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KR102703684B1 - 미생물 현장 오염 검출용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

미생물 현장 오염 검출용 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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KR102703684B1
KR102703684B1 KR1020210091587A KR20210091587A KR102703684B1 KR 102703684 B1 KR102703684 B1 KR 102703684B1 KR 1020210091587 A KR1020210091587 A KR 1020210091587A KR 20210091587 A KR20210091587 A KR 20210091587A KR 102703684 B1 KR102703684 B1 KR 102703684B1
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김선정
조현민
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재단법인 바이오나노헬스가드연구단
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Abstract

본 발명은 미생물 현장 오염 검출용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 미생물 현장 오염 검출용 조성물은 포괄적인 뉴클레아제의 핵산 분해능을 검출할 수 있어, 시료에서 살아있는 미생물을 매우 신속하고 정확하게 검출할 수 있으며, 검출 방법이 간편한 특징을 가진다. 이에 따라, 본 발명의 조성물은 환경에서 미생물의 오염도를 쉽고 간편하게 측정할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

미생물 현장 오염 검출용 조성물 및 이의 용도{Composition for In-situ Detecting Microbial Contamination and Uses Thereof}
본 발명은 미생물 현장 오염 검출용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
병원체는 주변 환경에서 널리 분포되어 있고 일상 생활에서 여러 곳에 존재하고 있다. 인체 역시 평균적으로 인체 내외에 걸쳐 150 타입 이상의 박테리아를 갖고 있으며, 이중 많은 미생물들이 인체에 무해 하기는 하나, 몇몇 종류는 식중독 (botulism), 콜레라 (cholera), 설사 (diarrhea), 구토(emesis), 폐렴 (pneumonia), 장티푸스 (typhoid) 등을 포함하는 다양한 감염성 질환을 유발한다. 병원체는 오염된 토양, 수질 환경, 식자재, 그리고 조리 환경 등을 통해 쉽게 인간에게 감염될 수 있다. 통상의 조건 하에서 병원체의 번식 속도는 매우 빠르기 때문에 아무리 적은 수의 병원체라도 일단 인체 내에 침입할 경우, 이의 생장 환경에 매우 적합한 장 속에서 빠르게 성장하여 인간의 건강을 위협할 수 있는 수준까지 이르게 된다. 따라서, 오염된 환경으로부터 빠르고 간편하게 병원체의 유무를 검출할 수 있는 진단 기술이 요구되고 있다. 병원성 미생물은 통상적으로 배지법을 이용하여 검출 동정하고 있으며 이 방법은 미생물의 증식 배양 등 시간이 오래 걸리는 단점이 있다. 또한 PCR, 항원 항체를 이용한 면역 진단 방법 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA)이 이용되고 있는데 이는 고가의 장비가 필요하며 숙련된 기술이 필요하여 현장에서 미생물의 존재 여부를 신속하게 판단하기에는 어려움이 있다. 따라서 보다 간편하고 신속하게 현장에서 미생물의 존재여부를 판단할 수 있는 기술이 필요하다.
또한, 일반적으로 ATP 측정을 통해서 현장에서 미생물의 존재여부를 확인 하나 ATP는 생명체의 물질 대사에 포함된 에너지원으로 미생물뿐만 아니라 다른 유기물들에서도 생산되기 때문에 정확하게 병원체의 감염에 대해서 측정하기가 어렵고 세포가 사멸하여도 ATP의 기능은 유지되어 사멸되거나 생존력이 매우 낮은 미생물 역시 측정될 가능성이 높다. 이런 문제점을 해결하기 위해서는 세포에 항시 존재하는 효소의 양 및 활성을 측정하여 미생물 검출에 응용하는 방법이 필요하다.
출원번호 KR1020100081068
이에 본 발명자들은 고가의 장비 및 숙련된 실험자 없이 매우 빠르고 효과적으로 생존 미생물을 검출하는 방법을 개발하기 위하여 예의노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 한쪽 말단에는 고체 기질이, 다른 한쪽 말단은 신호를 나타낼 수 있는 효소가 결합되어, 세포 내에 존재하는 뉴클레아제(nuclease)의 활성을 측정할 수 있는, 고체 기질-고정화 프로브를 개발하였고, 상기 프로브가 감염성이 있는 미생물의 뉴클레아제의 핵산분해능을 정확하고 효율적으로 검출할 수 있음을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 뉴클레아제를 검출하는 제제를 포함하는, 미생물 오염 검출용 조성물을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 미생물 오염 검출용 키트를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 미생물의 오염 검출 방법을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 뉴클레아제 활성 측정을 위한 올리고뉴클레오티드를 제공하는 데 있다.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 5' 또는 3'-말단이 고체 기질의 표면에 고정화된, 고체 표면-고정화 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하는, 미생물 현장 오염 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 상기 고체 기질은 임의의 것도 이용할 수 있으며, 예를 들어, 웰 플레이트, 슬라이드 글라스, 컬럼, 다공성 지지체, 자성 나노입자, 금, 합금, 알루미늄, 금속 옥사이드, 세라믹, 석영, 실리콘, 반도체, Si/SiO2 웨이퍼, 게르마늄, 갈륨 아르세나이드, 카본, 탄소나노튜브, 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아크릴아미드, 세파로스, 아가로스 및 콜로이드로 구성된 그룹에서 선택되는 1 종 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서는, 상기 고체 기질로서 자성 나노입자를 이용하며, 이에 따라 올리고뉴클레오티드 프로브가 연결된 자성 나노입자를 포함하는 미생물 현장 오염 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 살아있는 미생물을 검출하는 것에 이용될 수 있다.
즉, 본 발명의 특징은 살아있는 미생물 내 존재하는 효소인 뉴클레아제를 이용하여 미생물의 오염을 진단하는 것이다.
통상적으로 당업계에서 이용하는 미생물 정량법은 세포가 사멸하여도 ATP의 기능은 유지되기 때문에 사멸 또는 생존력이 매우 낮은 미생물 역시 측정되어 위양성 결과를 초래한다.
그러나, 본 발명의 조성물은 실질적으로 살아있는 미생물의 존재를 신속하고 용이하게 검출할 수 있으므로 상술한 바와 같은 위양성 발생 문제를 해결할 수 있다.
본 발명에서, 상기 미생물은 박테리아 또는 진균을 의미한다.
본 발명의 조성물이 검출할 수 있는 박테리아의 종류는 제한되지 않는다. 구체적으로 상기 박테리아는 그람-음성 박테리아 또는 그람-양성 박테리아일 수 있다.
상기 그람-음성 박테리아의 예는 Escherichia coli (E.coli), Helicobcater, Hemophilus, Neisseria, Cyano bacteria, Klebsiella, Acetobacter, Enterobacter, Chlamydia, Vibrio, Pseudomona, Salmonella, Thiobacter, Borrelia, Burkholderia, Serratia, Treponema 등 일 수 있다.
상기 그람-양성 박테리아의 예는 Bacillus, Nocardia, Clostridium, Propionibacterium, Actinomyces, Enterococcus, Cornyebacterium, Listria, Lactobacillus, Gardnerella, Mycobacterium, Mycoplasma, Staphylococcus, Streptomyces, Streptococcus등 일 수 있다.
본 발명의 조성물이 검출할 수 있는 진균은 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 진균은 식물병원성 진균으로 푸사리움속균(Fusarium spp.), 페니실리움속균(Penicillium spp.) 또는 라이족토니아속균(Rhizoctonia solani)일 수 있고, 동물병원성 진균으로서 칸디다(Candida spp.), 아스퍼질러스(Aspergillus spp.), 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans) 및 트리코파이톤(Trichophyton spp.) 등을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "올리고뉴클레오티드 프로브가 연결된 자성 나노입자"는, 타겟으로서 미생물의 뉴클레아제에 의해 인식되어 핵산 절단 반응에 의해 절단되는 올리고뉴클레오티드가 연결된 자성나노입자를 의미하며, 본 발명에서 "DNA 결합 자성 나노입자"와 혼용된다.
상기 DNA 결합 자성 나노입자는 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 특별히 제한되지 않으나, 예컨대, Au, Pt, Pd, Ag 및 Cu로 구성된 그룹에서 선택되는 금속; Co, Mn, Fe, Ni, Gd, Mo, MM'2O4, 및 MxOy (M 및 M'는 각각 독립적으로 Co, Fe, Ni, Mn, Zn, Gd, 또는 Cr을 나타내고, 0 < x ≤, 0 < y ≤5)로 구성된 그룹에서 선택되는 자성 물질; 또는 CoCu, CoPt, FePt, CoSm, NiFe 및 NiFeCo로 구성된 그룹에서 선택되는 자성 합금일 수 있으며, 바람직하게는, Fe이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브는 5' 또는 3' 말단에 검출가능한 시그널을 발생시키는 표지를 포함하며, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브는 미생물 뉴클레아제의 핵산 절단 반응에 의해 절단되어 이러한 표지가 방출되면서 검출가능한 시그널을 발생시킨다.
상기 표지는 단일 표지 또는 이중-표지일 수 있다.
상기 표지는 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 특별히 제한되지 않으나, 예컨대, 화학적 표지, 효소 표지, 방사능 표지, 형광 표지, 발광(luminescent) 표지, 화학발광(chemiluminescent) 표지 및 금속 표지로 이루어진 군에서 선택되는 1 종 이상일 수 있다.
예를 들어, 화학적 표지(예컨대, 바이오틴), 효소 표지(예컨대, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제 및 β-글루코시다아제, 루시페라제, 시토크롬 P450 및 호스라디쉬 퍼옥시다아제), 방사능 표지(예컨대, C14, I125, P32 및 S35), 형광 표지, 발광(luminescent) 표지, 화학발광(chemiluminescent) 표지 또는 금속 표지(예컨대, 금)이다.
본 발명의 표지는 실시간 방식으로 시그널을 발생시킬 수 있는 표지가 바람직하고, 본 발명의 일 실시예에서, 화학적 표지로서 바이오틴을 이용하였다.
상기 바이오틴은 스트렙타아비딘, 아비딘(avidin), 트랩타비딘(traptavidin) 및 뉴트라비딘(neutravidin)으로 이루어진 군에서 선택되는 1 종 이상의 바이오틴-친화성 단백질과 결합하며, 상기 바이오틴-친화성 단백질은 효소로 표지된다.
상기 효소는 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 특별히 제한되지 않으나, 예컨대, HRP(Horseradish peroxidase), ALP(Alkaline phosphatase), 루시퍼라이제(luciferase), 혈당 분해 효소, 인버타제(invertase), 글루코스 옥시다아제(Glucose Oxidase), 베타-디-갈락토시다아제(β-D-galactosidase), MDH(malate dehydrogenase) 및 아세틸콜린에스터라아제(acetylcholinestrerase)로 이루어진 군에서 선택되는 1 종 이상이고, 바람직하게는 HRP(Horseradish peroxidase)이다.
또한, 본 발명의 프로브 상의 표지는 그의 5'-말단 또는 5'-말단으로부터 1-5 뉴클레오타이드 이격된 위치에 있으며, 보다 바람직하게는 5'-말단 또는 5'-말단으로부터 1-4 뉴클레오타이드 이격된 위치, 보다 더 바람직하게는 5'-말단 또는 5'-말단으로부터 1-3 뉴클레오타이드 이격된 위치, 보다 더욱 더 바람직하게는 5'-말단 또는 5'-말단으로부터 1-2 뉴클레오타이드 이격된 위치, 가장 바람직하게는 5'-말단에 있다.
본 발명의 일 예에 따르면, 상기 올리고뉴클레오티드는 단일가닥 또는 이중가닥으로 이루어진다.
본 명세서에서 프로브를 언급하면서 사용된 용어 "5'-말단" 부위는, 프로브의 5'-말단으로부터 어떤 길이의 연속적인 서열을 포함하는 부위 또는 구역을 의미한다. 바람직하게는, 프로브의 5'-말단 부위는 그의 5'-말단으로부터 1-10 개의 뉴클레오티드를 포함하는 서열로 구성된다.
본 명세서에서 프로브를 언급하면서 사용된 용어 "3'-말단" 부위는 프로브의 3'-말단으로부터 어떤 길이의 연속적인 서열을 포함하는 부위 또는 구역을 의미한다. 바람직하게는, 프로브의 3'-말단 부위는 그의 3'-말단으로부터 1-10 개의 뉴클레오티드를 포함하는 서열로 구성된다.
본 발명에서 핵산 가닥은 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드, 및 그의 단편 또는 부분을 지칭하며, 센스 또는 안티센스 가닥을 의미할 수 있는 게놈 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA를 지칭한다. 본 발명에서 핵산 가닥은 바람직하게는 DNA로 이루어질 수 있다.
또한, 본 발명의 프로브는 바람직하게는 이중 핵산 가닥으로 이루어진 것을 특징으로 한다. 본 발명의 이중핵산 가닥은 상호 혼성화되어 있다. 본 명세서에서 용어 "혼성화"는 상보적인 핵산의 대합과 관련하여 사용된다. 혼성화 및 혼성화 강도(즉 핵산 사이의 연합 강도)는 핵산 사이의 상보성 정도, 관련 조건의 엄격성(stringency), 및 형성된 혼성물(hybrid)의 Tm과 같은 요인들에 의해 영향을 받는다. "혼성화" 방법은 하나의 핵산과 다른 상보적 핵산, 즉 상보적 뉴클레오티드 서열을 가진 핵산의 어닐링(annealing)을 포함한다. 상보적 서열을 포함하는 두 가지 핵산 중합체가 서로를 인식하고 염기 대합 상호작용을 통해 어닐링하는 능력은 잘 이해되어 있는 현상이다. "혼성화" 과정의 초기 관찰(Marmur and Lane, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 46:453 (1960) 및 Doty et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 46:461 (1960))은 후속의 연구에 의해 진보하여 현대 생물학의 필수 도구가 되었다.
본 발명의 핵산 가닥은 천연 핵산에서 일반적으로 발견되지 않는 염기도 본 발명의 핵산에 포함될 수 있으며, 이는 예를 들어 이노신 및 7-데아자구아닌을 포함한다. 상보성이 완벽할 필요는 없으며; 안정한 이중체가 불일치 염기쌍 또는 쌍을 이루지 않는 염기를 포함할 수 있다. 핵산 기술 분야의 당업자는, 예를 들어 올리고뉴클레오티드의 길이, 올리고뉴클레오티드의 염기 조성 및 서열, 이온 세기 및 불일치 염기쌍의 발생률과 같은 다수의 변수를 고려하여 실험적으로 이중체의 안정성을 결정할 수 있다.
본 발명의 핵산 가닥은 임의의 방식, 예를 들어 화학적 합성, DNA 복제, 역전사, PCR, 또는 이들의 조합에 의해 생성될 수 있다.
본 발명에서 뉴클레아제 (nuclease)는 핵산 가수분해 효소를 의미하며, 핵산, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드등의 가수분해 반응을 촉매하는 효소를 의미한다. 상기 뉴클레아제는 그 종류의 제한이 없으며, DNA를 분해하는 DNase, RNA를 분해하는 RNase를 포함한다. 또한, 상기 뉴클레아제는 폴리뉴클레오티다아제, 뉴클레오티다아제, 뉴클레오시다아제를 포함하는 개념이다. 또한, 이는 3' 말단 또는 5' 말단을 순차적으로 분해하는 엑소뉴클레아제(exonuclease) 및 핵산 사슬 내부를 절단하는 엔도뉴클레아제(endonuclease)를 포함한다. 특히, 본 발명은 엑소뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제를 동시에 측정할 수 있는 구성을 포함한다.
또한, 본 발명의 고체 표면-고정화된 올리고뉴클레오타이드 프로브는, 추가적으로 별개의 나노입자와 결합하며, 상기 별도의 나노입자는 그 표면에 표지 물질이 고정화된 것일 수 있다.
즉, 본 발명의 고체 표면-고정화된 올리고뉴클레오타이드 프로브는, 측정 시그널 발생의 증대를 위하여, 표지된 나노입자를 추가적으로 결합시킬 수 있으며, 상기 추가적인 별개의 나노입자로서, 예컨대, 금나노입자에 poly-HRP를 결합시킨 금 나노입자를 도입할 수 있다.
또한, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브는 서열번호 1 내지 5의 염기 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 염기서열로 구성될 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 단일가닥 상태 뿐만 아니라, 상기 단일가닥 상태의 염기 서열들 중 2 종 이상을 조합하여 어닐링시킴으로써 이중-가닥 상태로 제작하여 이용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 DNA 결합 자성 나노입자는, 다양한 핵산 분해효소(DNA exonuclease)에 의해 분해되어 신호를 생성할 수 있도록, 단일-가닥 및 이중-가닥 DNA 구조를 하나의 올리고뉴클레오타이드 프로브에 결합하고, 여기에 자성 나노입자를 고정화시켜, 올리고뉴클레오타이드 프로브가 연결된 자성나노입자를 설계하였고, 보다 바람직하게는, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 프로브는, 프로브 상에 검출가능한 시그널을 발생시키는 표지가 결합될 수 있도록 5'-말단을 바이오틴화시키고, 상기 바이오틴에 대해 친화적이며 검출가능한 시그널을 발생시키는 효소로 표지된 스트렙타아비딘과 결합시켰다. 또한, 상기 올리고뉴클레오타이드 프로브는 3'-말단에 아미노기(NH2)를 가지고 있으며, 이를 통하여 고상 기질(solid substrate)인 자성 나노입자의 표면상에 고정화하였다.
이러한 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 프로브가 연결된 자성나노입자는, 핵산 프로브가, 단일가닥, 이중가닥, 그 길이에 관계없이 세균 용해시 나오는 핵산 분해 효소에 의해 절단되기만 하면 검출 효과를 얻을 수 있으므로, 따라서, 본 발명의 프로브가 연결된 자성 나노입자를 활용한 미생물 오염도 검출 기술을 이용하면 그람-음성 박테리아 또는 그람-양성 박테리아를 위양성 시그널 없이 신속하며 용이하게 검출할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 미생물 현장 오염 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 미생물을 검출하는 것에 이용될 수 있다.
본 발명의 상기 키트는 미생물 검출을 실시하기 위해 필요한 반응 구성성분의 보관 또는 전달을 위한 키트를 제공한다. 키트는 검출에 필요하거나 바람직한 임의의 모든 구성성분을 포함할 수 있으며, 여기에는 시약 자체, 완충액, 제어 시약(예를 들어 조직 시료, 양성 및 음성 대조군 표적 올리고뉴클레오티드 등), 고체 지지체, 표지, 서면 및/또는 도면 사용 설명서 및 제품 정보, 저해제, 표지화 및/또는 검출 시약, 포장 환경 제어(예를 들어 얼음, 제습제 등) 등이 포함되나 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 키트는 상술한 조성물을 구성으로 포함하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 미생물 현장 오염 진단 방법을 제공한다:
(a) 시료 내 미생물을 용해시키는 단계;
(b) 상술한 조성물을 상기 시료에 처리하는 단계; 및
(c) 상기 시료에서 방출되는 시그널을 검출하는 단계.
본 발명에 있어서 용어 "시료"는 가장 광범위한 의미로 사용된다. 한편으로 이는 검체 또는 배양물 (예를 들어 미생물 배양물)을 포함하는 의미이다. 다른 한편으로는 생물학적 및 환경적 시료 양자 모두를 포함 하는 의미이다. 시료는 합성 기원의 검체를 포함할 수 있다.
생물학적 시료는 멸균된 액체 및 고체 식품 및 사료 제품(feed product) 및 유제품 품목, 야채, 식육 및 식육 부산물과 같은 성분, 및 폐기물일 수도 있다. 생물학적 시료는 야생화(feral) 또는 야생 동물을 비롯하여 다양한 계열의 모든 가축으로부터 수득할 수 있으며, 이들 동물은 유제류, 곰, 물고기, 토끼목의 포유류, 설치류 등을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
환경적 시료는, 식품 및 유제품 가공 기기, 기구, 장비, 용구, 일회용 및 비-일회용 품목과 함께, 표면 소재 (surface matter), 토양, 물 및 산업적 시료와 같은 환경적 재료를 포함한다. 이들 예가 본 발명에 적용할 수 있는 시료 유형을 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 발명의 상기 방법은 상기 시료에서 시그널로서 발색을 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 발색은 시료 내 미생물이 존재하는 경우, 시그널을 발생하는 효소로 표지된 프로브가 미생물의 뉴클레아제에 의하여 절단되는 시점에서, 절단된 프로브가 방출되면서 노출된 효소가 발색기질에 의해 시그널을 발생(발색)하는 것을 확인할 수 있다.
예컨대, TMB 등과 같은 기질용액을 첨가하면, 미생물이 부재인 음성 시료에서는 프로브가 절단되지 않아서 기질과 반응하지 않음으로써 비색(발색) 반응이 나타나지 않으며, 미생물이 존재하는 양성 시료에서는 프로브가 절단되면서 기질과 반응함으로써 강한 비색 반응이 나타나서, 미생물 오염 여부를 진단할 수 있는 것이 특징이다.
본 발명의 방법은 상술한 조성물을 이용하여 검출하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명에 따른 미생물 현장 오염 검출용 조성물은 포괄적인 뉴클레아제의 핵산 분해능을 검출할 수 있어, 시료에서 살아있는 미생물을 매우 신속하고 정확하게 검출할 수 있으며, 검출 방법이 간편한 특징을 가진다. 이에 따라, 본 발명의 조성물은 환경에서 미생물의 오염도를 쉽고 간편하게 측정할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명에 따른 DNA 결합 자성 나노입자에 의한 미생물 현장 오염 검출 방법을 도식적으로 보여준다.
도 2는 본 발명의 DNA 결합 자성 나노입자의 핵산 분해 효소(Endonuclease, DNase) 반응성 확인 결과를 보여준다.
도 3은 발색반응을 이용한 DNA 결합 자성 나노입자의 E.coli 검출 결과를 보여준다.
도 4는 발색반응을 이용한 DNA 결합 자성 나노입자의 양에 따른 E.coli 검출 결과를 보여준다.
도 5는 발색반응을 이용한 DNA 결합 자성 나노입자의 Acinetobacter baumannii 검출 결과를 보여준다.
도 6은 발색반응을 이용한 DNA 결합 자성 나노입자의 Staphylococcus aureus 검출 결과를 보여준다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 올리고뉴클레오타이드 프로브가 연결된 자성 나노입자의 제작
본 발명자들은 다양한 핵산 분해효소(DNA exonuclease)에 의해 분해되어 신호를 생성할 수 있도록, 단일-가닥 및 이중-가닥 DNA 구조를 하나의 올리고뉴클레오타이드 프로브에 결합하고, 여기에 자성 나노입자를 고정화시켜, 프로브가 연결된 자성나노입자를 설계하였다.
보다 구체적으로, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 프로브는 프로브 상에 검출가능한 시그널을 발생시키는 표지가 결합될 수 있도록 5'-말단을 바이오틴화시키고, 상기 바이오틴에 대해 친화적이며 검출가능한 시그널을 발생시키는 효소로 표지된 스트렙타아비딘과 결합시켰다. 또한, 상기 올리고뉴클레오타이드 프로브는 3'-말단에 아미노기(NH2)를 가지고 있으며, 이를 통하여 고상 기질(solid substrate)인 자성 나노입자의 표면상에 고정화하였다.
올리고뉴클레오타이드 서열은 다음과 같다:
DNA1: 5'-biotin-ATC ACC CTC CCC GCA CCT AAA GGG TGC GGG GAG GGT-NH2(C6)3'(서열번호 1)
DNA2: 5'-ACC CTC CCC GCA CCC TAT TGG TGC GGG GAG GG-3' (서열번호 2)
DNA3: 5'-biotin-ACC CTC CCC GCA CCC TAT TGG TGC GGG GAG GG-NH2(C6)3' (서열번호 3)
DNA4: 5'-ATC ACC CTC CCC GCA CCT AAA GGG TGC GGG GAG GGT-3' (서열번호 4)
DNA5: 5'-biotin TCG GGA CAC TGA ACC CTA AAG GGG TTC AGT GTC CC-NH2 (C6)3' (hairpin)(서열번호 5)
(밑줄은 미스매치 뉴클레오타이드들을 가리킨다)
5'-말단에는 바이오틴, 3'-말단에는 아미노기가 결합되어 있는 올리고뉴클레오타이드는 GenoTech (Korea)에서 공급받았다.
올리고뉴클레오타이드를 고농도로 100 μM의 증류수에 용해시켰다. 10 ㎕의 올리고뉴클레오타이드를 100 ㎕ 어닐링 완충액(50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7.9, 10 mM MgCl2, 100 μg mL-1 bovine serum albumin (BSA))에 혼합하였다. 이 어닐링 완충액은 완충 환경을 제공하고 염은 올리고뉴클레오타이드 혼성화에 필수적이다. 혼합된 올리고뉴클레오타이드는 95℃에서 5 분간 인큐베이션한 후 점차적으로 70 분 동안 45℃에서 서서히 냉각시켰다. 어닐링된 프로브는 안정한 이중-가닥 형태로 4℃에서 보관할 수 있다.
상기 올리고뉴클레오타이드 프로브 100 μM biotin-DNA sequence-NH2에, 카르복실기를 포함하고 있는 400 nm 자성 나노입자 5 mg(400 nm에 carboxylic acid로 표면 개질된 자성(Fe) 나노입자을 첨가한 후 24시간 동안 EDC(1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride) 및 NHS(N-hydroxysuccinimide)로 반응시켰다.
이후 자석을 통해서 미반응물을 제거하고 Streptavidin-HRP 또는 Streptavidin-poly HRP 또는 gold nanoparticle에 streptavidin-HRP를 결합시켜 2시간 상온에서 반응시켰다. 자석을 통해서 미반응물을 제거하고 PBS 100 μl에 재분산시켰다.
또한, 하기 실시예에 적용하기 위하여, 상기 DNA1 내지 5(서열번호 1 내지 5)를 하기와 같이 조합하여 프로브가 연결(결합)된 자성 나노입자 실험군을 제작하였다:
1번; 무처리 대조군으로서 자성 나노입자(magnetite nanoparticle) 단독,
2번; DNA1을 자성 나노입자에 결합 후 DNA2와 어닐링,
3번; DNA3을 자성 나노입자에 결합 후 DNA4와 어닐링,
4번; DNA5 (hairpin 구조를 갖음)를 자성 나노입자에 결합,
5번; DNA1과 DNA2를 어닐링한 후 자성 나노입자에 결합,
6번; DNA3과 DNA4를 어닐링한 후 자성 나노입자에 결합.
실시예 2. 올리고뉴클레오타이드 프로브가 연결된 자성 나노입자의 핵산 분해효소와의 반응성
본 발명자들은 상기 실시예 1에서 제작된 각각의 DNA 서열(올리고뉴클레오타이드 프로브)가 결합된 자성 나노입자(DNA 결합 자성 나노입자)의 효소 반응성을 측정하였다.
간략하게는 다음과 같다:
각 올리고뉴클레오타이드 프로브가 연결된 자성 나노입자 50 μl에 핵산분해효소(Endonuclease 및 Dnase) 10unit을 반응 완충액(reaction buffer) 450 μl (50mM Tris HCl (pH 8), 1mM MgCl2, 0.1% BSA)에서 10 분 반응시키고 자석을 이용하여 나노입자를 제거한 후, 핵산분해효소에 의해 절단된 DNA 프로브가 포함된 상층액을 획득하였다. 상기 상층액과 TMB 용액을 반응시켜 microplate reader (O.D 650nm)로 발색 반응을 관찰하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 2 내지 6번 실험군 모두에서 효소 반응 후 발색 반응이 일어나는 것을 확인할 수 있었다.
또한, Dnase를 처리했을 경우에서도 반응 완충액 (0.15M NaCl 용액)에서 반응 후 모든 나노입자에서 발색 반응이 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 나노입자에 DNA가 잘 결합되었고 결합된 DNA 시퀀스가 효소에 의해 절단되어 시그널을 발생시키는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3. 미생물 배양
Escherichia coli, Acenetobacter baumannii는 LB (Luria Bertani) broth에, Staphylococcus aureus는 NB (nutrient broth)에 접종하여 37℃ 진탕 배양기(shaking incubator)에서 14 내지 16시간 동안 배양하였다.
배양한 균들의 cfu (colony forming unit) 측정을 위해서 각각의 고체 평판배지에 배양액 100 μl를 접종하여 도말한 후, 37℃에서 16 내지 24 시간 배양하여, 형성되는 콜로니를 계수한 후 희석배수 곱하여 생균수를 측정하였다.
또한, 배양중인 균의 액체 배지에서 적당량을 흡광 광도계로 600 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다.
실시예 4. 올리고뉴클레오타이드 프로브가 연결된 자성 나노입자를 이용한 박테리아 검출 발색(TMB) 반응
본 발명자들은 본 발명의 프로브를 이용하여 발색(TMB) 반응을 통해 박테리아를 검출하였다.
간략하게는 다음과 같다:
각 농도의 E.coli 50 μl를 lysis buffer 50 μl (stock, 10X, 100 mM KCl, 20 mM Tris (pH 8.5), 5mM MgCl2, 1% NP-40, 1% Tween 20 (proteinae K)에 반응 시키고 올리고뉴클레오타이드 프로브가 연결된 자성 나노입자를 50 μl, 반응 완충액(reaction buffer)(50 mM Tris-HCl pH 8.0, 5mM CaCl2) 50 μl를 반응 후 자석으로 나노입 자를 제거하고, 미생물에 의해 절단된 DNA probe의 시그널을 측정하였다. 상층액 100 μl를 TMB 50 μl와 반응하여 발색 반응을 microplate reader로 흡광도 650 nm에서 측정하였다.
그 결과, 도 3 및 4에 나타낸 바와 같이, 모든 실험군에서 농도-의존적으로 시그널이 측정되었다.
특히, 5번 및 6번 실험군(DNA 어닐링 후 나노입자와 결합)에서 더욱 시그널이 증가되는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 도 5에 나타낸 바와 같이, 또 다른 그람 음성 박테리아(gram negative bacteria)인 다재내성균 Acentobacter baumanni에 처리한 경우에도, 5번 및 6번 실험군에서 농도-의존적으로 시그널이 측정되었다.
또한, 도 6에 나타낸 바와 같이, 그람 양성 박테리아(Gram positive bacteria)인 Staphylococcus aureus에 처리한 경우, 6번에서 가장 농도 의존적인 결과를 확인할 수 있었다.
결과적으로, 대부분의 실험군(각각 뉴클레오타이드가 결합된 나노입자)에서 박테리아와의 반응을 통해서 시그널의 증가가 확인되었다.
또한, biotin-DNA 결합 자성 나노입자에 효소를 더욱 많이 결합시키기 위해 추가적으로 금 나노입자를 도입하였다. 즉, 금 나노입자에 poly-HRP를 결합시킨 Gold nanoparticle-poly HRP를, biotin-DNA 결합 자성 나노입자에 결합시킴으로써 시그널을 증대시켰다.
그 결과, 반응 효소로 Gold nanoparticle-poly HRP를 나노입자에 결합시켰을 때 40 cfu까지 E. coli를 검출할 수 있었다.
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실시예 5. 올리고뉴클레오타이드 프로브가 연결된 자성 나노입자 양에 따른 박테리아 검출
효율이 좋았던 5번 나노입자를 이용하여 자성 나노입자 결합 양에 따른 박테리아(E. coli) 검출 양을 확인하였다. 같은 양의 gold-poly HRP를 각각의 양의 DNA 결합 자성 나노입자에 결합하였다. 각 농도의 E. coli 50 μl 를 용해 완충액(lysis buffer) 50 μl (stock, 10, 100 mM KCl, 20 mM Tris (pH 8.5), 5mM MgCl2, 1% NP-40, 1% Tween 20 (proteinase K)에 반응시키고 올리고뉴클레오타이드 프로브가 연결된 자성 나노입자를 50 μl 반응 완충액(50 mM Tris-HCl pH 8.0, 5mM CaCl2) 50 μl를 반응 후 자석으로 나노입자를 제거하고 미생물에 의해 절단된 DNA probe의 시그널을 측정하였다. 상층액 100 μl를 TMB 50 μl와 반응하여 발색 반응을 microplate reader로 흡광도 650 nm에서 측정하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 전체적인 시그널이 자성나노입자 결합 양에 따라 증가하였으며 각 농도의 E. coli를 반응 후 측정한 측정값에서는 나노입자의 양이 1mg보다 많았을 때 농도-의존적인 시그널 값을 확인할 수 있었다.
종합적으로, 본 발명은 한 쪽 말단에 고체 표면, 다른 쪽 말단에는 효소 및 발광체를 연결시키는 수단으로서의 핵산 프로브가, 단일가닥, 이중가닥, 그 길이에 관계없이 세균 용해시 나오는 핵산 분해 효소에 의해 절단되기만 하면 검출 효과를 얻을 수 있고, 실제 결과에서도 102 CFU/ml의 세균까지도 검출이 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명의 프로브가 연결된 자성 나노입자를 활용한 미생물 오염도 검출 기술을 이용하면 그람-음성 박테리아 또는 그람-양성 박테리아를 위양성 시그널 없이 신속하며 용이하게 검출할 수 있다.
비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한 첨부된 청구 범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.
<110> BioNano Health Guard Research Center <120> Composition for In-situ Detecting Microbial Contamination and Uses Thereof <130> NHG1-18p <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA1 <400> 1 atcaccctcc ccgcacctaa agggtgcggg gagggt 36 <210> 2 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA2 <400> 2 accctccccg caccctattg gtgcggggag gg 32 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA3 <400> 3 accctccccg caccctattg gtgcggggag gg 32 <210> 4 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA4 <400> 4 atcaccctcc ccgcacctaa agggtgcggg gagggt 36 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA5 <400> 5 tcgggacact gaaccctaaa ggggttcagt gtccc 35

Claims (17)

  1. 자성 나노입자 표면-고정화된 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하는, 살아있는 미생물 현장 오염 검출용 조성물로서,
    상기 올리고뉴클레오타이드 프로브는, 이의 3'-말단이 자성 나노입자 표면에 고정화되고, 이의 5'-말단은 검출가능한 시그널을 발생시키는 효소 표지를 포함하며;
    상기 효소 표지는 미생물 뉴클레아제의 핵산 절단 반응에 의해 절단되어 방출되면서 상기 검출가능한 시그널을 발생시키고;
    상기 시그널은 발색 반응이며;
    상기 효소 표지는 바이오틴에 의해 연결되고;
    상기 바이오틴은 스트렙타아비딘, 아비딘(avidin), 트랩타비딘(traptavidin) 및 뉴트라비딘(neutravidin)으로 이루어진 군에서 선택되는 1 종 이상의 바이오틴-친화성 단백질과 결합하며;
    상기 효소는 HRP(Horseradish peroxidase), ALP(Alkaline phosphatase), 루시퍼라이제(luciferase), 혈당 분해 효소, 인버타제(invertase), 글루코스 옥시다아제(Glucose Oxidase), 베타-디-갈락토시다아제(β-D-galactosidase), MDH(malate dehydrogenase) 및 아세틸콜린에스터라아제(acetylcholinestrerase)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 미생물은 그람-음성 박테리아 또는 그람-양성 박테리아인 것을 특징으로 하는,
    살아있는 미생물 현장 오염 검출용 조성물.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서,
    상기 자성 나노입자 표면-고정화된 올리고뉴클레오타이드 프로브는, 추가적으로 별개의 나노입자와 결합하며, 상기 별개의 나노입자 표면에 표지를 고정화하는 것을 특징으로 하는,
    살아있는 미생물 현장 오염 검출용 조성물.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제1항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오타이드 프로브는, 단일가닥, 이중가닥 또는 이의 조합으로 이루어진 것을 특징으로 하는,
    살아있는 미생물 현장 오염 검출용 조성물.
  15. 제1항 또는 제3항의 조성물을 포함하는, 살아있는 미생물 현장 오염 검출용 키트.
  16. (a) 시료 내 미생물을 용해시키는 단계;
    (b) 제1항 또는 제3항의 조성물을 상기 시료에 처리하는 단계; 및
    (c) 상기 시료에서 방출되는 시그널을 검출하는 단계;
    를 포함하는 살아있는 미생물 현장 오염 진단 방법으로서,
    상기 시그널의 검출은 상기 미생물의 존재를 나타내는 것을 특징으로 하는, 방법.
  17. 삭제
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