CN105308174A

CN105308174A - 用于增加的重组蛋白产生的制剂和方法

Info

Publication number: CN105308174A
Application number: CN201480010579.8A
Authority: CN
Inventors: Y.希莫尼; V.默尔勒; V.斯里尼瓦桑; R.马坦吉汉
Original assignee: Bayer Corp
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 2013-02-26
Filing date: 2014-02-25
Publication date: 2016-02-03
Also published as: BR112015020253A2; TW201522634A; HK1220991A1; JP2016508376A; IL240639A0; AU2014223680A1; SG11201506212PA; AR094875A1; UY35343A; MX2015010887A; WO2014134071A1; US20160002592A1; US20180010090A1; PE20152019A1; EA201591558A1; EP2961827A1; CA2902170A1; KR20150121701A

Abstract

公开了增加重组蛋白的产生的制剂和方法以及其他方面。所述制剂和方法涉及在用于培养表达重组蛋白的细胞的细胞培养基制剂中增加甘露糖或钙浓度、或两者。在一些实施方案中，提供了具有约3.5？g/L或更多的甘露糖和约1.5？mM至约9.5？mM范围内的钙中的至少一者的哺乳动物细胞培养基制剂。提供了许多其他方面和/或实施方案。

Description

用于增加的重组蛋白产生的制剂和方法

相关申请

本申请要求2013年2月26日提交的题为“FORMULATIONSANDMETHODSFORINCREASEDRECOMBINANTPROTEINPRODUCTION”(代理人案卷号BHC125022US(BH-023/L))的美国临时专利申请序列号61/769,402的优先权，所述申请在此出于所有目的以其整体通过引用并入本文。

背景

细胞培养系统可用于在包括营养物以促进细胞生长的细胞培养基制剂中产生重组蛋白。实例细胞培养基制剂包括DMEM/F12、RPMI(例如，RPMI1640)、MEM、DMEM、F-12、小鼠ES细胞基础培养基、L-15、IMDM、McCoy氏5A培养基和VeroPlusSFM。

在重组蛋白的生产，包括商业生产中，期望增加重组蛋白生产的水平，同时保持产物质量。

因此，需要增加重组蛋白生产而不降低产物的质量的细胞培养基制剂和方法。

概述

在一些实施方案中，提供哺乳动物细胞培养基制剂。所述制剂具有约3.5g/L或更多的甘露糖和约1.5mM至约9.5mM范围内的钙中的至少一者。

在一个或多个实施方案中，提供在细胞培养物中产生重组蛋白的方法。所述方法包括在细胞培养基中培养表达重组蛋白的细胞，所述细胞培养基具有约3.5g/L或更多的甘露糖和重组蛋白的稳定剂诸如约1.5mM至约9.5mM范围内的钙中的至少一者。在某些实施方案中，所述方法导致重组蛋白的产生的增加。在某些实施方案中，所述方法导致重组蛋白的产生的增加，而不妥协产生的重组蛋白的质量。

根据这些和其他实施方案提供许多其他方面。本文记载本教导的这些和其他特征。

附图

技术人员会理解下文描述的附图是仅用于说明目的。附图不是意在以任何方式限制本教导的范围。

图1是说明根据多个实施方案增加细胞培养系统中的重组蛋白产生的方法的流程图。

图2图示显示根据多个实施方案甘露糖浓度从3克/升(“g/L”)增加至5g/L使1L灌注生物反应器细胞培养中的重组人因子VIII(“rhFVIII”)滴度增加25％。

图3图示显示根据多个实施方案甘露糖浓度从3g/L增加至5g/L使15L灌注生物反应器细胞培养中的rhFVIII滴度增加~37%。

图4图示显示表明根据多个实施方案对滚管(重复分批)实验中5毫摩尔(“mM”)氯化钙的测试条件的rhFVIII滴度(~19%增加)的最高影响的结果。

图5图示显示根据多个实施方案钙浓度从1mM增加至5mM使1L灌注生物反应器细胞培养中的rhFVIII滴度增加~27%。

图6图示显示根据多个实施方案钙浓度从1mM增加至5mM使15L灌注生物反应器细胞培养中的rhFVIII滴度增加~29%。

图7A-B图示显示根据多个实施方案从对照培养基(含有1mM氯化钙和3g/L甘露糖)切换至针对两种组分富集的培养基(含有5mM氯化钙和5g/L甘露糖)使rhFVIII滴度增加29%且效果是可逆的结果。

图8A-B显示根据多个实施方案15L灌注生物反应器活动(A)和所得效价数据(B)的设计。

图9图示显示根据多个实施方案操纵细胞培养制剂的糖含量对rhFVIII的生产水平的结果，显示使用含有甘露糖的培养基和不含甘露糖的培养基的效价的平均值。

多个实施方案的描述

如所述，增加细胞培养基制剂中培养的表达蛋白的细胞的生产水平、而不会不利影响蛋白产物质量是一种挑战。根据本文描述的一个或多个实施方案，通过向细胞培养基提供额外的营养物诸如甘露糖和/或稳定剂诸如钙，可以生成改善的细胞培养基制剂。在一些实施方案中，改善的细胞培养基制剂可以增加使用细胞培养基制剂培养的表达蛋白的细胞的生产水平，而对产物质量具有很少影响或没有可检测的影响。还提供形成和/或使用此类细胞培养基制剂的方法。

实例细胞培养基制剂

如上所述，在多个实施方案中，可以通过增加制剂中甘露糖的浓度和/或重组蛋白的稳定剂诸如钙的浓度或两者而实现细胞培养基制剂中重组蛋白产生的增加。

在一个方面，提供细胞培养基制剂(例如，细胞培养基组合物)，其包括约3.5g/L或更多(或者，在某些实施方案中，约4g/L、约5g/L、约6g/L或约7g/L或更多)的甘露糖和约1.5mM至约9.5mM或更多(或者，在某些实施方案中，以约2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM或约9.5mM或更多)范围内的钙中的至少一者。可以采用其他细胞培养基制剂。

在添加约3.5g/L或更多的甘露糖和约1.5mM至约9.5mM范围内的钙中的至少一者之前，细胞培养基制剂可以是任何细胞培养基制剂。例如，在某些实施方案中，细胞培养基制剂可以包括合适比率诸如1:1的Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基和Ham氏F-12营养混合物(DMEM/F12)，和约5g/L的甘露糖和约5mM的钙中的至少一者。

可以采用其他细胞培养基制剂代替DMEM/F12诸如RPMI(例如，RPMI1640)、MEM、DMEM、F-12、小鼠ES细胞基础培养基、L-15、IMDM、McCoy氏5A培养基和VeroPlusSFM。在某些实施方案中，所述细胞培养基制剂用于培养哺乳动物细胞。

本文提供的实例细胞培养基制剂包括但不限于：

(a)约3.5g/L或更多的甘露糖和小于约1.5mM或大于约9.5mM的钙；

(b)小于约3.5g/L的甘露糖和约1.5mM至约9.5mM范围内的钙；

(c)约4g/L至约5g/L范围内的甘露糖和约1.5mM至约9.5mM范围内的钙中的至少一者；

(d)约5g/L的甘露糖和约1.5mM至约9.5mM范围内的钙中的至少一者；

(e)约4g/L至约5g/L范围内的甘露糖和小于约1.5mM或大于约9.5mM的钙；

(f)约5g/L的甘露糖和小于约1.5mM或大于约9.5mM的钙；

(g)约3.5g/L或更多的甘露糖和约2mM至约5mM范围内的钙中的至少一者；

(h)约3.5g/L或更多的甘露糖和约5mM的钙中的至少一者；

(i)小于约3.5g/L的甘露糖和约2mM至约5mM范围内的钙；

(j)小于约3.5g/L的甘露糖和约5mM的钙；和/或

(k)1:1比率的DMEM/F12，和约5g/L的甘露糖和约5mM的钙中的至少一者。

可以采用其他制剂。

形成/使用细胞培养基制剂的方法

现在将参考下面图1-8描述在细胞培养中产生重组蛋白的方法。

图1说明根据本文提供的某些实施方案在细胞培养中产生重组蛋白的方法100的流程图。参考图1，方法100开始于方框101，其中提供表达重组蛋白的细胞。

实例表达重组蛋白的细胞可以包括，例如，任何真核或原核细胞，包括哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、酵母细胞、细菌细胞等。在某些实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。实例哺乳动物细胞包括幼仓鼠肾(BHK)细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、肾和B细胞的杂交物(HBK)细胞、人胚肾(HEK)细胞和NS0细胞。

表达重组蛋白的细胞可以是产生任何生物蛋白产物的任何细胞。例如，所述细胞可以是经工程改造以表达一种或多种重组蛋白产物的重组细胞；和/或表达抗体分子的重组细胞。

表达重组蛋白的细胞的产物可以是任何蛋白产物，包括重组蛋白产物诸如凝血因子(凝血途径中的蛋白)，包括例如因子VII、因子VIII、因子IX和因子X。例如，表达重组蛋白的细胞可以是表达因子VIII的哺乳动物细胞。

因子VIII可以是因子VIII的变体，诸如遗传变体，其可以通过对rFVIII基因构建体进行遗传变异而生成，导致，例如，B结构域缺失的因子VIII和突变的因子VIII。因子VIII变体包括，例如，表达后修饰的因子VIII的变体，诸如，例如，聚乙二醇化的FVIII和具有共价连接的聚乙二醇(PEG)的FVIII。因子VIII变体也可以包括具有共表达结合元件的融合蛋白。

在某些实施方案中，表达重组蛋白的细胞的重组蛋白产物可以是糖蛋白。在一些实施方案中，重组蛋白是分泌的。可以采用用于形成表达重组蛋白的重组细胞的任何合适的来源和/或方法。

在方框102中，在细胞培养基制剂(即，组合物)中培养表达重组蛋白的细胞，所述细胞培养基制剂(即，组合物)包括约3.5g/L或更多的甘露糖和约1.5mM至约9.5mM范围内的钙中的至少一者。如本文所使用，细胞培养基可以包括组织或细胞培养液，一种或多种组织或细胞培养基，等。

在多个实施方案中，细胞培养基制剂可以是基于Sigma-AldrichFineChemicals(SAFC,Lenexa,Kansas)或LifeTechnologies(GrandIsland,N.Y.)制造的市售DMEM/F12制剂且补充其他补充剂诸如铁、普朗尼克(Pluronic)F-68或胰岛素的培养基组合物，并且可以基本上不含其他蛋白。可以采用其他基础培养基组合物。

可以使用络合剂组氨酸(his)和/或亚氨基二乙酸(IDA)，和/或可以使用有机缓冲剂，诸如MOPS(3-[N-吗啉代]丙磺酸)、TES(N-三[羟甲基]甲基-2-氨基乙磺酸)、BES(N,N-双[2-羟乙基]-2-氨基乙磺酸)和/或TRIZMA(三[羟甲基]氨基乙烷)；所有这些都可以例如获得自SAFC(St.Louis,Mo.)。在一些情况下，组织培养基可以单独或组合补充已知浓度的这些络合剂和/或有机缓冲剂。在一些实施方案中，组织培养液可以含有EDTA，例如，50μM，或另一种合适的金属(例如，铁)螯合剂。可以使用其他组合物、制剂、补充剂、络合剂和/或缓冲剂。

细胞培养基制剂可以包括氨基酸，其可以包括，例如，任何天然存在的氨基酸。

细胞培养基制剂可以包括盐，其可以包括氯化钾、硫酸镁、氯化钠、磷酸钠、氯化镁、硫酸铜、硫酸亚铁、硫酸锌、硝酸铁、二氧化硒、氯化钙和/或适合用于细胞培养基制剂中的其他盐。

细胞培养基制剂可以包括维生素，其可以包括生物素、氯化胆碱、泛酸钙、叶酸、次黄嘌呤、肌醇、烟酰胺、维生素C、吡哆醇、核黄素、硫胺素、胸苷、维生素B-12、吡哆醛、腐胺和/或适合用于细胞培养基制剂中的其他维生素。

细胞培养基制剂可以包括一种或多种不同于上文所列的那些的组分(“其他组分”)，其可以包括葡萄糖、甘露糖、丙酮酸钠、酚红、谷胱甘肽、亚油酸、硫辛酸、乙醇胺、巯基乙醇、正磷酸乙醇胺(orthophosphorylethanolamine)和/或适合用于细胞培养基制剂中的其他组分。

常见的哺乳动物细胞培养基制剂是DMEM/F12。DMEM/F12是Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM)和Ham氏F-12营养混合物的1:1混合物。DMEM/F12培养基可得自许多商业来源，并且经常用于生产重组蛋白诸如rhFVIII。DMEM/F12的完全组分组合物是自由可得的(例如，ATCC目录号30-2006)(表1)。DMEM/F12(1:1)通常含有1.05mM(0.11665g/L)易溶CaCl₂(无水)。D-甘露糖不是DMEM/F12(1:1)配方的组分；D-葡萄糖以约3g/L存在(作为碳水化合物源)。

在某些实施方案中，提供包含DMEM/F12和约3g/L或更少的甘露糖的制剂。例如，与具有DMEM/F12、不含任何甘露糖、但具有4g/L葡萄糖(4g/L总糖)的细胞培养物相比，具有DMEM/F12(具有1g/L的葡萄糖)和3g/L的甘露糖(具有4g/L的总糖)的制剂可以导致细胞培养物中的rhFIII滴度增加约28%。在某些实施方案中，与具有DMEM/F12且具有3g/L甘露糖和1g/L葡萄糖(4g/L总糖)的细胞培养物相比，具有DMEM/F12且具有4g/L甘露糖(4g/L总糖)、但不含任何葡萄糖的制剂可以导致细胞培养物中的rhFIII滴度增加约18%。参见，例如，图9，其图示说明操纵细胞培养制剂的糖含量对rhFVIII的生产水平的结果。

甘露糖是糖单体和葡萄糖的差向异构体。甘露糖参与细胞代谢。其在糖蛋白生物合成过程中翻译后掺入蛋白。连接至糖蛋白的寡糖可以协助新生蛋白的正确折叠和帮助保护成熟蛋白免于蛋白水解(Hebert和Molinari,Physiol.Rev.87:1377-1408(2007))。典型的N-连接寡糖含有甘露糖，以及N-乙酰葡糖胺，且通常具有几个分支，有时具有末端带负电荷的唾液酸残基。该结构修饰是许多糖蛋白(包括FVIII)的重要质量属性，其可以影响分子的生物合成、分泌和稳定性和药代动力学/药效动力学(PK/PD)特性。

尽管真核细胞在其中由甘露糖-6-磷酸异构酶将果糖-6-磷酸转化为甘露糖-6-磷酸的过程中能够将葡萄糖转化为甘露糖，但是，在某些细胞类型中，用于糖蛋白生物合成的大多数甘露糖源自甘露糖，不是葡萄糖(Alton等人,Glycobiology8(3)285-295(1998))。

重组蛋白的稳定剂可以是稳定重组蛋白免于(例如)降解的任何物质。稳定剂的实例包括钙和锰。

钙离子通过稳定FVIII复合物的四级结构而发挥稳定FVIII凝血活性的重要作用(Switzer等人,TheJournalofClinicalInvestigation60:819-828(1977);Mikaelsson等人Blood62(5):1006-1015(1983)).钙和锰已经显示通过结合重链和轻链两者从而调节异二聚体的构象来促进FVIII活性(综述于Fay,BloodRev.18:1-15(2004))。已经表明，需要钙(和/或锰)以促进FVIII的活性构象。

可以使用实施方案制剂和/或实施方案方法采用用于培养细胞的任何合适的细胞培养系统。细胞培养系统可以是哺乳动物细胞培养系统。细胞培养系统可以是生物反应器细胞培养系统，包括灌注生物反应器细胞培养系统。细胞培养系统可以包括小规模培养系统，诸如组织培养瓶或转瓶，和/或大规模细胞培养系统，诸如生物反应器细胞培养系统。实例细胞培养基可以进一步补充血清，包括牛血清、马血清、小牛血清、胎牛血清(fetalcalfserum)和/或胎牛血清(fetalbovineserum)。实例细胞培养基可以进一步补充人血清和/或人血浆蛋白级分。

生物反应器细胞培养系统可以包括：(1)表达重组蛋白的细胞；和(2)选自以下的细胞培养基制剂：(a)包含约3.5g/L或更多的甘露糖和约1.5mM至约9.5mM范围内的钙中的至少一者的制剂；(b)包含约3.5g/L或更多的甘露糖和小于约1.5mM或大于约9.5mM的钙的制剂；(c)包含小于约3.5g/L的甘露糖和约1.5mM至约9.5mM范围内的钙的制剂；(d)包含约4g/L至约5g/L范围内的甘露糖和约1.5mM至约9.5mM范围内的钙中的至少一者的制剂；(e)包含约5g/L的甘露糖和约1.5mM至约9.5mM范围内的钙中的至少一者的制剂；(f)包含约4g/L至约5g/L范围内的甘露糖和小于约1.5mM或大于约9.5mM的钙的制剂；(g)包含约5g/L的甘露糖和小于约1.5mM或大于约9.5mM的钙的制剂；(h)包含约3.5g/L或更多的甘露糖和约2mM至约5mM范围内的钙中的至少一者的制剂；(i)包含约3.5g/L或更多的甘露糖和约5mM的钙中的至少一者的制剂；(j)包含小于约3.5g/L的甘露糖和约2mM至约5mM范围内的钙的制剂；(k)包含小于约3.5g/L的甘露糖和约5mM的钙的制剂；和(l)包含1:1比率的DMEM/F12且包括约5g/L的甘露糖和约5mM的钙中的至少一者的制剂。

在一些实施方案中，通过使用包括约5g/L的甘露糖和约5mM的钙中的至少一者的细胞培养基制剂，增加重组蛋白的产生。在某些实施方案中，增加重组蛋白的产生，而不妥协产生的重组蛋白的质量(例如，当与不含约3.5g/L或更多的甘露糖和约1.5mM至约9.5mM范围内(或以本文所述的这些范围的任何特定点)的钙中的至少一者的相同或基本上相同的细胞培养基相比时)。在某些实施方案中，重组蛋白的产生增加持续长达约130天，或更长时间。

用于产生重组蛋白的实例细胞培养系统和生物反应器细胞培养系统描述于文献中。用于重组因子VIII的生产的实例灌注培养系统描述于文献中，例如题为“ProcessandMediumForMammalianCellCultureUnderLowDissolvedCarbonDioxideConcentration,”的US6,338,964和Boedeker,B.G.D.,SeminarsinThrombosisandHemostasis,27(4),第385-394页中。

上述制剂和方法可以显著增加工厂能力且降低生产成本。例如，在一些实施方案中，已经观察到细胞培养生产率对于rhFVIII增加高达~40%(例如，其中生产率增加持续连续灌注培养的至少3个月)。进一步，根据某些实施方案的方法对于在cGMP监管机构依从的API生产工厂中实现是复杂性和成本相对较低的。例如，在多个实施方案中，不需要遗传操作或改变建立的重组蛋白产物的细胞系；不需要对基础设施或生产工艺进行重大改变；和/或对产品质量没有影响。

本教导的方面可以鉴于以下实施例而进一步理解，所述实施例不应当被理解为以任何方式限制本教导的范围。

实施例

实施例1：增加甘露糖导致细胞培养系统中重组蛋白的产生增加

表达rhFVIII的BHK-21细胞在滚管中培养(Shimoni等人,BioPharmInternational23(8):28-37(2010))，其中改变存在的DMEM/F12培养基组分的浓度。当增加甘露糖水平时，观察到rhFVIII滴度增加(通过测定效价来测定)。

使用1L灌注生物反应器系统进行实验，随后进行15L规模灌注生物反应器研究。结果在1L规模和15L规模之间通常一致。

在1L规模灌注生物反应器中进行的一系列测试实验表明在含有3g/L甘露糖的标准培养基(对照条件)中接种和生长至稳定状态之后的甘露糖增加对滴度的剂量依赖性效果。将细胞各在含有3g/L甘露糖、随后4g/L和5g/L甘露糖的(标准)培养基中(通过切换补料至生物反应器中的培养基)进一步连续培养约10天。在该实验中不改变其他培养基组分。约每天取出样品(处理且冷冻)用于效价测定。当甘露糖从3g/L增加至4g/L时，滴度增加~15%，且当甘露糖进一步增加至5g/L时，滴度增加~25%(即，再增加~10%)(图2)。

来自图2的数据的统计分析表明，甘露糖浓度增加对增加效价/滴度的影响是显著的(P值<0.0001)。

当以15L规模进行实验(使培养从含有3g/L甘露糖的培养基切换至含有5g/L甘露糖的培养基，其中约每天取出样品(处理且冷冻))时，其导致滴度的~37%增加(图3；3g/L甘露糖在X轴上标记为“对照”且5g/L甘露糖在X轴上标记为“甘露糖”)。在两个实验中(以1L和15L规模进行)，统计分析显示，甘露糖增加的影响是统计学显著的。甘露糖对FVIII滴度的影响在培养基切换几天内观察到，且在连续(1L和15L)灌注培养系统中持续。

来自图3的数据的统计分析表明，甘露糖对增加效价/滴度的影响是显著的(P值<0.0012)。

实施例2：增加钙导致细胞培养系统中重组蛋白的产生增加

表达rhFVIII的BHK-21细胞在滚管中培养(Shimoni等人,BioPharmInternational23(8):28-37(2010))。当在基于DMEM/F12的培养基中增加钙水平时，观察到rhFVIII滴度增加(通过测定效价来测定)。

在滚管中进行一系列发现实验，以鉴定用于FVIII滴度增加的钙最佳浓度。在测试的浓度中，5mM氯化钙对FVIII滴度具有最大影响(~19%增加)(图4：在4天实验中在第2、3和4天收集样品(X轴)，其中滴度(效价)在Y轴中作为对照(1mM氯化钙)的％给出)。测试范围为1mM(对照)、2mM、5mM和10mM的氯化钙浓度。从1mM(对照)至2mM的钙增加使FVIII滴度增加~8%，而在5mM滴度则增加~19%。但在10mM，钙对滴度具有负面影响。

当1L灌注生物反应器中生长的细胞从含有1mM氯化钙的培养基(对照培养基)切换至含有5mM氯化钙的培养基时，滴度增加~27%(图5)。将细胞在1L灌注生物反应器中在含有1mM氯化钙的培养基中以稳定状态连续培养约5天，然后切换至含有5mM氯化钙的培养基且在其中再培养~5天。约每天取出样品(处理且冷冻)用于效价测定。

当在15L规模灌注生物反应器中重复类似实验时，滴度在含有5mM钙的培养基中比含有1mM钙的培养基中高~29%(图6：含有5mM氯化钙的培养基在X轴上标记为“Ca”)。将细胞在15L灌注生物反应器中在含有1mM氯化钙的培养基(“对照”)中以稳定状态连续培养约3天，然后切换至含有5mM氯化钙的培养基且在其中培养超过一周。约每天取出样品(处理且冷冻)用于效价测定。

以1L规模和15L规模进行的两个实验因此彼此非常一致，表明一旦培养基从1mM氯化钙切换至5mM氯化钙，FVIII滴度快速增加27-29％。在整个实验的持续时间中持续较高滴度。

在上述两个15L运行结束时收获且通过超滤浓缩材料：使用含有5g/L甘露糖的培养基(图2)，和使用含有5mM钙的培养基(图5)。

来自图6的数据的统计分析表明，钙浓度增加对增加效价/滴度的影响是显著的(p值<0.0176)。

实施例3：通过增加甘露糖或钙浓度增加重组蛋白的产生没有妥协蛋白质量

然后处理来自实施例1-2的冷冻的超滤培养收获物(15L生物反应器，用各培养基类型的约两周长活动：A.5mM钙；B.5g/L甘露糖)，且如先前所述(Boedeker,SeminarsinThrombosisandHemostasis27(4):385-394(2001))在几个步骤中纯化FVIII，最后评价多种产品质量属性。从含有5g/L甘露糖的培养基和含有5mM钙的培养基两者纯化的rhFVIII材料通过多种产品质量属性，包括由基于HPLC-SEC和SDS-PAGE/蛋白质印迹的方法评价的纯度和完整性、效价、比活性、多种宿主-细胞杂质(蛋白和核酸)和糖基化模式，表明培养基中的甘露糖和钙浓度的变化没有影响FVIII产物。

实施例4：增加甘露糖和钙导致细胞培养系统中重组蛋白的产生增加

图7A-7B显示，针对(5mM)钙和(5g/L)甘露糖两者富集的基于DMEM/F12的培养基比单独各组分对FVIII滴度具有较高的有益效果。还显示，滴度变化在一天内发生，并且是可逆的，因为一旦培养物返回至标准培养基(含有1mM氯化钙和3g/L甘露糖)，滴度的~29%增加反转至基线。

图7A-B图示显示从对照培养基(含有1mM氯化钙和3g/L甘露糖)切换至针对两种组分富集的培养基(含有5mM氯化钙和5g/L甘露糖)使rhFVIII滴度增加29%且效果是可逆的结果。在15L灌注生物反应器细胞培养中的标准培养基(1mM钙和3g/L甘露糖；对照-1)中连续培养的细胞(其被切换至含有5mM钙和5g/L甘露糖的培养基约9天，然后回至标准培养基(对照-2))表明快速(一天内)且可逆的rhFVIII滴度变化。条件为切换至/切换自(分别地)5mM氯化钙和5g/L甘露糖(“Ca+甘露糖”)测试培养基之前的“对照-1”和之后的“对照-2”。约每天取出样品(处理且冷冻)用于效价测定。小图A，表示为“条件”。

来自图7(A)和(B)的数据的统计分析表明，甘露糖和钙(一起)的浓度增加对增加效价/滴度的影响是显著的。来自图7(A)的数据的统计分析产生<0.05的p值。来自图7(B)的数据的统计分析产生<0.0102的p值。

实施例5：通过增加甘露糖和钙浓度增加重组蛋白的产生没有妥协蛋白质量

为了验证所述效果在灌注培养中持续130天的活动中持续，两个生物反应器并排运行：一个培养在含有5g/L甘露糖和5mM钙的测试培养基中，一个培养在含有3g/L甘露糖和1mM钙的对照培养基中(图8A)。的确，与对照相比，在测试生物反应器中的超过130天的灌注活动中持续>30%滴度益处(图8B)。

通过从实施例5收集收获材料且通过超滤浓缩它，在三个时间点对于测试(图8A，第3、5、7点)和对照(图8A，第2、4、6点)培养物并排测试产品质量。在从对照切换至测试培养基之前，从测试生物反应器收集早期、时间点1(图8A，第1点)。纯化超滤的培养收获物，且评价FVIII质量。使用测试培养基生成的FVIII已经满足所有质量度量，包括纯度和完整性、效价、比活性、多种宿主-细胞杂质和糖基化模式；进一步，从测试培养基中的培养物生成的FVIII材料与从对照培养基中生长的培养物生成的FVIII材料是相当的，表明滴度的>30%持续增加不影响产品质量。细胞培养生长属性在两个生物反应器(测试和对照)中也是相当的。过程控制设定点(pH、溶解氧、pCO₂和温度)、细胞属性(生物反应器细胞密度、生物反应器活力)、代谢物(葡萄糖和乳酸的残留和消耗速率)和比生产率在测试和对照生物反应器之间都是相当的。

实施例6：用于实施例1-5的材料和方法

滚管实验

如先前所述(Shimoni等人,BioPharmInternational,23(8):28-37(2010))，在具有通气螺丝帽的50mL培养管(Cultiflask50,Sartorius,BohemiaNY)中实施小规模培养基测试实验。以3x10⁵个细胞/mL的初始细胞密度用14mL测试培养基填充试管。在滚管平台上以30rpm以滚动运动混合管，所述滚管平台置于湿润、温度和CO₂控制的培养箱中。将所述管孵育四天，且在第2、3和4天取出1.3mL的样品，用于代谢物分析。在第3和4天取出额外样品，用于用凝血或生色测定进行效价测试。

1L灌注生物反应器细胞培养

对于比例扩大，将表达rhFVIII的BHK-21细胞使用生产培养基(基于DMEM/F12的培养基)接种在摇瓶中。摇瓶在35.5℃和30rpm下孵育，并且连续地分瓶(split)，直到出现期望的细胞量。

将来自比例扩大的细胞在DASGIP控制站上以9x10⁶vc/mL接种入以1L的工作体积的1.5LDASGIP(Eppendorf,Germany)容器中。通过控制培养基泵的液面传感器使工作体积保持不变。

通过取决于测量的细胞密度调整收获泵在稳定状态以0.45nL/细胞/天的目标细胞特异性灌注速率(“CSPR”)使用细胞保留装置(沉降器)建立灌注。使用站式恒温器(stationthermostat)将温度控制在35.5℃，且将沉降器温度控制在20-23℃。通过浸没硅胶管提供通气。响应于渐降的溶解氧从生物反应器排出细胞，以便维持25x10⁶vc/mL的目标细胞密度。补充通气通过5L/小时的顶部空间通气(headspaceaeration)提供。根据需要，培养物pH通过添加的碳酸钠溶液控制在6.85的目标。

15L灌注生物反应器细胞培养

在15L生物反应器(ApplikonInc.,FosterCity,CA)中以12L的工作体积进行细胞培养。以≥1x10⁶个细胞/mL的接种密度接种生物反应器。在整个运行中维持可控工艺参数的标准设定点；pH=6.8，温度=35.5℃，溶解氧DO=50%空气饱和度。将用于溶解氧和pH控制的混合气体通过硅胶膜供给至培养物，且经由手动转子流量计控制顶部空间以维持正压力且帮助剥离(stripping)。将生物反应器连接至细胞保留装置(沉降器)以便从收获流移取细胞，并且将细胞的沉降团块(mass)返回至生物反应器。

将CSPR调节至0.45nL/细胞/天的稳态目标且维持运行的持续时间。通过基于氧气流控制算法从系统中自动排出细胞而使稳态细胞浓度靶定在20x10⁶vc/mL。

取样和样品处理

每天从生物反应器和收获流取样品。用Cedex细胞计数器(RocheInnovatis,Germany)测量细胞浓度、活力和大小。用YSI2700生化分析仪(YSILifeSciences,USA)测量残余葡萄糖和乳酸浓度。用RapidLab248血液气体分析仪(Siemens,Germany)测量生物反应器气体和pH。通过一级凝血(one-stagecoagulation)或生色测定(以下描述)分析生物反应器和收获样品的rFVIII定量。

FVIII效价测定(一级凝血和生色)

凝血FVIII:C测试方法是基于活化部分凝血活酶时间(aPTT)的一级测定法。因子VIII在因子X至Xa的酶促转化中充当因子IXa、钙和磷脂存在的情况下的辅因子。在该测定中，将稀释的测试样品与FVIII缺乏的血浆底物和aPTT试剂的混合物在37℃孵育。将氯化钙添加至孵育的混合物且起始凝血。凝块形成花费的时间(秒)和FVIII:C的浓度的对数之间存在反比关系。通过将测试材料的多种稀释物的凝固时间与从一系列已知活性的标准材料的稀释物构建的曲线进行比较来内插未知样品的活性水平，并且其以国际单位/mL(IU/mL)报告。

生色效价测定方法包括两个连续的步骤，其中颜色强度与样品中因子VIII活性成比例。在第一步骤中，在钙离子和磷脂最优量的存在下，通过因子IXa和它的辅因子(因子VIIIa)，将因子X活化为因子Xa。存在过量的因子X，使得因子X的活化速率仅取决于因子VIII的量。在第二步骤中，因子Xa水解生色底物以产生生色团，并且在405nm光度测定读取颜色强度。使用线性回归统计方法计算未知物的效价，并且检查测定的可靠性。活性以国际单位/mL(IU/mL)报道。关于因子VIII的生色和凝血测定的进一步细节可见于文献(用于参考，参见：BarrowcliffeT.W.等人,seminarsinThrombosisandHemostasis,28(3),2002;LippiG.等人,BloodCoagulationandFibrinolysis2009,20(1),2009)。

此处报道的实验的结果以相对单位给出。

超滤的培养收获物

过滤15L发酵的收获液以去除细胞和碎片，然后通过使用100千道尔顿(kDa)截止膜的交叉流过滤浓缩40倍。

纯化至UFDF

通过一系列层析步骤从超滤材料纯化rFVIII，所述层析步骤包括通过使rFVIII结合至固定的单克隆抗体的免疫亲和层析和离子交换层析，如Boedeker,SeminarsinThrombosisandHemostasis,27(4):385-394(2001)中所述。

QC测定

为了分析产生的rFVIII蛋白的质量，应用一系列特定方法。针对完整性、糖基化模式和宿主细胞杂质的任何潜在变化评价FVIII产物的质量。

通过HPLC分析因子VIII完整性。还通过SDS-PAGE后的银染色和通过使用抗FVIII抗体的蛋白质印迹分析产物的完整性和杂质。

为了测定污染物和杂质，使用特异性免疫测定分析产物的宿主细胞蛋白，且还分析产物的源自BHK细胞培养物的核酸杂质。

通过测定不同的糖组分和唾液酸化的程度分析分离的蛋白的糖基化模式。将数据与内部(in-house)的对照rFVIII蛋白进行比较。

关于实施例1-6的结束语

这些结果表明，可能通过在培养基中引入和/或增加甘露糖和/或钙浓度实现>30%的滴度增益；滴度增益在连续灌注培养中持续>130天。重要地，产物质量属性(包括杂质)或培养性能都不受培养基改变的影响。用葡萄糖没有重现观察到的对滴度增加的影响，例如，当仅仅增加不包括甘露糖的DMEM/F12中葡萄糖的浓度时。

使用15L灌注生物反应器，将甘露糖浓度从3g/L增加至5g/L可以使rhFVIII生产率增加超过25％。独立地，钙从~1mM增加至5mM也导致生产率的几乎相同的增益。并且当甘露糖和钙两者增加时，生产率增益进一步增加至接近40％；与含有3g/L甘露糖和1mM钙的标准生产培养基相比，5g/L甘露糖和5mM钙的组合使得因子VIII比生产率增加>30%。细胞培养性能和产品质量属性不受这种培养基制剂变化的影响。对生产率的影响在培养基切换后约一天内是明显的，并且是可逆的。在连续灌注生物反应器细胞培养过程中，超过30％的生产率增益从细胞库解冻起持续超过3个月。

甘露糖和钙对滴度增加的影响当采用两者而非单独采用每一种时更高。已知钙稳定因子VIII分子。标准DMEM/F12(1:1)培养基制剂中钙的浓度为仅~1mM。培养基制剂中钙的较高水平因此可以帮助在过程中较早稳定因子VIII分子–早在当因子VIII被分泌到细胞之外时，而不是已经收集收获物之后。

表1

如ATCC目录中所述的DMEM:F-12(1:1)培养基制剂

ATCC目录号30-2006

无机盐(g/升)

CaCl₂(无水)0.11665

CuSO₄(无水)0.0000008

Fe(NO₃)₃.9H₂O0.00005

FeSO_4.7H₂O0.000417

MgSO₄(无水)0.08495

KCl0.3118

NaHC0₃1.20000

NaC17.00000

Na₂HPO₄(无水)0.07100

NaH₂PO₄.H₂O0.06250

ZnSO₄.7H₂O0.000432

氨基酸(g/升)

L-丙氨酸0.00445

L-精氨酸.HCl0.14750

L-天冬酰胺.H₂O0.00750

L-天冬氨酸0.00665

L-胱氨酸.HCl.H₂O0.01756

L-胱氨酸.2HCl0.03129

L-谷氨酸0.00735

L-谷氨酰胺0.36510

甘氨酸0.01875

L-组氨酸.HCl.H₂O0.03148

L-异亮氨酸0.05437

L-亮氨酸0.05895

L-赖氨酸-HCl0.09135

L-甲硫氨酸0.01724

L-苯丙氨酸0.03548

L-脯氨酸0.01725

L-丝氨酸0.02625

L-苏氨酸0.05355

L-色氨酸0.00902

L-酪氨酸.2Na.2H₂O0.05582

L-缬氨酸0.05285

维生素(g/升)

D-生物素0.0000036565

氯化胆碱0.00898

叶酸0.00265

肌醇0.01261

烟酰胺0.00202

D-泛酸0.00224

(半钙(hemicalcium))

吡哆醇·HCl0.00203

核黄素0.00022

硫胺素·HCl0.00217

维生素B-120.00068

其他(g/升)

D-葡萄糖3.15100

HEPES3.57480

次黄嘌呤0.00239

亚油酸0.000044

酚红，

钠盐0.00810

腐胺·2HCl0.00008

丙酮酸·Na0.05500

DL-硫辛酸0.000105

胸苷0.000365。

本文所用的部分标题(sectionheadings)仅为组织性目的，而不应理解为以任何方式限制所描述的主题。

虽然本教导结合多种实施方案进行了描述，但不旨在本教导受限于此类实施方案。相反，本教导涵盖多种替代方案、修饰、和等同方案，如本领域技术人员将理解的。

因此，应当在说明性而不是限制性意义上考虑本说明书和实施例。此外，本文引用的所有论文、书籍、专利申请和专利出于所有目的以其整体通过引用并入本文。

Claims

1.哺乳动物细胞培养基制剂，其包含约3.5g/L或更多的甘露糖和约1.5mM至约9.5mM范围内的钙中的至少一者。

2.权利要求1的制剂，其中所述培养基包含约3.5g/L或更多的甘露糖和小于约1.5mM或大于约9.5mM的钙。

3.权利要求1的制剂，其中所述培养基包含小于约3.5g/L的甘露糖和约1.5mM至约9.5mM范围内的钙。

4.权利要求1的制剂，其中所述培养基包含约4g/L至约5g/L范围内的甘露糖。

5.权利要求2的制剂，其中所述培养基包含约4g/L至约5g/L范围内的甘露糖。

6.权利要求1的制剂，其中所述培养基包含约2mM至约5mM范围内的钙。

7.权利要求3的制剂，其中所述培养基包含约2mM至约5mM范围内的钙。

8.权利要求1的制剂，其中所述制剂包含1:1比率的DMEM/F12且包括约4g/L至约5g/L范围内的甘露糖和约2mM至约5mM范围内的钙中的至少一者。

9.在细胞培养物中产生重组蛋白的方法，其包括：

提供表达重组蛋白的细胞；和

在细胞培养基中培养所述细胞，所述细胞培养基包括约3.5g/L或更多的甘露糖和约1.5mM至约9.5mM范围内的钙中的至少一者。

10.权利要求9的方法，其中所述培养基包含约3.5g/L或更多的甘露糖和小于约1.5mM或大于约9.5mM的钙。

11.权利要求9的方法，其中所述培养基包含小于约3.5g/L的甘露糖和约1.5mM至约9.5mM范围内的钙。

12.权利要求9的方法，其中所述培养基包含约4g/L至约5g/L范围内的甘露糖。

13.权利要求10的方法，其中所述培养基包含约4g/L至约5g/L范围内的甘露糖。

14.权利要求9的方法，其中所述培养基包含约2mM至约5mM范围内的钙。

15.权利要求11的方法，其中所述培养基包含约2mM至约5mM范围内的钙。

16.权利要求9的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。

17.权利要求16的方法，其中所述哺乳动物细胞选自BHK细胞、CHO细胞、HKB细胞、HEK细胞和NS0细胞。

18.权利要求17的方法，其中所述哺乳动物细胞是BHK细胞。

19.权利要求9的方法，其中所述细胞表达凝血途径重组蛋白。

20.权利要求19的方法，其中所述细胞表达重组人因子VIII(rhFVIII)、或其变体。

21.权利要求20的方法，其中所述变体因子VIII是遗传变体。

22.权利要求21的方法，其中所述遗传变体是B结构域缺失的FVIII。

23.权利要求20的方法，其中所述变体因子VIII是聚乙二醇化的FVIII。

24.权利要求9的方法，其中所述细胞是表达重组因子VIII的BHK细胞，其中所述培养基包含1:1比率的DMEM/F12且包括约4g/L至约5g/L范围内的甘露糖和约2mM至约5mM范围内的钙中的至少一者。