TW202336236A

TW202336236A - 偵測生物污染物之組成物及方法

Info

Publication number: TW202336236A
Application number: TW112118669A
Authority: TW
Inventors: 瑟奇曼波埃霍; 謝爾登米克; 保羅韋肖
Original assignee: 美商再生元醫藥公司
Priority date: 2015-03-27
Filing date: 2016-03-24
Publication date: 2023-09-16
Also published as: KR20240063188A; EA201792155A1; CA2980915A1; MX2017012437A; ZA201806101B; AU2022246398A1; EP3699298A1; CN107960108B; US11549154B2; EA202190319A1; ZA201706797B; IL302434A; EP3699298B1; JP6670847B2; IL281579B; JP2021121226A; DK3274469T3; EP4361290A3; JP2023184743A; CN107960108A

Abstract

本發明係提供可用於測定微生物汙染物是否存在生物治療劑生產製程中之組成物和方法。特言之，係提供能快速且即時偵測偽陽性結果之人工正增幅對照質體及獨特定量PCR偵測探針。

Description

偵測生物污染物之組成物及方法

本發明一般而言係關於經由細胞培養製造生物分子之方法。本發明係關於，更特言之，但非絕對，用於偵測細胞培養中之生物汙染物的組成物和方法。

生物醫藥，特別是治療性抗體，係由哺乳動物細胞培養所產生。中國倉鼠卵巢(CHO)細胞為最常用的宿主細胞。這些生產系統易受到偶發和內生性病毒感染，其呈現了生物醫藥之一潛在的安全問題。病毒清除程序和病毒載量測量因此被用於提升藥物的安全性。用於降低病毒載量之步驟包括奈米過濾、藉由熱或固定pH使病毒失活，以及層析。病毒載量及病毒移除之效率可藉由耗時的感染性分析或藉由快速定量分析，例如即時PCR或定量聚合酶連鎖反應(Q-PCR)來監測。

Q-PCR需要可靠的適合負對照組和正對照組。將核酸萃取對照物加到試驗樣本中以控制適當的核酸萃取。若在Q-PCR期間，核酸萃取對照物為陰性或在預期的回收範圍以外，則拒絕該樣本。相反地，若在Q-PCR期間，核酸萃取對照物為陽性或在預期的回收範圍之內，則來自該樣本的核酸萃取被認為是可靠的。負對照通常係包括在Q-PCR分析中，例如無樣本緩衝劑。負對照中陽性訊號的出現可能意味著Q-PCR汙染或核酸萃取試劑帶有病毒物質。

正增幅對照亦可能包括在Q-PCR病毒載量分析中。此一正對照可包括保守的病毒核酸序列，其係使用增幅真正病毒污染物之引子增幅。若試驗樣本中存有汙染物的話，Q-PCR無法偵測正對照物可能表示增幅程序無法偵測病毒污染物。

使用仿效目標污染物的正增幅對照，產生其本身的問題。若試驗樣本受到即使微量的正對照污染，考慮到Q-PCR之精細敏感性，試驗樣本可能顯示偽陽性。藉由使用低量的正增幅對照、使用隔離室進行正對照工作、使用UNG/dUTP系統選擇性降解含有dUTP之PCR產物、使用一次性使用的容器和置換移液管，以及藉由徹底清潔工作區域及設備，可能將偽陽性減低至某個程度。無論是否使用這些講究的緩和劑，在PCR試驗期間仍會發生偽陽性結果。

在生物醫藥製造中，得到生物污染物之偽陽性風險為不容忽視的且可能導致昂貴的校正措施。對於測定一特定陽性PCR結果是否為真正陽性或因正對照之交叉污染所造成的偽陽性之系統和方法有很大的需要。申請者們已開發出且目前揭示了得以即時測定偽陽性Q-PCR訊號之正對照組成物、系統及方法。

申請人已解決了即時鑑定試驗樣本中目標污染物之陽性Q-PCR訊號是否為真正陽性或為交叉污染之偽陽性的問題。申請人已製造出一正增幅對照質體，其係包括一生物污染物目標序列(亦即正對照序列)和一獨特人工質體-專一性序列。當此質體在一樣本中時，此獨特人工質體-專一性序列使得分析技術員能專一性鑑別此質體。因此，當偵測到陽性污染物訊號且此人工質體-專一性序列經測定為不存在時，技術人員可確信此結果為真正的陽性結果。相反的，在偽陽性的情況下，此獨特人工質體-專一性序列讓技術人員快速地排除此表面上的陽性結果為一偽陽性。

在某些實施例中，此正對照獨特人工質體-專一性序列(「獨特序列」，亦稱為PACP或正增幅對照聚核苷酸)係使用一包括在Q-PCR反應混合物中的螢光標定人工寡核苷酸偵測探針(「獨特偵測探針」或「UDP」)來偵測。此獨特偵測探針係包括與一螢光基團和一淬滅子(quencher)共價結合之核酸聚合物。此「獨特」核酸聚合物係設計專一黏合此獨特序列及在PCRF期間併入此獨特序列的複製擴增子中。此「獨特」核酸聚合物係經設計，在用於主體分析操作上之雜交條件下，不會辨識或與任何天然生成的小病毒(parvovirus)黏合。在一實施例中，此「獨特」核酸聚合物係包括17至20個核苷酸，其中有不超過七(7)至10個內部連續核苷酸及不超過六(6)個連續3'端核苷酸係與任何小病毒序列相同。在一實施例中，此「獨特」核酸聚合物係包括17至20個核苷酸，其中有不超過7至10個連續核苷酸及不超過六(6)個連續3'端核苷酸係與任何SEQ ID NO：9和12-37所述的小病毒序列相同。當此獨特偵測探針的核酸聚合物並未併入複製的擴增子中時，此淬滅子仍極貼近螢光基團。若螢光基團被激發，則此淬滅子吸收此發射光並防止此光被偵測到(藉由FRET或接觸淬滅)。當核酸聚合物併入複製的擴增子時(亦即當此獨特序列係存在樣本中時)，螢光基團和淬滅子從單一偵測探針釋出起因此在空間上為分開的。在該情況下，當螢光基團被激發，此淬滅子距離夠遠使其無法有效地淬滅此發射光。此發射光因此可被偵測到。因此，當獨特序列係存在樣本中時，在PCR處理時可偵測的發射波長強度增加。當無此獨特序列時，淬滅子進行其工作並且在PCR進行時無偵測到發射波長。在一實施例中，此螢光基團連接在核酸聚合物的5'-端或附近，而淬滅子係在3'-端或附近。在一替代的實施例中，此螢光基團係連接在核酸聚合物的3'-端或附近，而淬滅子係在5'-端或附近。

目前已知的或之後所發現的任何螢光基團-淬滅子對皆可用於施行本發明(參見例如S.A.Marras,“Selection of fluorophore and quencher pairs for fluorescent nucleic acid hybridization probes,”Methods Mol.Biol.2006；335：3-16.)。在某些實施例中，此螢光基團分別具有495nm、538nm或646nm之激發波長及520nm、554nm或669nm之發射波長。在某些實施例中，此淬滅子為一具有430nm至672nm吸收波峰之染劑。在某些實施例中，此淬滅子係由下列組成之群中選出：DDQ-I、Dabcyl、Eclipse、Iowa Black FQ、BHQ-1、QSY-7、BHQ-2、DDQ-II、Iowa Black RQ、QSY-21和DHQ-3。在一實施例中，此螢光基團具有495nm之激發波長及520nm之發射波長，例如FAM，且該淬滅子為BHQ-1。在一實施例中，此核酸聚合物係包括SEQ ID NO：3之核酸序列(5’-TGTCGATGGCGAATGGCTA-3’)。

本發明之一態樣為如上述之此獨特偵測探針本身，其含有核酸聚合物和連接的螢光基團及淬滅子。本發明之其他態樣包括正增幅對照(PAC)質體本身，其係含有一生物污染物目標序列及獨特人工植體-專一性序列，並使用此質體作為正對照來評估細胞培養中是否有目標胜物污染物存在。此PAC質體係用於成功的PCR增幅反應之對照，而該PCR增幅反應係設計供增幅目標生物污染物序列。例如，進行一分開和平行的PCR反應，其含有相同的組份且係在與試驗樣本相同的參數下運作，但含有正對照質體替代試驗樣本。若含有正對照質體的樣本產生陽性「污染物」訊號，但試驗樣本無，則可結論出此試驗樣本係無目標生物污染物。在某些實施例中，此試驗樣本係得自哺乳動物細胞培養，例如含有經工程化產生一感興趣治療蛋白之CHO細胞的生物反應器培養。

在一實施例中，此PAC質體係含有(a)一目標增幅聚核苷酸(TAP)序列，例如小病毒核酸序列或另外的目標污染物之序列，及(b)一質體增幅對照聚核苷酸(PACP)序列。PACP序列[義股或克立克股(Crick strand)]係與此獨特序列探針的核酸聚合物互補[反義股或華生股(Watson strand)]。

在一實施例中，此PAC質體係配置在與含有試驗樣本之Q-PCR反應平行的分開Q-PCR反應。此TAP序列係設計作為目標生物污染物之代表。例如，若試驗樣本Q-PCR反應無法產生TAP擴增子，且該正對照(亦即含PAC質體之樣本)Q-PCR無法產生TAP擴增子，則可推測此Q-PCR反應失敗。在一實施例中，此目標生物污染物為嚙齒類小病毒而此TAP序列係包括一嚙齒類小病毒序列。在一實施例中，此TAP序列係包括全部和部份的小病毒NS1序列，其在數種嚙齒類小病毒株中為保守的。參見See Cotmore,et al.,“Replication Initiator Protein NS1 of the parvovirus Minute Virus of Mice Binds to Modular Divergent Sites Distributed throughout Duplex Viral DNA,”J.Virol.2007 Dec；81(23)：13015-13027。在某些實施例中，此數種嚙齒類小病毒株係包括小鼠細小病毒之原型株(MVMp)、小鼠細小病毒之免疫抑制病毒株(MVMi)、小鼠細小病毒之Cutter病毒株(MVMc)、小鼠小病毒1b(MPV-1b)、小鼠小病毒1a(MPV-1a)、小鼠小病毒1c(MVP-1c)、倉鼠小病毒(HaPV)、杜蘭氏小病毒(H-1)、基爾漢大鼠病毒(KRV)、大鼠小病毒1a(RPV-1a)、大鼠小病毒(RMV)及大鼠L病毒之曼徹斯特大學病毒株(RV-Umass)。參見O.-W.Merten、“Virus Contaminations of Cell Cultures-A Biotechnological View,”Cytotechnology.2002 July；39(2)：91-116。在一實施例中，此TAP序列係包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2之核酸序列及SEQ ID NO：4之補體。

在其他態樣中，本發明係關於PCR混合液組成物及使用此PCR混合物偵測一試驗樣本中的目標污染物之方法並排除因試驗樣本與PAC之污染所造成的偽陽性。

在一實施例中，此PCR混合液中，除了其他之外，係含有一目標污染物專一性的前置寡核苷酸引子、目標污染物專一性寡核苷酸偵測探針、一人工寡核苷酸偵測探針，例如上述之獨特偵測探針(UDP)，以及一目標污染物專一性反置寡核苷酸引子。在其中該目標污染物為嚙齒類小病毒之實施例中，此PCR混合液含有，除了其他之外，係含有一嚙齒類小病毒專一性前置寡核苷酸引子、嚙齒類小病毒專一性寡核苷酸偵測探針、一人工寡核苷酸偵測探針，例如上述之獨特偵測探針(UDP)，以及一嚙齒類小病毒專一性反置寡核苷酸引子。各偵測探針(亦即目標污染物專一性寡核苷酸偵測探針，例如嚙齒類小病毒專一性寡核苷酸偵測探針及人工寡核苷酸偵測探針)係含有一核酸序列其在一端點(5'-或3'-)係連接一螢光基團及在另一端點(分別為3'-或5'-)係連接一淬滅子。

本處，嚙齒類小病毒專一性前置寡核苷酸引子和嚙齒類小病毒專一性寡核苷酸偵測探針之核酸序列係與小病毒之反義股雜交。嚙齒類小病毒專一性反置寡核苷酸引子係與此小病毒的義股雜交。在一實施例中，與此引子和小病毒專一性寡核苷酸探針雜交之小病毒序列，為一保守的嚙齒類小病毒序列。在一案例中，此保守的小病毒序列為一小病毒NS1序列，例如SEQ ID NO：9中所述之核酸序列。藉由使用一保守性序列，單一探針將能有效的偵測多株的嚙齒類小病毒。

在一實施例中，此人工寡核苷酸偵測探針不與小病毒核酸或任何生物污染物序列雜交。此人工寡核苷酸偵測探針之核酸為合成地且不會以任何嚴格性與任何生物生物污染物核酸序列雜交。在一實施例中，人工寡核苷酸偵測探針之核酸(亦稱為「獨特」核酸聚合物或獨特序列)係經設計，在用於主體分析操作上之雜交條件下，不會辨識或與任何天然生成的小病毒黏合。在一實施例中，此「獨特」核酸聚合物係包括17至20個核苷酸，其中有不超過七(7)至10個內部連續核苷酸及不超過六(6)個連續3'端核苷酸係與任何小病毒序列相同。在一實施例中，此「獨特」核酸聚合物係包括17至20個核苷酸，其中有不超過7至10個連續核苷酸及不超過六(6)個連續3'端核苷酸係與任何SEQ ID NO：9和12-37所述的小病毒序列相同。然而，人工寡核苷酸偵測探針之核酸(亦即此獨特序列)係與PAC質體的PACP序列雜交。因此，此人工寡核苷酸偵測探針係偵測PAC質體，而非小病毒或其他生物污染物序列。

在一實施例中，此PCR混合液可用於測定PAC質體是否存在試驗生物樣本中，反映一偽陽性結果。本處，若試驗樣本對小病毒專一性寡核苷酸探針顯示陽性Q-PCR訊號，及人工寡核苷酸偵測探針為陰性Q-PCR訊號，則係推測此試驗樣本並無PAC污染(亦即真正陽性)。

在一實施例中，此目標污染物專一性前置寡核苷酸引子係包括SEQ ID NO：1之序列；此目標污染物專一性寡核苷酸偵測探針核酸係包括SEQ ID NO：2之序列；此人工寡核苷酸偵測探針核酸(亦即UDP)係包括SEQ ID NO：3之序列，此目標污染物專一性反置寡核苷酸引子係包括SEQ ID NO：4之序列。

在其他態樣中，本發明係提供用於一試驗樣本中偵測生物污染物之系統和方法。本處，此試驗樣本為一細胞培養，例如用於生產治療蛋白之工業規模的哺乳動物細胞培養。可用於施行本發明之哺乳動物細胞包括，但不限於CHO細胞、CHO-K1細胞及EESYR細胞(參見美國專利第7,771,997號)。此系統和方法係包括-除了引子之外，探針、混合液和如上述所用之PAC質體-使用核酸萃取對照(NEC)。在一實施例中，此NEC為M13K07噬菌體，其係在核酸萃取之前包括在此試驗樣本中。若核酸萃取能滿足偵測污染物DNA或RNA之目的，則此NEC核酸(例如M13K07核酸)係經由Q-PCR於一「摻添的」試驗樣本中偵測。在一特定的實施例中，此Q-PCR反應混合物係含有一目標污染物專一性前置寡核苷酸引子、目標污染物專一性寡核苷酸偵測探針、人工寡核苷酸偵測探針，例如上述之獨特偵測探針(UDP)、目標污染物專一性反置寡核苷酸引子、NEC專一性前置寡核苷酸引子、NEC專一性寡核苷酸偵測探針及NEC專一性反置寡核苷酸引子。在一實施例中，此試驗樣本係由製造治療蛋白的細胞培養中所採集，其係在核酸萃取及後續的Q-PCR分析之前添加了一NEC(例如一M13K07噬菌體)。

在一特定的實施例中，此目標污染物為嚙齒類小病毒，在該情況下(1)此目標污染物專一性前置寡核苷酸引子為嚙齒類小病毒專一性前置寡核苷酸引子，更特言之係包括SEQ ID NO：1之序列；(2)此目標污染物專一性寡核苷酸偵測探針為嚙齒類小病毒專一性寡核苷酸偵測探針，更特言之係包括SEQ ID NO：2之核酸序列；(3)此人工寡核苷酸偵測探針為單一偵測探針(UDP)，更特言之係包括SEQ ID NO：3之核酸序列；(4)此目標污染物專一性反置寡核苷酸引子為嚙齒類小病毒專一性反置寡核苷酸引子，更特言之係包括SEQ ID NO：4之核酸序列；(5)此NEC專一性前置寡核苷酸引子為M13前置寡核苷酸引子，更特言之係包括SEQ ID NO：5之核酸序列；(6)此NEC專一性寡核苷酸偵測探針為M13偵測探針，更特言之係包括SEQ ID NO：6之核酸序列；及(7)此NEC專一性反置寡核苷酸引子為M13反置寡核苷酸引子，更特言之係包括SEQ ID NO：8之核酸。在此方法之一實施例中，若偵測到一NEC Q-PCR訊號(亦即該訊號係在預期的回收範圍內)，則可推測此試驗樣本的核酸萃取為成功的。另一方面，若無偵測到NEC訊號(亦即該訊號係在預期的回收範圍之外)，則可推測此試驗樣本的核酸萃取為失敗的，且任何陰性的Q-PCR目標污染物訊號則被視為無效的(亦即偽陽性)。

本發明之詳細說明

在描述本發明之前，應了解，本發明不限於所述的特定方法和實驗條件，因為此等方法和條件可改變。亦應了解，文中所用的術語僅作為描述特定實施例之目的，且不希望受限，因為本發明之範圍將僅受限於所附的申請專利範圍。

除非另有說明，否則所有文中所用的技術和科學術語係具有如本發明所屬技術之一般技術者所正常理解之相同意義。如文中所用，術語「大約」當用於有關特定引述的數值時，係指該值可從該引述值做不大於1%的變化。例如，如文中所用，「約100」一詞包括99和101及所有介於之間的值(例如99.1、99.2、99.3、99.4等)。

雖然在施行或試驗本發明時可使用任何類似或相當於該等與文中所述的方法和物質，但較佳的方法和物質為目前所述。文中所提及的所有刊物係以全文引用的方式併入本文中。從接續的詳細說明之論述中其他的實施例將變得顯而易見。

為了使文中所述的本發明可被充份了解，係提出下列詳細的說明。

本發明係關於用於任何製造治療蛋白之細胞培養中偵測任何生物污染物之改良的材料和方法。特言之，本發明係關於併入一容易偵測而消除偽陽性之正增幅對照元素或步驟的定量聚合酶連鎖反應(Q-PCR)材料和方法。

PCR及定量PCR

如文中所用，「聚合酶連鎖反應」(「PCR」)一詞係指藉由使用多個變性(分開模板DNA股)、黏合(單股寡核苷酸與單股模板DNA股雜交)及DNA合成(使用模板DNA股作為膜板，由雜交的寡核苷酸之3'-端待發的DNA聚合酶催化之新DNA股合成)之循環來製造核酸(例如DNA)複製本之方法。就增幅之發生，在PCR反應中係使用至少二種不同的寡核苷酸引子(簡稱為「引子」)。一引子，一般稱為前置引子，係與模板DNA的反義股雜交並形成新合成的義股之5'-端。另一引子，一般稱為反置引子，係與模板DNA的義股雜交並形成新合成的義股之5'-端。在各循環中，各模板股係經複製而形成新的雙股DNA分子，其亦稱為「擴增子」。因此，在非限定量之寡核苷酸引子，DNA聚合酶(亦即Taq聚合酶或其他熱穩定性DNA聚合酶；參見Innis et al.,DNA sequencing with Thermus aquaticus DNA polymerase and direct sequencing of polymerase chain reaction-amplified DNA,85(24)Proc Natl Acad Sci U S A.9436-40(1988))，及核苷酸三磷酸鹽下，DNA分子(模板和擴增子)在各循環變成雙倍。PCR係描述於美國專利第4,683,202號中(28,1987年7月28日所頒予)。亦參見PCR Peimer：A Laboratory Manual(Carl W.Dieffenbach & Gabriela S.Dveksler eds.,1995)。

如文中所用，術語「循環」係指一回合的(1)稱為「變性」之DNA股熔化，接著(2)寡核苷酸引子與生成的單股DNA藉由鹼基-配對規則雜交，一種稱為「黏合」之程序，及(3)由寡核苷酸引子之3'-端開始並以5-引子至3-引子方向移動，將新的DNA聚合，一種稱為「增幅」或「延伸」之程序。一般而言，聚合係使用DNA聚合酶酵素，例如Taq聚合酶來催化相鄰的去氧核苷三酸(「dNTP」)之間形成磷酸二酯鍵，其係沿著暴露的單股模板DNA藉由氫鍵根據鹼基配對規則來制定。變性、黏合和增幅係在特定的溫度，部份係以DNA模板的GC含量和寡核苷酸引子以及所要複製的 DNA股之長度為基準來進行。變性和黏合溫度以及反應緩衝劑的離子強度控制了雜交的嚴格性及DNA複製的精準度。

「定量PCR」或「qPCR」或「Q-PCR」(亦稱為「即時PCR」)為一種能在PCR循環進行期間監測增幅子形成的PCR。Q-PCR可用於定量樣本中特定的模板DNA。Q-PCR除了前置寡核苷酸引子和反置寡核苷酸引子之外，在反應混合物中併入至少一寡核苷酸偵測探針。此偵測探針為一在前置引子結合位置和反至引子結合位置之間的某處，與目標模板DNA之義股或反義股雜交的單股寡核苷酸。在黏合步驟期間，此寡核苷酸偵測探針係與單股模板黏合。當聚合發生時，此探針裂解並被DNA聚合酶之5-引子核酸酶活性所降解。因此，當特定模板序列之增幅發生時，偵測探針係以一指數速率被降解。

Q-PCR寡核苷酸偵測探針一般係以一連接的螢光基團(亦稱為報導子螢光染劑，或簡稱「報導子」)及一連接的淬滅子所建構。在大多數的情況下，此螢光基團係連接在寡核苷酸的5'-端或附近，而淬滅子係連接在寡核苷酸的3'-端或附近。然而，任何可行的結構皆可用於施行本發明。當寡核苷酸偵測探針為完整無缺的，此螢光基團和淬滅子為靠近的使得淬滅子能吸收激發的螢光基團所發射的光，藉此大量地降低可偵測螢光基團發射。當寡核苷酸偵測探針被裂解或降解，螢光基團和淬滅子被釋放出及隨後在空間被隔開。淬滅子不再靠得夠近而足以促滅螢光基團發射。當某些特定的增幅子形成時，更多的寡核苷酸偵測探針被裂解，釋出更多的螢光基團和淬滅子，使得更多成對的螢光基團/淬滅子分開，並增加螢光基團發射的幅度。換言之，增加的螢光基團發射訊號係與樣本中特定目標DNA的量相關。就Q-PCR之評論，請參見Ian M.Mackay et al.,Survey and Summary：Real-Time PCR in Virology,30(6)Nucleic Acids Research 1292-1305(2002)。

螢光淬滅可藉由報導子和淬滅子間的直接接觸(亦稱為靜態淬滅)，或當報導子和淬滅子二者彼此係在佛斯特半徑(Förster radius)內時藉由報導子和淬滅子間的螢光共振能量轉移(FRET)而發生。特定的螢光基團可被一或多種特定波長的光，或一範圍的最大波長所激發。此項係稱為激發波長。在螢光基團被激發後，其回到基態並以比激發波長更長的波長發射。此項稱為發射波長。在FRET期間，第二螢光基團、染劑、鑭系元素分子或其類似物，其具有與螢光基團的發射光譜相符或重疊的吸收光譜，吸收了在佛斯特半徑內之激發螢光基團所發射的光，藉此淬滅或降低螢光發射的波長。當報導子和淬滅子在螢光基團基態時形成三元複合物時，則產生接觸或靜態淬滅。此三元複合物為非螢光的，亦即基本上不可激發的且因此在預期的發射波長下不會發射光。

就靜態淬滅和FRET之評論，請參見Salvatore A.E.Marras et al.,Efficiencies of Fluorescence Resonance Energy Transfer and Contact-Mediated Quenching in Oligonucleotide Probes,30(21)Nucleic Acids Research e122,pp.1-8(2002)。Marras等人亦論述了報導子/淬滅子對之選擇性用於Q-PCR施用上。

核酸

術語「聚核苷酸」、「寡核苷酸」、「探針」、「核苷酸引子」或「寡核苷酸引子」，「模板」或「模板核酸」或「模板DNA」用於文中係根據其分子生物技術之一般技術者所知之一般意義。就各自的詳細解釋，請參見例如PCR Primer：A Laboratory Manual(Carl W.Dieffenbach & Gabriela S.Dveksler eds.,1995)。

如文中所用，「擴增子」係指從模板核酸序列經由PCR增幅所產生的DNA產物。當PCR進行及模板增幅時，新形成的DNA擴增子係作為後續各輪的DNA合成之模板。

細胞培養

本發明係關於用於偵測細胞培養中生物污染物之改良的Q-PCR方法。細胞培養常用於製造治療用途的複合生物分子，例如抗體、陷阱分子和Fc融合蛋白。這些培養應維持無生物污染物。偵測污染物以決定特定批次是否該丟棄或進行補救為重要的。

細胞培養包括培養基和細胞其通常係衍生自單一細胞株。本處，此細胞株係包括能製造生物治療蛋白之細胞。例行上用於製造生物治療劑之細胞株的實例，除了其他外，係包括初級細胞BSC細胞、HeLa細胞、HepG2細胞、LLC-MK細胞、CV-1細胞、COS細胞、VERO細胞、MDBK細胞、MDCK細胞、CRFK細胞、RAF細胞、RK細胞、TCMK-1細胞、LLCPK細胞、PK15細胞、LLC-RK細胞、MDOK細胞、BHK細胞、BHK-21細胞、CHO細胞、CHO-K1細胞、NS-1細胞、MRC-5細胞、WI-38細胞、3T3細胞、293細胞、Per.C6細胞和雞胚胎細胞。中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株或一或多種數種特定CHO細胞變體，例如CHO-K1細胞株係經最適化供大規模的蛋白生產。EESYR®細胞株為經最適化供強化感興趣蛋白生產之特殊化CHO細胞株。就EESYR®細胞之詳細說明請參見美國專利第7,771,997號(2010年8月10日10日頒予)。

「細胞培養」或「培養」係指細胞在多細胞生物或組織外部生長和繁殖的。哺乳動物細胞的適合培養條件已為本項技術所知。參見，例如Animal cell culture：A Practical Approach(D.Rickwood,ed.,1992)。哺乳動物細胞可在懸浮液中或連接一固體基質來培養。流體化床生物反應器、中空纖維生物反應器、旋轉瓶、震盪燒瓶或攪拌桶生物反應器，有或無微載體，以及分批操作、分批給料、連續、半連續或灌注模式為可取得的哺乳動物細胞培養。細胞培養基或濃縮補料培養基可在培養期間連續或間隔加入培養中(亦即分批給料)。例如，培養可每天、每隔一天、每三天給料一次，或可在特定培養基組份之濃度(直接或間接監控)落在所欲範圍之外時給料。

動物細胞，例如CHO細胞或EESYR®細胞可以小規模來培養，例如具有約25ml培養基之125ml容器，具有約50至100ml培養基之250ml容器，具有約100至200ml培養基之500ml容器。另一種選擇，培養可為大規模的，如具有約300至1000ml培養基之1000ml容器，具有約500至3000ml培養基之3000ml容器，具有約2000至8000ml培養基之8000ml容器，及具有約4000至15000ml培養基之15000ml容器。生產用的培養可含有10,000L的培養基或更多。大規模細胞培養，例如臨床的蛋白治療劑之製造，典型地係在細胞製造所欲蛋白時，維養數天或數週。在此期間，培養的樣本可移出並就有無生物污染物存在進行檢測。

治療蛋白之製造

監測生物污染物之生物培養可用於製造蛋白或其他感興趣生物分子，例如治療上有效的抗體或其他生物醫藥原料藥。蛋白產物(感興趣蛋白)，除了其他外，可為抗體、人類抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單株抗體、多專一性抗體、雙專一性抗體、抗原結合的抗體片段、單鏈抗體、雙抗體、三抗體或四抗體、Fab片段或F(ab')2片段、IgA抗體、IgD抗體、IgE抗體、IgM抗體、IgG抗體、IgG1抗體、IgG2抗體、IgG3抗體或gG4抗體。在一實施例中，此抗體為IgG1抗體。在一實施例中，此抗體為IgG2抗體。在一實施例中，此抗體為IgG4抗體。

感興趣蛋白可為含有一Fc基團和另外區域的重組蛋白(例如Fc-融合蛋白)。Fc-融合蛋白可為受體Fc-融合蛋白，含有一或多個受體結合Fc基團之一或多個胞外區。在某些情況下，此Fc基團係包括一絞鏈區接著一IgG之CH2和CH3區。在某些情況下，此受體Fc-融合蛋白係含有二或多個與單一配體或多配體結合的不同受體鏈。例如，此Fc-融合蛋白為一陷阱(trap)，例如IL-1阱(例如列洛西普(rilonacept)，其含有與Il-1R1胞外區融合之IL-1RAcP配體-結合區，而該Il-1R1胞外區係與hIgG1之Fc區融合；參見美國專利第6,927,004號)，或VEGF陷阱(例如阿柏西普(aflibercept)，其係含有與VEGF受體Flk1之Ig 3區融合的VEGF受體Flt1之Ig 2區，而該VEGF受體Flk1之Ig 3區係與hIgG1之Fc區融合；參見美國專利第7,087,411和7,279,159號)。

就蛋白製造，本發明不限於特定類型的細胞或細胞株。適合蛋白製造之細胞類型的實例包括哺乳動物細胞，例如CHO-衍生的細胞如EESYR®、昆蟲細胞、鳥類細胞、細菌細胞和酵母菌細胞。此細胞可為幹細胞或以重組基因表現的載體所轉化之重組細胞，或以製造病毒產物之病毒轉染的細胞。此細胞可含有一編碼感興趣蛋白之重組的異源性聚核苷酸結構。此結構可為游離體(episomal)(例如染色體外質體或片段)或其可為體質上整併至此細胞的基因體。此細胞亦可在不具有於異源多肽結構上所編碼的蛋白下，製造感興趣蛋白。換言之，此細胞可本質上編碼此感興趣蛋白，例如製造抗體的B-細胞。用於基因工程化細胞或細胞株供表現一感興趣蛋白的方法和載體已為本項技術之一般技術者所熟知。例如，Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel et al.,eds.(Wiley & Sons,New York,1988,and quarterly updates)；Sambrook et al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Laboratory Press,1989)；Kaufman,R.J.,Large Scale Mammalian Cell Culture,1990,pp.15-69中所說明的各種技術。適合培養生長之廣泛各種細胞株可得自美國菌種中心(American Type Culture Collection)(Manassas,Va.)和供應商。

此細胞亦可為初級細胞例如雞胚胎細胞，或初級細胞株。可用的細胞實例包括BSC細胞、LLC-MK細胞、CV-1細胞、COS細胞、VERO細胞、MDBK細胞、MDCK細胞、CRFK細胞、RAF細胞、RK細胞、TCMK-1細胞、LLCPK細胞、PK15細胞、LLC-RK細胞、MDOK細胞、BHK-21細胞、雞胚胎細胞、NS-1細胞、MRC-5細胞、WI-38細胞、BHK細胞、293細胞、Per.C6細胞和CHO細胞。在各種實施例中，此細胞株為CHO細胞衍生物，例如CHO-K1、CHO DUX B-11、CHO DG-44、Veggie-CHO、GS-CHO、S-CHO、CHO lec突變株或EESYR®細胞株。

在一特別的情況，此細胞為CHO細胞衍生物，例如異位(異源)表現一蛋白之EESYR®細胞。此蛋白係包括一免疫球蛋白重鏈區，例如CH1、CH2或CH3區。在一實施例中，此蛋白係包括一人類或嚙齒類免疫球蛋白CH2和CH3區。在一實施例中，此蛋白係包括一類或嚙齒類免疫球蛋白CH1、CH2和CH3區。在一實施例中，此蛋白係包括一絞鏈區及一CH1、CH2和CH3區。在一特定的實施例中，此蛋白係包括一免疫球蛋白重鏈可變區。在一特定的實施例中，此蛋白係包括一免疫球蛋白輕鏈可變區。在一特定的實施例中，此蛋白係包括一免疫球蛋白重鏈可變區及一免疫球蛋白輕鏈可變區。在一特定的實施例中，此蛋白為一抗體，例如人類抗體、嚙齒類抗體或嵌合的人類/嚙齒類抗體(例如人類/小鼠、人類/大鼠或人類/倉鼠)。

細胞培養的蛋白製造階段可以任何規模的培養來進行，從個別的燒瓶和震盪器燒瓶或搖動袋至1公升生物反應器，以及大規模工業生物反應器。大規模製程可以約100公升至20,000公升或更多之量來進行。有一或多個之數種方法可用來控制蛋白製造，例如溫度變換和化學誘導。在蛋白表現及/或分泌期間，細胞的生長階段可在高於製造階段的溫度下發生。例如，生長階段可在約35℃至38℃之第一溫度下發生，而製造階段可在約29℃至37℃之第二溫度下發生，視需要從約30℃至36℃或從約30℃至34℃。此外，蛋白製造的化學誘導劑，例如咖啡因、丁酸鹽、泰莫西芬(tamoxifen)、雌基素、四環黴素(tetracycline)、多西環素(doxycycline)及六亞甲基雙乙醯胺(HMBA)，可在溫度變換的同時、之前或之後加入。若誘導劑係在溫度變換之後加入，則其可在溫度變換後的1小時至5天加入，例如溫度變換後的1至2天。製造細胞的培養可以連續給料培養系統，如於恆化器(chemostat)中(參見C.Altamirano et al.,Biotechnol Prog.2001 Nov-Dec；17(6)：1032-41)，或根據分批給料法來運作(Huang,2010)。

治療性蛋白產物

如文中所用「胜肽」、「多肽」和「蛋白」自始至終可交換使用並係指包括二或多個胺基酸殘基彼此藉由胜肽鍵相連接之分子。胜肽、多肽和蛋白亦可包括修飾，例如糖基化、脂質連接、硫化、麩胺酸殘基之γ-羧基化、烷化和ADP-核糖基化。胜肽、多肽和蛋白可具有科學或商業利益，包括蛋白藥物。胜肽、多肽和蛋白包括，尤其是，抗體及嵌合或融合蛋白。胜肽、多肽和蛋白可藉由重組的動物細胞株使用細胞培養法來製造。

「抗體」係指包括藉由雙硫鍵相連接的四條多肽鏈(二條重(H)鏈和二條輕(L)鏈)所組成的免疫球蛋白分子。各重鏈具有一重鏈可變區(HCVR或V_H)及一重鏈恆定區。重鏈恆定區係含有三個區CH1、CH2和CH3區。各輕鏈具有一輕鏈可變區及一輕鏈恆定區。輕鏈恆定區由一個CL區所組成。VH和VL區可進一步細分為高變區，稱為互補決定區(CDR)，其間散佈著較保守性區域，稱為框架區(FR)。各VH和VL係由三個CDR和四個FR所組成，以下列順序由胺基端排列至羧基端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、 FR3、CDR3、FR4。術語「抗體」包括提到的糖基化和非糖基化免疫球蛋白之任何同型或亞類。術語「抗體」包括藉由重組方法製備、表現、創製或分離的抗體分子，例如由轉染表現此抗體之宿主細胞所分離的抗體。術語抗體亦包括雙專一性抗體，其係包括可與一個以上的表位結合之異四聚化免疫球蛋白。雙專一性抗體係一般性描述於美國專利申請公開案第2010/0331527號，其係以引用的方式併入本文中。

術語抗體之「抗原結合部份」(或「抗體片段」)係指一或多種保留與抗原專一結合之能力的抗體片段。涵蓋在術語抗體之「抗原結合部份」內的結合片段之實例包括(i)Fab片段，一種由VL、VH、CL和CH1區所組成的單價片段；(ii)F(ab')2片段，一種包括二個Fab片段藉由雙硫橋在絞鏈區相連結之二價片段；(iii)Fd片段，係由VH和CH1區所組成；(iv)Fv片段，係由抗體單臂之VL和VH區所組成，(v)dAb片段(Ward et al.(1989)Nature 241：544-546)，其係由VH區所組成，(vi)分離的CDR，及(vii)scFv，其係由Fv片段的二個區VL和VH，藉由合成的連接子相連接形成單一蛋白鏈所組成，其中VL和VH區域對係形成單價分子。其他單鏈抗體的形式，例如雙抗體亦涵蓋在術語「抗體」下(參見，例如Holliger et al.(1993)PNAS USA 90：6444-6448；Poljak et al.(1994)Structure 2：1121-1123)。

抗體或其抗原結合部份可為較大免疫黏附分子之部份，其係藉由抗體或抗體部分與一或多種其他蛋白或多肽共價或非共價結合所形成。此等免疫黏附分子之實例包括使用鏈黴親和素核心區來製造四聚化scFv分子(Kipriyanov et al.(1995)Human Antibodies and Hybridomas 6：93-101)及使用半胱胺酸殘基、標記蛋白和C-端聚組銨酸標籤來製造二價及生物素化的scFv分子(Kipriyanov et al.(1994)Mol.Immunol.31：1047-1058)。抗體部份，例如Fab和F(ab')2片段可從完整的抗體使用習知的技術，例如藉由完整抗體之木瓜酶(papain)或胃蛋白酶(pepsin)消化來製備。再者，抗體、抗體部份和免疫黏附分子可使用標準的重組DNA技術來取得(參見Sambrook et al.,1989)。

術語「人類抗體」希望包括具有衍生自人類生殖系列免疫球蛋白序列之可變區和恆定區的抗體。本發明之人類抗體亦可包括並非由人類生殖系列免疫球蛋白序列所編碼的胺基酸殘基(例如藉由隨機或定點突變於活體外導入突變藉由活體內之體細胞突變)，例如在CDR中及特別是CDR3。然而，術語「人類抗體」如文中所用，不包括其中衍生自另外的哺乳動物物種，例如小鼠之生殖系列的CDR序列已嫁接至人類框架序列上的抗體。

術語「重組的人類抗體」如文中所用，希望包括所有藉由重組方法製備、表現、創製或分離的人類抗體分子，例如使用轉染至宿主細胞之重組表現載體所表現的抗體、分離自重組物之抗體、組合的人類抗體庫、分離自人類免疫球蛋白基因之基因轉殖動物(例如小鼠)(參見，例如Taylor et al.(1992)Nucl.Acids Res.20：6287-6295)，或藉由其他涉及剪接人類免疫球蛋白基因序列至其他DNA序列之方法所製備、表現、創製或分離的抗體。此等重組的人類抗體具有衍生自人類生殖系列免疫球蛋白序列之可變區和恆定區。在特定的實施例中，然而，此等重組的人類抗體係於活體外進行突變(或當使用人類Ig序列之基因轉殖動物時為活體內體細胞突變)且因此該重組抗體的VH和VL區之胺基酸序列，當衍生自人類生殖系列VH和VL序列或與其相關時，為可能並非於活體內天然存在人類抗體生殖系列儲庫之序列。

「Fc融合蛋白」係包括部份或全部二或多個蛋白，其中之一為免疫球蛋白分子之Fc部份，其並非在自然界中一起發現的。包括特定異源性多肽與不同部份的抗體衍生多肽(包括Fc區)融合的融合蛋白之製備已有描述，例如Ashkenazi et al.,Proc.Natl.Acad.ScL USA 88：10535,1991； Byrn et al.,Nature 344：677,1990；and Hollenbaugh et al.,“Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins”,in Current Protocols in Immunology,Suppl.4,pages 10.19.1-10.19.11,1992。「受體Fc-融合蛋白」係包括一或多個與Fc基團結合之受體胞外區，其在某些實施例中係包括一絞鏈區接著免疫球蛋白之CH2和CH3區。在某些實施例中，此Fc-融合蛋白係含有二或多個與一或多個配體結合之不同受體鏈。例如，此Fc-融合蛋白為一陷阱(trap)，例如IL-1阱(例如列洛西普(rilonacept)，其含有與Il-1R1胞外區融合之IL-1RAcP配體-結合區，而該Il-1R1胞外區係與hIgG1之Fc區融合；參見美國專利第6,927,004號)，或VEGF陷阱(例如阿柏西普(aflibercept)，其係含有與VEGF受體Flk1之Ig 3區融合的VEGF受體Flt1之Ig 2區，而該VEGF受體Flk1之Ig 3區係與hIgG1之Fc區融合；參見美國專利第7,087,411和7,279,159號)。

生物污染物

如文中所用，術語「生物污染物」係指任何不要的、不欲的、有害的或可能有害的生物實體。此等實體係包括，除了其他之外，朊毒體(prion)(牛/傳染性海綿狀腦病之病因)、病毒粒子、病毒、黴漿菌、其他細菌、污染的後生動物細胞、DNA、RNA、轉位子(transposons)、其他跳躍基因、酵母菌、其他真菌、藻類、原生動物及其他外源性和內源性原因。其中與使用嚙齒類細胞(如CHO細胞及CHO細胞之衍生物)之生物治療劑製藥製程特別有關的為與細胞或培養基或製造原料有關的偶發性病毒。細胞培養大量加工料的污染以及生成藥物產物對病人具有直接風險以及阻礙醫藥供給之間接風險。

一可能感染CHO細胞培養之外源性和內源性原因之非詳盡列表包括：單股(-)RNA病毒，例如凱許山谷病毒(cache valley virus)、A/B 型流感病毒、1/2/3副流感病毒、類人猿病毒5(simian virus 5)、腮腺炎病毒、牛呼吸道融合病毒及水泡性口炎病毒；單股(+)RNA病毒，例如牛冠狀病毒、2117杯狀病毒、腦心肌炎病毒、B3型克沙奇病毒(coxsackie virus B-3)、利基森林病毒(semliki forest virus)及辛德畢斯病毒(sindbis virus)；雙股RNA病毒，例如藍舌病病毒、鹿流行性出血熱病毒及1/2/3型呼腸孤病毒；單股DNA病毒，例如1型猪環狀病毒及特別有問題的小病毒，其包括小鼠細小病毒；以及雙股DNA病毒，例如腺病毒和假性狂犬病毒。在這些可能的外源因子中，從不同製造商之CHO細胞培養的大量收取樣本中佔優勢的有四種病毒。此等病毒為2型呼腸孤病毒、凱許山谷病毒、鹿流行性出血熱病毒及嚙齒類小病毒小鼠細小病毒。就CHO細胞培養之外源性病毒污染物之詳細論述，請參見Andreas Berting et al.,Virus Susceptibility of Chinese Hamster Ovary(CHO)Cells and Detection of Viral Contaminations by Adventitious Agent Testing,106(4)Biotechnology and Bioengineering 598-607(2010)，以及Andrew Kerr & Raymond Nims,Adventitious Viruses Detected in Biopharmaceutical Bulk Harvest Samples over a 10 Year Period,64(5)PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 481-485(2010)。

外源性因子試驗分成二種一般類別。第一為使用活體外病毒分析之傳統病毒學法。本處，試驗樣本係用作指示劑細胞株，此等細胞係培養及傳代14至28天，及然後測量終點評估，例如細胞病變效應或血球凝集(Berting,2010)。第二為PCR-分析，其係測量即時有無與外源性和內源性因子結合之核酸。例如，參見Zhan et al.,detection of Minute Virus of Mice Using Real Time Quantitative PCR in Assessment of Virus Clearance during the Purification of Mammalian Cell Substrate Derived Biotherapeutics,30(4)Biologicals 259-270(2002)。

小鼠細小病毒(亦稱為MMV、小鼠的細小病毒或MVM)造成生物治療劑生產的特定問題。美國食品藥物管理局(FDA)和歐洲藥物管理局需要特別檢測MVM。此病毒為小病毒科(小病毒)的成員且為小鼠中常見的。其係於尿液和糞便中排出，在環境中為健全且持久的。此病毒可容易地導入生物治療劑製造過程。參見Moody et al.,Mouse Minute Virus(MMV)Contamination-A Case Study：Detection,Root Cause Determination,and Corrective Actions,65(6)PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology 580-288(2011)。其他的嚙齒類小病毒可能對細胞培養為主的生物醫藥生產有負面衝擊。除了MVM原型株之外，該等嚙齒類小病毒包括，除了其他之外，MVM免疫抑制病毒株和cutter病毒株、小鼠小病毒1a(MPV-1a)、MPV-1b、MPV-1c、倉鼠小病毒、杜蘭氏小病毒(小病毒H-1)、基爾漢大鼠病毒、大鼠小病毒1a、大鼠小病毒及大鼠L病毒之Umass病毒株。參見，S.F.Cotmore & P.Tattersal,The Autonomously Replicating Parvoviruses of Vertebrates,33 Advances in Virus Research 91-174(1987)，及Jacoby et al.,Rodent Parvovirus Infections,46(4)Lab Anim Sci.370-80(1996)。

這些小病毒享有保守的核酸序列稱為NS-1(NS1)，其係編碼一涉及病毒基因體增幅的非結構蛋白。此來自MVM之保守性NS1核苷酸序列係如SEQ ID NO：9所述。此序列的核苷酸875-956在整個廣泛嚙齒類小病毒NS1序列有97%為保守性，且因此為PCR基礎之外源性和內源性因子檢測的良好目標序列。嚙齒類小病毒(及其他外源性和內源性因子)之PCR檢測可在原料上、預收取的培養基、生物治療劑分子之大量處理純化上的不同點，以及在調配和包裝階段進行。污染物之偵測可能需要補救步驟，例如處置污染的材料、更換原料及去除設備污染。

除了在製造期間能起矯正和預防作用(CAPA)之檢測外源性因子、內源性因子和其他生物污染物外，特別的製造和大量處理步驟(亦即單元操作)可用於消除、降低或使病毒污染物失活。化學失活、病毒滯留性過濾及層析已顯示在已收取或部份純化的細胞培養中降低疱疹病毒、逆轉錄病毒和小病毒為有效的。最常使用的化學失活步驟為低pH處理，某些本項技術之一般技術咸信係由於病毒包膜蛋白變性所致。蛋白A、羥磷灰石、陽離子交換及陰離子交換層析步驟已顯示能移除病毒至某個程度。參見，例如Miesegaes et al.,Analysis of Viral Clearance Unit Operations for Monoclonal Antibodies,106(2)Biotechnology and Bioengineering 238-246(2010),and Liu et al.,Recovery and Purification Process Development for Monoclonal Antibody production,2(5)mAbs 480-499(2010)。

Q-PCR檢測：正對照和負對照

生物污染物之試驗應有適當對照以確保精確性、可靠性和可信任性。如文中所用，「負對照」係併入大部份或所有的實驗試劑及條件，但無試驗樣本。試驗樣本可用緩衝劑或不含有生物性感興趣污染物之已知的假培養基替代。另外如文中所用，「負對照」對生物污染物應產生陰性結果。若負對照產生陽性生物污染物結果，則熟習技術者或科學人員可推測此來自平行試驗樣本之陽性結果可能無法準確反應此試驗樣本是否含有生物污染物。

如文中所用，使用一或多個「正對照」來評估實驗條件是否為適當可操作用以偵測生物污染物。正對照可在實驗程序上的任何步驟使用以確保各步驟正在操作，及測定在哪個步驟程序出問題。

在某些實施例中，係在核酸萃取步驟使用正對照，用以評估所希望的任何生物污染物核酸之萃取是否為有效足以偵測生物污染物。此一正對照稱為「核酸萃取對照」或「NEC」。在某些情況下，NEC係經選擇就蛋白-核酸構造模擬目標生物污染物。若NEC係以足以被偵測的方式經萃取，則技術人員可推測此目標核酸亦以足以被偵測的方式所萃取。在一實施例中，此NEC為單股DNA噬菌體，並非全然與小病毒不同。

在一特定的實施例中，此NEC為M13噬菌體，其係由一約6407個核苷酸之環形單股DNA所組成。在一更特定的實施例中，此NEC為M13K07株，其為用於選殖和其他試驗室目的之一般可取得的分子生物試劑。參見van Wezenbeek et al.,Nucleotide Sequence of the Filamentous Bacteriophage M13 DNA Genome：Comparison with Phage fd,11(1-2)Gene 129-148(1980)。M13K07噬菌體之核苷酸序列係如SEQ ID NO：8所示。當M13噬菌體，或M13K07噬菌體株可在特定實施例中用作NEC的同時，本發明決非僅限於使用特定試劑作為NEC。在無悖離本發明範圍下，本項技術之一般技術者在本發明施行中可用另外的試劑取代作為NEC(例如用於反轉錄酶-PCR分析之MS2噬菌體；參見Kothapalli et al.,Problems associated with product enhancement reverse transcriptase assay using bacteriophage MS2 RNA as a template,109(2)J.Virol.Methods 203-207(2003))。

在本發明的某些實施例中，係在PCR增幅步驟使用正對照用以評估PCR試劑(包括引子)及PCR步驟是否足以偵測生物污染物模板核酸。此一正對照係稱為「質體增幅對照」或「PAC」。在某些情況下，此PAC係經選擇或設計以符合目標生物污染物核酸序列，及精確符合試驗樣本前置和反置寡核苷酸引子。在一特定的實施例中，此PAC另外含有一「獨特序列」，其並非在目標生物污染物核酸中所發現的。在一更特定的實施例中，此獨特序列並非自然界中所發現的。「獨特」核酸聚合物係設計用來專一與此獨特序列黏合並在PCR期間併入複製的獨特序列之擴增子中。此「獨特」核酸聚合物係經設計，在用於此主體分析操作之雜交條件下，不會辨識或與任何天然生成的小病毒黏合。在一實施例中，此「獨特」核酸聚合物係包括17至20個核苷酸，其中有不超過七(7)至10個內部連續核苷酸及不超過六(6)個連續3'端核苷酸係與任何小病毒序列相同。在一實施例中，此「獨特」核酸聚合物係包括17至20個核苷酸，其中有不超過7至10個連續核苷酸及不超過六(6)個連續3'端核苷酸係與任何SEQ ID NO：9和12-37所述的小病毒序列相同。

此獨特序列能使熟習技術者分辨真實的目標生物污染物序列以及帶有PAC質體之試驗Q-PCR反應的交叉污染。

在一實施例中，此PAC(為一質體，亦稱為PAC質體)係包括在一相同但分開的Q-PCR反應中用以對照PCR增幅。此PAC反應使用與試驗樣本Q-PCR反應確切相同的寡核苷酸引子和探針，以準確地反映實際目標生物污染物核酸之增幅。此試驗樣本Q-PCR反應和分開的PAC質體Q-PCR反應係包括一目標偵測探針及一獨特序列探針。此PAC反應，若適當運作，預期會產生一陽性目標訊號及一陽性獨特序列訊號。在含有PAC質體之反應中得到陽性目標訊號及陽性獨特序列訊號係表示運作適當得以在試驗樣本中產生陽性目標訊號，無論目標生物污染物核酸何時出現。

因此，此PAC係作為適當PCR增幅之對照。若在試驗樣本中得到一陰性目標訊號，但PAC顯示為陽性目標訊號，則熟習技術者可推測在試驗樣本中不存有可偵測的目標污染物DNA。相反地，若在試驗樣本中得到一陽性目標訊號及一陽性獨特序列訊號，則熟習技術者可推測PAC質體交叉污染了試驗樣本，且因此該陽性目標序列訊號可能為偽陽性。

數個實施例之詳細說明

在某些實施例中，係提供藉由使用聚合酶連鎖反應，更特言之Q-PCR，偵測生物污染物之正對照系統(亦即組成物和方法)。

在一態樣中，本發明係提供一獨特序列探針(USP)用以偵測正增幅對照質體(PAC質體)。此USP係含有能與此獨特人工質體-專一性序列(亦稱為獨特序列，或PACP獨特序列或UAPS)、螢光基團及淬滅子雜交之人工核苷酸序列。在一特定的實施例中，此能與UAPS雜交之人工核苷酸序列係包括SEQ ID NO：3之核酸序列(5’-TGTCGATGGCGAATGGCTA-3’)，其為UAPS義股序列之反義股(例如，亦即，SEQ ID NO：10-5’-TAGCCATTCGCC ATCGACA-3’.)。

如上所述，Q-PCR偵測探針係含有一螢光基團和一淬滅子。依照螢光基團/淬滅子對，淬滅可藉由接觸淬滅或藉由FRET。本處，螢光基團和淬滅子係共價連接USP寡核苷酸。在一實施例中，此螢光基團具有495nm至680nm之激發波長及515nm至710nm之發射波長。在某些實施例中，此螢光基團分別具有495nm、538nm或646nm之激發波長，及520nm、554nm或669nm之發射波長。在某些實施例中，此淬滅子為具有430nm至672nm之吸收波峰的染劑。有用的淬滅子之實例包括DDQ®-I、Dabcyl、Eclipse®、Iowa Black FQ®、BHQ®-1、QSY®-7、BHQ®-2、DDQ®-II、Iowa Black RQ®、QSY®-21和DHQ®-3。在一特定的實施例中，此螢光基團為螢光素亞醯胺(FAM；描述於美國專利第5,583,236號(1996年12月10日頒予)，其具有一約495nm最大吸收及約520nm最大發射，且此淬滅子為Black Hole Quencher®-1(BHQ®-1,Biosearch Technologies,Inc.,Petaluma,CA)，其係在480nm至580nm吸收。BHQ®-1係經由FRET淬滅和接觸淬滅。一般而言，但並非一定，此淬滅子係經由醚鍵與寡核苷酸的3'-端羥基基團相連接，而此螢光基團係經由酯鍵與寡核苷酸的5'-端磷酸基團相連接。

在另外的態樣中，本發明係提供一包括多個寡核苷酸和探針之Q-PCR試劑之混合物，其可用於偵測細胞培養、原料、部份純化及純化的生物分子等之生物污染物。在一實施例中，此生物污染物為DNA病毒，更特言之，小病毒，及又更特言之，嚙齒類小病毒，例如MVM。此小病毒含有一NS1基因，其具有至少88%與任何表1所列的序列相同之核酸序列。在另外的實施例中，此小病毒含有一NS1基因，其具有至少97%與SEQ ID NO：9所示的序列相同之核酸序列(亦即小鼠細小病毒(MVM)NS1基因)。又在另外的實施例中，此小病毒含有一NS1基因，其係包括SEQ ID NO：37之相同序列。

在一特定的實施例中，此混合物含有(1)嚙齒類小病毒專一性前置寡核苷酸引子；(2)嚙齒類小病毒專一性寡核苷酸偵測探針；(3)人工寡核苷酸偵測探針，例如USP；及(4)嚙齒類小病毒專一性反置寡核苷酸引子。此一混合物可用於試驗樣本和正對照樣本。在一更特定的實施例中，此寡核苷酸引子和小病毒專一性寡核苷酸偵測探針係與NS1序列，例如SEQ ID NO：9所示之NS1序列雜交。在一更特定的實施例中，(1)此前置引子係包括SEQ ID NO：1之序列；(2)此小病毒專一性寡核苷酸偵測探針係包括SEQ ID NO：2之序列；(3)此人工探針為USP並包括SEQ ID NO：3之序列；及(4)此反置引子係包括SEQ ID NO：4之序列。

如上所述，此USP係含有一螢光基團和一淬滅子，使得含有該序列之擴增子，亦即PAC DNA，在進行Q-PCR時可即時被偵測出。以類似的方法，此小病毒專一性偵測探針係含有一帶有共價連接之螢光基團和淬滅子的寡核苷酸。實際上，小病毒偵測探針之螢光基團發射波長應與USP的發射波長不同，以分辨真實的小病毒陽性訊號和因試驗樣本被PAC質體或其他PACP污染所造成的偽陽性(例如，PACP污染擴增子)。因此，在其中USP螢光基團為FAM之某些實施例中，與小病毒偵測探針寡核苷酸連接的螢光基團應具有約520nm以外的發射波長。在一特定的實施例中，與嚙齒類小病毒專一性寡核苷酸偵測探針連接的螢光基團為VIC®染劑(Life Technologies,Inc.,Carlsbad,CA)，其具有最大在538nm的吸收度及最大約554nm之發射。本處，淬滅子可為FRET淬滅子或接觸淬滅子。在一實施例中，此淬滅子為小溝結合非螢光淬滅子(MGBNFQ)(參見Sylvain et al.,Rapid Screening for HLA-B27 by a TaqMan-PCR Assay Using Sequence-Specific Primers and a Minor Groove Binder Probe,a Novel Type of TaqMan ^TM Probe,287(1-2)Journal of Immunological Methods 179-186(2004))。

上述之引子和探針之混合物係用於檢測和分辨正增幅對照結構與真實的小病毒污染物。在某些實施例中，此引子之混合物亦包括一組用於偵測核酸萃取對照(NEC)之引子和探針。在一特別的實施例中，此NEC為M13噬菌體，例如M13K07株(SEQ ID NO：8)。因此，在某些實施例中，除了小病毒引子和探針及UPS探針之外，此引子和探針之混合物係含有(5)M13專一性前置寡核苷酸引子；(6)M13專一性寡核苷酸偵測探針；及(7)M13專一性反置寡核苷酸引子。

在某些實施例中，此M13引子和探針係與SEQ ID NO：8之序列雜交。在一特定的實施例中，此M13專一性前置寡核苷酸引子係包括SEQ ID NO：5之核酸序列；此M13專一性寡核苷酸偵測探針係包括SEQ ID NO：6之核酸序列；及此M13專一性反置寡核苷酸引子係包括SEQ ID NO：7之核酸序列。就小病毒探針和USP之非重疊螢光基團發射光譜之情況，此NEC探針係含有發射光在非重疊光譜之螢光基團。在一特定的實施例中，與M13專一性寡核苷酸偵測探針相連接之螢光基團為Cy5，一種具有約650nm最大吸收及約670nm最大發射之花青染劑(cyanine dye)(參見Southwick et al.,Cyanine Dye Labeling Reagents：Carboxymethylindocyanine Succinimidyl Esters,11 Cytometry,418-430(1990))。本處，淬滅子可經由FRET或接觸淬滅來操作。在一實施例中，此淬滅子為Black Hole Quencher®-2(BHQ®-2,Biosearch Technologies,Inc.,Petaluma,CA)，其係在最大約579nm吸收，及在約550nm至約650nm的範圍內淬滅。

在另外態樣中，本發明係提供於一生物分子製造法中偵測生物污染物之方法。此生物污染物更特言之係包括一小病毒，更特言之嚙齒類小病毒，及最特別地，該等小病毒與MVM NS1基因係享有至少97%一致性。在某些實施例中，此NS1基因係包括SEQ ID NO：9之序列。在一實施例中，生物分子製造法為用於製造抗體、陷阱分子或其他治療抗體之哺乳動物細胞培養法。試驗樣本係由細胞培養(或大量成份)所採集及核酸萃取。在某些情況下，此試驗樣本係摻入一NEC，例如M13(例如SEQ ID NO：8)，以作為在Q-PCR前之適當萃取核酸的對照。此方法包括下列步驟：(1)將(a)由試驗樣本所萃取的核酸樣本、(b)寡核苷酸引子和探針(如上述)及(c)DNA聚合酶，較佳地具有5’核酸外切酶活性的熱穩定DNA聚合酶，例如Taq聚合酶組合；(2)將該組合物進行聚合酶連鎖反應(PCR)；及(3)監控各種擴增子經由螢光發射增幅之產生。。

特異性擴增子之形成係與試驗樣本中各種模板核酸的存在和量相關。特異性擴增子包括(1)目標增幅聚核苷酸(TAP)，例如嚙齒類小病毒序列(例如該等含NS1序列之生物污染物)，(2)核酸萃取對照(NEC)，例如M13(例如M13K07)聚核苷酸(NECPs)，及(3)質體增幅對照聚核苷酸(PACP)，例如獨特人工質子-專一性序列(UAPS)。若產生TAP和NECP，而未產生PACP，則其可結論出此試驗樣本含有生物污染物且不含有交叉感染地正增幅對照質體。然而，若在試驗樣本Q-PCR反應中產生TAP和PACP(亦即UAP)，則可結論出試驗樣本係經PAC質體交叉感染且該TAP結果為偽陽性。

在一特定的實施例中-其中該引子和探針係包括(1)包括SEQ ID NO：1序列之嚙齒類小病毒專一性前置寡核苷酸引子(2)包括SEQ ID NO：2序列、VIC螢光基團和MGBNFQ淬滅子之嚙齒類小病毒專一性寡核苷酸偵測探針，(3)包括SEQ ID NO：3序列及經6-FAM和BHQ®-1標定之人工寡核苷酸偵測探針，例如USP，(4)包括SEQ ID NO：4序列之嚙齒類小病毒專一性反置寡核苷酸引子，(5)包括SEQ ID NO：5序列之M13專一性前置寡核苷酸引子，(6)包括SEQ ID NO：6序列及經Cy5和BHQ®-2標定之M13專一性寡核苷酸偵測探針，及(7)包括SEQ ID NO：7序列之M13專一性反置寡核苷酸引子-TAP的產生係於約533nm至約580nm監測，PACP產生係於約465nm至約510nm監測，而NEC產生係於約618nm至約660nm監測。

在一實施例中，此試驗樣本係由生產CHO細胞培養，例如以編碼感興趣蛋白之核酸轉化的EESYR®生產細胞培養，在培養收獲時間之96至72小時前所採集。若在試驗樣本中偵測到TAP和NECP，但在樣本中未偵測到PACP，則可於收獲時間之48小時前由相同生產細胞培養所得來的第二試驗樣本中進行一確認試驗。若在第二試驗樣本中再次偵測到TAP和NECP，但在樣本中未偵測到PACP，則斷定此細胞培養係被污染，且可能無法再進一步加工處理。另一種選擇，可能不進行第二試驗樣本，可能仍未斷定此細胞培養受到污染而此培養不再進一步加工處理。

在一實施例中，核酸係由採自生產細胞培養之試驗樣本所萃取。本處，係將1毫升的試驗樣本進行細胞溶離及熱變性，接著將樣本與核酸萃取對照(NEC)樣本混合及然後從樣本萃取核酸。在一實施例中，核酸係使用自動核酸萃取系統，例如QIAsymphony®儀器(Qiagen,Inc.,Valencia,CA)，由試驗樣本(或摻入NEC之試驗樣本)所萃取(參見Lee et al.,Comparative evaluation of the QIAGEN QIAsymphony® SP system and bioMérieux NucliSens easyMAG automated extraction platforms in a clinical virology laboratory,52(4)J.Clin.Virol.339-43(2011))。

在一實施例中，係將酵素尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)加到Q-PCR反應混合物中，之後進行PCR，選擇性降解污染的擴增子(參見Taggart et al.,Use of heat labile UNG in an RT-PCR assay for enterovirus detection,105(1)J.Virol.Methods.57-65(2002))。將反應混合物於50℃培養至少2分鐘，更特言之，在某些情況下2分鐘或5分鐘。

在一特定的實施例中，在視需要的UNG處理後，將反應混合物於90℃培養2分鐘，接著8個循環的(1)於95℃變性10秒，接著(2)黏合及延伸30秒，使得第一次黏合溫度為70℃，然後於每個循環將黏合溫度降低1℃，使得第8次黏合為62℃。在起初的8個循環後，進行40個循環的DNA增幅，其包括下列步驟：(1)於95℃變性10秒，接著(2)於62℃黏合及延伸30秒。在一特別的實施例中，從變性溫度至黏合溫度之溫度變化率為每秒約4.4℃，而從黏合溫度至變性溫度為每秒約2.2℃。

在某些實施例中，偵測生產細胞培養基或其產物之生物污染物的方法包括進行一與試驗樣本分開運作的外部正增幅對照(PAC)分析，及進行一與試驗樣本分開運作的外部負對照分析和PAC分析。若負對照或正對照任一項失敗了，則摒棄由試驗樣本分所得到的結果。

在一實施例中，此外部正對照係包括下列步驟(1)除了其他之外及無試驗樣本下組合(a)正增幅對照(PAC)質體，其在一特定的實施例中係包括SEQ ID NO：11之序列，(b)包括SEQ ID NO：1序列之嚙齒類小病毒專一性前置寡核苷酸引子，(c)包括SEQ ID NO：2序列經VIC和MGBNFQ標定之嚙齒類小病毒專一性寡核苷酸偵測探針，(d)人工寡核苷酸偵測探針，例如包括SEQ ID NO：3序列經6-FAM和BHQ®-1標定之的USP，(e)包括SEQ ID NO：4序列之嚙齒類小病毒專一性反置寡核苷酸引子，及(f)DNA聚合酶，較佳地具有5’核酸外切酶活性之熱穩定DNA聚合酶，例如Taq聚合酶；(2)將正對照混合物進行正對照聚合酶連鎖反應(PCR)；及(3)監控PCR 期間(a)目標增幅聚核苷酸(TAP)，(b)核酸萃取對照增幅聚核苷酸(NECP)，及(c)質體增幅對照聚核苷酸(PACP)之產生。TAP的產生係於約533nm至約580nm監測，PACP產生係於約465nm至約510nm監測，而NECP產生係於約618nm至約660nm監測。

正增幅對照PCR反應係如同試驗樣本PCR反應一樣地進行(如上述)。若在正對照反應中產生TAP和PACP，則可結論出PCR增幅程序係操作得當。若在正對照反應中未產生TAP，則可中斷任何陰性TAP試驗樣本，因為PCR反應失敗。在一實施例中，此NEC(亦即，例如M13K07)係包括在此正增幅對照中。運作得當的對照組亦應顯示陽性的NECP訊號(參見表1)。

在一實施例中，外部負對照係包括下列步驟：(1)除了其他之外及無試驗樣本和無PAC質體下組合(a)空白樣本，其可為模擬試驗樣本緩衝系統之緩衝劑，或只是水，(b)包括SEQ ID NO：1序列之嚙齒類小病毒專一性前置寡核苷酸引子，(c)包括SEQ ID NO：2序列經VIC和MGBNFQ標定之嚙齒類小病毒專一性寡核苷酸偵測探針，(d)人工寡核苷酸偵測探針，例如包括SEQ ID NO：3序列經6-FAM和BHQ®-1標定之的USP，(e)包括SEQ ID NO：4序列之嚙齒類小病毒專一性反置寡核苷酸引子，及(f)DNA聚合酶，較佳地具有5’核酸外切酶活性之熱穩定DNA聚合酶，例如Taq聚合酶；(2)將正對照混合物進行正對照聚合酶連鎖反應(PCR)；及(3)監控PCR期間(a)目標增幅聚核苷酸(TAP)，(b)核酸萃取對照增幅聚核苷酸(NECP)，及(c)質體增幅對照聚核苷酸(PACP)之產生。TAP的產生係於約533nm至約580nm監測，PACP產生係於約465nm至約510nm監測。

負對照PCR反應係如同試驗樣本PCR反應一樣地進行(如上述)。若在負對照反應中產生TAP和PACP，則可結論出PCR試劑受PAC質體污染。若在負對照反應中有TAP，但無PACP，則可結論出PCR試劑受到小病毒污染。在這二種情況下係丟棄試驗樣本結果。然而，若在負對照反應中產生TAP和PACP，在正增幅對照中TAP和PACP產生為陽性，及TAP(視需要NECP)產生為陽性，而試驗樣本中PACP產生為陰性，則技術人員可結論出此試驗樣本受污染(參見表2和表3)。

在其他的態樣中，本發明係提供一正增幅對照質體(PAC質體)，及包括正對照質體之正對照試劑混合物。在一實施例中，此PAC質體係包括(1)小病毒核酸序列，(2)M13K07核酸序列，及(3)質體獨特的人工核酸序列(亦稱為UAPS或「獨特」序列)。在一特定的實施例中，此小病毒核酸序列係包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4之序列；此M13K07核酸序列係包括SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7之序列，而獨特序列係包括SEQ ID NO：3之反義序列。在一更特定的實施例中，PAC質體的核苷酸序列係由SEQ ID NO：11所示之序列所組成。

在某些實施例中，正對照試劑混合物係包括，除了其他之外，上述之PAC質體、嚙齒類小病毒專一性前置寡核苷酸引子、嚙齒類小病毒專一性寡核苷酸偵測探針、人工寡核苷酸偵測探針(亦即USP)、嚙齒類小病毒專一性反置寡核苷酸引子、M13專一性前置寡核苷酸引子、M13專一性寡核苷酸偵測探針和M13專一性反置寡核苷酸引子，以及緩衝劑。此混合物視需要含有dNTP和Taq聚合酶。

在一特定的實施例中，此嚙齒類小病毒專一性前置寡核苷酸引子係包括EQ ID NO：1之核酸序列，此嚙齒類小病毒專一性寡核苷酸偵測探係包括VIC螢光基團、小溝結合淬滅子(MGBNFQ)、SEQ ID NO：2之核酸序列，USP係包括VIC螢光基團、非螢光淬滅子BHQ和SEQ ID NO：3之核酸序列，此嚙齒類小病毒專一性反置寡核苷酸引子係包括SEQ ID NO：4之核酸序列，此M13專一性前置寡核苷酸引子係包括SEQ ID NO：5之核酸序列，M13專一性寡核苷酸偵測探針係包括Cy5螢光基團、BHQ-2淬滅子和SEQ ID NO：6之核酸序列，M13專一性反置寡核苷酸引子係包括SEQ ID NO：7之核酸序列。

實例1：寡核苷酸和核酸試劑

由各供應商得到各種等級和各種形式的嚙齒類小病毒、M13K07和人工獨特寡核苷酸(Oligo)，其係如表4所述。在從供應商收到後將所有的寡核苷酸標定為3年保存期限。

將寡核苷酸以水重建成100μM的濃度，製造一主儲存液。將主儲存液進一步稀釋，製造10X儲存液，之後安排qPCR反應。表5係描述10X和1X濃度之qPCR寡核苷酸(引子和探針)。

表4：小病毒、M13及獨特人工序列引子和探針

實例2：正增幅對照PLASMID

以pUC57-Kan質體(GeneWiz,Inc.,South Plainfield,NJ)製備parvo-M13正增幅對照(PAC)質體。此PAC質體係由SEQ ID NO：11所示之序列所組成。小病毒-M13 PAC質體含有2.1 x 10⁸複製體/ng，係使用係下列公式所計算：[數量=(量*數目/莫耳)/(bp * ng/g * g/bp之莫耳)]；其中量=ng，數目/莫耳=6.022 x 10²³,bp=4372，ng/g=1 x 10⁹，及g/bp之莫耳=650。計算質體濃度並以ng/μL表示，及連續稀釋至10X濃度之10²複製體/μL。從10²複製體/μL稀釋液，製備50μL等份並儲存於2mL無菌的螺旋蓋試管中。所有的等份係儲存於

-60℃。

實例3：製備M13K07噬菌體

使用MEM作為稀釋劑進行M13K07噬菌體之10-倍連續稀釋，得到100pfu/μL效價之M13K07。製備200μL等份並儲存於

-60℃及標上三年保存期限日期。

實例4：Q-PCR反應試劑製備

嚙齒類小病毒即時PCR偵測分析為一全自動的TaqMan® PCR法，係由使用QIAsymphony®(Qiagen)之自動化DNA純化，接著核酸增幅和LightCycler® 480儀器(Roche Diagnostic)上之即時PCR產物偵測所組成。各試驗檢品為自動化添加噬菌體M13K07作為內部對照(IC)，以便於評估PCR抑制劑之存在。嚙齒類小病毒引子寡核苷酸係設計於嚙齒類小病毒基因體之高保守區(NS-1區)內雜交，以確保廣範圍的偵測。此分析係以雙重複模式(亦即雙目標)來進行且嚙齒類小病毒和M13K07引子分別產生大約110和97bp之PCR產物。經由以不同報導子染劑標定的二探針裂解即時偵測PCR產物，其中用於嚙齒類小病毒之染劑為VIC螢光基團，而用於M13K07噬菌體的為Cy5螢光基團。使用濃度100複製體/uL之正增幅對照(PAC)質體此質體含有一獨特(Flag)序列(USP)，係使用經螢光基團FAM標定的專一性探針來區別其與野生型小病毒

根據表6將主混合液裝入2mL試管，其量為足夠試驗檢品(包括對照組)之數目的至少三倍。將試管存放於2-8℃。藉由於2mL試管中加入50uL的水，製備負增幅對照(NAC)小瓶。

實例5：試驗樣本製備

因為所有的樣本具有包含或被外源因子污染之可能，因此就所有的預處理步驟堅持無菌施作。於一乾淨的生物安全櫃中進行下列步驟。試驗檢品(樣本)係由製造EESYR®細胞培養之抗體或陷阱分子所得來並冷凍或直接使用。

將1000μL的PBS分成等份置入適當的2mL-試管，作為負萃取對照(NEC)。當使用PCR作為細胞培養步驟之終點評估時，使用細胞培養的正對照和負對照分別作為正萃取對照和負萃取對照。

於室溫將各試驗檢品融化。將置於60mL袋中之樣本轉置於50mL-Falcon試管，然後分成等份。將1000μL的各樣本吸量至2mL-試管進行預處理。將400μL的溶離緩衝劑(ChargeSwitch® Lysis Buffer L13,(Invitrogen,Cat# CS11202或同等物，Carlsbad,CA)加到各試管中並渦旋至少10秒。然後將20μL的蛋白酶K(

10mg/mL,

800單位/mL溶於40%甘油(v/v)，其含有10mM Tris-HCl,pH 7.5與1mM乙酸鈣；SAFC,Cat# P4850-5ML,Sigma Aldrich,St.Louis,MO)加到各樣本中，並渦旋至少10秒。然後將樣本於65℃培養30分鐘。培養後，將樣本渦旋及以17,000 x g離心10分鐘。

同時，融化正增幅對照(PAC；最少50uL的10²複製體/μL質體於2mL試管中)及M13K07(10²PFU/mL)內部對照(IC；最少150μL/12樣本)。

實例6：核酸EXTRACTION

QIASymphony®儀器(Qiagen,Valencia,CA)上的編程萃取法需要內部對照(IC)。此儀器將120μL的重建IC自動加入各樣本中。此儀器，每12個樣本需要1.8mL的IC(亦即1小瓶)。藉由將1650μL AVE緩衝液(含有疊氮鈉之無RNA酶的水)加到150μL的M13K07 IC中，製備IC小瓶。

將各製備的樣本裝入生物安全櫃(BSC)內的儀器樣本載台。將IC小瓶以每12個樣本1小瓶IC之比率裝入BSC內分開的(專用的)樣本載台。關上所有的抽屜並根據製造商的建議方法運轉此儀器(參見QIAsymphony DNA Handbook,09/2010，可得自http：//www.algimed.by/download/EN-QIAsymphony-DNA-Handbool.pdf)。

以IAsymphony® DSP病毒/病原體試劑套組製備，其含有進行萃取所需的全部的試劑(參見QIAsymphony® DSP Virus/Pathogen Kit Instructions for Use(Handbook,April 2013，可得自https：//www.qiagen.com/us/resources/download.aspx？id=f8bc0b3c-0aff-46ee-8807-5ed145f9e969&lang=en)。此試劑製備濾心(reagent prep cartridge)含有蛋白酶K並具有約2週的半衰期。

以96-孔模式反應盤進行核酸萃取來幫助與Q-PCR之整合。自動化核酸萃取程序完成及通過狀態檢查後，將反應盤冷卻並以LightCycler®480封膜(Roche,Branchburg,NJ)密封。將96-孔盤置於以適合的平衡物(例如另外的96-孔盤)平衡之盤式旋轉器中並旋轉30至60秒。檢查孔槽的氣泡，若需要重複旋轉。

實例7：Q-PCR

於LightCycler® 480儀器(Roche,Branchburg,NJ)上使用二種程式之一-TaqMan三重複及/或Veriquest三重複進行Q-PCR。TaqMan三重複法係使用無參照染劑之TaqMan Fast Advance Custom Master Mix(ROX)。選擇三種螢光通道(FAM、VIC和CY5)及2分鐘的UNG步驟時間。使用的反應參數係概述於表7中。

當使用VeriQuest® Master Mix，同時無ROX時，係使用5分鐘的UNG步驟時間。所用的反應參數係概述於表8中。

各M13內部對照、嚙齒類小病毒和正增幅對照質體的交叉點(Cp)螢光訊號係藉由一或二種演算法來測定。第一種演算法為自動二次微分法。此方法不需要使用者輸入且一般得到較佳的一致性，且因此被視為較佳的方法。第二種演算法為擬合點法。在分歧背景之情況下，此方法讓使用者設定閥線。對數線性曲線穿過的點，閥線變成交叉點。使用下列梳形濾波器來監測螢光訊號：嚙齒類小病毒(「樣本-小病毒」亞群)為533-580nm(VIC訊號)；內部對照M13K07(「樣本-M13」)為618-660nm(Cy5訊號)；及正增幅對照質體(「樣本-FAM」亞群)為465-510nm(FAM訊號)。就含糊的螢光訊號之情況，係使用擬合點分析測定螢光背景量。在增幅圖標度上，可接受的背景螢光訊號被認為

1單位。任何螢光訊號

1單為係視為在可接受的背景內，且因此為陰性。

表8：嚙齒類小病毒PCR VeriQuest三重複程序步驟

實例8：有效試驗階段之條件

就視為有效之試驗階段，必須符合下列條件。負增幅對照(NAC，亦即水)在所有三個通道中螢光訊號必須陰性。負萃取對照(NEC，亦即PBS)或細胞培養負對照燒瓶在[533-580]通道之螢光訊號(亦即嚙齒類小病毒探針VIC訊號)必須為陰性，在[465-510]通道之螢光訊號(亦即正增幅對照[PAC]反義標籤探針-FAM訊號)必須為陰性，而在[618-660]通道之螢光訊號(亦即M13K07探針-CY5訊號)必須為陽性。PAC在所有三個通道，螢光訊號應為陽性。使用NEC之M13K07 Cp值作為參照，供評估樣本中抑制物質的存在。

若使用PCR作為來自具有嚙齒類小病毒正對照之細胞培養步驟試驗檢品的終點評估，則正病毒對照組在[533-580]通道之螢光訊號(亦即嚙齒類小病毒探針VIC訊號)必須為陽性，[618-660]通道之螢光訊號(亦即M13K07探針-CY5訊號)必須為陽性，及[465-510]通道之螢光訊號(亦即PAC反義標籤探針-FAM訊號)必須為陰性。細胞培養正對照樣本中的M13K07 Cp值預期係在±4個循環範圍之NEC-M13 Cp值之內。

就所有含PAC質體的對照反應，在所有三個通道中螢光訊號必須為陽性。

實例9：無效試驗階段之條件

當符合下列一或多個條件時，則分析係視為無效的：(1)PAC的增幅曲線非常低(螢光分級表<1單位)，(2)確認的固定誤差(機器、軟體或人為誤差)，(3)在任何三個通道上NAC之增幅為陽性，(4)NEC之增幅在[533-580]VIC通道為陽性，增幅在[465-510]FAM通道為陽性，或增幅在[618-660]Cy5通道為陰性，及(5)在任何三個通道上PAC增幅訊號為陰性。當分析經測定為無效時，進行試驗樣本之偵查及再檢測。

實例10：有效試驗之陰性樣本結果的條件

就一陰性小病毒試驗結果，必須符合下列所有條件。樣本就M13K07 DNA增幅訊號，於NEC-M13 Cp±4個循環的預期Cp值範圍內，在M13[618-660]通道必須為陽性，其表示缺乏PCR抑制劑。樣本就小病毒DNA增幅訊號在小病毒[533-580]通道必須為陰性。螢光分級表低於1單位，無論Cp值是否被認為係在可接受的螢光背景量以內，且就小病毒DNA增幅之報告為陰性。樣本就PAC增幅訊號在反義flag[465-510]通道必須為陰性。請注意，螢光分級表低於1單位，與Cp值無關(由儀器自動產生)，係被認為在可接受的螢光背景量以內，且就PAC-質體DNA增幅係提報為陰性。

實例11：有效試驗階段之「無樣本」結果的條件

當符合下列一或多個條件時，則產生「無樣本」結果。無論何時當樣本就M13K07 DNA增幅訊號在Cy5通道[618-660]為陰性，就小病毒DNA增幅訊號在小病毒通道[533-580]為陰性，及就PAC增幅在反義Flag FAM通道[465-510]為陰性時，則此樣本或PCR試劑係依標準操作程序偵察。此狀況顯示，有PCR抑制劑存在或無法適當萃取核酸。樣本可稀釋(1：2，1：5，1：10)以克服抑制作用。範圍以外的M13通道[618 660]之螢光訊號Cp值(NEC M13 Cp±4循環)，表示PCR部份抑制或噬菌體摻入錯誤或有必要進行一重複試驗。可考慮樣本稀釋(1：2，1：5，1：10)以克服任何的PCR抑制作用。任何固定誤差的證據或M13通道[618-660]中觀察到意料外非常低的螢光訊號(螢光分級表<1單位)，其無法總結性評估樣本適合性，則視為「無樣本結果」，且表示增幅或DNA延伸為失敗的。有必要進行一重複試驗。

實例12：有效試驗階段之最初偏離規格(IOOS)樣本結果之條件

當(i)小病毒DNA增幅訊號在小病毒通道[533-580](亦即嚙齒類小病毒探針VIC)訊號為陽性，在螢光分級表上具有1單位以上的螢光訊號(二個雙重複孔槽中至少一個)，及(ii)PAC增幅在反義Flag FAM通道[465-510]為陰性，其顯示無來自PAC的交叉污染，則此樣本係視為iOOS。因此，技術人員必須(i)啟動GLIF(通用實驗室研究形式)，(ii)通知將樣本提報QC病毒學進行檢測之部門，(iii)開始NOE，(iv)保存增幅試管(冷凍於-20℃)作進一步研究(例如Flag序列篩選或定序)，及(v)重複分析及再檢測樣本。

實例13：重複及再檢測計畫

無論何時當分析為無效或樣本結果視為「無結果」時，則開始一重複試驗。重複試驗係為了確認iOOS事件所進行(亦即第一次樣本結果就DNA增幅訊號在小病毒通道[533-580]中為陽性)。再試驗或重複試驗必須使用新鮮的試劑等份(亦即主混合試劑、萃取套組)來執行。

若NAC在任何通道之螢光為陽性；則整個試驗階段必須使用已純化的DNA樣本與新鮮配製的主混合液，從增幅(PCR)步驟重複開始。若NEC M13通道[618-660]之螢光為陰性，則整個試驗階段應從DNA萃取步驟重複開始。若NEC在小病毒通道[533-580]或反義Flag通道[465-510]之螢光為陽性，則整個試驗階段應從增幅DNA萃取步驟重複開始。若PAC在任何通道的螢光為陰性，則試驗階段應使用已純化的DNA樣本與新鮮配製的主混合液，從增幅(PCR步驟)重複開始。

就這些具有「無樣本」結果之樣本，試驗階段應就受影響的樣本從DNA萃取步驟開始重複。在DNA萃取作為偵查之部份和提出解決方法之前，樣本應稀釋(1：2，1：5或1：10)(除了無稀釋的樣本外)，以便於驗證抑制劑的存在。

用以確認最初陽性結果(iOOS)之再試驗係如下使用四個分開的等份來進行：二等份來自原始取樣事件的試驗檢品(例如最終給料後1天)，及二等份來自不同取樣事件(例如，若可能，最終給料後2天)或不同樣品袋之檢品。若任何額外的四等份之檢測產生陽性結果而無固定誤差的證據(經由偵察來驗證)，該批係視為未達到無嚙齒類小病毒病毒基因體物質之需求。就各陽性Q-PCR結果之最終處置，感染性分析為必要的。使用CHO-K1細胞作為指示劑細胞株來測定所偵測的核酸之感染狀態。

無論何時當再試驗結果為陰性時，在不同的取樣事件(例如最終給料後3天)需要一確認試驗用以確認無嚙齒類小病毒基因體物質。

實例14：具有IOOS之其他樣本類型的再試驗計畫

其他樣本類型包括，例如未加工的大量原料、生產終了細胞、具有最初陽性結果之年齡極限細胞和豆類原料，係如下使用四個分開的等份再試驗：

將二等份來自原始樣本容器(亦即，例如袋子)和二等份來自不同樣本容器的試驗檢品，根據標準操作程序再試驗。將CHO-K1指示劑細胞以來自原始樣本容器之一樣本等份的試驗檢品培養。在依照標準操作程序培養1-3天後收取所培養的指示劑細胞CHO-K1，以測定所偵測的核酸之感染狀態。可使用定量再萃取核酸之標準曲線。

無論何時當四等份之任何額外的PCR檢測為陰性，而無固定誤差之證據時(經由偵察來驗證)，感染性分析決定檢品之最終處置。在確認最初的OOS後，可考慮核酸定序和穿透式電子顯微鏡(TEM)，以鑑定此微生物並排除任何實驗室誤差。

使用CHO-K1作為指示劑細胞供檢查污染物質之感染性分析為需要的，以便測定所偵測的核酸之感染狀態。無論何時當偵察無法支持小病毒污染物之可能性，且四等份檢品之額外的PCR試驗和CHOK1培養皆為陰性，則該批件係視為符合無感染的嚙齒類小病毒之需求。

實例15：重組蛋白製造期間之小病毒檢測

進行上述之Q-PCR程序作為檢測細胞培養液，亦即來自含有CHO細胞衍生物之生產生物反應器的未處理大量原料之重要製程中管控，其中該CHO衍生物含有異源性抗體重鏈和輕鏈結構。各異源性單株抗體(mAb)係與不同的目標或表位結合。由QC病毒學科學家以大規模生物處理生產設施進行良好作業程序(GMP)試驗。16項該等試驗係列於表9中。在各情況下，此等試驗階段為有效的，已符合分析系統適合性標準，且並未觀察到偽陽性。在試驗階段#13和#14，並未發生偽陰性偵測，其顯示有PCR抑制劑存在或核酸萃取失敗。

UPB=未處理原料；EA=預警；嚙齒類小病毒PCR=上述Q-PCR程序。

Claims

一種組成物，其包含人工核苷酸序列、螢光基團以及淬滅子，其中該人工核苷酸序列包含SEQ ID NO：3(5’-TGTCGATGGCGAATGGCTA-3’)之核酸序列。
如請求項1之組成物，其中在Q-PCR分析中該人工核苷酸序列不與任何天然生成的小病毒黏合。
如請求項1之組成物，其中該螢光基團係選自具有包含端點495nm至680nm間任意之激發波長以及包含端點515nm至710nm間任意之發射波長的螢光基團之群組。
如請求項1之組成物，其中該螢光基團具有495nm之激發波長以及520nm之發射波長。
如請求項1之組成物，其中該螢光基團為FAM。
如請求項1之組成物，其中該淬滅子係選自具有包含端點430nm至672nm間任意之吸收波峰的染劑之群組。
如請求項1之組成物，其中該淬滅子為BHQ-1。
如請求項1之組成物，其中該螢光基團係連接在該人工核苷酸序列的5’端或附近，且該淬滅子係連接該人工核苷酸序列的3’端或附近。
如請求項1之組成物，其中該螢光基團係連接在該人工核苷酸序列的3’端或附近，且該淬滅子係連接該人工核苷酸序列的5’端或附近。
如請求項1之組成物，其中該人工核苷酸序列係與正增幅對照(PAC)質體的獨特人工質體-專一性(UAPS)序列雜交。
如請求項10之組成物，其中該PAC質體進一步包含：

i)目標增幅聚核苷酸(TAP)序列，其中該TAP包含所有或部分之小病毒NS-1序列，以及

ii)核酸萃取對照(NEC)核苷酸序列，其中該NEC包含M13噬菌體核苷酸序列。
如請求項11之組成物，其中該小病毒NS-1序列包含SEQ ID NO：9或包含SEQ ID NO：12至37中之任一者。
如請求項12之組成物，其中該PAC質體包含SEQ ID NO：11之核酸序列。
如請求項11之組成物，其中該PAC質體包含與M13寡核苷酸引子雜交的結合位置。