CN114561492A - 一种新冠病毒核酸检测阳性质控品及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于病毒检测技术领域，涉及一种新冠病毒核酸检测阳性质控品及其制备方法和用途，所述阳性质控品由假病毒培养物，与扩增标签基因的引物、探针和RT‑PCR反应液共同组成，所述假病毒培养物由ORF1ab基因、N基因、E基因和标签基因构建重组质粒，转座，DNA的分离提取，转染，分离获得。本发明通过检测标签基因，能够及时准确区分阳性质控品和新型冠状病毒，从而准确判断是实验室污染，还是新冠病毒感染。
Description
技术领域
本发明属于病毒检测技术领域，涉及一种新冠病毒核酸检测阳性质控品及其制备方法和用途。
背景技术
冠状病毒是一个大型病毒家族，已知可引起感冒及中东呼吸综合征(MERS) 和严重急性呼吸综合征(SARS)等较严重疾病。新型冠状病毒(简称新冠病毒) 是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株。
人感染了冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。新冠肺炎病例具有很强的传染性，病例感染病毒后，首先累及到肺，表现在肺脏里面有实变，有大量的渗出，有炎症细胞因子的侵润，和炎症细胞大量的浸润等。同时，在小的支气管里看到很多分泌物，堵塞了小气道，影响了气体的交换。电镜下肺里还能够看到病毒颗粒。同时用核酸检测方法，发现病毒核酸。
在新冠病毒实验室检测中，实验过程的质量控制尤为重要，必须使用质控品和阴阳性对照，才能保证结果的可靠性。每批次检测时，应当随机放入至少1份弱阳性和3份阴性内质控样本，参与病毒核酸提取和扩增过程。这在强化实验室质量控制的同时，也增加了阳性内质控样本与待检标本交叉污染的风险。如果阳性质控品与待检标本发生交叉污染后，检测结果无法准确判断阳性来源，会造成疫情误判。
目前新冠病毒阳性质控品均为人工构建的假病毒，包含新冠病毒的 ORF1ab、N和E基因的部分或全部基因序列。由于阳性质控品的频繁使用，国内报告阳性质控品与待检标本发生交叉污染导致假阳性检测的事件时有发生。其主要的原因是，现行检测过程中，如果实验室一旦发生阳性质控品与待检标本交叉污染，由于阳性质控品与新冠病毒的检测靶位点完全一致，导致很难及时准确判断阳性来源，严重影响疫情研判。因此，准确判断是新冠病毒感染还是实验室污染对于新型冠状病毒检测的准确性和效率极为重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对现有技术的不足，提供了一种新冠病毒核酸检测阳性质控品及其制备方法和用途，通过将这些基因片段组合，形成用于构建假病毒的多核苷酸组合物，随后包装成假病毒颗粒，获得新冠病毒核酸检测阳性质控品，在发生疑似阳性质控品与待检标本交叉污染时，通过检测标签基因，及时准确区分阳性质控品和新冠病毒，从而准确判断是实验室污染，还是新冠病毒感染。
本发明提供了一种新冠病毒核酸检测阳性质控品，所述阳性质控品由假病毒培养物，与扩增标签基因的引物、探针和RT-PCR反应液共同组成；
所述假病毒培养物由ORF1ab基因、N基因、E基因和标签基因构建重组质粒，转座，DNA的分离提取，转染，分离获得；
所述标签基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
检测所述标签基因的上游引物如SEQ ID No.5所示，下游引物如SEQ ID No.6所示；
检测所述标签基因的探针的序列如SEQ ID No.7所示。
本发明还提供了一种新冠病毒核酸检测阳性质控品的制备方法，具体包括如下步骤：
S1，目的基因的获得：
分别扩增获得ORF1ab基因，N基因，E基因，合成标签基因；
所述ORF1ab基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述N基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述E基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
S2，构建重组质粒：
将ORF1ab基因、N基因和E基因酶切并连接至pFastBac载体构建重组质粒pFastBac-X，转化至感受态细胞，挑选阳性单克隆进行扩大培养并提取质粒；
S3，重组质粒pFastBac-X的转座：
将重组质粒pFastBac-X转化至DH10BacTM感受态细胞，蓝白斑筛选，挑选白色克隆；
S4，重组Bacmid-X DNA的分离提取：
挑选的白色克隆菌，进行进一步培养，细菌培养后提取DNA获得重组 Bacmid-XDNA；
S5，重组Bacmid-X转染sf9细胞；
S6，病毒原种的分离与贮存：
当细胞出现感染迹象时，离心获得含病毒的上清液，即为假病毒培养物，与检测所述标签基因的引物、探针和RT-PCR反应液共同组成新冠病毒检测试剂盒的通用质控品。
进一步的，所述标签基因选自植物。
进一步的，所述植物为野生大豆。
进一步的，S2中，所述感受态细胞为DH5α。
进一步的，S5中，重组Bacmid-X转染sf9细胞的具体过程如下：
(1)在六孔板中接种9×105个sf9细胞，27℃培养1h，使细胞贴壁；
(2)制备Bacmid-X与Cellfectin Reagent复合物；
(3)在制备Bacmid-x与Cellfectin Reagent复合物期间，将六孔板中的培养基吸掉，用2ml不完全Grace’s mediμm(不含双抗、FBS)洗涤一次，去掉培养基；
(4)在含有210μl的复合物的管内加入800μl的不完全Grace’s mediμm(不含双抗、FBS)，轻轻混匀，加到培养板的每个孔中；
(5)将培养板内的细胞27℃孵育5h；
(6)去掉复合物混合液，然后在每个孔中加2ml完全培养基(Graces mediμm 含双抗、10％FBS)
(7)培养至细胞出现病毒感染迹象。
进一步的，培养至细胞出现病毒感染迹象即在37℃，培育72h。
进一步的，S6中，离心条件为500g离心5min。
本发明还提供了所述的新冠病毒核酸检测阳性质控品在制备新冠病毒检测试剂盒中的用途。
进一步的，检测过程中的判定标准为：若检出新冠病毒核酸阳性标本，可增加标签基因检测步骤，如果检测标签基因时扩增出曲线，则为质控品污染，若没有扩增出曲线，则为新冠病毒感染。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、本发明中制备得到的新冠病毒核酸检测阳性质控品，合成新冠病毒的 ORF1ab、N和E基因的全部基因融合体时，在合成N基因时加入一段标签基因，在发生疑似阳性质控品与待检标本交叉污染时，通过检测标签基因，及时准确区分阳性质控品和新冠病毒，从而准确判断是实验室污染，还是新冠病毒感染，避免了因实验室阳性质控品与待检标本交叉污染而导的检测结果错误，提高了检测准确率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例中质控品ORF1ab基因扩增曲线；
其中，从左到右各曲线分别表示不同稀释浓度的假病毒培养物ORF1ab基因扩增曲线：A-假病毒培养物原液，B-假病毒培养物10-1稀释液，C-假病毒培养物10-2稀释液，D-假病毒培养物10-3稀释液，E-假病毒培养物10-4稀释液， F-假病毒培养物10-5稀释液，G-假病毒培养物10-6稀释液，H-假病毒培养物10-7稀释液，I-假病毒培养物10-8稀释液，J-假病毒培养物10-9稀释液，K-假病毒培养物10-10稀释液；
图2为本发明实施例中质控品N基因扩增曲线；
其中，从左到右各曲线分别表示不同稀释浓度的假病毒培养物N基因扩增曲线：A-假病毒培养物原液，B-假病毒培养物10-1稀释液，C-假病毒培养物10-2稀释液，D-假病毒培养物10-3稀释液，E-假病毒培养物10-4稀释液，F-假病毒培养物10-5稀释液，G-假病毒培养物10-6稀释液，H-假病毒培养物10-7稀释液， I-假病毒培养物10-8稀释液，J-假病毒培养物10-9稀释液，K-假病毒培养物10-10稀释液；
图3为本发明实施例中质控品E基因扩增曲线；
其中，从左到右各曲线分别表示不同稀释浓度的假病毒培养物E基因扩增曲线：A-假病毒培养物原液，B-假病毒培养物10-1稀释液，C-假病毒培养物10-2稀释液，D-假病毒培养物10-3稀释液，E-假病毒培养物10-4稀释液，F-假病毒培养物10-5稀释液，G-假病毒培养物10-6稀释液，H-假病毒培养物10-7稀释液， I-假病毒培养物10-8稀释液，J-假病毒培养物10-9稀释液，K-假病毒培养物10-10稀释液；
图4为本发明实施例中质控品标签基因扩增曲线；
其中，各标记所表示曲线分别为不同稀释浓度假病毒培养物的标签基因扩增曲线：A-假病毒培养物10-4稀释液，B-假病毒培养物105稀释液，C-假病毒培养物10-6稀释液，D-假病毒培养物10-7稀释液，E-假病毒培养物10-8稀释液， F-假病毒培养物10-9稀释液，G-假病毒培养物10-10稀释液，H-假病毒培养物10-11稀释液；
图5为本发明实施例中新冠病毒阳性标本和模拟质控品污染样本的标签基因的扩增曲线；
其中，A-D表示模拟质控品污染样本，其余为新冠病毒阳性标本。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
中国CDC与WHO所推荐检测的靶序列(ORF1ab基因、N基因、E基因)全基因序列长度为22778bp，但由于受限于假病毒构建过程自身的技术瓶颈，所引入的靶序列的长度不能过长。
本发明对新冠病毒核酸检测的靶区域与假病毒构建技术进行了研究，在借鉴其它阳性质控品基因组坐标的基础上，通过优化从ORF1ab基因(以045512.2 为例，266-21555)、N基因(以045512.2为例，28274-29533)和E基因(以045512.2 为例，26245-26472)，即从总长度为22778(21290+1260+228)bp的共3个基因中选择了一些核酸片段，并选择野生大豆中的一段基因作为标签基因(基因四 270bp)，将这些基因片段组合，形成用于构建假病毒的多核苷酸组合物，随后包装成假病毒颗粒，从而完成了本发明。可以模拟病毒从RNA提取至核酸扩增检测全过程的新冠假病毒核糖核酸标准物质，并带有标签基因。
一、本发明中新型新冠病毒核酸检测阳性质控品构建方法
1、目的基因的获得
基因一：分段设计引物扩增ORF1ab基因(12577-15910，序列附后)，以宁夏株新冠病毒核酸(与045512.2高度同源)为模板进行扩增和连接，获得相应的 nCoV-2019片段，电泳后对目的条带进行回收。
基因二：设计引物扩增N基因(28274-29533，序列附后)，以宁夏株新冠病毒核酸(与045512.2高度同源)为模板进行扩增，连接合成的标签基因(基因四270bp，序列附后)，获得相应的nCoV-2019片段(带标签)，电泳后对目的条带进行回收。
基因三：设计引物扩增E基因(26245-26472，序列附后)，以宁夏株新冠病毒核酸(与045512.2高度同源)为模板进行扩增，获得相应的nCoV-2019片段，电泳后对目的条带进行回收。
上述ORF1ab基因(基因一)、N基因(基因二)、E基因(基因三)和标签基因(基因四)均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
2、构建重组质粒
将上述基因一、基因二、基因三和基因四酶切并连接至pFastBac载体构建重组质粒pFastBac-X，重组质粒测电泳验证后，转化至DH5α感受态细胞。涂板后，挑选阳性单克隆进行扩大培养并提取质粒。
3、重组质粒pFastBac-X的转座
将重组质粒pFastBac-X转化至DH10BacTM感受态细胞，转化后的细胞涂板培养，用X-gal进行蓝白斑筛选，挑选白色克隆。
4、重组Bacmid-X DNA的分离提取
挑选白色克隆菌，进行进一步培养，细菌培养后提取DNA。
5、重组Bacmid-X转染sf9细胞
(1)在六孔板中接种9×105个sf9细胞，27℃培养1h，使细胞贴壁；
(2)制备Bacmid-X与Cellfectin Reagent复合物；
(3)在制备Bacmid-X与Cellfectin Reagent复合物期间，将六孔板中的培养基吸掉，用2ml不完全Grace’s mediμm(不含双抗、FBS)洗涤一次，去掉培养基；
(4)在含有210μl的复合物的管内加入800μl的不完全Grace’s mediμm(不含双抗、FBS)，轻轻混匀，加到每个孔中；
(5)将六孔板内的细胞27℃孵育5h；
(6)去掉复合物混合液，然后在每个孔中加2ml完全培养基(Graces mediμm 含双抗、10％FBS)；
(7)在27℃湿度培养箱中育72h或者直到细胞出现病毒感染迹象。
6、病毒原种的(P1)分离与贮存
当细胞出现感染迹象时，将上层培养基(约2mL)转移到无菌带盖的EP管中， 500g离心5min以去除细胞及大的碎片，将含病毒的上清液转移至无菌管中，即为假病毒培养物，与扩增所述标签基因的引物、探针和RT-PCR反应液等共同组成新型冠状病毒核酸检测质控品；
所述扩增标签基因的引物包括上游引物(SEQ ID No.5)和下游引物(SEQ IDNo.6)，检测所述标签基因的探针的序列如SEQ ID No.7所示。
二、质控品的应用
1、分别对本发明制备得到的阳性质控品中的ORF1ab基因、N基因、E基因和标签基因进行荧光定量PCR扩增检测；利用上海伯杰医疗科技有限公司 2019-nCoV核酸检测试剂盒进行检测。
结果如图1-图4所示，ORF1ab基因、N基因、E基因和标签基因均能够扩增出曲线，图1表示培养物病毒含量高，且不同稀释浓度对现有新冠病毒检测试剂的ORF基因、N基因、E基因和标签基因的检测灵敏度高。
2、标签基因检测引物和探针
(1)PCR扩增体系如下：
其中，引物探针液中，上游引物、下游引物和探针的混合体积比为1:1:1，引物、探针液的浓度均为0.4μM。
(2)扩增程序：45℃10min；95℃10min；95℃15sec，60℃45sec，45 个循环。
检测所述标签基因的上游引物如SEQ ID No.5所示，下游引物如SEQ ID No.6所示；
SEQ ID No.5：’-atgcttaagtccatgtttcgtaa-3’
SEQ ID No.6：5’-tctctacttgacatactgcacaa-3’
所述标签基因的探针的序列如SEQ ID No.7所示，所述探针的5’末端标记了FAM荧光报告基团，所述探针的3’末端标记了TAMRA淬灭基团。
所述标签基因的探针结构为：5’FAM-gtacgaggaaggatctgccatgctttca-TAMRA’3。
3、结果判断
判定标准为：在实验室检测过程中，如果检出新冠病毒核酸阴性，不再进行标签基因的检测，如果检出新冠病毒核酸阳性标本，需增加标签基因检测步骤，如果标签基因扩增出曲线，则为质控品污染，若标签基因未扩增出曲线，则确定为新冠病毒阳性。
本发明选择74份新冠病毒阳性标本和4份模拟质控品污染样本进行检测，其中，74份新冠病毒核酸检测阳性标本来源于宁夏新冠肺炎病例标本，4份模拟质控品污染样本的制备过程为：选择4份新冠病毒核酸检测阴性标本(2支 6mL和2支3mL)，分别在2支6mL的新冠核酸检测阴性标本中加入10-5稀释度的质控品5μL，2支3mL的新冠核酸检测阴性标本中加入10-6稀释度的质控品5μL，作为模拟质控品污染样本；
检测结果如图5所示，其中74份新冠病毒阳性标本标签基因为阴性(未扩增出曲线)，4份模拟质控品污染样本标签基因为阳性(扩增出曲线)。说明本发明中制备得到的质控品可以准确区分阳性质控品和新冠病毒，从而准确判断是实验室污染，还是新冠病毒感染。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<110> 宁夏回族自治区疾病预防控制中心
<120> 一种新冠病毒核酸检测阳性质控品及其制备方法和用途
<141> 2022-01-25
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3334
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
agatagtaaa attgttcaac ttagtgaaat tagtatggac aattcaccta atttagcatg 60
gcctcttatt gtaacagctt taagggccaa ttctgctgtc aaattacaga ataatgagct 120
tagtcctgtt gcactacgac agatgtcttg tgctgccggt actacacaaa ctgcttgcac 180
tgatgacaat gcgttagctt actacaacac aacaaaggga ggtaggtttg tacttgcact 240
gttatccgat ttacaggatt tgaaatgggc tagattccct aagagtgatg gaactggtac 300
tatctataca gaactggaac caccttgtag gtttgttaca gacacaccta aaggtcctaa 360
agtgaagtat ttatacttta ttaaaggatt aaacaaccta aatagaggta tggtacttgg 420
tagtttagct gccacagtac gtctacaagc tggtaatgca acagaagtgc ctgccaattc 480
aactgtatta tctttctgtg cttttgctgt agatgctgct aaagcttaca aagattatct 540
agctagtggg ggacaaccaa tcactaattg tgttaagatg ttgtgtacac acactggtac 600
tggtcaggca ataacagtta caccggaagc caatatggat caagaatcct ttggtggtgc 660
atcgtgttgt ctgtactgcc gttgccacat agatcatcca aatcctaaag gattttgtga 720
cttaaaaggt aagtatgtac aaatacctac aacttgtgct aatgaccctg tgggttttac 780
acttaaaaac acagtctgta ccgtctgcgg tatgtggaaa ggttatggct gtagttgtga 840
tcaactccgc gaacccatgc ttcagtcagc tgatgcacaa tcgtttttaa acgggtttgc 900
ggtgtaagtg cagcccgtct tacaccgtgc ggcacaggca ctagtactga tgtcgtatac 960
agggcttttg acatctacaa tgataaagta gctggttttg ctaaattcct aaaaactaat 1020
tgttgtcgct tccaagaaaa ggacgaagat gacaatttaa ttgattctta ctttgtagtt 1080
aagagacaca ctttctctaa ctaccaacat gaagaaacaa tttataattt acttaaggat 1140
tgtccagctg ttgctaaaca tgacttcttt aagtttagaa tagacggtga catggtacca 1200
catatatcac gtcaacgtct tactaaatac acaatggcag acctcgtcta tgctttaagg 1260
cattttgatg aaggtaattg tgacacatta aaagaaatac ttgtcacata caattgttgt 1320
gatgatgatt atttcaataa aaaggactgg tatgattttg tagaaaaccc agatatatta 1380
cgcgtatacg ccaacttagg tgaacgtgta cgccaagctt tgttaaaaac agtacaattc 1440
tgtgatgcca tgcgaaatgc tggtattgtt ggtgtactga cattagataa tcaagatctc 1500
aatggtaact ggtatgattt cggtgatttc atacaaacca cgccaggtag tggagttcct 1560
gttgtagatt cttattattc attgttaatg cctatattaa ccttgaccag ggctttaact 1620
gcagagtcac atgttgacac tgacttaaca aagccttaca ttaagtggga tttgttaaaa 1680
tatgacttca cggaagagag gttaaaactc tttgaccgtt attttaaata ttgggatcag 1740
acataccacc caaattgtgt taactgtttg gatgacagat gcattctgca ttgtgcaaac 1800
tttaatgttt tattctctac agtgttccca cctacaagtt ttggaccact agtgagaaaa 1860
atatttgttg atggtgttcc atttgtagtt tcaactggat accacttcag agagctaggt 1920
gttgtacata atcaggatgt aaacttacat agctctagac ttagttttaa ggaattactt 1980
gtgtatgctg ctgaccctgc tatgcacgct gcttctggta atctattact agataaacgc 2040
actacgtgct tttcagtagc tgcacttact aacaatgttg cttttcaaac tgtcaaaccc 2100
ggtaatttta acaaagactt ctatgacttt gctgtgtcta agggtttctt taaggaagga 2160
agttctgttg aattaaaaca cttcttcttt gctcaggatg gtaatgctgc tatcagcgat 2220
tatgactact atcgttataa tctaccaaca atgtgtgata tcagacaact actatttgta 2280
gttgaagttg ttgataagta ctttgattgt tacgatggtg gctgtattaa tgctaaccaa 2340
gtcatcgtca acaacctaga caaatcagct ggttttccat ttaataaatg gggtaaggct 2400
agactttatt atgattcaat gagttatgag gatcaagatg cacttttcgc atatacaaaa 2460
cgtaatgtca tccctactat aactcaaatg aatcttaagt atgccattag tgcaaagaat 2520
agagctcgca ccgtagctgg tgtctctatc tgtagtacta tgaccaatag acagtttcat 2580
caaaaattat tgaaatcaat agccgccact agaggagcta ctgtagtaat tggaacaagc 2640
aaattctatg gtggttggca caacatgtta aaaactgttt atagtgatgt agaaaaccct 2700
caccttatgg gttgggatta tcctaaatgt gatagagcca tgcctaacat gcttagaatt 2760
atggcctcac ttgttcttgc tcgcaaacat acaacgtgtt gtagcttgtc acaccgtttc 2820
tatagattag ctaatgagtg tgctcaagta ttgagtgaaa tggtcatgtg tggcggttca 2880
ctatatgtta aaccaggtgg aacctcatca ggagatgcca caactgctta tgctaatagt 2940
gtttttaaca tttgtcaagc tgtcacggcc aatgttaatg cacttttatc tactgatggt 3000
aacaaaattg ccgataagta tgtccgcaat ttacaacaca gactttatga gtgtctctat 3060
agaaatagag atgttgacac agactttgtg aatgagtttt acgcatattt gcgtaaacat 3120
ttctcaatga tgatactctc tgacgatgct gttgtgtgtt tcaatagcac ttatgcatct 3180
caaggtctag tggctagcat aaagaacttt aagtcagttc tttattatca aaacaatgtt 3240
tttatgtctg aagcaaaatg ttggactgag actgacctta ctaaaggacc tcatgaattt 3300
tgctctcaac atacaatgct agttaaacag ggtg 3334
<210> 2
<211> 1260
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
atgtctgata atggacccca aaatcagcga aatgcacccc gcattacgtt tggtggaccc 60
tcagattcaa ctggcagtaa ccagaatgga gaacgcagtg gggcgcgatc aaaacaacgt 120
cggccccaag gtttacccaa taatactgcg tcttggttca ccgctctcac tcaacatggc 180
aaggaagacc ttaaattccc tcgaggacaa ggcgttccaa ttaacaccaa tagcagtcca 240
gatgaccaaa ttggctacta ccgaagagct accagacgaa ttcgtggtgg tgacggtaaa 300
atgaaagatc tcagtccaag atggtatttc tactacctag gaactgggcc agaagctgga 360
cttccctatg gtgctaacaa agacggcatc atatgggttg caactgaggg agccttgaat 420
acaccaaaag atcacattgg cacccgcaat cctgctaaca atgctgcaat cgtgctacaa 480
cttcctcaag gaacaacatt gccaaaaggc ttctacgcag aagggagcag aggcggcagt 540
caagcctctt ctcgttcctc atcacgtagt cgcaacagtt caagaaattc aactccaggc 600
agcagtaggg gaacttctcc tgctagaatg gctggcaatg gcggtgatgc tgctcttgct 660
ttgctgctgc ttgacagatt gaaccagctt gagagcaaaa tgtctggtaa aggccaacaa 720
caacaaggcc aaactgtcac taagaaatct gctgctgagg cttctaagaa gcctcggcaa 780
aaacgtactg ccactaaagc atacaatgta acacaagctt tcggcagacg tggtccagaa 840
caaacccaag gaaattttgg ggaccaggaa ctaatcagac aaggaactga ttacaaacat 900
tggccgcaaa ttgcacaatt tgcccccagc gcttcagcgt tcttcggaat gtcgcgcatt 960
ggcatggaag tcacaccttc gggaacgtgg ttgacctaca caggtgccat caaattggat 1020
gacaaagatc caaatttcaa agatcaagtc attttgctga ataagcatat tgacgcatac 1080
aaaacattcc caccaacaga gcctaaaaag gacaaaaaga agaaggctga tgaaactcaa 1140
gccttaccgc agagacagaa gaaacagcaa actgtgactc ttcttcctgc tgcagatttg 1200
gatgatttct ccaaacaatt gcaacaatcc atgagcagtg ctgactcaac tcaggcctaa 1260
<210> 3
<211> 228
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
atgtactcat tcgtttcgga agagacaggt acgttaatag ttaatagcgt acttcttttt 60
cttgctttcg tggtattctt gctagttaca ctagccatcc ttactgcgct tcgattgtgt 120
gcgtactgct gcaatattgt taacgtgagt cttgtaaaac cttcttttta cgtttactct 180
cgtgttaaaa atctgaattc ttctagagtt cctgatcttc tggtctaa 228
<210> 4
<211> 270
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
gcaccacaaa caaagaagcc agtaaaggga atgcttaagt ccatgtttcg taaaaaatct 60
tctgaatcat cttcttatat tgacaaagag tacacagaac cagatgtagt agaggaattg 120
tacgaggaag gatctgccat gctttcagag aggttagata ctaaatatcc ggtctgcaac 180
atgttcaagt tgtttatttg tgcagtatgt caagtagaga taaaacctgg agaggggatt 240
tcaatacacg agggtgcacc caactctcaa 270
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
atgcttaagt ccatgtttcg taa 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
tctctacttg acatactgca caa 23
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
gtacgaggaa ggatctgcca tgctttca 28
Claims (10)
1.一种新冠病毒核酸检测阳性质控品，其特征在于，所述阳性质控品由假病毒培养物，与扩增标签基因的引物、探针和RT-PCR反应液共同组成；
所述假病毒培养物由ORF1ab基因、N基因、E基因和标签基因构建重组质粒，转座，DNA的分离提取，转染，分离获得；
所述标签基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
检测所述标签基因的上游引物如SEQ ID No.5所示，下游引物如SEQ ID No.6所示；
检测所述标签基因的探针的序列如SEQ ID No.7所示。
2.一种权利要求1所述的新冠病毒核酸检测阳性质控品的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
S1，目的基因的获得：
分别扩增获得ORF1ab基因，N基因，E基因，合成标签基因；
所述ORF1ab基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述N基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示，所述E基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
S2，构建重组质粒：
将ORF1ab基因、N基因、E基因和标签基因酶切并连接至pFastBac载体构建重组质粒pFastBac-X，转化至感受态细胞，挑选阳性单克隆进行扩大培养并提取质粒；
S3，重组质粒pFastBac-X的转座：
将重组质粒pFastBac-X转化至DH10BacTM感受态细胞，蓝白斑筛选，挑选白色克隆；
S4，重组Bacmid-X DNA的分离提取：
挑选的白色克隆菌，培养后提取DNA获得重组Bacmid-X DNA；
S5，重组Bacmid-X转染sf9细胞；
S6，病毒原种的分离与贮存：
当细胞出现感染迹象时，离心获得含病毒的上清液，即为假病毒培养物，与检测所述标签基因的引物、探针和RT-PCR反应液共同组成新冠病毒核酸检测阳性质控品。
3.根据权利要求2所述的新冠病毒核酸检测阳性质控品的制备方法，其特征在于，所述标签基因选自植物。
4.根据权利要求3所述的新冠病毒核酸检测阳性质控品的制备方法，其特征在于，所述植物为野生大豆。
5.根据权利要求2所述的新冠病毒核酸检测阳性质控品的制备方法，其特征在于，S2中，所述感受态细胞为DH5α。
6.根据权利要求2所述的新冠病毒核酸检测阳性质控品的制备方法，其特征在于，S5中，重组Bacmid-X转染sf9细胞的具体过程如下：
(1)在培养板中接种9×105个sf9细胞，27℃培养1h，使细胞贴壁；
(2)制备Bacmid-X与Cellfectin Reagent复合物；
(3)在制备Bacmid-x与Cellfectin Reagent复合物期间，将培养板中的培养基吸掉，用不完全Grace’s mediμm洗涤，去掉培养基；
(4)在含有210μl的复合物的管内加入800μl的不完全Grace’s mediμm，混匀，加到培养板的每个孔中；
(5)将培养板内的细胞27℃孵育5h；
(6)去掉复合物混合液，然后在每个孔中加2ml完全培养基；
(7)培养至细胞出现病毒感染迹象。
7.根据权利要求6所述的新冠病毒核酸检测阳性质控品的制备方法，其特征在于，培养至细胞出现病毒感染迹象即在27℃，培育72h。
8.根据权利要求2所述的新冠病毒核酸检测阳性质控品的制备方法，其特征在于，S6中，离心条件为500g离心5min。
9.一种权利要求1所述的新冠病毒核酸检测阳性质控品在制备新冠病毒检测试剂盒中的用途。
10.根据权利要求9所述的新冠病毒核酸检测阳性质控品在制备新冠病毒检测试剂盒中的用途，其特征在于，检测过程中的判定标准为：若检出新冠病毒核酸阳性标本，可增加标签基因检测步骤，如果检测标签基因时扩增出曲线，则为阳性质控品污染，若没有扩增出曲线，则为新冠病毒感染。
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