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CN112410447B - 一种铜绿假单胞菌的扩增引物组及检测方法 - Google Patents

一种铜绿假单胞菌的扩增引物组及检测方法 Download PDF

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CN112410447B
CN112410447B CN202011493433.7A CN202011493433A CN112410447B CN 112410447 B CN112410447 B CN 112410447B CN 202011493433 A CN202011493433 A CN 202011493433A CN 112410447 B CN112410447 B CN 112410447B
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CN
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pseudomonas aeruginosa
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rpa
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徐迎新
刘帛岩
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First Medical Center of PLA General Hospital
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Abstract

本发明公开了一种铜绿假单胞菌的扩增引物组及检测方法。本发明提供了一种检测铜绿假单胞菌的RPA引物,由引物1和引物2组成;所述引物1为如下(a1)或(a2):(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子;(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子;所述引物2为如下(a3)或(a4):(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子;(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子。本发明提供一种用于铜绿假单胞菌的扩增引物组及快速检测方法,该方法以重组酶聚合酶扩增反应(RPA)为基础,结合侧流层析试纸,能够快速、灵敏、高特异度地进行铜绿假单胞菌检测。

Description

一种铜绿假单胞菌的扩增引物组及检测方法
技术领域
本发明属于微生物检测技术领域,尤其涉及一种铜绿假单胞菌的扩增引物组及检测方法。
背景技术
快速、灵敏、特异的致病菌检测分析对于疾病诊断和感染患者的治疗具有重要意义。传统的病原菌微生物检测方法需要对病原菌进行分离、培养,并进行一系列的生化鉴定,操作繁琐,检测时间长,且无法适用于难以培养的病原菌,远不能满足临床实际需求。近年来,科研人员运用分子生物学及生物技术的最新成果,开发或优化了一系列新的细菌的快速检测技术,如PCR相关技术、基因芯片技术、酶联免疫技术、噬菌体技术、流式细胞技术及生物传感技术等。其中,流式细胞术具有检测速度快、精度高等特点,在细菌鉴定方面独具优势,已经成为细菌病理及微生物研究的重要手段。通过标记细菌的核酸或蛋白,可以快速、准确地检测样本中的细菌总数、活菌数等。此种检测方法已经应用在了检测水中污染的细菌数量。然而其高昂的费用和复杂的设备也限制了其进一步发展。而作为鉴定细菌最早发展起来的培养法,已改进为在培养基中加入特异性生化发硬底物、抗体、荧光反应底物、酶反应底物等,使得培养物的选择、分离和鉴定能够一次性完成。虽然此方法已广泛应用于临床,但仍然存在许多不足之处,如检测所需时间较长、指示剂系统单一等。酶联免疫法是一种固相酶免疫分析的方法,既可检测抗原,又可检测抗体,既能定性,也能够定量。但该方法也存在检测时间长、抗体制备困难、存在假阳性等缺点和不足。实时定量PCR通过直接测定PCR过程中荧光信号的变化,利用电脑分析软件对PCR过程中产生的扩增产物进行动态监测和自动定量,从而成功地实现了PCR从定性到定量的飞跃。然而由于受到寡核苷酸杂交特异性、TaqMan探针比例和染料浓度大等因素的影响,引起定量结果出现偏差或导致假阳性和假阴性结果。
因此,目前还需要开发可快速、高效检测致病菌的新技术。
重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)是一种新型的恒温扩增技术。该技术不依赖热循环扩增模板序列,可在37℃-42℃的温度中进行,短时间内即可将模板大量扩增。此外,该技术对于硬件要求低,操作简单,特异性好,灵敏度低,特别适用于体外快速检测。而由于其自身特点,RPA引物往往无法与PCR引物通用。筛选合适引物成为了能否成功扩增的关键。
发明内容
本发明一个目的是提供一种检测铜绿假单胞菌的RPA引物。
本发明提供的检测铜绿假单胞菌的RPA引物,其由引物1和引物2组成;
所述引物1为如下(a1)或(a2):
(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子;
(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子;
所述引物2为如下(a3)或(a4):
(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子;
(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子。
上述RPA引物中,所述引物1和所述引物2末端标记不同的基团;所述基团可以为荧光基团、生物素基团或其他功能基团。
在本发明的实施例中,引物1的5'末端标记Biotin,引物2的5'末端标记6-FAM。
含有上述RPA引物的PCR试剂或试剂盒也是本发明保护的范围。
上述PCR试剂中,所述引物1和所述引物2在所述PCR试剂中的浓度均为0.2-0.5μmol/L。
上述试剂盒还包括配套检测RPA扩增产物的核酸检测试纸条;
所述试剂条包括与所述引物1标记基团结合的抗体和与所述引物2标记基团结合的抗体。
在本发明的实施例中,具体采用D003-03型一次性核酸检测试纸条,此类型试纸条使用三种抗体:第一种抗体是被胶体金颗粒标记的吸附于结合垫上,能够同待检测样品中的第一种抗原(生物素)特异性结合的抗体;第二种抗体为固定在检测线(T线)上能够同待检测样品中第二种抗原(6-FAM)特异性结合的抗体;第三种抗体为固定在质控线(C线)上能够与胶体金颗粒上的抗原特异性结合的抗体。
上述RPA引物或上述PCR试剂或上述试剂盒在如下1)-8)中至少一种应用也是本发明保护的范围:
1)鉴定或辅助鉴定铜绿假单胞菌;
2)制备或辅助鉴定鉴定铜绿假单胞菌产品;
3)鉴定或辅助鉴定待测菌是否为铜绿假单胞菌;
4)制备鉴定或辅助鉴定待测菌是否为铜绿假单胞菌产品;
5)鉴定或辅助鉴定待测样本中是否感染或含有铜绿假单胞菌;
6)制备鉴定或辅助鉴定待测样本中是否感染或含有铜绿假单胞菌产品;
7)鉴定或辅助鉴定待测样本是否感染或含有铜绿假单胞菌;
8)制备鉴定或辅助鉴定待测样本是否感染或含有铜绿假单胞菌产品。
本发明还有一个目的是提供如下方法:
本发明提供了一种鉴定或辅助鉴定待测菌是否为铜绿假单胞菌的方法,包括如下步骤:
用上述引物对待测菌进行RPA扩增,检测RPA扩增产物;再用核酸检测试纸检测扩增产物;
若所述核酸检测试纸显色阳性,则所述待测菌为或候选为铜绿假单胞菌;
若所述核酸检测试纸显色阴性,则所述待测菌中不为或候选不为铜绿假单胞菌。
本发明提供了一种鉴定或辅助鉴定待测样本是否感染铜绿假单胞菌或含有铜绿假单胞菌核酸的方法,包括如下步骤:用上述引物对待测样本进行RPA扩增,检测RPA扩增产物;再用核酸检测试纸检测扩增产物;
若所述核酸检测试纸显色阳性,则所述待测样本中含有或候选含有铜绿假单胞菌核酸或感染或候选感染铜绿假单胞菌;
若所述核酸检测试纸显色阴性,则所述待测样本中不含有或候选不含有铜绿假单胞菌核酸或不感染或候选不感染铜绿假单胞菌。
上述方法中,所述RPA扩增的模板为待测菌或待测样本的核酸。
本发明提供一种用于铜绿假单胞菌的扩增引物组及快速检测方法,该方法以重组酶聚合酶扩增反应(RPA)为基础,结合侧流层析试纸,能够快速、灵敏、高特异度地进行铜绿假单胞菌检测,实现肉眼可见检测。
附图说明
图1为以蒸馏水为模板的检测结果。
图2为引物浓度为0.5μM时的检测结果。
图3为引物浓度为0.25μM时的检测结果。
图4为特异性检测结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
下述实施例中所需试剂及主要仪器:
TwistAmpTM Basic型重组酶聚合酶扩增试剂盒购自英国TwistDx公司。
D003-03型一次性核酸检测试纸条购自杭州优思达生物技术有限公司。
A200基因扩增仪购自杭州朗基科学仪器有限公司。
1730R小型高速冷冻离心机(Labogene公司)。
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
实施例1、引物的设计及检测铜绿假单胞菌的方法的建立
一、引物的设计
1、特异性序列的确定
在线登陆Geenbank网站(www.ncbi.nlm.nih.gov),查询并获取铜绿假单胞菌标准菌株的16S rDNA基因序列(NC_002516)。之后通过网站在线BLAST核酸比对功能,与不同种属细菌的16SrDNA序列进行比对,筛选出铜绿假单胞菌特异的序列。并在该序列上选取长度为100-200bp的序列。之后将该序列再次通过BLAST功能与全部基因库进行比对,确认其特异性。该特异性序列长度为136bp。序列如下:
5’-TACCTTGCTGTTTTGACGTTACCAACAGAATAAGCACCGGCTAACTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCAGCAAGTTGGAT-3’(序列3)
2、RPA引物设计及合成
根据上一步得到的序列,设计适用于重组酶聚合酶扩增的上下游引物,上下游引物分别末端标记不同的基团,使扩增产物的两端同时具有两种标记基团(便于下面D003-03型一次性核酸检测试纸条的检测);
在本发明中,为了配合核酸检测试纸条检测,分别在上游引物的5’端连接生物素(Biotin),下游引物的5’端连接6-羧基荧光素(6-FAM)。
上游引物:5’-(Biotin)TACCT TGCTG TTTTG ACGTT ACCAA CAGAA-3’(序列1)下游引物:5’-(6-FAM)ATCCA ACTTG CTGAA CCACC TACGC-3’(序列2)
3、核酸标准品构建
将序列3所示的铜绿假单胞菌特异性目标序列进行合成,作为进行后续实验的核酸标准品。
二、检测铜绿假单胞菌的试剂盒
检测铜绿假单胞菌的试剂盒包括上述一中的RPA引物和检测RPA引物扩增产物的配套核酸检测试纸条;
检测RPA引物扩增产物的配套核酸检测试纸条包括与上游引物标记Biotin结合的抗体和与下游引物标记6-FAM基团结合的抗体;
在本发明的实施例中,具体采用D003-03型一次性核酸检测试纸条,此类型试纸条使用三种抗体:第一种抗体是被胶体金颗粒标记的吸附于结合垫上,能够同待检测样品中的第一种抗原(生物素)特异性结合的抗体A;第二种抗体为固定在检测线(T线)上能够同待检测样品中第二种抗原(6-FAM)特异性结合的抗体B;第三种抗体为固定在质控线(C线)上能够与胶体金颗粒上的抗原特异性结合的抗体C。
三、检测铜绿假单胞菌的方法的建立
本检测方法设计了一组适用于重组酶聚合酶扩增的铜绿假单胞菌的特异性检测引物,其中上游引物以生物素标记,下游引物以6-FAM标记。如果扩增体系中含有铜绿假单胞菌的基因序列,使用此组引物通过重组酶聚合酶扩增可获得带有双标记的产物。将产物通过核酸检测试纸条进行检测时,如果一条核酸链上同时带有能够与抗体A特异性结合的生物素以及能与抗体B特异性结合的6-FAM,在检测时即可被T线上固定的抗体B结合,形成抗原-抗体复合物。该复合物由于含有胶体金颗粒从而显示红色,即出现T线。之后C线可与未被T线捕获的胶体金颗粒或胶体金-生物素复合物结合从而使C线呈现红色。若生物素与6-FAM不在同一条核酸链上,检测时仅可出现C线。而当C线不出现时,检测无效。
在本实验中,利用生物素标记上游引物的同时,利用6-FAM标记下游引物。当体系中存在目标基因序列时,通过重组酶聚合酶扩增,可将生物素与6-FAM两种抗原同时组合在一条双链DNA上,从而使核酸检测试纸条上的T线和C线均出现红色,结果显示为阳性。当体系中不存在目标基因序列,生物素与6-FAM无法结合在一条链上,T线上的抗体B无法捕获红色的胶体金颗粒,而C线上的抗体C能特异结合胶体金颗粒上的抗原c,从而使核酸检测试纸条呈现单一质控线(C线),结果显示为阴性。
具体方法如下:
1、铜绿假单胞菌核酸提取
将含有铜绿假单胞菌的待测样品加入到装有4ml蒸馏水的EP管中,混合均匀后,在PCR仪中100℃加热20分钟。处理完毕后使用离心机以转速10000r/min离心10分钟。将上清液取出转移到新的EP管中,即得到DNA粗提取液。
2、RPA扩增
按照TwistAmpTM Basic型重组酶聚合酶扩增试剂盒说明书指导,在预装有RPA冻干酶球的容量为1.5ml的EP管中建立以下扩增反应体系(表1):
表1为扩增反应体系
成分 体积 终浓度
上游引物 2.4μl 0.024μM
下游引物 2.4μl 0.024μM
无引物重泡胀缓冲液 29.5μl
模板及蒸馏水 13.2μl
加入以上成分后,用移液枪反复吹细混匀。之后向体系中加入浓度为280mM的乙酸镁溶液2.5μL。反应自加入乙酸镁溶液后即刻开始。
控制反应温度为39℃,反应时间为30分钟。反应完成后,将反应体系温度降至0℃以停止反应,得到核酸扩增产物。
3、试纸条检测
取10μl上述2得到的核酸扩增产物,滴加在D003-03型一次性核酸检测试纸条的样品垫上。在微孔板中加入100μl检测试纸缓冲液,并将一次性核酸检测试纸条的样品垫向下插入到缓冲液中,并在15分钟后,根据试纸条的显色来进行结果判读。
阳性(+):试纸条的判读区内出现两条红色条带,其中一条位于质控区(C线),另外一条位于检测区(T线)。阳性结果表明进行检测的样本中含有目标核酸片段,且此片段数量大于等于试纸条的最低检出量。
阴性(-):试纸条判读区内只有质控区(C线)出现一条红色条带,检测区(T线)没有条带出现。阴性结果表明样本中不含有待检测的目标核酸片段,或其数量小于试纸条的最低检出量。
无效:试纸条判读区内质控区(C线)和检测区(T线)均无条带出现。无效结果表明检测使用的试纸条和/或扩增试剂可能已损坏、失效,或者操作出现错误。此时应检查试验步骤,重新扩增和测量。
若试纸条显色阳性,则待测样本中含有或候选含有铜绿假单胞菌核酸或待测样本感染或候选感染铜绿假单胞菌;
若试纸条显色阴性,则待测样本中不含有或候选不含有铜绿假单胞菌核酸或待测样本不感染或候选不感染铜绿假单胞菌。
因此,可以用RPA扩增引物和核酸检测试纸配合使用检测待测样本是否含有铜绿假单胞菌核酸或是否感染铜绿假单胞菌,具体方法如下:
1、提取待测样本的核酸;
2、用RPA引物扩增待测样本的核酸,得到扩增产物;
3、用核酸检测试纸检测扩增产物;
若试纸条显色阳性,则待测样本中含有或候选含有铜绿假单胞菌核酸或待测样本感染或候选感染铜绿假单胞菌;
若试纸条显色阴性,则待测样本中不含有或候选不含有铜绿假单胞菌核酸或待测样本不感染或候选不感染铜绿假单胞菌。
上述方法也可检测待测菌是否为铜绿假单胞菌,具体如下:
1、提取待测菌的核酸;
2、用RPA引物扩增待测菌的核酸,得到扩增产物;
3、用核酸检测试纸检测扩增产物;
若试纸条显色阳性,则待测菌为或候选为铜绿假单胞菌;
若试纸条显色阴性,则待测菌中不为或候选不为铜绿假单胞菌。
实施例2、检测铜绿假单胞菌的引物浓度及灵敏度分析
一、引物浓度的摸索
以蒸馏水为模板,方法按照实施例1的三,其中扩增反应体系中上游引物和下游引物的浓度分别为如下不同浓度:10μM、5μM、1μM、0.5μM及0.25μM。
用核酸检测试纸检测扩增产物。
结果如图1所示,从左至右试纸分别对应引物浓度依次为10μM、5μM、1μM、0.5μM、0.25μM;可以看出,引物的浓度均分别为10μM、5μM、1μM时,核酸检测试纸条结果呈现为阳性,检测不准确;当引物浓度为0.5μM及0.25μM时,核酸检测试纸条结果呈现为阴性,检测准确。
因此,选择引物浓度为0.5μM、0.25μM继续后续灵敏度分析实验。
二、检测铜绿假单胞菌的灵敏度分析
1、人工合成序列3所示的DNA片段,代表铜绿假单胞菌(ATCC:27853)的核酸;
2、用水将上述1合成的DNA片段进行稀释,浓度分别为1×10-10μM、1×10-11μM、1×10-12μM、1×10-13μM和1×10-14μM进行实验。
方法按照实施例1的二进行RPA扩增,引物浓度均为0.5μM或0.25μM;得到不同模板的扩增产物。
3、用核酸检测试纸检测扩增产物;
引物浓度为0.5μM的结果如图2所示,左至右试纸条对应的扩增产物的模板浓度依次为1×10-10μM、1×10-11μM、1×10-12μM、1×10-13μM、1×10-14μM,当模板浓度为1×10-10μM、1×10-11μM、1×10-12μM时,核酸检测试纸条显示结果为阳性。当模板浓度为1×10-13μM、1×10-14μM时,核酸检测试纸条显示结果为阴性。因此,当引物浓度为0.5μM时,能够检测出的最低模板浓度为1×10-12μM,即引物浓度为0.5μM时的最低检测浓度1×10-12μM。
引物浓度0.25μM的结果如图3所示,左至右试纸条对应的扩增产物的模板浓度依次为1×10-10μM、1×10-11μM、1×10-12μM、1×10-13μM、1×10-14μM,此时核酸检测试纸条均显示阴性结果,即考虑为假阴性。
综合上述实验结果,最佳引物浓度为0.5μM。在此引物浓度下,该方法的最低检测浓度,即灵敏度为1×10-12μM。
三、检测铜绿假单胞菌的特异度分析
方法按照实施例1的三进行:
1、提取铜绿假单胞菌(ATCC:27853)、金黄色葡萄球菌(ATCC:25923)、白色念珠菌(ATCC:10231)、鲍曼不动杆菌(ATCC:19606)和肺炎克雷伯菌(ATCC:13883)的核酸;
2、稀释上述1得到的核酸,浓度分别为1×10-10μM、1×10-11μM、1×10-12μM、1×10-13μM和1×10-14μM进行实验。
稀释后的核酸为模板进行RPA扩增,引物浓度均为0.5μM或0.25μM;得到不同模板的扩增产物。
3、用核酸检测试纸检测扩增产物;
结果如图4所示,左至右试纸条依次为铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌,仅有铜绿假单胞菌核酸粗提取液为阳性,其余均为阴性。
因此,本发明的引物和方法的特异性高。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国人民解放军总医院第一医学中心
<120> 一种铜绿假单胞菌的扩增引物组及检测方法
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
taccttgctg ttttgacgtt accaacagaa 30
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
atccaacttg ctgaaccacc tacgc 25

Claims (9)

1.一种检测铜绿假单胞菌的RPA引物对,由引物1和引物2组成;
所述引物1为序列表的序列1所示的单链DNA分子;
所述引物2为序列表的序列2所示的单链DNA分子。
2.根据权利要求1所述的RPA引物对,其特征在于:所述引物1和所述引物2末端标记不同的基团。
3.含有权利要求1或2所述RPA引物对的PCR试剂或试剂盒。
4.根据权利要求3所述的PCR试剂,其特征在于:
所述引物1和所述引物2在所述PCR试剂中的浓度均为0.2-0.5μmol/L。
5.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于:
所述试剂盒还包括配套检测RPA扩增产物的核酸检测试纸条;
所述试纸条包括与所述引物1标记基团结合的抗体和与所述引物2标记基团结合的抗体。
6.权利要求1或2所述RPA引物对或权利要求3或4所述的PCR试剂或权利要求3或5所述的试剂盒在如下1)-4)中至少一种应用:
1)制备鉴定或辅助鉴定铜绿假单胞菌产品;
2)制备鉴定或辅助鉴定待测菌是否为铜绿假单胞菌产品;
3)制备鉴定或辅助鉴定待测样本中是否感染或含有铜绿假单胞菌产品;
4)制备鉴定或辅助鉴定待测样本是否感染或含有铜绿假单胞菌产品。
7.一种鉴定或辅助鉴定待测菌是否为铜绿假单胞菌的方法,所述方法为非疾病诊断治疗目的,包括如下步骤:
用权利要求1或2中的所述引物对对待测菌进行RPA扩增,检测RPA扩增产物;再用核酸检测试纸检测扩增产物;
若所述核酸检测试纸显色阳性,则所述待测菌为或候选为铜绿假单胞菌;
若所述核酸检测试纸显色阴性,则所述待测菌中不为或候选不为铜绿假单胞菌。
8.一种鉴定或辅助鉴定待测样本是否感染铜绿假单胞菌或含有铜绿假单胞菌核酸的方法,所述方法为非疾病诊断治疗目的,包括如下步骤:用权利要求1或2中的所述引物对对待测样本进行RPA扩增,检测RPA扩增产物;再用核酸检测试纸检测扩增产物;
若所述核酸检测试纸显色阳性,则所述待测样本中含有或候选含有铜绿假单胞菌核酸或感染或候选感染铜绿假单胞菌;
若所述核酸检测试纸显色阴性,则所述待测样本中不含有或候选不含有铜绿假单胞菌核酸或不感染或候选不感染铜绿假单胞菌。
9.根据权利要求7或8所述的方法,其特征在于:所述RPA扩增的模板为待测菌或待测样本的核酸。
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