CN104372072A

CN104372072A - 一种通用型检测血小板细菌污染的荧光定量pcr方法

Info

Publication number: CN104372072A
Application number: CN201410363658.9A
Authority: CN
Inventors: 蒙青林; 李勇; 田晶晶; 魏双施; 王红梅; 段生宝; 丁少华; 陈晔洲; 李冬
Original assignee: Suzhou Institute of Biomedical Engineering and Technology of CAS
Current assignee: Suzhou Institute of Biomedical Engineering and Technology of CAS
Priority date: 2014-07-29
Filing date: 2014-07-29
Publication date: 2015-02-25

Abstract

本发明公开了一种通用型检测血小板细菌污染的荧光定量PCR方法，荧光定量PCR方法采用一对检测细菌的通用型引物、一条适用于通用型引物的人工内参、第一条荧光标记的荧光探针和第二条荧光标记的荧光探针，两条荧光探针采用不同的荧光标记，第一条荧光探针是用于检测细菌的通用型荧光探针，第二条荧光探针是用于检测人工内参的内参探针，采用常规的PCR扩增技术进行检测。通过上述方式，本发明的检测方法，适用于血小板制品细菌污染筛查，可充分解决血小板制品细菌污染中细菌有无、细菌含量、细菌死活等问题，满足快速、准确、可靠的检测要求，为血小板安全输注提供一种科学、有效的辅助诊断方法。

Description

一种通用型检测血小板细菌污染的荧光定量PCR方法

技术领域

本发明涉及分子诊断和检测领域，特别是涉及一种通用型检测血小板细菌污染的荧光定量PCR方法。

背景技术

通过输血传播的病原体主要是病毒、细菌和原虫等，我国目前纳入血源筛查的项目仅有乙肝、丙肝、艾滋病毒和梅毒螺旋体。在输血的感染性风险中，细菌污染和败血症性输血反应尚未得到足够重视。血小板制品必须在(22±2)℃条件下振荡保存，这种环境下细菌污染的概率要高于其他血液成分细菌污染或病毒感染的概率，因此血小板制品有效保存期很短，一般规定是24小时或5天。研究表明，大约每3000单位的血小板制品中就有1个单位发生细菌污染，主要污染来源是献血者皮肤菌群，献血者存在无症状的菌血症以及在制备过程中发生的污染。发生细菌污染的血小板制品如果输注到病人体内，几乎无例外都要引起轻重程度不等的输血反应，甚至是致命的菌血症和败血症。美国血库协会（AABB）2004年规定所有血小板制品在输注前均应作细菌污染检测。我国卫生部在2004年专门讨论了血液制品的细菌安全问题，但至今还没有关于血液及血液成分细菌污染检测的相关法律法规出台。开展血小板细菌污染检测，既是为了保证临床血小板输注的安全，同时也是为了充分有效利用有限的血小板资源。

血小板细菌污染检测技术主要有三类：细菌培养检测、血清学免疫检测、核酸分子检测。目前以细菌培养检测方法作为金标准，其中通过FDA认证的有Bact/ALERT 细菌培养监测系统和PalleBDS细菌检测系统，均是基于细菌培养生长繁殖过程中的各种指标变化，如消耗的O₂、累积的CO₂、营养成分改变等，这种方法检测耗时较长，需要1～2天，会有漏检的情形发生。此外，通过FDA认证的PGD试纸条检测系统是采用细菌表面特异性抗原的单克隆抗体床旁快速检测血小板制品细菌污染，但该方法不能作为血小板质量控制检测方法，敏感性较差，对一些革兰氏阴性细菌不易检出。Scansystem系统则是利用单抗富集血小板滤过样本，对其中的细菌DNA用通透剂和荧光剂进行标记，并用激光扫描确定污染情况，该方法检测时间虽短，但灵敏度不高，最终结果判读标准复杂。目前，国内尚未开发血小板细菌制品污染相关的检测试剂及仪器。

核酸检测（Nucleic Acid Test，NAT）一般是对各种病原生物的特异性靶标核酸序列进行定性、定量分析。在血液及血液制品的筛查和检测领域，核酸检测已经广泛用来检测样本是否存在病毒感染，以降低输血传播病毒性传染病的风险。如艾滋、乙肝、丙肝和梅毒（HIV，HBV，HCV，Tp）是血液相关样本法定检测的四项，目前都采用核酸检测或联合酶联免疫检测的方法进行确认。核酸检测技术平台主要是从PCR（聚合酶链式反应）、TMA（转录介导扩增）技术发展而来，其中的PCR技术应用最为广泛。

荧光定量PCR是从PCR技术发展而来，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，可实时监控反应过程，通过计算机对产物进行分析，省略普通PCR的后续鉴定步骤，极大地简化了定量检测的过程，而且真正实现了绝对定量。荧光定量PCR检测已经在临床疾病诊断，优生优育检测，动植物检验检疫，食品安全，科学研究等不同领域得到应用。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种通用型检测血小板细菌污染的荧光定量PCR方法，该方法检测快速、准确、可靠。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种通用型检测血小板细菌污染的荧光定量PCR方法，所述荧光定量PCR方法采用一对检测细菌的通用型引物、一条适用于通用型引物的人工内参、第一条荧光标记的荧光探针和第二条荧光标记的荧光探针，所述两条荧光探针采用不同的荧光标记，所述第一条荧光探针是用于检测细菌的通用型荧光探针，所述第二条荧光探针是用于检测人工内参的内参探针，采用常规的PCR扩增技术进行检测。

在本发明一个较佳实施例中，所述一对检测细菌的通用型引物为CR5-F上游引物和CR7-R下游引物，所述CR5-F上游引物为GTGTAGCIGTGAAATGCGTAGA，所述CR7-R下游引物为TTGCGICCGTAITCCCCAGGCGG，所述第一条荧光探针为CR6-probe 探针，所述CR6-probe 探针为6FAM-CAGGATTAGATACCCTG-BHQ1，扩增产物大小为202 bp。

在本发明一个较佳实施例中，所述一对检测细菌的通用型引物为CR6-F 上游引物和CR8-R 下游引物，所述CR6-F 上游引物为TTAGATACCCTGGTAGTCCA，所述CR8-R 下游引物为GAGCTGACGACAICCITGC，所述第一条荧光探针为CR7-probe 探针，所述CR7-probe 探针为6FAM-ACTCAAAIGAATTGACGG-BHQ1，扩增产物大小为291 bp。

在本发明一个较佳实施例中，所述一对检测细菌的通用型引物为CR7-F 上游引物和CR9-R 下游引物，所述CR7-F 上游引物为GCAACGCGAAIAACCTTACC，所述CR9-R 下游引物为TGACGTCITCCCCACCTTC，所述第一条荧光探针为CR8-probe 探针，所述CR8-probe 探针为6FAM-TGAIATGTTGGGTTAAGTCC-BHQ1，扩增产物大小为243 bp。

在本发明一个较佳实施例中，所述一对检测细菌的通用型引物为23S3CD-F 上游引物和23S3CD-R 下游引物，所述23S3CD-F 上游引物为CTCAACGGATAAAAGITAC，所述23S3CD-R 下游引物为GACCIAACTGTCTCACGAC，所述第一条荧光探针为23S3CD -probe 探针，所述23S3CD -probe 探针为6FAM-TGTCGGCTCITCICATCCT -BHQ1，扩增产物大小为189 bp。

在本发明一个较佳实施例中，所述人工内参采用基因合成方式制备，两端序列和所述一对检测细菌的通用型引物完全匹配，中间80bp的序列和内参探针是人工设计的，与任何细菌及人类基因组没有任何相关性，所述人工内参的结构为5’上游引物序列-人工序列-下游引物互补序列 3’。

在本发明一个较佳实施例中，所述人工内参加入到检测样本中，可设为最低检出限或任意阈值，也可作为标准品，具有对检测结果提供质控、判读、定量参照功能。

在本发明一个较佳实施例中，所述荧光定量PCR方法中通过反转录荧光定量PCR检测样本中的RNA，与人工内参和相应DNA的Ct值进行比较，判断细菌是否为活性菌。

本发明的有益效果是：本发明的通用型检测血小板细菌污染的荧光定量PCR方法，该方法只用一对引物，两种探针就能完成血小板细菌污染的检测，其人工内参除了具有一般内参功能外，还可作为标准品使用，解决了目前血小板制品细菌污染缺少标准品的问题，也使得核酸检测用于血小板制品细菌污染筛查成为可能。本发明对常规荧光定量PCR方法进行了重新设计和优化，使其更适用于血小板制品细菌污染筛查，可充分解决血小板制品细菌污染中细菌有无、细菌含量、细菌死活等问题，以及满足快速、准确、可靠的检测要求，为血小板安全输注提供一种科学、有效的辅助诊断方法。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：

图1是本发明的通用型检测血小板细菌污染的荧光定量PCR方法的原理过程图；

图2是血小板细菌污染中细菌种类的统计图；

图3是计算机分析相关引物、探针在26种细菌中的匹配性图；

图4是CR5-F和CR7-R引物对细菌和人基因组的扩增特异性图；

图5是荧光定量PCR检测细菌DNA的信号图；

图6是人工内参的检测限与样本检测Ct值间的差异与判读图；

图7是反转录荧光定量PCR检测细菌RNA的Ct值比较图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1，本发明是基于荧光定量PCR方法检测血小板细菌污染的，所述荧光定量PCR方法设计了一对检测细菌的通用型引物、一条适用于通用型引物的人工内参、第一条荧光标记的荧光探针和第二条荧光标记的荧光探针。一对引物进行核酸扩增，两条荧光探针采用不同的荧光标记，一条荧光探针用于检测细菌靶标，另一条荧光探针是内参探针，用于内部质量控制以及定量参照。

所述荧光定量PCR方法采用以上设计的优点有：（1）只用一对引物就能完成靶标基因和内参基因的PCR扩增，不同一般靶标和内参分别需要不同引物来进行扩增，优化了整个PCR反应，减少引物过多引起的非特异性假阳性问题。（2）建立人工内参作为标准品，由于污染血小板的细菌种类各异，一般情况是不存在血小板细菌污染的标准品，本发明的人工内参既可作为血小板细菌污染检测样本的标准品，也可作为荧光PCR反应的内部质量控制以及定量参照。用内参作为最小检出限时，只有Ct（检测）≦Ct（内参），才能确保检测样本阳性，避免假阳性；用内参作为绝对定量参照时，可在检测不同样本的同时制作统一的标准曲线，同时既可作为反应质控内标，也可作为定量标准样品；（3）检测样本和内参可在同一个反应体系里进行，不同于一般核酸检测中标准品和检测样本分开在不同反应体系中，本发明设计可以更好发挥荧光定量PCR的优点，减少一般情形下标准品和检测样需放在不同反应体系所造成的人为或系统误差。

请参阅图2，血小板制品中可能污染的细菌种类有很多，研究发现，污染血小板的主要细菌属种为：葡萄球菌属（表皮葡萄球菌、金黄葡萄球菌）占27%，链球菌属（化脓链球菌，溶血性链球菌）占12%，假单胞菌属（铜绿假单胞菌，鼻疽假单胞菌）占9%，棒杆菌属（白喉杆菌，蜡状芽孢杆菌，皮肤丙酸杆菌，荚膜梭状杆菌，变性杆菌）占14%，肠科细菌（乳酸菌，肠球菌）占8%，伤寒沙门氏菌占8%，粘质沙雷氏菌占7%，大肠埃希菌占6%，肠结炎耶尔森氏菌占3%，肺炎克雷伯氏菌占4%，这些细菌占了97%以上。资料来源：Murphy MF和Pamphilon DH所著《Practical Transfusion Medicine》（2009，第3版，p146-152）一书。

在检测血小板制品细菌污染的实践中，一般情形下，并不需要对每种细菌都进行检测，只需能区分有无细菌污染的发生即可。因此，本发明以在人类基因组中不存在，但在细菌进化中高度保守的共有核酸序列作为细菌通用型检测靶标，如16S rDNA或23S rDNA，这2个基因存在于所有细菌染色体基因中，通常作为细菌系统分类研究中的靶标，具有良好的分子钟性质，进化上高度保守，可称为“细菌化石”。

本发明在16S rDNA和23S rDNA基因中选择了合适区域设计相关检测引物和探针：

（1）16S rDNA作为细菌通用型特异性检测靶标，在其不同恒定区（constant region，CR）设计了3套引物和探针：

①在恒定区5和恒定区7分别设计上下游引物，探针设计在恒定区6，扩增范围包括CR5-VR5-CR6-VR6-CR7：

CR5-F 上游引物：GTGTAGCIGTGAAATGCGTAGA ；

CR7-R 下游引物：TTGCGICCGTAITCCCCAGGCGG；

CR6-probe 探针：6FAM-CAGGATTAGATACCCTG-BHQ1；

扩增产物大小：202 bp。

②在恒定区6和恒定区8分别设计上下游引物，探针设计在恒定区7，扩增范围包括CR6-VR6-CR7-VR7-CR8：

CR6-F 上游引物：TTAGATACCCTGGTAGTCCA；

CR8-R 下游引物：GAGCTGACGACAICCITGC；

CR7-probe 探针：6FAM- ACTCAAAIGAATTGACGG-BHQ1；

扩增产物大小：291 bp。

③在恒定区7和恒定区9分别设计上下游引物，探针设计在恒定区8，扩增范围包括CR7-VR7-CR8-VR8-CR9：

CR7-F 上游引物：GCAACGCGAAIAACCTTACC；

CR9-R 下游引物：TGACGTCITCCCCACCTTC；

CR8-probe 探针：6FAM- TGAIATGTTGGGTTAAGTCC-BHQ1；

扩增产物大小：243 bp。

（2）23S rDNA作为细菌特异性检测靶标，在其3端的高度保守恒定区里设计引物和探针：

23S3CD-F 上游引物：CTCAACGGATAAAAGITAC；

23S3CD-R 下游引物：GACCIAACTGTCTCACGAC；

23S3CD -probe 探针：6FAM- TGTCGGCTCITCICATCCT -BHQ1；

扩增产物大小：189 bp。

上述4套引物和探针经过对26种经报道的常见血小板污染细菌相关核酸序列进行计算比对，结果显示出良好的匹配性和特异性。个别位置不一致的核苷酸序列，在引物合成中通过换成次黄嘌呤（I）碱基则可以与任意四种ATGC碱基互补，第1套引物、探针的比对结果如图3所示，其他几套引物比对结果也是如此。由于这26种细菌在统计中，基本覆盖已经报道并鉴定的血小板污染细菌，覆盖率大于97%以上，因此这些引物和探针具有非常高的检测血小板污染细菌的通用性。尽管如此，我们还将这些引物序列在NCBI的核酸数据库（ http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中进行了搜索比对，结果显示和各种细菌微生物吻合，但没有一例真核生物的匹配结果。在下面实施例里，也证实在人类基因中没有检出。

本发明设计了一套独特的人工内参系统，在通常血小板细菌污染没有标准品的情况下，这套人工内参的作用更加突出。这套人工内参采用基因合成方式制备，两端序列和检测用的上下游引物完全匹配，中间80bp的序列以及内参探针是人工设计的，与任何细菌以及人类基因组均没有任何相关性。

人工内参的结构是5’上游引物序列-人工序列-下游引物互补序列 3’，以16S rDNA第①套引物为实施例，人工内参的序列是：5’GTGTAGCIGTGAAATGCGTAGAGCAGGGCCAGGCCTGCCAGTTCTACAGCCTGCTTGGAACTGGCCGTCTTCCAGGATAGAAGTAACTTGGTGTCTGACAGTCCGCCTGGGGAITACGGICGCAA3’，其中GTGTAGCIGTGAAATGCGTAGA序列为上游引物，CCGCCTGGGGAITACGGICGCAA为下游引物（TTGCGICCGTAITCCCCAGGCGG）的互补序列，而CCTGCTTGGAACTG序列是内参探针：HEX- CTGCTTGGAACTG-BHQ1，扩增产物大小为125bp。

本发明作为常规的荧光定量PCR可以检测细菌的DNA是否在血小板制品中存在，同时本发明可增加反转录步骤作为RT-荧光定量PCR检测细菌的RNA是否存在，从而评估血小板细菌污染中的细菌是否为活菌。

实践中，一些血小板制品经过辐照处理，大部分细菌已经死亡，它们的DNA仍然存在于血小板中，常规荧光定量PCR可以检出这些极少量的细菌DNA，如何评价这些极少量细菌污染的血小板制品中，是否存在繁殖活跃的细菌，则可通过反转录荧光定量PCR进行细菌RNA检测，由于细菌RNA在生长过程中会大量转录，而细菌死亡后，RNA会迅速被降解，很少残留，因此活菌中RNA的检出量会显著高于DNA，即Ct（RNA）＜Ct（DNA）≤Ct（内参），而死菌中RNA的检出量会小于DNA，甚至是内参。

所用试剂和仪器：选用第①套引物和探针，CR5-F上游引物为GTGTAGCIGTGAAATGCGTAGA，CR7-R下游引物为TTGCGICCGTAITCCCCAGGCGG，CR6-probe探针为6FAM-CAGGATTAGATACCCTG-BHQ1，内参为GTGTAGCIGTGAAATGCGTAGAGCAGGGCCAGGCCTGCCAGTTCTACAGCCTGCTTGGAACTGGCCGTCTTCCAGGATAGAAGTAACTTGGTGTCTGACAGTCCGCCTGGGGAITACGGICGCAA，内参探针为HEX- CTGCTTGGAACTG-BHQ1，引物、探针和内参均在上海生工合成。PCR反应试剂为国产近岸生物产品，双蒸水，TE缓冲液，ABI 7500荧光定量PCR仪，国产基因组DNA提取试剂盒，RNA提取试剂盒，qPCR用8联管耗材。

样本：人全血样本、大肠杆菌、芽孢杆菌。

实施例一：CR5-F和CR7-R引物对细菌和人基因组的特异性

干粉引物和探针用TE缓冲液溶解到10μM；人基因组DNA和细菌基因组DNA用试剂盒进行提取，并用微量分光光度计进行定量；常规PCR进行扩增，30μL反应体系，包括：

2X 预混PCR Mix Buffer 15 μL

CR5-F上游引物（10μM） 1 μL

CR7-R下游引物（10μM） 1 μL

基因组模板（50～100ng） 1 μL

双蒸水补足 12 μL。

反应条件：95℃预变性，5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃孵育5min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，记录结果，如图4显示，这对引物只扩增细菌基因组，对人类基因组没有特异性。

实施例二：荧光定量PCR检测细菌DNA

实施例并没有使用血小板制品样本进行检测，而是用人全血基因组和细菌基因组单独或混合来模拟，以人基因组作为阴性对照，以人基因组混合梯度稀释的细菌基因组作为检测样本，进行荧光定量PCR检测，30μL反应体系，包括：

2X 预混PCR Mix Buffer 15 μL

CR5-F上游引物（10μM） 1 μL

CR7-R下游引物（10μM） 1 μL

CR6-probe探针（10μM） 0.5 μL

内参探针（10μM） 0.5 μL

基因组模板（50～100ng） 1 μL

人工内参（稀释至约100拷贝） 1 μL

双蒸水补足 10 μL。

反应条件：95℃预变性，2min；95℃变性20s，60℃退火、延伸及荧光检测1min，共进行40个循环。结果如图5显示，CR6-probe探针只在检测样本中有信号（图中①-④），在阴性对照中无信号，而内参探针在所有样本中均有荧光信号（图中⑤），说明无论是检测探针还是内参探针都有很好的特异性。

实施例三：人工内参的检测限与样本检测Ct值间的差异与判读

在该实施例中，人工内参由基因合成每OD约33ug的量，人工内参的分子数为38881.9，换算成拷贝数进行梯度稀释，通过荧光定量PCR可以确定在本实施例条件下（包括试剂，耗材，仪器，操作等因素），能检测的内参最低限是20拷贝数。培养的大肠杆菌用可见光分光光度检测其OD₆₀₀值，在OD₆₀₀=1.0时，1mL培养液中约有6.3x10⁸个活菌，进行相应的梯度稀释，拿50μL稀释液在95℃裂解20分钟，离心后取1μL稀释液作为模版进行荧光定量PCR检测，最后可检测的细菌最小范围是5～15个菌/mL浓度。人工内参的检测限与样本检测Ct值的差异与判读的结果如图6所示：1、细菌量浓度＞25个/mL时，Ct（检测）明显小于Ct（内参），表明在实施例条件下，检测结果是可保证的；2、细菌量浓度在15个/mL、10个/mL时，Ct（检测）和Ct（内参）差异不明显，表明在该实验条件下，样本中细菌载量接近最低检测限，结果可设为疑似或排除；而细菌量浓度在5个/mL时，Ct（检测）大于Ct（内参），结果可排除为假阳性。

实施例四：反转录荧光定量PCR检测细菌RNA

在目前血小板输注实践中，并不可能要求血小板制品完全无菌，因为通过FDA认证的检测系统，它们的细菌最低检出限都达不到10个菌/mL，比如Bact/ALERT和PalleBDS的细菌培养检测系统，检测限在10²～10³个菌/mL范围，而基于免疫方法的PGD检测试纸条的检测限要＞10³个菌/mL。而从实施例三可以看出荧光定量PCR核酸检测细菌的最低检出限很容易达到10²个菌/mL范围内，由此更可以说明人工内参的重要作用，它可以根据实际情况进行阈值设定帮助判读样品检测结果。本发明还提出通过反转录荧光定量PCR检测细菌RNA，可对一些细菌载量在10²个菌/mL范围的样品进行细菌活性评估。

同实施例三一样，对培养的大肠杆菌进行浓度测定，梯度稀释后取两份含10²个菌左右的100 μL样品，其中一份样品在70℃下孵育30min使细菌完全死亡，然后分别提取两份样品的总RNA，作为模版进行反转录荧光定量PCR检测，同时以相同菌数的样本DNA作为阳性对照，50μL反应体系，包括：

10X one step RT-PCR Buffer 5 μL

dNTPs（10mM） 4 μL

CR5-F上游引物（10μM） 1 μL

CR7-R下游引物（10μM） 1 μL

CR6-probe探针（10μM） 0.5 μL

内参探针（10μM） 0.5 μL

总RNA（100～300ng） 1 μL

人工内参（稀释至约100拷贝） 1 μL

反转录酶 1 μL

Taq酶 1 μL

双蒸水补足 34 μL。

反应条件：42℃反转录，50min；75℃终止反转录，15min；95℃预变性，2min；95℃变性20s，60℃退火、延伸及荧光检测1min，共进行40个循环。结果如图7显示，未经处理就提取RNA的样本，可以检测到荧光信号，其Ct（检测）明显小于Ct（内参）；而经过灭活处理后提取的RNA样本中，其Ct（检测）值大于Ct（内参）；阳性对照样本Ct（检测）处于两个RNA样本的Ct（检测）值之间。说明灭活后的细菌，其RNA会迅速降解，在反转录荧光定量PCR检测中可能测不出或者得到很大的Ct值。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

序列表

<110> 中国科学院苏州生物医学工程技术研究院

<120> 一种通用型检测血小板细菌污染的荧光定量PCR方法

<160>

<170>

<210> 1

<211> 1542

<212> DNA

<213> 16S rDNA基因序列

<400> 1

aaattgaagagtttgatcatggctcagattgaacgctggcggcaggcctaacacatgcaa 60

gtcgaacggtaacaggaagaagcttgcttctttgctgacgagtggcggacgggtgagtaa 120

tgtctgggaaactgcctgatggagggggataactactggaaacggtagctaataccgcat 180

aacgtcgcaagaccaaagagggggaccttcgggcctcttgccatcggatgtgcccagatg 240

ggattagctagtaggtggggtaacggctcacctaggcgacgatccctagctggtctgaga 300

ggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtgg 360

ggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtatgaagaaggcct 420

tcgggttgtaaagtactttcagcggggaggaagggagtaaagttaatacctttgctcatt 480

gacgttacccgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggag 540

ggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtttgttaagtca 600

gatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcatctgatactggcaagcttgagtctc 660

gtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaatacc 720

ggtggcgaaggcggccccctggacgaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagca 780

aacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcgacttggaggttgtgcc 840

cttgaggcgtggcttccggagctaacgcgttaagtcgaccgcctggggagtacggccgca 900

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tcgatgcaacgcgaagaaccttacctggtcttgacatccacagaactttccagagatgga 1020

ttggtgccttcgggaactgtgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtga 1080

aatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcttttgttgccagcggtccggc 1140

cgggaactcaaaggagactgccagtgataaactggaggaaggtggggatgacgtcaagtc 1200

atcatggcccttacgaccagggctacacacgtgctacaatggcgcatacaaagagaagcg 1260

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caaggtaaccgtaggggaacctgcggttggatcacctcctta 1542

<210> 2

<211> 2964

<212> DNA

<213> 23S rDNA基因序列

<400> 2

ggttaagcgactaagcgtacacggtggatgccctggcagtcagaggcgatgaaggacgtg 60

ctaatctgcgataagcgtcggtaaggtgatatgaaccgttataaccggcgatttccgaat 120

ggggaaacccagtgtgtttcgacacactatcattaactgaatccataggttaatgaggcg 180

aaccgggggaactgaaacatctaagtaccccgaggaaaagaaatcaaccgagattccccc 240

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gcgtctggaaaggcgcgcgatacagggtgacagccccgtacacaaaaatgcacatgctgt 360

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Claims

1.一种通用型检测血小板细菌污染的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述荧光定量PCR方法采用一对检测细菌的通用型引物、一条适用于通用型引物的人工内参、第一条荧光标记的荧光探针和第二条荧光标记的荧光探针，所述两条荧光探针采用不同的荧光标记，所述第一条荧光探针是用于检测细菌的通用型荧光探针，所述第二条荧光探针是用于检测人工内参的内参探针，采用常规的PCR扩增技术进行检测。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述一对检测细菌的通用型引物为CR5-F上游引物和CR7-R下游引物，所述CR5-F上游引物为GTGTAGCIGTGAAATGCGTAGA，所述CR7-R下游引物为TTGCGICCGTAITCCCCAGGCGG，所述第一条荧光探针为CR6-probe 探针，所述CR6-probe 探针为6FAM-CAGGATTAGATACCCTG-BHQ1，扩增产物大小为202 bp。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述一对检测细菌的通用型引物为CR6-F 上游引物和CR8-R 下游引物，所述CR6-F 上游引物为TTAGATACCCTGGTAGTCCA，所述CR8-R 下游引物为GAGCTGACGACAICCITGC，所述第一条荧光探针为CR7-probe 探针，所述CR7-probe 探针为6FAM-ACTCAAAIGAATTGACGG-BHQ1，扩增产物大小为291 bp。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述一对检测细菌的通用型引物为CR7-F 上游引物和CR9-R 下游引物，所述CR7-F 上游引物为GCAACGCGAAIAACCTTACC，所述CR9-R 下游引物为TGACGTCITCCCCACCTTC，所述第一条荧光探针为CR8-probe 探针，所述CR8-probe 探针为6FAM-TGAIATGTTGGGTTAAGTCC-BHQ1，扩增产物大小为243 bp。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述一对检测细菌的通用型引物为23S3CD-F 上游引物和23S3CD-R 下游引物，所述23S3CD-F 上游引物为CTCAACGGATAAAAGITAC，所述23S3CD-R 下游引物为GACCIAACTGTCTCACGAC，所述第一条荧光探针为23S3CD -probe 探针，所述23S3CD -probe 探针为6FAM-TGTCGGCTCITCICATCCT -BHQ1，扩增产物大小为189 bp。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述人工内参采用基因合成方式制备，两端序列和所述一对检测细菌的通用型引物完全匹配，中间80bp的序列和内参探针是人工设计的，与任何细菌及人类基因组没有任何相关性，所述人工内参的结构为5’上游引物序列-人工序列-下游引物互补序列 3’。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述人工内参加入到检测样本中，可设为最低检出限或任意阈值，也可作为标准品，具有对检测结果提供质控、判读、定量参照功能。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述荧光定量PCR方法中通过反转录荧光定量PCR检测样本中的RNA，与人工内参和相应DNA的Ct值进行比较，判断细菌是否为活性菌。