CN111088380A - 布鲁氏菌lf-rpa检测引物和探针及检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种布鲁氏菌LF‑RPA检测引物和探针及检测试剂盒。所述试剂盒中包含基于RPA技术检测布鲁氏菌的引物及探针，上、下游引物和探针序列分别如SEQ ID NO:1‑3所示。本发明首次采用RPA扩增技术建立快速检测布鲁氏菌的方法，进一步结合侧流层析技术，可用于临床和现场检测，为布鲁氏菌的现场快速检测提供一种灵敏、可靠的新方法。本发明大大简化了检测步骤，缩短了检测时长，同时还具有敏感性高、特异性强、稳定性好、检测标本类型多等优点，能够实现对人全血(血清)、关节液、脑脊液和动物全血(血清)、组织、流产物、可疑奶制品等感染布鲁氏菌的检测，对布鲁氏菌病的现场快速诊断具有重要意义。

Description

布鲁氏菌LF-RPA检测引物和探针及检测试剂盒

技术领域

本发明涉及核酸检测技术领域，具体地说，涉及一种布鲁氏菌LF-RPA检测引物和探针及检测试剂盒。

背景技术

布鲁氏菌病(以下简称布病)是由布鲁氏菌感染引起的人畜共患传染-变态反应性疾病，属于《中华人民共和国传染病防治法》规定的乙类传染病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为重要传染病，并列为《家畜家禽防疫条例实施细则》中的二类传染病。布病潜伏期1-3周，初期症状类似重感冒，如发热、乏力、多汗、关节疼痛。临床症状和体征极不典型，在诊疗过程中易造成误诊和漏诊，急性期如不及时诊断极易发展为慢性期，造成因病致贫和因病返贫。慢性期患者往往都伴有不同程度的骨关节系统病变。该病的致命性并发症为中枢神经系统病变及心肌病变。所以布病的早期诊断和治疗显得尤为重要。

传染病诊断的主要方法包括病原学检测、分子生物学检测和免疫学检测。在我国的诊断标准中，分离培养得到菌株的方法普遍作为诊断金标准。但是病原学的分离培养法具有对实验环境和操作技术要求高、耗时久、敏感性低、阳性率低、早期诊断易漏诊等不足，不适用于传染病现场诊断。免疫学检测法基本原理是利用抗原抗体特异性的结合反应，常见的有ELISA、荧光抗体染色镜检和胶体金免疫层析等。但由于发病期间抗原抗体产生的量、出现时间的早晚以及交叉反应等因素，使这种方法常出现假阴性或是假阳性结果。分子生物学检测法主要根据病原体的特异性基因的有无，从而判断病原体的种属。最为常见的检测方法为PCR及其衍生PCR技术如荧光定量PCR、巢式PCR和数字PCR等。因该方法的高特异性和高灵敏度，已经成为传染病病原体诊断的一个基本和必要的技术手段，广泛应用于细菌、病毒和寄生虫的检测中。但是由于传统的核酸扩增技术对仪器的依赖性较高，需要昂贵精密的仪器才能完成扩增过程和结果读取。检测成本高和耗时长，这些局限性使其应用大多限制于条件优良的实验室内，难以广泛应用于现场及野外检测。

诊断布病的“金标准”是病原分离，但病原分离要求在P3级生物实验室进行，细菌培养期较长(2-4周)，培养初期需要在5-10％CO₂环境下生长，对实验室操作人员有较高的专业技术要求；培养的阳性率较低(30％)，且有明显的操作暴露危险，增加医源性感染的可能，在基层不易推广。荧光定量PCR检测灵敏度高，但其需要精密昂贵的检测仪器和良好的实验环境，很难用于基层实验室和野外现场等地区。鉴于现有细菌学检测方法的诸多不足，恒温扩增技术在传染病诊断中具有广阔的应用前景。具有敏感度高、特异性好，同时兼具现场快速检测等优点。若能将该方法在布病实验室诊断和流行病现场筛查中推广应用，对于降低人畜布病漏诊率具有重要意义。同时结合就诊者临床资料以及流行病学接触史综合分析，可以了解该方法在不同临床就诊中的诊断意义和应用价值，为核酸检测标准化应用提供实验室参考依据。重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification,RPA)是近几年出现的一种新的核酸恒温扩增技术,RPA扩增产物可以在侧流层析试纸条(lateralflow strip)上显色,并具有快速、操作简便、特异性好、敏感性高等特点，基层工作者用其来检测布病具有很大的优势。LF-RPA技术是基于RPA扩增原理，利用带生物素标记的引物和带羧基荧光素(FAM)标记的探针与靶核酸进行扩增反应，使最终扩增产物同时携带FAM荧光素和生物素标记。LF试纸条前端包被有带FAM抗体的纳米金颗粒，检测线上包被有生物素抗体，当反应液进入试纸条时，带有FAM和生物素的扩增产物就会通过抗原抗体特异性结合，在检测线上形成生物素抗体-核酸-纳米金颗粒复合体并显色。LF试纸条上还有一条质控线，固定抗体包被在此，可直接与带FAM抗体的纳米金颗粒结合，在质控线上显色，以确保试纸条的有效性。LF-RPA作为一种快速、简便、可视化的核酸检测方法，已广泛应用到对细菌、病毒及寄生虫等病原体的检测工作中。LF-RPA检测方法操作简捷，并且无需大型精密仪器进行结果读取，十分适用于疾病防控或床旁诊断。

根据美国疾病预防控制中心(CDC)，布鲁氏菌可作为生物恐怖制剂，因其容易获得且成本低，易于传播，可引起广泛恐慌，快速诊断可以且减少在人群中快速传播所带来的影响。因此，开发快速廉价且易于使用的诊断工具对于此类传染病的预防和控制具有至关重要的作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种布鲁氏菌LF-RPA检测引物和探针及检测试剂盒。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种布鲁氏菌LF-RPA检测引物和探针，上、下游引物和探针序列分别如下(SEQ ID NO:1-3)：

上游引物：5′-CTAATCCTGAAATAATACTCATAGGTACCG-3′

下游引物：5′-Biotin-CAGAGCCACCTAACCCTAGAGTAGAACAGC-3′

探针：5′-FAM-TTGTAAGACATATAATTTGCTTGTTAATGA[THF]AATCGTAATGTTAGCT[C3spacer]-3′。

本发明基于布鲁氏菌属特异性基因(Bcsp31)，针对Bcsp31序列保守区设计并优化得到上述RPA引物和探针。

第二方面，本发明提供含有所述引物和探针的检测试剂或试剂盒。

第三方面，本发明提供一种布鲁氏菌LF-RPA检测试剂盒，所述试剂盒包括所述引物和探针，还包含侧流层析试纸条以及TwistAmp nfo试剂盒中部分试剂。

第四方面，本发明提供所述引物和探针、含有所述引物和探针的检测试剂或试剂盒在布鲁氏菌检测中的应用。

本发明中，所述布鲁氏菌包括羊种1型、羊种2型、羊种3型、牛种1型、牛种2型、牛种3型、牛种4型、牛种5型、牛种6型、牛种7型、牛种9型、猪种1型、猪种2型、猪种3型、猪种4型、猪种5型、犬种、沙林鼠种、绵羊附睾种布鲁氏菌6个种19个生物型标准菌株。

进一步地，所述布鲁氏菌还包括中国流行株165株。

第五方面，本发明提供一种非诊断目的RPA扩增检测布鲁氏菌的方法，包括以下步骤：

1)提取待测样本的总DNA，作为模板；

2)配制含有所述引物和探针的RPA反应体系，向反应体系中加入上述提取的总DNA，进行RPA扩增反应；

3)分析扩增产物。

前述的方法，步骤2)包括：向离心管中加入再水化缓冲液29.5μL，10μM上、下游引物各2.1μL，10μM探针0.6μL，DNA模板2μL，用ddH₂O补齐至总体积50μL，混匀后，将上述混合液加入含有冻干酶球的RPA反应管中，混匀，最后将280mM醋酸镁溶液2.5μL加至上述反应管中，混匀后将反应管置于等温扩增仪中，于37℃反应3-5min。取出震荡，再继续反应25-30min。

步骤2)所用部分反应试剂来自TwistAmp nfo试剂盒。

步骤3)包括：按1:9-19(优选1:19)体积比将扩增产物加入PBST缓冲液中，将侧流层析试纸条插入上述混合液中，室温放置5min后观察结果。

本发明中，侧流层析试纸条购自杭州优思达生物技术有限公司。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(一)本发明首次采用RPA扩增技术建立快速检测布鲁氏菌的方法，进一步结合侧流层析技术，可用于临床和现场检测，为布鲁氏菌的现场检测提供一种快速、灵敏、可靠的新方法。

(二)本发明大大简化了检测步骤，缩短了检测时长，同时还具有敏感性高、特异性强、稳定性好、检测标本类型多等优点，能够实现对人全血(血清)、关节液、脑脊液和动物全血(血清)、组织、流产物、可疑奶制品等感染布鲁氏菌的检测，对布鲁氏菌病的现场快速诊断具有重要意义。

(三)通过RPA反应能够将痕量的核酸模板扩增到可以检出的水平，本发明所建立的检测方法可检测出20fg的核酸。

(四)检测速度快，与常规PCR相比，不经过变温历程，30min内即可完成反应，尤其适于基层实验室和现场快速核酸检测。

附图说明

图1为本发明实施例1中5对RPA备选引物扩增后电泳结果。其中，M：DNA Marker，1-5分别对应于表2中引物1-5。

图2为本发明实施例1中LF-RPA特异性验证。只有布鲁氏菌核酸检测线上出现条带，其余均未出现条带，结果为阴性，说明该体系未与所选的其他病原菌出现交叉反应，特异性100％。

图3为本发明实施例1中LF-RPA最佳反应温度优化实验结果。

图4为本发明实施例1中LF-RPA最佳反应时间优化实验结果。

图5为本发明实施例1中LF-RPA体系敏感性验证实验结果。

图6为本发明实施例1中布鲁氏菌病部分患者血液标本LF-RPA检测结果图。

具体实施方式

本发明提供一种通用侧流层析-重组酶聚合酶扩增技术检测布鲁氏菌方法，具体来说是一种检测人(畜)布鲁氏菌病的可视化侧流层析试剂盒。该试剂盒主要由本发明中LF-RPA两条特异引物和一条探针(SEQ ID NO:1-3)组成。提取核酸后，按体系将核酸、引物和探针混匀后加入到RPA冻干酶粉的反应管中，混匀，37℃反应25min。取出震荡，从管中取出5μl产物加入95μl的PBST缓冲液中，将试纸条插入稀释液中，室温放置5min后观察结果。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1RPA扩增检测布鲁氏菌方法的建立

1、RPA引物设计

基于布鲁氏菌属特异性基因(Bcsp31)，针对Bcsp31序列保守区设计并优化得到上述RPA引物和探针。使用basic RPA方法扩增，随后将产物纯化后行凝胶电泳，根据扩增效率和特异性，筛选出最佳引物。LF-RPA检测方法的探针长度是46bp的核苷酸，其中在5'末端标记FAM基团，四氢呋喃残基位点(THF也称为dspacer)位于5'末端下游30个核苷酸处和在3'端标记一个阻断基团(C3spacer)。LP-RPA的反向引物在5'末端与生物素缀合。引物与探针的序列及修饰见表1。

表1引物与探针序列

共设计了5对引物(表2)，经验证后最终选择扩增效率最高且没有非特异扩增的引物1，引物筛选结果见图1。进一步地，在引物1基础上设计并优化得到表1的引物及探针。

表2 5对引物

2、特异性验证

用布鲁氏菌六个种19个生物型标准菌株(羊种1型、羊种2型、羊种3型、牛种1型、牛种2型、牛种3型、牛种4型、牛种5型、牛种6型、牛种7型、牛种9型、猪种1型、猪种2型、猪种3型、猪种4型、猪种5型、犬种、沙林鼠种、绵阳附睾种)及中国流行株165株进行验证。选用枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、志贺菌、阴沟杆菌、小肠结肠耶尔森菌、马尔通体、土拉弗朗西斯菌、鼠疫耶尔森菌、炭疽杆菌、人苍白杆菌共12种病原菌核酸进行特异性验证分析。结果见图2。

3、LF-RPA反应体系：使用TwistAmp nfo试剂盒，反应体系为50μl。将RehydrationBuffer 29.5μl，引物(10μmol/L)各2.1μl，探针(10μmol/L)0.6μl，ddH₂O水11.2μl，核酸模板2μl混合均匀后加入到RPA冻干酶粉的反应管中，混匀，最后加入280mmol/L的MgAC₂溶液2.5μl，混匀。将上述反应管置于水浴锅中，37℃反应5min，取出震荡，再继续反应25min后，从管中取出5μl产物加入95μl的PBST缓冲液中，将试纸条插入稀释液中，室温放置5min后观察结果。

4、LF-RPA反应温度优化：为确定最佳扩增温度，将上述LF-RPA反应体系，分别在20℃、25℃、30℃、37℃、40℃、45℃、50℃条件下进行扩增反应，30min后使用LF试纸条进行结果判读。为了找到最佳扩增温度，LF-RPA检测方法使用2ng基因组DNA(gDNA)在20℃，25℃，30℃，37℃，40℃，45℃和50℃不同温度下进行反应，反应时间为20分钟。该实验重复两次。结果见图3。最佳反应温度为37℃。

5、LF-RPA反应时间优化：配制上述LF-RPA的反应体系，37℃条件下进行反应，分别在5min、10min、15min、20min、25min、30min取出反应管冰上终止反应。待全部反应结束后使用LF试纸条进行结果判读。为了找到最佳时间，LF-RPA检测方法使用2ng基因组DNA(gDNA)在5min、10min、15min、20min、25min、30min不同时间下进行反应，该实验重复两次。结果见图4。最佳反应时间为25min。

6、灵敏性分析：将原始浓度为20ng/μl的布鲁氏菌基因组DNA按10倍稀释至2fg/μl。每个稀释浓度的核酸作为LF-RPA及TaqMan Real-Time PCR(qPCR)方法的模板，分析灵敏度。结果见图5。最低检测限为20fg。

7、LF-RPA检测布鲁氏菌病临床患者血液样本的实用性分析：收集布鲁氏菌病患者抗凝血，使用基因组提取试剂盒对109份临床患者全血样本提取DNA，然后用LF-RPA和qPCR检测，标准菌株羊种3型菌DNA和正常人血液样本DNA分别作为阳性对照和阴性对照。结果见表3、图6。

表3两种方法检测结果比较

结果	qPCR	LF-RPA
			阳性(+)	61例	65例
阴性(-)	48例	44例
			总计	109例	109例

结果表明，LF-RPA与qPCR的检测灵敏度相当。

LF-RPA技术的优势：首先，RPA的反应体系简单，只包含一对引物和一条探针，与荧光定量PCR相似。其次，RPA检测体系特异性强和灵敏度高，针对病原体的特异性基因设计的引物和探针进行扩增，将样本中的核酸含量短时间扩大到可检测的水平，且不易于其他病原体发生交叉反应。另外，配制RPA反应体系操作简便且反应所需时间较短，而且对反应温度要求不高，在25℃-45℃的温度范围内，恒温扩增10-20min即可。若配合使用试纸条读取结果，整个检测过程可在30min内完成。因此RPA技术不受大型精密实验仪器和良好的实验室环境所限制。除此之外，RPA的反应试剂是以干粉形式保存，这对冷链要不高，方便运输及开展现场检测工作。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所

<120> 布鲁氏菌LF-RPA检测引物和探针及检测试剂盒

<130> KHP201110090.4

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctaatcctga aataatactc ataggtaccg 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cagagccacc taaccctaga gtagaacagc 30

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttgtaagaca tataatttgc ttgttaatga aatcgtaatg ttagct 46

Claims (7)

1.布鲁氏菌LF-RPA检测引物和探针，其特征在于，上、下游引物和探针序列分别如下：

上游引物：5′-CTAATCCTGAAATAATACTCATAGGTACCG-3′

下游引物：5′-Biotin-CAGAGCCACCTAACCCTAGAGTAGAACAGC-3′

探针：5′-FAM-TTGTAAGACATATAATTTGCTTGTTAATGA[THF]AATCGTAATGTTAGCT[C3spacer]-3′。

2.含有权利要求1所述引物和探针的检测试剂或试剂盒。

3.布鲁氏菌LF-RPA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述引物和探针，还包含侧流层析试纸条。

4.非诊断目的RPA扩增检测布鲁氏菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待测样本的总DNA，作为模板；

2)配制含有权利要求1所述引物和探针的RPA反应体系，向反应体系中加入上述提取的总DNA，进行RPA扩增反应；

3)分析扩增产物。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)包括：向离心管中加入再水化缓冲液29.5μL，10μM上、下游引物各2.1μL，10μM探针0.6μL，DNA模板2μL，用ddH₂O补齐至总体积50μL，混匀后，将上述混合液加入含有冻干酶球的RPA反应管中，混匀，最后将280mM醋酸镁溶液2.5μL加至上述反应管中，混匀后将反应管置于等温扩增仪中，于37℃反应3-5min；取出震荡，再继续反应25-30min。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤3)包括：按1:9-19体积比将扩增产物加入PBST缓冲液中，将侧流层析试纸条插入上述混合液中，室温放置5min后观察结果。

7.根据权利要求4-6任一项所述的方法，其特征在于，所述布鲁氏菌包括羊种1型、羊种2型、羊种3型、牛种1型、牛种2型、牛种3型、牛种4型、牛种5型、牛种6型、牛种7型、牛种9型、猪种1型、猪种2型、猪种3型、猪种4型、猪种5型、犬种、沙林鼠种、绵羊附睾种布鲁氏菌。

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