JP2024531138A - 筋ジストロフィーを処置するための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、新規な合成核酸、およびそれを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、ならびにジストロフィン変異に関連する筋ジストロフィーの処置におけるそれらの使用方法を提供する。本発明の新規な合成核酸またはｒＡＡＶと、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤とを含む、医薬組成物もまた、提供される。本発明のｒＡＡＶを含む医薬組成物は、ジストロフィン関連型筋ジストロフィー（例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、およびＸ連鎖性心筋症）の処置のための遺伝子治療において有用であり得る。

Description

（関連出願の相互参照）
本願は、２０２１年８月１１日出願された米国仮出願第６３／２３１，７５２号に基づく利益および優先権を主張し、この米国仮出願の内容全体が、すべての目的のためにその全体が本明細書中の参照により本明細書により援用される。

（配列表ＸＭＬの参照）
本願は、ＸＭＬ形式で電子的に提出した配列表を含む。この配列表ＸＭＬは、参照により本明細書中に援用される。２０２２年８月３日付けで作成したこのＸＭＬファイルは、ＵＬＰ－０１１ＷＯ．ｘｍｌという名前であり、３５，８１２バイトのサイズである。

（発明の技術分野）
本開示は、概して、マイクロジストロフィンをコードする新規な核酸、組換えアデノ随伴ウイルスベクター、組換えアデノ随伴ウイルス、および１種または複数種の筋ジストロフィーを処置するための遺伝子治療におけるそれらの使用方法に関連する。

（発明の背景）
筋ジストロフィーは、進行性の筋消耗および筋力低下によって特徴付けられる、一群の一遺伝子性遺伝性筋障害である。筋ジストロフィーに関係付けられた最初の遺伝子であるジストロフィンは、Ｋｕｎｋｅｌらによって１９８７年にクローン化された。Ｋｏｅｎｉｇら、１９８７、Ｃｅｌｌ５０（３）：５０９～１７およびＫｕｎｋｅｌ、２００５、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７６：２０５～１４を参照のこと。ジストロフィン中の変異が、種々の形態の筋ジストロフィー（デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー、およびＸ連鎖性拡張型心筋症が挙げられる）の原因である。ＤＭＤは、およそ３，５００人の男性のうちの１人が罹患する遺伝性筋消耗障害である。ＤＭＤ患者は、ジストロフィンタンパク質の異常発現または発現喪失を引き起こす、ジストロフィン遺伝子中の少なくとも１つの変異を一般的には保有する。ＤＭＤを有する患者は、骨格筋の進行性消耗および心機能不全を経験し、これは、歩行能喪失と、主に心不全または呼吸不全から生じる早死とをもたらす。残念ながら、現在利用可能な処置は、一般的には、ＤＭＤの進行を遅くすることしかできない。したがって、ジストロフィン変異に関連するＤＭＤおよび他の障害を処置するための改善された組成物および方法が、緊急に必要である。

Ｋｏｅｎｉｇら、１９８７、Ｃｅｌｌ５０（３）：５０９～１７ Ｋｕｎｋｅｌ、２００５、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７６：２０５～１４

（発明の要旨）
本発明は、組成物および遺伝子治療におけるそれらの使用方法を提供する。より詳細には、マイクロジストロフィンタンパク質をコードする合成核酸が、本明細書において提供される。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドと、このアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシド中にパッケージングされたベクターゲノム（すなわち、「パッケージングされたベクターゲノム」）とを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）もまた提供され、このベクターゲノムは、マイクロジストロフィンタンパク質をコードする合成核酸を含む。本明細書において記載される合成核酸およびｒＡＡＶは、筋ジストロフィー（例えば、ＤＭＤ）の処置のための方法において使用され得る。
一局面において、本開示は、マイクロジストロフィンタンパク質をコードする新規な合成核酸配列を提供する。一実施形態において、本開示は、マイクロジストロフィンタンパク質をコードする核酸を提供し、この核酸は、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、またはそれよりも多く同一な配列を含む。例示的な実施形態において、本開示は、マイクロジストロフィンタンパク質をコードする核酸を提供し、この核酸は、配列番号１と少なくとも９９％（例えば、９９％～１００％）同一な配列を含む。さらなる例示的な実施形態において、本開示は、マイクロジストロフィンタンパク質をコードする核酸を提供し、この核酸は、配列番号１に示されている配列を含むか、または配列番号１に示されている配列からなる。機能的マイクロジストロフィン活性を有するポリペプチドをコードする、配列番号１に示されている核酸配列のフラグメントが、さらに提供される。一部の実施形態において、マイクロジストロフィンタンパク質をコードする核酸配列（例えば、配列番号１）は、終止コドン（ＴＧＡ、ＴＡＡ、またはＴＡＧ）を３’末端にさらに含み得る（例えば、配列番号１の３’末端にＴＡＧ終止コドンを含む配列番号２に例示されている配列など）。

別の局面において、本開示は、筋ジストロフィー（例えば、ＤＭＤ、ベッカー型筋ジストロフィー、またはＸ連鎖性拡張型心筋症）の処置において有用な、新規なベクターゲノム構築物を提供する。一実施形態において、本開示は、マイクロジストロフィンタンパク質をコードするベクターゲノム構築物（すなわち、ポリヌクレオチド）を提供し、このベクターゲノム構築物（すなわち、ポリヌクレオチド）は、配列番号３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、またはそれよりも多く同一である。例示的な実施形態において、本開示は、マイクロジストロフィンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供し、このポリヌクレオチドは配列番号３と少なくとも９９％（例えば、９９％～１００％）同一である。さらなる例示的な実施形態において、本開示は、マイクロジストロフィンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供し、このポリヌクレオチドは、配列番号３に示されている配列を含むか、または配列番号３に示されている配列からなる。

なお別の局面において、本開示は、ＡＡＶカプシドと、このＡＡＶカプシド中にパッケージングされたベクターゲノムとを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を提供し、このベクターゲノムは、マイクロジストロフィンタンパク質をコードする核酸を含み、この核酸は、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、またはそれよりも多く同一である。例示的な実施形態において、その核酸は、配列番号１と少なくとも９９％（例えば、９９％～１００％）同一な配列番号１を含む。さらなる例示的な実施形態において、その核酸は、配列番号１に示されている配列を含むか、または配列番号１に示されている配列からなる。

一部の実施形態において、そのパッケージングされたベクターゲノムは、（ａ）５’－逆位末端反復配列（ＩＴＲ）；（ｂ）筋特異的制御エレメント；（ｃ）イントロン；（ｄ）ポリアデニル化シグナル配列；および（ｅ）３’－逆位末端反復配列（ＩＴＲ）から選択される、１つまたは複数の追加的配列エレメントをさらに含み得る。一部の実施形態において、そのパッケージングされたベクターゲノムは、配列番号３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、またはそれよりも多く同一である。例示的な実施形態において、そのパッケージングされたベクターゲノムは、配列番号３と少なくとも９９％（例えば、９９％～１００％）同一である。さらなる例示的な実施形態において、そのパッケージングされたベクターゲノムは、配列番号３に示されている配列を含むか、または配列番号３に示されている配列からなる。

そのパッケージングされたベクターゲノムが５’－ＩＴＲを含む実施形態において、その５’－ＩＴＲはＡＡＶ２に由来し得る。一部の実施形態において、その５’－ＩＴＲは、（プラス／プラス＋鎖方向にある）配列番号４を含むか、または（プラス／プラス鎖方向にある）配列番号４からなる。他の実施形態において、その５’－ＩＴＲは非ＡＡＶ２供給源に由来する。

そのパッケージングされたベクターゲノムが３’－ＩＴＲを含む実施形態において、その３’－ＩＴＲはＡＡＶ２に由来し得る。一部の実施形態において、その３’－ＩＴＲは、（プラス／マイナス鎖方向にある）配列番号４を含むか、または（プラス／マイナス鎖方向にある）配列番号４からなり、この（プラス／マイナス鎖方向にある）配列番号４は、プラス／プラス鎖方向にある配列番号５に対応する。他の実施形態において、その３’－ＩＴＲは非ＡＡＶ２供給源に由来する。

そのパッケージングされたベクターゲノムが筋特異的制御エレメント（例えば、エンハンサーおよび／またはプロモーター）を含む実施形態において、その筋特異的制御エレメントは、ＣＫ８プロモーター、ＣＫ７プロモーター、ＣＫ９プロモーター、筋特異的クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、切断型ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）、ミオシン重鎖（ＭＨＣ），ハイブリッドα－ミオシン重鎖エンハンサー－／ＭＣＫ（ＭＨＣＫ７）エンハンサー－プロモーター、ヒト骨格筋アクチン（ｓｋｅｌｅｔａｌ ａｃｔｉｎ）遺伝子エレメント、心筋アクチン（ｃａｒｄｉａｃ ａｃｔｉｎ）遺伝子エレメント、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ｍｅｆ、Ｃ５－１２、マウスクレアチンキナーゼエンハンサーエレメント、骨格筋速筋型（ｓｋｅｌｅｔａｌ ｆａｓｔ－ｔｗｉｔｃｈ）トロポニンｃ遺伝子エレメント、遅筋型・心筋型（ｓｌｏｗ－ｔｗｉｔｃｈ ｃａｒｄｉａｃ）トロポニンｃ遺伝子エレメント、遅筋型（ｓｌｏｗ－ｔｗｉｔｃｈ）トロポニンｉ遺伝子エレメント、低酸素誘導性核因子、ステロイド誘導性エレメント、およびグルココルチコイド応答エレメント（ｇｒｅ）から選択され得る。例示的な実施形態において、その筋特異的制御エレメントはＣＫ８プロモーターおよびハイブリッドα－ミオシン重鎖エンハンサー－／ＭＣＫ（ＭＨＣＫ７）エンハンサー－プロモーターから選択される。さらなる例示的な実施形態において、その筋特異的制御エレメントは、配列番号６に示されている配列を含むかまたは配列番号６に示されている配列からなる、ＣＫ８プロモーターである。一部の実施形態において、その筋特異的制御エレメントは、配列番号６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、またはそれよりも多く同一な配列を含む。代替的実施形態において、その筋特異的制御エレメントは、配列番号７に示されている配列を含むかまたは配列番号７に示されている配列からなる、ＭＨＣＫ７エンハンサー－プロモーターである。一部の実施形態において、その筋特異的制御エレメントは、配列番号７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、またはそれよりも多く同一 な配列を含む。

そのパッケージングされたベクターゲノムが１つまたは複数のイントロン配列を含む実施形態において、そのイントロンはＳＶ４０スモールＴイントロン、ウサギヘモグロビンサブユニットβ（ｒＨＢＢ）イントロン、ヒトβ－グロビン／ＩｇＧキメライントロン、ヒトβグロビンＩＶＳ２イントロン、およびｈＦＩＸイントロンから選択され得る。

そのパッケージングされたベクターゲノムがポリアデニル化シグナル配列を含む実施形態において、そのポリアデニル化シグナル配列は合成ポリアデニル化シグナル配列、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列、およびウサギβグロビンポリアデニル化シグナル配列から選択され得る。例示的な実施形態において、そのポリアデニル化シグナル配列は、配列番号９に示されている配列を含むかまたは配列番号９に示されている配列からなる、合成ポリアデニル化シグナルである。一部の実施形態において、そのポリアデニル化シグナル配列は、配列番号９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、またはそれよりも多く同一である。

一部の実施形態において、そのＡＡＶカプシドは、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、ｒｈ１０、ｒｈ７４、ｈｕ３７のＡＡＶ（すなわち、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶｈｕ３７）、またはそれらの操作されたバリアントに由来する。例示的な実施形態において、そのＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ血清型ｈｕ３７（ＡＡＶｈｕ３７）カプシド、ＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）カプシド、ＡＡＶ９バリアントカプシド、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）カプシド、またはＡＡＶ８バリアントカプシドから選択される。さらなる例示的な実施形態において、そのＡＡＶカプシドはＡＡＶｈｕ３７カプシドである。

なお別の局面において、本開示は、筋ジストロフィー（例えば、ＤＭＤ）の処置における遺伝子治療のための薬剤として有用な、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を提供し、このｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシドと、このＡＡＶカプシド中にパッケージングされたベクターゲノムとを含む。一部の実施形態において、そのＡＡＶカプシドは、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、ｒｈ１０、ｒｈ７４、ｈｕ３７のＡＡＶ（すなわち、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶｈｕ３７）、またはそれらの操作されたバリアントに由来する。例示的な実施形態において、そのＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ血清型ｈｕ３７（ＡＡＶｈｕ３７）カプシド、ＡＡＶｈｕ３７バリアントカプシド、ＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）カプシド、ＡＡＶ９バリアントカプシド、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）カプシド、またはＡＡＶ８バリアントカプシドから選択される。さらなる例示的な実施形態において、そのＡＡＶカプシドはＡＡＶｈｕ３７カプシドまたはその操作されたバリアントである。一部の実施形態において、そのパッケージングされたベクターゲノムは、マイクロジストロフィンタンパク質をコードする核酸を含み、この核酸は、配列番号１と少なくとも９９％（例えば、９９％～１００％）同一な配列を含む。別の実施形態において、そのパッケージングされたベクターゲノムは、配列番号３と少なくとも９９％（例えば、９９％～１００％）同一なポリヌクレオチド配列を含む。

なお別の局面において、本開示は、筋ジストロフィー（例えば、ＤＭＤ）の処置のための本明細書において開示されているｒＡＡＶの使用を提供し、このｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシドと、このＡＡＶカプシド中にパッケージングされたベクターゲノムとを含む。一部の実施形態において、そのＡＡＶカプシドは、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、ｒｈ１０、ｒｈ７４、ｈｕ３７のＡＡＶ（すなわち、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶｈｕ３７）、またはそれらの操作されたバリアントに由来する。例示的な実施形態において、そのＡＡＶカプシドはＡＡＶ血清型ｈｕ３７（ＡＡＶｈｕ３７）カプシド、ＡＡＶｈｕ３７バリアントカプシド、ＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）カプシド、ＡＡＶ９バリアントカプシド、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）カプシド、またはＡＡＶ８バリアントカプシドから選択される。さらなる例示的な実施形態において、そのＡＡＶカプシドはＡＡＶｈｕ３７カプシドまたはその操作されたバリアントである。一部の実施形態において、そのパッケージングされたベクターゲノムは、マイクロジストロフィンタンパク質をコードする核酸を含み、この核酸は、配列番号１と少なくとも９９％（例えば、９９％～１００％）同一な配列を含む。別の実施形態において、そのパッケージングされたベクターゲノムは、配列番号３と少なくとも９９％（例えば、９９％～１００％）同一なポリヌクレオチド配列を含む。

本開示は、本明細書において開示されている合成核酸配列またはｒＡＡＶを含む、医薬組成物にさらに関連する。一部の実施形態において、その医薬組成物は、合成核酸と、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤とを含む。一部の実施形態において、その医薬組成物は、ｒＡＡＶと、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤とを含む。一部の実施形態において、そのｒＡＡＶを含む医薬組成物は、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、皮内投与、腹腔内投与、または髄腔内投与のために製剤化されている。例示的な実施形態において、そのｒＡＡＶを含む医薬組成物は、静脈内投与または筋肉内投与のために製剤化されている。

なお別の局面において、本開示は、ヒト対象における筋ジストロフィーを処置する方法を提供し、この方法は、そのヒト対象に治療有効量の少なくとも１種の本明細書において開示されているｒＡＡＶを投与する工程を含む。一実施形態において、その筋ジストロフィーは、ジストロフィン中の変異によって引き起こされている。一実施形態において、その筋ジストロフィーはデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー、およびＸ連鎖性拡張型心筋症から選択される。

一実施形態において、本開示は筋ジストロフィー（例えば、ＤＭＤ）を提供し、これは、ＡＡＶカプシドと、このＡＡＶカプシド中にパッケージングされたベクターゲノムとを含む、ｒＡＡＶを投与する工程を含み、この核酸は、配列番号１と少なくとも９９％（例えば、９９％～１００％）同一な配列を含む。一部の実施形態において、その方法は、そのｒＡＡＶの投与の前に、ＩｇＧ分解性プロテアーゼ（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＩｄｅＳまたはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ ＩｄｅＺ）の投与をさらに含み得る。一部の実施形態において、本開示は、ヒト対象における筋ジストロフィー（例えば、ＤＭＤ）を処置する方法を提供し、この方法は、治療有効量の少なくとも１種の本明細書において開示されているｒＡＡＶを投与する工程を含み、このヒト対象はＩｇＧ分解性プロテアーゼを投与済みである。

特定の実施形態において、本開示は、ヒト対象における筋ジストロフィー（例えば、ＤＭＤ）を処置する方法を提供し、この方法は、ジストロフィン中に少なくとも１つの変異を有すると診断されたヒト対象に、治療有効量の少なくとも１種の本明細書において開示されているｒＡＡＶを投与する工程を含む。一実施形態において、本開示は、ヒト対象における筋ジストロフィー（例えば、ＤＭＤ）を提供し、これは、ジストロフィン中に少なくとも１つの変異を有すると診断されたヒト対象に、ＡＡＶカプシドと、このＡＡＶカプシド中にパッケージングされたベクターゲノムとを含む、ｒＡＡＶを投与する工程を含み、このパッケージングされたベクターゲノムは、マイクロジストロフィンタンパク質をコードする核酸を含み、この核酸は、配列番号１と少なくとも９９％（例えば、９９％～１００％）同一な配列を含む。一部の実施形態において、そのパッケージングされたベクターゲノムは、配列番号３と少なくとも９９％（例えば、９９％～１００％）同一なポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、そのカプシドはＡＡＶｈｕ３７カプシドである。

一部の実施形態において、そのｒＡＡＶは、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、皮内投与、腹腔内投与、または髄腔内投与される。例示的な実施形態において、そのｒＡＡＶは、静脈内投与または筋肉内投与される。一部の実施形態において、そのｒＡＡＶは、１回の投与量約１×１０^１２ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇ～約１×１０^１６ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇで投与される。さらなる実施形態において、そのｒＡＡＶは、１回の投与量約１×１０^１３ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇ～約１×１０^１５ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇで投与される。さらなる実施形態において、そのｒＡＡＶは、１回の投与量が１×１０^１３ＧＣ／ｋｇまたは約１×１０^１３ＧＣ／ｋｇ、１×１０^１４ＧＣ／ｋｇまたは約１×１０^１４ＧＣ／ｋｇ、２×１０^１４ＧＣ／ｋｇまたは約２×１０^１４ＧＣ／ｋｇ、３×１０^１４ＧＣ／ｋｇまたは約３×１０^１４ＧＣ／ｋｇ、４×１０^１４ＧＣ／ｋｇまたは約４×１０^１４ＧＣ／ｋｇ、５×１０^１４ＧＣ／ｋｇまたは約５×１０^１４ＧＣ／ｋｇ、６×１０^１４ＧＣ／ｋｇまたは約６×１０^１４ＧＣ／ｋｇ、７×１０^１４ＧＣ／ｋｇまたは約７×１０^１４ＧＣ／ｋｇ、８×１０^１４ＧＣ／ｋｇまたは約８×１０^１４ＧＣ／ｋｇ、９×１０^１４ＧＣ／ｋｇまたは約９×１０^１４ＧＣ／ｋｇ、あるいは１×１０^１５ＧＣ／ｋｇまたは約１×１０^１５ＧＣ／ｋｇで投与される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶの単回投与が投与される。他の実施形態において、ｒＡＡＶの複数回投与が投与される。

一部の局面において、本明細書において開示されている合成核酸分子、ＡＡＶベクター、またはｒＡＡＶを含む、宿主細胞が、本明細書において提供される。特定の実施形態において、その宿主細胞は、ＡＡＶの増殖のために適切であり得る。特定の実施形態において、その宿主細胞は、ＨｅＬａ細胞、Ｃｏｓ－７細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ａ５４９細胞、ＢＨＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＲＤ細胞、ＨＴ－１０８０細胞、ＡＲＰＥ－１９細胞、およびＭＲＣ－５細胞から選択される。一部の実施形態において、その宿主細胞は、１つまたは複数の内在性遺伝子を不活化するように操作済みであるＨｅＬａ細胞である。

本発明のこれらの局面および特徴ならびに他の局面および特徴が、本開示の以下の節において記載される。

（図面の簡単な説明）
本発明は、以下の図面を参照して、より完全に理解され得る。

図１は、マイクロジストロフィンタンパク質コード配列をＣＫ８プロモーターの制御下に含む、例示的なパッケージングされたベクターゲノム構築物を示す図解である。そのパッケージングされたベクターゲノムは、５’から３’に向かって、５’－逆位末端反復配列（５’－ＩＴＲ）、ＣＫ８プロモーター、イントロン、ヒトマイクロジストロフィンコード配列、合成ポリアデニル化シグナル配列、および３’－逆位末端反復配列（３’－ＩＴＲ）を含む。この図は、配列番号３（４，７８４ｂｐ）の構成を示し、この配列番号３は、ヒトマイクロジストロフィンタンパク質をコードする配列番号１（３，８１０ｂｐ）に示されている合成核酸を含む。

図２は、インビトロ系における天然ＭＤ５コード配列（配列番号８）からのＭＤ５マイクロジストロフィンタンパク質発現と合成コドン最適化コード配列（配列番号１）からのＭＤ５マイクロジストロフィンタンパク質発現との比較を示す、棒グラフである。その合成コドン最適化コード配列は、天然コード配列と比較して統計的に有意な（ｐ＜０．０００１）、タンパク質発現のおよそ７倍への増加を示した（ｎ＝２）。マイクロジストロフィンタンパク質発現レベルは、市販のヒトジストロフィン特異的抗体を使用して、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）ＥＬＩＳＡによって決定した。生のＭＳＤ ＥＬＩＳＡ読取り値を天然マイクロジストロフィン群の平均値に対して正規化し、倍数変化として表した。

（発明の詳細な説明）
本発明は、治療適用のために使用される、一定範囲の新規な薬剤および組成物を提供する。本発明の核酸配列、ベクター、組換えウイルス、および関連する組成物は、本明細書において記載される種々の筋ジストロフィーを軽減、予防、または処置するために使用され得る。

別に示されない限り、技術用語は、従来の使用法にしたがって使用される。分子生物学における一般的な用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ、Ｇｅｎｅｓ Ｖ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ刊行、１９９４（ＩＳＢＮ ０－１９－８５４２８７－９）；Ｋｅｎｄｒｅｗら（編）、Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．刊行、１９９４（ＩＳＢＮ ０－６３２－０２１８２－９）；およびＲｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｉｎｃ．刊行、１９９５（ＩＳＢＮ １－５６０８１－５６９－８）において見出され得る。

本開示の種々の実施形態の概説を容易にするために、以下の特定の用語の説明が、提供される。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）：ヒトおよび他のいくつかの霊長類の種に感染する、小さい複製欠損性ノンエンベロープウイルス。ＡＡＶは、疾患を引き起こすとは知られておらず、非常に軽度の免疫応答を惹起する。ＡＡＶを利用する遺伝子治療ベクターは、分裂細胞および静止細胞の両方に感染し得、その宿主細胞のゲノム中に組み込むことなく染色体外状態で存続し得る。これらの特徴は、ＡＡＶを遺伝子治療のための魅力的なウイルスベクターにする。１２種の認識されたＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１～ＡＡＶ１２）ならびにいくつかのＡＡＶ血清型バリアント（例えば、ＡＡＶｈｕ３７、ＡＡＶｒｈ１０、およびＡＡＶｒｈ７４）が、現在存在する。

投与／投与する：対象に薬剤（例えば、治療剤（例えば、組換えＡＡＶ））を任意の有効な経路によって提供するかまたは与えること。例示的な投与経路としては、注射（例えば、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、皮内投与、腹腔内投与、または髄腔内投与）、経口経路、管内（ｉｎｔｒａｄｕｃｔａｌ）経路、舌下経路、直腸内経路、経皮経路、鼻腔内経路、腟内経路および吸入経路が挙げられるが、これらに限定はされない。

コード配列：「コード配列」とは、適切な調節配列に作動可能に連結された場合にインビトロまたはインビボでポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を意味する。コード配列は、そのコード領域の前および後に領域（例えば、５’非翻訳（５’ＵＴＲ）配列および３’非翻訳（３’ＵＴＲ）配列）を含んでも含まなくてもよく、個々のコードセグメント（エクソン）間に介在配列（イントロン）を含んでも含まなくてもよい。

コドン最適化：「コドン最適化」核酸とは、特定の系（例えば、特定の種または種の群）における発現のためにコドンが最適であるように変更された、核酸配列を指す。例えば、核酸配列は、哺乳動物細胞または特定の哺乳動物種（例えば、ヒト細胞）における発現のために最適化され得る。コドン最適化は、コードされるタンパク質のアミノ酸配列を変更しない。

エンハンサー：プロモーターの活性を増加させることによって転写速度を増加させる核酸配列。

イントロン：タンパク質のコード情報を含まない、遺伝子内の一連のＤＮＡ。イントロンは、メッセンジャーＲＮＡの翻訳前に除去される。

逆位末端反復配列（ＩＴＲ）：効率的な複製のために必要なアデノ随伴ウイルスゲノム中の対称的核酸配列。ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ ＤＮＡゲノムの各末端に位置する。ＩＴＲはウイルスＤＮＡ合成のための複製起点として機能し、ＩＴＲはＡＡＶ組込みベクターを作製するために必須のシス成分である。

単離された：「単離された」生物学的成分（例えば、核酸分子、タンパク質、ウイルスまたは細胞）は、その成分が天然で存在する生物の細胞もしくは組織またはその生物自体にある他の生物学的成分（例えば、他の染色体ＤＮＡおよび染色体ＲＮＡならびに染色体外ＤＮＡおよび染色体外ＲＮＡ、タンパク質および細胞）から、実質的に分離または精製されている。「単離された」核酸分子および「単離された」タンパク質としては、標準的な精製方法によって精製された、核酸分子およびタンパク質が挙げられる。この用語はまた、宿主細胞における組換え発現によって調製された、核酸分子およびタンパク質、ならびに化学合成された、核酸分子およびタンパク質を含む。

作動可能に連結された：第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的関係で配置された場合に、その第１の核酸配列はその第２の核酸配列と作動可能に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を与える場合に、そのプロモーターはそのコード配列と作動可能に連結されている。一般に、作動可能に連結されたＤＮＡ配列は、近接しており、２つのタンパク質コード領域を接続するために必要な場合には、同じリーディングフレーム中にある。

薬学的に受容可能なキャリア：本開示において有用な薬学的に受容可能なキャリア（賦形剤）は、従来どおりである。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、第１５版（１９７５）は、１つまたは複数の治療化合物、分子、または薬剤の薬学的送達のために適切な組成物および製剤を記載している。

一般に、キャリアの性質は、使用される特定の投与様式に依存する。例えば、非経口製剤は、通常は、薬学的および生理学的に受容可能な流体（例えば、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなど）を賦形剤として含む、注射可能な流体を含む。固体組成物（例えば、散剤形態、丸剤形態、錠剤形態、またはカプセル剤形態）のために、従来の非毒性固体キャリアは、例えば、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを含み得る。生物学的に中性のキャリアに加えて、投与される医薬組成物は、少量の非毒性補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝剤など（例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレート））を含み得る。

疾患を予防、処置または軽減する：疾患（例えば、ＤＭＤ）を「予防する」とは、疾患の完全な発症を阻害することを指す。「処置する」とは、疾患または病理学的状態（例えば、ＤＭＤ）の徴候もしくは症状を、それが発症し始めた後に軽減する、治療介入を指す。「軽減する」とは、疾患（例えば、ＤＭＤ）の徴候もしくは症状の数または重症度の減少を指す。

プロモーター：核酸（例えば、遺伝子）の転写を指示／開始するＤＮＡ領域。プロモーターは、転写開始部位付近に必要な核酸配列を含む。多くのプロモーター配列が当業者には公知であり、人工的核酸分子における別々のプロモーター配列の組合せさえも、可能である。

精製された：用語「精製された」は、絶対的な純粋性を必要とはしない。むしろ、用語「精製された」は、相対的用語として意図される。したがって、例えば、精製されたペプチド、タンパク質、ウイルス、または他の活性化合物は、天然で結合しているタンパク質および他の混入物から全体的または部分的に分離された、ペプチド、タンパク質、ウイルス、または他の活性化合物である。特定の実施形態において、用語「実質的に精製された」とは、細胞、細胞培養培地、または他の粗調製物から単離され、分画に供されて初期調製物の種々の成分（例えば、タンパク質、細胞片、および他の成分）を除去された、ペプチド、タンパク質、ウイルスまたは他の活性化合物を指す。

組換え：組換え核酸分子は、天然には存在しない配列を有するか、または他の状況では別々である２つの配列セグメントを人工的に組み合わせることによって作製された配列を有する、核酸分子である。この人工的組合せは、化学合成によって、または単離された核酸分子セグメントの（例えば、遺伝子操作技術による）人工的操作によって、達成され得る。

同様に、組換えウイルスは、天然には存在しない配列（例えば、ゲノム配列）を含むか、または異なる起源の少なくとも２つの配列の人工的組合せにより作製された配列（例えば、ゲノム配列）を含む、ウイルスである。用語「組換え」はまた、天然の核酸分子、タンパク質もしくはウイルスの一部の付加、置換、または欠失によってのみ変更された、核酸、タンパク質およびウイルスを含む。本明細書において使用される場合、「組換えＡＡＶ」とは、組換え核酸分子（例えば、マイクロジストロフィンをコードする組換え核酸分子）がパッケージングされた、ＡＡＶ粒子を指す。

配列同一性：２つ以上の核酸配列間または２つ以上のアミノ酸配列間の同一性もしくは類似性は、それらの配列間の同一性もしくは類似性に関して表される。配列同一性は、同一性パーセントに関して測定され得る。そのパーセンテージが高いほど、それらの配列は同一性が高い。配列類似性は、（保存的アミノ酸置換を考慮する）類似性パーセンテージに関して測定され得る。そのパーセンテージが高いほど、それらの配列は類似性が高い。核酸配列またはアミノ酸配列のホモログもしくはオルソログは、標準的方法を使用して整列された場合に、比較的高い程度の配列同一性／配列類似性を有する。この相同性は、オルソロガスなタンパク質またはｃＤＮＡが、より遠縁の種（例えば、ヒト配列とＣ．ｅｌｅｇａｎｓ配列）と比較して近縁の種（例えば、ヒト配列とマウス配列）に由来する場合に、より顕著である。

比較のための配列の整列方法は、当該分野において周知である。一般的に使用されるツールは、ＮＣＢＩ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３～１０、１９９０）であり、これは、配列分析プログラムであるｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘと組み合わせて使用するために、いくつかの供給源（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）が挙げられる）から、およびインターネット上で、利用可能である。さらなる情報が、ＮＣＢＩウェブサイト上で見出され得る。

血清型：特徴的な抗原の組によって区別される、一群の近縁微生物（例えば、ウイルス）。

対象：ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含む分類である、生きている多細胞脊椎動物生物。一部の実施形態において、その対象はヒトである。例示的な実施形態において、そのヒト対象は、小児科対象、すなわち、０歳～１８歳（両端を含む）のヒト対象である。あるいは、そのヒト対象は、成人対象、すなわち、１８歳を超えるヒト対象である。一部の実施形態において、その対象（例えば、ヒト対象）は、本発明のｒＡＡＶでの処置の前に、コルチコステロイドを投与済みである。一部の実施形態において、その対象（例えば、ヒト対象）は、本発明のｒＡＡＶでの処置の前に、ＩｇＧ分解性プロテアーゼを投与済みである。一部の実施形態において、その対象（例えば、ヒト対象）は、本発明のｒＡＡＶでの処置の前に、コルチコステロイドを投与済みであり、ＩｇＧ分解性プロテアーゼもまた投与済みである。

合成：合成核酸は、実験室において化学合成され得る天然に存在しない核酸配列、および／または組換え微生物または組換えウイルス（例えば、組換えＡＡＶ）により発現され得る天然に存在しない核酸配列である。

治療有効量：特定の薬剤または治療剤（例えば、組換えＡＡＶ）で処置される対象もしくは細胞において望まれる効果を達成するために十分な、その特定の薬剤または治療剤の量。薬剤の有効量は、いくつかの要因（処置される対象または細胞、およびその治療組成物の投与様式が挙げられるが、これらに限定はされない）に依存する。

ベクター：ベクターは、そのベクターが宿主細胞において複製する能力および／または組み込む能力を破壊することなく外来核酸の挿入を可能にする、核酸分子である。ベクターは、そのベクターが宿主細胞において複製することを可能にする核酸配列（例えば、複製起点）を含み得る。ベクターはまた、１つまたは複数の選択マーカー遺伝子および他の遺伝要素を含み得る。発現ベクターは、挿入される遺伝子または挿入される遺伝子群の転写および翻訳を可能にするために必要な調節配列を含む、ベクターである。本明細書における一部の実施形態において、そのベクターはＡＡＶベクターである。

別に説明されない限りは、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。単数の用語「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」および「その（この）（ｔｈｅ）」は、そうではないことを文脈が明示しない限りは、複数の指示物を含む。「ＡまたはＢを含む」とは、Ａ、またはＢ、またはＡとＢとの組合せを含む。核酸またはポリペプチドについて与えられる、すべての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、およびすべての分子量または分子質量の値は、概数であり、説明のために提示されることが、さらに理解されるべきである。本明細書において記載されている方法および材料と類似するかまたは均等である方法および材料が本開示の実施もしくは試験のために使用され得るが、適切な方法および材料が以下に記載される。本明細書において記載されているすべての公開物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照によって援用される。矛盾する場合は、用語の説明を含む本明細書が優先する。さらに、本材料、方法、および実施例は、例示に過ぎず、限定することは意図されない。

（マイクロジストロフィンをコードする新規な合成核酸）
本発明は、組成物および遺伝子治療におけるそれらの使用方法を提供する。本明細書において記載される組成物には、マイクロジストロフィンタンパク質をコードする合成核酸がある。したがって、第１の局面において、本開示は、マイクロジストロフィンタンパク質をコードする新規な合成核酸配列を提供する。

一部の実施形態において、本明細書において記載される新規な核酸によりコードされるマイクロジストロフィンタンパク質は、「ＭＤ５」という名前のマイクロジストロフィンタンパク質（配列番号１０；１，２７０アミノ酸、これは米国特許第１０，４７９，８２１号において配列番号４として列挙されている）またはその機能的フラグメントもしくは機能的バリアントである。米国特許第１０，４７９，８２１号（その全体が参照により本明細書中に援用される）において記載されるとおり、ＭＤ５（これは「μＤｙｓ５」または「マイクロＤｙｓ５」とも呼ばれる）は、アミノ末端アクチン結合ドメイン；β－ジストログリカン結合ドメイン；ならびにスペクトリン様反復ドメイン（５個のスペクトリン様反復（スペクトリン様反復１（ＳＲ１）、スペクトリン様反復１６（ＳＲ１６）、スペクトリン様反復１７（ＳＲ１７）、スペクトリン様反復２３（ＳＲ２３）、およびスペクトリン様反復２４（ＳＲ２４）を含む）からなる）を含む。

一部の実施形態において、本開示は、ＭＤ５マイクロジストロフィンタンパク質またはその機能的フラグメントもしくは機能的バリアントをコードする、合成核酸を提供する。一実施形態において、そのＭＤ５マイクロジストロフィンタンパク質またはその機能的フラグメントもしくは機能的バリアントをコードする合成核酸は、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、またはそれよりも多く同一な配列を含む。例示的な実施形態において、そのＭＤ５マイクロジストロフィンタンパク質またはその機能的フラグメントもしくは機能的バリアントをコードする合成核酸は、配列番号１と少なくとも９９％（例えば、９９％～１００％）同一な配列を含む。さらなる例示的な実施形態において、その合成核酸は、ＭＤ５マイクロジストロフィンタンパク質をコードし、配列番号１に示されている配列を含むかまたは配列番号１に示されている配列からなる。一部の実施形態において、そのＭＤ５マイクロジストロフィンタンパク質をコードする合成核酸（例えば、配列番号１）は、終止コドン（ＴＧＡ、ＴＡＡ、またはＴＡＧ）を３’末端にさらに含み得る（例えば、配列番号１の３’末端にＴＡＧ終止コドンを含む配列番号２に例示されている配列など）。

一部の実施形態において、本開示はまた、機能的マイクロジストロフィン活性を有するＭＤ５ポリペプチドフラグメントをコードする、配列番号１に示されている核酸配列のフラグメントを提供する。一部の実施形態において、本開示は、配列番号１０のうちの少なくとも３００個、少なくとも４００個、少なくとも５００個、少なくとも６００個、少なくとも７００個、少なくとも８００個、少なくとも９００個、少なくとも１０００個、少なくとも１１００個、少なくとも１２００個、少なくとも１２５０個、少なくとも１２６０、または少なくとも１２６５個連続するアミノ酸残基をコードする、配列番号１に示されている核酸配列のフラグメントを提供し、このＭＤ５ポリペプチドフラグメントは、配列番号１０の全長ＭＤ５マイクロジストロフィンポリペプチドに関連する１つまたは複数の活性（例えば、ｎＮＯＳ結合活性）を保持する。そのようなフラグメントは、当該分野において慣用的で周知である組換え技術によって取得され得る。一部の実施形態において、本開示は、配列番号１のうちの少なくとも９００個、少なくとも１０００個、少なくとも１１００個、少なくとも１２００個、少なくとも１３００個、少なくとも１４００個、少なくとも１５００個、少なくとも１６００個、少なくとも１７００個、少なくとも１８００個、少なくとも１９００個、少なくとも２０００個、少なくとも２１００個、少なくとも２２００個、少なくとも２３００個、少なくとも２４００個、少なくとも２５００個、少なくとも２６００個、少なくとも２７００個、少なくとも２８００個、少なくとも２９００個、少なくとも３０００個、少なくとも３１００個、少なくとも３２００個、少なくとも３３００個、少なくとも３４００個、少なくとも３５００個、少なくとも３６００個、少なくとも３７００個、または少なくとも３８００個連続するヌクレオチドである、配列番号１に示されている核酸配列のフラグメントを提供する。

一部の実施形態において、本開示はまた、配列番号１０のＭＤ５マイクロジストロフィンポリペプチドのバリアントをコードする、合成核酸配列を提供する。一部の実施形態において、そのバリアントポリペプチドは、配列番号１０と少なくとも８０％（例えば、８０％～１００％、例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％）同一であり得る。一部の実施形態において、そのバリアントポリペプチドは、本質的に治療的である。一部の実施形態において、その治療的バリアントポリペプチドは、配列番号１０と比較して少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、少なくとも３０個、少なくとも３１個、少なくとも ３２個、少なくとも３３個、少なくとも３４個、少なくとも３５個、少なくとも３６個、少なくとも３７個、少なくとも３８個、少なくとも３９、または少なくとも４０個異なる残基を有し得る。そのようなフラグメントは、当該分野において慣用的で周知である組換え技術によって取得され得る。一部の実施形態において、本開示は、配列番号１０のＭＤ５マイクロジストロフィンポリペプチドのバリアントをコードする、配列番号１の合成核酸バリアントを提供する。そのような配列番号１のバリアントは、配列番号１と比較して１個または複数個のヌクレオチド変化を含み得、配列番号１０のＭＤ５マイクロジストロフィンポリペプチドのバリアントをコードし得る。

本明細書において記載される種々の局面において、本発明は、ＭＤ５マイクロジストロフィンポリペプチドのフラグメント、バリアント、または融合物を送達するための、ｒＡＡＶの使用を企図する。例示的な実施形態において、そのフラグメント、バリアント、または融合タンパク質のＭＤ５部分は、配列番号１と少なくとも９９％（例えば、９９％～１００％）同一な配列の、対応するフラグメント、バリアント、またはＭＤ５コード部分によってコードされる。

（マイクロジストロフィンをコードする新規なベクターゲノム構築物）
別の局面において、本開示は、筋ジストロフィー（例えば、ＤＭＤ、ベッカー型筋ジストロフィー、またはＸ連鎖性心筋症）の処置において有用な新規なベクターゲノム構築物を提供する。

一部の実施形態において、そのベクターゲノム構築物は、マイクロジストロフィンタンパク質をコードする核酸配列を含む。一部の実施形態において、そのベクターゲノム構築物は、（ａ）５’－逆位末端反復配列（ＩＴＲ）；（ｂ）筋特異的制御エレメント；（ｃ）イントロン；（ｄ）ポリアデニル化シグナル配列；および（ｅ）３’－逆位末端反復配列（ＩＴＲ）から選択される、１つまたは複数の追加的配列エレメントをさらに含む。例示的な実施形態において、そのベクターゲノム構築物は、（ｉ）ＭＤ５マイクロジストロフィンタンパク質（配列番号１０）、またはそのフラグメント、バリアント、もしくは融合タンパク質をコードする、核酸配列；ならびに（ｉｉ）（ａ）５’－逆位末端反復配列（ＩＴＲ）；（ｂ）筋特異的制御エレメント；（ｃ）イントロン；（ｄ）ポリアデニル化シグナル配列；および（ｅ）３’－逆位末端反復配列（ＩＴＲ）から選択される、１つまたは複数の追加的配列エレメントを含む。

一部の実施形態において、そのベクターゲノム構築物は、（ｉ）配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、またはそれよりも多く同一なマイクロジストロフィンコード配列；ならびに（ｉｉ）（ａ）５’－逆位末端反復配列（ＩＴＲ）；（ｂ）筋特異的制御エレメント；（ｃ）イントロン；（ｄ）ポリアデニル化シグナル配列；および（ｅ）３’－逆位末端反復配列（ＩＴＲ）から選択される、１つまたは複数の追加的配列エレメントを含む。例示的な実施形態において、そのベクターゲノム構築物は、（ｉ）配列番号１と少なくとも９９％（例えば、９９％～１００％）同一なマイクロジストロフィンコード配列；ならびに（ｉｉ）（ａ）５’－逆位末端反復配列（ＩＴＲ）；（ｂ）筋特異的制御エレメント；（ｃ）イントロン；（ｄ）ポリアデニル化シグナル配列；および（ｅ）３’－逆位末端反復配列（ＩＴＲ）から選択される、１つまたは複数の追加的配列エレメントを含む。さらなる例示的な実施形態において、そのベクターゲノム構築物は、（ｉ）配列番号１に示されているマイクロジストロフィンコード配列；ならびに（ｉｉ）（ａ）５’－逆位末端反復配列（ＩＴＲ）；（ｂ）筋特異的制御エレメント；（ｃ）イントロン；（ｄ）ポリアデニル化シグナル配列；および（ｅ）３’－逆位末端反復配列（ＩＴＲ）から選択される、１つまたは複数の追加的配列エレメントを含む。

一部の実施形態において、そのベクターゲノム構築物は、配列番号３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、またはそれよりも多く同一な配列を含む。例示的な実施形態において、そのベクターゲノム構築物は、配列番号３と少なくとも９９％（例えば、９９％～１００％）同一な配列を含む。さらなる例示的な実施形態において、そのベクターゲノム構築物は、配列番号３に示されている配列を含むか、または配列番号３に示されている配列からなる。

（組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ））
なお別の局面において、本開示は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドと、このアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシド中にパッケージングされたベクターゲノムとを含む、新規な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を提供し、このパッケージングされたベクターゲノムは、マイクロジストロフィンタンパク質をコードする核酸を含む。

一部の実施形態において、そのｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシドと、パッケージングされたベクターゲノムとを含み、このパッケージングされたベクターゲノムは、（ｉ）配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、またはそれよりも多く同一なマイクロジストロフィンコード配列を含み、このパッケージングされたベクターゲノムは、（ｉｉ）（ａ）５’－逆位末端反復配列（ＩＴＲ）；（ｂ）筋特異的制御エレメント；（ｃ）イントロン；（ｄ）ポリアデニル化シグナル配列；および（ｅ）３’－逆位末端反復配列（ＩＴＲ）から選択される、１つまたは複数の追加的配列エレメントを必要に応じて含む。例示的な実施形態において、そのｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシドと、パッケージングされたベクターゲノムとを含み、このパッケージングされたベクターゲノムは、（ｉ）配列番号１と少なくとも９９％（例えば、９９％～１００％）同一なマイクロジストロフィンコード配列を含み、このパッケージングされたベクターゲノムは、（ｉｉ）（ａ）５’－逆位末端反復配列（ＩＴＲ）；（ｂ）筋特異的制御エレメント；（ｃ）イントロン；（ｄ）ポリアデニル化シグナル配列；および（ｅ）３’－逆位末端反復配列（ＩＴＲ）から選択される、１つまたは複数の追加的配列エレメントを必要に応じて含む。さらなる例示的な実施形態において、そのｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシドと、パッケージングされたベクターゲノムとを含み、このパッケージングされたベクターゲノムは、（ｉ）配列番号１に示されているマイクロジストロフィンコード配列を含み、このパッケージングされたベクターゲノムは、（ｉｉ）（ａ）５’－逆位末端反復配列（ＩＴＲ）；（ｂ）筋特異的制御エレメント；（ｃ）イントロン；（ｄ）ポリアデニル化シグナル配列；および（ｅ）３’－逆位末端反復配列（ＩＴＲ）から選択される、１つまたは複数の追加的配列エレメントを必要に応じて含む。

一部の実施形態において、そのｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシドと、パッケージングされたベクターゲノムとを含み、このパッケージングされたベクターゲノムは、配列番号３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、またはそれよりも多く同一な配列を含む。例示的な実施形態において、そのｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシドと、パッケージングされたベクターゲノムとを含み、このパッケージングされたベクターゲノムは、配列番号３と少なくとも９９％（例えば、９９％～１００％）同一な配列を含む。さらなる例示的な実施形態において、そのｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシドと、パッケージングされたベクターゲノムとを含み、このパッケージングされたベクターゲノムは、配列番号３に示されている配列を含むか、または配列番号３に示されている配列からなる。

（逆位末端反復配列（ＩＴＲ））
一部の実施形態において、そのｒＡＡＶは、ＡＡＶ ＩＴＲ配列を含む、パッケージングされたベクターゲノムを含み、このＡＡＶ ＩＴＲ配列は、ＡＡＶおよびアデノウイルスのヘルパー機能がトランスで提供された場合に、ベクターＤＮＡ複製起点およびこのベクターゲノムのパッケージングシグナルの両方として機能する。さらに、そのＩＴＲは、ラージＲｅｐタンパク質による一本鎖ヌクレオチド内（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｔｉｃ）ニック形成の標的として機能し、個々のゲノムを複製中間体から分離する。

一部の実施形態において、その５’－ＩＴＲはＡＡＶ２に由来する。一部の実施形態において、その５’－ＩＴＲは、（プラス／プラス鎖方向にある）配列番号４を含むか、または（プラス／プラス鎖方向にある）配列番号４からなる。他の実施形態において、その５’－ＩＴＲは非ＡＡＶ２供給源に由来する。

一部の実施形態において、その３’－ＩＴＲはＡＡＶ２に由来する。一部の実施形態において、その３’－ＩＴＲは、（プラス／マイナス鎖方向にある）配列番号４を含むか、または（プラス／マイナス鎖方向にある）配列番号４からなり、この（プラス／マイナス鎖方向にある）配列番号４は、プラス／プラス鎖方向にある配列番号５に対応する。他の実施形態において、その３’－ＩＴＲは非ＡＡＶ２供給源に由来する。

一部の実施形態において、その５’－ＩＴＲおよび３’－ＩＴＲの両方はＡＡＶ２に由来する。他の実施形態において、その５’－ＩＴＲおよび３’－ＩＴＲは両方とも非ＡＡＶ２供給源に由来する。

（筋特異的制御エレメント）
一部の実施形態において、そのｒＡＡＶは、マイクロジストロフィン発現を駆動および／または調節するのを補助する筋特異的制御エレメントを含む、パッケージングされたベクターゲノムを含む。例示的な実施形態において、その筋特異的制御エレメントは、５’－ＩＴＲ配列と、マイクロジストロフィンタンパク質コード配列との間に位置する。一部の実施形態において、その筋特異的制御エレメントは、イントロン配列の上流に位置する。一部の実施形態において、その筋特異的制御エレメントはプロモーターである。一部の実施形態において、その筋特異的制御エレメントはエンハンサーである。一部の実施形態において、その筋特異的制御エレメントはプロモーター／エンハンサーである。

一部の実施形態において、その筋特異的制御エレメントは、ＣＫ８プロモーター、ＣＫ７プロモーター、ＣＫ９プロモーター、筋特異的クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、切断型ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、ハイブリッドα－ミオシン重鎖エンハンサー－／ＭＣＫ（ＭＨＣＫ７）エンハンサー－プロモーター、ヒト骨格筋アクチン（ｓｋｅｌｅｔａｌ ａｃｔｉｎ）遺伝子エレメント、心筋アクチン（ｃａｒｄｉａｃ ａｃｔｉｎ）遺伝子エレメント、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ｍｅｆ、Ｃ５－１２、マウスクレアチンキナーゼエンハンサーエレメント、骨格筋速筋型（ｓｋｅｌｅｔａｌ ｆａｓｔ－ｔｗｉｔｃｈ）トロポニンｃ遺伝子エレメント、遅筋型・心筋型（ｓｌｏｗ－ｔｗｉｔｃｈ ｃａｒｄｉａｃ）トロポニンｃ遺伝子エレメント、遅筋型（ｓｌｏｗ－ｔｗｉｔｃｈ）トロポニンｉ遺伝子エレメント、低酸素誘導性核因子（例えば、ＨＩＦ－１α、ＨＩＦ－１β、ＨＩＦ－２α、ＨＩＦ－２β、ＨＩＦ－３α、およびＨＩＦ－３β）、ステロイド誘導性エレメント、ならびにグルココルチコイド応答エレメント（ｇｒｅ）から選択される。

例示的な実施形態において、その筋特異的制御エレメントは、配列番号６に示されている配列を含むかまたは配列番号６に示されている配列からなる、ＣＫ８プロモーターである。一部の実施形態において、その筋特異的制御エレメントは、配列番号６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、またはそれよりも多く同一な配列を含む。

別の実施形態において、その筋特異的制御エレメントは、配列番号７に示されている配列を含むかまたは配列番号７に示されている配列からなる、ハイブリッドα－ミオシン重鎖エンハンサー－／ＭＣＫ（ＭＨＣＫ７）エンハンサー－プロモーターである。一部の実施形態において、その筋特異的制御エレメントは、配列番号７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、またはそれよりも多く同一な配列を含む。

（イントロン）
一部の実施形態において、そのｒＡＡＶは、１つまたは複数のイントロン配列を含む、パッケージングされたベクターゲノムを含む。種々のイントロンが当該分野において公知である。イントロンは、哺乳動物宿主細胞におけるＲＮＡ転写物のプロセシングを促進し得、目的のタンパク質（例えば、マイクロジストロフィン）の発現を増加し得、かつ／またはＡＡＶ粒子中へのベクターのパッケージングを最適化し得る。一部の実施形態において、そのｒＡＡＶは、合成イントロン配列を含む、パッケージングされたベクターゲノムを含む。一部の実施形態において、そのｒＡＡＶは、天然に存在するイントロン配列を含む、パッケージングされたベクターゲノムを含む。

一部の実施形態において、そのイントロンは、プロモーターおよび／またはエンハンサー配列と、マイクロジストロフィンタンパク質コード配列との間に位置する。一部の実施形態において、そのイントロンは、マイクロジストロフィンタンパク質コード配列の上流に位置する。

一部の実施形態において、そのイントロンは、ＳＶ４０スモールＴイントロン、ウサギヘモグロビンサブユニットβ（ｒＨＢＢ）イントロン、ヒトβ－グロビン／ＩｇＧキメライントロン、ヒトβグロビンＩＶＳ２イントロン、およびｈＦＩＸイントロンから選択される。他の実施形態において、真核生物翻訳開始因子２サブユニット１（ＥＩＦ２Ｓ１）、Ｉ型コラーゲンα２鎖（ＣＯＬ１Ａ２）、酸性でシステインに富む分泌タンパク質（ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｉｄｉｃ ａｎｄ ｒｉｃｈ ｉｎ ｃｙｓｔｅｉｎｅ）（ＳＰＡＲＣ）、シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）、エノラーゼ１（ＥＮＯ１）、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫＭ）、フルクトース二リン酸アルドラーゼ（ａｌｄｏｌａｓｅ ｆｒｕｃｔｏｓｅ－ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ）Ａ（ＡＬＤＯＡ）、Ｙボックス結合タンパク質１（ＹＢＸ１）、グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）βポリペプチド２様１（ＧＮＢ２Ｌ１）、リボソームタンパク質Ｓ３（ＲＰＳ３）、ＧＮＡＳ複合遺伝子座（ＧＮＡＳ）、フィラミンＡ（ＦＬＮＡ）、トランスフェリンレセプター（ＴＦＲＣ）、ポリＡ結合タンパク質細胞質１（ＰＡＢＰＣ１）、ユビキチン様修飾因子活性化酵素１（ＵＢＡ１）、カルネキシン（ＣＡＮＸ）、および乳酸デヒドロゲナーゼＡ（ＬＤＨＡ）から選択されるタンパク質をコードする遺伝子に由来するイントロン配列が、使用され得る。

（ポリアデニル化シグナル）
一部の実施形態において、そのｒＡＡＶは、ポリアデニル化シグナル配列を含む、パッケージングされたベクターゲノムを含む。種々のポリアデニル化シグナル配列が当該分野において公知である。ポリアデニル化シグナル配列は、転写の有効な終結を提供することおよび転写されたｍＲＮＡを安定化することを補助する。一部の実施形態において、そのｒＡＡＶは、合成ポリアデニル化シグナル配列を含む、パッケージングされたベクターゲノムを含む。一部の実施形態において、そのｒＡＡＶは、天然に存在するポリアデニル化シグナル配列を含む、パッケージングされたベクターゲノムを含む。

一部の実施形態において、そのポリアデニル化シグナル配列は、マイクロジストロフィンタンパク質コード配列と、３’－ＩＴＲとの間に位置する。一部の実施形態において、そのポリアデニル化シグナル配列は、マイクロジストロフィンタンパク質コード配列のすぐ下流に位置する。

一部の実施形態において、そのポリアデニル化シグナル配列は、合成ポリアデニル化シグナル配列、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列、およびウサギβグロビンポリアデニル化シグナル配列から選択され得る。

例示的な実施形態において、そのｒＡＡＶは、合成ポリアデニル化シグナル配列を含む、パッケージングされたベクターゲノムを含む。一実施形態において、その合成ポリアデニル化シグナル配列は、配列番号９に示されている配列を含むか、または配列番号９に示されている配列からなる。一部の実施形態において、そのｒＡＡＶは、配列番号９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、またはそれよりも多く同一な配列を含むポリアデニル化シグナル配列を含む、パッケージングされたベクターゲノムを含む。

（ｒＡＡＶカプシド）
本明細書において記載される種々の実施形態において、そのｒＡＡＶはＡＡＶカプシドを含む。そのＡＡＶカプシドは、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、ｒｈ１０、ｒｈ７４、ｈｕ３７のＡＡＶ（すなわち、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶｈｕ３７）、ならびにヒトおよび非ヒト霊長類の組織から単離された天然に存在する１００種を超えるバリアントのうちのいずれか１種に由来し得る。例えば、Ｃｈｏｉら、２００５、Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、５：２９９～３１０、２００５およびＧａｏら、２００５、Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、５：２８５～２９７を参照のこと。

特定の例示的な実施形態において、本発明にしたがって投与されるｒＡＡＶはＡＡＶｈｕ３７カプシドを含む。そのＡＡＶｈｕ３７カプシドは、複数のＡＡＶｈｕ３７ ｖｐタンパク質から構成された、自己会合したＡＡＶカプシドである。そのＡＡＶｈｕ３７ ｖｐタンパク質（ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３）は、選択的ｍＲＮＡスプライスバリアントとして典型的には発現される。そのＡＡＶｈｕ３７ ｖｐ１アミノ酸配列は、配列番号１２（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＡＡＳ９９２８５．１）に示されている。一部の実施形態において、配列番号１２のＡＡＶｈｕ３７ ｖｐ１アミノ酸配列は、配列番号１１、またはその配列番号１１と少なくとも９５％（例えば、９５％～１００％、例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一な配列によって、コードされる。

一部の実施形態において、本発明にしたがって投与されるｒＡＡＶは、配列番号１２と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、またはそれよりも多く同一なｖｐ１アミノ酸配列を含む、ＡＡＶカプシドを含み得る。一部の実施形態において、本発明にしたがって投与されるｒＡＡＶは、配列番号１２のｖｐ１アミノ酸配列を含む、カプシドを含む。

一部の実施形態において、本発明にしたがって投与されるｒＡＡＶは、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、ｒｈ１０、またはｒｈ７４のｖｐ１アミノ酸配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、またはそれよりも多く同一なｖｐ１アミノ酸配列を含む、ＡＡＶカプシドを含み得る。

１つまたは複数の有益な治療特性（例えば、改善した選択組織標的化、向上した免疫応答回避能力、減少した中和抗体刺激など）を保有するように操作されたバリアントＡＡＶカプシドもまた、本発明の範囲内に含まれる。そのような操作されたバリアントカプシドの非限定的な例が米国特許第９，５０６，０８３号、同第９，５８５，９７１号、同第９，５８７，２８２号、同第９，６１１，３０２号、同第９，７２５，４８５号、同第９，８５６，５３９号、同第９，９０９，１４２号、同第９，９２０，０９７号、同第１０，０１１，６４０号、同第１０，０８１，６５９号、同第１０，１７９，１７６号、同第１０，２０２，６５７号、同第１０，２１４，５６６号、同第１０，２１４，７８５号、同第１０，２６６，８４５号、同第１０，２９４，２８１号、同第１０，３０１，６４８号、同第１０，３８５，３２０号、および同第１０，３９２，６３２号、ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ／２０１７／１６５８５９、同ＷＯ／２０１８／０２２９０５、同ＷＯ／２０１８／１５６６５４、同ＷＯ／２０１８／２２２５０３、および同ＷＯ／２０１８／２２６６０２に記載されており、それらの開示は、参照により本明細書中に援用される。

一部の実施形態において、ＡＡＶバリアントカプシドは、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、ｒｈ１０、ｒｈ７４、またはｈｕ３７の天然に存在するＡＡＶカプシドと比較して少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、少なくとも３０個、少なくとも３１個、少なくとも３２個、少なくとも３３個、少なくとも３４個、少なくとも３５個、少なくとも３６個、少なくとも３７個、少なくとも３８個、少なくとも３９、もしくは少なくとも４０個異なる残基を有し得る。

上記のカプシドのほかに、未だに発見されていないＡＡＶ、またはそれに基づく組換えＡＡＶが、ＡＡＶカプシドの供給源として使用され得る。

さらに、一部の実施形態において、そのＡＡＶカプシドは、上記のＡＡＶカプシドタンパク質のうちの２種、または３種、または４種、またはそれよりも多くに由来するドメインを含む、キメラであり得る。一部の実施形態において、そのＡＡＶカプシドは、２種もしくは３種の異なるＡＡＶまたは組換えＡＡＶに由来する、ＶｐｌモノマーとＶｐ２モノマーとＶｐ３モノマーとのモザイクである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ組成物は、上記のカプシドのうちの１種よりも多くを含む。

（組換え核酸分子を含む宿主細胞）
なお別の局面において、本明細書において開示されている組換え核酸分子、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）、またはｒＡＡＶを含む、宿主細胞が、本明細書において提供される。特定の実施形態において、その宿主細胞は、ＡＡＶの増殖のために適切であり得る。

一実施形態において、配列番号１に示されている組換え核酸分子を含む宿主細胞が、本明細書において提供される。別の実施形態において、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、またはそれよりも多く同一な組換え核酸分子を含む宿主細胞が、本明細書において提供される。

一実施形態において、配列番号３に示されている組換え核酸分子を含む宿主細胞が、本明細書において提供される。別の実施形態において、配列番号３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、またはそれよりも多く同一な組換え核酸分子を含む宿主細胞が、本明細書において提供される。

広範な範囲の宿主細胞（例えば、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞など）が、使用され得る。一部の実施形態において、その宿主細胞は、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）の産生のために適切な細胞（または細胞株）（例えば、ＨｅＬａ細胞、Ｃｏｓ－７細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ａ５４９細胞、ＢＨＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＲＤ細胞、ＨＴ－１０８０細胞、ＡＲＰＥ－１９細胞、またはＭＲＣ－５細胞）であり得る。例示的な実施形態において、その宿主細胞はＨｅＬａ細胞である。一部の実施形態において、その宿主細胞は、１つまたは複数の内在性遺伝子を不活化するように操作されたＨｅＬａ細胞である。一部の実施形態において、その宿主細胞は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ／２０２０／２１０５０７において記載されている１つまたは複数の内在性遺伝子（例えば、ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２、およびＮＡＬＣＮ－ＡＳ１）を不活化するように操作されたＨｅＬａ細胞である。例示的な実施形態において、その内在性遺伝子は、ＫＣＮＮ２（カルシウム活性化カリウムチャネルサブファミリーＮメンバー２）およびＲＧＭＡ（反発性ガイダンス分子（Ｒｅｐｕｌｓｉｖｅ Ｇｕｉｄａｎｃｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ）ＢＭＰコレセプターＡ）から選択される。

その組換え核酸分子またはベクターは、当該分野において公知である任意の適切な方法を使用して、宿主細胞培養物に送達され得る。一部の実施形態において、その組換え核酸分子またはベクターがそれ自体のゲノム中に挿入された安定な宿主細胞株が、作製される。一部の実施形態において、安定な宿主細胞株が作製され、それは、本明細書において記載されているｒＡＡＶベクターを含む。宿主培養物へのそのｒＡＡＶベクターのトランスフェクション後に、宿主ゲノム中へのそのｒＡＡＶの組込みが、種々の方法（例えば、抗生物質選択、蛍光活性化セルソーティング、サザンブロット、ＰＣＲベースの検出、および蛍光インサイチュハイブリダイゼーション）によって、アッセイされ得る。

（遺伝子治療のための組換えＡＡＶ）
なお別の局面において、本開示は、筋ジストロフィーの処置における遺伝子治療のための薬剤として有用な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を提供し、このｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシドと、このＡＡＶカプシド中にパッケージングされたベクターゲノムとを含む。一実施形態において、その筋ジストロフィーは、ジストロフィン中の変異によって引き起こされている。一部の実施形態において、その筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー、およびＸ連鎖性拡張型心筋症から選択される。

一部の実施形態において、そのｒＡＡＶは、５’から３’に向かう順序で作動可能に連結された成分として（ａ）５’－逆位末端反復配列（ＩＴＲ）；（ｂ）筋特異的制御エレメント；（ｃ）イントロン；（ｄ）ＭＤ５マイクロジストロフィンタンパク質の部分的コード配列または完全コード配列；（ｅ）ポリアデニル化シグナル配列；および（ｆ）３’－逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含む、パッケージングされたベクターゲノムを含む。

一部の実施形態において、そのＭＤ５マイクロジストロフィンタンパク質コード配列は、配列番号１、またはその配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、もしくは少なくとも９９．９％同一な配列を含む。

一部の実施形態において、そのパッケージングされたベクターゲノムは、配列番号３、またはその配列番号３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、もしくは少なくとも９９．９％同一な配列を含む。

一部の実施形態において、そのＡＡＶカプシドは、血清型８、血清型９、ｒｈ７４、およびｈｕ３７のＡＡＶから選択される。例示的な実施形態において、そのＡＡＶカプシドはｈｕ３７（ＡＡＶｈｕ３７）カプシドである。

一部の例示的な実施形態において、そのｒＡＡＶは、ＡＡＶｈｕ３７カプシドと、このＡＡＶｈｕ３７カプシド中にパッケージングされたベクターゲノムとを含み、このパッケージングされたベクターゲノムは、５’から３’に向かう順序で作動可能に連結された成分として、（ａ）ＡＡＶ２ ５’－ＩＴＲ；（ｂ）ＣＫ８プロモーター；（ｃ）イントロン；（ｄ）配列番号１に示されている配列を含むヒトマイクロジストロフィンコード配列；（ｅ）配列番号９に示されている配列を含む合成ポリアデニル化シグナル配列；および（ｆ）ＡＡＶ２ ３’－ＩＴＲを含む。

ＭＤ５マイクロジストロフィンタンパク質の発現のための例示的なパッケージングされたベクターゲノム構築物を示す図解が図１に提示されており、これは、５’から３’に向かう順序で、５’－ＩＴＲ、ＣＫ８プロモーター、イントロン、ＭＤ５マイクロジストロフィンタンパク質コード配列、合成ポリアデニル化シグナル配列、および３’－ＩＴＲを示す。配列番号３（４，７８４ｂｐ）の構成が図１に示されており、この配列番号３は、ヒトマイクロジストロフィンタンパク質（ＭＤ５）をコードする配列番号１（３，８１０ｂｐ）に示されている合成核酸を含む。

（医薬組成物）
なお別の局面において、本開示は、本明細書において開示されている合成核酸配列またはｒＡＡＶを含む、医薬組成物を含む。一部の実施形態において、その医薬組成物は、合成核酸と、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤とを含む。一部の実施形態において、その医薬組成物は、ｒＡＡＶと、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤とを含む。

特定の例示的な実施形態において、本開示は、本発明のｒＡＡＶ（例えば、マイクロジストロフィンの送達のためのｒＡＶＶ）と、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤とを含む、医薬組成物を提供する。一部の実施形態において、本発明のｒＡＶＶ（例えば、マイクロジストロフィンの送達のためのｒＡＶＶ）を含む医薬組成物は、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、皮内投与、腹腔内投与、または髄腔内投与のために製剤化されている。例示的な実施形態において、そのｒＡＡＶを含む医薬組成物は、静脈内投与または筋肉内投与のために製剤化されている。

一部の実施形態において、本発明のｒＡＶＶ（例えば、マイクロジストロフィンの送達のためのｒＡＶＶ）を含む医薬組成物は、局所投与または全身投与のために製剤化され得る。例えば、全身投与は、身体全体に影響を与えるように循環器系に投与される。全身投与としては、経腸投与（例えば、胃腸管を通じての吸収）、および注射を通じてかまたは注入を通じてかまたは移植を通じての非経口投与が挙げられる。

一部の実施形態において、そのｒＡＶＶは、ヒト対象における注入のために適切な緩衝液／キャリア中に製剤化される。その緩衝液／キャリアは、そのｒＡＶＶが注入チューブに固着するのを防ぐがインビボでそのｒＡＶＶ結合活性に干渉しない、成分を含むべきである。種々の適切な溶液としては、以下のうちの１つまたは複数が挙げられ得る：緩衝化生理食塩水、界面活性剤、および約１００ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）～約２５０ｍＭ塩化ナトリウムと等しいイオン強度に調整された生理的に適合性の塩もしくは塩混合物、または等しいイオン濃度に調整された生理的に適合性の塩。そのｐＨは、６．５～８．５、または７～８．５、または７．５～８の範囲にあり得る。適切な界面活性剤または界面活性剤の組合せは、ポロクサマー（すなわち、２つのポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））親水鎖によって両側を挟まれた中央のポリオキシプロピレン１０（ポリ（プロピレンオキシド））疏水鎖から構成された非イオン性トリプロックコポリマー）、ＳＯＬＵＴＯＬ ＨＳ １５（マクロゴール－１５ヒドロキシステアレート）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（登録商標）（ポリオキシカプリル酸グリセリル（Ｐｏｌｙｏｘｙ ｃａｐｒｙｌｌｉｃ ｇｌｙｃｅｒｉｄｅ））、ポリオキシ１０オレイルエーテル、ＴＷＥＥＮ（登録商標）（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノールおよびポリエチレングリコールから選択され得る。

例示的な実施形態において、そのｒＡＶＶは、ＮａＣｌ（例えば、２００ｍＭ ＮａＣｌ）とＭｇＣｌ_２（例えば、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２）とＴｒｉｓ（例えば、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ） ｐＨ ８．０とポロクサマー１８８（例えば、０．００５％ポロクサマー１８８または０．０１％ポロクサマー１８８）とを含む溶液中に、製剤化される。

（筋ジストロフィーを処置する方法）
なお別の局面において、本開示は、ヒト対象における筋ジストロフィーを処置する方法を提供し、この方法は、このヒト対象に、治療有効量の少なくとも１種の本明細書において開示されている合成核酸配列を投与する工程を含む。

なお別の局面において、本開示は、ヒト対象における筋ジストロフィーを処置する方法を提供し、この方法は、このヒト対象に、治療有効量の少なくとも本明細書において開示されているｒＡＶＶを投与する工程を含む。

一部の実施形態において、その筋ジストロフィーは、ジストロフィン中の変異によって引き起こされている。一部の実施形態において、その筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー、およびＸ連鎖性拡張型心筋症から選択される。

一実施形態において、本開示は、筋ジストロフィー（例えば、ＤＭＤ）を処置する方法を提供し、この方法は、ＡＡＶカプシドと、このＡＡＶカプシド中にパッケージングされたベクターゲノムとを含む、ｒＡＶＶを投与する工程を含み、このパッケージングされたベクターゲノムは、（ｉ）配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、またはそれよりも多く同一なマイクロジストロフィンコード配列を含み、このパッケージングされたベクターゲノムは、（ｉｉ）（ａ）５’－逆位末端反復配列（ＩＴＲ）；（ｂ）筋特異的制御エレメント；（ｃ）イントロン；（ｄ）ポリアデニル化シグナル配列；および（ｅ）３’－逆位末端反復配列（ＩＴＲ）から選択される、１つまたは複数の追加的配列エレメントを必要に応じて含む。例示的な実施形態において、そのｒＡＶＶは、ＡＡＶカプシドと、このＡＡＶカプシド中にパッケージングされたベクターゲノムとを含み、このパッケージングされたベクターゲノムは、（ｉ）配列番号１と少なくとも９９％（例えば、９９％～１００％）同一なマイクロジストロフィンコード配列を含み、このパッケージングされたベクターゲノムは、（ｉｉ）（ａ）５’－逆位末端反復配列（ＩＴＲ）；（ｂ）筋特異的制御エレメント；（ｃ）イントロン；（ｄ）ポリアデニル化シグナル配列；および（ｅ）３’－逆位末端反復配列（ＩＴＲ）から選択される、１つまたは複数の追加的配列エレメントを必要に応じて含む。さらなる例示的な実施形態において、そのｒＡＶＶは、ＡＡＶカプシドと、このＡＡＶカプシド中にパッケージングされたベクターゲノムとを含み、このパッケージングされたベクターゲノムは、（ｉ）配列番号１に示されているマイクロジストロフィンコード配列を含み、このパッケージングされたベクターゲノムは、（ｉｉ）（ａ）５’－逆位末端反復配列（ＩＴＲ）；（ｂ）筋特異的制御エレメント；（ｃ）イントロン；（ｄ）ポリアデニル化シグナル配列；および（ｅ）３’－逆位末端反復配列（ＩＴＲ）から選択される、１つまたは複数の追加的配列エレメントを必要に応じて含む。一部の実施形態において、そのＡＡＶカプシドは、血清型８、血清型９、ｒｈ７４、およびｈｕ３７のＡＡＶから選択される。例示的な実施形態において、そのＡＡＶカプシドはｈｕ３７（ＡＡＶｈｕ３７）カプシドである。

別の実施形態において、本開示は、筋ジストロフィー（例えば、ＤＭＤ）を処置する方法を提供し、この方法は、ＡＡＶカプシドと、このＡＡＶカプシド中にパッケージングされたベクターゲノムとを含む、ｒＡＶＶを投与する工程を含み、このパッケージングされたベクターゲノムは、配列番号３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、またはそれよりも多く同一な配列を含む。例示的な実施形態において、そのｒＡＶＶは、ＡＡＶカプシドと、パッケージングされたベクターゲノムとを含み、このパッケージングされたベクターゲノムは、配列番号３と少なくとも９９％（例えば、９９％～１００％）同一な配列を含む。さらなる例示的な実施形態において、そのｒＡＶＶは、ＡＡＶカプシドと、パッケージングされたベクターゲノムとを含み、このパッケージングされたベクターゲノムは、配列番号３に示されている配列を含むか、または配列番号３に示されている配列からなる。一部の実施形態において、そのＡＡＶカプシドは、血清型８、血清型９、ｒｈ７４、およびｈｕ３７のＡＡＶから選択される。例示的な実施形態において、そのＡＡＶカプシドはｈｕ３７（ＡＡＶｈｕ３７）カプシドである。

特定の実施形態において、本開示は、ジストロフィン中に少なくとも１つの変異を有すると診断されたヒト対象における筋ジストロフィー（例えば、ＤＭＤ）を処置する方法を提供し、この方法は。この対象に治療有効量の少なくとも１種の本明細書において開示されているｒＡＶＶを投与する工程を含む。

ＤＭＤおよびベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）の両方が、Ｘ染色体上のＸｐ２１領域にあるジストロフィン遺伝子（ＤＭＤ遺伝子としても知られている）（ＭＩＭ ３００３７７）（これは、２．４ＭｂのゲノムＤＮＡに広がる）中の変異によって引き起こされる。このジストロフィン遺伝子は、７９個のエクソンを含む最大のヒト遺伝子であり、これらのエクソンは１４Ｋｂ ｍＲＮＡをコードし、これらのエクソンは、ジストロフィン結合糖タンパク質複合体（ＤＧＣ）の形成にとって重要なジストロフィンと呼ばれる４２７キロダルトン（ｋＤａ）膜タンパク質を生成する。ジストロフィン中の病原性変異の非限定的なリストが、Ｔｕｆｆｅｒｙ－Ｇｉｒｕａｄら、２００９、Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ、３０（６）：９３４～４５、Ｔａｋｅｓｈｉｍａら、２０１０、Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎ、５５：３７９～８８、Ｂｌａｄｅｎら、２０１５、Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ、３６（４）：３９５～４０２、およびＴＲＥＡＴ－ＮＭＤ ＤＭＤ Ｇｌｏｂａｌ Ｄａｔａｂａｓｅに記載されている。

特定の実施形態において、本開示は、ジストロフィン中に少なくとも１つの変異を有すると診断されたヒト対象における筋ジストロフィー（例えば、ＤＭＤ）を処置する方法を提供し、この方法は、ＡＡＶカプシドと、このＡＡＶカプシド中にパッケージングされたベクターゲノムとを含む、ｒＡＶＶを投与する工程を含み、このパッケージングされたベクターゲノムは、（ｉ）配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、またはそれよりも多く同一なマイクロジストロフィンコード配列を含み、このパッケージングされたベクターゲノムは、（ｉｉ）（ａ）５’－逆位末端反復配列（ＩＴＲ）；（ｂ）筋特異的制御エレメント；（ｃ）イントロン；（ｄ）ポリアデニル化シグナル配列；および（ｅ）３’－逆位末端反復配列（ＩＴＲ）から選択される、１つまたは複数の追加的配列エレメントを必要に応じて含む。例示的な実施形態において、そのｒＡＶＶは、ＡＡＶカプシドと、このＡＡＶカプシド中にパッケージングされたベクターゲノムとを含み、このパッケージングされたベクターゲノムは、（ｉ）配列番号１と少なくとも９９％（例えば、９９％～１００％）同一なマイクロジストロフィンコード配列を含み、このパッケージングされたベクターゲノムは、（ｉｉ）（ａ）５’－逆位末端反復配列（ＩＴＲ）；（ｂ）筋特異的制御エレメント；（ｃ）イントロン；（ｄ）ポリアデニル化シグナル配列；および（ｅ）３’－逆位末端反復配列（ＩＴＲ）から選択される、１つまたは複数の追加的配列エレメントを必要に応じて含む。さらなる例示的な実施形態において、そのｒＡＶＶは、ＡＡＶカプシドと、このＡＡＶカプシド中にパッケージングされたベクターゲノムとを含み、このパッケージングされたベクターゲノムは、（ｉ）配列番号１に示されているマイクロジストロフィンコード配列を含み、このパッケージングされたベクターゲノムは、（ｉｉ）（ａ）５’－逆位末端反復配列（ＩＴＲ）；（ｂ）筋特異的制御エレメント；（ｃ）イントロン；（ｄ）ポリアデニル化シグナル配列；および（ｅ）３’－逆位末端反復配列（ＩＴＲ）から選択される、１つまたは複数の追加的配列エレメントを必要に応じて含む。一部の実施形態において、そのＡＡＶカプシドは、血清型８、血清型９、ｒｈ７４、およびｈｕ３７のＡＡＶから選択される。例示的な実施形態において、そのＡＡＶカプシドはｈｕ３７（ＡＡＶｈｕ３７）カプシドである。

特定の実施形態において、本開示は、ジストロフィン中に少なくとも１つの変異を有すると診断されたヒト対象における筋ジストロフィー（例えば、ＤＭＤ）を処置する方法を提供し、この方法は、ＡＡＶカプシドと、このＡＡＶカプシド中にパッケージングされたベクターゲノムとを含む、ｒＡＶＶを投与する工程を含み、このパッケージングされたベクターゲノムは、配列番号３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、またはそれよりも多く同一な配列を含む。例示的な実施形態において、そのｒＡＶＶは、ＡＡＶカプシドと、パッケージングされたベクターゲノムとを含み。このパッケージングされたベクターゲノムは、配列番号３と少なくとも９９％（例えば、９９％～１００％）同一な配列を含む。さらなる例示的な実施形態において、そのｒＡＶＶは、ＡＡＶカプシドと、パッケージングされたベクターゲノムとを含み、このパッケージングされたベクターゲノムは、配列番号３に示されている配列を含むか、または配列番号３に示されている配列からなる。一部の実施形態において、そのＡＡＶカプシドは、血清型８、血清型９、ｒｈ７４、およびｈｕ３７のＡＡＶから選択される。例示的な実施形態において、そのＡＡＶカプシドはｈｕ３７（ＡＡＶｈｕ３７）カプシドである。

任意の適切な方法または経路が、本明細書において記載されている合成核酸、ｒＡＶＶ、合成核酸含有医薬組成物、またはｒＡＶＶ含有医薬組成物を投与するために、使用され得る。

その医薬組成物がｒＡＶＶを含む特定の実施形態において、その医薬組成物は、種々の異なる経路を経て投与され得、それらの経路としては、静脈内経路、皮下経路、筋肉内経路、皮内経路、腹腔内経路、および髄腔内経路が挙げられるが、これらに限定はされない。例示的な実施形態において、本発明のｒＡＶＶを含む医薬組成物は、静脈内投与または筋肉内投与される。本明細書において記載されている使用のいずれかにおいて、本発明のｒＡＶＶを含む医薬組成物は、局所投与または全身投与され得る。一部の実施形態において、本発明のｒＡＶＶを含む医薬組成物は、注射、注入、または移植によって投与され得る。

投与される特定の１回の投与量は、各患者にとって均一な１回の投与量、例えば、患者１人当たり１．０×１０^１２ゲノムコピー（ＧＣ）～１．０×１０^１６ゲノムコピー（ＧＣ）のウイルスであり得る。あるいは、患者の１回の投与量は、その患者のおよその体重または表面積に適合され得る。適切な投与量を決定することにおける他の要因としては、処置または予防されるべき疾患もしくは状態、その疾患の重症度、投与経路、ならびにその患者の年齢、その患者の性別およびその患者の医学的状態が挙げられ得る。処置のために適切な投与量を決定するために必要な計算のさらなる改良は、特に本明細書において開示されている投与量情報およびアッセイを考慮して、当業者によって慣用的に行われる。その投与量はまた、適切な用量反応データと組み合わせて使用される、投与量を決定するための公知のアッセイの使用を通じて決定され得る。個別の患者の投与量はまた、その疾患の進行がモニターされるにつれて調整され得る。

一部の実施形態において、そのｒＡＶＶは、ｑＰＣＲまたはデジタルドロップレット（ｄｄＰＣＲ）によって測定された場合に、１回の投与量が、例えば、約１．０×１０^１２ゲノムコピー／（患者の体重１ｋｇ）（ＧＣ／ｋｇ）～約１×１０^１６ＧＣ／ｋｇ、約１×１０^１３ゲノムコピー／（患者の体重１ｋｇ）（ＧＣ／ｋｇ）～約１×１０^１５ＧＣ／ｋｇ、または約５×１０^１３～約５×１０^１４ＧＣ／ｋｇで投与される。一部の実施形態において、そのｒＡＶＶは、１回の投与量が１×１０^１３ＧＣ／ｋｇまたは約１×１０^１３ＧＣ／ｋｇ、１．５×１０^１３ＧＣ／ｋｇまたは約１．５×１０^１３ＧＣ／ｋｇ、２×１０^１３ＧＣ／ｋｇまたは約２×１０^１３ＧＣ／ｋｇ、２．５×１０^１３ＧＣ／ｋｇまたは約２．５×１０^１３ＧＣ／ｋｇ、３×１０^１３ＧＣ／ｋｇまたは約３×１０^１３ＧＣ／ｋｇ、３．５×１０^１３ＧＣ／ｋｇまたは約３．５×１０^１３ＧＣ／ｋｇ、４×１０^１３ＧＣ／ｋｇまたは約４×１０^１３ＧＣ／ｋｇ、４．５×１０^１３ＧＣ／ｋｇまたは約４．５×１０^１３ＧＣ／ｋｇ、５×１０^１３ＧＣ／ｋｇまたは約５×１０^１３ＧＣ／ｋｇ、５．５×１０^１３ＧＣ／ｋｇまたは約５．５×１０^１３ＧＣ／ｋｇ、６×１０^１３ＧＣ／ｋｇまたは約６×１０^１３ＧＣ／ｋｇ、６．５×１０^１３ＧＣ／ｋｇまたは約６．５×１０^１３ＧＣ／ｋｇ、７×１０^１３ＧＣ／ｋｇまたは約７×１０^１３ＧＣ／ｋｇ、７．５×１０^１３ＧＣ／ｋｇまたは約７．５×１０^１３ＧＣ／ｋｇ、８×１０^１３ＧＣ／ｋｇまたは約８×１０^１３ＧＣ／ｋｇ、８．５×１０^１３ＧＣ／ｋｇまたは約８．５×１０^１３ＧＣ／ｋｇ、９×１０^１３ＧＣ／ｋｇまたは約９×１０^１３ＧＣ／ｋｇ、９．５×１０^１３ＧＣ／ｋｇまたは約９．５×１０^１３ＧＣ／ｋｇ、１×１０^１４ＧＣ／ｋｇまたは約１×１０^１４ＧＣ／ｋｇ、１．５×１０^１４ＧＣ／ｋｇまたは約１．５×１０^１４ＧＣ／ｋｇ、２×１０^１４ＧＣ／ｋｇまたは約２×１０^１４ＧＣ／ｋｇ、２．５×１０^１４ＧＣ／ｋｇまたは約２．５×１０^１４ＧＣ／ｋｇ、３×１０^１４ＧＣ／ｋｇまたは約３×１０^１４ＧＣ／ｋｇ、３．５×１０^１４ＧＣ／ｋｇまたは約３．５×１０^１４ＧＣ／ｋｇ、４×１０^１４ＧＣ／ｋｇまたは約４×１０^１４ＧＣ／ｋｇ、４．５×１０^１４ＧＣ／ｋｇまたは約４．５×１０^１４ＧＣ／ｋｇ、５×１０^１４ＧＣ／ｋｇまたは約５×１０^１４ＧＣ／ｋｇ、５．５×１０^１４ＧＣ／ｋｇまたは約５．５×１０^１４ＧＣ／ｋｇ、６×１０^１４ＧＣ／ｋｇまたは約６×１０^１４ＧＣ／ｋｇ、６．５×１０^１４ＧＣ／ｋｇまたは約６．５×１０^１４ＧＣ／ｋｇ、７×１０^１４ＧＣ／ｋｇまたは約７×１０^１４ＧＣ／ｋｇ、７．５×１０^１４ＧＣ／ｋｇまたは約７．５×１０^１４ＧＣ／ｋｇ、８×１０^１４ＧＣ／ｋｇまたは約８×１０^１４ＧＣ／ｋｇ、８．５×１０^１４ＧＣ／ｋｇまたは約８．５×１０^１４ＧＣ／ｋｇ、９×１０^１４ＧＣ／ｋｇまたは約９×１０^１４ＧＣ／ｋｇ、９．５×１０^１４ＧＣ／ｋｇまたは約９．５×１０^１４ＧＣ／ｋｇ、あるいは１×１０^１５ＧＣ／ｋｇまたは約１×１０^１５ＧＣ／ｋｇで、投与される。そのｒＡＶＶは、望まれる治療結果のために必要な場合に、単回投与、または複数回投与（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回もしくはそれよりも多い投与）で投与され得る。

一部の実施形態において、本発明にしたがう筋ジストロフィー（例えば、ＤＭＤ）を処置する方法は、本明細書において記載されているｒＡＶＶの投与の前に、ＩｇＧ分解性プロテアーゼの投与をさらに含み得る。したがって、本開示は、筋ジストロフィー（例えば、ＤＭＤ）を処置する方法を提供し、この方法は、ＩｇＧ分解性プロテアーゼを先に投与し、その後、ＡＡＶカプシドと、このＡＡＶカプシド中にパッケージングされたベクターゲノムとを含む、ｒＡＶＶを投与する工程を含み、このベクターゲノムは、ヒトマイクロジストロフィンタンパク質コード配列を含む。

一部の実施形態において、本発明にしたがう筋ジストロフィー（例えば、ＤＭＤ）を処置する方法は、ＩｇＧ分解性プロテアーゼを投与済みのヒト対象に対して実施される。

本発明において使用され得るプロテアーゼの例としては、例えば、ＷＯ／２０２０／０１６３１８および／またはＷＯ／２０２０／１５９９７０において記載されているプロテアーゼ、（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃａｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓ、もしくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａに由来するシステインプロテアーゼが挙げられる）が挙げられるが、これらに限定はされない。

特定の実施形態において、そのＩｇＧ分解性プロテアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＩｄｅＳ（配列番号１３）、または配列番号１３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一なプロテアーゼである。一部の実施形態において、そのプロテアーゼは、配列番号１３の操作されたバリアントである。操作されたＩｄｅＳプロテアーゼの例が、ＷＯ／２０２０／０１６３１８ならびに米国特許出願公開第２０１８００２３０７０号および同第２０１８００３７９６２号において記載されている。一部の実施形態において、その操作されたＩｄｅＳバリアントは、配列番号１３と比較して１個、２個、３個、４個、５個、またはそれよりも多くのアミノ酸改変を有し得る。

特定の実施形態において、そのＩｇＧ分解性プロテアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉに由来するＩｄｅＺ（配列番号１４）、または配列番号１４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一なプロテアーゼである。一部の実施形態において、そのプロテアーゼは、配列番号１４の操作されたバリアントである。操作されたＩｄｅＺプロテアーゼの例が、ＷＯ／２０２０／０１６３１８に記載されている。一部の実施形態において、その操作されたＩｄｅＺバリアントは、配列番号１４と比較して１個、２個、３個、４個、５個、またはそれよりも多くのアミノ酸改変を有し得る。

本発明において使用され得る他のプロテアーゼとしては、例えば、ＷＯ／２０１７／１３４２７４において記載されている、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｏｒｃｉｎｕｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉに由来するＩｇｄＥ酵素が挙げられるが、これらに限定はされない。

一部の実施形態において、そのＩｇＧ分解性プロテアーゼは、リポソーム、ナノ粒子、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、ポリマー、マイクロ粒子、マイクロカプセル、ミセル、もしくは細胞外小胞中に封入され得るか、またはリポソーム、ナノ粒子、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、ポリマー、マイクロ粒子、マイクロカプセル、ミセル、もしくは細胞外小胞と複合体化され得る。

本明細書全体にわたって、組成物が特定の成分を有するか、含有するか、もしくは含むと記載される場合、またはプロセスおよび方法が特定の工程を有するか、含有するか、もしくは含むと記載される場合、さらに、記載された成分から本質的になる本発明の組成物、または記載された成分からなる本発明の組成物が存在すること、ならびに記載された処理工程から本質的になる本発明にしたがうプロセスおよび方法、または記載された処理工程からなる本発明にしたがうプロセスおよび方法が存在することが、企図される。

本開示において、構成要素もしくは成分が、記載された構成要素もしくは成分のリストに含まれ、かつ／または記載された構成要素もしくは成分のリストから選択されると言われている場合、その構成要素もしくは成分が、記載された構成要素もしくは成分のうちのいずれか１つであり得るか、またはその構成要素もしくは成分が、記載された構成要素もしくは成分のうちの２つ以上からなる群より選択され得ることが、理解されるべきである。

さらに、本明細書において記載されている組成物または方法の構成要素および／もしくは特徴は、本明細書において明示されているか暗示されているかに関係なく、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく種々の方法で組み合わせられ得ることが、理解されるべきである。例えば、特定の化合物に言及がされる場合、その化合物は、そうではないことが文脈から理解されない限りは、本発明の組成物および／または本発明の方法の種々の実施形態において、使用され得る。換言すると、本開示において、明確で正確な開示が記載され描写されることを可能にする様式で実施形態が記載され示されているが、実施形態は、本教示および本発明から逸脱することなく、種々に組み合わされてもよく、または別々であってもよいことが、意図され、理解される。例えば、本明細書において記載され示されているすべての特徴は、本明細書において記載され示されている発明のすべての局面に適用可能であり得ることが、理解される。

表現「のうちの少なくとも１つ」は、そうではないことがその文脈および使用から理解されない限りは、その表現の前に記載された目的語の各々を個別に含み、それらの記載された目的語のうちの２つ以上の種々の組合せを含むことが、理解されるべきである。３つ以上の記載された目的語と組み合わされた表現「および／または（および／もしくは）（および／あるいは）（ならびに／もしくは）（ならびに／または）（ならびに／あるいは）」は、そうではないことが文脈から理解されない限りは、同じ意味を有すると理解されるべきである。

用語「含む（含有する）（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（含有する）（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（含有する）（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｅ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（含有する）（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含む（含有する）（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」または「含む（含有する）（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（これらの文法上の同等物を含む）の使用は、そうではないことが具体的に記載されるかまたは文脈から理解されない限りは、制限がなく非限定的である（例えば、記載されていない追加的な構成要素も工程も排除しない）として一般的には理解されるべきである。

用語「約」の使用が量的値の前である場合、本発明は、そうではないことが具体的に記載されない限りは、その特定の量的値自体も含む。本明細書において使用される場合、用語「約」とは、そうではないことが示されることも推認されることもない限りは、その公称値から±１０％の変動を指す。

工程の順序またはある特定の動作を実施する順序は、本発明が作動可能なままである限りは重要ではないことが、理解されるべきである。さらに、２つ以上の工程または動作が、同時に実行され得る。

本明細書におけるあらゆるすべての例または例示的な言葉（例えば、「例えば（など）（ｓｕｃｈ ａｓ）」もしくは「含む（挙げられる）（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」）の使用は、単に本発明をより良く示すことが意図されるに過ぎず、これらの使用は、特許請求されない限りは、本発明の範囲に対して制限を課さない。本明細書中のどの語も、特許請求されていないなんらかの構成要素が本発明の実施にとって必須であると示すとは、解釈されるべきではない。

（実施例）
ここに一般的に記載されている開示は、以下の実施例を参照することによってより容易に理解される。以下の実施例は、本開示のある特定の局面および実施形態を単に例示することを目的として含まれているに過ぎず、いかなる方法でも本開示の範囲を限定することは意図されない。

（実施例１）
本実施例の目的は、インビトロ系において、ＭＤ５マイクロジストロフィンの天然コード配列（配列番号８）のタンパク質発現と、ＭＤ５マイクロジストロフィンの合成コドン最適化コード配列（配列番号１）のタンパク質発現とを比較することである。

本実施例において、Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞を筋管へと３日間分化させ、その後、１．８×１０^７ベクターゲノム／細胞のｒＡＶＶに感染させた。このｒＡＶＶは、ＡＡＶｈｕ３７カプシドと、このＡＡＶｈｕ３７カプシド中にパッケージングされたベクターゲノムとを含み、このベクターゲノムは、ＭＤ５マイクロジストロフィンの天然コード配列（配列番号８）またはＭＤ５マイクロジストロフィンの合成コドン最適化コード配列（配列番号１）のいずれかをコードした。細胞を感染の９６時間後に収集し、細胞タンパク質を単離した。マイクロジストロフィンタンパク質発現レベルを、市販のヒトジストロフィン特異的抗体を使用して、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）ＥＬＩＳＡによって決定した。生のＭＳＤ ＥＬＩＳＡ読取り値を天然マイクロジストロフィン群の平均値に対して正規化し、倍数変化として表した。

図２に示すとおり、マイクロジストロフィンの合成コドン最適化コード配列（配列番号１）は、マイクロジストロフィンの天然コード配列と比較して統計的に有意な（ｐ＜０．０００１）、タンパク質発現のおよそ７倍への増加を示した（ｎ＝２）。コード配列の差のほかは、そのｒＡＶＶの他のすべての成分は同一であり、このことは、配列番号１の合成コドン最適化コード配列の使用がタンパク質発現において観察された改善の原因であったことを示唆した。

（参照による援用）
本明細書において参照された特許文書および科学論文の各々の開示全体が、すべての目的のために参照により援用される。

（均等物）
本開示は、本開示の趣旨からも必須の特徴からも逸脱することなく、他の特定の形態で実施され得る。したがって、上記の実施形態は、あらゆる点で、本明細書において記載されている開示を限定するのではなく例示すると考えられるべきである。別々の実施形態の種々の構成要素および種々の開示された方法の工程は、種々に組合せおよび置換して利用され得、そのようなすべての変化形は、本開示の形態であると考えられるべきである。したがって、本開示の範囲は、上記の説明によってではなく添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等な意味および範囲内にあるすべての変更は、特許請求の範囲内に含まれると意図される。

（配列表）

Claims (70)

1. 組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、
   ＡＡＶカプシドと、
   該ＡＡＶカプシド中にパッケージングされたベクターゲノムと
   を含み、該ベクターゲノムは、配列番号１と少なくとも９９％同一な核酸配列を含む、
   組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
2. 前記核酸配列が、配列番号１に示されている配列を含む、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
3. 前記ＡＡＶカプシドが血清型ｈｕ３７、８、１、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、ｒｈ１０、またはｒｈ７４のＡＡＶに由来する、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
4. 前記ＡＡＶカプシドがｈｕ３７カプシドである、請求項３に記載のｒＡＡＶ。
5. 前記ＡＡＶカプシドがＡＡＶ８カプシドである、請求項３に記載のｒＡＡＶ。
6. 前記ＡＡＶカプシドがＡＡＶ９カプシドである、請求項３に記載のｒＡＡＶ。
7. 前記パッケージングされたベクターゲノムが筋特異的制御エレメントをさらに含む、前述の請求項のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
8. 前記筋特異的制御エレメントがＣＫ８プロモーター、ＣＫ７プロモーター、ＣＫ９プロモーター、筋特異的クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、切断型ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、ハイブリッドα－ミオシン重鎖エンハンサー－／ＭＣＫ（ＭＨＣＫ７）エンハンサー－プロモーター、ヒト骨格筋アクチン遺伝子エレメント、心筋アクチン遺伝子エレメント、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ｍｅｆ、Ｃ５－１２、マウスクレアチンキナーゼエンハンサーエレメント、骨格筋速筋型トロポニンｃ遺伝子エレメント、遅筋型・心筋型トロポニンｃ遺伝子エレメント、遅筋型トロポニンｉ遺伝子エレメント、低酸素誘導性核因子、ステロイド誘導性エレメント、およびグルココルチコイド応答エレメントから選択される、請求項７に記載のｒＡＡＶ。
9. 前記筋特異的制御エレメントがＣＫ８プロモーターである、請求項８に記載のｒＡＡＶ。
10. 前記ＣＫ８プロモーターが、配列番号６に示されている配列を含む、請求項９に記載のｒＡＡＶ。
11. 前記筋特異的制御エレメントがハイブリッドα－ミオシン重鎖エンハンサー－／ＭＣＫ（ＭＨＣＫ７）エンハンサー－プロモーターである、請求項８に記載のｒＡＡＶ。
12. 前記ＭＨＣＫ７エンハンサー－プロモーターが、配列番号７に示されている配列を含む、請求項１１に記載のｒＡＡＶ。
13. 前記パッケージングされたベクターゲノムが５’－ＩＴＲ配列をさらに含む、前述の請求項のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
14. 前記パッケージングされたベクターゲノムが３’－ＩＴＲ配列をさらに含む、前述の請求項のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
15. 前記５’－ＩＴＲ配列および／または３’－ＩＴＲ配列がＡＡＶ２に由来する、請求項１３または１４に記載のｒＡＡＶ。
16. 前記５’－ＩＴＲ配列および／または３’－ＩＴＲ配列が非ＡＡＶ２供給源に由来する、請求項１３または１４に記載のｒＡＡＶ。
17. 前記パッケージングされたベクターゲノムが１つまたは複数のイントロン配列をさらに含む、前述の請求項のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
18. 前記イントロンがＳＶ４０スモールＴイントロン、ウサギヘモグロビンサブユニットβ（ｒＨＢＢ）イントロン、ヒトβ－グロビン／ＩｇＧキメライントロン、ヒトβグロビンＩＶＳ２イントロン、およびｈＦＩＸイントロンから選択される、請求項１７に記載のｒＡＡＶ。
19. 前記パッケージングされたベクターゲノムがポリアデニル化シグナル配列をさらに含む、前述の請求項のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
20. 前記ポリアデニル化シグナル配列が合成ポリアデニル化シグナル配列、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列、およびウサギβグロビンポリアデニル化シグナル配列から選択される、請求項１９に記載のｒＡＡＶ。
21. 前記ポリアデニル化シグナル配列が合成ポリアデニル化シグナル配列である、請求項２０に記載のｒＡＡＶ。
22. 前記合成ポリアデニル化シグナル配列が、配列番号９に示されている配列を含む、請求項２１に記載のｒＡＡＶ。
23. 前記パッケージングされたベクターゲノムが、配列番号３に示されている配列を含む、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
24. 組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、
    ＡＡＶｈｕ３７カプシドと、
    該ＡＡＶｈｕ３７カプシド中にパッケージングされたベクターゲノムと
    を含み、該ベクターゲノムは、配列番号１０に示されているＭＤ５マイクロジストロフィンポリペプチドをコードする核酸配列を含む、
    組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
25. 前記ＭＤ５マイクロジストロフィンポリペプチドをコードする核酸配列が、配列番号１と少なくとも９９％同一な配列を含む、請求項２４に記載のｒＡＡＶ。
26. 前記ＭＤ５マイクロジストロフィンポリペプチドをコードする核酸配列が、配列番号１に示されている配列を含む、請求項２４に記載のｒＡＡＶ。
27. 前記パッケージングされたベクターゲノムが筋特異的制御エレメントをさらに含む、請求項２４～２６のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
28. 前記筋特異的制御エレメントがＣＫ８プロモーター、ＣＫ７プロモーター、ＣＫ９プロモーター、筋特異的クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、切断型ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、ハイブリッドα－ミオシン重鎖エンハンサー－／ＭＣＫ（ＭＨＣＫ７）エンハンサー－プロモーター、ヒト骨格筋アクチン遺伝子エレメント、心筋アクチン遺伝子エレメント、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ｍｅｆ、Ｃ５－１２、マウスクレアチンキナーゼエンハンサーエレメント、骨格筋速筋型トロポニンｃ遺伝子エレメント、遅筋型・心筋型トロポニンｃ遺伝子エレメント、遅筋型トロポニンｉ遺伝子エレメント、低酸素誘導性核因子、ステロイド誘導性エレメント、およびグルココルチコイド応答エレメントから選択される、請求項２７に記載のｒＡＡＶ。
29. 前記筋特異的制御エレメントがＣＫ８プロモーターである、請求項２８に記載のｒＡＡＶ。
30. 前記ＣＫ８プロモーターが、配列番号６に示されている配列を含む、請求項２９に記載のｒＡＡＶ。
31. 前記筋特異的制御エレメントがハイブリッドα－ミオシン重鎖エンハンサー－／ＭＣＫ（ＭＨＣＫ７）エンハンサー－プロモーターである、請求項２８に記載のｒＡＡＶ。
32. 前記ＭＨＣＫ７エンハンサー－プロモーターが、配列番号７に示されている配列を含む、請求項３１に記載のｒＡＡＶ。
33. 前記パッケージングされたベクターゲノムが５’－ＩＴＲ配列をさらに含む、請求項２４～３２のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
34. 前記パッケージングされたベクターゲノムが３’－ＩＴＲ配列をさらに含む、請求項２４～３２のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
35. 前記５’－ＩＴＲ配列および／または３’－ＩＴＲ配列がＡＡＶ２に由来する、請求項３３または３４に記載のｒＡＡＶ。
36. 前記５’－ＩＴＲ配列および／または３’－ＩＴＲ配列が非ＡＡＶ２供給源に由来する、請求項３３または３４に記載のｒＡＡＶ。
37. 前記パッケージングされたベクターゲノムが１つまたは複数のイントロン配列をさらに含む、請求項２４～３６のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
38. 前記イントロンがＳＶ４０スモールＴイントロン、ウサギヘモグロビンサブユニットβ（ｒＨＢＢ）イントロン、ヒトβ－グロビン／ＩｇＧキメライントロン、ヒトβグロビンＩＶＳ２イントロン、およびｈＦＩＸイントロンから選択される、請求項３７に記載のｒＡＡＶ。
39. 前記パッケージングされたベクターゲノムがポリアデニル化シグナル配列をさらに含む、請求項２４～３８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
40. 前記ポリアデニル化シグナル配列が合成ポリアデニル化シグナル配列、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列、およびウサギβグロビンポリアデニル化シグナル配列から選択される、請求項３９に記載のｒＡＡＶ。
41. 前記ポリアデニル化シグナル配列が合成ポリアデニル化シグナル配列である、請求項４０に記載のｒＡＡＶ。
42. 前記合成ポリアデニル化シグナル配列が、配列番号９に示されている配列を含む、請求項４１に記載のｒＡＡＶ。
43. 前記パッケージングされたベクターゲノムが、配列番号３に示されている配列を含む、請求項２４に記載のｒＡＡＶ。
44. 前述の請求項のいずれか一項に記載のｒＡＡＶと、薬学的に受容可能なキャリアとを含む、組成物。
45. ヒト対象における筋ジストロフィーを処置する方法であって、
    該ヒト対象に治療有効量の請求項１～４３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶまたは請求項４４に記載の組成物を投与する工程
    を含む、方法。
46. ヒト対象における筋ジストロフィーを処置する方法であって、
    該ヒト対象にＩｇＧ分解性プロテアーゼを先に投与し、その後、治療有効量の請求項１～４３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶまたは請求項４４に記載の組成物を投与する工程
    を含む、方法。
47. ヒト対象における筋ジストロフィーを処置する方法であって、該ヒト対象にはＩｇＧ分解性プロテアーゼが投与済みであり、該方法は、
    治療有効量の請求項１～４３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶまたは請求項４４に記載の組成物を投与する工程
    を含む、方法。
48. 前記ＩｇＧ分解性プロテアーゼがＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓのＩｄｅＳまたはその操作されたバリアントである、請求項４６または４７に記載の方法。
49. 前記ＩｇＧ分解性プロテアーゼがＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉのＩｄｅＺまたはその操作されたバリアントである、請求項４６または４７に記載の方法。
50. 前記筋ジストロフィーがジストロフィン遺伝子中の変異によって引き起こされている、請求項４５～４９のいずれか一項に記載の方法。
51. 前記筋ジストロフィーがデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー、およびＸ連鎖性拡張型心筋症から選択される、請求項５０に記載の方法。
52. 前記ｒＡＡＶまたは前記組成物が、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、皮内投与、腹腔内投与、または髄腔内投与される、請求項４５～５１のいずれか一項に記載の方法。
53. 前記ｒＡＡＶまたは前記組成物が静脈内投与される、請求項５２に記載の方法。
54. 前記ｒＡＡＶまたは前記組成物が筋肉内投与される、請求項５２に記載の方法。
55. 前記ｒＡＡＶが１回の投与量約１×１０^１２ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇ～約１×１０^１６ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇで投与される、請求項４５～５４のいずれか一項に記載の方法。
56. 前記ｒＡＡＶが１回の投与量約１×１０^１３ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇ～約１×１０^１５ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇで投与される、請求項５５に記載の方法。
57. 前記ｒＡＡＶが１回の投与量約１×１０^１４ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇで投与される、請求項５６に記載の方法。
58. 配列番号１の配列と少なくとも９９％同一な核酸配列を含むポリヌクレオチド。
59. 配列番号１に示されている核酸配列を含むポリヌクレオチド。
60. 配列番号１に示されている核酸配列からなるポリヌクレオチド。
61. 配列番号３の配列と少なくとも９９％同一な核酸配列を含むポリヌクレオチド。
62. 配列番号３に示されている核酸配列を含むポリヌクレオチド。
63. 配列番号３に示されている核酸配列からなるポリヌクレオチド。
64. 請求項５８～６３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
65. ＨｅＬａ細胞、Ｃｏｓ－７細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ａ５４９細胞、ＢＨＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＲＤ細胞、ＨＴ－１０８０細胞、ＡＲＰＥ－１９細胞、およびＭＲＣ－５細胞から選択される、請求項６４に記載の宿主細胞。
66. ＨｅＬａ細胞である、請求項６５に記載の宿主細胞。
67. 前記ＨｅＬａ細胞が、１つまたは複数の内在性遺伝子を不活化するように操作済みである、請求項６６に記載の宿主細胞。
68. 前記内在性遺伝子がＫＣＮＮ２、ＲＧＭＡ、ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、およびＮＡＬＣＮ－ＡＳ１から選択される、請求項６７に記載の宿主細胞。
69. 前記内在性遺伝子がＲＧＭＡである、請求項６８に記載の宿主細胞。
70. 前記内在性遺伝子がＫＣＮＮ２である、請求項６８に記載の宿主細胞、

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