TWI446918B

TWI446918B - Compositions for the treatment and / or prevention of skin disorders

Info

Publication number: TWI446918B
Application number: TW099109918A
Authority: TW
Inventors: Hiroaki Higuchi; Reiko Kuroda; Atsushi Narise; Katsumasa Shimizu; Kenji Osawa; Yoshihiro Nomura
Original assignee: Lotte Co Ltd
Priority date: 2009-03-31
Filing date: 2010-03-31
Publication date: 2014-08-01
Also published as: CN102365090B; EP2415476A4; CN102365090A; WO2010114149A1; US20120015063A1; EP2415476A1; HK1165320A1; KR20120027172A; TW201102079A; JPWO2010114149A1

Description

用於皮膚失調之治療及/或預防之組成物

本發明係關於一種山竹果皮的萃取物所構成之用於皮膚失調之治療及/或預防之組成物。

皮膚的皺紋、彈性降低、水分保持能力降低等皮膚失調，使得具有皮膚失調的人看起來變老，損害外表，甚至也會有產生癢或痛等不愉快感覺的情況。因此，期望能夠有皮膚失調的治療或預防。

皮膚失調的原因並未完全清楚，而其大多被認為是活性氧所造成。活性氧，是指氧在化學方面發揮活性的化學物種，非常不安定，並且表現出強氧化力。就活性氧而言，已知有超氧陰離子自由基、羥基自由基、過氧化氫、單重態氧等。另一方面在生物體中，超氧歧化酶(SOD)或觸酶、麩胺基硫過氧化酶等各種酵素，進一步藉由維生素E、維生素C、β-胡蘿蔔素、尿酸等的功能，具備了除去活性氧的抗氧化作用。但是，活性氧的產生若過剩，則會超過生物體所具備的抗氧化作用。將如此的狀態稱為氧化逆境狀態，在氧化逆境狀態之中，蛋白質、脂質、糖以及核酸等會被氧化。

在皮膚組織之中，活性氧會造成表皮的角化細胞受到傷害，細胞外基質的代謝變亂，其結果，角質厚度的不均勻化或角質層阻隔機能的降低所引起的乾燥，甚至導致皺紋發生。另外，在真皮中，活性氧會造成纖維芽細胞受到傷害，真皮膠原蛋白量的降低、膠原蛋白的交聯形成受到促進，真皮的柔軟性或伸縮性降低。如此的機制的詳細而言，認為如以下所述般。亦即，活性氧會對表皮組織細胞的受體或其配位體產生影響，引起來自表皮角化細胞或真皮纖維芽細胞的介白素1(IL-1：interleukin 1)或TNF-α(tumornecrosis factor-α)等細胞介素的產生，另外，還會對轉錄因子造成影響，誘導AP-1(activator protein-1)或NF-κβ的活性化、基質金屬蛋白酶(MMP：matrix metalloprotease)的產生增加。特別是MMPs的活性化認為會形成皺紋以及促進老化。

在皮膚組織之中，就誘導活性氧的代表性物質而言，已知為紫外線。紫外線係10～400nm的不可見光，由對人體或環境影響的差異，被分類成UVA(315～400nm)、UVB(280～315nm)、UVC(280nm以下)。一般而言，人們日常接受到的紫外線主要是來自太陽光。在太陽光之中，包含了波長為UVA、UVB、UVC的紫外線。其中，UVC被臭氧層吸收，幾乎不會到達地表，而UVA與UVB的一部份會到達地表，導致皮膚發生各種變化。由於紫外線的曝露，在皮膚組織會產生過氧化氫、超氧化物陰離子、單重態氧等。紫外線重覆且長年的暴露，會對皮膚的構造與機能造成不良影響。這樣的現象稱為光老化。另外還已知由紫外線照射所造成的發炎，亦即曬傷(sun burn)，甚至會導致皮膚組織中活性氧的生成。關於紫外線曝露造成對於真皮的影響，亦確認了一部份藉由表皮而受到控制。

山竹，其原產地在馬來半島附近，為藤黃科(Guttiferae)福木屬的常綠喬木，而廣佈於泰國或印度、斯里蘭卡、馬來西亞等地，被栽培作為果樹。不僅如此，山竹在東南亞地區，自古以來就被使用作為天然藥物，已知有抗發炎作用或抗菌效果，故山竹一直被使用於作為解熱劑、感染症治療藥，還有皮膚的發炎或傷之治療。

關於山竹的抗氧化作用，有如以下這樣的報告。已知在山竹果皮萃取物中含多種有效成分，以帶有非常地強力抗氧化作用的氧雜蒽酮為首，兒茶素或多酚、多醣、礦物質、維生素等物質皆豐富地被包含在內。其中也有發展出關於多酚的一種：氧雜蒽酮的研究，已經報告出各種氧雜蒽酮類(Journal of Agricultural and food chemistry 54：2077-2082,2006)。就山竹果皮所含特有的氧雜蒽酮而言，代表性的物質有α-mangostin與γ-mangostin，該等之中，被指出具有脂質的氧化抑制作用。已知特別是γ-mangostin具有比α-生育酚或BHA更強的氧化抑制作用，或與α-生育酚同等的自由基除去作用(YAKUGAKU ZASSHI 114(2)：129-133,1994)。另一方面，亦已知α-mangostin以及γ-mangostin具有抗組織胺效果或抗血清素效果(日本特許第3968405)。

另一方面，山竹在與皮膚、肌膚的改善、治療等相關的方面，有如以下所述這些報告。日本特開2007-31287揭示了含有露兜樹(Pandanus)果實成分的化妝料，在其中也揭示了摻合山竹萃取物的情況。日本特開2002-47125揭示了含有基質金屬蛋白酶阻礙劑的皮脂分泌抑制劑，並揭示了山竹萃取物含有該阻礙劑。另外，日本特開平9-87155揭示了以山竹為有效成分的紫外線吸收劑。另外，日本特願2008-134246報告出藉由口服攝取山竹萃取物，能治療、預防特異反應性皮膚炎。但是，此報告其對象集中在特異反應性皮膚炎。亦即，在該等報告中，任一者皆未揭示出山竹萃取物之中不含其他有效成分而使用作為皮膚失調之治療及/或預防用之組成物的情形。

另外，在山竹果皮的萃取物方面，曾經實施了各種安全性測試。在日本特開平5-17365的段落編號[0015]，揭示了使用小鼠由口服投予進行急性毒性測試，其結果，即使以10g/Kg投予山竹果皮萃取物，也不認為有死亡例。再者，在日本特開平4-244004的[0047]所揭示的安全性測試中，進行了對人體皮膚塗佈山竹果皮萃取物的刺激性測試，並指出其刺激性極低而安全性高。

另一方面，除了山竹以外，作為減低或除去活性氧作用的成分，已知有例如綠茶多酚或葡萄種子中的原花青素。(Journal of investigative Dermatology 122：1480-1487,2004)該文獻報告出綠茶多酚，在無毛小鼠皮膚，具有抑制起因於UV的氧化傷害或MMP表現的效果。(Molecular Cancer Therapeutics 6(3)：995-1005,2007)該文獻報告出葡萄種子中之原花青素會抑制UVB造成的氧化逆境，阻礙MAPK或NF-κβ的活性化。

在上述任一文獻之中，皆並未揭示山竹萃取物具有皮膚失調的治療及/或預防效果。本發明目的為提供一種用於皮膚失調之治療及/或預防之組成物，係由以極性溶劑萃取山竹(Garciniamango stana L.)果皮而得的萃取物所構成者。

[用於解決課題之方法]

本發明申請人等，以提供由以極性溶劑萃取山竹(Garcinia mangostana L.)果皮而得的萃取物所構成之用於皮膚失調之治療及/或預防之組成物為目的，潛心進行研究的結果，發現由以極性溶劑萃取山竹果皮而得的物質，能治療及/或預防皮膚失調，以至完成本發明。

亦即，本發明提供一種用於皮膚失調之治療及/或預防之組成物，係由以極性溶劑萃取山竹(Garcinia mangostana L.)果皮而得的萃取物所構成者。

本發明提供前述用於皮膚失調之治療及/或預防之組成物，其中前述皮膚失調係由活性氧所造成者。

本發明提供前述用於皮膚失調之治療及/或預防之組成物，其中前述皮膚失調係由由紫外線照射所造成者。

進一步本發明還提供一種食品，係含有前述用於皮膚失調之治療及/或預防之組成物。

在本發明中，山竹果皮，可使用由山竹果實(新鮮或乾燥品)所得到者。山竹果皮可直接使用，而若考慮萃取率的提升，則以製成破碎或粉末之後再進行萃取為適合。另外，亦可在萃取前以非極性溶劑使山竹果皮脫脂。

本發明之萃取，係採用由極性溶劑的甲醇、乙醇、正丙醇、2-丙醇、正丁醇、丙酮、醋酸乙酯、及水所構成之群中選出的極性溶劑至少1種溶劑而實施。亦可將兩種以上的溶劑組合而實施。另外，若考慮作為口服投予劑或飲食品使用，則使用乙醇或水與乙醇的組合作為萃取溶劑，在安全性的觀點上為適合。萃取的溫度並沒有特別規定，而從萃取效率的觀點上來考量，以室溫至溶劑的沸點溫度之範圍為適合。萃取時間會依照溶劑種類、果皮狀態(新鮮或乾燥品、粉碎物或粉末等)及萃取溫度而改變，而以0.5～24小時之範圍為適合。

萃取物亦可依照必要藉由蒸發器等，使萃取溶劑濃縮或除去。另外，萃取物亦可依照必要，藉由溶劑區分或層析精製而使用。

本說明書中，皮膚係與肌膚同義，是指動物身體的表層，由表皮、真皮、皮下組織所構成。在本說明書中，將具有皮膚發炎、水分減少、柔軟性降低、皺紋發生之中至少一個的狀態稱為皮膚失調。

本說明書中，活性氧是指氧在化學方面發揮活性的化學物種，非常不安定，並且表現出強氧化力，舉例而言，可列舉超氧陰離子自由基、羥基自由基、過氧化氫、單重態氧、一氧化氮、二氧化氮、臭氧、過氧化脂質。

本說明書中，紫外線是指具有10～400nm波長的光線。

本發明之用於皮膚失調之治療及/或預防之組成物的投予方法並沒有受到限定，而宜為經由口服攝取。因此，本發明之用於皮膚失調之治療及/或預防之組成物，可添加至清涼飲料、點心、冷凍點心、乳製品、酒類及肉類等食品。

用以作為皮膚失調之治療及/或預防之組成物的山竹果皮萃取物的投予量，係依照投予方法及必要的治療而變化，無法一概而定，而在口服攝取萃取物的情況，動物為每1kg60～250mg、人體為0.3mg～300mg/kg體重/天(較佳為0.5mg～200mg/kg體重/天)。

本發明之用於皮膚失調之治療及/或預防之組成物，可規定為在通常一天的食品攝取量之中，滿足上述有效量的摻合量。亦可將一天的份量分成數次攝取。

[發明之效果]

藉由本發明，可提供山竹果皮的萃取物所構成之用於皮膚失調之治療及/或預防之組成物。

山竹被稱為水果的女王，其果實被提供於食用方面，亦為知名度高、印象良好的材料。因此山竹果皮的萃取物所構成之用於皮膚失調之治療及/或預防之組成物，容易被消費者接受，適合使用作為在食品中所添加的組成物。進一步而言，本發明，由於是山竹之中通常應廢棄的果皮之萃取物，因此可廉價地取得原料，由環境保護的觀點考量亦為合適。

另外，本發明之萃取物，使用極性溶劑由山竹萃取而得，不需要進一步的精製，即可得到上述效果。

於以下列舉本發明之例作說明，而本發明之範圍並不受以下例子限定。

實施例1 山竹果皮萃取物之調製(引用自PAM0712)

山竹果皮萃取物，可由如以下的方法得到。亦即，將山竹的未乾燥果皮100g粉碎，在1L的70%乙醇中，於80℃攪拌1小時進行萃取。將其過濾，再將濾液以蒸發器減壓乾燥，得到27.4g的萃取物。

實施例2

藉由加入山竹果皮萃取物的混合飼料投予所產生的皮膚失調的改善效果之確認，實驗材料以及實驗方法

1.　使用的動物以及飼養環境

將54隻6週歲的雄性Hos:HR-1系無毛小鼠，經過1週的預備飼養之後，使用作為實驗動物。使用以下所述的飼料，以自由攝取、自由飲水的方式，在25℃環境下進行飼養。另外，在皮膚水分含量測定時，係以濕度計測定飼養室的濕度。實驗全部基於東京農工大學動物實驗委員會的承認(No.19-76)而進行。

2.　投予試樣之調製法

投予飼料之調製，係委託Oriental酵母股份有限公司。0.072%山竹果皮萃取物混合飼料、0.15%山竹果皮萃取物混合飼料，另外，正控制組係使用0.24%葡萄糖胺混合飼料、負控制組係使用CRF-1飼料。每天的山竹果皮萃取物攝取量，其基準定在0.072%群為120mg/kg body weight；在0.15%為250mg/kg body weight。

3.　飼養日程表

關於測試的日程表，係揭示於圖1。測試期間定為8週，在2007年10月至12月的期間實施。動物經過1週的預備飼養之後，注意不使皮膚水分含量與黏彈性偏離原本的狀況，而分成UV未照射CRF-1投予群(control(-)群)；UV未照射0.072%山竹果皮萃取物混合飼料投予群(0.072%(-)群)；UV照射CRF-1投予群(control(+)群)；UV照射0.072%山竹果皮萃取物混合飼料投予群(0.072%(+)群)；UV照射0.15%山竹果皮萃取物混合飼料投予群(0.15%(+)群)；UV照射0.24%葡萄糖胺(GlcN)混合飼料投予群(GlcN群)這6群。分群之後，對於UV照射群每週進行3次UV照射。亦即，第1週為1分鐘、第2週為2分鐘、第3、4週為3分鐘、第4週至解剖結束時為4分鐘，進行UV照射。總照射量為1.35J。另外，水分含量測定與食下量測定每週進行2次，體重測定每週進行1次。

4.　關於UV照射

UV照射係使用UVB lump GL20SE(SANKYO DENKI)，照射強度為0.3mW/cm² 而進行。UVB燈的分光分布係如圖2所表示般，放射出波長區域280nm～之光線，峰波長係在280nm。照射強度，係使用數位紫外線強度計UV-340(AS ONE)校準。照射時，在9cm×5cm×4cm的各個籠子內，每隔1小時半對小鼠照射，為了使各籠接受到的照射強度的差異得以緩和，因此每次皆使其旋轉而進行照射。

5.　皮膚水分含量測定

使用CORNEOMETER(註冊商標)CM825(COURAGE+KHAZAKA electronic GMBH公司製)，每週2次，在UVB照射前將探棒碰到小鼠腰部，然後進行測定。進行5次的測定後，以其平均值當作測定值。

6.　皮膚黏彈性測定

使用CUTOMETER(註冊商標)SEM575(KHAZAKA electronic GMBH公司製)，在分群時與解剖時進行測定。

此機器係藉由光線偵測器，對於被探棒吸引口吸進的皮膚高度，以1/100mm為單位進行測定的機械。由測定結果可得到以下r0～r9這10個參數。將各個值的定義揭示於圖3。

r0=e(a)：最初波形的振幅最大值(Uf)

r1=e(a+b)：最初波形的振幅最小值，回到原本狀態的能力(再變形能力)

r2=(e(a)-e(a+b))/e(a)：(Ua/Uf)

r3=e((r×a)+((r-1)×b))：最大振幅與再變形能力之差(全體的彈力)

r4=e((a+b)×r)

r5=(e(a)-e(a+0.1))/e(0.1)：不含黏性變形(viscous deformation)的皮膚全體彈性(Ur/Ue)

r6=(e(a)-e(0.1))/e(0.1)：對彈性膨脹的黏性之比例(Uv/Ue)

r7=(e(a)-e(a+0.1)/e(0.1)：將彈性部分與完全的波形(彈性100%)作比較之值(Ur/Uf)。

r8=e(b)：表示負壓解除後，回到原本狀態的力。

r9=r3-r0：在游標點的皮膚吸引高度

在此測試中，吸引口係使用直徑2mm的探棒，以300mbar的負壓吸引10秒鐘之後，急劇地解除負壓，然後在10秒鐘的解除吸引時間進行測定。測定3次，以其平均值當作測定值。

7.　背部皮膚照片拍攝

為了觀察小鼠背部的皮膚狀態，藉由數位相機進行攝影。背部照片，係在分群時與解剖前的兩次，以異氟烷對小鼠實施氣體麻醉，然後進行攝影。

8.　皮膚組織的取樣法

小鼠的解剖在飼養第57天進行，抽血後，進行皮膚組織的取樣。

使用8mm生物檢體打孔器，取樣病理解析用皮膚之後，取樣背部全部區域的皮膚，使用鎌狀手術刀的背部，除去皮下組織。皮膚組織係使用JFC-300型冷凍粉碎機(吉田製作所)，在液態氮下凍結粉碎，保存在-80℃。

9.　組織學的解析法

如同上述方式取樣而得的背部皮膚，以成為平貼的方式用濾紙包夾住，置於4cm dish，藉由滴入數滴Mildform 10N(和光純藥工業公司製)以進行固定。其後，依據常法進行石蠟包埋、切塊，並進行薄切，實施HE染色，進行病理組織標本的製作。標本製作委託札幌病理總合研究所股份有限公司。

觀察該等標本的全部視野，對於各個體的代表性的部分(切片的正中心附近，組織沒有隆起的部分)實施照片拍攝。另外，使用HE標本，對於各標本測定10處的表皮厚度，藉著求得其平均以進行表皮厚度的測定。

10.　來自皮膚組織的蛋白質萃取法

藉由甲醇使皮膚凍結粉碎物脫脂24小時之後，加入適量的含有蛋白酶抑制劑的PBS(-)，以旋轉器攪拌，洗淨2次，進行血清成分等的除去。其後，以皮膚組織濕重的10倍量進行添加萃取緩衝液(4M GuHCl/50mM Tris-HCl/0.1M NaCl/5mM苯甲脒鹽酸鹽/10mM EDTA-2Na/0.1M胺基己酸(pH7.4))，於4℃振動72小時進行萃取。其後，以4000rpm進行離心分離30分鐘，以RO水對上清液進行透析，透析結束後，冷凍乾燥。此試樣，係使用於膠原蛋白的偵測。

另外，以相對於皮膚濕重的2倍量加入其他的蛋白質萃取液(50mM Tris-HCl/1% TrionX-100/75mM NaCl/10mM EDTA-2Na/5mM苯甲脒鹽酸鹽/0.1M胺基己酸)，並進行萃取。萃取後，以4000rpm離心分離30分鐘，將上清液以過濾器過濾，以供羰基蛋白質偵測用。

11.　藉由SDS-PAGE及西方點墨法進行的偵測

SDS-PAGE係依據Laemmli等的方法進行。以Bradford法為基準，對冷凍乾燥物進行蛋白質定量，使各試樣的蛋白質濃度一致。在100℃加熱5分鐘之後，急速冷卻，製作出泳動用試樣。電泳後，進行CBB染色。在偵測膠原蛋白時，係使用6%丙烯醯胺膠體，偵測脫氫膽酸(實施例3)時，係使用7.5%丙烯醯胺膠體進行電泳。泳動結束後，使膠體以及PVDF膜在轉漬用緩衝液(25mM Tris-HCl/190mM Glycine/0.04% SDS/20% Methanol)中進行平衡化30分鐘。於冰冷下，使用濕式轉漬裝置(BiO-Rad公司製)，以0.05A通電18小時，使膠體中之蛋白質轉印至膜。轉印後，於室溫使PVDF膜在阻斷溶液中振動1小時。在膠原蛋白偵測方面，阻斷溶液係使用5%脫脂牛乳/TBS-Tween，在脫氫膽酸偵測方面，係使用以0.01U/ml的比例將軟骨素分解酵素ABC(生化學工業公司製)添加至5%脫脂牛乳/TBS-Tween之物。其後，1次抗體溶液(1次抗體；5%脫脂牛乳/TBS-Tween=1：1000)中，在室溫振動1小時。接下來，以TBS-Tween對膜實施5分鐘×4次的洗淨，在2次抗體溶液中以相同的方式，在室溫中振動1小時，以進行洗淨。抗原之偵測，使用了利用HRP反應的化學顯色法。使用ECL套件(Amersham-Pharmacia Biotech公司製)作為化學反應試藥，使FUJI MEDICAL X RAY FILM(Fuji Film公司製)感光之後，使薄膜顯像。顯像後的薄膜，使用影像解析軟體Scion Image(Scion Corporation公司製)，比較帶紋強度。

另外，在膠原蛋白的偵測方面，1次抗體係使用抗I型膠原蛋白(來自豬皮)兔抗血清，2次抗體係使用HRP標記抗兔IgG抗體。另外，在脫氫膽酸的偵測方面，1次抗體係使用抗脫氫膽酸核心蛋白質兔抗血清，2次抗體係使用HRP標記抗兔IgG抗體。

12.　來自皮膚組織的葡萄糖胺聚糖(GAG)萃取法

凍結粉碎後的皮膚，藉由乙醇在4℃脫脂1夜之後，相對於濕重而言，添加30倍量的0.5MNaOH，以旋轉器使其旋轉，同時在4℃反應20小時，藉此進行β脫離反應，使GAG由蛋白質游離出來。其後，加入所添加NaOH的一半量的1M HCl，以進行中和反應。使用pH測試紙確認是否已被中和。於此處，以NaOH的1.5倍量添加2×conc.的Actinase緩衝液，使其在100℃熱變性10分鐘。溶液回到50℃的時候，加入1片百里酚碎片作為防腐劑，以相對於最初添加的NaOH成為1%(w/v)的方式加入Actinase。在50℃使用振動機進行分解反應2天。此時，在從反應開始算起24小時後，再度添加與最初所加入相同量的Actinase。反應結束後，以最終濃度成為10%的方式添加三氯醋酸，在4℃放置1小時以除去蛋白質。其後，在0℃以9000g進行離心分離15分鐘，以DISMIC(註冊商標)(Advantec東洋股份有限公司公司製)過濾器將上清液過濾，進行透析。將透析結束後的液體冷凍乾燥，使冷凍乾燥物溶於mili-Q水，使用於纖維素醋酸酯膜電泳。

13.　藉由纖維素醋酸酯膜電泳進行的GAG解析法

為了鑑定無毛小鼠皮膚中葡萄糖胺聚糖之組成，纖維素醋酸酯膜電泳，係根據Hata等人的方法進行。藉著上述方法調製的GAG，係相對於萃取皮膚濕重100mg溶解於50μl的mili-Q水，製作出泳動用試樣。使用0.1M吡啶/0.47M蟻酸緩衝液，以每1cm膜寬1mA的定電流使0.5μl的試樣點(spot)在纖維素醋酸酯膜進行泳動。將溶解了玻尿酸(HA)、硫酸皮膚素(DS)、硫酸軟骨素(CS)1mg/ml之物各取50μl混入標準品中而使用。泳動結束後，以艾爾遜藍染色液(0.5%艾爾遜藍/25%乙醇/10%醋酸)進行染色，以10%醋酸進行脫色。

所得到之點(spot)，係使用影像解析軟體Scion Image(Scion Corporation)進行解析。

14.　使用TBA法的皮膚過氧化脂質測定法

TBA法，係使用作為對於絕大部分由脂質過氧化所產生的成分，脂質過氧化、丙二醛以及其他的醛、醛與蛋白質等反應物總合性地作測定的方法，對於在硫巴比妥酸(TBA)與游離自試樣的硫巴比妥酸反應性物質(TBARS)的反應所生成的紅色素進行定量，藉此測定脂質的過氧化度。

皮膚過氧化脂質度之測定，依據Ohkawa等人的方法進行。首先，於皮膚凍結粉碎物，以濕重成為15%(w/v)的方式添加1.15% KCl水溶液，並且攪拌。依照順序將8.1% SDS溶液100μl、醋酸緩衝液0.75ml、0.8% BHT醋酸溶液(抗氧化劑)25μl、0.8% TBA水溶液0.75ml、5mM FeCl₃ 350μl添加至50mg的組織均質物，並充分攪拌，在5℃保持60分鐘之後，在沸騰水浴中加熱60分鐘。冷卻後，加入mili-Q水0.5ml、丁醇-吡啶混合液(15：1，v/v)2.5ml，振盪混合，以3000rpm進行20分鐘離心分離。測定上清液在532nm的吸光度，由檢量線求得TBARS的量。此時，檢量線標準品方面，係使用1,1,3,3-四乙氧基丙烷(生化學用：和光純藥工業)代替皮膚凍結粉碎物，添加相同量的KCl水溶液，製作出blank。

15.　皮膚組織中氧化蛋白質之測定法

氧化蛋白質其中一種的羰基蛋白質，係氧化逆境的標記。使用Oxyblot^TM Protein Oxidation Detection Kit(CHEMICON(註冊商標)公司製)，進行羰基蛋白質之評估。具體的方法，如以下所述。

各群的試樣，係由BCA法進行蛋白質定量，使蛋白質濃度一致成為1.1mg/ml。相對於5μl的蛋白質試樣而言，添加5μl的12% SDS，於此添加10μl的2,4-二氫苯基腙(DNPH)溶液，在室溫恆溫15分鐘，藉此將DNPH誘導至羰基。其後，添加7.5μl的中和溶液而使反應結束。DNPH誘導化試樣，係使用10%膠體，供SDS-PAGE以使蛋白質分離，使用轉漬裝置，對PVDF膜進行轉漬。在常溫下將轉印後的膜浸漬於阻斷緩衝液(5%脫脂牛乳/TBS-Tween)1小時，進行阻斷之後，使其在常溫下與1次抗體進行反應1小時。反應後，以TBS-Tween實施5分鐘×4次的洗淨，使其與2次抗體在常溫下反應1小時。反應後，再度進行5分鐘×4次的洗淨。抗原的偵測方面，係採用利用HRP反應的化學顯色法。使用ECL套件(Amersham-Pharmacia Biotech)作為化學反應試藥，使FUJI MEDICAL X RAY FILM(Fuji Film公司製)感光之後，使薄膜顯像。顯像後的薄膜，係使用影像解析軟體Scion Image(Scion Corporation)，比較帶紋強度。

16.　血漿過氧化脂質(LPO)之測定

委託NIKKEN SEIL公司進行。

17.　統計處理

對於全部的參數確認是否有正規性、是否等分散，然後在正規分布且等分散的情況進行Tukey-kramer test，除此之外的情況進行Scheffe's F test。

結果 1.　基礎數據

為了調查UV照射以及混合飼料投予對小鼠有無影響，進行體重測定以及食下量測定。體重測定每週進行測定1次。每週2次分別對各籠進行食下量測定。將各個體重測定的結果揭示於圖4，食下量測定的結果揭示於圖5。在各群間並未觀察到體重之差。另外，關於食下量，在第4週以後，GlcN(+)群之中，相較於其他群，觀察到食下量較多的傾向，而食下量的上昇不會影響體重。

由食下量測定所求得各群的有效成分平均攝取量，在0.072%(-)群為129mg/kg/day；在0.072%(+)群為124mg/kg/day；在0.15%(+)群為269mg/kg body weight/day；在GlcN(+)群為434mg/kg/day(圖5B)。

2.　皮膚水分含量

為了針對UVB照射以及山竹果皮萃取物投予對皮膚水分含量造成的影響進行檢驗，使用CORNEOMETER CM 825測定皮膚水分含量。將結果揭示於圖6。圖6A係表示水分含量隨時間的變化與測定時的濕度，圖6B係表示第8週的水分含量。

在UVB照射群中，第3週左右開始觀察到水分含量有減少的傾向。至第5週，在各群間並未偵測到皮膚水分含量有明顯的差異，而第6週以後持續至第8週，確認了相對於control(-)而言，在control(+)之中有明顯的減少，以及相對於control(+)而言，在0.072%(+)有明顯的增加(p<0.05)。此外在第7、8週的時候，相對於control(+)而言，在GlcN(+)亦觀察到明顯的增加。在第8週的皮膚水分含量，在control(-)群為66.52±3.44；在control(+)群為57.60±6.71；在0.072%(+)群為62.89±2.92；在GlcN(+)群為62.96±2.78。

3.　皮膚彈性

皮膚彈性，係在分群時與測試結束時這兩次，使用CUTOMETER SEM575進行測定。

測定係對每一個體進行3次，使用其平均值作為測定值。關於R0之皮膚伸展性，相對於control(-)而言，在control(+)，確認有明顯的減少。會得到由於UV照射造成皮膚伸展性降低這樣的結果。另外，關於R1的皮膚恢復性，認為沒有明顯的差異，在各群皆沒有變化。關於反映該等數據而表示皮膚全體的彈性的R2值，相對於control(-)而言，在control(+)觀察到明顯的減少(圖7)。

4.　病理學的解析

為了調查對皺紋形成的影響，針對小鼠背部皮膚的皺紋狀態作觀察。以異氬烷進行氣體麻醉之後，藉由數位相機拍攝到背部照片，摘錄照片並揭示於圖8。在control(-)群中，確認了在往平行於脊椎的走向會有線條(圖8A)，這是由於小鼠的行動所造成消失或出現。在control(+)群中，與脊椎垂直的方向出現了線條(圖8B)，亦存在可確認皮膚發炎的個體。另外，在0.15%(+)群中，平行於脊椎方向的皺紋以及垂直方向的皺紋皆為淺薄的(圖8C)。

進一步製作HE染色標本，測定各群的表皮厚度。表皮厚度係使用HE染色標本，在各標本分別對10處作測定，求得各群的平均值。將HE染色標本各群代表性的圖揭示於圖9，將表皮厚度之測定結果揭示於圖10。表皮厚度，在control(-)為23.20±3.56μm；在0.072%(-)為21.88±5.17μm；在control(+)為38.72±7.56μm；在0.072%(+)為43.17±8.60μm；在0.15%(t)為36.74±5.92μm；在GlcN(+)為39.46±9.56μm。相對於control(-)而言，在control(+)、0.072%(+)、0.15%(+)、GlcN(+)，表皮厚度明顯增加，確認有肥厚化的現象。確認了由於受到UV照射，基底層的細胞內浮腫或細胞間浮腫增加，以及顆粒細胞sun-burn cell化的模樣。表皮的肥厚，尤其是有棘層的部分會變得肥厚。在0.15%(+)並未觀察到有棘層的肥厚化，而細胞狀態接近於未照射群，觀察到的則是細胞內浮腫，然而與0.072%(+)比較，細胞間浮腫有受到治療。

5.　藉由SDS-PAGE以及Western blotting進行的I型膠原蛋白定量

以各群的皮膚萃取物為試樣，就分離膠體而言，係使用6%聚丙烯醯胺Tris-HCl膠體作為分離膠體、3%聚丙烯醯胺Tris-HCl膠體作為濃縮膠體，進行電泳，藉由CBB染色確認。標記，係使用Prestained SDS-PAGE Standards High Range(Control 310001920)。將結果揭示圖11。由此結果確認了各試樣的蛋白質量為相等。

將西方點墨法的結果揭示於圖12A。在117kDa附近，觀察到推測為I型膠原蛋白α1鏈的帶紋，在200kDa附近，偵測到認為是β鏈的帶紋。圖12B，係藉由影像解析軟體Scion Image而使A的帶紋強度定量化的結果。帶紋強度，將control(-)定為1時，在0.072%(-)為1.56；在control(+)為2.29；在0.15%(+)為2.17；在0.072%(+)為1.28；在GlcN(+)為1.25(以α鏈與β鏈的平均值表示)(圖12B)。

6.　藉由纖維素醋酸酯膜電泳進行的GAG之鑑定

為了鑑定無毛小鼠皮膚萃取物中之GAG，特別是與皮膚的水分保持有關的玻尿酸(HA)的量，而進行纖維素醋酸酯膜電泳。將結果揭示於圖13A。藉由影像解析軟體Scion Image解析各點(spot)的濃度，將結果揭示於圖13B。HA的帶紋強度，若將control(-)定為1，則在0.072%(-)為1.03；在control(+)為1.25；在0.072%(+)為0.93；在0.15%(+)為0.86；在GlcN(+)為0.58。由於Uv照射使得HA量增加，而在相較於Control(+)觀察到皮膚水分含量的明顯增加的0.072%(+)山竹果皮萃取物投予的情況中，幾乎沒有觀察到其對HA量造成的變化。關於硫酸軟骨素(CS)係並未偵測到，而與3種標準品相異的點(spot)存在於CS之下游，在control(-)確認有濃的點(spot)。認為該點有可能是硫酸乙醯肝素(HS)，然而尚未進行鑑定。

7.　皮膚中過氧化脂質之定量

為了調查山竹果皮萃取物對皮膚的抗氧化效果，藉由TBA反應進行過氧化脂質之測定。在生物體內發生氧化逆境時，最容易受到障礙的是含高度不飽和脂肪酸的脂質。作為生物體的氧化逆境標記，係使用脂質羥基過氧化類以及硫巴比妥酸反應性物質(thiobarbituric acid-reactive substances：TBARS)，此方法，可理解為總合性地測定脂質過氧化度的有效方法。在Ohkawa法的反應之中，藉由EDTA或Fe離子的添加，可知試樣中的TBARS是何種物質。已知來自烯醛(alkenal)、二烯醛(alkadienal)類的紅色素的生成，會受到EDTA的阻礙，而藉由添加Fe離子會被增強。

在本測試之中，沒有添加任何物質的情況，幾乎沒有觀察到顯色，而在添加Fe離子的情況，有觀察到顯色，因此採用添加Fe離子的方法。

測定結果如圖14所揭示。TBARS測定的結果，在各群間並未偵測到明顯的差異。

8.　羰基蛋白質之定量

蛋白質亦為受到氧化傷害所影響的因子的其中一個，在發生光老化的皮膚之中，在真皮上部的蛋白質，可觀察到起因於ROS的傷害累積(Sander CS,2002)。蛋白質的氧化修飾，是指醛或酮的側鏈構造(羰基蛋白質)、酪胺酸交聯構造、胺基酸置換、胺基酸的氧化、胜肽鍵的開裂等。蛋白質的氧化傷害，例如使酵素活性變化、使構造蛋白質的機能失活、使對於蛋白質分解而言的敏感性變化(Shacter E,2000)。氧化修飾蛋白質之中具代表性的羰基蛋白質，其定量經常被使用。

使用蛋白質萃取液(1% TrionX-100/50mM Tris-HCl/75mM NaCl/10mM EDTA-2Na/5mM苯甲脒鹽酸鹽/0.1M胺基己酸)，由各群之皮膚組織得到萃取物，以該等當作試樣，進行電泳之後，藉由CBB染色，確認各試樣的蛋白質量。就分離膠體而言，係使用10%聚丙烯醯胺Tris-HCl膠體作為分離膠體，3%聚丙烯醯胺Tris-HCl膠體作為濃縮膠體。標記係使用Prestained SDS-PAGE Standards High Range(Lot. No. Control 310001920)。將結果揭示於圖15。由此結果，可確認各試樣的蛋白質量為相等。

各試樣的羰基蛋白質之評估，係依據前述「皮膚組織中氧化蛋白質之測定法」而實施。此評估法所得到各試樣之西方點墨法結果係揭示於圖16A。1次抗體係使用Rabbit Anti-DNP Antibody，2次抗體係使用Goat Anti-Rabbit IgG(HRP-conjugated)。在分子量97.4kDa與68kDa的附近偵測到濃的帶紋。另外，對於帶紋強度，使用圖像解析軟體Scion Image將濃度定量化，表示出將control(-)定為1時的相對強度(圖16B)。將control(-)定為1時，在0.072%(-)為1.18；在control(+)為3.18；在0.072%(+)為1.33；在0.15%(+)為1.86；在GlcN(+)為1.63，帶紋強度，在0.072%(+)為control(+)的約42%。

9.　血漿過氧化脂質之定量

測定了血漿中之過氧化脂質濃度，然而並未觀察到明顯的差異(圖17)。

考察

由以上可確認，由於UVB照射，在對照群之中，皮膚水分含量與皮膚彈性會降低，然而藉由山竹果皮萃取物投予，皮膚水分含量會增加。

已知山竹含有130種以上的有效成分。認為在本發明中，藉由多種成分總合性地、相乘地發揮作用，而發揮抗氧化作用，進一步而言，抗氧化作用以外的效果相乘，得到顯著的皮膚失調之治療及/或預防的效果。

Corneometer的測定區域為30～40μm，使用無毛小鼠的情況，考慮測定角質層與表皮一部份的水分含量。由病理學解析的結果可知，由於受到UV照射，表皮，特別是有棘層會變得肥厚，在基底細胞與有棘細胞出現細胞內浮腫以及細胞間浮腫。浮腫的狀態，與0.072%山竹果皮萃取物投予群相比，在0.15%山竹果皮萃取物投予群中觀察到治療效果，肥厚程度在0.15%(+)的情況亦為低的。由此現象，提示了山竹果皮萃取物的口服攝取，有治療在表皮的病理學變化的效果，顯示出其效果在0.15%混合飼料群的情況為顯著。但是，關於水分含量，在0.072%混合飼料投予群之中觀察到上昇。

就與皮膚水分含量上昇相關的因子而言，進行皮膚中之玻尿酸(HA)、膠原蛋白定量的結果，在I型膠原蛋白之定量中，UV照射控制群，與UV未照射控制群相比，可得到約2.1倍的帶紋強度。這認為是UV照射初期，生物體內的防御機制發揮作用，而傾向於生產增加，因此膠原蛋白增加。藉由投予山竹果皮萃取物，膠原蛋白的生產減少，而這能認為是由於UV照射傷害減輕，因此膠原蛋白沒有增加的傾向。

從羰基蛋白質的偵測得到的氧化逆境標記測定結果看來，結果可知，由UV照射會造成氧化逆境增加，而藉由山竹果皮萃取物攝取會減少，提示了山竹果皮萃取物的抗氧化作用，與皮膚狀態之治療關係很深。

由上述可知，在混合飼料投予實驗之中，觀察到藉由山竹果皮萃取物的口服攝取，水分含量會上昇。從其中一種氧化逆境標記的羰基蛋白質的偵測結果，提示了由山竹果皮萃取物投予所產生的水分含量上昇，係與氧化逆境的抑制相關。

實施例3

由山竹果皮萃取物口服強制投予所產生的皮膚失調改善效果之確認

1.　投予試樣之調製與口服投予

投予試樣，係使用山竹果皮製劑。亦即，使用以山竹果皮萃取物：阿拉伯膠=1：1而製劑化所得之物。在控制組中，僅使用阿拉伯膠，另外，使用膠原蛋白作為正控制組。製作出各濃度的溶液，在飼養期間中，使用胃插管每天將0.1ml/10g body weight的溶液口服投予至小鼠。製作出山竹果皮萃取物溶液為高濃度(24mg/ml)、低濃度(12mg/ml)這2種，阿拉伯膠溶液為24mg/ml、膠原蛋白溶液為20mg/ml之物。

2.　飼養日程表

關於測試日程表，係揭示於圖18。經過1週的預備飼養之後，以皮膚水分含量與黏彈性為基準進行分群，分成UV未照射阿拉伯膠投予(control(-)群)；UV未照射山竹果皮萃取物溶液(24mg/ml)投予(high(-)群)；UV照射阿拉伯膠投予(control(+)群)；UV照射山竹果皮萃取物溶液(24mg/ml)投予(high(+)群)；UV照射山竹果皮萃取物溶液(12mg/ml)投予(low(+)群)；UV照射膠原蛋白投予(collagen(+)群)的6群。進行每週3次的UVB照射與每天藉由插管進行強制口服投予。測試期間定為8週，在2007年5月至7月的期間實施。

3.　關於UVB照射

UVB照射，係使用UVB lump GL20SE(SANKYO DENKI)，照射強度為0.3mW/cm² ，每週進行3次。照射強度，係使用數位紫外線強度計UV-340(AS ONE)校準。在9cm×5cm×4cm的各個籠子內，每隔1小時半對小鼠照射，為了使得各籠接受到的照射強度的差異得以緩和，因此每次皆使其旋轉而進行照射。

照射時間以第1週為1分鐘、第2週為2分鐘、第3週為3分鐘的方式增加，其後進行3分鐘照射。由第38天開始，使照射強度上升，定為4分鐘，而由於在小鼠皮膚觀察到紅斑，因此第43天開始，以3分30秒進行照射。總照射量為1.224J。

4.　來自皮膚組織的蛋白質萃取法

與實施例2相同的方式取樣而得的皮膚組織，經過秤量並且分別將各群一併以乙醇進行脫脂24小時，用剪刀剪細之後，以含有蛋白酶抑制劑的PBS(-)(於PBS(-)中溶解有5mM苯甲脒鹽酸鹽/10mM EDTA-2Na/0.1M胺基己酸)洗淨兩次，除去血清成分等。其後，以相對於皮膚濕重的10倍量添加蛋白質萃取液(4M胍鹽酸鹽/50mM Tris-HCl/0.1M NaCl/5mM苯甲脒鹽酸鹽/10mM EDTA-2Na/0.1M胺基己酸(pH7.4))，使用振動機在4℃振動72小時。以4000rpm離心分離20分鐘，取樣出上清液，以7M urea/50mM Tris-HCl/0.1M NaCl/5mM苯甲脒鹽酸鹽/10mM EDTA-2Na/0.1M胺基己酸緩衝液(pH7.4)進行透析。透析後，加入TOYOPEARL(註冊商標)DEAE-650S(東曹公司製)，在4℃振動24小時，並分成吸附部分(A)與未吸附部分(B)。

對於A而言，添加溶離緩衝液(7M Urea/50mM Tris-HCl/2M NaCl/5mM苯甲脒鹽酸鹽/10mM EDTA-2Na/0.1M胺基己酸(pH7.4))，在4℃振動72小時，進行萃取，其後以RO水進行透析。對於B而言，係直接以RO水進行透析。在透析後，將A以及B皆供至冷凍乾燥，作為SDS-PAGE以及西方點墨法用的試樣使用。A係使用於脫氫膽酸偵測，B係使用於膠原蛋白偵測。將此步驟揭示於圖19。

5.其他的實驗係以與實施例2相同的方式進行。

結果 1.　皮膚水分含量

為了針對UVB照射以及山竹果皮萃取物投予對皮膚水分含量造成的影響進行檢驗，使用CORNEOMETER CM 825測定皮膚水分含量。將結果揭示於圖20A以及圖20B。到了第5週，還未偵測到各群間的差異。進入第6週，相對於control(-)而言，在control(+)顯示出水分含量減少的傾向(p<0.1)。另外，相對於control(+)而言，在high(+)觀察到明顯的上昇。在第7週的時候，相對於control(-)而言，在control(+)偵測到明顯的減少(p<0.05)，相對於control(+)而言，在high(+)偵測到明顯的增加。觀察到明顯差異的第7週皮膚水分含量，在control(-)為78.83±1.90；在high(-)為82.49±4.89；在control(+)為73.24±5.41；在high(+)為77.43±3.86；在low(+)為74.26±2.63；在collagen(+)為68.54±2.91。

2.　皮膚彈性

使用CUTOMETER SEM575，對無毛小鼠腰部皮膚的彈性進行測定。結果如同圖21A至J所表示般，在分群時，在各群間並未偵測到明顯的差異。關於解剖時，皮膚伸展性的參數之一的R0在各群間並未觀察到明顯的差異，而關於表示皮膚恢復性的R1，相對於control(-)而言，在control(+)確認出有明顯的減少(p<0.05)。另外，關於表示皮膚全體的彈性的R2，相對於control(-)而言，在control(+)確認有明顯的減少(P<0.01)，而相對於control(+)而言，在high(+)確認有明顯的增加(p<0.05)。另外，相對於high(-)而言，在high(+)確認有明顯的減少。

3.　病理學的解析

對於在背部皮膚HE染色標本應注意的觀察結果，使用圖22作說明。在圖22UV未照射標本(a)中，幾乎沒有發現基底細胞層的細胞內浮腫，而在照射標本(b)中，觀察到基底細胞層的細胞內浮腫。再者，若受到傷害，則在細胞間也會觀察到浮腫，而會有由基底細胞層擴大到有棘細胞層的現象，另外，還確認了在顆粒細胞也有sun-burn cell化後的細胞。亦即，具體而言，HE染色標本要注意(1)是否觀察到顆粒細胞的sun-burn cell化，(2)基底細胞的細胞內、以及細胞間浮腫的有無，(3)細胞間浮腫是否延伸至有棘層這3個重點。關於浮腫，在傷害小的情況只有觀察到細胞內浮腫，而傷害變得愈大，愈會有細胞間浮腫出現，基底層的細胞間浮腫會擴大到有棘層。

將各群病理的解析結果揭示於圖23。圖23係表示各群代表性的標本。在control(-)中，到處都觀察到有細胞內浮腫。在UV照射群中，除了細胞內浮腫以外還加上細胞間浮腫擴大，依照標本的不同，細胞間浮腫會擴大到有棘層。藉與control(+)相比，在high(+)浮腫狀態已明顯改善。另外，圖23中，由雙線圍住之處，係表示顆粒細胞的sun-burn cell化，由單線圍住之處，係表示基底細胞的細胞內浮腫，由虛線圍住之處係表示基底細胞的細胞間浮腫的病理觀察結果。

另外，將表皮厚度的測定結果揭示於圖24。這些值是對各標本測定10處的表皮厚度，以求得平均值。表皮厚度，在control(-)為29.87±11.94μm；在high(-)為21.03±2.46μm；在control(+)為50.42±11.89μm；在high(+)為39.63±6.63μm，相對於control(-)在control(+)以及相對於high(-)而言，在high(+)觀察到表皮的肥厚化(圖24)。

另外，針對背部皮膚的皺紋形成的模樣進行觀察的結果，與control(-)群相比，在control(+)確認了有深的皺紋形成的現象。將high(-)群與high(+)群加以比較的情況，亦可觀察到相同的模樣。control(-)群與high(-)群作對比的情況，並無法觀察到外觀上的不同。在將control(+)群與high(+)群相比的情況，感覺到若干的不同，然而以外觀的差別而言，無法觀察到明顯的差異。

4. I型膠原蛋白的SDS-PAGE以及西方點墨法使用6%聚丙烯醯胺膠體作為分離膠體，使用3%聚丙烯醯胺膠體作為濃縮膠體，使用Prestained SDS-PAGE Standards High Range(Control 310001920)作為標記而進行電泳，藉由CBB染色，確認了各試樣的蛋白質量為相等。西方點墨法的結果，係如圖25A以及B所表示般。在116kDa附近，確認出被認為是I型膠原蛋白α鏈的帶紋，將control(-)的帶紋強度定為1時，high(-)為1.60、control(+)為1.50、high(+)為2.86(圖25C)。 5.　脫氫膽酸的SDS-PAGE以及西方點墨法

使用7.5%聚丙烯醯胺膠體作為分離膠體，使用3%聚丙烯醯胺膠體作為濃縮膠體，使用Prestained SDS-PAGE Standards High Range(Lot. No. Control 310001920)作為標記，進行SDS-PAGE，以供CBB染色，確認各試樣的蛋白質量相等之後，進行西方點墨法(圖26A以及B)。帶紋強度，將control(-)定為1時，在high(-)為1.15，在control(+)為1.53，在high(+)為1.28(圖26C)。在UV照射對照群中，與未照射對照群相比，脫氫膽酸的帶紋無論低分子側或高分子側皆為擴大，在high(+)群之中，低分子側的帶紋消失。

考察

在本實施例之中，山竹果皮萃取物的投予，在無毛小鼠之中，可得到改善因Uv照射而降低的皮膚水分含量這樣的結果。因此認為，山竹果皮萃取物係具有皮膚水分保持效果的物質。

另外，作為插管試樣的分散劑，係採用沒有水分含量改善效果的阿拉伯膠，而在control群，亦觀察到水分含量增加的傾向。曾經有報告指出，經過單純化後的角質層in vitro模型之中，阿拉伯膠會抑制脂質過氧化(International Journal of Pharmaceutics 298：153-263,2005)，提示了阿拉伯膠表現出阻礙由UVB照射所產生的氧化逆境的功能的可能性。

另外，關於皮膚彈性，皮膚全體的彈性因為UV照射而降低，然而提示了山竹果皮萃取物具有使降低的彈性恢復的效果。

由西方點墨法的結果看來，膠原蛋白的帶紋強度，會因為UV照射而增加。曾經有報告指出在光老化模型小鼠之中，於皮膚的總膠原蛋白量，受到紫外線照射並不一定會減少，此結果係與該報告一致。與未照射或照射無關，藉著投予果皮萃取物，觀察到以浮腫為首的病理觀察結果的恢復，看來與皮膚組織的恢復機制有某些關係，推測為膠原蛋白的產生增加。

由脫氫膽酸的西方點墨法結果，可得到由UV照射所產生的低分子‧高分子量的脫氫膽酸，會因為果皮萃取物投予而減少這樣的結論。脫氫膽酸，係具有約100kDa的分子量的蛋白多醣，在約40kDa的核心蛋白質，有一條硫酸軟骨素鏈或硫酸皮膚素鏈與其發生共價鍵結。核心蛋白質，係富含白胺酸、具有8～10個胺基酸重覆排列(LRR)，而且分子量較小的蛋白多醣。脫氫膽酸，係與膠原蛋白或其他分子發生交互作用，在結締組織的形成或機能方面，扮演重要的角色。有報告指出欠缺脫氫膽酸基因的小鼠與野生型相比，皮膚脆弱且缺乏彈性。另外，有報告指出在纖維形成的調節之中，若對損傷的肌纖維局部投予脫氫膽酸，則過剩的纖維形成受到抑制，肌肉修復情況改善。該等報告，揭示出脫氫膽酸係與細胞外基質的正常構築有關。因為UV照射而增加、並且比通常情況更低或更高分子量的脫氫膽酸，係在水分含量、彈力這方面，主要與皮膚的彈力降低有關，藉著投予果皮萃取物脫氫膽酸低分子側的帶紋消失，彈性亦上昇，由此看來，認為低分子脫氫膽酸的增加會有使皮膚彈性減少的作用，果皮萃取物投予，會有抑制低分子脫氫膽酸產生的功能。關於詳細的機制，有必要進一步檢驗。

由以上的現象可知，山竹果皮萃取物的投予，會恢復皮膚水分含量、皮膚彈性及表皮的肥厚化。另外，還能改善UV照射造成的病理學觀察結果的惡化。推測其中，皮膚彈性的恢復，與UV照射造成的異常脫氫膽酸產生的抑制有關。

實施例4 使用山竹萃取物的食品之調製

使用實施例1所調製的山竹果皮萃取物，如以下的方式調製口香糖。

使用實施例1所調製的山竹果皮萃取物，如以下的方式調製糖果。

使用實施例1所調製的山竹果皮萃取物，如以下的方式調製軟糖。

使用實施例1所調製的山竹果皮萃取物，如以下的方式調製巧克力。

使用實施例1所調製的山竹果皮萃取物，如以下的方式調製凍果汁露(sherbet)。

使用實施例1所調製的山竹果皮萃取物，如以下的方式調製冰淇淋。

使用實施例1所調製的山竹果皮萃取物，如以下的方式調製餅乾。

使用實施例1所調製的山竹果皮萃取物，如以下的方式調製糖錠。

使用實施例1所調製的山竹果皮萃取物，如以下的方式調製飲料。

本申請案，係由2009年3月31日所申請的日本專利申請號2009-085411主張優先權，而引用其內容作為本申請案的一部份。

圖1係表示山竹果皮萃取物混合飼料投予實驗的日程。

圖2係表示UVB燈的分光分布。

圖3係針對Cutometer SEM575中的各種參數說明之圖。

圖4係表示體重。圖4A係體重變遷之圖形，圖4B係全部數據。

圖5係表示食下量。圖5A係食下量變遷之圖形，圖5B係食下量數據。

圖6係表示皮膚水分含量。圖6A係表示水分含量隨時間的變化與測定時之濕度，圖6B係第8週之水分含量。

圖7係表示皮膚彈性。圖7A係表示分群時皮膚彈性，圖7B係解剖時皮膚彈性。

圖8係表示背部皮膚的外觀。圖8A係control(-)群的No.3無毛小鼠，圖8B係control(+)群的No.26無毛小鼠，圖8C係0.15%(+)群的No.36無毛小鼠的外觀。

圖9係表示光老化模型無毛小鼠的HE染色標本。(a)係control(-)群的No.9無毛小鼠，(b)係0.072%(-)群的No.11無毛小鼠，(c)係control(+)群的No.25無毛小鼠，(d)係0.072%(+)群的No.29無毛小鼠，(e)係0.15%(+)群的No.41無毛小鼠，(f)係GlcN(+)群的No.50無毛小鼠的標本。

圖10係表示由病理HE染色標本求得的表皮厚度。

圖11係表示皮膚萃取物的SDS-PAGE結果。

圖12係表示I型膠原蛋白偵測所用的西方點墨法結果。圖12A係表示皮膚萃取物的西方點墨法結果，圖12B係表示藉由密度測定法解析所得到的帶紋強度。

圖13A係表示藉由纖維素醋酸酯膜電泳進行的GAG鑑定，圖13B係表示密度測定法解析所得到的帶紋強度。

圖14係表示由TBA法所得到的過氧化脂質測定結果。

圖15係表示皮膚萃取物的SDS-PAGE結果。

圖16A係表示由西方點墨法所得到的羰基蛋白質的偵測結果，圖16B係表示由密度測定法解析所得到的帶紋強度。

圖17係表示血漿過氧化脂質之測定。

圖18係表示山竹果皮萃取物經口強制投予實驗的日程。

圖19係圖示由皮膚組織萃取可溶性成分的步驟。

圖20係表示水分含量。圖20A係變遷之圖形，圖20B係全部數據。

圖21A係表示皮膚彈性。

圖21B係表示R0：伸展性。

圖21C係表示R1：回到原本狀態的力。

圖21D係表示R2：全體的彈力。

圖21E係表示R3。

圖21F係表示R4。

圖21G係表示R5。

圖21H係表示R6。

圖21I係表示R7。

圖21J係表示R8。

圖22係說明皮膚組織標本的觀察方法所用的圖。(a)係表示UV未照射標本，(b)係表示UV照射標本。

圖23係背部皮膚HE染色病理標本照片。

圖24係表示由HE染色標本求得的表皮厚度。

圖25係表示I型膠原蛋白偵測所用的SDS-PAGE以及西方點墨法的結果。圖25A係表示皮膚萃取物的SDS-PAGE結果，圖25B係表示西方點墨法的結果，圖25C係表示由密度測定法解析所得到的相對帶紋強度。

圖26係表示脫氫膽酸偵測所用的SDS-PAGE，以及西方點墨法的結果。圖26A係表示皮膚萃取物的SDS-PAGE結果，圖26B係表示西方點墨法的結果，圖26C係表示由密度測定法解析所得到的相對帶紋強度。

Claims

一種用於因紫外線照射造成之皮膚失調之治療及/或預防之組成物，其特徵為：由以極性溶劑萃取山竹(Garcinia mangostana L.)果皮而得的萃取物所構成者。
如申請專利範圍第1項之用於因紫外線照射造成之皮膚失調之治療及/或預防之組成物，其中極性溶劑係乙醇或乙醇水溶液。
如申請專利範圍第1項之用於因紫外線照射造成之皮膚失調之治療及/或預防之組成物，其係抑制由紫外線照射所造成的皮膚水分含量減少。
如申請專利範圍第2項之用於因紫外線照射造成之皮膚失調之治療及/或預防之組成物，其係抑制由紫外線照射所造成的皮膚水分含量減少。
如申請專利範圍第1項之用於因紫外線照射造成之皮膚失調之治療及/或預防之組成物，其係抑制由紫外線照射所造成的皮膚損傷。
如申請專利範圍第2項之用於因紫外線照射造成之皮膚失調之治療及/或預防之組成物，其係抑制由紫外線照射所造成的皮膚損傷。
一種食品，其特徵為：含有申請專利範圍第1~6項中任一項之用於因紫外線照射造成之皮膚失調之治療及/或預防之組成物。