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TW202444882A - 磁珠式核酸萃取系統 - Google Patents

磁珠式核酸萃取系統 Download PDF

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TW202444882A
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Abstract

磁珠式核酸萃取系統包括複數個磁珠以及無酒精緩衝液系統。無酒精緩衝液系統包括裂解結合緩衝液、第一清洗緩衝液、第二清洗緩衝液、以及沖提緩衝液。緩衝液包括特殊選擇的離液鹽、清潔劑、沉澱劑、及其他可理想萃取核酸所需的成分。磁珠式核酸萃取系統為穩定、用戶友好、環境友好、有效且高效的核酸萃取系統，適用於拭子樣本中的病原體，且可達成從拭子樣本的病毒和細菌中單獨或同時有效萃取DNA和RNA。

Description

磁珠式核酸萃取系統
本案係關於一種核酸萃取系統，尤指一種磁珠式核酸萃取系統。
核酸檢測由於具有優異靈敏度及特異性，是近年最受重視的分子診斷技術，且廣泛應用於遺傳疾病研究、腫瘤學和傳染病流行病學等各個領域。可否靈敏地檢測出目標的先決條件在於核酸萃取，核酸萃取的主要功能是獲得高質量的核酸並去除樣本基質中存在的抑制因子。基於不同的萃取機制開發了許多萃取方法，而現有方法可大致分為兩類：化學驅動方法(chemically driven methods)及基於固相的方法(solid phase based methods)。
化學驅動方法為早期開發的方法，主要利用溶液中苯酚-氯仿(phenol-chloroform)的相分離(phase separation)及以酒精例如異丙醇和乙醇進行核酸沉澱。細胞裂解發生在如十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)及蛋白酶K(proteinase K)等強蛋白變性成分存在下，接著加入苯酚：氯仿：異戊醇 (25:24:1)的混合物以促進DNA、脂質和其他細胞碎片的相分離，其中DNA會存在水相中，其餘則存在有機相中。在離心力作用下，含有DNA的水相會位在有機相的上方，故可轉移到乾淨的試管中進行分析，或者利用乙醇沉澱進一步回收和濃縮DNA。然而，此方法有幾項缺點。首先，它非常耗時且費力。又，由於採用氯仿或苯酚等致癌和有毒化學物質，這些程序對操作人員造成傷害的風險很高。此外，對於所萃取的核酸，也存在苯酚污染的風險，且增加在核酸許多位點產生切口(nick)的機率，反而嚴重影響所萃取核酸的穩定性。另外，乙醇會造成試劑運輸和儲存的不便和高成本。
鹽析法(salting-out method)為苯酚-氯仿萃取程序的替代方法，其原理是蛋白質和其他細胞污染物會因其相對疏水性而沉澱在飽和鹽溶液中，而DNA則不會。在細胞裂解後加入飽和鹽溶液，例如6 M氯化鈉(NaCl)，再將充分混合的細胞裂解物-鹽溶液進行離心以沉澱蛋白質成分，上清液則含有DNA，可將其轉移到新管中並與2倍體積的純乙醇混合，以進一步沉澱和純化DNA。此方法避免了有毒有機化學物質的使用，然而，用於蛋白質沉澱的鹽也可能污染所萃取的核酸，且此情況並不少見，這反而會抑制經由酶進行的核酸擴增，例如PCR或其他等溫擴增方法。
利用各種材料的固相來選擇性結合核酸是後來開發的方法，與基於相分離和鹽析機制且使用多個容器的傳統萃取方法相比，更實現了單容器核酸萃取。由於固相功能受到接觸溶液的影響，無論是裂解緩衝液、結合緩衝液、清洗緩衝液或沖提緩衝液，故緩衝液配方也是高效核酸萃取系統的重要部分。用於結合核酸的固相可以是載體材料、旋轉過濾器、二氧化矽顆粒、比色杯、微量滴定板、濾膜、聚苯乙烯珠及硝酸纖維素紙，並且相應地開發了許多方法。
上述方法，無論是基於液相分離還是基於固相分離，離心機都是必備的設備，這阻礙了樣本製備的高度自動化。核酸萃取的最新發展是包括可以藉由不同官能基功能化的磁珠，以選擇性地結合核酸，實現核酸萃取的快速及高度自動化。
藉由特殊裝置和相關緩衝液組成的套組形式，使得方便有效的核酸萃取在生物及分子科學中取得了技術進展，但仍有一些挑戰需要解決。首先，大多數商用核酸萃取套組都要求終端用戶提供消耗品及/或設備清單，而這只有設施完善的實驗室能滿足。其次，在上述最新開發的以功能化磁珠作為載體以特異性捕捉核酸的技術中，酒精或異丙醇是緩衝液中的重要成分。當放置在用於即時就地照護(Point of Care，POC)應用的卡匣上時，酒精會與塑料發生反應，從而破壞其機械/物理化學性能，且也會因其揮發性、易燃性和洩漏可能性而產生問題。這些特性使得酒精成為國際航空運輸協會(International Air Transport Association，IATA)高度管制的物質。第三，大多數商業套組的周轉時間(turn-around-time)超過半小時。第四，大多數萃取緩衝液只能用於從病毒或細菌中單獨提取DNA或RNA，缺乏一種通用的緩衝液系統，可以有效地從人體拭子樣本的病原體中萃取和純化所有核酸。最後，一些萃取緩衝液中的特殊成分需要-20°C或4°C冷凍/冷藏才能獲得所需的性能，特別是那些含有用於細胞裂解和核酸酶變性的蛋白酶以及用於低模板輸入量的載體核酸的套組，因而造成運輸和儲存方面的不便。
因此，實有必要提供一種核酸萃取系統來解決先前技術中遇到的挑戰。
本案之一目的在於提供一種穩定、用戶友好、環境友好、有效且高效的磁珠式核酸萃取系統，適用於拭子樣本中的病原體。
本案之另一目的在於提供一種無酒精的磁珠式核酸萃取系統，以避免酒精所產生的問題。
本案之又一目的在於提供一種磁珠式核酸萃取系統，可達成從拭子樣本的病毒和細菌中單獨或同時有效萃取DNA和RNA。
為達上述目的，本案提供一種磁珠式核酸萃取系統，包括複數個磁珠以及無酒精緩衝液系統。無酒精緩衝液系統包括裂解結合緩衝液、第一清洗緩衝液、第二清洗緩衝液、以及沖提緩衝液。裂解結合緩衝液包括0.5至4 M硫氰酸胍、5至20% (v/v) PEG8000、10至1000 mM檸檬酸鈉、以及非離子清潔劑，選自於由0.5至4% (v/v) NP-40替代物、0.5至4% (v/v) Tergitol 15-S-40、0.5至4% (v/v) Ecosurf EH-9及其混合物所組成的群組。第一清洗緩衝液包括0.5至3 M硫氰酸胍、5至20% (v/v) PEG8000、0.5至2 M氯化鈉、5至25 mM EDTA、以及非離子清潔劑，選自於由0.25至4% (v/v) Ecosurf EH-9、0.1至4% (v/v) Triton X-100、0.25至4% (v/v) Tergitol 15-S-40及其混合物所組成的群組。第二清洗緩衝液包括1至25mM氯化六氨合鈷(III)、5至20% (v/v) PEG8000、5至1000mM氯化鈉、以及非離子清潔劑，選自於由0.25至2% (v/v) Ecosurf EH-9、0.1至2% (v/v) Triton X-100、0.25至2% (v/v) Tergitol 15-S-40及其混合物所組成的群組。
在一實施例中，裂解結合緩衝液的pH值為3至5。
在一實施例中，第一清洗緩衝液的pH值為3至5。
在一實施例中，第一清洗緩衝液更包括0.01至1% (v/v)乳酸。
在一實施例中，第二清洗緩衝液的pH值為3至5。
在一實施例中，第二清洗緩衝液更包括0.01至1% (v/v)乳酸。
在一實施例中，沖提緩衝液的pH值為8。
在一實施例中，沖提緩衝液包括1至25 mM EDTA。
體現本案特徵與優點的一些實施例將在後段的說明中詳細敘述。應理解的是本案能夠在不同的態樣上具有各種的變化，其皆不脫離本案的範圍，且其中的說明及圖式在本質上為說明之用，而非用以限制本案。
本案提供一種穩定、用戶友好(user-friendly)、環境友好(environment-friendly)、有效且高效的全核酸萃取及純化系統，適用於拭子樣本中的病毒和細菌兩者。此系統包括緩衝液、磁珠和從拭子樣本中萃取核酸的方案。此系統能夠裂解起始材料、將核酸結合到磁珠上、清洗雜質並從磁珠上沖提核酸。相關萃取方案也進行了優化，以實現從拭子樣本病原體中單獨或同時有效萃取 DNA及RNA。
據此，本案提供了一種核酸萃取及純化系統，其採用固相機制，特別是磁分離(magnetic separation)。磁分離利用磁珠，較佳為順磁珠(paramagnetic bead)，來萃取細胞裂解液中的核酸，其原理是透過調節緩衝液條件，即可使磁珠與核酸可逆結合。磁分離沒有離心步驟，不需要去除上清液(supernatant)或更換容器，故可實現全自動化的萃取流程。
在傳統的磁分離技術中，酒精用於大多數清洗緩衝液中，且在一些方案中也用於裂解緩衝液或沖提緩衝液中。然而，由於其揮發性、易燃性、洩漏可能性、以及許多國家對酒精運輸的限制，使得酒精的存在產生問題。因此，本案的緩衝液系統係設計為不含酒精(alcohol-free)，藉此避免酒精帶來的問題。簡言之，本案的磁珠式核酸萃取系統包括複數個磁珠及無酒精緩衝液系統。緩衝液系統包括裂解結合緩衝液(lysis binding buffer)、清洗緩衝液(wash buffer)及沖提緩衝液(elution buffer)，這些緩衝液將詳細描述如下。
裂解結合緩衝液用於裂解樣本以及將核酸結合到磁珠上，其係透過清潔劑(detergent)、離液鹽(chaotropic salt)、沉澱劑(precipitant)、以及最佳pH值的鹽類所共同達成。
清潔劑可破壞脂質生物層的結構和微生物膜中的一些蛋白質，藉此破壞膜的完整性並促進細胞裂解。根據分子結構的不同，清潔劑可分為陰離子清潔劑(anionic detergent)、陽離子清潔劑(cationic detergent)、非離子清潔劑(non-ionic detergent)和兩性離子清潔劑(zwitter ionic detergent)四種。在本案中，裂解結合緩衝液採用的是非離子清潔劑。
在一實施例中，非離子清潔劑選自於由NP-40替代物(NP-40 alternative，CAS編號為9016-45-9，且不含NP-40)、Tergitol 15-S-40 (二級醇乙氧基化物(secondary alcohol ethoxylate)，CAS編號為84133-50-6)、Ecosurf EH-9 (2-乙基己-1-醇；2-甲基環氧乙烷；環氧乙烷(2-ethylhexan-1-ol;2-methyloxirane;oxirane，CAS編號為64366-70-7)及其混合物所組成的群組，其中，NP-40替代物濃度為0.5至4% (v/v)，較佳為0.8 至 1% (v/v)；Tergitol 15-S-40濃度為0.5至4% (v/v)，較佳為0.5至1.25% (v/v)；Ecosurf EH-9濃度為0.5至4% (v/v)，較佳為0.5至1.25% (v/v)。本案提供了三組裂解結合緩衝液，其係分別由NP-40替代物、Tergitol 15-S-40、或Ecosurf EH-9所配製而成。
離液鹽因具有破壞疏水相互作用(hydrophobic interaction)的能力，故能夠使蛋白質變性。離液鹽有助於細胞膜裂解、核酸酶失活、以及促進核酸與磁珠結合。在一實施例中，硫氰酸胍(guanidine thiocyanate，GuSCN)是最有效的離液劑之一，用於本案的裂解結合緩衝液中，且GuSCN的濃度為0.5至4M，較佳為1至3M。
DNA或RNA沉澱為從樣本的其他成分中分離出核酸的重要步驟，其可採用多種機制來進行，最突出的兩種機制是降低這些大分子之間的排斥力，如同多價陽離子的情況，以及減弱核酸和水分子之間的相互作用。酒精是減少核酸和水分子之間相互作用的有效沉澱劑，但它存在如上所述的問題。
在本案中，裂解結合緩衝液採用的是不含酒精的沉澱劑。在一實施例中，沉澱劑包括濃度為5至20% (v/v)，較佳為5至10% (v/v)的高分子量PEG8000，以及濃度為10至1000 mM，較佳為10至50 mM的檸檬酸鈉(sodium citrate)，以有效濃縮樣本中的核酸，後者還有助於螯合可活化DNase和RNase的金屬離子。在一些實施例中，PEG8000可由具有不同分子量的其他PEG替代。
除了化學物質的合理選擇及其較佳濃度選定之外，另一個重要因素是緩衝液的pH值。經特殊製造的磁珠表面具有功能基團，可特異性附著和分離核酸，此功能取決於緩衝液的pH值。裂解結合緩衝液的pH值為3至5，由三羥甲基胺基甲烷-乙酸鹽(Tris-acetate)來提供，其濃度為5至100 mM，較佳為5至20 mM，且在該濃度下磁珠具有最高的結合能力。
因此，如上所述，本案的磁珠式核酸萃取系統中使用的裂解結合緩衝液包括0.5至4 M GuSCN、5至20% (v/v) PEG8000、10至1000 mM檸檬酸鈉、以及非離子清潔劑，選自於由0.5至4% (v/v) NP-40替代物、0.5至4% (v/v) Tergitol 15-S-40、0.5至4% (v/v) Ecosurf EH-9及其混合物所組成的群組。裂解結合緩衝液的pH值用濃醋酸進行調整。本案提供三組裂解結合緩衝液A、B、C，其配方如下表1至表3所示。
表1：裂解結合緩衝液A
成分 濃度範圍
Tris-acetate (pH 3至5) 5至100 mM
GuSCN 0.5至4 M
PEG 8000 5至20% (v/v)
Ecosurf EH-9 0.5至4% (v/v)
檸檬酸鈉 10至1000 mM
表2：裂解結合緩衝液B
成分 濃度範圍
Tris-Acetate (pH3至5) 5至100 mM
GuSCN 0.5至4 M
PEG 8000 5至20% (v/v)
NP-40替代物 0.5至4% (v/v)
檸檬酸鈉 10至1000 mM
表3：裂解結合緩衝液C
成分 濃度範圍
Tris-Acetate (pH3至5) 5至100 mM
GuSCN 0.5至4 M
PEG 8000 5至20% (v/v)
Tergitol 15-S-40 0.5至4% (v/v)
檸檬酸鈉 10至1000 mM
清洗緩衝液用於從核酸中去除樣本中存在的雜質。由於核酸與磁珠結合，清洗緩衝液在去除雜質時必須最小程度地破壞磁珠上結合的核酸。本案的磁珠式核酸萃取系統使用至少兩種清洗緩衝液，每種清洗緩衝液均包括清潔劑、離液鹽、沉澱劑、螯合劑(chelating agent)、以及最佳pH值的鹽類。
在本案中，清洗緩衝液採用非離子清潔劑來幫助去除雜質。在一實施例中，非離子清潔劑選自於由Ecosurf EH-9、Triton X-100、Tergitol 15-S-40及其混合物所組成的群組。在本案第一清洗緩衝液中，Ecosurf EH-9濃度為0.25至4% (v/v)，較佳為0.5 至 1.25% (v/v)；Triton X-100濃度為0.1至 4% (v/v)，較佳為0.1 至 2% (v/v)；Tergitol 15-S-40濃度為0.25至4% (v/v)，較佳為0.5至1% (v/v)。而在本案第二清洗緩衝液中，Ecosurf EH-9濃度為0.25至2% (v/v)，較佳為0.25至0.75% (v/v)；Triton X-100濃度為0.1至2% (v/v)，較佳為0.1至1% (v/v)；Tergitol 15-S-40濃度為0.25至2% (v/v)，較佳為0.25至0.75% (v/v)。本案提供了三組清洗緩衝液，其係分別由Triton X-100、Tergitol 15-S-40或Ecosurf EH-9所配製而成。
在一實施例中，清洗緩衝液的pH值為3至5，由濃度為10至100 mM的Tris-HCl提供，其係最適合維持核酸在磁珠上的結合。可選擇地，也可以在清洗緩衝液中加入乳酸(lactic acid)來調節清洗緩衝液的pH值，且清洗緩衝液中乳酸的濃度為0.01至1% (v/v)，較佳為0.01至0.5% (v/v)。
在一實施例中，本案的第一清洗緩衝液也採用最有效離液劑之一的硫氰酸胍(GuSCN)，且GuSCN的濃度為0.5至3 M，較佳為1至2 M。第二清洗緩衝液則採用氯化六氨合鈷(III) (hexammine cobalt (III) chloride)，其濃度為1至25 mM，較佳為1至5 mM，由於它是四價金屬離子，為一種可選擇性沉澱RNA的壓實劑(compaction agent)，具有高RNA親和力，但在RNA純化過程中可以很容易地從RNA分子中剝離，而不會破壞RNA分子。
清洗緩衝液採用5至20% (v/v)，較佳為5至10% (v/v)的高分子量 PEG8000，以有效濃縮來自樣本的核酸。第一清洗緩衝液採用濃度為0.5至2 M，較佳為0.5至1 M的氯化鈉，而第二清洗緩衝液則採用濃度為5至1000 mM，較佳為20至200 mM的氯化鈉，以幫助維持離子介質的強度並促進細胞成分釋放到溶液中。乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)是一種螯合劑，採用於第一清洗緩衝液的濃度為5至25 mM，其有助於滅活核酸酶並有助於防止DNA和RNA的降解。
如上所述，本案的磁珠式核酸萃取系統中使用的第一清洗緩衝液包括0.5至3 M GuSCN、5至20% (v/v) PEG8000、0.5至2 M氯化鈉、5至25 mM EDTA、以及非離子清潔劑，選自於由0.25至4% (v/v) Ecosurf EH-9、0.1至4% (v/v) Triton X-100、0.25至4% (v/v) Tergitol 15-S-40及其混合物所組成的群組。第一清洗緩衝液的pH值用1 M HCl調整至3至5。可選擇地，也可以在第一清洗緩衝液中加入0.01至1% (v/v)的乳酸來調節pH值。本案提供三組第一清洗緩衝液A、B、C，其配方如下表4至表6所示。
表4：第一清洗緩衝液A
成分 濃度範圍
Tris-HCl (pH 3至5) 10至100 mM
PEG8000 5至20% (v/v)
氯化鈉 0.5至2 M
EDTA 5至25 mM
GuSCN 0.5至3 M
乳酸 0.01至1% (v/v)
Ecosurf EH-9 0.25至4% (v/v)
表5：第一清洗緩衝液B
成分 濃度範圍
Tris-HCl (pH 3至5) 10至100 mM
PEG8000 5至20% (v/v)
氯化鈉 0.5至2 M
EDTA 5至25 mM
GuSCN 0.5至3 M
乳酸 0.01至1% (v/v)
Triton X-100 0.1至4% (v/v)
表6：第一清洗緩衝液C
成分 濃度範圍
Tris-HCl (pH 3至5) 10至100 mM
PEG8000 5至20% (v/v)
氯化鈉 0.5至2 M
EDTA 5至25 mM
GuSCN 0.5至3 M
乳酸 0.01至1% (v/v)
Tergitol 15-S-40 0.25至4% (v/v)
如上所述，本案的磁珠式核酸萃取系統中使用的第二清洗緩衝液包括1至25mM 氯化六氨合鈷(III)、5至20% (v/v) PEG8000、5至1000mM氯化鈉、以及非離子清潔劑，選自於由0.25至2% (v/v) Ecosurf EH-9、0.1至2% (v/v) Triton X-100、0.25至2% (v/v) Tergitol 15-S-40及其混合物所組成的群組。第二清洗緩衝液的pH值用1 M HCl調整至3至5。可選擇地，也可以在第二清洗緩衝液中加入0.01至1% (v/v)的乳酸來調節pH值。本案提供三組第二清洗緩衝液A、B、C，其配方如下表7至表9所示。
表7：第二清洗緩衝液A
成分 濃度範圍
Tris-HCl (pH 3至5) 10至100 mM
PEG8000 5至20% (v/v)
氯化鈉 5至1000 mM
氯化六氨合鈷(III) 1至25 mM
乳酸 0.01至1% (v/v)
Ecosurf EH-9 0.25至2% (v/v)
表8：第二清洗緩衝液B
成分 濃度範圍
Tris-HCl (pH 3至5) 10至100 mM
PEG8000 5至20% (v/v)
氯化鈉 5至1000 mM
氯化六氨合鈷(III) 1至25 mM
乳酸 0.01至1% (v/v)
Triton X-100 0.1至2% (v/v)
表9：第二清洗緩衝液C
成分 濃度範圍
Tris-HCl (pH 3至5) 10至100 mM
PEG8000 5至20% (v/v)
氯化鈉 5至1000 mM
氯化六氨合鈷(III) 1至25 mM
乳酸 0.01至1% (v/v)
Tergitol 15-S-40 0.25至2% (v/v)
沖提緩衝液能夠從磁珠中釋放核酸。當緩衝液中的鹽濃度較低時，核酸分子可以接觸到水分子，使得核酸分子在沖提階段轉變為完全水合的形式。
本案沖提緩衝液的pH值為8，其係由Tris-HCl所提供，在該pH值下核酸與磁珠的結合被破壞，使得核酸從磁珠上釋放。
在一實施例中，Tris-HCl (pH 8)的最佳濃度為1至100 mM，而EDTA的最佳濃度為1至25 mM。如有必要，可用50 mM HCl將pH值調整為8。本案沖提緩衝液的配方如下表10所示。
表10：沖提緩衝液
成分 濃度範圍
Tris-HCl (pH 8) 1至100 mM
EDTA 1至25 mM
使用上述緩衝液及磁珠所開發的相關萃取方案能夠從拭子樣本中分別提取DNA和RNA以及同時提取DNA和RNA。
本案系統可與具有各種塗層和粒徑的不同類型磁珠一起使用。磁珠的塗層可為但不限於二氧化矽、聚合物、羧基或PEG，而磁珠的粒徑範圍為10 nm至3 μm。本案系統可用於手動純化，也可整合到裝置中，用於從拭子樣本中自動製備核酸。
本案也提供了一種使用上述緩衝液及磁珠的磁珠式核酸萃取方法。下面舉例說明在工作台上用根據上述實施例製備的裂解結合緩衝液、第一清洗緩衝液、第二清洗緩衝液、及沖提緩衝液在1.5 ml Eppendorf管中手動萃取核酸的程序。
1. 將15 μ1磁珠吸取到1.5 ml Eppendorf管中。
2. 將600 μ1裂解緩衝液加入管中。可選擇性震盪或利用移液器進行短時間混合，直到獲得均勻的混合物。
3. 將300 μ1樣本加入到含有磁珠的裂解緩衝液中，並重新懸浮整個混合物直到形成均勻的混合物。
4. 將管子在室溫下放置4分鐘。不需要連續攪拌/重新懸浮。
5. 將管子放在磁力架上30秒或直到上清液變澄清，然後小心地取出並丟棄上清液。(注意：核酸/磁珠複合物會貼附在Eppendorf管的一側，具有可見的深色凝膠狀外觀。)
6. 從磁力架上取下管子。加入200 μl的第一清洗緩衝液並重新懸浮核酸/磁珠複合物，直到它均勻分散。
7. 將管子放在磁力架上並靜置20秒或直到上清液變澄清。小心地取出並丟棄上清液。
8. 從磁力架上取下管子。加入200 μl的第二清洗緩衝液並重新懸浮核酸/磁珠複合物，直到它均勻分散。
9. 將管子放在磁力架上並靜置20秒或直到上清液變澄清。小心地取出並丟棄上清液。
10. 從磁力架上取下管子。將核酸/磁珠複合物重新懸浮於80 μl沖提緩衝液中，直至懸浮液變得均勻。
11. 將混合物在80°C孵育2分鐘，然後迅速離心管子以去除蓋子上的任何液體。將管子放在磁力架上並靜置20秒或直到上清液變澄清。
12. 將含有核酸的上清液轉移到新管中，準備用於下游反應。
以下將以示範例說明利用本案磁珠式核酸萃取方法從不同微生物萃取核酸的應用。
在以下的示範例中，樣本是用病毒運輸培養基(viral transport medium，VTM)及拭子模擬緩衝液製備的。拭子模擬緩衝液的配方如下表11所示。實驗樣本緩衝液包括250 μl VTM及50 μl拭子模擬緩衝液(以下簡稱300 μl實驗樣本緩衝液)。
表11：拭子模擬緩衝液
成分 濃度
豬黏液蛋白(Porcine mucin) 2.5% (w/v)
人類全血 1% (v/v)
氯化鈉 0.85% (w/v)
磷酸鹽緩衝鹽水(PBS) 1x
甘油 15% (v/v)
示範例1例示使用緩衝液組A從人類冠狀病毒HCoV-OC43手動萃取RNA，其中緩衝液組A包括裂解結合緩衝液A、第一清洗緩衝液A、第二清洗緩衝液A、及本案沖提緩衝液。將1 pfu (plaque-forming unit，病毒數量的一種單位)的HCoV-OC43摻入300 μl實驗樣本緩衝液中，然後使用緩衝液組A進行上述萃取程序。將10 μl所獲取的沖提液用於qPCR反應以進行HCoV-OC43的目標檢測。第1圖顯示示範例1中qPCR分析的擴增曲線及Cq值，結果顯示緩衝液組A可以成功地萃取HCoV-OC43的RNA，且不影響後續的核酸擴增和檢測。
示範例2例示使用緩衝液組A從金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)手動萃取DNA，其中緩衝液組A包括裂解結合緩衝液A、第一清洗緩衝液A、第二清洗緩衝液A、及本案沖提緩衝液。將10^5 cfu (colony-forming unit，細菌數量的一種單位)的金黃色葡萄球菌摻入300 μl實驗樣本緩衝液中，然後使用緩衝液組A進行上述萃取程序。將10 μl所獲取的沖提液用於qPCR反應以進行金黃色葡萄球菌的目標檢測。第2圖顯示示範例2中qPCR分析的擴增曲線及Cq值，結果顯示緩衝液組A可以成功地萃取金黃色葡萄球菌的DNA，且不影響後續的核酸擴增和檢測。
示範例3例示使用緩衝液組A從人類腺病毒3型(Human adenovirus 3，Ad3)手動萃取DNA，其中緩衝液組A包括裂解結合緩衝液A、第一清洗緩衝液A、第二清洗緩衝液A、及本案沖提緩衝液。將2500 pfu的人類腺病毒3型摻入300 μl實驗樣本緩衝液中，然後使用緩衝液組A進行上述萃取程序。將10 μl所獲取的沖提液用於qPCR反應以進行人類腺病毒3型的目標檢測。第3圖顯示示範例3中qPCR分析的擴增曲線及Cq值，結果顯示緩衝液組A可以成功地萃取人類腺病毒3型的DNA，且不影響後續的核酸擴增和檢測。
示範例4例示使用緩衝液組B從人類冠狀病毒HCoV-OC43手動萃取RNA，其中緩衝液組B包括裂解結合緩衝液B、第一清洗緩衝液B、第二清洗緩衝液B、及本案沖提緩衝液。將3 x 10^-4 pfu的HCoV-OC43摻入300 μl實驗樣本緩衝液中，然後使用緩衝液組B進行上述萃取程序。將10 μl所獲取的沖提液用於qPCR反應以進行HCoV-OC43的目標檢測。第4圖顯示示範例4中qPCR分析的擴增曲線及Cq值，結果顯示緩衝液組B可以成功地萃取HCoV-OC43的RNA，且不影響後續的核酸擴增和檢測。
示範例5例示使用緩衝液組B從金黃色葡萄球菌手動萃取DNA，其中緩衝液組B包括裂解結合緩衝液B、第一清洗緩衝液B、第二清洗緩衝液B、及本案沖提緩衝液。將100 cfu的金黃色葡萄球菌摻入300 μl實驗樣本緩衝液中，然後使用緩衝液組B進行上述萃取程序。將10 μl所獲取的沖提液用於qPCR反應以進行金黃色葡萄球菌的目標檢測。第5圖顯示示範例5中qPCR分析的擴增曲線及Cq值，結果顯示緩衝液組B可以成功地萃取金黃色葡萄球菌的DNA，且不影響後續的核酸擴增和檢測。
示範例6例示使用緩衝液組B從人類腺病毒3型手動萃取DNA，其中緩衝液組B包括裂解結合緩衝液B、第一清洗緩衝液B、第二清洗緩衝液B、及本案沖提緩衝液。將0.375 pfu的人類腺病毒3型摻入300 μl實驗樣本緩衝液中，然後使用緩衝液組B進行上述萃取程序。將10 μl所獲取的沖提液用於qPCR反應以進行人類腺病毒3型的目標檢測。第6圖顯示示範例6中qPCR分析的擴增曲線及Cq值，結果顯示緩衝液組B可以成功地萃取人類腺病毒3型的DNA，且不影響後續的核酸擴增和檢測。
示範例7例示使用緩衝液組C從人類冠狀病毒HCoV-OC43手動萃取RNA，其中緩衝液組C包括裂解結合緩衝液C、第一清洗緩衝液C、第二清洗緩衝液C、及本案沖提緩衝液。將3 x 10^-4 pfu的HCoV-OC43摻入300 μl實驗樣本緩衝液中，然後使用緩衝液組C進行上述萃取程序。將10 μl所獲取的沖提液用於qPCR反應以進行HCoV-OC43的目標檢測。第7圖顯示示範例7中qPCR分析的擴增曲線及Cq值，結果顯示緩衝液組C可以成功地萃取HCoV-OC43的RNA，且不影響後續的核酸擴增和檢測。
示範例8例示使用緩衝液組C從金黃色葡萄球菌手動萃取DNA，其中緩衝液組C包括裂解結合緩衝液C、第一清洗緩衝液C、第二清洗緩衝液C、及本案沖提緩衝液。將100 cfu的金黃色葡萄球菌摻入300 μl實驗樣本緩衝液中，然後使用緩衝液組C進行上述萃取程序。將10 μl所獲取的沖提液用於qPCR反應以進行金黃色葡萄球菌的目標檢測。第8圖顯示示範例8中qPCR分析的擴增曲線及Cq值，結果顯示緩衝液組C可以成功地萃取金黃色葡萄球菌的DNA，且不影響後續的核酸擴增和檢測。
示範例9例示使用緩衝液組C從人類腺病毒3型手動萃取DNA，其中緩衝液組C包括裂解結合緩衝液C、第一清洗緩衝液C、第二清洗緩衝液C、及本案沖提緩衝液。將0.375 pfu的人類腺病毒3型摻入300 μl實驗樣本緩衝液中，然後使用緩衝液組C進行上述萃取程序。將10 μl所獲取的沖提液用於qPCR反應以進行人類腺病毒3型的目標檢測。第9圖顯示示範例9中qPCR分析的擴增曲線及Cq值，結果顯示緩衝液組C可以成功地萃取人類腺病毒3型的DNA，且不影響後續的核酸擴增和檢測。
除PCR反應外，也進一步測試本案手動萃取系統與LAMP反應的相容性。示範例10例示使用本案緩衝液系統從人類冠狀病毒HCoV-OC43手動萃取RNA，其中萃取所得的核酸利用LAMP反應進行檢測。將0.1 pfu的HCoV-OC43摻入300 μl實驗樣本緩衝液中，然後進行上述萃取程序。將10 μl所獲取的沖提液用於LAMP反應以進行HCoV-OC43的目標檢測。第10圖顯示示範例10中LAMP分析的擴增曲線及Cq值，結果顯示本案緩衝液系統也與LAMP反應相容。
示範例11例示使用本案緩衝液系統從人類冠狀病毒HCoV-OC43及金黃色葡萄球菌手動萃取DNA及RNA兩者。將0.1 pfu的HCoV-OC43及10^4 cfu的金黃色葡萄球菌共同摻入300 μl實驗樣本緩衝液中，然後進行上述萃取程序。將10 μl獲取的沖提液用於qPCR反應以分別進行HCoV-OC43及金黃色葡萄球菌的目標檢測。第11A圖及第11B圖顯示示範例11中qPCR分析的擴增曲線及Cq值，結果顯示，除了分別萃取DNA及RNA，本案緩衝液系統也可用於DNA及RNA的同時萃取。
示範例12例示使用本案緩衝液系統從不同濃度的人類冠狀病毒HCoV-OC43中手動萃取RNA。將1.5 x 10^-4 pfu、10^-3 pfu、及10^-2 pfu的HCoV-OC43分別摻入300 μl實驗樣本緩衝液中，然後進行上述萃取程序。將10 μl個別獲取的沖提液用於qPCR反應以進行HCoV-OC43的目標檢測。第12圖顯示示範例12中qPCR分析的擴增曲線及Cq值，結果顯示本案緩衝液系統可以從低濃度的HCoV-OC43中萃取出RNA。
示範例13例示使用本案緩衝液系統從不同濃度的金黃色葡萄球菌中手動萃取DNA。將15 cfu、100 cfu、及1000 cfu的金黃色葡萄球菌分別摻入300 μl實驗樣本緩衝液中，然後進行上述萃取程序。將10 μl個別獲取的沖提液用於qPCR反應以進行金黃色葡萄球菌的目標檢測。第13圖顯示示範例13中qPCR分析的擴增曲線及Cq值，結果顯示本案緩衝液系統可以從低濃度的金黃色葡萄球菌中萃取出DNA。
示範例14例示使用本案緩衝液系統與業界領先的商業套組分別從1.5 x 10^-4 pfu的人類冠狀病毒HCoV-OC43中萃取RNA的比較。本案方案係與Katsura Viral DNA/RNA Respi套組及Macherey-Nagel (MN) NucleoMag Pathogen套組進行比較。將10 μl個別獲取的沖提液用於qPCR反應以進行HCoV-OC43的目標檢測。第14圖顯示示範例14中qPCR分析的擴增曲線及Cq值，結果顯示本案方案具有最佳的性能，其次是Katsura Viral DNA/RNA Respi套組及Macherey-Nagel (MN) NucleoMag Pathogen套組。
示範例15例示使用本案緩衝液系統與業界領先的商業套組分別從15 cfu的金黃色葡萄球菌中萃取DNA的比較。本案方案係與Katsura Viral DNA/RNA Respi套組進行比較。將10 μl個別獲取的沖提液用於qPCR反應以進行金黃色葡萄球菌的目標檢測。第15圖顯示示範例15中qPCR分析的擴增曲線及Cq值，結果顯示本案方案具有優於Katsura Viral DNA/RNA Respi套組的性能。
第16圖顯示本案方案與業界領先的商業套組的核酸萃取方案之周轉時間的比較。如第16圖所示，本案方案的周轉時間不到10分鐘，與業界領先的商業套組相比是最短的。
第17圖顯示本案方案與業界領先的商業套組的特徵比較。如第17圖所示，本案方案不含酒精、不含酶、且只需室溫保存。本案方案中沒有預處理或乾燥步驟，也不需要離心。此外，本案方案在相比的套組中具有最少的總步驟數和最少的總時間。
另一方面，也進一步測試了本案手動萃取系統與不同類型磁珠的相容性。不同類型的磁珠如下表12所示。
表12：磁珠類型
磁珠 塗層 粒徑
A 羧基(Carboxyl) 10 nm
B 羧基(Carboxyl) 20 nm
C 羧基(Carboxyl) 200 nm
D 二氧化矽及羧基修飾(Silica, carboxyl modified) 300-500 nm
E 二氧化矽(Silica) 10 nm
F 聚乙二醇1(PEG1) 10 nm
G 聚合物(Polymer) 1-3 um
H 羧基(Carboxyl) 0.8-1 μm
I 矽醇(Silanol) 0.2-2 μm
J 二氧化矽(Silica) 2-10 μm
第18A圖及第18B圖顯示使用不同類型的磁珠進行核酸萃取的qPCR分析的擴增曲線及Cq值，結果顯示本案方案可用於具有各種塗層和粒徑的不同類型的磁珠。
本案方案對於自動化核酸萃取也是理想的。例如，本案方案可應用於自動核酸萃取機(M32核酸萃取機，Katsura Biological Corp.)。第19圖顯示在自動核酸萃取機上使用Vircell RNA與本案方案的產量標準曲線，結果顯示出極好的線性，也證明本案方案可良好地整合到自動核酸萃取裝置中。
此外，第20圖顯示在自動核酸萃取機M32上使用Vircell RNA與本案方案與業界領先的商業套組Qiagen viral RNA kit的產量比較。結果顯示，在使用Vircell RNA進行測試時，相較於業界領先的商業套組，本案方案具有良好的回收率。
根據上述，本案展示了一種新穎的核酸萃取系統，其具有原始開發的緩衝液及相關方案，以解決先前技術中遇到的挑戰，並滿足WHO對POC檢測之要求，亦即由字首縮寫ASSURED標準所描述，為可負擔的(affordable)、靈敏的(sensitive)、專一的(specific)、用戶友好(user-friendly)、快速和穩健的(rapid and robust)、無設備的(equipment-free)、以及可交付給終端用戶的(deliverable to end-users)。
據此，本案提供了一種穩定、用戶友好、環境友好、有效且高效的核酸萃取及純化系統，適用於拭子樣本中的病原體。此系統包括緩衝液、磁珠和從拭子樣本中萃取核酸的方案。緩衝液包括在室溫下儲存穩定的裂解結合緩衝液、清洗緩衝液及沖提緩衝液。緩衝液包括特殊選擇的離液鹽、清潔劑、沉澱劑、及其他可理想萃取核酸所需的成分。此系統能夠裂解起始材料、將核酸結合到磁珠上、清洗掉抑制劑或碎片、以及從磁珠上沖提核酸。相關方案經過優化，可達成從拭子樣本的病毒和細菌中單獨或同時有效萃取DNA和RNA。
因此，本案之磁珠式核酸萃取系統具有以下優點。
1. 用戶友好和環境友好
本案不包括任何腐蝕性、致癌、有毒、有害或易燃的成分，這些成分可能對處理或使用它的人以及儲存和使用這些成分的環境產生不利影響。本案避免了使用其他DNA分離程序中常用的有機溶劑，包括乙醇。
2. 具有成本效益且便於運輸、儲存和使用
本案使用的原始配製緩衝液和磁珠在室溫下可穩定儲存。這些緩衝液經過特殊配製，無需包含用於細胞裂解的酶(如蛋白酶 K)，特別是一些需要苛刻裂解條件及/或破壞細胞裂解後釋放的核酸酶的細菌。排除通常需要在-20°C下儲存的溫度敏感成分，例如酶和載體RNA/DNA，使得本系統在室溫下儲存、運輸和使用時可保持穩定。
3. 周轉時間短
本案使用磁珠作為萃取工具，一旦核酸從細胞裂解中釋放出來，磁珠便特異性結合核酸，並在清洗步驟中固持核酸以去除雜質。在磁板的磁力作用下，磁珠從溶液中分離出來的速度非常快，可在 30 秒內完成。再加上高效的細胞裂解和沖提，即使手動萃取也只需不到10分鐘，而較快的商業套組則需要大約半小時。
4. 可從拭子樣本病原體(包括病毒和大多數細菌)萃取DNA和RNA的通用配方及工作流程
本案能夠從分別的樣本或一個樣本中的多種病原體中萃取DNA和RNA兩者。這比大多數用於從單一類型病原體(例如病毒或細菌)中特異性提取RNA或DNA的商業套組還要好。
5. 自動化和高通量的巨大潛力
大多數市售核酸萃取套組要求終端用戶提供消耗品及/或設備清單，這只能由設施完善的實驗室滿足，並且需要額外的離心步驟(例如基於柱(column)的方法)。由於本案採用磁珠分離技術，核酸萃取的全部過程可以在一個容器內完成，例如手動萃取採用的1.5 mL Eppendorf管。藉助於液體處理系統，可以實現全自動化和高通量的樣本處理。
6. 性能與業界領先的商業核酸萃取套組相比具有競爭力
比較數個商業套組的萃取效率，結果顯示，相較於Katsura Viral DNA/RNA Respi套組、Macherey-Nagel NucleoMag Pathogen套組和QIAamp Viral RNA Mini套組，本案展示了相當或更好的性能。
縱使本發明已由上述實施例詳細敘述而可由熟悉本技藝人士任施匠思而為諸般修飾，然皆不脫如附申請專利範圍所欲保護者。
無
第1圖顯示示範例1中qPCR分析的擴增曲線及Cq值。 第2圖顯示示範例2中qPCR分析的擴增曲線及Cq值。 第3圖顯示示範例3中qPCR分析的擴增曲線及Cq值。 第4圖顯示示範例4中qPCR分析的擴增曲線及Cq值。 第5圖顯示示範例5中qPCR分析的擴增曲線及Cq值。 第6圖顯示示範例6中qPCR分析的擴增曲線及Cq值。 第7圖顯示示範例7中qPCR分析的擴增曲線及Cq值。 第8圖顯示示範例8中qPCR分析的擴增曲線及Cq值。 第9圖顯示示範例9中qPCR分析的擴增曲線及Cq值。 第10圖顯示示範例10中LAMP分析的擴增曲線及Cq值。 第11A圖及第11B圖顯示示範例11中qPCR分析的擴增曲線及Cq值。 第12圖顯示示範例12中qPCR分析的擴增曲線及Cq值。 第13圖顯示示範例13中qPCR分析的擴增曲線及Cq值。 第14圖顯示示範例14中qPCR分析的擴增曲線及Cq值。 第15圖顯示示範例15中qPCR分析的擴增曲線及Cq值。 第16圖顯示本案方案與業界領先的商業套組的核酸萃取方案之周轉時間的比較。 第17圖顯示本案方案與業界領先的商業套組的特徵比較。 第18A圖及第18B圖顯示使用不同類型的磁珠進行核酸萃取的qPCR分析的擴增曲線及Cq值。 第19圖顯示在自動核酸萃取機上使用Vircell RNA與本案方案的產量標準曲線。 第20圖顯示在自動核酸萃取機上使用Vircell RNA與本案方案與業界領先的商業套組的產量比較。

Claims (8)

  1. 一種磁珠式核酸萃取系統，包括： 複數個磁珠；以及 一無酒精緩衝液系統，包括： 一裂解結合緩衝液，包括0.5至4 M硫氰酸胍、5至20% (v/v) PEG8000、10至1000 mM檸檬酸鈉、以及一非離子清潔劑，選自於由0.5至4% (v/v) NP-40替代物、0.5至4% (v/v) Tergitol 15-S-40、0.5至4% (v/v) Ecosurf EH-9及其混合物所組成的群組； 一第一清洗緩衝液，包括0.5至3 M硫氰酸胍、5至20% (v/v) PEG8000、0.5至2 M氯化鈉、5至25 mM EDTA、以及一非離子清潔劑，選自於由0.25至4% (v/v) Ecosurf EH-9、0.1至4% (v/v) Triton X-100、0.25至4% (v/v) Tergitol 15-S-40及其混合物所組成的群組； 一第二清洗緩衝液，包括1至25mM氯化六氨合鈷(III)、5至20% (v/v) PEG8000、5至1000mM氯化鈉、以及一非離子清潔劑，選自於由0.25至2% (v/v) Ecosurf EH-9、0.1至2% (v/v) Triton X-100、0.25至2% (v/v) Tergitol 15-S-40及其混合物所組成的群組；以及 一沖提緩衝液。
  2. 如請求項1所述的磁珠式核酸萃取系統，其中該裂解結合緩衝液的pH值為3至5。
  3. 如請求項1所述的磁珠式核酸萃取系統，其中該第一清洗緩衝液的pH值為3至5。
  4. 如請求項1所述的磁珠式核酸萃取系統，其中該第一清洗緩衝液更包括0.01至1% (v/v)乳酸。
  5. 如請求項1所述的磁珠式核酸萃取系統，其中該第二清洗緩衝液的pH值為3至5。
  6. 如請求項1所述的磁珠式核酸萃取系統，其中該第二清洗緩衝液更包括0.01至1% (v/v)乳酸。
  7. 如請求項1所述的磁珠式核酸萃取系統，其中該沖提緩衝液的pH值為8。
  8. 如請求項1所述的磁珠式核酸萃取系統，其中該沖提緩衝液包括1至25 mM EDTA。
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