CN116144804B - 基于特异序列标签的创伤弧菌exo-RPA快速检测方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于检测创伤弧菌的特异序列标签，以及在此基础上基于exo‑RPA技术的创伤弧菌快速检测方法及其成套试剂与应用。本发明涉及微生物检测领域，具体涉及检测创伤弧菌的成套试剂与应用。特异序列标签如SEQ ID No.1所示。成套试剂包括引物Vv‑F2、引物Vv‑R1和探针Vv‑P；引物Vv‑F2的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，引物Vv‑R1的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，探针Vv‑P的核苷酸序列如SEQ ID No.10和11所示。本研究提供了一种快速、便携、灵敏度高、特异性好的成套试剂和核酸等温扩增方法来检测创伤弧菌，可成为临床样本的快速诊断辅助工具，使之能更好的应用于现场筛查。

Description

基于特异序列标签的创伤弧菌exo-RPA快速检测方法及其 应用

技术领域

本发明属于微生物检测领域，具体涉及基于特异序列标签和exo-RPA(荧光法RPA)技术的创伤弧菌的检测分析方法及所用试剂与应用。

背景技术

创伤弧菌(Vibrio vulnificus)是一种广泛分布于海水和水产品中的革兰氏阴性弧菌，与霍乱弧菌、副溶血弧菌并称为人类三大致病性弧菌。当前世界上大部分沿海国家均有创伤弧菌的致病报道，因创伤弧菌急性感染引起的脓毒症患者，在3～4d内出现腹腔内广泛性坏死、多器官功能衰竭而死亡的案例，是公众饮食健康的重大威胁之一，所以对创伤弧菌的检测在公共卫生上具有十分重要的意义。

针对创伤弧菌开发出特异、快速、灵敏的检测方法对挽救患者生命具有积极作用。目前，公认检测的常用方法主要有分离培养病原菌，酶联免疫吸附测定(ELISA)，实时荧光定量PCR(qPCR)等。这些方法虽然可准确的检测到创伤弧菌，但是较长的测定时间(不少于几个小时)，昂贵且庞大的仪器(如qPCR仪器)，专业的实验人员和较高的实验环境要求限制了野外及现场检测。重组酶聚合酶介导的扩增技术(RPA)是近年兴起的一种恒温扩增技术，由于RPA扩增方式无需复杂的温度改变，且扩增反应时间短，与配对的检测荧光探针结合的exo-RPA法最短在10分钟内就能得到明显的阳性结果，适合用于现场快速检测。

创伤弧菌SNP突变频率高,有研究分析了260株创伤弧菌的全基因组序列，变异检测发现229462个SNP变异。但随着高通量测序技术的快速发展，使得短时间内能够获得大量创伤弧菌相关基因组数据。这些海量数据使得通过生物信息学分析方法获得创伤弧菌的核心基因组特异序列标签成为可能。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何快速、灵敏的检测创伤弧菌。

为解决上述技术问题，本发明提供了用于检测创伤弧菌的特异序列标签，所述特异序列标签核苷酸序列为SEQ ID No.1的DNA。

本发明还提供了一种鉴定或辅助鉴定创伤弧菌的试剂，所述试剂包括引物Vv-F2、引物Vv-R1和探针Vv-P；所述引物Vv-F2是核苷酸序列为SEQ ID No.3的单链DNA，所述引物Vv-R1是核苷酸序列为SEQ ID No.6的单链DNA，所述探针Vv-P的结构为核苷酸片段1-四氢呋喃残基-核苷酸片段2，其中核苷酸片段1的核苷酸序列为SEQ ID No.10，核苷酸片段2的核苷酸序列为SEQ ID No.11，SEQ ID No.10的第31位核苷酸T标记荧光基团，SEQ ID No.11的第2位核苷酸T标记淬灭基团，3’端进行阻断修饰。

上述试剂中，所述荧光基团为FAM，所述淬灭基团为BHQ1，所述SEQ ID No.11的3’端连接C3-spacer。

本发明还提供了检测创伤弧菌的试剂盒。

本发明提供的试剂盒含有上述试剂。

所述试剂盒还含有Genie II等温扩增荧光检测试剂。

所述试剂盒含有重组载体，所述重组载体含有核苷酸序列是序列表中序列1的DNA分子。

本发明还提供了用于鉴定或辅助鉴定创伤弧菌的引物组合物。

所述引物组合物包括上述引物Vv-F2和引物Vv-R1。

本发明还提供了鉴定或辅助鉴定创伤弧菌的方法。

在一种实施例中，所述方法包括以待测样本的DNA为模板，用上述试剂或试剂盒进行exo-RPA检测，获得荧光值；根据所述荧光值确定待测样本是否含有创伤弧菌。

所述待测样本可为环境样品(如水)或作为食品的动物组织和/或器官等。

本发明还提供了上述试剂或试剂盒在如下任一中的应用：

(1)检测或辅助检测创伤弧菌；

(2)制备检测或辅助检测创伤弧菌的产品。

本发明还提供了上述引物组合物在如下任一中的应用：

(1)检测或辅助检测创伤弧菌；

(2)制备检测或辅助检测创伤弧菌的产品；

(3)扩增创伤弧菌DNA；

(4)制备扩增创伤弧菌DNA的产品。

上述应用和方法的目的可以是疾病诊断目的、疾病预后目的和/或疾病治疗目的，它们的目的也可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和非疾病治疗目的；它们的直接目的可以是获取疾病诊断结果、疾病预后结果和/或疾病治疗结果的中间结果的信息，它们的直接目的可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和/或非疾病治疗目的。

RPA的等温扩增反应使用GenieⅡ等温扩增荧光检测系统完成，该系统紧凑小巧，轻便耐用，触摸屏操作，无需连接电脑，其内置长航时锂电池，可在无电源环境中全天户外工作，可实现便携式的致病菌现场快速检测，摆脱了实时荧光定量PCR(qPCR)等精密仪器的依赖，使得exo-RPA技术在创伤弧菌现场诊断方面具有广阔的应用前景。本发明用于创伤弧菌的exo-RPA检测引物和探针，将此引物组及其配对荧光探针用于基于exo-RPA技术的基因检测中可快速现场检测创伤弧菌，具有特异性好，灵敏度高，反应十分快速的优点，为创伤弧菌的体外诊断提供了可用的快速检测方法。

附图说明

图1为创伤弧菌exo-RPA引物对的筛选。

图2为创伤弧菌实时荧光RPA检测技术灵敏度评价。注：A.灵敏度荧光图，从上至下各扩增曲线使用基因组DNA浓度分别为100、10、1、0.5aM(1aM＝3.3fg/μL)；B.独立重复性检测图，n＝5次独立重复实验，t检验；ns，不显著；*，p<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。

图3为创伤弧菌实时荧光RPA检测技术灵敏度评价。注：A.灵敏度荧光图，从上至下各扩增曲线使用阳性质粒模板浓度分别为960-0.2拷贝/μL；B.独立重复性检测图，n＝3次独立重复实验，t检验；ns，不显著；*，p<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。

图4为创伤弧菌实时荧光RPA检测技术的特异性检验。注：A.特异性荧光图；B.28株创伤弧菌荧光图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

1.实验材料

用于生物信息学分析的创伤弧菌基因组序列：共计518条创伤弧菌基因组序列用于本研究，创伤弧菌公共基因组序列从NCBI(Https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/browse#！/prokaryotes/476/)下载。

实验中共涉及16种病原菌，创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)、鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia mallei)、羊布鲁氏菌(Brucella melitensis)、牛布鲁氏菌(Brucella abortus)、土拉弗朗西斯菌(Francisellatularensis)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、大肠杆菌(Escherichia coli)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)均由军事医学研究院微生物流行病研究所提供；将上述1mL热灭活供试细菌菌液采用DNA Mini Kit基因组DNA提取试剂盒(QIAGEN)提取菌液全基因组DNA，用100μL AE缓冲液洗脱，采用Qubit 4.0核酸浓度测量仪进行基因组核酸定量。

实验中涉及的28株创伤弧菌基因组均由军事医学研究院微生物流行病研究所未知病院分析研究室提供。

2.试剂与仪器

DNA Mini Kit基因组DNA提取试剂盒(QIAGEN)；荧光RPA扩增试剂盒(TwistAmp^TM exo Kit，TwistDx公司)；阳性参考质粒(北京天一辉远生物科技有限公司)；引物及探针(上海生工生物工程股份有限公司)；核酸快速扩增检测系统(OptiGene，GenieII)；Qubit 4.0核酸浓度测量仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)。

实施例1创伤弧菌exo-RPA检测

1.创伤弧菌的特异序列标签的鉴定

1)选定靶标序列：利用Illumina MiSeq(Illumina，San Diego，CA，USA)测序仪对创伤弧菌进行全基因组的从头测序，使用FASTX-Toolkit软件对测序获得的原始短读序列进行质量过滤，然后使用SPAdes 3.0软件进行组装。使用Prokka软件对创伤弧菌基因组进行注释生成GFF3文件，用Roary鉴定出创伤弧菌的泛基因组序列，然后使用Python编程从泛基因组中筛选出核心基因组序列。

通过本地NCBI核酸数据库对核心基因组进行筛选，使用在线NCBI核酸数据库对上述基因组进行进一步验证，获得与所有创伤弧菌基因组序列100％匹配，而与其他细菌不匹配的特异序列，将此特异性序列作为靶标序列，靶标序列如序列表中序列1所示(SEQ IDNo.1)。具体核苷酸序列为：ACACGTGCGCTACAATTGGCCGCAGAGCAGGGTGAGCCCGCAAAATTAACCGTCATTCGCCAAAGCTTAGGGCTGGATGAACTCAAATAATTCTATCAATCAGTAAGATATATAAATGATGAAAGCCTCGATTCTAACCAAGCTAGAAATGCTGGTTGAGCGTTATGAAGAAGTGCAGCACCTTCTTGGTGATCCGGGAGTGATCGGTGACCAAGACAAATTCCGTGCACTGTCAAAAGAGTATTCTCAACTTGAAGAAGTCACTAAGTGCTTTACTGCCTATAAACAAGCGCAAGAAGATTTAGTTGCTGCGGAAGAGATGGCCAAAGAAGACGACGCAGAGATGCGTGAAATGGCGCAAGAAGAAATCAAAGCGGCAAAAGTGGCCATTGAAGATTTGGCTGCAGAGTTGCAAATTCTTCTGCTACCGAAAGATCCGAATGACGATCGCAACTGTTTCCT。

2)RPA扩增引物和RPA探针设计：利用常用的PCR设计软件Primer Premier 6，更改该软件的默认参数(对引物Tm值、长度和扩增片段长度等参数进行相应的更改)，利用该软件对靶序列设计RPA引物；按照荧光法RPA探针设计原则(英国TwistDX公司RPA试剂盒说明书)设计相应探针：Vv-F1、Vv-F2、Vv-F3、Vv-F4、Vv-R1、Vv-R2、Vv-R3、Vv-R4和Vv-P。引物和探针均由上海生工生物工程股份有限公司合成，具体序列及修饰基团如下表1所示。

表1 RPA扩增引物对与配对荧光探针

注：其中idsp表示无碱基四氢呋喃THF残基，i6famdt表示该位置的核苷酸T被标记荧光基团FAM，ibhq1dt表示该位置的核苷酸T被标记淬灭基团BHQ1，3’端标记C3-spacer进行C3-spacer阻断修饰。也就是探针Vv-P的结构为核苷酸片段1-四氢呋喃残基-核苷酸片段2，其中核苷酸片段1的核苷酸序列为SEQ ID No.10，核苷酸片段2的核苷酸序列为SEQ IDNo.11；SEQ ID No.10的第31位核苷酸T标记FAM荧光基团，SEQ ID No.11的第2位核苷酸T标记BHQ1淬灭基团，3’端进行C3-spacer阻断修饰。

2.创伤弧菌检测靶标基因阳性参考质粒的构建

对创伤弧菌的特异靶标设计重组阳性参考质粒，从特异靶标上截取一段序列作为重组片段序列，此段序列需包含RPA扩增序列。重组阳性参考质粒pUC57-Vv交由北京天一辉远生物科技有限公司合成。

利用Qubit 4.0核酸定量仪测定重组阳性参考质粒pUC57-Vv的浓度，并换算出拷贝数浓度(拷贝数/μL)，对已知拷贝数浓度的质粒进行适当的倍比稀释后用于RPA检测体系灵敏度的分析。

3.创伤弧菌RPA扩增引物的筛选

将创伤弧菌基因组DNA按10倍梯度稀释至1aM，以此为模板按照RPA法扩增，同时以去离子水为模板作为阴性对照。使用荧光RPA扩增试剂盒TwistAmp^TM exo Kit(TwistDX)试剂盒进行实时荧光RPA扩增。

RPA扩增反应体系为50μL：将表1中RPA引物(10μM)各2.1μL，探针(10μM)0.6μL，TwistAmp^TM exo Kit中基础缓冲液29.5μL，加入到基础反应单元，并充分混匀，在管盖上加入3μL的280mM醋酸镁(MgOAc)。加入模板13μL充分混匀后，短暂离心后迅速放入GenieⅡ等温扩增荧光检测系统进行RPA反应。反应条件：39℃，20min。

其中，RPA引物为图1中的16对RPA引物对中的任一对，F1、F2、F3和F4分别为表1的Vv-F1、Vv-F2、Vv-F3、Vv-F4，R1、R2、R3和R4分别为表1的Vv-R1、Vv-R2、Vv-R3和Vv-R4。

图1中灰度深浅代表荧光值高低，灰度越深代表荧光值越高。

结果如图1所示，经实时荧光RPA反应发现，相较于其他引物组合，由表1中的Vv-F2和Vv-R1组成的RPA引物对荧光信号最高，效果更佳。

实施例2创伤弧菌exo-RPA检测方法的灵敏度及特异性评价

1.基因组灵敏度及稳定性分析

将筛选出的创伤弧菌RPA引物(由表1中的Vv-F2和Vv-R1组成的RPA引物对)和探针(表1中的Vv-P)按照实施例1步骤3的方法进行实时荧光RPA扩增。

按TwistAmp^TM exo Kit Quick Guide方法进行RPA的荧光扩增反应，设置创伤弧菌基因组DNA浓度梯度100aM，10aM，1aM，0.5aM共4个梯度，通过5次重复实验评价灵敏度，并且用去离子水做阴性对照(NTC)。

结果如图2中A所示，为5次重复实验中的1组代表实验的荧光信号-时间扩增曲线图。其反应阳性检出时间为5-10分钟；图2中B显示，对创伤弧菌基因组DNA的最低检测限为0.5aM(1.65fg/μL)，灵敏度能达到20fg/反应，且实验重复性好，说明该检测方法具有高灵敏度、高稳定性。

2.阳性质粒灵敏度分析

为了验证实时荧光RPA反应的灵敏度，将含有实施例1的重组质粒pUC57-Vv按照10倍倍比稀释，使其浓度分别在960-0.2拷贝/μL之间，以稀释的重组质粒pUC57-Vv为模板进行实时荧光RPA反应，并且用去离子水做阴性对照(NTC)，用创伤弧菌RPA引物(由表1中的Vv-F2和Vv-R1组成的RPA引物对)和探针(表1中的Vv-P)按照实施例1步骤3的方法进行实时荧光RPA扩增。

反应结果如图3中A所示：荧光信号会随着拷贝数的增加而提前，即当模板浓度达到10²拷贝/μL时，在5分钟后就可看到明显的荧光信号(图3中A)。为了检验灵敏度的稳定性，我们将实验重复了3次，最低检测限可达到0.96拷贝/μL(图3中B)，灵敏度为12.5拷贝/反应，且实验重复性好，稳定性高。

3.基因组特异性评价

按照实施例1中步骤3进行RPA荧光扩增反应，将15种非靶标细菌混合基因组(非创伤弧菌混合基因组)为模板，同时以来源不同的28株创伤弧菌基因组核酸为阳性对照、以去离子水为阴性模板(NTC)，用创伤弧菌RPA引物(由表1中的Vv-F2和Vv-R1组成的RPA引物对)和探针(表1中的Vv-P)按照实施例1步骤3的方法进行实时荧光RPA扩增。

非创伤弧菌混合基因组是由如下15种细菌基因组混合组成：类鼻疽伯克霍尔德菌、鼻疽伯克霍尔德菌、羊布鲁氏菌、牛布鲁氏菌、土拉弗朗西斯菌、炭疽芽孢杆菌、鼠疫耶尔森菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的提纯基因组。

结果如图4所示：针对创伤弧菌靶基因的exo-PRA检测，以创伤弧菌DNA为模板的检测结果显示，只有创伤弧菌DNA结果呈阳性，非创伤弧菌细菌混合基因组和以去离子水为模板的阴性空白对照组检测信号无差异，说明创伤弧菌靶基因的exo-PRA检测系统的引物探针及检测方法特异性良好(图4中A)。将来源不同的28株创伤弧菌进行exo-RPA检测，均检测到了阳性信号，说明所选靶标序列的保守性良好(图4中B)。

实施例3本发明的检测方法在模拟样本中的应用

1.模拟样本的制备

为了验证实时荧光RPA检测方法的实用性，请其他研究人员分别在14份不同编号的正常人全血中加入创伤弧菌和相同体积的1×PBS缓冲液(pH7.2)，分别得到含有10³-10⁰CFU/mL的创伤弧菌的全血模拟样本和空白对照样本(BC)。

表2模拟样本exo-RPA和qPCR的检测结果

注：“+”表示检测到荧光信号，“—”表示未检测到荧光信号。

2.exo-RPA方法检测样本中创伤弧菌

以QIAamp DNA Mini Kit提取步骤1的14份模拟样本的核酸，用创伤弧菌RPA引物(由表1中的Vv-F2和Vv-R1组成的RPA引物对)和探针(表1中的Vv-P)按照实施例1步骤3的方法进行实时荧光RPA扩增。检测人员对表2的14份样本进行盲测并以实时荧光定量PCR检测作为对照(表1中的qPCR-vvp-F和qPCR-vvp-R组成的引物对和表1中的qPCR-vvp-P探针)。

结果如表2所示，实时荧光RPA方法在血液模拟样本中可检测到的创伤弧菌为10³cfu/mL，实时荧光定量PCR无阳性信号；与人血基因组无交叉反应(空白对照组无阳性信号)，结果正确率高达100％，说明本研究建立的创伤弧菌RPA检测技术具有较好的灵敏性和特异性。

综上所述，我们运用生物信息学方法通过大量分析获得了创伤弧菌的核心基因组特异序列标签，并在此基础上设计了RPA引物，通过筛选和优化，最终获得一组高灵敏度的引物探针组合(由表1中的Vv-F2和Vv-R1组成的RPA引物对以及表1中的Vv-P探针)。利用这组引物探针可检测到浓度为1.65fg/μL的样本和0.96copies/μL的样本，且整个过程仅需5-10min便可看到明显的阳性结果(图2、图3)。

为了评价引物探针和靶标基因的特异性，将15种非创伤弧菌细菌DNA混合在一起，以创伤弧菌DNA为阳性对照，实时荧光RPA可以很容易的扩增和检测出正确的核酸靶点(图4中A)，将来源不同的28株创伤弧菌进行实时荧光RPA检测，均检测到了阳性信号(图4中B)。

将一定量的创伤弧菌加入到人类全血模拟样本并进行盲测，提取核酸后进行实时荧光RPA，盲测检测正确率高达100％(表2)，模拟样本的检测充分反应了该技术方法良好的灵敏性和特异性。

总之，本研究开发了一种快速、便携、灵敏度高、特异性好的核酸等温扩增方法来检测创伤弧菌，有望成为临床样本的快速诊断辅助工具。该技术方法前景广阔，上游也可与核酸免提取技术结合，下游与测流层析试纸结合研发，使之能更好的应用于现场筛查。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (7)

1.辅助鉴定创伤弧菌的试剂，其特征在于：所述试剂包括引物Vv-F2、引物Vv-R1和探针Vv-P；所述引物Vv-F2是核苷酸序列为SEQ ID No.3的单链DNA，所述引物Vv-R1是核苷酸序列为SEQ ID No.6的单链DNA，所述探针Vv-P的结构为核苷酸片段1-四氢呋喃残基-核苷酸片段2，其中核苷酸片段1的核苷酸序列为SEQ ID No.10，核苷酸片段2的核苷酸序列为SEQID No.11，SEQ ID No.10的第31位核苷酸T标记荧光基团，SEQ ID No.11的第2位核苷酸T标记淬灭基团，3’端进行阻断修饰。

2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于：所述荧光基团为FAM，所述淬灭基团为BHQ1，所述SEQ ID No.11的3’端连接C3-spacer。

3.检测创伤弧菌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有权利要求1或2所述的试剂。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还含有Genie II等温扩增荧光检测试剂。

5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有重组载体，所述重组载体含有核苷酸序列是序列表中序列1（SEQ ID No.1）的DNA分子。

6.辅助鉴定创伤弧菌的非疾病诊断和治疗目的的方法，其特征在于：包括以待测样本的DNA为模板，用权利要求1或2所述的试剂或权利要求3-5任一所述的试剂盒进行exo-RPA检测，获得荧光值；根据所述荧光值确定待测样本是否含有创伤弧菌。

7.权利要求1或2所述的试剂或权利要求3-5中任一所述的试剂盒在如下任一种的非疾病诊断和治疗目的的应用：

(1)辅助检测创伤弧菌；

(2)制备辅助检测创伤弧菌的产品。