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TW201522634A - 用於增進重組蛋白質製造之調配物及方法 - Google Patents

用於增進重組蛋白質製造之調配物及方法 Download PDF

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TW201522634A
TW201522634A TW103105992A TW103105992A TW201522634A TW 201522634 A TW201522634 A TW 201522634A TW 103105992 A TW103105992 A TW 103105992A TW 103105992 A TW103105992 A TW 103105992A TW 201522634 A TW201522634 A TW 201522634A
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mannose
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TW103105992A
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Yuval Shimoni
Volker Moehrle
Venkatesh Srinivasan
Ricaredo Matanguihan
Original Assignee
Bayer Healthcare Llc
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Abstract

本發明揭示增進重組蛋白質製造的調配物及方法，以及其他態樣。該等調配物及方法是有關於在用以培養表現重組蛋白質之細胞的細胞培養基調配物中增加甘露糖或鈣或兩者的濃度。

Description

用於增進重組蛋白質製造之調配物及方法
本發明揭示增進重組蛋白質製造的調配物及方法，以及其他態樣。該等調配物及方法是有關於在用以培養表現重組蛋白質之細胞的細胞培養基調配物中增加甘露糖或鈣或兩者的濃度。
細胞培養系統可用來在包含促使細胞生長之營養素的細胞培養基調配物中製造重組蛋白質。實例細胞培養基調配物包括DMEM/F12、RPMI(例如RPMI 1640)、MEM、DMEM、F-12、小鼠ES細胞基礎培養基、L-15、IMDM、麥科伊氏(McCoy’s)5A培養基以及VeroPlus SFM。
在製造重組蛋白質時(包括在商業製造時)，希望增加重組蛋白質製造的數量同時維持產品品質。
因此，需要增進重組蛋白質製造但不會降低產品品質的細胞培養基調配物及方法。
在一些具體例中，提供一種哺乳動物細胞培養基調配物。該調配物具有約3.5g/L或更高之甘露糖及範圍約1.5mM至約9.5mM之鈣中至少一者。
在一或多個具體例中，提供一種在細胞培養物中製造重組蛋白質的方法。該方法包括在具有下列至少一者的細胞培養基中培養重組蛋白質表現細胞：約3.5g/L或更高之甘露糖及重組蛋白質穩定劑，諸如範圍約1.5mM至約9.5mM之鈣。在某些具體例中，該方法增進重組蛋白質製造。在某些具體例中，該方法增進重組蛋白質製造而不會喪失所製造之重組蛋白質的品質。
依據這些以及其他具體例提供許多其他態樣。本教示的這些及其他特徵列示在本文中。
100‧‧‧方法
101‧‧‧方塊
102‧‧‧方塊
習於技藝者將理解下面所述圖式僅供說明之用。圖式不意欲在任何方面限制本教示的範疇。
圖1為流程圖，說明在依據不同具體例的細胞培養系統中增進重組蛋白質製造的方法。
圖2以圖式的方式顯示甘露糖濃度由3g/L增加至5g/L在依據不同具體例之1L灌注生物反應器細胞培養物中會增進重組人類因子VIII(「rhFVIII」)滴定濃度達25%。
圖3以圖式的方式顯示甘露糖濃度由3g/L增加至5g/L在依據不同具體例之15L灌注生物反應器細胞培養物中會增進rhFVIII滴定濃度~37%。
圖4以圖式的方式顯示在依據不同具體例之轉管(重複批式)實驗中，結果證實於5mM氯化鈣的測試條件下對rhFVIII滴定濃度(增進~19%)的影響最高。
圖5以圖式的方式顯示鈣濃度由1mM增加至5mM在依據不同具體例之1L灌注生物反應器細胞培養物中會增進rhFVIII滴定濃度達~27%。
圖6以圖式的方式顯示鈣濃度由1mM增加至5mM在依據不同具體例之15L灌注生物反應器細胞培養物中會增進rhFVIII滴定濃度達~29%。
圖7A-B以圖式的方式顯示從對照培養基(含有1mM氯化鈣與3g/L甘露糖)轉移至富含兩種組分(含有5mM氯化鈣與5g/L甘露糖)的培養基在依據不同具體例中會增進rhFVIII滴定濃度達29%且效用為可逆轉。
圖8A-B顯示依據不同具體例，15L灌注生物反應器作業的設計(A)以及所得效力數據(B)。
圖9以圖式的方式顯示依據不同具體例針對rhFVIII製造量操控細胞培養調配物的糖含量的結果，顯示使用含甘露糖培養基與無甘露糖培養基的效力平均值。
各種具體例的說明
如所述，在細胞培養基調配物中增進所培養之蛋白質表現細胞的製造量而不會不利地影響蛋白質產品品質是一項挑戰。依據本文所述的一或多個具體例，藉由將額外營養素(諸如甘露糖)及/或穩定劑(諸如鈣)提供至細胞培養基中，可以產生一個經改良的細胞培養基調配物。在一些具體例中，該經改良的細胞培養基調配物可以在使用對產品品質有極少或無可測得影響的細胞培養基調配物的情況下增進所培養之蛋白質表現細胞的製造量。亦提供形成及/或使用此等細胞培養基調配物的方法。
實例細胞培養基調配物
如上所述，在不同具體例中，可以藉由在調配物中增加甘露糖濃度及/或重組蛋白質穩定劑(諸如鈣)濃度或兩者而在細胞培養基調配物中達到增進重組蛋白質製造。
在一個態樣中，提供一種細胞培養基調配物(例如細胞培養基組合物)，該細胞培養基調配物包括約3.5g/L或更多的甘露糖(例如在某些具體例中約4g/L、約5g/L、約6g/L或約7g/L或更多)及範圍約1.5mM至約9.5mM或更多的鈣(或在某些具體例中約2mM、約3mM、約4mM、約5mM、約6mM、約7mM、約8mM、約9mM或約9.5mM或更多)中至少一者。可採用其他細胞培養基調配物。
在添加約3.5g/L或更多甘露糖及範圍約1.5mM至約9.5mM 的鈣中至少一者之前，該細胞培養基調配物可以是任一種細胞培養基調配物。例如，在某些具體例中，該細胞培養基調配物可包括杜貝可氏改良伊格氏培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)與漢氏F-12營養素混合物(Ham’s F-12 Nutrient Mixture)(DMEM/F12)呈諸如1：1的適當比例，以及約5g/L甘露糖與約5mM鈣中至少一者。
可採用其他細胞培養基調配物取代DMEM/F12，諸如RPMI(例如RPMI 1640)、MEM、DMEM、F-12、小鼠ES細胞基礎培養基、L-15、IMDM、麥科伊氏5A培養基以及VeroPlus SFM。在某些具體例中，該細胞培養基調配物是用於培養哺乳動物細胞。
本文提供之實例細胞培養基調配物在不受到限制的情況下包括下列：(a)約3.5g/L或更多的甘露糖及少於約1.5mM或多於約9.5mM的鈣；(b)少於約3.5g/L的甘露糖及範圍約1.5mM至約9.5mM的鈣；(c)範圍約4g/L至約5g/L的甘露糖及範圍約1.5mM至約9.5mM的鈣中至少一者；(d)約5g/L的甘露糖及範圍約1.5mM至約9.5mM的鈣中至少一者；(e)範圍約4g/L至約5g/L的甘露糖及少於約1.5mM或多於約9.5mM的鈣；(f)約5g/L的甘露糖及少於約1.5mM或多於約9.5mM的鈣；(g)約3.5g/L或更多的甘露糖及範圍約2mM至約5mM的鈣中至少一者；(h)約3.5g/L或更多的甘露糖及約5mM的鈣中至少一者；(i)少於約3.5g/L的甘露糖及範圍約2mM至約5mM的鈣；(j)少於約3.5g/L的甘露糖及約5mM的鈣；及/或(k)DMEM/F12呈1：1比例，與約5g/L的甘露糖及約5mM的鈣中至少一者。可採用其他調配物。
形成/使用細胞培養基調配物的方法
在細胞培養物中製造重組蛋白質的方法將在下面參照圖1-8來說明。
圖1說明用以在依據本文提供的某些具體例的細胞培養物中製造重組蛋白質的方法100的流程圖。參照圖1，方法100始於方塊101，其中提供重組蛋白質表現細胞。
實例重組蛋白質表現細胞可包括，例如任一種真核或原核細胞，包括哺乳動物細胞、植物細胞、昆蟲細胞、酵母菌細胞、細菌細胞或類似細胞。在某些具體例中，該等細胞為哺乳動物細胞。實例哺乳動物細胞包括幼倉鼠腎(BHK)細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、腎與B細胞雜合(HBK)的細胞、人類胚腎(HEK)細胞與NS0細胞。
重組蛋白質表現細胞可以是製造任何生物蛋白質產品的細胞。例如，該等細胞可以是經過工程化以表現一或多種重組蛋白質產品的重組細胞；及/或表現抗體分子的重組細胞。
重組蛋白質表現細胞的產品可以是任一種蛋白質產品，包括諸如凝血因子(一種在凝血路徑中的蛋白質)的重組蛋白質產品，凝血因子包括例如因子VII、因子VIII、因子IX與因子X。例如，重組蛋白質表現細胞可以是表現因子VIII的哺乳動物細胞。
因子VIII可以是因子VIII的變體，諸如遺傳變體，其可以藉由做出rFVIII基因構築體的遺傳變異而創造，產生例如B結構域被刪除的因子VIII與突變型因子VIII。因子VIII變體包括，例如經表現後修飾的因子VIII，諸如(例如)聚乙二醇化FVIII與帶有共價接合之聚乙二醇(PEG)的FVIII。在有共表現結合要素的情況下，因子VIII變體也可包括融合蛋白質。
在某些具體例中，重組蛋白質表現細胞的重組蛋白質產品可以是醣蛋白。在一些具體例中，該重組蛋白質被分泌。可採用任一種適當來源之表現重組蛋白質的重組細胞及/或用以形成表現重組蛋白質之重組細胞的方法。
在方塊102中，重組蛋白質表現細胞被培養在細胞培養基調配物(亦即組合物)中，該調配物包括約3.5g/L或更多的甘露糖及範圍約1.5 mM至約9.5mM的鈣中至少一者。如本文所用，細胞培養基可包括組織或細胞培養液、組織或細胞培養基(medium or media)或類似者。
在添加約3.5g/L或更多的甘露糖及範圍約1.5mM至約9.5mM的鈣中至少一者之前，該細胞培養基調配物可以是任一種細胞培養基調配物。例如，在某些具體例中，該細胞培養基調配物可包括杜貝可氏改良伊格氏培養基與漢氏F-12營養素混合物(DMEM/F12)呈諸如1：1的適當比例，以及約5g/L甘露糖與約5mM鈣中至少一者。
可採用其他細胞培養基調配物取代DMEM/F12，諸如RPMI(例如RPMI 1640)、MEM、DMEM、F-12、小鼠ES細胞基礎培養基、L-15、IMDM、麥科伊氏5A培養基以及VeroPlus SFM。在某些具體例中，該細胞培養基調配物是用於培養哺乳動物細胞。
在不同具體例中，該細胞培養基調配物可以是基於商業上購得之DMEM/F12調配物的培養基組合物，DMEM/F12調配物是由Sigma-Aldrich Fine Chemicals(SAFC,Lenexa,Kansas)或Life Technologies(Grand Island,N.Y.)所製造，補充有諸如鐵、普朗尼克F-68或胰島素的其他補充劑且基本上可能無其他蛋白質。可採用其他基礎培養基組合物。
舉例而言，可使用錯合劑組胺酸(his)及/或亞胺二乙酸(IDA)，及/或可使用諸如MOPS(3-[N-嗎啉基]丙烷磺酸)、TES(N-參[羥基甲基]甲基-2-胺基乙烷磺酸)、BES(N,N-二[2-羥基乙基]-2-胺基乙烷磺酸)及/或TRIZMA(參[羥基甲基]胺基乙烷)的有機緩衝劑；全部可得自SAFC(St.Louis,Mo.)。在一些情況下，組織培養基可個別或以組合方式補充已知濃度的此等錯合劑及/或有機緩衝劑。在一些具體例中，組織培養液可含有EDTA(例如50μM)或另一種適宜的金屬(例如鐵)螯合劑。可使用其他組合物、調配物、補充劑、錯合劑及/或緩衝劑。
該細胞培養基調配物可包括胺基酸，其可以包括例如任一種天然胺基酸。
該細胞培養基調配物可包括鹽類，其可包括氯化鉀、硫酸鎂、氯化鈉、磷酸鈉、氯化鎂、硫酸銅、硫酸鐵、硫酸鋅、硝酸鐵、二氧化硒、氯化鈣及/或其他適用於細胞培養基調配物中的鹽類。
該細胞培養基調配物可包括維生素，其可包括生物素、氯化膽鹼、泛酸鈣、葉酸、次黃嘌呤、肌醇、菸鹼醯胺、維生素C、吡哆醇、核黃素、硫胺素、胸苷、維生素B-12、吡哆醛、腐胺及/或其他適用於細胞培養基調配物中的維生素。
該細胞培養基調配物可包括一或多種上述以外的組分(「其他組分」)，其可包括右旋糖、甘露糖、丙酮酸鈉、酚紅、穀胱甘肽、亞麻油酸、硫辛酸、乙醇胺、巰乙醇、正磷醯乙醇胺及/或其他適用於細胞培養基調配物中的組分。
常見的哺乳動物細胞培養基調配物為DMEM/F12。DMEM/F12是杜貝可氏改良伊格氏培養基(DMEM)與漢氏F-12營養素混合物的1：1混合物。DMEM/F12培養基可得自於許多商業來源且常用於重組蛋白質(諸如rhFVIII)的製造。DMEM/F12的完整組分組成可自由取得(例如ATCC Cat # 30-2006)(表1)。DMEM/F12(1：1)通常含有1.05mM(0.11665g/L)充分溶解的CaCl2(無水)。D-甘露糖不是DMEM/F12(1：1)配方的組分；D-葡萄糖以約3g/L存在(作為碳水化合物來源)。
在某些具體例中，提供一種包含DMEM/F12及約3g/L或更少之甘露糖的調配物。例如，相較於有DMEM/F12而沒有任何甘露糖，但有4g/L葡萄糖(4g/L總糖)的細胞培養物，具有DMEM/F12(其中葡萄糖為1g/L)及約3g/L甘露糖的調配物(4g/L總糖)可在細胞培養物中使得rhFVIII滴定濃度增進達約28%。在某些具體例中，相較於有DMEM/F12與3g/L甘露糖及1g/L葡萄糖(4g/L總糖)的細胞培養物，具有DMEM/F12及4g/L甘露糖(4g/L總糖)但沒有葡萄糖的調配物可在細胞培養物中增加rhFVIII滴定濃度達約18%。參見例如圖9，其以圖式的方式說明針對rhFVIII製造量操控細胞培養調配物的糖含量的結果。
甘露糖是一種糖單體且是葡萄糖的表異構物。甘露糖參與細胞代謝。其在醣蛋白生合成期間以轉譯後的方式併入蛋白質中。附接至醣蛋白的寡醣可促使初生蛋白質正確摺疊並協助保護成熟蛋白質免於蛋白溶解(Hebert and Molinari,Physiol.Rev.87：1377-1408(2007))。典型N-連結寡醣含有甘露糖還有N-乙醯基葡萄糖胺，且常具有數個分支，有時末端帶有負 電荷唾液酸殘基。這個結構修飾對於許多醣蛋白(包括FVIII)來說是重要的品質屬性，其可影響分子的生物合成、分泌與穩定性和藥動學/藥效學(PK/PD)特性。
儘管真核細胞能夠在果糖-6-磷酸被轉換成甘露糖-6-磷酸的過程中藉由甘露糖-6-磷酸異構酶將葡萄糖轉換成甘露糖，但在一些細胞類型中，用於醣蛋白生合成的大部分甘露糖是自甘露糖衍生而來，而不是葡萄糖(Alton et al.,Glycobiology 8(3)285-295(1998))。
重組蛋白質的穩定劑可以是穩定重組蛋白質免於(例如)分解的任一者。穩定劑的實例包括鈣與錳。
鈣離子藉由穩定FVIII複合體的四級結構而在穩定FVIII凝集活性中扮演重要的角色(Switzer et al.,The Journal of Clinical Investigation 60：819-828(1977)；Mikaelsson et al.Blood 62(5)：1006-1015(1983))。已顯示鈣與錳藉由結合至重鏈與輕鏈調節雜二聚體構型來增進FVIII活性(在Fay,Blood Rev.18：1-15(2004)中回顧)。已提議需要鈣(及/或錳)來增進FVIII的活性構型。
使用具體例調配物及/或具體例方法，可採用任一種適宜細胞培養系統供培養細胞之用。該細胞培養系統可以是哺乳動物細胞培養系統。該細胞培養系統可以是生物反應器細胞培養系統，包括灌注生物反應器細胞培養系統。該細胞培養系統可包括小規模培養系統(諸如組織培養燒瓶或迴轉瓶)，及/或大規模細胞培養系統(諸如生物反應器細胞培養系統)。實例細胞培養基可進一步補充血清，包括牛血清、馬血清、小牛血清、胎小牛血清，及/或胎牛血清。實例細胞培養基可進一步補充人類血清及/或人類血漿蛋白質部分。
生物反應器細胞培養系統可包括(1)重組蛋白質表現細胞；及(2)選自下列的細胞培養基調配物：(a)包含約3.5g/L或更多之甘露糖及範圍約1.5mM至約9.5mM之鈣中至少一者的調配物；(b)包含約3.5g/L或更多的甘露糖及少於約1.5mM或多於約9.5mM的鈣的調配物；(c)包含少於約3.5g/L的甘露糖及範圍約1.5mM至約9.5mM的鈣的調配物；(d)包含範圍約4g/L至約5g/L的甘露糖及約1.5mM至約9.5mM的鈣中至少一者的調配物； (e)包含約5g/L甘露糖及範圍約1.5mM至約9.5mM的鈣中至少一者的調配物；(f)包含範圍約4g/L至約5g/L的甘露糖及少於約1.5mM或多於約9.5mM的鈣的調配物；(g)包含約5g/L的甘露糖及少於約1.5mM或多於約9.5mM的鈣的調配物；(h)包含約3.5g/L或更多的甘露糖及範圍約2mM至約5mM的鈣中至少一者的調配物；(i)包含約3.5g/L或更多的甘露糖及約5mM的鈣中至少一者的調配物；(j)包含少於約3.5g/L的甘露糖及範圍約2mM至約5mM的鈣的調配物；(k)包含少於約3.5g/L的甘露糖及約5mM鈣的調配物；以及(l)包含呈1：1比例的DMEM/F12，且包括約5g/L甘露糖及約5mM鈣中至少一者的調配物。
在一些具體例中，透過使用包括約5g/L甘露糖及約5mM鈣中至少一者的細胞培養基調配物，重組蛋白質的製造得以增進。在某些具體例中，重組蛋白質的製造在不喪失所製造之重組蛋白質品質的情況下得以增進(例如相較於本文所述無約3.5g/L或更多甘露糖及範圍約1.5mM至約9.5mM之鈣中至少一者，或在本文所述此等特定範圍的任一特定點上相同或實質上相同的細胞培養基)。在某些具體例中，重組蛋白質的製造增進持續至多約130天或更久。
用於製造重組蛋白質的實例細胞培養系統以及生物反應器細胞培養系統描述於文獻中。用於製造重組因子VIII的實例灌注培養系統描述於文獻中，例如在US 6,338,964標題為「Process and Medium For Mammalian Cell Culture Under Low Dissolved Carbon Dioxide Concentration」中以及在Boedeker,B.G.D.,Seminars in Thrombosis and Hemostasis,27(4),pages 385-394中。
上述調配物與方法可顯著地增進工廠產能並降低製造成本。例如，在一些具體例中，就rhFVIII而言，已發現到細胞培養物生產力增進至多~40%(例如生產力增加持續至少3個月的連續灌注培養)。此外，依據某些具體例的方法具有複雜性與設立cGMP管理局相符API製造設備的費用較低。例如，在不同具體例中，不需要針對已建立的重組蛋白質產物來進行遺傳操作或改變細胞株；不需要大範圍改變建設或生產製程；及/或對產品品質沒有影響。
本教示的態樣可從下面實例進一步了解，下面實例不應被理解為以任何方式限制本教示的範疇。
實例 實例1：增加甘露糖在細胞培養系統中增進重組蛋白質製造
表現rhFVIII的BHK-21細胞被培養在轉管中(Shimoni et al.,BioPharm International 23(8)：28-37(2010))，其中改變現有DMEM/F12培養基組分的濃度。當甘露糖濃度增加時，rhFVIII滴定濃度增加(藉由效力分析來測定)。
使用1L灌注生物反應器系統來進行實驗，接著是15L規模灌注生物反應器研究。在1L規模與15L規模之間的結果大體上是一致的。
在接種與在含有3g/L甘露糖的標準培養基(對照條件)中生長至穩態之後，於1L規模灌注生物反應器進行的範圍測試實驗證實甘露糖增加對滴定濃度的劑量依賴性效用。各別在含有3g/L甘露糖，接著4g/L與5g/L甘露糖的(標準)培養基中進一步連續培養細胞持續約10天(藉著轉換進料至生物反應器中的培養基)。在這個實驗中無其他的培養基組分有所改變。大約每天取得樣品(經處理並冷凍)供效力測定用。當甘露糖從3g/L增加至4g/L時，滴定濃度增加達~15%，當甘露糖進一步增加至5g/L時，滴定濃度增加達~25%(圖2)。
圖2數據的統計分析證實，甘露糖濃度增加對增進效力/滴定濃度的影響顯著(P值<0.0001)。
當以15L規模進行實驗時，將培養物從含有3g/L甘露糖的培養基轉換成含有5g/L甘露糖的培養基，其中約每天取得樣品(經處理並冷凍)，其造成滴定濃度增加~37%(圖3；3g/L甘露糖在X軸標記為「對照」而5g/L甘露糖在X軸標記為「甘露糖」)。在兩個實驗(以1L與15L規模進行)中，統計分析顯示甘露糖增加的效應在統計學上具有顯著性。在培養基轉換的天數內觀察到甘露糖對FVIII滴定濃度的效用且在連續(1L與15L)灌注培養系統中持續著。
圖3數據的統計分析證實，甘露糖對增進效力/滴定濃度的影響顯著(P值<0.0012)。
實例2：增加鈣在細胞培養系統中增進重組蛋白質製造
表現rhFVIII的BHK-21細胞被培養在轉管中(Shimoni et al.,BioPharm International 23(8)：28-37(2010))。當在以DMEM/F12為基礎的培養基中增加鈣濃度，觀察到rhFVIII滴定濃度增加(藉由效力分析來測定)。
在轉管中進行範圍查明實驗，以鑑別對於FVIII滴定濃度增加來說最佳的鈣濃度。在測試濃度中，5mM氯化鈣對FVIII滴定濃度的影響最大(增加~19%)(圖4：在4天實驗的第2、3及4天(X軸)收集樣品，其中滴定濃度(效力)為Y軸的對照(1mM氯化鈣)%)。在1mM(對照)、2mM、5mM與10mM範圍內測試氯化鈣濃度。鈣從1mM(對照)增加至2mM會增進FVIII滴定濃度達~8%，而在5mM下滴定濃度增加達~19%。但在10mM下，鈣對滴定濃度具有負面影響。
當在1L灌注生物反應器中生長的細胞由含有1mM氯化鈣的培養基(對照培養基)轉換至含有5mM氯化鈣的培養基時，滴定濃度增加達~27%(圖5)。於含有1mM氯化鈣的培養基中以穩態在1L灌注生物反應器中連續培養細胞持續約5天，接著轉移至含有5mM氯化鈣的培養基中並培養再~5天。約每天取得樣品(經處理並冷凍)供效力測定之用。
當在15L規模灌注生物反應器中重複類似實驗時，滴定濃度在含有5mM鈣的培養基中比在含有1mM鈣的培養基中高~29%(圖6：含有5mM氯化鈣的培養基在X軸標記為「Ca」)。在含有1mM氯化鈣的培養基(「對照」)中以穩態在15L灌注生物反應器中連續培養細胞約3天，且接著轉移至含有5mM氯化鈣的培養基中並培養超過一週。約每天取得樣品(經處理並冷凍)供效力測定之用。
以1L規模與以15L規模進行的實驗彼此相當一致，證實在培養基從1mM氯化鈣轉移至5mM氯化鈣之後，FVIII滴定濃度快速增加27-29%。較高的滴定濃度持續整個實驗持續期間。
在上述兩個15L操作結束時收取材料並藉由超過濾來濃縮，兩個15L操作為使用含有5g/L甘露糖的培養基(圖2)以及使用含有5mM鈣的培養基(圖5)。
圖6數據的統計分析證實，鈣濃度增加對增進效力/滴定濃度的影響顯著(p值<0.0176)。
實例3：藉由增加甘露糖或鈣濃度來增進重組蛋白質製造不會喪失蛋白質品質
接著處理實例1-2之經冷凍的超過濾培養物收取物(15L生物反應器，各培養基約兩週長作業，培養基類型A：5mM鈣；培養基類型B：5g/L甘露糖)並以如先前所述的數個步驟純化FVIII(Boedeker,Seminars in Thrombosis and Hemostasis 27(4)：385-394(2001))且最後針對各產品品質屬性進行評估。依據以HPLC-SEC與SDS-PAGE/西方墨點為基礎的方法、效力、比活性、各種宿主-細胞不純物(蛋白質和核酸)以及醣基化型態所評估，由含有5g/L甘露糖的培養基以及含有5mM鈣的培養基純化而來的rhFVIII材料通過各種產品品質屬性(包括純度以及完整性)，表示在培養基中甘露糖與鈣濃度的變化不會影響FVIII產品。
實例4：在細胞培養系統中增加甘露糖與鈣會增進重組蛋白質製造
圖7A-7B顯示以DMEM/F12為基礎的培養基富含(5mM)鈣以及(5g/L)甘露糖，且對於FVIII滴定濃度具有比單獨各個組分還高的有利效用。亦顯示，滴定濃度變化在一天內發生，且在培養回復成標準培養基(含有1mM氯化鈣和3g/L甘露糖)之後可逆轉地由增加~29%回退至基線。
圖7A-7B以圖式的方式顯示從對照培養基(含有1mM氯化鈣與3g/L甘露糖)轉移至富含兩種組分(含有5mM氯化鈣與5g/L甘露糖)的培養基會增進rhFVIII滴定濃度達29%，且效用為可逆轉。在15L灌注生物反應器細胞培養物中以標準培養基(1mM鈣和3g/L甘露糖；對照-1)連續培養的細胞被轉移至含有5mM鈣與5g/L甘露糖的培養基持續約9天並之後回復到標準培養基(對照-2)，證實了快速(一天內)且可逆轉的rhFVIII滴定濃度改 變。條件為轉移前「對照-1」，而(分別)轉移至5mM氯化鈣和5g/L甘露糖(「Ca+甘露糖」)測試培養基後/自5mM氯化鈣和5g/L甘露糖(「Ca+甘露糖」)測試培養基轉移「對照-2」。約每天取得樣品(經處理並冷凍)供效力測定之用。A區，依據「條件」。
圖7(A)與(B)數據的統計分析證實，甘露糖及鈣(一起)濃度增加對增進效力/滴定濃度的影響顯著。圖7(A)數據的統計分析產生p值<0.05。圖7(B)數據的統計分析產生p值<0.0102。
實例5：藉由增加甘露糖與鈣濃度來增進重組蛋白質製造不會喪失蛋白質品質
為了確認效力能在灌注培養物中維持一個持續超過130天的作業，兩個生物反應器並行運行：一個以含有5g/L甘露糖與5mM鈣的測試培養基培養，而一個以含有3g/L甘露糖與1mM鈣的對照培養基培養(圖8A)。在測試生物反應器對對照中，>30%滴定濃度益處確實持續超過130天的灌注作業(圖8B)。
藉由收集實例5的收取材料並將其藉由超過濾來濃縮，並行在三個時間點測試產品品質(針對測試培養物為圖8A，點3、5、7，而針對對照培養物為圖8A，點2、4、6)。在早期，在從對照轉移至測試培養基之前收集來自測試生物反應器的時間點一(圖8A，點1)。經超過濾的培養物收取物被純化並評估FVIII品質。使用測試培養基所生成的FVIII符合所有品質度量，包括純度及完整性、效力、比活性、各種宿主-細胞不純物與醣基化型態；此外，由在測試培養基的培養物所生成的FVIII材料與由在對照培養基中生長之培養物所生成者相當，表示滴定濃度持續增加>30%不會影響產品品質。在兩個生物反應器(測試與對照)中的細胞培養物生長屬性也相當。在測試與對照生物反應器之間，製程對照設定點(pH、溶氧、pCO2與溫度)、細胞屬性(生物反應器細胞密度、生物反應器存活率)、代謝物(葡萄糖與乳糖的殘餘和消耗率)以及比生產力全都相當。
實例6：實例1-5的材料與方法 轉管實驗
如前所述(Shimoni et al.,BioPharm International,23(8)：28-37(2010))，小規模培養基測試實驗室在具有螺蓋的50mL培養管(Cultiflask 50,Sartorius,Bohemia NY)中進行。將管充填14mL測試培養基，其中起始細胞密度為3x105細胞/mL。以30rpm的滾動在轉管平台上混合該等管，該轉管平台被置放在濕度、溫度與CO2受到控制的培養箱中。培育該等管歷時四天，在第2、3與4天取出1.3mL樣品供代謝物分析之用。在第3與4天取得用於效力測試以及凝集或顯色分析的其他樣品。
1L灌注生物反應器細胞培養
為了擴大規模，將表現rhFVIII的BHK-21細胞接種至使用生產培養基(以DMEM/F12為基礎的培養基)的搖瓶中。在35.5℃與30rpm下培育燒瓶並連續分裂直到出現所需要的細胞量。
擴大規模的細胞以9 x 106vc/mL被接種至DASGIP控制台的工作體積為1L之1.5L DASGIP(Eppendorf,Germany)管。工作體積是藉由控制培養基泵的水平感測器來維持恆定。
以0.45nL/細胞/天的目標細胞比灌注率(「CSPR」)在穩態下視測量到的細胞密度藉由調節收取泵使用細胞保持裝置(沉降槽)來建立灌注。使用恆溫台將溫度控制在35.5℃而沉降槽溫度控制在20-23℃。使用浸入式矽管提供打氣。相應於溶氧降低而將細胞從生物反應器丟棄，以維持目標細胞密度為25 x 106vc/mL。藉由5L/小時的頂部空間打氣來提供補充打氣。若需要的話，藉由添加碳酸鈉溶液將培養物pH控制在6.85的目標。
15L灌注生物反應器細胞培養
在15L生物反應器(Applikon Inc.,Foster City,CA)中以12L的工作體積進行細胞培養。以1 x 106細胞/mL的接種密度接種生物反應器。在整個作業過程中維持可控製程參數的標準設定點；pH=6.8，溫度=35.5℃，溶氧DO=50%飽和空氣。溶氧以及pH控制的混合氣體藉由矽膜被 供應至培養物且頂部空間是經由浮子流量計受到控制以維持正壓並有助於汽提。生物反應器連接至細胞保持裝置(沉降槽)以將細胞從收取流移除並將細胞的沉降團送回生物反應器。
將CSPR調節至穩態目標為0.45mL/細胞/天並維持整個作業持續期間。基於氧氣流量控制計算法藉由將細胞自動從系統移除，穩態細胞濃度目標為20 x 106vc/mL。
取樣以及樣品處理
每天取得來自生物反應器以及收取物流的樣品。細胞濃度、存活率與大小是使用Cedex細胞計數器(Roche Innovatis,Germany)來測量。剩餘葡萄糖及乳糖濃度是使用YSI 2700生化分析儀(YSI Life Sciences,USA)來測量。生物反應器氣體與pH是使用RapidLab 248血液氣體分析儀(Siemens,Germany)來測量。藉由一步驟凝集或顯色分析來分析生物反應器與收取物樣品的rFVIII定量(下述)。
FVIII效力分析(一步驟凝集與顯色)
凝血FVIII：C測試方法是一種一步驟分析，其是基於活化部分凝血酶時間(aPTT)。因子VIII在因子IXa、鈣與磷脂存在下於因子X酵素轉換成因子Xa時扮演一個輔因子。在這個分析中，經稀釋的測試樣品與FVIII缺乏血漿受質及aPTT試劑的混合物一起培育在37℃下。將氯化鈣添加至培育的混合物並開始凝血。血塊形成所費時間(秒)與FVIII：C濃度的對數呈反向關係。未知樣品的活性位準是藉由將不同稀釋度的測試材料的凝血時間與由具有已知活性之標準材料的一系列稀釋度所建構出的曲線來比較而被內推出，且被報導為國際單位/mL(IU/mL)。
顯色效力分析法包括兩個連續步驟，其中顏色強度與樣品中的因子VIII活性成比例。在第一步驟中，於最佳數量的鈣離子及磷脂存在下，因子X被因子IXa與其輔因子(因子VIIIa)活化成因子Xa。存在過量的因子X，使得因子X的活化率僅取決於因子VIII的數量。在第二步驟中，因子Xa水解顯色受質而產生發色團且在405nm下以光度讀取顏色強度。計算未 知品的效力並使用線性回歸統計方法檢核分析的有效性。活性報導為國際單位/mL(IU/mL)。關於因子VIII的顯色與凝集分析的更多詳細說明可以在文獻中找到(參照：Barrowcliffe T.W.et al.,seminars in Thrombosis and Hemostasis,28(3),2002；Lippi G.et al.,Blood Coagulation and Fibrinolysis 2009,20(1),2009)。
此處報導的實驗結果以相對單位來提供。
經超過濾的培養物收取物
將15L發酵的收取液過濾以移除細胞和殘渣，且接而透過交錯流過濾使用100千道耳頓(kDa)截斷值膜濃縮40倍。
UFDF的純化
rFVIII是由經超過濾材料透過連續層析步驟而被純化，連續層析步驟如Boedeker,Seminars in Thrombosis and Hemostasis,27(4)：385-394(2001)中所述包含免疫親和力層析(其是藉由rFVIII結合至固定的單株抗體)以及離子交換層析。
QC分析
為了要分析所生產之rFVIII蛋白質的品質，使用一系列特定方法。FVIII產品的品質是就完整性、醣基化型態的任何潛在變化與宿主細胞不純物來進行評估。
因子VIII完整性是藉由HPLC來分析。亦針對完整性與不純物藉由銀染然後SDS-PAGE以及藉由西方墨點使用FVIII抗體來分析產品。
關於測定汙染物以及不純物，使用特異性免疫分析來分析產品的宿主細胞蛋白質以及衍生自BHK細胞培養物的核酸不純物。
經分離蛋白質的醣基化型態是藉由測定差異性糖組分與唾液酸化程度來進行分析。將數據與內部對照rFVIII蛋白質相比對。
關於實例1-6的結論
這些結果證實，藉由在培養基中引入及/或增加甘露糖及/或鈣的濃度可以達到>30%滴定濃度受益；且滴定濃度受益在連續灌注培養中持續>130天。重要的是，產品品質屬性(包括不純物)或培養物性能都沒有受到更動培養基所影響。就滴定濃度增加所觀察到的影響不能在葡萄糖的情況(例如在DMEM/F12中僅增加葡萄糖濃度而不包括甘露糖)下觀察到。
使用15L灌注生物反應器，將甘露糖濃度從3g/L增加至5g/L可以增進rhFVIII生產力達超過25%。將鈣單獨從~1mM增加至5mM也在生產力方面有幾乎相同的受益。且當甘露糖與鈣都增加時，生產力受益更增進至近乎40%；5g/L甘露糖與5mM鈣的組合在因子VIII比生產力方面產生>30%增進，超過含有3g/L甘露糖與1mM鈣的標準生產培養基。細胞培養物性能與產品品質屬性不會受到這個培養基調配物的改變所影響。對生產力的影響明顯是在培養基轉換後一天內且是可逆轉的。在連續灌注生物反應器細胞培養期間，超過30%的生產力受益從細胞庫解凍起持續超過3個月。
甘露糖與鈣對滴定濃度增進的效用在同時採用兩者時比個別單獨時更高。鈣已知能穩定因子VIII分子。鈣在標準DMEM/F12(1：1)培養基調配物中的濃度僅有~1mM。在培養基調配物中更高濃度的鈣因此可能有助於在製程較早期穩定因子VIII分子，像是當因子VIII被分泌出細胞那麼早之時，而非在收取物已被收集之後。
本文所用段落標題僅是為了組織之用而不應認為以任何方式限制所述請求標的。
儘管已結合各種具體例來說明本教示，不意欲將本教示侷限於此等具體例。相反地，本教示涵括彼等習於技藝所理解的各種替代、修飾與等效。
因此，說明書以及實例被視為說明而非具有限制之意。此外，本文提及的所有論文、書籍、專利申請案及專利案以其整體就所有目的而言併入本文做為參考資料。

Claims (24)

  1. 一種哺乳動物細胞培養基調配物，包含約3.5g/L或更多的甘露糖及範圍約1.5mM至約9.5mM的鈣中至少一者。
  2. 如請求項1之調配物，其中該培養基包含約3.5g/L或更多的甘露糖及少於約1.5mM或多於約9.5mM的鈣。
  3. 如請求項1之調配物，其中該培養基包含少於約3.5g/L的甘露糖及範圍約1.5mM至約9.5mM的鈣。
  4. 如請求項1之調配物，其中該培養基包含範圍約4g/L至約5g/L的甘露糖。
  5. 如請求項2之調配物，其中該培養基包含範圍約4g/L至約5g/L的甘露糖。
  6. 如請求項1之調配物，其中該培養基包含範圍約2mM至約5mM的鈣。
  7. 如請求項3之調配物，其中該培養基包含範圍約2mM至約5mM的鈣。
  8. 如請求項1之調配物，其中該調配物包含呈1：1比例的DMEM/F12，且包括範圍約4g/L至約5g/L的甘露糖及範圍約2mM至約5mM的鈣中至少一者。
  9. 一種在細胞培養物中製造重組蛋白質的方法，包含：提供重組蛋白質表現細胞；以及將該等細胞培養在細胞培養基中，該細胞培養基包括約3.5g/L或更多的甘露糖及範圍約1.5mM至約9.5mM的鈣中至少一者。
  10. 如請求項9之方法，其中該培養基包含約3.5g/L或更多的甘露糖及少於約1.5mM或多於約9.5mM的鈣。
  11. 如請求項9之方法，其中該培養基包含少於約3.5g/L的甘露糖及範圍約1.5mM至約9.5mM的鈣。
  12. 如請求項9之方法，其中該培養基包含範圍約4g/L至約5g/L的甘露糖。
  13. 如請求項10之方法，其中該培養基包含範圍約4g/L至約5g/L的甘露糖。
  14. 如請求項9之方法，其中該培養基包含範圍約2mM至約5mM的鈣。
  15. 如請求項11之方法，其中該培養基包含範圍約2mM至約5mM的鈣。
  16. 如請求項9之方法，其中該等細胞為哺乳動物細胞。
  17. 如請求項16之方法，其中該等哺乳動物細胞選自BHK細胞、CHO細胞、HKB細胞、HEK細胞以及NS0細胞。
  18. 如請求項17之方法，其中該等哺乳動物細胞為BHK細胞。
  19. 如請求項9之方法，其中該等細胞表現凝血路徑重組蛋白質。
  20. 如請求項19之方法，其中該等細胞表現重組人類因子VIII(rhFVIII)或其變體。
  21. 如請求項20之方法，其中該變體因子VIII為遺傳變體。
  22. 如請求項21之方法，其中該遺傳變體為B結構域刪除的FVIII。
  23. 如請求項20之方法，其中該變體因子VIII為聚乙二醇化FVIII。
  24. 如請求項9之方法，其中該等細胞為表現重組因子VIII的BHK細胞，其中該培養基包含呈1：1比例的DMEM/F12，且包括範圍約4g/L至約5g/L的甘露糖及範圍約2mM至約5mM的鈣中至少一者。
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