TW202535891A - Ｋｒａｓ蛋白之小分子抑制劑 - Google Patents

Abstract

本發明係關於式(I)至(VII)化合物或其醫藥上可接受之鹽，其可抑制Kirsten大鼠肉瘤(KRAS)蛋白之G12C、G12D、G12V及/或G13D突變體且預期具有作為治療劑之用途，例如用於治療癌症。本發明亦提供包含式(I)至(VII)化合物或其醫藥上可接受之鹽之醫藥組合物。本發明亦關於使用該等化合物或其醫藥上可接受之鹽於治療及預防癌症中之方法及出於此目的用於製備藥品之方法。

Description

KRAS蛋白之小分子抑制劑

本發明係關於KRAS之小分子抑制劑，其抑制例如Kirsten大鼠肉瘤(KRAS)蛋白之G12C突變體、G12D突變體、G12V突變體、G13D突變體及野生型(WT)及關於一種包含式(I)至(VII)化合物之醫藥組合物以及使用此一化合物來治療疾病(包括癌症)之方法。

RAS，其為具有約21 kDa之分子量之小單體GTP結合蛋白，充作分子開/關開關。RAS可藉由結合至鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEF)之蛋白質(例如SOS1)結合至GTP，此迫使結合的核苷酸之釋放，且釋放GDP。當RAS結合至GTP，其變得活化(打開)且招募及活化其他受體的信號之傳播所需之蛋白質，諸如c-Raf及PI 3-激酶。RAS亦具有酶促活性，利用該酶促活性，其裂解GTP核苷酸之末端磷酸鹽且將該核苷酸轉化為GDP。轉化速率通常很慢，但可藉由GTP酶活化蛋白(GAP)類別之蛋白質(諸如RasGAP)來顯著加速。當將GTP轉化為GDP時，RAS經去活化(關閉)。

RAS亞家族之通常已知的成員包括HRAS、KRAS及NRAS。其中，在許多惡性腫瘤中：在86%的胰臟腺管腺癌(PDAC)中、在41%的結腸直腸癌(CRC)中、及在32%的肺腺癌(LUAD；非小細胞肺癌(NSCLC)的亞型)中，觀察到KRAS之突變。該等突變經常發生在KRAS的位置12處的甘胺酸殘基(「G12」)；在G12處之突變分別佔總KRAS突變的91% (PDAC)、68% (CRC)及85% (LUAD)。在G12處之胺基酸取代之分佈在每種組織類型之間有所不同。LUAD中之最盛行的突變為突變為半胱胺酸(「G12C」) (46%)，而PDAC (45%)及CRC (45%)中之主導突變為突變為天冬胺酸(「G12D」)。在PDAC (35%)、CRC (30%)及LUAD (23%)全部中之G12突變之顯著部分中觀察到在G12處突變為纈胺酸(「G12V」)。(Nature Reviews Drug Discovery，19，533-552，2020)。

正在大力開發KRAS-G12C抑制劑。已報導幾種專注於半胱胺酸殘基之共價抑制劑，且其中一些已經受臨床研究，諸如AMG510 (NCT03600883)、MRTX849 (NCT03785249)及JNJ-74699157 (NCT04006301)。然而，該KRAS-G12C突變僅佔所有KRAS突變之一部分且主要在LUAD中發現。為了有效抑制其他通常發生之KRAS突變蛋白，諸如KRAS-G12D及KRAS-G12V，需要不同方法，因為此等突變體在活性位點中缺乏反應性半胱胺酸(Nature Reviews Drug Discovery，19，533-552，2020)。

研究亦已指出，在不存在編碼突變下之WT KRAS之基因擴增及高表現亦可發生於某些癌症中。在食道、胃及卵巢腺癌中最頻繁觀察到此等擴增(Nature Medicine，24，968-977，2018)。因此，WT KRAS之有效抑制可對罹患此類癌症之患者提供治療益處。

本發明提供調節突變體及WT KRAS蛋白之小分子抑制劑且可為用於治療癌症之有價值的醫藥活性化合物。在一些實施例中，所揭示的化合物選擇性抑制KRAS-G12C、KRAS-G12D及/或KRAS-G12V蛋白。式(I)至(VII)化合物： (I)、 (II)、 (III)、 (IV)、 (V)、 (VI)、及 (VII) 及其醫藥上可接受之鹽可調節KRAS之活性且藉此影響調節與腫瘤性病症相關聯之細胞生長、分化及增殖之信號傳導路徑。在某些實施例中，式(I)至(VII)化合物可抑制KRAS-G12C、KRAS-G12D、KRAS-G12V、KRAS-G13D及/或WT KRAS蛋白。本發明此外提供用於製備式(I)至(VII)化合物之方法、使用此類化合物以治療腫瘤性病症之方法、及包含式(I)至(VII)化合物之醫藥組合物。

本發明亦提供調節突變體及WT KRAS蛋白之小分子抑制劑且可為用於治療癌症之有價值的醫藥活性化合物。在一些實施例中，所揭示的化合物選擇性抑制KRAS-G12C、KRAS-G12D及/或KRAS-G12V蛋白。式(III)、(IV)、(VI)及(VII)化合物： (III)、 (IV)、 (VI)及 (VII) 及其醫藥上可接受之鹽可調節KRAS之活性且藉此影響調節與腫瘤性病症相關聯之細胞生長、分化及增殖之信號傳導路徑。在某些實施例中，式(III)、(IV)、(VI)及(VII)化合物可抑制KRAS-G12C、KRAS-G12D、KRAS-G12V、KRAS-G13D及/或WT KRAS蛋白。本發明此外提供用於製備式(III)、(IV)、(VI)及(VII)化合物之方法、使用此類化合物以治療腫瘤性病症之方法、及包含式(III)、(IV)、(VI)及(VII)化合物之醫藥組合物。

相關申請案之交叉參考 本申請案主張2023年10月20日申請之美國臨時申請案第63/591,871號、2024年4月25日申請之63/638,789、及2024年8月7日申請之63/680,205之權益，該等案之揭示內容以其全文引用之方式併入本文中。 本發明化合物

在一個實施例中，本發明提供具有如上所顯示之結構式(I)至(VII)之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中該化合物為 (I)。

在一個實施例中，本發明提供具有如上所顯示之結構式(I)至(VII)之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中該化合物為 (II)。

在一個實施例中，本發明提供具有如上所顯示之結構式(I)至(VII)之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中該化合物為 (III)。

在一個實施例中，本發明提供具有如上所顯示之結構式(I)至(VII)之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中該化合物為 (IV)。

在一個實施例中，本發明提供具有如上所顯示之結構式(I)至(VII)之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中該化合物為 (V)。

在一個實施例中，本發明提供具有如上所顯示之結構式(I)至(VII)之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中該化合物為 (VI)。

在一個實施例中，本發明提供具有如上所顯示之結構式(I)至(VII)之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中該化合物為 (VII)。

在一個實施例中，本發明提供具有如上所顯示之結構式(III)、(IV)、(VI)及(VII)之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中該化合物為 (III)。

在一個實施例中，本發明提供具有如上所顯示之結構式(III)、(IV)、(VI)及(VII)之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中該化合物為 (IV)。

在一個實施例中，本發明提供具有如上所顯示之結構式(III)、(IV)、(VI)及(VII)之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中該化合物為 (VI)。

在一個實施例中，本發明提供具有如上所顯示之結構式(III)、(IV)、(VI)及(VII)之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中該化合物為 (VII)。

在特定實施例中，本發明提供一種如下文所闡述之實例1至7中任一實例中所述之化合物或其醫藥上可接受之鹽。

在一些實施例中，本發明提供具有低預測經口人類劑量之化合物，此由於優異藥效動力學性質(例如如在AsPC-1異種移植小鼠模型中以腫瘤磷酸-ERK抑制測得所證實)及以較佳經口暴露之優異臨床前藥物動力學性質(例如如在大鼠、狗及恆河猴中測定)所致。

本發明包括本文定義之化合物之醫藥上可接受之鹽，包括本文定義之所有結構式、實施例及類別之醫藥上可接受之鹽。 定義

除非另有定義，否則本文所使用的所有技術及科學術語具有與熟習本發明所屬技術者通常所理解相同的含義。

如在本發明全文中所使用，「式(I)至(VII)化合物」、「本文揭示之化合物」、「本文描述之化合物」、「本發明化合物」等可互換使用且應理解為包括所揭示之式(I)至(VII)化合物。式(I)至(VII)化合物可形成亦在本發明之範疇內之鹽。除非另有指示，否則本文中對本發明化合物(或式(I)至(VII)化合物)之引用應理解為包括對其鹽之引用。

波浪線 如本文所用指示對可呈E或Z形式之化合物之連接點。

式(I)至(VII)化合物可含有一或多個不對稱中心且可因此作為外消旋物及外消旋混合物、單一對映異構體、非對映異構體混合物及個別非對映異構體存在。存在於式(I)至(VII)化合物中之不對稱中心均可彼此獨立地具有S構型或R構型。式(I)至(VII)化合物包括所有可能之對映異構體及非對映異構體及兩種或更多種立體異構體之混合物，例如所有比率之對映異構體及/或非對映異構體之混合物。因此，對映異構體為呈對映異構體純形式(呈左旋及呈右旋對映體)、呈外消旋物之形式及呈所有比率之該兩種對映異構體之混合物之形式之本發明標的。在順式/反式異構現象之情況下，本發明包括順式形式及反式形式(及E形式及Z形式)以及所有比率之此等形式之混合物。本發明意指理解式(I)至(VII)化合物之所有此類立體異構形式。在結構式或化學名稱指定在立體中心處之特定構型之情況下，該化合物之由於該指定立體中心所致之對映異構體或立體異構體係預期的。在式(I)至(VII)化合物之結構式指示在對掌性中心處之直線之情況下，該結構式包括與該對掌性中心相關聯之S及R立體異構體及其混合物。

式(I)至(VII)化合物可藉由例如自適宜溶劑(例如甲醇或乙酸乙酯或其混合物)分級結晶或經由使用光學活性固定相之對掌性層析分離成其個別非對映異構體。絕對立體化學可藉由若需要則利用含有已知絕對構型之不對稱中心之試劑衍生得之結晶產物或結晶中間物之X射線結晶學來確定。振動循環二色性(VCD)亦可用於確定絕對立體化學。或者，式(I)至(VII)化合物之任何立體異構體或異構體可藉由使用已知絕對構型之光學純起始物質或試劑進行立體特異性合成來獲得。

若需要，則可分離該等化合物之外消旋混合物使得該等個別對映異構體得以分離。該分離可藉由此項技術中熟知的方法進行，諸如使化合物之外消旋混合物偶聯至對映異構體纯化合物以形成非對映異構體混合物，接著藉由標準方法(諸如分級結晶或層析)分離該等個體非對映異構體。該偶聯反應經常為使用對映異構體纯酸或鹼來形成鹽。該等非對映異構體衍生物可接著藉由裂解添加的對掌性殘基轉化為純對映異構體。亦可藉由利用對掌性固定相之層析方法直接分離該等化合物之外消旋混合物，該等方法係此項技術中熟知的。

式(I)至(VII)化合物含有烯烴雙鍵，除非另作指明，否則其意指包括E及Z幾何異構體。

本文所描述之化合物中的一些可呈互變異構體存在，該互變異構體具有伴隨一或多個雙鍵位移之不同氫連接點。例如，酮及其烯醇形式為酮-烯醇互變異構體。式(I)至(VII)化合物涵蓋該等個別互變異構體以及其混合物。

當圍繞單鍵之旋轉能障壁足夠高以防止在給定溫度下自由旋轉時，本文所描述之式(I)至(VII)化合物中的一些可以阻轉異構體存在，因此允許分離具有不同性質之個別構形異構體(conformer)。本發明之式(I)至(VII)化合物涵蓋該等個別阻轉異構體以及其混合物。在解析時，個別阻轉異構體可藉由確立規定(諸如彼等藉由國際純應用化學聯合會(the International Union of Pure Applied Chemistry) (IUPAC) 2013建議規定者)來指定。

在式(I)至(VII)化合物中，該等原子可展現其天然同位素豐度，或該等原子中之一者或多者可人工富集於具有相同原子序數但原子質量或質量數不同於主要在自然界中發現的原子質量或質量數之特定同位素中。如本文所描述及所主張之本發明意欲包括式(I)至(VII)化合物之所有適宜同位素變型及其實施例。例如，氫(H)之不同同位素形式包括氕( ¹H)及氘( ²H，本文中亦表示為D)。氕為自然界中發現的主要氫同位素。氘之富集可提供某些治療優點，諸如增加活體內半衰期或降低劑量需求或可提供可作為標準品用於生物樣本之表徵之化合物。同位素富含化合物可藉由熟習此項技術者熟知的習知技術或藉由類似於彼等描述於本文中方案及實例中者之方法使用適宜同位素富集試劑及/或中間物來製備而無需過度實驗。

術語「醫藥上可接受之鹽」係指自醫藥上可接受之非毒性鹼或酸製備之鹽。當式(I)至(VII)化合物為酸性時，其對應鹽可方便地自醫藥上可接受之非毒性鹼(包括無機鹼及有機鹼)製備。衍生自此類無機鹼之鹽包括鋁、銨、鈣、銅(高價及低價)、鐵、亞鐵、鋰、鎂、錳(高價及低價)、鉀、鈉、鋅鹽及類似鹽。較佳為銨鹽、鈣鹽、鎂鹽、鉀鹽及鈉鹽。自醫藥上可接受之有機非毒性鹼製備之鹽包括衍生自天然存在之來源及合成來源之一級、二級及三級胺之鹽。可自其形成鹽之醫藥上可接受之有機非毒性鹼包括例如精胺酸、甜菜鹼、咖啡因(caffeine)、膽鹼、N,N'-二苄基乙二胺、二乙胺、2-二乙基胺基乙醇、2-二甲基胺基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-乙基嗎啉、N-乙基哌啶、葡糖胺、葡萄糖胺、組胺酸、海巴明(hydrabamine)、異丙胺、二環己胺、離胺酸、甲基葡糖胺、嗎啉、哌嗪、哌啶、聚胺樹脂、普魯卡因(procaine)、嘌呤、可可豆鹼(theobromine)、三乙胺、三甲胺、三丙胺、緩血酸胺及類似者。

當式(I)至(VII)化合物為鹼性時，其對應鹽可習知上自醫藥上可接受之非毒性無機及有機酸製備。此類酸包括例如乙酸、苯磺酸、苯甲酸、樟腦磺酸、檸檬酸、乙磺酸、富馬酸、葡萄糖酸、麩胺酸、氫溴酸、鹽酸、羥乙磺酸、乳酸、馬來酸、蘋果酸、扁桃酸、甲磺酸、黏酸、硝酸、撲酸、泛酸、磷酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、對甲苯磺酸及類似者。較佳為檸檬酸、氫溴酸、鹽酸、馬來酸、磷酸、硫酸及酒石酸。若式(I)至(VII)化合物在該分子中同時含有酸性及鹼性基團，則除了提及之鹽形式之外，本發明亦包括內鹽或甜菜鹼(兩性離子)。鹽可自式(I)至(VII)化合物藉由熟習此項技術者已知的客製方法來獲得，例如藉由與有機或無機酸或鹼在溶劑或分散劑組合、或藉由與其他鹽之陰離子交換或陽離子交換。本發明亦包括式(I)至(VII)化合物之所有鹽，其由於低生理相容性而不直接適用於藥品但其可例如用作用於化學反應或用於製備醫藥上可接受之鹽之中間物。

此外，式(I)至(VII)化合物可以非晶形式及/或一或多種結晶形式存在，且因此式(I)至(VII)化合物(包括實例)之所有非晶及結晶形式及其混合物意欲包括在本發明之範疇內。此外，式(I)至(VII)化合物中的一些可與水(亦即水合物)或常見有機溶劑(諸如(但不限於)乙酸乙酯)形成溶劑合物。此類溶劑及水合物(特別是本化合物之醫藥上可接受之溶劑合物及水合物)以及未溶劑化及無水形式同樣涵蓋於本發明之範疇內。

導致活體內轉化為在本發明之範疇內之化合物之式(I)至(VII)化合物之任何醫藥上可接受之前藥修飾亦在本發明之範疇內。

術語「治療有效(effective/efficacious」)量及類似描述諸如「對於治療有效之量」或「有效劑量」意欲意指將引起研究人員、獸醫、醫生或其他臨床醫生正在尋求的組織、系統、動物或人類之生物或醫學反應之式(I)至(VII)化合物之量。在一個較佳實施例中，術語「治療有效量」意指緩解人類患者中之至少一種臨床症狀之式(I)至(VII)化合物之量。術語「預防有效(effective / efficacious)量」及類似描述諸如「對於預防有效之量」意欲意指將預防研究人員、獸醫、醫生或其他臨床醫生在組織、系統、動物或人類中尋求預防的生物或醫學事件發生或降低其之風險之式(I)至(VII)化合物之量。 式(I)至(VII)化合物之劑量

根據各種因素選擇利用式(I)至(VII)化合物之給藥方案，該各種因素包括患者之類型、物種、年齡、體重、性別及醫學病狀；待治療的病狀之嚴重度；所選擇的待投與之化合物之效價；投與途徑；及患者之腎功能及肝功能。出於確定預防、對抗或阻止病狀之進展所需之治療有效或預防有效劑量之目的，此等因素之考量完全在一般技藝臨床醫生之權限內。應理解，特定每日劑量可同時為例如用於治療腫瘤性病狀之治療有效量、及例如用於預防腫瘤性病狀之預防有效量。

儘管個別需求變化，但式(I)至(VII)化合物之有效量之最佳範圍之確定在此項技術之技藝內。對於人類在例如本文識別之病狀及病症之治癒性或預防性治療中之投與，式(I)至(VII)化合物之典型劑量可為約0.05 mg/kg/天至約50 mg/kg/天、或至少0.05 mg/kg、或至少0.08 mg/kg、或至少0.1 mg/kg、或至少0.2 mg/kg、或至少0.3 mg/kg、或至少0.4 mg/kg、或至少0.5 mg/kg及其間之任何量至約50 mg/kg或更少、或約40 mg/kg或更少、或約30 mg/kg或更少、或約20 mg/kg或更少、或約10 mg/kg或更少及其間之任何量，其可為例如約2.5 mg/天(0.5 mg/kg x 5 kg)至約5000 mg/天(50 mg/kg x 100 kg)。例如，該等化合物之劑量可為約0.1 mg/kg/天至約50 mg/kg/天、或約0.05 mg/kg/天至約10 mg/kg/天、或約0.05 mg/kg/天至約5 mg/kg/天、或約0.05 mg/kg/天至約3 mg/kg/天、或約0.07 mg/kg/天至約3 mg/kg/天、或約0.09 mg/kg/天至約3 mg/kg/天、或約0.05 mg/kg/天至約0.1 mg/kg/天、或約0.1 mg/kg/天至約1 mg/kg/天、或約1 mg/kg/天至約10 mg/kg/天、或約1 mg/kg/天至約5 mg/kg/天、或約1 mg/kg/天至約3 mg/kg/天、或約3 mg/天至約500 mg/天、或約5 mg/天至約250 mg/天、或約10 mg/天至約100 mg/天、或約3 mg/天至約10 mg/天、或約100 mg/天至約250 mg/天。此類劑量可以單劑量投與或可分成多個劑量。 醫藥組合物

式(I)至(VII)化合物及其醫藥上可接受之鹽可作為藥品本身、以與彼此之混合物或以醫藥組合物之形式投與至動物，較佳投與至哺乳動物，且特定言之投與至人類。術語「個體」或「患者」包括動物，較佳係哺乳動物且尤其是人類，其使用本活性劑用於預防或治療醫學病狀。對該個體投與該藥物包括自投與及由另一人對該患者投與。該個體可能有需要或期望治療現有疾病或醫學病狀，或可能有需要或期望預防性治療以預防該疾病或醫學病狀發生或降低其之風險。如本文所用，「有需要」治療現有病狀或預防性治療之個體涵蓋醫學專業人員對需要之確定以及患者對此種治療之期望。

因此，本發明亦提供用作藥品之式(I)至(VII)化合物及其醫藥上可接受之鹽、其用於調節突變體及/或WT KRAS蛋白之活性之用途且特定言之其在治療及預防下文提及之疾病或病症中之用途以及其用於製備用於此等目的之藥劑之用途。在某些實施例中，式(I)至(VII)化合物及其醫藥上可接受之鹽抑制KRAS-G12C、KRAS-G12D、KRAS-G12V及/或KRAS-G13D蛋白。

此外，本發明提供包含作為活性組分之有效劑量之至少一種式(I)至(VII)化合物及/或其醫藥上可接受之鹽及客製醫藥上可接受之載劑(亦即一或多種醫藥上可接受之載劑物質及/或添加劑)之醫藥組合物。

因此，本發明提供例如用作醫藥組合物之該化合物及其醫藥上可接受之鹽，該醫藥組合物包含作為活性組分之有效劑量之至少一種式(I)至(VII)化合物及/或其醫藥上可接受之鹽及客製醫藥上可接受之載劑；及該化合物及/或其醫藥上可接受之鹽於治療或預防下文提及之疾病或病症(例如癌症)之用途；以及其於製備用於此等目的之藥劑之用途。

根據本發明之醫藥組合物可經口(例如呈丸劑、錠劑、塗漆錠劑(lacquered tablet)、糖衣錠、顆粒、硬及軟明膠膠囊、水性、醇性或油性溶液、糖漿、乳液或懸浮液之形式)或經直腸(例如呈栓劑之形式)投與。投與亦可非經腸式，例如經皮下、經肌肉內或經靜脈內以注射用或輸注用溶液之形式進行。

其他適宜投與形式為例如穿皮或局部投與，例如，呈軟膏、酊劑、噴霧或經皮治療系統、或例如微膠囊、植入物或棒狀物(rod)之形式。較佳投與形式取決於例如待治療的疾病及其嚴重度。

醫藥組合物中之本文描述之化合物及/或其醫藥上可接受之鹽之活性化合物之量通常為每劑0.01至200 mg、或0.1至200 mg、或1至200 mg，但取決於該醫藥組合物之類型，其亦可為更高。在一些實施例中，該醫藥組合物中之式(I)至(VII)化合物及/或其醫藥上可接受之鹽之活性化合物之量為每劑0.01至10 mg。該等醫藥組合物通常包含0.5至90重量百分比之至少一種式(I)至(VII)化合物及/或其醫藥上可接受之鹽。該等醫藥組合物之製備可以本身已知之方式進行。針對此目的，使一或多種式(I)至(VII)化合物及/或其醫藥上可接受之鹽以及一或多種固體或液體醫藥載劑物質及/或添加劑(或輔助物質)且若需要與其他具有治療性或預防性作用之醫藥活性化合物組合成為適宜投與形式或劑型，其然後可用作人類或獸醫醫學中之藥品。

對於丸劑、錠劑、糖衣錠及硬明膠膠囊之產生，可使用例如乳糖、澱粉(例如玉米澱粉)、或澱粉衍生物、滑石、硬脂酸或其鹽等。用於軟明膠膠囊及栓劑之載劑為例如脂肪、蠟、半固體及液體多元醇、天然或硬化油等。用於製備溶液(例如注射用溶液)、或乳液或糖漿之適宜載劑為例如水、生理上可接受之氯化鈉溶液、醇，諸如乙醇、甘油、多元醇、蔗糖、轉化糖、葡萄糖、甘露醇、植物油等。亦可凍乾式(I)至(VII)化合物及其醫藥上可接受之鹽及使用所得凍乾產物例如來製備注射用或輸注用製劑。用於微膠囊、植入物或棒狀物之適宜載劑為例如乙醇酸及乳酸之共聚物。

除該等活性化合物及載劑外，該等醫藥組合物亦可含有慣常添加劑，例如填充劑、崩解劑、黏結劑、潤滑劑、潤濕劑、穩定劑、乳化劑、分散劑、防腐劑、甜味劑、著色劑、矯味劑、芳香劑、增稠劑、稀釋劑、緩衝物質、溶劑、增溶劑、用於達成蓄積效應(depot effect)之劑、用於改變滲透壓之鹽、塗佈劑及/或抗氧化劑。 使用式(I)至(VII)化合物之方法

本申請案提供一種抑制RAS介導之細胞信號傳導之方法，其包括使細胞與式(I)至(VII)化合物或其醫藥上可接受之鹽接觸。RAS介導之信號轉導之抑制可藉由此項技術中已知的多種方式來評估及證實。非限制性實例包括(a) RAS之GTP酶活性之降低；(b) GTP結合親和力之降低或GDP結合親和力之提高；(c) GTP之Koff之增加或GDP之Koff之減小；(d) RAS路徑中之信號轉導分子下游的含量之減小，諸如pMEK、pERK或pAKT含量之減小；及/或(e) RAS複合物對下游信號傳導分子(包括(但不限於) Raf)之結合之減少。套組及市售分析可用於確定上述一者或多者。

本申請案亦提供使用式(I)至(VII)化合物(或其醫藥上可接受之鹽)或含有此類化合物之醫藥組合物來治療疾病病狀之方法，該等疾病病狀包括(但不限於)突變體KRAS蛋白、及/或WT KRAS蛋白之擴增或過度表現(例如癌症)、及在一些實施例中KRAS-G12C、KRAS-G12D、KRAS-G12V及/或KRAS-G13D突變體所牽涉之病狀。

在一些實施例中，提供一種用於治療癌症之方法，該方法包括對有需要此種治療之個體投與治療有效量之式(I)至(VII)化合物(或其醫藥上可接受之鹽)或前述包含此一化合物之醫藥組合物中之任一者。在一些實施例中，該癌症藉由KRAS突變(例如KRAS-G12C、KRAS-G12D、KRAS-G12V及/或KRAS-G13D突變)介導。在各種實施例中，該癌症為胰臟癌、結腸直腸癌或肺癌。在一些實施例中，該癌症為膽囊癌、甲狀腺癌或膽管癌。

在一些實施例中，本發明提供一種治療有需要個體之病症之方法，其中該方法包括確定該個體是否具有KRAS突變(例如KRAS-G12C、KRAS-G12D、KRAS-G12V及/或KRAS-G13D突變)及若該個體經確定為具有KRAS突變，則對該個體投與治療有效量之式(I)至(VII)化合物或其醫藥上可接受之鹽。

在一些實施例中，本發明提供一種治療有需要之個體之病症之方法，其中該方法包括確定該個體是否具有擴增及/或過度表現之WT KRAS蛋白及若該個體經確定為具有此類特徵，則對該個體投與治療有效量之式(I)至(VII)化合物或其醫藥上可接受之鹽。

所揭示之化合物抑制非錨定依賴性細胞生長且因此具有抑制腫瘤轉移之潛力。因此，本發明之另一個實施例提供一種用於抑制腫瘤轉移之方法，該方法包括投與有效量之式(I)至(VII)化合物。

在惡性血液疾病(例如影響血液、骨髓及/或淋巴結之癌症)中亦已識別到KRAS突變。因此，某些實施例係關於對有需要惡性血液疾病之治療之個體投與式(I)至(VII)化合物(例如呈醫藥組合物之形式)。此類惡性病包括(但不限於)白血病及淋巴瘤。例如，目前揭示之化合物可用於治療疾病，諸如急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、小淋巴球性淋巴瘤(SLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性單核細胞白血病(AMoL)及/或其他白血病。在其他實施例中，該等化合物可用於治療淋巴瘤，諸如霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)或非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)。在各種實施例中，該等化合物可用於治療漿細胞惡性病，諸如多發性骨髓瘤及套細胞淋巴瘤及華氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglubunemia)。

確定腫瘤或癌症是否包含KRAS突變(例如KRAS-G12C、KRAS-G12D及/或KRAS-G12V突變)或WT KRAS可藉由評估編碼KRAS蛋白之核苷酸序列、藉由評估KRAS蛋白之胺基酸序列、或藉由評估推定KRAS突變體或WT KRAS蛋白之特性來進行。野生型人類KRAS之序列係此項技術中已知的。

用於偵測KRAS核苷酸序列或WT KRAS核苷酸序列中之突變之方法亦係熟習此項技術者已知的。此等方法包括(但不限於)聚合酶鏈反應-限制性片段長度多型性(PCR-RFLP)分析、聚合酶鏈反應-單股構象多型性(PCR-SSCP)分析、即時PCR分析、PCR定序、突變體對偶基因-特異性PCR擴增(MASA)分析、直接定序、引子延伸反應、電泳、寡核苷酸連接分析、雜交分析、TaqMan分析、SNP基因分型分析、高解析度熔融分析及微陣列分析。在一些實施例中，藉由即時PCR評價樣本之KRAS突變(例如KRAS-G12C、KRAS-G12D、KRAS-G12V及/或KRAS-G13D突變)。在即時PCR中，使用對KRAS突變具有特異性之螢光探針。當存在突變時，該探針結合且偵測到螢光。在一些實施例中，使用KRAS基因中之特定區域(例如外顯子2及/或外顯子3)之直接定序方法來識別該KRAS突變。

用於偵測KRAS蛋白或WT KRAS蛋白中之突變(例如KRAS-G12C、KRAS-G12D、KRAS-G12V、KRAS-G13D突變)之方法係熟習此項技術者已知的。此等方法包括(但不限於)使用對突變體或WT蛋白具特異性之結合劑(例如抗體)、蛋白質電泳及西方墨點(Western blotting)、及直接肽定序偵測KRAS突變體或WT KRAS蛋白。

可評估多個組織樣本以確定腫瘤或癌症是否包含KRAS突變(例如KRAS-G12C、KRAS-G12D、KRAS-G12V及/或KRAS-G13D突變)或經擴增/經過度表現之WT KRAS。在一些實施例中，自具有腫瘤或癌症之個體取得該樣本。在一些實施例中，該樣本為新鮮腫瘤/癌症樣本。在一些實施例中，該樣本為冷凍腫瘤/癌症樣本。在一些實施例中，該樣本為福爾馬林固定石蠟包埋樣本。在一些實施例中，該樣本為循環腫瘤細胞(CTC)樣本。在一些實施例中，將該樣本經加工為細胞溶解物。在一些實施例中，將該樣本經加工為DNA或RNA。

本申請案亦提供一種治療過度增生性病症之方法，其包括對有需要的個體投與治療有效量之式(I)至(VII)化合物或其醫藥上可接受之鹽。在一些實施例中，該方法係關於罹患癌症之個體之治療，諸如急性骨髓性白血病、青少年癌症、兒童腎上腺皮質癌、AIDS相關癌症(例如淋巴瘤及卡波西氏肉瘤(Kaposi's Sarcoma))、肛門癌、闌尾癌、星狀細胞瘤、非典型畸胎、基底細胞癌、膽管癌、膀胱癌、骨癌、腦幹膠質瘤、腦部腫瘤、乳癌、支氣管腫瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、類癌瘤、非典型畸胎、胚胎腫瘤、生殖細胞腫瘤、原發性淋巴瘤、子宮頸癌、兒童癌症、脊索瘤、心臟腫瘤、慢性淋巴球性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性骨髓增生性病症、結腸癌、結腸直腸癌、顱咽管瘤、皮膚T細胞淋巴瘤、肝外導管原位癌(DCIS)、胚胎腫瘤、CNS癌、子宮內膜癌、室管膜瘤、食管癌、嗅神經母細胞瘤、尤因氏肉瘤(Ewing sarcoma)、顱外生殖細胞瘤、腺外生殖細胞瘤、眼癌、骨骼纖維組織細胞瘤、膽囊癌、胃癌、胃腸道類癌瘤、胃腸道間質瘤(GIST)、生殖細胞瘤、妊娠滋養細胞腫瘤、毛細胞白血病、頭頸癌、心臟癌症、肝癌、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼內黑色素瘤、胰島細胞腫瘤、胰神經內分泌腫瘤、腎癌、喉癌、嘴脣及口腔癌、肝癌、小葉原位癌(LCIS)、肺癌、淋巴瘤、原發隱匿之轉移性鱗狀頸癌(metastatic squamous neck cancer with occult primary)、中線道癌、口腔癌；多發性內分泌腫瘤症候群、多發性骨髓瘤/漿細胞瘤、蕈狀肉芽腫、骨髓發育不良症候群、骨髓化生不良/骨髓增生性贅瘤、多發性骨髓瘤、梅克爾細胞癌(Merkel cell carcinoma)、惡性間皮瘤、骨骼及骨肉瘤之惡性纖維組織細胞瘤、鼻腔及副鼻竇癌、鼻咽癌、神經母細胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小細胞肺癌(NSCLC)、口腔癌、嘴唇及口腔癌、口咽癌、卵巢癌、胰臟癌、乳頭瘤病、副神經節瘤、副鼻竇及鼻腔癌、副甲狀腺癌、陰莖癌、咽癌、胸膜肺母細胞瘤、原發性中樞神經系統(CNS)淋巴瘤、前列腺癌、直腸癌、移行細胞癌、視網膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、唾液腺癌、皮膚癌、胃(stomach/gastric)癌、小細胞肺癌；小腸癌、軟組織肉瘤、T細胞淋巴瘤、睪丸癌、喉癌、胸腺瘤及胸腺癌、甲狀腺癌、腎盂及輸尿管之移行細胞癌、滋養細胞腫瘤、兒童之非尋常癌症、尿道癌、子宮肉瘤、陰道癌、外陰癌或病毒誘導之癌症。在一些實施例中，該方法係關於非癌性過度增生性病症(諸如皮膚之良性增生(例如牛皮癬)、再狹窄症或前列腺之良性增生(例如良性前列腺肥大(BPH)))之治療。

在一些實施例中，用於治療之方法係關於治療肺癌，且該等方法包括對有需要的個體投與治療有效量之式(I)至(VII)化合物(或包含此類化合物之醫藥組合物)。在某些實施例中，該肺癌為非小細胞肺癌(NSCLC)，例如腺癌、鱗狀細胞肺癌或大細胞肺癌。在一些實施例中，該肺癌為小細胞肺癌。式(I)至(VII)化合物可為其提供治療益處之其他肺癌包括(但不限於)腺腫瘤、類癌瘤及未分化癌。

本發明亦提供藉由使突變體KRAS蛋白或WT KRAS蛋白與有效量之式(I)至(VII)化合物接觸來調節突變體KRAS蛋白活性(例如由於KRAS-G12C、KRAS-G12D、KRAS-G12V及/或KRAS-G13D突變所致之活性)或WT KRAS蛋白活性之方法。調節可係抑制或活化蛋白質活性。在一些實施例中，本發明提供藉由使該突變體KRAS蛋白(例如KRAS-G12C、KRAS-G12D、KRAS-G12V及/或KRAS-G13D突變體)或WT KRAS蛋白與有效量之式(I)至(VII)化合物在溶液中接觸來抑制蛋白質活性之方法。在一些實施例中，本發明提供藉由接觸表現所關注蛋白質之細胞、組織或器官來抑制該突變體或WT KRAS蛋白活性之方法。在一些實施例中，本發明提供藉由將有效量之式(I)至(VII)化合物投與至個體(包括(但不限於)齲齒動物及哺乳動物(例如人類))中來抑制該等個體中之蛋白質活性之方法。 組合療法

一或多種另外藥理活性劑可與式(I)至(VII)化合物(或其醫藥上可接受之鹽)組合投與。另外活性劑(或劑)欲意指在體內具有活性之醫藥活性劑(或多種活性劑)，包括在投與後轉化成醫藥活性形式之前藥，其不同於式(I)至(VII)化合物。該等另外活性劑亦包括游離酸、游離鹼及該等另外活性劑之醫藥上可接受之鹽。一般而言，任何適宜另外一種或多種活性劑(包括化療劑或治療抗體)可與式(I)至(VII)化合物任意組合用於單一劑量調配物(例如固定劑量藥物組合)或用於一或多種單獨劑量調配物中，其允許同時或依序對個體投與該等活性劑(單獨活性劑之共同投與)。此外，式(I)至(VII)化合物(或其醫藥上可接受之鹽)可與放射療法、激素療法、手術或免疫療法組合投與。

本申請案亦提供用於組合療法之方法，其中已知與式(I)至(VII)化合物或其醫藥上可接受之鹽組合使用之該另外活性劑可調節其他路徑、或相同路徑之其他組分、或甚至重疊之靶向酵素組。在一個實施例中，此種療法包括(但不限於)一或多種式(I)至(VII)化合物與化療劑、免疫治療劑、激素及抗激素劑、靶向治療劑及抗血管生成劑組合以提供協同或累加治療效應。在另一個實施例中，此種療法包括放射治療以提供協同或累加治療效應。

另外活性劑(亦即另外抗癌劑)之實例包括化療劑(例如細胞毒性劑)、免疫治療劑、激素及抗激素劑、靶向治療劑及抗血管生成劑。許多抗癌劑可分類在此等群組中之一者或多者中。雖然某些抗癌劑已分類在本文的一或多個特定組或子組中，但許多此等劑亦可列於一或多個其他組或子組中，如此項領域中目前所理解。應理解，本文中將特定劑分類至特定組中並非意欲為限制性。許多抗癌劑目前係此項技術中已知的且可與本發明之化合物組合使用。

此外，劑可為促效劑、拮抗劑、變構調節劑、毒素，或更一般而言，可用於抑制或刺激其標靶(例如受體或酵素活化或抑制)。例如，適合使用的是一或多種特異性結合且抑制生長因子之活性之劑(例如抗體、抗原結合區域或可溶性受體)，諸如肝細胞生長因子(HGF，亦稱為分散因子(Scatter Factor))之拮抗劑、及特異性結合其受體「c-met」之抗體或抗原結合區域。

在一個實施例中，該另外抗癌劑為化療劑、免疫治療劑、激素劑、抗激素劑、靶向治療劑或抗血管生成劑(或抗血管生成抑制劑)。在一個實施例中，該另外抗癌劑選自由以下組成之群：化療劑、有絲分裂抑制劑、植物生物鹼、烷基化劑、抗代謝產物、鉑類似物、酵素、拓樸異構酶抑制劑、類視色素、氮丙啶(aziridine)、抗生素、激素劑、抗激素劑、抗雌激素、抗雄激素、抗腎上腺劑、雄激素、靶向治療劑、免疫治療劑、生物反應調節劑、細胞激素抑制劑、腫瘤疫苗、單株抗體、免疫檢查點抑制劑、抗-PD-1劑、抗-PD-L1劑、群落刺激因子、免疫調節劑、免疫調節醯亞胺(IMiD)、抗-CTLA4劑、抗-LAGl劑、抗-LAG3劑、抗-ILT4劑、抗-OX40劑、GITR促效劑、CAR-T細胞、BiTE、信號轉導抑制劑、生長因子抑制劑、酪胺酸激酶抑制劑、EGFR抑制劑、組蛋白去乙醯酶(HDAC)抑制劑、蛋白酶體抑制劑、細胞週期抑制劑、抗血管生成劑、基質-金屬蛋白酶(MMP)抑制劑、肝細胞生長因子抑制劑、TOR抑制劑、KDR抑制劑、VEGF抑制劑、HIF-1α抑制劑、HIF-2α抑制劑、纖維母細胞生長因子(FGF)抑制劑、RAF抑制劑、MEK抑制劑、ERK抑制劑、PI3K抑制劑、AKT抑制劑、MCL-1抑制劑、BCL-2抑制劑、SHP2抑制劑、HER-2抑制劑、BRAF抑制劑、基因表現調節劑、自體吞噬抑制劑、細胞凋亡誘導劑、抗增生劑及糖酵解抑制劑。

在一個實施例中，該(等)另外抗癌劑為化療劑。化療劑之非限制性實例包括有絲分裂抑制劑及植物生物鹼、烷基化劑、抗代謝產物、鉑類似物、酵素、拓撲異構酶抑制劑、類視黃質、氮丙啶及抗生素。

有絲分裂抑制劑及植物生物鹼之非限制性實例包括紫杉烷(taxane)，諸如卡巴他賽(cabazitaxel)、多烯紫杉醇(docetaxel)、拉洛他賽(larotaxel)、歐塔他賽(ortataxel)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)及特西他賽(tesetaxel)；秋水仙胺(demecolcine)；埃坡黴素(epothilone)；艾日布林(eribulin)；依託泊苷(etoposide) (VP - 16)；磷酸依託泊苷；諾維本(navelbine)；諾司卡賓(noscapine)；替尼泊苷(teniposide)；菌體胚素(thaliblastine)；長春花鹼(vinblastine)；長春新鹼(vincristine)；長春地辛(vindesine)；長春氟寧(vinflunine)；及長春瑞濱(vinorelbine)。

烷基化劑之非限制性實例包括氮芥，諸如萘氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、膽磷醯胺、細胞磷烷(cytophosphane)、雌莫司汀(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、甘露莫司汀(mannomustine)、氮芥(mechlorethamine)、氮芥氧化物鹽酸鹽、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、膽甾醇對苯乙酸氮芥(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、參(2-氯乙基)胺、曲磷胺(trofosfamide)及尿嘧啶氮芥；烷基磺酸酯，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；亞硝基脲，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲黴素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)、鏈佐黴素(streptozotocin)及TA-07；伸乙亞胺(ethylenimines)及甲基蜜胺，諸如六甲蜜胺(altretamine)、噻替哌(thiotepa)、曲他胺(triethylenemelamine)、三伸乙基硫磷醯胺、三伸乙基磷醯胺及三甲基三聚氰胺；氨莫司汀(ambamustine)；苯達莫司汀(bendamustine)；達卡巴嗪(dacarbazine)；依託格魯(etoglucid)；伊羅夫文(irofulven)；馬磷醯胺(mafosfamide)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；丙卡巴肼(procarbazine)；替莫唑胺(temozolomide)；曲奧蘇凡(treosulfan)；及三亞胺醌(triaziquone)。

抗代謝產物之非限制性實例包括葉酸類似物，諸如胺基喋呤(aminopterin)、二甲葉酸(denopterin)、依達曲沙(edatrexate)、胺甲喋呤、蝶羅呤(pteropterin)、雷替曲塞(raltitrexed)及曲美沙特(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、氟達拉濱(fludarabine)、氟羅德辛(forodesine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)及硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，諸如5-氟尿嘧啶(5-FU)、6-氮雜尿苷、安西他濱(ancitabine)、氮雜胞苷(azacytidine)、卡培他濱(capecitabine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、地西他濱(decitabine)、雙去氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifiuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、加洛他濱(galocitabine)、吉西他濱(gemcitabine)及沙帕他濱(sapacitabine)；3-胺基吡啶-2-甲醛縮胺基硫脲；溴尿苷(broxuridine)；克拉屈濱(cladribine)；環磷醯胺；阿糖胞苷(cytarabine)；乙嘧替氟(emitefur)；羥基脲；巰基嘌呤；奈拉濱(nelarabine)；培美曲塞(pemetrexed)；噴托他丁(pentostatin)；替加氟(tegafur)；及曲沙他濱(troxacitabine)。

鉑類似物之非限制性實例包括卡鉑(carboplatin)、順鉑、二環鉑(dicycloplatin)、庚鉑(heptaplatin)、樂鉑(lobaplatin)、奈達鉑(nedaplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、賽特鉑(satraplatin)及特瑞鉑(triplatin)四硝酸鹽。

酵素之非限制性實例包括天冬醯胺酶及培門冬酶(pegaspargase)。

拓樸異構酶抑制劑之非限制性實例包括吖啶甲醯胺、氨萘非特(amonafide)、安吖啶(amsacrine)、貝洛替康(belotecan)、依利銨(elliptinium)乙酸鹽、依沙替康(exatecan)、吲哚并咔唑、伊立諾替康(irinotecan)、勒托替康(lurtotecan)、米托蒽醌(mitoxantrone)、雷佐生(razoxane)、魯比替康(rubitecan)、SN-38、索布佐生(sobuzoxane)及拓樸替康(topotecan)。

類視色素之非限制性實例包括阿曲諾英(alitretinoin)、貝沙羅汀(bexarotene)、芬維A胺(fenretinide)、異維甲酸(isotretinoin)、利阿唑(liarozole)、RII視黃醯胺(retinamide)及維甲酸(tretinoin)。

氮丙啶之非限制性實例包括苯唑達帕(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美托達帕(meturedopa)及烏瑞替哌(uredopa)。

抗生素之非限制性實例包括嵌入抗生素；蒽二酮；蒽環黴素抗生素，諸如阿柔比星(aclarubicin)、胺柔比星(amrubicin)、道諾黴素(daunomycin)、道諾比星(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、伊達比星(idarubicin)、美諾立爾(menogaril)、諾加黴素(nogalamycin)、吡柔比星(pirarubicin)及伐蘆比星(valrubicin)；6-重氮基-5-側氧基-L-正白胺酸；阿克拉黴素(aclacinomysins)；放線菌素(actinomycin)；安麯黴素(authramycin)；氮絲胺酸(azaserine)；博來黴素(bleomycin)；放線菌素C (cactinomycin)；卡奇黴素(calicheamicin)；卡拉比辛(carabicin)；洋紅黴素(carminomycin)；嗜癌黴素(carzinophilin)；色黴素(chromomycin)；放線菌素(dactinomycin)；地托比星(detorubicin)；依索比星(esorubicin)；埃斯培拉黴素(esperamicin)；格爾德黴素(geldanamycin)；麻西罗霉素(marcellomycin)；絲裂黴素；絲裂黴素C；麥考酚酸(mycophenolic acid)；橄欖黴素(olivomycin)；諾凡特龍(novantrone)；培洛黴素(peplomycin)；泊非黴素(porfiromycin)；波福黴素(potfiromycin)；嘌呤黴素(puromycin)；三鐵阿黴素(quelamycin)；雷貝卡黴素(rebeccamycin)；羅多比星(rodorubicin)；鏈黑黴素(streptonigrin)；鏈佐星(streptozocin)；坦螺旋黴素(tanespimycin)；殺結核菌素(tubercidin)；烏苯美司(ubenimex)；淨司他丁(zinostatin)；淨司他丁斯酯(zinostatin stimalamer)；及佐柔比星(zorubicin)。

在一個實施例中，該(等)另外抗癌劑為激素及/或抗激素劑(亦即激素療法)。激素及抗激素劑之非限制性實例包括抗雄激素劑，諸如阿比特龍(abiraterone)、阿帕魯醯胺(apalutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、達洛魯胺(darolutamide)、恩雜魯胺(enzalutamide)、氟他胺(flutamide)、戈舍瑞林(goserelin)、亮丙瑞林(leuprolide)及尼魯米特(nilutamide)；抗雌激素劑，諸如4-羥基他莫昔芬(tamoxifen)、芳香酶抑制4(5)-咪唑、EM-800、磷雌酚(fosfestrol)、氟維司群(fulvestrant)、可莫昔芬(keoxifene)、LY 117018、奧那司酮(onapristone)、雷洛昔芬(raloxifene)、他莫昔芬、托瑞米芬(toremifene)及曲沃昔芬(trioxifene)；抗腎上腺劑(anti-adrenal)，諸如胺魯米特(aminoglutethimide)、德胺魯米特(dexaminoglutethimide)、米托坦(mitotane)及曲洛司坦(trilostane)；雄激素，諸如卡普睾酮(calusterone)、丙酸屈膜斯酮(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄胺(mepitiostane)及睾內酯(testolactone)；阿巴瑞克(abarelix)、阿那曲唑(anastrozole)；西曲瑞克(cetrorelix)；地洛瑞林(deslorelin)；依西美坦(exemestane)；法屈唑(fadrozole)；菲那雄胺(finasteride)；福美斯坦(formestane)；組胺瑞林(histrelin) (RL 0903)；人類絨毛膜促性腺素；蘭瑞肽(lanreotide)；LDI 200 (Milkhaus)；來曲唑(letrozole)；亮丙瑞林(leuprorelin)；米非司酮(mifepristone)；那法瑞林(nafarelin)；萘福昔定(nafoxidine)；奧沙特隆(osaterone)；普賴松(prednisone)；促甲狀腺激素α (thyrotropin alfa)；及曲普瑞林(triptorelin)。

在一個實施例中，該(等)另外抗癌劑為免疫治療劑(亦即免疫療法)。免疫治療劑之非限制性實例包括生物反應調節劑、細胞激素抑制劑、腫瘤疫苗、單株抗體、免疫查核點抑制劑、群落刺激因子及免疫調節劑。

生物反應調節劑(包括細胞激素抑制劑(細胞激素)，諸如干擾素及介白素)之非限制性實例包括干擾素α (interferon alfa/interferon alpha)，諸如干擾素α-2、干擾素α-2a、干擾素α-2b、干擾素α-nl、干擾素α-n3、集成干擾素α-1 (interferon alfacon-1)、PEG干擾素α(peginterferon alfa)-2a、PEG干擾素α-2b及白細胞α干擾素；干擾素β，諸如干擾素β-1a及干擾素β-1b；干擾素γ，諸如天然干擾素γ-1a及干擾素γ-1b；阿地白介素(aldesleukin)；介白素-1β；介白素-2；奧普瑞白介素(oprelvekin)；索納明(sonermin)；他索納明(tasonermin)；及維如利金(virulizin)。

腫瘤疫苗之非限制性實例包括APC 8015、AVICINE、膀胱癌疫苗、癌症疫苗(Biomira)、胃泌素17免疫原、丸山疫苗(Maruyama vaccine)、黑色素瘤溶解物疫苗、黑色素瘤溶癌物疫苗(New York Medical College)、黑色素瘤疫苗(New York University)、黑色素瘤疫苗(Sloan Kettering Institute)、TICE® BCG (Bacillus Calmette-Guerin)及病毒性黑色素瘤細胞溶解物疫苗(Royal Newcastle Hospital)。

單株抗體之非限制性實例包括阿巴伏單抗(abagovomab)、阿德木單抗(adecatumumab)、阿柏西普(aflibercept)、阿來組單抗(alemtuzumab)、布林木單抗(blinatumomab)、貝倫妥單抗維多汀(brentuximab vedotin)、CA 125 MAb (Biomira)、癌症MAb (Japan Pharmaceutical Development)、達利珠單抗(daclizumab)、達雷木單抗(daratumumab)、德奴單抗(denosumab)、依決洛單抗(edrecolomab)、吉妥珠單抗(gemtuzumab zogamicin)、HER-2及Fc MAb (Medarex)、替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)、遺傳型105AD7 MAb (CRC Technology)、遺傳型CEA MAb (Trilex)、伊匹單抗(ipilimumab)、齊沃利單抗(quavonlimab)、威柏托利單抗(vibostolimab)、法韋澤利單抗(favezelimab)、林妥珠單抗(lintuzumab)、LYM-1-碘131 MAb (Techni clone)、米妥莫單抗(mitumomab)、莫昔土莫單抗(moxetumomab)、奧法木單抗(ofatumumab)、多態上皮黏蛋白-釔90 MAb (Antisoma)、蘭尼單抗(ranibizumab)、利妥昔單抗(rituximab)及曲妥珠單抗(trastuzumab)。

免疫檢查點抑制劑之非限制性實例包括抗-PD-1劑或抗體，諸如西米普利單抗(cemiplimab)、納武單抗(nivolumab)及派立珠單抗(pembrolizumab)；抗-PD-L1劑或抗體，諸如阿特珠單抗(atezolizumab)、阿維單抗(avelumab)及度伐單抗(durvalumab)；抗-CTLA-4劑或抗體，諸如易普利單抗(ipilumumab)及齊沃利單抗(quavonlimab)；抗-LAG1劑；抗-LAG3劑，諸如法韋澤利單抗及抗-OX40劑。

群落刺激因子之非限制性實例包括達貝泊汀(darbepoetin) α、依泊汀(epoetin) α、依泊汀β、非格司亭(filgrastim)、粒細胞巨噬細胞群落刺激因子、來格司亭(lenograstim)、來立司亭(leridistim)、米立司亭(mirimostim)、莫拉司亭(molgramostim)、那托司亭(nartograstim)、培非司亭(pegfilgrastim)及沙格司亭(sargramostim)。

另外免疫治療劑之非限制性實例包括BiTE、CAR-T細胞、GITR促效劑、咪喹莫特(imiquimod)、免疫調節醯亞胺(IMiDs)、錯配雙股RNA (Ampligen)、雷西莫特(resiquimod)、SRL 172及胸腺法新(thymalfasin)。

在一個實施例中，該(等)另外抗癌劑為靶向治療劑(亦即靶向療法)。靶向治療劑包括例如單株抗體及小分子藥物。靶向治療劑之非限制性實例包括信號轉導抑制劑、生長因子抑制劑、酪胺酸激酶抑制劑、EGFR抑制劑、組蛋白去乙醯酶(HDAC)抑制劑、蛋白酶體抑制劑、細胞週期抑制劑、血管生成抑制劑、基質-金屬蛋白酶(MMP)抑制劑、肝細胞生長因子抑制劑、TOR抑制劑、KDR抑制劑、VEGF抑制劑、纖維母細胞生長因子(FGF)抑制劑、MEK抑制劑、ERK抑制劑、PI3K抑制劑、AKT抑制劑、MCL-1抑制劑、BCL-2抑制劑、SHP2抑制劑、HER-2抑制劑、BRAF抑制劑、BTK抑制劑(例如奈塔布替尼(nemtabrutinib))、基因表現調節劑、自體吞噬抑制劑、細胞凋亡誘導劑、抗增生劑及糖酵解抑制劑。

信號轉導抑制劑之非限制性實例包括酪胺酸激酶抑制劑、多激酶抑制劑、安羅替尼(anlotinib)、阿瓦替尼(avapritinib)、阿西替尼(axitinib)、達沙替尼(dasatinib)、多韋替尼(dovitinib)、伊馬替尼(imatinib)、樂伐替尼(lenvatinib)、氯尼達明(lonidamine)、尼洛替尼(nilotinib)、尼达尼布(nintedanib)、帕唑帕尼(pazopanib)、培維索孟(pegvisomant)、帕納替尼(ponatinib)、凡德他尼(vandetanib)及EGFR抑制劑。

EGFR抑制劑之非限制性實例包括EGFR之小分子拮抗劑，諸如阿法替尼(afatinib)、布利替尼(brigatinib)、埃羅替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、拉帕替尼(lapatinib)及奧斯替尼(osimertinib)；及基於抗體之EGFR抑制劑，包括可部分或完全阻斷其天然配位體之EGFR活化之任何抗-EGFR抗體或抗體片段。基於抗體之EGFR抑制劑可包括例如彼等描述於Modjtahedi, H.等人，1993，Br. J. Cancer 67:247-253；Teramoto, T.等人，1996，Cancer 77:639-645；Goldstein等人，1995，Clin. Cancer Res. 1 :1311-1318；Huang, S. M.等人，1999，Cancer Res. 15:59(8):1935-40；及Yang, X.等人，1999，Cancer Res. 59:1236-1243中者；單株抗體Mab E7.6.3 (Yang，1999，同上)；Mab C225 (ATCC登錄號HB-8508)、或具有其結合特異性之抗體或抗體片段；特異性反義核苷酸或siRNA；阿法替尼、西妥昔單抗(cetuximab)；馬茲替尼(matuzumab)；奈西木單抗(necitumumab)；尼托珠單抗(nimotuzumab)；帕尼單抗(panitumumab)；及扎蘆木單抗(zalutumumab)。

組蛋白去乙醯酶(HDAC)抑制劑之非限制性實例包括貝林司他(belinostat)、帕比司他(panobinostat)、羅米地辛(romidepsin)及伏立諾他(vorinostat)。

蛋白酶體抑制劑之非限制性實例包括硼替佐米(bortezomib)、卡非佐米(carfilzomib)、伊沙佐米(ixazomib)、瑪利佐米(marizomib) (鹽孢菌醯胺a (salinosporamide a))及奧普佐米(oprozomib)。

細胞週期抑制劑(包括CDK抑制劑)之非限制性實例包括阿貝西尼(abemaciclib)、阿瓦西地(alvocidib)、帕博西尼(palbociclib)及瑞博西尼(ribociclib)。

在一個實施例中，該(等)另外抗癌劑為抗血管生成劑(或血管生成抑制劑)，包括(但不限於)基質-金屬蛋白酶(MMP)抑制劑；VEGF抑制劑；EGFR抑制劑；TOR抑制劑，諸如依維莫司(everolimus)及替西羅莫司(temsirolimus)；PDGFR激酶抑制劑，諸如克雷拉尼(crenolanib)；HIF-lα抑制劑，諸如PX 478；HIF-2α抑制劑，諸如貝珠替凡(belzutifan)及描述於WO 2015/035223中之HIF-2α抑制劑；纖維母細胞生長因子(FGF)或FGFR抑制劑，諸如B-FGF及RG 13577；肝細胞生長因子抑制劑；KDR抑制劑；抗-Ang1及抗-Ang2劑；抗-Tie2激酶抑制劑；Tek拮抗劑(US 2003/0162712；US 6,413,932)；抗-TWEAK劑(US 6,727,225)；拮抗整合素對其配位體之結合之ADAM去整合素域(US 2002/0042368)；抗-eph受體及/或抗-艾普瑞林(ephrin)抗體或抗原結合區(US 5,981,245；5,728,813；5,969,110；6,596,852；6,232,447；及6,057,124)；及抗-PDGF-BB拮抗劑以及特異性結合至PDGF-BB配位體之抗體或抗原結合區域。

基質-金屬蛋白酶(MMP)抑制劑之非限制性實例包括MMP-2 (基質-金屬蛋白酶2)抑制劑、MMP-9 (基質-金屬蛋白酶9)抑制劑、普馬司他(prinomastat)、RO 32-3555及RS 13-0830。有用之基質金屬蛋白酶抑制劑之實例描述於例如WO 96/33172、WO 96/27583、EP 1004578、WO 98/07697、WO 98/03516、WO 98/34918、WO 98/34915、WO 98/33768、WO 98/30566、EP 0606046、EP 0931788、WO 90/05719、WO 99/52910、WO 99/52889、WO 99/29667、WO 1999/007675、EP 1786785、EP 1181017、US 2009/0012085、US 5,863,949、US 5,861,510及EP 0780386中。較佳MMP-2及MMP-9抑制劑為彼等具有很少或沒有抑制MMP-1之活性者。更佳為彼等相對於其他基質-金屬蛋白酶(亦即MAP-1、MMP-3、MMP-4、MMP-5、MMP-6、MMP-7、MMP-8、MMP-10、MMP-11、MMP-12及MMP-13)選擇性抑制MMP-2及/或MMP-9者。

VEGF及VEGFR抑制劑之非限制性實例包括貝伐單抗(bevacizumab)、塞地蘭尼(cediranib)、CEP 7055、CP 547632、KRN 633、塞地蘭尼(orantinib)、帕唑帕尼、哌加他尼(pegaptanib)、哌加他尼八鈉(pegaptanib octasodium)、司馬沙尼(semaxanib)、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)、VEGF拮抗劑(Borean，Denmark)及VEGF-TRAP™。

該(等)另外抗癌劑亦可為另一抗血管生成劑，包括(但不限於) 2-甲氧基雌二醇、AE 941、阿來組單抗、α-D148 Mab (Amgen，US)、α他汀(alphastatin)、乙酸阿奈可他(anecortave acetate)、安吉西丁(angiocidin)、血管生成抑制劑(SUGEN，US)、血管生成素、抗-Vn Mab (Crucell，Netherlands)、阿替莫德(atiprimod)、阿西替尼、AZD 9935、BAY RES 2690 (Bayer，Germany)、BC 1 (Genoa Institute of Cancer Research，Italy)、貝洛拉尼(beloranib)、氟草胺(benefin) (Lane Labs，US)、卡博替尼(cabozantinib)、CDP 791 (Celltech Group，UK)、軟骨素酶AC、西侖吉肽(cilengitide)、考布他汀(combretastatin) A4前藥、CP 564959 (OSI，US)、CV247、CYC 381 (Harvard University，US)、E 7820、EHT 0101、內皮抑素(endostatin)、恩紮妥林(enzastaurin)鹽酸鹽、ER-68203-00 (IVAX，US)、纖維蛋白原-E片段、Flk-1 (ImClone Systems，US)、FLT 1之形式(VEGFR 1)、FR-111142、GCS-100、GW 2286 (GlaxoSmithKline，UK)、IL-8、伊洛馬司他(ilomastat)、IM-862、伊索拉定(irsogladine)、KM-2550 (Kyowa Hakko，Japan)、來那度胺(lenalidomide)、樂伐替尼、MAb α5β3整合素、第二代(Applied Molecular Evolution，USA及Medlmmune，US)、MAb VEGF (Xenova，UK)、馬立馬司他(marimastat)、絲胺酸蛋白酶抑制劑(maspin) (Sosei，Japan)、轉移抑制素(metastatin)、莫托普胺(motuporamine) C、M-PGA、奧瑞布林(ombrabulin)、OXI4503、PI 88、血小板因子4、PPI 2458、雷莫蘆單抗(ramucirumab)、rBPI 21及BPI衍生之抗血管生成劑(XOMA，US)、瑞格菲尼(regorafenib)、SC-236, SD-7784 (Pfizer，US)、SDX 103 (University of California，San Diego，US)、SG 292 (Telios，US)、SU-0879 (Pfizer，US)、TAN-1120、TBC-1635、特色瓦替尼(tesevatinib)、四硫鉬酸鹽、沙利度胺(thalidomide)、血小板反應蛋白1抑制劑、Tie-2配位體(Regeneron，US)、組織因子路徑抑制劑(EntreMed，US)、腫瘤壞死因子-α抑制劑、腫瘤抑素(tumstatin)、TZ 93、尿激酶胞漿素原活化物抑制劑、瓦帝莫澤(vadimezan)、凡德他尼、伐索他汀(vasostatin)、瓦他拉尼(vatalanib)、VE-鈣黏素-2拮抗劑、束骨薑黃醇(xanthorrhizol)、XL 784 (Exelixis，US)、ziv-阿柏西普(ziv-aflibercept)及ZD 6126。

在實施例中，該(等)另外抗癌劑為破壞或抑制RAS-RAF-ERK或PI3K-AKT-TOR信號傳導路徑或為PD-1及/或PD-L1拮抗劑之另外活性劑。在實施例中，該(等)另外抗癌劑為RAF抑制劑、EGFR抑制劑、MEK抑制劑、ERK抑制劑、PI3K抑制劑、AKT抑制劑、TOR抑制劑、MCL-1抑制劑、BCL-2抑制劑、SHP2抑制劑、蛋白酶體抑制劑、或免疫療法，包括單株抗體、免疫調節醯亞胺(IMiD)、抗-PD-1、抗-PDL-1、抗-CTLA4、抗-LAGl、抗-LAG3、及抗-OX40劑、GITR促效劑、CAR-T細胞、及BiTE。

RAF抑制劑之非限制性實例包括達拉菲尼(dabrafenib)、恩拉菲尼(encorafenib)、瑞格菲尼、索拉非尼及維羅非尼(vemurafenib)。

MEK抑制劑之非限制性實例包括畢尼替尼(binimetinib)、CI-1040、考比替尼(cobimetinib)、PD318088、PD325901、PD334581、PD98059、瑞法替尼(refametinib)、司美替尼(selumetinib)及曲美替尼(trametinib)。

ERK抑制劑之非限制性實例包括LY3214996, LTT462、MK-8353、SCH772984、拉沃替尼(ravoxertinib)、優立替尼(ulixertinib)及如在WO 2017/068412中所述之ERKi。

PI3K抑制劑之非限制性實例包括17羥基渥曼青黴素(17-hydroxywortmannin)類似物(例如WO 06/044453)；AEZS-136；阿培里斯(alpelisib)；AS-252424；布帕里斯(buparlisib)；CAL263；科帕利普(copanlisib)；CUDC-907；達克里斯(dactolisib) (WO 06/122806)；去甲氧綠膠黴素(demethoxyviridin)；度維里斯(duvelisib)；GNE-477；GSK1059615；IC87114；艾代拉里斯(idelalisib)；INK1117；LY294002；Palomid 529；帕克薩利昔布(paxalisib)；哌立福新(perifosine)；PI-103；PI-103鹽酸鹽；皮克里斯(pictilisib) (例如WO 09/036,082；WO 09/055,730)；PIK 90；PWT33597；SF1126；索諾里斯(sonolisib)；TGI 00-115；TGX-221；XL147；XL-765；渥曼青黴素(wortmannin)；及ZSTK474。

AKT抑制劑之非限制性實例包括Akt-1-1 (抑制Aktl) (Barnett等人(2005) Biochem. J.，385 (Pt. 2)，399-408)；Akt-1-1,2 (Barnett等人(2005) Biochem. J.385 (Pt. 2)，399-408)；API-59CJ-Ome (例如Jin等人(2004) Br. J. Cancer 91，1808-12)；l-H-咪唑并[4,5-c]吡啶基化合物(例如WO05011700)；吲哚-3-卡必醇(carbinol)及其衍生物(例如美國專利第6,656,963號；Sarkar及Li (2004) J Nutr. 134(12 Suppl)，3493S-3498S)；哌立福新，Dasmahapatra等人(2004) Clin. Cancer Res.10(15)，5242-52，2004)；磷脂醯肌醇醚脂質類似物(例如Gills及Dennis (2004) Expert. Opin. Investig. Drugs13，787-97)；曲西立濱(triciribine) (Yang等人(2004) Cancer Res. 64，4394-9)；咪唑并噁嗪酮化合物，包括反式-3-胺基-1-甲基-3-[4-(3-苯基-5H-咪唑并[1,2-c]吡啶并[3,4-e][1,3]噁嗪-2-基)苯基]-環丁醇鹽酸鹽(WO 2012/137870)；阿伏瑞替(afuresertib)；卡帕塞替尼(capivasertib)；MK2206；帕他塞替尼(patasertib)、及彼等揭示於WO 2011/082270及WO 2012/177844中者。

TOR抑制劑之非限制性實例包括地弗莫司(deforolimus)；ATP競爭性TORC1/TORC2抑制劑，包括PI-103、PP242、PP30及Torin 1；FKBP12增強子、雷帕黴素(rapamycin)及其衍生物中之TOR抑制劑，包括替西羅莫司、依維莫司、WO 9409010；雷帕黴素类似物(rapalogs)，例如如在WO 98/02441及WO 01/14387中之所揭示，例如AP23573、AP23464或AP23841；40-(2-羥乙基)雷帕黴素、40-[3-羥基(羥甲基)甲基丙酸酯]-雷帕黴素；40-表-(四唑基)-雷帕黴素(亦稱為ABT578)；32-去側氧基雷帕黴素；揭示於WO 05/005434中之16-戊炔基氧基-32(S)-二氫雷帕黴素(dihydrorapanycin)、及其他衍生物；揭示於US 5,258,389、WO 94/090101、WO 92/05179、US 5,118,677、US 5,118,678、US 5,100,883、US 5,151,413、US 5,120,842、WO 93/111130、WO 94/02136、WO 94/02485、WO 95/14023、WO 94/02136、WO 95/16691、WO 96/41807、WO 96/41807及US 5,256,790中之衍生物；及含磷雷帕黴素衍生物(例如WO 05/016252)。

MCL-1抑制劑之非限制性實例包括AMG-176、MIK665及S63845。

SHP2抑制劑之非限制性實例包括描述於WO 2019/167000及WO 2020/022323中之SHP2抑制劑。

適合使用之抗癌劑之另外非限制性實例包括2-乙基醯肼、2,2',2"-三氯三乙胺、ABVD、醋葡內脂(aceglatone)、乙醯嗎喃(acemannan)、醛磷醯胺糖苷、阿法雷丁(alpharadin)、阿米福汀(amifostine)、胺基乙醯丙酸(aminolevulinic acid)、安那克來得(anagrelide)、ANCER、安塞司亭(ancestim)、抗-CD22免疫毒素、抗腫瘤發生草藥(antitumorigenic herb)、阿普淨醌(apaziquone)、阿格拉賓(arglabin)、三氧化二砷、硫唑嘌呤(azathioprine)、BAM 002 (Novelos)、bcl-2 (Genta)、貝斯他布西(bestrabucil)、比立考達(biricodar)、比生群(bisantrene)、溴隱亭(bromocriptine)、伯斯他素(brostallicin)、苔蘚抑素(bryostatin)、丁胱亞磺醯亞胺(buthionine sulfoximine)、花萼海綿誘癌素(calyculin)、細胞週期非特異性抗腫瘤劑、西莫白介素(celmoleukin)、氯膦酸鹽(clodronate)、克黴唑(clotrimazole)、阿糖胞苷十八焼基磷酸鹽(cytarabine ocfosfate)、DA 3030 (Dong-A)、地佛法明(defofamine)、地尼介白素迪夫托斯(denileukin diftitox)、右雷佐生(dexrazoxane)、地吖醌(diaziquone)、二氯乙酸氯、地拉卓(dilazep)、盤形德莫利得(discodermolide)、二十二醇(docosanol)、度骨化醇(doxercalciferol)、依地福新(edelfosine)、依氟鳥胺酸(eflornithine)、EL532 (Elan)、依扶米辛(elfomithine)、依沙蘆星(elsamitrucin)、恩尿嘧啶(eniluracil)、依他硝唑(etanidazole)、依昔舒林(exisulind)、鐵銹醇(ferruginol)、葉酸補充劑，諸如亞葉酸、加塞特辛(gacytosine)、硝酸鎵、吉美拉西(gimeracil)/奧特拉西(oteracil)/替加氟組合(S-1)、格萊克濱(glycopine)、組織胺二鹽酸鹽、HIT雙氯芬酸、HLA-B7基因療法(Vical)、人類胚胎α胎蛋白、伊班膦酸鹽(ibandronate)、伊班膦酸(ibandronic acid)、ICE化學療法方案、伊美克(imexon)、碘苄胍(iobenguane)、IT-101 (CRLX101)、拉尼喹達(laniquidar)、LC 9018 (Yakult)、來氟米特(leflunomide)、蘑菇多糖(lentinan)、左旋咪唑(levamisole) + 氟尿嘧啶(fluorouracil)、洛伐他汀(lovastatin)、硫蒽酮(lucanthone)、馬索羅酚(masoprocol)、美拉胂醇(melarsoprol)、甲氧氯普胺(metoclopramide)、米替福新(miltefosine)、米若昔芬(miproxifene)、米托胍腙(mitoguazone)、米托唑胺(mitozolomide)、莫哌達醇(mopidamol)、莫特沙芬釓(motexafin gadolinium)、MX6 (Galderma)、納洛酮(naloxone) + 潘他唑新(pentazocine)、硝呋旦(nitracrine)、諾拉曲塞(nolatrexed)、NSC 631570奧曲肽(octreotide) (Ukrain)、奧拉帕利(olaparib)、P-30蛋白、PAC-1、帕利夫明(palifermin)、帕米膦酸鹽(pamidronate)、帕米磷酸(pamidronic acid)、戊聚糖多硫酸鈉、苯來美特(phenamet)、畢西巴尼(picibanil)、匹杉瓊(pixantrone)、鉑、鬼臼酸(podophyllinic acid)、卟吩姆納(porfimer sodium)、PSK (多醣-K)、兔抗胸腺細胞多株抗體、拉斯伯門特(rasburiembodiment)、視黃酸、依替膦酸錸Re 186鹽(rhenium Re 186 etidronate)、羅莫肽(romurtide)、來昔決南釤(153 Sm) (samarium (153 Sm) lexidronam)、西佐喃(sizofiran)、苯基乙酸鈉、斯帕磷酸(sparfosic acid)、螺鍺胺(spirogermanium)、氯化鍶-89、蘇拉明(suramin)、苦馬豆素(swainsonine)、他拉泊芬(talaporfin)、他立喹達(tariquidar)、他佐羅汀(tazarotene)、替加氟-尿嘧啶、替莫泊芬(temoporfin)、細交鍵孢菌酮酸(tenuazonic acid)、四氯十氧化物(tetrachlorodecaoxide)、血小板生成素(thrombopoietin)、本紫紅素乙酯錫(tin ethyl etiopurpurin)、替拉扎明(tirapazamine)、TLC ELL-12、托西奠單抗(tositumomab)-碘131、曲氟尿苷(trifluridine)及替比拉西(tipiracil)組合、肌鈣蛋白(troponin) I (Harvard University、US)、尿烷、伐司朴達(valspodar)、維替泊芬(verteporfin)、唑來膦酸(zoledronic acid)及唑喹達(zosuquidar)。

本發明進一步提供一種式(I)至(VII)化合物或本文提供之醫藥組合物與放射療法組合用於治療癌症之方法。用於投與放射療法之技術係此項技術中已知的，且此等技術可用於本文描述之組合療法中。此組合療法中式(I)至(VII)化合物之投與可如本文所述來確定。放射療法可透過幾種方法中之一者或方法之組合來投與，包括(但不限於)外射束療法(external-beam therapy)、內部放射療法(internal radiation therapy)、植入放射、立體定位放射手術、全身放射療法、放射療法及永久性或暫時性間質近接療法。術語「近接療法」如本文所用係指在腫瘤或其他增生性組織疾病位點處或附近，藉由插入體內之空間侷限式放射性材料來遞送之放射療法。該術語意欲(但不限於)包括暴露至放射性同位素(例如At-211、I-131、I-125、Y-90、Re-186、Re-188、Sm-153、Bi-212、P-32、及Lu之放射性同位素)。用作本發明之細胞調理劑之適宜放射源包括固體及液體。以非限制性實例說明之，該放射源可為放射性核素，諸如I-125、I -131、Yb-169、Ir-192作為固體來源、I-125作為固體來源、或發射光子、β粒子、γ輻射或其他治療射線之其他放射性核素。該放射性材料亦可為由任何放射性核素溶液(例如I-125或I-131之溶液)製成之流體，或放射性流體可使用含有固體放射性核素(諸如Au-198、Y-90)之小粒子之適宜流體之漿液來產生。此外，該(等)放射性核素可包含在凝膠或放射性微球中。

本發明亦提供用於組合療法之方法，其中已知與式(I)至(VII)化合物或其醫藥上可接受之鹽組合使用之該另外活性劑可調節其他路徑、或相同路徑之其他組分、或甚至重疊之靶向酵素組。在一個實施例中，此種療法包括(但不限於)將一或多種式(I)至(VII)化合物與化療劑、免疫治療劑、激素治療劑、治療抗體、靶向治療劑及放射治療組合以提供協同或累加治療效應。

本發明之化合物可與本文揭示之劑或其他適宜劑組合使用，端視所治療的病狀而定。因此，在一些實施例中，本發明之一或多種化合物將與如上文所述之其他劑共同投與。當用於組合療法中時，將本文描述之化合物與該第二劑同時或單獨投與。此組合投與可包括以相同劑型同時投與該兩種劑、以單獨劑型同時投與及單獨投與。亦即，式(I)至(VII)化合物及任何上文所述劑可一起調配成相同劑型且同時投與。或者，式(I)至(VII)化合物及任何上文所述劑可同時投與，其中兩種該等劑均存在於單獨調配物中。在另一個替代例中，可投與式(I)至(VII)化合物，緊跟著係任何上文所述劑，或反之亦然。在該單獨投與方案之一些實施例中，式(I)至(VII)化合物及任何上文所述劑以相隔幾分鐘、或相隔幾小時、或相隔幾天投與。

由於本發明之一個態樣涵蓋用可單獨投與之醫藥活性化合物之組合治療該等疾病/病狀，本發明進一步關於以套組形式組合單獨醫藥組合物。該套組包含兩種單獨醫藥組合物：式(I)至(VII)化合物、及第二醫藥化合物。該套組包含用於裝納該等單獨組合物之容器，諸如分開之瓶或分開之箔包。容器之另外實例包括注射器、盒及袋。在一些實施例中，該套組包含使用單獨組分之使用說明。在該等單獨組分較佳以不同劑型(例如經口及非經腸)投與時、以不同劑量間隔投與、或在處方健康照護專業人員期望該組合之個別組分之滴定時，該套組形式特別有利。

本發明亦可提供用於療法中之式(I)至(VII)化合物或其醫藥上可接受之鹽，或該式(I)至(VII)化合物或其醫藥上可接受之鹽在療法中之用途。本發明亦提供式(I)至(VII)化合物或其醫藥上可接受之鹽，其用於治療癌症，或式(I)至(VII)化合物或其醫藥上可接受之鹽用於治療癌症之用途。本發明亦提供用於製備用於治療癌症之藥劑之式(I)至(VII)化合物或其醫藥上可接受之鹽、或該式(I)至(VII)化合物或其醫藥上可接受之鹽用於製備用於治療癌症之藥劑之用途。本發明亦提供用於治療癌症之式(I)至(VII)化合物或其醫藥上可接受之鹽及另外抗癌劑、或該式(I)至(VII)化合物或其醫藥上可接受之鹽及該另外抗癌劑用於治療癌症之用途。本發明亦提供用於製備用於治療癌症之藥劑之式(I)至(VII)化合物或其醫藥上可接受之鹽及另外抗癌劑、或該式(I)至(VII)化合物或其醫藥上可接受之鹽及該另外抗癌劑用於製備用於治療癌症之藥劑之用途。本發明亦提供用於治療癌症之包含式(I)至(VII)化合物或其醫藥上可接受之鹽之醫藥組合物、或包含該式(I)至(VII)化合物或其醫藥上可接受之鹽之該醫藥組合物用於治療癌症之用途。本發明亦提供用於治療癌症之包含式(I)至(VII)化合物或其醫藥上可接受之鹽及另外抗癌劑之醫藥組合物、或包含該式(I)至(VII)化合物或其醫藥上可接受之鹽及該另外抗癌劑之該醫藥組合物用於治療癌症之用途。 製備本發明化合物之方法

本文描述之化合物可根據根據以下方案及類似之程序使用適宜材料來製備且藉由以下具體實例進一步列舉。然而，該等實例中所說明之化合物不應被解釋為形成被認為是本發明之唯一屬。該等實例進一步說明用於製備本發明化合物之詳細內容。熟習此項技術者將易於理解，以下製備型程序之條件及製程之已知變型可用於製備此等化合物。例如，在一些情況下，進行反應方案之步驟之順序可改變以促進該反應或避免非所欲反應產物。提供此等實例僅用於進一步說明之目的且不意欲為對本發明之限制。下文描述之任何中間物在本文中可由其在「Int-」之前的數字來指稱。

在整個合成方案及實例中，除非另有指示，否則縮寫及頭字語可以以下含義使用：aq.= 水性；atm = 氣氛；氟硼螢-GDP = 二磷酸氫((2R,3S,4R,5R)-5-(2-胺基-6-側氧基-1,6-二氫-9H-嘌呤-9-基)-3-(((2-(3-(5,5-二氟-7,9-二甲基-5H-4l4,5l4-二吡咯并[1,2-c:2',1'-f][1,3,2]二氮雜硼雜環己三烯-3-基)丙醯胺基)乙基)胺甲醯基)氧基)-4-羥基四氫呋喃-2-基)甲酯及二磷酸氫((2R,3R,4R,5R)-5-(2-胺基-6-側氧基-1,6-二氫-9H-嘌呤-9-基)-4-(((2-(3-(5,5-二氟-7,9-二甲基-5H-4l4,5l4-二吡咯并[1,2-c:2',1'-f][1,3,2]二氮雜硼雜環己三烯-3-基)丙醯胺基)乙基)胺甲醯基)氧基)-3-羥基四氫呋喃-2-基)甲酯之混合物(Invitrogen ^TM，目錄號G22360)；cataCXium A Pd G2 = 氯[(二(1-金剛烷基)- N-丁基膦)-2-(2-胺基聯苯基)]鈀(II)；cataCXium A Pd G3 = 甲磺酸[(二(1-金剛烷基)-正丁基膦)-2-(2′-胺基-1,1′-聯苯基)]鈀(II)；conc. = 濃度；D = 氘；DAST = 三氟化(二乙基胺基)硫；dba = 二亞苄基丙酮；DCM = 二氯甲烷；DHP = 3,4-二氫-2 H-哌喃；DIBAL-H = 氫化二異丁基鋁；DIPEA = DIEA = N, N-二異丙基乙胺；DMF = N,N-二甲基甲醯胺；DMSO = 二甲基亞碸；dppf = 1,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵；EDTA = 乙二胺四乙酸；equiv、eq.= 當量；ESI = 電噴霧；Et = 乙基；EtOAc = 乙酸乙酯；EtOH = 乙醇；GDP = 二磷酸鳥苷；GTP = 三磷酸鳥苷；h = 小時；HEPES = 4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸；HMPA = 六甲基磷醯胺；HPLC = 高壓液相層析；Int = 中間物； iPr = 異丙基；IPA = i-PrOH = 異丙醇；KHMDS = 雙(三甲基矽基)醯胺鉀；LCMS = 液相層析-質譜法；min = 分鐘；LDA = 二異丙基醯胺鋰；LiHMDS = 雙(三甲基矽基)醯胺鋰；M = 莫耳； m-CPBA = 3-氯苯并過氧酸 = m-氯過氧苯甲酸；Me = 甲基；MeCN、ACN = 乙腈；MeOH = 甲醇；MS = 質譜法；NBS = N-溴琥珀醯亞胺；ND = 未測定； NMR = 核磁共振；PG = 丙二醇；Pet. ether = 石油醚；POCl ₃= 氯氧化磷(V)；RP-HPLC = 逆向HPLC；r.t.= 室溫；sat.= 飽和；SEM = (2-甲氧基乙基)三甲基矽烷；SEMCl = (2-氯甲氧基乙基)三甲基矽烷；SFC = 超臨界流體層析；SOS = 非七激酶子(Son of Sevenless)；SPhos Pd G3 = 甲磺酸(2-二環己基膦基-2′,6′-二甲氧基聯苯基)[2-(2′-胺基-1,1′-聯苯基)]鈀(II)；TBAF = 氟化四-正丁基銨；TBS = 第三丁基二甲基矽基；TBSCl = 第三丁基二甲基氯矽烷；TEA = Et ₃N = 三乙胺；Tf = 三氟甲基磺醯基；Tf ₂O = 三氟甲磺酸酐；TFA = 三氟乙酸；THF = 四氫呋喃；THP = 四氫哌喃；TIPS = 三異丙基矽基；TIPSCCBr = (溴乙炔基)三異丙基矽烷；TLC = 薄層層析；TR-FRET = 時差式螢光共振能量轉移；TsOH = 對-甲苯磺酸 = 4-甲基苯磺酸；吐溫(Tween) = 聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單月桂酸酯；VCD = 振動循環二色性；v、v/v = 體積、體積對體積；w、w/w = 重量、重量對重量，µm = 微米。 實例

除非另有註明，否則濃度係指在減壓下(例如藉由旋轉蒸發)移除揮發性組分。除非另有註明，否則所有溫度均以℃為單位。除非另有註明，否則質譜(MS)藉由電噴霧離子質譜法(ESI)在正離子偵測模式中測量且m/z係指[M+H] ⁺離子。除非另有註明，否則在環境溫度下在400至600 MHz下記錄 ¹H NMR光譜。報告為0.5 H之質子係由於旋轉異構信號所致。除非另有註明，否則RP-HPLC係指在利用梯度溶離之C18-官能化製備型或半製備型管柱上使用經三氟乙酸或氫氧化銨改性之乙腈及水作為溶離劑且溶離份藉由旋轉蒸發凍乾或濃縮之逆相HPLC。藉由管柱層析於在矽膠上之純化使用急驟層析系統(例如ISCO®或Biotage®)及市售預填裝之矽膠管柱且使用所述溶劑體系溶離來達成。除非在實驗程序及化合物表中另有註明，否則將本文描述之化合物合成為外消旋物。該等實例中之某些產物/中間物包括「峰1」及/或「峰2」之指示，其係指自用於在指定條件下分離該化合物之層析管柱(例如SFC管柱)溶離指定產物/中間物之順序。因此，例如，峰1係指在指定條件下之第一溶離化合物，例如第一溶離立體異構體。

用於立體異構體之解析中之SFC及HPLC管柱概述於下表中： 中間物合成：

中間物 1： ( S)-3-((( 第三丁基二甲基矽基 ) 氧基 ) 甲基 )-1,4- 氧氮雜環庚烷( Int-1)

步驟 A ： ( R)-3-( 羥甲基 )-1,4- 氧氮雜環庚烷 -4- 甲酸第三丁酯

在0℃下，將硼烷二甲硫複合物(0.799 mL，7.99 mmol，10M)添加至( S)-4-(第三丁氧基羰基)-1,4-氧氮雜環庚烷-3-甲酸(980 mg，4.00 mmol)含在THF (9.8 mL)中之溶液。在室溫下攪拌該混合物19小時後，藉由添加H ₂O淬滅該反應。以EtOAc萃取該反應混合物，用鹽水洗滌，經Na ₂SO ₄乾燥，過濾且在真空中濃縮。殘餘物藉由急驟矽膠層析(10至100%，EtOAc梯度含在己烷中)純化以得到( R)-3-(羥甲基)-1,4-氧氮雜環庚烷-4-甲酸第三丁酯。MS (ESI)： m/z(M+H) ⁺232。

步驟 B ： ( S)-3-((( 第三丁基二甲基矽基 ) 氧基 ) 甲基 )-1,4- 氧氮雜環庚烷( Int-1)

將HCl (4.97 mL，19.9 mmol，4.0M含在二噁烷中)添加至( R)-3-(羥甲基)-1,4-氧氮雜環庚烷-4-甲酸第三丁酯(767 mg，3.32 mmol)含在CH ₂Cl ₂(7.7 mL)中之溶液。在室溫下攪拌該混合物1小時後，在真空中濃縮該反應混合物。該粗製混合物直接用於下一步驟中而無需進一步純化。

在0℃下，將DIPEA (2.84 mL，16.6 mmol)、咪唑(226 mg，3.32 mmol)及第三丁基二甲基氯矽烷(650 mg，4.31 mmol)添加至含在CH ₂Cl ₂(7.7 mL)中之粗製混合物胺鹽酸鹽。在室溫下攪拌該混合物15小時後，藉由添加H ₂O淬滅該反應。以CHCl ₃萃取該反應混合物，用鹽水洗滌，經Na ₂SO ₄乾燥，過濾且在真空中濃縮以得到( S)-3-(((第三丁基二甲基矽基)氧基)甲基)-1,4-氧氮雜環庚烷( Int-1)。將此化合物直接用於下一步驟中而無需進一步純化。 ¹H NMR (400 MHz, CDCl ₃) δ 3.89-3.84 (m, 1H), 3.84-3.81 (m, 1H), 3.80-3.70 (m, 1H), 3.53 (dd, J=9.6, 5 .2 Hz, 1H), 3.45 (dd, J= 9.6, 7.2 Hz, 1H), 3.36 (dd, J= 12.4, 8.9 Hz, 1H), 3.15 (dt, J= 13.5, 4.9 Hz, 1H), 3.10-3.00 (m, 1H), 2.99-2.92 (m, 1H), 2.90-2.81 (m, 1H), 2.54-2.41 (m, 1H), 1.90-1.84 (m, 1H), 0.89 (s, 9H), 0.05 (s, 6H)。

中間物 2s： ( S)-5- 氯 -4- 氟 -2-( 甲硫基 )-8a,9,12,13- 四氫 -8 H,11 H-7,10- 二氧雜 -1,3,6,13a- 四氮雜萘并 [1,8- ab] 庚烯( Int-2)

步驟 A ： ( S)-3-((( 第三丁基二甲基矽基 ) 氧基 ) 甲基 )-4-(5,7- 二氯 -8- 氟 -2-( 甲硫基 ) 吡啶并 [4,3- d] 嘧啶 -4- 基 )-1,4- 氧氮雜環庚烷

將POCl ₃(0.360 mL，3.86 mmol)及DIPEA (1.10 mL，6.43 mmol)添加至5,7-二氯-8-氟-2-(甲硫基)吡啶并[4,3- d]嘧啶-4(3 H)-酮(900 mg，3.21 mmol)含在MeCN (16 mL)中之懸浮液。在80℃下攪拌該混合物1小時後，使該反應混合物冷卻至0℃。在0℃下，將DIPEA (1.10 mL，6.43 mmol)及( S)-3-(((第三丁基二甲基矽基)氧基)甲基)-1,4-氧氮雜環庚烷( Int-1)添加至該反應混合物。在室溫下攪拌該混合物2小時後，藉由添加H ₂O淬滅該反應。以EtOAc萃取該反應混合物，用鹽水洗滌，經Na ₂SO ₄乾燥，過濾且在真空中濃縮。殘餘物藉由急驟矽膠層析(10至50%，EtOAc梯度含在己烷中)純化以得到( S)-3-(((第三丁基二甲基矽基)氧基)甲基)-4-(5,7-二氯-8-氟-2-(甲硫基)吡啶并[4,3- d]嘧啶-4-基)-1,4-氧氮雜環庚烷。MS (ESI)： m/z(M+H) ⁺507。

步驟 B ： ( S)-5- 氯 -4- 氟 -2-( 甲硫基 )-8a,9,12,13- 四氫 -8 H,11 H-7,10- 二氧雜 -1,3,6,13a- 四氮雜萘并 [1,8- ab] 庚烯( Int-2)

將TBAF (9.05 mL，9.05 mmol，1.0M含在THF中)添加至( S)-3-(((第三丁基二甲基矽基)氧基)甲基)-4-(5,7-二氯-8-氟-2-(甲硫基)吡啶并[4,3- d]嘧啶-4-基)-1,4-氧氮雜環庚烷(1.53 g，3.02 mmol)含在THF (15 mL)中之溶液。在將該混合物在60℃下攪拌12小時後，將該反應冷卻至室溫。以EtOAc萃取該反應混合物，用磷酸鹽緩衝液、鹽水洗滌，經Na ₂SO ₄乾燥，過濾且在真空中濃縮。將殘餘物用CHCl ₃/異丙醚懸浮，過濾，且藉由異丙醚洗滌。將濾液在真空中濃縮且藉由急驟矽膠層析(10至80%，EtOAc梯度含在己烷中)純化以得到( S)-5-氯-4-氟-2-(甲硫基)-8a,9,12,13-四氫-8 H,11 H-7,10-二氧雜-1,3,6,13a-四氮雜萘并[1,8-ab]庚烯( Int-2)。MS (ESI)： m/z(M+H) ⁺357。 ¹H NMR (400 MHz, DMSO- d ₆) δ 5.03-4.94 (m, 1H), 4.70-4.63 (dd, J= 13.5, 4.5 Hz, 1H), 4.49 (d, J= 13.5 Hz, 1H), 4.32-4.25 (m, 1H), 4.07 (dd, J= 12.3, 3.8 Hz, 1H), 3.89-3.81 (m, 1H), 3.61-3.52 (m, 1H), 3.44-3.33 (m, 2H), 2.53 (s, 3H), 2.02-1.80 (m, 2H)。

中間物 3： ( S, Z)-(2-( 氟亞甲基 ) 四氫 -1 H- 吡咯嗪 -7a(5 H)- 基 ) 甲醇( Int-3)

步驟 A ： 2- 亞甲基 -5- 側氧基四氫 -1 H- 吡咯嗪 -7a(5 H)- 甲酸乙酯

在-40℃下，在氮氣氣氛下，將LiHMDS (636 mL，636 mmol，1 M含在THF中)滴加至( R)-5-側氧基吡咯啶-2-甲酸乙酯(50 g，318 mmol)及3-氯-2-(氯甲基)丙-1-烯(63.6 g，509 mmol)含在THF (300 mL)中之混合物。然後，允許該混合物升溫至室溫且攪拌20小時。TLC (石油醚/乙酸乙酯 = 1/1)顯示該起始物質已消耗且形成三個新的主要點。用飽和NH ₄Cl溶液(200 mL)淬滅該反應混合物且以EtOAc (200 mL x 3)萃取。用鹽水洗滌已合併的有機層，經Na ₂SO ₄乾燥，過濾且在減壓下濃縮以得到粗製產物，其藉由管柱層析(ISCO ^®；120 g SepaFlash ^®Silica Flash Column，0至50%乙酸乙酯含在石油醚梯度中之溶離劑，80 mL/min)純化以得到呈無色油之外消旋2-亞甲基-5-側氧基四氫-1 H-吡咯嗪-7a(5 H)-甲酸乙酯。MS (ESI)： m/z(M+H) ⁺210。

步驟 B ： ( S)-2- 亞甲基 -5- 側氧基四氫 -1 H- 吡咯嗪 -7a(5 H)- 甲酸乙酯

藉由製備型SFC (儀器SFC-17管柱DAICEL CHIRALPAK AS (250 mm x 50 mm，10 μm) 條件Neu-EtOH，開始B 25，結束B 25，梯度時間 (min) 200，100% B 保持時間 (min) 10流速(mL/min) 200注射200)分離外消旋2-亞甲基-5-側氧基四氫-1 H-吡咯嗪-7a(5 H)-甲酸乙酯(50 g，239 mmol)以得到( R)-2-亞甲基-5-側氧基四氫-1 H-吡咯嗪-7a(5 H)-甲酸乙酯(來自於SFC之第一溶離異構體)及( S)-2-亞甲基-5-側氧基四氫-1 H-吡咯嗪-7a(5 H)-甲酸乙酯(來自於SFC之第二溶離異構體)。MS (ESI)： m/z(M+H) ⁺210。 ¹H NMR (400 MHz, CDCl ₃) δ 5.07-4.88 (m, 2H), 4.22 (d, J= 15.6 Hz, 1H), 4.13 (q, J= 7.2 Hz, 2H), 3.70-3.58 (m, 1H), 2.98 (d, J= 15.6 Hz, 1H), 2.78-2.65 (m, 1H), 2.54 (ddd, J= 13.1, 9.1, 1.6, 1H), 2.46-2.33 (m, 2H), 2.12-2.00 (m, 1H), 1.20 (t, J= 7.1 Hz, 3H)。

步驟 C ： ( S)-2,5- 二側氧基四氫 -1 H- 吡咯嗪 -7a(5 H)- 甲酸乙酯

將( S)-2-亞甲基-5-側氧基四氫-1 H-吡咯嗪-7a(5 H)-甲酸乙酯(790 mg，3.78 mmol)含在DCM (15 mL)中之溶液在-78℃下用O ₃鼓泡直至該混合物變成藍色。在反應完成後，將二甲硫(469 mg，7.55 mmol)添加至該混合物且將該混合物在20℃下攪拌16小時。LCMS顯示該起始物質已消耗且發現所需MS。用鹽水(20 mL)洗滌已合併的有機層，經Na ₂SO ₄乾燥，過濾，且在減壓下濃縮以得到粗製產物，其藉由急驟矽膠層析(ISCO ^®；4 g SepaFlash ^®Silica Flash Column，0至50%乙酸乙酯含在石油醚梯度中之溶離劑，40 mL/min)純化以得到( S)-2,5-二側氧基四氫-1 H-吡咯嗪-7a(5 H)-甲酸乙酯。MS (ESI)： m/z(M+H) ⁺212。

步驟 D ： ( S)-2-( 氟亞甲基 )-5- 側氧基四氫 -1 H- 吡咯嗪 -7a(5 H)- 甲酸乙酯

在-78℃下，在氮氣氣氛下，將KHMDS (5.42 mL，5.42 mmol，1M含在THF中)添加至2-((氟甲基)磺醯基)吡啶(804 mg，4.59 mmol)含在THF (10.0 mL)中之溶液。30分鐘後，在-78℃下緩慢添加含在THF (3 mL)中之( S)-2,5-二側氧基四氫-1 H-吡咯嗪-7a(5 H)-甲酸乙酯(881 mg，4.17 mmol)，且將該混合物攪拌3小時。然後，使該反應系統升溫至室溫1小時。用飽和氯化銨水溶液(1 mL)，接著用HCl (2 mL，3M含在水中)淬滅該反應。以EtOAc (20 mL x 3)萃取該混合物。該有機層經硫酸鈉乾燥，過濾且在減壓下蒸發該溶劑以得到粗製產物。該粗製產物藉由在矽膠上之急驟層析(梯度：0至30%乙酸乙酯/石油醚)純化以得到( S)-2-(氟亞甲基)-5-側氧基四氫-1H-吡咯嗪-7a(5H)-甲酸乙酯。MS (ESI)： m/z(M+H) ⁺228。

步驟 E ： ( S, Z)-2-( 氟亞甲基 )-5- 側氧基四氫 -1 H- 吡咯嗪 -7a(5 H)- 甲酸乙酯

藉由製備型SFC (管柱DAICEL CHIRALPAK AY-H (250 mm x 30 mm，5 μm)條件0.1% NH ₃H ₂O EtOH 開始B 10 結束B 10 梯度時間(min) 60 100% B保持時間60 流速(mL/min) 90注射60)分離( S)-2-(氟亞甲基)-5-側氧基四氫-1 H-吡咯嗪-7a(5 H)-甲酸乙酯(210 mg，0.924 mmol)以得到( S, Z)-2-(氟亞甲基)-5-側氧基四氫-1 H-吡咯嗪-7a(5 H)-甲酸乙酯(來自於SFC之第一溶離異構體)及( S, E)-2-(氟亞甲基)-5-側氧基四氫-1 H-吡咯嗪-7a(5 H)-甲酸乙酯(來自於SFC之第二溶離異構體)。MS (ESI)： m/z(M+H) ⁺228。

步驟 F ： ( S, Z)-(2-( 氟亞甲基 ) 四氫 -1 H- 吡咯嗪 -7a(5 H)- 基 ) 甲醇( Int-3)

在0℃下，將DIBAL-H (1.12 L，1M含在甲苯中)滴加至( S, Z)-2-(氟亞甲基)-5-側氧基四氫-1 H-吡咯嗪-7a(5 H)-甲酸乙酯(84.6 g，372 mmol)含在THF (508 mL)中之溶液。使所得溶液升溫至室溫且攪拌1小時。用Na ₂SO ₄·10H ₂O淬滅該反應混合物。過濾該固體，且在減壓下濃縮該濾液。添加HCl (400 mL，4M含在乙酸乙酯中)且然後將所得混合物在rt下攪拌30分鐘。然後，在減壓下濃縮該混合物以得到( S, Z)-(2-(氟亞甲基)四氫-1 H-吡咯嗪-7a(5 H)-基)甲醇( Int-3，HCl鹽)，其無需進一步純化即可直接用於下一步驟中。MS (ESI)： m/z(M+H) ⁺172。

中間物 4： (6- 氯 -5- 環丙基 -1-( 四氫 -2 H- 哌喃 -2- 基 )-1 H- 吲唑 -4- 基 ) 硼酸( Int-4)

步驟 A ： 4- 氯 -2- 氟 -5- 硝基苯甲醛

將4-氯-2-氟苯甲醛(1.00 kg，6.31 mol，1.00當量)溶解於H ₂SO ₄(5.00 L)中且表示為體系R1。將發煙硝酸(517 g，8.20 mol，1.30當量)溶解於H ₂SO ₄(2.00 L)中且表示為體系R2。使該等體系R1及R2通過流體化學儀器且在0至25℃下反應3小時。利用TLC監測該反應。將該混合物倒入至冰水(36.0 L)中且分離出固體。然後，過濾該混合物，且用水(5.00 L x 2)洗滌該濾餅。在空氣下乾燥該產物以產生4-氯-2-氟-5-硝基苯甲醛。該產物無需進一步純化即可直接用於下一步驟中。 ¹H NMR (400 MHz, CDCl ₃) δ 10.31 (s, 1H), 8.46 (d, J= 6.8 Hz, 1H), 7.48 (d, J= 9.2 Hz, 1H)。

步驟 B ： 6- 氯 -5- 硝基 -1 H- 吲唑

在20至30℃下，將NH ₂NH ₂ ^.H ₂O (1.94 kg，30.9 mol，1.88 L，80%純度，3.50當量)滴加至4-氯-2-氟-5-硝基苯甲醛(1.80 kg，982 mmol，1.00當量)含在DMF (12.6 L)中之溶液。將該反應混合物在60至70℃下攪拌3小時。然後，使該反應混合物冷卻至20至30℃，且添加水(21.6 L)。沉澱固體且過濾所得混合物，且用水(9.00 L)洗滌該濾餅。在空氣下乾燥該產物以產生6-氯-5-硝基-1 H-吲唑。該產物無需進一步純化即可直接用於下一步驟中。 ¹H NMR (400MHz, DMSO- d ₆) δ 13.76 (s, 1H), 8.67 (s, 1H), 8.37 (s, 1H), 7.92 (s, 1H)。

步驟 C ： 6- 氯 -5- 硝基 -1-( 四氫 -2 H- 哌喃 -2- 基 )-1 H- 吲唑

在20至30℃下，將TsOH H ₂O (144 g，759 mmol，0.10當量)及DHP (1.28 kg，15.1 mol，1.39 L，2.00當量)添加至6-氯-5-硝基-1 H-吲唑(1.50 kg，7.59 mol，1.00當量)含在THF (10.5 L)中之溶液。將該反應混合物在40至50℃下攪拌5小時。在真空下在40至50℃下濃縮該反應混合物且用EtOAc (7.50 L)及水(10.5 L)稀釋。用aq. NaHCO ₃(7.50 L)及鹽水(7.50 L)洗滌該有機層，經Na ₂SO ₄乾燥。在40至45℃下在減壓下濃縮該有機溶液至1/3，且添加正庚烷(7.50 L)然後濃縮至1/3達3次。然後，過濾該混合物，且用正庚烷(6.00 L)洗滌所得濾餅以產生6-氯-5-硝基-1-(四氫-2 H-哌喃-2-基)-1 H-吲唑。 ¹H NMR (400MHz, CDCl ₃) δ 8.38(s, 1H), 8.15 (s, 1H), 7.81 (s, 1H), 5.72 (dd, J= 9.2, 8.8 Hz, 1H), 4.03-3.99 (m, 1H), 3.81-3.77 (m, 1H), 2.49-2.45 (m, 1H), 2.16-2.12 (m, 2H), 1.78-1.71 (m, 3H)。

步驟 D ： 6- 氯 -1-( 四氫 -2 H- 哌喃 -2- 基 )-1 H- 吲唑 -5- 胺

在20℃下，在Ar下，將Pt/C (100 g，23.7 mmol)添加至6-氯-5-硝基-1-(四氫-2 H-哌喃-2-基)-1 H-吲唑(500 g，479 mmol，1.00當量)含在2-MeTHF (3.50 L)中之溶液至該反應器。將所得混合物在真空下脫氣且然後用H ₂淨化三次。將該反應混合物在50℃下在H ₂(50 psi)下攪拌12小時。過濾該混合物，且用2-MeTHF (2.50 L x 2)洗滌該濾餅。在真空下在40至50℃下濃縮該濾液以產生6-氯-1-(四氫-2H-哌喃-2-基)-1H-吲唑-5-胺。該產物無需進一步純化即可直接用於下一步驟中。 ¹H NMR (400 MHz, CDCl ₃) δ 7.81 (s, 1H), 7.59 (s, 1H), 7.02 (s, 1H), 5.61-5.58 (dd, J= 9.2, 9.2 Hz, 1H), 4.03-4.00 (m, 3H), 3.76-3.71 (m, 1H), 2.52-2.49 (m, 1H), 2.14-2.05 (m, 2H), 1.77-1.65 (m, 3H)。

步驟 E ： 4- 溴 -6- 氯 -1-( 四氫 -2 H- 哌喃 -2- 基 )-1 H- 吲唑 -5- 胺

在N ₂下，在0至5℃下，將NBS (381 g，2.15 mol，1.20當量)分四批添加至6-氯-1-(四氫-2 H-哌喃-2-基)-1 H-吲唑-5-胺(450 g，1.79 mol，1.00當量)含在MeCN (3.15 L)中之溶液。將所得混合物在0至5℃下攪拌3小時。然後，將該反應混合物倒入至aq. NaHCO ₃(3.15 L)中且以EtOAc (4.50 L)萃取。然後，用鹽水(4.50 L)洗滌該有機層，且然後經Na ₂SO ₄乾燥。在減壓下濃縮該有機溶液且殘餘物藉由管柱層析(SiO ₂，石油醚/乙酸乙酯 = 100/1至1/1)純化以產生4-溴-6-氯-1-(四氫-2 H-哌喃-2-基)-1 H-吲唑-5-胺。 ¹H NMR (400MHz, CDCl ₃) δ 7.83 (s, 1H), 7.58 (s, 1H), 5.60 (dd, J= 9.2, 8.4 Hz, 1H), 4.35 (s, 2H) 3.98-3.97 (m, 1H), 3.80-3.69 (m, 1H), 2.52-2.45 (m, 1H), 2.15-2.05 (m, 2H), 1.80-1.65 (m, 3H)。

步驟 F ： 4- 溴 -6- 氯 -5- 碘 -1-( 四氫 -2 H- 哌喃 -2- 基 )-1 H- 吲唑

在0℃下，將I ₂(268 g，1.06 mol，213 mL，1.00當量)及CuI (20.1 g，105 mmol，0.10當量)添加至4-溴-6-氯-1-(四氫-2 H-哌喃-2-基)-1 H-吲唑-5-胺含在MeCN (2.10.L)中之溶液。然後，在0℃下，將亞硝酸異戊酯(148 g，1.27 mol，171 mL，1.20當量)滴加至該混合物。使所得混合物升溫至45℃且攪拌3小時。在25℃下藉由添加Na ₂SO ₃(2.50 L)淬滅該反應。然後，以EtOAc (2.50 L x 2)萃取該混合物且用鹽水(2.50 L)洗滌已合併的有機層，經Na ₂SO ₄乾燥，過濾且在減壓下濃縮。殘餘物藉由矽膠管柱層析(石油醚/乙酸乙酯 = 100/1至0/1)純化以產生4-溴-6-氯-5-碘-1-(四氫-2 H-哌喃-2-基)-1 H-吲唑。 ¹H NMR (400MHz, CDCl ₃) δ 7.93 (s, 1H), 7.78 (d, J= 1.6 Hz, 1H), 5.66-5.63 (m, 1H), 3.98 (d, J= 11.6 Hz 1H), 3.77-3.72 (m, 1H), 2.49-2.45 (m, 1H), 2.13-2.10 (m, 2H), 1.76-1.68 (m, 3H)。

步驟 G ： 4- 溴 -6- 氯 -5- 環丙基 -1-( 四氫 -2 H- 哌喃 -2- 基 )-1 H- 吲唑

在N ₂下，將Na ₂CO ₃(1 M，453 mL，5.00當量)、環丙基硼酸(9.34 g，108.mmol，1.20當量)及Pd(dppf)Cl ₂(13.2 g，18.1 mmol，0.20當量)添加至4-溴-6-氯-5-碘-1-(四氫-2 H-哌喃-2-基)-1 H-吲唑(50.0 g，90.6 mmol，1.00 eq)含在二噁烷(350 mL)中之溶液。在100℃下攪拌該反應混合物12小時。在25℃下藉由添加H ₂O (350 mL)淬滅該反應，且用EtOAc (350 mL x 2)萃取所得混合物。用鹽水(350 mL)洗滌已合併的有機層且經Na ₂SO ₄乾燥。在減壓下濃縮該有機溶液且殘餘物藉由管柱層析(SiO ₂，石油醚/乙酸乙酯 = 50/1至1/1)接著藉由製備型HPLC (管柱：Welch Xtimate C18 250 x 100 mm # 10 μm；流動相：[H ₂O (10 mM NH ₄HCO ₃)-ACN]；梯度：自70%至100%歷時18.0分鐘)純化以產生4-溴-6-氯-5-環丙基-1-(四氫-2 H-哌喃-2-基)-1 H-吲唑。 ¹H NMR (400 MHz, CDCl ₃) δ 7.98 (s, 1H), 7.62 (s, 1H), 5.64-5.61 (m, 1H), 4.01-3.97 (m, 1H), 3.75-3.71 (m, 1H), 2.50-2.47 (m, 1H), 2.13-2.08 (m, 2H), 1.84-1.67 (m, 4H), 1.22-1.19 (m, 2H), 0.80-0.77 (m, 2H)。

步驟 H ： (6- 氯 -5- 環丙基 -1-( 四氫 -2 H- 哌喃 -2- 基 )-1 H- 吲唑 -4- 基 ) 硼酸( Int-4)

在20℃下，在N ₂氣氛下，將TEA (12.54 mL，90 mmol)、四羥基二硼(3.02 g，33.7 mmol)及甲磺酸[(二(1-金剛烷基)-正丁基膦)-2-(2’-胺基-1,1’-聯苯基)]鈀(II) (1.504 g，2.249 mmol)添加至4-溴-6-氯-5-環丙基-1-(四氫-2 H-哌喃-2-基)-1 H-吲唑(8 g，22.49 mmol)含在MeOH (60 mL)中之溶液。將該反應在30℃下在N ₂氣氛下攪拌2小時。在真空中濃縮該反應混合物且殘餘物藉由急驟矽膠層析(ISCO ^®；80 g Agela ^®Silica Flash Column，0至10%梯度之EtOAc/EtOH=3:1含在石油醚中，40 mL/min，乾式負載)純化以得到(6-氯-5-環丙基-1-(四氫-2 H-哌喃-2-基)-1 H-吲唑-4-基)硼酸( Int-4)。MS (ESI)： m/z(M+H) ⁺321。

中間物 5： N - 甲氧基 - N- 甲基 -1-((2-( 三甲基矽基 ) 乙氧基 ) 甲基 )-1 H- 吡唑 -4- 甲醯胺( Int-5)

步驟 A ： 1-((2-( 三甲基矽基 ) 乙氧基 ) 甲基 )-1 H- 吡唑 -4- 甲酸乙酯

將DIEA (25.4 g，196 mmol)添加至1 H-吡唑-4-甲酸乙酯(13.8 g，98 mmol)含在DCM (100 mL)中之溶液且在0℃下攪拌該混合物15分鐘。緩慢添加(2-氯甲氧基乙基)三甲基矽烷(24.5 g，147 mmol)且在25℃下攪拌該混合物16小時。用水(50 mL)淬滅該反應，且以DCM (200 mL x 3)萃取所得混合物。已合併的有機層經無水Na ₂SO ₄乾燥，過濾，且在減壓下蒸發該濾液。該粗製產物藉由急驟矽膠層析(ISCO ^®；220 g SepaFlash ^®Silica Flash Column，0至35% EtOAc/石油醚梯度之溶離劑，80 mL/min)純化以得到1-((2-(三甲基矽基)乙氧基)甲基)-1 H-吡唑-4-甲酸乙酯。MS (ESI)： m/z(M+H) ⁺271。

步驟 B ： N - 甲氧基 - N- 甲基 -1-((2-( 三甲基矽基 ) 乙氧基 ) 甲基 )-1 H- 吡唑 -4- 甲醯胺( Int-5)

在0℃下，將 iPrMgBr (77 mL，222 mmol，2.9M含在2-甲基四氫呋喃中)添加至1-((2-(三甲基矽基)乙氧基)甲基)-1 H-吡唑-4-甲酸乙酯(20 g，74.0 mmol)及 N, O-二甲基羥基胺鹽酸鹽(10.8 g，111 mmol)含在無水THF (350 mL)中之溶液。將該混合物在25℃下攪拌16小時。用NH ₄Cl水溶液(100 mL)淬滅該反應，且以EtOAc (300 mL x 3)萃取所得混合物。該有機層經Na ₂SO ₄乾燥，過濾且在減壓下蒸發該濾液。該粗製產物藉由急驟矽膠層析(ISCO ^®；220 g SepaFlash ^®Silica Flash Column，0至50% EtOAc/石油醚梯度之溶離劑，70 mL/min)純化以得到 N-甲氧基- N-甲基-1-((2-(三甲基矽基)乙氧基)甲基)-1 H-吡唑-4-甲醯胺( Int-5)。MS (ESI)： m/z(M+H) ⁺286。

中間物 6： (6- 氟 -1-(( 三氟甲基 ) 磺醯基 )-5-(( 三異丙基矽基 ) 乙炔基 )-1 H- 苯并 [ f] 吲唑 -4- 基 ) 硼酸( Int-6) 步驟 A ： 5-((2- 溴 -4- 氟苯基 )( 羥基 ) 甲基 )- N- 甲氧基 - N- 甲基 -1-((2-( 三甲基矽基 ) 乙氧基 ) 甲基 )-1 H- 吡唑 -4- 甲醯胺

在-78℃下，在N ₂下，將二異丙基醯胺鋰(95 mL，95 mmol，1M含在THF中)添加至經攪拌之 N-甲氧基- N-甲基-1-((2-(三甲基矽基)乙氧基)甲基)-1 H-吡唑-4-甲醯胺( Int-5，24.74 g，87 mmol)含在THF (50 mL)中之溶液，且在-78℃下在N ₂下攪拌該反應混合物1小時。在-78℃下添加2-溴-4-氟苯甲醛(16 g，79 mmol)，且在-78℃下攪拌該混合物1小時。用水(50 mL)淬滅該反應且以EtOAc (500 mL x 3)萃取。用飽和鹽水(50 mL)洗滌該等有機層且經Na ₂SO ₄乾燥。在減壓下濃縮該有機溶液。殘餘物藉由急驟矽膠層析(ISCO ^®；Agela ^®Flash Column Silica-CS (330 g)，0至25%乙酸乙酯/石油醚梯度之溶離劑，30 mL/min)純化以得到5-((2-溴-4-氟苯基)(羥基)甲基)- N-甲氧基- N-甲基-1-((2-(三甲基矽基)乙氧基)甲基)-1 H-吡唑-4-甲醯胺。MS (ESI)： m/z(M+H) ⁺488、490。

步驟 B ： 5-(2- 溴 -4- 氟苄基 )- N- 甲氧基 - N- 甲基 -1 H- 吡唑 -4- 甲醯胺

將三乙基矽烷(118 mL，737 mmol)及TFA (56.8 mL，737 mmol)添加至5-((2-溴-4-氟苯基)(羥基)甲基)- N-甲氧基- N-甲基-1-((2-(三甲基矽基)乙氧基)甲基)-1 H-吡唑-4-甲醯胺(20 g，40.9 mmol)含在DCM (56 mL)中之溶液，且將該混合物在60℃下攪拌3小時。在真空中濃縮該反應混合物且用EtOAc (400 mL)稀釋殘餘物。用aq. NaHCO ₃及鹽水(30 mL x 2)洗滌該有機溶液，且該有機層經Na ₂SO ₄乾燥。在減壓下濃縮該有機溶液。殘餘物藉由急驟矽膠層析(ISCO ^®；Agela ^®Flash Column Silica-CS (220 g)，0至15%乙酸乙酯/石油醚梯度之稀釋劑，50 mL/min)純化以得到5-(2-溴-4-氟苄基)- N-甲氧基- N-甲基-1 H-吡唑-4-甲醯胺。MS (ESI)： m/z(M+H) ⁺342、344。

步驟 C ： 5-(2- 溴 -4- 氟苄基 )- N- 甲氧基 - N- 甲基 -1-( 四氫 -2 H- 哌喃 -2- 基 )-1 H- 吡唑 -4- 甲醯胺

在25℃下，將4-甲基苯磺酸(0.377 g，2.19 mmol)及DHP (4.01 mL，43.8 mmol)添加至5-(2-溴-4-氟苄基)- N-甲氧基- N-甲基-1 H-吡唑-4-甲醯胺(7.5 g，21.92 mmol)含在THF (80 mL)中之溶液，且將該混合物在25℃下攪拌2小時。在真空中濃縮該反應混合物，且殘餘物藉由急驟矽膠層析(ISCO ^®，80 g Agela Flash Column，石油醚/EtOAc = 2/1)純化以得到5-(2-溴-4-氟苄基)- N-甲氧基- N-甲基-1-(四氫-2 H-哌喃-2-基)-1 H-吡唑-4-甲醯胺。MS (ESI)： m/z(M+H) ⁺426、428。

步驟 D ： 6- 氟 -1-( 四氫 -2 H- 哌喃 -2- 基 )-1,9- 二氫 -4 H- 苯并 [ f] 吲唑 -4- 酮

在-5℃下，歷時5分鐘將氯化異丙基鎂•氯化鋰(67.7 mL，88 mmol，1.3M含在THF中)滴加至經攪拌之5-(2-溴-4-氟苄基)- N-甲氧基- N-甲基-1-(四氫-2 H-哌喃-2-基)-1 H-吡唑-4-甲醯胺(7.5 g，17.59 mmol)含在THF (225 mL)中之溶液。在添加完成後，將該反應在0℃下在N ₂下攪拌3小時。將該反應混合物倒入至飽和NH ₄Cl水溶液(50 mL)中，且以EtOAc (300 mL x 2)萃取該混合物。用鹽水洗滌已合併的有機層，經無水Na ₂SO ₄乾燥，過濾且在真空中濃縮。殘餘物藉由急驟矽膠層析(ISCO ^®，120 g Agela Flash Column，石油醚/EtOAc = 2/1)純化以得到6-氟-1-(四氫-2 H-哌喃-2-基)-1,9-二氫-4 H-苯并[ f]吲唑-4-酮。MS (ESI)： m/z(M+H) ⁺287。

步驟 E ： 6- 氟 -1-( 四氫 -2 H- 哌喃 -2- 基 )-5-(( 三異丙基矽基 ) 乙炔基 )-1,9- 二氫 -4 H- 苯并 [ f] 吲唑 -4- 酮

在25℃下，在N ₂氣氛下，將(溴乙炔基)三異丙基矽烷(5.43 g，20.8 mmol)、乙酸鉀(2.35 g，23.9 mmol)及二氯(對異丙基甲苯( p-cymene))釕(II)二聚物(3.18 g，5.20 mmol)添加至6-氟-1-(四氫-2 H-哌喃-2-基)-1,9-二氫-4 H-苯并[ f]吲唑-4-酮(3.5 g，10.4 mmol)含在二噁烷(50 mL)中之溶液。將該混合物在100℃下攪拌2小時。使該混合物冷卻，用EtOAc (50 mL)稀釋，且用鹽水(5 mL x 2)洗滌所得混合物。該有機層經無水Na ₂SO ₄乾燥，過濾且在真空中濃縮。殘餘物藉由急驟矽膠層析(ISCO ^®；40 g SepaFlash ^®Silica Flash Column，20%乙酸乙酯含在石油醚梯度中之溶離劑，25 mL/min)純化以得到6-氟-1-(四氫-2 H-哌喃-2-基)-5-((三異丙基矽基)乙炔基)-1,9-二氫-4 H-苯并[ f]吲唑-4-酮。MS (ESI)： m/z(M+H) ⁺467。

步驟 F ：三氟甲磺酸 6- 氟 -1-(( 三氟甲基 ) 磺醯基 )-5-(( 三異丙基矽基 ) 乙炔基 )-1 H- 苯并 [ f] 吲唑 -4- 基酯

在-40℃下，將Tf ₂O (2.05 mL，12.2 mmol)添加至6-氟-1-(四氫-2 H-哌喃-2-基)-5-((三異丙基矽基)乙炔基)-1,9-二氫-4 H-苯并[ f]吲唑-4-酮(2.7 g，4.05 mmol)及DIEA (4.24 mL，24.3 mmol)含在DCM (20 mL)中之溶液，且將該反應混合物在-40℃下攪拌15分鐘。在真空中在30℃下濃縮該反應混合物，且殘餘物藉由急驟矽膠層析(ISCO ^®，40 g Agela Flash Column，石油醚/EtOAc = 20/1)純化以得到三氟甲磺酸6-氟-1-((三氟甲基)磺醯基)-5-((三異丙基矽基)乙炔基)-1 H-苯并[ f]吲唑-4-基酯。 ¹H NMR (400MHz, CDCl ₃) δ 8.63 (s, 1H), 8.42 (s, 1H), 7.96 (dd, J= 9.3, 5.4 Hz, 1H), 7.51-7.41 (m, 1H), 1.17-1.06 (m, 21H)。

步驟 G ： (6- 氟 -1-(( 三氟甲基 ) 磺醯基 )-5-(( 三異丙基矽基 ) 乙炔基 )-1 H- 苯并 [ f] 吲唑 -4- 基 ) 硼酸( Int-6)

在25℃下，將四羥基二硼(213 mg，2.38 mmol)、氯[(二(1-金剛烷基)- N-丁基膦)-2-(2-胺基聯苯基)]鈀(II) (22.8 mg，0.034 mmol)及三乙胺(103 mg，1.02 mmol)添加至三氟甲磺酸6-氟-1-((三氟甲基)磺醯基)-5-((三異丙基矽基)乙炔基)-1 H-苯并[ f]吲唑-4-基酯(220 mg，0.340 mmol)含在MeOH (2.5 mL)及THF (2.5 mL)中之溶液，且將該混合物在50℃下在N ₂氣氛下攪拌2小時。該反應混合物藉由製備型TLC板(SiO ₂，石油醚/EtOAc = 10/1)純化以得到(6-氟-1-((三氟甲基)磺醯基)-5-((三異丙基矽基)乙炔基)-1 H-苯并[ f]吲唑-4-基)硼酸( Int-6)。MS (ESI)： m/z(M+H) ⁺543。

中間物 7 ： ((2 R,7a S)-2- 氟四氫 -1 H- 吡咯嗪 -7a(5 H)- 基 ) 甲醇( Int-7)

步驟 A ： 2,5- 二側氧基四氫 -1 H- 吡咯嗪 -7a(5 H)- 甲酸乙酯

在-70℃下，將臭氧(239 mmol) (0.5至1 m ³/h)鼓泡至2-亞甲基-5-側氧基四氫-1 H-吡咯嗪-7a(5 H)-甲酸乙酯( Int-3之步驟A) (160 g，765 mmol)含在DCM (1.60 L)及MeOH (160 mL)中之溶液中9小時。將氮氣鼓泡通過該反應混合物以淨化過量臭氧。然後，在-70℃下，將二甲硫(76.0 g，1.22 mol)添加至該混合物。將該反應混合物在20℃下攪拌14小時。在減壓下濃縮該反應混合物以得到殘餘物。粗製殘餘物藉由矽膠管柱層析(溶離劑：石油醚：乙酸乙酯 = 50:1至1:1)純化以得到2,5-二側氧基四氫-1 H-吡咯嗪-7a(5 H)-甲酸乙酯。MS (ESI)： m/z(M+H) ⁺212。

步驟 B ： 2- 羥基 -5- 側氧基四氫 -1 H- 吡咯嗪 -7a(5 H)- 甲酸乙酯

在0℃下，在N ₂下，將NaBH ₄(10.8 g，284 mmol)添加至2,5-二側氧基四氫-1 H-吡咯嗪-7a(5 H)-甲酸乙酯(200 g，947 mmol)含在EtOH (2.00 L)中之溶液。將該反應混合物在0℃下攪拌10分鐘。在5℃下，藉由添加飽和NH ₄Cl (50.0 mL)淬滅該反應混合物，且將該混合物在5℃下攪拌0.5小時。在減壓下濃縮該反應混合物。該粗製殘餘物藉由矽膠管柱層析(溶離劑：石油醚:乙酸乙酯 = 50:1至1:1)純化以得到2-羥基-5-側氧基四氫-1 H-吡咯嗪-7a(5 H)-甲酸乙酯。 ¹H NMR (400 MHz, CDCl ₃) δ4.70-4.54 (m, 1H), 4.31-4.16 (m, 2H), 3.93 (dd, J= 13, 6 Hz, 1H), 3.09 (d, J= 13 Hz, 1H), 2.90-2.75 (m, 1H), 2.63-2.39 (m, 4H), 2.13-2.01 (m, 1H), 1.83 (dd, J= 14, 6 Hz, 1H), 1.29 (t, J= 7 Hz, 3H)。

步驟 C ： (2 R,7a S)-2- 氟 -5- 側氧基四氫 -1 H- 吡咯嗪 -7a(5 H)- 甲酸乙酯

在-70℃下，在N ₂下，將DAST (113 g，703 mmol，93 mL)滴加至2-羥基-5-側氧基四氫-1 H-吡咯嗪-7a(5 H)-甲酸乙酯(100 g，468 mmol)含在DCM (1 L)中之溶液。使該反應混合物升溫至20℃且攪拌16小時。在10℃下，藉由添加EtOH (50.0 mL)淬滅該反應，且然後用水(300 mL)稀釋且以DCM (200 mL x 2)萃取。用鹽水(200 mL)洗滌已合併的有機層，經無水Na ₂SO ₄乾燥，過濾，且在減壓下濃縮。將來自於六個相同反應之粗製產物合併且藉由矽膠管柱層析(石油醚:乙酸乙酯 = 50:1至1:1)純化。此物質藉由製備型HPLC (C18，0至100% MeCN/水與0.05% HCl)進一步純化。該外消旋混合物使用對掌性SFC (Daicel Chiralpak AS (50 mm x 250 mm，10 um)、EtOH與0.1% NH ₄OH)解析，以得到(2 R,7a S)-2-氟-5-側氧基四氫-1 H-吡咯嗪-7a(5 H)-甲酸乙酯(峰2)。 ¹H NMR (400 MHz, CDCl ₃): δ 5.43-5.16 (m, 1H), 4.27-4.14 (m, 3H), 3.26-3.06 (m, 1H), 2.85-2.57 (m, 3H), 2.50-2.38 (m, 1H), 2.30-2.07 (m, 2H), 1.28 (t, J= 7 Hz, 3H)。

步驟 D ： ((2 R,7a S)-2- 氟四氫 -1 H- 吡咯嗪 -7a(5 H)- 基 ) 甲醇 (Int-7)

在0℃下，在氮氣下，將含在THF (520 mL)中之LiAlH ₄(21.7 g，571 mmol)之混合物添加至(2 R,7a S)-2-氟-5-側氧基四氫-1 H-吡咯嗪-7a(5 H)-甲酸乙酯(82.0 g，381 mmol)含在THF (300 mL)中之溶液。使該反應混合物升溫至70℃且攪拌3小時。使該反應混合物冷卻至0℃且藉由在0℃下在氮氣下添加Na ₂SO ₄·10H ₂O淬滅。將該反應混合物在20℃下攪拌0.5小時且然後過濾。用EtOAc (600 mL x 5)洗滌濾餅，且經無水Mg ₂SO ₄乾燥該濾液。過濾該混合物且在減壓下濃縮該濾液以得到殘餘物。粗製殘餘物藉由矽膠管柱層析(SiO ₂，DCM:甲醇 = 100:1至10:1)純化以得到((2 R,7a S)-2-氟四氫-1 H-吡咯嗪-7a(5 H)-基)甲醇( Int-7)。 ¹H NMR (400 MHz, CDCl ₃): δ 5.34-5.06 (m, 1H), 3.25 (s, 2H), 3.23-3.08 (m, 3H), 3.08-2.85 (m, 2H), 2.12-2.00 (m, 2H), 1.93-1.74 (m, 4H)。

中間物 8： (6- 氯 -5-(1- 氟環丙基 )-1-( 四氫 -2 H- 哌喃 -2- 基 )-1 H- 吲唑 -4- 基 ) 硼酸( Int-8)

步驟 A ： 1-(4- 溴 -6- 氯 -1-( 四氫 -2 H- 哌喃 -2- 基 )-1 H- 吲唑 -5- 基 ) 環丙 -1- 醇

在0℃下，在氮氣下，將氯化異丙基鎂•氯化鋰(0.100 g，0.686 mmol)添加至4-溴-6-氯-5-碘-1-(四氫-2 H-哌喃-2-基)-1 H-吲唑( Int-4之步驟F) (0.202 g，0.457 mmol)含在2-甲基-THF (880 µL)中之溶液。將該反應混合物在0℃下攪拌80分鐘(溶液A)。

在-78℃下，在氮氣下，將氯化甲基鎂(123 μL，0.368 mmol)添加至1-(苯基磺醯基)環丙-1-醇(80 mg，0.387 mmol)含在2-甲基-THF (880 mL)中之溶液。將溶液A添加至所得混合物且將所得混合物在-78℃下攪拌。4小時後，使該反應混合物升溫至rt且攪拌過夜。用水淬滅該反應且然後用乙酸乙酯稀釋。用飽和NH ₄Cl洗滌所得混合物且該有機層經Na ₂SO ₄乾燥。在減壓下移除該有機溶劑且殘餘物藉由急驟管柱層析(乙酸乙酯/己烷 = 20/80)純化以得到1-(4-溴-6-氯-1-(四氫-2 H-哌喃-2-基)-1 H-吲唑-5-基)環丙-1-醇。MS (ESI)： m/z(M+H) ⁺371。

步驟 B ： 4- 溴 -6- 氯 -5-(1- 氟環丙基 )-1-( 四氫 -2 H- 哌喃 -2- 基 )-1 H- 吲唑

在-78℃下，將DAST (90 μL，0.681 mmol)添加至1-(4-溴-6-氯-1-(四氫-2 H-哌喃-2-基)-1 H-吲唑-5-基)環丙-1-醇(112 mg，0.300 mmol)含在DCM (2.5 ml)中之溶液。將該反應混合物在-78℃下攪拌50分鐘且然後用飽和NaHCO ₃淬滅然後以DCM萃取所得混合物三次。用鹽水洗滌已合併的有機層，經MgSO ₄乾燥。在減壓下移除該有機溶劑且殘餘物藉由急驟管柱層析(乙酸乙酯含在己烷中，0至40%)純化以得到4-溴-6-氯-5-(1-氟環丙基)-1-(四氫-2 H-哌喃-2-基)-1 H-吲唑。MS (ESI)： m/z(M+H) ⁺373。

步驟 C ： (6- 氯 -5-(1- 氟環丙基 )-1-( 四氫 -2 H- 哌喃 -2- 基 )-1 H- 吲唑 -4- 基 ) 硼酸( Int-8)

在rt下，在氮氣下，將四羥基二硼(9.04 g)、cataCXium A Pd G2 (2.25 g)及三乙胺(37.2 ml)添加至4-溴-6-氯-5-(1-氟環丙基)-1-(四氫-2 H-哌喃-2-基)-1 H-吲唑(25.1 g，67.3 mmol)含在甲醇(220 ml)中之溶液。將所得混合物加熱至40℃且攪拌3小時。將該反應混合物冷卻至r.t.，然後過濾固體且用甲醇洗滌該濾餅。在減壓下濃縮該濾液且用乙酸乙酯稀釋殘餘物然後用飽和NH ₄Cl、水及鹽水洗滌。該有機層經Na ₂SO ₄乾燥且在減壓下移除有機溶劑。將殘餘物自乙酸乙酯含在己烷中(10%)結晶以產生(6-氯-5-(1-氟環丙基)-1-(四氫-2 H-哌喃-2-基)-1 H-吲唑-4-基)硼酸( Int-8)。MS (ESI)： m/z(M+H) ⁺339。

中間物 9： (5- 乙基 -6- 氟 -1-(( 三氟甲基 ) 磺醯基 )-1 H- 苯并 [ f] 吲唑 -4- 基 ) 硼酸( Int-9)

步驟 A ： 2-(2- 溴 -4- 氟苯基 )-1,3- 二氧雜環戊烷

將乙-1,2-二醇(47.6 g，767 mmol)及4-甲基苯磺酸(1.65 g，9.59 mmol)添加至2-溴-4-氟苯甲醛(38.9 g，192 mmol)含在甲苯(400 mL)中之溶液，且利用移除水之迪恩-斯達克(Dean-Stark)分離器而使該反應混合物回流16小時。用固體Na ₂CO ₃(2當量)鹼化該混合物，攪拌5分鐘，過濾且在減壓下蒸發該溶劑以得到粗製產物，其藉由急驟矽膠層析(ISCO ^®；220 g SepaFlash ^®Silica Flash Column，3%乙酸乙酯含在石油醚梯度中之溶離劑，80 mL/min)純化以得到2-(2-溴-4-氟苯基)-1,3-二氧雜環戊烷。MS (ESI)： m/z(M+H) ⁺247、249。

步驟 B ： 2-(2- 溴 -3- 乙基 -4- 氟苯基 )-1,3- 二氧雜環戊烷

在-40℃下，在N ₂氣氛下，將二異丙基醯胺鋰(89 mL，178 mmol，2M含在THF中)滴加至2-(2-溴-4-氟苯基)-1,3-二氧雜環戊烷(22 g，89 mmol)及碘乙烷(139 g，890 mmol)含在THF (200 mL)中之溶液。然後，將該混合物在-40℃下攪拌20分鐘。將該混合物倒入至飽和NH ₄Cl (100 mL)中且以EtOAc (100 mL x 2)萃取。用鹽水(100 mL)洗滌已合併的有機層，經無水Na ₂SO ₄乾燥，過濾且在減壓下濃縮以得到2-(2-溴-3-乙基-4-氟苯基)-1,3-二氧雜環戊烷。該產物無需進一步純化即可直接用於下一步驟中。MS (ESI)： m/z(M+H) ⁺275、277。

步驟 C ： 2- 溴 -3- 乙基 -4- 氟苯甲醛

將aq. HCl (2M，100 mL)添加至2-(2-溴-3-乙基-4-氟苯基)-1,3-二氧雜環戊烷(24.5 g，89 mmol)含在THF (200 mL)中之溶液，且將該反應混合物在25℃下攪拌2小時。在減壓下濃縮該反應混合物。用EtOAc (200 mL)稀釋殘餘物，用飽和NaHCO ₃(60 mL)及鹽水(60 mL)洗滌，且該有機層經無水Na ₂SO ₄乾燥，過濾且在減壓下濃縮。該粗製物藉由急驟矽膠層析(ISCO ^®；120 g SepaFlash ^®Silica Flash Column，5% EtOAc /石油醚梯度之溶離劑，80 mL/min)純化以得到2-溴-3-乙基-4-氟苯甲醛。MS (ESI)： m/z(M+H) ⁺231、233。

步驟 D ： 5-((2- 溴 -3- 乙基 -4- 氟苯基 )( 羥基 ) 甲基 )- N- 甲氧基 - N- 甲基 -1-((2-( 三甲基矽基 ) 乙氧基 ) 甲基 )-1 H- 吡唑 -4- 甲醯胺

在-78℃下，在N ₂下，將二異丙基醯胺鋰(15.8 mL，31.5 mmol，2M含在THF中)添加至經攪拌之 N-甲氧基- N-甲基-1-((2-(三甲基矽基)乙氧基)甲基)-1 H-吡唑-4-甲醯胺( Int-5) (3.00 g，10.5 mmol)含在THF (30 mL)中之溶液，且將該反應混合物-78℃下在N ₂下攪拌30分鐘。然後，在-78℃下添加2-溴-3-乙基-4-氟苯甲醛(2.43 g，10.5 mmol)含在THF (10 mL)中之溶液，且將該反應在-78℃下在N ₂下攪拌30分鐘。將所得混合物倒入至sat. aq. NH ₄Cl (40 mL)中且以EtOAc (50 mL x 2)萃取。用鹽水(20 mL)洗滌已合併的有機層，經Na ₂SO ₄乾燥，過濾且在減壓下濃縮。殘餘物藉由急驟矽膠層析(ISCO ^®；Agela ^®Flash Column Silica-CS(40 g)，0至36%乙酸乙酯/石油醚梯度之溶離劑，40 mL/min)純化以得到5-((2-溴-3-乙基-4-氟苯基)(羥基)甲基)- N-甲氧基- N-甲基-1-((2-(三甲基矽基)乙氧基)甲基)-1 H-吡唑-4-甲醯胺。MS (ESI)： m/z(M+Na) ⁺538、540。

步驟 E ： 5-(2- 溴 -3- 乙基 -4- 氟苄基 )- N- 甲氧基 - N- 甲基 -1 H- 吡唑 -4- 甲醯胺

將三乙基矽烷(30 mL，188 mmol)及TFA (15 mL)添加至經攪拌之5-((2-溴-3-乙基-4-氟苯基)(羥基)甲基)- N-甲氧基- N-甲基-1-((2-(三甲基矽基)乙氧基)甲基)-1 H-吡唑-4-甲醯胺(6.30 g，12.2 mmol)含在DCM (15 mL)中之溶液，且將該反應在50℃下攪拌16小時。在減壓下濃縮該反應，且用EtOAc (30 mL)稀釋殘餘物，然後倒入至sat. aq. NaHCO ₃(40 mL)中。將該混合物分離，且以EtOAc (50 mL x 2)萃取水層。用鹽水(20 mL)洗滌已合併的有機層，經Na ₂SO ₄乾燥，過濾且在減壓下濃縮該濾液。殘餘物藉由急驟矽膠層析(ISCO ^®；Agela ^®Flash Column Silica-CS (40 g)，0至100%乙酸乙酯/石油醚梯度之溶離劑，40 mL/min)純化以得到5-(2-溴-3-乙基-4-氟苄基)- N-甲氧基- N-甲基-1 H-吡唑-4-甲醯胺。MS (ESI)： m/z(M+H) ⁺370、372。

步驟 F ： 5- 乙基 -6- 氟 -1,9- 二氫 -4 H- 苯并 [ f] 吲唑 -4- 酮

在-78℃下，在N ₂氣氛下，將正丁基鋰(3.48 mL，8.70 mmol，2.5M含在己烷中)滴加至5-(2-溴-3-乙基-4-氟苄基)- N-甲氧基- N-甲基-1 H-吡唑-4-甲醯胺(1.40 g，3.78 mmol)及HMPA (0.724 mL，4.16 mmol)含在Me-THF (40 mL)中之溶液。將該反應混合物在-78℃下攪拌30分鐘。將該反應混合物倒入至飽和NH ₄Cl及L-抗壞血酸(aq.，20 mL)之混合物中。有機層經Na ₂SO ₄乾燥，過濾且在減壓下濃縮該濾液。用DCM (5 mL)稀釋殘餘物且形成沉澱。藉由過濾收集固體以得到5-乙基-6-氟-1,9-二氫-4 H-苯并[ f]吲唑-4-酮。MS (ESI)： m/z(M+H) ⁺231。

步驟 G ：三氟甲磺酸 5- 乙基 -6- 氟 -1-(( 三氟甲基 ) 磺醯基 )-1 H- 苯并 [ f] 吲唑 -4- 基酯

在-40℃下，將DIEA (4.55 mL，26.1 mmol)添加至5-乙基-6-氟-1,9-二氫-4 H-苯并[ f]吲唑-4-酮(600 mg，2.61 mmol)及L-抗壞血酸(92 mg，0.521 mmol)含在DCM (10 mL)中之溶液且將該混合物在-40℃下攪拌10分鐘。將Tf ₂O (4.40 mL，26.1 mmol)添加至該混合物，且將該反應混合物在-40℃下在N ₂氣氛下攪拌1小時。用DCM (20 mL)稀釋該反應混合物，用水(10 mL)及鹽水(10 mL)洗滌。該有機層經Na ₂SO ₄乾燥，過濾，且在減壓下濃縮濾液。殘餘物藉由急驟矽膠層析(ISCO ^®；12 g SepaFlash ^®Silica Flash Column，2% EtOAc /石油醚梯度之溶離劑，20 mL/min)純化以得到三氟甲磺酸5-乙基-6-氟-1-((三氟甲基)磺醯基)-1 H-苯并[ f]吲唑-4-基酯。 ¹H NMR (400 MHz, CDCl ₃) δ 8.61 (s, 1H), 8.44 (s, 1H), 7.89 (dd, J= 9.2, 5.6 Hz, 1H), 7.44 (dd, J= 9.2, 9.2 Hz, 1H), 3.35-3.29 (m, 2H), 1.14 (t, J= 7.6 Hz, 3H)。

步驟 H ： (5- 乙基 -6- 氟 -1-(( 三氟甲基 ) 磺醯基 )-1 H- 苯并 [ f] 吲唑 -4- 基 ) 硼酸 (Int-9)在25℃下，將TEA (0.042 mL，0.303 mmol)添加至三氟甲磺酸5-乙基-6-氟-1-((三氟甲基)磺醯基)-1 H-苯并[ f]吲唑-4-基酯(50 mg，0.101 mmol)、四羥基二硼(63.5 mg，0.708 mmol)及cataCXium A Pd G2 (6.76 mg，10.1 µmol)含在MeOH (1.5 mL)及THF (1.5 mL)中之溶液，且將該混合物在60℃下在N ₂氣氛下攪拌1小時。該反應混合物藉由製備型TLC板(SiO ₂，石油醚/EtOAc = 3/1)純化以得到(5-乙基-6-氟-1-((三氟甲基)磺醯基)-1 H-苯并[ f]吲唑-4-基)硼酸( Int-9)。 ¹H NMR (400 MHz, CDCl ₃) δ 8.59 (s, 1H), 8.41 (s, 1H), 7.92 (dd, J= 9.2, 5.6 Hz, 1H), 7.45 (dd, J= 9.2, 9.2 Hz, 1H), 3.28-3.22 (m, 2H), 1.33 (t, J= 7.6 Hz, 3H)。 實例合成：

實例 1 ： (8a S)-5-(6- 氯 -5- 環丙基 -1 H- 吲唑 -4- 基 )-4- 氟 -2-((( S, Z)-2-( 氟亞甲基 ) 四氫 -1 H- 吡咯嗪 -7a(5 H)- 基 ) 甲氧基 )-8a,9,12,13- 四氫 -8 H,11 H-7,10- 二氧雜 -1,3,6,13a- 四氮雜萘并 [ 1,8- ab] 庚烯( Ex-1)

步驟 A ： (8a S)-5-(6- 氯 -5- 環丙基 -1-( 四氫 -2 H- 哌喃 -2- 基 )-1 H- 吲唑 -4- 基 )-4- 氟 -2-( 甲硫基 )-8a,9,12,13- 四氫 -8 H,11 H-7,10- 二氧雜 -1,3,6,13a- 四氮雜萘并 [1,8- ab] 庚烯

在25℃下，在N ₂氣氛下，將(6-氯-5-環丙基-1-(四氫-2 H-哌喃-2-基)-1 H-吲唑-4-基)硼酸( Int-4，270 mg，0.841 mmol)、K ₂CO ₃(1.40 mL，2.80 mmol，2 M含在水中)及甲磺酸(2-二環己基膦基-2',6'-二甲氧基聯苯基)[2-(2'-胺基-1,1'-聯苯基)]鈀(II) (219 mg，0.280 mmol)添加至( S)-5-氯-4-氟-2-(甲硫基)-8a,9,12,13-四氫-8 H,11 H-7,10-二氧雜-1,3,6,13a-四氮雜萘并[1,8- ab]庚烯( Int-2，200 mg，0.561 mmol)含在甲苯(5 mL)中之溶液，且在40℃下攪拌該反應混合物16小時。所得混合物經冷卻，用EtOAc (50 mL)稀釋，用H ₂O (10 mL)洗滌。該有機層經Na ₂SO ₄乾燥，過濾且在減壓下蒸發該溶劑以得到粗製產物。該粗製產物藉由急驟矽膠層析(ISCO ^®；12 g SepaFlash ^®Silica Flash Column，30%乙酸乙酯含於石油醚梯度中之溶離劑，30 mL/min)純化以得到(8a S)-5-(6-氯-5-環丙基-1-(四氫-2 H-哌喃-2-基)-1 H-吲唑-4-基)-4-氟-2-(甲硫基)-8a,9,12,13-四氫-8 H,11 H-7,10-二氧雜-1,3,6,13a-四氮雜萘并[1,8- ab]庚烯。MS (ESI)： m/z(M+H) ⁺597。

步驟 B ： (8a S)-5-(6- 氯 -5- 環丙基 -1-( 四氫 -2 H- 哌喃 -2- 基 )-1 H- 吲唑 -4- 基 )-4- 氟 -2-( 甲基磺醯基 )-8a,9,12,13- 四氫 -8 H,11 H-7,10- 二氧雜 -1,3,6,13a- 四氮雜萘并 [1,8- ab] 庚烯

在25℃下，將 m-CPBA (494 mg，2.43 mmol，85%)添加至(8a S)-5-(6-氯-5-環丙基-1-(四氫-2 H-哌喃-2-基)-1 H-吲唑-4-基)-4-氟-2-(甲硫基)-8a,9,12,13-四氫-8 H,11 H-7,10-二氧雜-1,3,6,13a-四氮雜萘并[1,8- ab]庚烯(660 mg，1.11 mmol)含在DCM (7 mL)中之溶液。將該混合物在25℃下攪拌1小時。用DCM (120 mL)稀釋該混合物，用飽和NaHCO ₃溶液(30 mL)洗滌，經Na ₂SO ₄乾燥，過濾且在減壓下蒸發該溶劑以得到粗製產物。該粗製產物藉由急驟矽膠層析(ISCO ^®；12 g SepaFlash ^®Silica Flash Column，70%乙酸乙酯含在石油醚梯度中之溶離劑，30 mL/min)純化以得到(8a S)-5-(6-氯-5-環丙基-1-(四氫-2 H-哌喃-2-基)-1 H-吲唑-4-基)-4-氟-2-(甲基磺醯基)-8a,9,12,13-四氫-8 H,11 H-7,10-二氧雜-1,3,6,13a-四氮雜萘并[1,8- ab]庚烯。MS (ESI)： m/z(M+H) ⁺629。

步驟 C ： (8a S)-5-(6- 氯 -5- 環丙基 -1-( 四氫 -2 H- 哌喃 -2- 基 )-1 H- 吲唑 -4- 基 )-4- 氟 -2-((( S, Z)-2-( 氟亞甲基 ) 四氫 -1 H- 吡咯嗪 -7a(5 H)- 基 ) 甲氧基 )-8a,9,12,13- 四氫 -8 H,11 H-7,10- 二氧雜 -1,3,6,13a- 四氮雜萘并 [1,8- ab] 庚烯

在25℃下，將氫化鈉(30.5 mg，0.763 mmol，60重量%)添加至(8a S)-5-(6-氯-5-環丙基-1-(四氫-2 H-哌喃-2-基)-1 H-吲唑-4-基)-4-氟-2-(甲基磺醯基)-8a,9,12,13-四氫-8 H,11 H-7,10-二氧雜-1,3,6,13a-四氮雜萘并[1,8- ab]庚烯(80 mg，0.127 mmol)及( S, Z)-(2-(氟亞甲基)四氫-1 H-吡咯嗪-7a(5 H)-基)甲醇( Int-3，HCl鹽) (31.7 mg，0.153 mmol)含在DMF (1 mL)中之溶液。將該混合物在25℃下攪拌1小時。用飽和NH ₄Cl溶液(4 mL)淬滅該反應且然後用EtOAc (20 mL)稀釋所得混合物。用水(3 x 4 mL)洗滌該有機相，經Na ₂SO ₄乾燥，過濾且在減壓下蒸發該溶劑以得到殘餘物。殘餘物藉由製備型TLC (SiO ₂，DCM:MeOH = 10:1)純化以得到(8a S)-5-(6-氯-5-環丙基-1-(四氫-2 H-哌喃-2-基)-1 H-吲唑-4-基)-4-氟-2-((( S, Z)-2-(氟亞甲基)四氫-1 H-吡咯嗪-7a(5 H)-基)甲氧基)-8a,9,12,13-四氫-8 H,11 H-7,10-二氧雜-1,3,6,13a-四氮雜萘并[1,8- ab]庚烯。MS (ESI)： m/z(M+H) ⁺720。

步驟 D ： (8a S)-5-(6- 氯 -5- 環丙基 -1 H- 吲唑 -4- 基 )-4- 氟 -2-((( S, Z)-2-( 氟亞甲基 ) 四氫 -1 H- 吡咯嗪 -7a(5 H)- 基 ) 甲氧基 )-8a,9,12,13- 四氫 -8 H,11 H-7,10- 二氧雜 -1,3,6,13a- 四氮雜萘并 [1,8- ab] 庚烯( Ex-1)

在25℃下，將HCl (2 mL，4.00 mmol，2M含在二噁烷中)添加至(8a S)-5-(6-氯-5-環丙基-1-(四氫-2 H-哌喃-2-基)-1 H-吲唑-4-基)-4-氟-2-((( S, Z)-2-(氟亞甲基)四氫-1 H-吡咯嗪-7a(5 H)-基)甲氧基)-8a,9,12,13-四氫-8 H,11 H-7,10-二氧雜-1,3,6,13a-四氮雜萘并[1,8- ab]庚烯(67 mg，0.093 mmol)含在IPA (0.5 mL)中之溶液。將該混合物在25℃下攪拌15小時。在減壓下蒸發該溶劑。將殘餘物溶解於MeCN (1 mL)中且用經稀釋之NH ₃·H ₂O (1M含在MeCN中)鹼化至pH 7。所得混合物藉由逆相製備型HPLC (管柱：Boston Prime C18 150 x 30 mm x 5 μm；條件：水(0.05% NH ₃·H ₂O + 10 mM NH ₄HCO ₃)-ACN；開始B至結束B：44-74；梯度時間(min)：10；100% B保持時間(min)：2；流速(mL/min)：25)純化以得到(8a S)-5-(6-氯-5-環丙基-1 H-吲唑-4-基)-4-氟-2-((( S, Z)-2-(氟亞甲基)四氫-1 H-吡咯嗪-7a(5 H)-基)甲氧基)-8a,9,12,13-四氫-8 H,11 H-7,10-二氧雜-1,3,6,13a-四氮雜萘并[1,8- ab]庚烯。MS (ESI)： m/z(M+H) ⁺636。 ¹H NMR (400 MHz, MeOD) δ 7.96-7.79 (m, 1H), 7.75 (s, 1H), 6.85-6.38 (m, 1H), 5.30-5.16 (m, 1H), 4.76 (d, J= 10.3 Hz, 1H), 4.66-4.57 (m, 1H), 4.45-4.26 (m, 3H), 4.26-4.15 (m, 1H), 4.06-3.94 (m, 1H), 3.93-3.73 (m, 2H), 3.65-3.55 (m, 1H), 3.48 (d, J= 14.7 Hz, 2H), 3.23-3.05 (m, 1H), 2.85-2.58 (m, 2H), 2.46 (d, J= 15.1 Hz, 1H), 2.29-1.82 (m, 7H), 0.91 (dd, J= 14.6, 4.7 Hz, 1H), 0.70 (s, 1H), 0.35-0.09 (m, 2H)。

實例 2 ： (8a S)-5-(5- 乙基 -6- 氟 -1 H- 苯并 [ f] 吲唑 -4- 基 )-4- 氟 -2-(((2 R,7a S)-2- 氟四氫 -1 H- 吡咯嗪 -7a(5 H)- 基 ) 甲氧基 )-8a,9,12,13- 四氫 -8 H,11 H-7,10- 二氧雜 -1,3,6,13a- 四氮雜萘并 [ 1,8- ab] 庚烯( Ex-2)

步驟 A ： ( S)-5- 氯 -4- 氟 -2-( 甲基磺醯基 )-8a,9,12,13- 四氫 -8 H,11 H-7,10- 二氧雜 -1,3,6,13a- 四氮雜萘并 [1,8- ab] 庚烯

在25℃下，將 m-CPBA (501 mg，2.47 mmol，85重量%)添加至( S)-5-氯-4-氟-2-(甲硫基)-8a,9,12,13-四氫-8 H,11 H-7,10-二氧雜-1,3,6,13a-四氮雜萘并[1,8- ab]庚烯( Int-2，400 mg，1.12 mmol)含在CH ₂Cl ₂(5 mL)中之溶液。將該混合物在25℃下攪拌1小時。用DCM (80 mL)稀釋該混合物，用飽和NaHCO ₃溶液(20 mL)洗滌，經Na ₂SO ₄乾燥，過濾且在減壓下蒸發該溶劑以得到粗製產物。該粗製產物藉由急驟矽膠層析(ISCO ^®；4 g SepaFlash ^®Silica Flash Column，15%乙酸乙酯含在石油醚梯度中之溶離劑，30 mL/min)純化以得到( S)-5-氯-4-氟-2-(甲基磺醯基)-8a,9,12,13-四氫-8 H,11 H-7,10-二氧雜-1,3,6,13a-四氮雜萘并[1,8- ab]庚烯。MS (ESI)： m/z(M+H) ⁺389。

步驟 B ： ( S)-5- 氯 -4- 氟 -2-(((2 R,7a S)-2- 氟四氫 -1 H- 吡咯嗪 -7a(5 H)- 基 ) 甲氧基 )-8a,9,12,13- 四氫 -8 H,11 H-7,10- 二氧雜 -1,3,6,13a- 四氮雜萘并 [1,8- ab] 庚烯

在25℃下，將NaH (149 mg，3.73 mmol，60重量%)添加至( S)-5-氯-4-氟-2-(甲基磺醯基)-8a,9,12,13-四氫-8 H,11 H-7,10-二氧雜-1,3,6,13a-四氮雜萘并[1,8- ab]庚烯(290 mg，0.746 mmol)及((2 R,7a S)-2-氟四氫-1 H-吡咯嗪-7a(5 H)-基)甲醇( Int-7) (594 mg，3.73 mmol)含在THF (3 mL)中之溶液。將該混合物在25℃下攪拌1小時。用飽和NH ₄Cl溶液(8 mL)淬滅該反應，以EtOAc (2 x 15 mL)萃取，經Na ₂SO ₄乾燥，過濾且在減壓下蒸發該溶劑以得到粗製產物。該粗製產物藉由急驟矽膠層析(ISCO ^®；4 g SepaFlash ^®Silica Flash Column，5% MeOH含在DCM梯度中之溶離劑，30 mL/min)純化以得到( S)-5-氯-4-氟-2-(((2 R,7a S)-2-氟四氫-1 H-吡咯嗪-7a(5 H)-基)甲氧基)-8a,9,12,13-四氫-8 H,11 H-7,10-二氧雜-1,3,6,13a-四氮雜萘并[1,8- ab]庚烯。MS (ESI)： m/z(M+H) ⁺468。

步驟 C ： (8a S)-4- 氟 -5-(6- 氟 -1-(( 三氟甲基 ) 磺醯基 )-5-(( 三異丙基矽基 ) 乙炔基 )-1 H- 苯并 [ f] 吲唑 -4- 基 )-2-(((2 R,7a S)-2- 氟四氫 -1 H- 吡咯嗪 -7a(5 H)- 基 ) 甲氧基 )-8a,9,12,13- 四氫 -8 H,11 H-7,10- 二氧雜 -1,3,6,13a- 四氮雜萘并 [1,8- ab] 庚烯

在25℃下，在N ₂氣氛下，將(6-氟-1-((三氟甲基)磺醯基)-5-((三異丙基矽基)乙炔基)-1 H-苯并[ f]吲唑-4-基)硼酸( Int-6，160 mg，0.295 mmol)、K ₂CO ₃(0.614 mL，1.23 mmol，2M含在水中)及甲磺酸(2-二環己基膦基-2',6'-二甲氧基聯苯基)[2-(2'-胺基-1,1'-聯苯基)]鈀(II) (96 mg，0.123 mmol)添加至( S)-5-氯-4-氟-2-(((2 R,7a S)-2-氟四氫-1 H-吡咯嗪-7a(5 H)-基)甲氧基)-8a,9,12,13-四氫-8 H,11 H-7,10-二氧雜-1,3,6,13a-四氮雜萘并[1,8- ab]庚烯(115 mg，0.246 mmol)含在甲苯(1.5 mL)中之溶液。將該混合物在40℃下攪拌16小時。使該混合物冷卻，用EtOAc (20 mL)稀釋，用H ₂O (5 mL)洗滌，經Na ₂SO ₄乾燥，過濾且在減壓下蒸發該溶劑。殘餘物藉由製備型TLC (SiO ₂，DCM:MeOH = 10:1)純化以得到(8a S)-4-氟-5-(6-氟-1-((三氟甲基)磺醯基)-5-((三異丙基矽基)乙炔基)-1 H-苯并[ f]吲唑-4-基)-2-(((2 R,7a S)-2-氟四氫-1 H-吡咯嗪-7a(5 H)-基)甲氧基)-8a,9,12,13-四氫-8 H,11 H-7,10-二氧雜-1,3,6,13a-四氮雜萘并[1,8- ab]庚烯。MS (ESI)： m/z(M+H) ⁺930。

步驟 D ： (8a S)-4- 氟 -5-(6- 氟 -5-(( 三異丙基矽基 ) 乙炔基 )-1 H- 苯并 [ f] 吲唑 -4- 基 )-2-(((2 R,7a S)-2- 氟四氫 -1 H- 吡咯嗪 -7a(5 H)- 基 ) 甲氧基 )-8a,9,12,13- 四氫 -8 H,11 H-7,10- 二氧雜 -1,3,6,13a- 四氮雜萘并 [1,8- ab] 庚烯

在25℃下，將氨(4 mL，28.0 mmol，7M含在MeOH中)添加至(8a S)-4-氟-5-(6-氟-1-((三氟甲基)磺醯基)-5-((三異丙基矽基)乙炔基)-1 H-苯并[ f]吲唑-4-基)-2-(((2 R,7a S)-2-氟四氫-1 H-吡咯嗪-7a(5 H)-基)甲氧基)-8a,9,12,13-四氫-8 H,11 H-7,10-二氧雜-1,3,6,13a-四氮雜萘并[1,8- ab]庚烯(110 mg，0.118 mmol)含在DCM (2 mL)中之溶液。將該混合物在25℃下攪拌15小時。該反應混合物藉由製備型TLC (SiO ₂，DCM:MeOH = 10:1)直接純化以得到(8a S)-4-氟-5-(6-氟-5-((三異丙基矽基)乙炔基)-1 H-苯并[ f]吲唑-4-基)-2-(((2 R,7a S)-2-氟四氫-1 H-吡咯嗪-7a(5 H)-基)甲氧基)-8a,9,12,13-四氫-8 H,11 H-7,10-二氧雜-1,3,6,13a-四氮雜萘并[1,8- ab]庚烯。MS (ESI)： m/z(M+H) ⁺798。

步驟 E ： (8a S)-5-(5- 乙炔基 -6- 氟 -1 H- 苯并 [ f] 吲唑 -4- 基 )-4- 氟 -2-(((2 R,7a S)-2- 氟四氫 -1 H- 吡咯嗪 -7a(5 H)- 基 ) 甲氧基 )-8a,9,12,13- 四氫 -8 H,11 H-7,10- 二氧雜 -1,3,6,13a- 四氮雜萘并 [1,8- ab] 庚烯

在25℃下，將CsF (67 mg，0.441 mmol)添加至(8a S)-4-氟-5-(6-氟-5-((三異丙基矽基)乙炔基)-1 H-苯并[ f]吲唑-4-基)-2-(((2 R,7a S)-2-氟四氫-1 H-吡咯嗪-7a(5 H)-基)甲氧基)-8a,9,12,13-四氫-8 H,11 H-7,10-二氧雜-1,3,6,13a-四氮雜萘并[1,8- ab]庚烯(70 mg，0.088 mmol)含在DMF (1 mL)中之溶液。將該混合物在25℃下攪拌2小時。過濾該混合物且該溶液藉由逆相製備型HPLC (管柱：Phenomenex Gemini-NX 150 x 30 mm x 5 μm；條件：水(10 mM-NH ₄HCO ₃)-ACN；開始B-結束B：37-67；梯度時間(min)：11；100% B保持時間(min)：2.5；流速(mL/min)：25)直接純化以得到(8a S)-5-(5-乙炔基-6-氟-1 H-苯并[ f]吲唑-4-基)-4-氟-2-(((2 R,7a S)-2-氟四氫-1 H-吡咯嗪-7a(5 H)-基)甲氧基)-8a,9,12,13-四氫-8 H,11 H-7,10-二氧雜-1,3,6,13a-四氮雜萘并[1,8- ab]庚烯。MS (ESI)： m/z(M+H) ⁺642。 ¹H NMR (400 MHz, MeOD) δ 8.24 (s, 1H), 8.14 (dd, J= 9.3, 5.8 Hz, 1H), 8.08-7.93 (m, 1H), 7.38-7.33 (m, 1H), 5.39-5.16 (m, 2H), 4.71 (dd, J= 12.5, 3.8 Hz, 1H), 4.62-4.58 (m, 1H), 4.42-4.28 (m, 2H), 4.27-4.12 (m, 2H), 4.03-3.92 (m, 1H), 3.89-3.83 (m, 1H), 3.70-3.51 (m, 2H), 3.50-3.34 (m, 1H), 3.30-3.12 (m, 3H), 3.04-2.98 (m, 1H), 2.39-2.09 (m, 4H), 2.04-1.81 (m, 4H)。

步驟 F ： (8a S)-5-(5- 乙基 -6- 氟 -1 H- 苯并 [ f] 吲唑 -4- 基 )-4- 氟 -2-(((2 R,7a S)-2- 氟四氫 -1 H- 吡咯嗪 -7a(5 H)- 基 ) 甲氧基 )-8a,9,12,13- 四氫 -8 H,11 H-7,10- 二氧雜 -1,3,6,13a- 四氮雜萘并 [1,8- ab] 庚烯( Ex-2)

在25℃下，將氧化鉑(IV) (5 mg，0.022 mmol)添加至(8a S)-5-(5-乙炔基-6-氟-1 H-苯并[ f]吲唑-4-基)-4-氟-2-(((2 R,7a S)-2-氟四氫-1 H-吡咯嗪-7a(5 H)-基)甲氧基)-8a,9,12,13-四氫-8 H,11 H-7,10-二氧雜-1,3,6,13a-四氮雜萘并[1,8- ab]庚烯(20 mg，0.031 mmol)含在MeOH (10 mL)中之溶液。在25℃下，在H ₂氣氛(15 psi)下攪拌該混合物2小時。用MeOH (30 mL)稀釋該混合物，過濾且在減壓下蒸發該溶劑。殘餘物藉由逆相製備型HPLC (管柱：Boston Prime C18 150 x 30 mm x 5 μm；條件：水(0.05% NH ₃H ₂O+10 mM NH ₄HCO ₃)-ACN；開始B至結束B：42至72；梯度時間(min)：10；100%B保持時間(min)：2；流速(mL/min)：25)純化，以得到(8a S)-5-(5-乙基-6-氟-1 H-苯并[ f]吲唑-4-基)-4-氟-2-(((2 R,7a S)-2-氟四氫-1 H-吡咯嗪-7a(5 H)-基)甲氧基)-8a,9,12,13-四氫-8 H,11 H-7,10-二氧雜-1,3,6,13a-四氮雜萘并[1,8- ab]庚烯( Ex-2)。MS (ESI)： m/z(M+H) ⁺646。 ¹H NMR (400 MHz, MeOD) δ 8.21 (s, 1H), 7.99 (dd, J= 9.3, 6.0 Hz, 1H), 7.90-7.76 (m, 1H), 7.34-7.29 (m, 1H), 5.41-5.06 (m, 2H), 4.77-4.73 (m, 1H), 4.63 (dd, J= 13.3, 6.0 Hz, 2H), 4.38 (dd, J= 9.5, 5.2 Hz, 1H), 4.33-4.25 (m, 2H), 4.20 (dd, J= 12.4, 4.2 Hz, 1H), 4.04-4.00 (m, 1H), 3.93-3.75 (m, 1H), 3.67-3.58 (m, 1H), 3.49 (dd, J= 16.9, 10.5 Hz, 1H), 3.25-3.19 (m, 2H), 3.06-2.98 (m, 1H), 2.65-2.45 (m, 2H), 2.29-2.11 (m, 4H), 2.04-1.96 (m, 3H), 1.90 (s, 1H), 0.97-0.90 (m, 3H)。

下表中之實例使用如在 Ex-1及 Ex-2之合成中所述之類似程序藉由適宜取代起始物質、中間物及/或試劑來合成。此類起始物質、中間物及/或試劑可購買獲得、如在文獻中所述合成、使用熟習此項技術者可得之方法合成、或如本文中所述合成。

Ex.	結構	名稱	NMR	MS (ESI) [M+H] +
Ex-3		(8a S)-5-(6-氯-5-環丙基-1 H-吲唑-4-基)-4-氟-2-(((2 R,7a S)-2-氟四氫-1 H-吡咯嗪-7a(5 H)-基)甲氧基)-8a,9,12,13-四氫-8 H,11 H-7,10-二氧雜-1,3,6,13a-四氮雜萘并[1,8- ab]庚烯	1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6) δ 13.25-13.19 (m, 1H), 7.84-7.74 (m, 2H), 5.37-5.18 (m, 1H), 5.04-4.95 (m, 1H), 4.71-4.62 (m, 1H), 4.54 (dd, J= 12.9, 7.1 Hz, 1H), 4.38-4.27 (m, 1H), 4.18-4.00 (m, 3H), 3.93-3.85 (m, 1H), 3.78-3.56 (m, 1H), 3.52-3.34 (m, 2H), 3.13-2.98 (m, 3H), 2.87-2.78 (m, 1H), 2.19-1.71 (m, 9H), 0.84-0.76 (m, 1H), 0.67-0.57 (m, 1H), 0.23-0.00 (m, 2H)。	624
Ex-4		(8a S)-5-(5-乙基-6-氟-1 H-苯并[ f]吲唑-4-基)-4-氟-2-((( S, Z)-2-(氟亞甲基)四氫-1 H-吡咯嗪-7a(5 H)-基)甲氧基)-8a,9,12,13-四氫-8 H,11 H-7,10-二氧雜-1,3,6,13a-四氮雜萘并[1,8- ab]庚烯	1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 8.20 (s, 1H), 7.98 (dd, J= 9.3, 6.1 Hz, 1H), 7.83 (d, J= 27.6 Hz, 1H), 7.33-7.28 (m, 1H), 6.65 (d, J= 84.4 Hz, 1H), 5.29-5.19 (m, 1H), 4.77-4.72 (m, 1H), 4.63-4.60 (m, 2H), 4.41-4.26 (m, 3H), 4.19 (dd, J= 12.3, 4.2 Hz, 1H), 4.07-3.93 (m, 1H), 3.92-3.73 (m, 2H), 3.67-3.54 (m, 1H), 3.53-3.39 (m, 2H), 3.24-3.12 (m, 1H), 2.79-2.70 (m, 2H), 2.65-2.54 (m, 1H), 2.46 (br d, J= 15.6 Hz, 1H), 2.26-2.07 (m, 2H), 2.05-1.82 (m, 4H), 1.01-0.85 (m, 3H)。	658
Ex-5		(8a S)-5-(6-氯-5-(1-氟環丙基)-1 H-吲唑-4-基)-4-氟-2-((( S, Z)-2-(氟亞甲基)四氫-1 H-吡咯嗪-7a(5 H)-基)甲氧基)-8a,9,12,13-四氫-8 H,11 H-7,10-二氧雜-1,3,6,13a-四氮雜萘并[1,8- ab]庚烯	1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6) δ 13.48-13.42 (m, 1H), 7.89-7.83 (m, 2H), 6.86-6.64 (m, 1H), 5.02-4.95 (m, 1H), 4.70-4.63 (m, 1H), 4.57-4.51 (m, 1H), 4.38-4.27 (m, 1H), 4.15-4.03 (m, 3H), 3.93-3.85 (m, 1H), 3.76-3.56 (m, 2H), 3.52-3.35 (m, 2H), 3.30-3.24 (m, 1H), 3.03-2.95 (m, 1H), 2.60-2.52 (m, 2H), 2.35-2.28 (m, 1H), 2.06-1.66 (m, 6H), 1.51-1.34 (m, 1H), 1.14-1.03 (m, 1H), 0.75-0.52 (m, 2H)。	654

實例 6 ： (8a S)-5-(5- 乙基 -6- 氟 -3- 甲基 -1H- 苯并 [ f] 吲唑 -4- 基 )-4- 氟 -2-(((2 R,7a S)-2- 氟四氫 -1 H- 吡咯嗪 -7a(5 H)- 基 ) 甲氧基 )-8a,9,12,13- 四氫 -8 H,11 H-7,10- 二氧雜 -1,3,6,13a- 四氮雜萘并 [1,8- ab] 庚烯 (Ex-6)

步驟 A ： (8a S)-5-(5- 乙基 -6- 氟 -3- 碘 -1 H- 苯并 [ f] 吲唑 -4- 基 )-4- 氟 -2-(((2 R,7a S)-2- 氟四氫 -1 H- 吡咯嗪 -7a(5 H)- 基 ) 甲氧基 )-8a,9,12,13- 四氫 -8 H,11 H-7,10- 二氧雜 -1,3,6,13a- 四氮雜萘并 [1,8- ab] 庚烯。

在20℃下，在N ₂氣氛下，將KOH (122 mg，2.168 mmol)及I ₂(413 mg，1.626 mmol)添加至(8a S)-5-(5-乙基-6-氟-1 H-苯并[ f]吲唑-4-基)-4-氟-2-(((2 R,7a S)-2-氟四氫-1 H-吡咯嗪-7a(5 H)-基)甲氧基)-8a,9,12,13-四氫-8 H,11 H-7,10-二氧雜-1,3,6,13a-四氮雜萘并[1,8- ab]庚烯(350 mg，0.542 mmol)含在DMF (5 mL)中之溶液。將該混合物在20℃下攪拌1小時。用水(5 mL)稀釋該混合物，以EtOAc (3 x 5 mL)萃取，經Na ₂SO ₄乾燥，過濾且在減壓下蒸發該溶劑以得到粗製產物。該粗製產物藉由急驟矽膠層析(ISCO ^®；4 g SepaFlash ^®Silica Flash Column，0至10% MeOH/CH ₂Cl ₂梯度之溶離劑，40 mL/min)純化以得到(8a S)-5-(5-乙基-6-氟-3-碘-1 H-苯并[ f]吲唑-4-基)-4-氟-2-(((2 R,7a S)-2-氟四氫-1 H-吡咯嗪-7a(5 H)-基)甲氧基)-8a,9,12,13-四氫-8 H,11 H-7,10-二氧雜-1,3,6,13a-四氮雜萘并[1,8- ab]庚烯。MS (ESI) [M+H] ⁺： m/z772。

步驟 B ： (8a S)-5-(5- 乙基 -6- 氟 -3- 甲基 -1H- 苯并 [ f] 吲唑 -4- 基 )-4- 氟 -2-(((2 R,7a S)-2- 氟四氫 -1 H- 吡咯嗪 -7a(5 H)- 基 ) 甲氧基 )-8a,9,12,13- 四氫 -8 H,11 H-7,10- 二氧雜 -1,3,6,13a- 四氮雜萘并 [1,8- ab] 庚烯 (Ex-6)

在20℃下，在N ₂氣氛下，將三乙胺(157 mg，1.56 mmol)、Pd ₂(dba) ₃(47.5 mg，0.052 mmol)、三-鄰甲苯基磷烷(31.6 mg，0.104 mmol)及四甲基錫烷(130 mg，0.727 mmol)添加至(8a S)-5-(5-乙基-6-氟-3-碘-1 H-苯并[ f]吲唑-4-基)-4-氟-2-(((2 R,7a S)-2-氟四氫-1 H-吡咯嗪-7a(5 H)-基)甲氧基)-8a,9,12,13-四氫-8 H,11 H-7,10-二氧雜-1,3,6,13a-四氮雜萘并[1,8- ab]庚烯(200 mg，0.259 mmol)含在DMF (2 mL)中之溶液。將該混合物在80℃下攪拌12小時。用水(2 mL)稀釋該混合物，以EtOAc (3 x 2 mL)萃取，經Na ₂SO ₄乾燥，過濾且在減壓下蒸發該溶劑以得到粗製產物。殘餘物藉由製備型HPLC (管柱：Boston Green ODS 150 x 30 mm，5 μm；條件：水(0.2% FA)-ACN；開始B 25%；結束B 55%；流速25 mL/min)純化以得到粗製產物。該粗製產物藉由製備型SFC (管柱：DAICEL CHIRALCEL OJ (250 mm x 30 mm，10 μm)，條件：CO ₂-EtOH (0.1% NH ₃H ₂O)，開始B：40%；結束B：40%；梯度時間(min)：10；100%B保持時間：1；流速(ml/min：80；注射：30)分離，以得到(8a S)-5-(5-乙基-6-氟-3-甲基-1H-苯并[ f]吲唑-4-基)-4-氟-2-(((2 R,7a S)-2-氟四氫-1 H-吡咯嗪-7a(5 H)-基)甲氧基)-8a,9,12,13-四氫-8 H,11 H-7,10-二氧雜-1,3,6,13a-四氮雜萘并[1,8- ab]庚烯( Ex-6)。MS (ESI) [M+H] ⁺： m/z660。 ¹H NMR (400MHz, CD ₃OD) δ8.15 (s, 1H), 7.97 (dd, J= 9.1, 5.8 Hz, 1H), 7.32 (dt, J= 9.2, 3.5 Hz, 1H), 5.40 - 5.24 (m, 2H), 4.84 - 4.77 (m, 1H), 4.72 - 4.64 (m, 1H), 4.47 - 4.39 (m, 1H), 4.37 - 4.28 (m, 2H), 4.25 - 4.19 (m, 1H), 4.07 - 3.99 (m, 1H), 3.87 - 3.78 (m, 1H), 3.62 (dt, J= 8.4, 3.7 Hz, 1H), 3.56 - 3.42 (m, 2H), 3.29 - 3.22 (m, 2H), 3.11 - 3.00 (m, 1H), 2.79 - 2.44 (m, 2H), 2.30 - 2.13 (m, 4H), 2.06 - 1.98 (m, 5H), 1.91 (s, 2H), 0.99 - 0.91 (m, 3H)。

實例 7 ： (8a S)-5-(5- 乙基 -6- 氟 -3- 甲基 -1H- 苯并 [ f] 吲唑 -4- 基 )-4- 氟 -2-((( S, Z)-2-( 氟亞甲基 ) 四氫 -1 H- 吡咯嗪 -7a(5 H)- 基 ) 甲氧基 )-8a,9,12,13- 四氫 -8 H,11 H-7,10- 二氧雜 -1,3,6,13a- 四氮雜萘并 [1,8- ab] 庚烯( Ex-7)

步驟 A ： ( S)-5- 氯 -4- 氟 -2-( 甲基磺醯基 )-8a,9,12,13- 四氫 -8 H,11 H-7,10- 二氧雜 -1,3,6,13a- 四氮雜萘并 [1,8- ab] 庚烯

在0℃下，在N ₂氣氛下，將 m-CPBA (711 mg，3.50 mmol，85重量%)添加至( S)-5-氯-4-氟-2-(甲硫基)-8a,9,12,13-四氫-8 H,11 H-7,10-二氧雜-1,3,6,13a-四氮雜萘并[1,8- ab]庚烯( Int-2，500 mg，1.40 mmol)含在CH ₂Cl ₂(8 mL)中之溶液。將該混合物在20℃下攪拌1小時。用sat. aq. Na ₂SO ₃(5 mL)及sat. aq. NaHCO ₃(5 mL)淬滅該混合物，以CH ₂Cl ₂(3 x 5 mL)萃取，經Na ₂SO ₄乾燥，過濾且在減壓下蒸發該溶劑以得到粗製( S)-5-氯-4-氟-2-(甲基磺醯基)-8a,9,12,13-四氫-8 H,11 H-7,10-二氧雜-1,3,6,13a-四氮雜萘并[1,8- ab]庚烯。MS (ESI) [M+H] ⁺： m/z389。

步驟 B ： ( S)-5- 氯 -4- 氟 -2-((( S, Z)-2-( 氟亞甲基 ) 四氫 -1 H- 吡咯嗪 -7a(5 H)- 基 ) 甲氧基 )-8a,9,12,13- 四氫 -8 H,11 H-7,10- 二氧雜 -1,3,6,13a- 四氮雜萘并 [1,8- ab] 庚烯

在0℃下，在N ₂氣氛下，將NaH (206 mg，5.14 mmol) (60%含在礦物油中)添加至( S)-5-氯-4-氟-2-(甲基磺醯基)-8a,9,12,13-四氫-8 H,11 H-7,10-二氧雜-1,3,6,13a-四氮雜萘并[1,8- ab]庚烯(400 mg，1.03 mmol)及( S, Z)-(2-(氟亞甲基)四氫-1 H-吡咯嗪-7a(5 H)-基)甲醇( Int-3，HCl鹽，214 mg，1.03 mmol)含在DMF (4.5 mL)中之溶液，將該反應混合物在25℃下攪拌1小時。用aq. NH ₄Cl (5 mL)淬滅該反應且以EtOAc (10 mL x 3)萃取。用鹽水洗滌已合併的有機相，經無水Na ₂SO ₄乾燥，過濾且在真空中濃縮。殘餘物藉由急驟矽膠層析(ISCO ^®，20 g Agela Flash Column，CH ₂Cl ₂/MeOH = 10/1)純化以得到( S)-5-氯-4-氟-2-((( S, Z)-2-(氟亞甲基)四氫-1 H-吡咯嗪-7a(5 H)-基)甲氧基)-8a,9,12,13-四氫-8 H,11 H-7,10-二氧雜-1,3,6,13a-四氮雜萘并[1,8- ab]庚烯。MS (ESI) [M+H] ⁺： m/z480。

步驟 C ： (8a S)-5-(5- 乙基 -6- 氟 -1-(( 三氟甲基 ) 磺醯基 )-1 H- 苯并 [ f] 吲唑 -4- 基 )-4- 氟 -2-((( S, Z)-2-( 氟亞甲基 ) 四氫 -1 H- 吡咯嗪 -7a(5 H)- 基 ) 甲氧基 )-8a,9,12,13- 四氫 -8 H,11 H-7,10- 二氧雜 -1,3,6,13a- 四氮雜萘并 [1,8- ab] 庚烯

在20℃下，在N ₂氣氛下，將aq. K ₂CO ₃(2M，1.30 mL，2.60 mmol)及SPhos Pd G3 (122 mg，0.156 mmol)添加至( S)-5-氯-4-氟-2-((( S, Z)-2-(氟亞甲基)四氫-1 H-吡咯嗪-7a(5 H)-基)甲氧基)-8a,9,12,13-四氫-8 H,11 H-7,10-二氧雜-1,3,6,13a-四氮雜萘并[1,8- ab]庚烯(250 mg，0.521 mmol)及(5-乙基-6-氟-1-((三氟甲基)磺醯基)-1 H-苯并[ f]吲唑-4-基)硼酸( Int-9，264 mg，0.677 mmol)含在甲苯(6 mL)中之溶液。將該混合物在60℃下攪拌2小時。使該混合物冷卻，用水(6 mL)稀釋，以EtOAc (3 x 6 mL)萃取，經Na ₂SO ₄乾燥，過濾且在減壓下蒸發該溶劑以得到粗製產物。該粗製產物藉由急驟矽膠層析(ISCO ^®；80 g SepaFlash ^®Silica Flash Column，0至80% THF/石油醚梯度之溶離劑，40 mL/min)純化以得到(8a S)-5-(5-乙基-6-氟-1-((三氟甲基)磺醯基)-1 H-苯并[ f]吲唑-4-基)-4-氟-2-((( S, Z)-2-(氟亞甲基)四氫-1 H-吡咯嗪-7a(5 H)-基)甲氧基)-8a,9,12,13-四氫-8 H,11 H-7,10-二氧雜-1,3,6,13a-四氮雜萘并[1,8- ab]庚烯。MS (ESI) [M+H] ⁺： m/z790。

步驟 D ： (8a S)-5-(5- 乙基 -6- 氟 -1 H- 苯并 [ f] 吲唑 -4- 基 )-4- 氟 -2-((( S, Z)-2-( 氟亞甲基 ) 四氫 -1 H- 吡咯嗪 -7a(5 H)- 基 ) 甲氧基 )-8a,9,12,13- 四氫 -8 H,11 H-7,10- 二氧雜 -1,3,6,13a- 四氮雜萘并 [1,8- ab] 庚烯

在25℃下，將NH ₃/MeOH (7M，2 mL，14.0 mmol)添加至(8a S)-5-(5-乙基-6-氟-1-((三氟甲基)磺醯基)-1 H-苯并[ f]吲唑-4-基)-4-氟-2-((( S, Z)-2-(氟亞甲基)四氫-1 H-吡咯嗪-7a(5 H)-基)甲氧基)-8a,9,12,13-四氫-8 H,11 H-7,10-二氧雜-1,3,6,13a-四氮雜萘并[1,8- ab]庚烯(200 mg，0.253 mmol)含在DCM (0.1 mL)中之溶液。將該混合物在25℃下攪拌12小時。在減壓下蒸發該混合物以得到粗製(8a S)-5-(5-乙基-6-氟-1 H-苯并[ f]吲唑-4-基)-4-氟-2-((( S, Z)-2-(氟亞甲基)四氫-1 H-吡咯嗪-7a(5 H)-基)甲氧基)-8a,9,12,13-四氫-8 H,11 H-7,10-二氧雜-1,3,6,13a-四氮雜萘并[1,8- ab]庚烯。MS (ESI) [M+H] ⁺： m/z658。

步驟 E ： (8a S)-5-(5- 乙基 -6- 氟 -3- 碘 -1 H- 苯并 [ f] 吲唑 -4- 基 )-4- 氟 -2-((( S, Z)-2-( 氟亞甲基 ) 四氫 -1 H- 吡咯嗪 -7a(5 H)- 基 ) 甲氧基 )-8a,9,12,13- 四氫 -8 H,11 H-7,10- 二氧雜 -1,3,6,13a- 四氮雜萘并 [1,8- ab] 庚烯

在25℃下，將KOH (57.0 mg，1.02 mmol)及I ₂(193 mg，0.762 mmol)添加至(8a S)-5-(5-乙基-6-氟-1 H-苯并[ f]吲唑-4-基)-4-氟-2-((( S, Z)-2-(氟亞甲基)四氫-1 H-吡咯嗪-7a(5 H)-基)甲氧基)-8a,9,12,13-四氫-8 H,11 H-7,10-二氧雜-1,3,6,13a-四氮雜萘并[1,8- ab]庚烯(167 mg，0.254 mmol)含在DMF (2 mL)中之溶液。在25℃下攪拌該混合物30分鐘。用sat. aq. Na ₂SO ₃(3 mL)淬滅該混合物，以EtOAc (3 x 3 mL)萃取，經Na ₂SO ₄乾燥，過濾且在減壓下蒸發該溶劑以得到粗製產物。該粗製產物藉由急驟矽膠層析(ISCO ^®；4 g SepaFlash ^®Silica Flash Column，0至30% CH ₂Cl ₂/MeOH梯度之溶離劑，20 mL/min)純化以得到(8a S)-5-(5-乙基-6-氟-3-碘-1 H-苯并[ f]吲唑-4-基)-4-氟-2-((( S, Z)-2-(氟亞甲基)四氫-1 H-吡咯嗪-7a(5 H)-基)甲氧基)-8a,9,12,13-四氫-8 H,11 H-7,10-二氧雜-1,3,6,13a-四氮雜萘并[1,8- ab]庚烯。MS (ESI) [M+H] ⁺： m/z784。

步驟 F ： (8a S)-5-(5- 乙基 -6- 氟 -3- 甲基 -1H- 苯并 [ f] 吲唑 -4- 基 )-4- 氟 -2-((( S, Z)-2-( 氟亞甲基 ) 四氫 -1 H- 吡咯嗪 -7a(5 H)- 基 ) 甲氧基 )-8a,9,12,13- 四氫 -8 H,11 H-7,10- 二氧雜 -1,3,6,13a- 四氮雜萘并 [1,8- ab] 庚烯( Ex-7)

在20℃下，在N ₂氣氛下，將三乙胺(101 mg，0.995 mmol)、Pd ₂(dba) ₃(30.4 mg，0.033 mmol)及三-鄰甲苯基磷烷(20.2 mg，0.066 mmol)及四甲基錫烷(89 mg，0.498 mmol)添加至(8a S)-5-(5-乙基-6-氟-3-碘-1 H-苯并[ f]吲唑-4-基)-4-氟-2-((( S, Z)-2-(氟亞甲基)四氫-1 H-吡咯嗪-7a(5 H)-基)甲氧基)-8a,9,12,13-四氫-8 H,11 H-7,10-二氧雜-1,3,6,13a-四氮雜萘并[1,8- ab]庚烯(130 mg，0.166 mmol)含在DMF (2 mL)中之溶液。將該混合物在80℃下攪拌12小時。用水(2 mL)稀釋該混合物，以EtOAc (3 x 2 mL)萃取，經Na ₂SO ₄乾燥，過濾且在減壓下蒸發該溶劑。殘餘物藉由製備型TLC (SiO ₂、CH ₂Cl ₂：MeOH =10:1)純化以得到粗製產物。該粗產物藉由製備型SFC (管柱：DAICEL CHIRALCEL OD (250 mm x 30 mm，10 μm)，條件：CO ₂-EtOH (0.1% NH ₃H ₂O)，開始B：60%；結束B：60%；梯度時間(min)：10；100% B保持時間：10；流速(mL/min)：80；注射：35)分離以得到分離產物。然後，該分離產物藉由逆相製備型HPLC (管柱：Boston Prime C18 150 x 30 mm x 5 μm；條件：水(0.05% NH ₃H ₂O+10 mM NH ₄HCO ₃)-ACN；開始B--結束B：50--80；梯度時間(min)：11；100% B保持時間(min)：2.5；流速(mL/min)：25)再純化，以得到(8a S)-5-(5-乙基-6-氟-3-甲基-1H-苯并[ f]吲唑-4-基)-4-氟-2-((( S, Z)-2-(氟亞甲基)四氫-1 H-吡咯嗪-7a(5 H)-基)甲氧基)-8a,9,12,13-四氫-8 H,11 H-7,10-二氧雜-1,3,6,13a-四氮雜萘并[1,8- ab]庚烯。MS (ESI) [M+H] ⁺： m/z672。 ¹H NMR (400 MHz, CD ₃OD) δ8.27 - 8.08 (m, 1H), 7.96 (dd, J= 9.2, 6.1 Hz, 1H), 7.31 (m, 1H), 6.88 - 6.49 (m, 1H), 5.27 (m, 1H), 4.82 - 4.74 (m, 1H), 4.66 (d, J= 13.2 Hz, 1H), 4.46 - 4.29 (m, 3H), 4.25 - 4.18 (m, 1H), 4.09 - 3.95 (m, 1H), 3.92 - 3.76 (m, 2H), 3.68 - 3.56 (m, 1H), 3.53 - 3.37 (m, 2H), 3.23 - 3.11 (m, 1H), 2.81 - 2.71 (m, 2H), 2.70 - 2.30 (m, 3H), 2.29 - 2.13 (m, 2H), 2.13 - 1.80 (m, 7H), 0.95 (td, J= 18.7, 7.4 Hz, 3H)。 分析

KRAS-WT 、 G12C/D/V/A/R/S 、 G13D 、 Q61H 、 HRAS-WT 及 NRAS-WT 之 SOS 催化之核苷酸交換分析之程序

用於此分析中之重組KRAS-G12C蛋白具有另外三重突變(C51S/C80L/C118S)。而KRAS-WT、G12D/V/A/S/R、G13D、Q61H、HRAS及NRAS係在其WT蛋白序列背景之上下文中。具體而言，該SOS催化之核苷酸交換分析利用含有特異性生物素化RAS蛋白(KRAS-WT、G12C/V/D/A/S/R、G13D、Q61H、HRAS-WT、NRAS-WT；如上文所述)與氟硼螢-GDP、及鋱-鏈黴親和素之預形成之TR-FRET複合物。將化合物與此複合物預培養60分鐘。隨後，添加重組人類SOS蛋白及未標記之GTP以引發交換反應。小分子抑制劑使該氟硼螢-GDP複合物穩定而未處理之蛋白質迅速交換氟硼螢-GDP為未標記之GTP從而導致減少之TR-FRET信號。

為了組裝預形成之TR-FRET複合物，將每種生物素化RAS蛋白在EDTA緩衝液(20 mM HEPES pH 7.5、50 mM氯化鈉、10 mM EDTA及0.01%吐溫)中稀釋至2 µM且在室溫下培養一小時。然後，將此混合物在含有15 nM之鋱-鏈黴親和素(Invitrogen，目錄號PV3577)及900 nM之氟硼螢-GDP (Invitrogen，目錄號G22360)之分析緩衝液(20 mM HEPES pH 7.5、150 mM氯化鈉、10 mM氯化鎂及0.005%吐溫)中進一步稀釋至90 nM且在室溫下培養六小時。應注意，RAS蛋白各者之此預形成之TR-FRET複合物係預先製備，取等分試樣且儲存於-80℃直至實驗日。

將每種測試化合物(10 mM原液含在DMSO中)在DMSO中稀釋以製備最終10-點、3倍稀釋液且使用Echo 550 (Labcyte)聲學分配至384孔分析板(Corning，目錄號3820)中。該分析板之每個孔接受3 µL之特異性3x RAS預形成之TR-FRET複合物及3 µL之分析緩衝液且在室溫下培養60分鐘(預培養時間)。然後，每個孔接受3 µL含在分析緩衝液中之3x重組人類SOS蛋白及GTP (Sigma，G8877)且在室溫下培養30分鐘(G13D)、60分鐘(KRAS WT/G12C/D、H/NRAS)或90分鐘(針對G12A/R/S/V及Q61H)。每個孔中9 μL之最終反應由3 mM GTP、以下列濃度之特異性Ras及SOS蛋白組成：KRAS-G12C / SOS = 3 nM / 40 nM、KRAS-WT及G12D / SOS = 1 nM / 40 nM、KRAS-G12V / SOS = 1.25 nM / 160 nM、KRAS-G12A/S  / SOS = 1 nM / 160 nM、KRAS-G12R / SOS = 1 nM / 320 nM、KRAS-Q61H / SOS = 1 nM / 320 nM、KRAS-G13D / SOS = 1.25 nM / 0 nM、HRAS-WT及NRAS-WT = 1.25 nM/ 40 nM。

在Envision (PerkinElmer)板式讀取器上測定時差式螢光共振能量轉移(TR-FRET)信號：激發濾波器 = 340 nm；發射1 = 495 nm；發射2 = 520 nm；二向色鏡 = D400/D505；延遲時間 = 100 ms。每個孔之信號經確定為在520 nm處之發射與在495 nm處之發射之比。在標準化至含有DMSO (無效應)或飽和濃度之抑制劑(最大效應)之對照孔後，確定每個孔之效應百分比。將呈化合物濃度之函數關係之表觀效應擬合至四參數邏輯方程。

在 KRAS 野生型及突變體 (G12D 、 G12V) 細胞系中進行細胞磷酸 - ERK 分析之程序

將含有經擴增之野生型KRAS之MKN-1細胞(JCRB JCRB0252)在含有含有10%熱滅活胎牛血清(ThermoFisher Scientific 10091148)、1 mM丙酮酸鈉及10 mM HEPES之RPMI 1640-GlutaMAX™-I (ThermoFisher Scientific 61870)之生長培養基中培養。將含有純合子KRAS-G12D活化突變之AsPC-1細胞(ATCC® CRL-1682™)在T150燒瓶之生長培養基(含有10%胎牛血清(ThermoFisher Scientific 10091148)之RPMI培養基1640-GlutaMAX™-I (ThermoFisher Scientific 61870))中培養。將含有純合子KRAS-G12V活化突變之SW620細胞(ATCC® CRL-227™)在含有含有10%熱滅活胎牛血清(ThermoFisher Scientific 10091148)之RPMI 1640-GlutaMAX™-I (ThermoFisher Scientific 61870)之生長培養基中培養。

在生長培養基中在TrypLE (ThermoFisher scientific 12604021)消化後收穫用於該分析之細胞且以10,000至15,000個細胞/20 µL/孔之密度接種於384孔膠原蛋白塗覆細胞培養板(Corning 356702)中，且在37℃、5% CO ₂下培養過夜。製備該等化合物(具有10 mM原液濃度)劑量反應滴定[30 µM最終ERK偵測分析濃度及1:3稀釋，10點劑量反應]且使用Echo 550液體處理器將適宜量(270 nL)之測試化合物分配於384孔中間板中。將30 µL/孔之RPMI培養基1640-GlutaMAX™-I添加至中間板且然後將該中間板之內容物(10 µL/孔)轉移至384孔膠原蛋白塗覆細胞培養板，將其在37℃、5% CO ₂下培養2小時。在自該膠原蛋白塗覆細胞培養板移除培養基後，在室溫下在以300 rpm恆定振盪30分鐘下，將細胞在含有Halt™蛋白酶及磷酸酶抑制劑混合物(ThermoFisher Scientific 78446)之裂解緩衝液中裂解，該裂解緩衝液來自Alpha SureFire® Ultra™ Multiplex p-ERK及總ERK分析套組(PerkinElmer MPSU-PTERK)。然後，將該等細胞溶解物轉移至OptiPlate-384板(PerkinElmer 6005620)，且遵循製造商方案藉由Alpha SureFire® Ultra™ Multiplex p-EEK套組及總ERK分析套組(PerkinElmer MPSU-PTERK)偵測ERK之磷酸化(p-ERK)及總ERK含量。在EnVision多模式板式讀取器(PerkinElmer)上讀取分析板，且每個孔中之p-ERK相對於總ERK之比用作最終讀出。使用Spotfire軟體，使用4參數邏輯模型分析劑量反應曲線以來計算IC ₅₀值。

此等分析之結果呈現於下表中。

Ex #	KRAS G12D GNE IC50 (nM)	KRAS G12V GNE IC50 (nM)	KRAS WT GNE IC50 (nM)	KRAS G12C GNE IC50 (nM)	KRAS G13D GNE IC50 (nM)	HRAS GNE IC50 (nM)	NRAS GNE IC50 (nM)	KRAS G12A GNE IC50 (nM)	KRAS G12S GNE IC50 (nM)	KRAS G12R GNE IC50 (nM)	KRAS Q61H GNE IC50 (nM)
Ex-1	0.67	1.3	0.87	6.9	3.7	＞11060	＞11060	＜0.69	＜0.69	＜0.69	1.4
Ex-2	0.65	1.3	1.1	3.2	1.0	2743	7022	＜0.69	＜0.69	＜0.69	1.2
Ex-3	1.3	3.0	2.5	ND	ND	ND	ND	ND	ND	ND	ND
Ex-4	＜0.69	0.83	＜0.69	2.9	0.89	1275	2818	＜0.69	＜0.69	＜0.69	1.0
Ex-5	＜0.69	0.98	＜0.69	3.3	1.2	4684	＞11060	0.83	0.77	1.3	0.97
Ex-6	1.3	1.5	1.6	6.5	1.9	5516	10050	1.0	1.2	1.2	1.8
Ex-7	1.4	2.8	1.4	11	2.4	2180	8979	1.3	1.3	1.3	2.8

Ex #	AsPC1 pERK IC50 (nM)	SW620 pERK IC50 (nM)	MKN1 pERK IC50 (nM)
Ex-1	5.1	2.6	9.1
Ex-2	7.4	2.4	7.9
Ex-3	15	3.9	9.7
Ex-4	2.2	＜1.5	6.6
Ex-5	3.2	1.3	4.3
Ex-6	9.5	3.4	14
Ex-7	7.1	2.5	12

大鼠 IV/PO 藥物動力學研究之程序

在大鼠中自經口投與及IV投與研究確定清除率、分佈體積、半衰期及經口生物利用率之血漿藥物動力學參數。給藥前將4隻雄性大鼠(通常體重225至260 g)禁食過夜。如在下表中所顯示，藉由添加至媒劑來製備用於經口及IV給藥之化合物。IV調配物經由預先套管之頸靜脈投與至2隻大鼠，且經口給藥經由口腔強飼投與至2隻大鼠。藉由經預套管之動脈，通常在給藥前、給藥後2、8、15、30分鐘、1、2、4、6及8小時(針對IV給藥)；及在給藥前15、30分鐘、1、2、4、6、8小時(針對經口給藥)，收集血液。在K2EDTA管中收集樣本，儲存在冰上，然後離心。將血漿轉移至微量滴定板且儲存在-70℃直至分析。使用蛋白質沉澱提取血漿樣本且使用每種化合物之標準曲線藉由液相層析分離接著進行質譜偵測(LC-MS/MS)來分析。藉由非分區方法來計算IV及經口給藥數據之血漿藥物動力學參數。經口生物利用率測定為經口給藥相對於IV給藥後的劑量標準化血漿曲線下面積(AUC)之比。

媒劑、劑量、劑量體積及濃度顯示於下表中。

	媒劑	劑量[mg/kg]	劑量體積[mL/kg]	Conc. [mg/mL]
IV	PO	IV	PO	IV	PO	IV	PO
Ex-1	DMSO/PG/H 2O (20/60/20)	吐溫80/PG/H 2O (10/40/50)	1	2	1	5	1	0.4
Ex-2	DMSO/PG/H 2O (20/60/20)	DMSO/PG/H 2O (20/60/20)	1	2	1	5	1	0.4
Ex-3	DMSO/PG/H 2O (20/60/20)	吐溫80/PG/H 2O (10/40/50)	1	2	1	5	1	0.4
Ex-6	DMSO/PG/H 2O (20/60/20)	吐溫80/PG/H 2O (10/40/50)	1	2	1	5	1	0.4
Ex-7	30%卡布迪索(Captisol)	10%吐溫80	1	2	1	2	1	1.0

狗 IV/PO 藥物動力學研究之程序

在狗中自經口投與及IV投與研究確定清除率、分佈體積、半衰期、平均滯留時間(MRT)及經口生物利用率之血漿藥物動力學參數。給藥前將4隻雄性狗(通常體重8至12 kg)禁食過夜。如在下表中所顯示，藉由添加至媒劑來製備用於經口及IV給藥之化合物。經由隱靜脈或頭靜脈對2隻狗投與IV調配物，且經由口腔強飼對2隻狗投與經口給藥。藉由頭靜脈或頸靜脈，通常在給藥前、給藥後2、8、15、30分鐘、1、2、4、6、8及24小時(針對IV給藥)；及在給藥前15、30分鐘、1、2、4、6、8及24小時(針對經口給藥)，收集血液。在K2EDTA管中收集樣本，儲存在冰上，然後離心。將血漿轉移至微量滴定板且儲存在-70℃直至分析。使用蛋白質沉澱提取血漿樣本且使用每種化合物之標準曲線藉由液相層析分離接著進行質譜偵測(LC-MS/MS)來分析。藉由非分區方法來計算IV及經口給藥數據之血漿藥物動力學參數。經口生物利用率測定為經口給藥相對於IV給藥後的劑量標準化血漿曲線下面積(AUC)之比。

媒劑、劑量、劑量體積及濃度顯示於下表中。

	媒劑	劑量[mg/kg]	劑量體積[mL/kg]	Conc. [mg/mL]
IV	PO	IV	PO	IV	PO	IV	PO
Ex-1	DMSO/PG/H 2O (20/40/40)	10%吐溫80	0.25	0.5	1	2	0.25	0.25
Ex-2	DMSO/PG/H 2O (20/40/40)	10%吐溫80	0.05	0.5	1	2	0.05	0.25
Ex-3	DMSO/PG/H 2O (20/40/40)	吐溫80/PG/H 2O (10/40/50)	0.25	0.5	1	5	0.25	0.1
Ex-6	30%卡布迪索	10%吐溫80	0.25	0.5	1	2	0.25	0.25

狗 IV 盒藥物動力學研究之程序

在狗中自IV盒投與研究確定清除率、分佈體積、半衰期及平均滯留時間(MRT)之血漿藥物動力學參數。給藥前將2隻雄性狗(通常體重8至12 kg)禁食過夜。如在下表中所顯示，藉由添加至媒劑來製備用於經口及IV給藥之化合物。經由隱靜脈或頭靜脈對2隻狗投與IV調配物。藉由頭靜脈或頸靜脈，通常在給藥前、給藥後2、8、15、30分鐘、1、2、4、6、8及24小時，來收集血液。在K2EDTA管中收集樣本，儲存在冰上，然後離心。將血漿轉移至微量滴定板且儲存在-70℃直至分析。使用蛋白質沉澱提取血漿樣本且使用每種化合物之標準曲線藉由液相層析分離接著進行質譜偵測(LC-MS/MS)來分析。藉由非分區方法來計算血漿藥物動力學參數。

媒劑、劑量、劑量體積及濃度顯示於下表中。

	媒劑	劑量[mg/kg]	劑量體積[mL/kg]	Conc. [mg/mL]
Ex-7	DMSO/PEG400/H 2O (20/40/40)	0.05	0.5	0.1

藥物動力學研究之結果呈現於下表中。

	Ex-1	Ex-2	Ex-3	Ex-6	Ex-7
物種	大鼠	狗	大鼠	狗	大鼠	狗	大鼠	狗	大鼠	狗
CLp [mL/min/kg]	24	5.0	40	18	40	10	36	8.0	35	7.7
Vd [L/kg]	2.0	0.65	6.1	2.6	4.0	2.2	5.1	3.7	4.0	1.4
MRT [h]	1.4	2.2	2.5	2.4	1.7	3.6	2.4	7.8	1.9	3.1
F%	11	17	10	29	7.5	15	18	59	15	ND

利用 AsPC-1 異種移植模型之 PKPD 研究之程序

使用雌性NOD SCID (6至8週齡，Charles River Laboratories)在AsPC-1異種移植模型中評價抑制劑於pERK抑制上之效應。小鼠在側腹中經皮下植入含在100%基質膠中之AsPC-1腫瘤細胞(5 x 10 ⁶)。一旦腫瘤達到約250 mm ³的平均尺寸，立刻將小鼠隨機分組至治療組且開始測試物品或媒劑(5%吐溫-80)之投與。藉由添加5%吐溫-80至該材料，且使用2N HCl酸化至pH 2至5，來製備溶液調配物。該等調配物使用10 mL/kg之給藥體積投與。將所有化合物藉由口腔強飼投與且在化合物投與後之預定時間點，將動物安樂死，自頸靜脈收集血液且切除腫瘤然後快速冷凍。

在K2EDTA管中收集血液樣本，儲存在冰上，然後離心。將血漿轉移至微量滴定板且儲存在-70℃直至分析。使用蛋白質沉澱提取血漿樣本且使用每種化合物之標準曲線藉由液相層析分離接著進行質譜偵測(LC-MS/MS)來分析。

將新鮮冷凍之腫瘤樣本稱重於Lysis Matrix H管(MP Biomedicals)中且然後使用來自磷酸-ERK1/2及磷酸/總ERK1/2分析套組(Meso Scale Discovery)之補充有蛋白酶/磷酸酶抑制劑(ThermoFisher)之新鮮製備之完全裂解緩衝液(Tris裂解緩衝液，PMSF，SDS)裂解。在4℃下，將所有樣本在Lysis Matrix H管中均質化(Qiagen TissueLyser II) 5分鐘接著在4℃下以15,000 rpm離心15分鐘。將溶解物上清液收集至清潔1.5-mL離心管中以進行超音波處理。測定樣本之總蛋白質濃度，且使用(上文所描述之)完全裂解緩衝液將所有樣本稀釋至相同濃度(≥ 3mg/mL)。每個研究之MSD板之總蛋白質輸入之線性範圍經由試驗性實驗使用來自於2至3個代表性經媒劑-及化合物-處理之樣本之總蛋白質溶解物之稀釋來最佳化。在測定每個MSD板之最佳化蛋白質濃度之後，將所有樣本在(上文描述之)完全裂解緩衝液中稀釋至最佳化蛋白質濃度接著將等量之樣本裝載至MSD板中。遵循製造商方案，進行磷酸-ERK1/2及磷酸/總ERK1/2 MSD分析。使用MSD板式讀取器(Meso Scale Discovery)測定單獨磷酸-ERK信號或磷酸-ERK及總ERK信號。根據製造商方案(包括背景及總ERK標準化步驟)來計算每個樣本之相對磷酸-ERK信號。藉由將每一時間點每個樣本之相對磷酸-ERK信號標準化至所有媒劑對照樣本之平均相對磷酸-ERK信號來計算磷酸-ERK含量百分比。

利用Ex-1、Ex-2及Ex-6之PKPD研究之結果分別顯示於圖1、圖2及圖3中。

利用 AsPC-1 異種移植模型之 14 天功效研究之程序

自美國典型培養物保藏中心(the American Type Culture Collection)獲得AsPC-1細胞系且在推薦的培養基中培養。所有動物實驗程序在進行前均已獲得Merck機構動物照護及使用委員會(Merck’s Institutional Animal Care and Use Committee) (IACUC)的批準。在本研究期間，根據實驗室動物照護評估及認證協會(the Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care) (AAALAC)的規定進行動物之照護及使用。雌性NOD SCID小鼠(6至8週齡)購自Charles River Laboratories (Wilmington，MA)且維持在無病原體環境中。所有動物隨意接受食物及水。動物在右下腹中經皮下接種5 x 10E6個AsPC-1細胞(100%基質膠，Corning，356237)。使用公式0.5 × L × W ²測定腫瘤體積測量值，其中L係指每個腫瘤之長度及W係指寬度。在開始治療前，使所得腫瘤生長至約250 mm ³尺寸。將小鼠隨機分組至治療組(10隻小鼠/組)且用測試物品或媒劑(5%吐溫-80)處理。藉由添加5%吐溫-80至該材料，且使用2N HCl酸化至pH 2至5，來製備測試物品。該等調配物使用10 mL/kg之給藥體積投與。所有化合物藉由每天兩次之口腔強飼投與14天。每週測量腫瘤及體重兩次。

利用Ex-2及Ex-6之14天功效研究之結果分別顯示於圖4及圖5中。

序列

SEQ ID NO:1 – 重組人類KRAS G12C

GLNDIFEAQKIEWHETEYKLVVVGACGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETSLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLLVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPMVLVGNKSDLPSRTVDTKQAQDLARSYGIPFIETSAKTRQGVDDAFYTLVREIRKHKEK

SEQ ID NO:2 – 重組人類KRAS G12D

GLNDIFEAQKIEWHETEYKLVVVGADGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPMVLVGNKCDLPSRTVDTKQAQDLARSYGIPFIETSAKTRQGVDDAFYTLVREIRKHKEK

SEQ ID NO:3 – 重組人類KRAS G12V

GLNDIFEAQKIEWHETEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPMVLVGNKCDLPSRTVDTKQAQDLARSYGIPFIETSAKTRQGVDDAFYTLVREIRKHKEK

SEQ ID NO:4 – 重組人類KRAS G13D

GLNDIFEAQKIEWHETEYKLVVVGAGDVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPMVLVGNKCDLPSRTVDTKQAQDLARSYGIPFIETSAKTRQGVDDAFYTLVREIRKHKEK

SEQ ID NO:5 – 重組人類HRAS WT

ggggshmteyklvvvgaggvgksaltiqliqnhfvdeydptiedsyrkqvvidgetclldildtagqeeysamrdqymrtgegflcvfainntksfedihqyreqikrvkdsddvpmvlvgnkcdlaartvesrqaqdlarsygipyietsaktrqgvedafytlvrEirqh

SEQ ID NO:6 – 重組人類NRAS WT

GGGGMTEYKLVVVGAGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNSKSFADINLYREQIKRVKDSDDVPMVLVGNKCDLPTRTVDTKQAHELAKSYGIPFIETSAKTRQGVEDAFYTLVREIRQYRMKKLN

SEQ ID NO:7 – 重組人類SOS1蛋白

MGSSHHHHHHSGENLYFQGSSGLNDIFEAQKIEWHESSEEQMRLPSADVYRFAEPDSEENIIFEENMQPKAGIPIIKAGTVIKLIERLTYHMYADPNFVRTFLTTYRSFCKPQELLSLIIERFEIPEPEPTEADRIAIENGDQPLSAELKRFRKEYIQPVQLRVLNVCRHWVEHHFYDFERDAYLLQRMEEFIGTVRGKAMKKWVESITKIIQRKKIARDNGPGHNITFQSSPPTVEWHISRPGHIETFDLLTLHPIEIARQLTLLESDLYRAVQPSELVGSVWTKEDKEINSPNLLKMIRHTTNLTLWFEKCIVETENLEERVAVVSRIIEILQVFQELNNFNGVLEVVSAMNSSPVYRLDHTFEQIPSRQKKILEEAHELSEDHYKKYLAKLRSINPPCVPFFGIYLTNILKTEEGNPEVLKRHGKELINFSKRRKVAEITGEIQQYQNQPYCLRVESDIKRFFENLNPMGNSMEKEFTDYLFNKSLEIEPRNPKPLPRFPKKYSYPLKSPGVRPSNPRPGT

SEQ ID NO:8 – 重組人類KRAS WT

GGGGTEYKLVVVGAGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPMVLVGNKCDLPSRTVDTKQAQDLARSYGIPFIETSAKTRQGVDDAFYTLVREIRKHKEK

SEQ ID NO:9 – 重組人類KRAS G12A

GLNDIFEAQKIEWHETEYKLVVVGAAGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPMVLVGNKCDLPSRTVDTKQAQDLARSYGIPFIETSAKTRQGVDDAFYTLVREIRKHKEK

SEQ ID NO:10 – 重組人類KRAS G12S

GLNDIFEAQKIEWHETEYKLVVVGASGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPMVLVGNKCDLPSRTVDTKQAQDLARSYGIPFIETSAKTRQGVDDAFYTLVREIRKHKEK

SEQ ID NO:11 – 重組人類KRAS G12R

GLNDIFEAQKIEWHETEYKLVVVGARGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPMVLVGNKCDLPSRTVDTKQAQDLARSYGIPFIETSAKTRQGVDDAFYTLVREIRKHKEK

SEQ ID NO:12 – 重組人類KRAS Q61H

GLNDIFEAQKIEWHETEYKLVVVGAGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGHEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPMVLVGNKCDLPSRTVDTKQAQDLARSYGIPFIETSAKTRQGVDDAFYTLVREIRKHKEK

圖1為顯示關於Ex-1之PKPD研究之圖形表示。

圖2為顯示關於Ex-2之PKPD研究之圖形表示。

圖3為顯示關於Ex-6之PKPD研究之圖形表示。

圖4為顯示關於Ex-2之14天功效研究之圖形表示。

圖5為顯示關於Ex-6之14天功效研究之圖形表示。

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Claims (20)

1. 一種化合物，其選自由以下組成之群： (III)、 (IV)、 (VI)及 (VII)， 或其醫藥上可接受之鹽。
2. 如請求項1之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中該化合物為 (III)。
3. 如請求項1之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中該化合物為 (IV)。
4. 如請求項1之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中該化合物為 (VI)。
5. 如請求項1之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中該化合物為 (VII)。
6. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至5中任一項之化合物或其醫藥上可接受之鹽、及醫藥上可接受之載劑。
7. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至5中任一項之化合物或其醫藥上可接受之鹽、另外抗癌劑及醫藥上可接受之載劑。
8. 一種抑制KRAS-G12D蛋白之方法，其包括使KRAS-G12D蛋白與如請求項1至5中任一項之化合物或其醫藥上可接受之鹽接觸，以抑制該KRAS-G12D蛋白之活性。
9. 一種抑制KRAS-G12C蛋白之方法，其包括使KRAS-G12C蛋白與如請求項1至5中任一項之化合物或其醫藥上可接受之鹽接觸，以抑制該KRAS-G12C蛋白之活性。
10. 一種抑制KRAS-G12V蛋白之方法，其包括使KRAS-G12V蛋白與如請求項1至5中任一項之化合物或其醫藥上可接受之鹽接觸，以抑制該KRAS-G12V蛋白之活性。
11. 一種抑制KRAS-G13D蛋白之方法，其包括使KRAS-G13D蛋白與如請求項1至5中任一項之化合物或其醫藥上可接受之鹽接觸，以抑制該KRAS-G13D蛋白之活性。
12. 一種治療癌症之方法，其包括對有需要此種治療的個體投與治療有效量之如請求項1至5中任一項之化合物或其醫藥上可接受之鹽。
13. 如請求項12之方法，其進一步包括對該個體投與另外活性劑。
14. 如請求項1至5中任一項之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其用於療法中，或如請求項1至5中任一項之化合物或其醫藥上可接受之鹽在療法中之用途。
15. 如請求項1至5中任一項之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其用於治療癌症，或如請求項1至5中任一項之化合物或其醫藥上可接受之鹽用於治療癌症之用途。
16. 如請求項1至5中任一項之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其用於製備用於治療癌症之藥劑，或如請求項1至5中任一項之化合物或其醫藥上可接受之鹽用於製備用於治療癌症之藥劑之用途。
17. 如請求項1至5中任一項之化合物或其醫藥上可接受之鹽及另外抗癌劑，其用於治療癌症，或如請求項1至5中任一項之化合物或其醫藥上可接受之鹽及該另外抗癌劑用於治療癌症之用途。
18. 如請求項1至5中任一項之化合物或其醫藥上可接受之鹽及另外抗癌劑，其用於製備用於治療癌症之藥劑，或如請求項1至5中任一項之化合物或其醫藥上可接受之鹽及該另外抗癌劑用於製備用於治療癌症之藥劑之用途。
19. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至5中任一項之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其用於治療癌症，或包含如請求項1至5中任一項之化合物或其醫藥上可接受之鹽之醫藥組合物用於治療癌症之用途。
20. 一種包含如請求項1至5中任一項之化合物或其醫藥上可接受之鹽及另外抗癌劑之醫藥組合物，其用於治療癌症，或包含如請求項1至5中任一項之化合物或其醫藥上可接受之鹽及該另外抗癌劑之該醫藥組合物用於治療癌症之用途。