TW202134260A

TW202134260A - 微小肌縮蛋白基因療法之構築體及其用途

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Publication number: TW202134260A
Application number: TW109141932A
Authority: TW
Inventors: 春平喬; 迪文麥道加; 曄劉; 奧利斐爾達諾斯
Original assignee: 美商銳進科斯生物股份有限公司
Priority date: 2019-11-28
Filing date: 2020-11-27
Publication date: 2021-09-16
Also published as: WO2021108755A2; MX2022006427A; CA3159516A1; AU2020392243A1; KR20220107222A; JP2023503637A; BR112022009895A2; WO2021108755A3; EP4065596A2; CL2022001372A1; US20230270886A1

Abstract

本發明提供部分地基於編碼微小肌縮蛋白的新穎基因構築體用於基因療法。該等微小肌縮蛋白基因構築體及表現盒經工程化，當由病毒載體在肌細胞及/或CNS細胞中表現時，用於對個體之效能、功效及安全性改良之療法。

Description

微小肌縮蛋白基因療法之構築體及其用途

本發明係關於新穎微小肌縮蛋白及基因療法載體(例如編碼新穎微小肌縮蛋白之重組AAV載體)、以及其組合物及用途及使用其之治療方法。

一組稱為肌縮蛋白病之神經肌肉疾病係由DMD基因中之突變引起。每一肌縮蛋白病具有不同表型，其中所有患者皆患有肌無力且最終嚴重程度各異之心肌病。杜興氏肌營養不良(DMD)係一種嚴重的X性聯之進行性神經肌肉疾病，大約每3,600至9,200個活產男性中有一個受其影響。該病症係由廢除肌縮蛋白之表現的肌縮蛋白基因之框移突變引起。由於缺乏肌縮蛋白，骨骼肌及最終心臟及呼吸肌(例如肋間肌及橫膈膜)退化，從而導致過早死亡。進行性無力及肌肉萎縮在兒童期開始。受影響之個體經歷呼吸困難、呼吸道感染及吞嚥問題。幾乎所有DMD患者皆會發展心肌病。與心臟累及複合之肺炎係最常見之死亡原因，其經常在第三個十年之前發生。

貝氏肌肉營養不良症(Becker muscular dystrophy，BMD)之症狀不如DMD嚴重，但仍導致過早死亡。與DMD相比，BMD之特徵在於較晚發作之骨骼肌無力。而DMD患者在13歲之前依賴輪椅，患有BMD之彼等在16歲之後不能走動且需要輪椅。BMD患者亦展現對頸部屈肌力量之保護，此與患有DMD之其對應體不同。儘管較溫和之骨骼肌累及，但來自DMD相關之擴張性心肌病(DCM)之心臟衰竭係BMD發病之常見原因及死亡之最常見原因，其平均發生在40多歲左右。

肌縮蛋白係由DMD基因編碼之細胞質蛋白，且用於將細胞骨架肌動蛋白纖絲連接至膜蛋白。通常，肌縮蛋白主要位於骨骼肌及心肌中，在腦中表現之量較小，藉由將收縮裝置之肌動蛋白連接至圍繞每一肌纖維之結締組織層，在肌纖維收縮期間充當減震器。在肌肉中，肌縮蛋白位於肌纖維膜之細胞質面。

DMD 基因係已知之最大之人類基因。引起DMD或BMD之最常見突變係一或多個外顯子之大缺失突變(60-70%)，但重複突變(5-10%)及單核苷酸變體(包括小缺失或插入、單鹼基變化及剪接位點變化，在患有DMD之男性中佔約25-35%之致病性變體且在患有BMD之男性中佔約10-20%)亦可引起致病性肌縮蛋白變體。在DMD中，突變經常導致框移，此導致過早終止密碼子及截短之非功能性或不穩定之蛋白質。無義點突變亦可導致過早終止密碼子，結果相同。儘管引起DMD之突變可影響任何外顯子，但外顯子2-20及45-55係大缺失及重複突變之常見熱點。框內缺失導致嚴重程度較低之貝氏肌肉營養不良症(BMD)，其中患者表現截短之部分功能性肌縮蛋白。

全長肌縮蛋白係一種大(427 kDa)蛋白質，其包含許多有助於其功能之亞域。該等亞域自胺基端向羧基端依次包括N端肌動蛋白結合域、中央所謂之「棒狀」域、富含半胱胺酸之域及最後羧基端域或區。棒狀域由4個富含脯胺酸之鉸鏈域(縮寫為H)及24個血影蛋白樣重複(縮寫為R)按以下次序構成：第一鉸鏈域(H1)、3個血影蛋白樣重複(R1、R2、R3)、第二鉸鏈域(H2)、再16個血影蛋白樣重複(R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18、R19)、第三鉸鏈域(H3)、再5個血影蛋白樣重複(R20、R21、R22、R23、R24)及第四鉸鏈域(H4) (包括WW域)。在棒狀域之後係富含半胱胺酸之域及COOH (C) 端(CT)域。

隨著腺相關病毒(AAV)介導之基因療法潛在地治療多種罕見疾病之用途之進展，AAV可用於治療DMD、BMD及較不嚴重之肌縮蛋白病已成為希望且令人感興趣。由於對AAV載體之有效酬載大小之限制，注意力集中於產生微小或小型肌縮蛋白，即消除非必需亞域、同時維持全長蛋白之至少一些功能之肌縮蛋白之較小形式。據報導，mdx 小鼠中AAV介導之小型肌縮蛋白之基因療法(DMD之動物模型)在肌肉中展現有效表現及改良之肌肉功能(例如，參見Wang等人，J. Orthop. Res. 27:421 (2009))。

因此，業內需要編碼微小或小型肌縮蛋白之AAV載體，其可在患有DMD或BMD之個體之轉導細胞中以有效程度表現，且較佳最小化對治療性蛋白之免疫反應。

本發明提供部分地基於編碼微小肌縮蛋白的新穎基因構築體用於基因療法。微小肌縮蛋白基因構築體及表現盒經工程化，以當由病毒載體在肌細胞及/或CNS細胞中表現時，用於對個體之效能、功效及安全性改良之療法。基於活體內治療模型，本揭示內容之微小肌縮蛋白基因療法顯示握力、最大及特定肌力及/或器官及肌肉重量減少之量測之改良。因此，提供改良之基因療法載體，例如重組AAV載體，例如重組AAV8或AAV9載體，其包含用於微小肌縮蛋白之基因療法表現之該等構築體；以及在治療方法中使用該等基因療法載體之方法及製備如本文所述之該等基因療法載體之方法。

提供微小肌縮蛋白及編碼其之核酸構築體，其包含N端肌動蛋白結合域及鉸鏈、棒狀及血影蛋白域之亞組，之後係富含半胱胺酸之域，以及視情況C端域之全部或一部分(例如含有螺旋1之部分)。在特定實施例中，微小肌縮蛋白具有C端域之全部或部分、或其α1-互生蛋白(syntrophin)及/或α-異連蛋白(dystrobrevin)結合部分。具有C端域之微小肌縮蛋白或其α1-互生蛋白及/或α-異連蛋白結合部分可具有改良之心臟保護活性及/或導致弱化之心肌功能之改良或降低/延遲其進展。

實例性微小肌縮蛋白編碼構築體圖解說明於圖1A 及22 中。本文所述之實施例係自胺基端至羧基端具有以下之微小肌縮蛋白：

ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR，

ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT

ABD-H1-R1-R2-R16-R17-R24-H4-CR-CT，或

ABD-H1-R1-R2-R16-R17-R24-H4-CR，

其中ABD係肌縮蛋白之肌動蛋白結合域，H1係肌縮蛋白之鉸鏈1區，R1係肌縮蛋白之血影蛋白1區，R2係肌縮蛋白之血影蛋白2區，R3係肌縮蛋白之血影蛋白3區，H3係肌縮蛋白之鉸鏈3區，R16係肌縮蛋白之血影蛋白16區，R17係肌縮蛋白之血影蛋白17區，R24係肌縮蛋白之血影蛋白24區，CR係肌縮蛋白之富含半胱胺酸之區或其結合β-肌縮蛋白聚糖之至少一部分，且CT係肌縮蛋白之C端區之至少一部分，其中該部分包含α1-互生蛋白結合位點及/或α-異連蛋白結合位點。在某些實施例中，CT域具有SEQ ID NO: 35、70或83之胺基酸序列。在某些實施例中，H3域係SEQ ID NO: 11之完整序列。CR域可為全長CR域或縮短之CR域，特別是結合β-肌縮蛋白聚糖之縮短之CR域。在某些實施例中，CR域具有SEQ ID NO: 15或90之胺基酸序列。在某些實施例中，內源連接體序列連接域，例如內源人類肌縮蛋白中R23與R24之間之連接體之全部或3個胺基酸部分連接H3域及R24域。或者，在一些實施例中，H3可經肌縮蛋白之鉸鏈2區(H2)取代。

本文提供之微小肌縮蛋白展現肌縮蛋白功能(參見圖13)，例如(1)結合肌動蛋白、β-肌縮蛋白聚糖、α1-互生蛋白、α-異連蛋白及nNOS (包括經由α1-互生蛋白間接結合之nNOS)中之一者、組合或全部；(2)在動物模型(例如，在本文所述之mdx 小鼠模型中)或在人類個體中促進改良之肌肉功能或減緩肌肉功能降低之進展；及/或(3)在動物模型或人類患者中具有心臟保護功能或促進心肌功能改良或減弱心臟功能障礙或減緩心臟功能退化之進展。

在特定實施例中，微小肌縮蛋白具有SEQ ID NO: 1、2、79、91、92或93之胺基酸序列。

本文提供編碼微小肌縮蛋白之核酸，包括用於基因療法之轉基因或基因盒。在實施例中，微小肌縮蛋白由SEQ ID NO: 20、21、81、101、102或103之核苷酸序列或編碼SEQ ID NO: 1、2、79、91、92或93之胺基酸序列之任何核苷酸序列編碼。實例性構築體圖解說明於圖 1A 及22 中。在某些實施例中，構築體包括微小肌縮蛋白編碼序列之5’內含子。在一些實施例中，內含子之長度小於100個核苷酸。在特定實施例中，構築體包括人類免疫球蛋白重鏈可變區(VH) 4 (VH4)內含子，且該內含子位於微小肌縮蛋白編碼序列之5’。相對於不具有VH4內含子之核酸構築體之表現，VH4內含子之存在可導致微小肌縮蛋白在細胞中之表現改良。

本文提供之轉基因含有驅動微小肌縮蛋白在適當細胞類型(例如肌細胞(包括骨骼肌、心肌及/或平滑肌)及/或CNS細胞)中表現之啟動子。減小基因療法(例如用重組AAV載體療法)中使用之轉基因之大小，可改良重組AAV載體之效能及效率。本文提供轉基因，其中啟動子係肌肉特異性啟動子、CNS特異性啟動子或兩者。在某些實施例中，啟動子係長度小於350 kb之肌肉特異性啟動子。在一些實施例中，啟動子係SPc5-12啟動子(SEQ ID NO: 39)。本文提供轉基因，其中啟動子係截短之SPc5-12啟動子(SEQ ID NO: 40)，其指導微小肌縮蛋白之表現且比SPc5-12啟動子短，如本文更全面闡述。在某些實施例中，啟動子係CNS特異性啟動子。

亦提供轉基因或基因盒，其中微小肌縮蛋白編碼序列經密碼子最佳化以增加表現。另外或另一選擇為，微小肌縮蛋白編碼序列及/或轉基因序列可缺失CpG以降低免疫原性。在一些實施例中，微小肌縮蛋白轉基因具有少於兩個(2) CpG島、或一個(1) CpG島(具體而言如本文所定義)，且在某些實施例中無CpG島。與具有多於2個CpG島之微小肌縮蛋白構築體相比，具有少於2個、1個或具有0個CpG島之轉基因具有降低之免疫原性，如藉由抗藥物抗體效價所量測。

本文提供包含SEQ ID NO: 53、54、55、56、82、104、105或106之核苷酸序列之核酸，其編碼實例性基因盒或轉基因。

用於遞送本文所述轉基因之重組載體包括非複製重組腺相關病毒載體(rAAV)，且可為AAV8或AAV9血清型或適於將微小肌縮蛋白編碼序列遞送至肌細胞(包括骨骼肌及心肌兩者)及/或CNS細胞之任何其他血清型，該等CNS細胞將表現微小肌縮蛋白並向患者提供額外益處及/或遞送至肌細胞。

亦提供包含編碼本文提供之微小肌縮蛋白之重組載體之醫藥組合物(包括與醫藥上可接受之賦形劑一起)，以及藉由向有需要之個體投與本文所述基因療法載體來治療任何肌縮蛋白病(例如杜興氏肌肉營養不良症(DMD)及貝氏肌肉營養不良症(BMD))、X性聯擴張性心肌病以及DMD或BMD女性攜帶者之方法。

亦提供製造病毒載體、特別是基於AAV之病毒載體之方法，以及用於產生其之宿主細胞。在具體實施例中，提供產生重組AAV之方法，其包含培養含有人工基因體之宿主細胞，該人工基因體包含側接AAV ITR之順式表現盒，其中順式表現盒包含編碼治療性微小肌縮蛋白之轉基因，該轉基因可操作地連接至表現控制元件，該表現控制元件將控制轉基因在人類細胞中之表現；缺乏AAV ITR之反式表現盒，其中反式表現盒編碼AAV rep及殼體蛋白可操作地連接至表現控制元件，該等表現控制元件驅動AAV rep及殼體蛋白在培養物內於宿主細胞中表現並以反式形式供應rep及cap蛋白；足夠腺病毒輔助功能物以允許AAV殼體蛋白複製及包裝人工基因體；及自細胞培養物中回收殼體包裹人工基因體之重組AAV。

本發明藉助闡述微小肌縮蛋白載體之構築及製備以及展現有效性之活體外及活體內分析的下文實例加以闡釋。實例性實施例 1. 一種核酸組合物，其包含編碼微小肌縮蛋白之核酸序列，其中該微小肌縮蛋白包含自胺基端至羧基端排列為ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT之肌縮蛋白域或由其組成，其中ABD係肌縮蛋白之肌動蛋白結合域，H1係肌縮蛋白之鉸鏈1區，R1係肌縮蛋白之血影蛋白1區，R2係肌縮蛋白之血影蛋白2區，R3係肌縮蛋白之血影蛋白3區，H3係肌縮蛋白之鉸鏈3區，R24係肌縮蛋白之血影蛋白24區，H4係肌縮蛋白之鉸鏈4區，CR係肌縮蛋白之富含半胱胺酸之區或其β-肌縮蛋白聚糖結合部分，且CT係肌縮蛋白之C端區或包含α1-互生蛋白結合位點或異連蛋白結合位點之C端區之一部分。 2. 如實施例1之核酸組合物，其(1) 包含編碼具有SEQ ID NO: 1或91之胺基酸序列的微小肌縮蛋白之核酸序列，或與其至少90%、95%或98%一致之核酸序列或其反向互補體，該核酸序列編碼治療功能性微小肌縮蛋白，或(2) 包含SEQ ID NO: 20或100之核酸序列或與其至少90%、95%或98%一致之核酸序列或其反向互補體，或由其組成，其中該核酸序列編碼治療功能性微小肌縮蛋白。 3. 如實施例1之核酸組合物，其(1) 包含編碼具有SEQ ID NO: 79之胺基酸序列的微小肌縮蛋白之核酸序列，或與其至少90%、95%或98%一致之核酸序列或其反向互補體，該核酸序列編碼治療功能性微小肌縮蛋白，或(2) 包含SEQ ID NO: 81之核酸序列或與其至少90%、95%或98%一致之核酸序列或其反向互補體，或由其組成，其中該核酸序列編碼治療功能性微小肌縮蛋白。 4. 一種核酸組合物，其包含核酸序列，該核酸序列包含與編碼微小肌縮蛋白之核酸序列之5’端偶合的內含子(I)，其中該微小肌縮蛋白包含自胺基端至羧基端排列為ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR之肌縮蛋白域或由其組成，其中ABD係肌縮蛋白之肌動蛋白結合域，H1係肌縮蛋白之鉸鏈1區，R1係肌縮蛋白之血影蛋白1區，R2係肌縮蛋白之血影蛋白2區，R3係肌縮蛋白之血影蛋白3區，H3係肌縮蛋白之鉸鏈3區，R24係肌縮蛋白之血影蛋白24區，H4係肌縮蛋白之鉸鏈4區，CR係肌縮蛋白之富含半胱胺酸之區。 5. 如實施例4之核酸組合物，其(1) 包含編碼具有SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的微小肌縮蛋白之核酸序列，或與其至少90%、95%或98%一致之核酸序列或其反向互補體，或(2) 包含SEQ ID NO: 21之核酸序列或與其至少90%、95%或98%一致之核酸序列或其反向互補體，或由其組成，其中該核酸序列編碼治療功能性肌縮蛋白。 6. 如實施例1至3中任一項之核酸組合物，其進一步包含與編碼該微小肌縮蛋白之該核酸序列之該5’端偶合的內含子(I)。 7. 如實施例4至6中任一項之核酸組合物，其中I係人類免疫球蛋白重鏈可變區(VH) 4內含子(VH4)或SV40內含子或嵌合內含子位於該微小肌縮蛋白編碼序列之5’。 8. 如實施例7之核酸組合物，其中編碼該VH4內含子之該核酸序列包含SEQ ID NO: 41之核酸序列或與其至少90%、95%或98%一致之核酸序列或其反向互補體或由其組成，且相對於缺乏該VH4內含子序列之參考核酸增加微小肌縮蛋白表現；其中編碼嵌合內含子之該核酸序列包含SEQ ID NO: 75之核酸序列或與其至少90%、95%或98%一致之核酸序列或其反向互補體或由其組成，且相對於缺乏該嵌合內含子序列之參考核酸增加微小肌縮蛋白表現；或其中編碼SV40內含子之該核酸序列包含SEQ ID NO: 76之核酸序列或與其至少90%、95%或98%一致之核酸序列或其反向互補體或由其組成，且相對於缺乏該嵌合內含子序列之參考核酸增加微小肌縮蛋白表現。 9. 如實施例1至3或6至8中任一項之核酸組合物，其中編碼CT域之核酸序列包含SEQ ID NO: 35之核酸序列或與其至少90%、95%或98%一致之核酸序列或其反向互補體或由其組成，且相對於缺乏該CT域序列之參考微小肌縮蛋白，增加該微小肌縮蛋白與α1-互生蛋白、β-互生蛋白及/或異連蛋白之結合；其中編碼CT域之核酸序列包含SEQ ID NO: 70之核酸序列或與其至少90%、95%或98%一致之核酸序列或其反向互補體或由其組成，且相對於缺乏該CT域序列之參考微小肌縮蛋白，增加該微小肌縮蛋白與α1-互生蛋白、β-互生蛋白及/或異連蛋白之結合；或其中編碼最小CT域之核酸序列包含SEQ ID NO: 80之核酸序列或與其至少90%、95%或98%一致之核酸序列或其反向互補體或由其組成，且相對於缺乏該CT域序列之參考微小肌縮蛋白，增加該微小肌縮蛋白與α1-互生蛋白之結合。 10. 如實施例9之核酸組合物，其中該CT域具有SEQ ID NO: 16或83之胺基酸序列或包含SEQ ID NO: 84之胺基酸序列。 11. 如前述實施例中任一項之核酸組合物，其中編碼CR域之核酸序列包含SEQ ID NO: 34或69之核酸序列或與其至少90%、95%或98%一致之核酸序列或其反向互補體或由其組成，且相對於缺乏該CR域序列之參考微小肌縮蛋白，增加該微小肌縮蛋白與β-肌縮蛋白聚糖之結合；其中編碼CR域之核酸序列包含SEQ ID NO: 100或109之核酸序列或與其至少90%、95%或98%一致之核酸序列或其反向互補體或由其組成，且相對於缺乏該CR域序列之參考微小肌縮蛋白，增加該微小肌縮蛋白與β-肌縮蛋白聚糖之結合。 12. 如實施例11之核酸組合物，其中該CR域具有SEQ ID NO: 15或90之胺基酸序列。 13. 如前述實施例中任一項之核酸組合物，其中編碼ABD之核酸序列由SEQ ID NO: 22或57或與SEQ ID NO: 22或57具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成；編碼H1之核酸序列由SEQ ID NO: 24或59或與SEQ ID NO: 24或59具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成；編碼R1之核酸序列由SEQ ID NO: 26或61或與SEQ ID NO: 26或61具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成；編碼R2之核酸序列由SEQ ID NO: 27或62或與SEQ ID NO: 27或62具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成；編碼R3之核酸序列由SEQ ID NO: 29或64或與SEQ ID NO: 29或64具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成；編碼H2之核酸序列由SEQ ID NO: 38或與SEQ ID NO: 38具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成；編碼H3之核酸序列由SEQ ID NO: 30或65或與SEQ ID NO: 30或65具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成；編碼R24之核酸序列由SEQ ID NO: 32或67或與SEQ ID NO: 32或67具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成；編碼H4之核酸序列由SEQ ID NO: 33或68或與SEQ ID NO: 33或68具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成；編碼CR之核酸序列由SEQ ID NO: 34、69、100或109或與SEQ ID NO: 34、69、100或109具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成；編碼CT (若存在)之核酸序列由SEQ ID NO: 35、70或80或與SEQ ID NO: 35、70或80具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成；及視情況，該I核酸序列係SEQ ID NO: 41之核酸序列或與SEQ ID NO: 41具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列，其偶合於編碼該微小肌縮蛋白之該核酸序列之5’端。 14. 如前述實施例中任一項之核酸組合物，其中編碼ABD之該核酸序列由SEQ ID NO: 22或57組成；編碼H1之該核酸序列由SEQ ID NO: 24或59組成；編碼R1之該核酸序列由SEQ ID NO: 26或61組成；編碼R2之該核酸序列由SEQ ID NO: 27或62組成；編碼R3之該核酸序列由SEQ ID NO: 29或64組成；編碼H2之該核酸序列由SEQ ID NO: 38組成；編碼H3之該核酸序列由SEQ ID NO: 30或65組成；編碼H4之該核酸序列由SEQ ID NO: 33或68組成；編碼R24之該核酸序列由SEQ ID NO: 32或67組成；編碼CR之該核酸序列由SEQ ID NO: 34、69、100或109組成；I由SEQ ID NO: 41組成；及/或編碼CT之該核酸序列由SEQ ID NO: 35、70或80組成。 15. 如前述實施例中任一項之核酸組合物，其中該微小肌縮蛋白包含自胺基端至羧基端排列為ABD-L1-H1-L2-R1-R2-L3-R3-H3-L4-R24-H4-CR-CT或ABD-L1-H1-L2-R1-R2-L3-R3-H3-L4-R24-H4-CR之肌縮蛋白序列或由其組成，其中L1、L2、L3及L4係連接體。 16. 如前述實施例中任一項之核酸組合物，其中編碼L1之核酸序列包含SEQ ID NO: 23或58或由其組成，編碼L2之核酸序列包含SEQ ID NO: 25或60或由其組成，編碼L3之核酸序列包含SEQ ID NO: 28或63或由其組成，且編碼L4之核酸序列包含SEQ ID NO: 31、36、37、66、71或72或由其組成。 17. 一種核酸組合物，其包含編碼微小肌縮蛋白之核酸序列，其中該微小肌縮蛋白包含自胺基端至羧基端排列為ABD-H1-R1-R2-R16-R17-R24-H4-CR之肌縮蛋白域或由其組成，其中ABD係肌縮蛋白之肌動蛋白結合域，H1係肌縮蛋白之鉸鏈1區，R1係肌縮蛋白之血影蛋白1區，R2係肌縮蛋白之血影蛋白2區，R16係肌縮蛋白之血影蛋白16區，R17係肌縮蛋白之血影蛋白17區，R24係肌縮蛋白之血影蛋白24區，H4係肌縮蛋白之鉸鏈4區，且CR係肌縮蛋白之富含半胱胺酸之區。 18. 如實施例17之核酸組合物，其(1) 包含編碼具有SEQ ID NO: 93之胺基酸序列的微小肌縮蛋白之核酸序列，或與其至少90%、95%或98%一致之核酸序列或其反向互補體，或(2) 包含SEQ ID NO: 103之核酸序列或與其至少90%、95%或98%一致之核酸序列或其反向互補體，或由其組成，其中該核酸序列編碼治療功能性微小肌縮蛋白。 19. 如實施例17或18之核酸組合物，其進一步包含編碼CT域之核苷酸序列，該CT域包含α1-互生蛋白結合位點及/或異連蛋白結合位點在該CR域之C端。 20. 如實施例19中任一項之核酸組合物，其(1) 包含編碼具有SEQ ID NO: 92之胺基酸序列的微小肌縮蛋白之核酸序列，或與其至少90%、95%或98%一致之核酸序列或其反向互補體，或(2) 包含SEQ ID NO: 102之核酸序列或與其至少90%、95%或98%一致之核酸序列或其反向互補體，或由其組成，其中該核酸序列編碼治療功能性微小肌縮蛋白。 21. 如實施例19或20之核酸組合物，其中編碼CT域之核酸序列包含SEQ ID NO: 35之核酸序列或與其至少90%、95%或98%一致之核酸序列或其反向互補體或由其組成，且相對於缺乏該CT域序列之參考微小肌縮蛋白，增加該微小肌縮蛋白與α1-互生蛋白、β-互生蛋白及/或異連蛋白之結合；其中編碼CT域之核酸序列包含SEQ ID NO: 70之核酸序列或與其至少90%、95%或98%一致之核酸序列或其反向互補體或由其組成，且相對於缺乏該CT域序列之參考微小肌縮蛋白，增加該微小肌縮蛋白與α1-互生蛋白、β-互生蛋白及/或異連蛋白之結合；或其中編碼最小CT域之核酸序列包含SEQ ID NO: 80之核酸序列或與其至少90%、95%或98%一致之核酸序列或其反向互補體或由其組成，且相對於缺乏該CT域序列之參考微小肌縮蛋白，增加該微小肌縮蛋白與α1-互生蛋白之結合。 22. 如實施例17至21中任一項之核酸組合物，其中編碼ABD之核酸序列由SEQ ID NO: 22或57或與SEQ ID NO: 22或57具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成；編碼H1之核酸序列由SEQ ID NO: 24或59或與SEQ ID NO: 24或59具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成；編碼R1之核酸序列由SEQ ID NO: 26或61或與SEQ ID NO: 26或61具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成；編碼R2之核酸序列由SEQ ID NO: 27或62或與SEQ ID NO: 27或62具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成；編碼R16之核酸序列由SEQ ID NO: 94或98或與SEQ ID NO: 94或98具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成；編碼R17之核酸序列由SEQ ID NO: 95或99或與SEQ ID NO: 95或99具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成；編碼R24之核酸序列由SEQ ID NO: 32或67或與SEQ ID NO: 32或67具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成；編碼H4之核酸序列由SEQ ID NO: 33或68或與SEQ ID NO: 33或68具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成；編碼CR之核酸序列由SEQ ID NO: 34、69、100或109或與SEQ ID NO: 34或69具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成；編碼CT之核酸序列由SEQ ID NO: 35、70或80或與SEQ ID NO: 35、70或80具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成，其編碼具有功能活性之微小肌縮蛋白。 23. 如實施例17至22中任一項之核酸組合物，其中編碼ABD之該核酸序列由SEQ ID NO: 22或57組成；編碼H1之該核酸序列由SEQ ID NO: 24或59組成；編碼R1之該核酸序列由SEQ ID NO: 26或61組成；編碼R2之該核酸序列由SEQ ID NO: 27或62組成；編碼R16之該核酸序列由SEQ ID NO: 94或98組成；編碼R17之該核酸序列由SEQ ID NO: 95或99組成；編碼H4之該核酸序列由SEQ ID NO: 33或68組成；編碼R24之核酸序列由SEQ ID NO: 32或67組成；編碼CR之該核酸序列由SEQ ID NO: 34、69、100或109組成；且若存在，編碼CT之該核酸序列由SEQ ID NO: 35、70或80組成。 24. 如實施例17至23中任一項之核酸組合物，其進一步包含與編碼該微小肌縮蛋白之該核酸序列之該5’端偶合的內含子(I)。 25. 如實施例24之核酸組合物，其中I係人類免疫球蛋白重鏈可變區(VH) 4內含子(VH4)或SV40內含子或嵌合內含子位於該微小肌縮蛋白編碼序列之5’。 26. 如實施例25之核酸組合物，其中編碼該VH4內含子之該核酸序列包含SEQ ID NO: 41之核酸序列或與其至少90%、95%或98%一致之核酸序列或其反向互補體或由其組成，且相對於缺乏該VH4內含子序列之參考核酸增加微小肌縮蛋白表現；其中編碼嵌合內含子之該核酸序列包含SEQ ID NO: 75之核酸序列或與其至少90%、95%或98%一致之核酸序列或其反向互補體或由其組成，且相對於缺乏該嵌合內含子序列之參考核酸增加微小肌縮蛋白表現；或其中編碼SV40內含子之該核酸序列包含SEQ ID NO: 76之核酸序列或與其至少90%、95%或98%一致之核酸序列或其反向互補體或由其組成，且相對於缺乏該嵌合內含子序列之參考核酸增加微小肌縮蛋白表現。 27. 如實施例17至26中任一項之核酸組合物，其中該微小肌縮蛋白包含自胺基端至羧基端排列為ABD-L1-H1-L2-R1-R2-L3-R16-L4.1-R17-L4.2-R24-H4-CR-CT或ABD-L1-H1-L2-R1-R2-L3-R16-L4.1-R17-L4.2-R24-H4-CR之肌縮蛋白序列或由其組成，其中L1、L2、L3、L4.1及L4.2係連接體。 28. 如實施例27之核酸組合物，其中編碼L1核酸序列之包含SEQ ID NO: 23或58或由其組成；編碼L2之核酸序列包含SEQ ID NO: 25或60或由其組成；編碼L3之核酸序列包含SEQ ID NO: 28或63或由其組成；編碼L4.1之核酸序列包含SEQ ID NO: 107或125或由其組成；且編碼L4.2之核酸序列包含SEQ ID NO: 108或126或由其組成。 29. 如前述實施例中任一項之核酸組合物，其中該核酸係包含轉錄調節元件之核酸載體，該轉錄調節元件促進在肌肉及/或CNS組織中之表現且可操作連接至編碼該微小肌縮蛋白之該核酸序列。 30. 如實施例29之核酸組合物，其中該轉錄調節元件包含肌肉特異性啟動子，視情況骨骼肌、平滑肌、及/或心肌特異性啟動子。 31. 如實施例29或30之核酸組合物，其中該啟動子係SPc5-12或其轉錄活性部分。 32. 如實施例31之核酸組合物，其中該啟動子由SEQ ID NO: 39或40之核酸序列組成。 33. 如實施例29之核酸組合物，其中該轉錄調節元件包含CNS特異性啟動子。 34. 如實施例29之核酸組合物，其中該啟動子係CB7啟動子、巨細胞病毒(CMV)啟動子、勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)啟動子、MMT啟動子、EF-1 α啟動子(SEQ ID NO: 118)、UB6啟動子、雞β-肌動蛋白啟動子、CAG啟動子(SEQ ID NO: 116)、RPE65啟動子、視蛋白啟動子、TBG (甲狀腺素結合球蛋白)啟動子、APOA2啟動子、SERPINA1 (hAAT)啟動子、MIR122啟動子或可誘導型啟動子，例如低氧可誘導型或雷帕黴素(rapamycin)可誘導型啟動子。 35. 如實施例29或30之核酸組合物，其中該肌肉特異性轉錄調節元件係以下中之一者：CK1啟動子、CK4啟動子、CK5啟動子、CK6啟動子、CK7啟動子、CK8啟動子(SEQ ID NO: 115)、MCK啟動子(或其截短形式) (SEQ ID NO: 121)、結蛋白啟動子(SEQ ID NO: 119)、MHCK7啟動子(SEQ ID NO: 120)、enh358MCK啟動子、dMCK啟動子或tMCK啟動子。 36. 如前述實施例中任一項之核酸組合物，其中該核苷酸序列包含編碼該微小肌縮蛋白之核苷酸序列之3’多腺苷酸化信號。 37. 如實施例36之核酸組合物，其中該多腺苷酸化信號具有SEQ ID NO: 42之核苷酸序列。 38. 如前述實施例中任一項之核酸組合物，其中該核酸包含AAV載體核苷酸序列，其自5’至3’包含：(i) AAV ITR - 轉錄調節元件-編碼自N端至C端排列為ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT之該等微小肌縮蛋白域之核酸序列- 多腺苷酸化序列 - AAV ITR；(ii) AAV ITR-轉錄調節元件 - 編碼自N端至C端排列為ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR之該等微小肌縮蛋白域之核酸序列 - 多腺苷酸化序列 - AAV ITR；(iii) AAV ITR - 轉錄調節元件-編碼自N端至C端排列為ABD-H1-R1-R2-R16-R17-R24-H4-CR-CT之該等微小肌縮蛋白域之核酸序列- 多腺苷酸化序列 - AAV ITR；或(iv) AAV ITR-轉錄調節元件-編碼自N端至C端排列為ABD-H1-R1-R2-R16-R17-R24-H4-CR之該等微小肌縮蛋白域之核酸序列 - 多腺苷酸化序列 - AAV ITR，其中該AAV ITR視情況係AAV2 ITR。 39. 如前述實施例中任一項之核酸組合物，其中該核苷酸序列經密碼子最佳化及/或缺失CpG序列。 40. 如前述實施例中任一項之核酸組合物，其具有少於2個或1個CpG島，或無CpG島。 41. 如實施例40之核酸組合物，當投與人類個體時，與具有多於0個CpG島之微小肌縮蛋白構築體相比，其展現降低之免疫原性，如藉由抗藥物抗體效價所量測。 42. 如前述實施例中任一項之核酸組合物，其包含SEQ ID NO: 53、54、55、56、82、104、105或106之核酸序列。 43. 如前述實施例中任一項之核酸組合物，其包含AAV載體核苷酸序列，該AAV載體核苷酸序列在該核酸序列之5’及3’端包含AAV ITR，其中該AAV ITR視情況係AAV2 ITR。 44. 如實施例43之核酸組合物，其中該5’ ITR包含SEQ ID NO: 73之核苷酸序列或由其組成，且該3’ ITR包含SEQ ID NO: 74之核苷酸序列或由其組成。 45. 一種包含表現盒之rAAV粒子，該表現盒包含如前述實施例中任一項之核酸組合物。 46. 如實施例45之rAAV粒子，其具有來自至少一個選自以下之AAV型之殼體蛋白：AAV 1型(AAV1)、2型(AAV2)、3型(AAV3)、4型(AAV4)、5型(AAV5)、6型(AAV6)、7型(AAV7)、8型(AAV8)、rh8型(AAVrh8)、9型(AAV9)、PHP.B型(AAVPHP.B)、hu37型(AAV.hu37)、hu31型(AAV.hu31)、hu32型(AAV.hu32)、rh10型(AAVrh10)、rh20型(AAVrh20)、rh39型(AAVrh39)及rh74型(AAVrh74)。 47. 如實施例45或46之rAAV粒子，其中該殼體蛋白具有與SEQ ID NO: 77 (AAV8殼體)至少95%一致之胺基酸序列或具有SEQ ID NO: 77之胺基酸序列。 48. 如實施例45或46之rAAV粒子，其中該殼體蛋白具有與SEQ ID NO 78 (AAV9殼體)至少95%一致之胺基酸序列或具有SEQ ID NO: 78之胺基酸序列。 49. 一種醫藥組合物，其包含治療有效量之如實施例45至48中任一項之rAAV粒子及醫藥上可接受之載劑。 50. 一種遞送轉基因至細胞之方法，該方法包含使該細胞與如實施例45至49中任一項之rAAV粒子接觸，其中該細胞與該載體接觸。 51. 一種用於治療有需要之人類個體之肌縮蛋白病之醫藥組合物，其包含治療有效量之如實施例45至49中任一項之rAAV粒子，視情況其中該rAAV粒子經調配用於投與至該個體之循環、肌肉組織或CNS。 52. 一種治療有需要之人類個體之肌縮蛋白病的方法，其包含：向該個體投與包含治療有效量之如實施例45至49中任一項之rAAV粒子的醫藥組合物，使得在該個體之肌肉中形成貯庫，其釋放微小肌縮蛋白。 53. 一種預防肌縮蛋白病傳播至有需要之人類個體之後代的方法，其包含：向該個體投與包含治療有效量之如實施例45至49中任一項之rAAV粒子的醫藥組合物，使得向該個體之種系中併入編碼微小肌縮蛋白之核酸。 54. 如實施例51至53之醫藥組合物或方法，其中該肌縮蛋白病係DMD、BMD、X性聯擴張性心肌病，或該個體係DMD或BMD之女性攜帶者。 55. 如實施例51至54之醫藥組合物或方法，其中該組合物與至少一種有效治療該肌縮蛋白病之第二藥劑一起投與。 56. 如實施例55之醫藥組合物或方法，其中該第二藥劑選自由以下組成之群：引起DMD 基因之外顯子跳躍之反義寡核苷酸、肌肉生長抑制素抗體、促進核糖體無義突變通讀之藥劑、抑制過早終止密碼子之藥劑、合成代謝類固醇及皮質類固醇。 57. 如實施例51至56中任一項之醫藥組合物或方法，其中該投與改良患者之握力、增加最大及特定肌力及/或降低器官及肌肉重量。 58. 如實施例51至57中任一項之醫藥組合物或方法，其中該rAAV粒子之投與改良或維持心臟功能或減緩心臟功能之下降。 59. 如實施例51至58任一項之醫藥組合物或方法，其中該rAAV粒子之投與增加肌肉質量或力量或維持肌肉質量或力量或降低肌肉質量或力量損失之可能性。 60. 一種微小肌縮蛋白，其包含自胺基端至羧基端排列為ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT之肌縮蛋白域或由其組成，其中ABD係肌縮蛋白之肌動蛋白結合域，H1係肌縮蛋白之鉸鏈1區，R1係肌縮蛋白之血影蛋白1區，R2係肌縮蛋白之血影蛋白2區，R3係肌縮蛋白之血影蛋白3區，H3係肌縮蛋白之鉸鏈3區，R24係肌縮蛋白之血影蛋白24區，CR係肌縮蛋白之富含半胱胺酸之區，且CT係包含α1-互生蛋白結合位點、β-互生蛋白結合位點及/或異連蛋白結合位點之肌縮蛋白之C端區的至少一部分。 61. 如實施例60之微小肌縮蛋白，其包含SEQ ID NO: 1、79或91之胺基酸序列或由其組成。 62. 如實施例60或61之微小肌縮蛋白，其中CT域係包含α1-互生蛋白結合位點之經截短之CT域。 63. 如實施例60至62中任一項之微小肌縮蛋白，其中該CT域包含SEQ ID NO: 16或83之胺基酸序列或由其組成，或包含SEQ ID NO: 84之胺基酸序列。 64. 如實施例60至63中任一項之微小肌縮蛋白，其中CR域包含β-肌縮蛋白聚糖結合位點。 65. 如實施例60至64中任一項之微小肌縮蛋白，其中該CR域包含SEQ ID NO: 15或90之胺基酸序列或由其組成。 66. 如實施例60至66中任一項之微小肌縮蛋白，其中ABD由SEQ ID NO: 3或與SEQ ID NO: 3具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性之胺基酸序列組成；H1由SEQ ID NO: 5或與SEQ ID NO: 5具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列組成；R1由SEQ ID NO: 7或與SEQ ID NO: 7具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列組成；R2由SEQ ID NO: 8或與SEQ ID NO: 8具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列組成；H3由SEQ ID NO: 11或與SEQ ID NO: 11具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列組成；R24由SEQ ID NO: 13或與SEQ ID NO: 13具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列組成；H4由SEQ ID NO: 14或與SEQ ID NO: 14具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列組成；CR由SEQ ID NO: 15或90或與SEQ ID NO: 15或90具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列組成；且CT由SEQ ID NO: 16或83或與SEQ ID NO: 16或83具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列組成。 67. 如實施例60至66中任一項之微小肌縮蛋白，其中ABD由SEQ ID NO: 3組成，H1由SEQ ID NO: 5組成；R1由SEQ ID NO: 7組成；R2由SEQ ID NO: 8組成；R3由SEQ ID NO: 10組成；H3由SEQ ID NO: 11組成；R24由SEQ ID NO: 13組成；H4由SEQ ID NO: 14組成；CR由SEQ ID NO: 15或90組成；或CT由SEQ ID NO: 16或83組成。 68. 如實施例60至67中任一項之微小肌縮蛋白，其包含自胺基端至羧基端排列為ABD-L1-H1-L2-R1-R2-L3-R3-H3-L4-R24-H4-CR-CT之肌縮蛋白域，其中L1、L2、L3及L4係連接體。 69. 如實施例68之微小肌縮蛋白，其中L1、L2、L3及L4之胺基酸序列分別由SEQ ID NO: 4、6、9及12組成。 70. 一種微小肌縮蛋白，其包含自胺基端至羧基端排列為ABD-H1-R1-R2-R16-R17-R24-H4-CR之肌縮蛋白域或由其組成，其中ABD係肌縮蛋白之肌動蛋白結合域，H1係肌縮蛋白之鉸鏈1區，R1係肌縮蛋白之血影蛋白1區，R2係肌縮蛋白之血影蛋白2區，R16係肌縮蛋白之血影蛋白16區，R17係肌縮蛋白之血影蛋白17區，R24係肌縮蛋白之血影蛋白24區，且CR係肌縮蛋白之富含半胱胺酸之區。 71. 如實施例70之微小肌縮蛋白，其包含SEQ ID NO: 93之胺基酸序列或由其組成。 72. 如實施例70之微小肌縮蛋白，其包含自胺基端至羧基端排列為ABD-H1-R1-R2-R16-R17-R24-H4-CR-CT之肌縮蛋白域或由其組成，其中CT係包含α1-互生蛋白結合位點或異連蛋白結合位點之肌縮蛋白之C端區之至少一部分。 73. 如實施例72之微小肌縮蛋白，其中CT域包含SEQ ID NO: 16或83之胺基酸序列或由其組成，或包含SEQ ID NO: 84之胺基酸序列。 74. 如實施例72或73之微小肌縮蛋白，其包含SEQ ID NO: 92之胺基酸序列或由其組成。 75. 如實施例70至74中任一項之微小肌縮蛋白，其中H4域包含β-肌縮蛋白聚糖結合位點。 76. 如實施例70至75中任一項之微小肌縮蛋白，其中ABD由SEQ ID NO: 3或與SEQ ID NO: 3具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列組成；H1由SEQ ID NO: 5或與SEQ ID NO: 5具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列組成；R1由SEQ ID NO: 7或與SEQ ID NO: 7具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列組成；R2由SEQ ID NO: 8或與SEQ ID NO: 8具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列組成；R16由SEQ ID NO: 86或與SEQ ID NO: 86具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列組成；R17由SEQ ID NO: 87或與SEQ ID NO: 87具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列組成；R24由SEQ ID NO: 13或與SEQ ID NO: 13具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列組成；H4由SEQ ID NO: 14或與SEQ ID NO: 14具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列組成；且CR由SEQ ID NO: 15或90或與SEQ ID NO: 15或90具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列組成。 77. 如實施例70至76中任一項之微小肌縮蛋白，其包含在CR域之C端之CT域或由其組成，其中該CT由SEQ ID NO: 16或83或與SEQ ID NO: 16或83具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列組成。 78. 如實施例70至77中任一項之微小肌縮蛋白，其中ABD由SEQ ID NO: 3組成，H1由SEQ ID NO: 5組成；R1由SEQ ID NO: 7組成；R2由SEQ ID NO: 8組成；R16由SEQ ID NO: 86組成；R17由SEQ ID NO: 87組成；R24由SEQ ID NO: 13組成；H4由SEQ ID NO: 14組成；且CR由SEQ ID NO: 15或90組成；及/或CT由SEQ ID NO: 16或83組成。 79. 如實施例70至78中任一項之微小肌縮蛋白，其中該CT由SEQ ID NO: 16或83組成。 80. 如實施例70至80中任一項之微小肌縮蛋白，其包含自胺基端至羧基端排列為ABD-L1-H1-L2-R1-R2-L3-R16-L4.1-R17-L4.2-R24-H4-CR-CT或ABD-L1-H1-L2-R1-R2-L3-R16-L4.1-R17-L4.2-R24-H4-CR之肌縮蛋白域，其中L1、L2、L3、L4.1及L4.2係連接體。 81. 如實施例80之微小肌縮蛋白，其中L1、L2、L3、L4.1及L4.2之胺基酸序列分別由SEQ ID NO: 4、6、9、110及89組成。 82. 一種治療有需要之人類個體之肌縮蛋白病的方法，其包含向該人類個體之循環、肌肉組織及/或腦脊髓液遞送治療有效量之如實施例60至81中任一項之微小肌縮蛋白。 83. 一種用於治療人類個體之肌縮蛋白病之醫藥組合物，其包含治療有效量之如實施例60至81中任一項之微小肌縮蛋白，其經調配用於遞送至該人類個體之循環、肌肉組織及/或腦脊髓液。 84. 如實施例82或83之方法或醫藥組合物，其中該肌縮蛋白病係DMD、BMD或X性聯擴張性心肌病。 85. 如實施例82至84中任一項之方法或醫藥組合物，其中CT域包含α1-互生蛋白結合位點、β-互生蛋白結合位點及/或異連蛋白結合位點。 86. 如實施例85之方法或醫藥組合物，其中該CT域係包含α1-互生蛋白結合位點之經截短之CT域。 87. 如實施例82至86中任一項之方法或醫藥組合物，其中H4包含β-肌縮蛋白聚糖結合位點。 88. 一種產生重組AAV之方法，其包含： (a) 培養含有以下之宿主細胞： (i) 包含順式表現盒之人工基因體，其中該順式表現盒包含如實施例38至44中任一項之核酸組合物； (ii) 缺乏AAV ITR之反式表現盒，其中該反式表現盒編碼AAV rep及殼體蛋白可操作地連接至表現控制元件，該等表現控制元件驅動AAV rep及殼體蛋白在培養物內於宿主細胞中表現並以反式形式供應rep及cap蛋白； (iii) 足夠腺病毒輔助功能物以允許AAV殼體蛋白複製及包裝人工基因體；及 (b) 自該細胞培養物中回收殼體包裹人工基因體之重組AAV。 89. 一種宿主細胞，其包含： a. 包含順式表現盒之人工基因體，其中該順式表現盒包含如實施例38至44中任一項之核酸組合物； b. 缺乏AAV ITR之反式表現盒，其中該反式表現盒編碼AAV rep及殼體蛋白可操作地連接至表現控制元件，該等表現控制元件驅動AAV rep及殼體蛋白在培養物內於宿主細胞中表現並以反式形式供應rep及cap蛋白；及 c. 足夠腺病毒輔助功能物以允許該等AAV殼體蛋白複製及包裝該人工基因體。

提供微小肌縮蛋白(例如，如圖 1A 及圖 22 中所示)及編碼其之核酸組合物及rAAV載體、以及與其相關之醫藥組合物及治療方法。 5.1. 定義

術語「AAV」或「腺相關病毒」係指病毒之細小病毒科內之依賴病毒屬(Dependoparvovirus)。AAV可為衍生自天然「野生型」病毒之AAV、衍生自包裝至包含由天然cap基因編碼之殼體蛋白之殼體中之rAAV基因體及/或衍生自包裝至包含由非天然殼體cap基因編碼之殼體蛋白之殼體中之rAAV基因體的AAV。後者之實例包括具有殼體蛋白之rAAV，該殼體蛋白具有經修飾之序列及/或插入至天然殼體之胺基酸序列中之肽。

術語「rAAV」係指「重組AAV」。在一些實施例中，重組AAV具有其中rep及cap基因之部分或全部已經異源序列置換之AAV基因體。

術語「rep-cap輔助質體」係指提供病毒rep及cap基因功能並幫助自缺乏功能性rep及/或cap基因序列之rAAV基因體產生AAV之質體。

術語「cap基因」係指編碼殼體蛋白之核酸序列，該等殼體蛋白形成或幫助形成病毒之殼體外殼。對於AAV，殼體蛋白可為VP1、VP2或VP3。

術語「rep基因」係指編碼病毒複製及產生所需之非結構蛋白之核酸序列。

術語「核酸」及「核苷酸序列」包括DNA分子(例如cDNA或基因體DNA)、RNA分子(例如mRNA)、DNA及RNA分子或雜合DNA/RNA分子之組合、及DNA或RNA分子之類似物。該等類似物可使用(例如)核苷酸類似物產生，該等核苷酸類似物包括(但不限於)肌苷或三苯甲基化鹼基。該等類似物亦可包含DNA或RNA分子，該等DNA或RNA分子包含賦予分子有益屬性(例如核酸酶抗性或增加之跨細胞膜能力)之經修飾主鏈。核酸或核苷酸序列可為單鏈、雙鏈，可含有單鏈及雙鏈部分，且可含有三鏈部分，但較佳係雙鏈DNA。

如本文揭示之胺基酸殘基可藉由保守取代進行修飾，以維持或實質上維持總體多肽結構及/或功能。如本文所用之「保守胺基酸取代」指示：疏水性胺基酸(即，Ala、Cys、Gly、Pro、Met、Val、Ile及Leu)可經其他疏水性胺基酸取代；具有巨大側鏈之疏水性胺基酸(即，Phe、Tyr及Trp)可經具有巨大側鏈之其他疏水性胺基酸取代；具有帶正電荷側鏈之胺基酸(即，Arg、His及Lys)可經具有帶正電荷側鏈之其他胺基酸取代；具有帶負電荷側鏈之胺基酸(即，Asp及Glu)可經具有帶負電荷側鏈之其他胺基酸取代；且具有極性不帶電荷側鏈之胺基酸(即，Ser、Thr、Asn及Gln)可經具有極性不帶電荷側鏈之其他胺基酸取代。

術語「個體」、「宿主」及「患者」可互換使用。個體較佳係哺乳動物，例如非靈長類動物(例如牛、豬、馬、貓、狗、大鼠等)或靈長類動物(例如猴及人類)、最佳為人類。

術語「治療性功能微小肌縮蛋白」意指微小肌縮蛋白在本文章節5.4中所述之一或多種治療效用之分析中或在本文章節5.5中所述之治療方法之評價中展現治療效能。

術語「治療劑」係指可用於治療、管控或改善與疾病或病症相關之症狀之任何藥劑，其中疾病或病症與轉基因提供之功能相關。「治療有效量」係指當向患有目標疾病或病症之個體投與時，在目標疾病或病症之治療或管控中提供至少一種治療益處之藥劑之量(例如，由轉基因表現之產物之量)。此外，關於本發明之藥劑之治療有效量意指藥劑單獨或當與其他療法組合時在疾病或病症之治療或管控中提供至少一種治療益處之量。

術語「預防劑」係指可用於預防疾病或病症、降低疾病或病症之可能性、延遲或減緩疾病或病症之進展之任何藥劑，其中疾病或病症與轉基因提供之功能相關。「預防有效量」係指當向易患目標疾病或病症之個體投與時，在目標疾病或病症之預防或延遲中提供至少一種預防益處之預防劑之量(例如，轉基因表現之產物之量)。預防有效量亦可指藥劑足以預防目標疾病或病症、降低目標疾病或病症之可能性或延遲目標疾病或病症之發生、或減緩目標疾病或病症之進展之量；足以延遲或最小化目標疾病或病症之發作之量；或足以預防或延遲其復發或擴散之量。預防有效量亦可指足以預防或延遲目標疾病或病症之症狀惡化之藥劑的量。此外，關於本發明之預防劑之預防有效量意指預防劑單獨或當與其他藥劑組合時，在疾病或病症之預防或延遲中提供至少一種預防益處之量。

本發明之預防劑可投與「易患」目標疾病或病症之個體。「易患」疾病或病症之個體係顯示與疾病或病症之發展相關之症狀之個體，或具有遺傳構成、環境暴露或此類疾病或病症之其他風險因素之個體，但其中症狀尚未處於診斷為疾病或病症之程度。舉例而言，具有與缺失基因(由轉基因提供)相關之疾病家族史之患者可有資格成為易患其者。此外，具有在去除原發腫瘤後持續存在之休眠腫瘤之患者可有資格成為易於腫瘤復發者。

術語「CpG島」意指基因體中以高頻率含有二核苷酸CpG (例如C (胞嘧啶)鹼基、緊接著係G (鳥嘌呤)鹼基之彼等獨特區，因此CpG島之G+C含量顯著高於非島DNA之G+C含量。CpG島可藉由CpG二核苷酸之核苷酸長度、核苷酸組成及頻率之分析來鑑別。任何特定核苷酸序列或基因體中之CpG島含量可使用以下準則來量測：島之大小大於100，GC百分比大於50.0%，且CG二核苷酸之觀察數目對基於區段中Gs及Cs之數目之預期數目之比率大於0.6 (Obs/Exp大於0.6)。 Obs/Exp CpG = CpG之數目 * N / (C之數目 * G之數目)

其中N =序列之長度。

各種軟體工具可用於該等計算，例如world-wide-web.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi、world-wide-web.cpgislands.usc.edu/、world-wide-web.ebi.ac.uk/Tools/emboss/cpgplot/index.html及world-wide-web.bioinformatics.org/sms2/cpg_islands.html. (亦參見Gardiner-Garden及Frommer, J Mol Biol. 1987年7月20日；196(2):261-82；Li LC及Dahiya R. MethPrimer: designing primers for methylation PCRs. Bioinformatics. 2002年11月；18(11):1427-31)。在一個實施例中，用以鑑別CpG島之算法參見www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi。 5.2. 微小肌縮蛋白轉基因 5.2.1 微小肌縮蛋白

本文所述之實施例包含微小肌縮蛋白，其自胺基端至羧基端具有：ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR (例如SEQ ID NO: 2)或ABD1-H1-R1-R2-R16-R17-R24-H4-CR (SEQ ID NO: 93)，其中ABD係肌縮蛋白之肌動蛋白結合域，H1係肌縮蛋白之鉸鏈1區，R1係肌縮蛋白之血影蛋白1區，R2係肌縮蛋白之血影蛋白2區，R3係肌縮蛋白之血影蛋白3區，H3係肌縮蛋白之鉸鏈3區，R16係肌縮蛋白之血影蛋白16區，R17係肌縮蛋白之血影蛋白17區，R24係肌縮蛋白之血影蛋白24區，H4係肌縮蛋白之鉸鏈4區，CR係肌縮蛋白之富含半胱胺酸之區。

如上文所解釋，根據本揭示內容之微小肌縮蛋白包含ABD-H1-R1-R2-R3-R24-H4或ABD-H1-R1-R2-R16-R17-R24-H4。NH₂ 端及肌縮蛋白之棒狀域中之區直接結合但不交聯細胞骨架肌動蛋白。野生型肌縮蛋白之棒狀域由24個類似於血影蛋白之三螺旋重複的重複單元組成。此重複單元佔肌縮蛋白之大部分，且被認為賦予分子類似於β-血影蛋白之撓性棒狀結構。該等α-螺旋捲曲螺旋重複間雜有四個富含脯胺酸之鉸鏈區。在第24個重複之末端係第四鉸鏈區，緊接著係WW域[Blake, D.等人, Function and Genetics of Dystrophin and Dystrophin-Related Proteins in Muscle. Physiol. Rev. 82: 291-329, 2002]。本文揭示之微小肌縮蛋白不包括R4至R23，或另一選擇為不包括R3 (或，在一些實施例中，R4)至R15及R18至R23 (亦即，使得微小肌縮蛋白包括R16及R17，但在某些實施例中，可不包括R3)，且僅包括4個鉸鏈區或其部分中之2個或3個。實施例可含有肌縮蛋白血影蛋白樣重複16及17，其被理解為將nNOS錨定於肌纖維膜。在一些實施例中，沒有新的胺基酸殘基或連接體併入微小肌縮蛋白中。

在一些實施例中，微小肌縮蛋白包含H3 (例如，SEQ ID NO: 1、2或79)。在實施例中，H3可為自N端至C端之完全內源性H3域，例如SEQ ID NO: 11。換言之，一些微小肌縮蛋白實施例不含H3域之片段，但含有整個H3域。在一些實施例中，R3域之C端胺基酸直接偶合(或共價鍵結)至H3域之N端胺基酸。在一些實施例中，與H3域之N端胺基酸偶合之R3域之C端胺基酸係Q。在一些實施例中，與R3域偶合之H3域之5'胺基酸係Q。

在其他實施例中，微小肌縮蛋白包含H2而非H3。H2可為完全內源性H2域(SEQ ID NO: 19)。該等微小肌縮蛋白實施例自胺基端至羧基端具有：ABD-H1-R1-R2-R3-H2-R24-H4-CR。在一些實施例中，與鉸鏈域之N端胺基酸偶合之R3域之C端胺基酸為Q。在其他實施例中，與R3域偶合之H2域之N端胺基酸為P。在某些實施例中，R3域之C端胺基酸直接與鉸鏈域之N端胺基酸偶合，其中鉸鏈域之N端胺基酸為P或Q。在其他實施例中，R3域之C端胺基酸直接與H2域之N端胺基酸偶合，其中H2域之N端胺基酸為P。

不受任何一種理論之約束，為了對衍生之微小肌縮蛋白傳遞完全活性，在任何微小肌縮蛋白構築體中完全鉸鏈域可為適當的。將肌縮蛋白之鉸鏈區段識別為在性質上富含脯胺酸，且因此可賦予蛋白質產品撓性(Koenig及Kunkel, 265(6):4560-4566, 1990)。鉸鏈之一部分之任何缺失、尤其一或多個脯胺酸殘基之去除可降低其撓性，且因此藉由阻礙其與DAP複合物中其他蛋白質之相互作用而降低其效能。

本文揭示之微小肌縮蛋白包含野生型肌縮蛋白H4序列(其含有WW域)至並包括CR域(其含有ZZ域，在SEQ ID NO: 15中以單下劃線表示(UniProtKB-P11532 aa 3307-3354))。WW域係在若干信號傳導及調節分子中發現之蛋白質結合模組。WW域以與src同源性-3 (SH3)域類似之方式結合至富含脯胺酸之受質。此區介導β-肌縮蛋白聚糖與肌縮蛋白之間之相互作用，此乃因β-肌縮蛋白聚糖之細胞質域富含脯胺酸。WW域在鉸鏈4 (H4區)中。CR域含有兩個EF-手基序，其與α-輔肌動蛋白中之彼等類似，且可結合細胞內Ca²⁺ 。ZZ域含有許多保守半胱胺酸殘基，預計其形成二價金屬陽離子(例如Zn²⁺ )之配位點。ZZ域與許多類型鋅指結構類似，且在核內及胞質蛋白質中皆有發現。肌縮蛋白之ZZ域以Ca²⁺ 依賴方式結合至攜鈣蛋白。因此，ZZ域可表示功能性攜鈣蛋白結合位點，且可暗示攜鈣蛋白與其他肌縮蛋白相關蛋白結合。

某些實施例包含CR域之經截短部分，其包含ZZ域。舉例而言，微小肌縮蛋白自胺基端至羧基端包含：ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR(短)-CT (例如SEQ ID NO: 91，參見圖22中之RGX-DYS6)。在某些實施例中，CR域例如具有SEQ ID NO: 90之胺基酸序列。

為了克服AAV載體之典型包裝限制，許多為臨床應用而開發之微小肌縮蛋白基因缺乏CT域。一些研究者已指示，DAPC甚至不需要C端域來裝配，或C端係非必需的[Crawford等人，J Cell Biol, 2000, 150(6):1399-1409；及Ramos, J.N等人Molecular Therapy 2019, 27(3):1-13]。肌縮蛋白之CT域仍然可對心肌病提供有益效應。已顯示心肌中肌縮蛋白之CT域與β-肌縮蛋白聚糖之間之特殊相互作用，其中在質膜界面存在直接之分子相互作用，指示CT域在心肌細胞膜中錨定DAP複合物之直接作用[Stevenson, S.等人, Spatial relationship of the C-terminal domains of dystrophin and beta-dystroglycan in cardiac muscle support a direct molecular interaction at the plasma membrane interface. Circ Res, 1998. 82(1): 第82-93頁]。274個杜興氏及貝氏肌肉營養不良症患者之研究中肌縮蛋白基因型-心臟表型之校正揭示N端肌動蛋白結合結合域(ABD1)之存在，且CR域加上CT域具有降低之心肌病風險，從而進一步指出肌縮蛋白之CT域之有益心臟保護效應[Tandon, A.等人, Dystrophin genotype-cardiac phenotype correlations in Duchenne and Becker muscular dystrophies using cardiac magnetic resonance imaging. Am J Cardiol, 2015. 115(7): 第967-71頁]。另外，mdx 小鼠之骨骼肌中含有CT域之捲曲螺旋基序之螺旋1的微小肌縮蛋白基因之過表現增加招募α1-互生蛋及α-異連蛋白，其係DAP複合物之成員，用作招募至肌纖維膜之信號傳導蛋白之模塊銜接子[Koo, T.等人, Delivery of AAV2/9-microdystrophin genes incorporating helix 1 of the coiled-coil motif in the C-terminal domain of dystrophin improves muscle pathology and restores the level of α1-syntrophin and α-dystrobrevin in skeletal muscles of mdx mice. Hum Gene Ther, 2011. 22(11): 第1379-88頁]。與較短形式之微小肌縮蛋白相比，較長形式之微小肌縮蛋白之過表現亦改良mdx 小鼠中對延長收縮誘導之肌肉損傷之肌肉抗性[Koo, T.等人2011，同上]。

已顯示DMD患者中持續存在顯著降低之心臟功能。恢復神經元一氧化氮合酶(nNOS)功能之治療被認為藉由改良心臟功能係有益的，因此導致收縮BP、縮短分數及射血分數之顯著改良，且繼而減少心臟纖維化。心臟纖維化之進展指示為患者首先展現左心室(LV)擴張及肥大，其進展至稱為擴張性心肌病(DCM)之階段。

肌縮蛋白之CT域含有兩個多肽延伸序列，預測其形成與視棒狀域中之彼等類似之α-螺旋捲曲螺旋(參見下表1中SEQ ID 16中由單下劃線所指示之H1及由雙下劃線所指示之H2)。每一捲曲螺旋具有保守之重複七肽(a,b,c,d,e,f,g)_n ，其類似於白胺酸拉鍊中發現之彼等，其中白胺酸在「d」位置佔優勢。此域命名為CC (捲曲螺旋)域。肌縮蛋白之CC區形成異連蛋白之結合位點，且可調節α1-互生蛋白及其他肌縮蛋白相關蛋白之間之相互作用。

認為兩種互生蛋白同種型α1-互生蛋白及β1-互生蛋白經由肌縮蛋白外顯子73及74中之一個以上結合位點直接與肌縮蛋白相互作用(Yang等人，JBC 270(10):4975-8 (1995))。α1-及αβ1-互生蛋白分開與肌縮蛋白C端域結合，且α1-互生蛋白之結合位點至少位於胺基酸殘基3447至3481內，而β1-互生蛋白之結合位點位於胺基酸殘基3495至3535內(表 1 ，SEQ ID NO: 16，斜體)。阿爾法1-(α1-)互生蛋白及α-互生蛋白在全文中可互換使用。

微小肌縮蛋白基因盒之C端(CT)域中捲曲螺旋基序之螺旋1 (參見下表1中SEQ ID NO: 16內以單下劃線序列指示之H1)可對於心肌細胞保護為有利的，且以其他方式穩定肌縮蛋白相關之(糖)蛋白(DAP)複合物(DAPC)。DAPC可參與重要信號傳導作用以及結構作用。當然，已指示一氧化氮(NO)之產生發生改變，以及由複合物之不穩定及損失引起之其他功能之可能改變。

意外地，發現本文揭示之某些微小肌縮蛋白構築體結合並招募nNOS、以及α-互生蛋白、α-異連蛋白及β-肌縮蛋白聚糖。在包括肌縮蛋白之C端域之微小肌縮蛋白構築體結合nNOS之背景下，結合nNOS意指藉由用適當抗體免疫染色來確定在肌肉組織中表現之微小肌縮蛋白構築體，以鑑別轉導之肌肉組織之一部分中之肌纖維膜中或附近之α-互生蛋白、α-異連蛋白及nNOS中之每一者。參見下文章節6.5及6.7中之實例5及7。在某些實施例中，與不含C端域(但具有在其他方面相同之胺基酸序列，即「參考微小肌縮蛋白」)之可比微小肌縮蛋白相比，微小肌縮蛋白具有「增加」與α1-互生蛋白、β-互生蛋白及/或異連蛋白結合之C端域，此意味著與無C端域(但具有在其他方面與微小肌縮蛋白相同之胺基酸序列)之參考微小肌縮蛋白相比，DAPC更大程度地穩定或錨定於肌纖維膜，如藉由以下確定：與經參考微小肌縮蛋白(具有相同序列及肌縮蛋白組分，惟不具有C端域)處理之mdx 小鼠肌肉相比，經具有C端域之微小肌縮蛋白處理之mdx 小鼠肌肉之肌膜中一或多種DAPC組分之含量較高，其係藉由肌肉切片之免疫染色或肌肉組織溶解物或肌膜製劑之西方墨點對一或多種DAPC組分(包括α1-互生蛋白、β-互生蛋白、α-異連蛋白、β-肌縮蛋白聚糖或nNOS)進行測定(參見下文章節6.5及6.7)。

在一些實施例中，包括肌縮蛋白之C端域之微小肌縮蛋白構築體在C端域中包含互生蛋白結合位點及/或異連蛋白結合位點。在一些實施例中，包含α1-互生蛋白結合位點之C端域係經截短之C端域。在某些實施例中，經截短之C端域之胺基酸序列係SEQ ID NO: 83。在某些實施例中，經截短之C端域包含胺基酸序列MENSNGSYLNDSISPNESIDDEHLLIQHYCQSLNQ (α1-互生蛋白結合位點) (SEQ ID NO: 84)。在某些實施例中，經截短之C端域包含α1-互生蛋白結合位點，其中結合位點具有胺基酸序列MENSNGSYLNDSISPNESIDDEHLLIQHYCQSLNQ (SEQ ID NO: 84)，但不具有β1-互生蛋白或異連蛋白結合位點。

本揭示內容之微小肌縮蛋白構築體可進一步預防進行性心室纖維化，如藉由心肌巨噬細胞濃度之降低、黏附分子表現之降低及/或正規化心電圖(ECG)讀出(例如在投與微小肌縮蛋白構築體後收縮末期容積(左心室)、舒張末期容積、中風容積、射血分數、心率或心搏出量)所量測。收縮末期容積及其他心臟讀出亦可使用MRI (磁共振斷層攝影)、心臟CT (電腦斷層攝影)或SPECT (單光子發射電腦斷層攝影)來量測。亦可在DBA/2J-mdx小鼠模型中測試投與本發明之微小肌縮蛋白構築體後之心臟功能改良。

因此，本文所述之實施例可進一步包含CT域之全部或部分，其包含捲曲螺旋基序之螺旋1。舉例而言，微小肌縮蛋白自胺基端至羧基端包含：ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT (例如SEQ ID NO: 1、79或91)或ABD-H1-R1-R2-R16-R17-R24-H4-CR-CT (例如SEQ ID NO: 92)。在一些實施例中，CT係至少包含α1-互生蛋白結合位點及/或異連蛋白結合位點之肌縮蛋白的C端域之一部分，如圖14中所圖解說明。在某些實施例中，CT域包含α1-互生蛋白結合位點且不具有β1-互生蛋白或異連蛋白結合位點，例如，其具有SEQ ID NO: 83之胺基酸序列，其部分用於經由α1-互生蛋白招募nNOS及錨定nNOS於肌纖維膜。在一些實施例中，CT包含SEQ ID NO: 16或83之胺基酸序列。

微小肌縮蛋白實施例可進一步包含連接體(L1, L2, L3, L4, L4.1及/或L4.2)或其部分連接域，如下所示：ABD1-L1-H1-L2-R1-R2-L3-R3-H3-L4-R24-H4-CR-CT (例如SEQ ID NO: 1, 79或91)、ABD1-L1-H1-L2-R1-R2-L3-R3-H3-L4-R24-H4-CR (例如SEQ ID NO: 2)、ABD1-L1-H1-L2-R1-R2-L3-R16-L4.1-R17-L4.2-R24-H4-CR (例如SEQ ID NO: 92)或ABD1-L1-H1-L2-R1-R2-L3-R16-L4.1-R17-L4.2-R24-H4-CR-CT (例如SEQ ID NO: 93)。L1可為可將ABD1偶合至H1之內源性連接體L1 (例如SEQ ID NO: 4)。L2可為可將H1偶合至R1之內源性連接體L2 (例如SEQ ID NO: 6)。L3可為可將R2偶合至R3或R16之內源性連接體L3 (例如SEQ ID NO: 9)。

L4亦可為可偶合H3及R24之內源性連接體。在一些實施例中，L4為在天然肌縮蛋白序列中在R24之前之3個胺基酸，例如TLE (SEQ ID NO: 12)。在其他實施例中，L4可為在天然肌縮蛋白序列中在R24之前之4個胺基酸(SEQ ID NO: 17)或在R24之前之2個胺基酸(SEQ ID NO: 18)。在其他實施例中，在H3及R24之間不存在連接體、L4或其他。如上所提及，在H3之5'端上不存在連接體，而是R3直接偶合至H3或另一選擇為H2。

L4.1可為可偶合R16及R17之內源性連接體。在一些實施例中，L4.1係在天然肌縮蛋白序列中在R17之前之2個胺基酸，例如SV (SEQ ID NO: 110)。在其他實施例中，L4.2可為可偶合R17及R24之內源性連接體或內源性連接體之一部分。在一些實施例中，L4.2係4個胺基酸，例如R17之後之Q及R24 (SEQ ID NO: 89)之前之TLE (SEQ ID NO: 12)。

未具體闡述之微小肌縮蛋白其他域之上述組分可具有如下表1中提供之胺基酸序列。本文提供之域之胺基酸序列對應於UniProtKB-P11532 (DMD_HUMAN)之肌縮蛋白同種型，其以引用方式併入本文中。其他實施例可包含來自業內已知之天然功能性肌縮蛋白同種型之域，例如UniProtKB-A0A075B6G3 (A0A075B6G3_HUMAN) (以引用方式併入本文中)，其中例如R24具有在SEQ ID NO: 13之胺基酸3處取代Q之R。表 1 ：微小肌縮蛋白區段胺基酸序列

結構	SEQ ID	序列
ABD1	3	MLWWEEVEDCYEREDVQKKTFTKWVNAQFSKFGKQHIENLFSDLQDGRRLLDLLEGLTGQKLPKEKGSTRVHALNNVNKALRVLQNNNVDLVNIGSTDIVDGNHKLTLGLIWNIILHWQVKNVMKNIMAGLQQTNSEKILLSWVRQSTRNYPQVNVINFTTSWSDGLALNALIHSHRPDLFDWNSVVCQQSATQRLEHAFNIARYQLGIEKLLDPEDVDTTYPDKKSILMYITSLFQVLP
L1	4	QQVSIEAIQEVE
H1	5	MLPRPPKVTKEEHFQLHHQMHYSQQITVSLAQGYERTSSPKPRFKSYAYTQAAYVTTSDPTRSPFPSQHLEAPED
L2	6	KSFGSSLME
R1	7	SEVNLDRYQTALEEVLSWLLSAEDTLQAQGEISNDVEVVKDQFHTHEGYMMDLTAHQGRVGNILQLGSKLIGTGKLSEDEETEVQEQMNLLNSRWECLRVASMEKQSNLHR
R2	8	VLMDLQNQKLKELNDWLTKTEERTRKMEEEPLGPDLEDLKRQVQQHKVLQEDLEQEQVRVNSLTHMVVVVDESSGDHATAALEEQLKVLGDRWANICRWTEDRWVLLQD
L3	9	IL
R3	10	LKWQRLTEEQCLFSAWLSEKEDAVNKIHTTGFKDQNEMLSSLQKLAVLKADLEKKKQSMGKLYSLKQDLLSTLKNKSVTQKTEAWLDNFARCWDNLVQKLEKSTAQISQ
H3	11	QPDLAPGLTTIGASPTQTVTLVTQPVVTKETAISKLEMPSSLMLEVP
L4	12	TLE
R16	86	EISYVPSTYLTEITHVSQALLEVEQLLNAPDLCAKDFEDLFKQEESLKNIKDSLQQSSGRIDIIHSKKTAALQSATPVERVKLQEALSQLDFQWEKVNKMYKDRQGRFDR
L4.1	110	SV
R17	87	EKWRRFHYDIKIFNQWLTEAEQFLRKTQIPENWEHAKYKWYLKELQDGIGQRQTVVRTLNATGEEIIQQSSKTDASILQEKLGSLNLRWQEVCKQLSDRKKRLEE
R16-R17	88	EISYVPSTYLTEITHVSQALLEVEQLLNAPDLCAKDFEDLFKQEESLKNIKDSLQQSSGRIDIIHSKKTAALQSATPVERVKLQEALSQLDFQWEKVNKMYKDRQGRFDRSV EKWRRFHYDIKIFNQWLTEAEQFLRKTQIPENWEHAKYKWYLKELQDGIGQRQTVVRTLNATGEEIIQQSSKTDASILQEKLGSLNLRWQEVCKQLSDRKKRLEE L4. 連接R16及R17之1個連接體加下劃線。
L4.2	89	QTLE
R24	13	RLQELQEATDELDLKLRQAEVIKGSWQPVGDLLIDSLQDHLEKVKALRGEIAPLKENVSHVNDLARQLTTLGIQLSPYNLSTLEDLNTRWKLLQVAVEDRVRQLHE
H4	14	AHRDFGPASQHFLSTSVQGPWERAISPNKVPYYINHETQTTCWDHPKM TELYQSLADLNNVRFSAYRTAMKL WW域以單下劃線表示(UniProtKB-P11532 aa 3055-3088)
富含半胱胺酸之域(CR)	15	RRLQKALCLDLLSLSAACDALDQHNLKQNDQPMDILQIINCLTTIYDRLEQEHNNLVNVPLCVDMCLNWLLNVYDTGRTGRIRVLSFKTGIISLCKAHLEDKYRYLFKQVASSTGFCDQRRLGLLLHDSIQIPRQLGEVASFGGSNIEPSVRSCFQFANNKPEIEAALFLDWMRLEPQSMVWLPVLHRVAAAETAKHQAKCNICKECPIIGFRYRSLKHFNYDICQSCFFSGRVAKGHKMHY PMVEYC ZZ域以單下劃線表示(UniProtKB-P11532 aa 3307-3354)
CR短	90	AKHQAKCNICKECPIIGFRYRSLKHFNYDICQSCFFSGRVAKGHKMHYPMVEYC
C端域(CT)	16	TPTTSGEDVRDFAKVLKNKFRTKRYFAKHPRMGYLPVQTVLEGDNMETPVTLINFWPVDSAPASSPQLSHDDTHSRIEHYASRLAEMENSNGSYLNDSISPNESIDDEHLLIQHYCQSLNQDSPLSQPRSPAQILISLESEERGELERILADLEEENRNLQAEYDRLKQQHEHKGLSPLPS PPEMMPTSPQSPR 捲曲螺旋基序H1以單下劃線表示；基序H2以雙下劃線表示；異連蛋白結合位點呈斜體。
最小/經截短之C端域(CT1.5)	83	TPTTSGEDVRDFAKVLKNKFRTKRYFAKHPRMGYLPVQTVLEGDNMETPVTLINFWPVDSAPASSPQLSHDDTHSRIEHYASRLAEMENSNGSYLNDSISPNESIDDEHLLIQHYCQSLNQ DSPLSQPRSPAQILISLES α1-互生蛋白結合位點呈斜體。
L4	17	ETLE
L4	18	LE
H2	19	PSLTQTTVMETVTTVTTREQILVKHAQEELPPPPPQKKRQITVD
最小α-互生蛋白結合位點	84	MENSNGSYLNDSISPNESIDDEHLLIQHYCQSLNQ

本揭示內容亦考慮該等序列之變體，只要實質上維持每一域及連接體之功能及/或實質上維持包含該等變體之微小肌縮蛋白之治療效能即可。功能活性包括(1)與肌動蛋白、β-肌縮蛋白聚糖、α1-互生蛋白、α-異連蛋白及nNOS中之一者、組合或全部結合；(2)動物模型(例如，本文所述之mdx 小鼠模型)或人類個體中改良之肌肉功能；及/或(3) 動物模型或人類患者中心臟保護或心肌功能改良。具體而言，微小肌縮蛋白可包含ABD，其由SEQ ID NO: 3或與SEQ ID NO: 3具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列組成；H1，其由SEQ ID NO: 5或與SEQ ID NO: 5具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列組成；R1，其由SEQ ID NO: 7或與SEQ ID NO: 7具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列組成；R2，其由SEQ ID NO: 8或與SEQ ID NO: 8具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列組成；H2，其由SEQ ID NO: 19或與SEQ ID NO: 19具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列組成；H3，其由SEQ ID NO: 11或與SEQ ID NO: 11具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列組成；R24，其由SEQ ID NO: 13或與SEQ ID NO: 13具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列組成；H4，其由SEQ ID NO: 14或與SEQ ID NO: 14具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列組成；CR，其由SEQ ID NO: 15或90或與SEQ ID NO: 15或90具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列組成；CT，其由SEQ ID NO: 16或83或與SEQ ID NO: 16或83具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列組成；或包含SEQ ID NO: 84之CT。替代實施例與上述相同，惟H3域經H2域置換，該H2域由SEQ ID NO: 19或與SEQ ID NO: 19具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成，同樣編碼具有功能活性之微小肌縮蛋白。除了上述之外，微小肌縮蛋白亦可在上述位置中包含連接體，其包含如下序列或由其組成：L1，其由SEQ ID NO: 4或與SEQ ID NO: 4具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列組成；L2，其由SEQ ID NO: 6或與SEQ ID NO: 6具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列組成；L3，其由SEQ ID NO: 9或與SEQ ID NO: 9具有至少50%一致性之胺基酸序列組成，或對兩個L3殘基進行保守取代之變體；及L4，其由SEQ ID NO: 12、17或18或與SEQ ID NO: 12、17或18具有至少50%、至少75%序列一致性之胺基酸序列組成。

在特定實施例中，微小肌縮蛋白可包含ABD，其由SEQ ID NO: 3或與SEQ ID NO: 3具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列組成；H1，其由SEQ ID NO: 5或與SEQ ID NO: 5具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列組成；R1，其由SEQ ID NO: 7或與SEQ ID NO: 7具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列組成；R2，其由SEQ ID NO: 8或與SEQ ID NO: 8具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列組成；R16，其由SEQ ID NO: 86或與SEQ ID NO: 86具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列組成；R17，其由SEQ ID NO: 87或與SEQ ID NO: 87具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列組成；R24，其由SEQ ID NO: 13或與SEQ ID NO: 13具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列組成；H4，其由SEQ ID NO: 14或與SEQ ID NO: 14具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列組成；CR，其由SEQ ID NO: 15 或90或與SEQ ID NO: 15或90具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列組成；CT，其由SEQ ID NO: 16或83或與SEQ ID NO: 16或83具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列組成；或包含SEQ ID NO: 84之CT。除了上述之外，微小肌縮蛋白亦可在上述位置中包含連接體，其包含如下序列或由其組成：L1，其由SEQ ID NO: 4或與SEQ ID NO: 4具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列組成；L2，其由SEQ ID NO: 6或與SEQ ID NO: 6具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列組成；L3，其由SEQ ID NO: 9或與SEQ ID NO: 9具有至少50%一致性之胺基酸序列組成，或對兩個L3殘基進行保守取代之變體；L4.1，其由SEQ ID NO: 110或與SEQ ID NO: 110具有至少50%、至少75%序列一致性之胺基酸序列組成；及L4.2，其由SEQ ID NO: 89或與SEQ ID NO: 89具有至少50%、至少75%序列一致性之胺基酸序列組成。

表2提供根據本揭示內容之微小肌縮蛋白實施例之胺基酸序列。亦考慮其他實施例係如由SEQ ID NO: 1、2、79、91、92或93定義之微小肌縮蛋白之經取代變體。舉例而言，可對SEQ ID NO: 1、2、79、91、92或93進行保守取代，且該等保守取代實質上維持其功能活性。在實施例中，微小肌縮蛋白可與SEQ ID NO: 1、2、79、91、92或93之胺基酸序列具有至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性且維持功能性微小肌縮蛋白活性，如例如藉由下文章節5.4中揭示之動物模型中之一或多種活體外分析或活體內分析所確定。表 2 ： RGX-DYS 蛋白之胺基酸序列

結構	SEQ ID NO:	胺基酸序列
DYS1、DYS2及DYS4	1	MLWWEEVEDCYEREDVQKKTFTKWVNAQFSKFGKQHIENLFSDLQDGRRL LDLLEGLTGQKLPKEKGSTRVHALNNVNKALRVLQNNNVDLVNIGSTDIV DGNHKLTLGLIWNIILHWQVKNVMKNIMAGLQQTNSEKILLSWVRQSTRN YPQVNVINFTTSWSDGLALNALIHSHRPDLFDWNSVVCQQSATQRLEHAF NIARYQLGIEKLLDPEDVDTTYPDKKSILMYITSLFQVLPQQVSIEAIQE VEMLPRPPKVTKEEHFQLHHQMHYSQQITVSLAQGYERTSSPKPRFKSYA YTQAAYVTTSDPTRSPFPSQHLEAPEDKSFGSSLMESEVNLDRYQTALEE VLSWLLSAEDTLQAQGEISNDVEVVKDQFHTHEGYMMDLTAHQGRVGNIL QLGSKLIGTGKLSEDEETEVQEQMNLLNSRWECLRVASMEKQSNLHRVLM DLQNQKLKELNDWLTKTEERTRKMEEEPLGPDLEDLKRQVQQHKVLQEDL EQEQVRVNSLTHMVVVVDESSGDHATAALEEQLKVLGDRWANICRWTEDR WVLLQDILLKWQRLTEEQCLFSAWLSEKEDAVNKIHTTGFKDQNEMLSSL QKLAVLKADLEKKKQSMGKLYSLKQDLLSTLKNKSVTQKTEAWLDNFARC WDNLVQKLEKSTAQISQQPDLAPGLTTIGASPTQTVTLVTQPVVTKETAI SKLEMPSSLMLEVPTLERLQELQEATDELDLKLRQAEVIKGSWQPVGDLL IDSLQDHLEKVKALRGEIAPLKENVSHVNDLARQLTTLGIQLSPYNLSTL EDLNTRWKLLQVAVEDRVRQLHEAHRDFGPASQHFLSTSVQGPWERAISP NKVPYYINHETQTTCWDHPKMTELYQSLADLNNVRFSAYRTAMKLRRLQK ALCLDLLSLSAACDALDQHNLKQNDQPMDILQIINCLTTIYDRLEQEHNN LVNVPLCVDMCLNWLLNVYDTGRTGRIRVLSFKTGIISLCKAHLEDKYRY LFKQVASSTGFCDQRRLGLLLHDSIQIPRQLGEVASFGGSNIEPSVRSCF QFANNKPEIEAALFLDWMRLEPQSMVWLPVLHRVAAAETAKHQAKCNICK ECPIIGFRYRSLKHFNYDICQSCFFSGRVAKGHKMHYPMVEYCTPTTSGE DVRDFAKVLKNKFRTKRYFAKHPRMGYLPVQTVLEGDNMETPVTLINFWP VDSAPASSPQLSHDDTHSRIEHYASRLAEMENSNGSYLNDSISPNESIDD EHLLIQHYCQSLNQDSPLSQPRSPAQILISLESEERGELERILADLEEEN RNLQAEYDRLKQQHEHKGLSPLPSPPEMMPTSPQSPR
DYS3	2	MLWWEEVEDCYEREDVQKKTFTKWVNAQFSKFGKQHIENLFSDLQDGRRLLDLLEGLTGQKLPKEKGSTRVHALNNVNKALRVLQNNNVDLVNIGSTDIVDGNHKLTLGLIWNIILHWQVKNVMKNIMAGLQQTNSEKILLSWVRQSTRNYPQVNVINFTTSWSDGLALNALIHSHRPDLFDWNSVVCQQSATQRLEHAFNIARYQLGIEKLLDPEDVDTTYPDKKSILMYITSLFQVLPQQVSIEAIQEVEMLPRPPKVTKEEHFQLHHQMHYSQQITVSLAQGYERTSSPKPRFKSYAYTQAAYVTTSDPTRSPFPSQHLEAPEDKSFGSSLMESEVNLDRYQTALEEVLSWLLSAEDTLQAQGEISNDVEVVKDQFHTHEGYMMDLTAHQGRVGNILQLGSKLIGTGKLSEDEETEVQEQMNLLNSRWECLRVASMEKQSNLHRVLMDLQNQKLKELNDWLTKTEERTRKMEEEPLGPDLEDLKRQVQQHKVLQEDLEQEQVRVNSLTHMVVVVDESSGDHATAALEEQLKVLGDRWANICRWTEDRWVLLQDILLKWQRLTEEQCLFSAWLSEKEDAVNKIHTTGFKDQNEMLSSLQKLAVLKADLEKKKQSMGKLYSLKQDLLSTLKNKSVTQKTEAWLDNFARCWDNLVQKLEKSTAQISQQPDLAPGLTTIGASPTQTVTLVTQPVVTKETAISKLEMPSSLMLEVPTLERLQELQEATDELDLKLRQAEVIKGSWQPVGDLLIDSLQDHLEKVKALRGEIAPLKENVSHVNDLARQLTTLGIQLSPYNLSTLEDLNTRWKLLQVAVEDRVRQLHEAHRDFGPASQHFLSTSVQGPWERAISPNKVPYYINHETQTTCWDHPKMTELYQSLADLNNVRFSAYRTAMKLRRLQKALCLDLLSLSAACDALDQHNLKQNDQPMDILQIINCLTTIYDRLEQEHNNLVNVPLCVDMCLNWLLNVYDTGRTGRIRVLSFKTGIISLCKAHLEDKYRYLFKQVASSTGFCDQRRLGLLLHDSIQIPRQLGEVASFGGSNIEPSVRSCFQFANNKPEIEAALFLDWMRLEPQSMVWLPVLHRVAAAETAKHQAKCNICKECPIIGFRYRSLKHFNYDICQSCFFSGRVAKGHKMHYPMVEYCTPTTSGEDVRDFAKVLKNKFRTKRYFAKHPRMGYLPVQTVLEGDNMET
DYS5	79	MLWWEEVEDCYEREDVQKKTFTKWVNAQFSKFGKQHIENLFSDLQDGRRLLDLLEGLTGQKLPKEKGSTRVHALNNVNKALRVLQNNNVDLVNIGSTDIVDGNHKLTLGLIWNIILHWQVKNVMKNIMAGLQQTNSEKILLSWVRQSTRNYPQVNVINFTTSWSDGLALNALIHSHRPDLFDWNSVVCQQSATQRLEHAFNIARYQLGIEKLLDPEDVDTTYPDKKSILMYITSLFQVLPQQVSIEAIQEVEMLPRPPKVTKEEHFQLHHQMHYSQQITVSLAQGYERTSSPKPRFKSYAYTQAAYVTTSDPTRSPFPSQHLEAPEDKSFGSSLMESEVNLDRYQTALEEVLSWLLSAEDTLQAQGEISNDVEVVKDQFHTHEGYMMDLTAHQGRVGNILQLGSKLIGTGKLSEDEETEVQEQMNLLNSRWECLRVASMEKQSNLHRVLMDLQNQKLKELNDWLTKTEERTRKMEEEPLGPDLEDLKRQVQQHKVLQEDLEQEQVRVNSLTHMVVVVDESSGDHATAALEEQLKVLGDRWANICRWTEDRWVLLQDILLKWQRLTEEQCLFSAWLSEKEDAVNKIHTTGFKDQNEMLSSLQKLAVLKADLEKKKQSMGKLYSLKQDLLSTLKNKSVTQKTEAWLDNFARCWDNLVQKLEKSTAQISQQPDLAPGLTTIGASPTQTVTLVTQPVVTKETAISKLEMPSSLMLEVPTLERLQELQEATDELDLKLRQAEVIKGSWQPVGDLLIDSLQDHLEKVKALRGEIAPLKENVSHVNDLARQLTTLGIQLSPYNLSTLEDLNTRWKLLQVAVEDRVRQLHEAHRDFGPASQHFLSTSVQGPWERAISPNKVPYYINHETQTTCWDHPKMTELYQSLADLNNVRFSAYRTAMKLRRLQKALCLDLLSLSAACDALDQHNLKQNDQPMDILQIINCLTTIYDRLEQEHNNLVNVPLCVDMCLNWLLNVYDTGRTGRIRVLSFKTGIISLCKAHLEDKYRYLFKQVASSTGFCDQRRLGLLLHDSIQIPRQLGEVASFGGSNIEPSVRSCFQFANNKPEIEAALFLDWMRLEPQSMVWLPVLHRVAAAETAKHQAKCNICKECPIIGFRYRSLKHFNYDICQSCFFSGRVAKGHKMHYPMVEYCTPTTSGEDVRDFAKVLKNKFRTKRYFAKHPRMGYLPVQTVLEGDNMETPVTLINFWPVDSAPASSPQLSHDDTHSRIEHYASRLAEMENSNGSYLNDSISPNESIDDEHLLIQHYCQSLNQDSPLSQPRSPAQILISLES
DYS6	91	MLWWEEVEDCYEREDVQKKTFTKWVNAQFSKFGKQHIENLFSDLQDGRRLLDLLEGLTGQKLPKEKGSTRVHALNNVNKALRVLQNNNVDLVNIGSTDIVDGNHKLTLGLIWNIILHWQVKNVMKNIMAGLQQTNSEKILLSWVRQSTRNYPQVNVINFTTSWSDGLALNALIHSHRPDLFDWNSVVCQQSATQRLEHAFNIARYQLGIEKLLDPEDVDTTYPDKKSILMYITSLFQVLPQQVSIEAIQEVEMLPRPPKVTKEEHFQLHHQMHYSQQITVSLAQGYERTSSPKPRFKSYAYTQAAYVTTSDPTRSPFPSQHLEAPEDKSFGSSLMESEVNLDRYQTALEEVLSWLLSAEDTLQAQGEISNDVEVVKDQFHTHEGYMMDLTAHQGRVGNILQLGSKLIGTGKLSEDEETEVQEQMNLLNSRWECLRVASMEKQSNLHRVLMDLQNQKLKELNDWLTKTEERTRKMEEEPLGPDLEDLKRQVQQHKVLQEDLEQEQVRVNSLTHMVVVVDESSGDHATAALEEQLKVLGDRWANICRWTEDRWVLLQDILLKWQRLTEEQCLFSAWLSEKEDAVNKIHTTGFKDQNEMLSSLQKLAVLKADLEKKKQSMGKLYSLKQDLLSTLKNKSVTQKTEAWLDNFARCWDNLVQKLEKSTAQISQQPDLAPGLTTIGASPTQTVTLVTQPVVTKETAISKLEMPSSLMLEVPTLERLQELQEATDELDLKLRQAEVIKGSWQPVGDLLIDSLQDHLEKVKALRGEIAPLKENVSHVNDLARQLTTLGIQLSPYNLSTLEDLNTRWKLLQVAVEDRVRQLHEAHRDFGPASQHFLSTSVQGPWERAISPNKVPYYINHETQTTCWDHPKMTELYQSLADLNNVRFSAYRTAMKLRRLQKALCLDLLSLSAACDALDQHNLKQNDQPMDILQIINCLTTIYDRLEQEHNNLVNVPLCVDMCLNWLLNVYDTGRTGRIRVLSFKTGIISLCKAHLEDKYRYLFKQVASSTGFCDQRRLGLLLHDSIQIPRQLGEVASFGGAKHQAKCNICKECPIIGFRYRSLKHFNYDICQSCFFSGRVAKGHKMHYPMVEYCTPTTSGEDVRDFAKVLKNKFRTKRYFAKHPRMGYLPVQTVLEGDNMETPVTLINFWPVDSAPASSPQLSHDDTHSRIEHYASRLAEMENSNGSYLNDSISPNESIDDEHLLIQHYCQSLNQDSPLSQPRSPAQILISLESEERGELERILADLEEENRNLQAEYDRLKQQHEHKGLSPLPSPPEMMPTSPQSPR
DYS7	92	MLWWEEVEDCYEREDVQKKTFTKWVNAQFSKFGKQHIENLFSDLQDGRRLLDLLEGLTGQKLPKEKGSTRVHALNNVNKALRVLQNNNVDLVNIGSTDIVDGNHKLTLGLIWNIILHWQVKNVMKNIMAGLQQTNSEKILLSWVRQSTRNYPQVNVINFTTSWSDGLALNALIHSHRPDLFDWNSVVCQQSATQRLEHAFNIARYQLGIEKLLDPEDVDTTYPDKKSILMYITSLFQVLPQQVSIEAIQEVEMLPRPPKVTKEEHFQLHHQMHYSQQITVSLAQGYERTSSPKPRFKSYAYTQAAYVTTSDPTRSPFPSQHLEAPEDKSFGSSLMESEVNLDRYQTALEEVLSWLLSAEDTLQAQGEISNDVEVVKDQFHTHEGYMMDLTAHQGRVGNILQLGSKLIGTGKLSEDEETEVQEQMNLLNSRWECLRVASMEKQSNLHRVLMDLQNQKLKELNDWLTKTEERTRKMEEEPLGPDLEDLKRQVQQHKVLQEDLEQEQVRVNSLTHMVVVVDESSGDHATAALEEQLKVLGDRWANICRWTEDRWVLLQDILEISYVPSTYLTEITHVSQALLEVEQLLNAPDLCAKDFEDLFKQEESLKNIKDSLQQSSGRIDIIHSKKTAALQSATPVERVKLQEALSQLDFQWEKVNKMYKDRQGRFDRSVEKWRRFHYDIKIFNQWLTEAEQFLRKTQIPENWEHAKYKWYLKELQDGIGQRQTVVRTLNATGEEIIQQSSKTDASILQEKLGSLNLRWQEVCKQLSDRKKRLEEQTLERLQELQEATDELDLKLRQAEVIKGSWQPVGDLLIDSLQDHLEKVKALRGEIAPLKENVSHVNDLARQLTTLGIQLSPYNLSTLEDLNTRWKLLQVAVEDRVRQLHEAHRDFGPASQHFLSTSVQGPWERAISPNKVPYYINHETQTTCWDHPKMTELYQSLADLNNVRFSAYRTAMKLRRLQKALCLDLLSLSAACDALDQHNLKQNDQPMDILQIINCLTTIYDRLEQEHNNLVNVPLCVDMCLNWLLNVYDTGRTGRIRVLSFKTGIISLCKAHLEDKYRYLFKQVASSTGFCDQRRLGLLLHDSIQIPRQLGEVASFGGSNIEPSVRSCFQFANNKPEIEAALFLDWMRLEPQSMVWLPVLHRVAAAETAKHQAKCNICKECPIIGFRYRSLKHFNYDICQSCFFSGRVAKGHKMHYPMVEYCTPTTSGEDVRDFAKVLKNKFRTKRYFAKHPRMGYLPVQTVLEGDNMETPVTLINFWPVDSAPASSPQLSHDDTHSRIEHYASRLAEMENSNGSYLNDSISPNESIDDEHLLIQHYCQSLNQDSPLSQPRSPAQILISLES
DSY8	93	MLWWEEVEDCYEREDVQKKTFTKWVNAQFSKFGKQHIENLFSDLQDGRRLLDLLEGLTGQKLPKEKGSTRVHALNNVNKALRVLQNNNVDLVNIGSTDIVDGNHKLTLGLIWNIILHWQVKNVMKNIMAGLQQTNSEKILLSWVRQSTRNYPQVNVINFTTSWSDGLALNALIHSHRPDLFDWNSVVCQQSATQRLEHAFNIARYQLGIEKLLDPEDVDTTYPDKKSILMYITSLFQVLPQQVSIEAIQEVEMLPRPPKVTKEEHFQLHHQMHYSQQITVSLAQGYERTSSPKPRFKSYAYTQAAYVTTSDPTRSPFPSQHLEAPEDKSFGSSLMESEVNLDRYQTALEEVLSWLLSAEDTLQAQGEISNDVEVVKDQFHTHEGYMMDLTAHQGRVGNILQLGSKLIGTGKLSEDEETEVQEQMNLLNSRWECLRVASMEKQSNLHRVLMDLQNQKLKELNDWLTKTEERTRKMEEEPLGPDLEDLKRQVQQHKVLQEDLEQEQVRVNSLTHMVVVVDESSGDHATAALEEQLKVLGDRWANICRWTEDRWVLLQDILEISYVPSTYLTEITHVSQALLEVEQLLNAPDLCAKDFEDLFKQEESLKNIKDSLQQSSGRIDIIHSKKTAALQSATPVERVKLQEALSQLDFQWEKVNKMYKDRQGRFDRSVEKWRRFHYDIKIFNQWLTEAEQFLRKTQIPENWEHAKYKWYLKELQDGIGQRQTVVRTLNATGEEIIQQSSKTDASILQEKLGSLNLRWQEVCKQLSDRKKRLEEQTLERLQELQEATDELDLKLRQAEVIKGSWQPVGDLLIDSLQDHLEKVKALRGEIAPLKENVSHVNDLARQLTTLGIQLSPYNLSTLEDLNTRWKLLQVAVEDRVRQLHEAHRDFGPASQHFLSTSVQGPWERAISPNKVPYYINHETQTTCWDHPKMTELYQSLADLNNVRFSAYRTAMKLRRLQKALCLDLLSLSAACDALDQHNLKQNDQPMDILQIINCLTTIYDRLEQEHNNLVNVPLCVDMCLNWLLNVYDTGRTGRIRVLSFKTGIISLCKAHLEDKYRYLFKQVASSTGFCDQRRLGLLLHDSIQIPRQLGEVASFGGSNIEPSVRSCFQFANNKPEIEAALFLDWMRLEPQSMVWLPVLHRVAAAETAKHQAKCNICKECPIIGFRYRSLKHFNYDICQSCFFSGRVAKGHKMHYPMVEYCTPTTSGEDVRDFAKVLKNKFRTKRYFAKHPRMGYLPVQTVLEGDNMET

5.2.2 編碼微小肌縮蛋白之核酸組合物

本揭示內容之另一態樣係包含編碼如本文所述微小肌縮蛋白之核苷酸序列的核酸。該等核酸包含編碼微小肌縮蛋白之核苷酸序列，該微小肌縮蛋白具有自N端至C端佈置如下之域：ABD1-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT、ABD1-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR、ABD1-H1-R1-R2-R16-R17-R24-H4-CR-CT或ABD1-H1-R1-R2-R16-R17-R24-H4-CR。核苷酸序列可為編碼域之任何核苷酸序列。核苷酸序列可經密碼子最佳化及/或缺失CpG島用於在適當背景下表現。在特定實施例中，核苷酸序列編碼具有SEQ ID NO: 1、2、79、91、92或93之胺基酸序列之微小肌縮蛋白。核苷酸序列可為編碼微小肌縮蛋白之任何序列，包括SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 92或SEQ ID NO: 93之微小肌縮蛋白，該核苷酸序列可由於代碼之簡併性而變化。表3及4提供編碼DMD 域之實例性核苷酸序列。表3提供組分之野生型DMD 核苷酸序列且表4提供本文構築體中所用之DMD 組分之核苷酸序列，包括經密碼子最佳化及/或CpG缺失CpG島之序列，如下：表 3 ：肌縮蛋白區段核苷酸序列

結構	SEQ ID	核酸序列
ABD1	22	ATGCTTTGGTGGGAAGAAGTAGAGGACTGTTATGAAAGAGAAGATGTTCAAAAGAAAACATTCACAAAATGGGTAAATGCACAATTTTCTAAGTTTGGGAAGCAGCATATTGAGAACCTCTTCAGTGACCTACAGGATGGGAGGCGCCTCCTAGACCTCCTCGAAGGCCTGACAGGGCAAAAACTGCCAAAAGAAAAAGGATCCACAAGAGTTCATGCCCTGAACAATGTCAACAAGGCACTGCGGGTTTTGCAGAACAATAATGTTGATTTAGTGAATATTGGAAGTACTGACATCGTAGATGGAAATCATAAACTGACTCTTGGTTTGATTTGGAATATAATCCTCCACTGGCAGGTCAAAAATGTAATGAAAAATATCATGGCTGGATTGCAACAAACCAACAGTGAAAAGATTCTCCTGAGCTGGGTCCGACAATCAACTCGTAATTATCCACAGGTTAATGTAATCAACTTCACCACCAGCTGGTCTGATGGCCTGGCTTTGAATGCTCTCATCCATAGTCATAGGCCAGACCTATTTGACTGGAATAGTGTGGTTTGCCAGCAGTCAGCCACACAACGACTGGAACATGCATTCAACATCGCCAGATATCAATTAGGCATAGAGAAACTACTCGATCCTGAAGATGTTGATACCACCTATCCAGATAAGAAGTCCATCTTAATGTACATCACATCACTCTTCCAAGTTTTGCCT
L1	23	CAACAAGTGAGCATTGAAGCCATCCAGGAAGTGGAA
H1	24	ATGTTGCCAAGGCCACCTAAAGTGACTAAAGAAGAACATTTTCAGTTACATCATCAAATGCACTATTCTCAACAGATCACGGTCAGTCTAGCACAGGGATATGAGAGAACTTCTTCCCCTAAGCCTCGATTCAAGAGCTATGCCTACACACAGGCTGCTTATGTCACCACCTCTGACCCTACACGGAGCCCATTTCCTTCACAGCATTTGGAAGCTCCTGAAGAC
L2	25	AAGTCATTTGGCAGTTCATTGATGGAG
R1	26	AGTGAAGTAAACCTGGACCGTTATCAAACAGCTTTAGAAGAAGTATTATCGTGGCTTCTTTCTGCTGAGGACACATTGCAAGCACAAGGAGAGATTTCTAATGATGTGGAAGTGGTGAAAGACCAGTTTCATACTCATGAGGGGTACATGATGGATTTGACAGCCCATCAGGGCCGGGTTGGTAATATTCTACAATTGGGAAGTAAGCTGATTGGAACAGGAAAATTATCAGAAGATGAAGAAACTGAAGTACAAGAGCAGATGAATCTCCTAAATTCAAGATGGGAATGCCTCAGGGTAGCTAGCATGGAAAAACAAAGCAATTTACATAGA
R2	27	GTTTTAATGGATCTCCAGAATCAGAAACTGAAAGAGTTGAATGACTGGCTAACAAAAACAGAAGAAAGAACAAGGAAAATGGAGGAAGAGCCTCTTGGACCTGATCTTGAAGACCTAAAACGCCAAGTACAACAACATAAGGTGCTTCAAGAAGATCTAGAACAAGAACAAGTCAGGGTCAATTCTCTCACTCACATGGTGGTGGTAGTTGATGAATCTAGTGGAGATCACGCAACTGCTGCTTTGGAAGAACAACTTAAGGTATTGGGAGATCGATGGGCAAACATCTGTAGATGGACAGAAGACCGCTGGGTTCTTTTACAAGAC
L3	28	ATCCTT
R3	29	CTCAAATGGCAACGTCTTACTGAAGAACAGTGCCTTTTTAGTGCATGGCTTTCAGAAAAAGAAGATGCAGTGAACAAGATTCACACAACTGGCTTTAAAGATCAAAATGAAATGTTATCAAGTCTTCAAAAACTGGCCGTTTTAAAAGCGGATCTAGAAAAGAAAAAGCAATCCATGGGCAAACTGTATTCACTCAAACAAGATCTTCTTTCAACACTGAAGAATAAGTCAGTGACCCAGAAGACGGAAGCATGGCTGGATAACTTTGCCCGGTGTTGGGATAATTTAGTCCAAAAACTTGAAAAGAGTACAGCACAGATTTCACAG
R16	94	gaaatttcttatgtgccttctacttatttgactgaaatcactcatgtctcacaagccctattagaagtggaacaacttctcaatgctcctgacctctgtgctaaggactttgaagatctctttaagcaagaggagtctctgaagaatataaaagatagtctacaacaaagctcaggtcggattgacattattcatagcaagaagacagcagcattgcaaagtgcaacgcctgtggaaagggtgaagctacaggaagctctctcccagcttgatttccaatgggaaaaagttaacaaaatgtacaaggaccgacaagggcgatttgacaga
L4.1	107	TCTGTT
R17	95	gagaaatggcggcgttttcattatgatataaagatatttaatcagtggctaacagaagctgaacagtttctcagaaagacacaaattcctgagaattgggaacatgctaaatacaaatggtatcttaaggaactccaggatggcattgggcagcggcaaactgttgtcagaacattgaatgcaactggggaagaaataattcagcaatcctcaaaaacagatgccagtattctacaggaaaaattgggaagcctgaatctgcggtggcaggaggtctgcaaacagctgtcagacagaaaaaagaggctagaa
R16-R17	96	gaaatttcttatgtgccttctacttatttgactgaaatcactcatgtctcacaagccctattagaagtggaacaacttctcaatgctcctgacctctgtgctaaggactttgaagatctctttaagcaagaggagtctctgaagaatataaaagatagtctacaacaaagctcaggtcggattgacattattcatagcaagaagacagcagcattgcaaagtgcaacgcctgtggaaagggtgaagctacaggaagctctctcccagcttgatttccaatgggaaaaagttaacaaaatgtacaaggaccgacaagggcgatttgacagaTCTGTTgagaaatggcggcgttttcattatgatataaagatatttaatcagtggctaacagaagctgaacagtttctcagaaagacacaaattcctgagaattgggaacatgctaaatacaaatggtatcttaaggaactccaggatggcattgggcagcggcaaactgttgtcagaacattgaatgcaactggggaagaaataattcagcaatcctcaaaaacagatgccagtattctacaggaaaaattgggaagcctgaatctgcggtggcaggaggtctgcaaacagctgtcagacagaaaaaagaggctagaa
L4.2	108	CAAACCCTTGAA
H3	30	CAGCCTGACCTAGCTCCTGGACTGACCACTATTGGAGCCTCTCCTACTCAGACTGTTACTCTGGTGACACAACCTGTGGTTACTAAGGAAACTGCCATCTCCAAACTAGAAATGCCATCTTCCTTGATGTTGGAGGTACCT
L4	31	ACCCTTGAA
R24	32	AGACTCCAACTTCAAGAGGCCACGGATGAGCTGGACCTCAAGCTGCGCCAAGCTGAGGTGATCAAGGGATCCTGGCAGCCCGTGGGCGATCTCCTCATTGACTCTCTCCAAGATCACCTCGAGAAAGTCAAGGCACTTCGAGGAGAAATTGCGCCTCTGAAAGAGAACGTGAGCCACGTCAATGACCTTGCTCGCCAGCTTACCACTTTGGGCATTCAGCTCTCACCGTATAACCTCAGCACTCTGGAAGACCTGAACACCAGATGGAAGCTTCTGCAGGTGGCCGTCGAGGACCGAGTCAGGCAGCTGCATGAA
H4	33	GCCCACAGGGACTTTGGTCCAGCATCTCAGCACTTTCTTTCCACGTCTGTCCAGGGTCCCTGGGAGAGAGCCATCTCGCCAAACAAAGTGCCCTACTATATCAACCACGAGACTCAAACAACTTGCTGGGACCATCCCAAAATGACAGAGCTCTACCAGTCTTTAGCTGACCTGAATAATGTCAGATTCTCAGCTTATAGGACTGCCATGAAACTC
富含半胱胺酸之域(CR)	34	CGAAGACTGCAGAAGGCCCTTTGCTTGGATCTCTTGAGCCTGTCAGCTGCATGTGATGCCTTGGACCAGCACAACCTCAAGCAAAATGACCAGCCCATGGATATCCTGCAGATTATTAATTGTTTGACCACTATTTATGACCGCCTGGAGCAAGAGCACAACAATTTGGTCAACGTCCCTCTCTGCGTGGATATGTGTCTGAACTGGCTGCTGAATGTTTATGATACGGGACGAACAGGGAGGATCCGTGTCCTGTCTTTTAAAACTGGCATCATTTCCCTGTGTAAAGCACATTTGGAAGACAAGTACAGATACCTTTTCAAGCAAGTGGCAAGTTCAACAGGATTTTGTGACCAGCGCAGGCTGGGCCTCCTTCTGCATGATTCTATCCAAATTCCAAGACAGTTGGGTGAAGTTGCATCCTTTGGGGGCAGTAACATTGAGCCAAGTGTCCGGAGCTGCTTCCAATTTGCTAATAATAAGCCAGAGATCGAAGCGGCCCTCTTCCTAGACTGGATGAGACTGGAACCCCAGTCCATGGTGTGGCTGCCCGTCCTGCACAGAGTGGCTGCTGCAGAAACTGCCAAGCATCAGGCCAAATGTAACATCTGCAAAGAGTGTCCAATCATTGGATTCAGGTACAGGAGTCTAAAGCACTTTAATTATGACATCTGCCAAAGCTGCTTTTTTTCTGGTCGAGTTGCAAAAGGCCATAAAATGCACTATCCCATGGTGGAATATTGC
CR短	109	gccaagcatcaggccaaatgtaacatctgcaaagagtgtccaatcattggattcaggtacaggagtctaaagcactttaattatgacatctgccaaagctgctttttttctggtcgagttgcaaaaggccataaaatgcactatcccatggtggaatattgc
C端(CT)域	35	ACTCCGACTACATCAGGAGAAGATGTTCGAGACTTTGCCAAGGTACTAAAAAACAAATTTCGAACCAAAAGGTATTTTGCGAAGCATCCCCGAATGGGCTACCTGCCAGTGCAGACTGTCTTAGAGGGGGACAACATGGAAACTCCCGTTACTCTGATCAACTTCTGGCCAGTAGATTCTGCGCCTGCCTCGTCCCCTCAGCTTTCACACGATGATACTCATTCACGCATTGAACATTATGCTAGCAGGCTAGCAGAAATGGAAAACAGCAATGGATCTTATCTAAATGATAGCATCTCTCCTAATGAGAGCATAGATGATGAACATTTGTTAATCCAGCATTACTGCCAAAGTTTGAACCAGGACTCCCCCCTGAGCCAGCCTCGTAGTCCTGCCCAGATCTTGATTTCCTTAGAGAGTGAGGAAAGAGGGGAGCTAGAGAGAATCCTAGCAGATCTTGAGGAAGAAAACAGGAATCTGCAAGCAGAATATGACCGTCTAAAGCAGCAGCACGAACATAAAGGCCTGTCCCCACTGCCGTCCCCTCCTGAAATGATGCCCACCTCTCCCCAGAGTCCCCGG
L4	36	GAGACCCTTGAA
L4	37	CTTGAA
H2	38	CCATCACTAACACAGACAACTGTAATGGAAACAGTAACTACGGTGACCACAAGGGAACAGATCCTGGTAAAGCATGCTCAAGAGGAACTTCCACCACCACCTCCCCAAAAGAAGAGGCAGATTACTGTGGAT

表 4 ： RGX-DYS 區段核苷酸序列

結構	SEQ ID	核酸序列
ABD	57	ATGCTTTGGTGGGAAGAGGTGGAAGATTGCTATGAGAGGGAAGATGTGCAGAAGAAAACCTTCACCAAATGGGTCAATGCCCAGTTCAGCAAGTTTGGCAAGCAGCACATTGAGAACCTGTTCAGTGACCTGCAGGATGGCAGAAGGCTGCTGGATCTGCTGGAAGGCCTGACAGGCCAGAAGCTGCCTAAAGAGAAGGGCAGCACAAGAGTGCATGCCCTGAACAATGTGAACAAGGCCCTGAGAGTGCTGCAGAACAACAATGTGGACCTGGTCAATATTGGCAGCACAGACATTGTGGATGGCAACCACAAGCTGACCCTGGGCCTGATCTGGAACATCATCCTGCACTGGCAAGTGAAGAATGTGATGAAGAACATCATGGCTGGCCTGCAGCAGACCAACTCTGAGAAGATCCTGCTGAGCTGGGTCAGACAGAGCACCAGAAACTACCCTCAAGTGAATGTGATCAACTTCACCACCTCTTGGAGTGATGGACTGGCCCTGAATGCCCTGATCCACAGCCACAGACCTGACCTGTTTGACTGGAACTCTGTTGTGTGCCAGCAGTCTGCCACACAGAGACTGGAACATGCCTTCAACATTGCCAGATACCAGCTGGGAATTGAGAAACTGCTGGACCCTGAGGATGTGGACACCACCTATCCTGACAAGAAATCCATCCTCATGTACATCACCAGCCTGTTCCAGGTGCTGCCC
L1	58	CAGCAAGTGTCCATTGAGGCCATTCAAGAGGTTGAG
H1	59	ATGCTGCCCAGACCTCCTAAAGTGACCAAAGAGGAACACTTCCAGCTGCACCACCAGATGCACTACTCTCAGCAGATCACAGTGTCTCTGGCCCAGGGATATGAGAGAACAAGCAGCCCCAAGCCTAGGTTCAAGAGCTATGCCTACACACAGGCTGCCTATGTGACCACATCTGACCCCACAAGAAGCCCATTTCCAAGCCAGCATCTGGAAGCCCCTGAGGAC
L2	60	AAGAGCTTTGGCAGCAGCCTGATGGAA
R1	61	TCTGAAGTGAACCTGGATAGATACCAGACAGCCCTGGAAGAAGTGCTGTCCTGGCTGCTGTCTGCTGAGGATACACTGCAGGCTCAGGGTGAAATCAGCAATGATGTGGAAGTGGTCAAGGACCAGTTTCACACCCATGAGGGCTACATGATGGACCTGACAGCCCACCAGGGCAGAGTGGGAAATATCCTGCAGCTGGGCTCCAAGCTGATTGGCACAGGCAAGCTGTCTGAGGATGAAGAGACAGAGGTGCAAGAGCAGATGAACCTGCTGAACAGCAGATGGGAGTGTCTGAGAGTGGCCAGCATGGAAAAGCAGAGCAACCTGCACAGA
R2	62	GTGCTCATGGACCTGCAGAATCAGAAACTGAAAGAACTGAATGACTGGCTGACCAAGACAGAAGAAAGGACTAGGAAGATGGAAGAGGAACCTCTGGGACCAGACCTGGAAGATCTGAAAAGACAGGTGCAGCAGCATAAGGTGCTGCAAGAGGACCTTGAGCAAGAGCAAGTCAGAGTGAACAGCCTGACACACATGGTGGTGGTTGTGGATGAGTCCTCTGGGGATCATGCCACAGCTGCTCTGGAAGAACAGCTGAAGGTGCTGGGAGACAGATGGGCCAACATCTGTAGGTGGACAGAGGATAGATGGGTGCTGCTCCAGGAC
L3	63	ATTCTG
R3	64	CTGAAGTGGCAGAGACTGACAGAGGAACAGTGCCTGTTTTCTGCCTGGCTCTCTGAGAAAGAGGATGCTGTCAACAAGATCCATACCACAGGCTTCAAGGATCAGAATGAGATGCTCAGCTCCCTGCAGAAACTGGCTGTGCTGAAGGCTGACCTGGAAAAGAAAAAGCAGTCCATGGGCAAGCTCTACAGCCTGAAGCAGGACCTGCTGTCTACCCTGAAGAACAAGTCTGTGACCCAGAAAACTGAGGCCTGGCTGGACAACTTTGCTAGATGCTGGGACAACCTGGTGCAGAAGCTGGAAAAGTCTACAGCCCAGATCAGCCAG
H3	65	CAACCTGATCTTGCCCCTGGCCTGACCACAATTGGAGCCTCTCCAACACAGACTGTGACCCTGGTTACCCAGCCAGTGGTCACCAAAGAGACAGCCATCAGCAAACTGGAAATGCCCAGCTCTCTGATGCTGGAAGTCCCC
L4	66	ACACTGGAA
R16	97	GAGATCAGCTATGTGCCCAGCACCTACCTGACAGAGATCACCCATGTGTCTCAGGCCCTGCTGGAAGTGGAACAGCTGCTGAATGCCCCTGACCTGTGTGCCAAGGACTTTGAGGACCTGTTCAAGCAAGAGGAAAGCCTGAAGAACATCAAGGACAGCCTGCAGCAGTCCTCTGGCAGAATTGACATCATCCACAGCAAGAAAACAGCTGCCCTGCAGTCTGCCACACCTGTGGAAAGAGTGAAGCTGCAAGAGGCCCTGAGCCAGCTGGACTTCCAGTGGGAGAAAGTGAACAAGATGTACAAGGACAGGCAGGGCAGATTTGATAGA
L4.1	125	AGTGTG
R17	98	GAAAAGTGGAGAAGGTTCCACTATGACATCAAGATCTTCAACCAGTGGCTGACAGAGGCTGAGCAGTTCCTGAGAAAGACACAGATCCCTGAGAACTGGGAGCATGCCAAGTACAAGTGGTATCTGAAAGAACTGCAGGATGGCATTGGCCAGAGACAGACAGTTGTCAGAACCCTGAATGCCACAGGGGAAGAGATCATCCAGCAGAGCAGCAAGACAGATGCCAGCATCCTGCAAGAGAAGCTGGGCAGCCTGAACCTGAGATGGCAAGAAGTGTGCAAGCAGCTGTCTGACAGAAAGAAGAGGCTGGAAGAA
R16-R17	99	GAGATCAGCTATGTGCCCAGCACCTACCTGACAGAGATCACCCATGTGTCTCAGGCCCTGCTGGAAGTGGAACAGCTGCTGAATGCCCCTGACCTGTGTGCCAAGGACTTTGAGGACCTGTTCAAGCAAGAGGAAAGCCTGAAGAACATCAAGGACAGCCTGCAGCAGTCCTCTGGCAGAATTGACATCATCCACAGCAAGAAAACAGCTGCCCTGCAGTCTGCCACACCTGTGGAAAGAGTGAAGCTGCAAGAGGCCCTGAGCCAGCTGGACTTCCAGTGGGAGAAAGTGAACAAGATGTACAAGGACAGGCAGGGCAGATTTGATAGAAGTGTGGAAAAGTGGAGAAGGTTCCACTATGACATCAAGATCTTCAACCAGTGGCTGACAGAGGCTGAGCAGTTCCTGAGAAAGACACAGATCCCTGAGAACTGGGAGCATGCCAAGTACAAGTGGTATCTGAAAGAACTGCAGGATGGCATTGGCCAGAGACAGACAGTTGTCAGAACCCTGAATGCCACAGGGGAAGAGATCATCCAGCAGAGCAGCAAGACAGATGCCAGCATCCTGCAAGAGAAGCTGGGCAGCCTGAACCTGAGATGGCAAGAAGTGTGCAAGCAGCTGTCTGACAGAAAGAAGAGGCTGGAAGAA
L4.2	126	CAGACACTGGAA
R24	67	AGGCTGCAAGAACTTCAAGAGGCCACAGATGAGCTGGACCTGAAGCTGAGACAGGCTGAAGTGATCAAAGGCAGCTGGCAGCCAGTTGGGGACCTGCTCATTGATAGCCTGCAGGACCATCTGGAAAAAGTGAAAGCCCTGAGGGGAGAGATTGCCCCTCTGAAAGAAAATGTGTCCCATGTGAATGACCTGGCCAGACAGCTGACCACACTGGGAATCCAGCTGAGCCCCTACAACCTGAGCACCCTTGAGGACCTGAACACCAGGTGGAAGCTCCTCCAGGTGGCAGTGGAAGATAGAGTCAGGCAGCTGCATGAG
H4	68	GCCCACAGAGATTTTGGACCAGCCAGCCAGCACTTTCTGTCTACCTCTGTGCAAGGCCCCTGGGAGAGAGCTATCTCTCCTAACAAGGTGCCCTACTACATCAACCATGAGACACAGACCACCTGTTGGGATCACCCCAAGATGACAGAGCTGTACCAGAGTCTGGCAGACCTCAACAATGTCAGATTCAGTGCCTACAGGACTGCCATGAAGCTC
富含半胱胺酸之域(CR)	69	AGAAGGCTCCAGAAAGCTCTGTGCCTGGACCTGCTTTCCCTGAGTGCAGCTTGTGATGCCCTGGACCAGCACAATCTGAAGCAGAATGACCAGCCTATGGACATCCTCCAGATCATCAACTGCCTCACCACCATCTATGATAGGCTGGAACAAGAGCACAACAATCTGGTCAATGTGCCCCTGTGTGTGGACATGTGCCTGAATTGGCTGCTGAATGTGTATGACACAGGCAGAACAGGCAGGATCAGAGTCCTGTCCTTCAAGACAGGCATCATCTCCCTGTGCAAAGCCCACTTGGAGGACAAGTACAGATACCTGTTCAAGCAAGTGGCCTCCAGCACAGGCTTTTGTGACCAGAGAAGGCTGGGCCTGCTCCTGCATGACAGCATTCAGATCCCTAGACAGCTGGGAGAAGTGGCTTCCTTTGGAGGCAGCAATATTGAGCCATCAGTCAGGTCCTGTTTTCAGTTTGCCAACAACAAGCCTGAGATTGAGGCTGCCCTGTTCCTGGACTGGATGAGACTTGAGCCTCAGAGCATGGTCTGGCTGCCTGTGCTTCATAGAGTGGCTGCTGCTGAGACTGCCAAGCACCAGGCCAAGTGCAACATCTGCAAAGAGTGCCCCATCATTGGCTTCAGATACAGATCCCTGAAGCACTTCAACTATGATATCTGCCAGAGCTGCTTCTTTAGTGGCAGGGTTGCCAAGGGCCACAAAATGCACTACCCCATGGTGGAATACTGC
CR短(DYS6)	100	GCCAAGCACCAGGCCAAGTGCAACATCTGCAAAGAGTGCCCCATCATTGGCTTCAGATACAGATCCCTGAAGCACTTCAACTATGATATCTGCCAGAGCTGCTTCTTTAGTGGCAGGGTTGCCAAGGGCCACAAAATGCACTACCCCATGGTGGAATACTGC
C端(CT)域 (DYS1、DYS2、DYS4、DYS6)	70	ACCCCAACAACCTCTGGGGAAGATGTTAGAGACTTTGCCAAGGTGCTGAAAAACAAGTTCAGGACCAAGAGATACTTTGCTAAGCACCCCAGAATGGGCTACCTGCCTGTCCAGACAGTGCTTGAGGGTGACAACATGGAAACCCCTGTGACACTGATCAATTTCTGGCCAGTGGACTCTGCCCCTGCCTCAAGTCCACAGCTGTCCCATGATGACACCCACAGCAGAATTGAGCACTATGCCTCCAGACTGGCAGAGATGGAAAACAGCAATGGCAGCTACCTGAATGATAGCATCAGCCCCAATGAGAGCATTGATGATGAGCATCTGCTGATCCAGCACTACTGTCAGTCCCTGAACCAGGACTCTCCACTGAGCCAGCCTAGAAGCCCTGCTCAGATCCTGATCAGCCTTGAGTCTGAGGAAAGGGGAGAGCTGGAAAGAATCCTGGCAGATCTTGAGGAAGAGAACAGAAACCTGCAGGCAGAGTATGACAGGCTCAAACAGCAGCATGAGCACAAGGGACTGAGCCCTCTGCCTTCTCCTCCTGAAATGATGCCCACCTCTCCACAGTCTCCAAGGTGATGA (終止密碼子加下劃線)
最小C端(CT1.5) 域(DYS5、DYS7)	80	ACCCCAACAACCTCTGGGGAAGATGTTAGAGACTTTGCCAAGGTGCTGAAAAACAAGTTCAGGACCAAGAGATACTTTGCTAAGCACCCCAGAATGGGCTACCTGCCTGTCCAGACAGTGCTTGAGGGTGACAACATGGAAACCCCTGTGACACTGATCAATTTCTGGCCAGTGGACTCTGCCCCTGCCTCAAGTCCACAGCTGTCCCATGATGACACCCACAGCAGAATTGAGCACTATGCCTCCAGACTGGCAGAGATGGAAAACAGCAATGGCAGCTACCTGAATGATAGCATCAGCCCCAATGAGAGCATTGATGATGAGCATCTGCTGATCCAGCACTACTGTCAGTCCCTGAACCAGGACTCTCCACTGAGCCAGCCTAGAAGCCCTGCTCAGATCCTGATCAGCCTTGAGTCTTGATGA (終止密碼子加下劃線)
L4	71	GAAACACTGGAA或GAGACACTGGAA
L4	72	CTGGAA

在一些實施例中，該等組合物包含編碼ABD1之核酸序列，其由SEQ ID NO: 22或與SEQ ID NO: 22具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成；編碼H1之核酸序列，其由SEQ ID NO: 24或與SEQ ID NO: 24具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成；編碼R1之核酸序列，其由SEQ ID NO: 26或與SEQ ID NO: 26具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成；編碼R2之核酸序列，其由SEQ ID NO: 27或與SEQ ID NO: 27具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成；編碼R3之核酸序列，其由SEQ ID NO: 29或與SEQ ID NO: 29具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成；編碼H3之核酸序列，其由SEQ ID NO: 30或與SEQ ID NO: 30具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成；編碼R24之核酸序列，其由SEQ ID NO: 32或與SEQ ID NO: 32具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成；編碼H4之核酸序列，其由SEQ ID NO: 33或與SEQ ID NO: 33具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成；編碼CR之核酸序列，其由SEQ ID NO: 34或109或與SEQ ID NO: 34或109具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成；及/或編碼CT之核酸序列，其由SEQ ID NO: 35或與SEQ ID NO: 35具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成，其編碼具有功能活性之微小肌縮蛋白。替代實施例與上述相同，惟H3核酸序列經編碼H2之核酸置換，該編碼H2之核酸由SEQ ID NO: 38或與SEQ ID NO: 38具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成，其同樣編碼具有功能活性之微小肌縮蛋白。

在一些實施例中，該等組合物包含編碼ABD1之核酸序列，其由SEQ ID NO: 22或與SEQ ID NO: 22具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成且編碼SEQ ID NO: 3之ABD1域；編碼H1之核酸序列，其由SEQ ID NO: 24或與SEQ ID NO: 24具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成且編碼SEQ ID NO: 5之H1域；編碼R1之核酸序列，其由SEQ ID NO: 26或與SEQ ID NO: 26具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成且編碼SEQ ID NO: 7之R1域；編碼R2之核酸序列，其由SEQ ID NO: 27或與SEQ ID NO: 27具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成且編碼SEQ ID NO: 8之R2域；編碼R3之核酸序列，其由SEQ ID NO: 29或與SEQ ID NO: 29具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成且編碼SEQ ID NO: 10之R3域；編碼H3之核酸序列，其由SEQ ID NO: 30或與SEQ ID NO: 30具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成且編碼SEQ ID NO: 11之H3域；編碼R24之核酸序列，其由SEQ ID NO: 32或與SEQ ID NO: 32具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成且編碼SEQ ID NO: 13之R24域；編碼H4之核酸序列，其由SEQ ID NO: 33或與SEQ ID NO: 33具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成且編碼SEQ ID NO: 14之H4域；編碼CR之核酸序列，其由SEQ ID NO: 34或109或與SEQ ID NO: 34或109具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成且編碼SEQ ID NO: 15或90之CR域；及/或編碼CT之核酸序列，其由SEQ ID NO: 35或80或與SEQ ID NO: 35或80具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成且編碼SEQ ID NO: 16或83之CT域。替代實施例與上述相同，惟H3核酸序列由編碼H2之核酸置換，該編碼H2之核酸由SEQ ID NO: 38或與SEQ ID NO: 38具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成且編碼SEQ ID NO: 19之H2域。

除了上述之外，核酸組合物亦可在上述位置中視情況包含編碼連接體之核苷酸序列，其包含如下序列或由其組成：編碼L1之核酸序列，其由SEQ ID NO: 23或與SEQ ID NO: 23具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之序列組成(例如編碼SEQ ID NO: 4之L1域)；編碼L2之核酸序列，其由SEQ ID NO: 25或與SEQ ID NO: 25具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之序列組成(例如編碼SEQ ID NO: 6之L2域)；編碼L3之核酸序列，其由SEQ ID NO: 28或與SEQ ID NO: 28具有至少50%一致性之序列組成，編碼SEQ ID NO: 9之L3域，或對兩個L3殘基進行保守取代之變體；及編碼L4之核酸序列，其由SEQ ID NO: 31、36或37或與SEQ ID NO: 31、36或37具有至少50%、至少75%序列一致性之序列組成(例如編碼SEQ ID NO: 12、17或18之L4域或對L4殘基中之任一者進行保守取代之變體)。

在一些實施例中，該等組合物包含編碼ABD1之核酸序列，其由SEQ ID NO: 22或與SEQ ID NO: 22具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成；編碼H1之核酸序列，其由SEQ ID NO: 24或與SEQ ID NO: 24具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成；編碼R1之核酸序列，其由SEQ ID NO: 26或與SEQ ID NO: 26具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成；編碼R2之核酸序列，其由SEQ ID NO: 27或與SEQ ID NO: 27具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成；編碼R16之核酸序列，其由SEQ ID NO: 94或與SEQ ID NO: 94具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成；編碼R17之核酸序列，其由SEQ ID NO: 95或與SEQ ID NO: 95具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成；編碼R24之核酸序列，其由SEQ ID NO: 32或與SEQ ID NO: 32具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成；編碼H4之核酸序列，其由SEQ ID NO: 33或與SEQ ID NO: 33具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成；編碼CR之核酸序列，其由SEQ ID NO: 34或109或與SEQ ID NO: 34或109具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成；及/或編碼CT之核酸序列，其由SEQ ID NO: 35或與SEQ ID NO: 35具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成，其編碼具有功能活性之微小肌縮蛋白。替代實施例與上述相同，惟H3核酸序列經編碼H2之核酸置換，該編碼H2之核酸由SEQ ID NO: 38或與SEQ ID NO: 38具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成，其同樣編碼具有功能活性之微小肌縮蛋白。

在一些實施例中，該等組合物包含編碼ABD1之核酸序列，其由SEQ ID NO: 22或與SEQ ID NO: 22具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成且編碼SEQ ID NO: 3之ABD1域；編碼H1之核酸序列，其由SEQ ID NO: 24或與SEQ ID NO: 24具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成且編碼SEQ ID NO: 5之H1域；編碼R1之核酸序列，其由SEQ ID NO: 26或與SEQ ID NO: 26具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成且編碼SEQ ID NO: 7之R1域；編碼R2之核酸序列，其由SEQ ID NO: 27或與SEQ ID NO: 27具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成且編碼SEQ ID NO: 8之R2域；編碼R16之核酸序列，其由SEQ ID NO: 94或與SEQ ID NO: 94具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成且編碼SEQ ID NO: 86之R16域；編碼R17之核酸序列，其由SEQ ID NO: 95或與SEQ ID NO: 95具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成且編碼SEQ ID NO: 87之R17域；編碼R24之核酸序列，其由SEQ ID NO: 32或與SEQ ID NO: 32具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成且編碼SEQ ID NO: 13之R24域；編碼H4之核酸序列，其由SEQ ID NO: 33或與SEQ ID NO: 33具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成且編碼SEQ ID NO: 14之H4域；編碼CR之核酸序列，其由SEQ ID NO: 34或109或與SEQ ID NO: 34或109具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成且編碼SEQ ID NO: 15或90之CR域；及/或編碼CT之核酸序列，其由SEQ ID NO: 35或80或與SEQ ID NO: 35或80具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成且編碼SEQ ID NO: 16或83之CT域。替代實施例與上述相同，但H3核酸序列由編碼H2之核酸置換，該編碼H2之核酸由SEQ ID NO: 38或與SEQ ID NO: 38具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成且編碼SEQ ID NO: 19之H2域。

除了上述之外，核酸組合物亦可在上述位置中視情況包含編碼連接體之核苷酸序列，其包含如下序列或由其組成：編碼L1之核酸序列，其由SEQ ID NO: 23或與SEQ ID NO: 23具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之序列組成(例如編碼SEQ ID NO: 4之L1域)；編碼L2之核酸序列，其由SEQ ID NO: 25或與SEQ ID NO: 25具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之序列組成(例如編碼SEQ ID NO: 6之L2域)；編碼L3之核酸序列，其由SEQ ID NO: 28或與SEQ ID NO: 28具有至少50%一致性之序列組成，其編碼SEQ ID NO: 9之L3域，或對兩個L3殘基進行保守取代之變體；編碼L4.1之核酸序列，其由SEQ ID NO: 125或與SEQ ID NO: 125具有至少50%、至少75%序列一致性之序列組成(例如編碼SEQ ID NO: 110之L4.1域或對L4.1殘基中之任一者進行保守取代之變體)；及編碼L4.2之核酸序列，其由SEQ ID NO: 126或與SEQ ID NO: 126具有至少50%、至少75%序列一致性之序列組成(例如編碼SEQ ID NO: 89之L4.2域或對L4.2殘基中之任一者進行保守取代之變體)。

在各個實施例中，核酸包含編碼微小肌縮蛋白之核苷酸序列，該微小肌縮蛋白具有SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 92或SEQ ID NO: 93之胺基酸序列。在實施例中，核酸包含核苷酸序列，其係SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 102或SEQ ID NO: 103 (分別編碼SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 92及SEQ ID NO: 93之微小肌縮蛋白)。在各個實施例中，編碼微小肌縮蛋白之核苷酸序列可與SEQ ID NO: 20、21、83、101、102或103之核苷酸序列(表5)或其反向互補體具有至少50%、至少60%、至少70 %、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性且編碼治療有效之微小肌縮蛋白。表 5 ： RGX-DYS 構築體核苷酸序列

結構	SEQ ID	核酸序列
DYS1、DYS2及DYS4	20	ATGCTTTGGTGGGAAGAGGTGGAAGATTGCTATGAGAGGGAAGATGTGCA GAAGAAAACCTTCACCAAATGGGTCAATGCCCAGTTCAGCAAGTTTGGCA AGCAGCACATTGAGAACCTGTTCAGTGACCTGCAGGATGGCAGAAGGCTG CTGGATCTGCTGGAAGGCCTGACAGGCCAGAAGCTGCCTAAAGAGAAGGG CAGCACAAGAGTGCATGCCCTGAACAATGTGAACAAGGCCCTGAGAGTGC TGCAGAACAACAATGTGGACCTGGTCAATATTGGCAGCACAGACATTGTG GATGGCAACCACAAGCTGACCCTGGGCCTGATCTGGAACATCATCCTGCA CTGGCAAGTGAAGAATGTGATGAAGAACATCATGGCTGGCCTGCAGCAGA CCAACTCTGAGAAGATCCTGCTGAGCTGGGTCAGACAGAGCACCAGAAAC TACCCTCAAGTGAATGTGATCAACTTCACCACCTCTTGGAGTGATGGACT GGCCCTGAATGCCCTGATCCACAGCCACAGACCTGACCTGTTTGACTGGA ACTCTGTTGTGTGCCAGCAGTCTGCCACACAGAGACTGGAACATGCCTTC AACATTGCCAGATACCAGCTGGGAATTGAGAAACTGCTGGACCCTGAGGA TGTGGACACCACCTATCCTGACAAGAAATCCATCCTCATGTACATCACCA GCCTGTTCCAGGTGCTGCCCCAGCAAGTGTCCATTGAGGCCATTCAAGAG GTTGAGATGCTGCCCAGACCTCCTAAAGTGACCAAAGAGGAACACTTCCA GCTGCACCACCAGATGCACTACTCTCAGCAGATCACAGTGTCTCTGGCCC AGGGATATGAGAGAACAAGCAGCCCCAAGCCTAGGTTCAAGAGCTATGCC TACACACAGGCTGCCTATGTGACCACATCTGACCCCACAAGAAGCCCATT TCCAAGCCAGCATCTGGAAGCCCCTGAGGACAAGAGCTTTGGCAGCAGCC TGATGGAATCTGAAGTGAACCTGGATAGATACCAGACAGCCCTGGAAGAA GTGCTGTCCTGGCTGCTGTCTGCTGAGGATACACTGCAGGCTCAGGGTGA AATCAGCAATGATGTGGAAGTGGTCAAGGACCAGTTTCACACCCATGAGG GCTACATGATGGACCTGACAGCCCACCAGGGCAGAGTGGGAAATATCCTG CAGCTGGGCTCCAAGCTGATTGGCACAGGCAAGCTGTCTGAGGATGAAGA GACAGAGGTGCAAGAGCAGATGAACCTGCTGAACAGCAGATGGGAGTGTC TGAGAGTGGCCAGCATGGAAAAGCAGAGCAACCTGCACAGAGTGCTCATG GACCTGCAGAATCAGAAACTGAAAGAACTGAATGACTGGCTGACCAAGAC AGAAGAAAGGACTAGGAAGATGGAAGAGGAACCTCTGGGACCAGACCTGG AAGATCTGAAAAGACAGGTGCAGCAGCATAAGGTGCTGCAAGAGGACCTT GAGCAAGAGCAAGTCAGAGTGAACAGCCTGACACACATGGTGGTGGTTGT GGATGAGTCCTCTGGGGATCATGCCACAGCTGCTCTGGAAGAACAGCTGA AGGTGCTGGGAGACAGATGGGCCAACATCTGTAGGTGGACAGAGGATAGA TGGGTGCTGCTCCAGGACATTCTGCTGAAGTGGCAGAGACTGACAGAGGA ACAGTGCCTGTTTTCTGCCTGGCTCTCTGAGAAAGAGGATGCTGTCAACA AGATCCATACCACAGGCTTCAAGGATCAGAATGAGATGCTCAGCTCCCTG CAGAAACTGGCTGTGCTGAAGGCTGACCTGGAAAAGAAAAAGCAGTCCAT GGGCAAGCTCTACAGCCTGAAGCAGGACCTGCTGTCTACCCTGAAGAACA AGTCTGTGACCCAGAAAACTGAGGCCTGGCTGGACAACTTTGCTAGATGC TGGGACAACCTGGTGCAGAAGCTGGAAAAGTCTACAGCCCAGATCAGCCA GCAACCTGATCTTGCCCCTGGCCTGACCACAATTGGAGCCTCTCCAACAC AGACTGTGACCCTGGTTACCCAGCCAGTGGTCACCAAAGAGACAGCCATC AGCAAACTGGAAATGCCCAGCTCTCTGATGCTGGAAGTCCCCACACTGGA AAGGCTGCAAGAACTTCAAGAGGCCACAGATGAGCTGGACCTGAAGCTGA GACAGGCTGAAGTGATCAAAGGCAGCTGGCAGCCAGTTGGGGACCTGCTC ATTGATAGCCTGCAGGACCATCTGGAAAAAGTGAAAGCCCTGAGGGGAGA GATTGCCCCTCTGAAAGAAAATGTGTCCCATGTGAATGACCTGGCCAGAC AGCTGACCACACTGGGAATCCAGCTGAGCCCCTACAACCTGAGCACCCTT GAGGACCTGAACACCAGGTGGAAGCTCCTCCAGGTGGCAGTGGAAGATAG AGTCAGGCAGCTGCATGAGGCCCACAGAGATTTTGGACCAGCCAGCCAGC ACTTTCTGTCTACCTCTGTGCAAGGCCCCTGGGAGAGAGCTATCTCTCCT AACAAGGTGCCCTACTACATCAACCATGAGACACAGACCACCTGTTGGGA TCACCCCAAGATGACAGAGCTGTACCAGAGTCTGGCAGACCTCAACAATG TCAGATTCAGTGCCTACAGGACTGCCATGAAGCTCAGAAGGCTCCAGAAA GCTCTGTGCCTGGACCTGCTTTCCCTGAGTGCAGCTTGTGATGCCCTGGA CCAGCACAATCTGAAGCAGAATGACCAGCCTATGGACATCCTCCAGATCA TCAACTGCCTCACCACCATCTATGATAGGCTGGAACAAGAGCACAACAAT CTGGTCAATGTGCCCCTGTGTGTGGACATGTGCCTGAATTGGCTGCTGAA TGTGTATGACACAGGCAGAACAGGCAGGATCAGAGTCCTGTCCTTCAAGA CAGGCATCATCTCCCTGTGCAAAGCCCACTTGGAGGACAAGTACAGATAC CTGTTCAAGCAAGTGGCCTCCAGCACAGGCTTTTGTGACCAGAGAAGGCT GGGCCTGCTCCTGCATGACAGCATTCAGATCCCTAGACAGCTGGGAGAAG TGGCTTCCTTTGGAGGCAGCAATATTGAGCCATCAGTCAGGTCCTGTTTT CAGTTTGCCAACAACAAGCCTGAGATTGAGGCTGCCCTGTTCCTGGACTG GATGAGACTTGAGCCTCAGAGCATGGTCTGGCTGCCTGTGCTTCATAGAG TGGCTGCTGCTGAGACTGCCAAGCACCAGGCCAAGTGCAACATCTGCAAA GAGTGCCCCATCATTGGCTTCAGATACAGATCCCTGAAGCACTTCAACTA TGATATCTGCCAGAGCTGCTTCTTTAGTGGCAGGGTTGCCAAGGGCCACA AAATGCACTACCCCATGGTGGAATACTGCACCCCAACAACCTCTGGGGAA GATGTTAGAGACTTTGCCAAGGTGCTGAAAAACAAGTTCAGGACCAAGAG ATACTTTGCTAAGCACCCCAGAATGGGCTACCTGCCTGTCCAGACAGTGC TTGAGGGTGACAACATGGAAACCCCTGTGACACTGATCAATTTCTGGCCA GTGGACTCTGCCCCTGCCTCAAGTCCACAGCTGTCCCATGATGACACCCA CAGCAGAATTGAGCACTATGCCTCCAGACTGGCAGAGATGGAAAACAGCA ATGGCAGCTACCTGAATGATAGCATCAGCCCCAATGAGAGCATTGATGAT GAGCATCTGCTGATCCAGCACTACTGTCAGTCCCTGAACCAGGACTCTCC ACTGAGCCAGCCTAGAAGCCCTGCTCAGATCCTGATCAGCCTTGAGTCTG AGGAAAGGGGAGAGCTGGAAAGAATCCTGGCAGATCTTGAGGAAGAGAAC AGAAACCTGCAGGCAGAGTATGACAGGCTCAAACAGCAGCATGAGCACAA GGGACTGAGCCCTCTGCCTTCTCCTCCTGAAATGATGCCCACCTCTCCAC AGTCTCCAAGGTGATGA
DYS3	21	ATGCTTTGGTGGGAAGAGGTGGAAGATTGCTATGAGAGGGAAGATGTGCA GAAGAAAACCTTCACCAAATGGGTCAATGCCCAGTTCAGCAAGTTTGGCA AGCAGCACATTGAGAACCTGTTCAGTGACCTGCAGGATGGCAGAAGGCTG CTGGATCTGCTGGAAGGCCTGACAGGCCAGAAGCTGCCTAAAGAGAAGGG CAGCACAAGAGTGCATGCCCTGAACAATGTGAACAAGGCCCTGAGAGTGC TGCAGAACAACAATGTGGACCTGGTCAATATTGGCAGCACAGACATTGTG GATGGCAACCACAAGCTGACCCTGGGCCTGATCTGGAACATCATCCTGCA CTGGCAAGTGAAGAATGTGATGAAGAACATCATGGCTGGCCTGCAGCAGA CCAACTCTGAGAAGATCCTGCTGAGCTGGGTCAGACAGAGCACCAGAAAC TACCCTCAAGTGAATGTGATCAACTTCACCACCTCTTGGAGTGATGGACT GGCCCTGAATGCCCTGATCCACAGCCACAGACCTGACCTGTTTGACTGGA ACTCTGTTGTGTGCCAGCAGTCTGCCACACAGAGACTGGAACATGCCTTC AACATTGCCAGATACCAGCTGGGAATTGAGAAACTGCTGGACCCTGAGGA TGTGGACACCACCTATCCTGACAAGAAATCCATCCTCATGTACATCACCA GCCTGTTCCAGGTGCTGCCCCAGCAAGTGTCCATTGAGGCCATTCAAGAG GTTGAGATGCTGCCCAGACCTCCTAAAGTGACCAAAGAGGAACACTTCCA GCTGCACCACCAGATGCACTACTCTCAGCAGATCACAGTGTCTCTGGCCC AGGGATATGAGAGAACAAGCAGCCCCAAGCCTAGGTTCAAGAGCTATGCC TACACACAGGCTGCCTATGTGACCACATCTGACCCCACAAGAAGCCCATT TCCAAGCCAGCATCTGGAAGCCCCTGAGGACAAGAGCTTTGGCAGCAGCC TGATGGAATCTGAAGTGAACCTGGATAGATACCAGACAGCCCTGGAAGAA GTGCTGTCCTGGCTGCTGTCTGCTGAGGATACACTGCAGGCTCAGGGTGA AATCAGCAATGATGTGGAAGTGGTCAAGGACCAGTTTCACACCCATGAGG GCTACATGATGGACCTGACAGCCCACCAGGGCAGAGTGGGAAATATCCTG CAGCTGGGCTCCAAGCTGATTGGCACAGGCAAGCTGTCTGAGGATGAAGA GACAGAGGTGCAAGAGCAGATGAACCTGCTGAACAGCAGATGGGAGTGTC TGAGAGTGGCCAGCATGGAAAAGCAGAGCAACCTGCACAGAGTGCTCATG GACCTGCAGAATCAGAAACTGAAAGAACTGAATGACTGGCTGACCAAGAC AGAAGAAAGGACTAGGAAGATGGAAGAGGAACCTCTGGGACCAGACCTGG AAGATCTGAAAAGACAGGTGCAGCAGCATAAGGTGCTGCAAGAGGACCTT GAGCAAGAGCAAGTCAGAGTGAACAGCCTGACACACATGGTGGTGGTTGT GGATGAGTCCTCTGGGGATCATGCCACAGCTGCTCTGGAAGAACAGCTGA AGGTGCTGGGAGACAGATGGGCCAACATCTGTAGGTGGACAGAGGATAGA TGGGTGCTGCTCCAGGACATTCTGCTGAAGTGGCAGAGACTGACAGAGGA ACAGTGCCTGTTTTCTGCCTGGCTCTCTGAGAAAGAGGATGCTGTCAACA AGATCCATACCACAGGCTTCAAGGATCAGAATGAGATGCTCAGCTCCCTG CAGAAACTGGCTGTGCTGAAGGCTGACCTGGAAAAGAAAAAGCAGTCCAT GGGCAAGCTCTACAGCCTGAAGCAGGACCTGCTGTCTACCCTGAAGAACA AGTCTGTGACCCAGAAAACTGAGGCCTGGCTGGACAACTTTGCTAGATGC TGGGACAACCTGGTGCAGAAGCTGGAAAAGTCTACAGCCCAGATCAGCCA GCAACCTGATCTTGCCCCTGGCCTGACCACAATTGGAGCCTCTCCAACAC AGACTGTGACCCTGGTTACCCAGCCAGTGGTCACCAAAGAGACAGCCATC AGCAAACTGGAAATGCCCAGCTCTCTGATGCTGGAAGTCCCCACACTGGA AAGGCTGCAAGAACTTCAAGAGGCCACAGATGAGCTGGACCTGAAGCTGA GACAGGCTGAAGTGATCAAAGGCAGCTGGCAGCCAGTTGGGGACCTGCTC ATTGATAGCCTGCAGGACCATCTGGAAAAAGTGAAAGCCCTGAGGGGAGA GATTGCCCCTCTGAAAGAAAATGTGTCCCATGTGAATGACCTGGCCAGAC AGCTGACCACACTGGGAATCCAGCTGAGCCCCTACAACCTGAGCACCCTT GAGGACCTGAACACCAGGTGGAAGCTCCTCCAGGTGGCAGTGGAAGATAG AGTCAGGCAGCTGCATGAGGCCCACAGAGATTTTGGACCAGCCAGCCAGC ACTTTCTGTCTACCTCTGTGCAAGGCCCCTGGGAGAGAGCTATCTCTCCT AACAAGGTGCCCTACTACATCAACCATGAGACACAGACCACCTGTTGGGA TCACCCCAAGATGACAGAGCTGTACCAGAGTCTGGCAGACCTCAACAATG TCAGATTCAGTGCCTACAGGACTGCCATGAAGCTCAGAAGGCTCCAGAAA GCTCTGTGCCTGGACCTGCTTTCCCTGAGTGCAGCTTGTGATGCCCTGGA CCAGCACAATCTGAAGCAGAATGACCAGCCTATGGACATCCTCCAGATCA TCAACTGCCTCACCACCATCTATGATAGGCTGGAACAAGAGCACAACAAT CTGGTCAATGTGCCCCTGTGTGTGGACATGTGCCTGAATTGGCTGCTGAA TGTGTATGACACAGGCAGAACAGGCAGGATCAGAGTCCTGTCCTTCAAGA CAGGCATCATCTCCCTGTGCAAAGCCCACTTGGAGGACAAGTACAGATAC CTGTTCAAGCAAGTGGCCTCCAGCACAGGCTTTTGTGACCAGAGAAGGCT GGGCCTGCTCCTGCATGACAGCATTCAGATCCCTAGACAGCTGGGAGAAG TGGCTTCCTTTGGAGGCAGCAATATTGAGCCATCAGTCAGGTCCTGTTTT CAGTTTGCCAACAACAAGCCTGAGATTGAGGCTGCCCTGTTCCTGGACTG GATGAGACTTGAGCCTCAGAGCATGGTCTGGCTGCCTGTGCTTCATAGAG TGGCTGCTGCTGAGACTGCCAAGCACCAGGCCAAGTGCAACATCTGCAAA GAGTGCCCCATCATTGGCTTCAGATACAGATCCCTGAAGCACTTCAACTA TGATATCTGCCAGAGCTGCTTCTTTAGTGGCAGGGTTGCCAAGGGCCACA AAATGCACTACCCCATGGTGGAATACTGCACCCCAACAACCTCTGGGGAA GATGTTAGAGACTTTGCCAAGGTGCTGAAAAACAAGTTCAGGACCAAGAG ATACTTTGCTAAGCACCCCAGAATGGGCTACCTGCCTGTCCAGACAGTGC TTGAGGGTGACAACATGGAAACC
DYS5	81	ATGCTTTGGTGGGAAGAGGTGGAAGATTGCTATGAGAGGGAAGATGTGCAGAAGAAAACCTTCACCAAATGGGTCAATGCCCAGTTCAGCAAGTTTGGCAAGCAGCACATTGAGAACCTGTTCAGTGACCTGCAGGATGGCAGAAGGCTGCTGGATCTGCTGGAAGGCCTGACAGGCCAGAAGCTGCCTAAAGAGAAGGGCAGCACAAGAGTGCATGCCCTGAACAATGTGAACAAGGCCCTGAGAGTGCTGCAGAACAACAATGTGGACCTGGTCAATATTGGCAGCACAGACATTGTGGATGGCAACCACAAGCTGACCCTGGGCCTGATCTGGAACATCATCCTGCACTGGCAAGTGAAGAATGTGATGAAGAACATCATGGCTGGCCTGCAGCAGACCAACTCTGAGAAGATCCTGCTGAGCTGGGTCAGACAGAGCACCAGAAACTACCCTCAAGTGAATGTGATCAACTTCACCACCTCTTGGAGTGATGGACTGGCCCTGAATGCCCTGATCCACAGCCACAGACCTGACCTGTTTGACTGGAACTCTGTTGTGTGCCAGCAGTCTGCCACACAGAGACTGGAACATGCCTTCAACATTGCCAGATACCAGCTGGGAATTGAGAAACTGCTGGACCCTGAGGATGTGGACACCACCTATCCTGACAAGAAATCCATCCTCATGTACATCACCAGCCTGTTCCAGGTGCTGCCCCAGCAAGTGTCCATTGAGGCCATTCAAGAGGTTGAGATGCTGCCCAGACCTCCTAAAGTGACCAAAGAGGAACACTTCCAGCTGCACCACCAGATGCACTACTCTCAGCAGATCACAGTGTCTCTGGCCCAGGGATATGAGAGAACAAGCAGCCCCAAGCCTAGGTTCAAGAGCTATGCCTACACACAGGCTGCCTATGTGACCACATCTGACCCCACAAGAAGCCCATTTCCAAGCCAGCATCTGGAAGCCCCTGAGGACAAGAGCTTTGGCAGCAGCCTGATGGAATCTGAAGTGAACCTGGATAGATACCAGACAGCCCTGGAAGAAGTGCTGTCCTGGCTGCTGTCTGCTGAGGATACACTGCAGGCTCAGGGTGAAATCAGCAATGATGTGGAAGTGGTCAAGGACCAGTTTCACACCCATGAGGGCTACATGATGGACCTGACAGCCCACCAGGGCAGAGTGGGAAATATCCTGCAGCTGGGCTCCAAGCTGATTGGCACAGGCAAGCTGTCTGAGGATGAAGAGACAGAGGTGCAAGAGCAGATGAACCTGCTGAACAGCAGATGGGAGTGTCTGAGAGTGGCCAGCATGGAAAAGCAGAGCAACCTGCACAGAGTGCTCATGGACCTGCAGAATCAGAAACTGAAAGAACTGAATGACTGGCTGACCAAGACAGAAGAAAGGACTAGGAAGATGGAAGAGGAACCTCTGGGACCAGACCTGGAAGATCTGAAAAGACAGGTGCAGCAGCATAAGGTGCTGCAAGAGGACCTTGAGCAAGAGCAAGTCAGAGTGAACAGCCTGACACACATGGTGGTGGTTGTGGATGAGTCCTCTGGGGATCATGCCACAGCTGCTCTGGAAGAACAGCTGAAGGTGCTGGGAGACAGATGGGCCAACATCTGTAGGTGGACAGAGGATAGATGGGTGCTGCTCCAGGACATTCTGCTGAAGTGGCAGAGACTGACAGAGGAACAGTGCCTGTTTTCTGCCTGGCTCTCTGAGAAAGAGGATGCTGTCAACAAGATCCATACCACAGGCTTCAAGGATCAGAATGAGATGCTCAGCTCCCTGCAGAAACTGGCTGTGCTGAAGGCTGACCTGGAAAAGAAAAAGCAGTCCATGGGCAAGCTCTACAGCCTGAAGCAGGACCTGCTGTCTACCCTGAAGAACAAGTCTGTGACCCAGAAAACTGAGGCCTGGCTGGACAACTTTGCTAGATGCTGGGACAACCTGGTGCAGAAGCTGGAAAAGTCTACAGCCCAGATCAGCCAGCAACCTGATCTTGCCCCTGGCCTGACCACAATTGGAGCCTCTCCAACACAGACTGTGACCCTGGTTACCCAGCCAGTGGTCACCAAAGAGACAGCCATCAGCAAACTGGAAATGCCCAGCTCTCTGATGCTGGAAGTCCCCACACTGGAAAGGCTGCAAGAACTTCAAGAGGCCACAGATGAGCTGGACCTGAAGCTGAGACAGGCTGAAGTGATCAAAGGCAGCTGGCAGCCAGTTGGGGACCTGCTCATTGATAGCCTGCAGGACCATCTGGAAAAAGTGAAAGCCCTGAGGGGAGAGATTGCCCCTCTGAAAGAAAATGTGTCCCATGTGAATGACCTGGCCAGACAGCTGACCACACTGGGAATCCAGCTGAGCCCCTACAACCTGAGCACCCTTGAGGACCTGAACACCAGGTGGAAGCTCCTCCAGGTGGCAGTGGAAGATAGAGTCAGGCAGCTGCATGAGGCCCACAGAGATTTTGGACCAGCCAGCCAGCACTTTCTGTCTACCTCTGTGCAAGGCCCCTGGGAGAGAGCTATCTCTCCTAACAAGGTGCCCTACTACATCAACCATGAGACACAGACCACCTGTTGGGATCACCCCAAGATGACAGAGCTGTACCAGAGTCTGGCAGACCTCAACAATGTCAGATTCAGTGCCTACAGGACTGCCATGAAGCTCAGAAGGCTCCAGAAAGCTCTGTGCCTGGACCTGCTTTCCCTGAGTGCAGCTTGTGATGCCCTGGACCAGCACAATCTGAAGCAGAATGACCAGCCTATGGACATCCTCCAGATCATCAACTGCCTCACCACCATCTATGATAGGCTGGAACAAGAGCACAACAATCTGGTCAATGTGCCCCTGTGTGTGGACATGTGCCTGAATTGGCTGCTGAATGTGTATGACACAGGCAGAACAGGCAGGATCAGAGTCCTGTCCTTCAAGACAGGCATCATCTCCCTGTGCAAAGCCCACTTGGAGGACAAGTACAGATACCTGTTCAAGCAAGTGGCCTCCAGCACAGGCTTTTGTGACCAGAGAAGGCTGGGCCTGCTCCTGCATGACAGCATTCAGATCCCTAGACAGCTGGGAGAAGTGGCTTCCTTTGGAGGCAGCAATATTGAGCCATCAGTCAGGTCCTGTTTTCAGTTTGCCAACAACAAGCCTGAGATTGAGGCTGCCCTGTTCCTGGACTGGATGAGACTTGAGCCTCAGAGCATGGTCTGGCTGCCTGTGCTTCATAGAGTGGCTGCTGCTGAGACTGCCAAGCACCAGGCCAAGTGCAACATCTGCAAAGAGTGCCCCATCATTGGCTTCAGATACAGATCCCTGAAGCACTTCAACTATGATATCTGCCAGAGCTGCTTCTTTAGTGGCAGGGTTGCCAAGGGCCACAAAATGCACTACCCCATGGTGGAATACTGCACCCCAACAACCTCTGGGGAAGATGTTAGAGACTTTGCCAAGGTGCTGAAAAACAAGTTCAGGACCAAGAGATACTTTGCTAAGCACCCCAGAATGGGCTACCTGCCTGTCCAGACAGTGCTTGAGGGTGACAACATGGAAACCCCTGTGACACTGATCAATTTCTGGCCAGTGGACTCTGCCCCTGCCTCAAGTCCACAGCTGTCCCATGATGACACCCACAGCAGAATTGAGCACTATGCCTCCAGACTGGCAGAGATGGAAAACAGCAATGGCAGCTACCTGAATGATAGCATCAGCCCCAATGAGAGCATTGATGATGAGCATCTGCTGATCCAGCACTACTGTCAGTCCCTGAACCAGGACTCTCCACTGAGCCAGCCTAGAAGCCCTGCTCAGATCCTGATCAGCCTTGAGTCTTGATGA
RGX-DYS6 (編碼序列 3867 bp)	101	ATGCTTTGGTGGGAAGAGGTGGAAGATTGCTATGAGAGGGAAGATGTGCAGAAGAAAACCTTCACCAAATGGGTCAATGCCCAGTTCAGCAAGTTTGGCAAGCAGCACATTGAGAACCTGTTCAGTGACCTGCAGGATGGCAGAAGGCTGCTGGATCTGCTGGAAGGCCTGACAGGCCAGAAGCTGCCTAAAGAGAAGGGCAGCACAAGAGTGCATGCCCTGAACAATGTGAACAAGGCCCTGAGAGTGCTGCAGAACAACAATGTGGACCTGGTCAATATTGGCAGCACAGACATTGTGGATGGCAACCACAAGCTGACCCTGGGCCTGATCTGGAACATCATCCTGCACTGGCAAGTGAAGAATGTGATGAAGAACATCATGGCTGGCCTGCAGCAGACCAACTCTGAGAAGATCCTGCTGAGCTGGGTCAGACAGAGCACCAGAAACTACCCTCAAGTGAATGTGATCAACTTCACCACCTCTTGGAGTGATGGACTGGCCCTGAATGCCCTGATCCACAGCCACAGACCTGACCTGTTTGACTGGAACTCTGTTGTGTGCCAGCAGTCTGCCACACAGAGACTGGAACATGCCTTCAACATTGCCAGATACCAGCTGGGAATTGAGAAACTGCTGGACCCTGAGGATGTGGACACCACCTATCCTGACAAGAAATCCATCCTCATGTACATCACCAGCCTGTTCCAGGTGCTGCCCCAGCAAGTGTCCATTGAGGCCATTCAAGAGGTTGAGATGCTGCCCAGACCTCCTAAAGTGACCAAAGAGGAACACTTCCAGCTGCACCACCAGATGCACTACTCTCAGCAGATCACAGTGTCTCTGGCCCAGGGATATGAGAGAACAAGCAGCCCCAAGCCTAGGTTCAAGAGCTATGCCTACACACAGGCTGCCTATGTGACCACATCTGACCCCACAAGAAGCCCATTTCCAAGCCAGCATCTGGAAGCCCCTGAGGACAAGAGCTTTGGCAGCAGCCTGATGGAATCTGAAGTGAACCTGGATAGATACCAGACAGCCCTGGAAGAAGTGCTGTCCTGGCTGCTGTCTGCTGAGGATACACTGCAGGCTCAGGGTGAAATCAGCAATGATGTGGAAGTGGTCAAGGACCAGTTTCACACCCATGAGGGCTACATGATGGACCTGACAGCCCACCAGGGCAGAGTGGGAAATATCCTGCAGCTGGGCTCCAAGCTGATTGGCACAGGCAAGCTGTCTGAGGATGAAGAGACAGAGGTGCAAGAGCAGATGAACCTGCTGAACAGCAGATGGGAGTGTCTGAGAGTGGCCAGCATGGAAAAGCAGAGCAACCTGCACAGAGTGCTCATGGACCTGCAGAATCAGAAACTGAAAGAACTGAATGACTGGCTGACCAAGACAGAAGAAAGGACTAGGAAGATGGAAGAGGAACCTCTGGGACCAGACCTGGAAGATCTGAAAAGACAGGTGCAGCAGCATAAGGTGCTGCAAGAGGACCTTGAGCAAGAGCAAGTCAGAGTGAACAGCCTGACACACATGGTGGTGGTTGTGGATGAGTCCTCTGGGGATCATGCCACAGCTGCTCTGGAAGAACAGCTGAAGGTGCTGGGAGACAGATGGGCCAACATCTGTAGGTGGACAGAGGATAGATGGGTGCTGCTCCAGGACATTCTGCTGAAGTGGCAGAGACTGACAGAGGAACAGTGCCTGTTTTCTGCCTGGCTCTCTGAGAAAGAGGATGCTGTCAACAAGATCCATACCACAGGCTTCAAGGATCAGAATGAGATGCTCAGCTCCCTGCAGAAACTGGCTGTGCTGAAGGCTGACCTGGAAAAGAAAAAGCAGTCCATGGGCAAGCTCTACAGCCTGAAGCAGGACCTGCTGTCTACCCTGAAGAACAAGTCTGTGACCCAGAAAACTGAGGCCTGGCTGGACAACTTTGCTAGATGCTGGGACAACCTGGTGCAGAAGCTGGAAAAGTCTACAGCCCAGATCAGCCAGCAACCTGATCTTGCCCCTGGCCTGACCACAATTGGAGCCTCTCCAACACAGACTGTGACCCTGGTTACCCAGCCAGTGGTCACCAAAGAGACAGCCATCAGCAAACTGGAAATGCCCAGCTCTCTGATGCTGGAAGTCCCCACACTGGAAAGGCTGCAAGAACTTCAAGAGGCCACAGATGAGCTGGACCTGAAGCTGAGACAGGCTGAAGTGATCAAAGGCAGCTGGCAGCCAGTTGGGGACCTGCTCATTGATAGCCTGCAGGACCATCTGGAAAAAGTGAAAGCCCTGAGGGGAGAGATTGCCCCTCTGAAAGAAAATGTGTCCCATGTGAATGACCTGGCCAGACAGCTGACCACACTGGGAATCCAGCTGAGCCCCTACAACCTGAGCACCCTTGAGGACCTGAACACCAGGTGGAAGCTCCTCCAGGTGGCAGTGGAAGATAGAGTCAGGCAGCTGCATGAGGCCCACAGAGATTTTGGACCAGCCAGCCAGCACTTTCTGTCTACCTCTGTGCAAGGCCCCTGGGAGAGAGCTATCTCTCCTAACAAGGTGCCCTACTACATCAACCATGAGACACAGACCACCTGTTGGGATCACCCCAAGATGACAGAGCTGTACCAGAGTCTGGCAGACCTCAACAATGTCAGATTCAGTGCCTACAGGACTGCCATGAAGCTCAGAAGGCTCCAGAAAGCTCTGTGCCTGGACCTGCTTTCCCTGAGTGCAGCTTGTGATGCCCTGGACCAGCACAATCTGAAGCAGAATGACCAGCCTATGGACATCCTCCAGATCATCAACTGCCTCACCACCATCTATGATAGGCTGGAACAAGAGCACAACAATCTGGTCAATGTGCCCCTGTGTGTGGACATGTGCCTGAATTGGCTGCTGAATGTGTATGACACAGGCAGAACAGGCAGGATCAGAGTCCTGTCCTTCAAGACAGGCATCATCTCCCTGTGCAAAGCCCACTTGGAGGACAAGTACAGATACCTGTTCAAGCAAGTGGCCTCCAGCACAGGCTTTTGTGACCAGAGAAGGCTGGGCCTGCTCCTGCATGACAGCATTCAGATCCCTAGACAGCTGGGAGAAGTGGCTTCCTTTGGAGGCGCCAAGCACCAGGCCAAGTGCAACATCTGCAAAGAGTGCCCCATCATTGGCTTCAGATACAGATCCCTGAAGCACTTCAACTATGATATCTGCCAGAGCTGCTTCTTTAGTGGCAGGGTTGCCAAGGGCCACAAAATGCACTACCCCATGGTGGAATACTGCACCCCAACAACCTCTGGGGAAGATGTTAGAGACTTTGCCAAGGTGCTGAAAAACAAGTTCAGGACCAAGAGATACTTTGCTAAGCACCCCAGAATGGGCTACCTGCCTGTCCAGACAGTGCTTGAGGGTGACAACATGGAAACCCCTGTGACACTGATCAATTTCTGGCCAGTGGACTCTGCCCCTGCCTCAAGTCCACAGCTGTCCCATGATGACACCCACAGCAGAATTGAGCACTATGCCTCCAGACTGGCAGAGATGGAAAACAGCAATGGCAGCTACCTGAATGATAGCATCAGCCCCAATGAGAGCATTGATGATGAGCATCTGCTGATCCAGCACTACTGTCAGTCCCTGAACCAGGACTCTCCACTGAGCCAGCCTAGAAGCCCTGCTCAGATCCTGATCAGCCTTGAGTCTGAGGAAAGGGGAGAGCTGGAAAGAATCCTGGCAGATCTTGAGGAAGAGAACAGAAACCTGCAGGCAGAGTATGACAGGCTCAAACAGCAGCATGAGCACAAGGGACTGAGCCCTCTGCCTTCTCCTCCTGAAATGATGCCCACCTCTCCACAGTCTCCAAGGTGATGA 終止密碼子加下劃線
RGX-DYS7 (編碼序列 4041 bp)	102	ATGCTTTGGTGGGAAGAGGTGGAAGATTGCTATGAGAGGGAAGATGTGCAGAAGAAAACCTTCACCAAATGGGTCAATGCCCAGTTCAGCAAGTTTGGCAAGCAGCACATTGAGAACCTGTTCAGTGACCTGCAGGATGGCAGAAGGCTGCTGGATCTGCTGGAAGGCCTGACAGGCCAGAAGCTGCCTAAAGAGAAGGGCAGCACAAGAGTGCATGCCCTGAACAATGTGAACAAGGCCCTGAGAGTGCTGCAGAACAACAATGTGGACCTGGTCAATATTGGCAGCACAGACATTGTGGATGGCAACCACAAGCTGACCCTGGGCCTGATCTGGAACATCATCCTGCACTGGCAAGTGAAGAATGTGATGAAGAACATCATGGCTGGCCTGCAGCAGACCAACTCTGAGAAGATCCTGCTGAGCTGGGTCAGACAGAGCACCAGAAACTACCCTCAAGTGAATGTGATCAACTTCACCACCTCTTGGAGTGATGGACTGGCCCTGAATGCCCTGATCCACAGCCACAGACCTGACCTGTTTGACTGGAACTCTGTTGTGTGCCAGCAGTCTGCCACACAGAGACTGGAACATGCCTTCAACATTGCCAGATACCAGCTGGGAATTGAGAAACTGCTGGACCCTGAGGATGTGGACACCACCTATCCTGACAAGAAATCCATCCTCATGTACATCACCAGCCTGTTCCAGGTGCTGCCCCAGCAAGTGTCCATTGAGGCCATTCAAGAGGTTGAGATGCTGCCCAGACCTCCTAAAGTGACCAAAGAGGAACACTTCCAGCTGCACCACCAGATGCACTACTCTCAGCAGATCACAGTGTCTCTGGCCCAGGGATATGAGAGAACAAGCAGCCCCAAGCCTAGGTTCAAGAGCTATGCCTACACACAGGCTGCCTATGTGACCACATCTGACCCCACAAGAAGCCCATTTCCAAGCCAGCATCTGGAAGCCCCTGAGGACAAGAGCTTTGGCAGCAGCCTGATGGAATCTGAAGTGAACCTGGATAGATACCAGACAGCCCTGGAAGAAGTGCTGTCCTGGCTGCTGTCTGCTGAGGATACACTGCAGGCTCAGGGTGAAATCAGCAATGATGTGGAAGTGGTCAAGGACCAGTTTCACACCCATGAGGGCTACATGATGGACCTGACAGCCCACCAGGGCAGAGTGGGAAATATCCTGCAGCTGGGCTCCAAGCTGATTGGCACAGGCAAGCTGTCTGAGGATGAAGAGACAGAGGTGCAAGAGCAGATGAACCTGCTGAACAGCAGATGGGAGTGTCTGAGAGTGGCCAGCATGGAAAAGCAGAGCAACCTGCACAGAGTGCTCATGGACCTGCAGAATCAGAAACTGAAAGAACTGAATGACTGGCTGACCAAGACAGAAGAAAGGACTAGGAAGATGGAAGAGGAACCTCTGGGACCAGACCTGGAAGATCTGAAAAGACAGGTGCAGCAGCATAAGGTGCTGCAAGAGGACCTTGAGCAAGAGCAAGTCAGAGTGAACAGCCTGACACACATGGTGGTGGTTGTGGATGAGTCCTCTGGGGATCATGCCACAGCTGCTCTGGAAGAACAGCTGAAGGTGCTGGGAGACAGATGGGCCAACATCTGTAGGTGGACAGAGGATAGATGGGTGCTGCTCCAGGACATTCTGGAGATCAGCTATGTGCCCAGCACCTACCTGACAGAGATCACCCATGTGTCTCAGGCCCTGCTGGAAGTGGAACAGCTGCTGAATGCCCCTGACCTGTGTGCCAAGGACTTTGAGGACCTGTTCAAGCAAGAGGAAAGCCTGAAGAACATCAAGGACAGCCTGCAGCAGTCCTCTGGCAGAATTGACATCATCCACAGCAAGAAAACAGCTGCCCTGCAGTCTGCCACACCTGTGGAAAGAGTGAAGCTGCAAGAGGCCCTGAGCCAGCTGGACTTCCAGTGGGAGAAAGTGAACAAGATGTACAAGGACAGGCAGGGCAGATTTGATAGAAGTGTGGAAAAGTGGAGAAGGTTCCACTATGACATCAAGATCTTCAACCAGTGGCTGACAGAGGCTGAGCAGTTCCTGAGAAAGACACAGATCCCTGAGAACTGGGAGCATGCCAAGTACAAGTGGTATCTGAAAGAACTGCAGGATGGCATTGGCCAGAGACAGACAGTTGTCAGAACCCTGAATGCCACAGGGGAAGAGATCATCCAGCAGAGCAGCAAGACAGATGCCAGCATCCTGCAAGAGAAGCTGGGCAGCCTGAACCTGAGATGGCAAGAAGTGTGCAAGCAGCTGTCTGACAGAAAGAAGAGGCTGGAAGAACAGACACTGGAAAGGCTGCAAGAACTTCAAGAGGCCACAGATGAGCTGGACCTGAAGCTGAGACAGGCTGAAGTGATCAAAGGCAGCTGGCAGCCAGTTGGGGACCTGCTCATTGATAGCCTGCAGGACCATCTGGAAAAAGTGAAAGCCCTGAGGGGAGAGATTGCCCCTCTGAAAGAAAATGTGTCCCATGTGAATGACCTGGCCAGACAGCTGACCACACTGGGAATCCAGCTGAGCCCCTACAACCTGAGCACCCTTGAGGACCTGAACACCAGGTGGAAGCTCCTCCAGGTGGCAGTGGAAGATAGAGTCAGGCAGCTGCATGAGGCCCACAGAGATTTTGGACCAGCCAGCCAGCACTTTCTGTCTACCTCTGTGCAAGGCCCCTGGGAGAGAGCTATCTCTCCTAACAAGGTGCCCTACTACATCAACCATGAGACACAGACCACCTGTTGGGATCACCCCAAGATGACAGAGCTGTACCAGAGTCTGGCAGACCTCAACAATGTCAGATTCAGTGCCTACAGGACTGCCATGAAGCTCAGAAGGCTCCAGAAAGCTCTGTGCCTGGACCTGCTTTCCCTGAGTGCAGCTTGTGATGCCCTGGACCAGCACAATCTGAAGCAGAATGACCAGCCTATGGACATCCTCCAGATCATCAACTGCCTCACCACCATCTATGATAGGCTGGAACAAGAGCACAACAATCTGGTCAATGTGCCCCTGTGTGTGGACATGTGCCTGAATTGGCTGCTGAATGTGTATGACACAGGCAGAACAGGCAGGATCAGAGTCCTGTCCTTCAAGACAGGCATCATCTCCCTGTGCAAAGCCCACTTGGAGGACAAGTACAGATACCTGTTCAAGCAAGTGGCCTCCAGCACAGGCTTTTGTGACCAGAGAAGGCTGGGCCTGCTCCTGCATGACAGCATTCAGATCCCTAGACAGCTGGGAGAAGTGGCTTCCTTTGGAGGCAGCAATATTGAGCCATCAGTCAGGTCCTGTTTTCAGTTTGCCAACAACAAGCCTGAGATTGAGGCTGCCCTGTTCCTGGACTGGATGAGACTTGAGCCTCAGAGCATGGTCTGGCTGCCTGTGCTTCATAGAGTGGCTGCTGCTGAGACTGCCAAGCACCAGGCCAAGTGCAACATCTGCAAAGAGTGCCCCATCATTGGCTTCAGATACAGATCCCTGAAGCACTTCAACTATGATATCTGCCAGAGCTGCTTCTTTAGTGGCAGGGTTGCCAAGGGCCACAAAATGCACTACCCCATGGTGGAATACTGCACCCCAACAACCTCTGGGGAAGATGTTAGAGACTTTGCCAAGGTGCTGAAAAACAAGTTCAGGACCAAGAGATACTTTGCTAAGCACCCCAGAATGGGCTACCTGCCTGTCCAGACAGTGCTTGAGGGTGACAACATGGAAACCCCTGTGACACTGATCAATTTCTGGCCAGTGGACTCTGCCCCTGCCTCAAGTCCACAGCTGTCCCATGATGACACCCACAGCAGAATTGAGCACTATGCCTCCAGACTGGCAGAGATGGAAAACAGCAATGGCAGCTACCTGAATGATAGCATCAGCCCCAATGAGAGCATTGATGATGAGCATCTGCTGATCCAGCACTACTGTCAGTCCCTGAACCAGGACTCTCCACTGAGCCAGCCTAGAAGCCCTGCTCAGATCCTGATCAGCCTTGAGTCTTGATGA 終止密碼子加下劃線
RGX-DYS8 (編碼序列 3765 bp)	103	ATGCTTTGGTGGGAAGAGGTGGAAGATTGCTATGAGAGGGAAGATGTGCAGAAGAAAACCTTCACCAAATGGGTCAATGCCCAGTTCAGCAAGTTTGGCAAGCAGCACATTGAGAACCTGTTCAGTGACCTGCAGGATGGCAGAAGGCTGCTGGATCTGCTGGAAGGCCTGACAGGCCAGAAGCTGCCTAAAGAGAAGGGCAGCACAAGAGTGCATGCCCTGAACAATGTGAACAAGGCCCTGAGAGTGCTGCAGAACAACAATGTGGACCTGGTCAATATTGGCAGCACAGACATTGTGGATGGCAACCACAAGCTGACCCTGGGCCTGATCTGGAACATCATCCTGCACTGGCAAGTGAAGAATGTGATGAAGAACATCATGGCTGGCCTGCAGCAGACCAACTCTGAGAAGATCCTGCTGAGCTGGGTCAGACAGAGCACCAGAAACTACCCTCAAGTGAATGTGATCAACTTCACCACCTCTTGGAGTGATGGACTGGCCCTGAATGCCCTGATCCACAGCCACAGACCTGACCTGTTTGACTGGAACTCTGTTGTGTGCCAGCAGTCTGCCACACAGAGACTGGAACATGCCTTCAACATTGCCAGATACCAGCTGGGAATTGAGAAACTGCTGGACCCTGAGGATGTGGACACCACCTATCCTGACAAGAAATCCATCCTCATGTACATCACCAGCCTGTTCCAGGTGCTGCCCCAGCAAGTGTCCATTGAGGCCATTCAAGAGGTTGAGATGCTGCCCAGACCTCCTAAAGTGACCAAAGAGGAACACTTCCAGCTGCACCACCAGATGCACTACTCTCAGCAGATCACAGTGTCTCTGGCCCAGGGATATGAGAGAACAAGCAGCCCCAAGCCTAGGTTCAAGAGCTATGCCTACACACAGGCTGCCTATGTGACCACATCTGACCCCACAAGAAGCCCATTTCCAAGCCAGCATCTGGAAGCCCCTGAGGACAAGAGCTTTGGCAGCAGCCTGATGGAATCTGAAGTGAACCTGGATAGATACCAGACAGCCCTGGAAGAAGTGCTGTCCTGGCTGCTGTCTGCTGAGGATACACTGCAGGCTCAGGGTGAAATCAGCAATGATGTGGAAGTGGTCAAGGACCAGTTTCACACCCATGAGGGCTACATGATGGACCTGACAGCCCACCAGGGCAGAGTGGGAAATATCCTGCAGCTGGGCTCCAAGCTGATTGGCACAGGCAAGCTGTCTGAGGATGAAGAGACAGAGGTGCAAGAGCAGATGAACCTGCTGAACAGCAGATGGGAGTGTCTGAGAGTGGCCAGCATGGAAAAGCAGAGCAACCTGCACAGAGTGCTCATGGACCTGCAGAATCAGAAACTGAAAGAACTGAATGACTGGCTGACCAAGACAGAAGAAAGGACTAGGAAGATGGAAGAGGAACCTCTGGGACCAGACCTGGAAGATCTGAAAAGACAGGTGCAGCAGCATAAGGTGCTGCAAGAGGACCTTGAGCAAGAGCAAGTCAGAGTGAACAGCCTGACACACATGGTGGTGGTTGTGGATGAGTCCTCTGGGGATCATGCCACAGCTGCTCTGGAAGAACAGCTGAAGGTGCTGGGAGACAGATGGGCCAACATCTGTAGGTGGACAGAGGATAGATGGGTGCTGCTCCAGGACATTCTGGAGATCAGCTATGTGCCCAGCACCTACCTGACAGAGATCACCCATGTGTCTCAGGCCCTGCTGGAAGTGGAACAGCTGCTGAATGCCCCTGACCTGTGTGCCAAGGACTTTGAGGACCTGTTCAAGCAAGAGGAAAGCCTGAAGAACATCAAGGACAGCCTGCAGCAGTCCTCTGGCAGAATTGACATCATCCACAGCAAGAAAACAGCTGCCCTGCAGTCTGCCACACCTGTGGAAAGAGTGAAGCTGCAAGAGGCCCTGAGCCAGCTGGACTTCCAGTGGGAGAAAGTGAACAAGATGTACAAGGACAGGCAGGGCAGATTTGATAGAAGTGTGGAAAAGTGGAGAAGGTTCCACTATGACATCAAGATCTTCAACCAGTGGCTGACAGAGGCTGAGCAGTTCCTGAGAAAGACACAGATCCCTGAGAACTGGGAGCATGCCAAGTACAAGTGGTATCTGAAAGAACTGCAGGATGGCATTGGCCAGAGACAGACAGTTGTCAGAACCCTGAATGCCACAGGGGAAGAGATCATCCAGCAGAGCAGCAAGACAGATGCCAGCATCCTGCAAGAGAAGCTGGGCAGCCTGAACCTGAGATGGCAAGAAGTGTGCAAGCAGCTGTCTGACAGAAAGAAGAGGCTGGAAGAACAGACACTGGAAAGGCTGCAAGAACTTCAAGAGGCCACAGATGAGCTGGACCTGAAGCTGAGACAGGCTGAAGTGATCAAAGGCAGCTGGCAGCCAGTTGGGGACCTGCTCATTGATAGCCTGCAGGACCATCTGGAAAAAGTGAAAGCCCTGAGGGGAGAGATTGCCCCTCTGAAAGAAAATGTGTCCCATGTGAATGACCTGGCCAGACAGCTGACCACACTGGGAATCCAGCTGAGCCCCTACAACCTGAGCACCCTTGAGGACCTGAACACCAGGTGGAAGCTCCTCCAGGTGGCAGTGGAAGATAGAGTCAGGCAGCTGCATGAGGCCCACAGAGATTTTGGACCAGCCAGCCAGCACTTTCTGTCTACCTCTGTGCAAGGCCCCTGGGAGAGAGCTATCTCTCCTAACAAGGTGCCCTACTACATCAACCATGAGACACAGACCACCTGTTGGGATCACCCCAAGATGACAGAGCTGTACCAGAGTCTGGCAGACCTCAACAATGTCAGATTCAGTGCCTACAGGACTGCCATGAAGCTCAGAAGGCTCCAGAAAGCTCTGTGCCTGGACCTGCTTTCCCTGAGTGCAGCTTGTGATGCCCTGGACCAGCACAATCTGAAGCAGAATGACCAGCCTATGGACATCCTCCAGATCATCAACTGCCTCACCACCATCTATGATAGGCTGGAACAAGAGCACAACAATCTGGTCAATGTGCCCCTGTGTGTGGACATGTGCCTGAATTGGCTGCTGAATGTGTATGACACAGGCAGAACAGGCAGGATCAGAGTCCTGTCCTTCAAGACAGGCATCATCTCCCTGTGCAAAGCCCACTTGGAGGACAAGTACAGATACCTGTTCAAGCAAGTGGCCTCCAGCACAGGCTTTTGTGACCAGAGAAGGCTGGGCCTGCTCCTGCATGACAGCATTCAGATCCCTAGACAGCTGGGAGAAGTGGCTTCCTTTGGAGGCAGCAATATTGAGCCATCAGTCAGGTCCTGTTTTCAGTTTGCCAACAACAAGCCTGAGATTGAGGCTGCCCTGTTCCTGGACTGGATGAGACTTGAGCCTCAGAGCATGGTCTGGCTGCCTGTGCTTCATAGAGTGGCTGCTGCTGAGACTGCCAAGCACCAGGCCAAGTGCAACATCTGCAAAGAGTGCCCCATCATTGGCTTCAGATACAGATCCCTGAAGCACTTCAACTATGATATCTGCCAGAGCTGCTTCTTTAGTGGCAGGGTTGCCAAGGGCCACAAAATGCACTACCCCATGGTGGAATACTGCACCCCAACAACCTCTGGGGAAGATGTTAGAGACTTTGCCAAGGTGCTGAAAAACAAGTTCAGGACCAAGAGATACTTTGCTAAGCACCCCAGAATGGGCTACCTGCCTGTCCAGACAGTGCTTGAGGGTGACAACATGGAAACCTGATGA 終止密碼子加下劃線

5.2.2.1 密碼子最佳化及CpG缺失

在一個態樣中，編碼微小肌縮蛋白盒之核苷酸序列藉由密碼子最佳化及CpG二核苷酸及CpG島缺失來修飾。針對微小肌縮蛋白轉基因之免疫反應係人類臨床應用所關注之問題如在第一次杜興氏肌肉營養不良症(DMD)基因療法臨床試驗及在犬模型中之若干腺相關病毒(AAV) -微小肌縮蛋白基因療法中所證明[Mendell, J.R.等人, Dystrophin immunity in Duchenne's muscular dystrophy.N Engl J Med , 2010. 363(15): 第1429-37頁；及Kornegay, J.N.等人，Widespread muscle expression of an AAV9 human mini-dystrophin vector after intravenous injection in neonatal dystrophin-deficient dogs.Mol Ther , 2010. 18(8): 第1501-8頁]。

藉由減少AAV基因體中CpG二核苷酸之數量可抑制AAV定向之免疫反應[Faust, S.M.等人, CpG-depleted adeno-associated virus vectors evade immune detection.J Clin Invest , 2013. 123(7): 第2994-3001頁]。缺失CpG基序之轉基因序列可減少TLR9在將轉基因識別為非自身時活化先天免疫中之作用，且因此提供穩定及延長之轉基因表現。[亦參見Wang, D., P.W.L. Tai及G. Gao, Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.Nat Rev Drug Discov , 2019. 18(5): 第358-378頁；及Rabinowitz, J., Y.K. Chan及R.J. Samulski, Adeno-associated Virus (AAV) versus Immune Response.Viruses , 2019. 11(2)]。在實施例中，微小肌縮蛋白盒係用CpG缺失進行人類密碼子最佳化。密碼子最佳化及CpG缺失之核苷酸序列可藉由業內已知之任何方法設計，包括例如藉由利用GeneOptimizer (Waltham, MA USA)之Thermo Fisher Scientific GeneArt Gene Synthesis Tools。本文所述之核苷酸序列SEQ ID NO: 20、21、57-72、80、81及101-103表示密碼子最佳化及CpG缺失之序列。

提供具有減少數量之CpG二核苷酸序列且因此具有減少數量之CpG島之微小肌縮蛋白轉基因。在某些實施例中，微小肌縮蛋白核苷酸序列具有少於兩(2)個CpG島、或一(1)個CpG島或零(0)個CpG島。在實施例中，提供具有少於2個、或1個CpG島、或0個CpG島之微小肌縮蛋白轉基因，如藉由抗藥物抗體效價所量測，與具有多於2個CpG島之微小肌縮蛋白轉基因相比，其具有降低之免疫原性。在某些實施例中，基本上由SEQ ID NO: 20、21、81、101、102或103組成之微小肌縮蛋白核苷酸序列具有零(0)個CpG島。在其他實施例中，微小肌縮蛋白轉基因核苷酸序列基本上由與啟動子可操作地連接之微小肌縮蛋白基因組成，其中微小肌縮蛋白由SEQ ID NO: 20、21、81、101、102或103組成，具有少於兩(2)個CpG島。在其他實施例中，微小肌縮蛋白轉基因核苷酸序列基本上由與啟動子可操作地連接之微小肌縮蛋白基因組成，其中微小肌縮蛋白由SEQ ID NO: 20、21、81、101、102或103組成，具有一(1)個CpG島。 5.3. 基因盒及調節元件

本發明之另一態樣係關於核酸表現盒，其包含經設計以賦予或增強微小肌縮蛋白表現之調節元件。本發明進一步涉及工程化調節元件，包括啟動子元件，及視情況增強子元件及/或內含子，以增強或促進轉基因之表現。在一些實施例中，rAAV載體亦包括熟習此項技術者已知之該等調節控制元件，以影響RNA及/或由核酸(轉基因)編碼之蛋白產物在個體之靶細胞內之表現。調節控制元件可為組織特異性的，亦即，僅在靶細胞/組織中係活性的(或實質上更具活性或顯著更具活性)。 5.3.1 啟動子 5.3.1.1 組織特異性啟動子

在具體實施例中，AAV載體之表現盒包含與允許在靶組織中表現之轉基因可操作連接之調節序列，例如啟動子。啟動子可為組成型啟動子，例如CB7啟動子。額外啟動子包括：巨細胞病毒(CMV)啟動子、勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子、MMT啟動子、EF-1 α啟動子(SEQ ID NO: 118)、UB6啟動子、雞β-肌動蛋白啟動子、CAG啟動子(SEQ ID NO: 116)、RPE65啟動子、視蛋白啟動子、TBG (甲狀腺素結合球蛋白)啟動子、APOA2啟動子、SERPINA1 (hAAT)啟動子或MIR122啟動子。在一些實施例中，特別是在可能期望關閉轉基因表現之情況下，使用可誘導型啟動子，例如低氧可誘導型或雷帕黴素可誘導型啟動子。

在某些實施例中，啟動子係肌肉特異性啟動子。片語「肌肉特異性」、「肌肉選擇性」或「肌肉定向」係指由於該等元件與肌細胞之細胞內環境之相互作用而在肌細胞或組織中適應其活性之核酸元件。該等肌細胞可包括肌細胞、肌管、心肌細胞及諸如此類。包括具有不同性質之專門形式之肌細胞，例如心臟、骨骼及平滑肌細胞。各種治療劑可受益於轉基因之肌肉特異性表現。具體而言，治療遞送至肌細胞並在肌細胞中實現高轉導效率之各種形式之肌肉營養不良症之基因療法具有在最需要轉基因之細胞中引導轉基因表現之額外益處。心臟組織亦將受益於轉基因之肌肉定向表現。肌肉特異性啟動子可操作地連接至本發明之轉基因。在一些實施例中，肌肉特異性啟動子選自SPc5-12啟動子、肌肉肌酸激酶肌凝蛋白輕鏈(MLC)啟動子、肌凝蛋白重鏈(MHC)啟動子、結蛋白啟動子(SEQ ID NO: 119)、MHCK7啟動子(SEQ ID NO: 120)、CK6啟動子、CK8啟動子(SEQ ID NO: 115)、MCK啟動子(或其截短形式) (SEQ ID NO: 121)、α肌動蛋白啟動子、β肌動蛋白啟動子、γ肌動蛋白啟動子、E-syn啟動子、心臟肌鈣蛋白C啟動子、肌鈣蛋白I啟動子、myoD基因家族啟動子、或位於眼型Pitx3之內含子1內之肌肉選擇性啟動子。

已顯示合成啟動子c5-12 (Li, X.等人 Nature Biotechnology 第17卷，第241-245頁，MARCH 1999) (稱作SPc5-12啟動子)具有細胞類型限制之表現、尤其肌肉-細胞特異性表現。在長度小於350 bp時，SPc5-12啟動子之長度小於大部分內源性啟動子，此在編碼治療性蛋白質之核酸長度相對較長時可為有利的。在實施例中，提供具有SPc5-12啟動子(SEQ ID NO: 39)之基因治療盒。

為了進一步減小載體之長度，調控元件可為本文所述啟動子中之任一者之減小或縮短形式(本文稱為「最小啟動子」)。最小啟動子至少包含全長形式之轉錄活性域，且因此仍能夠驅動表現。舉例而言，在一些實施例中，AAV載體可包含與治療性蛋白轉基因可操作連接之肌肉特異性啟動子(例如最小SPc5-12啟動子) (例如SEQ ID NO: 40)之轉錄活性域。在實施例中，治療性蛋白質係如本文所述之微小肌縮蛋白。本揭示內容之最小啟動子可含有或不含有有助於以組織特異性方式調節表現之啟動子序列之部分。

因此，在實施例中，提供具有SPc5-12啟動子(SEQ ID NO: 39)之基因治療盒。在實施例中，提供具有引導微小肌縮蛋白在肌細胞中表現之最小啟動子之基因治療盒。一種該啟動子係SEQ ID NO: 40之最小SPc5-12啟動子。該等啟動子之序列提供於表6中。表 6 ：啟動子序列

啟動子	SEQ ID	核酸序列
SPc5-12	39	GGCCGTCCGCCCTCGGCACCATCCTCACGACACCCAAATATGGCGACGGGTGAGGAATGGTGGGGAGTTATTTTTAGAGCGGTGAGGAAGGTGGGCAGGCAGCAGGTGTTGGCGCTCTAAAAATAACTCCCGGGAGTTATTTTTAGAGCGGAGGAATGGTGGACACCCAAATATGGCGACGGTTCCTCACCCGTCGCCATATTTGGGTGTCCGCCCTCGGCCGGGGCCGCATTCCTGGGGGCCGGGCGGTGCTCCCGCCCGCCTCGATAAAAGGCTCCGGGGCCGGCGGCGGCCCACGAGCTACCCGGAGGAGCGGGAGGCGCCAAGC
minSPc5-12	40	GAATGGTGGACACCCAAATATGGCGACGGTTCCTCACCCGTCGCCATATTTGGGTGTCCGCCCTCGGCCGGGGCCGCATTCCTGGGGGCCGGGCGGTGCTCCCGCCCGCCTCGATAAAAGGCTCCGGGGCCGGCGGCGGCCCACGAGCTACCCGGAGGAGCGGGAGGCGCCAAG
CK8	115	ccactacgggtttaggctgcccatgtaaggaggcaaggcctggggacacccgagatgcctggttataattaacccagacatgtggctgccccccccccccccaacacctgctgcctctaaaaataaccctgtccctggtggatcccactacgggtttaggctgcccatgtaaggaggcaaggcctggggacacccgagatgcctggttataattaacccagacatgtggctgccccccccccccccaacacctgctgcctctaaaaataaccctgtccctggtggatcccactacgggtttaggctgcccatgtaaggaggcaaggcctggggacacccgagatgcctggttataattaacccagacatgtggctgccccccccccccccaacacctgctgcctctaaaaataaccctgtccctggtggatcccctgcatgcgaagatcttcgaacaaggctgtgggggactgagggcaggctgtaacaggcttgggggccagggcttatacgtgcctgggactcccaaagtattactgttccatgttcccggcgaagggccagctgtcccccgccagctagactcagcacttagtttaggaaccagtgagcaagtcagcccttggggcagcccatacaaggccatggggctgggcaagctgcacgcctgggtccggggtgggcacggtgcccgggcaacgagctgaaagctcatctgctctcaggggcccctccctggggacagcccctcctggctagtcacaccctgtaggctcctctatataacccaggggcacaggggctgccctcattctaccaccacctccacagcacagacagacactcaggagccagccagcgtcga
CAG	116	gacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgcgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggctgtaattagcgcttggtttaatgacggcttgtttcttttctgtggctgcgtgaaagccttgaggggctccgggagggccctttgtgcggggggagcggctcggggggtgcgtgcgtgtgtgtgtgcgtggggagcgccgcgtgcggctccgcgctgcccggcggctgtgagcgctgcgggcgcggcgcggggctttgtgcgctccgcagtgtgcgcgaggggagcgcggccgggggcggtgccccgcggtgcggggggggctgcgaggggaacaaaggctgcgtgcggggtgtgtgcgtgggggggtgagcagggggtgtgggcgcgtcggtcgggctgcaaccccccctgcacccccctccccgagttgctgagcacggcccggcttcgggtgcggggctccgtacggggcgtggcgcggggctcgccgtgccgggcggggggtggcggcaggtgggggtgccgggcggggcggggccgcctcgggccggggagggctcgggggaggggcgcggcggcccccggagcgccggcggctgtcgaggcgcggcgagccgcagccattgccttttatggtaatcgtgcgagagggcgcagggacttcctttgtcccaaatctgtgcggagccgaaatctgggaggcgccgccgcaccccctctagcgggcgcggggcgaagcggtgcggcgccggcaggaaggaaatgggcggggagggccttcgtgcgtcgccgcgccgccgtccccttctccctctccagcctcggggctgtccgcggggggacggctgccttcgggggggacggggcagggcggggttcggcttctggcgtgtgaccggcggctctagagcctctgctaaccatgttcatgccttcttctttttcctacagctcctgggcaacgtgctggttattgtgctgtctcatcattttggcaaag
mU1a	117	atggaggcggtactatgtagatgagaattcaggagcaaactgggaaaagcaactgcttccaaatatttgtgatttttacagtgtagttttggaaaaactcttagcctaccaattcttctaagtgttttaaaatgtgggagccagtacacatgaagttatagagtgttttaatgaggcttaaatatttaccgtaactatgaaatgctacgcatatcatgctgttcaggctccgtggccacgcaactcatact
EF-1α	118	gggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaacgggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacag
人類結蛋白	119	ctgcagacatgcttgctgcctgccctggcgtgccctggcgaggcttgccgtcacaggacccccgctggctgactcaggggcgcaggctcttgcgggggagctggcctcccgcccccacggccacgggccctttcctggcaggacagcgggatcttgcagctgtcaggggaggggatgacgggggactgatgtcaggaggggatacaaatagtgccgaacaaggaccggattagatctacc
MHCK7	120	aagcttgcat gtctaagcta gacccttcag attaaaaata actgaggtaa gggcctgggt aggggaggtg gtgtgagacg ctcctgtctc tcctctatct gcccatcggc cctttgggga ggaggaatgt gcccaaggac taaaaaaagg ccatggagcc agaggggcga gggcaacaga cctttcatgg gcaaaccttg gggccctgct gtctagcatg ccccactacg ggtctaggct gcccatgtaa ggaggcaagg cctggggaca cccgagatgc ctggttataa ttaacccaga catgtggctg cccccccccc cccaacacct gctgcctcta aaaataaccc tgtccctggt ggatcccctg catgcgaaga tcttcgaaca aggctgtggg ggactgaggg caggctgtaa caggcttggg ggccagggct tatacgtgcc tgggactccc aaagtattac tgttccatgt tcccggcgaa gggccagctg tcccccgcca gctagactca gcacttagtt taggaaccag tgagcaagtc agcccttggg gcagcccata caaggccatg gggctgggca agctgcacgc ctgggtccgg ggtgggcacg gtgcccgggc aacgagctga aagctcatct gctctcaggg gcccctccct ggggacagcc cctcctggct agtcacaccc tgtaggctcc tctatataac ccaggggcac aggggctgcc ctcattctac caccacctcc acagcacaga cagacactca ggagcagcca gc
經截短之MCK	121	ccactacggg tctaggctgc ccatgtaagg aggcaaggcc tggggacacc cgagatgcct ggttataatt aaccccaaca cctgctgccc cccccccccc aacacctgct gcctgagcct gagcggttac cccaccccgg tgcctgggtc ttaggctctg tacaccatgg aggagaagct cgctctaaaa ataaccctgt ccctggtgga tccactacgg gtctatgctg cccatgtaag gaggcaaggc ctggggacac ccgagatgcc tggttataat taaccccaac acctgctgcc cccccccccc caacacctgc tgcctgagcc tgagcggtta ccccaccccg gtgcctgggt cttaggctct gtacaccatg gaggagaagc tcgctctaaa aataaccctg tccctggtgg accactacgg gtctaggctg cccatgtaag gaggcaaggc ctggggacac ccgagatgcc tggttataat taaccccaac acctgctgcc cccccccccc aacacctgct gcctgagcct gagcggttac cccaccccgg tgcctgggtc ttaggctctg tacaccatgg aggagaagct cgctctaaaa ataaccctgt ccctggtcct ccctggggac agcccctcct ggctagtcac accctgtagg ctcctctata taacccaggg gcacaggggc tgcccccggg tcac

在某些實施例中，啟動子係CNS特異性啟動子。舉例而言，表現盒可包含選自以下之啟動子：分離自神經元特異性烯醇酶(NSE)之基因之啟動子、任何神經元啟動子(例如多巴胺-1受體或多巴胺-2受體之啟動子)、突觸蛋白啟動子、CB7啟動子(雞β-肌動蛋白啟動子及CMV增強子)、RSV啟動子、GFAP啟動子(膠質原纖維酸性蛋白)、MBP啟動子(髓磷脂鹼性蛋白)、MMT啟動子、EF-1α、U86啟動子、RPE65啟動子或視蛋白啟動子、可誘導型啟動子(例如低氧可誘導型啟動子及藥物可誘導型啟動子，例如由雷帕黴素及相關試劑誘導之啟動子)。

在其他實施例中，表現盒可包含多個啟動子，其可串聯置於包含微小肌縮蛋白轉基因之表現盒中。因此，可採用串聯或雜合啟動子以增強多種組織類型之表現及/或引導多種組織類型(例如，參見於2019年8月15日公開之PCT國際公開案第WO2019154939A1號，以引用方式併入本文中)且具體而言如2020年7月24日提出申請之PCT國際申請案第PCT/US2020/043578號(以引用方式併入本文中)中所揭示之LMTP6、LMTP13、LMTP14、LMTP15、LMTP18、LMTP19或LMTP20之表現。 5.3.2 內含子

本發明之另一態樣係關於在調節盒中包含內含子之AAV載體。實例2展現微小肌縮蛋白編碼序列之VH4內含子5’增強了正確剪接，且因此增強微小肌縮蛋白表現。因此，在一些實施例中，內含子與編碼微小肌縮蛋白(例如ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR、ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT、ABD-H1-R1-R2-R16-R17-R24-H4-CR或ABD-H1-R1-R2-R16-R17-R24-H4-CR-CT)之序列之5’端偶合。具體而言，內含子可與肌動蛋白結合域連接。在其他實施例中，內含子之長度小於100個核苷酸。

在實施例中，內含子係VH4內含子。VH4內含子核酸可包含如下表7中所示之SEQ ID NO: 41。表 7 ：不同內含子之核苷酸序列

結構	SEQ ID	序列
VH4內含子	41	GTGAGTATCTCAGGGATCCAGACATGGGGATATGGGAGGTGCCTCTGATC CCAGGGCTCACTGTGGGTCTCTCTGTTCACAG
嵌合內含子	75	GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG
SV40內含子	76	GTAAGTTTAGTCTTTTTGTCTTTTATTTCAGGTCCCGGATCCGGTGGTGGTGCAAATCAAAGAACTGCTCCTCAGTGGATGTTGCCTTTACTTCTAG

在其他實施例中，內含子係衍生自人類β-珠蛋白及Ig重鏈之嵌合內含子(亦稱為β-珠蛋白剪接供體/免疫球蛋白重鏈剪接受體內含子、或β-珠蛋白/IgG嵌合內含子) (表7，SEQ ID NO: 75)。可採用熟習此項技術者熟知之其他內含子，例如雞β-肌動蛋白內含子、小鼠細小病毒(MVM)內含子、人類因子IX內含子(例如FIX截短之內含子1)、β-珠蛋白剪接供體/免疫球蛋白重鏈剪接受體內含子、腺病毒剪接供體/免疫球蛋白剪接受體內含子、SV40晚期剪接供體/剪接受體(19S/16S)內含子(表7，SEQ ID NO: 76)。 5.3.3 其他調節元件 5.3.3.1 聚A

本揭示內容之另一態樣係關於在微小肌縮蛋白轉基因之編碼區下游包含多腺苷酸化(聚A)位點之表現盒。任何發出轉錄終止信號並引導聚A尾合成之聚A位點適用於本揭示內容之AAV載體。實例性聚A信號衍生自但不限於以下：SV40晚期基因、兔β-珠蛋白基因、牛生長激素(BPH)基因、人類生長激素(hGH)基因及合成聚A (SPA)位點。在一個實施例中，聚A信號包含如表8中所示之SEQ ID NO: 42。表 8 ：聚 A 信號之核苷酸序列

結構	SEQ ID	序列
聚A	42	AGGCCTAATAAAGAGCTCAGATGCATCGATCAGAGTGTGTTGGTTTTTTG

5.3.4 病毒載體

根據本揭示內容之微小肌縮蛋白轉基因可包括於AAV載體中，用於向人類個體進行基因療法投與。在一些實施例中，重組AAV (rAAV)載體可包含AAV病毒殼體及病毒或人工基因體，其包含側接AAV反向末端重複(ITR)之表現盒，其中表現盒包含微小肌縮蛋白轉基因，該轉基因可操作地連接至一或多個控制轉基因在人類肌細胞或CNS細胞中之表現之調節序列以表現及遞送微小肌縮蛋白。所提供之方法適用於產生用於遞送本文所述微小肌縮蛋白之任何分離之重組AAV粒子，適用於產生包含編碼微小肌縮蛋白之任何分離之重組AAV粒子之組合物，或適用於在有需要之個體中治療適於用微小肌縮蛋白治療之疾病或病症的方法，該方法包含投與編碼本文所述微小肌縮蛋白之任何分離之重組AAV粒子。因此，rAAV可為業內已知之其任何血清型、變體、修飾形式、雜合體或衍生物或其任一組合(統稱為「血清型」)。在特定實施例中，AAV血清型具有肌肉組織向性。在其他實施例中，AAV血清型具有CNS向性。在其他實施例中，AAV血清型具有肌肉組織及CNS向性。且在其他實施例中，AAV血清型具有肝向性，在該情形下，用AAV轉導之肝細胞形成微小肌縮蛋白分泌細胞之貯庫，將微小肌縮蛋白分泌至循環中。

在一些實施例中，rAAV粒子具有來自選自以下之AAV血清型之殼體蛋白： AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、 AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15、或AAV.HSC16或其衍生物、修飾形式或假型。在一些實施例中，rAAV粒子包含與(例如)選自以下之AAV殼體血清型之VP1、VP2及/或VP3序列至少80%或更大一致、例如85%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%等、即高達100%一致的殼體蛋白：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15及AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、rAAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15、或AAV.HSC16、或其衍生物、修飾形式或假型。

舉例而言，rAAV粒子之群體可包含兩種或更多種血清型，例如包含以下中之兩者或更多者：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15及AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15、或AAV.HSC16或其他rAAV粒子、或其兩者或更多者之組合。)

在一些實施例中，rAAV粒子包含Anc80或Anc80L65之殼體，如Zinn等人，2015, Cell Rep. 12(6): 1056-1068中所述，其全文以引用方式併入。在某些實施例中，rAAV粒子包含具有以下胺基酸插入中之一者之殼體：LGETTRP或LALGETTRP，如美國專利第9,193,956號、第9458517號及第9,587,282號及美國專利申請公開案第2016/0376323號中所述，其各自係全文以引用方式併入本文中。在一些實施例中，rAAV粒子包含AAV.7m8之殼體，如美國專利第9,193,956號、第9,458,517號及第9,587,282號及美國專利申請公開案第2016/0376323號中所述，其各自係全文以引用方式併入本文中。在一些實施例中，rAAV粒子包含如美國專利第9,585,971號中所揭示之任何AAV殼體，例如AAVPHP.B。在一些實施例中，rAAV粒子包含美國專利第9,840,719號及WO 2015/013313中揭示之任何AAV殼體，例如AAV.Rh74及RHM4-1，該等專利各自係全文以引用方式併入本文中。在一些實施例中，rAAV粒子包含WO 2014/172669中揭示之任何AAV殼體，例如AAV rh.74，該專利全文以引用方式併入本文中。在一些實施例中，rAAV粒子包含AAV2/5之殼體，如Georgiadis等人，2016, Gene Therapy 23: 857-862及Georgiadis等人，2018, Gene Therapy 25: 450中所述，其各自係全文以引用方式併入。在一些實施例中，rAAV粒子包含WO 2017/070491中所揭示之任何AAV殼體，例如AAV2tYF，該專利係以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，rAAV粒子包含AAVLK03或AAV3B之殼體，如Puzzo等人，2017, Sci. Transl. Med. 29(9): 418中所述，其全文以引用方式併入。在一些實施例中，rAAV粒子包含美國專利第8,628,966號、US 8,927,514、US 9,923,120及WO 2016/049230中揭示之任何AAV殼體，例如HSC1、HSC2、HSC3、HSC4、HSC5、HSC6、HSC7、HSC8、HSC9、HSC10、HSC11、HSC12、HSC13、HSC14、HSC15或HSC16，該等專利各自係以全文引用之方式併入。

在一些實施例中，rAAV粒子包含各自以全文引用之方式併入本文中之以下專利及專利申請案中之任一者中所揭示的AAV殼體：美國專利第7,282,199號、第7,906,111號、第8,524,446號、第8,999,678號、第8,628,966號、第8,927,514號、第8,734,809號；US 9,284,357、9,409,953、9,169,299、9,193,956、9458517及9,587,282；美國專利申請公開案第2015/0374803號、第2015/0126588號、第2017/0067908號、第2013/0224836號、第2016/0215024號、第2017/0051257號；及國際專利申請案第PCT/US2015/034799號、第PCT/EP2015/053335號。在一些實施例中，rAAV粒子具有與各自以全文引用之方式併入本文中之以下專利及專利申請案中之任一者中所揭示的AAV殼體之VP1、VP2及/或VP3序列至少80%或更大一致、例如85%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%等、即高達100%一致的殼體蛋白：美國專利第7,282,199號、第7,906,111號、第8,524,446號、第8,999,678號、第8,628,966號、第8,927,514號、第8,734,809號；US 9,284,357、9,409,953、9,169,299、9,193,956、9458517及9,587,282；美國專利申請公開案第2015/0374803號、第2015/0126588號、第2017/0067908號、第2013/0224836號、第2016/0215024號、第2017/0051257號；及國際專利申請案第PCT/US2015/034799號、第PCT/EP2015/053335號。

在一些實施例中，rAAV粒子具有以下中揭示之殼體蛋白：國際申請公開案第WO 2003/052051號(例如，參見´051之SEQ ID NO: 2)、第WO 2005/033321號(例如，參見´321之SEQ ID NO: 123及88)、第WO 03/042397號(例如，參見´397之SEQ ID NO: 2、81、85及97)、第WO 2006/068888號(例如，參見´888之SEQ ID NO: 1及3-6)、第WO 2006/110689號(例如，參見´689之SEQ ID NO: 5-38)、第WO2009/104964號(例如，參見´964之SEQ ID NO: 1-5、7、9、20、22、24及31)、第WO 2010/127097號(例如，參見´097之SEQ ID NO: 5-38)及第WO 2015/191508號(例如，參見´508之SEQ ID NO: 80-294)、及美國申請公開案第20150023924號(例如，參見´924之SEQ ID NO: 1、5-10)，每一專利之內容係以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，rAAV粒子具有與以下中揭示之AAV殼體之VP1、VP2及/或VP3序列至少80%或更大一致、例如85%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%等、即高達100%一致的殼體蛋白：國際申請公開案第WO 2003/052051號(例如，參見´051之SEQ ID NO: 2)、第WO 2005/033321號(例如，參見´321之SEQ ID NO: 123及88)、第WO 03/042397號(例如，參見´397之SEQ ID NO: 2、81、85及97)、第WO 2006/068888號(例如，參見´888之SEQ ID NO: 1及3-6)、第WO 2006/110689號(例如，參見´689之SEQ ID NO: 5-38)、第WO2009/104964號(例如，參見964之SEQ ID NO: 1-5、7、9、20、22、24及31)、第W0 2010/127097號(例如，參見´097之SEQ ID NO: 5-38)及第WO 2015/191508號(例如，參見´508之SEQ ID NO: 80-294)、及美國申請公開案第20150023924號(例如，參見´924之SEQ ID NO: 1、5-10)。

基於AAV之病毒載體之核酸序列及製備重組AAV及AAV殼體之方法教示於以下中：例如，美國專利第7,282,199號、第7,906,111號、第8,524,446號、第8,999,678號、第8,628,966號、第8,927,514號、第8,734,809號；US 9,284,357、9,409,953、9,169,299、9,193,956、9458517及9,587,282；美國專利申請公開案第2015/0374803號、第2015/0126588號、第2017/0067908號、第2013/0224836號、第2016/0215024號、第2017/0051257號；國際專利申請案第PCT/US2015/034799號、第PCT/EP2015/053335號；WO 2003/052051、WO 2005/033321、WO 03/042397、WO 2006/068888、WO 2006/110689、WO2009/104964、W0 2010/127097及WO 2015/191508、及美國專利申請公開案第20150023924號。

在其他實施例中，rAAV粒子包含假型AAV殼體。在一些實施例中，假型AAV殼體係rAAV2/8或rAAV2/9假型AAV殼體。產生及使用假型rAAV粒子之方法為業內已知(例如，參見Duan等人，J. Virol., 75:7662-7671 (2001)；Halbert等人，J. Virol., 74:1524-1532 (2000)；Zolotukhin等人，Methods 28:158-167 (2002)；及Auricchio等人，Hum. Molec. Genet. 10:3075-3081, (2001))。

在某些實施例中，可使用單鏈AAV (ssAAV)。在某些實施例中，可使用自補載體，例如scAAV (例如，參見Wu, 2007, Human Gene Therapy, 18(2):171-82, McCarty等人，2001, Gene Therapy, 第8卷，第16期，第1248-1254頁；及美國專利第6,596,535號、第7,125,717號及第7,456,683號，其各自係全文以引用方式併入本文中)。

在一些實施例中，rAAV粒子包含來自選自AAV8或AAV9之AAV殼體血清型的殼體蛋白。在一些實施例中，rAAV粒子包含來自選自由以下組成之群之AAV殼體血清型的殼體蛋白：AAV7、AAV8、AAV9、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu31、AAV.hu32、AAV.hu37、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB及AAV.7m8。在一些實施例中，rAAV粒子包含與AAV8或AAV9具有高序列同源性之殼體蛋白，例如AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu31、AAV.hu32及AAV.hu37。在一些實施例中，rAAV粒子具有AAV1之AAV殼體血清型或其衍生物、修飾形式或假型。在一些實施例中，rAAV粒子具有AAV4之AAV殼體血清型或其衍生物、修飾形式或假型。在一些實施例中，rAAV粒子具有AAV5之AAV殼體血清型或其衍生物、修飾形式或假型。在一些實施例中，rAAV粒子具有AAV8之AAV殼體血清型或其衍生物、修飾形式或假型。在一些實施例中，rAAV粒子具有AAV9之AAV殼體血清型或其衍生物、修飾形式或假型。

在一些實施例中，rAAV粒子包含為AAV8或AAV9殼體蛋白之衍生物、修飾形式或假型的殼體蛋白。在一些實施例中，rAAV粒子包含殼體蛋白，其具有與AAV8殼體蛋白之VP1、VP2及/或VP3序列至少80%或更大一致、例如85%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%等、即高達100%一致的AAV8殼體蛋白。在一些實施例中，rAAV粒子包含為AAV9殼體蛋白之衍生物、修飾形式或假型的殼體蛋白。在一些實施例中，rAAV粒子包含殼體蛋白，其具有與AAV8殼體蛋白之VP1、VP2及/或VP3序列至少80%或更大一致、例如85%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%等、即高達100%一致的AAV9殼體蛋白。

在一些實施例中，rAAV粒子包含與AAV7、AAV8、AAV9、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu31、AAV.hu32、AAV.hu37、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB或AAV.7m8殼體蛋白之VP1、VP2及/或VP3序列具有至少80%或更大一致性、例如85%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%等、即高達100%一致性的殼體蛋白。在一些實施例中，rAAV粒子包含與AAV殼體蛋白之VP1、VP2及/或VP3序列具有至少80%或更大一致性、例如85%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%等、即高達100%一致性的殼體蛋白，該AAV殼體蛋白與AAV8或AAV9具有高序列同源性，例如AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu31、AAV.hu32及AAV.hu37。

在其他實施例中，rAAV粒子包含鑲嵌殼體。鑲嵌AAV粒子由來自AAV之不同血清型之病毒殼體蛋白之混合物構成。在一些實施例中，rAAV粒子包含含有選自以下之血清型之殼體蛋白的鑲嵌殼體：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15及AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、 AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15及AAV.HSC16。

在一些實施例中，rAAV粒子包含含有選自以下之血清型之殼體蛋白的鑲嵌殼體：AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAVrh.8及AAVrh.10。

在其他實施例中，rAAV粒子包含假型rAAV粒子。在一些實施例中，假型rAAV粒子包含(a) 包含AAV ITR之核酸載體及(b)由衍生自AAVx (例如AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10 AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15及AAV16)之殼體蛋白構成的殼體。在其他實施例中，rAAV粒子包含由選自以下之AAV血清型之殼體蛋白構成的假型rAAV粒子：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15及AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu31、AAV.hu32、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10 、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15及AAV.HSC16。在其他實施例中，rAAV粒子包含含有AAV8殼體蛋白之假型rAAV粒子。在其他實施例中，rAAV粒子包含由AAV9殼體蛋白構成之假型rAAV粒子。在一些實施例中，假型rAAV8或rAAV9粒子係rAAV2/8或rAAV2/9假型粒子。產生及使用假型rAAV粒子之方法為業內已知(例如，參見Duan等人，J. Virol., 75:7662-7671 (2001)；Halbert等人，J. Virol., 74:1524-1532 (2000)；Zolotukhin等人，Methods 28:158-167 (2002)；及Auricchio等人，Hum. Molec. Genet. 10:3075-3081, (2001))。

在其他實施例中，rAAV粒子包含含有兩種或更多種AAV殼體血清型之殼體蛋白嵌合體的殼體。在其他實施例中，殼體蛋白係2種或更多種來自選自以下之AAV血清型之AAV殼體蛋白的嵌合體：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15及AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、rAAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10 、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15及AAV.HSC16。在其他實施例中，殼體蛋白係2種或更多種來自選自以下之AAV血清型之AAV殼體蛋白的嵌合體：AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAVrh.8及AAVrh.10。

在一些實施例中，rAAV粒子包含AAV8殼體蛋白及一或多種來自選自以下之AAV血清型之AAV殼體蛋白的AAV殼體蛋白嵌合體：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15及AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15及AAV.HSC16。在一些實施例中，rAAV粒子包含AAV8殼體蛋白及一或多種來自選自以下之AAV血清型之AAV殼體蛋白的AAV殼體蛋白嵌合體：AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV9、AAV10、AAVrh.8及AAVrh.10。

在一些實施例中，rAAV粒子包含AAV9殼體蛋白及一或多種來自選自以下之AAV殼體血清型之殼體蛋白的AAV殼體蛋白嵌合體：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15及AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、 AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15及AAV.HSC16。

在一些實施例中，rAAV粒子包含AAV9殼體蛋白及一或多種來自選自以下之AAV殼體血清型之殼體蛋白的AAV殼體蛋白嵌合體：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AA6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.8及AAVrh.10。

在一些實施例中，rAAV粒子包含A、B、E或F分支AAV殼體蛋白。. 在一些實施例中，rAAV粒子包含F分支AAV殼體蛋白。在一些實施例中，rAAV粒子包含E分支AAV殼體蛋白。

下表9提供AAV8、AAV9、AAV.rh74、AAV.hu31、AAV.hu32及AAV.hu37殼體蛋白之胺基酸序列及AAV2 5’-及3’ ITR之核酸序列的實例。表 9 ：

結構	SEQ ID	序列
5’-ITR	73	cgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgc agagagggagtggccaactccatcactaggggttcct Rep蛋白結合位點(rps)加下劃線。
3’-ITR	74	aggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagc gcgcag Rep蛋白結合位點(rps)加下劃線。
AAV8殼體	77	MAADGYLPDW LEDNLSEGIR EWWALKPGAP KPKANQQKQD DGRGLVLPGY KYLGPFNGLD KGEPVNAADA AALEHDKAYD QQLQAGDNPY LRYNHADAEF QERLQEDTSF GGNLGRAVFQ AKKRVLEPLG LVEEGAKTAP GKKRPVEPSP QRSPDSSTGI GKKGQQPARK RLNFGQTGDS ESVPDPQPLG EPPAAPSGVG PNTMAAGGGA PMADNNEGAD GVGSSSGNWH CDSTWLGDRV ITTSTRTWAL PTYNNHLYKQ ISNGTSGGAT NDNTYFGYST PWGYFDFNRF HCHFSPRDWQ RLINNNWGFR PKRLSFKLFN IQVKEVTQNE GTKTIANNLT STIQVFTDSE YQLPYVLGSA HQGCLPPFPA DVFMIPQYGY LTLNNGSQAV GRSSFYCLEY FPSQMLRTGN NFQFTYTFED VPFHSSYAHS QSLDRLMNPL IDQYLYYLSR TQTTGGTANT QTLGFSQGGP NTMANQAKNW LPGPCYRQQR VSTTTGQNNN SNFAWTAGTK YHLNGRNSLA NPGIAMATHK DDEERFFPSN GILIFGKQNA ARDNADYSDV MLTSEEEIKT TNPVATEEYG IVADNLQQQN TAPQIGTVNS QGALPGMVWQ NRDVYLQGPI WAKIPHTDGN FHPSPLMGGF GLKHPPPQIL IKNTPVPADP PTTFNQSKLN SFITQYSTGQ VSVEIEWELQ KENSKRWNPE IQYTSNYYKS TSVDFAVNTE GVYSEPRPIG TRYLTRNL
AAV9殼體	78	MAADGYLPDW LEDNLSEGIR EWWALKPGAP QPKANQQHQD NARGLVLPGY KYLGPGNGLD KGEPVNAADA AALEHDKAYD QQLKAGDNPY LKYNHADAEF QERLKEDTSF GGNLGRAVFQ AKKRLLEPLG LVEEAAKTAP GKKRPVEQSP QEPDSSAGIG KSGAQPAKKR LNFGQTGDTE SVPDPQPIGE PPAAPSGVGS LTMASGGGAP VADNNEGADG VGSSSGNWHC DSQWLGDRVI TTSTRTWALP TYNNHLYKQI SNSTSGGSSN DNAYFGYSTP WGYFDFNRFH CHFSPRDWQR LINNNWGFRP KRLNFKLFNI QVKEVTDNNG VKTIANNLTS TVQVFTDSDY QLPYVLGSAH EGCLPPFPAD VFMIPQYGYL TLNDGSQAVG RSSFYCLEYF PSQMLRTGNN FQFSYEFENV PFHSSYAHSQ SLDRLMNPLI DQYLYYLSKT INGSGQNQQT LKFSVAGPSN MAVQGRNYIP GPSYRQQRVS TTVTQNNNSE FAWPGASSWA LNGRNSLMNP GPAMASHKEG EDRFFPLSGS LIFGKQGTGR DNVDADKVMI TNEEEIKTTN PVATESYGQV ATNHQSAQAQ AQTGWVQNQG ILPGMVWQDR DVYLQGPIWA KIPHTDGNFH PSPLMGGFGM KHPPPQILIK NTPVPADPPT AFNKDKLNSF ITQYSTGQVS VEIEWELQKE NSKRWNPEIQ YTSNYYKSNN VEFAVNTEGV YSEPRPIGTR YLTRNL
hu.37殼體	112	MAADGYLPDW LEDNLSEGIR EWWDLKPGAP KPKANQQKQD DGRGLVLPGY KYLGPFNGLD KGEPVNAADA AALEHDKAYD QQLKAGDNPY LRYNHADAEF QERLQEDTSF GGNLGRAVFQ AKKRVLEPLG LVEEAAKTAP GKKRPVEPSP QRSPDSSTGI GKKGQQPAKK RLNFGQTGDS ESVPDPQPIG EPPAGPSGLG SGTMAAGGGA PMADNNEGAD GVGSSSGNWH CDSTWLGDRV ITTSTRTWAL PTYNNHLYKQ ISNGTSGGST NDNTYFGYST PWGYFDFNRF HCHFSPRDWQ RLINNNWGFR PKRLSFKLFN IQVKEVTQNE GTKTIANNLT STIQVFTDSE YQLPYVLGSA HQGCLPPFPA DVFMIPQYGY LTLNNGSQAV GRSSFYCLEY FPSQMLRTGN NFEFSYTFED VPFHSSYAHS QSLDRLMNPL IDQYLYYLSR TQSTGGTQGT QQLLFSQAGP ANMSAQAKNW LPGPCYRQQR VSTTLSQNNN SNFAWTGATK YHLNGRDSLV NPGVAMATHK DDEERFFPSS GVLMFGKQGA GRDNVDYSSV MLTSEEEIKT TNPVATEQYG VVADNLQQTN TGPIVGNVNS QGALPGMVWQ NRDVYLQGPI WAKIPHTDGN FHPSPLMGGF GLKHPPPQIL IKNTPVPADP PTTFSQAKLA SFITQYSTGQ VSVEIEWELQ KENSKRWNPE IQYTSNYYKS TNVDFAVNTE GTYSEPRPIG TRYLTRNL
hu.31殼體	113	MAADGYLPDW LEDTLSEGIR QWWKLKPGPP PPKPAERHKD DSRGLVLPGY KYLGPGNGLD KGEPVNAADA AALEHDKAYD QQLKAGDNPY LKYNHADAEF QERLKEDTSF GGNLGRAVFQ AKKRLLEPLG LVEEAAKTAP GKKRPVEQSP QEPDSSAGIG KSGSQPAKKK LNFGQTGDTE SVPDPQPIGE PPAAPSGVGS LTMASGGGAP VADNNEGADG VGSSSGNWHC DSQWLGDRVI TTSTRTWALP TYNNHLYKQI SNSTSGGSSN DNAYFGYSTP WGYFDFNRFH CHFSPRDWQR LINNNWGFRP KRLNFKLFNI QVKEVTDNNG VKTIANNLTS TVQVFTDSDY QLPYVLGSAH EGCLPPFPAD VFMIPQYGYL TLNDGGQAVG RSSFYCLEYF PSQMLRTGNN FQFSYEFENV PFHSSYAHSQ SLDRLMNPLI DQYLYYLSKT INGSGQNQQT LKFSVAGPSN MAVQGRNYIP GPSYRQQRVS TTVTQNNNSE FAWPGASSWA LNGRNSLMNP GPAMASHKEG EDRFFPLSGS LIFGKQGTGR DNVDADKVMI TNEEEIKTTN PVATESYGQV ATNHQSAQAQ AQTGWVQNQG ILPGMVWQDR DVYLQGPIWA KIPHTDGNFH PSPLMGGFGM KHPPPQILIK NTPVPADPPT AFNKDKLNSF ITQYSTGQVS VEIEWELQKE NSKRWNPEIQ YTSNYYKSNN VEFAVSTEGV YSEPRPIGTR YLTRNL
hu.32 殼體	114	MAADGYLPDW LEDTLSEGIR QWWKLKPGPP PPKPAERHKD DSRGLVLPGY KYLGPGNGLD KGEPVNAADA AALEHDKAYD QQLKAGDNPY LKYNHADAEF QERLKEDTSF GGNLGRAVFQ AKKRLLEPLG LVEEAAKTAP GKKRPVEQSP QEPDSSAGIG KSGSQPAKKK LNFGQTGDTE SVPDPGQPIG EPPAAPSGVG SLTMASGGGA PVADNNEGAD GVGSSSGNWH CDSQWLGDRV ITTSTRTWAL PTYNNHLYKQ ISNSTSGGSS NDNAYFGYST PWGYFDFNRF HCHFSPRDWQ RLINNNWGFR PKRLNFKLFN IQVKEVTDNN GVKTIANNLT STVQVFTDSD YQLPYVLGSA HEGCLPPFPA DVFMIPQYGY LTLNDGSQAV GRSSFYCLEY FPSQMLRTGN NFQFSYEFEN VPFHSSYAHS QSLDRLMNPL IDQYLYYLSK TINGSGQNQQ TLKFSVAGPS NMAVQGRNYI PGPSYRQQRV STTVTQNNNS EFAWPGASSW ALNGRNSLMN PGPAMASHKE GEDRFFPLSG SLIFGKQGTG RDNVDADKVM ITNEEEIKTT NPVATESYGQ VATNHQSAQA QAQTGWVQNQ GILPGMVWQD RDVYLQGPIW AKIPHTDGNF HPSPLMGGFG MKHPPPQILI KNTPVPADPP TAFNKDKLNS FITQYSTGQV SVEIEWELQK ENSKRWNPEI QYTSNYYKSN NVEFAVNTEG VYSEPRPIGT RYLTRNL
Rh.74形式1	127	MAADGYLPD WLEDNLSEG IREWWDLKP GAPKPKANQ QKQDNGRGL VLPGYKYLG PFNGLDKGE PVNAADAAA LEHDKAYDQ QLQAGDNPY LRYNHADAE FQERLQEDT SFGGNLGRA VFQAKKRVL EPLGLVESP VKTAPGKKR PVEPSPQRS PDSSTGIGK KGQQPAKKR LNFGQTGDS ESVPDPQPI GEPPAGPSG LGSGTMAAG GGAPMADNN EGADGVGSS SGNWHCDST WLGDRVITT STRTWALPT YNNHLYKQI SNGTSGGST NDNTYFGYS TPWGYFDFN RFHCHFSPR DWQRLINNN WGFRPKRLN FKLFNIQVK EVTQNEGTK TIANNLTST IQVFTDSEY QLPYVLGSA HQGCLPPFP ADVFMIPQY GYLTLNNGS QAVGRSSFY CLEYFPSQM LRTGNNFEF SYNFEDVPF HSSYAHSQS LDRLMNPLI DQYLYYLSR TQSTGGTAG TQQLLFSQA GPNNMSAQA KNWLPGPCY RQQRVSTTL SQNNNSNFA WTGATKYHL NGRDSLVNP GVAMATHKD DEERFFPSS GVLMFGKQG AGKDNVDYS SVMLTSEEE IKTTNPVAT EQYGVVADN LQQQNAAPI VGAVNSQGA LPGMVWQNR DVYLQGPIW AKIPHTDGN FHPSPLMGG FGLKHPPPQ ILIKNTPVP ADPPTTFNQ AKLASFITQ YSTGQVSVE IEWELQKEN SKRWNPEIQ YTSNYYKST NVDFAVNTE GTYSEPRPI GTRYLTRNL
Rh.74形式2	85	MAADGYLPD WLEDNLSEG IREWWDLKP GAPKPKANQ QKQDNGRGL VLPGYKYLG PFNGLDKGE PVNAADAAA LEHDKAYDQ QLQAGDNPY LRYNHADAE FQERLQEDT SFGGNLGRA VFQAKKRVL EPLGLVESP VKTAPGKKR PVEPSPQRS PDSSTGIGK KGQQPAKKR LNFGQTGDS ESVPDPQPI GEPPAAPSG VGPNTMAAG GGAPMADNN EGADGVGSS SGNWHCDST WLGDRVITT STRTWALPT YNNHLYKQI SNGTSGGST NDNTYFGYS TPWGYFDFN RFHCHFSPR DWQRLINNN WGFRPKRLN FKLFNIQVK EVTQNEGTK TIANNLTST IQVFTDSEY QLPYVLGSA HQGCLPPFP ADVFMIPQY GYLTLNNGS QAVGRSSFY CLEYFPSQM LRTGNNFEF SYNFEDVPF HSSYAHSQS LDRLMNPLI DQYLYYLSR TQSTGGTAG TQQLLFSQA GPNNMSAQA KNWLPGPCY RQQRVSTTL SQNNNSNFA WTGATKYHL NGRDSLVNP GVAMATHKD DEERFFPSS GVLMFGKQG AGKDNVDYS SVMLTSEEE IKTTNPVAT EQYGVVADN LQQQNAAPI VGAVNSQGA LPGMVWQNR DVYLQGPIW AKIPHTDGN FHPSPLMGG FGLKHPPPQ ILIKNTPVP ADPPTTFNQ AKLASFITQ YSTGQVSVE IEWELQKEN SKRWNPEIQ YTSNYYKST NVDFAVNTE GTYSEPRPI GTRYLTRNL

所提供之方法適用於產生編碼轉基因之重組AAV。在某些實施例中，轉基因係如本文所述之微小肌縮蛋白。在一些實施例中，rAAV基因體包含含有以下組分之載體：(1)側接表現盒之AAV反向末端重複；(2)調節控制元件，例如a)啟動子/增強子，b) 聚A信號，及c)視情況內含子；及(3)編碼所述轉基因之核酸序列。在具體實施例中，本文所述之構築體包含以下組分：(1)側接表現盒之AAV2或AAV8反向末端重複(ITR)；(2)控制元件，其包括肌肉特異性SPc5.12啟動子及小poly A信號；及(3)提供(例如編碼)編碼本文所述微小肌縮蛋白之核酸的轉基因。在具體實施例中，本文所述構築體包含以下組分：(1) 側接表現盒之AAV2或AAV8 ITR；(2) 控制元件，其包括a) 肌肉特異性SPc5.12啟動子，b)小poly A信號；及(3) 微小肌縮蛋白盒，其自N端至C端包括ABD1-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR、ABD1-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT、ABD-H1-R1-R2-R16-R17-R24-H4-CR或ABD-H1-R1-R2-R16-R17-R24-H4-CR-CT。在具體實施例中，本文所述構築體包含以下組分：(1) 側接表現盒之AAV2或AAV8 ITR；(2) 控制元件，其包括a) CNS啟動子，b)小poly A信號；及(3) 微小肌縮蛋白盒，其自N端至C端包括ABD1-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR、ABD1-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT、ABD-H1-R1-R2-R16-R17-R24-H4-CR或ABD-H1-R1-R2-R16-R17-R24-H4-CR-CT。在具體實施例中，本文所述構築體包含以下組分：(1) 側接表現盒之AAV2或AAV8 ITR；(2) 控制元件，其包括a) 肌肉特異性SPc5.12啟動子，b)內含子(例如VH4)及c) 小poly A信號；及(3) 微小肌縮蛋白盒，其自N端至C端包括ABD1-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR、ABD1-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT、ABD-H1-R1-R2-R16-R17-R24-H4-CR或ABD-H1-R1-R2-R16-R17-R24-H4-CR-CT，ABD1直接與VH4偶合。在具體實施例中，本文所述構築體包含以下組分：(1) 側接表現盒之AAV2或AAV8 ITR；(2) 控制元件，其包括a) CNS啟動子，b)內含子(例如VH4)及c)小poly A信號；及(3) 微小肌縮蛋白盒，其自N端至C端包括ABD1-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR、ABD1-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT、ABD-H1-R1-R2-R16-R17-R24-H4-CR或ABD-H1-R1-R2-R16-R17-R24-H4-CR-CT，ABD1直接與VH4偶合。在具體實施例中，本文所述構築體包含以下組分：(1) 側接表現盒之AAV2或AAV8 ITR；(2) 控制元件，其包括a) 用於肌肉特異性轉基因表現之最小SPc啟動子，b) 視情況人類免疫球蛋白重鏈可變區內含子(例如VH4)及c) 小poly A信號；及(3) 微小肌縮蛋白盒，其自N端至C端包括ABD1-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR、ABD1-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT、ABD-H1-R1-R2-R16-R17-R24-H4-CR或ABD-H1-R1-R2-R16-R17-R24-H4-CR-CT。在具體實施例中，本文所述構築體包含以下組分：(1) 側接表現盒之AAV2或AAV8 ITR；(2) 控制元件，其包括a) 肌肉特異性SPc5.12啟動子或CNS啟動子，b)內含子(例如VH4)及c) 小poly A信號；及(3) 微小肌縮蛋白盒，其自N端至C端包括ABD1-H1-R1-R2-R3-H2-R24-H4-CR、ABD1-H1-R1-R2-R3-H2-R24-H4-CR-CT、ABD-H1-R1-R2-R16-R17-R24-H4-CR或ABD-H1-R1-R2-R16-R17-R24-H4-CR-CT，ABD1直接與VH4偶合。在一些實施例中，包含側接微小肌縮蛋白表現盒(其自N端至C端包括ABD1-H1-R1-R2-R3-H2-R24-H4-CR、ABD1-H1-R1-R2-R3-H2-R24-H4-CR-CT、ABD-H1-R1-R2-R16-R17-R24-H4-CR或ABD-H1-R1-R2-R16-R17-R24-H4-CR-CT)之AAV ITR的本文所述構築體之長度可介於4000 nt與5000 nt之間，在一些實施例中，該等構築體之長度小於4900 nt、4800 nt、4700 nt、4600 nt、4500 nt、4400 nt或4300 nt。

本揭示內容之一些核酸實施例包含編碼微小肌縮蛋白之rAAV載體，該微小肌縮蛋白包含下表10中提供之SEQ ID NO: 53、54、55、56或82之核苷酸序列或由其組成。在各個實施例中，rAAV載體包含核苷酸序列，該核苷酸序列與SEQ ID NO: 53、54、55、56、82之核苷酸序列或其反向互補體具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性且編碼適於在肌細胞中表現治療有效之微小肌縮蛋白之rAAV載體。表 10 ： RGX-DYS 盒核苷酸序列

結構	SEQ ID	核酸序列
RGX-DYS1 (全盒SPc5-12至聚A，包括介入序列) 4734bpITR 以小寫顯示	53	ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcctCATATGcagggtaatggggatcctCTAGAGGCCGTCCGCCCTCGGCACCATCCTCACGACACCCAAATATGGCGACGGGTGAGGAATGGTGGGGAGTTATTTTTAGAGCGGTGAGGAAGGTGGGCAGGCAGCAGGTGTTGGCGCTCTAAAAATAACTCCCGGGAGTTATTTTTAGAGCGGAGGAATGGTGGACACCCAAATATGGCGACGGTTCCTCACCCGTCGCCATATTTGGGTGTCCGCCCTCGGCCGGGGCCGCATTCCTGGGGGCCGGGCGGTGCTCCCGCCCGCCTCGATAAAAGGCTCCGGGGCCGGCGGCGGCCCACGAGCTACCCGGAGGAGCGGGAGGCGCCAAGCGgAATTCGCCACCATGCTTTGGTGGGAAGAGGTGGAAGATTGCTATGAGAGGGAAGATGTGCAGAAGAAAACCTTCACCAAATGGGTCAATGCCCAGTTCAGCAAGTTTGGCAAGCAGCACATTGAGAACCTGTTCAGTGACCTGCAGGATGGCAGAAGGCTGCTGGATCTGCTGGAAGGCCTGACAGGCCAGAAGCTGCCTAAAGAGAAGGGCAGCACAAGAGTGCATGCCCTGAACAATGTGAACAAGGCCCTGAGAGTGCTGCAGAACAACAATGTGGACCTGGTCAATATTGGCAGCACAGACATTGTGGATGGCAACCACAAGCTGACCCTGGGCCTGATCTGGAACATCATCCTGCACTGGCAAGTGAAGAATGTGATGAAGAACATCATGGCTGGCCTGCAGCAGACCAACTCTGAGAAGATCCTGCTGAGCTGGGTCAGACAGAGCACCAGAAACTACCCTCAAGTGAATGTGATCAACTTCACCACCTCTTGGAGTGATGGACTGGCCCTGAATGCCCTGATCCACAGCCACAGACCTGACCTGTTTGACTGGAACTCTGTTGTGTGCCAGCAGTCTGCCACACAGAGACTGGAACATGCCTTCAACATTGCCAGATACCAGCTGGGAATTGAGAAACTGCTGGACCCTGAGGATGTGGACACCACCTATCCTGACAAGAAATCCATCCTCATGTACATCACCAGCCTGTTCCAGGTGCTGCCCCAGCAAGTGTCCATTGAGGCCATTCAAGAGGTTGAGATGCTGCCCAGACCTCCTAAAGTGACCAAAGAGGAACACTTCCAGCTGCACCACCAGATGCACTACTCTCAGCAGATCACAGTGTCTCTGGCCCAGGGATATGAGAGAACAAGCAGCCCCAAGCCTAGGTTCAAGAGCTATGCCTACACACAGGCTGCCTATGTGACCACATCTGACCCCACAAGAAGCCCATTTCCAAGCCAGCATCTGGAAGCCCCTGAGGACAAGAGCTTTGGCAGCAGCCTGATGGAATCTGAAGTGAACCTGGATAGATACCAGACAGCCCTGGAAGAAGTGCTGTCCTGGCTGCTGTCTGCTGAGGATACACTGCAGGCTCAGGGTGAAATCAGCAATGATGTGGAAGTGGTCAAGGACCAGTTTCACACCCATGAGGGCTACATGATGGACCTGACAGCCCACCAGGGCAGAGTGGGAAATATCCTGCAGCTGGGCTCCAAGCTGATTGGCACAGGCAAGCTGTCTGAGGATGAAGAGACAGAGGTGCAAGAGCAGATGAACCTGCTGAACAGCAGATGGGAGTGTCTGAGAGTGGCCAGCATGGAAAAGCAGAGCAACCTGCACAGAGTGCTCATGGACCTGCAGAATCAGAAACTGAAAGAACTGAATGACTGGCTGACCAAGACAGAAGAAAGGACTAGGAAGATGGAAGAGGAACCTCTGGGACCAGACCTGGAAGATCTGAAAAGACAGGTGCAGCAGCATAAGGTGCTGCAAGAGGACCTTGAGCAAGAGCAAGTCAGAGTGAACAGCCTGACACACATGGTGGTGGTTGTGGATGAGTCCTCTGGGGATCATGCCACAGCTGCTCTGGAAGAACAGCTGAAGGTGCTGGGAGACAGATGGGCCAACATCTGTAGGTGGACAGAGGATAGATGGGTGCTGCTCCAGGACATTCTGCTGAAGTGGCAGAGACTGACAGAGGAACAGTGCCTGTTTTCTGCCTGGCTCTCTGAGAAAGAGGATGCTGTCAACAAGATCCATACCACAGGCTTCAAGGATCAGAATGAGATGCTCAGCTCCCTGCAGAAACTGGCTGTGCTGAAGGCTGACCTGGAAAAGAAAAAGCAGTCCATGGGCAAGCTCTACAGCCTGAAGCAGGACCTGCTGTCTACCCTGAAGAACAAGTCTGTGACCCAGAAAACTGAGGCCTGGCTGGACAACTTTGCTAGATGCTGGGACAACCTGGTGCAGAAGCTGGAAAAGTCTACAGCCCAGATCAGCCAGCAACCTGATCTTGCCCCTGGCCTGACCACAATTGGAGCCTCTCCAACACAGACTGTGACCCTGGTTACCCAGCCAGTGGTCACCAAAGAGACAGCCATCAGCAAACTGGAAATGCCCAGCTCTCTGATGCTGGAAGTCCCCACACTGGAAAGGCTGCAAGAACTTCAAGAGGCCACAGATGAGCTGGACCTGAAGCTGAGACAGGCTGAAGTGATCAAAGGCAGCTGGCAGCCAGTTGGGGACCTGCTCATTGATAGCCTGCAGGACCATCTGGAAAAAGTGAAAGCCCTGAGGGGAGAGATTGCCCCTCTGAAAGAAAATGTGTCCCATGTGAATGACCTGGCCAGACAGCTGACCACACTGGGAATCCAGCTGAGCCCCTACAACCTGAGCACCCTTGAGGACCTGAACACCAGGTGGAAGCTCCTCCAGGTGGCAGTGGAAGATAGAGTCAGGCAGCTGCATGAGGCCCACAGAGATTTTGGACCAGCCAGCCAGCACTTTCTGTCTACCTCTGTGCAAGGCCCCTGGGAGAGAGCTATCTCTCCTAACAAGGTGCCCTACTACATCAACCATGAGACACAGACCACCTGTTGGGATCACCCCAAGATGACAGAGCTGTACCAGAGTCTGGCAGACCTCAACAATGTCAGATTCAGTGCCTACAGGACTGCCATGAAGCTCAGAAGGCTCCAGAAAGCTCTGTGCCTGGACCTGCTTTCCCTGAGTGCAGCTTGTGATGCCCTGGACCAGCACAATCTGAAGCAGAATGACCAGCCTATGGACATCCTCCAGATCATCAACTGCCTCACCACCATCTATGATAGGCTGGAACAAGAGCACAACAATCTGGTCAATGTGCCCCTGTGTGTGGACATGTGCCTGAATTGGCTGCTGAATGTGTATGACACAGGCAGAACAGGCAGGATCAGAGTCCTGTCCTTCAAGACAGGCATCATCTCCCTGTGCAAAGCCCACTTGGAGGACAAGTACAGATACCTGTTCAAGCAAGTGGCCTCCAGCACAGGCTTTTGTGACCAGAGAAGGCTGGGCCTGCTCCTGCATGACAGCATTCAGATCCCTAGACAGCTGGGAGAAGTGGCTTCCTTTGGAGGCAGCAATATTGAGCCATCAGTCAGGTCCTGTTTTCAGTTTGCCAACAACAAGCCTGAGATTGAGGCTGCCCTGTTCCTGGACTGGATGAGACTTGAGCCTCAGAGCATGGTCTGGCTGCCTGTGCTTCATAGAGTGGCTGCTGCTGAGACTGCCAAGCACCAGGCCAAGTGCAACATCTGCAAAGAGTGCCCCATCATTGGCTTCAGATACAGATCCCTGAAGCACTTCAACTATGATATCTGCCAGAGCTGCTTCTTTAGTGGCAGGGTTGCCAAGGGCCACAAAATGCACTACCCCATGGTGGAATACTGCACCCCAACAACCTCTGGGGAAGATGTTAGAGACTTTGCCAAGGTGCTGAAAAACAAGTTCAGGACCAAGAGATACTTTGCTAAGCACCCCAGAATGGGCTACCTGCCTGTCCAGACAGTGCTTGAGGGTGACAACATGGAAACCCCTGTGACACTGATCAATTTCTGGCCAGTGGACTCTGCCCCTGCCTCAAGTCCACAGCTGTCCCATGATGACACCCACAGCAGAATTGAGCACTATGCCTCCAGACTGGCAGAGATGGAAAACAGCAATGGCAGCTACCTGAATGATAGCATCAGCCCCAATGAGAGCATTGATGATGAGCATCTGCTGATCCAGCACTACTGTCAGTCCCTGAACCAGGACTCTCCACTGAGCCAGCCTAGAAGCCCTGCTCAGATCCTGATCAGCCTTGAGTCTGAGGAAAGGGGAGAGCTGGAAAGAATCCTGGCAGATCTTGAGGAAGAGAACAGAAACCTGCAGGCAGAGTATGACAGGCTCAAACAGCAGCATGAGCACAAGGGACTGAGCCCTCTGCCTTCTCCTCCTGAAATGATGCCCACCTCTCCACAGTCTCCAAGGTGATGACTCGAGAGGCCTAATAAAGAGCTCAGATGCATCGATCAGAGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGCCAGGGTAATGGGCTAGCTGCGGCCGCaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcag
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RGX-DYS5 (全盒SPc5-12至聚A，包括介入序列) 4560bpITR 以小寫顯示	82	ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcctCATATGcagggtaatggggatcctCTAGAGGCCGTCCGCCCTCGGCACCATCCTCACGACACCCAAATATGGCGACGGGTGAGGAATGGTGGGGAGTTATTTTTAGAGCGGTGAGGAAGGTGGGCAGGCAGCAGGTGTTGGCGCTCTAAAAATAACTCCCGGGAGTTATTTTTAGAGCGGAGGAATGGTGGACACCCAAATATGGCGACGGTTCCTCACCCGTCGCCATATTTGGGTGTCCGCCCTCGGCCGGGGCCGCATTCCTGGGGGCCGGGCGGTGCTCCCGCCCGCCTCGATAAAAGGCTCCGGGGCCGGCGGCGGCCCACGAGCTACCCGGAGGAGCGGGAGGCGCCAAGCGGAATTCGCCACCATGCTTTGGTGGGAAGAGGTGGAAGATTGCTATGAGAGGGAAGATGTGCAGAAGAAAACCTTCACCAAATGGGTCAATGCCCAGTTCAGCAAGTTTGGCAAGCAGCACATTGAGAACCTGTTCAGTGACCTGCAGGATGGCAGAAGGCTGCTGGATCTGCTGGAAGGCCTGACAGGCCAGAAGCTGCCTAAAGAGAAGGGCAGCACAAGAGTGCATGCCCTGAACAATGTGAACAAGGCCCTGAGAGTGCTGCAGAACAACAATGTGGACCTGGTCAATATTGGCAGCACAGACATTGTGGATGGCAACCACAAGCTGACCCTGGGCCTGATCTGGAACATCATCCTGCACTGGCAAGTGAAGAATGTGATGAAGAACATCATGGCTGGCCTGCAGCAGACCAACTCTGAGAAGATCCTGCTGAGCTGGGTCAGACAGAGCACCAGAAACTACCCTCAAGTGAATGTGATCAACTTCACCACCTCTTGGAGTGATGGACTGGCCCTGAATGCCCTGATCCACAGCCACAGACCTGACCTGTTTGACTGGAACTCTGTTGTGTGCCAGCAGTCTGCCACACAGAGACTGGAACATGCCTTCAACATTGCCAGATACCAGCTGGGAATTGAGAAACTGCTGGACCCTGAGGATGTGGACACCACCTATCCTGACAAGAAATCCATCCTCATGTACATCACCAGCCTGTTCCAGGTGCTGCCCCAGCAAGTGTCCATTGAGGCCATTCAAGAGGTTGAGATGCTGCCCAGACCTCCTAAAGTGACCAAAGAGGAACACTTCCAGCTGCACCACCAGATGCACTACTCTCAGCAGATCACAGTGTCTCTGGCCCAGGGATATGAGAGAACAAGCAGCCCCAAGCCTAGGTTCAAGAGCTATGCCTACACACAGGCTGCCTATGTGACCACATCTGACCCCACAAGAAGCCCATTTCCAAGCCAGCATCTGGAAGCCCCTGAGGACAAGAGCTTTGGCAGCAGCCTGATGGAATCTGAAGTGAACCTGGATAGATACCAGACAGCCCTGGAAGAAGTGCTGTCCTGGCTGCTGTCTGCTGAGGATACACTGCAGGCTCAGGGTGAAATCAGCAATGATGTGGAAGTGGTCAAGGACCAGTTTCACACCCATGAGGGCTACATGATGGACCTGACAGCCCACCAGGGCAGAGTGGGAAATATCCTGCAGCTGGGCTCCAAGCTGATTGGCACAGGCAAGCTGTCTGAGGATGAAGAGACAGAGGTGCAAGAGCAGATGAACCTGCTGAACAGCAGATGGGAGTGTCTGAGAGTGGCCAGCATGGAAAAGCAGAGCAACCTGCACAGAGTGCTCATGGACCTGCAGAATCAGAAACTGAAAGAACTGAATGACTGGCTGACCAAGACAGAAGAAAGGACTAGGAAGATGGAAGAGGAACCTCTGGGACCAGACCTGGAAGATCTGAAAAGACAGGTGCAGCAGCATAAGGTGCTGCAAGAGGACCTTGAGCAAGAGCAAGTCAGAGTGAACAGCCTGACACACATGGTGGTGGTTGTGGATGAGTCCTCTGGGGATCATGCCACAGCTGCTCTGGAAGAACAGCTGAAGGTGCTGGGAGACAGATGGGCCAACATCTGTAGGTGGACAGAGGATAGATGGGTGCTGCTCCAGGACATTCTGCTGAAGTGGCAGAGACTGACAGAGGAACAGTGCCTGTTTTCTGCCTGGCTCTCTGAGAAAGAGGATGCTGTCAACAAGATCCATACCACAGGCTTCAAGGATCAGAATGAGATGCTCAGCTCCCTGCAGAAACTGGCTGTGCTGAAGGCTGACCTGGAAAAGAAAAAGCAGTCCATGGGCAAGCTCTACAGCCTGAAGCAGGACCTGCTGTCTACCCTGAAGAACAAGTCTGTGACCCAGAAAACTGAGGCCTGGCTGGACAACTTTGCTAGATGCTGGGACAACCTGGTGCAGAAGCTGGAAAAGTCTACAGCCCAGATCAGCCAGCAACCTGATCTTGCCCCTGGCCTGACCACAATTGGAGCCTCTCCAACACAGACTGTGACCCTGGTTACCCAGCCAGTGGTCACCAAAGAGACAGCCATCAGCAAACTGGAAATGCCCAGCTCTCTGATGCTGGAAGTCCCCACACTGGAAAGGCTGCAAGAACTTCAAGAGGCCACAGATGAGCTGGACCTGAAGCTGAGACAGGCTGAAGTGATCAAAGGCAGCTGGCAGCCAGTTGGGGACCTGCTCATTGATAGCCTGCAGGACCATCTGGAAAAAGTGAAAGCCCTGAGGGGAGAGATTGCCCCTCTGAAAGAAAATGTGTCCCATGTGAATGACCTGGCCAGACAGCTGACCACACTGGGAATCCAGCTGAGCCCCTACAACCTGAGCACCCTTGAGGACCTGAACACCAGGTGGAAGCTCCTCCAGGTGGCAGTGGAAGATAGAGTCAGGCAGCTGCATGAGGCCCACAGAGATTTTGGACCAGCCAGCCAGCACTTTCTGTCTACCTCTGTGCAAGGCCCCTGGGAGAGAGCTATCTCTCCTAACAAGGTGCCCTACTACATCAACCATGAGACACAGACCACCTGTTGGGATCACCCCAAGATGACAGAGCTGTACCAGAGTCTGGCAGACCTCAACAATGTCAGATTCAGTGCCTACAGGACTGCCATGAAGCTCAGAAGGCTCCAGAAAGCTCTGTGCCTGGACCTGCTTTCCCTGAGTGCAGCTTGTGATGCCCTGGACCAGCACAATCTGAAGCAGAATGACCAGCCTATGGACATCCTCCAGATCATCAACTGCCTCACCACCATCTATGATAGGCTGGAACAAGAGCACAACAATCTGGTCAATGTGCCCCTGTGTGTGGACATGTGCCTGAATTGGCTGCTGAATGTGTATGACACAGGCAGAACAGGCAGGATCAGAGTCCTGTCCTTCAAGACAGGCATCATCTCCCTGTGCAAAGCCCACTTGGAGGACAAGTACAGATACCTGTTCAAGCAAGTGGCCTCCAGCACAGGCTTTTGTGACCAGAGAAGGCTGGGCCTGCTCCTGCATGACAGCATTCAGATCCCTAGACAGCTGGGAGAAGTGGCTTCCTTTGGAGGCAGCAATATTGAGCCATCAGTCAGGTCCTGTTTTCAGTTTGCCAACAACAAGCCTGAGATTGAGGCTGCCCTGTTCCTGGACTGGATGAGACTTGAGCCTCAGAGCATGGTCTGGCTGCCTGTGCTTCATAGAGTGGCTGCTGCTGAGACTGCCAAGCACCAGGCCAAGTGCAACATCTGCAAAGAGTGCCCCATCATTGGCTTCAGATACAGATCCCTGAAGCACTTCAACTATGATATCTGCCAGAGCTGCTTCTTTAGTGGCAGGGTTGCCAAGGGCCACAAAATGCACTACCCCATGGTGGAATACTGCACCCCAACAACCTCTGGGGAAGATGTTAGAGACTTTGCCAAGGTGCTGAAAAACAAGTTCAGGACCAAGAGATACTTTGCTAAGCACCCCAGAATGGGCTACCTGCCTGTCCAGACAGTGCTTGAGGGTGACAACATGGAAACCCCTGTGACACTGATCAATTTCTGGCCAGTGGACTCTGCCCCTGCCTCAAGTCCACAGCTGTCCCATGATGACACCCACAGCAGAATTGAGCACTATGCCTCCAGACTGGCAGAGATGGAAAACAGCAATGGCAGCTACCTGAATGATAGCATCAGCCCCAATGAGAGCATTGATGATGAGCATCTGCTGATCCAGCACTACTGTCAGTCCCTGAACCAGGACTCTCCACTGAGCCAGCCTAGAAGCCCTGCTCAGATCCTGATCAGCCTTGAGTCTTGATGAGTCGACAGGCCTAATAAAGAGCTCAGATGCATCGATCAGAGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGGCTAGCTGCGGCCGCaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcag
RGX-DYS6 (全盒，包括側接ITR、Spc5-12啟動子至聚A及介入序列) 4584 bpITR 以小寫顯示	104	ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcctCATATGCAGGGTAATGGGGATCCTCTAGAGGCCGTCCGCCCTCGGCACCATCCTCACGACACCCAAATATGGCGACGGGTGAGGAATGGTGGGGAGTTATTTTTAGAGCGGTGAGGAAGGTGGGCAGGCAGCAGGTGTTGGCGCTCTAAAAATAACTCCCGGGAGTTATTTTTAGAGCGGAGGAATGGTGGACACCCAAATATGGCGACGGTTCCTCACCCGTCGCCATATTTGGGTGTCCGCCCTCGGCCGGGGCCGCATTCCTGGGGGCCGGGCGGTGCTCCCGCCCGCCTCGATAAAAGGCTCCGGGGCCGGCGGCGGCCCACGAGCTACCCGGAGGAGCGGGAGGCGCCAAGCGgAATTCGCCACCATGCTTTGGTGGGAAGAGGTGGAAGATTGCTATGAGAGGGAAGATGTGCAGAAGAAAACCTTCACCAAATGGGTCAATGCCCAGTTCAGCAAGTTTGGCAAGCAGCACATTGAGAACCTGTTCAGTGACCTGCAGGATGGCAGAAGGCTGCTGGATCTGCTGGAAGGCCTGACAGGCCAGAAGCTGCCTAAAGAGAAGGGCAGCACAAGAGTGCATGCCCTGAACAATGTGAACAAGGCCCTGAGAGTGCTGCAGAACAACAATGTGGACCTGGTCAATATTGGCAGCACAGACATTGTGGATGGCAACCACAAGCTGACCCTGGGCCTGATCTGGAACATCATCCTGCACTGGCAAGTGAAGAATGTGATGAAGAACATCATGGCTGGCCTGCAGCAGACCAACTCTGAGAAGATCCTGCTGAGCTGGGTCAGACAGAGCACCAGAAACTACCCTCAAGTGAATGTGATCAACTTCACCACCTCTTGGAGTGATGGACTGGCCCTGAATGCCCTGATCCACAGCCACAGACCTGACCTGTTTGACTGGAACTCTGTTGTGTGCCAGCAGTCTGCCACACAGAGACTGGAACATGCCTTCAACATTGCCAGATACCAGCTGGGAATTGAGAAACTGCTGGACCCTGAGGATGTGGACACCACCTATCCTGACAAGAAATCCATCCTCATGTACATCACCAGCCTGTTCCAGGTGCTGCCCCAGCAAGTGTCCATTGAGGCCATTCAAGAGGTTGAGATGCTGCCCAGACCTCCTAAAGTGACCAAAGAGGAACACTTCCAGCTGCACCACCAGATGCACTACTCTCAGCAGATCACAGTGTCTCTGGCCCAGGGATATGAGAGAACAAGCAGCCCCAAGCCTAGGTTCAAGAGCTATGCCTACACACAGGCTGCCTATGTGACCACATCTGACCCCACAAGAAGCCCATTTCCAAGCCAGCATCTGGAAGCCCCTGAGGACAAGAGCTTTGGCAGCAGCCTGATGGAATCTGAAGTGAACCTGGATAGATACCAGACAGCCCTGGAAGAAGTGCTGTCCTGGCTGCTGTCTGCTGAGGATACACTGCAGGCTCAGGGTGAAATCAGCAATGATGTGGAAGTGGTCAAGGACCAGTTTCACACCCATGAGGGCTACATGATGGACCTGACAGCCCACCAGGGCAGAGTGGGAAATATCCTGCAGCTGGGCTCCAAGCTGATTGGCACAGGCAAGCTGTCTGAGGATGAAGAGACAGAGGTGCAAGAGCAGATGAACCTGCTGAACAGCAGATGGGAGTGTCTGAGAGTGGCCAGCATGGAAAAGCAGAGCAACCTGCACAGAGTGCTCATGGACCTGCAGAATCAGAAACTGAAAGAACTGAATGACTGGCTGACCAAGACAGAAGAAAGGACTAGGAAGATGGAAGAGGAACCTCTGGGACCAGACCTGGAAGATCTGAAAAGACAGGTGCAGCAGCATAAGGTGCTGCAAGAGGACCTTGAGCAAGAGCAAGTCAGAGTGAACAGCCTGACACACATGGTGGTGGTTGTGGATGAGTCCTCTGGGGATCATGCCACAGCTGCTCTGGAAGAACAGCTGAAGGTGCTGGGAGACAGATGGGCCAACATCTGTAGGTGGACAGAGGATAGATGGGTGCTGCTCCAGGACATTCTGCTGAAGTGGCAGAGACTGACAGAGGAACAGTGCCTGTTTTCTGCCTGGCTCTCTGAGAAAGAGGATGCTGTCAACAAGATCCATACCACAGGCTTCAAGGATCAGAATGAGATGCTCAGCTCCCTGCAGAAACTGGCTGTGCTGAAGGCTGACCTGGAAAAGAAAAAGCAGTCCATGGGCAAGCTCTACAGCCTGAAGCAGGACCTGCTGTCTACCCTGAAGAACAAGTCTGTGACCCAGAAAACTGAGGCCTGGCTGGACAACTTTGCTAGATGCTGGGACAACCTGGTGCAGAAGCTGGAAAAGTCTACAGCCCAGATCAGCCAGCAACCTGATCTTGCCCCTGGCCTGACCACAATTGGAGCCTCTCCAACACAGACTGTGACCCTGGTTACCCAGCCAGTGGTCACCAAAGAGACAGCCATCAGCAAACTGGAAATGCCCAGCTCTCTGATGCTGGAAGTCCCCACACTGGAAAGGCTGCAAGAACTTCAAGAGGCCACAGATGAGCTGGACCTGAAGCTGAGACAGGCTGAAGTGATCAAAGGCAGCTGGCAGCCAGTTGGGGACCTGCTCATTGATAGCCTGCAGGACCATCTGGAAAAAGTGAAAGCCCTGAGGGGAGAGATTGCCCCTCTGAAAGAAAATGTGTCCCATGTGAATGACCTGGCCAGACAGCTGACCACACTGGGAATCCAGCTGAGCCCCTACAACCTGAGCACCCTTGAGGACCTGAACACCAGGTGGAAGCTCCTCCAGGTGGCAGTGGAAGATAGAGTCAGGCAGCTGCATGAGGCCCACAGAGATTTTGGACCAGCCAGCCAGCACTTTCTGTCTACCTCTGTGCAAGGCCCCTGGGAGAGAGCTATCTCTCCTAACAAGGTGCCCTACTACATCAACCATGAGACACAGACCACCTGTTGGGATCACCCCAAGATGACAGAGCTGTACCAGAGTCTGGCAGACCTCAACAATGTCAGATTCAGTGCCTACAGGACTGCCATGAAGCTCAGAAGGCTCCAGAAAGCTCTGTGCCTGGACCTGCTTTCCCTGAGTGCAGCTTGTGATGCCCTGGACCAGCACAATCTGAAGCAGAATGACCAGCCTATGGACATCCTCCAGATCATCAACTGCCTCACCACCATCTATGATAGGCTGGAACAAGAGCACAACAATCTGGTCAATGTGCCCCTGTGTGTGGACATGTGCCTGAATTGGCTGCTGAATGTGTATGACACAGGCAGAACAGGCAGGATCAGAGTCCTGTCCTTCAAGACAGGCATCATCTCCCTGTGCAAAGCCCACTTGGAGGACAAGTACAGATACCTGTTCAAGCAAGTGGCCTCCAGCACAGGCTTTTGTGACCAGAGAAGGCTGGGCCTGCTCCTGCATGACAGCATTCAGATCCCTAGACAGCTGGGAGAAGTGGCTTCCTTTGGAGGCGCCAAGCACCAGGCCAAGTGCAACATCTGCAAAGAGTGCCCCATCATTGGCTTCAGATACAGATCCCTGAAGCACTTCAACTATGATATCTGCCAGAGCTGCTTCTTTAGTGGCAGGGTTGCCAAGGGCCACAAAATGCACTACCCCATGGTGGAATACTGCACCCCAACAACCTCTGGGGAAGATGTTAGAGACTTTGCCAAGGTGCTGAAAAACAAGTTCAGGACCAAGAGATACTTTGCTAAGCACCCCAGAATGGGCTACCTGCCTGTCCAGACAGTGCTTGAGGGTGACAACATGGAAACCCCTGTGACACTGATCAATTTCTGGCCAGTGGACTCTGCCCCTGCCTCAAGTCCACAGCTGTCCCATGATGACACCCACAGCAGAATTGAGCACTATGCCTCCAGACTGGCAGAGATGGAAAACAGCAATGGCAGCTACCTGAATGATAGCATCAGCCCCAATGAGAGCATTGATGATGAGCATCTGCTGATCCAGCACTACTGTCAGTCCCTGAACCAGGACTCTCCACTGAGCCAGCCTAGAAGCCCTGCTCAGATCCTGATCAGCCTTGAGTCTGAGGAAAGGGGAGAGCTGGAAAGAATCCTGGCAGATCTTGAGGAAGAGAACAGAAACCTGCAGGCAGAGTATGACAGGCTCAAACAGCAGCATGAGCACAAGGGACTGAGCCCTCTGCCTTCTCCTCCTGAAATGATGCCCACCTCTCCACAGTCTCCAAGGTGATGACTCGAGAGGCCTAATAAAGAGCTCAGATGCATCGATCAGAGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGCCAGGGTAATGGGCTAGCTGCGGCCGCaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcag
RGX-DYS7 (全盒，包括側接ITR、Spc5-12啟動子至聚A及介入序列) 4746 bpITR 以小寫顯示	105	ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcctCATATGCAGGGTAATGGGGATCCTCTAGAGGCCGTCCGCCCTCGGCACCATCCTCACGACACCCAAATATGGCGACGGGTGAGGAATGGTGGGGAGTTATTTTTAGAGCGGTGAGGAAGGTGGGCAGGCAGCAGGTGTTGGCGCTCTAAAAATAACTCCCGGGAGTTATTTTTAGAGCGGAGGAATGGTGGACACCCAAATATGGCGACGGTTCCTCACCCGTCGCCATATTTGGGTGTCCGCCCTCGGCCGGGGCCGCATTCCTGGGGGCCGGGCGGTGCTCCCGCCCGCCTCGATAAAAGGCTCCGGGGCCGGCGGCGGCCCACGAGCTACCCGGAGGAGCGGGAGGCGCCAAGCGgAATTCGCCACCATGCTTTGGTGGGAAGAGGTGGAAGATTGCTATGAGAGGGAAGATGTGCAGAAGAAAACCTTCACCAAATGGGTCAATGCCCAGTTCAGCAAGTTTGGCAAGCAGCACATTGAGAACCTGTTCAGTGACCTGCAGGATGGCAGAAGGCTGCTGGATCTGCTGGAAGGCCTGACAGGCCAGAAGCTGCCTAAAGAGAAGGGCAGCACAAGAGTGCATGCCCTGAACAATGTGAACAAGGCCCTGAGAGTGCTGCAGAACAACAATGTGGACCTGGTCAATATTGGCAGCACAGACATTGTGGATGGCAACCACAAGCTGACCCTGGGCCTGATCTGGAACATCATCCTGCACTGGCAAGTGAAGAATGTGATGAAGAACATCATGGCTGGCCTGCAGCAGACCAACTCTGAGAAGATCCTGCTGAGCTGGGTCAGACAGAGCACCAGAAACTACCCTCAAGTGAATGTGATCAACTTCACCACCTCTTGGAGTGATGGACTGGCCCTGAATGCCCTGATCCACAGCCACAGACCTGACCTGTTTGACTGGAACTCTGTTGTGTGCCAGCAGTCTGCCACACAGAGACTGGAACATGCCTTCAACATTGCCAGATACCAGCTGGGAATTGAGAAACTGCTGGACCCTGAGGATGTGGACACCACCTATCCTGACAAGAAATCCATCCTCATGTACATCACCAGCCTGTTCCAGGTGCTGCCCCAGCAAGTGTCCATTGAGGCCATTCAAGAGGTTGAGATGCTGCCCAGACCTCCTAAAGTGACCAAAGAGGAACACTTCCAGCTGCACCACCAGATGCACTACTCTCAGCAGATCACAGTGTCTCTGGCCCAGGGATATGAGAGAACAAGCAGCCCCAAGCCTAGGTTCAAGAGCTATGCCTACACACAGGCTGCCTATGTGACCACATCTGACCCCACAAGAAGCCCATTTCCAAGCCAGCATCTGGAAGCCCCTGAGGACAAGAGCTTTGGCAGCAGCCTGATGGAATCTGAAGTGAACCTGGATAGATACCAGACAGCCCTGGAAGAAGTGCTGTCCTGGCTGCTGTCTGCTGAGGATACACTGCAGGCTCAGGGTGAAATCAGCAATGATGTGGAAGTGGTCAAGGACCAGTTTCACACCCATGAGGGCTACATGATGGACCTGACAGCCCACCAGGGCAGAGTGGGAAATATCCTGCAGCTGGGCTCCAAGCTGATTGGCACAGGCAAGCTGTCTGAGGATGAAGAGACAGAGGTGCAAGAGCAGATGAACCTGCTGAACAGCAGATGGGAGTGTCTGAGAGTGGCCAGCATGGAAAAGCAGAGCAACCTGCACAGAGTGCTCATGGACCTGCAGAATCAGAAACTGAAAGAACTGAATGACTGGCTGACCAAGACAGAAGAAAGGACTAGGAAGATGGAAGAGGAACCTCTGGGACCAGACCTGGAAGATCTGAAAAGACAGGTGCAGCAGCATAAGGTGCTGCAAGAGGACCTTGAGCAAGAGCAAGTCAGAGTGAACAGCCTGACACACATGGTGGTGGTTGTGGATGAGTCCTCTGGGGATCATGCCACAGCTGCTCTGGAAGAACAGCTGAAGGTGCTGGGAGACAGATGGGCCAACATCTGTAGGTGGACAGAGGATAGATGGGTGCTGCTCCAGGACATTCTGGAGATCAGCTATGTGCCCAGCACCTACCTGACAGAGATCACCCATGTGTCTCAGGCCCTGCTGGAAGTGGAACAGCTGCTGAATGCCCCTGACCTGTGTGCCAAGGACTTTGAGGACCTGTTCAAGCAAGAGGAAAGCCTGAAGAACATCAAGGACAGCCTGCAGCAGTCCTCTGGCAGAATTGACATCATCCACAGCAAGAAAACAGCTGCCCTGCAGTCTGCCACACCTGTGGAAAGAGTGAAGCTGCAAGAGGCCCTGAGCCAGCTGGACTTCCAGTGGGAGAAAGTGAACAAGATGTACAAGGACAGGCAGGGCAGATTTGATAGAAGTGTGGAAAAGTGGAGAAGGTTCCACTATGACATCAAGATCTTCAACCAGTGGCTGACAGAGGCTGAGCAGTTCCTGAGAAAGACACAGATCCCTGAGAACTGGGAGCATGCCAAGTACAAGTGGTATCTGAAAGAACTGCAGGATGGCATTGGCCAGAGACAGACAGTTGTCAGAACCCTGAATGCCACAGGGGAAGAGATCATCCAGCAGAGCAGCAAGACAGATGCCAGCATCCTGCAAGAGAAGCTGGGCAGCCTGAACCTGAGATGGCAAGAAGTGTGCAAGCAGCTGTCTGACAGAAAGAAGAGGCTGGAAGAACAGACACTGGAAAGGCTGCAAGAACTTCAAGAGGCCACAGATGAGCTGGACCTGAAGCTGAGACAGGCTGAAGTGATCAAAGGCAGCTGGCAGCCAGTTGGGGACCTGCTCATTGATAGCCTGCAGGACCATCTGGAAAAAGTGAAAGCCCTGAGGGGAGAGATTGCCCCTCTGAAAGAAAATGTGTCCCATGTGAATGACCTGGCCAGACAGCTGACCACACTGGGAATCCAGCTGAGCCCCTACAACCTGAGCACCCTTGAGGACCTGAACACCAGGTGGAAGCTCCTCCAGGTGGCAGTGGAAGATAGAGTCAGGCAGCTGCATGAGGCCCACAGAGATTTTGGACCAGCCAGCCAGCACTTTCTGTCTACCTCTGTGCAAGGCCCCTGGGAGAGAGCTATCTCTCCTAACAAGGTGCCCTACTACATCAACCATGAGACACAGACCACCTGTTGGGATCACCCCAAGATGACAGAGCTGTACCAGAGTCTGGCAGACCTCAACAATGTCAGATTCAGTGCCTACAGGACTGCCATGAAGCTCAGAAGGCTCCAGAAAGCTCTGTGCCTGGACCTGCTTTCCCTGAGTGCAGCTTGTGATGCCCTGGACCAGCACAATCTGAAGCAGAATGACCAGCCTATGGACATCCTCCAGATCATCAACTGCCTCACCACCATCTATGATAGGCTGGAACAAGAGCACAACAATCTGGTCAATGTGCCCCTGTGTGTGGACATGTGCCTGAATTGGCTGCTGAATGTGTATGACACAGGCAGAACAGGCAGGATCAGAGTCCTGTCCTTCAAGACAGGCATCATCTCCCTGTGCAAAGCCCACTTGGAGGACAAGTACAGATACCTGTTCAAGCAAGTGGCCTCCAGCACAGGCTTTTGTGACCAGAGAAGGCTGGGCCTGCTCCTGCATGACAGCATTCAGATCCCTAGACAGCTGGGAGAAGTGGCTTCCTTTGGAGGCAGCAATATTGAGCCATCAGTCAGGTCCTGTTTTCAGTTTGCCAACAACAAGCCTGAGATTGAGGCTGCCCTGTTCCTGGACTGGATGAGACTTGAGCCTCAGAGCATGGTCTGGCTGCCTGTGCTTCATAGAGTGGCTGCTGCTGAGACTGCCAAGCACCAGGCCAAGTGCAACATCTGCAAAGAGTGCCCCATCATTGGCTTCAGATACAGATCCCTGAAGCACTTCAACTATGATATCTGCCAGAGCTGCTTCTTTAGTGGCAGGGTTGCCAAGGGCCACAAAATGCACTACCCCATGGTGGAATACTGCACCCCAACAACCTCTGGGGAAGATGTTAGAGACTTTGCCAAGGTGCTGAAAAACAAGTTCAGGACCAAGAGATACTTTGCTAAGCACCCCAGAATGGGCTACCTGCCTGTCCAGACAGTGCTTGAGGGTGACAACATGGAAACCCCTGTGACACTGATCAATTTCTGGCCAGTGGACTCTGCCCCTGCCTCAAGTCCACAGCTGTCCCATGATGACACCCACAGCAGAATTGAGCACTATGCCTCCAGACTGGCAGAGATGGAAAACAGCAATGGCAGCTACCTGAATGATAGCATCAGCCCCAATGAGAGCATTGATGATGAGCATCTGCTGATCCAGCACTACTGTCAGTCCCTGAACCAGGACTCTCCACTGAGCCAGCCTAGAAGCCCTGCTCAGATCCTGATCAGCCTTGAGTCTTGATGAGTCGACAGGCCTAATAAAGAGCTCAGATGCATCGATCAGAGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGGCTAGCTGCGGCCGCaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcag
RGX-DYS8 (全盒，包括側接ITR、Spc5-12啟動子至聚A及介入序列) 4470 bpITR 以小寫顯示	106	ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcctCATATGCAGGGTAATGGGGATCCTCTAGAGGCCGTCCGCCCTCGGCACCATCCTCACGACACCCAAATATGGCGACGGGTGAGGAATGGTGGGGAGTTATTTTTAGAGCGGTGAGGAAGGTGGGCAGGCAGCAGGTGTTGGCGCTCTAAAAATAACTCCCGGGAGTTATTTTTAGAGCGGAGGAATGGTGGACACCCAAATATGGCGACGGTTCCTCACCCGTCGCCATATTTGGGTGTCCGCCCTCGGCCGGGGCCGCATTCCTGGGGGCCGGGCGGTGCTCCCGCCCGCCTCGATAAAAGGCTCCGGGGCCGGCGGCGGCCCACGAGCTACCCGGAGGAGCGGGAGGCGCCAAGCGgAATTCGCCACCATGCTTTGGTGGGAAGAGGTGGAAGATTGCTATGAGAGGGAAGATGTGCAGAAGAAAACCTTCACCAAATGGGTCAATGCCCAGTTCAGCAAGTTTGGCAAGCAGCACATTGAGAACCTGTTCAGTGACCTGCAGGATGGCAGAAGGCTGCTGGATCTGCTGGAAGGCCTGACAGGCCAGAAGCTGCCTAAAGAGAAGGGCAGCACAAGAGTGCATGCCCTGAACAATGTGAACAAGGCCCTGAGAGTGCTGCAGAACAACAATGTGGACCTGGTCAATATTGGCAGCACAGACATTGTGGATGGCAACCACAAGCTGACCCTGGGCCTGATCTGGAACATCATCCTGCACTGGCAAGTGAAGAATGTGATGAAGAACATCATGGCTGGCCTGCAGCAGACCAACTCTGAGAAGATCCTGCTGAGCTGGGTCAGACAGAGCACCAGAAACTACCCTCAAGTGAATGTGATCAACTTCACCACCTCTTGGAGTGATGGACTGGCCCTGAATGCCCTGATCCACAGCCACAGACCTGACCTGTTTGACTGGAACTCTGTTGTGTGCCAGCAGTCTGCCACACAGAGACTGGAACATGCCTTCAACATTGCCAGATACCAGCTGGGAATTGAGAAACTGCTGGACCCTGAGGATGTGGACACCACCTATCCTGACAAGAAATCCATCCTCATGTACATCACCAGCCTGTTCCAGGTGCTGCCCCAGCAAGTGTCCATTGAGGCCATTCAAGAGGTTGAGATGCTGCCCAGACCTCCTAAAGTGACCAAAGAGGAACACTTCCAGCTGCACCACCAGATGCACTACTCTCAGCAGATCACAGTGTCTCTGGCCCAGGGATATGAGAGAACAAGCAGCCCCAAGCCTAGGTTCAAGAGCTATGCCTACACACAGGCTGCCTATGTGACCACATCTGACCCCACAAGAAGCCCATTTCCAAGCCAGCATCTGGAAGCCCCTGAGGACAAGAGCTTTGGCAGCAGCCTGATGGAATCTGAAGTGAACCTGGATAGATACCAGACAGCCCTGGAAGAAGTGCTGTCCTGGCTGCTGTCTGCTGAGGATACACTGCAGGCTCAGGGTGAAATCAGCAATGATGTGGAAGTGGTCAAGGACCAGTTTCACACCCATGAGGGCTACATGATGGACCTGACAGCCCACCAGGGCAGAGTGGGAAATATCCTGCAGCTGGGCTCCAAGCTGATTGGCACAGGCAAGCTGTCTGAGGATGAAGAGACAGAGGTGCAAGAGCAGATGAACCTGCTGAACAGCAGATGGGAGTGTCTGAGAGTGGCCAGCATGGAAAAGCAGAGCAACCTGCACAGAGTGCTCATGGACCTGCAGAATCAGAAACTGAAAGAACTGAATGACTGGCTGACCAAGACAGAAGAAAGGACTAGGAAGATGGAAGAGGAACCTCTGGGACCAGACCTGGAAGATCTGAAAAGACAGGTGCAGCAGCATAAGGTGCTGCAAGAGGACCTTGAGCAAGAGCAAGTCAGAGTGAACAGCCTGACACACATGGTGGTGGTTGTGGATGAGTCCTCTGGGGATCATGCCACAGCTGCTCTGGAAGAACAGCTGAAGGTGCTGGGAGACAGATGGGCCAACATCTGTAGGTGGACAGAGGATAGATGGGTGCTGCTCCAGGACATTCTGGAGATCAGCTATGTGCCCAGCACCTACCTGACAGAGATCACCCATGTGTCTCAGGCCCTGCTGGAAGTGGAACAGCTGCTGAATGCCCCTGACCTGTGTGCCAAGGACTTTGAGGACCTGTTCAAGCAAGAGGAAAGCCTGAAGAACATCAAGGACAGCCTGCAGCAGTCCTCTGGCAGAATTGACATCATCCACAGCAAGAAAACAGCTGCCCTGCAGTCTGCCACACCTGTGGAAAGAGTGAAGCTGCAAGAGGCCCTGAGCCAGCTGGACTTCCAGTGGGAGAAAGTGAACAAGATGTACAAGGACAGGCAGGGCAGATTTGATAGAAGTGTGGAAAAGTGGAGAAGGTTCCACTATGACATCAAGATCTTCAACCAGTGGCTGACAGAGGCTGAGCAGTTCCTGAGAAAGACACAGATCCCTGAGAACTGGGAGCATGCCAAGTACAAGTGGTATCTGAAAGAACTGCAGGATGGCATTGGCCAGAGACAGACAGTTGTCAGAACCCTGAATGCCACAGGGGAAGAGATCATCCAGCAGAGCAGCAAGACAGATGCCAGCATCCTGCAAGAGAAGCTGGGCAGCCTGAACCTGAGATGGCAAGAAGTGTGCAAGCAGCTGTCTGACAGAAAGAAGAGGCTGGAAGAACAGACACTGGAAAGGCTGCAAGAACTTCAAGAGGCCACAGATGAGCTGGACCTGAAGCTGAGACAGGCTGAAGTGATCAAAGGCAGCTGGCAGCCAGTTGGGGACCTGCTCATTGATAGCCTGCAGGACCATCTGGAAAAAGTGAAAGCCCTGAGGGGAGAGATTGCCCCTCTGAAAGAAAATGTGTCCCATGTGAATGACCTGGCCAGACAGCTGACCACACTGGGAATCCAGCTGAGCCCCTACAACCTGAGCACCCTTGAGGACCTGAACACCAGGTGGAAGCTCCTCCAGGTGGCAGTGGAAGATAGAGTCAGGCAGCTGCATGAGGCCCACAGAGATTTTGGACCAGCCAGCCAGCACTTTCTGTCTACCTCTGTGCAAGGCCCCTGGGAGAGAGCTATCTCTCCTAACAAGGTGCCCTACTACATCAACCATGAGACACAGACCACCTGTTGGGATCACCCCAAGATGACAGAGCTGTACCAGAGTCTGGCAGACCTCAACAATGTCAGATTCAGTGCCTACAGGACTGCCATGAAGCTCAGAAGGCTCCAGAAAGCTCTGTGCCTGGACCTGCTTTCCCTGAGTGCAGCTTGTGATGCCCTGGACCAGCACAATCTGAAGCAGAATGACCAGCCTATGGACATCCTCCAGATCATCAACTGCCTCACCACCATCTATGATAGGCTGGAACAAGAGCACAACAATCTGGTCAATGTGCCCCTGTGTGTGGACATGTGCCTGAATTGGCTGCTGAATGTGTATGACACAGGCAGAACAGGCAGGATCAGAGTCCTGTCCTTCAAGACAGGCATCATCTCCCTGTGCAAAGCCCACTTGGAGGACAAGTACAGATACCTGTTCAAGCAAGTGGCCTCCAGCACAGGCTTTTGTGACCAGAGAAGGCTGGGCCTGCTCCTGCATGACAGCATTCAGATCCCTAGACAGCTGGGAGAAGTGGCTTCCTTTGGAGGCAGCAATATTGAGCCATCAGTCAGGTCCTGTTTTCAGTTTGCCAACAACAAGCCTGAGATTGAGGCTGCCCTGTTCCTGGACTGGATGAGACTTGAGCCTCAGAGCATGGTCTGGCTGCCTGTGCTTCATAGAGTGGCTGCTGCTGAGACTGCCAAGCACCAGGCCAAGTGCAACATCTGCAAAGAGTGCCCCATCATTGGCTTCAGATACAGATCCCTGAAGCACTTCAACTATGATATCTGCCAGAGCTGCTTCTTTAGTGGCAGGGTTGCCAAGGGCCACAAAATGCACTACCCCATGGTGGAATACTGCACCCCAACAACCTCTGGGGAAGATGTTAGAGACTTTGCCAAGGTGCTGAAAAACAAGTTCAGGACCAAGAGATACTTTGCTAAGCACCCCAGAATGGGCTACCTGCCTGTCCAGACAGTGCTTGAGGGTGACAACATGGAAACCTGATGAGTCGACAGGCCTAATAAAGAGCTCAGATGCATCGATCAGAGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGGCTAGCTGCGGCCGCaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcag

5.3.5 製備rAAV粒子之方法

本發明之另一態樣涉及製備本文揭示之分子。在一些實施例中，本發明之分子係藉由以下製得：提供包含編碼本文任何殼體蛋白分子之核酸序列之核苷酸；及使用包裝細胞系統製備具有由殼體蛋白製成之殼體外殼之相應rAAV粒子。該等殼體蛋白闡述於上文章節5.3.4中。在一些實施例中，核酸序列編碼與本文所述之殼體蛋白分子之序列具有至少60%、70%、80%、85%、90%或95%、較佳96%、97%、98%、99%或99.9%一致性之序列，且保留(或實質上保留)殼體蛋白及來自異源蛋白或其域之插入肽之生物功能。在一些實施例中，核酸序列編碼與AAV8殼體蛋白之序列具有至少60%、70%、80%、85%、90%或95%、較佳96%、97%、98%、99%或99.9%一致性之序列，同時保留(或實質上保留) AAV8殼體蛋白及插入肽之生物功能。

殼體蛋白、外殼及rAAV粒子可藉由業內已知之技術製備。在一些實施例中，病毒基因體包含至少一個反向末端重複以允許包裝至載體中。在一些實施例中，病毒基因體進一步包含cap基因及/或rep基因，用於cap基因之表現及剪接。在實施例中，cap及rep基因由包裝細胞提供，且不存在於病毒基因體中。

在一些實施例中，將編碼經工程化殼體蛋白之核酸選殖至AAV Rep-Cap質體中代替現存殼體基因。當一起引入宿主細胞時，此質體幫助將rAAV基因體包裝至經工程化殼體蛋白中作為殼體外殼。包裝細胞可為具有促進AAV基因體複製、殼體組裝及包裝所必需之基因之任何細胞類型。

業內已知許多基於細胞培養之系統用於產生rAAV粒子，其中之任一者可用於實踐本文揭示之方法。基於細胞培養之系統包括轉染、穩定細胞系產生及感染性雜合病毒產生系統，其包括(但不限於)腺病毒-AAV雜合體、疱疹病毒-AAV雜合體及桿狀病毒-AAV雜合體。用於產生rAAV病毒粒子之rAAV生產培養物需要：(1)適宜宿主細胞，包括例如人類源細胞系、哺乳動物細胞系或昆蟲源細胞系；(2)適宜輔助病毒功能，由野生型或突變腺病毒(例如溫度敏感性腺病毒)、疱疹病毒、桿狀病毒或提供輔助功能物之質體構築體提供；(3) AAV rep及cap基因及基因產物；(4)側接AAV ITR序列及視情況調節元件之轉基因(例如治療性轉基因)；及(5)支持細胞生長/存活及rAAV產生之適宜培養基及培養基組分(營養物)。

宿主細胞之非限制性實例包括：A549、WEHI、10T1/2、BHK、MDCK、COS1、COS7、BSC 1、BSC 40、BMT 10、VERO、W138、HeLa、HEK293及其衍生物(HEK293T細胞、HEK293F細胞)、Saos、C2C12、L、HT1080、HepG2、原代纖維母細胞、肝細胞、肌母細胞細胞、CHO細胞或CHO源細胞、或昆蟲源細胞系，例如SF-9 (例如在桿狀病毒產生系統之情形下)。關於綜述，參見Aponte-Ubillus等人，2018, Appl. Microbiol. Biotechnol. 102:1045-1054，其製造技術以全文引用之方式併入本文中。

在一態樣中，本文提供產生rAAV粒子之方法，其包含(a)提供包含昆蟲細胞之細胞培養物；(b)將編碼以下中之至少一者之一或多種桿狀病毒載體引入細胞中：i.欲包裝之rAAV基因體，ii.足以用於包裝之AAV rep蛋白，及iii.足以用於包裝之AAV cap蛋白；(c)向細胞培養物中添加足夠營養物並將細胞培養物維持在允許rAAV粒子產生之條件下。在一些實施例中，該方法包含使用編碼rep及cap基因之第一桿狀病毒載體及編碼rAAV基因體之第二桿狀病毒載體。在一些實施例中，該方法包含使用編碼rAAV基因體之桿狀病毒及表現rep及cap基因之昆蟲細胞。在一些實施例中，該方法包含使用編碼rep及cap基因以及rAAV基因體之桿狀病毒載體。在一些實施例中，昆蟲細胞係Sf-9細胞。在一些實施例中，昆蟲細胞係包含一或多種編碼Rep及Cap基因之穩定整合之異源多核苷酸的Sf-9細胞。

在一些實施例中，本文揭示之方法使用桿狀病毒產生系統。在一些實施例中，桿狀病毒產生系統使用編碼rep及cap基因之第一桿狀病毒及編碼rAAV基因體之第二桿狀病毒。在一些實施例中，桿狀病毒產生系統使用編碼rAAV基因體之桿狀病毒及表現rep及cap基因之宿主細胞。在一些實施例中，桿狀病毒產生系統使用編碼rep及cap基因及rAAV基因體之桿狀病毒。在一些實施例中，桿狀病毒產生系統使用昆蟲細胞，例如Sf-9細胞。

熟習此項技術者知道許多方法，藉由該等方法，可向細胞中引入AAV rep及cap基因、AAV輔助基因(例如腺病毒E1A基因、E1b基因、E4基因、E2a基因及VA基因)及rAAV基因體(包含側接反向末端重複(ITR)之一或多個目的基因)以產生或包裝rAAV。片語「腺病毒輔助功能物」係指在細胞中表現之許多病毒輔助基因(如RNA或蛋白質)，使得AAV在細胞中有效生長。熟習此項技術者理解，輔助病毒(包括腺病毒及單純疱疹病毒(HSV))促進AAV複製，且已鑑別提供必需功能之某些基因，例如，輔助基因可誘導細胞環境之變化，此促進該AAV基因表現及複製。在本文揭示之方法之一些實施例中，藉由轉染編碼AAV rep及cap基因、輔助基因及rAAV基因體之一或多種質體載體，將AAV rep及cap基因、輔助基因及rAAV基因體引入細胞中。在本文揭示之方法之一些實施例中，AAV rep及cap基因、輔助基因及rAAV基因體可藉由用病毒載體(例如編碼AAV rep及cap基因、輔助基因及rAAV基因體之rHSV載體)轉導而引入細胞中。在本文揭示之方法之一些實施例中，藉由用rHSV載體轉導將AAV rep及cap基因、輔助基因及rAAV基因體中之一或多者引入細胞中。在一些實施例中，rHSV載體編碼AAV rep及cap基因。在一些實施例中，rHSV載體編碼輔助基因。在一些實施例中，rHSV載體編碼rAAV基因體。在一些實施例中，rHSV載體編碼AAV rep及cap基因。在一些實施例中，rHSV載體編碼輔助基因及rAAV基因體。在一些實施例中，rHSV載體編碼輔助基因及AAV rep及cap基因。

在一態樣中，本文提供產生rAAV粒子之方法，其包含(a)提供包含宿主細胞之細胞培養物；(b)向細胞中引入編碼以下中之至少一者之一或多種rHSV載體：i.欲包裝之rAAV基因體，ii.包裝rAAV粒子所需之輔助功能物，iii.足以用於包裝之AAV rep蛋白，及iv.足以用於包裝之AAV cap蛋白；(c)向細胞培養物中添加足夠營養物並將細胞培養物維持在允許rAAV粒子產生之條件下。在一些實施例中，rHSV載體編碼AAV rep及cap基因。在一些實施例中，rHSV載體編碼輔助功能物。在一些實施例中，rHSV載體包含一或多種編碼輔助功能物之內源基因。在一些實施例中，rHSV載體包含一或多種編碼輔助功能物之異源基因。在一些實施例中，rHSV載體編碼rAAV基因體。在一些實施例中，rHSV載體編碼AAV rep及cap基因。在一些實施例中，rHSV載體編碼輔助功能物及rAAV基因體。在一些實施例中，rHSV載體編碼輔助功能物及AAV rep及cap基因。在一些實施例中，細胞包含一或多種編碼Rep及Cap基因之穩定整合之異源多核苷酸。

在一態樣中，本文提供產生rAAV粒子之方法，其包含(a)提供包含哺乳動物細胞之細胞培養物；(b)向細胞中引入編碼以下中之至少一者之一或多種多核苷酸：i.欲包裝之rAAV基因體，ii.包裝rAAV粒子所需之輔助功能物，iii.足以用於包裝之AAV rep蛋白，及iv.足以用於包裝之AAV cap蛋白；(c)向細胞培養物中添加足夠營養物並將細胞培養物維持在允許rAAV粒子產生之條件下。在一些實施例中，輔助功能物由腺病毒基因編碼。在一些實施例中，哺乳動物細胞包含一或多種編碼Rep及Cap基因之穩定整合之異源多核苷酸。

用以開發編碼AAV rep及cap基因、輔助基因及/或rAAV基因體之質體或病毒載體之分子生物學技術係業內公知的。在一些實施例中，AAV rep及cap基因由一種質體載體編碼。在一些實施例中，AAV輔助基因(例如腺病毒E1a基因、E1b基因、E4基因、E2a基因及VA基因)由一種質體載體編碼。在一些實施例中，E1a基因或E1b基因由宿主細胞穩定表現，且藉由一種病毒載體轉染將剩餘之AAV輔助基因引入細胞中。在一些實施例中，E1a基因及E1b基因由宿主細胞穩定表現，且將E4基因、E2a基因及VA基因藉由一種質體載體轉染而引入細胞中。在一些實施例中，一或多種輔助基因由宿主細胞穩定表現，且一或多種輔助基因藉由一種質體載體轉染而引入細胞中。在一些實施例中，輔助基因由宿主細胞穩定表現。在一些實施例中，AAV rep及cap基因由一種病毒載體編碼。在一些實施例中，AAV輔助基因(例如腺病毒E1a基因、E1b基因、E4基因、E2a基因及VA基因)由一種病毒載體編碼。在一些實施例中，E1a基因或E1b基因由宿主細胞穩定表現，且藉由一種病毒載體轉染將剩餘之AAV輔助基因引入細胞中。在一些實施例中，E1a基因及E1b基因由宿主細胞穩定表現，且E4基因、E2a基因及VA基因藉由一種病毒載體轉染而引入細胞中。在一些實施例中，一或多種輔助基因由宿主細胞穩定表現，且一或多種輔助基因藉由一種病毒載體轉染而引入細胞中。在一些實施例中，AAV rep及cap基因、包裝所需之腺病毒輔助功能物及欲包裝之rAAV基因體藉由用一或多種多核苷酸(例如載體)轉染而引入細胞。在一些實施例中，本文揭示之方法包含用三種多核苷酸之混合物轉染細胞：一個編碼cap及rep基因，一個編碼包裝所需之腺病毒輔助功能物(例如，腺病毒E1a基因、E1b基因、E4基因、E2a基因及VA基因)，及一個編碼欲包裝之rAAV基因體。在一些實施例中，AAV cap基因係AAV8或AAV9 cap基因。在一些實施例中，AAV cap基因係AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.PHB或AAV.7m8 cap基因。在一些實施例中，AAV cap基因編碼與AAV8或AAV9具有高序列同源性之殼體蛋白：例如AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1及AAV.hu37。在一些實施例中，編碼欲包裝之rAAV基因體之載體包含側接AAV ITR之目的基因。在一些實施例中，AAV ITR係來自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10 、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15、或AAV.HSC16或其他AAV血清型。

可使用載體之任何組合將AAV rep及cap基因、AAV輔助基因及rAAV基因體引入其中欲產生或包裝rAAV粒子之細胞。在本文揭示之方法之一些實施例中，可使用編碼包含側接AAV反向末端重複(ITR)之目的基因之rAAV基因體之第一質體載體、編碼AAV rep及cap基因之第二載體及編碼輔助基因之第三載體。在一些實施例中，將三種載體之混合物共轉染至細胞中。在一些實施例中，藉由使用質體載體以及病毒載體兩者來使用轉染及感染之組合。

在一些實施例中，rep及cap基因中之一或多者以及AAV輔助基因由細胞組成型表現，且不需要轉染或轉導至細胞中。在一些實施例中，細胞組成型表現rep及/或cap基因。在一些實施例中，細胞組成型表現一或多種AAV輔助基因。在一些實施例中，細胞組成型表現E1a。在一些實施例中，細胞包含編碼rAAV基因體之穩定轉基因。

在一些實施例中，AAVrep 、cap 及輔助基因(例如，Ela基因、E1b基因、E4基因、E2a基因或VA基因)可為任何AAV血清型。類似地，AAV ITR亦可為任何AAV血清型。舉例而言，在一些實施例中，AAV ITR係來自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15及AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、 AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15、或AAV.HSC 16，或其他AAV血清型(例如具有來自一種以上血清型之序列的雜合血清型)。在一些實施例中，AAVcap 基因係來自AAV8或AAV9cap 基因。在一些實施例中，AAVcap 基因係來自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15及AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10 、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15、AAV.HSC16、AAV.rh74、AAV.hu31、AAV.hu32、或AAV.hu37，或其他AAV血清型(例如具有來自一種以上血清型之序列的雜合血清型)。在一些實施例中，用於產生rAAV粒子之AAVrep 及cap 基因來自不同血清型。舉例而言，rep 基因來自AAV2，而cap 基因來自AAV8。在另一實例中，rep 基因來自AAV2，而cap 基因來自AAV9。

在一些實施例中，rep 基因來自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15及AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15、或AAV.HSC16或其他AAV血清型(例如具有來自一種以上血清型之序列的雜合血清型)。在其他實施例中，rep 及cap 基因來自相同血清型。在其他實施例中，rep 及cap 基因來自相同血清型，且rep 基因包含至少一個經修飾之蛋白域或經修飾之啟動子域。在某些實施例中，至少一個經修飾之域包含血清型不同於殼體血清型之核苷酸序列。rep 基因內之經修飾之域可為由不同血清型片段組成之雜合核苷酸序列。

雜合rep 基因提供rAAV粒子之改良之包裝效率，包括包含大於4 kb、大於4.1 kb、大於4.2 kB、大於4.3 kb、大於4.4 kB、大於4.5 kB或大於4.6 kb之微小肌縮蛋白轉基因之病毒基因體的包裝。AAVrep 基因由編碼病毒複製及產生所需之非結構蛋白之核酸序列組成。rep 基因之轉錄起始於p5或p19啟動子，分別產生兩個大的(Rep78及Rep68)及兩個小的(Rep52及Rep40)非結構Rep蛋白。另外，Rep78/68域含有識別ITR內特定ITR序列之DNA結合域。所有四種Rep蛋白具有共同解旋酶及ATP酶域，其在基因體複製及/或殼體包裹中起作用(Maurer AC, 2020, DOI: 10.1089/hum.2020.069)。cap 基因之轉錄起始於p40啟動子，該序列位於rep 基因之C端，且已表明，rep 基因中之其他元件可誘導p40啟動子活性。p40啟動子域包括轉錄因子結合元件EF1A、MLTF及ATF、Fos/Jun結合元件(AP-1)、Sp1樣元件(Sp1及GGT)及TATA元件(Pereira及Muzyczka, Journal of Virology, 1997年6月, 71(6):4300-4309)。在一些實施例中，rep 基因包含經修飾之p40啟動子。在一些實施例中，p40啟動子在EF1A結合元件、MLTF結合元件、ATF結合元件、Fos/Jun結合元件(AP-1)、Sp1樣元件(Sp1或GGT)或TATA元件中之任一或多者處經修飾。在其他實施例中，rep 基因係血清型1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、rh8、rh10、rh20、rh39、rh.74、RHM4-1或hu37，且p40啟動子域之部分或元件經修飾成血清型2。在其他實施例中，rep 基因係血清型8或9，且p40啟動子域之部分或元件經修飾成血清型2。

ITR含有A及A’互補序列、B及B’互補序列、以及C及C’互補序列；且D序列與ssDNA基因體鄰接。ITR之互補序列藉由自身退火形成髮夾結構(Berns KI. The Unusual Properties of the AAV Inverted Terminal Repeat.Hum Gene Ther 2020)。D序列含有Rep結合元件(RBE)及末端解鏈位點(TRS)，其一起構成AAV複製起點。亦需要ITR作為複製後基因體殼體包裹之包裝信號。在一些實施例中，ITR序列及cap 基因來自相同血清型，惟A及A’互補序列、B及B’互補序列、C及C’互補序列或D序列中之一或多者可經修飾以含有來自與殼體不同血清型之序列。在一些實施例中，經修飾之ITR序列來自與rep 基因相同之血清型。在其他實施例中，ITR序列及cap 基因來自不同血清型，惟選自A及A’互補序列、B及B’互補序列、C及C’互補序列或D序列之ITR序列中之一或多者來自與殼體(cap 基因)相同之血清型，且ITR序列中之一或多者來自與rep 基因相同之血清型。

在一些實施例中，rep及cap基因來自相同血清型，且rep基因包含經修飾之Rep78域、DNA結合域、內核酸酶域、ATP酶域、解旋酶域、p5啟動子域、Rep68域、p5啟動子域、Rep52域、p19啟動子域、Rep40域或p40啟動子域。在其他實施例中，rep及cap基因來自相同血清型，且rep基因包含至少一個來自不同血清型之蛋白域或啟動子域。在一個實施例中，rAAV包含側接AAV2 ITR序列之轉基因、AAV8帽及雜合AAV2/8rep 。在另一實施例中，AAV2/8rep 包含血清型8rep ，惟p40啟動子域或其部分來自血清型2rep 。在其他實施例中，AAV2/8rep 包含血清型2rep ，惟p40啟動子域或其部分來自血清型8rep 。在一些實施例中，可使用兩種以上血清型來構築雜合rep /cap 質體。

業內已知之任何適宜方法可用於轉染細胞，可用於根據本文揭示之方法產生rAAV粒子。在一些實施例中，本文揭示之方法包含使用基於化學之轉染方法轉染細胞。在一些實施例中，基於化學之轉染方法使用磷酸鈣、高度支化之有機化合物(樹枝狀聚合物)、陽離子聚合物(例如DEAE聚葡萄糖或聚乙烯亞胺(PEI))、脂質轉染。在一些實施例中，基於化學之轉染方法使用陽離子聚合物(例如DEAE聚葡萄糖或聚乙烯亞胺(PEI))。在一些實施例中，基於化學之轉染方法使用聚乙烯亞胺(PEI)。在一些實施例中，基於化學之轉染方法使用DEAE聚葡萄糖。在一些實施例中，基於化學之轉染方法使用磷酸鈣。

標準技術可用於重組DNA、寡核苷酸合成及組織培養及轉變(例如電穿孔、脂轉染)。酶促反應及純化技術可根據製造商之說明書或如業內通常完成或如本文所述實施。前述技術及程序通常可根據業內熟知之習用方法且如在本說明書中引用及論述之各種一般及更具體之參考文獻中所述來實施。例如，參見Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))，其出於任何目的以引用方式併入本文中。除非提供具體定義，結合本文所述之分析化學、合成有機化學及藥物及醫藥化學所用之術語以及其實驗室程序及技術係業內眾所周知且常用之彼等。標準技術可用於化學合成、化學分析、醫藥製備、調配及遞送以及患者之治療。

基於AAV之病毒載體之核酸序列及製備重組AAV及AAV殼體之方法教示於(例如) US 7,282,199、US 7,790,449、US 8,318,480、US 8,962,332及PCT/EP2014/076466，其各自係全文以引用方式併入本文中。

在較佳實施例中，rAAV提供可用於治療及預防應用之轉基因遞送載體，如下文更詳細論述。 5.4. 治療用途

提供分析編碼如本文所揭示之微小肌縮蛋白之構築體(包括重組基因療法載體)的方法，該等構築體用於治療效能。方法包括如本文所述之動物模型中之活體外及活體內測試或使用業內已知用於測試微小肌縮蛋白之活性及效能之任何其他方法。 5.4.1 活體外分析 5.4.1.1 肌細胞之活體外感染系統

提供測試本文揭示之重組載體(例如rAAV粒子)之感染性之方法。舉例而言，重組基因療法載體在肌細胞中之感染性可在C2C12肌母細胞中測試，如本文實例 2 中所述。可利用若干肌肉或心臟細胞系，包括(但不限於) T0034 (人類)、L6 (大鼠)、MM14 (小鼠)、P19 (小鼠)、G-7 (小鼠)、G-8 (小鼠)、QM7 (鵪鶉)、H9c2(2-1) (大鼠)、Hs 74.Ht (人類)及Hs 171.Ht (人類)細胞系。載體拷貝數可使用聚合酶鏈式反應技術來評價，且微小肌縮蛋白表現值可藉由量測細胞中微小肌縮蛋白mRNA之含量來測試。 5.4.2 動物模型

含有編碼如本文所述之微小肌縮蛋白之轉基因之病毒載體的效能可藉由投與給動物模型以替代突變之肌縮蛋白、例如藉由使用mdx 小鼠及/或金毛獵犬肌肉營養不良症(GRMD)模型，且評價轉基因表現之生物分佈、表現及治療效應來測試。例如，可藉由評價接受微小肌縮蛋白轉基因之動物中肌肉力量之變化來評價治療效應。使用較大哺乳動物以及非哺乳動物脊椎動物及無脊椎動物之動物模型亦可用於評價本文所述載體之臨床前治療效能。因此，提供用於治療性投與之組合物及方法，其包含根據本文揭示之用於評價治療效能之方法展現有效之量的劑量之本文揭示之微小肌縮蛋白編碼載體。 5.4.2.1 鼠類模型

基因療法載體之效能可在DMD鼠類模型中評價。mdx 小鼠模型(Yucel, N.等人, Humanizing the mdx mouse model of DMD: the long and the short of it, Regenerative Medicine 第3卷，文章編號：4 (2018))攜帶外顯子23之無義突變，從而產生早期終止密碼子及經截短之蛋白質(mdx )。Mdx 小鼠與同窩出生仔畜對照相比具有3倍高之丙酮酸激酶活性血液含量。與人類DMD疾病一樣，mdx 骨骼肌展現活躍之肌纖維壞死、細胞浸潤、寬範圍之肌纖維尺寸及許多中心成核之再生肌纖維。此表型在橫膈膜中增強，其經歷進行性變性及肌纖維損失，從而導致肌肉等長力量降低約5倍。後肢肌肉之壞死及再生在3-4週齡左右達到峰值，但此後達到平臺期。在mdx 小鼠及與其他小鼠背景(例如DBA/2J)雜交之mdx 小鼠中，觀察到心臟射血分數輕微但顯著之降低(Van Westering, Molecules 2015, 20, 8823-8855)。具有心臟功能缺陷之該等DMD模型小鼠可用於評價本文所述基因療法載體之心臟保護效應或心臟功能之改良或維持或心臟功能障礙之減輕。本文實例 3 詳述mdx 小鼠模型用於評價編碼微小肌縮蛋白之基因療法載體之用途。

額外mdx 小鼠模型：已經產生不同遺傳背景之許多替代形式，包括mdx2cv 、mdx3cv 、mdx4cv 及mdx5cv 系(C57BL/6遺傳背景)。該等模型係藉由用化學誘變劑N-乙基-N-亞硝基脲處理小鼠而建立。每一菌株攜帶不同點突變。總之，與mdx 小鼠相比，在mdxcv 模型中疾病表型之表現幾乎沒有差異。藉由將mdx系與各種剔除小鼠模型(例如Myod1 ^-/- 、α- Integrin7 ^-/- 、α-Dystrobrevin ^-/- 及Utrophin ^-/- )雜交，建立額外小鼠模型。目前用於研究DMD之所有小鼠模型已由Yucel, N.等人詳細闡述於以下中：Humanizing themdx mouse model of DMD: the long and the short of it, npj Regenerative Medicine 第3卷，文章編號：4 (2018)，其係以引用方式併入本文中。 5.4.2.2 犬

大部分犬研究在金毛獵犬肌肉營養不良症(GRMD)模型中執行(Korneygay, J.N.等人, The golden retriever model of Duchenne muscular dystrophy.Skelet Muscle . 2017；7: 9，其全文以引用方式併入)。患有GRMD之狗患有進行性、致命性疾病，具有骨骼肌及心肌表型及選擇性肌肉累及-更接近地反映DMD表型之嚴重表型。GRMD狗攜帶導致外顯子跳躍及框外DMD轉錄本之單個核苷酸變化。狗之表型特徵包括血清CK之升高、EMG上之CRD、以及成組之肌纖維壞死及再生之組織病理學證據。如在人類中，在GRMD中經常觀察到表型變化。GRMD狗發生反常之肌肉肥大，其似乎在受影響之狗之表型中起作用，其中步態僵硬、關節運動範圍減小及牙關緊閉係常見特徵。用於評估疾病進展之客觀生物標記包括強直性屈曲、脛跗關節角度、%離心收縮減量、最大髖屈曲角度、骨盆角度、顱縫匠肌周長及股四頭肌重量。 5.5. 治療方法

提供治療人類個體之任何肌肉營養不良疾病之方法，該等肌肉營養不良疾病可藉由提供功能性肌縮蛋白來治療。DMD係最常見之該疾病，但可投與本文提供之表現微小肌縮蛋白之基因療法載體來治療貝氏肌肉營養不良症(BMD)、強直性肌肉營養不良症(斯坦納特氏病(Steinert’s disease))、面肩肱型疾病(FSHD)、肢帶型肌營養不良症、X性聯擴張性心肌病或眼咽型肌肉營養不良症。本揭示內容之微小肌縮蛋白可為本文所述之任何微小肌縮蛋白，包括具有以N端至C端次序ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR、ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT、ABD-H1-R1-R2-R16-R17-R24-H4-CR或ABD-H1-R1-R2-R16-R17-R24-H4-CR-CT之域的彼等，其中ABD係肌縮蛋白之肌動蛋白結合域，H1係肌縮蛋白之鉸鏈1區，R1係肌縮蛋白之血影蛋白1區，R2係肌縮蛋白之血影蛋白2區，R3係肌縮蛋白之血影蛋白3區，H3係肌縮蛋白之鉸鏈3區，R16係肌縮蛋白之血影蛋白16區，R17係肌縮蛋白之血影蛋白16區，R24係肌縮蛋白之血影蛋白24區，CR係肌縮蛋白之富含半胱胺酸之區且CT係包含α1-互生蛋白結合位點及/或α-異連蛋白結合位點之肌縮蛋白之C端區的至少一部分。在實施例中，微小肌縮蛋白具有SEQ ID No: 1、2、79、91、92或93之胺基酸序列。編碼微小肌縮蛋白之載體包括具有SEQ ID NO: 20、21、81、101、102或103之核酸序列之彼等，在某些實施例中，可操作地連接至用於組成型、肌肉特異性(包括骨骼肌、平滑肌及心肌特異性)表現或CNS特異性表現之調節元件，以及其他調節元件(例如poly A位點)。該核酸可在rAAV基因體之背景下，例如，側接ITR序列，具體而言AAV2 ITR序列。在某些實施例中，方法及組合物包含向有需要之個體投與包含具有SEQ ID NO: 53、54、55、56、82、104、105或106之核酸序列之構築體的rAAV。在實施例中，患者已經診斷為患有DMD及/或具有DMD相關之症狀。用於遞送編碼微小肌縮蛋白之轉基因之重組載體闡述於章節5.3.4.1中。該等載體應具有人類肌細胞向性，且可包括非複製rAAV、具體而言帶有AAV8殼體之彼等。重組載體(例如圖 1A 及圖 22 中所示之彼等)可以任何方式投與，使得重組載體進入肌肉組織或CNS，較佳藉由將重組載體引入血流中。

投與該基因療法之個體可為對基因療法介導遞送微小肌縮蛋白至肌肉有反應的彼等。在特定實施例中，該等方法包括治療已經診斷患有DMD或其他肌肉營養不良疾病(例如貝氏肌肉營養不良症(BMD)、強直性肌肉營養不良症(斯坦納特氏病)、面肩肱型疾病(FSHD)、肢帶型肌營養不良症、X性聯擴張性心肌病或眼咽型肌肉營養不良症)、或具有一或多種與其相關之症狀、且鑑別為對用微小肌縮蛋白治療有反應、或被認為係用微小肌縮蛋白之基因介導遞送之療法的良好候選者之患者。在具體實施例中，患者先前已用合成形式之肌縮蛋白治療，且已發現對一或多種合成形式之肌縮蛋白有反應。為了確定反應性，可將合成形式之肌縮蛋白(例如，在人類細胞培養物、生物反應器等中產生)直接投與個體。

治療有效劑量之任何該等重組載體應以任何方式投與，使得重組載體進入肌肉(例如骨骼肌或心肌)，較佳藉由將重組載體引入血流中。在具體實施例中，載體係皮下、肌內或靜脈內投與。肌內、皮下或靜脈內投與應導致可溶性轉基因產物在肌細胞及/或CNS細胞中表現。轉基因產物之表現導致轉基因產物在肌肉及/或CNS中之遞送及維持。或者，遞送可導致基因療法遞送及微小肌縮蛋白在肝中之表現，且然後微小肌縮蛋白經由血流被攜帶至肌肉，在肌肉中其可賦予其治療效應。

投與特定個體之實際劑量量可由臨床臨時考慮參數來確定，該等參數例如但不限於身體及生理因素，包括體重、病況之嚴重程度、疾病類型、先前或同時之治療干預、個體之特發病及/或投與途徑。劑量可在1×10⁸ 個載體基因體/kg (vg/kg)至1×10¹⁵ vg/kg之範圍內。治療有效量可藉由在治療方案過程(即，數天、數週、數月等)期間投與單劑量或多劑量來實現。

適於靜脈內、肌內、皮下或肝投與之醫藥組合物包含重組載體在調配緩衝液中之懸浮液，該重組載體包含編碼微小肌縮蛋白之轉基因，該調配緩衝液包含生理上相容之水性緩衝液。調配緩衝液可包含多醣、表面活性劑、聚合物或油中之一或多者。

本文提供之基因療法載體可與用於肌肉營養不良症之其他治療(包括皮質類固醇、β阻斷劑及ACE抑制劑)組合投與。 5.5.1 肌肉變性/再生

肌縮蛋白之缺失導致機械不穩定性，從而引起肌纖維弱化並最終在收縮期間斷裂。患有DMD之患者在兒童早期首先展現骨骼肌無力，其迅速進展為肌肉質量損失、稱為脊柱後彎之脊柱彎曲、麻痹，且最終在30歲之前因心肺衰竭而死亡。DMD患者之骨骼肌亦發生肌肉肥大(具體而言腓腸之肌肉肥大，其係局部壞死性肌纖維之證據)、肌纖維直徑之異常變化、增加之脂肪沈積及纖維化，以及在免疫組織切片中缺乏肌縮蛋白染色。

本文提供之基因療法治療之目標係減緩或阻止DMD或其他肌肉營養不良疾病之進展，或降低與DMD或其他肌肉營養不良疾病相關之一或多種症狀之嚴重程度。具體而言，本文提供之基因療法之目標係減少肌肉變性、誘導/改良肌肉再生及/或預防/減少下游病理，包括干擾肌肉再生並引起運動喪失之發炎及纖維化、矯形術併發症以及最終呼吸及心臟衰竭。

效能可藉由如下來監測：藉由使用北極星可行動評價(North Star Ambulatory Assessment，NSAA) (量表係按順序的，其中34為指示完全獨立功能之最大評分)或年齡適當之改進評價量測大肌肉動作功能自基線之變化，藉由評價可行動功能之變化(例如6-min (步行距離＜300m、介於300m與400m之間、或＞400m))，藉由實施定時功能測試以量測自仰臥位站起所花費之時間(1-8s (良好)、8-20s (中等)及20-35s (差))自基線之變化，藉由實施爬升時間(4步)及跑步/步行評價時間(10米)，以及肌監測以評估上肢及下肢之力量自基線之變化[Mazzone等人, North Star Ambulatory Assessment, 6-minute walk test and timed items in ambulant boys with Duchenne muscular dystrophy, Neuromuscular Disorders 20 (2010) 712-716]。

效能亦可藉由量測肌肉生檢中血清肌酸激酶(CK)含量(正常：35-175 U/L，DMD：500-20,000 U/L) (當肌肉受損時以異常高含量發現之酶)、血清或尿肌酸酐含量(DMD：10-25 μmol/L，輕度BMD：20-30 μmol/L，正常＞53 μmol/L，DMD)及微小肌縮蛋白含量自基線之變化(降低)來監測。亦可實施磁共振成像(MRI)以評價骨骼肌(脂肪部分)中之脂肪組織浸潤(Burakiewicz, J.等人「Quantifying fat replacement of muscle by quantitative MRI in muscular dystrophy.」Journal of Neurology 第264卷,10 (2017): 2053-2067. doi:10.1007/s00415-017-8547-3)。

因此，提供核酸組合物及投與彼等組合物之方法，該等組合物改良大肌肉動作功能或減緩大肌肉動作功能損失，例如，如使用北極星可行動評價以評價與未處理對照相比或與用核酸組合物治療之前之個體相比之可行動功能所量測。或者，本文所述核酸組合物及投與核酸組合物之方法導致大肌肉動作功能之改良或大肌肉動作功能損失之減少(如藉由用以量測自仰臥位站起所花費之時間的定時功能測試、肌監測所評價)、或血清肌酸酐激酶(CK)含量之減少或脂肪組織浸潤之減少。血清肌酸酐激酶含量可進一步分成其同工酶分數MM-CPK (骨骼肌)、BB-CPK (腦)及MB-CPK (心臟)。

亦提供包含一定量之核酸組合物之組合物，該核酸組合物具體而言包括含有基因盒之載體、病毒載體及AAV載體，其包含編碼本文所述微小肌縮蛋白之核酸序列，該微小肌縮蛋白有效改良大肌肉動作功能或減緩大肌肉動作功能損失，例如，如使用北極星可行動評價所量測以與未治療對照相比或與用核酸組合物治療前之個體相比評價可行動功能；或如藉由定時功能測試所評價以量測自仰臥位站起所花時間，或以藉由肌監測或血清肌酸酐激酶含量降低展現改良。 5.5.2 心搏出量

儘管骨骼肌症狀被認為係DMD之確定特徵，但患者最通常死於呼吸或心臟衰竭。DMD患者由於心肌細胞中缺乏收縮功能所需之肌縮蛋白而發生擴張性心肌病(DCM)。此導致細胞外鈣之流入、觸發蛋白酶活化、心肌細胞死亡、組織壞死及發炎，最終導致脂肪累積及纖維化。此過程首先影響左心室(LV)，左心室負責將血液泵送至身體之大部分且較厚，且因此經歷較大之工作負荷。萎縮性心肌細胞展現紋理化損失、空泡化、片段化及核變性。功能上，萎縮及瘢痕形成導致LV之結構不穩定及運動機能減退，最終發展為一般DCM。DMD可與各種ECG變化(如竇性心動過速、晝夜指數降低、心率變化降低、短PR間期、右心室肥大、S-T段抑制及QTc延長)相關。

本文提供之基因療法治療可減緩或阻止DMD及其他肌縮蛋白病之進展，具體而言減少心臟功能障礙之進展或減弱心臟功能障礙及/或維持或改良心臟功能。效能可藉由使用連續心電圖及連續非侵入性成像研究(例如，超音波心動描計術或心臟磁共振成像(CMR))定期評估適合於試驗群體之年齡及疾病階段之心臟累及或心臟衰竭之體徵及症狀來監測。CMR可用於監測用力肺活量(FVC)、用力呼氣量(FEV1)、最大吸氣壓力(MIP)、最大呼氣壓力(MEP)、呼氣峰流量(PEF)、咳嗽峰流量、左心室射血分數(LVEF)、左心室短軸縮短率(LVFS)、發炎及纖維化自基線之變化。ECG可用於監測傳導異常及心律失常。具體而言，ECG可用於評價PR間隔、V1中之R波、V6中之Q波、心室再極化、下側壁及/或上側壁中之QS波、右束支中之傳導干擾、QT C及QRS之正規化。

因此，提供核酸組合物，包括含有基因表現盒及病毒載體之組合物，該等基因表現盒及病毒載體含有編碼本文揭示之微小肌縮蛋白之核酸；以及投與彼等組合物之方法，該等組合物例如藉由防止減少之LVEF降低至45%以下及/或如藉由連續心電圖及/或連續非侵入性成像研究(例如超音波心動描計術或心臟磁共振成像(CMR))量測之功能正規化(LVFS ≥ 28%)來改良或維持心臟功能或減緩心臟功能喪失。量測結果可與未處理對照或與用核酸組合物治療前之個體進行比較。或者，本文所述之核酸組合物及投與核酸組合物之方法導致心臟功能改良或心臟功能損失減少，如藉由監測用力肺活量(FVC)、用力呼氣量(FEV1)、最大吸氣壓力(MIP)、最大呼氣壓力(MEP)、呼氣峰流量(PEF)、咳嗽峰流量、左心室射血分數(LVEF)、左心室縮短分數(LVFS)、發炎及纖維化自基線之變化所評價。ECG可用於監測傳導異常及心律失常。具體而言，ECG可用於評價PR間隔、V1中之R波、V6中之Q波、心室再極化、下側壁及/或上側壁中之QS波、右束支中之傳導干擾、QT C及QRS之正規化。 5.5.3 中樞神經系統

患有DMD之患者之一部分亦可患有癲癇、學習及認知損害、失讀症、神經發育障礙(例如注意力缺失過動症(ADHD))、自閉症及/或精神異常(例如強迫症、焦慮症或睡眠病症)。

本文揭示之基因療法之目標可為改良認知功能或緩和癲癇及/或精神異常之症狀。效能可藉由定期評估適合於試驗群體之年齡及疾病階段之行為及認知功能及/或藉由量化及定性癲癇發作事件來評價。

因此，提供核酸組合物及投與微小肌縮蛋白之基因療法組合物之方法，該等微小肌縮蛋白之基因療法組合物改良認知功能、減少癲癇發作之發生或嚴重程度、緩和ADHD、強迫症、焦慮症及/或睡眠病症之症狀。 5.5.4 患者主要終點

可在所治療之個體之臨床評估中評價組合物之效能，包括組合物之劑量，及本文所述之方法。患者主要終點可包括監測用力肺活量(FVC)、用力呼氣量(FEV1)、最大吸氣壓力(MIP)、最大呼氣壓力(MEP)、呼氣峰流量(PEF)、咳嗽峰流量、左心室射血分數(LVEF)、左心室短軸縮短率(LVFS)自基線之變化；NSAA自基線之變化；上肢行為表現(PUL)評分自基線之變化；以及布魯克(Brooke)上肢量表評分(Brooke評分)自基線之變化；握力、捏力自基線之變化；藉由MRI之心臟纖維化評分之變化；藉由MRI評價之上臂(二頭肌)肌肉脂肪及纖維化之變化；使用測力計腿部力量之量測結果；步行測試6分鐘；步行測試10分鐘；步行分析-3D記錄步行；經由免疫染色之生檢切片之可量化成像之肌營養相關蛋白(utrophin)膜染色之變化；以及藉由量測(經由肌肉生檢)纖維大小及新生肌凝蛋白陽性之組合之再生纖維變化。例如，參見Mazzone E等人，North Star Ambulatory Assessment, 6-minute walk test and timed items in ambulant boys with Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscular Disorders 20 (2010) 712-716.；Abdelrahim Abdrabou Sadek等人, Evaluation of cardiac functions in children with Duchenne Muscular Dystrophy: A prospective case-control study. Electron Physician (2017) Nov；9(11): 5732-5739；Magrath, P.等人，Cardiac MRI biomarkers for Duchenne muscular dystrophy. BIOMARKERS IN MEDICINE (2018) 第12卷，第11期；Pane, M.等人，Upper limb function in Duchenne muscular dystrophy: 24個月縱向數據. PLoS One. 2018年1約20日；13(6):e0199223。6. 實例 6.1 實例 1 - 用於插入順式質體之構築微小肌縮蛋白 (DMD) 基因表現盒 .

具有類似主鏈之DMD構築體：5’- ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-3’ (圖1)。四種構築體在啟動子長度上係不同的，一種不含C端(RGX-DYS3)，一種不含內含子(RGX-DYS1)，且一種具有經截短之肌肉特異性啟動子(RGX-DYS4)。所有皆選殖至側接ITR之順式質體中。編碼DMD 基因之所有DNA序列皆密碼子最佳化，且缺失CpG。6.1.1. RGX-DYS1 及 RGX-DYS2 轉基因之重組工程化

簡言之，使用GeneArt Gene Synthesis (Invitrogen, Thermo Fisher, Waltham, MA)合成如圖 1A 中所示之RGX-DYS1及RGX-DYS2中之微小肌縮蛋白構築體之人類密碼子最佳化及CpG缺失之核苷酸序列，其編碼N端-ABD1-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT-C端。使用以下兩種引子藉由定點誘變製備期望C端：5′：TGA CTC GAG AGG CCT AAT AAA GAG C (SEQ ID NO: 43)，3′：CCT TGG AGA CTG TGG AGA GGT G (SEQ ID NO: 44)。為了產生具有VH4內含子序列之RGX-DYS2 (參見下文章節6.1.4)，將含有編碼微小肌縮蛋白之核苷酸序列之片段與含有AAV ITR、複製起點及抗生素抗性之主鏈質體內聚性連接，以形成RGX-DYS2質體構築體。序列分析揭示內含子之5′剪接位點中額外之胞嘧啶(C)，因此，藉由定點誘變方法去除額外之C核苷酸，且所得構築體RGX-DYS2含有VH4內含子。類似地，利用定點誘變去除VH4內含子，得到RGX-DYS1。6.1.2. RGX-DYS3 及 RGX-DYS4 轉基因之重組工程化

工程化構築體RGX-DYS3 (圖1A )，其編碼上文詳述之RGX-DYS1及RGX-DYS2構築體之微小肌縮蛋白，而無CT域。此構築體在構築體之5’端包括VH4內含子。

RGX-DYS4 (圖1A )如RGX-DYS2中一樣含有編碼微小肌縮蛋白及VH4內含子之盒，其與最小SPc5-12啟動子(SEQ ID NO: 40；參見章節6.1.3)而非全長SPc5-12啟動子連接。6.1.3. RGX-DYS5 之重組工程化

工程化構築體RGX-DYS5 (圖1A )，其編碼微小肌縮蛋白，命名為DYS5 (SEQ ID NO: 79之胺基酸序列)，具有長度為140個胺基酸之C端域(具有SEQ ID NO: 83之胺基酸序列之經截短之C端域)，且含有α1-互生蛋白結合位點，而非異連蛋白結合位點。該質體編碼人類密碼子最佳化及CpG缺失形式之微小肌縮蛋白DYS5轉基因、合成肌肉啟動子(例如spc5-12)及小的聚(A)信號序列，且側接ITR (SEQ ID NO. 82之核苷酸序列)。

藉由用中等長度形式之C端尾置換質體RGX-DYS1中之DYS1之長形式之C端，產生質體RGX-DYS5。簡言之，自整合DNA技術合成gBlock-DMD-1.5尾，其含有側接EcoRV及NheI位點之中間形式之C端以及RGX-DYS1質體之17 bp重疊序列。用限制酶NheI及EcoRV (New England Biolabs)消化源質體RGX-DYS1，且然後與gBlock-DMD1.5尾進行內融合連接。藉由酶消化及隨後之測序確認最終質體RGX-DYS5。

藉由西方墨點法確認蛋白質之長度及表現。為此，將不同質體轉染至成肌母細胞細胞系C2C12細胞中。分化後四天，在溶解緩衝液中收穫細胞。將20μg來自每一質體樣品之細胞溶解物加載至SDS-PAGE凝膠上。使用針對肌縮蛋白(MANEX1011B，Developmental Studies Hybridoma Bank)之抗體(1c7)檢測微小肌縮蛋白帶。自質體RGX-DYS5 (表現DYS5)產生之微小肌縮蛋白帶顯著短於RGX-DYS1 (表現DYS1)，且長於DYS3 (圖1B及C)。在產生圖 1B 之實驗中，DYS3轉基因由遍在CB啟動子驅動，而DYS1及DYS5轉基因表現由肌肉特異性啟動子驅動。使用α-肌動蛋白蛋白對照作為一致總蛋白回收率之量度(圖1C )。

為了檢查RGX-DYS5之包裝效率，使用HEK293細胞將RGX-DYS5包裝至AAV8載體中，且在搖瓶培養及親和純化後測定載體RGX-DYS5之效價。在該等臺式生產運行中，平均效價高於AAV8包裝之RGX-DYS1，且與AAV8包裝之RGX-DYS3相當。(數據未顯示)。6.1.4. VH4 內含子及 minSPc5-12 啟動子

RGX-DYS2、RGX-DYS3及RGX-DYS4中之VH4內含子係自人免疫球蛋白重鏈可變區(SEQ ID NO: 41；GenBank登錄號AB019438.1)獲得。首先在C2C12細胞中活體外測試VH4內含子之剪接效率及準確度，執行逆轉錄PCR產物之測序以測試是否發生正確剪接事件。將RGX-DYS2質體轉染至C2C12肌母細胞中，且將細胞在分化培養基中培養三天。然後使細胞經受RNA提取、cDNA合成及PCR。用於PCR之引子係：引子1：GGC CCA CGA GCT ACC CGG AG (SEQ ID NO: 45)，引子2：CTT CCA GCA GAT CCA GCA GCC (SEQ ID NO: 46)。凝膠純化預期之PCR產物並進行Sanger測序。測序結果揭示，發生準確剪接事件。然後在構築體中測試VH4內含子之功能，在該構築體中微小肌縮蛋白編碼序列經GFP報導基因蛋白之編碼序列置換。亦測試含有GFP基因之AAV8載體，其由SPc5-12啟動子驅動，在不同劑量下在分化之C2C12細胞中具有或不具有VH4內含子。拍攝影像，且使用Cytation 5細胞成像多模式讀取器進行定量。定量及影像數據皆指示，VH4內含子使GFP表現增加近5倍(圖2A-F 及圖 3 )。 6.2 實例2-使用分化之C2C12細胞對微小肌縮蛋白載體之活體外功效分析

藉由分析AAV8-CAG-GFP載體在HEK293細胞中之感染性，開發用於測試微小肌縮蛋白載體之功效之活體外分析。感染(1 × 10E5 vg /細胞)三天後，觀察到很少GFP陽性HEK293細胞(數據未顯示)，此指示用AAV8載體之HEK293細胞之感染性較低。然後以相同方式測試AAV8-CAG-GFP載體轉導C2C12肌母細胞之能力。用AAV8-CAG-GFP載體(1 × 10e6 vg/細胞)感染未分化之C2C12肌母細胞，然後分化三天。與HEK293細胞相似，觀察到非常少之GFP陽性細胞，展現未分化之C2C12肌母細胞展示由rAAV8之低感染性(數據未顯示)。藉由在分化培養基(DMEM +2%馬血清)中培養C2C12細胞3天，且然後將其用AAV8-CAG-GFP感染，在分化之C2C12細胞中測試感染性。在感染後三天及分化後三天拍攝影像。許多GFP陽性細胞係可見的，表明分化之肌管易於由AAV8載體轉導(圖4A-C )。

成功建立肌細胞之活體外感染系統後，分析微小肌縮蛋白載體之功效。舉例而言，在分化之C2C12細胞中測試使用相同產生方法相隔若干個月產生之兩批載體(RGX-DYS1-RS及RGX-DYS1-03)之功效。所用之一級抗體係針對人類肌縮蛋白之單株抗體(DSHB目錄號MANHINGE1A(6F11))。使用JMP軟體分析數據。測試載體(RGX-DYS1-03)之相對功效係參照對照(RGX-DYS1-RS，100%)之81.47%，指示該兩種載體之感染性非常類似(圖5A-H )。

產生成批之重組AAV包裝DYS1、DYS2、DYS3或DYS4載體，且將其在分化之肌細胞系C2C12細胞中比較相對感染性，作為載體功效之量度(圖6 )。簡言之，將小鼠肌細胞系C2C12細胞以2×10E5細胞/孔接種於6孔板中，該板在杜貝克氏改良鷹氏培養基(Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)中與10%胎牛血清(FBS)一起培養。然後在第二天將細胞換成分化培養基(DMEM，含2%馬血清，補充有胰島素(1 ug/ml))。分化三天後，用2.5E4 vg/細胞之劑量之不同DMD載體感染細胞。感染後三天，收穫感染之細胞，且進行DNA提取，之後進行Q-PCR。使用DNeasy血液及組織套組(目錄號：69504，Qiagen)提取DNA。對內源性對照(升糖素基因)及AAV載體二者皆使用Taqman分析。作為內源對照之小鼠升糖素基因允許載體拷貝數之正規化。小鼠升糖素引子及探針之序列如下：升糖素-real-F (小鼠)：AAGGGACCTTTACCAGTGATGTG (SEQ ID NO: 47)；升糖素-real-R (小鼠)：ACTTACTCTCGCCTTCCTCGG (SEQ ID NO: 48)；Taqman小鼠升糖素探針：FAM-CAGCAAAGGAATTCA-MGB (SEQ ID NO: 49)。對於靶AAV載體，引子及探針經設計以識別微-dys序列，且如下：Dys-C-F：TGG GCC TGC TCC TGC ATG (SEQ ID NO: 50)；Dys-C-R：ATC TCA GGC TTG GCA AAC (SEQ ID NO: 51)；Dys-C-探針：FAM-CAA TAT TGA GCC ATC AGT C-MGB (SEQ ID NO: 52)。每個二倍體細胞之拷貝數計算為：

將DYS1-RS批次視為參考對照(設定為1.0)，且將所有其他載體與其進行比較(載體拷貝數/參考對照(倍數變化))。如圖 6 中所示，所有AAV8載體之感染性係相當的(50-150%之感染性係可接受的)，展現良好品質之載體。

在用兩種不同劑量(1e5 vg/細胞及5e4 vg/細胞)之各種AAV8載體感染分化之C2C12細胞後測定微小肌縮蛋白基因之RNA表現值。用RGX-DYS3載體轉染之細胞中微小肌縮蛋白之mRNA含量比用RGX-DYS1載體轉染之細胞中微小肌縮蛋白之mRNA含量高2-3倍(圖7 )。此差異可能係由於RGX-DYS3穩定mRNA中存在VH4內含子。 6.3 實例3 - 向mdx小鼠模型之基因療法投與6.3.1. 研究方法

使用HEK293細胞將RGX-DYS1包裝至AAV8載體中，且載體RGX-DYS1之效價為4.6E13 vg/ml。簡言之，藉由尾靜脈注射以2E14 vg/kg劑量將RGX-DYS1 AAV8載體全身性地遞送至5週齡雄性mdx 小鼠中(n = 13)。定期對小鼠稱重。在治療後5週量測肌肉握力，且在注射後6週實施活體外肌肉收縮功能分析。結果示於表 11 中。表 11 ： mdx 小鼠模型分析之概要

	治療週數(週齡)
1(5)	2(6)	3(7)	4(8)	5(9)	6(10)
體重	+	+	+	+	+	+
臨床觀察結果	+	+	+	+	+	+
藥物投與	+	-	-	-	-	-
前肢握力	-	-	-	+	+	-
活體外力組織收集	-	-	-	-	-	+

6.3.2. 體重及組織重量

由於骨骼肌變性及再生之發病機理，mdx 小鼠通常比野生型小鼠重。如圖 8 中所揭示，用RGX-DYS1載體之治療顯著降低體重。事實上，在治療後2週，經治療之小鼠之體重與野生型對應物類似。

所有小鼠在注射後6週安樂死，且對各種器官及肌肉進行稱重。RGX-DYS1治療之小鼠展示器官及肌肉重量之顯著降低，包括比目魚肌、四頭肌及三頭肌以及脛骨前肌(TA) (圖 9A 及9B )。6.3.3. 握力

為了量測握力，在開始程序之前使小鼠適應測試室約10分鐘。實驗者對治療不知情，且由另一個人將欲量測之小鼠移交給實驗者。將小鼠輕輕地放在前肢金屬絲網格之頂部，使得僅允許其前爪抓住水平桿之一。在確保兩個前爪抓住相同桿且軀幹與地面水平且與桿平行之後，用均勻之力沿網格之整個長度穩定地向後拉小鼠，直至鬆開抓握。連續五天對每一動物進行5次良好之拉動以馴化及測試。計算單一最佳記錄值(最大力)用於分析個體小鼠之最大力量。基於體重計算正規化力量(KGF/kg)。

治療後5週之握力量測揭示，與患病媒劑對照相比，治療顯著增加RGX-DYS1治療之小鼠之肌肉力量(p≤0.001) (圖 10 )。6.3.4. 活體外力

使用氯胺酮(Ketamine)及甲苯噻嗪(Xylazine)麻醉小鼠。自每一小鼠去除右後肢之EDL肌肉，並在25℃下浸沒於含有林格氏溶液(Ringer’s solution，pH 7.4)之氧合浴(95% O2、5% CO2)中。使用非疲勞抽搐，將肌肉調節至產生力之最佳長度。用電極刺激肌肉以引發強直性收縮，其相隔2分鐘之休息間隔。對於隨後之每一破傷風，刺激頻率以20、30或50Hz之步長增加，直至力達到通常在250Hz左右出現之平臺期。基於肌肉質量、纖維長度及組織密度量測肌肉之橫斷面積。最後，基於肌肉之橫斷面積計算肌肉比力(kN/m2)。

與健康BL10小鼠相比，媒劑mdx 小鼠(n=13)顯示最大及比力之顯著降低(歷史數據，n=14)。與媒劑對照相比，用RGX-DYS1治療mdx 小鼠在6週時導致最大及比力之顯著改良(圖11 )。6.3.5. 心臟功能

為了量測血壓(BP)，使用1.5%異氟甲烷鎮靜小鼠，持續監測麻醉之程度並維持體溫在36.5-37.58℃。心率維持在450-550次/分鐘。在尾部周圍放置BP袖帶，且然後將尾部放置在感測器總成中，用於在麻醉期間進行非侵入性BP監測。進行十次連續之BP量測。使用分析軟體離線進行尾部BP之定性及定量量測，包括收縮壓、舒張壓及平均壓。例如，參見Wehling-Henricks等人，Human Molecular Genetics, 2005, 第14卷，第14期；Uaesoontrachoon等人，Human Molecular Genetics, 2014, 第23卷，第12期。

為了監測在清醒、自由移動之小鼠中之ECG波高及間隔持續時間，使用無線電遙測裝置。將發射器單元植入麻醉小鼠之腹膜腔中，且將兩根電導線以導線II定向固定在心尖及右肩峰附近。將小鼠單獨地圈養在在連接至電腦系統之天線接收器上方之籠子中，用於數據記錄。未過濾之ECG數據每小時收集10秒，持續35天。丟棄前7天之數據以允許自外科手術程序恢復並確保麻醉之任何效應已經減退。用DSI分析包(ART 3.01及Physiostat 4.01)分析數據波形及參數，並編譯量測結果，並對其求平均，以確定心率、ECG波高及間隔持續時間。由兩個獨立之觀察者掃描原始ECG波形以發現心律不整。

實施Picro-Sirius紅染色以量測試驗小鼠心臟中之纖維化程度。簡言之，在試驗結束時，在安樂死後立即移出心肌並固定在10%福馬林(formalin)中用於稍後處理。將心臟切片，且將石蠟切片在二甲苯中脫蠟，且然後用Weigert蘇木素核染色8 min。然後將其洗滌，且然後用Picro-Sirius紅(0.5g Sirius紅F3B，苦味酸之飽和水溶液)再染色30 min。以三次二甲苯更換清潔切片並安裝於Permount中。使用Eclipse E800 (Nikon, Japan)顯微鏡拍攝五張隨機數位影像，並使用Image J (NIH)進行盲化分析。

當動物被安樂死時，經由心臟穿刺獲取血樣，且收集之血清用於量測肌肉CK含量。 6.4 實例4 載體生物分佈

在治療後6週處死媒劑及RGX-DYS1治療之mdx 小鼠，且使用來自Stilla Technologies之Naica Crystal Digital PCR系統在包括骨骼肌、心肌及肝細胞之各種組織上評價載體拷貝數。

RGX-DYS1載體經由尾靜脈注射投與至四週齡雄性肌營養不良mdx 小鼠中。注射後六週，處死小鼠，且對組織進行總DNA提取及ddPCR分析以確定載體拷貝數。

用DNeasy Blood & Tissue套組提取收集之組織之總DNA，並使用Nanodrop分光光度計量測DNA濃度。為了確定組織中之載體拷貝數，用Naica Crystal Digital PCR系統(Stilla Technologies)實施數位PCR。在此應用兩種顏色多重系統以同時量測肌縮蛋白轉基因及內源對照基因。簡言之，用FAM (6-羧基螢光素)染料標記肌縮蛋白探針，而用VIC螢光染料標記內源性對照升糖素探針。小鼠升糖素引子及探針之序列如下：升糖素-real-F (小鼠)：AAG GGA CCT TTA CCA GTG ATG TG (SEQ ID NO: X)；升糖素-real-R (小鼠)：ACT TAC TCT CGC CTT CCT CGG；Taqman 小鼠升糖素探針：VIC-CAG CAA AGG AAT TCA-MGB。對於AAV載體，引子及探針經設計以識別肌縮蛋白基因之C端：Dys-dd-F2：ACA GAT ACC TGT TCA AGC AAG TGG C (SEQ ID NO: 122)；Dys-dd-R2：TCA ATC TCA GGC TTG GC (SEQ ID NO: 123)；Dys-C-探針：FAM-CAA TAT TGA GCC ATC AGT C-MGB (SEQ ID NO: 124)。每個二倍體細胞在特定組織中遞送之載體之拷貝數計算為：

。

RGX-DYS1投與在肝組織中產生最高之載體拷貝數(437±78拷貝/細胞，n=13)。心肌(23±9，n=13)及骨骼肌(脛骨前肌(TA) 28±10拷貝/細胞，伸趾長肌(EDL) 23±11拷貝/細胞，橫膈膜肌28±29拷貝/細胞，三頭肌49±22拷貝/細胞)皆展現顯著之載體分佈(圖 12 )。 6.5 實例5 包括nNOS之DAPC之恢復

肌縮蛋白相關蛋白與肌縮蛋白一起形成稱為肌縮蛋白相關蛋白複合物(DAPC)之複合物，其作為橋樑經由細胞外基質將細胞內細胞骨架肌動蛋白連接至基底層。Sadoulet-Puccio, H.M.,等人，Dystrobrevin and dystrophin: an interaction through coiled-coil motifs. (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94:12413-8。DAPC由若干亞複合物構成：肌縮蛋白聚糖、肌聚糖及互生蛋白/異連蛋白，其共同在收縮及鬆弛之重複循環期間以及在細胞信號傳導中維持纖維完整性方面發揮作用，同上(圖13 )。在野生型肌縮蛋白中，β-肌縮蛋白聚糖結合位點位於鉸鏈4及富含半胱胺酸(CR)之域中。肌縮蛋白之WW域需要EF-手區以與β-肌縮蛋白聚糖相互作用(Rentschler, S.等人 1999, Biol Chem 380:431-42)。RGX-DYS1包括C端之一部分(SEQ ID NO: 16)，其含有異連蛋白及互生蛋白結合域(參見表 1 )。互生蛋白之重要功能之一係將信號傳導蛋白(例如神經元一氧化氮合酶(nNOS))錨定於肌纖維膜。Adams, M.E.等人，2000. Absence of α1- syntrophin leads to structurally aberrant neuromuscular synapses deficient in utrophin. J Cell Biol 150:1385-98。因此，預期mdx 小鼠肌肉中來自RGX-DYS1之微小肌縮蛋白之表現將使肌膜之異連蛋白、互生蛋白及nNOS恢復。

對經治療及對照腓腸肌肌肉之冷凍薄切片實施針對肌縮蛋白、nNOS、α1-互生蛋白、α-異連蛋白之免疫螢光染色。用於實驗程序之試劑及抗體列於表12及13中。表 12 ：染色試劑

說明	目錄號	供應商 / 供方
DAPI核酸染料，FluoroPure級	D21490	Thermo Fisher/Invitrogen
馬血清(New Zealand Origin)	16050-130	Thermo Fisher/Gibco
小鼠對小鼠(Mouse on Mouse，M.O.M)封閉試劑	VWR目錄號101098-256， Vector Labs目錄號MKB-2213	VWR/Vector Laboratories
Apex高級膠黏劑載玻片	VWR目錄號10015-146, Leica目錄號3800080	VWR/Leica
SlowFade Gold Antifade封固劑	S36937	Thermo Fisher/Invitrogen
蓋玻璃	VWR目錄號75810-254, Leica目錄號3800150ACS	VWR/Leica
PAP筆液體封閉劑，小	VWR目錄號100502-806, Electron Microscopy Service目錄號71312	VWR/Electron Microscopy Service
PBS	20012-027	Thermo Fisher/ Gibco
超純蒸餾水	10977-015	Thermo Fisher/Invitrogen

藉由立即於異戊烷/液氮雙浴中快速冷凍新鮮分離之小鼠組織，且其後於-80度下儲存。藉由添加幾滴OCT (最佳切割溫度)化合物且然後將組織以期望切割定向放置在塊上將組織固定於切割塊。在低溫恒溫器中在合適的位置冷凍OCT及組織(以期望定向保持組織直至OCT為固體)，且將組織切片成10μm (8-10μm可接受)。在每一載玻片上佈置四至六個切片並於-80度下儲存。

將肌肉冷凍切片載玻片自-80度儲存中移出，並在室溫(RT)下風乾10分鐘。然後用PAP筆在組織切片區域周圍做標記。若一級抗體來自小鼠單株抗體，則需要兩個封閉步驟。首先，藉由添加適當體積之1× M.O.M.以覆蓋由PAP筆藉由吸量管包圍之全部區域來封閉樣品，並在RT下培育1.5小時。藉由抽吸去除血清，且隨後於RT下用10%馬血清(在PBS中)封閉1小時。若一級抗體並非來自小鼠來源，則藉由使用吸量管以添加適當體積之PBS以覆蓋PAP筆包圍之全部區域用10%馬血清(在PBS中)直接封閉樣品，且隨後在RT培育1小時。

將一級抗體稀釋於2%馬血清(在PBS中)中，並將樣品在RT下培育1-2小時。然後藉由添加適當體積之PBS以覆蓋PAP筆包圍之全部區域用1× PBS洗滌載玻片，之後在RT下培育3分鐘並抽吸。重複總共3-4次。將二級抗體(CY3，等效物，例如Alexa Fluor 594或488偶聯之抗體)稀釋於PBS中之2%馬血清中，並將載玻片在RT下培育1小時。在室溫下將載玻片用1× PBS洗滌3-4次，持續3分鐘。用DAPI實施複染色以藉由將載玻片與稀釋於PBS中之1x DAPI在RT下培育5至8分鐘來展示細胞核。DAPI染色後，在RT下用1× PBS洗滌載玻片3分鐘，且然後於RT下用1-2滴/載玻片之抗褪色封固培養基封固。載玻片在封固後於RT下風乾且避光。使用螢光顯微鏡分析螢光並拍攝影像。表 13 ：用於 DAPC 分析之一級及二級抗體

說明	目錄號	供應商 / 供方	推薦稀釋
小鼠抗肌縮蛋白單株抗體	MANEX1011B (1C7) 上清液	Developmental Studies Hybridoma Bank /University of Iowa	1:100
小鼠抗β-肌縮蛋白聚糖單株抗體	MANDAG2 (7D11) 上清液	Developmental Studies Hybridoma Bank (University of Iowa)	1:3000
小鼠抗NOS1單株抗體	SC-5302	Santa Cruz Biotechnology	1:50
兔抗互生蛋白α 1，多株抗體	Ab11187	Abcam	1:3000
小鼠抗異連蛋白單株抗體	610766	BD Biosciences	1:100
山羊抗小鼠IgG多株抗體，Cy3偶聯物	AP124C	Millipore Sigma	1:500
山羊抗兔IgG (H+L)多株抗體，Cy3偶聯物	A10520	Thermo Fisher/Invitrogen	1:500

如圖 14 中所示，除了少數返祖纖維外，在肌縮蛋白及檢查之DAPC蛋白在未用RGX-DYS1處理之mdx 小鼠肌肉中皆不存在。RGX-DYS1之全身性遞送有效地恢復肌縮蛋白表現，同時將α1-互生蛋白、α-異連蛋白、β-肌縮蛋白聚糖及nNOS錨定於肌纖維膜(表 14 )。注意，使用兩種商業抗體進行nNOS染色。在兩種情況下，與未治療之對照組相比，nNOS表現顯著使肌膜恢復。總之，RGX-DYS1微小肌縮蛋白能夠在活體內使肌纖維膜之肌縮蛋白相關蛋白複合物(包括nNOS)恢復。表 14. DAPC膜之錨定

	β- 肌縮蛋白聚糖	α - 異連蛋白	α 1- 互生蛋白	nNOS
野生型肌縮蛋白	+++	+++	+++	+++
DYS1	+++	+++	+++	++
DYS3	+++	+	+	-
DYS5	+++	+	+++	++

6.6 實例6 - 向mdx 小鼠模型之基因療法投與

在13隻雄性C57BL/10ScSn-Dmd^mdx /J (mdx )小鼠中實施AAV8-RGX-DYS3及AAV8-RGX-DYS5載體之活體內測試。所有載體藉由尾靜脈注射以2E14 vg/kg劑量全身遞送至5週齡mdx 小鼠中(對於組1，n =5，AAV8-RGX-DYS3；對於組2，n =5，AAV8-RGX-DYS5；n =3，mdx 陰性(無給藥)對照)。在給藥當天，動物之體重範圍為15.9 g至22.0 g。在載體投與後6週，收集血液用於血清，且將動物安樂死並進行驗屍用於組織收集。收集主要骨骼肌，包括腓腸肌(Gas)、脛骨前肌(TA)、橫膈膜肌、三頭肌、四頭肌、心臟、肝及主要器官，且在異戊烷/液氮雙浴中快速冷凍，並放置於預冷之冷凍管中。

每週兩次記錄每一動物之體重，並計算每一組之平均體重變化。所有動物在7週時段內皆增加體重，如所預期，除了動物#12 (R13-135-012)。

表15 ：自第0天至第42天個體及組體重之變化

動物編號	組	體重變化(g)	組中之平均體重變化(g)
R13-135-001	1	9.5	5.9
R13-135-002	1	7.7
R13-135-005	1	1.7
RI 3-135-006	1	5.2
R13-135-007	1	5.4
R13-135-008	2	9.7	7.3
R13-135-009	2	3.8
R13-135-011	2	8.0
R13-135-012	2	患病動物
R13-135-013	2	7.7
R13-135-003	陰性對照	13.8	13.2
R13-135-004	陰性對照	12.7
R13-135-010	陰性對照	13.0

mdx 小鼠中骨骼肌變性及再生之發病機理通常導致比野生型小鼠重。如表 15 中所見，與未接受治療之mdx 小鼠相比，用RGX-DYS3或RGX-DYS5載體治療之mdx 小鼠導致顯著更小之體重變化。6.7 實例 7- 經治療之 mdx 小鼠中微小肌縮蛋白 ( μ -Dys) 蛋白表現之評價 6.7.1 藉由西方墨點法、 mRNA 表現及 DNA 載體拷貝數進行 μ -Dys 表現比較。

在如下文章節6.3所述之治療後收集本實例中闡述之與RGX-DYS1實驗相關之數據及樣品(n =13隻小鼠，投用AAV8-RGX-DYS1)。在如上文章節6.6所述之治療後，收集下文闡述之與投與AAV8-RGX-DYS3及AAV8-RGX-DYS5之動物之實驗相關之數據及樣品(每一治療之mdx 小鼠組，n=5)。在不同設施實施實驗。

藉由西方墨點法檢查自經治療之mdx 小鼠收集之腓腸肌之微小肌縮蛋白表現。簡言之，將20至30 mg組織在蛋白質溶解緩衝液(15% SDS、75mM Tri-HCl pH6.8、蛋白酶抑制劑、20%甘油、5% β-巰基乙醇)中勻漿(Beam Mill勻漿器Bead Ruptor 12，SKU：19050A，OMNI International)。勻漿後，在室溫下以最高速度將樣品離心5 min，並對上清液進行蛋白質定量。使用Qubit蛋白分析套組(目錄號Q33211，ThermoFisher Scientific)定量蛋白質儲備上清液。計算每份儲備液之總蛋白質濃度，然後將20 ug蛋白質儲備上清液上樣至SDS-PAGE凝膠上。使用以1:1000稀釋之一級抗肌縮蛋白抗體(MANEX1011B (1C7)，Developmental Studies Hybridoma Bank)實施西方墨點法，且應用之二級抗體係與辣根過氧化物酶(HRP)偶聯之山羊抗小鼠IgG2a (Thermo Fisher Scientific，目錄號62-6520)。α1-肌動蛋白在凝膠之每一泳道中用作上樣對照。對於抗-α1-肌動蛋白墨點，以1:10,000之稀釋因子使用兔多株抗-α1-肌動蛋白抗體(PA5-78715，Thermo Fisher)，且以1:20,000使用二級山羊抗兔抗體(Thermo Fisher Scientific，目錄號31460)。使用ECL Prime西方墨點法檢測試劑檢測蛋白信號(根據製造商之說明書；AMERSHAM，RPN2232)，並藉由Image Lab軟體(Bio-Rad)指導之光密度測定法定量。

西方墨點法結果(圖15 )揭示若干觀察結果：首先，每一μ-肌縮蛋白之估計大小與其在凝膠上觀察到之遷移完全一致，例如RGX-DYS1 µ-肌縮蛋白為148 kDa，而RGX-DYS5及RGX-DYS3蛋白之大小分別為142 kDa及132 kDa。其次，對於腓腸肌組織中存在之每一蛋白質，帶之強度不同。較長形式之μ-肌縮蛋白RGX-DYS1載體展示最強之轉基因表現，之後係中間形式之RGX-DYS5及較短形式之RGX-DYS3 (圖 15 及圖 16A )。該三種構築體之間µ-肌縮蛋白表現值之差異可能係由於AAV載體基因體含量之變化或不同長度之µ-肌縮蛋白構築體之蛋白質穩定性。

為了闡明每個細胞之基因體拷貝，使用章節6.4 (實例4)中先前闡述之方法實施ddPCR以檢查彼等組織中之AAV-μ-dys載體基因體拷貝數。如圖 16B 中所展示， RGX-DYS1載體遞送組織之載體基因體拷貝數(50±14 gc/細胞)的確高於RGX-DYS5 (17±4 gc/細胞)及RGX-DYS3 (16±5 gc/細胞)載體遞送之組織(值正規化為升糖素基因體拷貝)。然後將相對μ-肌縮蛋白表現與載體拷貝數進行比較。如圖 16C 中所示，RGX-DYS1處理之肌肉(1.33 ± 0.39)及RGX-DYS5處理之肌肉(1.774 ± 0.40)中之相對μ-肌縮蛋白之表現皆顯著高於RGX-DYS3處理之肌肉(0.77 ± 0.22，p＜ 0.05，n = 3至5)。此數據指示由RGX-DYS1及RGX-DYS3載體產生之較長形式之µ-肌縮蛋白(具有C端)使得µ-肌縮蛋白在肌細胞中之活體內穩定性更佳。

另外，用ddPCR量測與經治療之小鼠相比，未治療之野生型B6及mdx 小鼠中骨骼肌中之μ-及野生型(WT)-肌縮蛋白之mRNA表現。使用RNeasy纖維組織微型套組(REF 74704，Qiagen)自肌肉組織提取總RNA。使用具有RNAse抑制劑之高容量cDNA反轉錄套組(Ref 4374966，Thermo Fisher Scientific之Applied Biosystems)合成cDNA。使用Nanodrop分光光度計量測RNA濃度。使用數位PCR (Naica Crystal Digital PCR系統，Stilla Technologies)量測µ-肌縮蛋白、WT-肌縮蛋白及內源性對照甘油醛3-磷酸去氫酶(GAPDH) mRNA之拷貝數。針對小鼠WT-肌縮蛋白之引子及探針(mm01216951_m1, Thermo Fisher Scientific) (亦闡述於上述章節6.4 (實例4)之生物分佈研究)及針對小鼠GAPDH之引子及探針(mm99999915_g1，Thermo Fisher Scientific)有市售。如圖 17A 中所示，未經處置之B6小鼠中相對WT-肌縮蛋白轉錄本為1±0.64，且mdx 小鼠中WT-肌縮蛋白mRNA表現為1.55 ± 0.77 (p = 0.15，n =4)。經治療之動物中之相對μ-肌縮蛋白mRNA如下：RGX-DYS1處理之肌肉，22.66 ± 11.6 (p ＜ 0.01，n =5)；RGX-DYS5處理之肌肉，16.83 ± 11.07 (p = 0.06，n = 3)及RGX-DYS3處理之肌肉，11.87 ± 7.90 (p＜ 0.05，n = 4)。此數據指示，RGX-DYS1、RGX-DYS5及RGX-DYS3組中遞送μ-肌縮蛋白載體皆產生比野生型含量高得多之μ-肌縮蛋白轉錄本。此外，將µ-肌縮蛋白mRNA拷貝數正規化為每個細胞之AAV載體基因體拷貝數，且除了GAPDH正規化之外，將WT-肌縮蛋白mRNA正規化為每個細胞之基因體拷貝數(2個拷貝/細胞)。如圖 17B 中所示，所有組在每個基因體基礎上皆展示基本類似之mRNA表現值(n =3至5，p ＞0.05)。此指示驅動AAV-μ-肌縮蛋白轉基因表現之肌肉特異性Spc5-12啟動子與小鼠骨骼肌細胞中之天然肌縮蛋白啟動子一樣有效。6.7.2 藉由免疫螢光 (IF) 染色之 µ- 肌縮蛋白表現及肌縮蛋白相關蛋白複合物 (DAPC) 締合

接下來，實施免疫螢光(IF)染色以檢查肌縮蛋白及肌縮蛋白相關蛋白複合物(包括異連蛋白、β-肌縮蛋白聚糖、互生蛋白及nNos)在不同組之腓腸肌上之表現。IF染色方案及所應用之抗體如上文章節6.5 (實例5)中先前所述。如圖 18 中所示，肌縮蛋白及檢查之DAPC蛋白在未處理之mdx 肌肉中皆不存在，而其強烈存在於野生型B6肌膜上。對於所有三個處理組，在幾乎100%肌纖維上表現µ-肌縮蛋白，且其在不同之治療組之間係不可區分的。三個治療組展示肌膜上異連蛋白表現之恢復，觀察到非常類似之模式。對於β-肌縮蛋白聚糖染色，RGX-DYS1治療之組中之肌肉展示更均勻且更強烈之β-肌縮蛋白聚糖染色(表現)。

在互生蛋白染色中觀察到治療組之間更顯著之差異。在含有長度較長之μ-肌縮蛋白之RGX-DYS1組中，肌膜上互生蛋白之表現大大增強，之後係RGX-DYS5及RGX-DYS3 (圖 18 及圖 19A )。藉由對肌肉溶解物之西方墨點分析進一步證實相同趨勢(圖 19B )。對骨骼肌組織溶解物(腓腸肌組織來自mdx 處理組及未處理組中各3組，且一個腓腸肌及兩個三頭肌來自B6小鼠組)實施針對互生蛋白之西方墨點法。多株抗互生蛋白抗體(Abcam，ab11187)以1:10,000使用，室溫培育培育1小時。以1:5000稀釋應用針對α-輔肌動蛋白之兔單株抗體(ab68167，Abcam)。應用二級山羊抗兔抗體(Thermo Fisher Scientific，目錄號A-10685)。與mdx 組(0.84±0.22)相比，WT肌肉中互生蛋白表現對內源性對照輔肌動蛋白表現之比率為4.56 ± 0.76 (n =3，藉由單因子ANOVA，p ＜0.001)。RGX-DYS1及RGX-DYS5組中之比率分別為2.72 ± 0.97 (n =3，與mdx組相比，p ＜ 0.05)及1.35 ± 0.03 (圖 19C )。藉由西方墨點法在總肌膜提取物上另外檢查骨骼肌中互生蛋白之表現值。使用Mem-Per Plus膜蛋白提取套組(目錄號89842，Thermo Fisher)提取總骨骼肌蛋白(腓腸肌組織來自mdx 處理及未處理組中之每一者，及四頭肌來自B6小鼠組)。將20 ug總膜蛋白上樣至每一泳道中(圖19D )。多株抗互生蛋白抗體(Abcam，ab11187)以1:10,000使用，於4℃下培育過夜。上樣對照多株抗肌動蛋白(PA5-78715，Thermo Fisher)以1:10,000稀釋應用，於4℃下培育過夜。與WT肌肉展示最高互生蛋白表現值之全溶解物西方實驗略有不同，總膜蛋白西方墨點在RGX-DYS1組(0.81±0.26，n =3)中、之後在B6_WT組(0.6623±0.05，n =3)、RGX-DYS3組(0.59±0.08)及mdx 組(0.32±0.07，n=3)中展示最高相對互生蛋白表現，如圖 19E 中所見。該等結果明確指示，由µ-肌縮蛋白載體產生之µ-肌縮蛋白能夠恢復肌膜互生蛋白表現，且較長形式之RGX-DYS1比較短形式之RGX-DYS3具有優異之將互生蛋白錨定於肌膜之能力。

類似地使用肌膜(腓腸肌組織/mdx 及四頭肌/B6組)製備nNOS西方墨點。使用Mem-Per Plus膜蛋白提取套組(目錄號89842，Thermo Fisher)提取總肌膜蛋白。將20 ug總膜蛋白上樣至SDS-PAGE凝膠之每一泳道中。針對nNOS之一級抗體(SC-5302，Santa Cruz Biotechnology)以1:500使用，且多株抗肌動蛋白(PA5-78715，Thermo Fisher)以1:10,000稀釋應用。應用二級山羊抗小鼠IgG抗體HRP (62-6520，ThermoFisher)。關於nNOS表現，吾人觀察到IF染色後RGX-DYS1及RGX-DYS3組影像之間之顯著差異(圖20A )。然而，西方墨點結果未揭示RGX-DYS1、RGX-DYS3及未治療之mdx 組(圖 20B-C )之間有任何顯著差異，指示nNOS藉由RGX-DYS1載體之恢復較低。

總之，mdx 小鼠中遞送RGX-DYS1、RGX-DYS3及RGX-DYS5載體皆導致穩健µ-肌縮蛋白表現及肌縮蛋白相關蛋白複合物(DAPC)之恢復。較長形式之RGX-DYS1載體增強DAPC之恢復，特別係針對互生蛋白及β-肌縮蛋白聚糖之恢復。RGX-DYS1載體使膜DAPC之nNOS恢復之能力較低，但在IF染色時可見。6.8 實例 8- 衛星細胞之轉導及藉由 RGX-DYS1 載體之肌營養不良肌之再生的改良

骨骼肌幹細胞或衛星細胞(SC)通常係靜止的，且位於肌纖維之基底層與肌纖維膜之間。在生長期間及肌肉損傷後，SC之生肌程式被活化，且SC自我更新以維持其之庫及/或分化形成肌母細胞並最終形成肌纖維。腺相關病毒(AAV)載體眾所周知用於轉導分化之肌纖維，因此吾人研究衛星細胞是否可由AAV載體轉導。衛星細胞很小，具有極少細胞質，因此研究該等細胞中之轉基因表現在技術上具有挑戰性。此處，吾人應用RNAscope以研究AAV是否能轉導衛星細胞。RNAscope係一種切緣原位雜交(ISH)技術，其能夠同時進行信號放大及背景噪聲抑制，此允許以單細胞解析度直接在完整組織中可視化單分子基因表現。利用用螢光團Opal 570 (紅色)標記之AAV μ-肌縮蛋白探針及用螢光團Opal 520 (綠色)標記之肌肉衛星細胞標記物Pax7進行RNAscope多重螢光分析。在Advanced Cell Diagnostics Inc (Newark, CA)實施AAV轉基因及Pax7 mRNA表現之RNAscope多重螢光分析。使用RNeasy纖維組織微型套組(Qiagen目錄號74704)自骨骼肌提取總RNA，並利用具有RNase抑制劑之高容量cDNA反轉錄套組(Applied Biosystems目錄號4374966)合成cDNA。使用數位PCR (Naica Crystal Digital PCR系統，Stilla Technologies)量測µ-肌縮蛋白mRNA及內源性對照GAPDH mRNA之絕對拷貝數。針對μ-肌縮蛋白之引子及探針與先前闡述之相同。小鼠pax7引子及探針組(TaqMan ™ MGB探針，Applied Biosystems目錄號4316034)係商業購買的。

如圖 21A-B 中所示，紅色(左圖，圖21A )指示µ-肌縮蛋白信號(mRNA表現或AAV基因體之存在)，且綠色表示pax7+衛星細胞(由圖 21A-B 中之箭頭指示)。DAPI染色之藍色(左圖及右圖，圖 21A-B )指示細胞核染色。綠色、紅色及藍色之共定位(白色箭頭)代表肌肉衛星細胞之AAV-DMD載體轉導，而僅綠色及藍色之細胞(具有黑線之白色箭頭)指示無AAV轉導之衛星細胞。計數µ-肌縮蛋白轉導之衛星細胞，並計算衛星細胞轉導率。在AAV-μ-dys轉導之骨骼肌中，衛星細胞之轉導率為23±1.5% (圖 21C )。此指示AAV載體能夠轉導肌肉衛星細胞，儘管其轉導率比成熟肌纖維低得多。

然後在RNAscope影像中計數總pax7+衛星細胞數，以研究不同治療組中衛星細胞數是否類似。如圖 21D 中所示，未治療之mdx 中每個影像之pax7陽性細胞計數為39.12±15.14，且野生型B6小鼠及DMD載體治療之小鼠中陽性細胞計數分別為11.87±3.23 (計數8個影像，藉由單因子ANOVA，p＜0.0001)及14.66±5.91 (計數12個影像，藉由單因子ANOVA，p＜0.0001)。未處理之mdx 肌肉中衛星細胞數之增加指示肌營養不良肌之再生性質。用RGX-DYS1載體遞送μ-肌縮蛋白逆轉此病理並緩和肌肉再生。

除了RNAscope技術分析之外，吾人提取總肌肉RNA並實施cDNA合成。使用RNeasy纖維組織微型套組(Qiagen目錄號74704)自骨骼肌提取總RNA，並利用具有RNase抑制劑之高容量cDNA反轉錄套組(Applied Biosystems目錄號4374966)合成cDNA。使用小鼠pax7特異性引子及探針組(可商購獲得：分別為mm01354484_m1 Pax7，Thermo Fisher Scientific；及TaqMan ™ MGB探針，來自Applied Biosystems目錄號4316034)對樣品進行ddPCR分析。使用小鼠GAPDH引子及探針組來正規化RNA及cDNA輸入。使用數位PCR (Naica Crystal Digital PCR系統，Stilla Technologies)量測μ-肌縮蛋白mRNA及內源性對照GAPDH mRNA之絕對拷貝數。比較各組間pax7 mRNA拷貝數對GAPDH mRNA拷貝數之比率(圖 21E )。如所預期，mdx 小鼠中pax7表現之相對表現係7.56 ± 3.14，其比WT-B6小鼠高得多(1 ± 0.68，n =5，藉由單因子ANOVA，p＜ 0.001)。三個不同μ-肌縮蛋白載體處理組中之相對pax7表現大大降低(RGX-DYS5組為4.40 ± 1.50 (n =3，p =0.06)，RGX-DYS3組為3.12 ± 0.74 (n =5，p＜ 0.01)，RGX-DYS1組為2.98 ± 0.68 (n =5，p＜ 0.01)。藉由ddPCR方法降低pax7 mRNA表現與RNAscope技術發現一致，進一步證明肌營養不良肌中由本發明之μ-肌縮蛋白載體介導之治療機制之一係經由肌肉再生之改善。6.9 實例 9- 額外微小肌縮蛋白 (DMD) 基因表現盒之構築 .

為了潛在地進一步改良μ-肌縮蛋白之功能並降低總轉基因大小(kB)，重組工程化若干額外μ-肌縮蛋白構築體(圖22 )。對於RGX-DYS6 (SEQ ID NO: 91)，去除富含半胱胺酸(CR短，SEQ ID NO: 90)域中之約50個胺基酸以減小AAV基因體大小以進行有效包裝。對於RGX-DYS7 (SEQ ID NO: 92)，使用前述構築體作為重組工程化之支架，將nNOS錨定之血影蛋白重複域R16及R17 (SEQ ID NO: 86及87)插入R2區與R24區之間。RGX-DYS8 (SEQ ID NO: 93)與RGX-DYS7之相似之處在於插入nNOS錨定之域R16及R17，但去除C端域(CT)以減小AAV載體之大小。

將所有µ-肌縮蛋白順式質體包裝至AAV8載體中，並將載體(2×10⁵ 個gc/細胞)感染至分化之C2C12肌管上，如章節6.2 (實例2)中所述。感染後五天，收穫細胞，並使用抗肌縮蛋白一級抗體(如本文所述用以檢測µ-肌縮蛋白之MANEX1011B(1C7)進行西方墨點分析。所有使用之方法皆類似於章節6.7 (實例7)中所述之彼等方法。如圖 23A 中所示，攜帶不同形式之µ-肌縮蛋白之AAV載體產生不同長度之µ-肌縮蛋白，且其大小如預期遷移。兩個值得注意之觀察結果：1)一般而言，較長形式之µ-肌縮蛋白具有較強之帶(圖 23A-B )。藉由ddPCR檢查之μ-肌縮蛋白mRNA表現值(圖 23C )與蛋白質表現值不相關，指示由較長形式之μ-肌縮蛋白產生之較強帶並非由於mRNA表現增加，相反可能係由於蛋白質穩定性增加。2)與其他相比，μ-肌縮蛋白RGX-DYS6特別不穩定。吾人推論，CR域中50個胺基酸之缺失可能影響µ-肌縮蛋白之穩定性。

儘管參考本發明之具體實例詳細闡述本發明，但應理解，功能上等同之變型在本發明之範圍內。實際上，除本文中所展示及闡述之修改外，熟習此項技術者依據前述說明及附圖亦將明瞭本發明之各種修改。該等修改意欲屬隨附申請專利範圍之範圍。彼等熟習此項技術者僅使用常規實驗即可識別或能確定本文所述本發明具體實施例之許多等效形式。此等等效形式意欲涵蓋於以下申請專利範圍中。

本說明書中所提及之所有公開案、專利及專利申請案皆以引用方式併入本說明書中，其併入程度如同具體地及個別地指示將每一個別公開案、專利或專利申請案以引用方式併入本文中一般。

本文之論述提供對本領域所面臨之問題之性質之更佳理解，且不應以任何方式解釋為承認先前技術，亦不應將本文對任何參考文獻之引用解釋為承認該參考文獻構成本申請案之「先前技術」。

本文所引用之所有參考文獻(包括專利申請案及出版物)之全文均以引用方式併入本文中且出於所有目的，其併入程度如同出於所有目的特定地且個別地指示將每一個別公開案或專利或專利申請案之全文以引用方式併入一般。熟習此項技術者應瞭解，可在不背離本發明之精神及範疇之情況下對本發明作出多種修改及變化。本文所述之具體實施例僅以實例方式提供，且本發明僅受限於各項隨附申請專利範圍以及該等申請專利範圍所授權之等效物之全部範疇。

圖1A-C. 圖1A 圖解說明用於基因療法之順式質體之載體基因表現盒及微小肌縮蛋白構築體。列出每一構築體之每一組分及完整轉基因之DNA長度。SPc5-12：合成肌肉特異性啟動子；Mini-SPc：截短之合成肌肉特異性啟動子；CT1.5：截短之/最小CT域；VH4：人類免疫球蛋白重鏈可變區內含子；ABD：肌動蛋白結合域；H：鉸鏈；R：棒；CR：富含半胱胺酸之域；CT：C端域；smPA：小聚A；ABD：肌動蛋白結合域1 (ABD1)。圖 1B-C 繪示藉由西方墨點法檢測之蛋白質條帶(針對肌縮蛋白之抗體(1C7))，其顯示由質體RGX-DYS1、RGX-DYS3及RGX-DYS5表現之微小肌縮蛋白之相對大小。

圖2A-F 繪示在用不同劑量之報導基因AAV載體AAV8-GFP (A -C )及AAV8-VH4-GFP (D -F )感染三天後，分化之C2C12細胞之螢光顯微鏡檢查(如上影像所指示：5 × 10e5 vg/細胞(A, D) 、 1 × 10e5 vg/細胞(B, E) 、 0.2 × 10e5 vg/細胞(C, F) )。線狀比例尺：200 µM。vg：載體基因體。

圖3 顯示用三種不同劑量之AAV8-GFP及AAV8-VH4-GFP載體感染三天後量測之轉導之C2C12細胞的平均螢光強度(單位)：5 × 10e5 vg/細胞、1 × 10e5 vg/細胞及0.2 × 10e5 vg/細胞。

圖4A-C 繪示用AAV8-CAG-GFP感染後六天分化之C2C12細胞之螢光顯微鏡檢查。使用具有透射光及GFP通道之EVOS™顯微鏡在相同放大倍數下每天拍攝影像A-C：A，顯微影像設定為GFP通道；B，明視野(或相差)以觀察細胞之鋪滿；C，將A及B之影像合併以觀察感染細胞之數量約為50%。

圖5A-H 繪示藉由肌縮蛋白之免疫螢光染色，與參考對照(RGX-DYS-RS，A-D )相比，微小肌縮蛋白載體(RGX-DYS1-03，E-H )之活體外功效測試。對於每一劑量有三個重複(如上各別影像所指示)：1e12 vg/ml(A, E) 、 4e11 vg/ml(B, F) 、 1.6e11 vg/ml(C, G) 及 6.4e10 vg/ml(D, H) 。

圖6 提供每一載體在小鼠肌細胞系C2C12細胞中之感染性數據，作為載體功效之量度。顯示每一載體批次RGX-DYS1-01、RGX-DYS1-02、RGX-DYS2-01、RGX-DYS3-01、RGX-DYS3-02、RGX-DYS4-01及RGX-DYS1-RS之正規化數據(載體拷貝數/參考對照)。將基於較早批次之DYS1 (RGX-DYS1-RS)之內部對照載體視為參考標準(1.0)。

圖7 提供不同生產批次之每一載體在小鼠肌細胞系C2C12細胞中之微小肌縮蛋白數據，各生產批次使用相同方法(RGX-DYS1-01、RGX-DYS1-02、RGX-DYS2-01、RGX-DYS3-01、RGX-DYS3-02、RGX-DYS4-01及RGX-DYS1-RS)，作為mRNA表現之量度。使用兩個不同載體劑量感染C2C12細胞(1e5 vg/細胞及5e4 vg/細胞)。每批之mRNA表現值計算為qPCR中針對微小肌縮蛋白之引子/探針及針對來自相同cDNA樣品之內源對照小鼠GAPDH之引子/探針之間之倍數變化(ΔCT)。該圖顯示倍數增加，且將RGX-DYS1-RS視為100%之參考標準且設定為1。

圖8 顯示每週體重之變化(g)。數據表示為平均值± SEM。對於mdx RGX-DYS1組，n = 12；對於mdx 媒劑組，n= 13；對於BL10媒劑組，n = 14。

圖9A-B 繪示小鼠肌肉及器官重量之量測結果(正規化至體重，g/kg)。四頭肌及比目魚肌重量示於圖9A中，且三頭肌及TA重量示於圖9B中。數據表示為平均值± SEM。對於mdx RGX-DYS1組，n = 12；對於mdx 媒劑組，n= 13；對於BL10媒劑組，n = 14。***P≤0.001 (單因子ANOVA)；###P≤0.001 (t-測試)。

圖10 繪示握力量測結果(KGF/kg)。*-單因子ANOVA (***P ≤ 0.001)；#- t-測試(### p ≤ 0.001)。藉由肌肉重量對每一小鼠之前臂肌肉夾持力進行正規化。對於mdx RGX-DYS1組，n = 12；對於mdx 媒劑組，n= 13；對於BL10媒劑組，n = 14。

圖11 圖解說明治療後第6週之活體外肌力收縮力分析，其揭示RGX-DYS1治療之mdx 小鼠與用媒劑治療之mdx 小鼠相比肌力顯著改良。顯示最大力(mN)及比力(kN/m2)。***，藉由單因子ANOVA，p＜ 0.001。###，經由t-測試，p ＜ 0.001。對於mdx RGX-DYS1組，n = 12；對於mdx 媒劑組，n= 13；對於BL10媒劑組，n = 14。

圖12 藉由ddPCR方法之骨骼肌、心肌及肝中之載體拷貝數(vg/二倍體基因體)。使用來自Stilla Technologies之Naica Crystal Digital PCR系統。對於每一處理之組織，n =13。所列之數字係平均值± Stdev。載體拷貝數計算為2X微小肌縮蛋白轉基因拷貝數/內源性對照小鼠升糖素拷貝數。未注射之mdx 肝樣品(n =13)用作陰性對照樣品。TA，脛骨前肌；EDL，伸趾長肌。

圖13 肌纖維膜之圖解說明，其顯示野生型肌縮蛋白或含有異連蛋白及α1-及β1-互生蛋白結合位點之微小肌縮蛋白(例如RGX-DYS1)與具有肌動蛋白細胞骨架之肌縮蛋白相關之蛋白複合物(DAPC)之間之相互作用。設想具有異連蛋白、α1-互生蛋白及β1-互生蛋白結合位點之RGX-DYS1將部分招募nNOS並經由α1-互生蛋白將nNOS錨定於肌纖維膜。

圖14 mdx RGX-DYS1、mdx 對照及WT對照組之腓腸肌之免疫螢光染色。用抗α-異連蛋白、抗β-肌縮蛋白聚糖、抗nNos、抗肌縮蛋白(抗dys)及抗α-互生蛋白對冷凍切片進行染色。用CY3標記二級抗體，且所有切片在封固前用DAPI複染。

圖15 ：針對自AAV-μ-肌縮蛋白載體注射之腓腸肌組織提取之肌縮蛋白之西方墨點。泳道1至4 =來自AAV8-RGX-DYS1注射之mdx 小鼠之蛋白樣品，泳道5至8 =來自AAV8-RGX-DYS5注射之mdx 小鼠之蛋白樣品，且泳道9至12 =來自AAV8-RGX-DYS3注射之mdx 小鼠之蛋白樣品。α1-肌動蛋白在每一泳道中用作上樣對照。Mdx (泳道13)指示未注射之mdx 小鼠。對於肌縮蛋白墨點，使用小鼠小鼠抗肌縮蛋白單株抗體(1:100稀釋)。對於抗α1-肌動蛋白墨點，以1:10,000之稀釋因子使用多株抗體，且以1:20,000使用二級(抗兔)抗體。

圖16A-C ：藉由西方墨點之μ-肌縮蛋白帶之量化(圖A)，藉由ddPCR之AAV-μ-Dys載體拷貝數之量化(圖B)，以及藉由AAV-μ-Dys載體拷貝數正規化之μ-肌縮蛋白帶之量化(圖C)。* p＜ 0.05；** P ＜ 0.01；***P＜0001。

圖17A-B ：骨骼肌(腓腸肌)中之μ-肌縮蛋白及野生型(WT)肌縮蛋白之mRNA表現。自骨骼肌中提取總RNA，且合成cDNA。使用數位PCR (Naica Crystal Digital PCR系統，Stilla Technologies)量測μ-肌縮蛋白、WT-肌縮蛋白及內源性對照甘油醛3-磷酸去氫酶(GAPDH) mRNA之拷貝數。A . 藉由GAPDH正規化之相對µ-或WT-肌縮蛋白mRNA表現。將B6-WT骨骼肌中WT-肌縮蛋白對GAPDH之比率視為1。B .單細胞中相對μ-或WT-肌縮蛋白mRNA表現。藉由GAPDH正規化μ-或WT-肌縮蛋白mRNA表現拷貝數及每個細胞之基因體拷貝數。

圖18 .自mdx 小鼠提取之腓腸肌、製備之組織切片、及針對肌縮蛋白及肌縮蛋白相關之蛋白複合物(包括異連蛋白、β-肌縮蛋白聚糖及互生蛋白)之免疫螢光(IF)染色。小鼠按如下所述處理：Bl6 (未治療之野生型小鼠)；RGX-DYS1 (小鼠ID 3553及小鼠ID 3588)；RGX-DYS3 (小鼠ID 5及小鼠ID 7)；及RGX-DYS5 (小鼠ID 9及小鼠ID 11)。物鏡：40x。

圖19A-E ：骨骼肌中之互生蛋白表現。A .自mdx 小鼠提取之腓腸肌、製備之組織切片、及針對互生蛋白進行之免疫螢光(IF)染色。小鼠按如下所述處理：Bl6 (未治療之野生型小鼠)；RGX-DYS1 (小鼠ID 3553及小鼠ID 3588)；RGX-DYS3 (小鼠ID 5及小鼠ID 7)；及RGX-DYS5 (小鼠ID 9及小鼠ID 11)。物鏡：40x。B .針對來自肌肉組織溶解物之互生蛋白之西方墨點；C . 西方墨點帶之量化。*，p＜ 0.05；***，p ＜ 0.0001。D . 針對來自總肌膜蛋白之互生蛋白之西方墨點。E . 西方墨點帶之量化。

圖20A-C ：骨骼肌中之nNOS表現。A . 針對nNOS之免疫螢光染色。B . 針對nNOS之西方墨點。C .西方墨點帶之量化。

圖21A-E ：藉由編碼μ-肌縮蛋白基因之AAV載體轉導衛星細胞及改良細胞再生。A-B . RGX-DYS1治療之mdx 小鼠(圖A)及未治療之mdx 小鼠(圖B)之RNAScope影像，其揭示μ-肌縮蛋白(紅色)及pax7衛星細胞(綠色)之共表現。在Advanced Cell Diagnostics Inc (Newark, CA)實施AAV轉基因及Pax7 mRNA表現服務之RNAscope多重螢光分析。C . AAV-DMD轉導之衛星細胞之百分比。D . RNAscope影像中之總衛星細胞計數。E . 藉由ddPCR揭示之Pax7 mRNA在來自不同組之骨骼肌中之表現。針對μ-肌縮蛋白之引子及探針與先前闡述之相同。將B6-WT骨骼肌中pax7對GAPDH之比率視為1。**，p＜0.01；***，p＜0.001；****，p＜0.0001，與未治療之mdx小鼠相比。

圖22 ：額外經修飾之μ-肌縮蛋白構築體之圖解說明。CR短：富含半胱胺酸之域比野生型肌縮蛋白中之短150 bp。R16/R17：肌縮蛋白血影蛋白樣重複16及17。

圖23A-C ：用不同形式之AAV8-μ-肌縮蛋白構築體活體外感染C2C12肌管。在分化培養基中誘導C2C12肌母細胞，然後用AAV載體感染。感染五天後收穫細胞用於西方墨點法或mRNA表現。1：陰性對照；2：RGX-DYS8；3：RGX-DYS7；4：RGX-DYS6；5：RGX-DYS3；6：RGX-DYS5；7：RGX-DYS1；8：RGX-DYS1；9：RGX-DYS1；10：RGX-DYS1；11：RGX-DYS1。A . BC2C12細胞之μ-肌縮蛋白表現之西方墨點分析。B . 西方墨點分析之量化。C . 藉由ddPCR檢測μ-肌縮蛋白mRNA表現。

Claims

一種核酸組合物，其包含編碼微小肌縮蛋白之核酸序列，其中該微小肌縮蛋白包含自胺基端至羧基端排列為ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT之肌縮蛋白域或由其組成，其中ABD係肌縮蛋白之肌動蛋白結合域，H1係肌縮蛋白之鉸鏈1區，R1係肌縮蛋白之血影蛋白(spectrin) 1區，R2係肌縮蛋白之血影蛋白2區，R3係肌縮蛋白之血影蛋白3區，H3係肌縮蛋白之鉸鏈3區，R24係肌縮蛋白之血影蛋白24區，H4係肌縮蛋白之鉸鏈4區，CR係肌縮蛋白之富含半胱胺酸之區或其β-肌縮蛋白聚糖(dystroglycan)結合部分，且CT係肌縮蛋白之C端區或包含α1-互生蛋白(syntrophin)結合位點或異連蛋白(dystrobrevin)結合位點之C端區之一部分。
如請求項1之核酸組合物，其(1) 包含編碼具有SEQ ID NO: 1、79或91之胺基酸序列的微小肌縮蛋白之核酸序列，或與其至少90%、95%或98%一致之核酸序列或其反向互補體，該核酸序列編碼治療功能性微小肌縮蛋白，或(2) 包含SEQ ID NO: 20、81或100之核酸序列或與其至少90%、95%或98%一致之核酸序列或其反向互補體，或由其組成，其中該核酸序列編碼治療功能性微小肌縮蛋白。
如請求項1或2中任一項之核酸組合物，其中(1) 編碼CT域之核酸序列包含SEQ ID NO: 35之核酸序列或與其至少90%、95%或98%一致之核酸序列或其反向互補體或由其組成，且相對於缺乏該CT域序列之參考微小肌縮蛋白，增加該微小肌縮蛋白與α1-互生蛋白及/或異連蛋白之結合；其中編碼該CT域之核酸序列包含SEQ ID NO: 70之核酸序列或與其至少90%、95%或98%一致之核酸序列或其反向互補體或由其組成，且相對於缺乏該CT域序列之參考微小肌縮蛋白，增加該微小肌縮蛋白與α1-互生蛋白及/或異連蛋白之結合；或其中編碼最小CT域之核酸序列包含SEQ ID NO: 80之核酸序列或與其至少90%、95%或98%一致之核酸序列或其反向互補體或由其組成，且相對於缺乏該CT域序列之參考微小肌縮蛋白，增加該微小肌縮蛋白與α1-互生蛋白之結合；或(2)編碼該CT域之核酸序列編碼SEQ ID NO: 16或83之胺基酸序列或包含SEQ ID NO: 84之胺基酸序列。
一種核酸組合物，其包含含有內含子(I)與編碼微小肌縮蛋白之核酸序列之5’端偶合的核酸序列，其中該微小肌縮蛋白包含自胺基端至羧基端排列為ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR之肌縮蛋白域或由其組成，其中ABD係肌縮蛋白之肌動蛋白結合域，H1係肌縮蛋白之鉸鏈1區，R1係肌縮蛋白之血影蛋白1區，R2係肌縮蛋白之血影蛋白2區，R3係肌縮蛋白之血影蛋白3區，H3係肌縮蛋白之鉸鏈3區，R24係肌縮蛋白之血影蛋白24區，H4係肌縮蛋白之鉸鏈4區，CR係肌縮蛋白之富含半胱胺酸之區。
如請求項4之核酸組合物，其(1) 包含編碼具有SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的微小肌縮蛋白之核酸序列，或與其至少90%、95%或98%一致之核酸序列或其反向互補體，或(2) 包含SEQ ID NO: 21之核酸序列或與其至少90%、95%或98%一致之核酸序列或其反向互補體，或由其組成，其中該核酸序列編碼治療功能性肌縮蛋白。
如前述請求項中任一項之核酸組合物，其中(1)編碼該CR域之核酸序列包含SEQ ID NO: 34或69之核酸序列或與其至少90%、95%或98%一致之核酸序列或其反向互補體或由其組成，且相對於缺乏該CR域序列之參考微小肌縮蛋白，增加該微小肌縮蛋白與β-肌縮蛋白聚糖之結合；(2)編碼該CR域之核酸序列包含SEQ ID NO: 100或109之核酸序列或與其至少90%、95%或98%一致之核酸序列或其反向互補體或由其組成，且相對於缺乏該CR域序列之參考微小肌縮蛋白，增加該微小肌縮蛋白與β-肌縮蛋白聚糖之結合；或(2)編碼該CR域之核酸序列編碼包含SEQ ID NO: 15或90之胺基酸序列或由其組成的CR域。
如前述請求項中任一項之核酸組合物，其中編碼ABD之核酸序列由SEQ ID NO: 22或57或與SEQ ID NO: 22或57具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成；編碼H1之核酸序列由SEQ ID NO: 24或59或與SEQ ID NO: 24或59具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成；編碼R1之核酸序列由SEQ ID NO: 26或61或與SEQ ID NO: 26或61具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成；編碼R2之核酸序列由SEQ ID NO: 27或62或與SEQ ID NO: 27或62具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成；編碼R3之核酸序列由SEQ ID NO: 29或64或與SEQ ID NO: 29或64具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成；編碼H2之核酸序列由SEQ ID NO: 38或與SEQ ID NO: 38具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成；編碼H3之核酸序列由SEQ ID NO: 30或65或與SEQ ID NO: 30或65具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成；編碼R24之核酸序列由SEQ ID NO: 32或67或與SEQ ID NO: 32或67具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成；編碼H4之核酸序列由SEQ ID NO: 33或68或與SEQ ID NO: 33或68具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成；編碼CR之核酸序列由SEQ ID NO: 34、69、100或109或與SEQ ID NO: 34、69、100或109具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成；編碼CT (若存在)之核酸序列由SEQ ID NO: 35、70或80或與SEQ ID NO: 35、70或80具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列組成；及視情況，該I核酸序列係SEQ ID NO: 41之核酸序列或與SEQ ID NO: 41具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列，其偶合於編碼該微小肌縮蛋白之核酸序列之5’端。
如前述請求項中任一項之核酸組合物，其中編碼ABD之核酸序列由SEQ ID NO: 22或57組成；編碼H1之核酸序列由SEQ ID NO: 24或59組成；編碼R1之核酸序列由SEQ ID NO: 26或61組成；編碼R2之核酸序列由SEQ ID NO: 27或62組成；編碼R3之核酸序列由SEQ ID NO: 29或64組成；編碼H2之核酸序列由SEQ ID NO: 38組成；編碼H3之核酸序列由SEQ ID NO: 30或65組成；編碼H4之核酸序列由SEQ ID NO: 33或68組成；編碼R24之核酸序列由SEQ ID NO: 32或67組成；編碼CR之核酸序列由SEQ ID NO: 34、69、100或109組成；I由SEQ ID NO: 41組成；及/或編碼CT之核酸序列由SEQ ID NO: 35、70或80組成。
如前述請求項中任一項之核酸組合物，其中該微小肌縮蛋白包含自胺基端至羧基端排列為ABD-L1-H1-L2-R1-R2-L3-R3-H3-L4-R24-H4-CR-CT或ABD-L1-H1-L2-R1-R2-L3-R3-H3-L4-R24-H4-CR之肌縮蛋白序列或由其組成，其中L1、L2、L3及L4係連接體。
如前述請求項中任一項之核酸組合物，其中編碼L1之核酸序列包含SEQ ID NO: 23或58或由其組成，編碼L2之核酸序列包含SEQ ID NO: 25或60或由其組成，編碼L3之核酸序列包含SEQ ID NO: 28或63或由其組成，且編碼L4之核酸序列包含SEQ ID NO: 31、36、37、66、71或72或由其組成。
一種核酸組合物，其包含編碼微小肌縮蛋白之核酸序列，其中該微小肌縮蛋白包含自胺基端至羧基端排列為ABD-H1-R1-R2-R16-R17-R24-H4-CR之肌縮蛋白域或由其組成，其中ABD係肌縮蛋白之肌動蛋白結合域，H1係肌縮蛋白之鉸鏈1區，R1係肌縮蛋白之血影蛋白1區，R2係肌縮蛋白之血影蛋白2區，R16係肌縮蛋白之血影蛋白16區，R17係肌縮蛋白之血影蛋白17區，R24係肌縮蛋白之血影蛋白24區，H4係肌縮蛋白之鉸鏈4區，且CR係肌縮蛋白之富含半胱胺酸之區。
如請求項11之核酸組合物，其進一步包含編碼CT域之核苷酸序列，該CT域包含α1-互生蛋白結合位點及/或異連蛋白結合位點在該CR域之C端。
如請求項11或12之核酸組合物，其(1) 包含編碼具有SEQ ID NO: 92或93之胺基酸序列的微小肌縮蛋白之核酸序列，或與其至少90%、95%或98%一致之核酸序列或其反向互補體，或(2) 包含SEQ ID NO: 102或103之核酸序列或與其至少90%、95%或98%一致之核酸序列或其反向互補體，或由其組成，其中該核酸序列編碼治療功能性肌縮蛋白。
如請求項1至3或6至13中任一項之核酸組合物，其進一步包含與編碼該微小肌縮蛋白之核酸序列之5’端偶合的內含子(I)，視情況，其中I係人類免疫球蛋白重鏈可變區(VH) 4內含子(VH4)或SV40內含子或嵌合內含子位於該微小肌縮蛋白編碼序列之5’。
如前述請求項中任一項之核酸組合物，其中該核酸係包含轉錄調節元件之核酸載體，該轉錄調節元件促進在肌肉及/或CNS組織中之表現，可操作連接至編碼該微小肌縮蛋白之核酸序列。
如請求項15之核酸組合物，其中啟動子係SPc5-12或其轉錄活性部分。
如前述請求項中任一項之核酸組合物，其中該核酸包含AAV載體核苷酸序列，其自5’至3’包含：(i) AAV ITR - 轉錄調節元件-編碼自N端至C端排列為ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT之該等微小肌縮蛋白域之核酸序列- 多腺苷酸化序列 - AAV ITR；(ii) AAV ITR-轉錄調節元件 - 編碼自N端至C端排列為ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR之該等微小肌縮蛋白域之核酸序列 - 多腺苷酸化序列 - AAV ITR；(iii) AAV ITR - 轉錄調節元件-編碼自N端至C端排列為ABD-H1-R1-R2-R16-R17-R24-H4-CR-CT之該等微小肌縮蛋白域之核酸序列- 多腺苷酸化序列 - AAV ITR；或(iv) AAV ITR-轉錄調節元件-編碼自N端至C端排列為ABD-H1-R1-R2-R16-R17-R24-H4-CR之該等微小肌縮蛋白域之核酸序列 - 多腺苷酸化序列 - AAV ITR，其中該AAV ITR視情況係AAV2 ITR。
如前述請求項中任一項之核酸組合物，其中該核苷酸序列經密碼子最佳化及/或缺失CpG序列。
如前述請求項中任一項之核酸組合物，其包含SEQ ID NO: 53、54、55、56、82、104、105或106之核酸序列。
一種包含表現盒之rAAV粒子，該表現盒包含如前述請求項中任一項之核酸組合物。
如請求項20之rAAV粒子，其中該殼體蛋白具有與SEQ ID NO: 77 (AAV8殼體)至少95%一致之胺基酸序列，具有SEQ ID NO: 77之胺基酸序列，具有與SEQ ID NO 78 (AAV9殼體)至少95%一致之胺基酸序列，或具有SEQ ID NO: 78之胺基酸序列。
一種醫藥組合物，其包含治療有效量之如請求項20或21之rAAV粒子及醫藥上可接受之載劑。
一種遞送轉基因至細胞之方法，該方法包含使該細胞與如請求項20或21之rAAV粒子接觸，其中該細胞與載體接觸。
一種用於治療有需要之人類個體之肌縮蛋白病(dystrophinopathy)之醫藥組合物，其包含治療有效量之如請求項20或21之rAAV粒子，視情況其中該rAAV粒子經調配用於投與至該個體之循環、肌肉組織或CNS。
一種治療有需要之人類個體之肌縮蛋白病的方法，該方法包含：向該個體投與包含治療有效量之如請求項20或21之rAAV粒子的醫藥組合物，其中該投與使得微小肌縮蛋白遞送至該個體之肌肉或CNS。
如請求項24或25之醫藥組合物或方法，其中該肌縮蛋白病係DMD、BMD、X性聯擴張性心肌病，或該個體係DMD或BMD之女性攜帶者。
一種微小肌縮蛋白，其包含自胺基端至羧基端排列為ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT之肌縮蛋白域或由其組成，其中ABD係肌縮蛋白之肌動蛋白結合域，H1係肌縮蛋白之鉸鏈1區，R1係肌縮蛋白之血影蛋白1區，R2係肌縮蛋白之血影蛋白2區，R3係肌縮蛋白之血影蛋白3區，H3係肌縮蛋白之鉸鏈3區，R24係肌縮蛋白之血影蛋白24區，CR係肌縮蛋白之富含半胱胺酸之區，且CT係包含α1-互生蛋白結合位點或異連蛋白結合位點之肌縮蛋白之C端區的至少一部分。
如請求項27之微小肌縮蛋白，其包含SEQ ID NO: 1、79或91之胺基酸序列或由其組成。
一種微小肌縮蛋白，其包含自胺基端至羧基端排列為ABD-H1-R1-R2-R16-R17-R24-H4-CR之肌縮蛋白域或由其組成，其中ABD係肌縮蛋白之肌動蛋白結合域，H1係肌縮蛋白之鉸鏈1區，R1係肌縮蛋白之血影蛋白1區，R2係肌縮蛋白之血影蛋白2區，R16係肌縮蛋白之血影蛋白16區，R17係肌縮蛋白之血影蛋白17區，R24係肌縮蛋白之血影蛋白24區，且CR係肌縮蛋白之富含半胱胺酸之區。
如請求項29之微小肌縮蛋白，其包含自胺基端至羧基端排列為ABD-H1-R1-R2-R16-R17-R24-H4-CR-CT之肌縮蛋白域或由其組成，其中CT係包含α1-互生蛋白結合位點或異連蛋白結合位點之肌縮蛋白之C端區之至少一部分。
如請求項29或30之微小肌縮蛋白，其包含SEQ ID NO: 92或93之胺基酸序列或由其組成。
一種治療有需要之人類個體之肌縮蛋白病的方法，其包含向該人類個體之循環、肌肉組織及/或腦脊髓液遞送治療有效量之如請求項27至31中任一項之微小肌縮蛋白。
一種用於治療人類個體之肌縮蛋白病之醫藥組合物，其包含治療有效量之如請求項27至31中任一項之微小肌縮蛋白，其經調配用於遞送至該人類個體之循環、肌肉組織及/或腦脊髓液。
一種產生重組AAV之方法，其包含： (a) 培養含有以下之宿主細胞： (i) 包含順式表現盒之人工基因體，其中該順式表現盒包含如請求項17至19中任一項之核酸組合物； (ii) 缺乏AAV ITR之反式表現盒，其中該反式表現盒編碼AAV rep及殼體蛋白可操作地連接至表現控制元件，該等表現控制元件驅動該等AAV rep及殼體蛋白在培養物內於該宿主細胞中表現並以反式形式供應rep及cap蛋白； (iii) 足夠腺病毒輔助功能物以允許該等AAV殼體蛋白複製及包裝該人工基因體；及 (b) 自該細胞培養物中回收殼體包裹(encapsidating)該人工基因體之重組AAV。
一種宿主細胞，其包含： a. 包含順式表現盒之人工基因體，其中該順式表現盒包含如請求項17至19中任一項之核酸組合物； b. 缺乏AAV ITR之反式表現盒，其中該反式表現盒編碼AAV rep及殼體蛋白可操作地連接至表現控制元件，該等表現控制元件驅動該等AAV rep及殼體蛋白在培養物內於該宿主細胞中表現並以反式形式供應rep及cap蛋白；及 c. 足夠腺病毒輔助功能物以允許該等AAV殼體蛋白複製及包裝該人工基因體。