TWI331631B - Assay systems, kits and methods for detecting microorganisms - Google Patents

Description

1331631 良、.發明說日月 說5Γ屬之技術賴、錢技術、内容、實 【發明所屬之技術領域】 本發明係有關一種可用來檢測疑似病例 ，，是肺結_之_統、套組及方=== 關-種可在同-儀器中同時進行溫度及磁性控制 置，以大幅減少雜合反應的時間。 β裝 【先前技術】 肺結核(Tuberculosis，ΤΒ)是兒童與成年人的主要感毕 ^之-，且為世界上最常見的傳染性疾病。目前世^ =二分之一的人口感染肺結核，其中兩千萬人為已登錄的 病據估計肺結核在未來十年内將使三千萬人致死。另 目前可能已有超過五千萬人感染多重抗藥性 (multidrug-resistant，MDR)的肺結核菌。抗藥性的出現是 來自公衛系統的自滿以及缺乏適當管理肺結核的治療所 致在夕重抗樂性的肺結核邊出現之前，多重藥物治療肺 結核的治癒率在同時感染愛滋病的病患中仍可超過9〇%。 如今多重抗藥性的肺結核菌不但具高度傳染性，亦無法完 全治癒，死亡率將近50%。現今，在人類免疫力不全病毒 (Human 丨mmunodeficiency Virus，HIV)呈陽性的患者群 中，肺結核為引起死亡的主因，且死亡率高達8〇0/〇。 肺、，核是由肺結核分枝桿菌(一種桿菌)所傳染，它是由 空氣懸浮微粒散播並會造成不可逆的肺部損害。若病菌自 肺部釋出將可能造成全身性的疾病，影響器官包括：骨、 闕節、f:脾、腸胃道及腦部等。凡接觸肺結核菌患者， 50石會受感染’而15%受感染者會發病。貧窮、營養不良 v及2=#皆會增加，肺結核菌的擴散與蔓延。 最近由ί;重及使用不同抗生素的組合。 合方式，都現，投用抗生素的種類與組 得以手術方^在極端的情況下， 肺部法i肺結姆斷是奠基於臨床症狀發現與 進-Si :再以痰液或組織抹片中有無肺結核菌來 ^/確“。延些方法仍然是診斷之金科玉律，但 離酵素鏈鎖反應(PCR)分析，以及i “ίΐΠ岐加靈敏與快速。但是，快速技術所增 的靈敏度，並不能確保精確度也隨之增加。 已接該個其他臨床魏—起賴，惟當病患 田注射或被非肺結核分枝桿菌感染時，皮膚 二I法成為確定診斷之靈敏性或特異性的測試方法◊檢 料的結_患時，常需提供特定位置組織或體 液的檢體用作抹片、組織培養或組織學的分析。典型 結核損害包括肝酪化(caseatjng)或是未肝酪的肉g瘤與巨 ，胞。能夠快速檢驗出病患所感染的肺結核菌及其對^之 藥物的方法，對於診斷、治療與社區的肺結核控制具有莫 大幫助。 八、 適切的診斷對於控制肺結核的擴散極為重要。一般先 以顯微鏡檢驗痰液檢體，再以易於觀察的快速酸性螢光染 料(acid-fast fluorochrome dye) auramine 0，或較具專一 性的Zeehl-Neelsen染色法進行檢驗❶檢體若不是在固態的 基質上培養(如Lowenstein-Jensen slant)，就是存放在組織 ’如BACTEC自動放射計數參統(automated radiometric system)。然後再以生化技術或核糖核緩探針 1331631 來鑑定不同g株。以常⑽幾種抗生素 培養而非傳統的洋.菜稀釋法測試分離出的 運用fiehl-Neelsen石碳酸品紅（⑽咖咖 口红染劑來檢測肺結核已有脾歷史，雖缺 :有、'且^培養那^敏銳，但此種快速酸性的抹片，屬於^ ^而又價廉制試方法’鶴基本設 ^ 二並可識、分析桿菌::=七 ^同，一個痰液抹片的敏銳度可在22% % 率亦可由聯合多個抹片的檢查而提昇。 ]辨別 大多^國的實驗室均採用螢光 aU「am丨ne- rhodamine染料。利用這種科技分 倍率的顯微鏡下顯示贿的橘色，明加抹片靈=度在低 (^en-P^be公司的Amp丨_心⑺心㈣⑽ 、目1ί、隹e「C^i=reCt 丁邮是針對分枝桿菌的核糖體RNA檢 丁轉錄放大。這_驗使騎肺馳g專—性極高的 針I雜騎最適於(也伽於)酸雜速桿菌抹片 呈陳反應’且_培養仍在^^行中的病患。由於專一性 目oom吏對於抹片呈陽性反應的病患，仍偶有偽陽 性出現，通吊出現在非肺結核型的分枝减菌感毕中。 A這個技術會放大，即使是目標肺結核菌0_复合體非 兩小的一部份。這個測驗使用一自動化的系統，可以快 偵測到小至在檢體，支氣管肺泡|avage (b(OnehQa|ve。丨y lav^e) ’胸腔液(pleura| fluid),或其他體液或組織檢體中 的單一生物體，並且在肺部疾病中有9〇%的靈敏度盥專一 性。. ， ’、

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Mantoux測驗是檢驗肺結核較佳與較標準的皮膚診斷 10 1331631 法。包括皮下注身ί5單位结核菌素（tubercu|jn unit，τυ)的 :屯化蛋白質竹生物(purified protein derivative，PPD，結核 ，素tuberculin) ’通常為◦ 1。硬化(|ncjurat丨on)程度則 f注射後48到72小時量測。硬化程度(而非紅腫)應量測兩 固，直的直徑後再平均。若欲減少觀察的變異性，可 =圓珠筆自硬」t區外緣小心的移射^。當愈靠近硬化 二&阻力會愈咼，應在硬化區的外緣作記號。然而，約2〇% 西，結核病患的皮膚測試可能出現陰性反應，有些族群有 偽1J性出現率。例如明顯被人類免疫不全病毒(HIV) ί ^現率可能提高5()%以上。偽陽性也可 二出:見在感染非肺結核分枝桿菌的病患中(例如，

Mycobacta , j，將錢無法齡肺結_可雛，只有—個 的皮膚測試、絲，也無法較必彡雜受診療。 有鑑於全球抗藥性結核菌有益g之 产 J t f^ ^ ^ t ^ (Centers Tor Di；ett h

Prevention)以及世界衛生組織(w〇r|d * 0丨，nd 均建議對财錄㈣職顧 =zat_ 方式螢此火 ，前仍在發心 測肺速且完全_ 檢體㈣菌敏度與專-性 本發明係針對疑似病例檢财微生物(特別是肺結核 • 11 菌)之一種分析系統、套組及方法。 碟=¾ 一、 顯示本發明偵測方法之流程圖。 ㉝貞測的肺結核菌基因體DNA。 _示本之肺結核菌。 顯示本發明套組的靈敏度與專一性。 巧6顯示本發明的相關儀器。 【實施方式】 $=11:種^貞測微生物DNA的方法，包括： H W與微生物專—探針於雜交管甲進 仃雜乂，其中該探針與磁珠相連； γ退 移f磁性槽中進行清洗； (將阻斷液(blocking sdut丨。n)加入試 ί ΐ $(avld_素複麵或賴抗生物辛 (streptav丨dm)酵素複合物至管中； < 王卿京 磁場來去軒擾物質； 滅，。本發明方法特別適用於：二·病母、細 #资j㈣ϊϊ體液如腦脊髓液、血清、血液、痰液、 菌i學自:S J便】!用:^唾J佳:肺結核 與喉·拭等。、 血清、血液 '唾液、肺流出物 12 ^1631 .聚合酵素鏈鎖反應(PCR)可見於Saili et al. (19851 Science，230 1350。PCR是由重複週期之DNA聚合酵素所 引起的引子延長反應所組成。將標的DNA加熱變性，並盥 f放大之DNA標定的序列互補的兩段寡核苷^蔓 (^ligc^nucleotide)進行雜交。和dna聚合酵素一起時，這些 养核苷酸係用來作為引子。DNA的複製是藉由延長引子， 做出雙股的第二份複製品。經姐覆酸性、5丨子雜交及 延長過程後，標的DNA便可在約2至4小時内放大至一百萬 =更多。PCR是-種分子生物學方法，必須和測定技術 同枯使用]才能測得放大的結果。本發明中，係使用帶 生物素(boitin)標記的引子對來進行pcr放大。 本文中所用的「探針」，係一種類似分子之物質，可被 某一特定標的物辨識出來。一般來說，探針會連接於固相 體上，以便分離DNA。本發明中，以磁珠連接探針 (MagProbe)者為佳。本MagProbe探針的序列為胺 -TAACCGGCTGTGGGTAGCAG。 斤夕』為胺 般b使用的標§志物質包括（但不限於）：生物素 (biotin)、螢光分子、放射性分子、呈色受質、化學冷光及 其他類似物等。將核酸以生物素標定的方法，如同將螢光 为子及放射性分子放入寡核苷酸及核酸的方法，係該 所熟知之技藝。 虽使用生物素時，可利用與如酵素(例如辣根過氧化物 酵素(horseradish peroxidase))之可測定性標記丘輛姓人 的印白素(avid丨·η)、鏈黴抗生物素(streptavkJ丨·η)或g他 物來偵測。酵素共軛結合物可自市面上購得，例如自Vect〇r Labora丨ories (Burlingame，加州）。鏈黴抗生物素盥生物素 結合的親和力很高，將未結合的鏈黴抗生物素完'成清洗 13 1331031 後、’再利，存放於過氧化氫及適當緩衝液中之冷光受質來 j貞測山'葵過氧的存在。可利用BerthQld冷光分析儀 (Pforzheim，德國)來測定其產物。 測疋螢光、放射線、化學冷光、呈色標記、以及其他 1的標定物質之方法，已是騎熟知的技術。簡言之， 冷光因其散做長及酸，最能直接被侧出來並予 疋罝。

，了便於在一種儀器裝置中操作整合溫度及磁性控 二本發，亦提供了 —種可在該同-裝置中進行核酸雙股 刀離,、雜交、清洗、磁珠分離及溫度控制之設備。包括： (a) 可放置反應容器的裝置； (b) 可控制容器溫度的裝置； (c) 可控制容器磁力的裝置。 其中，控制容器溫度的裝置與放置反應容器的裝置相 =0以及控齡器磁力的裝置與钱反應容11的裝置相

的改的裝置可加熱容器，根據溫度 成酸雙股的分離。溫度控制器报容易便可自 購f。因為雜交後大部分的操作步驟都和磁性 組，g明亦提供了一個可檢測微生物cDna之診斷套 (a) —個連接磁珠的探針； (b) —個具生物反應性的引子； ' .1 14 1331.631 ⑹印白素酵素複合物或鏈黴抗生物素酵素複合物； (d)酵素受質。 在套組中，具生物反應性引子係由DNA標定試劑與引 子反應而製備。DNA標定試劑係一種標的DNA試劑。▲佳 試劑不限，但具有下式之化合物：

Fu-BE-D ί I从Fu代麵絲衍生補倾素触物之組合所挑 k出的喃香豆精(furocouma「in)衍生物；其尹，BE代表

含有C4·12錄、絲、聚絲胺及聚乙二醇之 t的士合增強子；以及其中，0代表含有生物素、榮光 =二錠酯(acr丨d丨nium ester)及錠·9_羧醯胺之組合的可 之爻物。最佳DNA標定試劑是9_(4"_(胺甲基)_4, 5"-二 止素）錠羧醯胺。 ’ 一τ 統包^發明亦提供了—個可檢測微生物之分析純，該系 (丨)一個可測定微生物cDNA之診斷套組，包含·· (a) 一個連接至磁珠的探針； 3 (b) —個具生物反應性的引子； ⑹印白素酵素複合物鏈黴抗生物素酵素複人 (d)酵素受質； σ ’ (二)-種可在同-裝置中進行核酸雙股分離、雜交 冼、磁珠分離及溫度控制的裝置，其包含： (a) 可放置反應容器的裝置；八 · (b) 可控制容器溫度的裝置； ⑹可控制容器磁力的裝置。 (III)—個可吸住容器壁上磁珠之磁 (iv) 一個偵測器。 …：……· 15 1331631 清洗缓衝液及阻斷緩雜交緩衝液、 本發明之料^財將整‘二；=尸。—般而言， 時以内。 定们彳貝劂肺結核 < 過程縮短至5小 【實施例】 而僅代表本發明之不同方面 以下實施例不具限制性 及特性。 丨·器材與方法 主要套組丨： (1) 溶解緩衝液丨（5 ml) (2) 溶解緩衝液丨丨（4 ml) (3) 雜交緩衝液(5 ml) (4) 清洗緩衝液(60 ml) (5) 溶解試管(1.8 ml，25管） (6) 雜交試管(12x75 mm，50管） (7) 延長試管(3 m卜抵達後儲存於-2(rc) 主要套組丨丨：（50反應/套組，儲存於4。〇） (1)MagProb (450 μΙ，抵達後儲存於4。〇 測定套組-丨：（250反應/套組，儲存於4〇c) (1) p且斷緩衝液(0.5%，60 ml，儲存於4。匸） (2) 受質A (7.5 m卜儲存於4°c) ' (3) 受質B (7.5 m卜儲存於4°〇 4貞測套組-丨丨·（250反應/套組，儲存於_2〇°c) (1)生物催化劑(BC，1 mg/ml，15 μ|，儲存於_20。〇 其>他器材：| , (1)磁力架… ' 16 丄幻1631 (2) NALC (N-乙醯基-L-半胱胺酸） (3) 4%氫氧化鈉溶液 (4) 2.94%擰檬酸納(s〇djum citrate)溶液 (5) 磷酸緩衝鹽溶液(pbs)，pH 7.0 (6) 0.1% PBST(礙酸緩衝鹽溶液力^0.1% tween-2〇) (7) 0·5% PBST(磷酸緩衝鹽溶液加0.5% tween-20) (8) 磁性乾浴槽 (9) 連接至電腦之Berthold冷光分析儀 過程：

丨·淨化臨床檢體(以各醫學中心p3級實驗室内執行為 佳） ⑴收集檢體並儲藏於4°C冰箱。 (2) 將1g的NALC溶於100 ml無菌的4%氳氧化鈉溶液 與100 m丨的2_94%檸檬酸鈉溶液(當日準備）。 (3) 將同體積的氫氧化鈉-檸檬酸—NALC加入臨床檢體。 (4) 以震盪旋渦混合器混合3〇秒後，將檢體試管反轉數 次，並置於室溫下15分鐘。

(5)加入磷酸緩衝鹽溶液至檢體試管的5〇 m|刻度位 置，以3000 rpm離心20分鐘。 (6)將上清液移除，然後以1 ml磷酸緩衝鹽溶液回溶沉 澱物。 丨丨沉澱物的溶解(可在P2層級實驗室進行） (1) 將10 ml的ddH2〇與1 ml回溶的沉澱物混合，以震盪 旋渦混合器混合20秒後’以3,800 rpm離心15分鐘。 (2) 移除上清液’加入150 μΙ溶解緩衝鹽溶液|，並以震 盪旋渦混合器混合1分鐘後，置於寞溫下1〇分鐘。 (3) 將溶解試管放置在100°C水浴槽中20分鐘，然後加 17 1331631 入125 μ|溶解緩衝涑丨丨。 (4)以1〇,〇〇〇巾⑴離心2分鐘，收集DNA裂解物，並存 於-20°c冰箱。 III.目標放大(兩步驟） 步驟1 : ⑴依照順序將下列試劑置入0.2 m丨的微試管(microfuge tube)： 試劑 體積 DNA 1 μι 反應混合液* 49 μΙ *反應混合物包含以下試劑： 試劑 體積 10X放大緩衝鹽溶液 5 μΙ

#4 引子(TGAGGGCACGAGGTGGCA) 5 #5 引子(CGTAGGCGTCGGTCACAA) dNTP

Taq DNA聚合酵素(21Ι/μΙ) ddH20 5 μΙ 1 μΙ 0.5 μΙ 32.5 μΙ

18 1331631 同時啟動加熱蓋： —一 — 溫度 時間/ 週期數 1 94〇C 5分鐘 1個週期 94〇C 30秒 2 62.5〇C 15秒 30個週期 72〇C 15秒 3 72〇C 10分鐘 1個週期 4 4°C 靜置 — 步驟2 : (1)依照順序將下列試劑置入一新的0.2 ml微試管 (microfuge tube)： 試劑 體積 自步驟丨取得的PCR產物 15 μΙ 反應混合液* 35 μΙ *反應混合液包括以下成份： 試劑 體積 10X放大緩衝鹽溶液 5 μΙ #6 引子(GATGCACCGTCGAACGGC) 5μΙ #7 引子(CCACGTAGGCGAACCCT) 5 μΙ dNTP 1 μΙ Taq DNA聚合酵素(2υ/μΙ) 0.5 μΙ ddH2〇 18.5 μΙ (2)啟動放大程式。， *放大程式如同步驟1。 19 1331631 IV.雜交反應 . ⑴完成雜交反應管標示後，將125 μ】的ddH20、15 μΙ 的MagProbe、150 μΙ的雜交缓衝液及50 μ|帶有標記 之樣本DNA混合。 (2) 將雜交反應管置於1〇〇°c乾浴槽5分鐘。 (3) 將溫度調整至60°C，並靜置20分鐘。 (4) 將雜交反應管移到磁性槽中，靜置5分鐘。 (5) 將雜交緩衝液抽除。

(6) 於母一試管加入1 m| 6〇艺預熱的清洗緩衝液，震盪 混合後’放回磁性槽中靜置5分鐘。 (7) 將雜交緩衝液抽除。 (8) 重複步驟(6)至(7)。 (9) 於室溫中靜置雜交反應器。 V測定 (1 =室溫取200 μ|的阻斷緩衝液至每一管中，震盡混 合0 (2)^5 ^新鮮配製的BC (99 μ丨〇 1%嗯丁+1 μ| β

混合料。於室溫靜置2Q分鐘。飾 交反鱗放人磁架中，靜置5分鐘，然後細 ’震魏合餅反應_ (⑽◦◦ 抽除溶液，再重複一次。 重新懸浮。 忒s中，並以震盪混合使磁_ i(76^驟ί5Β)Ι取出的懸浮溶液。 (7)加50峨合受質至每-試管中（25 μι受質Α+25μι 20 1331631 桿菌(Mint)。 實施例4 : 均 、以本發明檢查臨床檢體，不論呈陽性或陰性反應， 以抹片試驗培養及二行程PCR(Nested pCR)加以=， 同。上述結果顯示：本發明肺結^_ 測套組具備極咼之靈敏度及專一性。 田识 _本發明已詳細說明及例式，俾使熟悉此項技;^标者能白 打操作並加以利用，惟任何替代、變更與修 離本發明之___進行。 在不脫 熟悉此項技術者，能在短時間内即可達到本發 ί 1標=制本文憎叙絲及伽。 動物及其製造棘和方法僅為示雜之較佳實施例， 制發明之範圍。熟悉此項技術者可能對進 ΐΐ改及賴於其侧途，惟任何可麟修改均應包含在 本發明的精神内，並僅限於申請專利範圍之用。 熟，此項技術者極易在不脫離本發明之 内’對本發明進行變更與修改。 乾圍 本說明書所述之所有專利及發表，均為此領域 明有關之-般技術。本說明書所述及之專利表發 可說明熟悉_本發日__人士具有的技術文早’ "本文所述之發明圖示’可在沒有任何要件或^ 订，而非特定於本文所揭露者。所使用 ，之用，而非用於限制，且非利用這些名 ，更修改仍可能在發日种請專概_ 雖然㈣用較佳實施例及選擇性的特徵且 明，但熟悉此項技術者可能會根據此中所#露之^= 22 恤軸附申請專 【圖式簡下列的申請專利範圍中有提到。 ㉗=月J測方法之流程圖。 圖3顯示經由本發===結核菌基因體DNA。 ，核菌。 圖6_示本發明的⑶度與專—性。

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Claims (1)

1331631 9舉Y9日修正 _，補充 1公告本 一 申請專利範圍 1.一種偵測疑似病人樣本中肺結核菌DNA的方法，包含： (a) 利用具生物活性的引子放大肺結核gcDNA，其中具 生物活性的引子係將生物素標記於引子上，先以#4 引子(SEQ ID NO: 1)及#5引子(SEQ |D N〇:2)執行 PCR(Polymerase Chain Reaction)放大，再將PCR 取得之產物以#6引子(SEQ ID NO: 3)及#7引子 (SEQ ID N0:4)執行PCR放大； (b) 將以#6及#7引子執行pcr放大之肺結核菌的cDNA 與微生物專一探針於雜交管中進行雜交，且探針與 磁珠相連’其中微生物專一探針係MagPr〇be，^ 列為胺-TAACCGGCTGTGGGTAGCAG(SEQ ID NO： 5)； (c) 將雜交試管移到磁性槽中進行清洗； (d) 將阻斷液加入試管中； (e) 加入卵白素酵素複合物或鏈黴抗生物素酵素複合 至試管中； (0進行清洗反應，利用磁性去除干擾物質； (g) 使磁珠懸浮； (h) 在加入酵素受質後偵測冷光或顏色的變化；及 ⑴與對照組相比，比較在步驟(h)顏色的改變。 2_t申請專概目第1項所述之方法，其巾該鏈黴抗生物 素酵素複合物為鏈黴抗生物素山葵過氧化氫酵素。 1 3_如申請專利範圍第彳項所述之 用渦漩震盪(vortex)試管。 次，其中磁珠懸浮是利 4.如申請專利範圍第1項所述之 化，係利用冷光分析儀或分光光度計進中行該^定顏色變 其中步驟(a)至(j)是 5.如申請專利範圍第彳項所述之方法 在同一試管内進行。 6.;r=雜交缓衝液中放大的肺結核 菌cDNA之診糊 ⑻:個=生婦雜錢魅辦的 $物專一探針係MagPr〇be，序列為^ 化、:!^?CGGCTGTGGGTAGCAG(SEQ ID Να 5); (L、生物反應性的引子，其中包括執行第一次pCR放 大之#4引子(SEQ ID NO: 1)及#5引子(SEQ ID N0.2) ’以及執行第二次pcr放大之#6引子(SEQ ID NO: 3)及#7引子(SEQ ID N0:4); (c) 印白素酵素複合物或鏈黴抗生物素酵素複合物；及 (d) 卵白素酵素複合物或鏈黴抗生物素酵素複合物之酵 素受質。 7.如申請專利範圍第6項所述之診斷套組，其中具生物反 應性的引子是由將DNA標定物與引子反應所得。 ^申請專利第7項所述之 組 物具有以下結構： Fu-BE-D 其中’ Fu代表含有自定素衍生物及補骨脂素衍生物 之組合所挑選出的π夫喃香豆精(fur〇c〇uma「jn)衍生 =;其中’ BE代表沒有或一個含有〇412烷基、烯基、 聚烷基胺及聚乙二醇之組合所挑選出來的結合增強 子；以及其中，D代表自含有生物素、螢光素、吖 錠醋(acridinium ester)及吖錠-9-羧醯胺之組合所挑 選出來的一群可測定物。 9_如申請專利範圍第7項所述之診斷套組，其中DNA標定 物為9-(4”-(胺甲基)-4，，5·，-二曱白芷素)η丫錠羧醯胺。