CN117210584A - 一种用于肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎衣原体和肺炎支原体核酸多重检测的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎衣原体和肺炎支原体核酸多重检测的试剂盒，涉及生物技术领域。本研亢选取痰液样本作为检测对象具有较大的临床意义。肺脏深部的痰液可以比较准确地反应肺组织内部病原微生物的感染情况，而且该取样方法属于无创取样，不会对患者造成比较大的应激反应。该检测方法可以高灵敏高特异性地检测痰液中肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎衣原体和肺炎支原体，因此具有较重要的临床价值。目前市场上开发了基于Cas12a的单病原菌检测方法，该方法虽然可以快速准确地检测病原微生物感染，但是检测覆盖范围窄，检测成本相对较高，而RPA/CRISPR检测方法有利于克服以上不足之处。

Description

一种用于肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎衣原体和肺炎支原 体核酸多重检测的试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎衣原体和肺炎支原体核酸多重检测的试剂盒。

背景技术

呼吸系统疾病严重危害人类健康，其中以细菌为代表的病原微生物感染是引发呼吸系统疾病的主要因素。其中，肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎衣原体和肺炎支原体这四种病原微生物是较为常见，且危害较大的病原微生物。在临床诊断过程中，痰液细菌培养法(痰培养)是鉴定病原微生物的“金标准”，其具有较强的临床指导意义，是每一位呼吸系统疾病患者几乎必做的一项检查。但是该实验的缺点也比较明显，其检测时间较长，痰液病原微生物的培养周期在5-7天左右，因此痰液培养的检测结果往往不能够及时地为临床治疗提供指导，且痰培养方法对病原微生物的检出率较低，所以是一种不完美的“金标准”。因此，开发检测痰液病原微生物的新方法，将有利于丰富呼吸道病原微生物的检测手段，推动精准医疗的发展。

CRISPR-Cas是细菌的一种适应性免疫系统，Cas蛋白在RNA的引导下可以靶向切割外来核酸。2017-2018年张锋团队和Jennifer Doudna团队分别报道了CRISPR-Cas13a对单链RNA病毒和CRISPR-Cas12a对双链DNA病毒的侧链非特异性高效切割活性，将CRISPR-Cas系统应用到核酸检测领域，尤其是应用于疾病特异性检测领域。

目前基于CRISPR/Cas12a的检测方法具有巨大潜力，基于CRISPR/Cas12a的检测方法正在传染病的诊断中被不断发展。但是不同的病原微生物存在较大的种属差异，因此CRISPR/Cas12a的检测方法较难以一种标准的方式进行流程化开发，需要针对不同的病原微生物优化检测体系，如包括反应体积、pH、离子浓度、引物浓度、RPA引物的浓度及比例、Cas12a的浓度、crRNA的浓度、Cas12a与crRNA的比例等。

目前以CRISPR/Cas12a为基础已经开发出针对单一细菌的检测方法，如一种基于CRISPR辅助检测平台的肺炎链球菌家庭自测试剂盒和一种基于RPA-CRISPR/Cas12a技术的肺炎支原体的快速高效检测方法。虽然以上基于CRISPR/Cas12a的检测方法灵敏有效，但是只能检测单一细菌感染，而在临床实践中患者往往是细菌混合感染。利用以上方法得到细菌混合感染的结果需要使用大量的检测耗材以及不必要的人力消耗。如果一次检测可以同时检测多重病原菌感染，那将大大节约检测时间和成本。

肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎衣原体和肺炎支原体是四种常见且严重危害人类呼吸系统健康的病原微生物。2005年有文章报道了一种基于多重PCR技术检测以上四种病原菌的方法。PCR是核酸检测的通用方法，但是该PCR检测方式属于第一代PCR方法(qPCR是第二代PCR方法；数字PCR是第三代PCR方法，可实现核酸分子的绝对定量)。该检测方法需要在实验室中进行，严重依赖昂贵的科研仪器，不能够产生可视化的荧光，检测时间较长，因此在便携式临床应用上体现出一定的局限性。

发明内容

根据目前临床上痰培养检测病原菌的不足之处，本发明以Cas12为基础开发了一种痰液病原菌的四重检测方法，本发明具有不依赖大型仪器，操作相对简便，检测特异性和灵敏度高，检测成本相对较低，有利于丰富痰液病原微生物检测的技术手段，有利于解决痰培养检测周期长、检出率低的问题。

本发明的具体技术方案如下：

本发明提供了一种用于肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎衣原体和肺炎支原体核酸多重检测的靶标，其特征在于，所述靶标为四条序列组成的靶标组合，所述靶标组合的核苷酸序列如SEQ ID NO.21至SEQ ID NO.24所示。

本发明还提供了一种用于肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎衣原体和肺炎支原体核酸多重检测的RPA引物组合，所述引物组合包括：

核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的肺炎链球菌(stp)特异性引物，

核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的流感嗜血杆菌(Hai)特异性引物，

核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的肺炎衣原体(Chp)特异性引物，

核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的肺炎支原体(Myp)特异性引物。

本发明还提供了一种用于肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎衣原体和肺炎支原体核酸多重检测的crRNA组合，所述crRNA组合包括：

序列如SEQ ID NO.9所示的肺炎链球菌特异性crRNA，

序列如SEQ ID NO.10所示的流感嗜血杆菌特异性crRNA，

序列如SEQ ID NO.11所示的肺炎衣原体特特异性crRNA，

序列如SEQ ID NO.12所示的肺炎支原体特异性crRNA。

本发明还提供了一种用于肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎衣原体和肺炎支原体质粒全长引物扩增引物，所述全长PCR引物为：

肺炎链球菌检测靶基因lytA的上游PCR序列如SEQ ID NO.13和下游PCR序列SEQID NO.14所示，

流感嗜血杆菌检测靶基因lytA的上游PCR序列如SEQ ID NO.15和下游PCR序列如SEQ ID NO.16所示，

肺炎衣原体检测靶基因Chp-ompa核苷酸序列如SEQ ID NO.17和下游PCR序列如SEQ ID NO.18所示，

肺炎支原体检测靶基因Myp-P1核苷酸序列如SEQ ID NO.19和下游PCR序列SEQ IDNO.20所示。

优选地，特异性crRNA的制备方法包括：针对肺炎链球菌lytA基因、流感嗜血杆菌16S-rRNA基因、肺炎衣原体P1基因和肺炎支原体Ompa基因，寻找PAM(Protospaceradjacent motif)序列TTTN，设计crRNA。设计完成后，化学方法合成寡核苷酸(oligo)获得目的crRNA，再通过Cas12a检测获得反应性最佳的crRNA用于方法建立与试剂盒构建。

本发明还提供了一种用于肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎衣原体和肺炎支原体核酸多重检测的试剂盒，包括等温扩增体系、检测体系、酶标仪荧光检测体系；

所述等温扩增体系包括作为等温扩增引物的所述的引物组合，

所述Cas12a检测体系包括所述的crRNA组合，

所述酶标仪荧光检测体系用于检测所述Cas12a检测体系产生的Cas12a检测反应产物。

具体的，所述Cas12a检测体系还包括Cas12a蛋白、ssDNA报告系统(ssDNA-FAM/BHQ1，AZENTA)，所述ssDNA报告系统包括用于荧光检测的ssDNA FQ reporter。

其中，所述ssDNA FQ reporter为利用6-羧基荧光素(6-FAM)和荧光淬灭剂(BHQ1)标记的ssDNA，标记产物如下：/56FAM/TTATT/3BHQ1/，命名为ssDNA FQ reporter/5 6FAM/TTATT/3BHQ1/。

本发明提供的试剂盒既可以利用酶标仪荧光检测也可以利用蓝光切胶仪照射。荧光检测时，Cas12a检测体系中DNA(ssDNA)报告系统为ssDNA FQ reporter。

荧光检测时，肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎衣原体和肺炎支原体特异性核酸激活后的Cas12a蛋白会切割由荧光基团和淬灭基团标记的ssDNA FQ reporter，从而释放激活荧光基团，使用酶标仪可以检测到荧光读数。相对应的，待检测样品中不存在特异性核酸时，不会有荧光读数。

蓝光切胶仪照射的波长为470纳米，对于核酸检测的阳性结果可以激发产生肉眼可见的荧光信号。

本发明还提供了一种用于肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎衣原体和肺炎支原体核酸多重检测的方法，包括以下步骤：

(1)提取待检测生物样品核酸；

(2)RPA等温扩增与Cas12a检测：利用所述的引物组合在RPA等温扩增体系中扩增取步骤(1)得到的生物样品核酸，将扩增的产物进行Cas12a检测，反应得到Cas12a检测产物；

(3)将Cas12a检测产物进行酶标仪荧光检测或蓝光切胶仪照射。

步骤(1)中，所述待检测生物样品为痰液样本。

步骤(2)中，所述扩增条件为39℃反应20分钟；所述Cas12a检测条件为37℃反应15分钟。

等温扩增-Cas12a检测首先将待检样品加入至等温扩增反应腔室，反应完成后再吸取等温扩增产物至Cas12a检测反应腔室，最终将所有Cas12a检测反应产物通过荧光信号判读检测结果，完成检测。

具体的，用于肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎衣原体和肺炎支原体核酸多重检测的方法包括以下步骤：

S1：特异性crRNA的制备。针对肺炎链球菌lytA基因、流感嗜血杆菌16S-rRNA基因、肺炎衣原体P1基因和肺炎支原体Ompa基因设计包含Cas12a识别序列TTTN的crRNA，构建载体后体外转录获得crRNA；

S2：核酸释放。利用核酸快速释放试剂释放待测样品中核酸；

S3：核酸等温扩增与Cas12a检测。利用等温扩增引物在RPA体系中扩增S2步骤样品(39℃反应20分钟)，并由Cas12a识别肺炎链球菌lytA基因、流感嗜血杆菌16S-rRNA基因、肺炎衣原体P1基因或肺炎支原体Ompa基因特异性核酸序列，使激活的Cas12a切割探针(37℃反应15分钟)。

S4：反应产物使用蓝光切胶仪照射，通过肉眼观察判读检测结果。

本发明的有益效果：

1、本研亢选取痰液样本作为检测对象具有较大的临床意义。肺脏深部的痰液可以比较准确地反应肺组织内部病原微生物的感染情况，而且该取样方法属于无创取样，不会对患者造成比较大的应激反应。但痰液样本含有的病原菌数量相对降低，所以准确检测有一定的难度。但是该检测方法可以高灵敏高特异性地检测痰液中肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎衣原体和肺炎支原体，因此具有较重要的临床价值。

2、目前市场上开发了基于Cas12a的单病原菌检测方法，该方法虽然可以快速准确地检测病原微生物感染，但是检测覆盖范围窄，检测成本相对较高，而RPA/CRISPR检测方法有利于克服以上不足之处。

3、该检测方法，通过检测Cas12a蛋白非特异性侧链切割单链荧光报告基因的荧光情况，可以高灵敏高特异性地检测痰液样本中的四病原微生物。

附图说明

图1为多重检测痰液样本病原微生物的原理及流程图。

图2为肺炎链球菌的检测灵敏度图；其中，*p＜0.05。

图3为流感嗜血杆菌的检测灵敏度图；其中，*p＜0.05。

图4为肺炎衣原体的检测灵敏度图；其中，*p＜0.05。

图5为肺炎支原体检测灵敏度图；其中，*p＜0.05。

图6为四重RPA/CRISPR方法检测质粒样品核酸靶基因的荧光结果图。

图7为图6中RPA/CRISPR荧光检测结果的统计分析图；其中，*p＜0.05。

图8为临床阳性患者痰液样本病原微生物DNA的检测图。

图9为pUC57质粒图谱。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的总体技术示意图如图1所示，包括以下4部分：特异性crRNA的制备、核酸释放、核酸等温扩增与Cas12a检测，及蓝光照胶仪荧光检测。

所述基于CRISPR/Cas12a的用于肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎衣原体和肺炎支原体核酸多重检测的方法包括以下步骤：

S1：特异性crRNA的制备。针对肺炎链球菌lytA基因、流感嗜血杆菌16S-rRNA基因、肺炎衣原体P1基因和肺炎支原体Ompa基因设计包含Cas12a识别序列TTTN的crRNA，构建载体后体外转录获得crRNA；

S2：核酸释放。利用核酸快速释放试剂释放待测样品中核酸；

S3：核酸等温扩增与Cas12a检测。利用等温扩增引物在RPA体系中扩增S2步骤样品(39℃反应20分钟)，并由Cas12a识别肺炎链球菌lytA基因、流感嗜血杆菌16S-rRNA基因、肺炎衣原体P1基因或肺炎支原体Ompa基因特异性核酸序列，使激活的Cas12a切割探针(37℃反应15分钟)。

S4：反应产物使用蓝光切胶仪照射，通过肉眼观察判读检测结果。

实施例1

一种用于肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎衣原体和肺炎支原体核酸多重检测的试剂盒及方法：

1、特异性crRNA的制备

(1)筛选痰液待检病原菌

通过临床调研，选取多种影响较为严重且具有一定代表性的病原微生物作为检测靶标，本发明使用具有较强的代表性的且痰液中容易造成肺脏组织感染的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae，Stp)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae，Hai)、肺炎支原体(Chlamydophila pneumoniae，Chp)和肺炎衣原体(Mycoplasma pneumoniae，Myp)。

(2)合成病原菌检测质粒

本发明四种病原菌的检测基因，肺炎链球菌的lytA靶基因片段序列如SEQ IDNO.21所示、流感嗜血杆菌的16S-rRNA靶基因片段序列如SEQ ID NO.22所示、肺炎支原体的P1靶基因片段序列如SEQ ID NO.23所示和肺炎衣原体的Ompa靶基因片段序列如SEQ IDNO.24所示，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，并构建到pUC57载体(图谱如图9所示)上，用于肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎衣原体和肺炎支原体质粒全长引物扩增引物如表1所示。

(3)合成并筛选特异性crRNA

在检测靶标范围内，根据PAM位点(TTTN)每条基因优选4-5条crRNA。crRNA合成后以矩阵的方式测是不同crRNA与检测模板是否存在交叉反应。本项目所使用的crRNA是经过筛选后的高效crRNA与不同模板之间不存在交叉反应，结果如图6所示，结果证实多重RPA产物分别在四种病原菌特异性crRNA的侧链切割下产生荧光，该多重RPA反应体系成功扩增四种病原微生物，包括肺炎链球菌的lytA靶基因片段、流感嗜血杆菌的16S-rRNA靶基因片段、肺炎支原体的P1靶基因片段和肺炎衣原体的Ompa靶基因片段的质粒。因此本发明所使用的crRNA具有高度特异性。即对应肺炎链球菌的lytA靶基因片段序列、流感嗜血杆菌的16S-rRNA靶基因片段序列、肺炎支原体的P1靶基因片段序列和肺炎衣原体的Ompa靶基因片段序列得到序列如SEQ ID NO.9～12所示的特异性crRNA，具体信息如表1所示。crRNA由金斯瑞金斯瑞生物科技股份有限公司负责合成。

2、样本制备

利用核酸快速释放试剂释放待测样品中核酸。

取1-2g痰液组织，加入痰消化液(Sputasol法)，挑起约5mL浓痰液至已标记的50mL离心管中。加入等量的痰消化液进行均质化处理，涡旋震荡20s，30～37℃静置15～20min。加入无菌PBS(pH6.8左右)至约50mL，3000rpm离心15min。倒掉上清液，添加PBS1～3mL，100℃温浴震荡10min，得到待测样品中核酸。

3、RPA等温扩增与Cas12a检测

利用反转录等温扩增(RT-RPA)对病原菌核酸进行预扩增，以便进行Cas12a检测反应；

按照等温扩增反应要求，根据步骤1中(2)的检测靶标，在模板上游和下游分别设计3条RPA引物，扩增产物控制在200bp以内，RPA引物合成后根据荧光信号强度优选出最佳的引物组合方式。本专利所使用的RPA引物为经过筛选后效果最佳的引物组合对，序列信息如表1所示。RPA引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

等温扩增-Cas12a检测首先将待检样品加入至等温扩增反应腔室，反应完成后再吸取等温扩增产物至Cas12a检测反应腔室，最终将所有Cas12a检测反应产物通过荧光信号判读检测结果，完成检测。

本研亢利用酶促重组等温扩增(Enzymatic Recombinase Amplification，ERA)技术，反应体系为25μL，具体包括：反应缓冲液10μL，ERA 5μL，10μM上游引物(序列如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.7，体积比例为1∶1∶1∶1)1.25μL，10μM下游引物(序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.8，体积比例为1∶1∶1∶1)1.25μL，激动剂醋酸镁(MgoAC，350mM)1μL，DNA模板2μL(加样体积不变，不同的加样样本中含有不同浓度的基因拷贝数)，ddH₂O 4μL，扩增条件为39℃ 20min。RPA试剂盒购买于苏州先达基因科技有限公司。

CRISPR/Cas12a反应体系为20μL，其中包括：ddH₂O8.9μL、RNA酶抑制剂0.1μL、Buffer 3.1 2μL、ssDNA reporter 1μL、Cas12a蛋白1μL、crRNA(序列如SEQ ID NO.9～12所示)2μL、RPA产物5μL。其中，所述ssDNA报告系统包括用于酶标仪荧光检测的ssDNA FQreporter。

其中，所述ssDNA FQ reporter为利用6-羧基荧光素(6-FAM)和荧光淬灭剂(BHQ1)标记的ssDNA，标记产物如下：/56FAM/TTATT/3BHQ1/，命名为ssDNA FQ reporter/5 6FAM/TTATT/3BHQ1/。

荧光检测时，肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎衣原体和肺炎支原体特异性核酸激活后的Cas12a蛋白会切割由荧光基团和淬灭基团标记的ssDNA FQ reporter，从而释放激活荧光基团，使用蓝光照胶仪可以检测到荧光。

蓝光切胶仪照射的波长为470纳米，对于核酸检测的阳性结果可以激发产生肉眼可见的荧光信号。

待检测样品的核酸通过等温扩增反应体系，39℃孵育20min，之后将5μL等温扩增反应产物通过CRISPR/Cas12a反应体系，在39℃反应15min，本研亢所使用的检测反应产物荧光信号的仪器为蓝光照胶仪，检测波长为470-520nm。

图6结果证实，多重RPA产物分别在四种菌特异性crRNA的侧链切割下产生荧光。研亢结果证实该多重RPA反应体系成功扩增四种病原微生物，包括肺炎链球菌(lytA)、流感嗜血杆菌(16S-rRNA)、支原体(P1)和衣原体(Ompa)的质粒。

图7是对图6结果的统计分析，图6代表的是本研亢的检测体系，在检测体系中包含检测所需的CRISPR组分、四重引物的上下游。阴性对照组中加入的是无菌水，检测组中加入的样本是不同的待检测质粒。不同分组之间通过特异性crRNA来区别。与对照(no templatecontrol，NC)组相比，肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎支原体和肺炎衣原体组的荧光强度均显著升高。这一结果说明，本研亢的检测体系具有科学性和合理性，成功的构建了一种用于肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎衣原体和肺炎支原体核酸多重检测方法。

表1

实施例2 RPA/CRISPR的检测灵敏度

连续稀释实施例1中制备的DNA模板至不同的基因拷贝数，包括1.0×10⁵(也可写成e5)、1.0×10⁴、1.0×10³、1.0×10²、1.0×10¹、0，通过荧光结果分别判定四种病原菌的检测灵敏度。检测结果如图2～5所示，图2结果证实，该检测方法具有高灵敏性，针对肺炎链球菌的检测灵敏度可达到10copies/μL；图3结果证实，该检测方法具有高灵敏性，针对流感嗜血杆菌的检测灵敏度可达到10copies/μL；图4结果证实，该检测方法具有高灵敏性，针对肺炎衣原体的检测灵敏度可达到10copies/μL；图5结果证实，该检测方法具有高灵敏性，针对肺炎支原体的检测灵敏度可达到10copies/μL。

实施例3临床检测

对临床阳性患者痰液样本病原微生物DNA的检测。在临床实践中，虽然单一细菌感染呼吸道的情况虽然也很常见，但是较多情况是存多重细菌的混合感染。鉴于这种客观事实，本实施例随机挑选一名经过医生诊断后同时存在肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎支原体和肺炎衣原体感染的阳性患者。

1、样本的制备

随机取临床阳性患者痰液样本，临床样本来自于杭州市第一人民医院，加入痰消化液(Sputasol法)，挑起约5ml浓痰液至已标记的50mL离心管中。加入等量的痰消化液进行均质化处理，涡旋震荡20s，30～37℃静置15～20min。加入无菌PBS(pH6.8左右)至约50mL，3000r/min离心15min。倒掉上清液，添加PBS 1～3mL，100℃温浴震荡10min，得到处理后的样品。取5μL处理后的样品用于RPA扩增和CRISPR/Cas12a检测。

2、RPA等温扩增与Cas12a检测

取5μL“1、样本的制备”步骤处理后的样本加入至等温扩增反应体系中，39℃孵育10分钟。之后通过吸取5μL等温扩增反应产物至CRISPR/Cas12a反应体系中，在39℃反应15min，得到Cas12a反应产物；其中，等温扩增反应体系和CRISPR/Cas12a反应体系为实施例1中步骤3的等温扩增反应体系和CRISPR/Cas12a反应体系。

3、蓝光照胶仪荧光检测

将步骤2中的Cas12a反应产物用于蓝光照胶仪测定，研亢结果表明本项目开发的RPA/Cas12a检测方法成功检出痰液样本中的病原微生物，包括肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎支原体和肺炎衣原体。

综上所述，该实验证明了该检测方法具有高灵敏性和便携性，可以快速检测痰液样本中四种病原微生物，丰富了呼吸道病原微生物的检测手段，对于指导临床呼吸道病原微生物的诊断具有重要意义。

尽管已经展示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下，可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (9)

1.一种用于肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎衣原体和肺炎支原体核酸多重检测的靶标，其特征在于，所述靶标为四条序列组成的靶标组合，所述靶标组合的核苷酸序列如SEQID NO.21至SEQ ID NO.24所示。

2.一种用于肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎衣原体和肺炎支原体核酸多重检测的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括：

核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的肺炎链球菌特异性引物，

核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的流感嗜血杆菌特异性引物，

核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的肺炎衣原体特异性引物，

核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的肺炎支原体特异性引物。

3.一种用于肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎衣原体和肺炎支原体核酸多重检测的crRNA组合，其特征在于，所述crRNA组合包括：

序列如SEQ ID NO.9所示的肺炎链球菌特异性crRNA，

序列如SEQ ID NO.10所示的流感嗜血杆菌特异性crRNA，

序列如SEQ ID NO.11所示的肺炎衣原体特特异性crRNA，

序列如SEQ ID NO.12所示的肺炎支原体特异性crRNA。

4.一种用于肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎衣原体和肺炎支原体核酸多重检测的试剂盒，其特征在于，包括等温扩增体系、检测体系、酶标仪荧光检测体系；

所述等温扩增体系包括作为等温扩增引物的权利要求2所述的引物组合，

所述Cas12a检测体系包括权利要求3所述的crRNA组合，

所述酶标仪荧光检测体系用于检测所述Cas12a检测体系产生的Cas12a检测反应产物。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述Cas12a检测体系还包括Cas12a蛋白、ssDNA报告系统，所述ssDNA报告系统包括用于荧光检测的ssDNA FQ reporter。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述用于荧光检测的ssDNA FQreporter，5’端标记的荧光基团是6-FAM，3’端标记的淬灭基团是BHQ1。

7.一种用于肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎衣原体和肺炎支原体核酸多重检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待检测生物样品核酸；

(2)RPA等温扩增与Cas12a检测：利用权利要求2中所述的引物组合在RPA等温扩增体系中扩增取步骤(1)得到的生物样品核酸，将扩增的产物进行Cas12a检测，反应得到Cas12a检测产物；

(3)将Cas12a检测产物进行酶标仪荧光检测或蓝光切胶仪照射。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述待检测生物样品为痰液样本。

9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述扩增条件为39℃反应20分钟；所述Cas12a检测条件为37℃反应15分钟。