含SEQ IDNO.:26的至少90个连续氨基酸。
37.如权利要求36所述的抗体或抗原结合片段，其中该轻链可变区是如在SEQ ID NO.:24中所列出并且其中该重链可变区是如在SEQ ID NO.:26中所列出。
38.如权利要求1至37中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包含一个恒定区的氨基酸。
39.如权利要求38所述的抗体或抗原结合片段，其中该恒定区的这些氨基酸是来自一种人抗体。
40.如权利要求1至40中任一项所述的抗体或抗原结合片段，包含一个人IgG1恒定区。
41.如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中该抗体包含如在SEQ ID NO.:23中所列出的一个轻链。
42.如权利要求1或41所述的抗体或抗原结合片段，其中该抗体包含如在SEQ ID NO.:27中所列出的一个重链。
43.如权利要求1或41所述的抗体或抗原结合片段，其中该抗体包含如在SEQ ID NO.:46中所列出的一个重链。
44.如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中该抗体包含如在SEQ ID NO.:7中所列出的一个轻链。
45.如权利要求1或44所述的抗体或抗原结合片段，其中该抗体包含如在SEQ ID NO.:29中所列出的一个重链。
46.如权利要求45所述的抗体或抗原结合片段，其中该抗体包含如在SEQ ID NO.:13中所列出的一个重链。
47.如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体是选自下组，该组由以下各项组成：
a.包含如在SEQ ID NO.:7中所列出的一个轻链和如在SEQ ID NO.:13中所列出的一个重链的一种抗体或其抗原结合片段；
b.包含如在SEQ ID NO.:7中所列出的一个轻链和如在SEQ ID NO.:15中所列出的一个重链的一种抗体或其抗原结合片段；
c.包含如在SEQ ID NO.:7中所列出的一个轻链和如在SEQ ID NO.:17中所列出的一个重链的一种抗体或其抗原结合片段；
d.包含如在SEQ ID NO.:7中所列出的一个轻链和如在SEQ ID NO.:19中所列出的一个重链的一种抗体或其抗原结合片段；
e.包含如在SEQ ID NO.:7中所列出的一个轻链和如在SEQ ID NO.:29中所列出的一个重链的一种抗体或其抗原结合片段；
f.包含如在SEQ ID NO.:7中所列出的一个轻链和如在SEQ ID NO.:59中所列出的一个重链的一种抗体或其抗原结合片段；
g.包含如在SEQ ID NO.:7中所列出的一个轻链和如在SEQ ID NO.:60中所列出的一个重链的一种抗体或其抗原结合片段；
h.包含如在SEQ ID NO.:7中所列出的一个轻链和如在SEQ ID NO.:61中所列出的一个重链的一种抗体或其抗原结合片段；
i.包含如在SEQ ID NO.:9中所列出的一个轻链和如在SEQ ID NO.:13中所列出的一个重链的一种抗体或其抗原结合片段；
j.包含如在SEQ ID NO.:9中所列出的一个轻链和如在SEQ ID NO.:15中所列出的一个重链的一种抗体或其抗原结合片段；
k.包含如在SEQ ID NO.:9中所列出的一个轻链和如在SEQ ID NO.:17中所列出的一个重链的一种抗体或其抗原结合片段；
l.包含如在SEQ ID NO.:9中所列出的一个轻链和如在SEQ ID NO.:19中所列出的一个重链的一种抗体或其抗原结合片段；
m.包含如在SEQ ID NO.:9中所列出的一个轻链和如在SEQ ID NO.:29中所列出的一个重链的一种抗体或其抗原结合片段；
n.包含如在SEQ ID NO.:9中所列出的一个轻链和如在SEQ ID NO.:59中所列出的一个重链的一种抗体或其抗原结合片段；
o.包含如在SEQ ID NO.:9中所列出的一个轻链和如在SEQ ID NO.:60中所列出的一个重链的一种抗体或其抗原结合片段；
p.包含如在SEQ ID NO.:9中所列出的一个轻链和如在SEQ ID NO.:61中所列出的一个重链的一种抗体或其抗原结合片段；
q.包含如在SEQ ID NO.:23中所列出的一个轻链和如在SEQ ID NO.:27中所列出的一个重链的一种抗体或其抗原结合片段以及；
r.包含如在SEQ ID NO.:23中所列出的一个轻链和如在SEQ ID NO.:46中所列出的一个重链的一种抗体或其抗原结合片段。
48.如权利要求1至47中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该抗原结合片段是一种scFv、Fab、Fab'或(Fab')2。
49.如权利要求1至48中任一项所述的抗体或抗原结合片段，与一个细胞毒性部分缀合。
50.如权利要求1至48中任一项所述的抗体或抗原结合片段，与一个可检测部分缀合。
51.如权利要求1至50中任一项所述的抗体或抗原结合片段，用于在治疗骨丢失中使用。
52.一种分离的抗体或抗原结合片段，能够与如权利要求1至50中任一项所述的抗体或抗原结合片段竞争。
53.一种核酸，编码如权利要求1至48中任一项所述的抗体或抗原结合片段的一个轻链可变结构域和/或一个重链可变结构域。
54.一种载体，包含如权利要求53所述的核酸。
55.如权利要求54所述的载体，其中所述载体是一种表达载体。
56.一种分离的细胞，包含如权利要求53所述的核酸。
57.如权利要求56所述的分离的细胞，其中所述细胞包含编码一个轻链可变结构域的一种核酸和编码一个重链可变结构域的一种核酸。
58.如权利要求57所述的分离的细胞，其中所述细胞能够表达、组装和/或分泌一种抗体或其抗原结合片段。
59.一种分离的细胞，包含或表达如权利要求1至48中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
60.如权利要求59所述的分离的细胞，其中所述细胞包含编码一个轻链可变结构域的一种核酸和编码一个重链可变结构域的一种核酸。
61.如权利要求60所述的分离的细胞，其中所述细胞能够表达、组装和/或分泌一种抗体或其抗原结合片段。
62.一种药物组合物，包含如权利要求1至50中任一项所述的抗体或抗原结合片段以及一种药学上可接受的载体。
63.一种组合物，包含如权利要求1至50中任一项所述的抗体或抗原结合片段以及一种载体。
64.一种治疗骨丢失的方法，该方法包括向有需要的受试者给予如权利要求1至49中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
65.如权利要求64所述的方法，其中骨丢失是与以下各项相关联：癌症、癌症治疗、骨质疏松症、骨质减少、骨软化症、甲状旁腺功能亢进、甲状腺功能减退、甲状腺功能亢进、性腺功能减退症、甲状腺毒症、全身性肥大细胞增多症、成人型低磷酸酯酶症、肾上腺皮质功能亢进、成骨不全、佩吉特氏病、库兴氏病/综合征、特纳氏综合征、戈谢病、埃-当二氏综合征、马方氏综合征、门克斯综合征、范科尼氏综合征、多发性骨髓瘤、高钙血症、低钙血症、关节炎、牙周病、软骨病(包括维生素D依赖性I型和II型以及x连锁低血磷佝偻病)、骨成纤维发生不全、骨硬化病症如致密性成骨不全症或由巨噬细胞介导的炎性过程骨引起的损害。
66.一种试剂盒，包括如权利要求1至50中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
67.如权利要求1至50中任一项所述的抗体或抗原结合片段在制造用于治疗骨丢失的药剂中的用途。
68.如权利要求67中所定义的用途，其中骨丢失是与以下各项相关联：癌症、癌症治疗、骨质疏松症、骨质减少、骨软化症、甲状旁腺功能亢进、甲状腺功能减退、甲状腺功能亢进、性腺功能减退症、甲状腺毒症、全身性肥大细胞增多症、成人型低磷酸酯酶症、肾上腺皮质功能亢进、成骨不全、佩吉特氏病、库兴氏病/综合征、特纳氏综合征、戈谢病、埃-当二氏综合征、马方氏综合征、门克斯综合征、范科尼氏综合征、多发性骨髓瘤、高钙血症、低钙血症、关节炎、牙周病、软骨病(包括维生素D依赖性I型和II型以及x连锁低血磷佝偻病)、骨成纤维发生不全、骨硬化病症如致密性成骨不全症或由巨噬细胞介导的炎性过程引起的损害。
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