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TW201805308A - 結合β-ＫＬＯＴＨＯ，ＦＧＦ受體及其複合物之人類抗原結合蛋白 - Google Patents

結合β-ＫＬＯＴＨＯ，ＦＧＦ受體及其複合物之人類抗原結合蛋白 Download PDF

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TW201805308A
TW201805308A TW106117037A TW106117037A TW201805308A TW 201805308 A TW201805308 A TW 201805308A TW 106117037 A TW106117037 A TW 106117037A TW 106117037 A TW106117037 A TW 106117037A TW 201805308 A TW201805308 A TW 201805308A
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TW106117037A
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岸恩 福特茲
伽德維克 泰倫斯 金恩
李洋
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安美基公司
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Abstract

本發明提供與活化FGF21介導之信號傳導之抗原結合蛋白有關或自其衍生的組合物及方法。在實施例中，抗原結合蛋白特異性結合至(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物。在一些實施例中，抗原結合蛋白誘導類似FGF21信號傳導。在一些實施例中，抗原結合蛋白為全人類、人類化或嵌合抗體、該等抗體之結合片段及衍生物、及特異性結合至以下之多肽：(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物。其他實施例提供編碼該等抗原結合蛋白及其片段及衍生物及多肽之核酸、包含該等聚核苷酸之細胞、製造該等抗原結合蛋白及其片段及衍生物及多肽之方法，及使用該等抗原結合蛋白及其片段及衍生物及多肽之方法，該等方法包括治療或診斷罹患2型糖尿病、肥胖症、NASH、代謝症候群及相關病症或病狀之個體的方法。

Description

結合β-KLOTHO,FGF受體及其複合物之人類抗原結合蛋白
本發明係關於編碼抗原結合蛋白之核酸分子，該等抗原結合蛋白結合至(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物。本發明亦提供抗原結合蛋白，其結合至：(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物，包括誘導類似FGF21信號傳導之抗原結合蛋白；以及醫藥組合物，其包含抗原結合蛋白，該等蛋白結合至(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物，包括誘導類似FGF21信號傳導之抗原結合蛋白；及使用該等核酸、多肽或醫藥組合物治療代謝病症之方法。亦提供使用該等抗原結合蛋白之診斷方法。
本申請案主張2009年12月7日申請之美國臨時申請案第61/267,321號及2010年9月10日申請之美國臨時申請案第61/381,846號之權利，該等文獻以引用的方式併入本文中。
本申請案含有經由EFS-Web以ASCII格式提交且以全文引用方式併入本文中之序列表。將2010年11月24日創建之該ASCII複本命名為A1519NP.txt且大小為645,894位元組。
纖維母細胞生長因子21(FGF21)為屬於包括FGF19、FGF21及FGF23之纖維母細胞生長因子(FGF)子家族的分泌多肽(Itoh等人，(2004)Trend Genet. 20 ：563-69)。FGF21為非典型FGF，因為其不依賴肝素且在葡萄糖、脂質及能量代謝之調節中起激素作用。
其高度表現於肝臟及胰臟中且為FGF家族中主要表現於肝臟之唯一成員。過度表現FGF21之轉殖基因小鼠展現緩慢生長速率、低血漿葡萄糖及三酸甘油酯含量以及不存在年齡相關之2型糖尿病、胰島增生及肥胖症之代謝表型。重組FGF21蛋白於齧齒動物及靈長類動物模型中之藥理學投與使得血漿葡萄糖含量正常化、三酸甘油酯及膽固醇含量降低及葡萄糖耐受性及胰島素敏感性提高。此外，FGF21藉由增加能量消耗、身體活動及代謝率而減少體重及體脂肪。實驗研究為治療人類之2型糖尿病、肥胖症、血脂異常及其他代謝病狀或病症之FGF21藥理學投與提供支持。
FGF21為源自肝臟之內分泌激素，其經由活化其受體來刺激脂肪細胞中葡萄糖吸收及脂質內穩定。有趣的是，除典型FGF受體外，FGF21受體亦包含膜相關之β-Klotho作為必需輔因子。FGF21受體之活化對許多代謝參數產生多種作用。
在哺乳動物中，FGF經由一組四個FGF受體FGFR1-FGFR4介導其作用，該等FGF受體又在多個剪接變異體例如FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中表現。FGF受體各含有配位體結合時活化之細胞內酪胺酸激酶域，從而產生涉及MAPK(Erk1/2)、RAF1、AKT1及STAT之下游信號傳導路徑。(Kharitonenkov等人，(2008)BioDrugs 22 ：37-44)。若干報導表明FGFR1-3之「c」-報導體剪接變異體展現與β-Klotho之特定親和力且可充當FGF21之內源性受體(Kurosu等人，(2007)J.Biol.Chem. 282 ：26687-26695；Ogawa等人，(2007)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 104 ：7432-7437；Kharitonenkov等人，(2008)J.Cell Physiol. 215 ：1-7)。在大量表現β-Klotho與FGFR4之肝臟中，雖然FGF21與β-Klotho-FGFR4複合物穩固結合，但FGF21不會誘導MAPK磷酸化。在3T3-L1細胞及白色脂肪組織中，FGFR1為到目前為止最豐富之受體，且因此很可能此組織中FGF21之主要功能受體為β-Klotho/FGFR1c複合物。
本發明提供誘導類似FGF21信號傳導之人類(或人類化)抗原結合蛋白，諸如單株抗體，例如模擬FGF21功能之促效抗體。該種抗體為具有類似FGF21活性及選擇性之分子，但亦具有對於抗體而言在治療上合乎需要之額外典型特徵，諸如蛋白質穩定性、缺乏免疫原性、易於產生及活體內半衰期長。
本發明提供誘導FGF21介導之信號傳導的分離之抗原結合蛋白。
亦提供分離之抗原結合蛋白，其特異性結合至以下中之至少一者：(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；及(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物，其中該抗原結合蛋白誘導FGF21介導之信號傳導。
在一實施例中，提供之抗原結合蛋白包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：(a)包含選自由以下組成之群的序列之輕鏈CDR3：(i)與選自由L1-L18之輕鏈CDR3序列組成之群的CDR3序列相差總計不超過三個胺基酸添加、取代及/或缺失的輕鏈CDR3序列，SEQ ID NO：180-194；(ii)QVWDX1 X2 SDHVV(SEQ ID NO：276)；(iii)QQX3GX4 X5 X6 X7 T(SEQ ID NO：283)；(iv)LQHNSYPLT(SEQ ID NO：267)；(v)MQSLQTPFT(SEQ ID NO：268)；(vi)QQYNNWPPT(SEQ ID NO：269)；(vii)MQSIQLPRT(SEQ ID NO：270)；(viii)QQANDFPIT(SEQ ID NO：271)；(ix)MQALQTPCS(SEQ ID NO：272)；(b)包含選自由以下組成之群的序列之重鏈CDR3序列：(i)與選自由 H1-H18之重鏈CDR3序列組成之群的CDR3序列相差總計不超過四個胺基酸添加、取代及/或缺失的重鏈CDR3序列，SEQ ID NO：145-157；(ii)X34 X16 X17 X18 GX19 YYYX20 GMDV(SEQ ID NO：322)；(iii)SLIVVX21 VY X22 LDX23 (SEQ ID NO：326)；(iv)IVVVPAAIQSYYYYYGMGV(SEQ ID NO：311)；(v)PDGDYYYYGMDV(SEQ ID NO：312)；(vi)TYSSGWYVWDYYGMDV(SEQ ID NO：313)；(vii)DRVLSYYAMAV(SEQ ID NO：314)；(viii)VRIAGDYYYYYGMDV(SEQ ID NO：315)；(ix)ENIVVIP AAIFAGWFDP(SEQ ID NO：316)；及(x)DRAAAGLHYYYGMDV(SEQ ID NO：317)；或(c)該(a)之輕鏈CDR3序列及該(b)之重鏈CDR3序列；其中X1 為G、S或N；X2 為N、S或T；X3 為C、Y或S；X4 為G或S；X5 為A或S；X6 為P或F；X7 為L或不存在；X34 為I、V或S；X16 為L或V；X17 為L、T或V；X18 為L、V、G或T；X19 為A、G或不存在；X20 為Y、C或D；X21 為I或M；X22 為A或V；且X23 為H或Y；且其中該抗原結合蛋白特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物。
在另一實施例中，提供之抗原結合蛋白包含：(a)選自由以下組成之群的輕鏈CDR1序列：(i)與L1-L18之CDR1序列相差不超過三個胺基酸添加、取代及/或缺失之輕鏈CDR1，SEQ ID NO：158-170；(ii)RASQ X9 X10 X11 X12 X13 X14 LA(SEQ ID NO：304)；(iii)GGNNIGSX15 SVH(SEQ ID NO：307)；(iv)RSSQSLLX29 X30 NGX31 X32 X33 LD(SEQ ID NO：310)；(v)RASQSVNSNLA(SEQ ID NO：295)；(vi)RASQDIRYDLG(SEQ ID NO：296)；(vii)RASQGISIWLA(SEQ ID NO：297)；及(viii)KSSQSLLQSDGKTYLY(SEQ ID NO：298)；(b)選自由以下組成之群的輕鏈CDR2序列：(i)與L1-L18之CDR2序列相差不超過兩個胺基酸添加、取代及/或缺失之輕鏈CDR2，SEQ ID NO：171-179；(ii)LGSX27 RAS(SEQ ID NO：290)；(iii)GX8 SX28 RAT(SEQ ID NO：294)；(iv)AASSLQS(SEQ ID NO：284)；(v)GVSTRAT(SEQ ID NO：285)；(vi)DDSDRPS(SEQ ID NO：286)；(vii)EVSNRFS(SEQ ID NO：287)；(c)選自由以下組成之群的重鏈CDR1序列：(i)與H1-H18之CDR1序列相差不超過兩個胺基酸添加、取代及/或缺失之重鏈CDR1，SEQ ID NO：121-131；及(ii)NARMGVX39 (SEQ ID NO：352)；(iii)X40 YGIH(SEQ ID NO：355)；(iv)DLSMH(SEQ ID NO：345)；(v)DAWMS(SEQ ID NO：346)；(vi)TYAMS(SEQ ID NO：347)；(vii)SYFWS(SEQ ID NO：348)；(viii)SYYWS(SEQ ID NO：131)；(ix)SGGYNWS(SEQ ID NO：349)；(d)選自由以下組成之群的重鏈CDR2：(i)與H1-H18之CDR2序列相差不超過三個胺基酸添加、取代及/或缺失之重鏈序列，SEQ ID NO：132-144；(ii)HIFSNDEKSYSTSLKX24 (SEQ ID NO：333)；(iii)X25 ISGSGVSTX26 YADSVKG(SEQ ID NO：338)；(iv)VIWYDGSX35 KYYX36 DSVKG(SEQ ID NO：341)；(v)X37 IYX38 SGSTX41 YNPSLKS(SEQ ID NO：344)；(vi)GFDPEDGETIYAQKFQG(SEQ ID NO：327)；(vii)RIKSKTDGGTTDYAAPVKG(SEQ ID NO：328)；(viii)RIYTSGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO：329)；(ix)RIKSKDGG TTDYAAPVKG(SEQ ID NO：330)；(x)RIKSKX42 DGGTTD YAAPVKG(SEQ ID NO：483)；其中X9 為N或S；X10 為V或F；X11 為D或S；X12 為G或S；X13 為S、N或T；X14 為S或Y；X15 為E或Q；X29 為Y或H；X30 為Y或S；X31 為F或Y；X32 為T或N；X33 為Y或F；X27 為N或D；X8 為A或T；X28 為S或F；X39 為S或N；X24 為S或N；X25 為G或A；X26 為H、Y或N；X35 為D或I；X36 為A或G；X37 為N或R；X38 為Y或T；X41 為Y或N；X42 為T或不存在；(e)該(a)之輕鏈CDR1及該(b)之輕鏈CDR2；(f)該(a)之輕鏈CDR1及該(c)之重鏈CDR1；(g)該(a)之輕鏈CDR1及該(d)之重鏈CDR2；(h)該(b)之輕鏈CDR1及該(c)之重鏈CDR1；(i)該(c)之重鏈CDR1及該(d)之重鏈CDR2；(j)該(b)之輕鏈CDR2及該(d)之重鏈CDR2； (k)該(a)之輕鏈CDR1、該(b)之輕鏈CDR2及該(c)之重鏈CDR1；(1)該(b)之輕鏈CDR2、該(c)之重鏈CDR1及該(d)之重鏈CDR2；(m)該(a)之輕鏈CDR1、該(c)之重鏈CDR1及該(d)之重鏈CDR2；或(n)該(a)之輕鏈CDR1、該(b)之輕鏈CDR2、該(c)之重鏈CDR2及該(d)之重鏈CDR2，其中該抗原結合蛋白特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物。
在另一實施例中，提供之抗原結合蛋白包含：(a)包含以下之輕鏈可變域：(i)選自SEQ ID NO：158-170之輕鏈CDR1序列；(ii)選自SEQ ID NO：171-179之輕鏈CDR2序列；(iii)選自SEQ ID NO：180-194之輕鏈CDR3序列；及(b)包含以下之重鏈可變域：(i)選自SEQ ID NO：121-131之重鏈CDR1序列；(ii)選自SEQ ID NO：132-144之重鏈CDR2序列；及(iii)選自SEQ ID NO：145-157之重鏈CDR3序列；或(c)該(a)之輕鏈可變域及該(b)之重鏈可變域，其中該抗原結合蛋白特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物.
在另一實施例中，提供之抗原結合蛋白包含：(a)選自由以下組成之群的輕鏈可變域序列：(i)序列與選自SEQ ID NO：48-65之VL 1-VL 18之輕鏈可變域序列至少80%一致之胺基酸；(ii)藉由與編碼SEQ ID NO：48-65之VL 1-VL 18之輕鏈可變域序列的聚核苷酸序列至少80%一致之聚核苷酸序列編碼之胺基酸序列；(b)選自由以下組成之群的重鏈可變域序列：(i)與SEQ ID NO：66-84之VH 1-VH 18之重鏈可變域序列至少80%一致之胺基酸序列；(ii)藉由與編碼SEQ ID NO：66-84之VH 1-VH 18之重鏈可變域序列的聚核苷酸序列至少80%一致之聚核苷酸序列編碼之胺基酸序列；或(c)該(a)之輕鏈可變域及該(b)之重鏈可變域；其中該抗原結合蛋白特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、 FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物。在特定實施例中，提供之抗原結合蛋白包含：(a)選自由以下組成之群的輕鏈可變域序列：SEQ ID NO：48-65之VL 1-VL 18；(b)選自由以下組成之群的重鏈可變域序列：SEQ ID NO：66-84之VH 1-VH 18；或(c)該(a)之輕鏈可變域及該(b)之重鏈可變域，其中該抗原結合蛋白特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物。在其他特定實施例中，提供之抗原結合蛋白、輕鏈可變域及重鏈可變域係選自由以下組成之組合群：VL 1VH 1、VL 2VH 2、VL 3VH 3、VL 3VH 4、VL 4VH 5、VL 5VH 6、VL 6VH 7、VL 7VH 8、VL 8VH 8、VL 9VH 9、VL 9VH 10、VL 10VH 11、VL 11VH 11、VL 12VH 12、VL 13VH 13、VL 14VH 14、VL 15VH 15、VL 16VH 16、VL 17VH 17及VL 18VH 18，其中該抗原結合蛋白特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物。在其他實施例中，提供之抗原結合蛋白另外包含：(a)SEQ ID NO：10之輕鏈恆定序列；(b)SEQ ID NO：11之輕鏈恆定序列；(c)SEQ ID NO：9之重鏈恆定序列；或(d)SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11之輕鏈恆定序列及SEQ ID NO：9之重鏈恆定序列。
提供之抗原結合蛋白可呈許多形式，且可為例如人類抗體、人類化抗體、嵌合抗體、單株抗體、多株抗體、重組抗體、抗原結合抗體片段、單鏈抗體、微型雙功能抗體、微型三功能抗體、微型四功能抗體、Fab片段、F(fab')2 片段、域抗體、IgD抗體、IgE抗體、IgM抗體、IgG1抗體、IgG2抗體、IgG3抗體、IgG4抗體或在鉸鏈區中具有至少一個突變之IgG4抗體。
在另一實施例中，提供之抗原結合蛋白當結合至(i)β-Klotho；(ii) FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物時：(a)以與參考抗體實質上相同之Kd結合至(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物；(b)如ELK螢光素酶報導體檢定所量測，其所誘導的類似FGF21信號傳導為包含SEQ ID NO：2之成熟形式之野生型FGF21標準物所誘導信號傳導的10%或10%以上；(c)在選自由以下組成之群的檢定中所展現類似FGF21信號傳導之EC50為10nM或10nM以下：(i)FGFR1c/β-Klotho介導之活體外基於重組細胞之檢定；及(ii)活體外人類脂肪細胞功能檢定；(d)在β-Klotho存在下，在活體外重組FGFR1c受體介導之報導體檢定中，所展現對FGFR1c之促效活性之EC50小於10nM；及(e)在無β-Klotho存在下，在活體外重組FGFR1c受體介導之報導體檢定中，所展現對FGFR1c之促效活性之EC50大於1μM；或(f)與參考抗體競爭結合至(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物，其中該參考抗體包含選自由以下組成之群的輕鏈及重鏈可變域序列之組合：VL 1VH 1、VL 2VH 2、VL 3VH 3、VL 3VH 4、VL 4VH 5、VL 5VH 6、VL 6VH 7、VL 7VH 8、VL 8VH 8、VL 9VH 9、VL 9VH 10、VL 10VH 11、VL 11VH 11、VL 12VH 12、VL 13VH 13、VL 14VH 14、VL 15VH 15、VL 16VH 16、VL 17VH 17及VL 18VH 18。在其他實施例中，提供之抗原結合蛋白當結合至(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物時可：(a)降低動物模型中之血糖；(b)降低動物模型中之血清脂質含量；(c)降低動物模型中之胰島素含量；或(d)(a)及(b)及(c)中之兩者或兩者以上。
在特定實施例中，提供之抗原結合蛋白包含：(a)包含SEQ ID NO：31、32、390-401、404-405中之一者之重鏈；(b)包含SEQ ID NO：13、14、385-389、402-403中之一者之輕鏈；或(c)包含(a)之重鏈及(b)之輕鏈的組合。
亦提供在(a)位置1-80；(b)位置303-522；(c)位置852-1044；及(d)其組合中之至少一處能夠結合野生型人類β-Klotho(SEQ ID NO：7)但不會結合至嵌合形式之β-Klotho的抗原結合蛋白，其中該嵌合形式之β-Klotho包含人類β-Klotho構架，其中鼠類β-Klotho序列替代該等野生型人類殘基。
在另一態樣中，本發明提供在(a)位置1-80；(b)位置303-522；(c)位置852-1044；及(d)其組合中之至少一處能夠結合野生型人類β-Klotho(SEQ ID NO：7)之抗原結合蛋白。
在另一態樣中，本發明提供能夠與技術方案8或13之抗原結合蛋白競爭結合至(a)位置1-80；(b)位置303-522；(c)位置852-1044；及(d)其組合中之至少一處之人類野生型β-Klotho殘基的抗原結合蛋白。
亦提供一種醫藥組合物，其包含一或多種本文提供之抗原結合蛋白與其醫藥學上可接受之載劑混合。
在另一態樣中，亦提供編碼本文所揭示之抗原結合蛋白的分離之核酸分子。在一些情況下，分離之核酸分子可與控制序列操作地連接。在實施例中，該等核酸包含編碼本文提供之抗原結合蛋白之輕鏈可變域、重鏈可變域或兩者之聚核苷酸序列。在特定實施例中，該等核酸包含(a)VL 1-VL 18(SEQ ID NO：48-65)；(b)VH 1-VH 18(SEQ ID NO：66-84)；或(c)一或多個(a)之序列及一或多個(b)之序列。
在另一態樣中，亦提供表現載體及用該等表現載體轉型或轉染之宿主細胞，該等表現載體包含編碼本文所揭示之抗原結合蛋白之前述分離之核酸分子。
在另一態樣中，亦提供製備特異性地或選擇性地結合(i) β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物的抗原結合蛋白之方法，且包含由分泌抗原結合蛋白之宿主細胞製備該抗原結合蛋白之步驟。
其他實施例提供預防或治療需要該治療之個體的病狀之方法，其包含向個體投與治療有效量之本文提供之醫藥組合物，其中該病狀可藉由降低血糖、胰島素或血清脂質含量來治療。在實施例中，病狀為2型糖尿病、肥胖症、血脂異常、NASH、心血管疾病或代謝症候群。
本文較詳細描述此等及其他態樣。提供之態樣可各涵蓋多個本文提供之實施例。因此，預期涉及一個要素或要素組合之實施例可各包括在各所述態樣中，且清楚地考慮以上態樣及實施例之所有該等組合。所揭示之抗原結合蛋白及相關方法及組合物之其他特徵、目的及優點在以下實施方式中顯而易見。
圖1A-圖1B為顯示人類FGFR1c(GenBank寄存編號P11362；SEQ ID NO：356)與鼠類FGFR1c(GenBank寄存編號NP_034336；SEQ ID NO：357)之間的序列同源性的比對；突出顯示各種特徵，包括信號肽、跨膜序列、肝素結合區，且提供共同序列(SEQ ID NO：358)。
圖2A-圖2C為顯示人類β-Klotho(GenBank寄存編號NP_783864；SEQ ID NO：359)與鼠類β-Klotho(GenBank寄存編號NP_112457；SEQ ID NO：360)之間的序列同源性的比對；突出顯示各種特徵，包括跨膜序列及兩個糖基水解酶域，且提供共同序列(SEQ ID NO：361)。
圖3為用作免疫原以產生抗原結合蛋白之經FGF21-Alexa 647染色之細胞的流式細胞測量術概況；該圖顯示FGF21R(包含FGFR1c及β-Klotho之複合物)之表現程度及其與FGF21之結合。
圖4為顯示用作免疫原以產生抗原結合蛋白之Fc融合蛋白之序列 (SEQ ID NO：362)；免疫原包含人類FGFR1c之細胞外域(ECD)經由Gly5 連接子(SEQ ID NO：379)融合至IgG1 Fc；FGFR1c組分呈大寫形式，連接子為斜體且加下劃線，且Fc呈小寫字母。
圖5為顯示用作免疫原以產生抗原結合蛋白之Fc融合蛋白之序列(SEQ ID NO：363)；免疫原包含人類β-Klotho之細胞外域(ECD)經由Gly5 連接子(SEQ ID NO：379)融合至IgG1 Fc；β-Klotho組分呈大寫形式，連接子為斜體且加下劃線，且Fc呈小寫字母。
圖6為顯示由包含FGFR1c ECD-Fc及β-Klotho ECD-Fc之可溶性FGF21受體複合物之製劑得到的純度的SDS PAGE凝膠，該複合物用作免疫原以產生抗原結合蛋白。
圖7為由對重組CHO純系2E10執行如本文所述之ELK螢光素酶報導體檢定產生之一系列曲線圖，表明在表現包含FGFR1c及β-Klotho之FGF21受體複合物之重組CHO細胞中一些抗原結合蛋白能誘導類似FGF21信號傳導。
圖8為由如本文所述之ERK1/2磷酸化檢定產生之一系列曲線圖，表明在大鼠L6細胞中一些抗原結合蛋白能夠誘導類似FGF21信號傳導。X軸為抗原結合蛋白之濃度且Y軸為磷酸化ERK1/2佔總ERK1/2之百分比。
圖9為由如本文所述之ERK1/2磷酸化檢定產生之一系列曲線圖，表明L6細胞中之抗原結合蛋白介導之類似FGF21信號傳導具有FGFR1c/β-Klotho特異性。
圖10為由如本文所述之ERK磷酸化檢定產生之一系列曲線圖，表明在人類脂肪細胞中一些抗原結合蛋白能夠誘導類似FGF21信號傳導。
圖11A為一系列結合感應圖(反應單位對比時間)，表明由24H11(A組)及17D8(B組)表示之一些誘導FGF21介導之信號傳導的抗原結合蛋 白在兩個不同但部分重疊之結合位點結合至人類β-Klotho，而不誘導FGF21介導之信號傳導之抗原結合蛋白(2G10、1A2)不結合至此等位點。
圖11B為一系列結合感應圖(反應單位對比時間)，其表明針對由39F7表示之C組抗原結合蛋白鑑別之人類β-Klotho上的第三結合位點。
圖11C顯示實例8中獲得之分類結果。
圖12為一系列結合感應圖(反應單位對比時間)，表明一些誘導FGF21介導之信號傳導的抗原結合蛋白(12E4、24H11、17C3、18B11)干擾β-Klotho結合至FGF21，而其他抗原結合蛋白(21H2、17D8、18G1)不干擾。
圖13為所產生之一些抗原結合蛋白之可變區的比對；鑑別構架及CDR區。圖13分別揭示按外觀排列之SEQ ID NO：364、59、365、60、366、61、367、62、368、57、369、55、51-52、56、56、53-54、63-65、370、58、371、50、50、49、48、372、78、373、66-69、79、374、76、81、375、70、73、73、71-72、376、83、82、84、377、80、378、75及74。
圖14為圖解描繪在肥胖獼猴中執行68天研究之研究設計之示意圖。
圖15為描繪媒劑及16H7對所研究之肥胖獼猴之上午餐食物攝入的影響的曲線圖。
圖16為兩個描繪媒劑及16H7對所研究之肥胖獼猴之水果攝入及下午食物攝入的影響的曲線圖。
圖17為描繪媒劑及16H7對所研究之肥胖獼猴之體重的影響的曲線圖。
圖18為顯示媒劑及16H7對所研究之肥胖獼猴之身體質量指數(BMI)的影響的曲線圖。
圖19為顯示媒劑對所研究之肥胖獼猴之腹圍(AC)的影響的曲線圖。
圖20為顯示媒劑及16H7對所研究之肥胖獼猴之皮膚褶襞厚度(SFT)的影響的曲線圖。
圖21為顯示在所研究之肥胖獼猴之葡萄糖耐受性測試期間媒劑及16H7對葡萄糖含量之影響之曲線圖。
圖22為顯示在所研究之肥胖獼猴之葡萄糖耐受性測試期間媒劑及16H7對血漿胰島素含量之影響之曲線圖。
圖23為顯示媒劑及16H7對所研究之肥胖獼猴之空腹血糖含量的影響的曲線圖。
圖24為顯示媒劑及16H7對所研究之肥胖獼猴之空腹血漿胰島素含量的影響的曲線圖。
圖25為顯示媒劑及16H7對所研究之肥胖獼猴之飽食血漿葡萄糖含量的影響的曲線圖。
圖26為顯示媒劑及16H7對所研究之肥胖獼猴之飽食血漿胰島素含量的影響的曲線圖。
圖27為顯示媒劑及16H7對所研究之肥胖獼猴之空腹血漿三酸甘油酯含量的影響的曲線圖。
圖28為顯示媒劑及16H7對所研究之肥胖獼猴之飽食血漿三酸甘油酯含量的影響的曲線圖。
圖29為描繪被構築且用以研究抗原結合蛋白之結合的人類-小鼠β-Klotho嵌合體的示意圖。
圖30為描繪構築之人類-小鼠β-Klotho嵌合體之示意圖，且亦包括FGF21、16H7、37D3及39F7之定性結合資料。
圖31A-圖31C為描繪所構築之8種16H7及22H5變異體以及22H5及16H7之結合資料之一系列曲線圖。
圖32A-圖32C為描繪用於表明若干22H5及16H7變異體均具有結合能力之ELISA檢定之結果的一系列曲線圖。
圖33為比較所產生之若干22H5及17H7變異體之解離速率的條形圖。
圖34為描繪用FGF21滴定時39F11之結合曲線及用39F11滴定時FGF21之結合曲線的兩個曲線圖；曲線圖表明累加效應。
圖35為描繪用39F11滴定時16H7之結合曲線及用16H7滴定時39F11之結合曲線的兩個曲線圖；曲線圖表明累加效應。
本文使用之章節標題(section heading)係僅出於組織目的且不應視為限制所述標的物。
除非本文另有定義，否則與本申請案結合使用之科學及技術術語應具有由一般熟習此項技術者所通常理解之含義。此外，除非上下文另有所需，否則單數術語應包括複數且複數應包括單數。
一般而言，本文所述之與細胞及組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學及蛋白質與核酸化學及雜交結合使用之命名法及其技術為彼等此項技術中所熟知及常用之命名法及技術。除非另外指出，否則一般根據此項技術中所熟知之習知方法及如本說明書通篇所引用及討論之多種一般及更為具體之參考文獻所描述之方法來執行本發明之方法及技術。參見例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001)；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992)；Harlow及Lane,Antibodies：A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1990)，該等文獻以引用的方式併入本文中。根據製造商之說明書如此項技術中通常所實現或如本文中所述來執行 酶促反應及純化技術。本文所述之與分析化學、合成有機化學、及醫藥化學結合使用之術語及其實驗室程序與技術為此項技術中所熟知及常用之術語及程序與技術。標準技術係用於化學合成、化學分析、醫藥製備、調配及傳送及患者之治療中。
應瞭解，本發明不限於本文所述之特定方法、方案及試劑等且因而可改變。本文所用之術語僅為描述特定實施例之目的，且並不意欲限制本發明之範疇。
應瞭解，除操作性實例中或其中另有說明之外，本文所使用之表示成分之量或反應條件的所有數字可在所有情況下藉由術語「約」修飾。術語「約」與百分比結合使用時可意謂±5%，例如1%、2%、3%或4%。
I.定義
除非另外明確規定，否則如本文所用之術語「一」意謂「一或多個(種)」。
「抗原結合蛋白」為包含結合至抗原或目標之部分、視情況存在之使抗原結合部分呈現促進抗原結合蛋白結合至抗原之構形的架構或構架部分的蛋白質。抗原結合蛋白之實例包括人類抗體、人類化抗體；嵌合抗體；重組抗體；單鏈抗體；微型雙功能抗體；微型三功能抗體；微型四功能抗體；Fab片段；F(ab')2 片段；IgD抗體；IgE抗體；IgM抗體；IgG1抗體；IgG2抗體；IgG3抗體；或IgG4抗體、及其片段。抗原結合蛋白可包含例如具有移植CDR或CDR衍生物之替代性蛋白質架構或人工架構。該等架構包括(但不限於)包含經引入以例如穩定抗原結合蛋白之三維結構之突變的抗體衍生之架構，以及包含例如生物相容聚合物之全合成架構。參見例如Korndorfer等人，2003,Proteins：Structure,Function,and Bioinformatics ,53 (1)：121-129(2003)；Roque等人，Biotechnol.Prog. 20 ：639-654(2004)。此外，可使用肽抗體模擬 劑(「PAM」)以及基於抗體模擬劑之支架，利用纖維結合蛋白組分作為支架。
抗原結合蛋白可具有例如天然存在之免疫球蛋白之結構。「免疫球蛋白」為四聚分子。在天然存在之免疫球蛋白中，各四聚體由一致之兩對多肽鏈組成，各對具有一個「輕」鏈(約25kDa)及一個「重」鏈(約50-70kDa)。各鏈之胺基末端部分包括主要負責抗原識別之約100至110種或更多胺基酸之可變區。各鏈之羧基末端部分界定主要負責效應功能之恆定區。將人類輕鏈分類成κ及λ輕鏈。將重鏈分類成μ、δ、γ、α或ε，且將抗體之同型分別定義為IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。在輕鏈及重鏈內，由約12種或更多胺基酸之「J」區來連接可變區及恆定區，其中重鏈亦包括約10種或更多胺基酸之「D」區。一般參見Fundamental Immunology，第7章(Paul,W.編，第2版，Raven Press,N.Y.(1989))(其為所有目的以全文引用的方式併入本文中)。各輕/重鏈對之可變區形成抗體結合位點以完整之免疫球蛋白具有兩個結合位點。
天然存在之免疫球蛋白鏈展現由三個高變區接合之相對守構架區(FR)之相同通式結構，該等高變區亦稱為互補決定區或CDR。自N端至C端，輕鏈與重鏈皆包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4域。可根據Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，US Dept.of Health and Human Services,PHS,NIH,NIH公開案第91-3242號，1991之定義將胺基酸分配至各域。CDR亦可視需要根據替代命名方案，諸如Chothia之命名方案重新定義(參見Chothia & Lesk,1987,J.Mol.Biol. 196 ：901-917；Chothia等人，1989,Nature 342 ：878-883或Honegger & Pluckthun,2001,J.Mol.Biol. 309 ：657-670)。
在本發明之上下文中，認為當解離常數(KD )
Figure TW201805308AD00001
10-8 M時抗原結合蛋白「特異性結合」或「選擇性結合」其目標抗原。KD
Figure TW201805308AD00002
5×10-9 M時抗體 以「高親和力」特異性結合抗原，且KD
Figure TW201805308AD00003
5×10-10 M時以「極高親和力」特異性結合抗原。在一實施例中，抗體將以約10-7 M與10-12 M之間的KD 結合至FGFR1c、β-Klotho、FGFR1c與β-Klotho或包含FGFR1c及β-Klotho之複合物，包括人類FGFR1c、人類β-Klotho或人類FGFR1c與人類β-Klotho，且在另一實施例中，抗體將以KD
Figure TW201805308AD00004
5×10-9 結合。
除非另作說明，否則「抗體」係指完整免疫球蛋白或其與完整抗體競爭特異性結合之抗原結合部分。抗原結合部分可藉由重組DNA技術或藉由完整抗體之酶促或化學裂解來產生。抗原結合部分尤其包括Fab，Fab'、F(ab')2 、Fv、域抗體(dAb)、包括互補決定區(CDR)之片段、單鏈抗體(scFv)、嵌合抗體、微型雙功能抗體、微型三功能抗體、微型四功能抗體及多肽，該等多肽含有足以使特異性抗原結合至多肽之至少一部分免疫球蛋白。
Fab片段為具有VL 、VH 、CL 及CH 1域之單價片段；F(ab')2 片段為具有兩個在鉸鏈區藉由二硫橋連接之Fab片段的二價片段；Fd片段具有VH 及CH 1域；Fv片段具有抗體之單臂之VL 及VH 域；且dAb片段具有VH 域、VL 域或VH 或VL 域之抗原結合片段(美國專利第6,846,634號、第6,696,245號、美國申請公開案第05/0202512號、第04/0202995號、第04/0038291號、第04/0009507號、第03/0039958號、Ward等人，Nature 341：544-546(1989))。
單鏈抗體(scFv)為VL 及VH 區經由連接子(例如胺基酸殘基之合成序列)接合以形成連續蛋白質鏈之抗體，其中該連接子之長度足以使蛋白質鏈本身摺疊且形成單價抗原結合位點(參加例如Bird等人，Science 242：423-26(1988)及Huston等人，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-83(1988))。微型雙功能抗體為包含兩個多肽鏈之二價抗體，其中多肽鏈各包含藉由連接子接合之VH 及VL 域，該連接子過短以致不能在同一鏈上之兩個結構域之間配對，因此使各結構域與另一多肽鏈 上之互補結構域配對(參加例如Holliger等人，1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-48(1993)及Poljak等人，Structure 2：1121-23(1994))。若微型雙功能抗體之兩個多肽鏈一致，則由使其配對產生之微型雙功能抗體將具有兩個一致抗原結合位點。可使用具有不同序列之多肽鏈製造具有兩個不同抗原結合位點之微型雙功能抗體。類似地，微型三功能抗體及微型四功能抗體分別為包含三個及四個多肽鏈之抗體，且分別形成三個及四個可相同或不同之抗原結合位點。
可使用Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，US Dept.of Health and HumanServices,PHS,NIH,NIH公開案第91-3242號，1991所述之系統鑑別指定抗體之互補決定區(CDR)及構架區(FR)。亦可視需要根據替代命名方案，諸如Chothia之命名方案重新定義CDR(參加Chothia & Lesk,1987,J.Mol.Biol. 196 ：901-917；Chothia等人，1989,Nature 342 ：878-883或Honegger & Pluckthun,2001,J.Mol.Biol. 309 ：657-670)。可將一或多個CDR共價或非共價地併入分子中以使其成為抗原結合蛋白。抗原結合蛋白可併入有CDR作為較大多肽鏈之一部分，可使CDR共價連接至另一多肽鏈，或可非共價地併入有CDR。CDR可使抗原結合蛋白特異性結合至所關注之特定抗原。
抗原結合蛋白可具有一或多個結合位點。若有一個以上結合位點，則結合位點可彼此一致或可不同。舉例而言，天然存在之人類免疫球蛋白通常具有兩個一致結合位點，而「雙特異性」或「雙功能性」抗體具有兩個不同結合位點。
術語「人類抗體」包括所有抗體，具有一或多個源自人類免疫球蛋白序列之可變區及恆定區。在一實施例中，所有可變及恆定域均源自人類免疫球蛋白序列(全人類抗體)。此等抗體可由多種方式製備，以下描述該等方式之實例，包括經由用小鼠之所關注之抗原免疫，該 小鼠經遺傳修飾以表現源自人類重及/或輕鏈編碼基因之抗體，諸如源自Xenomouse®、UltiMabTM 或Velocimmune®系統之小鼠。亦可利用基於噬菌體之方法。
人類化抗體具有與源自非人類物種之抗體序列相差一或多個胺基酸取代、缺失及/或添加之序列，以致當將其投與人類個體時，與非人類物種抗體相比該人類化抗體誘導免疫反應之可能性較小，及/或誘導較不嚴重之免疫反應。在一實施例中，使非人類物種抗體之重鏈及/或輕鏈之構架及恆定域中之某些胺基酸突變產生人類化抗體。在另一實施例中，使來自人類抗體之恆定域與非人類物種之可變域融合。在另一實施例中，改變非人類抗體之一或多個CDR序列中之一或多個胺基酸殘基以當將非人類抗體投與人類個體時降低非人類抗體之可能免疫原性，其中該等改變之胺基酸殘基對於抗體之免疫特異性結合至其抗原並不關鍵，或作出之胺基酸序列之改變為保守改變，以致人類化抗體結合至抗原並不明顯劣於非人類抗體結合至抗原製造人類化抗體之操作方式之實例可見於美國專利第6,054,297號、第5,886,152號及第5,877,293號中。
在一些實施例中，「嵌合抗體」係指含有來自一種抗體之一或多個區及來自一或多種其他抗體之一或多個區之抗體。在一實施例中，一或多個CDR係源自結合以下之人類抗體：(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物。在另一實施例中，所有CDR均係源自結合以下之人類抗體：(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物。在另一實施例中，使來自一種以上結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物之人類抗體 之CDR在嵌合抗體中混合且匹配。舉例而言，嵌合抗體可包含來自結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物之第一人類抗體之輕鏈之CDR1、來自結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物之第二人類抗體之輕鏈之CDR2及CDR3、及來自結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物之第三抗體之重鏈之CDR。此外，構架區可源自一種結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物之相同抗體、源自一或多種不同抗體(諸如人類抗體)或源自人類化抗體。在嵌合抗體之一實例中，重鏈及/或輕鏈之一部分與來自特定物種或屬於特定抗體類別或子類之抗體一致、同源或源自其，而該(該等)鏈之其餘部分與來自另一物種或屬於另一抗體類別或子類之抗體一致、同源或源自其。亦包括展現所需生物活性(例如特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物之能力)之該等抗體之片段。
術語「輕鏈」包括具有足以賦予結合特異性之可變區序列的全長輕鏈及其片段。全長輕鏈包括可變區結構域VL 及恆定區結構域CL 。輕鏈之可變區結構域處於多肽之胺基末端。輕鏈包括κ鏈及λ鏈。
術語「重鏈」包括具有足以賦予結合特異性之可變區序列的全長重鏈及其片段。全長重鏈包括可變區結構域VH 及三個恆定區結構域CH 1、CH 2及CH 3。VH 結構域處於多肽之胺基末端，且CH 結構域處於羧基末端，其中CH 3最靠近多肽之羧基末端。重鏈可具有任何同型，包括 IgG(包括IgG1，IgG2，IgG3及IgG4亞型)、IgA(包括IgA1且IgA2亞型)、IgM及IgE。
如本文所用之術語抗原結合蛋白(例如抗體或免疫球蛋白鏈(重鏈或輕鏈))之「免疫功能性片段」(或簡單地「片段」)為包含抗體之一部分(與彼部分如何獲得或合成無關)且缺乏全長鏈中存在之至少一些胺基酸但能夠特異性結合至抗原之抗原結合蛋白。該等片段之生物學活性為其特異性結合至目標抗原且可與包括完整抗體之其他抗原結合蛋白競爭以特異性結合至指定抗原決定基。在一態樣中，該片段將保留全長輕鏈或重鏈中存在之至少一個CDR，且在一些實施例中將包含單一重鏈及/或輕鏈或其部分。此等生物學活性片段可藉由重組DNA技術產生，或可藉由包括完整抗體之抗原結合蛋白之酶促或化學裂解產生。免疫功能性免疫球蛋白片段包括(但不限於)Fab、Fab'、F(ab')2 、Fv、域抗體及單鏈抗體，且可源自任何哺乳動物來源，包括(但不限於)人類、小鼠、大鼠、駱駝科動物或兔子。本文所揭示之抗原結合蛋白之功能部分(例如一或多個CDR)另外意欲可共價結合至第二蛋白質或結合至小分子，以產生針對體內之特定目標、具有雙功能治療特性或具有長血清半衰期之治療劑。
「Fc」區含有兩個包含抗體之CH 2及CH 3域之重鏈片段。兩個重鏈片段藉由兩個或兩個以上二硫鍵及藉由CH 3域之疏水性相互作用結合於一起。
「Fab'片段」含有一個輕鏈及一個含有VH 域及CH 1域以及CH 1與CH 2域之間的區之重鏈之一部分，以致可在兩個Fab'片段之兩個重鏈之間形成鏈間二硫鍵，以形成F(ab')2 分子。
「F(ab')2 片段」含有兩個輕鏈及含有CH 1與CH 2域之間的恆定區之一部分的兩個重鏈，以致在兩個重鏈之間形成鏈間二硫鍵。因此F(ab')2 片段由兩個藉由兩個重鏈之間的二硫鍵結合於一起之Fab'片段構成。
「Fv區」包含來自重鏈與輕鏈之可變區，但缺乏恆定區。
「域抗體」為僅含有重鏈之可變區或輕鏈之可變區的免疫功能性免疫球蛋白片段。在一些情況下，使兩個或兩個以上VH 區與肽連接子共價接合於一起以產生二價域抗體。二價域抗體之兩個VH 區可靶向相同或不同抗原。
「半鏈抗體(hemibody)」為包含完全重鏈、完全輕鏈及與完全重鏈之Fc區配對之第二重鏈Fc區的免疫功能性免疫球蛋白構築體。可(但非必需)利用連接子接合重鏈Fc區及第二重鏈Fc區。在特定實施例中，半鏈抗體為單價形成之本文所揭示之抗原結合蛋白。在其他實施例中，可利用帶電殘基使一個Fc區與第二Fc區關聯。第二重鏈Fc區可包含例如SEQ ID NO：441，且可經由連接子(例如SEQ ID NO：440)與輕鏈接合。例示性半鏈抗體重鏈包含序列SEQ ID NO：453。
「二價抗原結合蛋白」或「二價抗體」包含兩個抗原結合位點。在一些情況下，兩個結合位點具有相同抗原特異性。如本文所述，二價抗原結合蛋白及二價抗體可具雙特異性。
「多特異性抗原結合蛋白」或「多特異性抗體」為靶向一個以以上抗原或抗原決定基者。
「雙特異性」或「雙功能性」抗原結合蛋白或抗體為分別具有兩個不同抗原結合位點之雜交抗原結合蛋白或抗體。雙特異性抗原結合蛋白及抗體一種多特異性抗原結合蛋白或多特異性抗體，且可藉由包括(但不限於)使融合瘤融合或使Fab'片段連接之多種方法產生。參見例如Songsivilai及Lachmann,1990,Clin.Exp.Immunol. 79 ：315-321；Kostelny等人，1992,J.Immunol. 148 ：1547-1553。雙特異性抗原結合蛋白或抗體之兩個結合位點將結合至兩個不同抗原決定基，其可存在於相同或不同蛋白質目標上。
當應用於本發明之抗原結合蛋白時，術語「類似FGF21信號傳導」 及「誘導類似FGF21信號傳導」意謂抗原結合蛋白模擬或調節藉由結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物誘導之活體內生物作用，且誘導另外由FGF21活體內結合至(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物產生之生物反應。在分析抗原結合蛋白(例如抗體或其免疫功能性片段)之結合及特異性中，認為當包含SEQ ID NO：2之成熟形式(亦即人類FGF21序列之成熟形式)之野生型FGF21標準物之活性的反應等於或大於5%，且較佳等於或大於10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%時，抗體或片段誘導生物反應，且具有以下特性：展現在(1)實例5之重組FGF21受體介導之螢光素酶報導體細胞檢定；(2)實例5之重組FGF21受體介導之細胞檢定中之ERK-磷酸化；及(3)如實例7所述之人類脂肪細胞之ERK磷酸化中FGF21標準物之功效程度等於或大於5%，EC50等於或小於100nM，例如90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM或10nM。將抗原結合蛋白之「效能」定義為展現抗原結合蛋白之EC50等於或小於100nM，例如90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM且較佳小於10nM，在下文檢定中：(1)實例5之重組FGF21受體介導之螢光素酶報導體細胞檢定；(2)實例5之重組FGF21受體介導之細胞檢定中之ERK磷酸化；及(3)如實例7所述之人類脂肪細胞中之ERK磷酸化。
應注意，並非所有本發明之抗原結合蛋白均誘導FGF21介導之信號傳導，此特性亦非在所有情況下均合乎需要。然而，不誘導FGF21介導之信號傳導之抗原結合蛋白形成本發明之態樣，且可適用作診斷劑或其他應用。
如本文所用之術語「FGF21R」意謂活體內已知或懷疑會形成FGF21之多聚受體複合物。在多個實施例中，FGF21R包含(i)FGFR，例如FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4及(ii)β-Klotho。
術語「聚核苷酸」或「核酸」包括單股與雙股核苷酸聚合物。包含聚核苷酸之核苷酸可為核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸或任一類型核苷酸之經修飾形式。該等修飾包括鹼基修飾，諸如溴尿苷及肌苷衍生物；核糖修飾，諸如2',3'-二去氧核糖及核苷酸間鍵合修飾，諸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯及磷醯胺酸。
術語「寡核苷酸」意謂包含200個或200個以下核苷酸之聚核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸之長度為10至60個鹼。在其他實施例中，寡核苷酸之長度為12、13、14、15、16、17、18、19或20至40個核苷酸。例如用於構築突變型基因而言，寡核苷酸可為單股或雙股的。寡核苷酸可為有義或反義寡核苷酸。寡核苷酸可包括用於偵測檢定之標記，包括放射性標記、螢光標記、半抗原或抗原標記。寡核苷酸可用作例如PCR引子、選殖引子或雜交探針。
「分離之核酸分子」意謂與所有或一部分聚核苷酸不相關之基因組、mRNA、cDNA或合成來源之DNA或RNA或其一些組合，其中分離之聚核苷酸可見於自然界中或與自然界中其未連接之聚核苷酸連接。為達到本發明之目的，應瞭解「包含特定核苷酸序列之核酸分子」不涵蓋完整染色體。「包含」特定核酸序列之分離之核酸分子除特定序列之外可包括至多10種或甚至至多20種其他蛋白質或其部分之編碼序列，或可包括控制所述核酸序列之編碼區表現的可操作地連接之調節序列，及/或可包括載體序列。
除非另有說明，否則任何本文所述之單股聚核苷酸序列之左側端為5'端；雙股聚核苷酸序列之左側方向稱為5'方向。初生RNA轉錄物之 5'至3'添加方向被稱作轉錄方向；在DNA股上具有與RNA轉錄物相同之序列且為RNA轉錄物5'端之5'方向的序列區被稱為「上游序列」；在DNA鏈上具有與RNA轉錄物相同之序列且為RNA轉錄物3'端之3'方向的序列區被稱為「下游序列」。
術語「控制序列」係指可影響其所連接之編碼序列之表現及處理的聚核苷酸序列。該等控制序列之性質可視宿主生物體而定。在特定實施例中，原核生物之控制序列可包括啟動子、核糖體結合位點及轉錄終止序列。舉例而言，真核生物之控制序列可包括包含一個或複數個轉錄因子之識別部位、轉錄強化子序列及轉錄序列的啟動子。「控制序列」可包括前導序列及/或融合搭配物序列。
術語「載體」意謂用於將蛋白質編碼資訊轉移至宿主細胞中之任何分子或實體(例如核酸、質體、噬菌體或病毒)。
術語「表現載體」或「表現構築體」係指適於轉型宿主細胞之載體且含有引導及/或控制(與宿主細胞結合)一或多個與其操作性連接之異編碼區表現的核酸序列。表現構築體可包括(但不限於)影響或控制與其可操作地連接之編碼區的轉錄、轉譯及(若存在內含子)影響RNA剪接之序列。
如本文所用之「可操作地連接」意謂應用該術語之組分有使其在適合條件下執行其固有功能之關係。舉例而言，與蛋白質編碼序列「可操作地連接」之載體中之控制序列與其連接，以便在與控制序列之轉錄活性相容之條件下實現蛋白質編碼序列之表現。
術語「宿主細胞」意謂已用核酸序列轉型或能夠用核酸序列轉型且藉此表現所關注之基因的細胞。該術語包括母細胞之子代，不管子代在形態或遺傳構成上是否與原始母細胞一致，只要所關注之基因存在即可。
術語「轉導」意謂基因通常藉由噬菌體由一種細菌轉移至另一種 細菌。「轉導」亦係指藉由複製缺陷反轉錄病毒獲取及轉移真核細胞序列。
術語「轉染」意謂藉由細胞吸收外來或外源DNA，且當將外源DNA引入細胞膜內時細胞「轉染」。此項技術中熟知且本文中揭示許多轉染技術。參見例如Graham等人，(1973)Virology 52 ：456；Sambrook等人，(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，上述；Davis等人，(1986)Basic Methods in Molecular Biology ,Elsevier；Chu等人，(1981)Gene 13 ：197。可使用該等技術以將一或多個外源DNA部分引入適合宿主細胞中。
術語「轉型」係指細胞遺傳特徵之改變且當其經修飾含有新穎DNA或RNA時細胞轉型。舉例而言，細胞藉由經由轉染、轉導或其他技術引入新穎遺傳物質而自其天然狀態轉型(此處其經基因修飾)。在轉染或轉導之後，轉型DNA可藉由物理上整合至細胞之染色體中與細胞之DNA重組，或可短暫地維持為游離型要素而不進行複製，或可獨立地複製成為質體。認為當由細胞分裂複製轉型DNA時，細胞已「穩定轉型」。
本文術語「多肽」或「蛋白質」可互換使用，且係指胺基酸殘基之聚合物。該等術語亦應用於一或多個胺基酸殘基為相應天然存在之胺基酸之類似物或模擬物胺基酸聚合物以及天然存在之胺基酸聚合物。術語亦可涵蓋已例如藉由添加醣殘基修飾以形成醣蛋白或磷酸化之胺基酸聚合物。多肽及蛋白質可藉由天然存在且非重組之細胞產生，或多肽及蛋白質可藉由遺傳工程改造或重組之細胞產生。多肽及蛋白質可包含具有天然蛋白質之胺基酸序列的分子，或自天然序列缺失一或多個胺基酸、向其中添加一或多個胺基酸及/或取代其之一或多個胺基酸之分子。術語「多肽」及「蛋白質」涵蓋特異性或選擇性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含 β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物的抗原結合蛋白，或自特異性或選擇性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物的抗原結合蛋白缺失一或多個胺基酸、向其中添加一或多個胺基酸及/或取代其之一或多個胺基酸的序列。術語「多肽片段」係指與全長蛋白質相比具有胺基末端缺失、羧基末端缺失及/或內部缺失之多肽。該與全長蛋白質相比等片段亦可含有經修飾胺基酸。在某些實施例中，片段之長度為約5至500個胺基酸。舉例而言，片段之長度為至少5、6、8、10、14、20、50、70、100、110、150、200、250、300、350、400或450個胺基酸。有用多肽片段包括抗體之免疫功能性片段，包括結合域。在結合至(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物的抗原結合蛋白之情況下，有用片段包括(但不限於)CDR區、重鏈或輕鏈之可變域、抗體鏈之一部分或包括兩個CDR之僅其可變區及其類似物。
所涉及之術語「分離之蛋白質」意謂目標蛋白質(1)不含至少一些其通常可見之其他蛋白質，(2)基本上不含來自相同來源，例如來自相同物種之其他蛋白質，(3)藉由來自不同物種之細胞表現，(4)與至少約50%之自然界中與其相關之聚核苷酸、脂質、醣或其他物質分離，(5)與自然界中與其相關之多肽可操作關聯(藉由共價或非共價相互作用)，或(6)自然界中不存在。通常，「分離之蛋白質」構成指定樣品之至少約5%、至少約10%、至少約25%或至少約50%。合成來源之基因組DNA、cDNA、mRNA或其他RNA或其任何組合可編碼該分離之蛋白質。較佳地，分離之蛋白質實質上不含見於干擾其治療性、診斷性、預防性、研究或其他用途之其自然環境中之蛋白質或多肽或其他污染物。
多肽(抗原結合蛋白或抗體)之「變異體」包含相對於另一多肽序列，將一或多個胺基酸殘基插入胺基酸序列、自胺基酸序列缺失及/或取代至胺基酸序列中之胺基酸序列。變異體包括融合蛋白。
多肽之「衍生物」為以一些不同於插入、缺失或取代變化形式之方式，例如藉由與另一化學部分結合而經化學修飾之多肽(例如抗原結合蛋白或抗體)。
如整個說明書中與諸如多肽、核酸、宿主細胞及其類似物之生物物質結合使用之術語「天然存在」係指在自然界中所見之物質。
「抗原結合區」意謂特異性結合特定抗原(例如FGFR1c、β-Klotho或FGFR1c與β-Klotho)之蛋白質或蛋白質之一部分。舉例而言，含有與抗原相互作用且使抗原結合蛋白具有其對抗原之特異性及親和性之胺基酸殘基的抗原結合蛋白的該部分係稱為「抗原結合區」。抗原結合區通常包括一或多個「互補結合區」(「CDR」)。某些抗原結合區亦包括一或多個「構架」區。「CDR」為促成抗原結合特異性及親和性之胺基酸序列。「構架」區可有助於維持CDR之適當構形，以促進抗原結合區與抗原之間的結合。
在某些態樣中，提供結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物的重組抗原結合蛋白。關於此點，「重組蛋白質」為使用重組技術，亦即經由如本文所述表現重組核酸而製造之蛋白質。產生重組蛋白質之方法及技術在此項技術中為熟知的。
當在針對目標上之相同抗原決定基或結合位點競爭之抗原結合蛋白(例如中和抗原結合蛋白、中和抗體、促效抗原結合蛋白、促效抗體及結合至(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物之結合蛋白)之情況下使用時，術語「競爭」意謂如由檢定測定 之抗原結合蛋白之間的競爭，在該檢定中研究中之抗原結合蛋白(例如抗體或其免疫功能性片段)預防或抑制參考分子(例如參考配位體或參考抗原結合蛋白，諸如參考抗體)特異性結合至共同抗原(例如FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c、FGFR4、β-Klotho或其片段)。可使用許多類型之競爭性結合檢定來測定測試分子是否與參考分子競爭結合。可利用之檢定之實例包括固相直接或間接放射免疫檢定(RIA)；固相直接或間接酶免疫檢定(EIA)；夾心競爭檢定(參見例如Stahli等人，(1983)Methods in Enzymology 9 ：242-253)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(參見例如Kirkland等人，(1986)J.Immunol. 137 ：3614-3619)；固相直接標記檢定；固相直接標記夾心檢定(參見例如Harlow及Lane,(1988)Antibodies,A Laboratory Manual ,Cold Spring Harbor Press)；使用I-125標記物之固相直接標記RIA(參見例如Morel等人，(1988)Molec.Immunol. 25 ：7-15)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(參見例如Cheung，等人，(1990)Virology 176 ：546-552)；及直接標記RIA(Moldenhauer等人，(1990)Scand.J.Immunol. 32 ：77-82)。通常，該檢定涉及使用結合至固體表面或帶有未標記測試抗原結合蛋白或標記之參考抗原結合蛋白中之任一者之細胞的純化抗原。藉由測定在測試抗原結合蛋白存在下與固體表面或細胞結合之標記的量來量測競爭性抑制。測試抗原結合蛋白通常過量存在。藉由競爭檢定鑑別之抗原結合蛋白(競爭性抗原結合蛋白)包括結合至與參考抗原結合蛋白相同之抗原決定基的抗原結合蛋白，及由於存在位阻而結合至足夠接近於參考抗原結合蛋白所結合之抗原決定基之鄰近抗原決定基的抗原結合蛋白。本文實例中提供關於測定競爭性結合之方法的其他詳述。通常，當競爭性抗原結合蛋白以過量存在時，其將抑制參考抗原結合蛋白與共同抗原之特異性結合達至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%。在一些情況下，結合被抑制至少80%、85%、90%、95% 或97%或97%以上。
術語「抗原」係指能夠藉由諸如抗原結合蛋白(包括例如抗體或其免疫功能性片段)之選擇性結合劑結合之分子或分子之一部分，且亦可能用於動物中以產生能夠結合至彼抗原之抗體。抗原可具有一或多個能夠與不同抗原結合蛋白(例如抗體)相互作用之抗原決定基。
術語「抗原決定基」意謂當抗原結合蛋白結合至目標分子時，由抗原結合蛋白(例如抗體)所接觸之目標分子之胺基酸。該術語包括當諸如抗體之抗原結合蛋白結合至目標分子時所接觸之目標分子之胺基酸的完整列表的任何子集。抗原決定基可為連續或非連續的(例如(i)在單鏈多肽中，為在多肽序列中不彼此相鄰但在目標分子之情況下藉由抗原結合蛋白結合之胺基酸殘基，或(ii)在包含兩個或兩個以上個別組分(例如(i)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4及(ii)β-Klotho)之多聚體受體中，為存在於一或多個個別組分上但仍藉由抗原結合蛋白結合之胺基酸殘基)。在某些實施例中，抗原決定基可為模擬物，因為其包含與用以產生抗原結合蛋白之抗原性抗原決定基類似之三維結構，但不包含或僅包含一些在用以產生抗原結合蛋白之彼抗原決定基中存在之胺基酸殘基。抗原決定基最通常存在於蛋白質上，但在一些情況下可存在於諸如核酸之其他種類分子上。抗原決定基決定子可包括化學活性表面分子群組，諸如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基，且可具有特定三維結構特徵及/或荷質比特徵。一般而言，在蛋白質及/或巨分子之複合混合物中，對特定目標分子具有特異性之抗原結合蛋白將優先識別目標分子上之抗原決定基。
術語「一致性」係指如藉由比對及比較序列所確定的兩種或兩種以上多肽分子或兩種或兩種以上核酸分子之序列之間的關係。「一致性百分比」意謂所比較分子中胺基酸或核苷酸之間的一致殘基的百分比，且係基於進行比較之最小分子的大小來計算。對於此等計算，必 須藉由特定數學模型或電腦程式(亦即「演算法」)處理比對中之空隙(若出現)。可用以計算比對之核酸或多肽之一致性的方法包括以下文獻所述之方法：Computational Molecular Biology ,(Lesk,A.M.編)，(1988)New York：Oxford University Press；Biocomputing Informatics and Genome Projects,(Smith,D.W.編)，1993,New York：Academic Press；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,(Griffin,A.M.及Griffin,H.G.編)，1994,New Jersey：Humana Press；von Heinje,G.,(1987)Sequence Analysis in Molecular Biology,New York：Academic Press；Sequence Analysis Primer,(Gribskov,M.及Devereux,J.編)，1991,New York：M.Stockton Press；及Carillo等人，(1988)SIAM J.Applied Math. 48 ：1073。
在計算一致性百分比中，進行比較之序列以在序列之間獲得最大匹配之方式比對。用以測定一致性百分比之電腦程式為GCG程式包，其包括GAP(Devereux等人，(1984)Nucl.Acid Res. 12 ：387；Genetics Computer Group,University of Wisconsin,Madison,WI)。使用電腦演算法GAP比對待測定序列一致性百分比之兩個多肽或聚核苷酸。比對序列以達到其各別胺基酸或核苷酸之最佳匹配(「匹配跨距」，如該演算法所測定)。將空隙開放罰分(其以平均對角線之3倍計算，其中「平均對角線」為所使用之比較矩陣之對角線的平均值；「對角線」為藉由特定比較矩陣分配給各完全胺基酸匹配之分數或數目)及空隙擴展罰分(其通常為空隙開放罰分之1/10)，並且諸如PAM 250或BLOSUM 62之比較矩陣與該演算法結合使用。在某些實施例中，該演算法亦使用標準比較矩陣(對於PAM 250比較矩陣參見Dayhoff等人，(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure 5 ：345-352；對於BLOSUM 62比較矩陣參見Henikoff等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 89 ：10915-10919)。
使用GAP程式測定多肽或核苷酸序列之一致性百分比的推薦參數 如下：
演算法：Needleman等人，1970,J.Mol.Biol. 48 ：443-453；
比較矩陣：來自Henikoff等人，1992，上述之BLOSUM 62；
空隙罰分：12(但對於末端空隙無罰分)
空隙長度罰分：4
相似性之臨限：0
比對兩個胺基酸序列之某些比對方案可導致該兩個序列中僅有短區域匹配，且雖然兩個全長序列之間無明顯關係，但此小比對區域可具有極高的序列一致性。因此，若需要，則可調整所選比對方法(例如GAP程式)，以比對跨越目標多肽之至少50個連續胺基酸。
如本文所用之「實質上純」意謂所述分子物質為主要存在之物質，亦即以莫耳計，其含量高於同一混合物中任何其他個別物質的含量。在某些實施例中，實質上純之分子為組合物，其中目標物質佔存在之所有巨分子物質之至少50%(以莫耳計)。在其他實施例中，實質上純之組合物將佔存在於組合物中之所有巨分子物質之至少80%、85%、90%、95%或99%。在其他實施例中，將目標物質純化至基本上呈均質，其中藉由習知偵測方法不可偵測到組合物中之污染物質，且因此組合物係由單一可偵測巨分子物質組成。
術語「治療」係指成功治療或改善損傷、病變或病狀之任何特徵，包括任何客觀或主觀參數，諸如症狀之消除、減輕、減弱或使患者更能耐受損傷、病變或病狀；減緩退化或衰退速率；降低退化終點時之衰弱程度；改善患者之身體或心理健康。症狀之治療或改善可基於客觀或主觀參數；包括身體檢查、神經精神病檢驗及/或精神病評估之結果。舉例而言，可利用本文中呈現之某些方法預防性地或作為急性治療來治療2型糖尿病、肥胖症及/或血脂異常，降低血漿葡萄糖含量，降低循環三酸甘油酯含量，降低循環膽固醇含量及/或改善與2型糖尿 病、肥胖症及血脂異常相關之症狀。
「有效量」一般為足以降低症狀之嚴重程度及/或發生頻率、消除症狀及/或潛在病因、預防症狀及/或其潛在病因出現、及/或改良或醫治由糖尿病、肥胖症及血脂異常產生或與其相關之損傷時的用量。在一些實施例中，有效量為治療有效量或預防有效量。「治療有效量」為足以醫治疾病病況(例如糖尿病、肥胖症或血脂異常)或症狀，尤其與該疾病病況相關之病況或症狀，或另外以任何方式預防、防止、延遲或逆轉與疾病相關之疾病病況或任何其他不希望出現之症狀進展時的用量。「預防有效量」為投與個體時具有預定預防性作用，例如預防或延遲糖尿病、肥胖症或血脂異常發作(或復發)或降低糖尿病、肥胖症或血脂異常或相關症狀發作(或復發)之可能性的醫藥組合物之量。投與一次劑量不一定會出現全部治療性或預防性作用，且僅在投與一系列劑量之後才會出現。因此，可在一或多次投藥中投與治療或預防有效量。
「胺基酸」採用其在此項技術中之標準含義。20個天然存在之胺基酸及其縮寫遵循習知用途。參見Immunology-A Synthesis，第2版，(E.S.Golub及D.R.Green編)，Sinauer Associates：Sunderland,Mass.(1991)，其以引用的方式併入本文中以用於任何目的。20個習知胺基酸之立體異構體(例如D-胺基酸)、非天然或非天然存在之胺基酸(諸如α-,α-雙取代胺基酸)、N-烷基胺基酸及其他非習知胺基酸亦可為適用於多肽之組分且包括於片語「胺基酸」中。非天然胺基酸(其視需要可取代本文所揭示之任何序列中存在的任何天然存在之胺基酸)之實例包括：4-羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸、ε-N,N,N-三甲基離胺酸、ε-N-乙醯離胺酸、O-磷絲胺酸、N-乙醯絲胺酸、N-甲醯甲硫胺酸、3-甲基組胺酸、5-羥基離胺酸、σ-N-甲基精胺酸及其他類似胺基酸及亞胺基酸(例如4-羥基脯胺酸)。在本文中所用之多肽記錄法中，根據標準用法及慣 例，左側方向為胺基末端方向而右側方向為羧基末端方向。可插入抗原結合蛋白序列或取代抗原結合序列中之野生型殘基之非天然存在之胺基酸之實例的非限制性列表包括β-胺基酸、高胺基酸、環狀胺基酸及具有衍生側鏈之胺基酸。實例包括(呈L形式或D形式；括號中為縮寫)：瓜胺酸(Cit)、高瓜胺酸(hCit)、Nα-甲基瓜胺酸(NMeCit)、Nα-甲基高瓜胺酸(Nα-MeHoCit)、鳥胺酸(Orn)、Nα-甲基鳥胺酸(Nα-MeOrn或NMeOrn)、肌胺酸(Sar)、高離胺酸(hLys或hK)、高精胺酸(hArg或hR)、高麩醯胺酸(hQ)、Nα-甲基精胺酸(NMeR)、Nα-甲基白胺酸(Nα-MeL或NMeL)、N-甲基高離胺酸(NMeHoK)、Nα-甲基麩醯胺酸(NMeQ)、正白胺酸(Nle)、正纈胺酸(Nva)、1,2,3,4-四氫異喹啉(Tic)、八氫吲哚-2-甲酸(Oic)、3-(1-萘基)丙胺酸(1-Nal)、3-(2-萘基)丙胺酸(2-Nal)、1,2,3,4-四氫異喹啉(Tic)、2-二氫茚基甘胺酸(IgI)、對碘苯丙胺酸(pI-Phe)、對胺基苯丙胺酸(4AmP或4-Amino-Phe)、4-胍基苯丙胺酸(Guf)、甘胺醯基離胺酸(縮寫為「K(Nε-glycyl)」或「K(glycyl)」或「K(gly)」)、硝基苯丙胺酸(nitrophe)、胺基苯丙胺酸(aminophe或Amino-Phe)、苄基苯丙胺酸(benzylphe)、γ-羧基麩胺酸(γ-carboxyglu)、羥基脯胺酸(hydroxypro)、對羧基-苯丙胺酸(Cpa)、α-胺基己二酸(Aad)、Nα-甲基纈胺酸(NMeVal)、N-α-甲基白胺酸(NMeLeu)、Nα-甲基正白胺酸(NMeNle)、環戊基甘胺酸(Cpg)、環己基甘胺酸(Chg)、乙醯精胺酸(acetylarg)、α,β-二胺基丙酸(Dpr)、α,γ-二胺基丁酸(Dab)、二胺基丙酸(Dap)、環己基丙胺酸(Cha)、4-甲基-苯丙胺酸(MePhe)、β,β-二苯基-丙胺酸(BiPhA)、胺基丁酸(Abu)、4-苯基-苯丙胺酸(或聯苯丙胺酸；4Bip)、α-胺基-異丁酸(Aib)、β-丙胺酸、β-胺基丙酸、哌啶酸、胺基己酸、胺基庚酸、胺基庚二酸、鎖鏈素、二胺基庚二酸、N-乙基甘胺酸、N-乙基天冬醯胺、羥基離胺酸、別羥基離胺酸、異鎖鏈素、別異白胺酸、N-甲基甘胺酸、N-甲基異白胺酸、N-甲基纈胺酸、4-羥 基脯胺酸(Hyp)、γ-羧基麩胺酸、ε-N,N,N-三甲基離胺酸、ε-N-乙醯離胺酸、O-磷絲胺酸、N-乙醯絲胺酸、N-甲醯甲硫胺酸、3-甲基組胺酸、5-羥基離胺酸、ω-甲基精胺酸、4-胺基-O-鄰苯二甲酸(4APA)及其他類似胺基酸及特定列舉之任一彼等胺基酸之衍生形式。
II.通用概述
本文提供結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物的抗原結合蛋白。本文所揭示之抗原結合蛋白之獨特特性為此等蛋白質之促效性，特定言之，模擬FGF21之活體內作用及誘導類似FGF21信號傳導之能力。更值得注意且更特定言之，在若干活體外基於細胞之檢定中一些本文所揭示之抗原結合蛋白誘導類似FGF21信號傳導，該等檢定包括在以下條件下之實例5之ELK螢光素酶報導體檢定：(1)與FGF21受體之結合及FGF21受體之活性為β-Klotho依賴性的；(2)該活性對FGFR1c/βKlotho複合物有選擇性；(3)結合至FGFR1c/βKlotho觸發類似FGF21信號傳導路徑；及(4)效能(EC50)可與包含SEQ ID NO：2之成熟形式的野生型FGF21標準物相比較，其係如以下基於細胞之檢定所量測：(1)實例5之重組FGF21受體介導之螢光素酶報導體細胞檢定；(2)實例5之重組FGF21受體介導之細胞檢定中之ERK磷酸化；及(3)實例7中所詳細描述之人類脂肪細胞中之ERK磷酸化。因此，預期所揭示之抗原結合蛋白展現與FGF21之天然生物功能一致之活體內活性。此特性使所揭示之抗原結合蛋白成為治療代謝疾病，諸如2型糖尿病、肥胖症、血脂異常、NASH、心血管疾病、代謝症候群及需要模擬或增強FGF21之活體內作用的廣泛存在之任何疾病或病狀之可行治療劑。
在本發明之一些實施例中，提供之抗原結合蛋白可包含可嵌埋及/或接合一或多個互補決定區(CDR)之多肽。在該等抗原結合蛋白中， CDR可將嵌埋於「構架」區中，其使CDR定向以致獲得適當CDR之抗原結合特性。一般而言，提供之該等抗原結合蛋白可促進或增強FGFR1c與β-Klotho之間的相互作用，且可實質上誘導FGF21像信號傳導。
某些本文所述之抗原結合蛋白為抗體或源自抗體。在某些實施例中，抗原結合蛋白之多肽結構係基於抗體，該等抗體包括(但不限於)單株抗體、雙特異性抗體、微型抗體、域抗體、合成抗體(有時本文稱為「抗體模擬物」)、嵌合抗體、人類化抗體、人類抗體、抗體融合物(有時本文稱為「抗體結合物」)、半鏈抗體及其片段。下文另外描述多個結構。
表明本文提供之抗原結合蛋白結合至(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物，且尤其結合至(i)人類β-Klotho；(ii)人類FGFR1c、人類FGFR2c、人類FGFR3c或人類FGFR4；或(iii)包含人類β-Klotho及人類FGFR1c、人類FGFR2c、人類FGFR3c及人類FGFR4中之一者的複合物。如本文中之實例所述及所示，基於西方墨點法結果，市售抗β-Klotho或抗FGFR1c抗體結合至變性β-Klotho或FGFR1c，而抗原結合蛋白(促效抗體)不結合。相反地，基於提供之FACS結果，所提供之抗原結合蛋白識別細胞表面上之FGFR1c及β-Klotho之天然結構，而市售抗體不識別。參見實例9。因此，所提供之抗原結合蛋白模擬FGF21之天然活體內生物活性。因此，本文提供之抗原結合蛋白能夠活化類似FGF21信號傳導活性。詳言之，例如在諸如2型糖尿病、肥胖症、血脂異常、NASH、心血管疾病及代謝症候群之病狀中，所揭示之抗原結合蛋白可具有一或多個以下活體內活性：誘導類似FGF21信號轉導路徑、降低血糖含量、降低循環脂質含量、改良代謝參數及活體內藉由形成FGFR1c、β-Klotho及FGF21之三元複合物誘導 之其他生理作用。
本文所揭示之特異性結合至(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物的抗原結合蛋白具有多種效用。舉例而言，一些抗原結合蛋白適用於特異性結合檢定；(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物，包括此等所揭示蛋白質之人類形式之親合純化；及鑑別類似FGF21信號傳導活性之其他促效劑之篩檢檢定。
如本文所述，本文所揭示之特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物的抗原結合蛋白可用於多種治療應用中。舉例而言，某些抗原結合蛋白適用於治療患者中與類似FGF21信號處理相關之病狀，諸如降低、減緩或治療2型糖尿病、肥胖症、血脂異常、NASH、心血管疾病及代謝症候群。抗原結合蛋白之其他用途包括例如與β-Klotho、FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c、FGFR4或FGF21相關之疾病或病狀之診斷，及測定此等分子存在或不存在之篩檢檢定。一些本文所述之抗原結合蛋白可適用於治療與類似FGF21信號傳導活性降低相關之病狀、症狀及/或病變。例示性病狀包括(但不限於)糖尿病、肥胖症、NASH及血脂異常。
FGF21
如本文所定義，本文所揭示之抗原結合蛋白誘導FGF21介導之信號傳導。活體內FGF21之成熟形式為分子之活性形式。提供編碼全長FGF21之核苷酸序列；將編碼信號序列之核苷酸加下劃線。
Figure TW201805308AD00005
Figure TW201805308AD00006
(SEQ ID NO：1)
提供全長FGF21之胺基酸序列；將組成信號序列之該等胺基酸加下劃線：
Figure TW201805308AD00007
Figure TW201805308AD00008
(SEQ ID NO：2)
FGFR1c
當與β-Klotho締合時，本文所揭示之抗原結合蛋白結合至FGFR1c，尤其人類FGFR1c。提供人類FGFR1c之核苷酸序列(GenBank寄存登記號NM_023110)：
Figure TW201805308AD00009
Figure TW201805308AD00010
Figure TW201805308AD00011
Figure TW201805308AD00012
(SEQ ID NO：3)
提供人類FGFR1c之胺基酸序列(GenBank寄存登記號NP_075598)：
Figure TW201805308AD00013
Figure TW201805308AD00014
(SEQ ID NO：4)
本文所述之抗原結合蛋白結合FGFR1c之細胞外部分。FGFR1c之細胞外區之實例為：
Figure TW201805308AD00015
Figure TW201805308AD00016
(SEQ ID NO：5)
如本文所述，FGFR1c蛋白質亦可包括片段。如本文所用之該等術語可互換使用，意謂與β-Klotho及FGF21締合時誘導類似FGF21信號傳導活性之受體，詳言之且除非另作說明，否則為人類受體。
術語FGFR1c亦包括FGFR1c胺基酸序列之轉譯後修飾，例如可能存在之N連接糖基化作用位點。因此，抗原結合蛋白可結合至在一或多個位置糖基化之蛋白質或由其產生。
β-Klotho
本文所揭示之抗原結合蛋白結合至β-Klotho，尤其人類β-Klotho。提供編碼人類β-Klotho之核苷酸序列(寄存登記號NM_175737)：
Figure TW201805308AD00017
Figure TW201805308AD00018
Figure TW201805308AD00019
Figure TW201805308AD00020
(SEQ ID NO：6)
提供全長人類β-Klotho之胺基酸序列(GenBank寄存登記號NP_783864)：
Figure TW201805308AD00021
Figure TW201805308AD00022
Figure TW201805308AD00023
(SEQ ID NO：7)
本文所述之抗原結合蛋白結合β-Klotho之細胞外部分。β-Klotho之細胞外區之實例為：
Figure TW201805308AD00024
(SEQ ID NO：8)
鼠類形式之β-Klotho且其片段及子序列可適用於研究及/或構築本文提供之分子。提供編碼鼠類β-Klotho之核苷酸序列(GenBank寄存登記號NM_031180)：
Figure TW201805308AD00025
Figure TW201805308AD00026
Figure TW201805308AD00027
Figure TW201805308AD00028
(SEQ ID NO：469)
提供全長鼠類β-Klotho之胺基酸序列(GenBank寄存登記號NP_112457)：
Figure TW201805308AD00029
Figure TW201805308AD00030
(SEQ ID NO：468)
如本文所述，β-Klotho蛋白質亦可包括片段。如本文所用之該等術語可互換使用，意謂與FGFR1c及FGF21締合時誘導類似FGF21信號傳導活性之輔助受體，詳言之且除非另作說明，否則為人類輔助受體。
術語β-Klotho亦包括β-Klotho胺基酸序列之轉譯後修飾，例如可能 存在之N連接糖基化作用位點。因此，抗原結合蛋白可結合至在一或多個位置糖基化之蛋白質或由其產生。
特異性結合β-Klotho、FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c、FGFR4c中之一或多者的抗原結合蛋白
提供適用於調節類似FGF21信號傳導之多種選擇性結合劑。此等藥劑包括例如含有抗原結合域(例如單鏈抗體、域抗體、半鏈抗體、免疫黏附物及具有抗原結合區之多肽)且特異性結合至FGFR1c、β-Klotho或FGFR1c與β-Klotho，詳言之人類FGFR1c及人類β-Klotho之抗原結合蛋白。舉例而言，一些藥劑適用於模擬藉由活體內FGFR1c與β-Klotho及與FGF21締合產生之信號傳導效應，且因此可用以增強或調節一或多種與類似FGF21信號傳導相關之活性。
一般而言，提供之抗原結合蛋白通常包含一或多個本文所述之CDR(例如1，2、3，4，5或6個CDR)。在一些實施例中，抗原結合蛋白藉由純系天然表現，而在其他實施例中，抗原結合蛋白可包含(a)多肽構架結構及(b)插入及/或接合至多肽構架結構中之一或多個CDR。在一些此等實施例中，CDR形成藉由本文所述純系表現之重鏈或輕鏈之組分；在其他實施例中，可將CDR插入不會天然表現CDR之構架中。多肽構架結構可呈多種不同形式。舉例而言，多肽構架結構可為或包含天然存在之抗體或其片段或變異體之構架，或其可為實質上完全合成的。下文另外描述多個抗原結合蛋白結構之實例。
在一些實施例中，其中抗原結合蛋白包含(a)多肽構架結構及(b)插入及/或接合至多肽構架結構之一或多個CDR，抗原結合蛋白之多肽構架結構為抗體或源自抗體，該抗體包括(但不限於)單株抗體、雙特異性抗體、微型抗體、域抗體、合成抗體(有時稱為「抗體模擬物」)、嵌合抗體、人類化抗體、抗體融合物(有時稱為「抗體結合物」)及分別各者之部分或片段。在一些情況下，抗原結合蛋白為抗體之免疫片 段(例如Fab、Fab'、F(ab')2 或scFv)。
某些如本文所提供之抗原結合蛋白特異性結合至(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物，包括此等蛋白質之人類形式。在一實施例中，抗原結合蛋白特異性結合至包含胺基酸序列SEQ ID NO：5之人類FGFR1c與包含胺基酸序列SEQ ID NO：8之人類β-Klotho，且在另一實施例中，抗原結合蛋白特異性結合至包含胺基酸序列SEQ ID NO：5之人類FGFR1c與具有胺基酸序列SEQ ID NO：8之人類β-Klotho，且誘導FGF21-樣信號傳導。因此，抗原結合蛋白可但不一定誘導類似FGF21信號傳導。
抗原結合蛋白結構
特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物之一些抗原結合蛋白，包括本文提供之此等蛋白質之人類形式，具有通常與天然存在之抗體相關之結構。此等抗體之結構單元通常包含一或多個四聚體，各四聚體由一致之兩對多肽鏈構成，但哺乳動物之一些物質亦產生僅具有單一重鏈之抗體。在典型抗體中，各對包括一個全長「輕」鏈(在某些實施例中約25kDa)及酮全長「重」鏈(在某些實施例中約50-70kDa)。各個別免疫球蛋白鏈由若干「免疫球蛋白域」構成，各免疫球蛋白域由約90至110個胺基酸組成且表現特徵摺疊圖案。此等結構域為組成抗體多肽之基本單位。各鏈之胺基末端部分通常包括負責抗原識別之可變域。與鏈之其他末端相比，羧基末端部分演化上更保守，且稱為「恆定區」或「C區」。通常將人類輕鏈分類成κ及λ輕鏈，且此等輕鏈各含有一種可變域及一個恆定域。通常將重鏈分類成μ、δ、γ、α或ε，且此等鏈將抗體之同型分別定義為IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。IgG具有若干亞型，包括(但不限 於)IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。IgM亞型包括IgM及IgM2。IgA亞型包括IgA1及IgA2。在人類中，IgA及IgD同型含有4個重鏈及4個輕鏈；IgG及IgE同型含有2個重鏈及2個輕鏈；且IgM同型含有5個重鏈及5個輕鏈。重鏈C區通常包含一或多個可負責效應功能之結構域。重鏈恆定區結構域之數目將視同型而定。將例如各含有三個C區結構域之IgG重鏈稱為CH 1、CH 2且CH 3。提供之抗體可具有任一此等同型及亞型。在某些實施例中，特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物中之一或多者的抗原結合蛋白為IgG1、IgG2或IgG4亞型之抗體。
在全長輕鏈及重鏈中，可變區及恆定區由約12或更多胺基酸之「J」區接合，其中重鏈亦包括約10或更多胺基酸之「D」區。參見例如Fundamental Immunology，第2版，第7章(Paul,W.編)1989,New York：Raven Press(為所有目的以全文引用方式併入本文中)。各輕鏈/重鏈對之可變區通常形成抗原結合位點。
特異結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物之例示性單株抗體之IgG2重鏈恆定域之一實例具有胺基酸序列：
Figure TW201805308AD00031
Figure TW201805308AD00032
(SEQ ID NO：9)
結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或 (iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物之例示性單株抗體之κ輕鏈恆定域之一實例具有胺基酸序列：
Figure TW201805308AD00033
Figure TW201805308AD00034
(SEQ ID NO：10)
結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物之例示性單株抗體之λ輕鏈恆定域之一實例具有胺基酸序列：
Figure TW201805308AD00035
Figure TW201805308AD00036
(SEQ ID NO：11)
免疫球蛋白鏈之可變區通常展現相同總體結構，其包含藉由三個高變區，更通常稱為「互補決定區」或CDR接合之相對保守之構架區(FR)。來自各以上所提及之重鏈/輕鏈對之兩個鏈的CDR通常藉由構架區比對異形式與目標蛋白質(例如(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物)上之特異性抗原決定基特異性結合結構。由N端到C端，天然存在之輕鏈與重鏈可變區接通常與以下次序之此等要素一致：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。已設計編號系統以將編號分配至佔據此等結構域中之每一者中之位置之胺基酸。Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest中定義此編號系統(1987及1991,NIH,Bethesda,MD)。CDR亦可視需要根據替代命名方案，諸如Chothia之命名方案重新定義(參見Chothia & Lesk,1987,J.Mol.Biol. 196 ：901-917；Chothia等人，1989,Nature 342 ：878-883或Honegger & Pluckthun,2001,J.Mol.Biol. 309 ：657-670)。
表2中描述本文所提供之抗原結合蛋白之多個重鏈及輕鏈可變 區。可使此等可變區各連接至以上重鏈及輕鏈恆定區分別形成完全抗體重鏈及輕鏈。此外，如此產生之重鏈及輕鏈序列各可經組合形成完全抗體結構。應瞭解，亦可將本文提供之重鏈及輕鏈可變區連接至序列不同於上文所列之例示性序列的其他恆定域。
提供之抗體及其相應胺基酸序列之一些全長輕鏈及重鏈之特定實例概述於表1A及表1B中。表1A展示例示性輕鏈序列，且表1B展示例示性重鏈序列。
Figure TW201805308AD00037
Figure TW201805308AD00038
Figure TW201805308AD00039
Figure TW201805308AD00040
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Figure TW201805308AD00044
Figure TW201805308AD00045
此外，表1B及下文表6A中所列之例示性重鏈(H1、H2 H3等)可各與表1A及下文表6A中所示之任一例示性輕鏈組合形成抗體。該等組合之實例包括H1與L1至L18中之任一者組合；H2與L1至L18中之任一者組合；H3與L1穿過L18中之任一者組合等。在一些情況下，抗體包括 來自表1A及表1B及下文表6A中所列之至少一個重鏈及一個輕鏈；輕鏈及重鏈配對之特定實例包括L1與H1、L2與H2、L3與H3、L4與H4、L5與H5、L6與H6、L7與H7、L8與H8、L9與H9、L10與H10、L11與H11、L12與H12、L13與H13、L14與H14、L15與H15、L16與H16、L17與H17及L18與H18。除包含來自同一純系之重鏈及輕鏈之抗原結合蛋白外，來自第一純系之重鏈可與來自第二純系之輕鏈配對(例如來自46D11之重鏈與來自16H7之輕鏈配對、或來自16H7之重鏈與來自46D11之輕鏈配對)。一般而言，該等配對可包括具有90%或大於90%之同源性之VL可與天然存在之純系的重鏈配對。在一些情況下，抗體包含表1A及表1B及下文表6A中所列之兩個不同重鏈及兩個不同輕鏈。在其他情況下，抗體含有兩個一致輕鏈及兩個一致重鏈。舉例而言，抗體或免疫功能性片段可包括表1A及表1B及下文表6A中所列之兩個H1重鏈及兩個L1輕鏈，或兩個H2重鏈及兩個L2輕鏈，或兩個H3重鏈及兩個L3輕鏈及輕鏈對及重鏈對之其他類似組合。
在本發明之另一態樣中，提供「半鏈抗體」。半鏈抗體為單價抗原結合蛋白，包含(i)完整輕鏈及(ii)重鏈視情況經由連接子融合至Fc區(例如SEQ ID NO：441之IgG2 Fc區)。連接子可為(G4 S)x 連接子，其中「x」為非零整數(例如(G4 S)8 ；SEQ ID NO：440)。可使用所提供之重鏈及輕鏈組分構築半鏈抗體。半鏈抗體之特定實例揭示於實例14中。
其他所提供之抗原結合蛋白為由組合表1A及表1B及下文表6A中所示之重鏈及輕鏈形成之抗體的變異體，且包含各與此等鏈之胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之輕鏈及/或重鏈。在一些情況下，該等抗體包括至少一個重鏈及一個輕鏈、而在其他情況下，變異體形式含有兩個一致輕鏈及兩個一致重鏈。
抗原結合蛋白之可變域
亦提供抗原結合蛋白，其含有選自由如表2B中所示之以下組成之群的抗體重鏈可變區：VH 1、VH 2、VH 3、VH 4、VH 5、VH 6、VH 7、VH 8、VH 9、VH 10、VH 11、VH 12、VH 13、VH 14、VH 15、VH 16、VH 17及VH 18，及/或選自由如表2A中所示之以下組成之群的抗體輕鏈可變區：VL 1、VL 2、VL 3、VL 4、VL 5、VL 6、VL 7、VL 8、VL 9、VL 10、VL 11、VL 12、VL 13、VL 14、VL 15、VL 16、VL 17及VL 18，及此等輕鏈及重鏈可變區之免疫功能性片段、衍生物、突變型蛋白及變異體。
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Figure TW201805308AD00059
表2B中所列之重鏈可變區可各與表2A中所示之任一輕鏈可變區組合形成抗原結合蛋白。該等組合之實例包括VH 1與VL 1、VL 2、VL 3、VL 4、VL 5、VL 6、VL 7、VL 8、VL 9、VL 10、VL 11、VL 12、VL 13、VL 14、VL 15、VL 16、VL 17或VL 18中之任一者組合；VH 2與VL 1、VL 2、VL 3、VL 4、VL 5、VL 6、VL 7、VL 8、VL 9、VL 10、VL 11、VL 12、VL 13、VL 14、VL 15、VL 16、VL 17或VL 18；VH 3中之任一者組合；VH 3與VL 1、VL 2、 VL 3、VL 4、VL 5、VL 6、VL 7、VL 8、VL 9、VL 10、VL 11、VL 12、VL 13、VL 14、VL 15、VL 16、VL 17或VL 18中之任一者組合等。
在一些情況下，抗原結合蛋白包括來自表2A及表2B中所列之至少一個重鏈可變區及/或一個輕鏈可變區。在一些情況下，抗原結合蛋白包括來自表2A及表2B中所列之至少兩個不同重鏈可變區及/或輕鏈可變區。該抗原結合蛋白之實例包含(a)一個VH 1，及(b)VH 2、VH 3、VH 4、VH 5、VH 6、VH 7、VH 8、VH 9、VH 10、VH 11、VH 12、VH13 、VH14 、VH15 、VH16 、VH17 或VH18 中之一者。另一實例包含(a)一個VH 2，及(b)VH 1、VH 3、VH 4、VH 5、VH 6、VH 7、VH 8、VH 9、VH 10、VH 11、VH 12、VH 13、VH 14、VH 15、VH 16、VH 17或VH 18中之一者。又一實例包含(a)一個VH 3，及(b)VH 1、VH 2、VH 4、VH 5、VH 6、VH 7、VH 8、VH 9、VH 10、VH 11、VH 12、VH 13、VH 14、VH 15VH 16、VH 17或VH 18中之一者等。
該抗原結合蛋白之又一實例包含(a)一個VL 1及(b)VL 2、VL 3、VL 4、VL 5、VL 6、VL 7、VL 8、VL 9、VL 10、VL 11、VL 12、VL 13、VL 14、VL 15、VL 16、VL 17或VL 18中之一者。該抗原結合蛋白之又一實例包含(a)一個VL 2及(b)VL 1、VL 3、VL 4、VL 5、VL 6、VL 7、VL 8、VL 9、VL 10、VL 11或VL 12中之一者。該抗原結合蛋白之又一實例包含(a)一個VL 3及(b)VL 1、VL 2、VL 4、VL 5、VL 6、VL 7、VL 8、VL 9、VL 10、VL 11、VL 12、VL 13、VL 14、VL 15、VL 16、VL 17或VL 18中之一者等。
重鏈可變區之多種組合可與輕鏈可變區之多種組合中之任一者組合。
在其他實施例中，抗原結合蛋白包含兩個一致輕鏈可變區及/或兩個一致重鏈可變區。舉例而言，抗原結合蛋白可為包括如表2A及表2B所列之一對輕鏈可變區及一對重鏈可變區之組合中之兩個輕鏈可變區及兩個重鏈可變區之抗體或其免疫功能性片段。
一些所提供之抗原結合蛋白包含胺基酸序列與選自VH 1、VH 2、 VH 3、VH 4、VH 5、VH 6、VH 7、VH 8、VH 9、VH 10、VH 11、VH 12、VH 13、VH 14、VH 15、VH 16、VH 17及VH 18之重鏈可變域序列僅1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸殘基不同的重鏈可變域，其中該序列差異各獨立地缺失、插入或取代一個胺基酸，其中該等缺失、插入及/或取代產生僅15個相對於上述可變域序列之胺基酸改變。一些抗原結合蛋白中之重鏈可變區包含胺基酸序列與VH 1、VH 2、VH 3、VH 4、VH 5、VH 6、VH 7、VH 8、VH 9、VH 10、VH 11、VH 12、VH 13、VH 14、VH 15、VH 16、VH 17及VH 18之重鏈可變區之胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%的序列一致性。
某些抗原結合蛋白包含胺基酸序列與選自VL 1、VL 2、VL 3、VL 4、VL 5、VL 6、VL 7、VL 8、VL 9、VL 10、VL 11、VL 12、VL 13、VL 14、VL 15、VL 16、VL 17及VL 18之輕鏈可變域序列僅1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸殘基不同的輕鏈可變域，其中該序列差異各獨立地缺失、插入或取代一個胺基酸，其中該等缺失、插入及/或取代產生僅15個相對於上述可變域序列之胺基酸改變。一些抗原結合蛋白中之輕鏈可變區包含胺基酸序列與VL 1、VL 2、VL 3、VL 4、VL 5、VL 6、VL 7、VL 8、VL 9、VL 10、VL 11、VL 12、VL 13、VL 14、VL 15、VL 16、VL 17或VL 18之輕鏈可變區之胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%的序列一致性。
在其他情況下，抗原結合蛋白包含以下輕鏈及重鏈可變域配對：VL 1與VH 1、VL 2與VH 2、VL 2與VH 3、VL 3與VH 4、VL 4與VH 5、VL 5與VH 6、VL 6與VH 7、VL 7與VH 8、VL 8與VH 8、VL 9與VH 9、VL 9與VH 10、VL 10與VH 11、VL 11與VH 11、VL 12與VH 12、VL 13與VH 13、VL 14與VH 14、VL 15與VH 15、VL 16與VH 16、VL 17與VH 17及VL 18與VH 18。在一些情況下，呈以上配對之抗原結合蛋白可包含胺基酸序列與特定可變域具有70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一 致性。
例如抗體或免疫功能性片段之其他抗原結合蛋白包括如剛剛所述之變異體形式之變異型重鏈及變異型輕鏈。
抗原結合蛋白CDR
在多個實施例中，本文所揭示之抗原結合蛋白可包含其中移植、插入及/或接合一或多個CDR之多肽。抗原結合蛋白可具有1、2、3、4、5或6個CDR。抗原結合蛋白因此可具有例如一個重鏈CDR1(「CDRH1」)、及/或一個重鏈CDR2(「CDRH2」)、及/或一個重鏈CDR3(「CDRH3」)、及/或一個輕鏈CDR1(「CDRL1」)、及/或一個輕鏈CDR2(「CDRL2」)、及/或一個輕鏈CDR3(「CDRL3」)。一些抗原結合蛋白包括CDRH3與CDRL3。分別在表3A及表3B中且下文在表6C中鑑別特異性重鏈及輕鏈CDR。
可使用Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，US Dept.of Health and Human Services,PHS,NIH,NIH公開案第91-3242號，1991所述之系統鑑別指定抗體之互補決定區(CDR)及構架區(FR)。CDR亦可視需要根據替代命名方案，諸如Chothia之命名方案重新定義(參見Chothia & Lesk,1987,J.Mol.Biol. 196 ：901-917；Chothia等人，1989,Nature 342 ：878-883或Honegger & Pluckthun,2001,J.Mol.Biol. 309 ：657-670)。某些本文所揭示之抗體包含與表3A(CDRH)及表3B(CDRL)及下文表6C中存在之一或多個CDR之胺基酸序列一致或具有實質序列一致性之一或多個胺基酸序列。
Figure TW201805308AD00060
Figure TW201805308AD00061
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Figure TW201805308AD00064
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Figure TW201805308AD00066
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Figure TW201805308AD00069
Figure TW201805308AD00070
上述已描述天然存在之抗體內之CDR之結構及特性。簡言之，在傳統抗體中，將CDR嵌埋於重鏈可變區及輕鏈可變區中之構架內，其中其構成負責抗原結合及識別之區域。參見上文(Kabat等人，1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest ,Public Health Service N.I.H.,Bethesda,MD；亦參見Chothia及Lesk,1987,J.Mol.Biol. 196 ：901-917；Chothia等人，1989,Nature 342 ：877-883)，在構架區(表示構架區1-4、FR1、FR2、FR3及FR4，藉由Kabat等人，1991；亦參見Chothia及Lesk，1987，上述)內可變區包含至少三個重鏈CDR或輕鏈CDR。然而如本文所述，本文提供之CDR不僅可用以定義傳統抗體結構之抗原結合域，亦可嵌埋於多種其他多肽結構中。
在一態樣中，提供之CDR為(a)選自由以下組成之群的CDRH：(i)選自由SEQ ID NO：121-131組成之群的CDRH1；(ii)選自由SEQ ID NO：132-144組成之群的CDRH2；(iii)選自由SEQ ID NO：145-157組成之 群的CDRH3；及(iv)含有不超過5、4、3、2或1個胺基酸之一或多個胺基酸取代、缺失或插入的(i)、(ii)及(iii)之CDRH；(B)選自由以下組成之群的CDRL：(i)選自由SEQ ID NO：158-170組成之群的CDRL1；(ii)選自由SEQ ID NO：171-179組成之群的CDRL2；(iii)選自由SEQ ID NO：180-194組成之群的CDRL3；及(iv)含有不超過1、2、3、4或5個胺基酸之一或多個胺基酸取代、缺失或插入的(i)、(ii)及(iii)之CDRL。
在另一態樣中，抗原結合蛋白包含1、2、3、4、5或6個表3A及表3B及下文表6C中所列之變異體形式之CDR，各與表3A及表3B及下文表6C中所列之CDR序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。一些抗原結合蛋白包含1、2、3、4、5或6個表3A及表3B及下文表6C中所列之CDR，各與此等表中所列之CDR有不超過1、2、3、4或5個胺基酸不同。
在又一態樣中，抗原結合蛋白包括CDRL1、CDRL2及CDRL3之以下締合：SEQ ID NO：167、176及190；SEQ ID NO：167、176及189、SEQ ID NO：166、176及188；SEQ ID NO：166、176及188；SEQ ID NO：161、174及183；SEQ ID NO：162、173及184；SEQ ID NO：162、173及186；SEQ ID NO：164、173及186；SEQ ID NO：160、173及182；SEQ ID NO：163、173及185；SEQ ID NO：163、173及185；SEQ ID NO：159、172及181；SEQ ID NO：165、175及187；SEQ ID NO：158、171及180；SEQ ID NO：168、171及191；SEQ ID NO：169、177及192；SEQ ID NO：170、178及193；SEQ ID NO：163、173及194；SEQ ID NO：163、173及194；及SEQ ID NO：163、179及194。
在另一態樣中，抗原結合蛋白包括CDRH1、CDRH2及CDRH3之以下締合：SEQ ID NO：122、133及146；SEQ ID NO：122、133及147；SEQ ID NO：122、133及148；SEQ ID NO：122、134及148；SEQ ID NO：124、136及150；SEQ ID NO：124、138及152；SEQ ID NO：124、139 及152；SEQ ID NO：124、137及151；SEQ ID NO：124、137及151；SEQ ID NO：131、140及153；SEQ ID NO：125、140及153；SEQ ID NO：123、135及149；SEQ ID NO：123、135及149；SEQ ID NO：121、132及145；SEQ ID NO：126、133及154；SEQ ID NO：130、144及157；SEQ ID NO：127、135及155；SEQ ID NO：129、142及156；SEQ ID NO：128、141及156；及SEQ ID NO：128、143及156。
在另一態樣中，抗原結合蛋白包括CDRL1、CDRL2及CDRL3與CDRH1、CDRH2及CDRH3之以下締合：SEQ ID NO：167、176及190；SEQ ID NO：167、176及189、SEQ ID NO：166、176及188；SEQ ID NO：166、176及188；SEQ ID NO：161、174及183；SEQ ID NO：162、173及184；SEQ ID NO：162、173及186；SEQ ID NO：164、173及186；SEQ ID NO：160、173及182；SEQ ID NO：163、173及185；SEQ ID NO：163、173及185；SEQ ID NO：159、172及181；SEQ ID NO：165、175及187；SEQ ID NO：158、171及180；SEQ ID NO：168、171及191；SEQ ID NO：169、177及192；SEQ ID NO：170、178及193；SEQ ID NO：163、173及194；SEQ ID NO：163、173及194；SEQ ID NO：163、179及194與SEQ ID NO：122、133及146；SEQ ID NO：122、133及147；SEQ ID NO：122、133及148；SEQ ID NO：122、134及148；SEQ ID NO：124、136及150；SEQ ID NO：124、138及152；SEQ ID NO：124、139及152；SEQ ID NO：124、137及151；SEQ ID NO：124、137及151；SEQ ID NO：131、140及153；SEQ ID NO：125、140及153；SEQ ID NO：123、135及149；SEQ ID NO：123、135及149；SEQ ID NO：121、132及145；SEQ ID NO：126、133及154；SEQ ID NO：130、144及157；SEQ ID NO：127、135及155；SEQ ID NO：129、142及156；SEQ ID NO：128、141及156；及SEQ ID NO：128、143及156。
共同序列
在另一態樣中，本文所揭示之CDR包括源自相關單株抗體群之共同序列。如本文所述，「共同序列」係指具有在許多序列之間共有的保守胺基酸以及在指定胺基酸序列內有變化之可變胺基酸的胺基酸序列。提供之CDR共同序列包括與CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2及CDRL3中之每一者對應之CDR。
使用與所揭示抗體之VH 及VL 對應之CDR的標準分析測定共同序列，其中一些抗體特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物。藉由在與VH 或VL 對應之相同序列內保持CDR連續來測定共同序列。
輕鏈CDR3
第1組：
LQHNSYPLT(SEQ ID NO：267)
第2組
MQSLQTPFT(SEQ ID NO：268)
第3組
QQYNNWPPT(SEQ ID NO：269)
第4組
MQSIQLPRT(SEQ ID NO：270)
第5組
QQANDFPIT(SEQ ID NO：271)
第6組
MQALQTPCS(SEQ ID NO：272)
第7組
QVWD G N SDHVV(SEQ ID NO：273)
QVWD N T SDHVV(SEQ ID NO：274)
QVWD S S SDHVV(SEQ ID NO：275)
QVWD X 1 X 2 SDHVV (SEQ ID NO：276)
其中X1 為G、S或N且X2 為S、T或N。
第8組
QQ C G S S P L T(SEQ ID NO：277)
QQ Y G G S P L T(SEQ ID NO：278)
QQ Y G S A P L T(SEQ ID NO：279)
QQ Y G S S F T(SEQ ID NO：280)
QQ Y G S S P L T(SEQ ID NO：281)
QQ S G S S P L T(SEQ ID NO：282)
QQ X 3 G X 4 X 5 X 6 X 7 T (SEQ ID NO：283)
其中X3 為C、Y或S，X4 為S或G，X5 為S或A，X6 為P或F且X7 為L或不存在。
輕鏈CDR2
第1組：
AASSLQS(SEQ ID NO：284)
第2組
GVSTRAT(SEQ ID NO：285)
第3組
DDSDRPS(SEQ ID NO：286)
第4組
EVSNRFS(SEQ ID NO：287)
第5組
L G S N R A S(SEQ ID NO：288)
L G S D R A S(SEQ ID NO：289)
L G S X 27 R A S (SEQ ID NO：290)
其中X27 為N或D。
第6組
G A S S RAT(SEQ ID NO：291)
G T S S RAT(SEQ ID NO：292)
G A S F RAT(SEQ ID NO：293)
G X 8 S X 28 RAT (SEQ ID NO：294)
其中X8 為A或T且X28 為S或F。
輕鏈CDR1
第1組：
RASQSVNSNLA(SEQ ID NO：295)
第2組
RASQDIRYDLG(SEQ ID NO：296)
第3組
RASQGISIWLA(SEQ ID NO：297)
第4組
KSSQSLLQSDGKTYLY(SEQ ID NO：298)
第5組
RASQ N F D S S S LA(SEQ ID NO：299)
RASQ N F D S S Y LA(SEQ ID NO：300)
RASQ S V S G N Y LA(SEQ ID NO：301)
RASQ S V S G T Y LA(SEQ ID NO：302)
RASQ N F D S N Y LA(SEQ ID NO：303)
RASQ X 9 X 10 X 11 X 12 X 13 X 14 LA (SEQ ID NO：304)
其中X9 為A或S，X10 為V或F，X11 為D或S，X12 為G或S，X13 為S、N或T，且X14 為S或Y。
第6組
GGNNIGS E SVH(SEQ ID NO：305)
GGNNIGS Q SVH(SEQ ID NO：306)
GGNNIGS X 15 SVH (SEQ ID NO：307)
其中X15 為E或Q。
第7組
RSSQSLL Y Y NG F T Y LD(SEQ ID NO：308)
RSSQSLL H S NG Y N F LD(SEQ ID NO：309)
RSSQSLL X 29 X 30 NG X 31 X 32 X 33 LD (SEQ ID NO：310)
其中X29 為Y或H，X30 為Y或S，X31 為F或Y，X32 為T或N且X33 為Y或F。
重鏈CDR3
第1組：
IVVVPAAIQSYYYYYGMGV(SEQ ID NO：311)
第2組
DPDGDYYYYGMDV(SEQ ID NO：312)
第3組
TYSSGWYVWDYYGMDV(SEQ ID NO：313)
第4組
DRVLSYYAMAV(SEQ ID NO：314)
第5組
VRIAGDYYYYYGMDV(SEQ ID NO：315)
第6組
ENIVVIPAAIFAGWFDP(SEQ ID NO：316)
第7組
DRAAACLHYYYGMDV(SEQ ID NO：317)
第8組
I L L L G A YYY Y GMDV(SEQ ID NO：318)
I L L V G A YYY C GMDV(SEQ ID NO：319)
V V T G G YYY D GMDV(SEQ ID NO：320)
S V V T G G YYY D GMDV(SEQ ID NO：321)
X 34 X 16 X 17 X 18 G X 19 YYY X 20 GMDV (SEQ ID NO：322)
其中X34 為I、V或S，X16 為L或V，X17 為L、T或V，X18 為L、V、G或T，X19 為A、G或不存在且X20 為Y、C或D。
第9組
SLIVV I VY A LD H(SEQ ID NO：323)
SLIVV I VY A LD Y(SEQ ID NO：324)
SLIVV M VY V LD Y(SEQ ID NO：325)
SLIVV X 21 VY X 22 LD X 23 (SEQ ID NO：326)
其中X21 為I或M，X22 為A或V且X23 為H或Y。
重鏈CDR2
第1組：
GFDPEDGETIYAQKFQG(SEQ ID NO：327)
第2組
RIKSK T DGGTTDYAAPVKG(SEQ ID NO：328)
RIKSK DGGTTDYAAPVKG(SEQ ID NO：330)
RIKSK X 42 DGGTTDYAAPVKG(SEQ ID NO：483)
其中X42 為T或不存在。
第3組
HIFSNDEKSYSTSLK S(SEQ ID NO：331)
HIFSNDEKSYSTSLK N(SEQ ID NO：332)
HIFSNDEKSYSTSLK X 24 (SEQ ID NO：333)
其中X24 為S或N。
第4組
G ISGSGVST H YADSVKG(SEQ ID NO：334)
G ISGSGVST Y YADSVKG(SEQ ID NO：335)
A ISGSGVST Y YADSVKG(SEQ ID NO：336)
A ISGSGVST N YADSVKG(SEQ ID NO：337)
X 25 ISGSGVST X 26 YADSVKG (SEQ ID NO：338)
其中X25 為G或A且X26 為H、Y或N。
第5組
VIWYDGS D KYY A DSVKG(SEQ ID NO：339)
VIWYDGS I KYY G DSVKG(SEQ ID NO：340)
VIWYDGS X 35 KYY X 36 DSVKG (SEQ ID NO：341)
其中X35 為D或I且X36 為A或G。
第6組
N IY Y SGST Y YNPSLKS(SEQ ID NO：342)
R IY T SGST Y YNPSLKS(SEQ ID NO：343)
R IY T SGST N YNPSLKS(SEQ ID NO：329)
X 37 IY X 38 SGST X 41 YNPSLKS (SEQ ID NO：344)
其中X37 為N或R，X38 為Y或T且X41 為Y或N。
重鏈CDR1
第1組：
DLSMH(SEQ ID NO：345)
第2組
DAWMS(SEQ ID NO：346)
第3組
TYAMS(SEQ ID NO：347)
第4組
SYFWS(SEQ ID NO：348)
第5組
SGGYNWS(SEQ ID NO：349)
第6組
NARMGV S(SEQ ID NO：350)
NARMGV N(SEQ ID NO：351)
NARMGV X 39 (SEQ ID NO：352)
其中X39 為S或N。
第7組
S YGIH(SEQ ID NO：353)
N YGIH(SEQ ID NO：354)
X 40 YGIH (SEQ ID NO：355)
其中X40 為S或N。
在一些情況下，抗原結合蛋白包含至少一個具有一個上述共同序列之重鏈CDR1、CDR2或CDR3。在一些情況下，抗原結合蛋白包含至少一個具有一個上述共同序列之輕鏈CDR1、CDR2或CDR3。在其他情況下，抗原結合蛋白包含至少兩個根據上述共同序列之重鏈CDR，及/或至少兩個根據上述共同序列之輕鏈CDR。在其他情況下，抗原結合蛋白包含至少三個根據上述共同序列之重鏈CDR，及/或至少三個根據上述共同序列之輕鏈CDR。
例示性抗原結合蛋白
根據一態樣，分離之抗原結合蛋白包含(a)一或多個選自由以下組成之群的重鏈互補決定區(CDRH)：(i)選自由SEQ ID NO：121-131組成之群的CDRH1；(ii)選自由SEQ ID NO：132-144組成之群的CDRH2；(iii)選自由SEQ ID NO：145-157組成之群的CDRH3；及(iv)含有不超過1、2、3、4或5固胺基酸之一或多個胺基酸取代、缺失或插入之(i)、(ii)及(iii)之CDRH；(b)一或多個選自由以下組成之群的輕鏈互補決定區(CDRL)：(i)選自由SEQ ID NO：158-170組成之群的CDRL1；(ii)選自由SEQ ID NO：171-179組成之群的CDRL2；(iii)選自由SEQ ID NO：180-194 組成之群的CDRL3；及(iv)含有不超過5、4、3、4、2或1個胺基酸之一或多個胺基酸取代、缺失或插入之(i)、(ii)及(iii)之CDRL；或(c)一或多個(a)之重鏈CDRH及一或多個(b)之輕鏈CDRL。
在另一實施例中，CDRH與選自由SEQ ID NO：121-157組成之群的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性，及/或CDRL與選自由SEQ ID NO：158-194組成之群的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。在另一實施例中，VH係選自由SEQ ID NO：121-157組成之群，及/或VL係選自由SEQ ID NO：158-194組成之群。
根據一態樣，分離之抗原結合蛋白包含(a)一或多個選自由以下組成之群的可變重鏈(VH)：(i)SEQ NO：121-157；及(ii)含有不超過5、4、3、4、2或1個胺基酸之一或多個胺基酸取代、缺失或插入之(i)之VH；(b)一或多個選自由以下組成之群的可變輕鏈(VL)：(i)SEQ ID NO：158-194，及(ii)含有不超過5、4、3、4、2或1個胺基酸之一或多個胺基酸取代、缺失或插入之(i)之VL；或(c)一或多個(a)之可變重鏈及一或多個(b)之可變輕鏈。
在另一實施例中，可變重鏈(VH)與選自由SEQ ID NO：121-157組成之群的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性，及/或可變輕鏈(VL)與選自由SEQ ID NO：158-194組成之群的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。
在一態樣中，亦提供一種抗原結合蛋白，其特異性結合至包含一或多個來自FGFR1c、FGRF2c、FGFR3c及FGFR4之胺基酸殘基之抗原決定基。
在一態樣中，亦提供一種抗原結合蛋白，其特異性結合至包含一或多個β-Klotho之胺基酸殘基的抗原決定基。
在另一態樣中，亦提供一種分離之抗原結合蛋白，其特異性結合至包含一或多個來自β-Klotho之胺基酸殘基與一或多個來自FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4之胺基酸殘基之抗原決定基。
在又一實施例中，上文所述之分離之抗原結合蛋白包含有包含至少一個本文所揭示之CDRH共同序列的第一胺基酸序列，及包含至少一個本文所揭示之CDRL共同序列的第二胺基酸序列。
在一態樣中，第一胺基酸序列包含至少兩個CDRH共同序列，及/或第二胺基酸序列包含至少兩個CDRL共同序列。在某些實施例中，第一及第二胺基酸序列彼此共價鍵結。
在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白之第一胺基酸序列包含SEQ ID NO：146之CDRH3、SEQ ID NO：133之CDRH2及SEQ ID NO：122之CDRH1，及/或分離之抗原結合蛋白之第二胺基酸序列包含SEQ ID NO：190之CDRL3、SEQ ID NO：176之CDRL2及SEQ ID NO：167之CDRL1。
在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白之第一胺基酸序列包含SEQ ID NO：147之CDRH3、SEQ ID NO：133之CDRH2及SEQ ID NO：122之CDRH1，及/或分離之抗原結合蛋白之第二胺基酸序列包含SEQ ID NO：189之CDRL3、SEQ ID NO：176之CDRL2及SEQ ID NO：167之CDRL1。
在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白之第一胺基酸序列包含SEQ ID NO：148之CDRH3、SEQ ID NO：133之CDRH2及SEQ ID NO：122之CDRH1，及/或分離之抗原結合蛋白之第二胺基酸序列包含SEQ ID NO：188之CDRL3、SEQ ID NO：176之CDRL2及SEQ ID NO：166之CDRL1。
在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白之第一胺基酸序列包含SEQ ID NO：148之CDRH3、SEQ ID NO：134之CDRH2及SEQ ID NO：122 之CDRH1，及/或分離之抗原結合蛋白之第二胺基酸序列包含SEQ ID NO：188之CDRL3、SEQ ID NO：176之CDRL2及SEQ ID NO：166之CDRL1。
在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白之第一胺基酸序列包含SEQ ID NO：150之CDRH3、SEQ ID NO：136之CDRH2及SEQ ID NO：124之CDRH1，及/或分離之抗原結合蛋白之第二胺基酸序列包含SEQ ID NO：183之CDRL3、SEQ ID NO：174之CDRL2及SEQ ID NO：161之CDRL1。
在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白之第一胺基酸序列包含SEQ ID NO：152之CDRH3、SEQ ID NO：138之CDRH2及SEQ ID NO：124之CDRH1，及/或分離之抗原結合蛋白之第二胺基酸序列包含SEQ ID NO：184之CDRL3、SEQ ID NO：173之CDRL2及SEQ ID NO：162之CDRL1。
在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白之第一胺基酸序列包含SEQ ID NO：152之CDRH3、SEQ ID NO：139之CDRH2及SEQ ID NO：124之CDRH1，及/或分離之抗原結合蛋白之第二胺基酸序列包含SEQ ID NO：186之CDRL3、SEQ ID NO：173之CDRL2及SEQ ID NO：162之CDRL1。
在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白之第一胺基酸序列包含SEQ ID NO：151之CDRH3、SEQ ID NO：137之CDRH2及SEQ ID NO：124之CDRH1，及/或分離之抗原結合蛋白之第二胺基酸序列包含SEQ ID NO：186之CDRL3、SEQ ID NO：173之CDRL2及SEQ ID NO：164之CDRL1。
在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白之第一胺基酸序列包含SEQ ID NO：151之CDRH3、SEQ ID NO：137之CDRH2及SEQ ID NO：124之CDRH1，及/或分離之抗原結合蛋白之第二胺基酸序列包含SEQ ID NO：182之CDRL3、SEQ ID NO：173之CDRL2及SEQ ID NO：160之CDRL1。
在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白之第一胺基酸序列包含SEQ ID NO：153之CDRH3、SEQ ID NO：140之CDRH2及SEQ ID NO：131之CDRH1，及/或分離之抗原結合蛋白之第二胺基酸序列包含SEQ ID NO：185之CDRL3、SEQ ID NO：173之CDRL2及SEQ ID NO：163之CDRL1。
在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白之第一胺基酸序列包含SEQ ID NO：153之CDRH3、SEQ ID NO：140之CDRH2及SEQ ID NO：125之CDRH1，及/或分離之抗原結合蛋白之第二胺基酸序列包含SEQ ID NO：185之CDRL3、SEQ ID NO：173之CDRL2及SEQ ID NO：163之CDRL1。
在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白之第一胺基酸序列包含SEQ ID NO：149之CDRH3、SEQ ID NO：135之CDRH2及SEQ ID NO：123之CDRH1，及/或分離之抗原結合蛋白之第二胺基酸序列包含SEQ ID NO：181之CDRL3、SEQ ID NO：172之CDRL2及SEQ ID NO：159之CDRL1。
在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白之第一胺基酸序列包含SEQ ID NO：149之CDRH3、SEQ ID NO：135之CDRH2及SEQ ID NO：123之CDRH1，及/或分離之抗原結合蛋白之第二胺基酸序列包含SEQ ID NO：187之CDRL3、SEQ ID NO：175之CDRL2及SEQ ID NO：165之CDRL1。
在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白之第一胺基酸序列包含SEQ ID NO：145之CDRH3、SEQ ID NO：132之CDRH2及SEQ ID NO：121之CDRH1，及/或分離之抗原結合蛋白之第二胺基酸序列包含SEQ ID NO：180之CDRL3、SEQ ID NO：171之CDRL2及SEQ ID NO：158之 CDRL1。
在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白之第一胺基酸序列包含SEQ ID NO：154之CDRH3、SEQ ID NO：133之CDRH2及SEQ ID NO：126之CDRH1，及/或分離之抗原結合蛋白之第二胺基酸序列包含SEQ ID NO：191之CDRL3、SEQ ID NO：171之CDRL2及SEQ ID NO：168之CDRL1。
在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白之第一胺基酸序列包含SEQ ID NO：157之CDRH3、SEQ ID NO：144之CDRH2及SEQ ID NO：130之CDRH1，及/或分離之抗原結合蛋白之第二胺基酸序列包含SEQ ID NO：192之CDRL3、SEQ ID NO：177之CDRL2及SEQ ID NO：169之CDRL1。
在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白之第一胺基酸序列包含SEQ ID NO：155之CDRH3、SEQ ID NO：135之CDRH2及SEQ ID NO：127之CDRH1，及/或分離之抗原結合蛋白之第二胺基酸序列包含SEQ ID NO：193之CDRL3、SEQ ID NO：178之CDRL2及SEQ ID NO：170之CDRL1。
在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白之第一胺基酸序列包含SEQ ID NO：156之CDRH3、SEQ ID NO：142之CDRH2及SEQ ID NO：129之CDRH1，及/或分離之抗原結合蛋白之第二胺基酸序列包含SEQ ID NO：194之CDRL3、SEQ ID NO：173之CDRL2及SEQ ID NO：163之CDRL1。
在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白之第一胺基酸序列包含SEQ ID NO：156之CDRH3、SEQ ID NO：141之CDRH2及SEQ ID NO：128之CDRH1，及/或分離之抗原結合蛋白之第二胺基酸序列包含SEQ ID NO：194之CDRL3、SEQ ID NO：173之CDRL2及SEQ ID NO：163之CDRL1。
在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白之第一胺基酸序列包含SEQ ID NO：156之CDRH3、SEQ ID NO：143之CDRH2及SEQ ID NO：128之CDRH1，及/或分離之抗原結合蛋白之第二胺基酸序列包含SEQ ID NO：194之CDRL3、SEQ ID NO：179之CDRL2及SEQ ID NO：163之CDRL1。
在另一實施例中，抗原結合蛋白包含如表4A中所示之重鏈序列H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17或H18之至少兩個CDRH序列。在又一實施例中，抗原結合蛋白包含如表4B中所示之輕鏈序列L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、L10、L11、L12、L13、L14、L15、L16、L17或L18之至少兩個CDRL序列。在又一實施例中，抗原結合蛋白包含如表4A中所示之重鏈序列H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17或H18之至少兩個CDRH序列，及如表4B中所示之輕鏈序列L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、L10、L11、L12、L13、L14、L15、L16、L17或L18之至少兩個CDRL。
在又一實施例中，抗原結合蛋白包含如表4A中所示之重鏈序列H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17或H18之CDRH1、CDRH2及CDRH3序列。在又一實施例中，抗原結合蛋白包含如表4B中所示之輕鏈序列L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、L10、L11、L12、L13、L14、L15、L16、L17或L18之CDRL1、CDRL2及CDRL3序列。
在又一實施例中，抗原結合蛋白包含如表4A及表4B中所示之L1及H1、或L2及H2、或L3及H3、或L3及H4、或L4及H5、或L5及H6、或L6及H7、或L7及H8、或L8及H7、或L9及H9、或L9及H10、或L10及H11、或L11及H11、或L12及H12、或L13及H13、或L14及H14、或L15及H15、或L16及H16、或L17及H17、或L18及H18之所有6個CDR。
Figure TW201805308AD00071
Figure TW201805308AD00072
Figure TW201805308AD00073
在一態樣中，本文提供之特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物的分離之抗原結合蛋白可為單株抗體、多株抗體、重組抗體、人類抗體、人類化抗體、嵌合抗體、多特異性抗體或其抗體片段。
在另一實施例中，本文提供之分離之抗原結合蛋白的抗體片段可為Fab片段、Fab'片段、F(ab')2 片段、Fv片段、微型雙功能抗體或單鏈抗體分子。
在另一實施例中，本文提供之特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物的分離之抗原結合蛋白為人類抗體且可具有IgG1型、IgG2型、IgG3型或IgG4型。
在另一實施例中，特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物的分離之抗原結合蛋白包含如表1A-表1B 中所示之輕鏈或重鏈多肽。在一些實施例中，特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物的抗原結合蛋白包含可變輕鏈或可變重鏈結構域，諸如表2A-表2B中所列舉者。在其他實施例中，特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物的抗原結合蛋白包含如表3A-表3B、表4A-表4B及下文表6C中所示之1、2或3個CDRH或1、2或3個CDRL。該等抗原結合蛋白及實際上任一本文所揭示之抗原結合蛋白可由一或多個聚乙二醇分子聚乙二醇化，例如分子量係選自由5K、10K、20K、40K、50K、60K、80K、100K或大於100K組成之群的聚乙二醇分子。
在另一態樣中，可將本文提供之特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物的任何抗原結合蛋白可偶合至標記組且與一種本文提供之分離之抗原結合蛋白之抗原結合蛋白競爭結合至(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物之細胞外部分。在一實施例中，本文提供之分離之抗原結合蛋白當投與患者時可降低血糖含量，降低三酸甘油酯及膽固醇含量，或改良其他血糖參數及心血管風險因子。
如所瞭解，對於包含一個以上表3A-表3B及表4A-表4B中提供之CDR的任何抗原結合蛋白而言，可使用獨立地選自所述序列之CDR之任何組合。因此，可產生具有1、2、3、4、5或6個獨立選擇之CDR之抗原結合蛋白。然而，如熟習此項技術者所瞭解，特定實施例通常利用非重複CDR之組合，例如抗原結合蛋白通常並非由兩個CDRH2區等製成。
下文詳細討論本文提供之特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物的一些抗原結合蛋白。
抗原結合蛋白及結合抗原決定基及結合域
舉例而言，當抗原結合蛋白被稱為結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物上之抗原決定基，或β-Klotho、FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4之細胞外域時，意謂抗原結合蛋白特異性結合至(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物之特定部分。在一些實施例中，例如在抗原結合蛋白僅結合FGFR1c或β-Klotho之某些情況下，該抗原結合蛋白可特異性結合至由特定殘基(例如β-Klotho、FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4之特定區段，諸如實例14中所揭示之彼等殘基)組成之多肽。在其他實施例中，例如在抗原結合蛋白與β-Klotho及一或多個FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4相互作用之某些情況下，該抗原結合蛋白可視抗原結合蛋白識別之受體而定結合殘基、殘基之序列或β-Klotho與FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4中之區域。在其他實施例中，抗原結合蛋白將結合殘基、殘基之序列或包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者(例如FGFR1c)之複合物的區域。
在任一上述實施例中，該抗原結合蛋白不需要接觸(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物或所述蛋白質或複合物之細胞外域之每一殘基。在(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物內或所述蛋白質或複合物之細胞 外域內未發生每一單個胺基酸取代或缺失，必然明顯影響結合親和力。
抗原決定基特異性及抗原結合蛋白之結合域可藉由多種方法測定。舉例而言，一些方法可使用抗原之截短部分。其他方法利用在一或多個特異性殘基處突變之抗原，諸如藉由利用丙胺酸掃描或精胺酸掃描型方法，或藉由產生及研究多個結構域、區域或胺基酸在兩個蛋白質(例如小鼠及人類形式之一或多個抗原或目標蛋白質)之間交換之嵌合蛋白質，或藉由蛋白酶保護檢定。
競爭性抗原結合蛋白
在另一態樣中，提供抗原結合蛋白，其與例示抗體或功能性片段中之一者競爭結合至(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物。該等抗原結合蛋白亦可結合至與本文所例示之抗原結合蛋白中之一者相同之抗原決定基，或重疊抗原決定基。預期與例示抗原結合蛋白相同之抗原決定基競爭或結合之抗原結合蛋白及片段展示類似功能特性。例示抗原結合蛋白及片段包括具有重鏈及輕鏈H1-H18及L1-L18、可變區結構域VL 1-VL 18及VH 1-VH 18及本文提供之CDR之彼等抗原結合蛋白及片段，包括表1、表2、表3及表4中之彼等抗原結合蛋白及片段。因此，作為特定實例，提供之抗原結合蛋白包括與包含以下之抗體競爭之彼等抗原結合蛋白：(a)針對表3A及表3B及表4A及表4B及下文表6C中所列之抗體所列舉之1、2、3、4、5或所有6個CDR；(b)選自VL 1-VL 18及VH 1-VH 18及針對表2A及表2B中所列之抗體所列舉之VH 及VL ；或(c)如針對表1A及表12B及下文表6A中所列之抗體所具體說明之兩個輕鏈及兩個重鏈。
因此，在一實施例中，本發明提供與參考抗體競爭結合至(i) β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物的抗原結合蛋白，其中參考抗體包含選自由L1H1、L2H2、L3H3、L3H4、L4H5、L5H6、L6H7、L7H8、L8H8、L9H9、L9H10、L10H11、L11H11、L12H12、L13H13、L14H14、L15H15、L16H16、L17H17或L18H18組成之群的輕鏈及重鏈可變域序列之組合。在另一實施例中，本發明提供與參考抗體競爭結合至(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物的人類抗體，其中該參考抗體為17C3、22H5、16H7、24H11、18G1、17D8、26H11、12E4、12C11、21H2、21B4、18B11.1、18B11.2、20D4、46D11、40D2、37D3、39F7、39F1或39G5。
在另一實施例中，提供分離之人類抗體，其以與參考抗體實質上相同之Kd結合至(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物；在活體外ELK螢光素酶檢定中引發與參考抗體相同程度之類似FGF21信號傳導；降低血糖；降低血清脂質含量；及/或與該參考抗體競爭結合至(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物，其中該參考抗體係選自由17C3、22H5、16H7、24H11、18G1、17D8、26H11、12E4、12C11、21H2、21B4、18B11.1、18B11.2、20D4、46D11、40D2、37D3、39F7、39F1或39G5組成之群。
可使用任何適合檢定(諸如實例8中所述之檢定)測定與抗體競爭之能力，其中可將抗原結合蛋白17C3、22H5、16H7、24H11、18G1、17D8、26H11、12E4、12C11、21H2、21B4、18B11.1、18B11.2、20D4、46D11、40D2、37D3、39F7、39F1或39G5用作參考抗體。
單株抗體
提供之抗原結合蛋白包括結合至(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物且以不同程度誘導類似FGF21信號傳導之單株抗體。可使用此項技術中已知之任何技術，例如藉由在免疫程式完成之後使自轉殖基因動物收集之脾臟細胞永生化產生單株抗體。可使用此項技術中已知之任何技術，例如藉由使其與骨髓瘤細胞融合以產生融合瘤使脾臟細胞永生化。用於融合瘤產生融合程序中之骨髓瘤細胞較佳為非抗體產生，具有高融合效率及使其不能在支持僅所需融合細胞(融合瘤)之生長之某些選擇培養基中生長之酶缺乏。適用於小鼠融合中之細胞株之實例包括Sp-20、P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 4 1、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7及S194/5XXO Bul；用於大鼠融合中之細胞株之實例包括R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983F及4B210。適用於細胞融合之其他細胞株為U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2及UC729-6。
在一些情況下，融合瘤細胞株藉由以下步驟產生：用FGFR1c、β-Klotho或FGFR1c及/或β-Klotho免疫原(例如如實例2及實例3中所示之包含FGFR1c、FGFR2c FGFR3c或FGFR4及/或β-Klotho之細胞外域之可溶性複合物；如實例1及實例3中所示之其上表現膜FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4及/或β-Klotho之膜；或如實例1及實例3中所示表現FGFR1c及/或β-Klotho之全細胞)免疫動物(例如具有人類免疫球蛋白序列之轉殖基因動物)；自免疫動物收集脾臟細胞；將收集之脾臟細胞融合至骨髓瘤細胞株，藉此產生融合瘤細胞；由融合瘤細胞建立融合瘤細胞株，且鑑別產生結合至(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物且可誘導類似FGF21信號傳導(例 如如實例5-實例7所述)之抗體的融合瘤細胞株。該等融合瘤及由其產生之單株抗體形成本發明之態樣。
由融合瘤細胞株分泌之單株抗體可使用此項技術中已知之任何技術來純化。可進一步篩檢融合瘤或mAb以鑑別具有特定特性，諸如誘導類似FGF21信號傳導之能力之mAb。本文提供該等篩檢之實例。
嵌合及人類化抗體
可容易地產生基於上述序列之嵌合及人類化抗體。一個實例為嵌合抗體，其為由來自不同抗體且共價接合以產生功能性免疫球蛋白輕鏈或重鏈或其免疫功能性部分之蛋白質區段構成抗體。一般而言，重鏈及/或輕鏈之一部分與源自特定物種或屬於特定抗體類別或子類之抗體中之相應序列相同或同源，而鏈之其餘部分與源自另一物種或屬於另一抗體類別或子類之抗體中之相應序列相同或同源的。對於與嵌合抗體有關之方法而言，參見例如美國專利第4,816,567號；及Morrison等人，1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81 ：6851-6855，該等文獻以引用方式併入本文中。CDR移植描述於例如美國專利第6,180,370號、第5,693,762號、第5,693,761號、第5,585,089號及第5,530,101號中。
一般而言，製造嵌合抗體之目的為產生來自預定患者/接受者物種之胺基酸數目最大之嵌合體。一個實例為「CDR移植」抗體，其中該抗體包含一或多個來自特定物種或屬於特定抗體類別或子類之互補決定區(CDR)，而抗體鏈之其餘部分與源自另一物種或屬於另一抗體類別或子類之抗體中之相應序列相同或同源。對於用於人類而言，通常將來自齧齒動物抗體之可變區或所選CDR移植於人類抗體中，替代天然存在之人類抗體之可變區或CDR。
一種適用類型之嵌合抗體為「人類化」抗體。一般而言，人類化抗體由最初在非人類動物中出現之單株抗體產生。通常來自抗體之非抗原識別部分的此單株抗體中之某些胺基酸殘基經修飾與相應同型之 人類抗體中之相應殘基同源。可例如使用多種方法藉由用齧齒動物可變區之至少一部分取代人類抗體之相應區域進行人類化，(參見例如美國專利第5,585,089號及第5,693,762號；Jones等人，1986,Nature 321 ：522-525；Riechmann等人，1988,Nature 332 ：323-27；Verhoeyen等人，1988,Science 239 ：1534-1536)。
在一態樣中，將本文提供之抗體之輕鏈及重鏈可變區的CDR(例如表3及表4)移植至來自相同或不同系統發育物種之抗體的構架區(FR)。舉例而言，可將重鏈及輕鏈可變區VH 1、VH 2、VH 3、VH 4、VH 5、VH 6、VH 7、VH 8、VH 9、VH 10、VH 11、VH 12、VH 13、VH 14、VH 15、VH 16、VH 17 or VH 18及/或VL 1、VL 2、VL 3、VL 4、VL 5、VL 6、VL 7、VL 8、VL 9、VL 10、VL 11、VH 12、VL 13、VL 14、VL 15、VL 16、VL 17或VL 18之CDR移植至共同人類FR中。為產生共同人類FR，可比對來自若干人類重鏈或輕鏈胺基酸序列之FR以鑑別共同胺基酸序列。在其他實施例中，經來自不同重鏈或輕鏈之FR置換本文所揭示之重鏈或輕鏈之FR。在一態樣中，特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物的抗原結合蛋白(例如抗體)之重鏈及輕鏈的FR中之稀有胺基酸不會被替代，而替代FR胺基酸之其餘部分。「稀有胺基酸」為處於通常不會在FR中發現之此特定胺基酸之位置的特異性胺基酸。或者，可使用來自一重鏈或輕鏈之移植可變區與不同於如本文所揭示之特定重鏈或輕鏈之恆定區的恆定區。在其他實施例中，移植可變區為單鏈Fv抗體之一部分。
在某些實施例中，可使用來自非人類之物種的恆定區以及人類可變區，以產生雜交抗體。
全人類抗體
亦藉由本發明提供全人類抗體。方法可用於在不將人類曝露於抗 原之情況下製造對指定抗原具有特異性之全人類抗體(「全人類抗體」)。為實現產生全人類抗體所提供之一種特異性方法為小鼠體液性免疫系統之「人類化」。將人類免疫球蛋白(Ig)基因座引入內源性Ig基因已無活性之小鼠中為在小鼠(亦即一種可由任何合乎需要之抗原免疫的動物)中一種產生全人類單株抗體(mAb)之方法。使用全人類抗體可使有時可由向人類投與小鼠或小鼠源mAb作為治療劑所引起免疫原性及過敏性反應減至最小。
全人類抗體可藉由免疫能夠在無內源性免疫球蛋白產生之情況下產生人類抗體譜系之轉殖基因動物(通常為小鼠)來產生。用於此目的之抗原通常具有6個或6個以上連續胺基酸，且視情況結合至載劑，諸如半抗原。參見例如Jakobovits等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 ：2551-2555；Jakobovits等人，(1993)Nature 362 ：255-258；及Bruggermann等人，(1993)Year in Immunol. 7 ：33。在該方法之一實例中，轉殖基因動物藉由以下步驟產生：使內源性小鼠免疫球蛋白基因座不能編碼其中之小鼠重及輕免疫球蛋白鏈，且插入含有編碼人類重鏈及輕鏈蛋白質之基因座的人類基因組DNA之小鼠基因組大片段中。接著使補體少於人類免疫球蛋白基因座之全部補體的部分修飾之動物雜交以獲得具有所有所需免疫系統修飾之動物。當投與免疫原時，此等轉殖基因動物產生對免疫原具有免疫特異性但具有人類而非鼠類胺基酸序列(包括可變區)之抗體。關於該等方法之更多細節，參見例如WO 96/33735及WO 94/02602。與轉殖基因小鼠有關之製造人類抗體之其他方法描述於美國專利第5,545,807號；第6,713,610號；第6,673,986號；第6,162,963號；第5,545,807號；第6,300,129號；第6,255,458號；第5,877,397號；第5,874,299號及第5,545,806號中；PCT公開案WO 91/10741、WO 90/04036及EP 546073B1及EP 546073A1。
本文稱為「HuMab」小鼠之如上所述轉殖基因小鼠含有編碼非重 組人類重鏈([μ]及[γ])及[κ]輕鏈免疫球蛋白序列之人類免疫球蛋白基因微小基因座，以及使內源性μ及κ鏈基因座無活性之目標突變(Lonberg等人，1994,Nature 368：856-859)。因此，該小鼠展現降低之小鼠IgM或[κ]表現及對免疫之反應，且引入之人類重鏈及輕鏈轉殖基因經歷類別轉換及體細胞突變產生高親和力人類IgG[κ]單株抗體(Lonberg等人，上述；Lonberg及Huszar,(1995)Intern.Rev.Immunol. 13 ：65-93；Harding及Lonberg,(1995)Ann.N.Y Acad.Sci. 764 ：536-546)。HuMab小鼠之製備詳細描述於Taylor等人，(1992)Nucleic Acids Research 20 ：6287-6295；Chen等人，(1993)International Immunology 5 ：647-656；Tuaillon等人，(1994)J.Immunol. 152 ：2912-2920；Lonberg等人，(1994)Nature 368 ：856-859；Lonberg,(1994)Handbook of Exp.Pharmacology 113 ：49-101；Taylor等人，(1994)International Immunology 6 ：579-591；Lonberg及Huszar,(1995)Intern.Rev.Immunol. 13 ：65-93；Harding及Lonberg,(1995)Ann.N.YAcad.Sci. 764 ：536-546；Fishwild等人，(1996)Nature Biotechnology 14 ：845-851；為所有目的，上述參考文獻係以全文引用的方式併入本文中。另外參見美國專利第5,545,806號；第5,569,825號；第5,625,126號；第5,633,425號；第5,789,650號；第5,877,397號；第5,661,016號；第5,814,318號；第5,874,299號；及第5,770,429號；以及美國專利第5,545,807號；國際公開案第WO 93/1227號；WO 92/22646；及WO 92/03918，為所有目的，所有文獻之揭示內容均以全文引用的方式併入本文中。WO 98/24893及Mendez等人，(1997)Nature Genetics 15 ：146-156中亦揭示用以在此等轉殖基因小鼠中產生人類抗體之技術，該等文獻以引用方式併入本文中。舉例而言，可使用HCo7及HCo12轉殖基因小鼠菌株產生結合至(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物且 可誘導類似FGF21信號傳導之抗原結合蛋白(例如抗體)。在以下實例中提供關於使用轉殖基因小鼠產生人類抗體之其他細節。
使用融合瘤技術，可產生具有所需特異性之抗原特異性人類mAb，且其可選自轉殖基因小鼠，諸如上文所述之彼等轉殖基因小鼠。該等抗體可使用適合載體及宿主細胞選殖及表現，或可自培養之融合瘤細胞收集該等抗體。
全人類抗體亦可源自噬菌體展示文庫(如Hoogenboom等人，(1991)J.Mol.Biol. 227 ：381；及Marks等人，(1991)J.Mol.Biol. 222 ：581中所述)。噬菌體展示技術模擬經由抗體譜系於絲狀噬菌體表面上之展示的免疫選擇及藉由噬菌體與所選抗原結合之噬菌體的後續選擇。一種該技術描述於PCT公開案第WO 99/10494號中(以引用方式併入本文中)，其描述使用該方法針對MPL-受體及msk-受體分離高親和力及功能性促效抗體。
雙特異性或雙功能性抗原結合蛋白
亦提供如上所述包括一或多個CDR或一或多個可變區之雙特異性及雙功能性抗體。在一些情況下，雙特異性或雙功能性抗體可為具有兩個不同重/輕鏈對及兩個不同結合位點之人工雜交抗體。雙特異性抗體可由包括(但不限於)融合瘤融合或Fab'片段連接之多種方法產生。參見例如Songsivilai及Lachmann,1990,Clin.Exp.Immunol. 79 ：315-321；Kostelny等人，1992,J.Immunol. 148 ：1547-1553。當本發明之抗原結合蛋白結合(i)β-Klotho與FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4中之一或多者；或(ii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物時，如由實例5-實例7中所述之類似FGF21功能及信號傳導檢定所量測，該結合可使類似FGF21活性活化；當該抗原結合蛋白為抗體時，將其稱為促效抗體。
多種其他形式
一些本發明提供之特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物的抗原結合蛋白包括本文所揭示之抗原結合蛋白之變異體形式(例如具有表1-表4中所列之序列之彼等抗原結合蛋白)。
在多個實施例中，本文所揭示之抗原結合蛋白可包含一或多個非天然存在之胺基酸。舉例而言，一些抗原結合蛋白具有一或多個表1-表4中所列之重或輕鏈、可變區或CDR之一或多個非天然存在之胺基酸取代。非天然胺基酸(其可視需要替代見於本文所揭示之任何序列中之任何天然存在之胺基酸)之實例包括：4-羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸、ε-N,N,N-三甲基離胺酸、ε-N-乙醯離胺酸、O-磷絲胺酸、N-乙醯絲胺酸、N-甲醯甲硫胺酸、3-甲基組胺酸、5-羥基離胺酸、σ-N-甲基精胺酸及其他類似胺基酸及亞胺基酸(例如4-羥基脯胺酸)。在本文中所使用之多肽記錄法中，根據標準用法及慣例，左側方向為胺基末端方向且右側方向為羧基末端方向。可插入抗原結合蛋白序列中或替代抗原結合序列中之野生型殘基的非天然存在之胺基酸之實例的非限制性列舉包括β-胺基酸、高胺基酸、環狀胺基酸及具有衍生側鏈之胺基酸。實例包括(呈L形式或D形式；括號中為縮寫)：瓜胺酸(Cit)、高瓜胺酸(hCit)、Nα-甲基瓜胺酸(NMeCit)、Nα-甲基高瓜胺酸(Nα-MeHoCit)、鳥胺酸(Orn)、Nα-甲基鳥胺酸(Nα-MeOrn或NMeOrn)、肌胺酸(Sar)、高離胺酸(hLys或hK)、高精胺酸(hArg或hR)、高麩醯胺酸(hQ)、Nα-甲基精胺酸(NMeR)、Nα-甲基白胺酸(Nα-MeL或NMeL)、N-甲基高離胺酸(NMeHoK)、Nα-甲基麩醯胺酸(NMeQ)、正白胺酸(Nle)、正纈胺酸(Nva)、1,2,3,4-四氫異喹啉(Tic)、八氫吲哚-2-甲酸(Oic)、3-(1-萘基)丙胺酸(1-Nal)、3-(2-萘基)丙胺酸(2-Nal)、1,2,3,4-四氫異喹啉(Tic)、2-二氫茚基甘胺酸(IgI)、對碘苯丙胺酸(pI-Phe)、對胺基苯丙胺酸(4AmP 或4-Amino-Phe)、4-胍基苯丙胺酸(Guf)、甘胺醯基離胺酸(縮寫為「K(Nε-glycyl)」或「K(glycyl)」或「K(gly)」)、硝基苯丙胺酸(nitrophe)、胺基苯丙胺酸(aminophe或Amino-Phe)、苄基苯丙胺酸(benzylphe)、γ-羧基麩胺酸(γ-carboxyglu)、羥基脯胺酸(hydroxypro)、對羧基-苯丙胺酸(Cpa)、α-胺基己二酸(Aad)、Nα-甲基纈胺酸(NMeVal)、N-α-甲基白胺酸(NMeLeu)、Nα-甲基正白胺酸(NMeNle)、環戊基甘胺酸(Cpg)、環己基甘胺酸(Chg)、乙醯精胺酸(acetylarg)、α,β-二胺基丙酸(Dpr)、α,γ-二胺基丁酸(Dab)、二胺基丙酸(Dap)、環己基丙胺酸(Cha)、4-甲基-苯丙胺酸(MePhe)、β,β-二苯基-丙胺酸(BiPhA)、胺基丁酸(Abu)、4-苯基-苯丙胺酸(或聯苯丙胺酸；4Bip)、α-胺基-異丁酸(Aib)、β-丙胺酸、β-胺基丙酸、哌啶酸、胺基己酸、胺基庚酸、胺基庚二酸、鎖鏈素、二胺基庚二酸、N-乙基甘胺酸、N-乙基天冬醯胺、羥基離胺酸、別羥基離胺酸、異鎖鏈素、別異白胺酸、N-甲基甘胺酸、N-甲基異白胺酸、N-甲基纈胺酸、4-羥基脯胺酸(Hyp)、γ-羧基麩胺酸、ε-N,N,N-三甲基離胺酸、ε-N-乙醯離胺酸、O-磷絲胺酸、N-乙醯絲胺酸、N-甲醯甲硫胺酸、3-甲基組胺酸、5-羥基離胺酸、ω-甲基精胺酸、4-胺基-O-鄰苯二甲酸(4APA)及其他類似胺基酸及特定列舉之任一彼等胺基酸之衍生形式。
另外，抗原結合蛋白可具有一或多個表1-表4中所列之重或輕鏈、可變區或CDR之一或多個保守胺基酸取代。可基於常見側鏈特性將天然存在之胺基酸分類：1)疏水性胺基酸：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；2)中性親水性胺基酸：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；3)酸性胺基酸：Asp、Glu；4)鹼性胺基酸：His、Lys、Arg；5)影響鏈定向之殘基：Gly、Pro；及 6)芳族胺基酸：Trp、Tyr、Phe。
保守胺基酸取代可涉及將一種此等類別中之一成員換成同一類別中之另一成員。保守性胺基酸取代可涵蓋通常藉由化學肽合成而非藉由生物系統中之合成併入的非天然存在之胺基酸殘基。參見下文表5。此等胺基酸殘基包括肽模擬物及胺基酸部分之其他反向或反相形式。
非保守性取代可涉及將一種上述類別中之一成員換成另一種類中之一成員。可將該等經取代之殘基引入與人類抗體同源之抗體之區域或分子之非同源區域中。
在發生該等改變之過程中，根據某些實施例，可考慮胺基酸之親水指數。蛋白質之親水概況藉由為各胺基酸分配一數值(「親水指數」)且接著沿肽鏈反覆取此等值的平均來計算。各胺基酸已基於其疏水性及電荷特徵分配一親水指數。該等胺基酸為：異白胺酸(+4.5)；纈胺酸(+4.2)；白胺酸(+3.8)；苯丙胺酸(+2.8)；半胱胺酸/胱胺酸(+2.5)；甲硫胺酸(+1.9)；丙胺酸(+1.8)；甘胺酸(-0.4)；蘇胺酸(-0.7)；絲胺酸(-0.8)；色胺酸(-0.9)；酪胺酸(-1.3)；脯胺酸(-1.6)；組胺酸(-3.2)；麩胺酸(-3.5)；麩醯胺酸(-3.5)；天門冬胺酸(-3.5)；天冬醯胺(-3.5)；離胺酸(-3.9)；及精胺酸(-4.5)。
此項技術中已瞭解親水概況在賦予蛋白質互動生物功能中之重要性(參見例如Kyte等人，1982,J.Mol.Biol. 157 ：105-131)。已知可用某些胺基酸替代具有類似親水指數或分數之其他胺基酸，且仍保留類似生物活性。在基於親水指數發生改變之過程中，在某些實施例中，包括親水指數在±2範圍內之胺基酸的取代。在一些態樣中，包括在±1範圍內之胺基酸的取代，且在其他態樣中，包括在±0.5內之胺基酸的取代。
在此項技術中亦應瞭解，如在本發明之情況下，可基於親水性有 效地進行類似胺基酸之取代，特定言之其中藉此產生之生物學功能蛋白或肽意欲用於免疫實施例。在某些實施例中，如由蛋白質之鄰近胺基酸之親水性控制之蛋白質之最大局部平均親水性與其免疫原性及抗原結合或免疫原性有關，亦即與蛋白質之生物特性有關。
已將以下親水性數值分配給此等胺基酸殘基：精胺酸(+3.0)；離胺酸(+3.0)；天門冬胺酸(+3.0±1)；麩胺酸(+3.0±1)；絲胺酸(+0.3)；天冬醯胺(+0.2)；麩醯胺酸(+0.2)；甘胺酸(0)；蘇胺酸(-0.4)；脯胺酸(-0.5±1)；丙胺酸(-0.5)；組胺酸(-0.5)；半胱胺酸(-1.0)；甲硫胺酸(-1.3)；纈胺酸(-1.5)；白胺酸(-1.8)；異白胺酸(-1.8)；酪胺酸(-2.3)；苯丙胺酸(-2.5)及色胺酸(-3.4)。在基於類似親水性數值發生改變之過程中，在某些實施例中，包括親水性數值在±2範圍內之胺基酸的取代，在其他實施例中，包括在±1範圍內之胺基酸的取代，且在其他實施例中，包括取代在±0.5內之胺基酸的取代。在一些情況下，亦可基於親水性鑑別來自一級胺基酸序列之抗原決定基。此等區域亦稱為「抗原決定核心區」。
表5中闡述例示性保守胺基酸取代。
Figure TW201805308AD00074
Figure TW201805308AD00075
熟練技術者將能夠使用熟知技術結合本文提供之資訊測定如本文所述之多肽之適合變異體。熟習此項技術者可鑑別可改變而不會藉由咸信對於活性並不重要之目標區域破壞活性的分子之適合區域。熟練技術者亦能鑑別在類似多肽中保守之殘基及分子之一部分。
在其他實施例中，甚至對生物活性或對結構可謂重要之區域可經受保守胺基酸取代而不破壞生物活性或不會不利地影響多肽結構。
另外，熟習此項技術者可回顧關於識別類似多肽中對活性或結構而言重要之殘基的結構功能研究。鑒於該比較，可預測在蛋白質中與類似蛋白質中對活性或結構重要之胺基酸殘基對應之胺基酸殘基的重要性。熟習此項技術者可選擇化學上類似之胺基酸取代來用於該等預測之重要胺基酸殘基。
熟習此項技術者亦可分析與類似多肽中之三維結構相關之三維結構及胺基酸序列。鑒於該資訊，熟習此項技術者可關於其三維結構預測抗體之胺基酸殘基之比對。熟習此項技術者可選擇不使胺基酸殘基發生預測在蛋白質之表面上之自由基改變，因為該等殘基可涉及與其他分子之重要相互作用。此外，熟習此項技術者可產生在各所需胺基酸殘基處含有單一胺基酸取代之測試變異體。接著可使用用於類似FGF21信號傳導之檢定篩檢此等變異體，(參見本文提供之實例)，因此產生與可改變胺基酸及不可改變胺基酸相關之資訊。換言之，基於自該等常規實驗收集之資訊，熟習此項技術者可容易地判定何處應單獨避免進一步取代或連同其他突變之胺基酸。
許多科學出版物已致力於二級結構之預測。參見Moult,(1996)Curr.Op.in Biotech. 7 ：422-427；Chou等人，(1974)Biochem. 13 ：222-245；Chou等人，(1974)Biochemistry 113 ：211-222；Chou等人，(1978)Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol. 47 ：45-148；Chou等人，(1979)Ann.Rev.Biochem. 47 ：251-276；及Chou等人，(1979)Biophys.J. 26 ：367-384。此外，目前可用電腦程式幫助預測二級結構。預測二級結構之一種方法係基於同源模型。舉例而言，具有大於約30%的序列同一性或大於40%的相似性之兩種多肽或蛋白質通常具有類似結構拓撲。蛋白質結構資料庫(PDB)之發展增強了二級結構(包括多肽或蛋白質之結構內潛在的摺疊數)之可預測性。參見Holm等人，(1999)Nucl.Acid.Res. 27 ：244-247。已表明(Brenner等人，(1997)Curr.Op.Struct.Biol. 7 ：369-376)在指定多肽或蛋白質中存在有限數量之摺疊，且一旦解析關鍵數量之結構，結構預測將明顯更精確。
預測二級結構之其他方法包括「穿線(threading)」(Jones,(1997)Curr.Opin.Struct.Biol. 7 ：377-387；Sippl等人，(1996)Structure 4 ：15-19)、「輪廓分析(profile analysis)」(Bowie等人，(1991)Science 253 ：164-170；Gribskov等人，(1990)Meth.Enzym. 183 ：146-159；Gribskov等人，(1987)Proc.Nat.Acad.Sci. 84 ：4355-4358)及「進化連接(evolutionary linkage)」(參見Holm,(1999)上述；及Brenner,(1997)上述)。
在一些實施例中，進行以下胺基酸取代：(1)減少對蛋白水解之敏感性，(2)減少對氧化之敏感性，(3)改變形成蛋白複合物之結合親和力，(4)改變配位體或抗原結合親和力，及/或(4)賦予該等多肽其他物理化學或功能性性質或更改該等性質。舉例而言，可在天然存在之序列中進行單個或多個胺基酸取代(在某些實施例中，保守胺基酸取代)。可在位於結構域外形成分子間接觸之抗體之彼部分中進行取代。在該等實施例中，可使用實質上不改變親本序列之結構特徵(例如一或 多個不破壞表徵親本或天然抗原結合蛋白之二級結構的置換胺基酸)的保守胺基酸取代。技術公認之多肽二級及三級結構之實例描述於Proteins,Structures and Molecular Principles (Creighton編)，1984,W.H.New York：Freeman and Company；Introduction to Protein Structure (Branden及Tooze編)，1991,New York：Garland Publishing；及Thornton等人，(1991)Nature 354 ：105中，該等文獻各以引用方式併入本文中。
其他較佳抗體變異體包括半胱胺酸變異體，其中將親本或天然胺基酸序列中之一或多個半胱胺酸殘基自另一胺基酸(例如絲胺酸)刪除或由另一胺基酸取代。半胱胺酸變異體適用，當必須將抗體再摺疊成生物學活性構形時尤其如此。半胱胺酸變異體可具有比天然抗體少的半胱胺酸殘基，且通常具有偶數個以將由未成對半胱胺酸引起之相互作用降至最低。
可使用所揭示之重鏈及輕鏈、可變區結構域及CDR以製備含有可特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物且可誘導類似FGF21信號傳導之抗原結合區之多肽。舉例而言，可將表3及表4中所列之一或多個CDR共價或非共價地併入分子(例如多肽)中以產生免疫黏附素。免疫黏附素可併入有作為較大多肽鏈之一部分的CDR，可共價連接CDR至另一多肽鏈或可非共價地併入有CDR。CDR使免疫黏附素特異性結合至所關注之特定抗原(例如(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物或其上之抗原決定基)。
可使用所揭示之重鏈及輕鏈、可變區結構域及CDR製備含有可特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合 物且可誘導類似FGF21信號傳導之抗原結合區之多肽。舉例而言，可將表3及表4中所列之一或多個CDR併入結構上與包含與Fc片段配對之抗原結合蛋白之重鏈、輕鏈的「半」抗體類似之分子(例如多肽)中，以便抗原結合區為單價的(如Fab片段)但具有二聚Fc部分。
亦提供基於本文所述可變區結構域及CDR之模擬物(例如「肽模擬物」)。此等類似物可為肽、非肽或肽及非肽區之組合。Fauchere,1986,Adv.Drug Res. 15 ：29；Veber及Freidinger,1985,TINS 第392頁；及Evans等人，1987,J.Med.Chem. 30 ：1229，該等文獻為任何目的以引用的方式併入本文中。結構上與治療上適用之肽類似之肽模擬物可用以產生類似的治療或預防效果。該等化合物通常藉助於電腦化分子模型來研發。一般而言，肽模擬物為與展示所需生物活性(本文中諸如特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物之能力)之抗體結構上類似，但具有視情況藉由此項技術中熟知之方法經選自以下之鍵置換之一或多個肽鍵：-CH2 NH-、-CH2 S-、-CH2 -CH2 -、-CH-CH-(順式及反式)、-COCH2 -、-CH(OH)CH2 -及-CH2 SO-之蛋白質。可在某些實施例中使用用同型之D胺基酸系統取代共同序列之一或多個胺基酸(例如D-離胺酸替代L-離胺酸)產生更穩定蛋白質。另外，包含共同序列或實質上一致之共同序列變化的限制性肽可由此項技術中已知之方法產生(Rizo及Gierasch,1992,Ann.Rev.Biochem. 61 ：387，其以引用的方式併入本文中)，例如藉由添加能夠形成使肽環化之分子內二硫橋的內部半胱胺酸殘基產生。
亦提供本文所述之特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物的抗原結合蛋白之衍生物。衍生之抗原結合蛋白可包含對抗體或片段賦予所需特性，諸如在特定使用中 增加半衰期之任何分子或物質。衍生之抗原結合蛋白可包含例如可偵測(或標記)部分(例如放射性、比色、抗原或酶促分子、可偵測珠粒(諸如磁性或電密(例如金)珠粒)、或結合至另一分子之分子(例如生物素或抗生蛋白鏈菌素))、治療或診斷部分(例如放射性、細胞毒性或醫藥學活性部分)或增加抗原結合蛋白對特定用途之適用性的分子(例如投與個體，諸如人類個體或其他活體內或活體外用途)。可用以衍生抗原結合蛋白之分子之實例包括白蛋白(例如人血清白蛋白)及聚乙二醇(PEG)。可使用此項技術中熟知之技術製備抗原結合蛋白之白蛋白連接及聚乙二醇化衍生物。某些抗原結合蛋白包括如本文所述之聚乙二醇化單鏈多肽。在一實施例中，使抗原結合蛋白結合或另外連接至運甲狀腺素蛋白(TTR)或TTR變異體。TTR或TTR變異體可用例如選自由葡聚糖、聚(正乙烯吡咯啶酮)、聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚合物、聚氧乙烯化多元醇及聚乙烯醇組成之群的化學品化學上修飾。
其他衍生物包括諸如藉由表現包含融合至誘導類似FGF21信號傳導之抗原結合蛋白之N端或C端之異源多肽的重組融合蛋白得到之本文所揭示之特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物的抗原結合蛋白與其他蛋白質或多肽的共價或聚集結合物。舉例而言，結合肽可為異源信號傳導(或前導序列)多肽，例如酵母α因子前導序列，或諸如抗原決定基標籤之肽。本發明之含有抗原結合蛋白之融合蛋白可包含肽，經添加以有助於純化或鑑別特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物(例如poly-His標籤)且可誘導類似FGF21信號傳導之抗原結合蛋白。如Hopp等人，1988,Bio/Technology 6 ：1204；及美國專利第5,011,912號所 述，特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物的抗原結合蛋白亦可連接至FLAG肽。FLAG肽極具抗原性且提供藉由特異性單株抗體(mAb)可逆結合之抗原決定基，從而能夠快速檢定及易於純化表現之重組蛋白質。適用於製備融合蛋白之試劑可購得(Sigma,St.Louis,MO)，其中將FLAG肽融合至指定多肽。
包含一或多個特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物的抗原結合蛋白之多聚體形成本發明之另一態樣。多聚體可呈共價連接或非共價連接二聚體、三聚體或更高級多聚體形式。包含兩個或兩個以上結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物且可誘導類似FGF21信號傳導之抗原結合蛋白的多聚體意欲用作治療劑、診斷劑且亦用於其他用途，其中該多聚體之一實例為均二聚體。其他例示性多聚體包括雜二聚體、.同源三聚體、雜三聚體、同源四聚體、雜四聚體等。
一實施例係針對包含經由融合至特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物的抗原結合蛋白肽部分之間的共價或非共價相互作用接合之多個特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物的抗原結合蛋白的多聚體。該等肽可為肽連接子(間隔基)或具有促進多聚化之特性的肽。如本文所更詳細描述，白胺酸拉鏈及源自抗體之某些多肽為可促進其所連接之抗原結合蛋白多聚化之肽。
在特定實施例中，多聚體包含2至4個結合(i)β-Klotho；(ii) FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物的抗原結合蛋白。多聚體之抗原結合蛋白部分可呈上文所述之任何形式，例如變異體或片段。較佳地，多聚體包含能夠特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物的抗原結合蛋白。
在一實施例中，使用源自免疫球蛋白之多肽製備寡聚物。已例如藉由Ashkenazi等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88 ：10535；Byrn等人，(1990)Nature 344 ：677；及Hollenbaugh等人，1992「Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins」,Current Protocols in Immunology ，增刊4，第10.19.1-10.19.11頁描述製備包含融合至抗體衍生之多肽之多個部分之某些異源多肽(包括Fc域)之融合蛋白。
一實施例包含有包含兩個由使特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物的抗原結合蛋白融合至抗體之Fc區產生的融合蛋白之二聚體。二聚體可藉由例如將編碼融合蛋白之基因融合物插入適當表現載體中，在用重組表現載體轉型之宿主細胞中表現基因融合物且允許表現之融合蛋白組合大量類似抗體分子，因此在Fc部分之間形成鏈間二硫鍵以產生二聚體來製造。
如本文所用之術語「Fc多肽」包括源自抗體之Fc區多肽之天然及突變型蛋白形式。亦包括含有促進二聚作用之鉸鏈區之該等多肽之截短形式。包含Fc部分之融合蛋白(及由此形成之寡聚物)有利於容易地藉由親和層析法經蛋白質A或蛋白質G管柱純化。
PCT申請案WO 93/10151及美國專利第5,426,048號及第5,262,522號中所述之一種適合Fc多肽為自N端鉸鏈區向人類IgG1抗體之Fc區之天然C端延伸之單鏈多肽。另一適用Fc多肽為美國專利第5,457,035號 及Baum等人，(1994)EMBO J. 13 ：3992-4001中所述之Fc突變型蛋白。此突變型蛋白之胺基酸序列與WO 93/10151中存在之天然Fc序列之胺基酸序列一致，其中例外為胺基酸19已由Leu變為Ala，胺基酸20已由Leu變為Glu且胺基酸22已由Gly變為Ala。突變型蛋白展現對Fc受體之低親和力。
在其他實施例中，可用如本文所揭示之抗原結合蛋白之重及/或輕鏈之可變部分取代抗體重及/或輕鏈之可變部分。
或者，寡聚物為包含多個在有或無連接子(間隔肽)之情況下特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物的抗原結合蛋白之融合蛋白。其中適合肽連接子為美國專利第4,751,180號及第4,935,233號中所述之彼等肽連接子。
製備包含特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物之彼抗原結合蛋白之寡聚衍生物的另一種方法涉及使用白胺酸拉鏈。白胺酸拉鏈域為促進發現其之蛋白質寡聚反應之肽。最初在若干DNA結合蛋白(Landschulz等人，(1988)Science 240 ：1759)中鑑別出白胺酸拉鏈，且從此見於多種不同蛋白質中。其中已知白胺酸拉鏈為會二聚或三聚之天然存在之肽及其衍生物。適用於產生可溶性寡聚蛋白質之白胺酸拉鏈域之實例描述於PCT申請案WO 94/10308中，且源自肺界面活性劑蛋白質D(SPD)之白胺酸拉鏈描述於Hoppe等人，(1994)FEBS Letters 344 ：191中，其以引用方式併入本文中。與經修飾白胺酸拉鏈融合之異源蛋白穩定三聚的經修飾白胺酸拉鏈之用途描述於Fanslow等人，(1994)Semin.Immunol. 6 ：267-278中。在一種方法中，使包含特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c 及FGFR4中之一者的複合物且融合至白胺酸拉鏈肽之抗原結合蛋白片段或衍生物之重組融合蛋白，表現於適合宿主細胞中，且自培養物上清液回收所形成之可溶性寡聚抗原結合蛋白片段或衍生物。
在某些實施例中，抗原結合蛋白之KD (平衡結合親和力)小於1pM、10pM、100pM、1nM、2nM、5nM、10nM、25nM或50nM。
在另一態樣中，本發明提供活體外或活體內半衰期為至少一天(例如當投與人類個體時)之抗原結合蛋白。在一實施例中，抗原結合蛋白之半衰期為至少三天。在另一實施例中，抗體或其部分之半衰期為4天或更長。在另一實施例中，抗體或其部分具有之半衰期為8天或更長。在另一實施例中，抗體或其部分之半衰期為10天或更長。在另一實施例中，抗體或其部分之半衰期為11天或更長。在另一實施例中，抗體或其部分之半衰期為15天或更長。在另一實施例中，抗體或其抗原結合部分經衍生或修飾，以致其具有與未經衍生或未經修飾之抗體相比較長之半衰期。在另一實施例中，如以引用的方式併入本文中之2000年2月24日公開之WO 00/09560中所述，特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物的抗原結合蛋白含有點突變以增加血清半衰期。
糖基化作用
特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物的抗原結合蛋白可具有與天然物種中所見之彼糖基化模式不同或自其改變之糖基化模式。如此項技術中所已知，糖基化模型可視蛋白質之序列(例如存在或不存在以下所述之特定糖基化胺基酸殘基)或產生蛋白質之宿主細胞或生物體而定。以下討論特定表現系統。
多肽之糖基化通常為N連接型或O連接型。N連接型係指碳水化合物部分與天冬醯胺殘基之側鏈連接。三肽序列天冬醯胺-X-絲胺酸及天冬醯胺-X-蘇胺酸(其中X為除脯胺酸外之任何胺基酸)為碳水化合物部分酶促結合至天冬醯胺側鏈之識別序列。因此，此等三肽序列中之任一者在抗體中的存在產生潛在性糖基化位點。O連接型糖基化係指糖N-乙醯基半乳胺糖、半乳糖或木糖中之一者與羥基胺基酸連接，儘管亦可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸，但最常見的為絲胺酸或蘇胺酸。
向抗原結合蛋白加入糖基化位點宜藉由改變胺基酸序列，以致其含有一或多個上述三肽序列(對於N連接糖基化位點而言)來方便地完成。亦可藉由向起始序列加入一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基或經一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基取代起始序列來進行改變(對於O連接糖基化位點而言)。簡易地，抗原結合蛋白胺基酸序列可經由DNA含量之變化而改變，特定言之藉由在預先選定之鹼基上使編碼目標多肽之DNA突變以致產生將轉化為所需胺基酸之密碼子。
增加抗原結合蛋白上之碳水化合物部分數目之其他方法為藉由使糖苷與蛋白質化學或酶促偶合。此等程序之有利之處在於其不需要在宿主細胞中產生具有能夠進行N或O連接型糖基化之糖基化能力的蛋白質。視所用偶合模式而定，可將該或該等糖連接至(a)精胺酸及組胺酸、(b)游離羧基、(c)游離巰基(諸如半胱胺酸之彼等巰基)、(d)游離羥基(諸如絲胺酸、蘇胺酸、或羥基脯胺酸之彼等羥基)、(e)芳族殘基(諸如苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸之彼等芳族殘基)、或(f)麩醯胺酸之醯胺基。此等方法描述於WO 87/05330及Aplin及Wriston,(1981)CRC Crit.Rev.Biochem. ，第259-306頁中。
可化學或酶促完成存在於起始抗原結合蛋白上之碳水化合物部分之移除。化學去糖基化作用需要將該蛋白質曝露至化合物三氟甲磺 酸或等效化合物。此處理引起除連接糖(N-乙醯葡糖胺或N-乙醯半乳糖胺)之外的絕大多數或所有糖之裂解，而使抗體完整。Hakimuddin等人，(1987)Arch.Biochem.Biophys. 259 ：52及Edge等人，(1981)Anal.Biochem. 118 ：131描述化學去糖基化作用。多肽上之碳水化合物部分之酶促裂解可如由Thotakura等人，(1987)Meth.Enzymol. 138 ：350所述藉由使用多種內醣苷酶及外醣苷酶而達到。可如Duskin等人，(1982)J.Biol.Chem. 257 ：3105所述藉由使用化合物衣黴素防止潛在性糖基化位點處之糖基化作用。衣黴素阻斷蛋白質-N-糖苷鍵形成。
因此，本發明之態樣包括特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物的抗原結合蛋白之糖基化變異體，其中糖基化位點之數目及/或類型與親本多肽之胺基酸序列相比已有改變。在某些實施例中，抗體蛋白質變異體包含與天然抗體相比更多或更少數目的N連接型糖基化位點。N連接型糖基化位點之特徵在於以下序列：Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中表示為X之胺基酸殘基可為除脯胺酸外之任何胺基酸殘基。產生此序列之胺基酸殘基之取代提供潛在的新穎位點以用於添加N連接型碳水化合物鏈。或者，消除或改變此序列之取代將防止添加N連接天然多肽中存在之型碳水化合物鏈。舉例而言，可藉由缺失Asn或藉由用不同胺基酸取代Asn降低糖基化作用。在其他實施例中，產生一或多個新穎N連接型位點。抗體通常在Fc區中具有N連接型糖基化位點。
標記物及效應基團
在一些實施例中，特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物的抗原結合蛋白包含一或多個標記物。術語「標記基團」或「標記物」意謂任何可偵測標記物。適合標記基團 之實例包括(但不限於)以下：放射性同位素或放射性核素(例如3 H、14 C、15 N、35 S、90 Y、99 Tc、111 ln、125 ll、131 I)、螢光基團(例如FITC、若丹明(rhodamine)、鑭系磷)、酶促基團(例如辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶)、化學發光基團、生物素基團、由二級報導體所識別之預定多肽抗原決定基(例如白胺酸拉鏈對序列、二級抗體之結合位點、金屬結合域、抗原決定基標籤)。在一些實施例中，將標記基團經由各種長度之間隔臂與抗原結合蛋白偶合以降低潛在位阻。標記蛋白質之多種方法在此項技術中已知且可以最適宜之形式使用。
術語「效應基團」意謂偶合至特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物中之一者之抗原結合蛋白且充當細胞毒性劑之任何基團。適合效應基團之實例為放射性同位素或放射性核素(例如3 H、14 C、15 N、35 S、90 Y、99 Tc、111 In、125 I、131 I)。其他適合基團包括毒素、治療基團或化學治療基團。適合基團之實例包括卡奇黴素(calicheamicin)、阿瑞他汀(auristatin)、格爾德黴素(geldanamycin)及卡坦新(cantansine)。在一些實施例中，經由各種長度之間隔臂使效應基團偶合至抗原結合蛋白以降低潛在位阻。
一般而言，標記物屬於多種類別，其視偵測其之檢定而定：a)同位素標記物，其可為放射性或重同位素；b)磁性標記物(例如磁粉)；c)氧化還原活性部分；d)光學染料；酶促基團(例如辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶)；e)生物素標記基團；及f)由二次報導體識別之預定多肽抗原決定基(例如白胺酸拉鏈對序列、二次抗體之結合位點、金屬結合域、抗原決定基標籤等)。在一些實施例中，經由各種長度之間隔臂使標記基團與抗原結合蛋白偶合以降低潛在位阻。標記蛋白質之各種方法在此項技術中已知。
特定標記物包括光學染料，其包括(但不限於)發色團、磷光體及螢光團，其中在許多實例中後者為特定的。螢光團可為「小分子」氟或蛋白質氟。
「螢光標記物」意謂可經由其固有螢光特性偵測之任何分子。適合螢光標記物包括(但不限於)螢光素、若丹明、四甲基若丹明、伊紅、藻紅、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀綠、芪、螢光黃、級聯藍(Cascade Blue)、得克薩斯紅(Texas Red)、IAEDANS、EDANS、BODIPY FL、LC Red 640、Cy 5、Cy 5.5、LC Red 705、俄勒岡綠(Oregon green)、Alexa-Fluor染料(Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680)、級聯藍、級聯黃及R-藻紅素(PE)(Molecular Probes,Eugene,OR)、FITC、若丹明及得克薩斯紅(Pierce,Rockford,IL)、Cy5、Cy5.5、Cy7(Amersham Life Science,Pittsburgh,PA)。包括螢光團之適合光學染料描述於Richard P.Haugland,MOLECULAR PROBES HANDBOOK中，因此其以引用的方式明確併入本文中。
適合蛋白質螢光標記物亦包括(但不限於)綠色螢光蛋白，其包括GFP之Renilla、Ptilosarcus或Aequorea物種(Chalfie等人，(1994)Science 263 ：802-805)、EGFP(Clontech Labs.,Inc.,Genbank寄存登記號U55762)，藍色螢光蛋白(BFP,Quantum Biotechnologies,Inc.,Quebec,Canada；Stauber,(1998)Biotechniques 24 ：462-471；Heim等人，(1996)Curr.Biol. 6 ：178-182)，增強之黃色螢光蛋白(EYFP,Clontech Labs.,Inc.)，螢光素酶(Ichiki等人，(1993)J.Immunol. 150 ：5408-5417)，β半乳糖苷酶(Nolan等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 85：2603-2607)及Renilla(WO 92/15673、WO 95/07463、WO 98/14605、WO 98/26277、WO 99/49019、美國專利第5292658號、第5418155號、第5683888號、 第5741668號、第5777079號、第5804387號、第5874304號、第5876995號、第5925558號)。
製備抗原結合蛋白
所提供之非人類抗體可例如源自任何產生抗體之動物，諸如小鼠、大鼠、兔子、山羊、驢或非人類靈長類動物(諸如猴子(例如獼猴或恆河猴)或猿(例如黑猩猩))。非人類抗體可用於例如基於活體外細胞培養物及細胞培養物之應用或對抗體之免疫反應不存在或不重要的、可能得以防止、無關或不需要之其他應用中。在某些實施例中，抗體可藉由用全長β-Klotho、FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4(實例1)、用β-Klotho、FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4之細胞外域(實例2)或β-Klotho、FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之兩者(實例1)、用表現FGFR1c、β-Klotho或FGFR1c與β-Klotho之全細胞(實例1及實例3)、用由表現FGFR1c、β-Klotho或FGFR1c與β-Klotho之細胞製備之膜(實例1及實例3)、用融合蛋白(例如包含FGFR1c、β-Klotho或FGFR1c及β-Klotho(或其細胞外域)融合至Fc之Fc融合物)(實例2及實例3)及此項技術中已知之其他方法(例如如本文存在之實例所述之方法)免疫產生。或者，某些非人類抗體可藉由用作為形成本文提供之某些抗體所結合之抗原決定基之一部分的β-Klotho、FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4中之一或多者的區段之胺基酸免疫來產生。抗體可為多株抗體、單株抗體或可藉由表現重組DNA在宿主細胞中合成。
可如上所述藉由免疫含有人類免疫球蛋白基因座之轉殖基因動物或藉由選擇表現人類抗體譜系之噬菌體展示文庫製備全人類抗體。
單株抗體(mAb)可藉由多種技術產生，該等技術包括習知單株抗體方法，例如Kohler及Milstein,(1975)Nature 256 ：495之標準體細胞雜交技術。或者，可利用產生單株抗體之其他技術，例如B-淋巴細胞之病毒或致癌轉型。製備融合瘤之一種適合動物系統為鼠類系統，其為 極佳常規程序。分離用於融合之免疫脾細胞之免疫方案及技術在此項技術中已知。對於該等程序而言，使來自免疫小鼠之B細胞與適合永生化融合搭配物，諸如鼠類骨髓瘤細胞株融合。若需要，可免疫大鼠或其他哺乳動物而不免疫小鼠，且可使來自該等動物之B細胞與鼠類骨髓瘤細胞株稠合形成融合瘤。或者，可使用來自除小鼠以外之來源的骨髓瘤細胞株。亦熟知製造融合瘤之融合程序。SLAM技術亦用於產生抗體。
提供之單鏈抗體可由經由胺基酸橋(短肽連接子)連接重鏈及輕鏈可變域(Fv區)片段形成，從而產生單個多肽鏈。該等單鏈Fv(scFv)可藉由融合編碼在編碼兩可變域多肽(VL 及VH )之DNA之間的肽連接子之DNA來製備。所得多肽可本身可摺疊以形成抗原結合單體，或其可視兩個可變域之間的可撓性連接子之長度而定形成多聚體(例如二聚體、三聚體或四聚體)(Kortt等人，(1997)Prot.Eng. 10 ：423；Kortt等人，(2001)Biomol.Eng. 18 ：95-108)。藉由組合不同包含VL及VH之多肽，可形成結合至不同抗原決定基之多聚scFv(Kriangkum等人，(2001)Biomol.Eng. 18 ：31-40)。開發用於產生單鏈抗體之技術包括美國專利第4,946,778號；Bird,(1988)Science 242 ：423；Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 85 ：5879；Ward等人，(1989)Nature 334 ：544,de Graaf等人，(2002)Methods Mol Biol. 178 ：379-387中所述之彼等技術。源自本文提供之抗體單鏈抗體包括(但不限於)包含表2中所述之重鏈及輕鏈可變區之可變域組合之scFv，或包括表3及表4中所述之CDR的輕及重鏈可變域之組合。
可使用子類轉換方法將屬於一個子類之本文提供之抗體變為來自不同子類之抗體。因此，IgG抗體可源自例如IgM抗體，反之亦然。該等技術可使得製備具有指定抗體(親本抗體)之抗原結合特性，而且展現與不同於親本抗體之抗體同型或子類相關之生物特性之新穎抗 體。可利用重組DNA技術。編碼特定抗體多肽之經選殖DNA可用於該等程序中，例如編碼所需同型之抗體之恆定域的DNA。參見例如Lantto等人，(2002)Methods Mol.Biol. 178 ：303-316。
因此，提供之抗體包括包含例如具有所需同型(例如IgA、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE及IgD)之上述可變域組合之彼等抗體以及其Fab或F(ab')2 片段。此外，若需要IgG4，則其亦可能需要如Bloom等人，(1997)Protein Science 6 ：407(以引用的方式併入本文中)所述在鉸鏈區中引入點突變(CPSCP->CPPCP(分別SEQ ID NO：380-381，按外觀排列))以減緩形成可產生IgG4抗體不均一性之H鏈內二硫鍵之傾向。
此外，亦已知衍生具有不同特性之抗體之技術(亦即改變對其所結合之抗原之親和力)。稱為鏈改組之一種該技術涉及通常稱為噬菌體展示之在絲狀噬菌體之表面上展示免疫球蛋白可變域基因譜系。如Marks等人， (1992)BioTechnology 10 ：779所述，已使用鏈改組製備對半抗原2-苯基噁唑-5-酮親和力高之抗體。
可對表2中所述之重鏈及輕鏈可變區、或表3A及表3B、表4A及表4B及下文表6C中所述之CDR進行保守修飾(及編碼核酸之相應修飾)以產生具有功能及生物化學特徵之抗原結合蛋白。上文所述實現該等修飾之方法。
可以多種方式另外修飾特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物中之一或多者之抗原結合蛋白。舉例而言，若將其用於治療目的，則其可與聚乙二醇(PEGylated)結合以延長血清半衰期或增強蛋白質傳遞。或者，可使個體抗體或其片段之V區與不同抗體分子之Fc區稠合。用於此目的之Fc區可經修飾以便其不會結合補體，因此降低當將融合蛋白用作治療劑時誘發患者中細胞溶解之可能性。另外，可使目標抗體或其功能性片段與人血清白蛋白 結合以增強抗體或其片段之血清半衰期。抗原結合蛋白或其片段之另一有用融合搭配物為運甲狀腺素蛋白(TTR)。TTR能形成四聚體，因此抗體-TTR融合蛋白可形成可增加其結合親合力之多價抗體。
或者，本文所述抗原結合蛋白之功能及/或生物化學特徵之實質修飾可藉由在對維持(a)取代區域中分子主鏈之結構(例如呈片或螺旋狀構形)、(b)目標位點處之分子之電荷或疏水性或(c)側鏈大小之作用明顯不同之重鏈及輕鏈之胺基酸序列中產生取代來實現。「保守胺基酸取代」可涉及天然胺基酸殘基經對彼位置之胺基酸殘基之極性或電荷具有少許或無作用之非天然殘基取代。參見上述表5。此外，如先前針對丙胺酸掃描突變誘發所述，多肽中之任何天然殘基亦可經丙胺酸取代。
目標抗體之胺基酸取代(保守或非保守取代)可由熟習此項技術者藉由應用常規技術來實現。可使用胺基酸取代以鑑別本文提供之抗體之重要殘基或使此等抗體對(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物中之一或多者的親和力增大或減小或改變本文所述之其他抗原結合蛋白之結合親和力。
表現抗原結合蛋白之方法
本文亦提供包含至少一個如上所述之聚核苷酸的呈質體、表現載體、轉錄或表現卡匣形式之表現系統及構築體，以及包含該等表現系統或構築體之宿主細胞。
本文提供之抗原結合蛋白可藉由許多習知技術中之任一者製備。舉例而言，特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物的抗原結合蛋白可藉由重組體表現系統使用此項技術中已知之任何技術來產生。參見例如Monoclonal Antibodies,Hybridomas：A New Dimension in Biological Analyses,Kennet等人(編) Plenum Press,New York(1980)；及Antibodies：A Laboratory Manual,Harlow及Lane(編)，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1988)。
抗原結合蛋白可表現於融合瘤細胞株中(例如詳言之抗體可表現於融合瘤中)或除融合瘤以外之細胞株中。編碼抗體之表現構築體可用以轉型哺乳動物、昆蟲或微生物宿主細胞。如美國專利第4,399,216號；第4,912,040號；第4,740,461號；第4,959,455號所例示，轉型可使用將聚核苷酸引入宿主細胞中之任何已知方法來執行，該等方法包括例如將聚核苷酸包裹於病毒或噬菌體中且藉由此項技術中已知之轉染程序用構築體轉導宿主細胞。所用之最佳轉型程序將視轉型之宿主細胞的類型而定。用於將異源聚核苷酸引入哺乳動物細胞中之方法在此項技術中熟知，且包括(但不限於)葡聚糖介導之轉染、磷酸鈣沈澱、凝聚胺介導之轉染、原生質體融合、電穿孔、將該或該等聚核苷酸封裝在脂質體中、混合核酸與帶正電脂質及將DNA直接微量注入核中。
重組表現構築體通常包含編碼包含下列一或多者之多肽的核酸分子：一或多個本文提供之CDR；輕鏈恆定區；輕鏈可變區；重鏈恆定區(例如CH 1、CH 2及/或CH 3)；及/或抗原結合蛋白之另一架構部分。使用標準接合技術將此等核酸序列插入適當表現載體。在一實施例中，將重或輕鏈恆定區附接至抗β-Klotho、抗-FGFR1c、抗-FGFR2c、抗-FGFR3c、抗-FGFR4或β-Klotho及FGFR1c特異性重或輕鏈可變區之C端且接合至表現載體。通常選擇載體，以在所用之特定宿主細胞中發揮功能(亦即載體可與宿主細胞機制相容，從而使得可能進行基因之擴增及/或表現)。在有些實施例中，使用利用蛋白質片段互補檢定法使用蛋白質報導體(諸如二氫葉酸還原酶)之載體(參見例如美國專利第6,270,964號，其以引用方式併入本文中)。合適之表現載體可購自例如Invitrogen Life Technologies or BD Biosciences(先前為「Clontech」)。 用於選殖及表現抗體及片段之其他適用載體包括Bianchi及McGrew,(2003)Biotech.Biotechnol.Bioeng. 84 ：439-44中所述彼等載體，該文獻以引用方式併入本文中。舉例而言Methods Enzymol. ，第185卷(D.V.Goeddel編)，1990,New York：Academic Press中討論其他合適之表現載體。
通常，用於任一宿主細胞中之表現載體將含有用於維持質體及用於選殖及表現外源核苷酸序列之序列。在某些實施例中總稱為「側接序列」之該等序列通常包括一或多個以下核苷酸序列：啟動子、一或多種強化子序列、複製起點、轉錄終止序列、含有供體及受體剪接位點之完整內含子序列、編碼多肽分泌之前導序列的序列、核糖體結合位點、聚腺苷酸化序列、用於插入編碼待表現之多肽之核酸的多酶切點接頭區及可選標記元素。以下討論此等序列中之每一者。
視情況，載體可含有編碼「標籤」之序列，亦即位於編碼抗原結合蛋白之序列的5'或3'末端之寡聚核苷酸分子；寡聚核苷酸序列編碼polyHis(諸如hexaHis(SEQ ID NO：382))，或另一「標籤」，諸如存在市售抗體之FLAG、HA(血球凝集素流感病毒)或myc。此標籤通常在多肽表現之後融合至多肽且可充當親和純化或偵測來自宿主細胞之抗原結合蛋白的方法。親和純化可藉由例如管柱層析法使用抗標籤之抗體作為親和基質來實現。視情況，標籤可隨後藉由諸如使用某些用於裂解之肽酶之各種方法自經純化抗原結合蛋白移除。
側接序列可為同源(亦即來自作為宿主細胞之同一物質及/或菌株)、異源(亦即來自除宿主細胞物質或菌株外之物質)、雜交(亦即來自一個以上來源之側接序列的組合)、合成或天然序列。因而，側接序列之來源可為任何原核或真核生物體、任何有脊椎或無脊椎生物體、或任何植物，其限制條件為側接序列在宿主細胞機制中具有功能性且可藉由宿主細胞機制活化。
適用於載體之側接序列可藉由此項技術中熟知之若干方法中的任一者而獲得。通常，本文所適用之側接序列先前將藉由定位及/或藉由限制性核酸內切酶消化來鑑別，且因此可使用適當限制性核酸內切酶與固有組織來源分離。在一些情況下，可能已知側接序列之全核苷酸序列。本文中，側接序列可使用本文所述用於核酸合成或選殖之方法來合成。
全部側接序列或僅側接序列之一部分已知，其可使用聚合酶鏈式反應(PCR)及/或藉由用適合探針(諸如寡聚核苷酸及/或來自同一或另一物質之側接序列片段)篩檢基因組文庫獲得。在已知側接序列之情況下，含有側接序列之DNA片段可與較大片可含有例如編碼序列或甚至另一或其他基因之DNA分離。可藉由限制性核酸內切酶消化以產生適當DNA片段，隨後使用瓊脂糖凝膠純化，Qiagen® 管柱層析(Chatsworth,CA)或熟練技術者所已知之其他方法分離而完成分離。選擇適合酶類以完成此目的對於一般熟習此項技術者將顯而易見。
複製起點通常為彼等市售原核表現載體之一部分且在宿主細胞中起點有助於擴增載體。若所選載體不含複製位點之起點，則其可能係基於已知序列化學上合成且接合至載體。舉例而言，來自質體pBR322(New England Biolabs,Beverly,MA)之複製起點適合於大多數革蘭氏陰性細菌，且各種病毒來源(例如SV40、多瘤病毒、腺病毒、泡狀口腔炎病毒(VSV)或乳頭狀瘤病毒(諸如HPV或BPV))適用於在哺乳動物細胞中選殖載體。一般而言，對於哺乳動物表現載體不需要複製組分起點(例如通常僅使用SV40起點，因為其亦含有病毒早期啟動子)。
轉錄終止序列通常使3'位於多肽編碼區域的末端且用以終止轉錄。通常，原核細胞中之轉錄終止序列為富含G-C之片段，隨後為poly-T序列。雖然序列易於自文庫中選殖或甚至以載體之一部分購買，但其亦可易於使用諸如本文所述之彼等方法的核酸合成之方法來合成。
可選擇標記基因編碼選擇性培養基中所生長之宿主細胞的存活及生長所必須之蛋白質。典型選擇標記基因編碼蛋白質，該等蛋白質(a)對原核宿主細胞之抗生素或其他毒素(例如安比西林(ampicillin)、四環素(tetracycline)或康黴素(kanamycin))賦予抗性；(b)補充細胞之營養缺陷型缺乏；或(c)提供不可自複合物或所合成培養基獲得之關鍵養分。特定可選標記物為抗康黴素基因、抗安比西林基因及抗四環素基因。有利地，抗新黴素(neomycin)基因亦可用以原核與真核宿主細胞中之選擇。
其他可選基因可用以擴增將表現之基因。擴增為其中產生對生長或細胞存活關鍵之蛋白質所需的基因與連續代重組細胞之染色體合作重複之方法。適用於哺乳動物細胞之可選標記物之實例包括二氫葉酸還原酶(DHFR)及無啟動子胸苷激酶基因。將哺乳動物細胞轉型物置放於選擇壓力下，在該壓力下僅轉型物獨特地適合於藉助於載體中存在之可選基因存活。選擇壓力藉由在使培養基中選擇藥劑之濃度逐步增加之條件下培養轉型細胞而施加，藉此導致可選基因與編碼另一基因，諸如結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物的抗原結合蛋白之DNA擴增。因此，諸如抗原結合蛋白之大量多肽由擴增之DNA合成。
核糖體結合位點通常為mRNA之轉譯起始所必需，且特徵為Shine-Dalgamo序列(原核生物)或Kozak序列(真核生物)。元素通常位於啟動子之3'處及待表現之多肽的編碼序列之5'處。
在諸如真核宿主細胞表現系統中需要糖基化之一些情況下，可利用各種前序列(pre-sequence或pro-sequence)以改良糖基化或產生。舉例而言，可能改變特定信號肽之肽酶裂解位點或添加亦可影響糖基化之前序列。最終蛋白產物可能在-1位置(相對於成熟蛋白之第一胺基酸) 具有一或多個易於表現之其他胺基酸，該等胺基酸不可全部移除。舉例而言，最終蛋白產物可具有在與胺基末端連接之肽酶裂解位點所見之一或兩個胺基酸殘基。或者，使用一些酶裂解位點若酶在成熟多肽內之該區域切斷則可產生所需多肽之略截短形式。
表現及選殖將通常含有啟動子，藉由宿主生物體識別且可操作地連接至編碼抗原結合蛋白之分子，該抗原結合蛋白特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物。啟動子為安置於控制結構基因轉錄之結構基因(一般而言在約100至1000bp內)之起始密碼子上游(亦即5')之非轉錄序列。將啟動子習知地分組至以下兩個類別中之一者：誘導型啟動子及組成性的啟動子。在誘導性啟動子控制下對應於培養條件之一些改變(諸如存在或不存在養分或溫度改變)，誘導型啟動子起始增加程度之由DNA的轉錄。另一方面，組成性啟動子一致地轉錄可操作地連接之基因，亦即極少或不控制基因表現。大量可由多種潛在宿主細胞所別之啟動子已熟知。適合啟動子與編碼包含抗原結合蛋白之重鏈或輕鏈之DNA藉由自來源DNA中移除啟動子，由限制性酶消化及將所需啟動子序列插入載體中而可操作地連接。
此項技術中亦熟知與酵母宿主一起使用之適合啟動子。酵母強化子宜以酵母啟動子方式使用。與哺乳動物宿主細胞一起使用之適合啟動子已熟知且包括(但不限於)自病毒之基因組獲得之彼等啟動子，該等病毒為諸如多形瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(諸如2型腺病毒)、牛乳頭狀瘤病毒、禽類肉瘤病毒、細胞巨大病毒、反轉錄病毒、B型肝炎病毒及猴病毒40(SV40)。其他適合哺乳動物啟動子包括異源哺乳動物啟動子，例如熱休克啟動子及肌動蛋白啟動子。
可引起關注之其他啟動子包括(但不限於)：SV40早期啟動子 (Benoist及Chambon,(1981)Nature 290 ：304-310)；CMV啟動子(Thornsen等人，(1984)Proc.Natl.Acad.U.S.A. 81 ：659-663)；勞氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)之3'長末端重複序列中所含有之啟動子(Yamamoto等人，(1980)Cell 22 ：787-797)；疱疹胸苷激酶啟動子(Wagner等人，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 78 ：1444-1445)；來自金屬硫蛋白基因之啟動子及調節序列(Prinster等人，(1982)Nature 296 ：39-42)；及諸如β-內醯胺酶啟動子之原核啟動子(Villa-Kamaroff等人，(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 75 ：3727-3731)；或tac啟動子(DeBoer等人，(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 80 ：21-25)。亦關注以下動物轉錄控制區，其展現組織特異性且已用於轉殖基因動物中：在胰臟腺泡細胞中具有活性之彈性蛋白酶I基因控制區(Swift等人，(1984)Cell 38 ：639-646；Ornitz等人，(1986)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol. 50 ：399-409；MacDonald,(1987)Hepatology 7 ：425-515)；在胰臟β細胞中具有活性之胰島素基因控制區(Hanahan,(1985)Nature 315 ：115-122)；在淋巴細胞中具有活性之免疫球蛋白基因控制區(Grosschedl等人，(1984)Cell 38 ：647-658；Adames等人，(1985)Nature 318 ：533-538；Alexander等人，(1987)Mol.Cell.Biol. 7 ：1436-1444)；在睾丸、乳房、淋巴及肥大細胞中具有活性之小鼠乳腺瘤病毒控制區(Leder等人，(1986)Cell 45 ：485-495)；在肝臟中具有活性之白蛋白基因控制區(Pinkert等人，(1987)Genes and Devel. 1 ：268-276)；在肝臟中具有活性之α-胎蛋白基因控制區(Krumlauf等人，(1985)Mol.Cell.Biol. 5 ：1639-1648；Hammer等人，(1987)Science 253 ：53-58)；在肝臟中具有活性之α1-抗胰蛋白酶基因控制區(Kelsey等人，(1987)Genes and Devel. 1 ：161-171)；在骨髓細胞中具有活性之β-血球蛋白基因控制區(Mogram等人，(1985)Nature 315 ：338-340；Kollias等人，(1986)Cell 46 ：89-94)；在腦中之寡樹突神經質細胞中具有活性之髓鞘鹼性蛋白基 因控制區(Readhead等人，(1987)Cell 48 ：703-712)；在骨骼肌中具有活性之肌球蛋白輕鏈-2基因控制區(Sani,(1985)Nature 314 ：283-286)；及在下丘腦中具有活性之促性腺釋放激素基因控制區(Mason等人，(1986)Science 234 ：1372-1378)。
可將強化子序列插入載體中以藉由高級真核生物，例如特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物之人類抗原結合蛋白增強編碼包含抗原結合蛋白之輕鏈或重鏈之DNA的轉錄，該抗原結合蛋白特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物。強化子為DNA之順式作用元素，通常長度約10-300bp，其作用於啟動子以增強轉錄。強化子為取向及位置相對獨立的，已在轉錄單位之位置5'及3'處發現。已知若干獲自哺乳動物基因之強化子序列(例如血球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白及胰島素)。然而，通常使用來自病毒之強化子。此項技術中已知之SV40強化子、細胞巨大病毒早期啟動子強化子、多瘤病毒強化子及腺病毒強化子為用於活化真核啟動子之例示性增強元素。儘管強化子可置於載體中編碼序列之5'或3'處，但其通常位於啟動子之位點5'處。可將編碼適當天然或異源信號序列(前導序列或信號肽)之序列併入表現載體中以促進抗體之細胞外分泌。信號肽或前導序列之選擇視將產生抗體之宿主細胞的類型而定，且異源信號序列可替代天然信號序列。在哺乳動物宿主細胞中具有功能性之信號肽的實例包括以下：美國專利第4,965,195號中所述之介白素-7(IL-7)之信號序列；Cosman等人，(1984)Nature 312 ：768中所述之介白素-2受體之信號序列；歐洲專利第0367 566號中所述之介白素-4受體信號肽；美國專利第4,968,607號中所述之I型介白素-1受體信號肽；歐洲專利第0 460 846號中所述之II型介白素 -1受體信號肽。
提供之表現載體可由諸如市售載體之起始載體構築。該等載體可能含有但不需要含有所有所需側接序列。在本文所述之側接序列中之一或多者已存在於載體中之情況下，其可個別獲得且接合至載體。熟習此項技術者熟知獲得每一側接序列所用之方法。
在載體已構築且編碼包含特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物的抗原結合蛋白之輕鏈、重鏈或輕鏈及重鏈之核酸分子已插入載體之適當位點之後，可將完整載體插入用以擴增及/或多肽表現之適合宿主細胞中。將抗原結合蛋白之表現載體轉型為經選擇宿主細胞可藉由熟知方法完成，該等方法包括轉染、感染、磷酸鈣共沈澱、電穿孔、顯微注射、脂質體轉染、DEAE-葡聚糖調節轉染或其他已知技術。所選方法將部分程度上隨所用宿主細胞類型而變。此等方法及其他適合方法為熟練技術者所熟知且在例如Sambrook等人，(2001)，上述中闡明。
當在適當條件下培養時，宿主細胞合成抗原結合蛋白，隨後該抗原結合蛋白可自培養基(若宿主細胞將其分泌至培養基中)中或直接自產生其之宿主細胞(若不分泌)中收集。適當宿主細胞之選擇將視各種因子，諸如所需表現程度、活化(諸如糖基化或磷酸化)所需或所必須之多肽修飾及摺疊為生物學活性分子之容易性而定。
可用作表現宿主之哺乳動物細胞在此項技術中熟知，且包括(但不限於)可獲自美國菌種保存中心(American Type Culture Collection，ATCC)之永生化細胞株，其包括(但不限於)中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎臟細胞(COS)、人類肝細胞癌細胞(例如Hep G2)及許多其他細胞株。在某些實施例中，細胞株可經由測定具有高表現程度且組成性產生具有合乎需要之結合特性(例如能 夠結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物)的抗原結合蛋白之細胞株來選擇。在另一實施例中，可選擇不產生其自身的抗體但具有產生及分泌異種抗體之能力的來自B細胞系之細胞株。誘導類似FGF21信號傳導之能力亦可形成選擇準則。
用於診斷及治療目的之抗原結合蛋白的用途
本文所揭示之抗原結合蛋白適用於在生物樣品中偵測(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物及鑑別產生(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物中之一或多者之細胞或組織。舉例而言，本文所揭示之抗原結合蛋白可用於診斷檢定，例如偵測及/或定量組織或細胞中表現之(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物之結合檢定。特異性結合至(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物的抗原結合蛋白可用於治療有需要之患者與類似FGF21信號傳導相關之疾病，諸如2型糖尿病、肥胖症、血脂異常、NASH、心血管疾病及代謝症候群。藉由形成包含抗原結合蛋白及(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物之信號傳導複合物，活體內與FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c、FGFR4及β-Klotho關聯以引發信號傳導之FGF21之天然活體內活性可模擬及/或增強，從而產生治療效應。
適應症
與人類FGF21相關之疾病或病狀包括在患者中之發作至少部分由誘導類似FGF21信號傳導引起之任何疾病或病狀，類似FGF21信號傳導活體內藉由形成包含FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4及β-Klotho及FGF21之複合物引發。疾病或病狀之嚴重程度亦可藉由誘導類似FGF21信號傳導降低。可用抗原結合蛋白治療之疾病及病狀之實例包括2型糖尿病、肥胖症、血脂異常、NASH、心血管疾病及代謝症候群。
本文所述之抗原結合蛋白可用以治療2型糖尿病、肥胖症、血脂異常、NASH、心血管疾病及代謝症候群，或可用作例如每天、每週、每兩週、每月、隔月、每半年等投與之預防性治療以預防或降低症狀之頻率及/或嚴重程度，例如提高血漿葡萄糖含量、提高三酸甘油酯及膽固醇含量，藉此提供改良之血糖及心血管風險因子概況。
診斷方法
本文所述之抗原結合蛋白可用於診斷目的以偵測、診斷或監測與FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c、FGFR4、β-Klotho、FGF21或其組合相關之疾病及/或病狀。亦提供使用熟習此項技術者已知之傳統免疫組織方法偵測在樣品中存在(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物之方法(例如Tijssen,1993,Practice and Theory of Enzyme Immunoassays ，第15卷 (R.H.Burdon及P.H.van Knippenberg編，Elsevier,Amsterdam)；Zola,(1987)Monoclonal Antibodies：A Manual of Techniques ，第147-158頁(CRC Press,Inc.)；Jalkanen等人，(1985)J.Cell.Biol. 101 ：976-985；Jalkanen等人， (1987)J.Cell Biol. 105 ：3087-3096)。可在活體內或活體外進行偵測(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物。
本文提供之診斷應用包括使用抗原結合蛋白偵測(i)β-Klotho；(ii) FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物之表現及/或結合至(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物。適用於偵測存在(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物之方法的實例包括免疫檢定，諸如酶聯免疫吸附檢定(ELISA)及放射免疫檢定(RIA)。
對於診斷應用而言，抗原結合蛋白通常由可偵測標記基團標記。適合標記基團包括(但不限於)以下：放射性同位素或放射性核素(例如3 H、14 C、15 N、35 S、90 Y、99 Tc、111 In、125 I、131 I)、螢光基團(例如FITC、若丹明、鑭系磷)、酶促基團(例如辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶)、化學發光基團、生物素基團、由二級報導體所識別之預定多肽抗原決定基(例如白胺酸拉鏈對序列、二級抗體之結合位點、金屬結合域、抗原決定基標籤)。在一些實施例中，經由各種長度之間隔臂使標記基團抗原結合蛋白偶合以降低潛在位阻。標記蛋白質之多種方法在此項技術中已知且可使用。
在另一態樣中，抗原結合蛋白可用以鑑別表現(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物之細胞。在一特定實施例中，用標記基團標記抗原結合蛋白，且偵測標記之抗原結合蛋白與(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物之結合。在另一特定實施例中，活體內偵測到抗原結合蛋白與(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物之結合。在 另一特定實施例中，使用此項技術中已知之技術分離且量測抗原結合蛋白。參見例如Harlow及Lane ,(1988)Antibodies：A Laboratory Manual, New York：Cold Spring Harbor(1991版及定期增刊)；John E.Coligan編 ，(1993)Current Protocols In Immunology New York：John Wiley & Sons。
如本文所揭示，另一態樣為偵測測試與提供之抗原結合蛋白競爭結合至(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物之分子之存在。一種該檢定之實例可涉及在存在或不存在測試分子之情況下偵測含有適量(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物中之一者之溶液中游離抗原結合蛋白之量。游離抗原結合蛋白之量的增加(亦即不結合至(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物的抗原結合蛋白)將指示測試分子能夠與抗原結合蛋白競爭結合至(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物。在一實施例中，抗原結合蛋白由標記基團標記。或者，在存在或不存在抗原結合蛋白之情況下，標記測試分子且監控游離測試分子之量。
治療方法：醫藥調配物及投藥途徑
亦提供使用抗原結合蛋白之方法。在一些方法中，為患者提供抗原結合蛋白。抗原結合蛋白誘導類似FGF21信號傳導。
提供包含治療有效量之一或複數個抗原結合蛋白及醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑、增溶劑、乳化劑、防腐劑及/或佐劑的醫藥組合物。此外，提供藉由投與該醫藥組合物治療患者之方法。術語「患者」包括人類患者。
可接受之調配物質在所用劑量及濃度下對接受者無毒。在特定實施例中，提供包含治療有效量之特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物之人類抗原結合蛋白之醫藥組合物。
在某些實施例中，可接受之調配物質在所用劑量及濃度下對接受者無毒。在某些實施例中，醫藥組合物可含有調配物質以供修飾、維持或保存(例如)該組合物之pH、滲透壓、黏度、澄清度、顏色、等張性、氣味、無菌度、穩定性、溶解或釋放速率、吸附或穿透。在該等實施例中，適合調配物質包括(但不限於)胺基酸(諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、精胺酸或離胺酸)；抗菌劑；抗氧化劑(諸如抗壞血酸、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉)；緩衝劑(諸如硼酸鹽、碳酸氫鹽、Tris-HCl、檸檬酸鹽、磷酸鹽或其他有機酸)；膨化劑(諸如甘露糖醇或甘胺酸)；螯合劑(諸如乙二胺四乙酸(EDTA))；錯合劑(諸如咖啡鹼、聚乙烯吡咯啶酮、β-環糊精或羥丙基-β-環糊精)；填充劑；單醣；雙醣；及其他碳水化合物(諸如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白質(諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)；著色劑、調味劑及稀釋劑；乳化劑；親水性聚合物(諸如聚乙烯吡咯啶酮)；低分子量多肽；形成鹽之相對離子(諸如鈉)；防腐劑(諸如氯化苯甲烴銨、苯甲酸、柳酸、硫柳汞、苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或過氧化氫)；溶劑(諸如丙三醇、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(諸如甘露糖醇或山梨糖醇)；懸浮劑；界面活性劑或濕潤劑(諸如泊洛尼克(Pluronics)、PEG、脫水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯(諸如聚山梨醇酯20)、聚山梨醇酯、曲拉通、緩血酸胺、卵磷脂、膽固醇、四丁酚醛(tyloxapal))；穩定性增強劑(諸如蔗糖或山梨糖醇)；張力增強劑(諸如鹼金屬鹵化物、較佳氯化鈉或氯化鉀、甘露糖醇、山梨糖醇)；傳遞媒劑；稀釋劑；賦形劑及/或醫 藥佐劑。參見Remington's Pharmaceutical Sciences ，第18版，(A.R.Gennaro編)，1990,Mack Publishing Company。
在某些實施例中，最佳醫藥組合物將由熟習此項技術者視例如預期投與途徑、傳遞型式及所需劑量來確定。參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences，上述。在某些實施例中，該等組合物可影響物理狀態、穩定性、所揭示抗原結合蛋白之活體內釋放速率及活體內清除速率。在某些實施例中，醫藥組合物中之原始媒劑或載劑天然可為含水或不含水的。舉例而言，適合媒劑或載劑可為注射用水、生理食鹽水溶液或人工腦脊髓液，可能補充有供非經腸投與之組合物中所常用之其他物質。中性緩衝生理食鹽水或與血清白蛋白混合之生理食鹽水為其他例示性媒劑。在特定實施例中，醫藥組合物包含pH值約為7.0-8.5之Tris緩衝液或pH值約為4.0-5.5之乙酸酯緩衝液，且可進一步包括山梨糖醇或適合之替代物。在某些實施例中，可製備包含特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物的抗原結合蛋白之組合物以藉由混合具有所需純度之所選組合物與視情況存在之調配物藥劑(Remington's Pharmaceutical Sciences ，上述)呈冷凍乾燥濾餅或水溶液形式來儲存。此外，在某些實施例中，可使用諸如蔗糖之適當賦形劑將結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物的抗原結合蛋白調配成冷凍乾燥產物。
可選擇醫藥組合物用於非經腸傳遞。或者，組合物可經選擇用以吸入或經由消化道(諸如經口)傳遞。該等醫藥學上可接受之組合物之製備係在此項技術範圍內。
調配組分係較佳以投藥部位可接受之濃度存在。在某些實施例中，緩衝劑係用以將組合物維持於生理pH值或略微較低之pH值，通常 在約5至約8之pH值範圍內。
當預期經腸投藥時，治療組合物可呈於醫藥學上可接受之媒劑中包含所需抗原結合蛋白之無熱原質、非經腸可接受之水溶液形式。用於非經腸注射之特別適合之媒劑為無菌蒸餾水，其中抗原結合蛋白調配成經適當保護之無菌等滲溶液。在某些實施例中，製備可涉及使所需分子與諸如可注射微球體、生物可侵蝕性顆粒、聚合化合物(諸如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠粒或脂質體之藥劑調配，其可提供經控制或持續釋放之可經由積存注射傳遞之產物。在某些實施例中，亦可使用可具有促進循環持續時間之效應的玻糖醛酸。在某些實施例中，可植入藥物傳遞裝置可用以引入所需抗原結合蛋白。
某些醫藥組合物經調配用於吸入。在一些實施例中，將結合至(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物的抗原結合蛋白調配成乾燥可吸入粉末。在特定實施例中，抗原結合蛋白吸入溶液亦可與用於霧劑傳遞之推進劑一起調配。在某些實施例中，溶液可經霧化。因此，肺部投藥及調配方法進一步描述於國際專利申請案第PCT/US94/001875號中，其以引用的方式併入本文中且描述經化學修飾之蛋白的肺部傳遞。一些調配物可經口投與。以此方式投與之特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物的抗原結合蛋白可在有或無混合諸如錠劑及膠囊之固體劑型中通常使用的載體下調配。在某些實施例中，膠囊可經設計以於胃腸道中在生物可用性最大且體循環前(pre-systemic)降解最小之時釋放調配物之活性部分。可包括促進抗原結合蛋白吸收之其他藥劑。亦可利用稀釋劑、調味劑、低熔點蠟、植物油、潤滑劑、懸浮劑、錠劑崩解劑及黏合劑。
一些醫藥組合物包含有效量之特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物之一種或複數種人類抗原結合蛋白與適用於錠劑製造之無毒賦形劑之混合物。藉由將錠劑溶解於無菌水或另一適當媒劑中，可以單位劑量形式製備溶液。適合賦形劑包括(但不限於)惰性稀釋劑，諸如碳酸鈣、碳酸鈉或碳酸氫鈉、乳糖或磷酸鈣；或結合劑，諸如澱粉、明膠或阿拉伯膠；或潤滑劑，諸如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。
其他醫藥組合物將對熟習此項技術者顯而易見，其包括呈持續或控制傳遞調配物之涉及特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物的抗原結合蛋白之調配物。用來調配多種其他持續或控制傳遞手段(諸如脂質體載劑、生物可侵蝕微粒或多孔珠粒及積存注射劑)之技術亦為熟習此項技術者所已知。參見例如國際專利申請案第PCT/US93/00829號，其以引用的方式併入本文中且描述供傳遞醫藥組合物之多孔聚合微粒之控制釋放。持續釋放製劑可包括呈成型物件形式(例如膜或微膠囊)之半透性聚合物基質。持續釋放基質可包括聚酯、水凝膠、聚乳酸交酯(如美國專利第3,773,919號及歐洲專利申請公開案第EP 058481號中所示，該等文獻各以引用的方式併入本文中)、L-麩胺酸與γ乙基-L-麩胺酸鹽之共聚物(Sidman等人,1983,Biopolymers 2 ：547-556)、聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等人,1981,J .Biomed .Mater .Res .15 ：167-277及Langer,1982,Chem .Tech .12 ：98-105)、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人,1981,上述)或聚-D(-)-3-羥基丁酸(歐洲專利申請公開案EP 133,988第號)。持續釋放組合物亦可包括可藉由此項技術中已知之若干方法中之任一者製備的脂質體。參見例如Eppstein等人,1985,Proc .Natl .Acad .Sci .U .S .A .82 ：3688-3692；歐 洲專利申請公開案第EP 036,676號；第EP 088,046號及第EP 143,949號，其以引用的方式併入本文中。
通常以無菌製劑形式提供用於活體內投藥之醫藥組合物。滅菌可藉由經由無菌過濾膜過濾而實現。當組合物經冷凍乾燥時，可於冷凍乾燥及復水之前或之後使用此方法進行滅菌。用於非經腸投藥之組合物可以冷凍乾燥形式或以溶液形式儲存。一般將非經腸組合物置放於具有無菌取樣口(access port)之容器中，例如具有可藉由皮下注射針穿透之塞子之靜脈內溶液袋或小瓶。
在某些實施例中，封裝表現如本文所揭示之重組抗原結合蛋白之細胞以進行傳遞(參見Invest .Ophthalmol Vis Sci (2002)43 ：3292-3298及Proc .Natl .Acad .Sciences USA (2006)103 ：3896-3901)。
在某些調配物中，抗原結合蛋白之濃度為至少10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml、100mg/ml或150mg/ml。一些調配物含有緩衝液、蔗糖及聚山梨醇酯。調配物之實例為含有50-100mg/ml抗原結合蛋白、5-20mM乙酸鈉、5-10% w/v蔗糖及0.002-0.008% w/v聚山梨醇酯之調配物。舉例而言，某些調配物含有65-75mg/ml抗原結合蛋白於9-11mM乙酸鈉緩衝液、8-10% w/v蔗糖及0.005-0.006% w/v聚山梨醇酯中。某些該等調配物之pH值在4.5-6之範圍內。其他調配物之pH值為5.0-5.5(例如pH值為5.0、5.2或5.4)。
醫藥組合物一經調配，即可以溶液、懸浮液、凝膠、乳液、固體、結晶形式或脫水或冷凍乾燥粉末形式儲存於無菌小瓶中。該等調配物可以即用形式或於投與前復水之形式(例如冷凍乾燥形式)儲存。亦提供產生單次劑量投藥單位之套組。某些套組含有具有乾燥蛋白質之第一容器及具有含水調配物之第二容器。在某些實施例中，提供含有單一腔室及多腔室預填充注射器(例如液體注射器及溶藥注射器 (lyosyringe))之套組。待使用之含有治療有效量之抗原結合蛋白之醫藥組合物將視例如治療範圍及目標而定。熟習此項技術者將瞭解，治療之適合劑量濃度將部分視所傳遞之分子、使用抗原結合蛋白之適應症、投藥途徑及患者之尺寸(體重、體表或器官尺寸)及條件(年齡及總體健康狀況)而變動。在某些實施例中，臨床醫師可滴定劑量及修改投藥途徑以獲得最佳治療效果。
典型劑量可視以上所提及之因素而定，在約1μg/kg至至多約30mg/kg或30mg/kg以上之範圍內。在特定實施例中，劑量可在10μg/kg至約30mg/kg，視情況在0.1mg/kg至約30mg/kg，或者0.3mg/kg至約20mg/kg之範圍內。在一些申請案中，劑量為0.5mg/kg至20mg/kg。 在一些情況下，抗原結合蛋白之劑量為0.3mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg或20mg/kg。在一些治療方案中，給藥進度為：劑量為0.3mg/kg每週一次、0.5mg/kg每週一次、1mg/kg每週一次、3mg/kg每週一次、10mg/kg每週一次或20mg/kg每週一次。
投藥頻率將視所用調配物中特定抗原結合蛋白之藥物動力學參數而定。通常，臨床醫師投與組合物直至達到實現所需效果之劑量。因此，可以單次劑量、隨時間以兩次或兩次以上劑量(其可含有或可不含相同量之所要分子)或經由植入裝置或導管連續輸注來投與組合物。可經由使用適當劑量-反應資料來確定適當劑量。在某些實施例中，可在整個延長時期內將抗原結合蛋白投與患者。長期投與抗原結合蛋白最小化通常與並非完全人類之抗原結合蛋白相關之不利免疫或過敏反應，例如在非人類動物中針對人類抗原生長之抗體，例如非人類物種中產生之非全人類抗體或非人類抗體。
醫藥組合物之投藥途徑係根據已知方法，例如經口，經由藉由靜脈內、腹膜內、腦內(腦實質內)、腦室內、肌肉內、眼內、動脈內、門靜脈內或病損部位途徑注射；藉由持續釋放系統或藉由植入裝置。 在某些實施例中，可藉由快速注射(bolus injection)或藉由連續輸注或藉由植入裝置投與該等組合物。
組合物亦可經由植入膜、海綿或已吸收或囊封所需分子之另一適合物質而局部投與。在使用植入裝置之某些實施例中，可將該裝置植入任何適合組織或器官中，且該所需分子之傳遞可經由擴散、經時釋放大丸劑或連續投藥。
亦可能需要離體使用抗原結合蛋白醫藥組合物。在該等實例中，將已由患者移除之細胞、組織或器官曝露於抗原結合蛋白醫藥組合物，隨後將該等細胞、組織及/或器官植回該患者中。
詳言之，特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物的抗原結合蛋白可藉由植入已遺傳工程改造之某些細胞，使用諸如本文所述方法之方法傳遞以表現及分泌多肽。在某些實施例中，該等細胞可為動物或人類細胞，且可為自體、異源或異基因。在某些實施例中，可將細胞永生化。在其他實施例中，為減少免疫反應之機會，可封裝該等細胞以避免浸潤周圍組織。在另一實施例中，封裝物質通常為生物相容、半滲透之聚合殼或膜，其使該或該等蛋白質產物釋放但防止患者免疫系統或其他來自周圍組織之有害因子破壞該等細胞。
組合療法
在另一態樣中，本發明提供一種用本發明之治療抗原結合蛋白，諸如本文所述之全人類治療抗體以及一或多種其他治療治療個體糖尿病之方法。在一實施例中，該組合治療實現添加或協同效應。抗原結合蛋白可與目前可用之一或多種2型糖尿病或肥胖症治療組合投與。糖尿病之此等治療包括雙胍(甲福明(metaformin))及磺醯脲(諸如格列苯脲(glyburide)、格列吡嗪(glipizide))。針對維持葡萄糖內穩定之其他治 療包括PPARγ促效劑(吡格列酮(pioglitazone)、羅格列酮(rosiglitazone))；格列奈類(glinide)(美格列奈(meglitinide)、諾和隆(repaglinide)及那格列奈(nateglinide))；DPP-4抑制劑(Januvia®及Onglyza®)及麥芽糖酶抑制劑(醣祿(acarbose)、伏格列波糖(voglibose))。
糖尿病之其他組合治療包括可注射治療，諸如胰島素及腸促胰島素模擬物(Byetta®、Exenatide®)、其他GLP-1(升糖素樣肽)類似物(諸如利拉魯肽(liraglutide))、其他GLP-1R促效劑及Symlin®(普蘭林肽(pramlintide))。
針對重量減輕之其他組合治療包括Meridia®及Xenical®。
實例
包括所進行實驗及所達成結果之以下實例僅為說明目的而提供而不欲解釋為限制本發明。
實例1
製備FGFR1c過度表現細胞用作抗原
將編碼全長人類FGFR1c多肽之核酸序列(SEQ ID NO：4；圖1A-圖1B)及編碼全長人類β-Klotho多肽之分離序列(SEQ ID NO：7；圖2A-圖2C)次選殖至適合哺乳動物細胞表現載體(例如pcDNA3.1 Zeo、pcDNA3.1 Hyg(Invitrogen,Carlsbad,CA)或pDSRα20)中。pDSRα20載體含有表現所關注基因之SV40早期啟動子/強化子及在CHO DHFR(-)宿主細胞(諸如AM1 CHO(DG44之衍生物、CHO DHFR(-)))中選擇之小鼠DHFR表現卡匣。
將AM-1 CHO細胞以每100mm盤碟1.5×106 個細胞接種。24小時之後，將細胞用pDSRα20/huFGFR1c及pDSRα20/huβ-Klotho之線性化之DNA與FuGene6(Roche Applied Science)共同轉染。在轉染之後將轉染細胞以胰蛋白酶處理2天，且接種至含有10%經透析FBS且無次黃嘌呤/ 胸苷補充劑之CHO DHFR選擇性生長培養基中。2週之後，將所得轉染菌落以胰蛋白酶處理且彙集。
按照與CHO轉染及選擇所用之程序類似之程序，將HEK293T細胞用基於pcDNA3.1系列或pTT14(藉由Durocher,NRCC開發之表現載體，具有CMV啟動子及EBV ori，與pTT5及嘌呤黴素選擇標記物類似)之載體中之全長huFGFR1c及huβ-Klotho或pTT14轉染且用相應藥物選擇。
使用Alexa 647標記之FGF21重複分選FGF21R(亦即FGFR1c及βKlotho)轉染之AM1 CHO或293T細胞池。作為細胞表面染色劑，根據製造商(Molecular Probes,Inc.Cat A 2006)推薦之方法將FGF21用Alexa 647-NHS標記。Alexa 647標記之FGF21展示特定染色FGF21R受體表現細胞，且並非未轉染親本細胞(圖3)。高度表現細胞在最終分選結束時收集、擴增且冷凍至小瓶中。製備AM-1/huFGF21R細胞進行免疫，且在免疫之後且在藉由FMAT進行之融合瘤上清液之結合篩檢中藉由FACS使用293T/huFGF21R細胞滴定小鼠血清(參見實例4)。
實例2
製備可溶性FGFR1c/β -KLOTHO複合物用作抗原
在pTT14或pcDNA3.1表現載體中產生可溶性FGF21受體構築體。FGFR1c ECD-Fc構築體(SEQ ID NO：362，圖4)包含FGFR1c之N端細胞外域(胺基酸殘基#1-374；SEQ ID NO：5)融合至Fc(SEQ ID NO：384)。β-Klotho ECD-Fc構築體(SEQ ID NO：363，圖5)包含β-Klotho之N端細胞外域(胺基酸殘基#1-996；SEQ ID NO：8)融合至Fc(SEQ ID NO：384)。
將HEK293細胞(293F，Invitrogen)用huFGFR1c ECD-Fc/pTT5、huβ-Klotho ECD-Fc/pTT14-puro及dGFP/pcDNA3.1-Neo轉染，且在相應藥物存在下進行選擇，隨後基於dGFP表現重複FACS分選。細胞生長於有補充有非必需胺基酸之達爾伯克氏改良之伊格氏培養基 (Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM)之HyperFlasks(Corning)中4天且於收集之條件培養基(CM)中以進行純化。
濃縮293 CM 6倍且施用於在PBS中平衡之Protein A FF中。用Pierce Gentle Ag/Ab溶離緩衝液溶離蛋白質。針對20mM Tris-HCl(pH 7)、10mM NaCl透析Protein A池且施用於SP HP(pH 7.0)。FGFR1c ECD-Fc存在於流池(flow-through，FT)中且用0-0.4M NaCl之線性梯度、20mM Tris-HCl(pH 7.0)溶離雜二聚體。N端胺基酸定序驗證純化可溶性FGF21R為由(1：1)比率之FGFR1c ECD-Fc及β-Klotho ECD-Fc構成之雜二聚體。將純化之可溶性FGF21R-Fc(圖6)用作用以免疫之抗原。
實例3
製備單株抗體
使用一或多種適合形成之FGF21受體抗原進行免疫，該等FGF21受體抗原包括：(1)在細胞表面表現全長人類FGFR1c及β-Klotho之CHO轉染子之細胞結合受體，其係藉由用編碼人類全長FGFR1c多肽SEQ ID NO：4(亦參見圖1a-圖1b)之cDNA及編碼人類β-Klotho多肽SEQ ID NO：7(亦參見圖2a-圖2c)之cDNA轉染CHO細胞獲得；(2)來自表現FGF21R受體複合物之前述細胞之膜萃取物；或(3)可由共同表現FGFR1c之N端細胞外域(ECD)(SEQ ID NO：5；亦參見圖4)及β-Klotho之N端細胞外域(ECD)(SEQ ID NO：8；亦參見圖)獲得之可溶性FGF21R受體或(4)其組合。
根據1996年12月3日申請之美國專利申請案第08/759,620號及國際專利申請案第WO 98/24893號及第WO 00/76310號中所揭示之方法，使用適合量之免疫原(亦即每個小鼠10μgs可溶性FGF21R、或每個小鼠3-4×106 個穩定轉染之CHO細胞、或每個小鼠150μgs純化之由穩定表現FGF21R之CHO細胞製備之FGF21R膜)在XenoMouseTM 中進行初始免疫，該等文獻之揭示內容以引用方式併入本文中。在初始免疫之後， 在時程中給予免疫原之後續增強免疫(每個小鼠5μg可溶性FGF21R、或每個小鼠1.7×106 個FGF21R轉染細胞、或75μgs純化之FGF21R膜)且歷時在小鼠中誘導適合抗FGF21R效價所必需之持續時間。藉由適合方法，例如藉由酶免疫檢定、螢光活化細胞分選(FACS)或藉由其他方法(包括酶免疫檢定與FACS之組合)測定效價。
鑑別展現適合效價之動物，且淋巴細胞由引流淋巴結獲得，且必要時針對各群組彙集。藉由在適合培養基中研磨自淋巴組織解離淋巴細胞(例如達爾伯克氏改良之伊格氏培養基；DMEM；可獲自Invitrogen,Carlsbad,CA)以自組織釋放細胞，且懸浮於DMEM中。使用標準方法選擇及/或擴增B細胞，且使用此項技術中已知之技術與適合融合搭配物，例如非分泌骨髓瘤P3X63Ag8.653細胞(美國菌種保存中心CRL 1580；Kearney等人,J .Immunol .123,1979,1548-1550)稠合。
在一個適合融合方法中，使淋巴細胞與融合搭配物細胞以1：4之比率混合。藉由400×g下離心4分鐘使細胞混合物輕輕丸化，傾析上清液，且輕微混合物細胞混合物(例如藉由使用1ml吸液管)。用PEG/DMSO(聚乙二醇/二甲亞碸；獲自Sigma-Aldrich，St.Louis MO；每1百萬個淋巴細胞1ml)誘導融合。在輕微攪拌下經一分鐘緩慢添加PEG/DMSO，隨後混合酮分鐘。接著在輕微攪拌下經2分鐘添加IDMEM(無麩醯胺酸之DMEM；每1百萬個B細胞2ml)，隨後經3分鐘再添加IDMEM(每1百萬個B細胞8ml)。
丸化(400×g，6分鐘)融合細胞且再懸浮於選擇培養基(例如含有偶氮絲胺酸及次黃嘌呤[HA]及視需要其他補充物質之DMEM)(每1百萬個B細胞20ml)中。在37℃下培育細胞20-30分鐘，且接著再懸浮於200ml選擇培養基中，且在T175燒瓶中培養3至4天，之後96孔板塗佈。
使用標準技術使細胞分佈於96孔板中以使所得菌落之選殖性最大。培養若干天之後，收集上清液且如以下實例所述之經受篩檢檢定， 包括證實結合至人類FGF21受體、特異性及/或跨物種反應性。另外選擇陽性細胞且經受標準選殖及次選殖技術。活體外擴增無性繁殖系，且獲得分泌之人類抗體以進行分析。
以此方式，用表現全長FGF21R細胞之細胞或膜或可溶性FGF21R細胞外域免疫小鼠，在約一至三個半月之期間內進行11-17次範圍內之免疫。獲得分泌FGF21R特異性抗體之若干細胞株，且進一步表徵該抗體。本文及在序列表中存在其定序，且提供使用此等抗體之各種測試之結果。
實例4
藉由FMAT選擇結合抗體
培養14天之後，藉由螢光微量容量檢定技術(FMAT)藉由針對用人類FGF21R轉染之CHO AM1/huFGF21R細胞株或重組HEK293細胞篩檢且針對親本CHO或HEK293細胞反篩檢來針對FGF21R特異性單株抗體篩檢融合瘤上清液。簡言之，以每孔50μL之容量，對於穩定轉染子而言以每孔4,000個細胞之密度且對於親本細胞而言以每孔16,000個細胞之密度將游離式培養基(Freestyle media，Invitrogen)中之細胞接種於384孔FMAT板中，且在37℃下培育細胞隔夜。接著每孔添加10μL上清液，且在4℃下培育板約1小時，此後每孔添加10μL濃度為2.8μg/ml之抗人類IgG-Cy5二次抗體(最終濃度為400ng/ml)。接著在4℃下培育板1小時，且使用FMAT細胞偵測系統(Applied Biosystems)讀數螢光。
藉由FMAT方法鑑別總計大於3,000種融合瘤上清液結合至FGF21受體表現細胞而非親本藉由。接著如以下所述在FGF21功能檢定中測試此等上清液。
實例5
選擇誘導類似FGF21信號傳導之抗體
使用適合FGF21報導體檢定進行實驗以鑑別模擬野生型FGF21活 性(例如誘導類似FGF21信號傳導之能力)之功能性抗體。所揭示之FGF21報導體檢定經由MAPK路徑讀出量測FGFR信號傳導之活化。β-Klotho為FGF21信號傳導之輔助受體，且儘管咸信由於其極短細胞質域而不具有任何固有信號傳導能力，但FGF21需要經由FGFR誘導信號傳導。
實例5.1
ELK-螢光素酶報導體檢定
使用重組人類293T腎臟細胞或CHO細胞系統進行ELK-螢光素酶檢定。特定言之，宿主細胞經工程改造以過度表現β-Klotho及螢光素酶報導體構築體。報導體構築體含有編碼GAL4-ELK1及5xUAS-Luc之序列，GAL4-ELK1及5xUAS-Luc為由含有Gal4結合位點之5個串聯複本之啟動子驅動的螢光素酶報導體。活化此等重組報導體細胞株中之FGF21受體複合物誘導細胞內信號轉導，此舉又引起ERK及ELK磷酸化。螢光素酶活性係由磷酸化ELK之含量調節，且用以間接監測及量化FGF21活性。
在一實例中，依序根據製造商之方案使用Lipofectamine 2000轉染試劑(Invitrogen)，用表現β-Klotho、FGFR1c及報導體質體之受體構築體轉染CHO細胞：5×Gal4-螢光素酶(在螢光素酶上游具有5×Gal4結合位點之最小TK啟動子)及Gal4-ELK1。Gal4-ELK1結合至Gal4結合位點且當藉由ERK磷酸化時活化轉錄。螢光素酶轉錄且關於此點由此產生之相應酶活性係由磷酸化ELK1之含量調節，且用以間接監測及定量FGF21活性。
基於10-20倍之最佳檢定窗口選擇純系2E10作為FGF21螢光素酶報導體細胞株，其中天然FGF21展現EC50在單一nM範圍內。
對於檢定而言，將ELK螢光素酶報導體細胞塗佈於96孔檢定板中且缺乏血清隔夜。在37℃下添加FGF21或測試樣品歷時6小時。接著使 板冷卻至室溫，且用Bright-Glo(Promega)量測細胞溶胞物中之螢光素酶活性。
實例5.2
ERK-磷酸化檢定
開發替代宿主細胞株，特定言之L6(一種大鼠成肌細胞株)且用以鑑別具有類似FGF21信號傳導活性之抗體。對於活性檢定大鼠L6細胞株為合乎需要之宿主細胞株，因為已知其會表現最低含量之內源性FGF受體。L6細胞甚至當用β-Klotho表現載體轉染時對FGF21無反應，且因此提供清潔本底。(Kurosu等人,(2007)J .Biol .Chem .282 ,26687-26695)。
將L6細胞維持在補充有10%胎牛血清及青黴素/鏈黴素之達爾伯克氏改良之伊格氏培養基中。根據製造商之方案使用Lipofectamine 2000轉染試劑(Invitrogen)用表現βKlotho及個別FGFR之質體轉染細胞。
如文獻中所述分析L6細胞中之FGF信號傳導(Kurosu等人,(2007)J .Biol .Chem .282 ,26687-26695)。在處理FGF21或測試分子之後收集細胞培養物10分鐘，且於液態氮中瞬間冷凍，於溶解緩衝液中均質化，且使用抗磷酸-p44/42 MAP激酶(ERK1/2)抗體及抗ERK抗體(Cell Signaling)經受西方墨點分析。以此方式測定磷酸化ERK對總ERK蛋白質之百分比。
另外，亦可開發且應用頻繁用於細胞激素受體之基於因子依賴性小鼠BaF3細胞之增殖檢定。
在基於CHO細胞(純系2E10)之人類FGF21 ELK螢光素酶報導體檢定中所測試之融合瘤上清液中，與作為陽性對照之20nM FGF21相比時，大於30種經鑑別呈陽性(FGF21活性>5%)。接著自此等呈陽性之融合瘤培養物之條件培養基中純化抗體，且又在基於CHO細胞之ELK螢 光素酶報導體檢定中測試。(圖7)顯示劑量反應效能檢定中之代表性抗體，其中EC50估計值小於1μg/ml(或6.7nM)。在基於L6細胞之ERK1/2-磷酸化檢定(圖8)中證實該等活性，其中EC50小於10nM，其與CHO穩定細胞株2E10中之ELK-螢光素酶檢定一致。
實例6
類似FGF21信號傳導之誘導對FGFR1c/β KLOTHO複合物具有特異性
已報導FGF21經由包括FGFR1c、2c、3c及4(當與β-Klotho配對時)之多種受體複合物信號傳導。在用表現各別FGFR及βKlotho之載體轉染之大鼠成肌細胞L6細胞中測試FGF21促效抗體之選擇性。圖9中所示之結果表明活性經由FGFR1c而非經由FGFR2c、3c或4(當其與β-Klotho配對時)選擇性及獨佔地介導，因為對於高達100nM之促效抗體在後面受體上未偵測到活性。此獨特選擇性強烈表明此等抗體之作用具β-Klotho依賴性，然而其亦必須特定包括信號傳導複合物之FGFR1c組分。
實例7
初級人類脂肪細胞中之活性
FGF21刺激培養之脂肪細胞中葡萄糖攝取及脂解，且認為脂肪細胞與重組報導體細胞系統相比更具生理學相關性。
顯示抗體組在人類脂肪細胞檢定中展現與FGF21類似之Erk磷酸化活性(圖10)，其中EC50估計值小於10nM。
實例8
競爭結合及抗原決定基分類
為比較FGF21受體上抗體之結合位點的相似性，進行一系列競爭結合實驗且由Biacore量測。在一實例中(且如圖11中所示)，將兩種代表性促效FGF21受體抗體(24H11及17D8)及一種非功能性FGF21受體結合抗體(1A2.1)固定於感測器晶片表面上。接著在固定之抗體表面上 捕捉可溶性人類FGFR1c/β-Klotho ECD-Fc複合物或β-Klotho。最終，將若干測試FGF21受體抗體個別注射於捕捉之可溶性人類FGF21受體或β-Klotho上。若注射之抗體識別相對於固定抗體所識別之結合位點不同之結合位點，則將觀測到第二結合事件。若抗體識別極類似的結合位點，則將不再觀測到結合。
如(圖11A)中所示，測試之促效抗體存在兩個不同但部分重疊之結合位點。一個位點由24H11、21H2、18B11.1及17C3(A組)覆蓋且另一位點由17D8、12E4及18G1(B組)覆蓋。兩種非功能性抗體2G10及1A2結合至彼此不同之位點且與由A組及B組中之促效抗體覆蓋之兩個位點不同。結合至A組抗原決定基之其他功能性抗體包括20D4、22H5、16H7、40D2及46D11。此方法顯示兩種其他功能性抗體26H11及37D3結合由B組抗體覆蓋之相同位點。另外，針對39F11、39F7及39G5(C組)鑑別功能性抗體之第三結合位點，其似乎與A組及B組結合位點不同(圖11B)。
用固定於感測器晶片上之生物素標記FGF21進行另一Biacore分析。接著使10nM可溶性β-Klotho單獨或與100nM之個別測試抗體混合經過晶片。圖12顯示A組中之若干促效抗體(24H11、18B11、17C3)及抗體12E4(來自B組)明顯與FGF21競爭結合至可溶性β-Klotho，而非功能性抗體2G10及1A2及若干其他功能性抗體不顯示與FGF21競爭結合。
圖11C概述獲得之分類結果。
實例9
識別天然及變性結構
研究所揭示之抗原結合蛋白識別變性及天然結構之能力。程序及結果如下。
實例9.1
如FACS所示，FGF21受體促效抗體不識別變性結構
在無β-巰基乙醇之情況(非還原條件)下，用樣品緩衝液稀釋來自穩定表現FGF21受體(FGFR1c及β-Klotho)之CHO細胞或CHO親本細胞之細胞溶胞物。將細胞溶胞物以每泳道20μl裝載於4-20% SDS-PAGE凝膠上用分子量標記泳道隔離之鄰近泳道上。在電泳之後，將凝膠塗抹於0.2μ硝化纖維濾紙上。用Tris緩衝生理食鹽水/Triton-X(TBST)加5%脫脂奶(阻斷緩衝液)處理墨點30分鐘。接著沿分子量標記泳道切割墨點。接著在TBST/5%牛奶中用FGF21受體促效抗體(12C3、26H11、12E4、21H2、18B11或20D4)及市售山羊抗鼠類β-Klotho或小鼠抗huFGFR1(R & D Diagnostics)探測條帶。在室溫下用抗體培育墨點1小時，隨後用TBST+1%牛奶洗滌3次。接著用抗人類或抗山羊IgG-HRP二次抗體探測墨點20分鐘。將墨點用TBST洗滌3×15分鐘，隨後用Pierce Supersignal West Dura顯影試劑處理(1分鐘)，且曝露於Kodak Biomax X射線膠片。
市售抗β-Klotho及抗FGFR1抗體在SDS-PAGE中偵測相應受體蛋白，表明其結合至變性受體蛋白。相反，無測試之FGF21受體促效抗體偵測到相應蛋白質物質，表明其結合至與結合至變性序列之市售抗體不同的天然構形抗原決定基。
實例9.2
如FACS所示，FGF21受體促效抗體結合至天然受體結構
用若干市售FGFR1c及β-Klotho抗體及若干所揭示之FGF21受體促效抗體進行FACS結合檢定。如下進行實驗。
將穩定表現FGF21受體之CHO細胞用R&D Systems小鼠抗huFGFR1、山羊抗mu β-Klotho或FGF21受體抗體24H11、17C3、17D8、18G1或2G10(每1×106 個細胞1μg，於100μl PBS/0.5% BSA中)處理。在4℃下用抗體培育細胞，隨後用PBS/BSA洗滌兩次。接著在4℃下用FITC 標記之二次抗體處理細胞，隨後洗滌兩次。使細胞再懸浮於1ml PBS/BSA中，且使用FACS Calibur儀器分析抗體結合。
與西方墨點法結果一致，在FACS中所有測試之FGF21受體促效抗體均良好結合至細胞表面FGF21受體，而市售抗β-Klotho或抗FGFR1抗體則不結合。此觀測進一步證實，FGF21受體促效抗體識別天然結構，而受體組分之市售抗體則不識別。
實例10
精胺酸掃描
如上所述，產生且表徵結合人類FGF21R，例如FGFR1c、β-Klotho或FGFR1c與β-Klotho之抗原結合蛋白。為測定此等各種抗原結合蛋白結合之人類FGFR1c及/或β-Klotho上之中和決定子，可構築在人類FGFR1c及/或β-Klotho之選擇胺基酸殘基處具有精胺酸取代的許多突變型FGFR1c及/或β-Klotho蛋白質。精胺酸掃描為評估抗體或其他蛋白質與另一蛋白質之結合位置的技術認可之方法，參見例如Nanevicz等人,(1995)J .Biol .Chem .,270 ：37,21619-21625及Zupnick等人,(2006)J .Biol .Chem .,281：29,20464-20473。一般而言，精胺酸側鏈帶正電且與其他胺基酸相比相對龐大，其可破壞抗體結合至引入突變之抗原區。精胺酸掃描為測定殘基是否為中和決定子及/或抗原決定基之一部分的方法。
可選擇遍及人類FGFR1c及/或β-Klotho細胞外域分佈之各種胺基酸以供突變成精胺酸之用。該選擇可能偏向於帶電或極性胺基酸，以使殘基處於表面上之可能性最大，且降低產生錯誤摺疊蛋白質之突變之可能性。使用此項技術中已知之標準技術，可基於Stratagene Quickchange® II方案套組(Stratagene/Agilent,Santa Clara,CA)提供之準則設計含有突變殘基之有義及反義寡核苷酸。可使用Quickchange® II套組(Stratagene)進行野生型(WT)FGFR1c及/或β-Klotho序列之突變 誘發。嵌合構築體可經工程改造以編碼細胞外域之羧基末端上之FLAG-組胺酸標籤(6個組胺酸(SEQ ID NO：382))以有助於經由poly-His標籤純化。
可進行使用Bio-Plex工作站及軟體(BioRad,Hercules,CA)之多工分析(Multiplex analysis)，以藉由分析例示性人類FGFR1c及/或β-Klotho mAb差異結合至精胺酸突變體對比野生型FGFR1c及/或β-Klotho蛋白質來測定人類FGFR1c及/或β-Klotho上之中和決定子。經pentaHis塗佈之珠粒(「penta-His」示為SEQ ID NO：383)(Qiagen,Valencia,CA；參見www1.qiagen.com)的許多珠粒碼(bead code)可用以捕捉組胺酸標記之蛋白質。珠粒碼可使FGFR1c及/或β-Klotho精胺酸突變體及野生型人類FGFR1c及/或β-Klotho多工。
為製備珠粒，在用力震盪下，在4℃下使來自短暫表現培養物之100μl野生型FGFR1c及/或β-Klotho及FGFR1c及/或β-Klotho精胺酸突變體上清液結合至penta-His塗佈之珠粒(「penta-His」示為SEQ ID NO：383)隔夜或在室溫下歷時2小時。接著根據製造商之方案洗滌珠粒，彙集珠粒組，且分別等分至96孔過濾板(Millipore,Bellerica,MA,產品編號MSBVN1250)之2或3行中以用於獲得雙重複或三重複檢定點。將100μl抗FGFR1c及/或抗β-Klotho抗體之4倍稀釋液添加至各孔中，在室溫下培育1小時且洗滌。將100μl PE結合抗人類IgG Fc(Jackson Labs.,Bar Harbor,ME,產品編號109-116-170)之1：100稀釋液添加至各孔中，在室溫下培育1小時且洗滌。使珠粒再懸浮於1% BSA中，震盪3分鐘且經Bio-Plex工作站讀數。將結合至FGFR1c及/或β-Klotho精胺酸突變型蛋白質之抗體與結合至來自同一池之人類FGFR1c及/或β-Klotho野生型之抗體相比。可執行約5對數標度之抗體滴定。FGFR1c及/或β-Klotho精胺酸突變型蛋白質之中值螢光強度(MFI)可圖示為最大野生型人類FGFR1c及/或β-Klotho信號之百分比。可將來自所有抗體 之信號低於臨界值(cut-off value)(例如30%之野生型FGFR1c及/或β-Klotho)之彼等突變體視為由於在短暫培養物中不良表現而在珠粒上具有過低的蛋白質濃度或可能之錯誤摺疊，且可由分析排除。可將使FGFR1c及/或β-Klotho mAb之EC50增加至臨界值，例如3倍或更大(如藉由例如GraphPad Prism® 所計算)之突變(亦即精胺酸取代)視為負面影響FGFR1c及/或β-Klotho mAb結合。經由此等方法闡明各種FGFR1c及/或β-Klotho抗體之中和決定子及抗原決定基。
實例11
構築嵌合受體
在測定此等各種抗原結合蛋白所結合之人類FGFR1c及/或β-Klotho上之活化決定子之另一種方法中，可構築人類與小鼠物種之間的特異性嵌合FGFR1c及/或β-Klotho蛋白質，將其表現於如先前所述之短暫或穩定293或CHO細胞中並進行測試。舉例而言，可構築包含天然人類FGFR1c、FGFR2C、FGFR3c或FGFR4(在一實例中為FGFR1c)與嵌合人類/小鼠β-Klotho配對之嵌合FGF21受體，其中人類β-Klotho上之所選區域或序列系統地經相應的小鼠特異性殘基置換(參見例如圖2A-2C)。類似地，天然人類β-Klotho與嵌合人類/小鼠FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4(在一實例中為FGFR1c)配對，其中人類FGFR1c上之所選區域或序列系統地經相應的小鼠特異性殘基置換(參見例如圖1A-圖1B之比對)。抗原結合蛋白之結合及/或活性中涉及之關鍵序列可經由先前實例4、實例5、實例6及實例7中所述之結合檢定或活性量測，基於嵌合FGF21受體衍生。
實例11.1構築特異性嵌合體
使用實例14中所述之方法構築人類-小鼠β-Klotho嵌合體。構築之嵌合體之示意圖呈現於圖29中；概括地，產生之嵌合體包含(由N至C末端)人類β-Klotho序列融合至鼠類β-Klotho序列融合至人類β-Klotho 序列之融合體。將人類β-Klotho(SEQ ID NO：8)用作構架，其中插入鼠類β-Klotho之區域(SEQ ID NO：468中所示之全長序列)。插入之鼠類β-Klotho之區域如下：
鼠類殘基82P-520P
Figure TW201805308AD00076
Figure TW201805308AD00077
(SEQ ID NO：470)
鼠類殘基506F-1043S
Figure TW201805308AD00078
Figure TW201805308AD00079
(SEQ ID NO：471)
鼠類殘基1M-193L
Figure TW201805308AD00080
Figure TW201805308AD00081
(SEQ ID NO：472)
鼠類殘基82P-302S
Figure TW201805308AD00082
Figure TW201805308AD00083
(SEQ ID NO：473)
鼠類殘基194Y-416G
Figure TW201805308AD00084
Figure TW201805308AD00085
(SEQ ID NO：474)
鼠類殘基302S-506F
Figure TW201805308AD00086
Figure TW201805308AD00087
(SEQ ID NO：475)
鼠類殘基416G-519P
GWFTDSYIKTEDTTAIYMMKNFLNQVLQAIKFDEIRVFGYTAWTLLDGFEWQDAYTTR RGLFYVDFNSEQKERKPKSSAHYYKQIIQDNGFPLKESTPDMKGRF(SEQ ID NO：476)
鼠類殘基507P-632G
Figure TW201805308AD00088
Figure TW201805308AD00089
(SEQ ID NO：477)
鼠類殘基520P-735A
Figure TW201805308AD00090
Figure TW201805308AD00091
(SEQ ID NO：478)
鼠類殘基632G-849Q
Figure TW201805308AD00092
Figure TW201805308AD00093
(SEQ ID NO：479)
鼠類殘基735A-963S
Figure TW201805308AD00094
Figure TW201805308AD00095
(SEQ ID NO：480)
鼠類殘基1M-81F
MKTGCAAGSPGNEWIFFSSDERNTRSRKTMSNRALQRSAVLSAFVLLRAVTGFSGDGK AIWDKKQYVSPVNPSQLFLYDTF(SEQ ID NO：481)
鼠類殘基82P-193L
PKNFSWGVGTGAFQVEGSWKTDGRGPSIWDRYVYSHLRGVNGTDRSTDSYIFLEKDLLALDFLGVSFYQFSISWPRLFPNGTVAAVNAQGLRYYRALLDSLVLRNIEPIVTL(SEQ ID NO：482)
使用鼠類β-Klotho序列產生之嵌合體包含以下組分：
Figure TW201805308AD00096
產生之嵌合體包含以下胺基酸序列：
(i)huβ_Klotho(1-81,523-1044)(muβKLOTHO 82-520)
Figure TW201805308AD00097
Figure TW201805308AD00098
Figure TW201805308AD00099
(SEQ ID NO：455)
(ii)huβ_Klotho(1-507)(muβKLOTHO 506F-1045S)
Figure TW201805308AD00100
Figure TW201805308AD00101
(SEQ ID NO：456)
(iii)huβ_Klotho(194-1044)(muβKLOTHO 1-L193)
Figure TW201805308AD00102
Figure TW201805308AD00103
Figure TW201805308AD00104
(SEQ ID NO：457)
(iv)huβ_Klotho(1-81,303-1044)(muβKLOTHO 82P-302S)
Figure TW201805308AD00105
Figure TW201805308AD00106
(SEQ ID NO：458)
(v)huβ_Klotho(1-193,419-1044)(muβKLOTHO Y194-416G)
Figure TW201805308AD00107
Figure TW201805308AD00108
(SEQ ID NO：459)
(vi)huβ_Klotho(1-301,509-1044)(muβKLOTHO S302-F506)
Figure TW201805308AD00109
Figure TW201805308AD00110
Figure TW201805308AD00111
(SEQ ID NO：460)
(vii)huβ_Klotho(1-417,522-1044)(muβKLOTHO G416-F519)
Figure TW201805308AD00112
Figure TW201805308AD00113
(SEQ ID NO：461)
(viii)huβ_Klotho(1-507,635-1044)(muβ KLOTHO F06-G632)
Figure TW201805308AD00114
Figure TW201805308AD00115
Figure TW201805308AD00116
(SEQ ID NO：462)
(ix)huβ_Klotho(1-521,738-1044)(muβ KLOTHO 520P-735A)
Figure TW201805308AD00117
Figure TW201805308AD00118
(SEQ ID NO：463)
(x)huβ_Klotho(1-633,852-1044)(muβ KLOTHO 632G-849Q)
Figure TW201805308AD00119
Figure TW201805308AD00120
Figure TW201805308AD00121
(SEQ ID NO：464)
(xi)huβ_Klotho(1-736,967-1044)(muβ KLOTHO 735A-963S)
Figure TW201805308AD00122
Figure TW201805308AD00123
(SEQ ID NO：465)
(xii)huβ_Klotho(82-1044)(muβ KLOTHO 1-81F)
Figure TW201805308AD00124
Figure TW201805308AD00125
Figure TW201805308AD00126
(SEQ ID NO：466)
(xiii)huβ_Klotho(1-81,194-1044)(muβ KLOTHO 82P-193L)
Figure TW201805308AD00127
Figure TW201805308AD00128
(SEQ ID NO：467)
測試本文提供之各種抗原結合蛋白以及人類FGF21活化L6細胞中嵌合體之能力。圖30係關於各測試分子之觀測結果。
此等資料指示，儘管人類FGF21能夠活化與所有人類/小鼠 β-Klotho嵌合體組合之FGFR1c(「+」符號指示受體上之活性)，但小鼠序列取代至人類β-Klotho中會影響16H7、37D3及39F7之活性。參見圖30。此等結果表明β-Klotho序列1-81、302-522及849-1044對於促效抗原結合蛋白之活性很重要，且可表示對於其功能很重要之抗原決定基。
實例12
蛋白酶保護分析
藉由結合人類FGF21受體(例如FGFR1c、β-Klotho或FGFR1c與β-Klotho複合物)之抗原結合蛋白所結合之人類FGF21受體區域可藉由用特異性蛋白酶(例如AspN、Lys-C、胰凝乳蛋白酶或胰蛋白酶)將人類FGF21受體分段成為肽來鑑別。接著可測定所得人類FGF21受體肽之序列(亦即來自FGFR1c及β-Klotho部分之含有二硫鍵與不含二硫鍵之肽片段)。在一實例中，可溶形式之人類FGF21受體，例如本文所述之包含FGFR1c ECD Fc及β-Klotho ECD-Fe雜二聚體之複合物，可藉由在37℃下用2μg AspN培育含約100μg可溶性FGF21受體之0.1M磷酸鈉(pH 6.5)(1.0mg/ml)20小時而用AspN消化(其在胺基端在天冬胺酸及一些麩胺酸殘基之後裂解)。
接著可經HPLC層析產生AspN消化物之肽概況，而預期用類似量抗體之對照消化基本上具有AspN內切蛋白酶抗性。接著可在抗原結合蛋白存在下執行蛋白酶保護檢定以測定人類FGF21受體之蛋白水解消化。此檢定之通用原則為，抗原結合蛋白與FGF21受體之結合可引起某些特異性蛋白酶裂解位點受到保護，且此資訊可用以測定抗原結合蛋白結合之FGF21受體之區域或部分。
簡言之，可對肽消化物進行HPLC肽定位；收集個別峰，且藉由線上電噴霧電離LC-MS(ESI-LC-MS)分析及/或藉由N端定序來鑑別及定位該等肽。可執行此等研究之HPLC分析，對於離線分析使用窄孔逆相C18管柱(Agilent Technologies)且對於LC-MS使用毛細管逆相C18管柱 (The Separation Group)。可用0.05%三氟乙酸(移動相A)至含90%乙腈之0.05%三氟乙酸之線性梯度執行HPLC肽定位。可在合乎需要之流速下針對窄孔HPLC進行離線或線上LC-MS分析且針對毛細管HPLC進行線上LC-MS分析來開發管柱。
序列分析可藉由線上LC-MS/MS及藉由對自HPLC回收之肽峰執行Edman定序來進行。可執行肽消化物之線上ESI LC-MS分析以測定藉由HPLC分離之肽之精確質量及序列。因此可測定來自蛋白酶消化之肽峰中存在的所選肽之一致性。
實例13
獼猴研究
使用實例1-實例3中所揭示之方法產生編碼本文命名為16H7之抗原結合蛋白之構築體。16H7如實例1-實例5中所述進行表現、純化及表徵，且在肥胖獼猴中進行活體內研究。16H7為全人類IgG1抗體且藉由上述表1-表4中提供之序列進行描述。
實例13.1
研究設計
在肥胖獼猴中進行研究。猴子為8至19年齡。其體重在7至14kg之範圍內且BMI在36-74kg/m2 之範圍內。使猴子適應6週，之後起始化合物投與。在適應期期間，使猴子熟悉包括椅子約束、皮下注射(PBS，0.1ml/kg)、管飼(水，10ml/kg)及針對非OGTT及OGTT樣品之抽血之研究相關之程序。培訓4週之後，量測基線OGTT及血漿代謝參數。選擇20隻且隨機分為兩個處理組以獲得體重、葡萄糖OGTT概況及血漿葡萄糖及三酸甘油酯含量之類似基線含量。
以盲法方式進行研究。媒劑(n=10)、16H7(n=10)。每隔一週給予化合物(5mg/kg)。在不用16H7注射動物之該週，作為替代其接受媒劑注射。注射16H7 2次之後，在另外6週針對化合物沖洗及來自處理之恢 復監測。在整個研究中監測食物攝入、體重、臨床化學及OGTT。量測每餐之食物攝入。每週量測體重。在不同天在空腹或飽食狀態下收集血樣以量測葡萄糖、胰島素及三酸甘油酯含量。在研究起始之後每兩週進行OGTT。將起始處理之日指定為0，且詳細研究計劃展示於圖14中。
此實例中存在之結果表示在整個68天研究中收集之資料。
實例13.2
16H7對食物攝入之影響
對動物每天餵食兩次，各動物接受120g在適應期期間確定之調配食物。在各餐之後移除剩餘食物且稱重以計算食物攝入。餵食時間為8：00 AM至8：30 AM(±30分鐘)且接著為4：30 PM至5：00 PM(±30分鐘)。每天在11：30至12：30 PM(±30分鐘)對各動物提供水果(150g)。
與媒劑相比較，16H7降低猴子中之食物攝入。在處理約21天之後，影響減弱且食物攝入恢復至接近於基線或對照程度。在處理期間16H7對上午食物攝入無顯著影響(圖15)且僅適當降低下午餐中之食物攝入(圖16)。在第49天之後觀測到上午食物攝入之增加(圖15)。在整個研究中(且甚至在適應期期間)，16H7組中水果攝入似乎低於媒劑組。總而言之，16H7在抑制食物攝入方面展示顯著影響。
實例13.3
16H7對體重之影響
在整個研究中每週監測體重。經4週處理過程，用媒劑處理之動物之體重保持恆定，而用16H7處理之動物之體重逐漸降低。6週沖洗期結束時體重不會恢復至基線(圖17)。
實例13.4
16H7對身體質量指數(BMI)、腹圍(AC)及皮膚褶襞厚度(SFT)之影響
當獲取體重時，整個研究中(投與測試化合物之前與之後)每週監 測BMI、AC及SFT。BMI被定義為個體體重除以其身長之平方。SFT為皮膚及其下脂肪之雙層之厚度，如用測徑規所量測。BMI、SFT及AC為身體組成之相對精確、簡單且廉價之量測值，尤其指示皮下脂肪。在整個研究中用媒劑處理之動物顯示相對穩定之BMI、SFT及AC。用16H7處理之動物顯示經4週研究過程BMI、AC及SFT之程度降低，從而表明16H7化合物引起脂肪質量減少。結果分別顯示於圖18-圖20中。在6週沖洗期結束時此等量測參數不會恢復至基線值。
實例13.5
16H7對口服葡萄糖耐受性測試(OGTT)之影響
在處理起始之前及之後進行OGTT。在16H7注射之前，在整個OGTT中量測葡萄糖及胰島素含量之基線值(分別參見圖21及圖22)，且該等基線值在媒劑與16H7組之間統計上明顯不同。在處理期期間每兩週及在3週沖洗期之後執行給藥後OGTT。在4週處理及3週沖洗期之後，16H7略微改良葡萄糖耐受性。所用之動物模型並非對葡萄糖不耐受，說明觀測到適度影響(圖21)。在用16H7處理之動物中胰島素含量統計上明顯降低(在處理2週之後OGTT執行期間0時、在處理4週之後OGTT執行期間0及15分鐘時、及在處理2週之後執行OGTT期間0及60分鐘時觀測到顯著變化)(圖22)。
實例13.6
16H7對空腹及飽食血糖及胰島素含量之影響
自隔夜空腹動物或在上午餵食之後在飽食條件下收集血液。在空腹條件下，每週在各注射後5日進行血液抽取。在飽食條件下，在第一次注射之後第2、11、16、25及46日進行血液抽取。16H7不會降低空腹或飽食血糖含量(圖23及圖25)。在任一用16H7處理之猴子中未觀測到低血糖症。然而，16H7引起空腹及飽食血漿胰島素含量之統計上顯著降低(圖24及圖26)。
實例13.7
16H7對三酸甘油酯含量之影響
對針對葡萄糖及胰島素量測而收集之相同樣品進行量測。當在空腹或飽食條件下量測時，在用16H7處理之動物中三酸甘油酯含量明顯降低(圖27及圖28)。
實例13.8
結論
在雄性肥胖獼猴中進行之研究中，用16H7處理之動物展示改良之代謝參數。體重降低且身體組成改良。觀測到食物攝入之短期減少，影響逐漸減弱，且在研究21天時食物攝入恢復至基線或對照程度。16H7亦降低空腹胰島素及三酸甘油酯含量。亦改良OGTT期間量測之胰島素含量。
實例14
抗原結合蛋白16H7及22H5之變異體形式
使本文表1-表4中所述之抗原結合蛋白16H7及22H5突變以賦予分子不同特性，諸如溶解性、pI、總電荷、人類及動物模型中之免疫原性、穩定性等之變化。突變包含分子之輕鏈(表示為「LC」，SEQ ID NO：14)或重鏈(表示為「HC」，SEQ ID NO：32)中之添加、缺失或取代。個別地進行所揭示之單點突變，或組合兩個或兩個以上突變。
引入16H7重鏈及輕鏈序列中之突變及突變組合之實例包括以下：
I83K(在16H7重鏈中)(SEQ ID NO：396)
E16Q(在16H7重鏈中)+V24F(在16H7重鏈中)+I83T(在16H7重鏈中)+S100I(在16H7重鏈中)+T119L(在16H7重鏈中)(SEQ ID NO：395)
D109S(在16H7重鏈中)(SEQ ID NO：401)
缺失Y107(在16H7重鏈中)(SEQ ID NO：400)
在Y107之N端一側插入Y殘基(在16H7重鏈中)(SEQ ID NO：405)
D88R+P89A+V90E(在16H7重鏈中)(SEQ ID NO：398)
D49Y(在16H7輕鏈中)(SEQ ID NO：386)
D49A(在16H7輕鏈中)(SEQ ID NO：387)
D91A(在16H7輕鏈中)(SEQ ID NO：388)
D49A(在16H7輕鏈中)+D91A(在16H7輕鏈中)(SEQ ID NO：389)
Q16K(在16H7輕鏈中)(SEQ ID NO：385)
引入22H5重鏈及輕鏈序列中之突變及突變組合之實例包括以下：
N92Q(在22H5輕鏈中)(SEQ ID NO：402)
S94A(在22H5輕鏈中)(SEQ ID NO：403)
C109S(在22H5重鏈中)(SEQ ID NO：404)
概括地，所產生之抗原結合蛋白包含以下16H7重鏈及輕鏈對：(i)16H7輕鏈(SEQ ID NO：14)與包含I83K之16H7重鏈(SEQ ID NO：396)配對；(ii)16H7輕鏈(SEQ ID NO：14)與包含E16Q、V24F、I83T、S100I、T119L之16H7重鏈(SEQ ID NO：395)配對；(iii)16H7輕鏈(SEQ ID NO：14)與包含D109S之16H7重鏈(SEQ ID NO：401)配對；(iv)16H7輕鏈(SEQ ID NO：14)與包含Y107缺失之16H7重鏈(SEQ ID NO：400)配對；(v)16H7輕鏈(SEQ ID NO：14)與包含在Y107之N端一側插入Y殘基之16H7重鏈(SEQ ID NO：405)配對；(vi)16H7輕鏈(SEQ ID NO：14)與包含D88R、P89A、V90E之16H7重鏈(SEQ ID NO：398)配對；(vii)16H7重鏈(SEQ ID NO：32)與包含D49Y之16H7輕鏈(SEQ ID NO：386)配對；(viii)16H7重鏈(SEQ ID NO：32)與包含D49A之16H7輕鏈 (LC)(SEQ ID NO：387)配對；(xi)16H7重鏈(SEQ ID NO：32)與包含D91A(SEQ ID NO：388)之16H7輕鏈配對；(ix)16H7重鏈(SEQ ID NO：32)與包含D49A、D91A(SEQ ID NO：389)之16H7輕鏈配對；(x)16H7重鏈(SEQ ID NO：32)與包含Q16K之16H7輕鏈(LC)(SEQ ID NO：385)配對；及以下22H5重鏈及輕鏈序列對：(xi)22H5重鏈(SEQ ID NO：31)與包含N92Q之22H5輕鏈(LC)(SEQ ID NO：402)配對；(xii)22H5重鏈(SEQ ID NO：31)與包含S94A之22H5輕鏈(LC)(SEQ ID NO：403)配對；(xiii)22H5輕鏈(SEQ ID NO：13)與包含C109S之22H5重鏈(HC)(SEQ ID NO：404)配對；(xiv)22H5輕鏈(SEQ ID NO：13)與包含在位置107插入酪胺酸殘基之22H5重鏈(SEQ ID NO：405)配對。
所產生之輕鏈變異體之胺基酸序列展示於表6中：
Figure TW201805308AD00129
Figure TW201805308AD00130
Figure TW201805308AD00131
Figure TW201805308AD00132
Figure TW201805308AD00133
Figure TW201805308AD00134
Figure TW201805308AD00135
Figure TW201805308AD00136
Figure TW201805308AD00137
Figure TW201805308AD00138
Figure TW201805308AD00139
Figure TW201805308AD00140
Figure TW201805308AD00141
Figure TW201805308AD00142
Figure TW201805308AD00143
Figure TW201805308AD00144
Figure TW201805308AD00145
Figure TW201805308AD00146
Figure TW201805308AD00147
Figure TW201805308AD00148
Figure TW201805308AD00149
Figure TW201805308AD00150
Figure TW201805308AD00151
Figure TW201805308AD00152
Figure TW201805308AD00153
Figure TW201805308AD00154
Figure TW201805308AD00155
Figure TW201805308AD00156
Figure TW201805308AD00157
Figure TW201805308AD00158
Figure TW201805308AD00159
另外，產生及研究「半鏈抗體(hemibody)」。此結構包含16H7輕鏈(L3；SEQ ID NO：50)，其與工程改造形式之16H7重鏈配對；該工程改造之重鏈包含16H7重鏈(SEQ ID NO：32)經由(G4 S)8 連接子(SEQ ID NO：440)接合至IgG2 Fc序列(SEQ ID NO：441)，其與16H7重鏈之Fc序列配對。半鏈抗體之組成部分具有以下序列：
16H7重鏈
Figure TW201805308AD00160
(SEQ ID NO：32)
連接子
GGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：440)
IgG2 Fc
Figure TW201805308AD00161
Figure TW201805308AD00162
(SEQ ID NO：441)
完全半鏈抗體重鏈具有如下所示之胺基酸序列：
Figure TW201805308AD00163
Figure TW201805308AD00164
(SEQ ID NO：453)
其藉由以下序列編碼：
Figure TW201805308AD00165
Figure TW201805308AD00166
Figure TW201805308AD00167
(SEQ ID NO：454)
實例14.1
工程改造抗體之β-Klotho結合ELISA
使用ELISA檢定測試工程改造形式之16H7及22H5之β-Klotho結合。ELISA之條件如下。
在4℃下用2μg/ml β-Klotho培育抗生蛋白鏈菌素塗佈之Maxisorp板隔夜。在室溫下添加抗體之以1μM起始的3倍連續稀釋液達1小時。將HRP結合抗人類Fc用作偵測抗體。用Lumiglo顯影信號且經Envision讀數。
ELISA檢定之結果示於圖32A-圖32C中，且指示除了在位置107具有酪胺酸插入的突變體外，大多數16H7變異體結合至人類β-Klotho。
實例14.2
16H7及22H5之工程改造之變異體結合至天然受體結構，如FACS所示
用若干工程改造形式之16H7及22H5進行FACS結合檢定。如下進行實驗。
用親本抗體16H7及22H5以及用其工程改造變異體處理穩定表現FGF21受體之CHO細胞(每1×106 個細胞1μg，於100μl PBS/0.5% BSA中)。在4℃下用抗體培育細胞，隨後用PBS/BSA洗滌兩次。接著在4℃下用FITC標記之二次抗體處理細胞，隨後洗滌兩次。使細胞再懸浮於1ml PBS/BSA中，且使用FACS Calibur儀器分析抗體結合。
與ELISA結果一致，在FACS中測試之FGF21受體促效抗體之大多數工程改造變異體良好結合至細胞表面FGF21受體。此觀測進一步證實，FGF21受體促效抗體之導引工程改造保持與天然結構結合。在CDR3經工程改造以包括位置Y107之酪胺酸的一種突變體中，觀測到完全喪失與細胞表面受體之結合，此類似於ELISA結果。此觀測係針對CDR3環在與天然構形結合中之作用。
實例14.3
初級人類脂肪細胞中16H7及22H5變異體之活性
FGF21刺激培養之脂肪細胞中葡萄糖攝取及脂解，且因此通常將脂肪細胞視為與具生理學相關檢定。如表7中所示，顯示16H7及22H5之工程改造變異體組在人類脂肪細胞檢定中展現與FGF21類似之Erk磷酸化活性，其中EC50估計值小於10nM。
Figure TW201805308AD00168
Figure TW201805308AD00169
實例14.4
Biacore結合實驗及解離速率量測
使用Biacore檢定測試16H7及22H5變異體與人類β-Klotho之結合。簡言之，將使用胺偶合劑(General Electronics,Piscataway,NJ)小鼠抗His抗體(Qiagen,Valencia,CA)固定於CM5晶片上。在第二流量槽上捕捉His標記之人類重組β-Klotho達約100RU。將第一流量槽用作本底對照。將100nM mAb稀釋於PBS加0.1mg/ml BSA、0.005% P20中且注射於在抗His抗體表面上捕捉之β-Klotho上。對於動力學量測而言，將0.78至100nM mAb稀釋於PBS加0.1mg/ml BSA、0.005% P20中為注射於β-Klotho表面上。
測試變異體概述於表8中：表8 結合及解離速率實驗中研究之變異體
Figure TW201805308AD00170
在測試之工程改造mAb中，除顯示未結合之#15之外，其大部分均顯示緊密結合至人類β-Klotho。以下表9顯示100nM mAb結合至抗His上捕捉之β-Klotho。圖33顯示解離速率之比較。
Figure TW201805308AD00171
Figure TW201805308AD00172
實例15
抗原結合蛋白之組合顯示累加效應
選擇表示不同結合類別(binding bin)之抗原結合蛋白，且在報導體檢定中成對測試，以測定分子對是否將以累加方式表現。如下進行檢定。
在第1天，將AM-1/D FGFR1c+β-Klotho Luc純系以20K個細胞/孔接種於96孔板中之DMEM+10% FBS培養基中。將板培育隔夜。第二天，培養基經檢定培養基(DMEM+0.2% FBS)置換且培育隔夜。由抗體研究原料(於PBS中1mg/mL)，用檢定培養基製備2μg/ml之所研究各抗體之稀釋液。將100μL各待測試抗體組合於U型底之板中。從細胞移除檢定培養基，且將50μL抗體混合物轉移至細胞中。經細胞培育抗體混合物5小時。最後，根據製造商之說明書用SteadyGlo螢光素酶試劑(每孔50μl)讀數各樣品。
以下表10為由研究觀測到之活性(來自報導體檢定之FGF21活性之百分比)之概述；表11表示觀測到之關於各類別之活性。
Figure TW201805308AD00173
Figure TW201805308AD00174
令人驚奇地，若干對分子均顯示累加效應。分別如圖34及圖35中所示，當在實例5之報導體檢定中量測時，39F11及FGF21顯示累加效應，與16H7及39F11相同。
概述來自此組實驗之資料，觀測到當來自同一結合池之抗原結合蛋白，例如16H7與20D4配對時(兩者皆來自A組)，總活性不累加。當12E4與26H11配對時(兩者皆來自B組)亦觀測到此情況。另外，來自不相重疊類別之配對抗原結合蛋白顯示累加活性，例如16H7(A組)與26H11或12E4(B組)配對或與39F7(C組)配對。此外，抗原結合蛋白26H11及12E4(B組)當與來自A組而非C組之抗體組合時顯示累加效應，從而表明在B組及C組之結合位點之間可能存在一些重疊及/或藉由來自B組及C組之抗原結合蛋白誘導之活化構形互不相容。最終，正如所料，當功能性抗原結合蛋白與來自A組、B組或C組之結合至不同及不相重疊結合位點之非功能性抗原結合蛋白(例如2G10)配對時，對來自A組、B組或C組之功能性抗原結合蛋白之活性無影響。
總而言之，可將此資料表明所揭示之抗原結合蛋白共同投與以增強指定抗原結合蛋白可對其自身之影響。
為其所有教示且為所有目的，將本文引用之各參考文獻以全文引用的方式併入本文中。
本發明不限於本文所述特定實施例之範疇內，該等特定實施例意欲說明本發明之個別態樣，且功能等效方法及組分形成本發明之態樣。當然，除本文中所示及描述之彼等修改外，本發明之各種修改自先前描述及伴隨圖示而對熟習此項技術者顯而易見。該等修改意欲在隨附申請專利範圍之範疇內。
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Figure TW201805308AD00175
Figure TW201805308AD00176
<210> 2
<211> 209
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Figure TW201805308AD00177
Figure TW201805308AD00178
<210> 3
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 3
Figure TW201805308AD00179
Figure TW201805308AD00180
Figure TW201805308AD00181
<210> 4
<211> 822
<212> PRT
<213> 智人
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<212> PRT
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 74
Figure TW201805308AD00357
<210> 75
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 75
Figure TW201805308AD00358
<210> 76
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 76
Figure TW201805308AD00359
<210> 77
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 77
Figure TW201805308AD00360
<210> 78
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 78
Figure TW201805308AD00361
<210> 79
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 79
Figure TW201805308AD00362
<210> 80
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 80
Figure TW201805308AD00363
<210> 81
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 81
Figure TW201805308AD00364
Figure TW201805308AD00365
<210> 82
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 82
Figure TW201805308AD00366
Figure TW201805308AD00367
<210> 83
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 83
Figure TW201805308AD00368
Figure TW201805308AD00369
<210> 84
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 84
Figure TW201805308AD00370
Figure TW201805308AD00371
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<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 85
Figure TW201805308AD00372
Figure TW201805308AD00373
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<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 86
Figure TW201805308AD00374
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<211> 324
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 87
Figure TW201805308AD00375
Figure TW201805308AD00376
<210> 88
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 88
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<210> 89
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 89
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Figure TW201805308AD00379
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<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 90
Figure TW201805308AD00380
<210> 91
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 91
Figure TW201805308AD00381
Figure TW201805308AD00382
<210> 92
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 92
Figure TW201805308AD00383
<210> 93
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 93
Figure TW201805308AD00384
Figure TW201805308AD00385
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 94
Figure TW201805308AD00386
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<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 95
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<210> 96
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 96
Figure TW201805308AD00388
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<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 97
Figure TW201805308AD00389
<210> 98
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 98
Figure TW201805308AD00390
<210> 99
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 99
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 100
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<211> 324
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 101
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<211> 324
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 102
Figure TW201805308AD00394
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<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 103
Figure TW201805308AD00395
<210> 104
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 104
Figure TW201805308AD00396
Figure TW201805308AD00397
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<211> 372
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 105
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 106
Figure TW201805308AD00399
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 107
Figure TW201805308AD00401
<210> 108
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 108
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<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 109
Figure TW201805308AD00403
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<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 110
Figure TW201805308AD00404
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<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 111
Figure TW201805308AD00405
Figure TW201805308AD00406
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<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 112
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<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 113
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Figure TW201805308AD00409
<210> 114
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<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 114
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<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 115
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<211> 381
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 116
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 117
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 118
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 119
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<210> 120
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 120
Figure TW201805308AD00416
Figure TW201805308AD00417
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
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<210> 122
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 122
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<210> 123
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 123
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<210> 124
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 124
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 125
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<210> 126
<211> 7
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 126
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<210> 127
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 127
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<210> 128
<211> 5
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 128
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 129
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 130
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 131
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<210> 132
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 132
Figure TW201805308AD00429
Figure TW201805308AD00430
<210> 133
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 133
Figure TW201805308AD00431
<210> 134
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 134
Figure TW201805308AD00432
<210> 135
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 135
Figure TW201805308AD00433
Figure TW201805308AD00434
<210> 136
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 136
Figure TW201805308AD00435
<210> 137
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 137
Figure TW201805308AD00436
<210> 138
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 138
Figure TW201805308AD00437
<210> 139
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 139
Figure TW201805308AD00438
<210> 140
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 140
Figure TW201805308AD00439
<210> 141
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 141
Figure TW201805308AD00440
<210> 142
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 142
Figure TW201805308AD00441
<210> 143
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 143
Figure TW201805308AD00442
<210> 144
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 144
Figure TW201805308AD00443
<210> 145
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 145
Figure TW201805308AD00444
<210> 146
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 146
Figure TW201805308AD00445
<210> 147
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 147
Figure TW201805308AD00446
<210> 148
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 148
Figure TW201805308AD00447
<210> 149
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 149
Figure TW201805308AD00448
<210> 150
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 150
Figure TW201805308AD00449
<210> 151
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 151
Figure TW201805308AD00450
<210> 152
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 152
Figure TW201805308AD00451
<210> 153
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 153
Figure TW201805308AD00452
<210> 154
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 154
Figure TW201805308AD00453
<210> 155
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 155
Figure TW201805308AD00454
<210> 156
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 156
Figure TW201805308AD00455
<210> 157
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 157
Figure TW201805308AD00456
<210> 158
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 158
Figure TW201805308AD00457
<210> 159
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 159
Figure TW201805308AD00458
<210> 160
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 160
Figure TW201805308AD00459
<210> 161
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 161
Figure TW201805308AD00460
<210> 162
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 162
Figure TW201805308AD00461
<210> 163
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 163
Figure TW201805308AD00462
<210> 164
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 164
Figure TW201805308AD00463
<210> 165
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 165
Figure TW201805308AD00464
<210> 166
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 166
Figure TW201805308AD00465
<210> 167
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 167
Figure TW201805308AD00466
<210> 168
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 168
Figure TW201805308AD00467
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 169
Figure TW201805308AD00468
<210> 170
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 170
Figure TW201805308AD00469
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 171
Figure TW201805308AD00470
<210> 172
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 172
Figure TW201805308AD00471
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 173
Figure TW201805308AD00472
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 174
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 175
Figure TW201805308AD00474
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 176
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<210> 177
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 177
Figure TW201805308AD00476
<210> 178
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 178
Figure TW201805308AD00477
<210> 179
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 179
Figure TW201805308AD00478
<210> 180
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 180
Figure TW201805308AD00479
<210> 181
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
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Figure TW201805308AD00480
<210> 182
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
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Figure TW201805308AD00481
<210> 183
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 183
Figure TW201805308AD00482
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 184
Figure TW201805308AD00483
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 185
Figure TW201805308AD00484
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 186
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 187
Figure TW201805308AD00486
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 188
Figure TW201805308AD00487
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 189
Figure TW201805308AD00488
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 190
Figure TW201805308AD00489
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 191
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 192
Figure TW201805308AD00491
<210> 193
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 193
Figure TW201805308AD00492
<210> 194
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 194
Figure TW201805308AD00493
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 195
Figure TW201805308AD00494
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<211> 21
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 196
Figure TW201805308AD00495
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 197
Figure TW201805308AD00496
<210> 198
<211> 15
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 198
Figure TW201805308AD00497
<210> 199
<211> 15
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 199
Figure TW201805308AD00498
<210> 200
<211> 21
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 200
Figure TW201805308AD00499
<210> 201
<211> 15
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 201
Figure TW201805308AD00500
<210> 202
<211> 15
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 202
Figure TW201805308AD00501
<210> 203
<211> 15
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 203
Figure TW201805308AD00502
<210> 204
<211> 21
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 204
Figure TW201805308AD00503
<210> 205
<211> 51
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 205
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<211> 48
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 206
Figure TW201805308AD00505
<210> 207
<211> 48
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 207
Figure TW201805308AD00506
<210> 208
<211> 57
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 208
Figure TW201805308AD00507
<210> 209
<211> 51
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 209
Figure TW201805308AD00508
<210> 210
<211> 51
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 210
Figure TW201805308AD00509
<210> 211
<211> 51
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 211
Figure TW201805308AD00510
<210> 212
<211> 51
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 212
Figure TW201805308AD00511
<210> 213
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 213
Figure TW201805308AD00512
<210> 214
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 214
Figure TW201805308AD00513
<210> 215
<211> 51
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 215
Figure TW201805308AD00514
<210> 216
<211> 51
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 216
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<210> 217
<211> 48
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 217
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<210> 218
<211> 57
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 218
Figure TW201805308AD00517
<210> 219
<211> 42
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 219
Figure TW201805308AD00518
<210> 220
<211> 42
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 220
Figure TW201805308AD00519
<210> 221
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 221
Figure TW201805308AD00520
<210> 222
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 222
Figure TW201805308AD00521
<210> 223
<211> 36
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 223
Figure TW201805308AD00522
<210> 224
<211> 36
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 224
Figure TW201805308AD00523
<210> 225
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 225
Figure TW201805308AD00524
<210> 226
<211> 39
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 226
Figure TW201805308AD00525
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<211> 45
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 227
Figure TW201805308AD00526
<210> 228
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 228
Figure TW201805308AD00527
<210> 229
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 229
Figure TW201805308AD00528
<210> 230
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 230
Figure TW201805308AD00529
<210> 231
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 231
Figure TW201805308AD00530
<210> 232
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 232
Figure TW201805308AD00531
<210> 233
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 233
Figure TW201805308AD00532
<210> 234
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 234
Figure TW201805308AD00533
<210> 235
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 235
Figure TW201805308AD00534
<210> 236
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 236
Figure TW201805308AD00535
<210> 237
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 237
Figure TW201805308AD00536
<210> 238
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 238
Figure TW201805308AD00537
<210> 239
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 239
Figure TW201805308AD00538
<210> 240
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 240
Figure TW201805308AD00539
<210> 241
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 241
Figure TW201805308AD00540
<210> 242
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 242
Figure TW201805308AD00541
<210> 243
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 243
Figure TW201805308AD00542
<210> 244
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 244
Figure TW201805308AD00543
<210> 245
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 245
Figure TW201805308AD00544
<210> 246
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 246
Figure TW201805308AD00545
<210> 247
<211> 21
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 247
Figure TW201805308AD00546
<210> 248
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 248
Figure TW201805308AD00547
<210> 249
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 249
Figure TW201805308AD00548
<210> 250
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 250
Figure TW201805308AD00549
<210> 251
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 251
Figure TW201805308AD00550
<210> 252
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 252
Figure TW201805308AD00551
<210> 253
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 253
Figure TW201805308AD00552
<210> 254
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 254
Figure TW201805308AD00553
<210> 255
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 255
Figure TW201805308AD00554
<210> 256
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 256
Figure TW201805308AD00555
<210> 257
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 257
Figure TW201805308AD00556
<210> 258
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 258
Figure TW201805308AD00557
<210> 259
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 259
Figure TW201805308AD00558
<210> 260
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 260
Figure TW201805308AD00559
<210> 261
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 261
Figure TW201805308AD00560
<210> 262
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 262
Figure TW201805308AD00561
<210> 263
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 263
Figure TW201805308AD00562
<210> 264
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 264
Figure TW201805308AD00563
<210> 265
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 265
Figure TW201805308AD00564
<210> 266
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 266
Figure TW201805308AD00565
<210> 267
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 267
Figure TW201805308AD00566
<210> 268
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 268
Figure TW201805308AD00567
<210> 269
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 269
Figure TW201805308AD00568
<210> 270
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 270
Figure TW201805308AD00569
<210> 271
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 271
Figure TW201805308AD00570
<210> 272
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 272
Figure TW201805308AD00571
<210> 273
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 273
Figure TW201805308AD00572
<210> 274
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 274
Figure TW201805308AD00573
<210> 275
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 275
Figure TW201805308AD00574
<210> 276
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Gly,Ser或Asn
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Ser,Thr或Asn
<400> 276
Figure TW201805308AD00575
<210> 277
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 277
Figure TW201805308AD00576
<210> 278
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 278
Figure TW201805308AD00577
Figure TW201805308AD00578
<210> 279
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 279
Figure TW201805308AD00579
<210> 280
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 280
Figure TW201805308AD00580
<210> 281
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 281
Figure TW201805308AD00581
<210> 282
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 282
Figure TW201805308AD00582
<210> 283
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Cys,Tyr或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Ser或Gly
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Ser或Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Pro或Phe
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> Leu或不存在
<400> 283
Figure TW201805308AD00583
<210> 284
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 284
Figure TW201805308AD00584
<210> 285
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 285
Figure TW201805308AD00585
<210> 286
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 286
Figure TW201805308AD00586
<210> 287
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 287
Figure TW201805308AD00587
<210> 288
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 288
Figure TW201805308AD00588
<210> 289
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 289
Figure TW201805308AD00589
<210> 290
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Asn或Asp
<400> 290
Figure TW201805308AD00590
<210> 291
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 291
Figure TW201805308AD00591
<210> 292
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 292
Figure TW201805308AD00592
<210> 293
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 293
Figure TW201805308AD00593
<210> 294
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Ala或Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Ser或Phe
<400> 294
Figure TW201805308AD00594
<210> 295
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 295
Figure TW201805308AD00595
<210> 296
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 296
Figure TW201805308AD00596
<210> 297
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 297
Figure TW201805308AD00597
<210> 298
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 298
Figure TW201805308AD00598
<210> 299
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 299
Figure TW201805308AD00599
<210> 300
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 300
Figure TW201805308AD00600
<210> 301
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 301
Figure TW201805308AD00601
<210> 302
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 302
Figure TW201805308AD00602
<210> 303
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 303
Figure TW201805308AD00603
<210> 304
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Asn或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Val或Phe
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Asp或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> Gly或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> Ser,Asn或Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> Ser或Tyr
<400> 304
Figure TW201805308AD00604
<210> 305
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 305
Figure TW201805308AD00605
<210> 306
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 306
Figure TW201805308AD00606
<210> 307
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> Glu或Gln
<400> 307
Figure TW201805308AD00607
<210> 308
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 308
Figure TW201805308AD00608
<210> 309
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 309
Figure TW201805308AD00609
<210> 310
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> Tyr或His
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> Tyr或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> Phe或Tyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> Thr或Asn
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> Tyr或Phe
<400> 310
Figure TW201805308AD00610
<210> 311
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 311
Figure TW201805308AD00611
<210> 312
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 312
Figure TW201805308AD00612
<210> 313
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 313
Figure TW201805308AD00613
<210> 314
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 314
Figure TW201805308AD00614
<210> 315
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 315
Figure TW201805308AD00615
<210> 316
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 316
Figure TW201805308AD00616
<210> 317
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 317
Figure TW201805308AD00617
Figure TW201805308AD00618
<210> 318
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 318
Figure TW201805308AD00619
<210> 319
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 319
Figure TW201805308AD00620
<210> 320
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 320
Figure TW201805308AD00621
<210> 321
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 321
Figure TW201805308AD00622
<210> 322
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Ile,Val或Ser
<220>
<221> MPD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Leu或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Leu,Thr或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Leu,Val,Gly或Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Ala,Gly或不存在
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> Tyr,Cys或Asp
<400> 322
Figure TW201805308AD00623
<210> 323
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 323
Figure TW201805308AD00624
<210> 324
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 324
Figure TW201805308AD00625
<210> 325
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 325
Figure TW201805308AD00626
<210> 326
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Ile或Met
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> Ala或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> His或Tyr
<400> 326
Figure TW201805308AD00627
<210> 327
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 327
Figure TW201805308AD00628
<210> 328
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 328
Figure TW201805308AD00629
<210> 329
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 329
Figure TW201805308AD00630
<210> 330
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 330
Figure TW201805308AD00631
<210> 331
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 331
Figure TW201805308AD00632
<210> 332
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 332
Figure TW201805308AD00633
<210> 333
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> Ser或Asn
<400> 333
Figure TW201805308AD00634
<210> 334
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 334
Figure TW201805308AD00635
<210> 335
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 335
Figure TW201805308AD00636
<210> 336
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 336
Figure TW201805308AD00637
<210> 337
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 337
Figure TW201805308AD00638
<210> 338
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Gly或Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> His,Tyr或Asn
<400> 338
Figure TW201805308AD00639
<210> 339
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 339
Figure TW201805308AD00640
<210> 340
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 340
Figure TW201805308AD00641
<210> 341
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> Asp或Ile
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> Ala或Gly
<400> 341
Figure TW201805308AD00642
<210> 342
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 342
Figure TW201805308AD00643
<210> 343
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 343
Figure TW201805308AD00644
<210> 344
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Asn或Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Tyr或Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> Tyr或Asn
<400> 344
Figure TW201805308AD00645
<210> 345
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 345
Figure TW201805308AD00646
<210> 346
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 346
Figure TW201805308AD00647
<210> 347
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 347
Figure TW201805308AD00648
<210> 348
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 348
Figure TW201805308AD00649
<210> 349
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 349
Figure TW201805308AD00650
<210> 350
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 350
Figure TW201805308AD00651
<210> 351
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 351
Figure TW201805308AD00652
<210> 352
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Ser或Asn
<400> 352
Figure TW201805308AD00653
<210> 353
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 353
Figure TW201805308AD00654
<210> 354
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 354
Figure TW201805308AD00655
<210> 355
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Ser或Asn
<400> 355
Figure TW201805308AD00656
<210> 356
<211> 822
<212> PRT
<213> 智人
<400> 356
Figure TW201805308AD00657
Figure TW201805308AD00658
Figure TW201805308AD00659
Figure TW201805308AD00660
Figure TW201805308AD00661
Figure TW201805308AD00662
<210> 357
<211> 822
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 357
Figure TW201805308AD00663
Figure TW201805308AD00664
Figure TW201805308AD00665
Figure TW201805308AD00666
Figure TW201805308AD00667
Figure TW201805308AD00668
<210> 358
<211> 822
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成共同序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Ser或Gly
<220>
<221> MOD_RES
<222> (36)..(36)
<223> Ala或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (43)..(43)
<223> Phe或Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (74)..(74)
<223> Ala或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (89)..(89)
<223> Gln或Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (149)..(149)
<223> Met或Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (812)..(812)
<223> Ala或Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (817)..(817)
<223> Gly或Ser
<400> 358
Figure TW201805308AD00669
Figure TW201805308AD00670
Figure TW201805308AD00671
Figure TW201805308AD00672
Figure TW201805308AD00673
Figure TW201805308AD00674
<210> 359
<211> 1044
<212> PRT
<213> 智人
<400> 359
Figure TW201805308AD00675
Figure TW201805308AD00676
Figure TW201805308AD00677
Figure TW201805308AD00678
Figure TW201805308AD00679
Figure TW201805308AD00680
Figure TW201805308AD00681
<210> 360
<211> 1043
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 360
Figure TW201805308AD00682
Figure TW201805308AD00683
Figure TW201805308AD00684
Figure TW201805308AD00685
Figure TW201805308AD00686
Figure TW201805308AD00687
Figure TW201805308AD00688
<210> 361
<211> 1045
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成共同序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Pro或Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (22)..(22)
<223> Ile或Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (23)..(23)
<223> Thr或Asn
<220>
<221> MOD_RES
<222> (26)..(26)
<223> Tyr或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (28)..(28)
<223> Asn或Lys
<220>
<221> MOD_RES
<222> (33)..(33)
<223> Gly或Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> Val或Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (44)..(44)
<223> Leu或Phe
<220>
<221> MOD_RES
<222> (62)..(62)
<223> Ser或Asp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (64)..(64)
<223> Asn或Lys
<220>
<221> MOD_RES
<222> (65)..(65)
<223> Pro或Gln
<220>
<221> MOD_RES
<222> (66)..(66)
<223> Asn或Tyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (67)..(67)
<223> Phe或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (72)..(72)
<223> Glu或Pro
<220>
<221> MOD_RES
<222> (86)..(86)
<223> Phe或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (94)..(94)
<223> Leu或Phe
<220>
<221> MOD_RES
<222> (102)..(102)
<223> Lys或Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (112)..(112)
<223> His或Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (120)..(120)
<223> Asn或Gly
<220>
<221> MOD_RES
<222> (122)..(122)
<223> Ser或Asn
<220>
<221> MOD_RES
<222> (123)..(123)
<223> Ser或Gly
<220>
<221> MOD_RES
<222> (125)..(125)
<223> Asn或Asp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (126)..(126)
<223> Gly或Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (139)..(139)
<223> Ser或Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (161)..(161)
<223> Asp或Asn
<220>
<221> MOD_RES
<222> (163)..(163)
<223> Ile或Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (165)..(165)
<223> Thr或Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (166)..(167)
<223> Val或Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (170)..(170)
<223> Lys或Gln
<220>
<221> MOD_RES
<222> (173)..(173)
<223> Gln或Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (176)..(176)
<223> Ser或Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (177)..(177)
<223> Thr或Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (201)..(201)
<223> Ala或Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (205)..(205)
<223> Lys或Glu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (212)..(212)
<223> Asp或Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (228)..(228)
<223> Met或Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (264)..(264)
<223> Ala或Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (285)..(285)
<223> Asn或Asp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (286)..(286)
<223> Thr或Lys
<220>
<221> MOD_RES
<222> (287)..(287)
<223> His或Asn
<220>
<221> MOD_RES
<222> (313)..(313)
<223> Thr或Met
<220>
<221> MOD_RES
<222> (314)..(314)
<223> Met或Glu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (317)..(317)
<223> Phe或Ile
<220>
<221> MOD_RES
<222> (318)..(318)
<223> Lys或Asn
<220>
<221> MOD_RES
<222> (321)..(321)
<223> Gln或His
<220>
<221> MOD_RES
<222> (324)..(324)
<223> Val或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (343)..(343)
<223> Gly或Phe
<220>
<221> MOD_RES
<222> (346)..(346)
<223> Lys或Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (347)..(347)
<223> Lys或Gly
<220>
<221> MOD_RES
<222> (348)..(348)
<223> Leu或不存在
<220>
<221> MOD_RES
<222> (349)..(349)
<223> Phe或不存在
<220>
<221> MOD_RES
<222> (354)..(354)
<223> Ile或glu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (361)..(361)
<223> His或Glu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (382)..(382)
<223> Leu或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (386)..(386)
<223> Ala或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (398)..(398)
<223> Glu或Gln
<220>
<221> MOD_RES
<222> (399)..(399)
<223> Ala或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (408)..(409)
<223> Asn或Asp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (411)..(411)
<223> Arg或Gln
<220>
<221> MOD_RES
<222> (424)..(424)
<223> Arg或Tyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (441)..(441)
<223> Ser或Asn
<220>
<221> MOD_RES
<222> (449)..(449)
<223> Leu或Phe
<220>
<221> MOD_RES
<222> (474)..(474)
<223> Ile或Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (486)..(486)
<223> Lys或Glu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (504)..(504)
<223> Arg或Gln
<220>
<221> MOD_RES
<222> (509)..(509)
<223> Ser或Pro
<220>
<221> MOD_RES
<222> (518)..(518)
<223> Gln或Lys
<220>
<221> MOD_RES
<222> (520)..(520)
<223> Gln或Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (538)..(538)
<223> Ser或Phe
<220>
<221> MOD_RES
<222> (539)..(539)
<223> Val或Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (540)..(540)
<223> Ala或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (555)..(555)
<223> Ala或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (581)..(581)
<223> Asn或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (585)..(585)
<223> Gln或Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (598)..(598)
<223> Arg或Gln
<220>
<221> MOD_RES
<222> (604)..(604)
<223> Ala或Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (614)..(614)
<223> Ala或Lys
<220>
<221> MOD_RES
<222> (619)..(619)
<223> Ala或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (636)..(636)
<223> Ser或Phe
<220>
<221> MOD_RES
<222> (637)..(637)
<223> Ala或Pro
<220>
<221> MOD_RES
<222> (653)..(653)
<223> Glu或Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (657)..(657)
<223> His或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (659)..(659)
<223> Asp或Gly
<220>
<221> MOD_RES
<222> (664)..(664)
<223> Pro或Met
<220>
<221> MOD_RES
<222> (665)..(665)
<223> Ser或Asn
<220>
<221> MOD_RES
<222> (668)..(668)
<223> Glu或Lys
<220>
<221> MOD_RES
<222> (672)..(672)
<223> Ala或Asp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (675)..(675)
<223> Gly或Glu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (679)..(679)
<223> Gln或Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (705)..(705)
<223> Gly或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (710)..(710)
<223> Gly或Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (721)..(721)
<223> Leu或Gln
<220>
<221> MOD_RES
<222> (722)..(722)
<223> Ala或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (724)..(724)
<223> Arg或His
<220>
<221> MOD_RES
<222> (733)..(733)
<223> Ser或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (735)..(735)
<223> Arg或His
<220>
<221> MOD_RES
<222> (744)..(744)
<223> Ala或Cys
<220>
<221> MOD_RES
<222> (754)..(754)
<223> Ala或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (785)..(785)
<223> Ala或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (794)..(794)
<223> His或Asn
<220>
<221> MOD_RES
<222> (795)..(795)
<223> Arg或Gln
<220>
<221> MOD_RES
<222> (802)..(802)
<223> Ala或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (806)..(806)
<223> Leu或Phe
<220>
<221> MOD_RES
<222> (808)..(808)
<223> Glu或Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (809)..(809)
<223> Ala或Lys
<220>
<221> MOD_RES
<222> (811)..(811)
<223> Arg或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (821)..(821)
<223> Cys或Tyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (834)..(834)
<223> Glu或Lys
<220>
<221> MOD_RES
<222> (837)..(837)
<223> Ala或Asn
<220>
<221> MOD_RES
<222> (838)..(838)
<223> Gly或Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (839)..(839)
<223> Ser或Asn
<220>
<221> MOD_RES
<222> (841)..(841)
<223> Tyr或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (842)..(842)
<223> Asp或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (865)..(865)
<223> Ile或Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (874)..(874)
<223> Arg或Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (881)..(881)
<223> Gly或Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (883)..(883)
<223> Met或Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (890)..(890)
<223> Ser或Asn
<220>
<221> MOD_RES
<222> (895)..(895)
<223> Gln或Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (901)..(901)
<223> Arg或Gln
<220>
<221> MOD_RES
<222> (908)..(908)
<223> Gly或Glu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (914)..(914)
<223> Val或Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (934)..(934)
<223> Ala或Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (959)..(959)
<223> Asn或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (965)..(965)
<223> Arg或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (967)..(967)
<223> Phe或Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (969)..(969)
<223> Phe或Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (972)..(972)
<223> Ser或Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (974)..(974)
<223> Ser或Pro
<220>
<221> MOD_RES
<222> (975)..(975)
<223> Arg或Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (977)..(977)
<223> Ser或Gly
<220>
<221> MOD_RES
<222> (979)..(979)
<223> Thr或Pro
<220>
<221> MOD_RES
<222> (980)..(980)
<223> Gln或Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (982)..(982)
<223> Asn或Asp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (989)..(989)
<223> Leu或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (993)..(993)
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<220>
<221> MOD_RES
<222> (1000)..(1000)
<223> Leu或Phe
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1005)..(1005)
<223> Phe或Ile
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1009)..(1009)
<223> Val或Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1015)..(1015)
<223> Ala或Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1018)..(1018)
<223> Gln或His
<220>
<221> MOD_RES
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<223> Arg或His
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1026)..(1026)
<223> Trp或Gln
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1033)..(1033)
<223> His或Asn
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1040)..(1040)
<223> Lys或His
<220>
<221> MOD_RES
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<220>
<221> MOD_RES
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<223> Val或Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1044)..(1044)
<223> Ser或Phe
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1045)..(1045)
<223> Ser或不存在
<400> 361
Figure TW201805308AD00689
Figure TW201805308AD00690
Figure TW201805308AD00691
Figure TW201805308AD00692
Figure TW201805308AD00693
Figure TW201805308AD00694
Figure TW201805308AD00695
<210> 362
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 362
Figure TW201805308AD00696
Figure TW201805308AD00697
Figure TW201805308AD00698
Figure TW201805308AD00699
Figure TW201805308AD00700
<210> 363
<211> 1176
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 363
Figure TW201805308AD00701
Figure TW201805308AD00702
Figure TW201805308AD00703
Figure TW201805308AD00704
Figure TW201805308AD00705
Figure TW201805308AD00706
Figure TW201805308AD00707
Figure TW201805308AD00708
<210> 364
<211> 88
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 364
Figure TW201805308AD00709
<210> 365
<211> 88
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 365
Figure TW201805308AD00710
<210> 366
<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 366
Figure TW201805308AD00711
Figure TW201805308AD00712
<210> 367
<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 367
Figure TW201805308AD00713
Figure TW201805308AD00714
<210> 368
<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 368
Figure TW201805308AD00715
Figure TW201805308AD00716
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<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 369
Figure TW201805308AD00717
<210> 370
<211> 88
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 370
Figure TW201805308AD00718
<210> 371
<211> 87
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 371
Figure TW201805308AD00719
Figure TW201805308AD00720
<210> 372
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 372
Figure TW201805308AD00721
Figure TW201805308AD00722
<210> 373
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
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Figure TW201805308AD00723
Figure TW201805308AD00724
<210> 374
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 374
Figure TW201805308AD00725
<210> 375
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 375
Figure TW201805308AD00726
<210> 376
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 376
Figure TW201805308AD00727
<210> 377
<211> 99
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 377
Figure TW201805308AD00728
Figure TW201805308AD00729
<210> 378
<211> 97
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 378
Figure TW201805308AD00730
Figure TW201805308AD00731
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 379
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<211> 5
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Figure TW201805308AD00733
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<212> PRT
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Figure TW201805308AD00734
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成6xHis標籤
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Figure TW201805308AD00735
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
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Figure TW201805308AD00736
<210> 384
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
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Figure TW201805308AD00738
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
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Figure TW201805308AD00739
Figure TW201805308AD00740
<210> 386
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
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Figure TW201805308AD00742
<210> 387
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 387
Figure TW201805308AD00743
Figure TW201805308AD00744
<210> 388
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 388
Figure TW201805308AD00745
Figure TW201805308AD00746
<210> 389
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 389
Figure TW201805308AD00747
Figure TW201805308AD00748
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 390
Figure TW201805308AD00749
Figure TW201805308AD00750
Figure TW201805308AD00751
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
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Figure TW201805308AD00753
Figure TW201805308AD00754
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
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Figure TW201805308AD00756
Figure TW201805308AD00757
Figure TW201805308AD00758
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
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Figure TW201805308AD00759
Figure TW201805308AD00760
Figure TW201805308AD00761
Figure TW201805308AD00762
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
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Figure TW201805308AD00764
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Figure TW201805308AD00766
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
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Figure TW201805308AD00768
Figure TW201805308AD00769
Figure TW201805308AD00770
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 396
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Figure TW201805308AD00772
Figure TW201805308AD00773
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 397
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Figure TW201805308AD00775
Figure TW201805308AD00776
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 398
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Figure TW201805308AD00778
Figure TW201805308AD00779
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 399
Figure TW201805308AD00780
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Figure TW201805308AD00782
Figure TW201805308AD00783
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
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Figure TW201805308AD00785
Figure TW201805308AD00786
Figure TW201805308AD00787
<210> 401
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 401
Figure TW201805308AD00788
Figure TW201805308AD00789
Figure TW201805308AD00790
Figure TW201805308AD00791
<210> 402
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 402
Figure TW201805308AD00792
Figure TW201805308AD00793
<210> 403
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 403
Figure TW201805308AD00794
Figure TW201805308AD00795
<210> 404
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 404
Figure TW201805308AD00796
Figure TW201805308AD00797
Figure TW201805308AD00798
Figure TW201805308AD00799
<210> 405
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 405
Figure TW201805308AD00800
Figure TW201805308AD00801
Figure TW201805308AD00802
<210> 406
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 406
Figure TW201805308AD00803
<210> 407
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 407
Figure TW201805308AD00804
<210> 408
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 408
Figure TW201805308AD00805
Figure TW201805308AD00806
<210> 409
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 409
Figure TW201805308AD00807
<210> 410
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 410
Figure TW201805308AD00808
<210> 411
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 411
Figure TW201805308AD00809
Figure TW201805308AD00810
<210> 412
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 412
Figure TW201805308AD00811
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<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
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<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 415
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Figure TW201805308AD00818
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<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
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<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
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Figure TW201805308AD00824
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 419
Figure TW201805308AD00825
Figure TW201805308AD00826
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<212> DNA
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<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 420
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Figure TW201805308AD00828
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<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
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<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
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Figure TW201805308AD00834
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 424
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
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Figure TW201805308AD00837
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<220>
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
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<220>
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 434
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<220>
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
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Figure TW201805308AD00877
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Figure TW201805308AD00879
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列之描述：合成多肽
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Figure TW201805308AD00884
Figure TW201805308AD00885
Figure TW201805308AD00886
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Figure TW201805308AD00888
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
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Figure TW201805308AD00898
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
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Figure TW201805308AD00905
Figure TW201805308AD00906
Figure TW201805308AD00907
Figure TW201805308AD00908
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
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Figure TW201805308AD00922
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure TW201805308AD00929
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<213> 人工序列
<220>
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Figure TW201805308AD00935
Figure TW201805308AD00936
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<213> 人工序列
<220>
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Figure TW201805308AD00942
Figure TW201805308AD00943
<210> 465
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 465
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Figure TW201805308AD00945
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Figure TW201805308AD00947
Figure TW201805308AD00948
Figure TW201805308AD00949
Figure TW201805308AD00950
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 466
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Figure TW201805308AD00953
Figure TW201805308AD00954
Figure TW201805308AD00955
Figure TW201805308AD00956
<210> 467
<211> 1044
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 467
Figure TW201805308AD00957
Figure TW201805308AD00958
Figure TW201805308AD00959
Figure TW201805308AD00960
Figure TW201805308AD00961
Figure TW201805308AD00962
Figure TW201805308AD00963
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<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 468
Figure TW201805308AD00964
Figure TW201805308AD00965
Figure TW201805308AD00966
Figure TW201805308AD00967
Figure TW201805308AD00968
Figure TW201805308AD00969
Figure TW201805308AD00970
<210> 469
<211> 3132
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 469
Figure TW201805308AD00971
Figure TW201805308AD00972
Figure TW201805308AD00973
<210> 470
<211> 439
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 470
Figure TW201805308AD00974
Figure TW201805308AD00975
Figure TW201805308AD00976
<210> 471
<211> 538
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 471
Figure TW201805308AD00977
Figure TW201805308AD00978
Figure TW201805308AD00979
Figure TW201805308AD00980
<210> 472
<211> 193
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 472
Figure TW201805308AD00981
Figure TW201805308AD00982
<210> 473
<211> 221
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 473
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Figure TW201805308AD00984
<210> 474
<211> 223
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 474
Figure TW201805308AD00985
Figure TW201805308AD00986
<210> 475
<211> 205
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 475
Figure TW201805308AD00987
Figure TW201805308AD00988
<210> 476
<211> 104
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 476
Figure TW201805308AD00989
Figure TW201805308AD00990
<210> 477
<211> 126
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 477
Figure TW201805308AD00991
<210> 478
<211> 216
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 478
Figure TW201805308AD00992
Figure TW201805308AD00993
<210> 479
<211> 218
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 479
Figure TW201805308AD00994
Figure TW201805308AD00995
<210> 480
<211> 229
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 480
Figure TW201805308AD00996
Figure TW201805308AD00997
Figure TW201805308AD00998
<210> 481
<211> 81
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 481
Figure TW201805308AD00999
<210> 482
<211> 112
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 482
Figure TW201805308AD01000
<210> 483
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Thr或不存在
<400> 330
Figure TW201805308AD01001

Claims (26)

  1. 一種分離之抗原結合蛋白，其誘導FGF21介導之信號傳導。
  2. 一種分離之抗原結合蛋白，其特異性結合至以下至少一者：(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；及(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者之複合物，其中該抗原結合蛋白誘導FGF21介導之信號傳導。
  3. 如請求項1之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：(a)包含選自由以下組成之群的序列的輕鏈CDR3：(i)與選自由L1-L18之輕鏈CDR3序列組成之群的CDR3序列相差總計不超過三個胺基酸添加、取代及/或缺失的輕鏈CDR3序列，SEQ ID NO：180-194；(ii)QVWDX1 X2 SDHVV(SEQ ID NO：276)；(iii)QQX3GX4 X5 X6 X7 T(SEQ ID NO：283)；(iv)LQHNSYPLT(SEQ ID NO：267)；(v)MQSLQTPFT(SEQ ID NO：268)；(vi)QQYNNWPPT(SEQ ID NO：269)；(vii)MQSIQLPRT(SEQ ID NO：270)；(viii)QQANDFPIT(SEQ ID NO：271)；(ix)MQALQTPCS(SEQ ID NO：272)；(b)包含選自由以下組成之群的序列的重鏈CDR3序列：(i)與選自由H1-H18之重鏈CDR3序列組成之群的CDR3序列相差總計不超過四個胺基酸添加、取代及/或缺失的重鏈CDR3序列，SEQ ID NO：145-157； (ii)X34 X16 X17 X18 GX19 YYYX20 GMDV(SEQ ID NO：322)；(iii)SLIVVX21 VYX22 LDX23 (SEQ ID NO：326)；(iv)IVVVPAAIQSYYYYYGMGV(SEQ ID NO：311)；(v)DPDGDYYYYGMDV(SEQ ID NO：312)；(vi)TYSSGWYVWDYYGMDV(SEQ ID NO：313)；(vii)DRVLSYYAMAV(SEQ ID NO：314)；(viii)VRIAGDYYYYYGMDV(SEQ ID NO：315)；(ix)ENIVVIPAAIFAGWFDP(SEQ ID NO：316)；及(x)DRAAAGLHYYYGMDV(SEQ ID NO：317)；或(c)該(a)之輕鏈CDR3序列及該(b)之重鏈CDR3序列；其中，X1 為G、S或N；X2 為N、S或T；X3 為C、Y或S；X4 為G或S；X5 為A或S；X6 為P或F；X7 為L或不存在；X34 為I、V或S；X16 為L或V；X17 為L、T或V；X18 為L、V、G或T；X19 為A、G或不存在；X20 為Y、C或D；X21 為I或M；X22 為A或V；及 X23 為H或Y；且其中該抗原結合蛋白特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物。
  4. 如請求項1之抗原結合蛋白，其包含以下中之任一者：(a)選自由以下組成之群的輕鏈CDR1序列：(i)與L1-L18之CDR1序列相差不超過三個胺基酸添加、取代及/或缺失之輕鏈CDR1，SEQ ID NO：158-170；(ii)RASQ X9 X10 X11 X12 X13 X14 LA(SEQ ID NO：304)；(iii)GGNNIGSX15 SVH(SEQ ID NO：307)；(iv)RSSQSLLX29 X30 NGX31 X32 X33 LD(SEQ ID NO：310)；(v)RASQSVNSNLA(SEQ ID NO：295)；(vi)RASQDIRYDLG(SEQ ID NO：296)；(vii)RASQGISIWLA(SEQ ID NO：297)；及(viii)KSSQSLLQSDGKTYLY(SEQ ID NO：298)；(b)選自由以下組成之群的輕鏈CDR2序列：(i)與L1-L18之CDR2序列相差不超過兩個胺基酸添加、取代及/或缺失之輕鏈CDR2，SEQ ID NO：171-179；(ii)LGSX27 RAS(SEQ ID NO：290)；(iii)GX8 SX28 RAT(SEQ ID NO：294)；(iv)AASSLQS(SEQ ID NO：284)；(v)GVSTRAT(SEQ ID NO：285)；(vi)DDSDRPS(SEQ ID NO：286)；(vii)EVSNRFS(SEQ ID NO：287)；(c)選自由以下組成之群的重鏈CDR1序列：(i)與H1-H18之CDR1序列相差不超過兩個胺基酸添加、取 代及/或缺失之重鏈CDR1，SEQ ID NO：121-131；及(ii)NARMGVX39 (SEQ ID NO：352)；(iii)X40 YGIH(SEQ ID NO：355)；(iv)DLSMH(SEQ ID NO：345)；(v)DAWMS(SEQ ID NO：346)；(vi)TYAMS(SEQ ID NO：347)；(vii)SYFWS(SEQ ID NO：348)；(viii)SYYWS(SEQ ID NO：131)；(ix)SGGYNWS(SEQ ID NO：349)；(d)選自由以下組成之群的重鏈CDR2：(i)與H1-H18之CDR2序列相差不超過三個胺基酸添加、取代及/或缺失之重鏈序列，SEQ ID NO：132-144；(ii)HIFSNDEKSYSTSLKX24 (SEQ ID NO：333)；(iii)X25 ISGSGVSTX26 YADSVKG(SEQ ID NO：338)；(iv)VIWYDGSX35 KYYX36 DSVKG(SEQ ID NO：341)；(v)X37 IYX38 SGSTX41 YNPSLKS(SEQ ID NO：344)；(vi)GFDPEDGETIYAQKFQG(SEQ ID NO：327)；(vii)RIKSKTDGGTTDYAAPVKG(SEQ ID NO：328)；(viii)RIYTSGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO：329)；(ix)RIKSKDGGTTDYAAPVKG(SEQ ID NO：330)；(x)RIKSKX42 DGGTTDYAAPVKG(SEQ ID NO：483)；其中X9 為N或S；X10 為V或F；X11 為D或S；X12 為G或S； X13 為S、N或T；X14 為S或Y；X15 為E或Q；X29 為Y或H；X30 為Y或S；X31 為F或Y；X32 為T或N；X33 為Y或F；X27 為N或D；X8 為A或T；X28 為S或F；X39 為S或N；X24 為S或N；X25 為G或A；X26 為H、Y或N；X35 為D或I；X36 為A或G；X37 為N或R；X38 為Y或T；X41 為Y或N；X42 為T或不存在；(e)該(a)之輕鏈CDR1及該(b)之輕鏈CDR2；(f)該(a)之輕鏈CDR1及該(c)之重鏈CDR1；(g)該(a)之輕鏈CDR1及該(d)之重鏈CDR2；(h)該(b)之輕鏈CDR1及該(c)之重鏈CDR1；(i)該(c)之重鏈CDR1及該(d)之重鏈CDR2； (j)該(b)之輕鏈CDR2及該(d)之重鏈CDR2；(k)該(a)之輕鏈CDR1、該(b)之輕鏈CDR2及該(c)之重鏈CDR1；(l)該(b)之輕鏈CDR2、該(c)之重鏈CDR1及該(d)之重鏈CDR2；(m)該(a)之輕鏈CDR1、該(c)之重鏈CDR1及該(d)之重鏈CDR2；或(n)該(a)之輕鏈CDR1、該(b)之輕鏈CDR2、該(c)之重鏈CDR2及該(d)之重鏈CDR2，其中該抗原結合蛋白特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物。
  5. 如請求項1之抗原結合蛋白，其包含以下中之任一者：(a)包含以下之輕鏈可變域：(i)選自SEQ ID NO：158-170之輕鏈CDR1序列；(ii)選自SEQ ID NO：171-179之輕鏈CDR2序列；(iii)選自SEQ ID NO：180-194之輕鏈CDR3序列；及(b)包含以下之重鏈可變域：(i)選自SEQ ID NO：121-131之重鏈CDR1序列；(ii)選自SEQ ID NO：132-144之重鏈CDR2序列；及(iii)選自SEQ ID NO：145-157之重鏈CDR3序列；或(c)該(a)之輕鏈可變域及該(b)之重鏈可變域，其中該抗原結合蛋白特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物。
  6. 如請求項1之抗原結合蛋白，其包含以下中之任一者：(a)選自由以下組成之群的輕鏈可變域序列：(i)序列與選自SEQ ID NO：48-65之VL 1-VL 18之輕鏈可變域 序列至少80%一致之胺基酸；(ii)藉由與編碼SEQ ID NO：48-65之VL 1-VL 18之輕鏈可變域序列的聚核苷酸序列至少80%一致之聚核苷酸序列編碼之胺基酸序列；(b)選自由以下組成之群的重鏈可變域序列：(i)與SEQ ID NO：66-84之VH 1-VH 18之重鏈可變域序列至少80%一致之胺基酸序列；(ii)藉由與編碼SEQ ID NO：66-84之VH 1-VH 18之重鏈可變域序列的聚核苷酸序列至少80%一致之聚核苷酸序列編碼之胺基酸序列；或(c)該(a)之輕鏈可變域及該(b)之重鏈可變域；其中該抗原結合蛋白特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物。
  7. 如請求項6之抗原結合蛋白，其包含以下中之任一者：(a)選自由以下組成之群的輕鏈可變域序列：SEQ ID NO：48-65之VL 1-VL 18；(b)選自由以下組成之群的重鏈可變域序列：SEQ ID NO：66-84之VH 1-VH 18；或(c)該(a)之輕鏈可變域及該(b)之重鏈可變域，其中該抗原結合蛋白特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、 FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物。
  8. 如請求項7之抗原結合蛋 白，其中該輕鏈可變域及重鏈可變域係選自由以下組成之組合群：VL 1VH 1、VL 2VH 2、VL 3VH 3、VL 3VH 4、VL 4VH 5、VL 5VH 6、VL 6VH 7、VL 7VH 8、VL 8VH 8、VL 9VH 9、VL 9VH 10、VL 10VH 11、 VL 11VH 11、VL 12VH 12、VL 13VH 13、VL 14VH 14、VL 15VH 15、VL 16VH 16、VL 17VH 17及VL 18VH 18，其中該抗原結合蛋白特異性結合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物。
  9. 如請求項8之抗原結合蛋白，其另外包含：(a)SEQ ID NO：10之輕鏈恆定序列；(b)SEQ ID NO：11之輕鏈恆定序列；(c)SEQ ID NO：9之重鏈恆定序列；或(d)SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11之輕鏈恆定序列及SEQ ID NO：9之重鏈恆定序列。
  10. 如請求項1之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白為人類抗體、人類化抗體、嵌合抗體、單株抗體、多株抗體、重組抗體、抗原結合抗體片段、單鏈抗體、微型雙功能抗體、微型三功能抗體、微型四功能抗體、Fab片段、F(fab')2 片段、域抗體、IgD抗體、IgE抗體、IgM抗體、IgG1抗體、IgG2抗體、IgG3抗體、IgG4抗體或在鉸鏈區中具有至少一個突變之IgG4抗體。
  11. 如請求項1之抗原結合蛋白，當結合至(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物時，其：(a)依與參考抗體實質上相同之Kd結合至(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物；(b)如ELK螢光素酶報導體檢定所量測，其所誘導的類似FGF21信號傳導為包含SEQ ID NO：2之成熟形式之野生型FGF21標準物所誘導信號傳導的10%或10%以上； (c)在選自由以下組成之群的檢定中所展現類似FGF21信號傳導之EC50為10nM或10nM以下：(i)FGFR1c/β-Klotho介導之活體外基於重組細胞之檢定；及(ii)活體外人類脂肪細胞功能檢定；(d)在β-Klotho存在下，在活體外重組FGFR1c受體介導之報導體檢定中，所展現對FGFR1c之促效活性之EC50小於10nM；及(e)在無β-Klotho存在下，在活體外重組FGFR1c受體介導之報導體檢定中，所展現對FGFR1c之促效活性之EC50大於1μM；或(f)與參考抗體競爭結合至(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物，其中該參考抗體包含選自由以下組成之群的輕鏈及重鏈可變域序列之組合：VL 1VH 1、VL 2VH 2、VL 3VH 3、VL 3VH 4、VL 4VH 5、VL 5VH 6、VL 6VH 7、VL 7VH 8、VL 8VH 8、VL 9VH 9、VL 9VH 10、VL 10VH 11、VL 11VH 11、VL 12VH 12、VL 13VH 13、VL 14VH 14、VL 15VH 15、VL 16VH 16、VL 17VH 17及VL 18VH 18。
  12. 如請求項11之抗原結合蛋白，當結合至(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物時，其：(a)降低動物模型中之血糖；(b)降低動物模型中之血清脂質含量；(c)降低動物模型中之胰島素含量；或(d)(a)及(b)及(c)中之兩者或兩者以上。
  13. 如請求項1之抗原結合蛋白，其中該等抗原結合蛋白包含：(a)包含SEQ ID NO：31、32、390-401、404-405中之一者之重鏈；(b)包含SEQ ID NO：13、14、385-389、402-403中之一者之輕鏈； 或(c)包含(a)之重鏈及(b)之輕鏈之組合。
  14. 一種抗原結合蛋白，其能夠結合野生型人類β-Klotho(SEQ ID NO：7)但不會結合至嵌合形式之β-Klotho，其中該嵌合形式之β-Klotho包含人類β-Klotho構架，其中鼠類β-Klotho序列置換野生型人類殘基之(a)位置1-80；(b)位置303-522；(c)位置852-1044；及(d)其組合中之至少一處。
  15. 一種抗原結合蛋白，其能夠與野生型人類β-Klotho(SEQ ID NO：7)之(a)位置1-80；(b)位置303-522；(c)位置852-1044；及(d)其組合中之至少一處結合。
  16. 一種抗原結合蛋白，其能夠與如請求項8或13之抗原結合蛋白競爭結合至(a)位置1-80；(b)位置303-522；(c)位置852-1044；及(d)其組合中之至少一處之人類野生型β-Klotho殘基。
  17. 一種醫藥組合物，其包含一或多種如請求項1之抗原結合蛋白與其醫藥學上可接受之載劑混合。
  18. 一種醫藥組合物，其包含一或多種如請求項11之抗原結合蛋白與其醫藥學上可接受之載劑混合。
  19. 一種分離之核酸，其包含編碼如請求項6之抗原結合蛋白之輕鏈可變域、重鏈可變域或兩者之聚核苷酸序列。
  20. 如請求項19之分離之核酸，其中該序列包含：(a)VL 1-VL 18(SEQ ID NO：48-65)；(b)VH 1-VH 18(SEQ ID NO：66-84)；或(c)(a)之一或多個序列及(b)之一或多個序列。
  21. 一種表現載體，其包含如請求項19或20之核酸。
  22. 一種分離之細胞，其包含如請求項19或20之核酸。
  23. 一種分離之細胞，其包含如請求項21之表現載體。
  24. 一種產生抗原結合蛋白之方法，該抗原結合蛋白特異性結合至(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及FGFR4中之一者的複合物，該方法包含在允許如請求項23之宿主細胞表現該抗原結合蛋白之條件下培育如請求項23之宿主細胞。
  25. 一種如請求項17之組合物之用途，其用於製造用以預防或治療可藉由降低血糖、胰島素或血清脂質含量治療之病狀的藥劑。
  26. 如請求項25之用途，其中該病狀為2型糖尿病、肥胖症、血脂異常、NASH、心血管疾病或代謝症候群。
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