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TW201531476A - 二氫羥戊甲嗎啡 - Google Patents

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TW201531476A
TW201531476A TW104114556A TW104114556A TW201531476A TW 201531476 A TW201531476 A TW 201531476A TW 104114556 A TW104114556 A TW 104114556A TW 104114556 A TW104114556 A TW 104114556A TW 201531476 A TW201531476 A TW 201531476A
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Abstract

本發明提供一種用於製備式(VI)化合物或其鹽或其衍生物的方法， □其中R1及R2獨立地為C1-8烷基，且*表示立體中心。

Description

二氫羥戊甲嗎啡
本發明係關於一種製造二氫羥戊甲嗎啡之新穎方法、(S)-二氫羥戊甲嗎啡本身以及在其合成期間所製備之中間物。
(R)-二氫羥戊甲嗎啡(如下所示)為一種強效止痛藥。
在中國，其主要以舌下形式、以20μg至180μg範圍內之劑量使用。據報導，與其他止痛劑相比，其產生強止痛效應及相對輕微之副作用。JP-10-231248中亦揭示以經皮貼片使用(R)-二氫羥戊甲嗎啡。然而，據本申請人所知，市面上並無該種貼片出售。
二氫羥戊甲嗎啡為羥戊甲嗎啡之變體。(R)-羥戊甲嗎啡為用於麻醉動物(例如大象)的功效極強之類鴉片。其開發於20世紀60年代，且製備其之合成路線已為人所熟知。舉例而言，GB 925,723之實施例12揭示羥戊甲嗎啡之合成，其中向蒂巴因(thebaine)衍生物中添加格林納試劑 (Grignard reagent)(碘化丙基鎂)，如下所示：
實施例12中所得之結果表明，粗反應產物於甲醇中濕磨可產生α異構物，且當用水稀釋並傾析液體時，β異構物可自甲醇性液體中結晶。
因此，申請人預期GB 925,723中所述之合成路線可用於二氫羥戊甲嗎啡且會產生(R)與(S)非對映異構物。然而發現情況並非如此。反倒是向二氫蒂巴因衍生物中添加鹵化丙基鎂產生了出乎意料高的立體選擇性且僅獲得(R)非對映異構物。
據申請人所知，二氫羥戊甲嗎啡之(S)異構物從未得到製備。因此，需要一種可提供(S)-二氫羥戊甲嗎啡之替代合成路線，且尤其需要以較高非對映異構物過量產生(S)-二氫羥戊甲嗎啡的程序。需要此異構物以證實已知立體異構物之立體化學構型。
申請人現已發現滿足此等需要之方法。此外，本申請人已發現二氫羥戊甲嗎啡之(S)異構物具備適用之藥理學性質，尤其止痛效應。
因而，根據一個態樣，本發明係關於一種製備式(VI)化合物或其鹽或衍生物的方法， (其中R1及R2獨立地為C1-8烷基，且*表示立體中心，較佳為S立體中心)，其包含水解式(V)化合物 其中R1、R2及*如上文所定義。
在本發明之一個較佳方法中，式(V)化合物係藉由使式(IV)化合物與式R2M(X)p之化合物(其中R2為C1-8烷基，M為金屬，X為鹵素且p為1或0)反應來製備： (其中R1如上文所定義)。
在本發明之另一較佳方法中，式(IV)化合物係藉由還原式(III)化合物來製備： (其中R1如上文所定義)。
在本發明之又一較佳方法中，式(III)化合物係藉由使式(I)化合物與式(II)化合物反應來製備： (其中R1為C1-8烷基)。
因而，根據另一態樣，本發明提供一種製備式(VI)化合物或其鹽或衍生物的方法， (其中R1及R2獨立地為C1-8烷基，且*表示立體中心，較佳為S立體中心)，其包含：使式(I)化合物與式(II)化合物反應，以獲得式(III)化合物： (其中R1為C1-8烷基) (其中R1如上文所定義)；還原該式(III)化合物以產生式(IV)化合物： (其中R1如上文所定義)；使該式(IV)化合物與式R2M(X)p化合物反應，其中R2為C1-8烷基、M為金屬、X為鹵素且p為1或0，以獲得式(V)化合物： (其中R1、R2及*如上文所定義)；(iv)水解該式(V)化合物以產生式(VI)化合物。
根據另一態樣，本發明係關於一種式(VI)化合物，或其鹽或衍生物， 其中R1及R2獨立地為C1-8烷基，且*表示(S)立體中心。
根據另一態樣，本發明係關於作為上述方法中之中間物的化合物，亦即式(V)、式(IV)及式(III)化合物或(適當時)其鹽或衍生 物，如下所示： 其中R1及R2獨立地為C1-8烷基，且*表示(S)或(R)立體中心，較佳為(S)立體中心； 其中R1為C1-8烷基； 其中R1為C1-8烷基。
根據另一態樣，本發明係關於一種用於製備式(III)化合物之方法，其包含使式(I)化合物與式(II)化合物反應： (其中R1為C1-8烷基)。
根據另一態樣，本發明係關於包含如上文所述之新穎化合物的組成物，較佳為醫藥組成物。
根據另一態樣，本發明係關於如上文所述之化合物，其係用於醫藥(例如用作止痛劑)。
根據又一態樣，本發明係關於如上文所述之化合物的用途，其係用於製造供治療疼痛用之藥劑。
如本文中所使用，術語「烷基」係用於指直鏈、環狀或分支鏈飽和脂族烴。化合物(II)至(VI)中所存在之較佳烷基為直鏈烷基。較佳烷基具有式CnH2n+1，其中n為1至8。典型烷基包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基及辛基。化合物(II)至(VI)中之較佳烷基係未經取代。
圖1展示(R)及(S)-19-丙基二氫西芬恩醇之1H NMR光譜。
圖2及圖3展示(R)-19-丙基二氫西芬恩醇之X射線結構。
圖4及圖5展示(S)-19-丙基二氫西芬恩醇之X射線結構。
圖6及圖7展示(R)-二氫羥戊甲嗎啡之X射線結構。
圖8及圖9展示(S)-二氫羥戊甲嗎啡之X射線結構。
圖10展示(R)-二氫羥戊甲嗎啡及(S)-二氫羥戊甲嗎啡中所存在之所有手性碳的立體化學構型。
圖11至圖13展示靜脈內投予(R)-DHE或(S)-DHE或參考物質或比較物質之後的時程曲線。
圖14至圖17展示靜脈內投予(R)-DHE或(S)-DHE或參考物質或比較物質之後的劑量反應曲線。
圖18至圖23展示在神經病變性疼痛之脊神經結紮模型中靜脈內投予(R)-DHE或(S)-DHE或參考物質或比較物質之後的影響。
式(I)化合物為蒂巴因，且可購自例如Tasmanian Alkaloids,Pty。或者，可根據文獻中所述之程序製備式(I)化合物。
在本發明之一個較佳方法中，式(II)化合物中之R1較佳為C2-7烷基，更佳為C3-5烷基，尤其為C3烷基(例如正丙基)。尤佳式(II)化合物為己烯-3-酮。其可購自例如Sigma-Aldrich。
使式(I)化合物與式(II)化合物反應，以便製造式(III)化合物。此等化合物所進行之反應典型地稱為狄耳士-阿德爾反應(Diels-Alder reaction)。狄耳士-阿德爾反應可在此項技術中習知之條件下進 行。舉例而言，式(I)化合物與式(II)化合物之反應可在任何習知溶劑中進行。沸點超過60℃之溶劑較佳(例如甲醇及乙醇)。乙醇為尤佳溶劑。
在式(I)化合物與式(II)化合物之間的典型反應中，該等化合物在過量溶劑中加熱至回流，例如持續10至24小時。反應過程可使用例如TLC及/或1H NMR來監測。在較佳反應中，相對於式(I)化合物使用1.2至15莫耳當量、更佳1.5至10莫耳當量或2至8莫耳當量之式(II)化合物。在一個尤佳反應中，相對於式(I)化合物使用約1.2至2莫耳當量、更佳1.3至1.8莫耳當量(例如約1.5莫耳當量)之式(II)化合物。
接著，冷卻並濃縮反應混合物。所得產物式(III)化合物可藉由習知處理程序獲得且視情況經純化。純化可例如藉由自甲醇或異丙醇中結晶來進行。式(III)化合物更佳直接自反應溶劑中結晶。其可視情況再結晶。反應產率較佳為至少60%，更佳為至少65%，例如至少80%。最高產率為100%。式(III)化合物之純度較佳為至少95%，更佳為至少97%，更佳為至少99%，例如99.5%。最高純度為100%。純度較佳使用HPLC測定。
在本發明之較佳方法中，式(III)化合物具有下式： 其中，R1如上文所定義，例如R1為C2-7烷基，更佳為C3-5烷基，尤其C3烷基(例如正丙基)。
式(III)化合物可藉由已知的任何適合還原反應來還原，但較佳使用氫化反應(例如使用H2(在Parr容器中)或氫轉移反應)來還原。舉例而言，式(III)化合物可在溶劑(例如乙醇)中、在催化劑(例如鈀/碳)存在下、在氫氣壓力下(例如高達50psi之H2)進行氫化。反應體積較佳在5至80L範圍內，更佳為10至20L，例如約12L。催化劑之用量較佳在10wt%至60wt%範圍內，更佳為30wt%至55wt%，例如約50wt%。反應可在30℃至100℃之溫度下、較佳在40℃至60℃之溫度下，例如在50℃或65℃下進行。
在反應結束時，其中所使用之任何催化劑(例如鈀)均可藉由過濾除去。接著，可藉由習知處理程序分離產物式(IV)化合物。式(IV)化合物視情況經純化。舉例而言，用C1-8烷烴(諸如庚烷)洗滌可除去乙醇。然而，氫化反應之一個優勢在於式(IV)化合物不藉由層析及/或結晶加以純化即可使用。反應產率較佳為至少50%，更佳為至少65%，更佳為85%，更佳為至少90%。最高產率為100%。所得式(IV)化合物之純度較佳為至少95%、更佳為至少99%(例如至少99.5%)。最高純度為100%。純度較佳使用HPLC測定。
在本發明之較佳方法中，式(IV)化合物具有下式： 其中，R1如上文所定義，例如R1為C2-7烷基，更佳為C3-5烷基，尤其C3烷基 (例如正丙基)。
式(IV)化合物與式R2M(X)p化合物反應(其中R2為C1-8烷基，M為金屬(例如鹼金屬或鹼土金屬)，X為鹵素且p為1或0)可產生式(V)化合物。在較佳式R2M(X)p化合物中，R2為C1-3烷基，更佳為C1-2烷基，例如甲基。
在其他較佳式R2M(X)p化合物中，M為鎂或鋰，較佳為鎂。當M為Mg時，p較佳為1。當M為鋰時，p較佳為0。X存在時較佳為Cl、Br或I。鹵化甲基鎂(尤其溴化甲基鎂及碘化甲基鎂)為較佳式R2M(X)p化合物，尤其溴化甲基鎂。
式(IV)化合物與式R2M(X)p化合物之反應典型地稱為親核加成反應。當M為Mg且X為鹵素時，反應通常稱為格林納加成反應(Grignard addition)。加成反應可在任何習知溶劑中進行。較佳溶劑不含水(例如無水溶劑)。較佳溶劑之一個實例為醚，例如MTBE、THF或乙醚。MTBE或乙醚較佳。乙醚為尤佳溶劑。當使用式R2M(X)p化合物(其中M為Mg，X為Cl且p為2)時，THF尤佳。
加成反應較佳在20℃至60℃、更佳30℃至45℃範圍內之溫度(例如約35℃)下進行。較佳使用過量式R2M(X)p化合物。詳言之，相對於式(IV)化合物較佳使用1.2至4當量、更佳1.5至3當量之式R2M(X)p化合物。
式(V)化合物可使用習知技術分離。其可視情況於例如甲醇中濕磨。或者，或另外，式(V)化合物可藉由管柱層析純化。式(V)化合物亦可進行結晶。式(V)化合物較佳用甲醇結晶。反應產率較佳為至 少20%，更佳為至少30%，例如20%至60%，更佳為至少65%。最高產率為100%。式(V)化合物之純度較佳為至少95%，更佳為至少99%，例如至少99.5%。最高純度為100%。純度較佳使用HPLC測定。
加成反應在式(V)化合物中於碳19處產生新的立體中心。此立體中心之構型至少部分取決於R1及R2之性質。因而，可能產生(R)與(S)立體中心。因此，本發明之方法可提供式(V)化合物之外消旋混合物。相應地，本發明提供式(VI)化合物之外消旋混合物，例如19-(R)-二氫羥戊甲嗎啡與19-(S)-二氫羥戊甲嗎啡之外消旋混合物。
在本發明之較佳方法中，在碳19處產生(S)立體中心。在尤佳方法中，在碳19處以至少85%、更佳至少90%(例如至少95%或至少99%)之非對映異構物過量產生(S)立體中心。因而，較佳方法中所提供之式(V)化合物不存在或實質上不存在(R)-異構物。所提供之式(V)化合物具有較佳小於1wt%、更佳小於0.5wt%之(R)-異構物。
在本發明之尤佳方法中，R1為C3-6烷基(例如丙基)，R2為C1-2烷基(例如甲基)，且在加成反應中，以至少85%、更佳至少90%(例如至少95%或至少99%)之非對映異構物過量，在碳19處產生(S)立體中心。
因而，在本發明之較佳方法中，式(V)化合物具有下式： 其中R1及R2如上文所述，例如R1為C2-7烷基，更佳為C3-5烷基，尤其C3烷 基(例如正丙基)；R2為C1-3烷基，更佳為C1-2烷基，例如甲基；且(*)表示立體中心，較佳為S立體中心。
在本發明之尤佳方法中，式(V)化合物為：
如上文所提及，式(V)化合物可視情況進行結晶。在本發明之較佳方法中，式(V)化合物經結晶。結晶過程可使用任何習知溶劑，例如C1-4醇、水、丙酮、乙腈、DCM及MTBE。甲醇、乙醇、水及其混合物為較佳結晶溶劑，尤其乙醇/水及乙醇。在典型結晶過程中，獲自加成反應的一定量式(V)化合物溶解於較佳最低量之所選溶劑中；且使溶液靜置例如3至4天。結晶較佳在-5℃至5℃，例如0至4℃下進行。
式(V)化合物較佳用鹼金屬氫氧化物水解以形成式(VI)化合物。較佳鹼金屬氫氧化物為KOH。較佳在水解反應中使用過量鹼金屬氫氧化物，例如相對於式(V)化合物過量10至40當量。反應可在任何習知溶劑中進行。二乙二醇為較佳溶劑。
水解反應較佳在150℃至220℃範圍內(例如約180℃至200℃)之溫度下進行。反應進程可藉由習知技術監測，例如TLC，但典型地需要10至20小時，例如12至18小時。
反應完成之後，式(VI)化合物可使用習知技術分離。可濕磨式(VI)化合物。反應產率較佳為至少40%，更佳為至少45%，更佳為 85%，更佳為至少90%。最高產率為100%。式(VI)化合物之純度較佳為至少90%，更佳為至少95%。最高純度為100%。純度較佳使用HPLC測定。
式(VI)化合物亦可進行結晶。用於結晶之較佳溶劑為AcCN及MTBE。式(VI)化合物更佳自C1-4醇及/或水(例如乙醇及/或乙醇/水)中結晶。
在較佳水解反應中，保持式(V)化合物中所存在之各立體中心的立體化學構型。提供之式(VI)化合物(例如19-S-二氫羥戊甲嗎啡)較佳不存在或實質上不存在(R)-異構物。較佳存在小於1wt%、更佳小於0.5wt%、更佳小於0.01wt%之(R)-異構物。
因而，在較佳方法中，式(VI)化合物為： 其中R1及R2如上文所述，例如R1為C2-7烷基，更佳為C3-5烷基，尤其C3烷基(例如正丙基)；R2為C1-3烷基，更佳為C1-2烷基，例如甲基；且(*)表示立體中心，較佳為S立體中心。式(VI)化合物較佳具有例如至少99%之純度，如藉由HPLC所測定。
在一個尤佳方法中，式(VI)化合物為：
上述化合物(V)及(VI)可藉由此項技術中熟知的技術轉化成其鹽及衍生物。較佳鹽為醫藥上可接受之鹽。較佳衍生物為醫藥上可接受之衍生物。有時少量存在(例如<5wt%)之衍生物為6-羥基化合物。若水解反應另外水解6-甲氧基，則產生此化合物。6-羥基衍生物可藉由再結晶分離。
較佳鹽為彼等保持本發明化合物之生物效用及性質且由適合之無毒有機酸或無機酸形成的鹽。酸加成鹽較佳。鹽之代表性實例包括衍生自無機酸(諸如鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、胺基磺酸、磷酸及硝酸)及衍生自有機酸(諸如對甲苯磺酸、水楊酸、甲磺酸、草酸、丁二酸、檸檬酸、蘋果酸、乳酸、反丁烯二酸、三氟乙酸及其類似酸)之彼等鹽。化合物變成鹽為藥師熟知的技術，其可用於改良化合物之物理及化學穩定性、吸濕性、流動性及溶解度。
本發明之較佳化合物為上文所述之式(VI)、(V)、(IV)及(III)化合物，其中R1較佳為C2-7烷基，更佳為C3-5烷基，尤其C3烷基(例如正丙基)。在較佳式(VI)及(V)化合物中，R2為C1-3烷基，更佳為C1-2烷基，例如甲基。在本發明之化合物(VI)及(V)中，碳19處之立體中心為(S)。
一種較佳式(VI)化合物為下式之化合物： 其中R1及R2如上文所述(例如R1為C2-7烷基，更佳為C3-5烷基，尤其C3烷基(例如正丙基)；R2為C1-3烷基，更佳為C1-2烷基)，且(*)表示(S)立體中心。
一種尤佳式(VI)化合物為下式之化合物：
本發明之其他較佳化合物為作為中間物用於製備式(VI)化合物之彼等物。因而，本發明之其他較佳化合物為式(V-S)化合物： 其中R1及R2如上文所述(例如R1為C2-7烷基，更佳為C3-5烷基，尤其C3烷基(例如正丙基)；R2為C1-3烷基，更佳為C1-2烷基)，且(*)表示(S)或(R)立體中心，較佳為(S)立體中心。
一種尤佳式(V)化合物為：
其他較佳中間物為式(IVa)及(IIIa)之化合物，如以下所示：
如上文所述，式(III)化合物(諸如上文之(IIIa))，可藉由狄耳士-阿德爾反應用式(II)化合物形成。此反應形成本發明之另一態樣。R1較佳如上文中所述。
本發明化合物具有多種用途。舉例而言，化合物(VI-S)可用於證實已知二氫羥戊甲嗎啡產物之(R)手性。本發明化合物之此種用途說 明於下文之實施例中。本發明之化合物(III)及(IV)亦適用於製備(R)-二氫羥戊甲嗎啡，已知此化合物具有適用之醫藥性質。
此外，式(VI-S)、(V-S)、(V-R)、(IV)及(III)之化合物，尤其式(VI-S)之化合物，可併入組成物(較佳為醫藥組成物)中。因而，本發明亦包括醫藥組成物，其包含如上文所述之本發明化合物(例如式(VI-S)、(V-S)、(V-R)、(IV)及(III)，尤其(VI-S)之化合物)及一或多種醫藥上可接受之載劑。本發明化合物(例如式(VI-S)化合物)可單獨或與另一種活性成分組合存在於組成物中。
本發明之組成物(例如醫藥組成物)可呈任何習知形式。然而，本發明組成物較佳呈適合經皮投藥之劑型製備。本發明之替代性較佳組成物係呈適合非經腸(例如靜脈內)投藥之劑型來製備。
「經皮」遞送意謂向個體之皮膚表面投予上文所述之化合物，以使藥劑穿過皮膚組織且進入該個體之血流中。術語「經皮」意欲包括經黏膜投藥，亦即向個體之黏膜(例如舌下、頰內、陰道、直腸)表面投予化合物，以使其穿過黏膜組織並進入該個體之血流中。
本發明之經皮劑型包括(但不限於)口含片劑、噴霧劑、氣溶膠、乳膏、洗劑、軟膏、凝膠、溶液、乳液、懸浮液或熟習此項技術者已知的其他形式。適合治療口腔內黏膜組織之劑型可調配成漱口液或經口凝膠。此外，經皮劑型包括「儲器型(reservoir type)」或「基質型」貼片，其可施用於皮膚且在特定時段損耗以容許所要量的活性成分進行滲透。
適合賦形劑(例如載劑及稀釋劑)及可用於提供本發明所涵蓋之經皮劑型的其他物質為熟習醫藥技術者所熟知，且取決於指定醫藥組 成物或劑型將施用之特定組織。考慮到此事實，典型賦形劑包括(但不限於)水、丙酮、乙醇、乙二醇、丙二醇、丁-1,3-二醇、肉豆蔻酸異丙酯、棕櫚酸異丙酯、礦物油及其混合物，以用於形成無毒且醫藥上可接受之洗劑、酊劑、乳膏、乳液、凝膠或軟膏。必要時亦可向醫藥組成物及劑型中添加濕潤霜或保濕劑。該等附加成分之實例在此項技術中已為人所熟知。
視欲治療之特定組織而定，可在用本發明化合物治療之前、同時或之後使用其他組分。舉例而言，可使用滲透增進劑促進化合物遞送至組織。適合滲透增進劑包括(但不限於)：丙酮；多種醇，諸如乙醇、油醇及四氫映喃；烷基亞碸，諸如二甲亞碸；二甲基乙醯胺；二甲基甲醯胺；聚乙二醇；吡咯啶酮，諸如聚乙烯吡咯啶酮；科利當級(Kollidon grade)聚維酮(Povidone；Polyvidone)；尿素；及多種水溶性或不溶性糖酯，諸如Tween 80(聚山梨醇酯80)及Span 60(脫水山梨醇單硬脂酸酯)。
亦可調節醫藥組成物或劑型之pH值，或醫藥組成物或劑型所施用之組織的pH值以改良一或多種活性成分之遞送。類似地，可調節溶劑載劑之極性、其離子濃度或張力以改良遞送。諸如硬脂酸酯之化合物亦可添加至醫藥組成物或劑型中，以有利地改變一或多種活性成分之親水性或親油性，從而改良遞送。就此而言，硬脂酸酯可充當調配物之脂質媒劑、乳化劑或界面活性劑，及遞送增進劑或滲透增進劑。活性成分之不同鹽、水合物或溶劑合物可用於進一步調節所得組成物之性質。
用於舌下投予本發明化合物(例如式(VI-S)化合物)之經口凝膠可藉由混合該化合物與一或多種適合賦形劑(包括調味劑)來製備。用於經直腸投予本發明化合物(例如式(VI-S)化合物)之栓劑可藉由混合 該化合物與適合賦形劑(諸如可可脂、水楊酸鹽及聚乙二醇)來製備。用於經陰道投藥之調配物可呈子宮托、棉塞、乳膏、凝膠、糊狀物、泡沫或噴霧方劑之形式，除了活性成分以外，亦可含有此項技術中已知之適合載劑。
局部投藥時，包含本發明化合物之醫藥組成物可呈適合投予皮膚、眼、耳或鼻之乳膏、軟膏、擦劑、洗劑、乳液、懸浮液、凝膠、溶液、糊狀物、散劑、噴霧劑及滴劑形式。局部投藥亦可包括經由諸如經皮貼片之方式經皮投藥。以此形式遞送尤佳。
靜脈內投藥意謂直接向靜脈中投予呈液體形式的上述化合物。適合靜脈內投藥之劑型包括(但不限於)溶液、乳液及懸浮液。
因而，根據另一態樣，本發明提供用作止痛劑之如上文所定義之化合物，尤其式(VI-S)化合物，其中該化合物係靜脈內投予。
典型地，用於靜脈內投藥之組成物包含無菌等張性水性緩衝液。必要時組成物亦可包括增溶劑。該等成分可單獨供應，或混合在一起以單位劑型供應。舉例而言，該等成分可以含有凍乾粉末或無水濃縮物、指示活性劑之量的密閉容器(例如安瓿(ampule)或沙馳(sachette))及含有無菌水或緩衝液之安瓿分開供應以便混合後投藥。或者，組成物可以預混合形式供應。
本發明化合物(例如式(VI-S)化合物)可用於醫藥，例如提供止痛作用。所需化合物劑量將取決於例如待治療之個體、待治療之疼痛的嚴重程度、所使用之化合物、投藥模式等，而且容易由熟習此項技術者判定。
因而，根據另一態樣，本發明提供一種治療需要減輕疼痛之個體(例如哺乳動物)的方法，該方法包含向該個體投予治療有效量的上述化合物(例如式(VI-S)化合物)。亦已令人驚訝地發現，在雪貂之噁心及嘔吐標準測試中，在類似於下述測試中所使用之劑量範圍內，R-DHE及S-DHE均不誘發噁心或嘔吐。
本發明化合物尤其適用於治療傷痛刺激性疼痛及神經病變性疼痛。
現參考以下非限制性實施例及圖式描述本發明，其中：圖1展示(R)及(S)-19-丙基二氫西芬恩醇之1H NMR光譜。
圖2及圖3展示(R)-19-丙基二氫西芬恩醇之X射線結構。
圖4及圖5展示(S)-19-丙基二氫西芬恩醇之X射線結構。
圖6及圖7展示(R)-二氫羥戊甲嗎啡之X射線結構。
圖8及圖9展示(S)-二氫羥戊甲嗎啡之X射線結構。
圖10展示(R)-二氫羥戊甲嗎啡及(S)-二氫羥戊甲嗎啡中所存在之所有手性碳的立體化學構型。
圖11至圖13展示靜脈內投予(R)-DHE或(S)-DHE或參考物質或比較物質之後的時程曲線。
圖14至圖17展示靜脈內投予(R)-DHE或(S)-DHE或參考物質或比較物質之後的劑量反應曲線。
圖18至圖23展示在神經病變性疼痛之脊神經結紮模型中靜脈內投予(R)-DHE或(S)-DHE或參考物質或比較物質之後的影響。
實施例
製備(S)-二氫羥戊甲嗎啡
階段1：狄耳士-阿德爾反應
方法
按照下表中所說明在溶劑中用己烯-3-酮處理蒂巴因，且加熱至回流。適量時間(隔夜)之後，冷卻反應且蒸發混合物。所得油狀物溶解於乙酸異丙酯(IPAc)中，且用1M鹽酸溶液洗滌。合併酸性層，且用IPAc洗滌，接著用碳酸氫鈉溶液鹼化，且最後在二氯甲烷(DCM)中萃取。蒸發DCM層，獲得黃色固體。
使用乙醇作為溶劑時，處理後所得呈淡黃色固體狀之產物之最終分離產率為70%，且品質(藉由1H NMR)顯示極佳。
階段2：氫化反應
方法
來自階段1之19-丙基西芬恩酮(propylthevinone)(4.1g)中間物在高達50psi之氫氣壓力下、在乙醇(60ml)中使用鈀/碳(1g；10%)氫化。容器之溫度維持在約50℃且壓力維持在50psi，直至指示不再吸收氫氣。濾出催化劑且藉由在真空下蒸餾除去溶劑。分離產率總共為91%，獲得3.8g產物。
階段3：格林納加成反應
反應流程
方法
19-丙基二氫西芬恩酮(階段2產物)溶解於乙醚(35個體積)中。在20℃至25℃下，經5分鐘向此溶液中添加溴化甲基鎂(92.6莫耳當量)(少量放熱)。接著，所得混合物加熱至約40℃之內部溫度，歷時約2小時，接著冷卻且用氯化銨溶液中止。混合物用2-甲基THF萃取，且在真空中蒸發有機層，獲得黏性油狀物。
格林納加成反應之唯一產物為(S)-對映異構物。未偵測到(R)-對映異構物。
階段4：(R)及(S)-19-丙基二氫西芬恩醇(propyldihydrothevinol)之結晶
為了製備高品質之單晶體供X射線晶體學分析，在多種溶 劑中進行一系列實驗以確定用於生長19-丙基二氫西芬恩醇之單晶體的最佳溶劑系統。實驗匯總於下表4中。R-對映異構物係使用替代方法製備。
一般而言，所使用之結晶法如下：少量固體19-丙基二氫西芬恩醇(獲自階段3)溶解於稍微超過最低量的溶劑中。使溶液靜置多達3至4天，且藉由過濾或傾析除去溶劑以分離單晶體。
各種非對映異構物之1H NMR光譜示於圖1中。
階段5：(S)-19-丙基二氫西芬恩醇之水解
方法
(S)-19-丙基二氫西芬恩醇(來自階段3)溶解於二乙二醇(17個體積)中，且用氫氧化鉀(約20當量)處理，並加熱至約195℃，歷時12至18小時。此時間之後，反應混合物冷卻至室溫且在水(40個體積)中 中止。所得溶液使用固體氯化銨酸化至pH 9-10，且用DCM(3×50個體積)萃取混合物。所合併之有機萃取物在真空中蒸發以獲得粗油狀物(約40%純度)。藉由在甲醇中重複濕磨來增加純度直至形成黃色固體，且以良好純度(>95%)分離。
產物自若干溶劑中再結晶，且自乙腈中獲得晶體。此等晶體用於X射線晶體學研究。
R-對映異構物係使用類似反應獲得。
X射線晶體學研究
所有X射線晶體學實驗均在Oxford Xcalibur單晶體繞射儀或Nonius Kappa繞射儀上進行。兩種機器均使用鉬K α X射線源及CCD偵測器。
(R)-19-丙基二氫西芬恩醇及(S)-19-丙基二氫西芬恩醇
對多批(R)-19-丙基二氫西芬恩醇與(S)-19-丙基二氫西芬恩醇進行X射線晶體學分析。
X射線結構示於圖2至圖5中。
圖2及圖3展示(R)-19-丙基二氫西芬恩醇之X射線結構。由X射線可顯而易見，其在碳19處具有(R)-構型。此可能歸因於手性甲醚，其保留蒂巴因起始物質之(R)-構型。
此外，由圖3(其中顯示氫原子)可見，7位置之氫與5位置之氫(鄰接於呋喃環)在同一平面上，從而呈現(R)-構型。
所有手性碳現均已以此方式指定並描繪於圖10中。
圖4及圖5展示(S)-19-丙基二氫西芬恩醇之X射線結構。
由圖4可顯而易見，其在碳19處具有與圖3中所示之晶體相反的(S)-構型立體化學。此可能歸因於手性甲醚，其保留蒂巴因起始物質之(R)-構型。
又，7-碳氫(圖5中所示)顯示此碳處之構型亦為(R)，如同第一種非對映異構物。
因此，現可有把握地作出如下結論：依據X射線晶體學，兩種化合物之間的唯一差異在於碳19處之立體構型。
(R)-二氫羥戊甲嗎啡及(S)-二氫羥戊甲嗎啡
X射線結構示於圖6至圖9中。
圖6及圖7展示(R)-二氫羥戊甲嗎啡之X射線結構。由此等圖可顯而易見，其在碳19處具有(R)-構型。此可能歸因於手性甲醚，其保留最初起始物質蒂巴因之(R)-構型。
圖8及圖9展示(S)-二氫羥戊甲嗎啡之X射線結構。由此等圖可顯而易見，其在碳19處具有(S)-構型。此可能歸因於手性甲醚，其保留最初起始物質蒂巴因之(R)-構型。
此外，7-碳氫(圖9中所示)顯示此碳處之構型亦為(R)，如同第一種非對映異構物。
因此，可作出如下結論：依據X射線晶體學，兩種化合物之間的唯一差異在於碳19處之立體構型。
方法優化
使用以下方法及設備：方法38XB及UFC-LC-MUN-1為逆相、梯度HPLC程序，其使用Xbridge C18管柱及由乙腈及0.01M乙酸銨(pH 9.2)組成之移動相。
NMR係使用Bruker Avance 400MHz光譜儀進行。
MS係使用ZMD Micromass質譜儀進行。
LC係使用Agilent 1100 HPLC系統進行。
階段1：狄耳士-阿德爾反應
所採用之起始方法如上文所述。主要污染物鑑定為以下所示之7β-異構物。
隨後發現20-α-乙基西芬恩酮之純度與回收率均可藉由將1-己烯-3-酮饋料自2.8當量降低至1.8當量而得以改良，見表10。進一步改良係藉由使用1.5當量1-己烯-3-酮(以2份1.4當量及0.1當量添加)且在反應完成之後經由蒸餾除去0.5個體積之溶劑來達成。冷卻所得溶液之後，沈澱出固體狀產物(老化1小時)且過濾。
程序：向配備頂置式攪拌器及回流冷凝器之1L(3頸)燒瓶中饋入蒂巴因(0.32M，100g，1當量)、EtOH(250mL)及1-己烯-3-酮(90%，0.45M，58mL，1.4當量)。混合物在回流下加熱13小時，且藉由1H NMR分析，且發現含有起始物質(約4.5mol%)。再添加0.1當量1-3-己烯-3-酮，且混合物再加熱2小時，接著在室溫下攪拌隔夜。分析顯示起始物質(約2.8mol%)。物質轉移至圓底燒瓶(500mL)中(燒瓶用20mL EtOH洗滌)。在真空中於50℃下除去EtOH(約65mL)，且所得沈澱固體在5℃攪拌1小時，接著過濾。固體用冰冷EtOH(4×20mL)洗滌，且在過濾器上抽乾，歷時約1.5小時。得到白色固體(105.4g，80%)。
分析方法及製程中檢查(IPC)
在實驗操作期間，使用1H NMR(400MHz)加HPLC法38XB進行IPC。當剩餘起始物質<5莫耳%(依據1H NMR，基於δ 5.05ppm及δ 5.3ppm之信號(CDCl3))時，反應視為完成。
為證實純度及進行LC-MS操作，在分析實驗中使用UFC-LC-MUN-1法。
TLC(5% MeOH/95% DCM)碘鉑酸鹽污染：Rf=0.25蒂巴因，Rf=0.66(7α)-20-乙基西芬恩酮。
分析匯總
1H NMR(CDCl3；400MHz)：δ=0.80(3H,t),1.4(1H,m),1.6(3H,六重峰)，1.9(1H,d),2.0(1H,br),2.4-2.6(8H,m),2.9(2H,br),3.35(2H,d),3.6(3H,s),3.85(3H,s),4.6(1H,s),5.6(1H,d),6.0(1H,d),6.55(1H,d),6.7(1H,d)。
13C NMR(CDCl3；75MHz)：δ=13.71,16.89,22.49,30.25,43.26,43.51,45.57,45.72,47.40,49.94,53.78,56.68,60.06,81.52,95.84,113.61,119.36.125.89,134.07,135.53,141.87,148.07。
MS：[M+H]+=410.3。
LC：>99.5%純度。
TLC：5：95；MeOH：DCM；單點rf=0.66。
優化方法之優勢
產率增加至80%
1-己烯-3-酮之量已降至1.5當量而轉化率或產率並未下降。
降低1-己烯-3-酮當量可改良分離(自反應溶劑中直接結晶)，得到極高純度之物質。
體積效率極高(最高總共約4個體積)。
純度改良至>99%(藉由HPLC)。
IPC顯示反應完成時轉化率>97%(依據1H NMR)(<3%蒂巴因)。
階段2：氫化反應
氫化階段研發工作之結果陳述於下表11中。反應在催化劑負載與反應溫度方面均已「強化」。此外，藉由將反應體積自17個體積降至12個體積，已改良產物之品質及產物之分離。
有趣的是，起始物質與產物均可在約80℃下耐熱1至2小時，從而允許反應期間之較高反應溫度、增加起始物質與產物的溶解度。發現在此情況下溶解度為良好反應性之關鍵且在擴大反應期間採用較高溫度可完成反應。
在最終擴大反應中，在反應容器之初始加熱期間溫度增加超出「正常」範圍，且觀察到快速反應(氫吸收)。將溫度降至55℃之後，反 應顯著減慢，且惟有再添加催化劑並增高溫度至約65℃方可完成反應。
藉由將反應混合物升溫至77℃以出現亞回流溫度且接著自反應混合物濾出催化劑來簡化產物分離。最初藉由蒸餾來減少所得溶液之體積，然而，據發現，該溶液可在冰浴中冷卻且藉由過濾結晶固體而以良好產率(72%)分離高純度物質。
程序：20-乙基西芬恩酮(0.244M，100g)饋入2L Parr氫化容器中。10% Pd/C(50%濕潤，10g)於EtOH(200mL)中形成漿液，且饋入氫化容器中。向容器中饋入EtOH(1L)，密封容器且用氬氣惰性化(×4)。容器用氫氣再填充至50psi(×2)，且最終保持在50psi。溫度設定為35℃。內部溫度峰值為82℃，且允許冷卻回至室溫隔夜(反應釜放熱)。容器用H2再填充，取樣，且藉由LC分析，且發現反應未完成。容器加熱至55℃至65℃之內部溫度，且藉由LC監測反應進程-氫氣壓力在整個再填充期間維持在50psi。24小時之後，再饋入催化劑(5g)且反應繼續進行。再經過16小時之後，反應完成(依據LC及1H NMR)。內部溫度升高至68℃，且混合物在真空下轉移至3L圓底燒瓶中。Parr容器用熱EtOH(200mL)沖洗，且洗滌液轉移至圓底燒瓶中。混合物加熱至77℃，接著過濾(GF/F紙)。催化劑床用熱EtOH(1×300mL)洗滌，且使濾液冷卻至室溫。濾液於冰-水浴中冷卻50分鐘，接著過濾。所收集之固體用冰冷EtOH(1×100mL)、庚烷(1×300mL)洗滌且抽乾，歷時1.5小時。得到白色固體(72g，72%)。
分析方法及製程中檢查
在實驗操作期間，使用1H NMR(400MHz)加HPLC法38XB進行IPC。反應進程係藉由LC分析監測：以100g規模進行之反應未顯示20-乙基西芬恩酮，且顯示96% 20-乙基二氫西芬恩酮。
為證實純度及進行LC-MS操作法，在分析實驗中使用100g規模反應之產物。
分析結果
分析
1H NMR(CDCl3；400MHz)：δ=0.75(1H,t,t),0.9(1H,t),1.35(1H,t,d),1.5-1.75(7H,m),2.1(1H,t,d),2.3(5H,m),2.5(2H,q),2.6-2.7(3H,m),3.0(1H,q,t),3.1(1H,d),3.5(3H,s),3.9(3H,s),4.5(1H,d),6.6(1H,d),6.7(1H,d)。
13C NMR(CDCl3；75MHz)：δ=13.73,16.99,17.31,21.98,28.67,30.70,35.17,35.66,43.51,45.24,45.78,48.28,48.91,52.26,56.76,61.35,94.96,114.01,119.16,128.71,132.47,141.76,146.80。
LC：>99%。
殘餘溶劑(依據1H NMR)：無殘餘乙醇。
優化方法之優勢
反應體積自17個體積降至12個體積允許產物直接結晶。
所分離之產物純度>99%，產率為72%。
對於溶解度及反應性，約65℃之溫度似乎最佳。
在過濾床上將固體脫水且用庚烷洗滌可移除痕量乙醇至可接受程度，以備用於下一階段。
階段3及4：格林納反應及結晶
處理結果匯總於下表12中。研究不同的醚性溶劑，以乙醚所獲之物質的品質最佳，雖然發現乙醚與MTBE之間的差異相對較小。
一般而言，獲自格林納反應之粗物質含有兩種主要雜質(各為約10%，LC-MS)。兩種雜質均具有與產物相同之質譜([M+H]+=428.4)。兩種雜質之一已假設指定為組成性異構物，其係由過量格林納試劑在20-乙基二氫西芬恩酮上之閉環開環反應產生。
據信，第二種雜質(其具有與產物相似之滯留時間(LC-MS))為非對映異構物(R)-19-丙基二氫西芬恩醇。
兩種雜質均可藉由甲醇再結晶而有效移除。
用乙醚研究反應溫度之作用，且發現就反應進程及雜質(LC分析)而言之反應概況在室溫下與在回流溫度下類似。
因而，在反應中記錄之所觀察之純度差異視為起因於不同的 純化程序(使用油浴及具有磁攪拌器之回流冷凝器再結晶，或經由在旋轉蒸發器上旋轉而用甲醇濕磨)。
亦利用碘化甲基鎂且獲得與溴化物類似之結果。
程序：20-乙基二氫西芬恩酮(0.073M，30g)溶解(混濁溶液)於無水乙醚(1050mL；35個體積)中。經1小時逐滴添加溴化甲基鎂(0.189M，63mL)，維持內部溫度低於28℃。所得白色懸浮液在回流下加熱5小時，冷卻至室溫且在氮氣氛下攪拌隔夜。移除等分試樣(約0.3mL)且用飽和NH4Cl(約1.0mL)中止，並且藉由LC(等分試樣之上層用MeCN(約1mL)稀釋)進行分析。反應繼續進行直至起始物質含量小於5%。藉由向反應混合物中添加飽和NH4Cl(138mL)中止反應，維持內部溫度低於30℃。對混合物進行相分離，水相用乙醚萃取(1×200mL)且將(MgSO4)所合併之有機相脫水。溶液在真空中濃縮，產生黏性油狀物(33.4g)。添加MeOH(100mL)且混合物加熱至60℃之浴溫，接著冷卻至室溫。濾出固體，用冰冷MeOH(3×25mL)洗滌，用庚烷(1×25mL)洗滌且抽乾。得到白色固體(21g，68%)。
分析方法及製程中檢查
在實驗操作期間，使用1H NMR(400MHz)加HPLC法38XB。藉由LC分析經中止(飽和NH4Cl)之反應等分試樣來監測反應：<2.0% 20-乙基二氫西芬恩醇及71%(S)-19-丙基二氫西芬恩醇。
為證實純度及進行LC-MS操作，在分析實驗中使用 UFC-LC-MUN-1法。
分析結果
1H NMR(CDCl3；400MHz)：δ=0.75(1H,m),0.85(3H,t),0.95-1.1(6H,m),1.3(1H,m),1.5-1.7(7H,m),1.8(1H,t),2.0(1H,t,d),2.1-2.4(6H,m),2.6(1H,d),2.7(1H,t,d),3.0(1H,d),3.5(3H,s),3.8(3H,s),4.3(1H,s),4.7(1H,s),6.5(1H,d),6.7(1H,d)。
13C NMR(CDCl3；75MHz)：δ=15.12,16.96,18.04,21.91,25.55.29.88,31.99,35.53,36.05,38.97,43.53,45.17,46.19,49.09,50.77,52.72,56.93,61.32,80.34,97.05,114.21,119.06,128.84,132.48,141.63,146.97。
LC：>99%。
優化方法之優勢
反應可在多種醚性溶劑中進行，儘管乙醚似乎可獲得最潔淨粗產物。
自甲醇中再結晶之後，獲得具優良純度之物質。
階段5：水解
反應在無顯著變化的情況下進行(表13)。自乙醇/水混合物中、接著自乙醇中再結晶。
程序：向EtOH(60mL)中添加(S)-DHE(10g)，且在回流下加熱直至溶解。水(32mL)形成混濁溶液，允許該溶液經約2小時冷卻至室溫。藉由過濾收集白色固體。(4.26g，42wt%回收率)。純度98%。總體wt%產率=45%。
分析方法及製程中檢查
在實驗操作期間，使用1H NMR(400MHz)加HPLC法38XB進行IPC。反應係藉由LC分析監測，且當無(S)-19-丙基二氫西芬恩醇剩餘時，中止反應。反應完成92%。
為證實純度及進行LC-MS操作，在分析實驗中使用 UFC-LC-MUN-1法。
分析結果
1H NMR(CDCl3；400MHz)：δ=0.7(1H,m),0.8(3H,t),1.0-1.1(5H,m),1.3(1H,m),1.5-1.8(6H,m),1.85(1H,t),1.95(1H,t,d),2.1-2.3(5H,m),2.6(1H,d),2.7(1H,t),3.0(1H,d),3.5(3H,s),4.3(1H,s),4.8(1H,s),6.0(1H,br),6.4(1H,d),6.7(1H,d)。
13C NMR(CDCl3；75MHz)：δ=15.10,16.95,18.00,21.99,25.37,29.82,31.96,35.43,36.15,38.93,43.51,45.22,46.50,49.04,52.72,61.33,80.42,97.38,116.61,119.46,127.92,132.07,137.56,145.67。
LC：98.8%。
手性LC：99.44%(S)-DHE,0.554(R)-DHE。
優化方法之優勢
反應所得之粗物質的純度顯著改良至95%。
可除去自乙醇/水及乙醇中再結晶之甲醇濕磨物質。
階段6：再結晶
水含量增加至約35%(總體積9.2個體積)導致形成白色固體。進一步自乙醇及乙醇/水混合物中再結晶可改良物質之純度(表14)。
程序：
(1)向EtOH(10mL)中添加(S)-DHE(3.0g)，且懸浮液在回流下加熱，產生橙色溶液。使溶液經16小時冷卻至室溫。藉由過濾收集所得白色固體(2.1g，70wt%)。純度>99%。
(2)向EtOH(7mL)中添加(S)-DHE(1.8g)，且在回流下加熱混合物直至溶解。添加水(2mL)，且允許混濁溶液經約2小時冷卻至室溫。藉由過濾收集所得白色固體(1.29g，72wt%)。
分析方法及製程中檢查
在實驗操作期間，使用1H NMR(400MHz)加HPLC法38XB進行IPC。
為證實純度及進行LC-MS操作，在分析實驗中使用UFC-LC-MUN-1法。為證實手性純度，在分析實驗中使用UFC-LC-MUN-2法。
分析結果
優化方法之優勢
自乙醇/水或乙醇中再結晶可產生具良好總體純度之物質及<0.02%(R)-DHE。
(R)-二氫羥戊甲嗎啡及(S)-二氫羥戊甲嗎啡治療疼痛之用途
(R)-二氫羥戊甲嗎啡及(S)-二氫羥戊甲嗎啡在大鼠傷痛刺激之閃尾測試(Tail Flick Test)中的效應
所使用之測試模型在此項技術中已為人所熟知，且描述於J.Pharmacol Exp Ther,1941,72,74-79(D'Amour等人，A method for determining loss of pain sensation)中。
此研究之目標為在設計成偵測對大鼠傷痛刺激之效應的閃尾測試中，評定二氫羥戊甲嗎啡之R-異構體及S-異構體(R-DHE及S-DHE)在0.1μg/kg、0.3μg/kg及0.5μg/kg(R-DHE)及3μg/kg、10μg/kg及30μg/kg(S-DHE)之劑量下的潛在止痛效應。鹽酸嗎啡用作參考物質，且檸檬酸芬太尼(fentanyl citrate)用作比較物質。
測試物質及材料
測試物質、參考物質及媒劑
測試物質：二氫羥戊甲嗎啡(R-DHE無色液體，用作游離鹼)及二氫羥戊甲嗎啡(S-DHE液體；用作游離鹼)
測試物質用之媒劑：檸檬酸鹽緩衝液(單水合檸檬酸：檸檬 酸鈉：氯化鈉：灌注用水，比率為0.03：0.10：0.86：90.01(g：g：g：mL))[單水合檸檬酸(白色粉末，Sigma,UK)；檸檬酸鈉(Sigma,UK)；氯化鈉(白色固體；Merck)；灌注用無菌水(澄清液體；Baxter Healthcare,UK)]
參考物質：鹽酸嗎啡(白色粉末；Macfarlan Smith,Edinburgh,UK)
比較物質：檸檬酸芬太尼(白色粉末；Sigma，UK)
測試物質、參考物質及比較物質儲存
測試物質在室溫下避光儲存，且參考物質及比較物質在室溫下儲存。
投藥途徑及劑量
DHE之R-異構體及S-異構體形式以及媒劑的投藥途徑為靜脈內。人類之可能投藥途徑為靜脈內。R-DHE之劑量為0.1μg/kg、0.3μg/kg及0.5μg/kg。S-DHE之劑量為3μg/kg、10μg/kg及30μg/kg。
嗎啡之劑量為5mg/kg。嗎啡之投藥途徑為靜脈內。
芬太尼之劑量為0.5μg/kg、2μg/kg及6μg/kg。芬太尼之投藥途徑為靜脈內。
動物
物種：大鼠
品系：史泊格多利大白鼠(Sprague-Dawley)
性別：雄性
動物數目：分配111隻動物供研究；剩餘9隻動物返回存養。
年齡範圍：9週至11週(根據平均體重)
體重範圍：198g至258g
適應時間：遞送之後、開始研究之前6天
來源：Harlan UK公司
動物鑑別及隨機分配
各動物任意分配唯一鑑別編號，編號呈現於資料表及籠卡片上。藉由防水尾部標記鑑別動物。
動物健康及福利
所有研究均根據基於動物(科學程序)法案1986之法規、根據英國內政部(UK Home Office)關於實施該法案之指南，且根據關於護理及圈養實驗動物之所有適用操作規程來進行。此研究中所採用之程序涵蓋於第213N號程序中，該程序具有中等嚴格度限制。
圈養及環境
動物分成多達5組圈養於填有鋸屑、底部為固體的籠子中。在適應環境期間，定期清潔室內及籠子以保持衛生。如內政部動物(科學程序)法案1986中所推薦，室內係藉由經設定可提供12小時亮-黑循環(07.00開，19.00關)之螢光燈照明。室內用空調調節，且量測氣溫及相對濕度。在適應環境期間，維持室溫(範圍為19℃至22℃)，且濕度在22%至44%範圍內。維持程序室溫(範圍為20℃至21℃)，且濕度在22%至26%範圍內。
飲食及水
不限量提供RM1(E)SQC之飲食(Special Diets Services,Witham,UK)及總線自來水。各批飲食均隨附詳述營養組成及特定污染物(例如重金屬、黃曲毒素(aflatoxin)及殺昆蟲劑)之含量的分析證明書一起遞 送。定期分析水之雜質及污染物。有關儲備飲食及水源中之污染物之可接受含量的標準分別在飲食製造商及水分析服務商所制定之分析說明書內。
健康狀態
動物在到達時及研究之前接受檢查；所有動物均健康，且視為適合實驗使用。
實驗設計
調配測試物質、參考物質及比較物質
檸檬酸鹽緩衝液係藉由精確稱取適量之各組分且將其溶解於灌注用無菌水中來製備。當組分完全溶解時，量測溶液之滲透壓度及pH值。當pH值為5.01(其在pH 4.8至5.2範圍內)且滲透壓度為296mOsmol/kg(在280至300mOsmol/kg範圍內)時，媒劑視為可接受。接著，媒劑最後在無菌條件下、經由Millex GV無菌杯過濾，且在使用前於2℃至8℃下儲存。
測試物質DHE(R-異構體及S-異構體)於檸檬酸鹽緩衝液中調配以便呈溶液形式給藥。供給藥之所要濃度(對於R-DHE為0.02μg/mL、0.06μg/mL及0.10μg/mL，且對S-DHE為0.6μg/mL、2μg/mL及6μg/mL)係藉由連續稀釋適當儲備溶液而達成，儲備溶液係以約20μg/mL之濃度提供。儲備溶液通過Millex GV 0.22μm Durapore無菌過濾單元進入玻璃小瓶中，且藉由無菌操作、用無菌檸檬酸鹽緩衝液進行各隨後稀釋。調配物在(R)-DHE之已知穩定期內製備，且在約4℃冷藏儲存直至需要進行給藥時。
參考物質鹽酸嗎啡係藉由以已知量溶解於檸檬酸鹽緩衝液 中來調配，以獲得1mg/mL溶液供給藥。應用修正因數1.32以使嗎啡之劑量能夠以游離鹼表示。溶液係新鮮製備且避光保存。
比較物質檸檬酸芬太尼係藉由以已知量溶解於檸檬酸鹽緩衝液中來調配，以獲得濃度為0.36mg/mL之儲備溶液供給藥。接著，用檸檬酸鹽緩衝液連續稀釋此儲備溶液以獲得0.1μg/mL、0.4μg/mL及1.2μg/mL之最終濃度。應用修正因數1.57以使芬太尼之劑量能夠以游離鹼表示。溶液係新鮮製備且避光保存。
組大小、劑量及鑑別數目
有11個處理組，每組多達10隻大鼠。各處理組賦予一個字母(A至K)。在給藥前一天，根據閃尾測試(見下文)之給藥前基線值將大鼠隨機分配至處理組。
媒劑為檸檬酸鹽緩衝液。動物係使用5mL/kg之劑量體積及具有Becton Dickinson 25G(0.5×16mm)針之聚丙烯注射器向尾部靜脈內進行靜脈內給藥。5mL/kg之總體積以儘可能恆定之速率經2分鐘±10秒之間隔遞送。記錄緩慢推注之起始時間及停止時間。給藥時間以原始資料形式記錄。
不知情處理
對給藥溶液進行編號(A至K)，以使觀察者不瞭解處理組之身分。
體重
測試前稱量動物體重，且記錄投予物質之同一天之體重。
程序
1.適應環境
在行為測試之前的某一時刻，對各動物進行常規處理且適應行為測試環境。
2.基線行為測試
在實驗前一天將大鼠移至程序室。接著在程序室中圈養大鼠，給藥，及觀察。在給藥前的3個獨立時刻對所有大鼠進行閃尾測試(見下文)以確定基線值。給藥前基線值被視為最後測試讀數(第一個測試及第二個測試之資料不包括在內，但列為環境適應之一部分)。
閃尾測試：將各大鼠輕輕地固持在閃尾裝置(Ugo Basile,Italy)之表面上，以將其尾部直接定位在紅外光源上。接著，向尾部腹面上之小區域施加紅外光源。啟動紅外光源的同時啟動計時器，計時器自動記 錄尾部偏離(收縮或閃開)所需之時間。記錄各動物之閃尾潛伏期。紅外強度設定在IR50，且曝露於IR源之最長時間為10秒。因此，無反應之動物分配10秒之收縮潛伏期。
3.組分配及排除標準
在給藥前一天，根據閃尾測試之給藥前基線值將動物隨機分配至處理組(A至K)。
4.給藥及行為測試
用於此研究之動物不禁食。在給藥後約5分鐘、10分鐘、20分鐘、30分鐘、60分鐘及120分鐘(相對於給藥起始時間)進行閃尾測試，以研究處理效果。
5.處死
未分配至處理組的任何動物均在研究結束時，藉由頸椎脫位術處死。其餘動物在最終測試期結束之後返回存養。
統計分析
使用參數統計程序或非參數統計程序，在DHE(R-異構體及S-異構體)組、嗎啡組、芬太尼組與媒劑組之間進行統計比較。基於待比較之組是否滿足方差齊次性準則(藉由F檢驗之Levene Mean檢驗所評估)選擇參數統計程序(單向方差分析(ANOVA)、Dunnett之t檢驗))或非參數統計程序(Kruskal-Wallis統計、Dunn檢驗及Mann-Whitney U檢驗)。當P<0.05時假定統計顯著性。
此外，資料換算成% MPE(最大可能效應)，定義為100×(測試值-對照值)/(截止值-對照值)，其中「對照值」為媒劑組觀察值，「測試值」 為給藥後觀察值，且「截止值」為刺激所允許之最長時間(對於閃尾，為10秒)。產生DHE之各異構體(R-異構體及S-異構體)及芬太尼在頭4個觀察時間點之劑量反應曲線，且計算ED50(50% MPE劑量)。使用S形劑量反應之非線性回歸(最佳擬合線)對log10(劑量×103)進行分析。由於給藥後資料在60分鐘及120分鐘時間點已返回至基線，因此不需要對此等資料進行計算。
結果
閃尾收縮潛伏期之組平均值±標準誤差的平均值資料匯總於表15中。比較針對R-DHE、S-DHE及芬太尼所計算之ED50值，以便評估其相對效力(表11)。時程曲線圖呈現於圖11至圖13中，且ED50(50% MPE劑量)劑量反應曲線及資料呈現於圖14至圖17中。
媒劑為檸檬酸鹽緩衝液[單水合檸檬酸：檸檬酸鈉：氯化鈉：灌注用水，比率為0.03：0.10：0.86：99.01(g：g：g：mL)]。
資料以平均值±SEM表示。
N=10隻動物/組，除非在括弧中另外說明。
*P<0.05且**P<0.01，當與媒劑(ANOVA及Dunnett之t檢驗)相比時。
$P<0.05，$$P<0.01且$$$P<0.001，當與媒劑(Kruskal-Wallis及Dunn檢驗)相比時。
#P<0.05且###P<0.001，當與媒劑(Mann-Whitney U檢驗)相比時。
二氫羥戊甲嗎啡(R-DHE)對閃尾收縮潛伏期之影響(圖11)
與媒劑組資料(5.2±0.6秒)相比，以0.1μg/kg之劑量靜脈內投予R-DHE導致給藥後5分鐘時的閃尾潛伏期顯著增加(7.9±0.7秒；ANOVA及Dunnett之t檢驗)。與媒劑組資料(分別為5.2±0.6秒及5.0±0.2秒)相比，以0.3μg/kg靜脈內投予R-DHE導致給藥後5分鐘及10分鐘時的閃尾收縮潛伏期顯著增加(分別為9.2±0.5秒，P<0.01，ANOVA及Dunnett之t檢驗；7.7±0.7秒，P<0.05，Kruskal-Wallis及Dunn檢驗)，但在任何其他時間點均無影響。當與媒劑組資料(分別為5.2±0.6秒、5.0±0.2秒、5.1±0.2秒及4.9±0.4秒)相比時，以0.5μg/kg之劑量靜脈內投予R-DHE導致給藥後5分鐘、10分鐘、20分鐘及30分鐘時的閃尾收縮潛伏期顯著增加(分別為9.4±0.6秒，P<0.01，ANOVA及Dunnett之t檢驗；9.7±0.3秒，P<0.001；8.8±0.5秒，P<0.01；8.2±0.8秒，P<0.05；均為Kruskal-Wallis及Dunn檢驗)。在0.5μg/kg組中，所觀察之給藥後60分鐘時的閃尾潛伏期顯著減少被視為與藥理學無關。在給藥後120分鐘時未記錄到效應。此等資 料表明立即發揮止痛作用，峰值效應出現於給藥後約5分鐘及10分鐘，至給藥後60分鐘之時間點恢復至基線值(與媒劑對照組相比)。
在給藥後5分鐘、10分鐘、20分鐘及30分鐘時，R-DHE之ED50估計值(亦即50% MPE)分別為0.08μg/kg、0.23μg/kg、0.25μg/kg及0.42μg/kg。在給藥後60分鐘及120分鐘之時間點無劑量反應。
二氫羥戊甲嗎啡(S-DHE)對閃尾收縮潛伏期之影響(圖12)
與媒劑組資料相比，以3μg/kg之劑量靜脈內投予S-DHE在任何測試時間點均不顯著影響閃尾收縮潛伏期。與媒劑組資料(分別為5.2±0.6秒及5.0±0.2秒)相比，以10μg/kg靜脈內投予S-DHE導致在給藥後5分鐘及10分鐘時的閃尾收縮潛伏期顯著增加(分別為9.7±0.3秒及9.3±0.3秒；P均小於0.01；Kruskal-Wallis及Dunn檢驗)。在給藥後60分鐘時觀察到閃尾潛伏期顯著減少被視為與藥理學無關。與媒劑組資料(分別為5.2±0.6秒、5.0±0.2秒、5.1±0.2秒及4.9±0.4秒)相比，以30μg/kg之劑量靜脈內投予S-DHE導致給藥後5分鐘、10分鐘、20分鐘及30分鐘時的閃尾收縮潛伏期顯著增加(分別為10.0±0.0秒，P<0.001；9.2±0.8秒，P<0.01；9.1±0.6秒，P<0.001，Kruskal-Wallis及Dunn檢驗；及8.3±0.7秒，P<0.01，ANOVA及Dunnett之t檢驗)。此等資料表明立即發揮止痛作用，峰值效應出現於給藥後5分鐘之時間點，至給藥後60分鐘之時間點恢復至基線值(與媒劑對照組類似)。
在給藥後5分鐘、10分鐘、20分鐘及30分鐘時，DHE(S-異構體)之ED50估計值(亦即50% MPE)分別為2.17μg/kg、3.80μg/kg、7.52μg/kg及20.95μg/kg)。在給藥後60分鐘及120分鐘之時間點無劑量 反應。
芬太尼對閃尾收縮潛伏期之影響(圖13)
與媒劑組資料相比，以0.5μg/kg之劑量靜脈內投予芬太尼在任何測試時間點均不顯著影響閃尾收縮潛伏期。與媒劑組資料(分別為5.2±0.6秒及5.0±0.2秒)相比，以2μg/kg靜脈內投予芬太尼導致在給藥後5分鐘及10分鐘時的閃尾收縮潛伏期顯著增加(分別為9.0±0.7秒，P<0.01及9.1±0.4秒，P<0.001；Kruskal-Wallis與Dunn檢驗)。與媒劑組資料(分別為5.2±0.6秒、5.0±0.2秒及5.1±0.2秒)相比，以6μg/kg之劑量靜脈內投予芬太尼導致給藥後5分鐘、10分鐘及20分鐘時的閃尾收縮潛伏期顯著增加(分別為10.0±0.0秒，P<0.001；8.4±0.7秒，P<0.01；8.1±0.7秒，P<0.05；Kruskal-Wallis與Dunn檢驗)。此等資料表明立即發揮止痛作用，峰值效應出現於5分鐘之時間點，至給藥後60分鐘之時間點恢復至基線值(與媒劑對照組類似)。
在給藥後5分鐘、10分鐘、20分鐘及30分鐘時，芬太尼之ED50估計值(亦即50% MPE)分別為1.14μg/kg、1.25μg/kg、3.11μg/kg及9.68μg/kg。在給藥後60分鐘及120分鐘之時間點無劑量反應。
R-DHE、S-DHE及芬太尼之效應比較
比較R-DHE、S-DHE及芬太尼之ED50計算值，以評估其相對效力(表16)。資料表明，在最初30分鐘期間，向雄性大鼠單次靜脈內投予各化合物之後，R-DHE之止痛效力為芬太尼的5至23倍，S-DHE之止痛效力為芬太尼的0.3至0.5倍，且R-DHE之止痛效力為S-DHE的17至50倍。
嗎啡對閃尾收縮潛伏期之影響
當與媒劑組資料(分別為5.2±0.6秒、5.00.2秒、5.1±0.2秒、4.9±0.4秒及5.6±0.4秒)相比時，靜脈內投予嗎啡(5mg/kg)導致給藥後5分鐘、10分鐘、20分鐘、30分鐘(所有4個時間點的閃尾收縮潛伏期皆為10.0±0.0秒，P<0.001，Mann-Whitney U檢驗)及60分鐘(8.7±0.9秒，P<0.05，Mann Whitney U檢驗)時的閃尾收縮潛伏期顯著增加。
結論
以0.1μg/kg、0.3μg/kg及0.5μg/kg之劑量單次靜脈內投予R-DHE，以及以10μg/kg及30μg/kg之劑量投予S-DHE雄性大鼠在給藥後至多30分鐘導致閃尾收縮潛伏期隨劑量顯著增加。以2μg/kg及6μg/kg之劑量靜脈內投予芬太尼在給藥後長達30分鐘導致閃尾收縮潛伏期隨劑量顯著增加。
比較R-DHE、S-DHE及芬太尼之ED50計算值，以評估其相對效力(表16)。資料表明，在最初30分鐘期間，向雄性大鼠單次靜脈內 投予各化合物之後，R-DHE之止痛效力為芬太尼的5至23倍，S-DHE之止痛效力為芬太尼的0.3至0.5倍，且R-DHE之止痛效力為S-DHE的17至50倍。
靜脈內投藥後R-DHE及S-DHE之類鴉片止痛活性的持續時間突顯此等化合物在治療急性疼痛中的潛在益處及治療潛能。
投予嗎啡後所記錄之效應與其已知藥理學活性一致，且因而，此測試系統可靈敏地偵測傷痛刺激效應。
(R)-二氫羥戊甲嗎啡及(S)-二氫羥戊甲嗎啡在神經病變性疼痛之脊神經結紮模型中的效應
所使用之測試模型在此項技術中已為人所熟知，且描述於Pain 1992；50：355-363(Kim SH,Chung JM.,An experimental model for peripheral neuropathy produced by segmental spinal nerve ligation in the rat)中。
在給予0.1μg/kg、0.3μg/kg及0.5μg/kg(R-異構體)之單次靜脈內劑量以及3μg/kg、10μg/kg及30μg/kg(S-異構體)之單次靜脈內劑量之後，研究二氫羥戊甲嗎啡在神經病變性疼痛之脊神經結紮模型中之潛在止痛效應。藉由緊固結紮L5及L6脊神經來在大鼠之左後肢中誘發周圍單神經病變。使用已確立之行為測試(分別為馮弗萊測試(Von Frey test)及Hargreaves足底測試)監測機械性異常疼痛及熱痛覺過敏之發展。嗎啡用作參考物質，且普瑞巴林(Pregabalin)用作比較物質。
測試物質及材料
測試物質、參考物質、比較物質及媒劑
測試物質：二氫羥戊甲嗎啡(R-異構體)及二氫羥戊甲嗎啡 (S-異構體)
測試用媒劑及參考物質：
檸檬酸鹽緩衝液(單水合檸檬酸：檸檬酸鈉：氯化鈉：無菌水，比率為0.03：0.10：0.86：90.01(g：g：g：mL))[單水合檸檬酸(白色粉末，Sigma,UK)；檸檬酸鈉(Sigma,UK)；氯化鈉(白色固體；Merck)；無菌水(澄清液體；Baxter Healthcare,UK)]
參考物質：鹽酸嗎啡(白色粉末；Macfarlan Smith,Edinburgh，UK)
比較物質：普瑞巴林(商標名Lyrica®；白色膠囊，由Pfizer製造且由Lindsay & Gilmour Chemist,Juniper Green,Edinburgh供應)
比較物質用之媒劑：1% w/v羧甲基纖維素(CMC，粉末；Sigma,UK)
測試物質、參考物質及比較物質儲存
測試物質在室溫下避光儲存，且參考物質及比較物質在室溫下儲存。
投藥途徑及劑量
二氫羥戊甲嗎啡之R-異構體及S-異構體形式以及媒劑(檸檬酸鹽緩衝液)的投藥途徑為靜脈內。此途徑為人類之潛在投藥途徑。R-DHE之劑量為0.1μg/kg、0.3μg/kg及0.5μg/kg，且S-DHE之劑量為3μg/kg、10μg/kg及30μg/kg。
嗎啡之投藥途徑為靜脈內。嗎啡之劑量為5mg/kg。
比較物質普瑞巴林之投藥途徑為經口。在研究之第2階段中，普瑞巴林之劑量為30mg/kg。對於第3階段，比較物質普瑞巴林之劑量濃度為30mg/kg、50mg/kg及100mg/kg。
動物
物種：大鼠
品系：史泊格多利大白鼠
性別：雄性
動物數目：75隻動物進行手術準備。
年齡範圍：6至7週(供手術)；8至9週(第1給藥階段)；9至10週(第2給藥階段)；11至12週(第3給藥階段)。
體重範圍：139g至183g(供手術)；190g至257g(第1給藥階段)；210g至284g(第2給藥階段)；243g至341g(第3給藥階段)。
適應時間：遞送之後、開始行為測試之前3天
來源：Harlan UK公司
動物鑑別及隨機分配
各動物任意分配唯一鑑別編號，該編號呈現於資料表及籠卡片上。動物係藉由防水尾部標記來鑑別。
動物健康及福利
所有研究均根據基於動物(科學程序)法案1986之法規、根據英國內政部關於實施該法案之指南，且根據關於護理及圈養實驗動物之所有適用操作規程來進行。
圈養及環境
動物分成多達5組圈養於填有鋸屑、底部為固體的籠子中。在適應環境期間，定期清潔室內及籠子以保持衛生。如內政部動物(科學程序)法案1986中所推薦，室內係藉由經設定可提供12小時亮-黑循環(07.00 開，19.00關)之螢光燈照明。室內用空調調節，且量測氣溫及相對濕度。在適應環境期間，維持室溫(範圍為20℃至22℃)，且濕度在46%至59%範圍內。維持程序室溫(範圍為19℃至22℃)，且濕度在26%至43%範圍內。
飲食及水
不限量提供RM1(E)SQC之膨化齧齒動物飲食(Special Diets Services,Witham,UK)及總線自來水。各批飲食均隨附詳述營養組成及特定污染物(例如重金屬、黃曲毒素及殺昆蟲劑)之含量的分析證明書(CA)一起遞送。定期分析水之雜質及污染物。有關儲備飲食及水源中之污染物之可接受含量的標準分別在飲食製造商及水分析服務商所制定之分析說明書內。
健康狀態
動物在到達時及研究之前進行檢查；所有動物均健康，且視為適合實驗使用。
實驗設計
調配測試物質、參考物質及比較物質
檸檬酸鹽緩衝液係藉由精確稱取適量之各組分且將其溶解於注射用無菌水中來製備。當組分完全溶解時，量測溶液之滲透壓度及pH值。當pH值為5.03(其在4.8至5.2範圍內)且滲透壓度為296mOsmol/kg(在280至300mOsmol/kg範圍內)時，媒劑視為可接受。接著，媒劑最後在無菌條件下經由Millex GV無菌杯(0.22μm過濾器)過濾，且在使用前於2℃至8℃下儲存。
測試物質二氫羥戊甲嗎啡(R-異構體及S-異構體)於檸檬酸 鹽緩衝液中調配以便呈溶液形式給藥。供給藥之所要濃度(對於R-DHE為0.02μg/mL、0.06μg/mL及0.10μg/mL，且對於S-DHE為0.6μg/mL、2μg/mL及6μg/mL)係藉由連續稀釋適當儲備溶液而達成，儲備溶液係以約20μg/mL之濃度提供。儲備溶液之實際濃度以原始資料形式記錄。在連續稀釋之前，儲備溶液通過Millex GV 0.22μm Durapore無菌過濾單元進入玻璃小瓶中，且藉由無菌操作用無菌檸檬酸鹽緩衝液進行各隨後稀釋。不應用修正因數，且調配物以游離鹼形式製備。調配物在研究給藥日期之前製備，且在R-DHE之已知穩定期(11天)內使用(製備後1至2天)。S-DHE在製備之後1至2天使用。二氫羥戊甲嗎啡(R-異構體及S-異構體)之給藥溶液在約4℃冷藏儲存，直至需要將其給藥時。
參考物質鹽酸嗎啡係藉由以已知量溶解於檸檬酸鹽緩衝液中來調配，以獲得1mg/mL溶液供給藥。應用修正因數1.32以使嗎啡之劑量能夠以游離鹼表示。溶液係新鮮製備且避光保存。
比較物質普瑞巴林係藉由以已知量懸浮於1% w/v CMC中來調配，以獲得3mg/mL懸浮液供第2階段使用，且製備3mg/mL、5mg/mL及10mg/mL懸浮液供第3階段使用。不需要修正因數，因此普瑞巴林以游離鹼形式給藥。懸浮液係新鮮製備且避光保存。
組大小、劑量及鑑別編號
有5個處理組，每組最多10隻大鼠。各治療組賦予一個字母(第1階段：A至E，第2階段：F至J，且第3階段：K至O)。在給藥前一天，根據熱痛覺過敏測試(見下文)之給藥前基線值將大鼠隨機分配至處理組。
第1階段：
第2階段：
第3階段：
第1階段及第2階段使用靜脈內媒劑檸檬酸鹽緩衝液且第3階段使用經口媒劑1% w/v CMC。分配至靜脈內處理組之動物係使用5mL/kg之劑量體積及具有Becton Dickinson 25G(0.5×16mm)針之聚丙烯注射器向尾部靜脈內給藥。5mL/kg之總靜脈內體積以儘可能恆定之速率經2分鐘± 10秒之間隔遞送。記錄靜脈內緩慢推注之起始時間及停止時間。分配至經口處理組之動物係使用10mL/kg之劑量體積經口管飼來給藥。給藥時間以原始資料形式記錄。
不知情處理
對給藥溶液進行編號(第1階段：A至E；第2階段：F至J；且第3階段：K至O)，以使觀察者不瞭解處理組之身分。由於在研究第2階段中藉由不同的給藥途徑投予比較物質，因此執行給藥者瞭解此組，且此組編號為H。又，由於第3階段中之嗎啡對照組係靜脈內投藥，且此途徑不同於媒劑組及比較物質組(經口給藥)，因此嗎啡組為知情組，且因此編號為O。
體重
在手術前、在手術後(PO)第1天，且在各給藥日、於投予物質之前稱量動物體重，並記錄體重。
每日觀察
自手術後第0天開始，每天對所有動物進行一般觀察，尤其注意動物左後爪及右後爪之狀況。
程序
1 適應環境
在行為測試之前，對動物進行常規處理且適應行為測試環境。
2 基線行為測試
在實驗前一天將大鼠移至程序室。接著在程序室中圈養大 鼠，給藥，及觀察。在手術前之2個獨立時刻對所有大鼠進行行為測試(見下文)以確定基線值。手術前基線值被視為測試最後一天(第2天)之資料(測試第1天之資料列為環境適應之一部分)。依序對機械性異常疼痛、熱痛覺過敏進行測試，測試間隔時間最少5分鐘。
機械性異常疼痛(馮弗萊測試)：各動物置於絲網籠中，且一系列馮弗萊纖絲自下方施加於後爪之足底表面。纖絲係以遞增順序施力(自最弱之力開始)，評估左後爪與右後爪之收縮臨限值。各纖絲以足底中部表面恰好開始彎曲之程度壓在足底表面中部上；每個纖絲以約1Hz之頻率重複此舉約8至10次。收縮臨限值定義為兩根或兩根以上連續馮弗萊纖絲引起反射性收縮反應(亦即，短暫爪部閃開)之最小力。
熱痛覺過敏(Hargreaves足底測試)：各大鼠置於具有玻璃地板之透明塑膠室中，且在測試之前允許短時間適應其環境(約1分鐘)。接著，用輻射紅外(IR)熱源自下方直接在動物之後爪足底表面刺激動物，且計算左後爪與右後爪之收縮潛伏期。紅外強度設定為IR50(設定經設計可遞送250mW cm3之熱流讀數)，且曝露於IR源之最長時間為18秒。因此，無反應之動物分配18秒之收縮潛伏期。
3 手術程序
動物進行手術準備3天。各大鼠在1%至3%氧氣中根據需要用異氟烷麻醉。各大鼠以臥姿放置，且將切割部位周圍之表面剃毛，並以手術用酒精殺菌。在無菌條件下，在L4 S2平面自棘突分離脊椎左側肌肉。接著，用小骨鉗小心移除L6橫突，且鑑別L4 L6脊神經。分離左L5及L6脊神經，且使用6-0絲線緊固結紮(如在40倍放大率下所檢視)。使用適當 縫合材料逐層閉合上層肌肉及皮膚，且一旦完成之後，即停止麻醉。自麻醉中恢復之後，大鼠即與其籠中同伴一起再圈養，最初在柔軟墊層上隔夜以降低感染風險，且在完全恢復之後，隨之在鋸屑層上圈養。在重新開始行為測試之前，允許動物恢復最少4天。
4 產生測試
手術之後，在給藥日之前進行兩次行為測試以監測異常疼痛/痛覺過敏之產生。亦包括其他任意測試日，以確保足夠數目之動物在各給藥階段之前已產生異常疼痛/痛覺過敏。
5 組分配及排除標準
在給藥前一天，根據熱痛覺過敏測試之給藥前基線值將動物隨機分配至處理組。在研究中僅包括產生機械性異常疼痛與熱痛覺過敏之動物。若動物左爪對馮弗萊纖絲之收縮臨限值5g力(其對應於4.56號或4.56號以下之單纖絲)，則認為動物已產生機械性異常疼痛。若動物左爪對足底熱裝置之收縮潛伏期與左爪在手術前之值(給藥前)的差異大於30%，則認為動物已產生熱痛覺過敏。
6 給藥及行為測試
用於此研究之動物不禁食。在各給藥日，所分配之動物各自接受測試物質、參考物質或媒劑之單次靜脈內給藥；或比較物質或媒劑之經口給藥。研究以3個階段進行。各階段之給藥分2天進行，且在各給藥日對最少3個處理組之動物進行給藥。各階段完成之後，在開始下一階段研究之前給予動物最少1週之清除時段。
在研究之第1階段及第2階段，給藥之後(自開始給藥約5 分鐘)及給藥後約25分鐘、50分鐘及120分鐘時，使用馮弗萊測試評定各大鼠左後爪及右後爪的機械性異常疼痛。在給藥後約15分鐘、35分鐘、60分鐘及130分鐘時，使用Hargreaves足底測試評定各大鼠之左後爪及右後爪的熱痛覺過敏，以研究處理效果。所有時間點均相對於投藥開始時間。
在研究之第3階段中，在給藥後約60分鐘、120分鐘、180分鐘及240分鐘時，使用馮弗萊測試評定各大鼠之左後肢及右後肢的機械性異常疼痛。在給藥後約70分鐘、130分鐘、190分鐘及250分鐘時，使用Hargreaves足底測試評定各大鼠之左後肢及右後肢的熱痛覺過敏，以研究處理效果。
7 處死
在最終測試期結束之後，所有研究動物均藉由頸椎脫位術處死。
統計分析
使用參數統計程序(例如單向差異分析、Dunnett之t檢驗、學生t檢驗)或非參數統計程序(例如Kruskal-Wallis統計法、Dunn檢驗、Mann-Whitney U檢驗)在治療組之間進行統計比較。基於待比較之組是否滿足方差齊次性準則(藉由Levene Mean檢驗或F檢驗評估)選擇參數檢驗或非參數檢驗。分析之前將馮弗萊資料轉換為對數形式(log10(公克力×10,000))。在研究之第2階段中，藉由不同給藥途徑投予比較物質普瑞巴林，使用配對學生t檢驗對普瑞巴林資料與給藥前之值進行比較。在研究之第3階段中，藉由不同於媒劑及測試物質之給藥途徑投予參考物質嗎啡，使用配對學生t檢驗對嗎啡資料與給藥前之值進行比較。對於所有測試，當 P<0.05時假定統計顯著性。馮弗萊測試之統計顯著性雖然以轉換成對數形式之資料表示，但在結果部分中係以公克力表示以用於說明之目的。分析之完整細節以原始資料給出。
結果
收縮臨限值及收縮潛伏期的組平均值±標準誤差之平均值資料匯總於表17至表22中。
神經病變性疼痛狀態之產生
使用已確立之行為測試來研究神經病變性疼痛之兩個不同組分，亦即使用馮弗萊纖絲測試機械性異常疼痛之存在，且使用Hargreaves足底測試來測試熱痛覺過敏之存在。大多數經歷脊神經結紮之動物顯示在傷害後數日內左後爪對兩種行為測試之敏感度顯著增加，表明產生了周圍單神經病變。右後爪顯示手術後敏感度未增加。在研究之各階段中，所有經給藥之動物視為在左後爪中發生神經病變，如在給藥前一天使用已確立之行為測試所評定。
R-DHE對行為測試反應之影響(第1階段)
機械性異常疼痛：在第1階段中，以0.1μg/kg及0.3μg/kg靜脈內投予R-DHE未使左爪或右爪對馮弗萊纖絲之收縮臨限值產生任何顯著變化。然而，與媒劑組值5.43±2.58g相比，以0.5μg/kg靜脈內投予R-DHE導致左爪收縮臨限值在給藥後約5分鐘顯著增加(21.97±2.30g，P0.01，Kruskal-Wallis及Dunn檢驗)；且與媒劑組值2.25±0.75g相比，在給藥後約25分鐘時亦顯著增加(13.12±3.41g，P<0.05，ANOVA及Dunnett之t檢驗)(表17，圖18)。
熱痛覺過敏：與媒劑相比，靜脈內投予R-DHE對左爪收縮潛伏期不具顯著影響。與媒劑組值(10.3±0.9秒)相比，以0.3μg/kg之劑量靜脈內投予R-DHE導致給藥後約35分鐘時右爪收縮潛伏期顯著增加(14.5±0.7秒，p<0.05，ANOVA及Dunnett之t檢驗)；然而，此與生理學無關，因為右爪收縮臨限值與給藥前之右爪值(14.3±0.6秒)相似(表18，圖19)。
S-DHE對行為測試反應之影響(第1階段)
機械性異常疼痛：在第2階段中，以3μg/kg及10μg/kg靜脈內投予S-DHE未使左爪或右爪對馮弗萊纖絲之收縮臨限值產生任何顯著變化。然而，與媒劑組值6.11±2.39g相比，30μg/kg靜脈內投藥導致左爪收縮臨限值在給藥後約5分鐘時顯著增加(24.56±0.33g，P0.001，Kruskal-Wallis及Dunn檢驗)；且與媒劑組值1.66±0.47g相比，在給藥後約25分鐘時亦顯著增加(21.92±1.70g，P<0.001，Kruskal-Wallis及Dunn檢驗)(表19，圖20)。
熱痛覺過敏：與媒劑組值相比，以3及10μg/kg之劑量靜脈內投予S-DHE對左爪及右爪收縮潛伏期不具顯著影響。然而，與媒劑值10.3±0.8秒及13.4±0.8秒相比，以30μg/kg之劑量靜脈內投予S-DHE在給藥後約15分鐘時使左後爪(17.6±0.4秒，P<0.01，Kruskal-Wallis及Dunn檢驗)及右後爪(17.5±0.4秒，P<0.01，Kruskal-Wallis及Dunn檢驗)之爪收縮潛伏期顯著增加。右爪潛伏期之增加可能表明二氫羥戊甲嗎啡(S-異構體)在30μg/kg劑量下之重要作用(表20，圖21)。
嗎啡對行為測試反應之影響(第1階段及第3階段)
在第1階段中，對嗎啡參考物與媒劑進行比較，因為二者均經口給藥。在第3階段中，對嗎啡參考物與給藥前進行比較，因為將其與經口媒劑相比不具相關性。
機械性異常疼痛：與媒劑值2.25±0.75g及2.11±0.82g相比，以5mg/kg靜脈內投予嗎啡之後(第1階段)，在給藥後約25分鐘(19.23±2.73g，P<0.001，未配對雙尾學生t檢驗)及給藥後約50分鐘(21.55±2.40g，p<0.001，未配對雙尾學生t檢驗)時左後爪收縮臨限值顯著增加。與媒劑值(22.26±1.52g)相比，觀察到右爪給藥前資料顯著降低(16.37±2.20g，P<0.05，未配對雙尾學生t檢驗)。此現象不可避免，因為處理組之分配係基於熱痛覺過敏測試之給藥前值(表17，圖18)。未記錄到對右後爪之其他顯著影響。
在第3階段中，與給藥前值1.46±0.37g相比，靜脈內投予嗎啡(5mg/kg)使給藥後約60分鐘(21.32±2.56g，P<0.001，配對雙尾學生t檢驗)、120分鐘(11.08±2.85g，P<0.01，配對雙尾學生t檢驗)及給藥後約180分鐘(3.68±0.97g，P<0.05，配對雙尾學生t檢驗)時的左爪收縮臨限值顯著增加(表21，圖22)。
熱痛覺過敏：在第1階段中，以5mg/kg靜脈內投予嗎啡導致在所有測試時間點左爪收縮潛伏期顯著增加，且導致給藥後約15分鐘、35分鐘及60分鐘時右爪收縮潛伏期顯著增加。與媒劑值(分別為7.5±0.5秒、12.8±1.1秒、7.0±1.2秒、10.3±0.9秒、7.6±0.9秒、12.4±1.4秒及7.4±0.9秒)相比，收縮潛伏期在給藥後約15分鐘為(左爪：12.0±1.5秒，P<0.05，Mann-Whitney U檢驗)，(右爪：17.5±0.5秒，P<0.001，Mann-Whitney U檢 驗)；在給藥後35分鐘為(左爪：16.4±0.9秒，P<0.001，未配對雙尾學生t檢驗)，(右爪：16.8±0.7秒，P<0.001，未配對雙尾學生t檢驗)；且在給藥後約60分鐘時兩個爪之收縮潛伏期為(左爪：12.8±1.3秒，P<0.01，未配對雙尾學生t檢驗)、(右爪：16.3±1.1秒，P<0.05，未配對雙尾學生t檢驗)；且在給藥後約130分鐘時左爪為(10.6±0.9秒，P<0.05，未配對雙尾學生t檢驗)(表18，圖19)。
在研究之第3階段中，與給藥前值6.0±0.5秒相比，靜脈內投予嗎啡導致左爪收縮潛伏期顯著增加(給藥後約70分鐘(11.8±1.2秒，P<0.01，配對雙尾學生t-檢驗)、給藥後約190分鐘(8.0±0.8秒，P<0.05，配對雙尾學生t-檢驗)及給藥後約250分鐘(10.6±1.4秒，P<0.05，配對雙尾學生t-檢驗))(表22，圖23)。
普瑞巴林對行為測試反應之影響(第2階段及第3階段)
在第2階段中，對普瑞巴林與給藥前進行比較，而在研究之第3階段中，與媒劑進行比較。在研究之第2階段中，藉由不同於媒劑(靜脈內)之途徑(經口)投予普瑞巴林，因此與媒劑相比不適當。在研究之第3階段中，將對普瑞巴林(使用3種劑量)之劑量反應與媒劑進行比較，而不是與給藥前進行比較。
機械性異常疼痛：在第2階段中，與給藥前值1.09±0.35g相比時，經口投予普瑞巴林(30mg/kg)導致在給藥後約50分鐘(10.35±2.51g，P<0.001，配對雙尾學生t檢驗)及給藥後約120分鐘(13.90±3.00g，P<0.001，配對雙尾學生t-檢驗)時左爪收縮臨限值顯著增加(表19，圖20)。
在第3階段中，與分別為5.00±2.34g及2.57±0.92g之媒 劑值相比，以30mg/kg之劑量經口投予普瑞巴林導致在給藥後約120分鐘時(17.06±2.88g，P<0.01，Kruskal-Wallis及Dunn檢驗)及給藥後約180分鐘(13.86±3.21g，P<0.01，ANOVA及Dunnett檢驗)時左爪收縮臨限值顯著增加。與分別為2.57±0.92g及16.57±1.75g之媒劑值相比，以50mg/kg之劑量經口投予普瑞巴林在給藥後約180分鐘時導致左爪及右爪收縮臨限值顯著增加(左爪：15.20±3.31g，P<0.01，ANOVA及Dunnett檢驗；且右爪：24.20±0.39g，P<0.05，Kruskal-Wallis及Dunn檢驗)，且與媒劑值(1.48±0.30g)相比，左爪收縮臨限值在給藥後約240分鐘時為(12.05±3.41g，P<0.05，Kruskal-Wallis及Dunn檢驗)。與分別為2.57±0.92g及16.57±1.75g之媒劑值相比，以100mg/kg之劑量經口投予普瑞巴林在給藥後約120分鐘時導致左爪收縮臨限值顯著增加(23.29±1.19g，P<0.01，ANOVA及Dunnett檢驗)且在給藥後約180分鐘時導致左爪及右爪收縮臨限值顯著增加(左爪：19.77±2.70g，P<0.01，ANOVA及Dunnett檢驗；且右爪：23.70±1.04g，P<0.01，Kruskal-Wallis及Dunn檢驗))；且與媒劑值(1.48±0.30g)相比，左爪收縮臨限值在給藥後約240分鐘時為(15.91±2.86g，P<0.001，Kruskal-Wallis及Dunn檢驗)。以50mg/kg及100mg/kg投予普瑞巴林之後，右爪收縮臨限值增加表明普瑞巴林在此等劑量下之重要作用。此符合動物在止痛性臨床症狀之層面所顯示之劑量依賴性增加(表21，圖22)。
熱痛覺過敏：在第2階段中，與給藥前值6.2±0.5秒相比，經口投予普瑞巴林(30mg/kg)導致在給藥後約15分鐘、35分鐘、60分鐘及130分鐘時的左爪收縮潛伏期顯著增加(8.3±0.7秒，P<0.05；8.6±1.0秒，P<0.05；8.8±1.0秒，P<0.05；9.6±0.8秒，P<0.001；均為配對雙尾學生 t檢驗)。此等顯著增加視為與藥理學無關，因為在第2階段中，與給藥前值6.2±0.5秒相比，在給藥後約15分鐘、35分鐘、60分鐘及130分鐘時(10.3±0.8秒，P<0.01；8.1±0.5秒，P<0.05；9.3±0.7秒，P<0.001；9.8±1.0秒，P<0.01；均為配對雙尾學生t檢驗)，媒劑對照組(靜脈內投藥)之收縮潛伏期之值存在類似增加；且在研究之第3階段中，與媒劑對照組相比，經口投予普瑞巴林在所有測試劑量(30、50及100mg/kg)下且在所有給藥後時間點(60分鐘、120分鐘、180分鐘及240分鐘)均未對左爪及右爪收縮潛伏期產生顯著影響(表20，圖21及表22，圖23)。
結論
藉由緊固結紮L5及L6脊神經可在大鼠之左後肢中誘發周圍單神經病變。機械異常疼痛及熱痛覺過敏之產生可使用已確立之行為測試(分別為馮弗萊測試及Hargreaves足底測試)監測。評定左後爪(受影響)與右後爪(未受影響)之反應臨限值及潛伏期。在研究之各個階段中，所有給藥之動物視為在左後爪中患有神經病變，如在給藥前一天使用已確立之行為測試所評定。
以0.5μg/kg靜脈內投予R-DHE在給藥後至多25分鐘導致收縮臨限值增加(機械性異常疼痛)，峰值效應出現與給藥後約5分鐘時。0.5μg/kg之R-DHE在任何測試時間點對收縮臨限值均無影響(熱痛覺過敏)。R-DHE在0.1μg/kg及0.3μg/kg之較低劑量下，對機械性異常疼痛或熱痛覺過敏亦無影響。
以30μg/kg之劑量靜脈內投予S-DHE在收縮臨限值(機械性異常疼痛)(峰值效應出現於給藥後約5分鐘至25分鐘)與收縮潛伏期 (熱痛覺過敏)(峰值效應出現於給藥後約15分鐘)方面均產生顯著止痛效應。在3μg/kg及10μg/kg S-DHE下，未記錄到對機械性異常疼痛或熱痛覺過敏之影響。
在大鼠之機械性異常疼痛與熱痛覺過敏測試中，靜脈內投予類鴉片化合物R-DHE及S-DHE均顯示止痛活性。由此突顯此等化合物治療神經病變性疼痛的治療潛能。
以高達100mg/kg之劑量投予普瑞巴林(在第3階段中)之後，收縮臨限值隨劑量增加，峰值效應出現於給藥後約180分鐘與240分鐘之間。普瑞巴林在熱痛覺過敏測試中無影響。投予普瑞巴林之後所記錄之影響與其已知藥理學活性(根據文獻資料)一致，對機械性異常疼痛具顯著作用，而對熱痛覺過敏之作用有限。
靜脈內投予嗎啡之後所記錄之影響與其已知藥理學活性一致，其對機械性異常疼痛與熱痛覺過敏均具顯著作用。此測試系統因此可在大鼠之機械性異常疼痛與熱痛覺過敏測試中靈敏地偵測傷痛刺激效應。

Claims (33)

  1. 一種製備式(VI)化合物或其鹽或衍生物之方法， (其中R1及R2獨立地為C1-8烷基，且*表示立體中心)，該方法包含水解式(V)化合物 其中R1、R2及*如上文所定義。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該式(V)化合物係藉由式(IV)化合物 (其中R1如上文所定義)與式R2M(X)p化合物(其中R2為C1-8烷基，M為金屬，X為鹵素且p為1或0)反應所製備。
  3. 如申請專利範圍第2項之方法，其中該式(IV)化合物係藉由還原式(III)化合物來製備 (其中R1如上文所定義)。
  4. 如申請專利範圍第3項之方法，其中該式(III)化合物係藉由式(I)化合物與式(II)化合物反應所製備： (其中R1為C1-8烷基)。
  5. 一種製備式(VI)化合物或其鹽或衍生物之方法， (其中R1及R2獨立地為C1-8烷基，且*表示立體中心)，該方法包含：使式(I)化合物與式(II)化合物反應以獲得式(III)化合物 (其中R1為C1-8烷基) (其中R1如上文所定義)；還原該式(III)化合物以產生式(IV)化合物： (其中R1如上文所定義)；使該式(IV)化合物與式R2M(X)p化合物(其中R2為C1-8烷基，M為金 屬，X為鹵素且p為1或0)反應以獲得式(V)化合物： 其中R1、R2及*如上文所定義；(iv)水解該式(V)化合物以獲得式(VI)化合物。
  6. 如申請專利範圍第1項至第5項中任一項之方法，其進一步包含使該式(VI)化合物結晶之步驟。
  7. 如申請專利範圍第1項至第5項中任一項之方法，其中R1為C3-5烷基。
  8. 如申請專利範圍第1項至第5項中任一項之方法，其中R1為丙基。
  9. 如申請專利範圍第1項至第5項中任一項之方法，其中R1為正丙基。
  10. 如申請專利範圍第1項至第5項中任一項之方法，其中R2為C1-2烷基。
  11. 如申請專利範圍第1項至第5項中任一項之方法，其中R2為甲基。
  12. 如申請專利範圍第1項至第5項中任一項之方法，其中式(V)及式(VI)中之該立體中心(*)為(S)立體中心。
  13. 如申請專利範圍第12項之方法，其中式(V)化合物係以至少90%之非對映異構物過量產生。
  14. 如申請專利範圍第1項至第5項中任一項之方法，其中該式(V)化合物為：
  15. 如申請專利範圍第1項至第5項中任一項之方法，其中該式(VI)化合物為：
  16. 如申請專利範圍第1項至第5項中任一項之方法，其中式(V)及式(VI)中之該立體中心(*)為(R)立體中心。
  17. 一種式(VI)化合物，或其鹽或衍生物， 其中R1及R2獨立地為C1-8烷基，且*表示(S)立體中心。
  18. 如申請專利範圍第17項之式(VI)化合物，或其鹽，其具有式(VIa)
  19. 一種式(V)化合物，或其鹽或衍生物， 其中R1及R2獨立地為C1-8烷基，且(*)表示(S)或(R)立體中心，較佳為(S)立體中心。
  20. 如申請專利範圍第19項之化合物，或其鹽，其具有式(Va)
  21. 如申請專利範圍第17項至第20項中任一項之化合物，其係呈游離鹼形式。
  22. 如申請專利範圍第17項至第20項中任一項之化合物，其係為醫藥上可接受之鹽。
  23. 如申請專利範圍第17項至第20項中任一項之化合物，其係鹽酸鹽。
  24. 一種式(IV)化合物， (其中R1為C1-8烷基)。
  25. 一種式(III)化合物， (其中R1為C1-8烷基)。
  26. 如申請專利範圍第24項或第25項之化合物，其中R1為丙基。
  27. 一種製造式(III)化合物之方法，其包含使式(I)化合物與式(II)化合物反應： (其中R1為C1-8烷基)。
  28. 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第17項至第26項中任一項之化合物。
  29. 如申請專利範圍第28項之醫藥組成物，其係呈適合經皮投藥之劑型。
  30. 如申請專利範圍第28項之醫藥組成物，其係用於治療需要減輕疼痛之個體。
  31. 一種用於醫藥之如申請專利範圍第17項至第26項中任一項之化合物。
  32. 一種用作止痛劑之如申請專利範圍第17項至第26項中任一項之化合物。
  33. 一種如申請專利範圍第17項至第26項中任一項之化合物的用途，其係用於製造供治療疼痛用之藥劑。
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