TW201313689A

TW201313689A - Ｎｅｄｄ８－活化酵素之抑制劑

Info

Publication number: TW201313689A
Application number: TW101130884A
Authority: TW
Inventors: Ashley Sue Mccarron; Todd B Sells; Matthew Stirling; Stephen G Stroud
Original assignee: Millennium Pharm Inc
Priority date: 2011-08-24
Filing date: 2012-08-24
Publication date: 2013-04-01
Also published as: CO6900148A2; HK1199252A1; TN2014000080A1; US20130150388A1; WO2013028832A3; IL231069B; EP3323414A1; UY34292A; CR20140128A; US20180290983A1; CN103889988A; UA114894C2; BR112014004239A2; MA35439B1; CL2014000441A1; CA2846231A1; NZ622220A; KR20140054288A; EP2748168A4; PH12014500419A1

Abstract

本發明揭示作為Nedd8-活化酵素(NAE)之抑制劑之化學實體，即化合物胺磺酸{(1S,2S,4R)-4-[(6-{[(1R,2S)-5-氯-2-甲氧基-2,3-二氫-1H-茚-1-基]胺基}嘧啶-4-基)氧基]-2-羥基環戊基}甲酯及其醫藥上可接受之鹽；其固態形式；及其前藥。本發明亦揭示使用該等化學實體治療諸如癌症等病症之方法。

Description

NEDD8-活化酵素之抑制劑

本發明係關於治療各種病症、特定而言細胞增殖之病症(包括癌症)及發炎性病症之化合物、組合物及方法。特定而言，本發明提供抑制NEDD8-活化酵素之活性之化合物。

由類泛素分子(ub1)達成之蛋白質轉譯後修飾在細胞內係重要調控過程，在控制包括細胞分裂、細胞信號傳導及免疫反應之許多生物學過程中起關鍵作用。ub1係小蛋白質，其經由與ub1之C端甘胺酸之異肽連接以共價方式附接至靶蛋白質上之離胺酸。類泛素分子改變靶蛋白質之分子表面，並可影響靶之諸如蛋白質-蛋白質相互作用、酵素活性、穩定性及細胞定位等性質。

泛素及其他ub1係由特異性E1酵素活化，該特異性E1酵素催化具有ub1之C端甘胺酸之醯基-腺苷酸中間物之形成。然後藉助形成硫酯鍵中間物將經活化ub1分子轉移至E1酵素內之催化半胱胺酸殘基。E1-ub1中間物及E2締合，從而導致硫酯交換，其中將ub1轉移至E2之活性位點半胱胺酸。然後直接地或結合E3連接酶將ub1偶聯至靶蛋白質，此係藉助與靶蛋白質中離胺酸側鏈之胺基形成異肽鍵來達成。

ub1修飾之生物學後果取決於討論中之靶。泛素係ub1之最佳特徵，且藉由泛素化修飾之後果係多泛素化蛋白質被 26S蛋白體酶降解。藉助酵素級聯將泛素偶聯至其靶蛋白質，該藉助酵素涉及其特異性E1活化酵素Ubal(泛素活化酵素，UAE)(來自E2之家族之偶聯酵素)及來自E3之RING或HECT類別之泛素連接酶。參見Huang等人，Oncogene 23：1958-71(2004)。靶特異性係藉由E2及E3蛋白質之特定組合來控制，其中目前已知>40種E2及>100種E3。除泛素以外，有至少10種類泛素蛋白質，據信每一者係藉由特異性E1活化酵素來活化並藉助類似但不同之下游偶聯途徑來處理。已鑑別其E1活化酵素之其他ub1包括Nedd8(APPBP1-Uba3)、ISG15(UBE1L)及SUMO家族(Aos1-Uba2)。

藉由異源二聚體Nedd8-活化酵素(APPBP1-Uba3)(NAE)來活化ub1 Nedd8，並將其轉移至單一E2(Ubc12)，最後使得連接至cullin蛋白質。nedd分子接合化之功能係泛素化中所涉及之基於cullin之泛素連接酶之活化且因而許多細胞週期蛋白質及細胞信號傳導蛋白質(包括p27及I-κB)之周轉。參見Pan等人，Oncogene.23：1985-97(2004)。藉由異源二聚體sumo活化酵素(Aos1-Uba2)(SAE)來活化ub1 SUMO，並將其轉移至單一E2(Ubc9)，接著與多種E3連接酶配位，最後使得靶蛋白質sumo化。Sumo修飾可影響靶蛋白質之細胞定位，且經SUMO家族成員修飾之蛋白質在核轉運、信號轉導及壓力反應中涉及。參見Seeler及Dejean,Nat Rev Mol Cell Biol.4：690-9,(2003)。sumo化之功能包括活化轉錄調控中所涉及之細胞信號傳導途徑(例如，細胞因子、WNT、生長因子及類固醇激素信號傳導)；以及基因組完整性(例如，DNA複製、對DNA損害之反應、重組及修復)之控制中所涉及之途徑。參見Muller等人，Oncogene.23：1998-2006,(2004)。有其他ub1(例如，ISG15、FAT10、Apg12p)之生物學功能仍在研究中。

經由E1活化酵素活性調控之尤為重要之途徑係泛素-蛋白體酶途徑(UPP)。如上文所論述，酵素UAE及NAE在泛素化級聯中之兩個不同步驟調控UPP。UAE在級聯之第一步驟中活化泛素，而NAE經由活化Nedd8為活化基於cullin之連接酶負責，該基於cullin之連接酶又係泛素至某些靶蛋白質之最終轉移所需要的。功能UPP途徑係正常細胞維持所需要的。UPP在轉錄、細胞週期進行及凋亡中所涉及之許多關鍵調控蛋白質之周轉中起一定作用，該等過程全部在疾病狀態(包括腫瘤細胞)中甚為重要。參見例如，King等人，Science 274：1652-1659(1996)；Vorhees等人，Clin.Cancer Res.,9：6316-6325(2003)；及Adams等人，Nat.Rev.Cancer,4：349-360(2004)。增殖細胞對UPP之抑制尤其敏感。參見Drexler,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 94：855-860(1977)。UPP途徑在腫瘤形成中之作用已使得研究作為潛在抗癌療法之蛋白體酶抑制。例如，藉由VELCADE^®(bortezomib)抑制26S蛋白體酶來調節UPP途徑已證明在某些癌症中為有效治療，且批准用於治療已接受至少一種先前療法之多發性骨髓瘤及套膜細胞淋巴瘤患者。含量受在NAE及UAE活性下游之基於cullin之泛素連接酶控制的蛋白質實例包括CDK抑制劑p27^Kip1及NFκB、 IκB之抑制劑。參見Podust等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,97：4579-4584(2000)及Read等人，Mol.Cell Biol.,20：2326-2333(2000)。預期抑制p27之降解阻斷通過細胞週期之G1及S期之細胞進行。干擾IκB之降解應防止NF-κB之核定位、與惡性表現型有關之各種NF-κB-依賴性基因之轉錄及對標準細胞毒性療法之抗性。另外，NF-κB在許多促發炎性介質之表現中起關鍵作用，此證明該等抑制劑在發炎性疾病中之作用。此外，已證明抑制UPP為其他治療法之有效靶，例如發炎性病症，包括(例如)風濕性關節炎、氣喘、多發性硬化症、牛皮蘚及再灌注損傷；神經退化病症，包括(例如)帕金森氏病(Parkinson's disease)、阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)、三連體重複病症；神經性病變疼痛；局部缺血性病症，例如，中風、梗塞、腎病症；及惡病質。參見例如Elliott及Ross,Am.J.Clin.Pathol.,116：637-46(2001)；Elliott等人，J.Mol.Med.,81：235-45(2003)；Tarlac及Storey,J.Neurosci.Res.74：406-416(2003)；Mori等人，Neuropath.Appl.Neurobiol.,31：53-61(2005)；Manning,Curr.Pain Headache Rep.,8：192-8(2004)；Dawson及Dawson,Science,302：819-822(2003)；Kukan,J.Physiol.Pharmacol.,55：3-15(2004)；Wojcik及DiNapoli,Stroke,35：1506-18(2004)；Lazarus等人，Am J Physiol.,27：E332-41(1999)。

靶向E1活化酵素提供干擾各種對於維持細胞分裂及細胞信號傳導之完整性而言甚為重要之生化途徑之唯一機會。 E1活化酵素在ub1偶聯途徑之第一步驟起作用；因此，抑制E1活化酵素將特異性調節ub1修飾之下游生物學後果。如此，抑制該等活化酵素及由此抑制ub1-偶聯之下游效應代表干擾細胞分裂、細胞信號傳導及細胞生理學中對於疾病機制而言甚為重要之若干態樣之完整性的方法。因此，諸如UAE、NAE及SAE等E1酵素作為不同細胞功能之調控劑係鑑別治療疾病及病症之新穎方法之潛在重要治療靶。

美國專利申請案第11/346,469號(2006年2月2日申請，公開案第US 2006/0189636號)及國際專利申請案第PCT/US06/04637號(2006年2月2日申請，公開案第WO 2006/084281號)(共同地，「Critchley等人」)報導下式之各種E1酵素抑制劑：

該等申請案未報導為本申請案之標的物之化學實體。

美國專利申請案第11/700,614號(2007年1月31日申請，公開案第US 2007/0191293號)及國際專利申請案第PCT/US07/02560號(2007年1月31日申請，公開案第WO 2007/092213號)(共同地，「Langston等人」)報導下式之各種E1酵素抑制劑：

該等申請案未報導為本申請案之標的物之化學實體。

美國專利申請案第11/890,338號(2007年8月6日申請，公開案第US 2008/0051404號)及國際專利申請案第PCT/US07/17463號(2007年8月6日申請，公開案第WO 2008/019124號)(共同地，「Claiborne等人」)報導下式之各種E1酵素抑制劑：，其中：環A係6員含氮雜芳基環，視情況稠合至5-或6員芳基、雜芳基、環脂族或雜環；且W係-CH₂-、-CHF-、-CF₂-、-CH(R¹)-、-CF(R¹)-、-NH-、-N(R¹)-、-O-、-S-或-NHC(O)-。

該等申請案未報導為本申請案之標的物之化學實體。

同時，E1活化酵素之抑制劑尚未經政府衛生局(government health authority)批准用作治療。業內仍存在對諸如NAE等E1活化酵素之抑制劑之需求。

在一態樣中，本發明係關於化學實體，該化學實體係化合物胺磺酸{(1S,2S,4R)-4-[(6-{[(1R,2S)-5-氯-2-甲氧基-2,3-二氫-1H-茚-1-基]胺基}嘧啶-4-基)氧基]-2-羥基環戊基}甲酯(I-216)及其醫藥上可接受之鹽及其前藥。

在一態樣中，本發明係關於包含化學實體及一或多種醫藥上可接受之載劑之組合物，該化學實體係化合物胺磺酸{(1S,2S,4R)-4-[(6-{[(1R,2S)-5-氯-2-甲氧基-2,3-二氫-1H-茚-1-基]胺基}嘧啶-4-基)氧基]-2-羥基環戊基}甲酯(I-216)或其醫藥上可接受之鹽或其前藥。

在一態樣中，本發明係關於化合物胺磺酸{(1S,2S,4R)-4-[(6-{[(1R,2S)-5-氯-2-甲氧基-2,3-二氫-1H-茚-1-基]胺基}嘧啶-4-基)氧基]-2-羥基環戊基}甲酯(I-216)或其醫藥上可接受之鹽的固態形式。

在一態樣中，本發明係關於治療癌症之方法，該方法包含向需要該治療之患者投與為化合物胺磺酸{(1S,2S,4R)-4-[(6-{[(1R,2S)-5-氯-2-甲氧基-2,3-二氫-1H-茚-1-基]胺基}嘧啶-4-基)氧基]-2-羥基環戊基}甲酯(I-216)或其醫藥上可接受之鹽或其前藥之化學實體。

提供有效作為Nedd8-活化酵素(NAE)之抑制劑之化學實體。化學實體係用於抑制活體外及活體內NAE活性，且係用於治療細胞增殖之病症(特定而言癌症)及與NAE活性有關之其他病症。化學實體係化合物胺磺酸{(1S,2S,4R)-4-[(6-{[(1R,2S)-5-氯-2-甲氧基-2,3-二氫-1H-茚-1-基]胺基}嘧啶-4-基)氧基]-2-羥基環戊基}甲酯(本文稱為「I-216」)：及非共價方式締合之分子實體。因此，包含化合物I-216之化學實體包括(例如)游離化合物I-216、I-216之醫藥上可接受之鹽、I-216之醫藥上可接受之溶劑合物及I-216之醫藥上可接受之鹽的醫藥上可接受之溶劑合物。在一些實施例中，化學實體係游離化合物I-216或其醫藥上可接受之鹽。在一些實施例中，化學實體係I-216之醫藥上可接受之鹽。在一些實施例中，化學實體係游離化合物I-216或其醫藥上可接受之溶劑合物。在一些實施例中，化學實體係I-216之醫藥上可接受之鹽的醫藥上可接受之溶劑合物。

Claiborne等人報導E1酵素(包括NAE)之各種抑制劑。例如，Claiborne等人報導下表1中之化合物在NAE分析中呈現小於或等於500 nM之IC₅₀值(Claiborne實例137)。

此外，Claiborne等人報導下表2中之化合物在此NAE分析中呈現大於500 nM且小於10 μM之IC₅₀值(Claiborne實例137)。

Claiborne等人亦報導下表3中之化合物在此NAE分析中呈現大於10 μM之IC₅₀值(Claiborne實例137)。

Claiborne等人亦報導實例137中之sumo活化酵素(SAE)及泛素活化酵素(UAE)HTRF分析。然而，未報導IC₅₀值。

如圖中所顯示，以10 mg/kg投與之I-216之血漿AUC(圖1)與針對以30 mg/kg投與之I-115所觀測者(圖2)相當，且大約為針對以30 mg/kg投與之I-216所觀測到之AUC的一半(圖3)。因此，預期化合物I-216係比I-115強效2至3倍之NAE之抑制劑。

本文所用術語「約(about)」意指大約(approximately)、在…的附近(in the region of)、概略地(roughly)或左右(around)。當術語「約」與數值範圍連用時，其藉由將邊界延伸至高於及低於所述數值來限定此範圍。除非另有說明，否則本文使用術語「約」將數值限定為所述數值向上及向下變動10%。

除非另有說明，否則術語「包括」(「include」及「including」及諸如此類)意欲為非限制性的。例如，除非另有說明，否則「包括」意指包括但不限於。

在本文所述之化合物中，若定義相對立體化學，則化合物之非鏡像異構體純度較佳為至少80%，更佳至少90%，仍更佳至少95%且最佳至少99%。本文所用術語「非鏡像異構體純度」係指具有所述相對立體化學之化合物之量，以佔所存在之所有非鏡像異構體之總量之百分比表示。

較佳，化合物之鏡像異構體純度係至少80%，更佳至少90%，仍更佳至少95%且最佳至少99%。本文所用術語「鏡像異構體純度」係指具有所述絕對立體化學之化合物之量，以佔所述化合物及其鏡像異構體之總量之百分比表示。

測定非鏡像異構體及鏡像異構體純度之方法為業內所熟知。非鏡像異構體純度可藉由任一能夠定量區分化合物及其非鏡像異構體之分析方法來測定。適宜分析方法之實例包括(但不限於)核磁共振光譜法(NMR)、氣相層析法(GC)及高效液相層析法(HPLC)。類似地，鏡像異構體純度可藉由任一能夠定量區分化合物及其鏡像異構體之分析方法來測定。適宜分析方法之實例包括(但不限於)GC或HPLC，使用對掌性管柱填充材料進行。若先利用富集光學異構性之衍生劑(例如，Mosher酸)衍生化，則亦可藉由NMR來區分鏡像異構體。

本文所用「結晶」係指固體中構成原子、分子或離子以具有高度規則化學結構之通常有序、重複的三維圖案堆疊。特定而言，結晶鹽可呈一或多種結晶形式產生。出於本申請案之目的，術語「結晶形式」及「多晶型」為同義字；該等術語區分具有不同性質(例如，不同XRPD圖案，不同DSC掃描結果)之晶體。假多晶型通常係材料之不同溶劑合物，且因此其性質彼此不同。因此，每一不同多晶型及假多晶型在本文中視為不同結晶形式。

「實質上結晶」係指至少特定重量百分數結晶之鹽。特定重量百分比包括50%、60%、70%、75%、80%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%及99.9%。在一些實施例中，實質上結晶係指至少70%結晶之鹽。在一些實施例中，實質上結晶係指至少80%結晶之鹽。在一些實施例中，實質上結晶係指至少85%結晶之鹽。在一些實施例中，實質上結晶係指至少90%結晶之鹽。在一些實施例中，實質上結晶係指至少95%結晶之鹽。

術語「溶劑合物或溶劑化的」意指本發明化合物與一或多個溶劑分子之物理締合。此物理締合包括氫鍵結。在某些情況下，溶劑合物能夠分離，例如當將一或多個溶劑分子納入結晶固體之晶格中時。「溶劑合物」涵蓋溶液相及可分離之溶劑合物二者。代表性溶劑合物包括(例如)水合物、乙醇合物及甲醇合物。

術語「水合物」係指其中溶劑分子係以經界定化學計量量存在之H₂O之溶劑合物，且包括(例如)半水合物、單水合物、二水合物及三水合物。

術語「混合物」係指混合物之合併組份，無論組合之相態為何(例如，液體或液體/結晶)。

術語「引晶」係指將結晶材料添加至溶液或混合物中以起始結晶。

本發明之一些實施例係關於I-216鹽酸鹽，其中至少特定重量百分比之鹽酸鹽為結晶的。在一些實施例中，該鹽酸鹽實質上為結晶的。結晶或實質上結晶鹽酸鹽之實例包括結晶形式之鹽酸鹽或不同結晶形式之混合物。本發明之一些實施例係關於鹽酸鹽，其中至少特定重量百分比之鹽酸鹽為結晶的。特定重量百分比包括10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%及99.9%。當特定重量百分比之鹽酸鹽為結晶的時，其餘鹽酸鹽為非晶形形式之鹽酸鹽。

本發明之一些實施例係關於為結晶形式或實質上為結晶形式之I-216鹽酸鹽。結晶形式可係特定重量百分比之結晶鹽酸鹽。特定重量百分比包括10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%及99.9%。當特定重量百分比之鹽酸鹽為指定結晶形式時，其餘鹽酸鹽係非晶形形式之鹽酸鹽與一或多種不包括指定結晶形式之結晶形式之鹽酸鹽的某組合。在一些實施例中，鹽酸鹽為至少90重量%之結晶形式。在一些實施例中，鹽酸鹽為至少95重量%之結晶形式。在一些實施例中，鹽酸鹽為至少80重量%之結晶形式。在一些實施例中，鹽酸鹽為至少85重量%之結晶形式。

除非另有說明，否則當使用一或多個表示為角2θ之 XRPD峰鑑別鹽酸鹽之結晶形式時，每一2θ值應理解為意指所給值±0.2度。

在整個說明書及申請專利範圍中，當使用一或多個來自DSC曲線之溫度(例如，吸熱轉變、熔融等開始)鑑別鹽酸鹽之結晶形式時，每一溫度值應理解為意指所給值±2℃。

固態形式

本文提供各種表徵資訊來描述I-216之鹽酸鹽之結晶形式1(形式1)。

圖4顯示I-216之鹽酸鹽之形式I之使用CuKα輻射所獲得的X-射線粉末繞射(XRPD)圖案。圖4中所鑑別之峰包括彼等表4中所列示者。

在一些實施例中，形式I之特徵在於具有2θ角為4.5°、15.2°、21.3°、21.8°及24.0°之峰之XRPD圖案。在一些實施例中，形式I之特徵在於具有2θ角為4.5°、7.5°、14.4°、14.6°、15.2°、15.9°、19.5°、21.3°、21.8°、22.4°、22.7°、24.0°及24.8°之峰之XRPD圖案。在一些實施例中，形式I之特徵在於具有2θ角為4.5°、7.5°、8.9°、9.8°、13.3°、14.4°、14.6°、15.2°、15.9°、17.2°、19.5°、20.0°、21.3°、21.8°、22.4°、22.7°、24.0°、24.8°、25.7° 及26.4°之峰之XRPD圖案。在一些實施例中，形式I之特徵在於實質上如圖4中所顯示之XRPD圖案。

在一些實施例中，形式I之特徵在於具有2θ角為4.5±0.3°之參考峰且具有相對於參考峰2θ角為10.7°、16.8°、17.3°及19.5°之峰的XRPD圖案。術語「參考峰」係指XRPD繞射圖中熟習此項技術者視為告知材料之多晶型形式、即不同於儀器雜訊之峰。「相對」意指每一峰之所觀測到之2θ角將係參考峰之2θ角及該峰之相對2θ角之和。例如，若參考峰具有4.4°之2θ角，則相對峰將具有15.1°、21.2°、21.7°及23.9°之2θ角；若參考峰具有4.5°之2θ角，則相對峰將具有15.2°、21.3°、21.8°及24.0°之2θ角；若參考峰具有4.6°之2θ角，則相對峰將具有15.3°、21.4°、21.9°及24.1°之2θ角；等。在一些實施例中，形式I之特徵在於具有2θ角為4.5±0.3°之參考峰且具有相對於參考峰2θ角為3.0°、9.9°、10.1°、10.7°、11.4°、15.0°、16.8°、17.3°、17.9°、18.2°、19.5°及20.3°之峰之XRPD圖案。在一些實施例中，形式I之特徵在於具有2θ角為4.5±0.3°之參考峰且具有相對於參考峰2θ角為3.0°、4.4°、5.3°、8.8°、9.9°、10.1°、10.7°、11.4°、12.7°、15.0°、15.5°、16.8°、17.3°、17.9°、18.2°、19.5°、20.3°、21.2°及21.9°之峰之XRPD圖案。熟習此項技術者視為告知材料之多晶型形式之每一峰可用作參考峰，且然後可計算相對峰。例如，若參考峰具有24.0°之2θ角，則相對於參考峰相對峰將具有-19.5°、-8.8°、-2.7°及-2.2°之2θ角。圖5顯示形式I之示差掃描量熱法(DSC)曲線。 DSC溫度記錄圖對隨樣品之溫度而變之熱流作圖，溫度速率變化為約10℃/min。在一些實施例中，形式I之特徵在於實質上如圖5中所顯示之DSC曲線。圖5顯示具有對應於水損失以及熔融之約129.8℃之開始及約135.6℃處之峰的吸熱事件。亦觀測到具有約181.6℃之開始及約195.5℃處之峰的寬吸熱及具有約275.3℃之開始及約275.5℃處之峰的尖銳吸熱。

圖6顯示I-216之鹽酸鹽之形式I之熱解重量分析(TGA)曲線。TGA溫度記錄圖對樣品之隨溫度而變之百分比重量損失作圖，溫度速率變化為約10℃/min。圖6顯示在100℃至150℃之間大約3.7%重量損失，此表明I-216 HCl形式I係單水合物。在一些實施例中，I-216 HCl形式I之特徵在於實質上如圖6中所顯示之TGA曲線。卡爾費休(Karl Fischer)量測顯示約3.5%之水含量，此進一步表明TGA曲線中所見之重量損失係歸因於水損失，此指示形式I係單水合物。

圖10顯示I-216之鹽酸鹽之形式II之使用CuKα輻射所獲得的X-射線粉末繞射(XRPD)圖案。圖10中所鑑別之峰包括彼等表5中所列示者。

在一些實施例中，形式II之特徵在於具有2θ角為8.7°、15.2°、15.7°、19.6°及24.2°之峰之XRPD圖案。在一些實施例中，形式II之特徵在於具有2θ角為4.3°、8.7°、15.2°、15.7°、19.6°、20.0°、20.8°、22.5°、23.1°及24.2°之峰之XRPD圖案。在一些實施例中，形式II之特徵在於具有2θ角為4.3°、8.7°、12.4°、14.5°、15.2°、15.7°、17.3°、18.2°、18.5°、19.6°、20.0°、20.8°、22.0°、22.5°、23.1°、24.2°、24.7°、25.7°、28.2°及29.4°之峰之XRPD圖案。在一些實施例中，形式II之特徵在於實質上如圖10中所顯示之XRPD圖案。

在一些實施例中，形式II之特徵在於具有2θ角為8.7±0.3°之參考峰且具有相對於參考峰2θ角為6.5°、7.0°、10.9°及15.5°之峰之XRPD圖案。術語「參考峰」及「相對」具有與先前所述相同之含義。在一些實施例中，形式II之特徵在於具有2θ角為8.7±0.3°之參考峰且具有相對於參考峰2θ角為-4.4°、6.5°、7.0°、10.9°、11.3°、12.1°、13.8°、14.4°及15.5°之峰之XRPD圖案。在一些實施例中，形式II之特徵在於具有2θ角為8.7±0.3°之參考峰且具有相對於參考峰2θ角為-4.4°、3.7°、5.8°、6.5°、7.0°、8.6°、9.5°、9.8°、10.9°、11.3°、13.3°、13.8°、14.4°、15.5°、16.0°、17.0°、19.5°及20.7°之峰之XRPD圖案。熟習此項技術者視為告知材料之多晶型形式之每一峰可用作參考峰，且然後可計算相對峰。例如，若參考峰具有24.2°之2θ角，則相對於參考峰相對峰將具有-15.5°、-9.0°、-8.5°及-4.6°之2θ角。

合成方法

化合物I-216可藉由熟習此項技術者已知之方法及/或參照下文所顯示之反應圖及以下實例來製備。實例性合成途徑係闡述於下文反應圖1-4及下文實例中。

反應圖1

反應圖1闡述(1R,2S)-5-氯-2-甲氧基二氫茚-1-胺(8)之合成，其在下文實例1中進一步例示。使用Jacobsen觸媒使6-氯-1H-茚(1)環氧化，從而得到環氧乙烯(2)，用存於乙腈中之發菸硫酸處理環氧乙烯(2)，從而在添加水及加熱之後形成rel-(1R,2S)-1-胺基-5-氯二氫茚-2-醇(3)。使用D-(-)-杏仁酸以對掌性方式拆分rel-(1R,2S)-1-胺基-5-氯二氫茚-2-醇(3)，從而在去除對掌性助劑之後得到(1R,2S)-1-胺基-5-氯二氫茚-2-醇(5)。使用鄰苯二甲酸酐保護(5)中之一級胺，從而形成化合物(6)。利用碘甲烷對羥基進行甲基化形成化合物(7)，隨後利用肼去保護，從而得到期望(1R,2S)-5-氯-2-甲氧基二氫茚-1-胺(8)。

反應圖2

反應圖2顯示胺磺酸{(1S,2S,4R)-4-[(6-{[(1R,2S)-5-氯-2-甲氧基-2,3-二氫-1H-茚-1-基]胺基}嘧啶-4-基)氧基]-2-羥基環戊基}甲酯HCl形式1之合成，其進一步例示於下文實例2中。以第三丁基二甲基甲矽烷基醚形式保護外消旋-(9)之一級醇，從而得到化合物(10)，使用南極假絲酵母菌(Candida Antarctica)在丙烯酸樹脂上酶促拆分該化合物(10)，從而得到鏡像異構體過量大於99%之化合物(11)。然後以第三丁基二甲基甲矽烷基醚形式保護(11)中之二級醇，從而提供(12)。用兒茶酚硼烷在威爾金森觸媒(Wilkinson's catalyst)之存在下處理化合物(12)，從而提供(13)，將(13)進一步與4,6-二氯嘧啶反應，從而提供化合物(14)。使(14)之一級醇選擇性去保護，且然後藉由(15)與(1R,2S)-5-氯-2-甲氧基二氫茚-1-胺(8)反應來安裝該分子之二氫茚部分，從而提供化合物(16)。藉由使化合物(16)與氯磺醯胺反應，之後在酸性條件下使二級醇去保護來製備I-216。用存於乙腈中之鹽酸處理I-216，從而提供I-216之鹽酸鹽之形式I。

反應圖3

反應圖3闡述(1R,2S)-5-氯-2-甲氧基-2,3-二氫-1H-茚-1-胺鹽酸鹽(20)之製備，其在下文實例4中進一步例示。將5-氯-2,3-二氫-1H-茚-1-酮(17)與原甲酸三甲酯在酸性條件下反應、接著用Koser試劑[PhI(OH)(OTs)]處理，從而得到5-氯-2-甲氧基-2,3-二氫-1H-茚-1-酮(18)。用(R)-第三丁基亞磺醯胺在四乙氧化鈦之存在下處理茚酮，從而提供相應的亞磺醯胺(19)。使反應繼續進行，直至可藉由HPLC檢測到小於5%之不期望非鏡像異構體為止。使用NaBH₄還原粗亞磺醯胺，從而提供一級胺，用鹽酸處理該一級胺，從而提供(1R,2S)-5-氯-2-甲氧基-2,3-二氫-1H-茚-1-胺鹽酸鹽(20)。

反應圖4

反應圖4顯示I-216鹽酸鹽形式I之製備途徑，其在下文實例5中進一步例示。藉由用二異丙基醯胺鋰處理來對(1S,2R,3S,5R)-3-(苄基氧基)-2-(苄基氧基甲基)-6-氧雜雙環 [3.1.0]環己烷(21)中之環氧化物進行開環，且藉由用三甲基甲矽烷基氯處理來捕獲所得陰離子，從而提供(22)。使用氫及Pd/BaSO₄觸媒還原雙鍵，且去除三甲基甲矽烷基保護基團，從而提供二級醇(23)。使二級醇(23)甲磺酸化，且然後用乙酸四丁基銨、接著氫氧化鈉處理，從而提供(24)，使(24)與氫化鈉及4,6-二氯嘧啶反應，從而提供中間物(25)。使用三氯化硼去除苄基保護基團以提供(26)，接著在130℃及50 psi下與(1R,2S)-5-氯-2-甲氧基-2,3-二氫-1H-茚-1-胺鹽酸鹽(20)反應，從而形成胺磺酸((1S,2S,4R)-4-(6-((1R,2S)-5-氯-2-甲氧基-2,3-二氫-1H-茚-1-基胺基)嘧啶-4-基氧基)-2-羥基環戊基)甲酯(27)。使化合物(27)中之一級醇胺磺酸化，從而提供I-216。藉由用6 M鹽酸處理存於異丙基醇中之I-216、接著添加乙酸異丙酯作為反溶劑來產生I-216之鹽酸鹽之形式I。

用途

本發明之化學實體係E1酵素活性之有用抑制劑。特定而言，化學實體經設計為NAE之抑制劑。抑制劑意欲包括化學實體，該等化學實體降低E1酵素在至靶蛋白質之ub1(特定而言，Nedd8)偶聯中之促進效應(例如，降低泛素化、nedd分子接合化)，降低藉由ub1(特定而言，Nedd8)偶聯調介之細胞內信號傳導，及/或降低藉由ub1(特定而言，Nedd8)偶聯調介之蛋白分解(例如，抑制cullin-依賴性泛素化及蛋白分解(例如，泛素-蛋白體酶途徑))。因此，可根據本文中進一步詳細提供之方法或業內已知方法分析本發明之化學實體活體外或活體內或在細胞或動物模型內抑制E1酵素的能力。可評估化學實體直接約束或調介E1酵素活性之能力。或者，可藉助間接細胞分析或量測E1活化之下游效應以評估E1抑制之下游效應(例如，抑制cullin-依賴性泛素化及蛋白分解)之抑制的分析來評估化學實體之活性。例如，可藉由以下來評估活性：檢測ub1-偶聯基質(例如，ub1-偶聯E2，nedd分子接合化cullin，泛素化基質)；檢測下游蛋白質基質穩定(例如，p27之穩定、IκB之穩定)；檢測UPP活性之抑制；檢測蛋白質E1抑制及基質穩定之下游效應(例如，報告基因分析，例如，NFκB報告基因分析、p27報告基因分析)。評估活性之分析係闡述於下文實驗部分中及/或為業內所已知。

應瞭解，可在官能團處使本發明化學實體衍生化，以提供能夠活體內轉化回母體化學實體之前藥衍生物。該等前藥之實例包括生理上可接受且代謝不穩定之衍生物。更具體而言，本發明之化學實體之前藥係化學實體之-NH-基團之胺基甲酸酯或醯胺，或化學實體之-OH基團之醚或酯。

化學實體之-NH-基團之該等胺基甲酸酯前藥包括以下胺基甲酸酯：9-茀基甲基、9-(2-硫)茀基甲基、9-(2,7-二溴)茀基甲基、17-四苯并[a,c,g,i]茀基甲基、2-氯-3-茚基甲基、苯并[f]茚-3-基甲基、2,7,二-第三丁基-[9-(10,10-二側氧基-10,10,10,10-四氫硫基)]甲基、1,1-二側氧基苯并[b]噻吩-2-基-甲基、2,2,2-三氯乙基、2-三甲基甲矽烷基乙基、2-苯基乙基、1-(1-金剛烷基)-1-甲基乙基、2-氯乙基、1,1-二甲基-2-鹵代乙基、1,1-二甲基-2,2-二溴乙基、1,1-二甲基-2,2,2-三氯乙基、1-甲基-1-(4-聯苯基)乙基、1-(3,5-二-第三丁基苯基)-1-甲基乙基、2-(2'-及4'-吡啶基)乙基、2,2-雙(4'-硝基苯基)乙基、N-2-三甲基乙醯基胺基)-1,1-二甲基乙基、2-[(2-硝基苯基)二硫]-1-苯基乙基、2-(N,N-二環己基甲醯胺基)乙基、第三丁基、1-金剛烷基、2-金剛烷基、乙烯基、烯丙基、1-異丙基烯丙基、桂皮基、4-硝基桂皮基、3-(3'-吡啶基)丙-2-烯基、8-喹啉基、N-羥基六氫吡嗪基、烷基二硫、苄基、對甲氧基苄基、對硝基苄基、對溴苄基、對氯苄基、2,4-二氯苄基、4-甲基亞磺醯基苄基、9-蒽基甲基、二苯基甲基、啡噻嗪基-(10)-羰基、N'-對甲苯磺醯基胺基羰基及N'-苯基胺基硫代羰基。

化學實體之-NH-基團之該等醯胺前藥包括以下醯胺：N-甲醯基、N-乙醯基、N-氯乙醯基、N-三氯乙醯基、N-三氟乙醯基、N-苯基乙醯基、N-3-苯基丙醯基、N-4-戊烯醯基、N-吡啶甲醯基(N-picolinoyl)、N-3-吡啶基甲醯胺基、N-苯甲醯基苯基丙胺醯基、N-苯甲醯基及N-對苯基苯甲醯基。

化學實體之-OH基團之該等醚前藥包括以下醚：甲基、甲氧基甲基、甲基硫代甲基、(苯基二甲基甲矽烷基)甲氧基甲基、苄基氧基甲基、對甲氧基苄基氧基甲基、對硝基苄基氧基甲基、鄰硝基苄基氧基甲基、(4-甲氧基苯氧基)甲基、愈創木酚甲基、第三丁氧基甲基、4-戊烯基氧基甲基、矽氧基甲基、2-甲氧基乙氧基甲基、2,2,2-三氯乙氧基甲基、雙(2-氯乙氧基)甲基、2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基甲基、薄荷氧基甲基、四氫哌喃基、3-溴四氫哌喃基、四氫噻喃基、1-甲氧基環己基、4-甲氧基四氫哌喃基、4-甲氧基四氫噻喃基、S,S-二氧化4-甲氧基四氫噻喃基、1-[(2-氯-4-甲基)苯基]-4-甲氧基六氫吡啶-4-基、1-(2-氟苯基)-4-甲氧基六氫吡啶-4-基、1,4-二噁烷-2-基、四氫呋喃基、四氫硫代呋喃基、2,3,3a,4,5,6,7,7a-八氫-7,8,8-三甲基-4,7-甲烷基苯并呋喃-2-基、1-乙氧基乙基、1-(2-氯乙氧基)乙基、1-[2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基]乙基、1-甲基-1-甲氧基乙基、1-甲基-1-苄基氧基乙基、1-甲基-1-苄基氧基-2-氟乙基、1-甲基-1-苯氧基乙基、2,2,2-三氯乙基、1,1-二甲氧苯基-2,2,2-三氯乙基、1,1,1,3,3,3-六氟-2-苯基異丙基、2-三甲基甲矽烷基乙基、2-(苄基硫)乙基、2-(苯基氧硒基)乙基、第三丁基、烯丙基、炔丙基、對氯苯基、對甲氧基苯基、對硝基苯基、2,4-二硝基苯基、2,3,5,6-四氟-4-三氟甲基)苯基、苄基、對甲氧基苄基、3,4-二甲氧基苄基、鄰硝基苄基、對硝基苄基、對鹵代苄基、2,6-二氯苄基、對氰基苄基、對苯基苄基、2,6-二氟苄基、對醯基胺基苄基、對疊氮基苄基、4-疊氮基-3-氯苄基、2-三氟甲基苄基、對(甲基亞磺醯基)苄基、2-吡啶甲基、4-吡啶甲基、N-氧離子基3-甲基-2-吡啶甲基、2-喹啉基甲基、1-芘基甲基、二苯基甲基、p,p'-二硝基二苯甲基、5-二苯并環庚基、三苯基甲基、α-萘基二苯基甲基、對甲氧基苯基二苯基甲基、二(對甲氧基苯基)苯基甲基、三(對甲氧基苯基)甲基、4-(4'-溴苯甲醯甲基氧基)苯基二苯基甲基、4,4',4"-叁(4,5-二氯鄰苯二甲醯亞胺苯基)甲基、4,4',4"-三(乙醯丙醯基氧基苯基)甲基、4,4',4"-三(苯甲醯基氧基苯基)甲基、4,4'-二甲氧基-3"-[N-(咪唑基甲基)三苯甲基、4,4'-二甲氧基-3"[N-咪唑基乙基]胺甲醯基]三苯甲基、1,1-雙(4-甲氧基苯基)-1'-芘基甲基、4-(17-四苯并[a,c,g,i]茀基甲基)-4,4"-二甲氧基三苯甲基、9-蒽基、9-(9-苯基)二苯并哌喃基、9-(9-苯基-10-側氧基)蒽基、1,3-苯并二噻-2-基、S,S-二氧化苯并異噻唑基、三甲基甲矽烷基、三乙基甲矽烷基、三異丙基甲矽烷基、二甲基異丙基甲矽烷基、二乙基異丙基甲矽烷基、二甲基矽烷基、第三丁基二甲基甲矽烷基、第三丁基二苯基甲矽烷基、三苄基甲矽烷基、三-對二甲苯基甲矽烷基、三苯基甲矽烷基、二苯基甲基甲矽烷基、二-第三丁基甲基甲矽烷基、叁(三甲基甲矽烷基)甲矽烷基、(2-羥基苯乙烯基)二甲基甲矽烷基、(2-羥基苯乙烯基)二異丙基甲矽烷基、第三丁基甲氧基苯基甲矽烷基及第三丁氧基二苯基甲矽烷基。

化學實體之-OH基團之該等酯前藥包括以下酯：甲酸酯、苯甲醯基甲酸酯、乙酸酯、氯乙酸酯、二氯乙酸酯、三氯乙酸酯、三氟乙酸酯、甲氧基乙酸酯、三苯基甲氧基乙酸酯、苯氧基乙酸酯、對氯苯氧基乙酸酯、苯基乙酸酯、對-P-苯基乙酸酯、二苯基乙酸酯、菸鹼酸酯、3-苯基丙酸酯、4-戊烯酸酯、4-側氧基戊酸酯、4,4-(伸乙基二硫) 戊酸酯、5-[3-雙(4-甲氧基苯基)羥基甲基苯氧基]乙醯丙酸酯、新戊酸酯、1-金剛酸酯、巴豆酸酯、4-甲氧基巴豆酸酯、苯甲酸酯、對苯基苯甲酸酯及2,4,6-三甲基苯甲酸酯。另外，本發明化學實體之類似於-OH基團之代謝不穩定醚、酯或-NH-基團之胺基甲酸酯或醯胺且能夠活體內產生本文所述母體化學實體的任何生理上可接受之等效物均屬於本發明之範圍內。參見例如Greene及Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis，第3版.John Wiley & Sons有限公司(1999)。

本發明之一些實施例係關於包含本發明之化學實體及醫藥上可接受之載劑的組合物。本發明之一些實施例係關於包含本發明之化學實體之前藥及醫藥上可接受之載劑的組合物。

若醫藥上可接受之鹽係該等組合物中所利用之本發明化學實體，則該等鹽較佳係衍生自無機或有機酸及鹼。關於適宜鹽之綜述，參見例如，Berge等人，J.Pharm.Sci.66：1-19(1977)及Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第20版，A.Gennaro(編輯)，Lippincott Williams & Wilkins(2000)(「Remington's」)。

適宜酸加成鹽之實例包括以下：乙酸鹽、己二酸鹽、藻酸鹽、天冬胺酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、丁酸鹽、檸檬酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、環戊烷丙酸鹽、二葡萄糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、富馬酸鹽、葡庚糖酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、已酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基乙磺酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽、甲磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、菸鹼酸鹽、草酸鹽、雙羥萘酸鹽、果膠酯酸鹽、過硫酸鹽、3-苯基-丙酸鹽、苦味酸鹽、三甲基乙酸鹽、丙酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽及十一烷酸鹽。

適宜鹼加成鹽包括銨鹽、鹼金屬鹽(例如鈉及鉀鹽)、鹼土金屬鹽(例如鈣及鎂鹽)、與有機鹼形成之鹽(例如二環己基胺鹽、N-甲基-D-葡萄糖胺)及與胺基酸(例如精胺酸、離胺酸等)形成之鹽。

而且，鹼性含氮基團亦可利用諸如以下等試劑四級銨化：低碳烷基鹵化物，例如甲基、乙基、丙基及丁基氯、溴及碘；硫酸二烷基酯，例如硫酸二甲酯、硫酸二乙酯、硫酸二丁酯及硫酸二戊酯；長鏈鹵化物，例如癸基、月桂基、肉豆蔻基及硬脂基氯、溴及碘；芳烷基鹵化物，例如苄基溴及苯乙基溴及其他。藉此獲得水或油可溶性或可分散性產物。

本發明之醫藥組合物較佳呈適於向接受個體、較佳哺乳動物、更佳人類投與之形式。本文所用術語「醫藥上可接受之載劑」係指與接受個體相容且適於在不終止活性劑之活性之情況下向靶位點遞送該藥劑之材料。與載劑有關之毒性或不利效應(若存在)較佳與活性劑之預期用途之合理風險/益處比率相稱。許多該等醫藥上可接受之載劑為業內所已知。參見例如，Remington's；Handbook of Pharmaceutical Excipients，第6版，R.C.Rowe等人(編輯)，Pharmaceutical Press(2009)。

本發明之醫藥組合物可藉由業內所熟知之方法來製造，尤其例如習用製粒、混合、溶解、囊封、冷凍乾燥或乳化過程。組合物可製成各種形式，包括顆粒、沈澱物或粒子、粉末(包括冷凍乾燥、旋轉乾燥或噴霧乾燥之粉末、非晶形粉末)、錠劑、膠囊、糖漿、栓劑、注射液、乳液、酏劑、懸浮液或溶液。調配物可視情況含有穩定劑、pH調整劑、表面活性劑、增容劑、生物可用度調整劑及該等之組合。

該等組合物中可使用之醫藥上可接受之載劑包括離子交換劑、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、血清蛋白(例如人類血清白蛋白)、緩衝物質(例如磷酸鹽或碳酸鹽)、甘胺酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸之偏甘油酯混合物、水、鹽或電解質(例如硫酸魚精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、膠狀二氧化矽、三矽酸鎂、聚乙烯基吡咯烷酮、基於纖維素之物質、聚乙二醇、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸酯、蠟、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段共聚物、聚乙二醇及羊毛脂。

根據較佳實施例，本發明之組合物經調配用於向哺乳動物、較佳人類醫藥投與。本發明之該等醫藥組合物可經口、非經腸、藉由吸入噴霧、局部地、經直腸、經鼻、經口腔、經陰道或經由植入型儲存器投與。本文所用術語「非經腸」包括皮下、靜脈內、腹膜內、肌內、關節內、滑膜內、胸骨內、鞘內、肝內、病灶內及顱內注射或輸注技術。較佳地，經口、經靜脈內或經皮下投與該等組合物。本發明之調配物可經設計為短效、速釋或長效。更進一步而言，化合物可以局部而非全身方式投與，例如在腫瘤位點處投與(例如，藉由注射)。

醫藥調配物可使用液體(例如油、水、醇及其組合)製成液體懸浮液或溶液。可包括增溶劑，例如環糊精。可添加醫藥上適宜之表面活性劑、懸浮劑或乳化劑用於經口或非經腸投與。懸浮液可包括油，例如花生油、芝麻油、棉籽油、玉米油及橄欖油。懸浮液製劑亦可含有脂肪酸之酯，例如油酸乙酯、肉豆蔻酸異丙酯、脂肪酸甘油酯及乙醯化脂肪酸甘油酯。懸浮液調配物可包括醇，例如乙醇、異丙醇、十六烷醇、甘油及丙二醇。懸浮液調配物中亦可使用醚(例如聚(乙二醇))、石油烴(例如礦物油及石蠟脂)；及水。

本發明組合物之無菌可注射形式可為水性或油性懸浮液。該等懸浮液可根據業內已知技術使用適宜之分散或濕潤劑及懸浮劑進行調配。無菌可注射製劑亦可為存於無毒非經腸可接受之稀釋劑或溶劑中之無菌可注射溶液或懸浮液，例如，呈存於1,3-丁二醇中之溶液。可採用之可接受媒劑及溶劑包括水、林格氏(Ringer)溶液及等滲氯化鈉溶液。另外，常採用無菌不揮發性油作為溶劑或懸浮媒介。出於此目的，可採用任何溫和不揮發性油，包括合成單甘油酯或二甘油酯。可使用脂肪酸(例如油酸及其甘油酯衍生物)製備注射劑，例如天然的醫藥上可接受之油，例如橄欖油或蓖麻油，尤其呈其聚氧乙烯化形式者。該等油溶液或懸浮液亦可含有長鏈醇稀釋劑或分散劑，例如羧甲基纖維素或通常用於調配包括乳液及懸浮液之醫藥上可接受之劑型的類似分散劑。亦可將其他常用表面活性劑(例如吐溫(Tween)、司盤(Span)及其他通常用於製造醫藥上可接受之固體、液體、或其他劑型之乳化劑或生物利用度增強劑)用於調配目的。化合物可經調配用於藉由注射(例如，濃注或連續輸注)非經腸投與。用於注射之單位劑型可在安瓿或多劑量容器中。

本發明之醫藥組合物可以任何經口可接受劑型經口投與，該等劑型包括膠囊、錠劑、水性懸浮液或溶液。當需口服使用水性懸浮液時，可將該活性成份與乳化劑及懸浮劑組合。若需要，亦可添加某些甜味劑、矯味劑或著色劑。在該等固體劑型中，活性化學實體係與至少一種醫藥上可接受之惰性賦形劑或載劑(例如，檸檬酸鈉或磷酸二鈣)及/或以下物質混合：a)填充劑或增量劑，例如，澱粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、微晶纖維素及矽酸，b)黏合劑，例如羧甲基酸纖維素、海藻酸鹽、明膠、蔗糖及阿拉伯膠(acacia)，c)保濕劑，例如甘油，d)崩解劑，例如瓊脂、碳酸鈣、聚乙烯基吡咯啶酮、交聯羧甲基纖維素、羥乙酸澱粉鈉、馬鈴薯或木薯澱粉、海藻酸、某些矽酸鹽及碳酸鈉，e)溶液阻滯劑，例如石蠟，f)吸收促進劑，例如四級銨化合物，g)潤濕劑，例如鯨蠟醇及甘油單硬脂酸酯，h)吸收劑，例如高嶺土(kaolin)及膨潤土，及i) 潤滑劑，例如滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、硬脂醯基富馬酸鈉、固體聚乙二醇、月桂基硫酸鈉、二氧化矽及其混合物。在膠囊、錠劑及丸劑情形下，該劑型亦可包含緩衝劑。

活性化學實體亦可呈具有一或多種上述賦形劑之微囊形式。可利用諸如腸溶包膜、釋放控制包膜及醫藥調配領域中熟知之其他包膜等包膜及包殼來製備錠劑、糖衣錠、膠囊、丸劑及顆粒之固體劑型。在該等固體劑型中，可將活性化合物與至少一種惰性稀釋劑(例如，蔗糖、乳糖或澱粉)混合。該等劑型除惰性稀釋劑外亦可包含如同通常實踐一般之其他物質，例如壓片潤滑劑及其他壓片助劑(例如硬脂酸鎂及微晶纖維素)。在膠囊、錠劑及丸劑情形下，該等劑型亦可包含緩衝劑。其可視情況含有失透劑且亦可為視需要以延遲方式僅(或優先)在腸道之某一部分中釋放活性成份的組合物。可用包埋組合物之實例包括聚合物質及蠟。

或者，本發明之醫藥組合物可以用於直腸投與之栓劑形式投與。可藉由將藥劑與適宜之非刺激性賦形劑混合來製備該等組合物，該賦形劑在室溫下為固體，但在直腸溫度下為液體，且因此可在直腸中融化來釋放藥物。該等材料包括可可脂、蜂蠟及聚乙二醇。

本發明之醫藥組合物亦可局部投與，尤其當治療靶包括可藉由局部施用易於達到之區域或器官(包括眼睛、皮膚或較低腸道)時。易於製備針對每一該等區域或器官之適宜局部調配物。

可以直腸栓劑調配物(參見上文)或適宜灌腸調配物實現較低腸道之局部施用。亦可使用局部經皮貼片。對於局部施用，可將醫藥組合物調配於含有懸浮或溶解於一或多種載劑中之活性組份的適宜軟膏中。用於本發明化合物局部投與之載劑可包括：礦物油、液體石蠟脂、白石蠟脂、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蠟及水。或者，可將醫藥組合物調配於含有懸浮或溶解於一或多種醫藥上可接受載劑中之活性組份的適宜洗劑或乳膏中。適宜載劑包括礦物油、山梨醇酐單硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、鯨蠟基酯蠟、鯨蠟硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇及水。

對於使用，可將醫藥組合物可調配成存於等滲、pH調節無菌鹽水中之微粉化懸浮液，或較佳調配成存於等滲、pH調節無菌鹽水中之溶液，具有或不具有防腐劑，例如苯紮氯銨(benzylalkonium chloride)。或者，對於眼睛使用，可將醫藥組合物調配於軟膏(例如石蠟脂)中。

亦可藉由經鼻氣溶膠或吸入劑投與本發明之醫藥組合物。根據醫藥調配領域中熟知之技術來製備該等組合物並可將其製備成鹽水溶液，其採用苯甲醇或其他適宜防腐劑、吸收促進劑(增強生物利用度)、氟碳化合物及/或其他習用增溶劑或分散劑。

本發明之醫藥組合物尤其用於與本文所述病症(例如，增殖病症(例如，癌症)、發炎性、神經退化病症)相關之治療施用。本文所用術語「個體」意指動物，較佳為哺乳動物，最佳為人類。本文所用術語「患者」意指人類。較佳地，組合物經調配用於向患有所治療之相關病症或具有發生或經歷所治療之相關病症復發風險的患者或個體投與。本發明之較佳醫藥組合物係彼等經調配用於經口、靜脈內或皮下投與者。然而，任何含有治療有效量之本發明化學實體之以上劑型肯定屬於常規實驗之範疇，且因此肯定屬於本發明之範圍。在某些實施例中，本發明之醫藥組合物可進一步包含另一治療劑。較佳地，該另一治療劑通常係向患有所治療之病症、疾病或病況之患者投與。

「治療有效量」意指化學實體或組合物在單一或多個劑量投與後足以導致E1酵素活性及/或所治療之病症或疾病狀態之嚴重性的可檢測降低之量。「治療有效量」亦意欲包括足以治療細胞、延長或預防所治療之病症或疾病狀態之進展(例如，預防癌症之額外腫瘤生長，預防額外發炎性反應)、改善、緩和、緩解或改良個體之病症症狀超過在不存在該治療下所預期者之量。所需要之E1酵素抑制劑之量將取決於所給組合物之特定化合物、所治療之病症之類型、投與途徑及治療該病症所需要之時間長度。亦應瞭解，用於任一特定患者之具體劑量及治療方案可取決於多種因素，包括所採用具體化學實體之活性、患者之年齡、體重、一般健康、性別及飲食、投與時間、排泄速率、藥物組合、治療醫師之判斷及所治療特定疾病之嚴重性。在其中抑制劑與另一藥劑組合投與之某些態樣中，本發明組合物中所存在之額外治療劑之量通常將不超過通常在包含該治療劑作為唯一活性劑之組合物中將投與之量。較佳地，額外治療劑之量將在包含該藥劑作為唯一治療活性劑之組合物中通常所存在量之約50%至約100%之範圍內。

在一些實施例中，本發明係關於抑制或降低樣品中E1酵素活性之方法，該方法包含將樣品與本發明之化學實體或包含本發明化學實體之組合物接觸。本文所用之樣品包括包含以下之樣品：經純化或經部分純化E1酵素、所培養之細胞或細胞培養物之提取物；進行生檢之細胞或自哺乳動物獲得之流體或其提取物；及體液(例如，血液、血清、唾液、尿、糞便、精液、淚)或其提取物。樣品中E1酵素活性之抑制可在活體外或活體內、細胞內或原位實施。

在一些實施例中，本發明提供治療患有病症、病症之症狀、具有發生或經歷病症復發風險之患者的方法，該方法包含向該患者投與本發明之化學實體或醫藥組合物。治療可係治癒、癒合、緩和、緩解、改變、補救、改善、減輕、改良或影響病症、該病症之症狀或患該病症之素質。儘管不希望受理論限制，但據信治療使得活體外或活體內抑制細胞或組織生長、摘除或殺死細胞或組織，或另外降低細胞或組織(例如，異常細胞、病變組織)調介病症、例如本文所述病症(例如，增殖病症(例如，癌症)、發炎性病症)之能力。本文所用「抑制細胞或組織(例如，增殖細胞、腫瘤組織)之生長」或其之「生長之抑制」係指減緩、中斷、遏製或終止其生長及轉移，且未必指示生長全部消除。

疾病應用包括彼等其中抑制E1酵素活性對病變細胞或組織之生存及/或擴增有害之病症(例如，細胞對E1抑制敏感；抑制E1活性使疾病機制紊亂；降低E1活性使為疾病機制之抑制劑之蛋白質穩定；降低E1活性使得抑制為疾病機制之活化劑之蛋白質)。疾病應用亦意欲包括需要有效cullin及/或泛素化活性之任何病症、疾病或病狀，該活性可藉由減弱E1酵素活性(例如，NAE活性)來調控。

例如，本發明之方法係用於治療涉及細胞增殖之病症，包括需要有效的cullin-依賴性泛素化及蛋白分解途徑(例如，泛素蛋白體酶途徑)來維持及/或進行疾病狀態之病症。本發明之方法係用於治療經由蛋白質(例如，NFκB活化、p27^Kip活化、p21^WAF/CIP1活化、p53活化)調介之病症，該等蛋白質係藉由E1活性(例如，NAE活性)來調控。相關病症包括增殖病症(最顯著為癌症)及發炎性病症(例如，風濕性關節炎、發炎性腸疾病、氣喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、骨關節炎、皮膚病(例如，異位性皮膚炎、牛皮蘚)、血管增殖病症(例如，動脈粥樣硬化、再狹窄)、自體免疫疾病(例如，多發性硬化症、組織及器官排斥))；以及與感染有關之炎症(例如，免疫反應)、神經退化病症(例如，阿茲海默氏病、帕金森氏病、運動神經性疾病、神經性病變疼痛、三連體重複病症、星狀細胞瘤及由於酒精肝疾病導致之神經退化)、局部缺血性損傷(例如，中風)及惡病質(例如，加速之肌蛋白質分解，其伴隨各種生理及病理狀態(例如，神經損傷、禁食、發熱、酸中毒、HIV感染、癌症痛苦及某些內分泌病))。

本發明之化合物及醫藥組合物尤其用於治療癌症。本文所用術語「癌症」係指以以下為特徵之細胞病症：不受控或失調之細胞增殖、降低之細胞分化、侵入周圍組織之不適當能力及/或在異位位點處進行新生長之不適當能力。術語「癌症」包括固體腫瘤及血源性腫瘤。術語「癌症」涵蓋皮膚、組織、器官、骨、軟骨、血液及血管之疾病。術語「癌症」進一步涵蓋原發性及轉移性癌症。

在一些實施例中，癌症係固體腫瘤。可藉由本發明方法治療之固體腫瘤之實例包括胰腺癌；膀胱癌；結腸直腸癌；乳癌，包括轉移性乳癌；前列腺癌，包括雄性激素-依賴性及雄性激素-非依賴性前列腺癌；腎癌，包括(例如)轉移性腎細胞癌；肝細胞癌症；肺癌症，包括(例如)非小細胞肺癌(NSCLC)、小細胞肺癌、細枝氣管肺泡癌(BAC)及肺之腺癌；卵巢癌症，包括(例如)進行性上皮或原發性腹膜癌症；宮頸癌；胃癌症；食管癌症；頭頸癌症，包括(例如)頭頸之鱗狀細胞癌；黑色素瘤；神經內分泌癌症，包括轉移性神經內分泌腫瘤；腦腫瘤，包括(例如)神經膠質瘤、未分化寡樹突神經膠細胞瘤、成人多形性神經膠質母細胞瘤及成人未分化星狀細胞瘤；骨癌；及軟組織肉瘤。

在一些實施例中，癌症係血液惡性腫瘤。血液惡性腫瘤之實例包括急性骨髓樣白血病(AML)；慢性骨髓性白血病(CML)，包括加速之CML及CML急性期(CML-BP)；急性淋巴胚細胞白血病(ALL)；慢性淋巴球性白血病(CLL)；霍奇金氏(Hodgkin)疾病(HD)；非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)，包括濾泡淋巴瘤及套膜細胞淋巴瘤；B-細胞淋巴瘤；T-細胞淋巴瘤；多發性骨髓瘤(MM)；瓦爾登斯特倫氏(Waldenstrom)巨球蛋白血症；骨髓發育不良症候群(MDS)，包括頑固性貧血(RA)、環狀鐵粒幼細胞性頑固性貧血(RARS)、過量芽細胞性頑固性貧血(RAEB)及轉變中之RAEB(RAEB-T)；及骨髓增生症候群。

視預治療之特定病症或病狀而定，在一些實施例中，本發明之E1酵素抑制劑與額外治療劑結合投與。在一些實施例中，額外治療劑係通常向患有所治療之病症或病狀之患者投與者。本文所用之通常投與以治療特定疾病或病狀之額外治療劑稱為「適於所治療之疾病或病狀」。

本發明之E1抑制劑可與另一治療劑以單一劑型或作為單獨劑型一起投與。當作為單獨劑型投與時，另一治療劑可在投與本發明E1抑制劑之前、與其同時或在其之後投與。

在一些實施例中，本發明之E1酵素抑制劑與適於治療增殖病症及癌症之選自細胞毒性劑之治療劑、放射療法及免疫療法結合投與。適宜與本發明之E1酵素抑制劑組合使用之細胞毒性劑之實例包括：抗代謝物質，包括(例如)卡培他濱(capecitabine)、吉西他濱(gemcitabine)、5-氟尿嘧啶或5-氟尿嘧啶/甲醯四氫葉酸、氟達拉濱(fludarabine)、阿糖胞苷(cytarabine)、巰嘌呤、硫鳥嘌呤、噴司他汀(pentostatin)及甲胺蝶呤；拓撲異構酶抑制劑，包括(例如) 依託泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、喜樹鹼、托泊替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan)、多柔比星(doxorubicin)及柔紅黴素(daunorubicin)；長春花生物鹼(vinca alkaloid)，包括(例如)長春新鹼(vincristine)及長春花鹼(vinblastin)；紫杉烷(taxane)，包括(例如)紫杉醇(paclitaxel)及多西他賽(docetaxel)；鉑藥劑，包括(例如)順鉑、卡鉑(carboplatin)及奧沙利鉑(oxaliplatin)；抗生素，包括(例如)放線菌素D、博來黴素(bleomycin)、絲裂黴素C、阿德力黴素(adriamycin)、柔紅黴素、伊達比星(idarubicin)、多柔比星及聚乙二醇化脂質體多柔比星；烷化劑，例如黴法蘭(melphalan)、苯丁酸氮芥、硫酸布他卡因(busulfan)、噻替哌(thiotepa)、依弗醯胺(ifosfamide)、卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、司莫司汀(semustine)、鏈脲黴素(streptozocin)、氮烯咪胺(dacarbazine)及環磷醯胺；包括(例如)CC-5013及CC-4047；蛋白質酪胺酸激酶抑制劑，包括(例如)甲磺酸伊馬替尼(imatinib mesylate)及吉非替尼(gefitinib)；蛋白體酶抑制劑，包括(例如)硼替佐米(bortezomib)；曲司佐單抗(thalidomide)及相關類似物；抗體，包括(例如)沙利竇邁(trastuzumab)、利妥昔單抗(rituximab)、西妥昔單抗(cetuximab)及貝伐珠單抗(bevacizumab)；米托蒽醌(mitoxantrone)；地塞米松(dexamethasone)；普賴松(prednisone)；及替莫唑胺(temozolomide)。

可與本發明抑制劑組合之藥劑之其他實例包括抗炎劑，例如皮質類固醇、TNF阻斷劑、II-1 RA、硫唑嘌呤、環磷醯胺及柳氮磺吡啶；免疫調節及免疫阻抑劑，例如環孢黴素、他克莫司(tacrolimus)、雷帕黴素(rapamycin)、麥考酚酸嗎乙酯(mycophenolate mofetil)、干擾素、皮質類固醇、環磷醯胺、硫唑嘌呤、甲胺蝶呤及柳氮磺吡啶；抗菌及抗病毒劑；及用於阿茲海默氏治療之藥劑，例如多奈派齊(donepezil)、加蘭他敏(galantamine)、美金剛(memantine)及利斯的明(rivastigmine)。

為了更全面理解本發明，闡述以下製備及測試實例。該等實例僅係出於說明性目的且並不意欲視為以任何方式限制本發明之範圍。

實例縮寫

一般方法

X射線粉末繞射。使用Bruker AXS D8 Advance X-射線繞射儀實施XRPD。將大約100 mg樣品平鋪至50 mm直徑石英取樣盤中用於粉末量測。使用2θ/θ鎖定耦合角以自 2.9°至29.6°之2θ之連續掃描運行樣品。每一角間隔係0.05° 2θ且經2秒數據收集。樣品運行發生在環境條件下，且使用EVA 9.0版軟體實施所有數據分析。

熱分析。使用示差掃描量熱法(DSC)及熱重分析(TGA)分析熱事件。使用TA儀器DSC Q200及TGA Q500用於所有樣品運行。使用Q系列軟體之Thermal Advantage分析溫度記錄圖。

示差掃描量熱法。用蓋子將樣品(1-2 mg)密封於鋁盤中。以10℃/min之升溫速率將樣品自25℃加熱至400℃，而將氮樣品吹洗物保持在50 mL/min下恆定不變。

熱重分析。在開放鉑盤中運行樣品(5-10 mg)。以10℃/min之升溫速率將樣品加熱至400℃，其中氮樣品吹洗物在60 mL/min下。

實例1.(1R,2S)-5-氯-2-甲氧基二氫茚-1-胺(8)之合成

步驟1：rel-(1aR,6aS)-4-氯-6,6a-二氫-1aH-茚并[1,2-b]環氧乙烯(2)。

在0℃下向N-氧化4-苯基丙基吡啶(278 mg，1.31 mmol)存於二氯甲烷(20 mL)中之正攪拌溶液中添加(R,R)-Jacobsen觸媒(237.0 mg，0.3732 mmol)及次氯酸鈉溶液(2.0 M存於水中；16 mL，32 mmol)。在0℃下將所得褐色懸浮液攪拌15分鐘，然後經由唧筒添加6-氯-1H-茚(1)(2.81 g，18.6 mmol)存於二氯甲烷(20 mL)中之溶液，同時添加額外次氯酸鈉(2.0 M存於水中；16 mL，32 mmol)。在0℃下將反應物攪拌1小時，然後去除冰浴且在室溫下將反應物攪拌1 hr。取等份試樣，且二氧化矽(環己烷)上之TLC顯示消耗所有起始材料。將反應物倒入鹽水中並用二氯甲烷萃取。將合併萃取物用鹽水洗滌，然後經硫酸鈉乾燥，過濾並在減壓下蒸發，從而留下粗產物，該粗產物在置於高真空下時固化。產量為約3.7 g之褐色固體。¹H NMR(400 MHz,DMSO)δ 7.55(d,J=7.6 Hz,1H),7.32(s,1H),7.23(d,J=7.3 Hz,1H),4.36(s,1H),4.16(s,1H),3.03(dd,J=45.8,18.2 Hz,2H)。

步驟2：rel-(1R,2S)-1-胺基-5-氯二氫茚-2-醇(3)。

向發菸硫酸(4.098 mL，44.06 mmol)存於乙腈(30 mL，500 mmol)中之-40℃混合物中逐滴添加rel-(1aR,6aS)-4-氯-6,6a-二氫-1aH-茚并[1,2-b]環氧乙烯(2)(2.94 g，17.6 mmol)存於乙腈(70 mL)及環己烷(40 mL)中之懸浮液。然後使雙相混合物升溫至室溫並再攪拌1小時，從而留下渾濁的鏽紅色混合物。小心添加水(30 mL)(所有固體溶解，從而得到紅褐色溶液)，且將所得溶液攪拌30分鐘。然後添加額外水(70 mL)，且在氮之氣氛下在室溫下將反應物攪拌過夜。將水(50 mL)添加至反應，附接蒸餾頭，對混合物實施回流並蒸餾，直至頭溫度達到100℃為止。去除蒸餾頭，且附接回流冷凝器，且在回流下將反應物加熱1小時，從而得到澄清橙色溶液，在邊緣周圍有一些黑色膠黏固體。稍微冷卻反應物，然後將熱溶液自膠倒至500 ml圓底燒瓶中。攪拌溶液並使其冷卻至室溫，然後經由逐滴添加50% NaOH水溶液使其變鹼(pH 12)。添加二氯甲烷；充分攪拌混合物，且然後將其轉移至分液漏斗中。分離有機層，且用額外二氯甲烷反覆萃取水性層(直至TLC分析表明已自水性層萃取出所有產物為止)。將有機萃取物合併，用鹽水洗滌，經硫酸鈉乾燥，過濾並在真空下蒸發，從而留下2.53 g呈淺褐色粉末之粗產物。LCMS：甲酸，[M+ H+ + Na+]=208；¹H NMR(400 MHz,DMSO)δ 7.31(d,J=7.8 Hz,1H),7.24-7.15(m,2H),4.79(s,1H),4.20(s,1H),4.01(s,1H),2.92(d,J=15.3 Hz,1H),2.73(d,J=16.2 Hz,1H),2.15-1.43(s,2H)。對掌性HPLC(Chiralpak AD 4.6×250管柱，用95/5/0.1%環己烷/EtOH/DEA溶析，以2.0 ml/min-45 min運行)顯示80%之ee。

步驟3及4：(1R,2S)-1-胺基-5-氯二氫茚-2-醇(5)之對掌性拆分。

在回流下在攪拌下向含有rel-(1R,2S)-1-胺基-5-氯二氫茚-2-醇(3)(2.53 g，13.8 mmol)存於甲醇(100 mL)中之溶液之燒瓶中添加D-(-)-杏仁酸(2.09 g，13.8 mmol)。回流約15 min後，去除加熱套膜，且在攪拌下使溶液冷卻至室溫。在已去除熱源後，固體開始沈澱約15分鐘。在室溫下將所得混合物攪拌過夜。然後將混合物過濾，用甲醇(10 mL)然後二乙醚(15 mL)洗滌並在真空下乾燥，從而提供2.50 g之中間物鹽。將濾液濃縮至約1/3體積並冷凍過夜，在此期間更多產物沈澱。再次，將混合物過濾並用甲醇(7.5 mL)然後二乙醚(10 mL)洗滌並在真空下乾燥，從而再提供0.60 g之中間物鹽。總共收集3.1 g。

在乙酸乙酯(50 ml)及水性NaOH(0.2 M，60 ml)之混合物中攪拌中間物鹽，直至溶解完全。將混合物轉移至分液漏斗，且分離有機層。用乙酸乙酯(3×50 ml)進一步萃取水層。用鹽水洗滌合併有機層，直至洗滌液為中性為止，然後將其經硫酸鈉乾燥，過濾並蒸發，從而留下淺棕褐色固體。在高真空下進一步乾燥，得到1.42 g(56%產率)呈淺棕褐色粉末之標題化合物。標題化合物之分析數據：¹H NMR(400 MHz,DMSO)δ 7.31(d,J=7.9 Hz,1H),7.24-7.15(m,2H),4.83(s,1H),4.20(t,J=3.9 Hz,1H),4.00(d,J=4.5 Hz,1H),2.92(dd,J=16.2,4.9 Hz,1H),2.73(d,J=15.2 Hz,1H),1.85(s,2H)。對掌性HPLC(Chiralpak AD 4.6×250管柱，用95/5/0.1%環己烷/EtOH/DEA溶析，以2.0 ml/min-45 min運行)顯示>99%之ee。

步驟5：2-[(1R,2S)-5-氯-2-羥基-2,3-二氫-1H-茚-1-基]-1H-異吲哚-1,3(2H)-二酮(6)。

在1 L圓底燒瓶中，將N,N-二異丙基乙基胺(15.2 mL，0.0871 mol)添加至(1S,2R)-1-胺基-5-氯二氫茚-2-醇(16.0 g，0.0871 mol)及鄰苯二甲酸酐(14.2 g，0.0958 mol)存於甲苯(473 mL，4.44 mol)中之懸浮液中，且在回流下將反應混合物加熱18小時。將反應物冷卻至室溫，此時大量固體沈澱。將為期望產物之固體過濾，用EtOAc沖洗並收集。將濾液冷卻至0℃，過濾，且將固體用EtOAc沖洗並與第一批次合併。將濾液轉移至分液漏斗並用H₂O(200 mL)稀釋。分離各層，且用EtOAc(3×200 mL)萃取水層。將合併有機層用1×鹽水(100 mL)洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾並在真空下濃縮。將所得灰白色固體懸浮於EtOAc中，利用超音波處理破碎較大塊，且將懸浮液冷卻至0℃。將固體過濾並與先前2個批次合併。在真空下濃縮濾液，且將所得白色固體最後一次懸浮於Et₂O(100 mL)中，過濾並與先前3個批次合併。所有4個批次之固體之總產量係25.3 g(92%)。LCMS：(FA)ES+分子離子314，主要電離167；¹H NMR(400 MHz,DMSO)δ 7.83(s,4H),7.33(s,1H),7.27(d,J=8.2,1H),7.19(dd,J=2.0,8.1,1H),5.52(d,J=7.4,1H),5.34(d,J=5.2,1H),4.64(dt,J=6.9,12.7,1H),3.21(dd,J=7.4,16.1,1H),3.02(dd,J=6.1,16.1,1H)。

步驟6：2-[(1R,2S)-5-氯-2-甲氧基-2,3-二氫-1H-茚-1-基]-1H-異吲哚-1,3(2H)-二酮(7)

向2-[(1R,2S)-5-氯-2-羥基-2,3-二氫-1H-茚-1-基]-1H-異吲哚-1,3(2H)-二酮(25.8 g，0.0822 mol)存於四氫呋喃(186 mL，2.29 mol)中之溶液中添加碘甲烷(20.5 mL，0.329 mol)，且在0℃下攪拌溶液。經由添加漏斗經1小時向此溶液中逐滴添加存於四氫呋喃(90.4 mL，0.0904 mol)之1.00 M第三丁氧化鉀。經由添加0.1 N HCl(250 mL)使反應淬滅，並將其轉移至含有EtOAc(600 mL)之分液漏斗中。分離各層，且用1 N NaOH(2×各自100 mL)並用鹽水(100 mL)洗滌有機層。將有機層經Na₂SO₄乾燥，過濾並濃縮，從而提供2-[(1R,2S)-5-氯-2-甲氧基-2,3-二氫-1H-茚-1-基]-1H-異吲哚-1,3(2H)-二酮(25.8 g，96%)，其未經進一步純化即用於下一步驟中。

步驟7：(1R,2S)-5-氯-2-甲氧基二氫茚-1-胺(8)

向2-[(1R,2S)-5-氯-2-甲氧基-2,3-二氫-1H-茚-1-基]-1H-異吲哚-1,3(2H)-二酮(7)(25.8 g，0.0787 mol)存於乙醇(260 mL，4.4 mol)中之懸浮液中添加肼(4.94 mL，0.157 mol)，且向燒瓶黏附回流冷凝器並加熱至90℃之浴液溫度。攪拌幾分鐘後沈澱物開始形成，且加熱1小時後混合物已變成濃漿液/固體。將反應物冷卻至室溫，且將固體反應副產物過濾並用CH₂Cl₂(約300 mL)洗滌。在真空下自濾液去除揮發成份，且將殘餘物懸浮於CH₂Cl₂(250 mL)中，此時藉由過濾再次去除固體副產物。在真空下去除揮發成份，且將殘餘物再次懸浮於CH₂Cl₂(約50 mL)中。藉由過濾最後一次去除固體副產物，從而提供呈紅色/橙色蠟狀固體之(1R,2S)-5-氯-2-甲氧基二氫茚-1-胺(15.5 g，99%)。LCMS：(FA)ES+分子離子198，主要電離181；¹H NMR(400 MHz,DMSO)δ 7.30(d,J=7.9,1H),7.25-7.16(m,2H),4.14(d,J=4.9,1H),3.89(td,J=2.8,4.9,1H),3.29(s,3H),2.89(ddd,J=3.8,16.4,21.3,2H),2.04(s,2H)。對掌性HPLC(Chiralpak AD 4.6×250管柱，用95/5/0.1%環己烷/EtOH/DEA溶析，以1.0 ml/min-30 min運行)顯示>99%之ee。

實例2.胺磺酸{(1S,2S,4R)-4-[(6-{[(1R,2S)-5-氯-2-甲氧基-2,3-二氫-1H-茚-1-基]胺基}嘧啶-4-基)氧基]-2-羥基環戊基}甲酯(I-216)之合成

步驟1：rel-(1R,5R)-5-({[第三丁基(二甲基)甲矽烷基]氧基}甲基)環戊-2-烯-1-醇(10)。

在0℃下在氮之氣氛下，向rel-(1R,5R)-5-(羥基甲基)環戊-2-烯-1-醇(47.20 g，0.4135 mol)、N,N-二甲基胺基吡啶(2.52 g，0.0207 mol)及1H-咪唑(30.97 g，0.4549 mol)存於二氯甲烷(800 mL，10 mol)中之溶液中添加第三丁基二甲基甲矽烷基氯(28.0 g，0.186 mol)。在0℃下將反應物攪拌2.5 h，此時添加第三丁基二甲基甲矽烷基氯(28.0 g，0.186 mol)。將反應物再攪拌2小時。藉由添加飽和NaCl水溶液(200 mL)及水(200 mL)來使反應淬滅。分離各層，且將有機層用水(3×200 mL)及鹽水(1×200 mL)洗滌，經Na₂SO₄乾燥，過濾並在真空下濃縮。該材料未經進一步純化即用於下一步驟中。

步驟2：(1S,5S)-5-({[第三丁基(二甲基)甲矽烷基]氧基}甲基)環戊-2-烯-1-醇(11)

向rel-(1R,5R)-5-({[第三丁基(二甲基)甲矽烷基]氧基}甲基)-環戊-2-烯-1-醇(來自先前步驟之粗(10))及丙烯酸樹脂上之南極假絲酵母菌(24.9 g；10,800 units/g)存於甲基第三丁基醚(1500 mL，10 mol)中之懸浮液中添加乙酸乙烯基酯(190 mL，2.05 mol)，且將反應物攪拌過夜。藉由過濾去除固體，且在真空下去除揮發成份，從而提供澄清無色油狀物(143克)，藉由管柱層析法(1 kg矽膠管柱，溶析液0-30% Et₂O：環己烷)純化該油狀物，從而提供期望鏡像異構體(1S,5S)-5-({[第三丁基(二甲基)甲矽烷基]氧基}甲基)環戊-2-烯-1-醇(37.5克，79.5%)。對掌性HPLC；對掌性 Technologies Chiralpak AS RH(4.6×150 mm)5微米管柱，溶析液-55%(存於99：1 H₂O/CH₃CN中之0.1%甲酸)、45%(存於95：5 CH₃CN/H₂O中之0.1%甲酸)指示>99%之ee。¹H NMR(400 MHz,CDCl₃)δ 5.96-5.91(m,1H),5.86-5.80(m,1H),4.87(dd,J=2.3,4.9,1H),3.87(dd,J=4.7,10.1,1H),3.79(dd,J=7.7,10.1,1H),2.50-2.40(m,1H),2.35(ddt,J=2.0,8.4,16.8,1H),2.23-2.14(m,1H),0.90(s,9H),0.08(s,3H),0.07(s,3H)。以相應的乙酸酯形式分離不期望鏡像異構體且產率為81.6%。

步驟3：第三丁基[((1S,2S)-2-{[第三丁基(二甲基)甲矽烷基]氧基}環戊-3-烯-1-基)甲氧基]二甲基矽烷(12)

在烘箱乾燥且在氮下冷卻之2 L兩頸燒瓶中，向(1S,5S)-5-({[第三丁基(二甲基)甲矽烷基]氧基}甲基)環戊-2-烯-1-醇(11)(98.07 g，0.3864 mol)存於二氯甲烷(500 mL，8 mol)中之溶液中添加1H-咪唑(31.57 g，0.4637 mol)。經由添加漏斗經約30 min向所得黃色溶液中添加第三丁基二甲基甲矽烷基氯(58.2 g，0.386 mol)存於二氯甲烷(300 mL，5 mol)中之溶液。將混合物機械攪拌18小時。經由添加水(500 mL)使反應淬滅，且分離各層。將有機層用水(2×500 mL)洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾並濃縮在真空下，從而提供呈粗殘餘物形式之第三丁基[((1S,2S)-2-{[第三丁基(二甲基)甲矽烷基]氧基}環戊-3-烯-1-基)甲氧基]二甲基矽烷(143.3 g)，不進一步純化即使用該粗殘餘物。

步驟4：(1R,3S,4S)-3-{[第三丁基(二甲基)甲矽烷基]氧基}-4-({[第三丁基(二-甲基)甲矽烷基]氧基}甲基)環戊醇(13)

在2 L圓底燒瓶中，將第三丁基[((1S,2S)-2-{[第三丁基(二甲基)甲矽烷基]氧基}環戊-3-烯-1-基)甲氧基]二甲基矽烷(12)(12.08 g之粗殘餘物)與甲苯共沸3次，在真空下乾燥30分鐘，並在氬之氣氛下溶解於無水四氫呋喃(402.7 mL)中。向溶液中逐滴添加存於四氫呋喃(1.00 M，88.1 mL，0.0881 mol)中之兒茶酚硼烷。然後使氬鼓泡穿過20分鐘以使反應溶液去氧。然後添加叁(三苯基膦)氯化銠(I)(3.26 g，0.00352 mol)，且在室溫下在氬下將反應物攪拌18小時。向反應物中添加1.00 M存於水(528.8 mL，0.5288 mol)中之氫氧化鈉，接著小心添加過氧化氫溶液(35 wt%存於水中，30.79 mL，0.3525 mol)，且在室溫下將混合物攪拌4小時。經由添加飽和Na₂S₂O₃(500 mL)使反應淬滅，分離各層，且用EtOAc(2×300 mL)萃取水性層。將合併有機部分用鹽水洗滌，經Na₂SO₄乾燥，過濾並在真空中濃縮。藉由管柱層析法(溶析液0%至20%存於環己烷中之醚)純化褐色油狀物，從而提供(1R,3S,4S)-3-{[第三丁基(二甲基)甲矽烷基]氧基}-4-({[第三丁基(二-甲基)甲矽烷基]氧基}甲基)環戊醇(7.78 g，2步驟產率=66%)。¹H NMR(400 MHz,CDCl₃)δ 4.50(d,J=4.3,1H),4.34(td,J=2.7,4.8,1H),3.71(dd,J=7.0,10.0,1H),3.53(dd,J=7.0,10.0,1H),2.32-2.20(m,1H),2.04(ddd,J=2.6,6.7,13.9,1H),1.85(ddd,J=7.1,10.3,13.5,1H),1.73(dt,J=4.8,13.9,1H),1.63 (ddd,J=2.1,7.9,13.5,1H),1.35(s,1H),0.88(s,9H),0.86(s,9H),0.04(s,3H),0.03(s,9H)。

步驟5：4-{[(1R,3S,4S)-3-{[第三丁基(二甲基)甲矽烷基]氧基}-4-({[第三丁基(二甲基)甲矽烷基]氧基}甲基)環戊基]氧基}-6-氯嘧啶(14)

向火焰乾燥之50 mL圓底燒瓶中裝填氫化鈉(0.322 g，0.008 mol)及四氫呋喃(20 mL，0.3 mol)，且在氮之氣氛下將所得懸浮液冷卻至0℃。在0℃下，向懸浮液中逐滴添加(1R,3S,4S)-3-{[第三丁基(二甲基)甲矽烷基]氧基}-4-({[第三丁基(二甲基)甲矽烷基]氧基}甲基)環戊醇(13)(1.45 g，0.004 mol)存於0.5 mL THF中之溶液。在0℃下將混合物攪拌10分鐘，此時添加4,6-二氯嘧啶(0.659 g，0.004 mol)，且使混合物升溫至室溫並攪拌18小時。經由添加飽和NH₄Cl水溶液(25 mL)使反應淬滅並轉移至分液漏斗。分離各層且用第三BuOMe(3×25 mL)萃取水層。將合併有機層用鹽水洗滌，經無水MgSO₄乾燥、過濾並在真空下濃縮。藉由矽膠層析法(溶析液-0-10%存於環己烷中之EtOAc)純化所得油狀物，從而提供4-{[(1R,3S,4S)-3-{[第三丁基(二甲基)甲矽烷基]氧基}-4-({[第三丁基(二甲基)甲矽烷基]氧基}甲基)環戊基]氧基}-6-氯嘧啶(1.75 g，92%產率)。LCMS：(FA)ES+473；¹H NMR(300 MHz,CDCl₃)δ 8.55(d,J=0.7,1H),6.69(d,J=0.8,1H),5.61-5.49(m,1H),4.36(dd,J=4.6,6.8,1H),3.73(dd,J=7.0,10.0,1H),3.57(dd,J=6.7,9.9,1H),2.36-2.13(m,2H),2.10-1.73(m,3H),0.89 (s,9H),0.88(s,9H),0.08-0.00(m,12H)。

步驟6：{(1S,2S,4R)-2-{[第三丁基(二甲基)甲矽烷基]氧基}-4-[(6-氯嘧啶-4-基)氧基]環戊基}甲醇(15)

在2 L圓底燒瓶中，將4-{[(1R,3S,4S)-3-{[第三丁基(二甲基)甲矽烷基]-氧基}-4-({[第三丁基(二甲基)甲矽烷基]氧基}甲基)環戊基]氧基}-6-氯嘧啶(14)(20.5 g，0.0433 mol)溶解於乙醇(647.2 mL，11.08 mol)中，並冷卻至-45℃之內部溫度。向此溶液中添加濃HCl存於EtOH中之2%預冷卻(-20℃)溶液(326 mL，0.0516 mol，藉由將6.5 mL濃HCl稀釋於319.5 mL乙醇中製得)。將反應混合物升溫至-25℃(以防止在燒瓶加蓋後累積壓力)，且然後加蓋並置於在-35℃下之冷凍器中。使反應物在-35℃下靜置18小時。利用碳酸鈉(13.78 g，0.1300 mol，相對於HCl約3當量)存於水(40 mL，2 mol)中之溶液來使反應淬滅。在真空下去除揮發成份，且用CH₂Cl₂(750 mL)稀釋反應混合物。過濾固體並擱置一旁，且在真空下自濾液去除揮發成份。將所得水性混合物用EtOAc(500 mL)及水(200 mL)稀釋並轉移至分液漏斗。分離各層，且用EtOAc(2×250 mL)萃取水層。將合併有機層經Na₂SO₄乾燥，過濾並在真空下濃縮。藉由管柱層析法(施加至具有約50 mL CH₂Cl₂之管柱，400 g管柱，溶析液為0-40% EtOAc：環己烷經40 min)純化粗殘餘物，從而提供{(1S,2S,4R)-2-{[第三丁基(二甲基)甲矽烷基]氧基}-4-[(6-氯嘧啶-4-基)氧基]環戊基}甲醇(11.2 g，72%)。LCMS：(FA)ES+359；¹H NMR(400 MHz,CDCl₃)δ 8.56 (app d,J=0.6,1H),6.70(app d,J=0.8,1H),5.62-5.54(m,1H),4.56(dd,J=5.6,10.9,1H),3.86-3.78(m,1H),3.70(ddd,J=6.0,7.6,11.3,1H),2.48(dd,J=4.6,7.6,1H),2.42-2.31(m,1H),2.23(ddd,J=6.3,9.8,14.2,1H),2.15-2.09(m,2H),1.89(ddd,J=1.9,8.0,14.3,1H),0.91(s,9H),0.12(s,3H),0.11(s,3H)。

步驟7：{(1S,2S,4R)-2-{[第三丁基(二甲基)甲矽烷基]氧基}-4-[(6-{[(1R,2S)-5-氯-2-甲氧基-2,3-二氫-1H-茚-1-基]胺基}嘧啶-4-基)氧基]環戊基}甲醇(16)

在350 mL可密封反應容器中，向{(1S,2S,4R)-2-{[第三丁基(二甲基)甲矽烷基]氧基}-4-[(6-氯嘧啶-4-基)氧基]環戊基}甲醇(15)(11.2 g，0.0312 mol)及N,5-二氯-2-甲氧基-2,3-二氫-1H-茚-1-胺(9.00 g，0.0384 mol)存於1-丁醇(99.2 mL，1.09 mol)中之溶液中添加三乙胺(21.7 mL，0.156 mol)。將溶液密封且然後在油浴中在攪拌下加熱至148℃，持續72小時。將溶液冷卻至室溫，且在真空下去除揮發成份，且將Et₂O(200 mL)添加至所得殘餘物中。藉由超音波處理使固體均勻化，過濾並用Et₂O(50 mL)沖洗。向濾液中添加Celite^®(100 mL)，且在真空下去除揮發成份。將吸附至Celite^®上之產物添加至乾加載筒中，並經由管柱層析法(400 g管柱，溶析液經80 min 0-80% EtOAc：環己烷)純化，從而提供{(1S,2S,4R)-2-{[第三丁基(二甲基)甲矽烷基]氧基}-4-[(6-{[(1R,2S)-5-氯-2-甲氧基-2,3-二氫-1H-茚-1-基]胺基}嘧啶-4-基)氧基]環戊基}甲醇 (11.5 g，71%)。LCMS：(FA)ES+520；¹H NMR(400 MHz,CDCl₃)δ 8.31(s,1H),7.24-7.13(m,3H),5.75(s,1H),5.56(s,1H),5.45(dt,J=2.9,5.8,2H),4.57(dd,J=5.9,11.2,1H),4.19(td,J=1.3,4.7,1H),3.84-3.77(m,1H),3.75-3.65(m,1H),3.37(s,3H),3.10(d,J=16.6,1H),2.97(dd,J=4.5,16.7,1H),2.58(dd,J=4.8,7.4,1H),2.43-2.32(m,1H),2.23-2.06(m,3H),1.90(dd,J=8.0,14.2,1H),0.91(s,9H),0.11(s,3H),0.10(s,3H)。

步驟8：胺磺酸{(1S,2S,4R)-4-[(6-{[(1R,2S)-5-氯-2-甲氧基-2,3-二氫-1H-茚-1-基]胺基}嘧啶-4-基)氧基]-2-羥基環戊基}甲酯(I-216)

向{(1S,2S,4R)-2-{[第三丁基(二甲基)甲矽烷基]氧基}-4-[(6-{[(1R,2S)-5-氯-2-甲氧基-2,3-二氫-1H-茚-1-基]胺基}嘧啶-4-基)氧基]環戊基}甲醇(16)(11.5 g，0.0221 mol)存於N,N-二甲基乙醯胺(160 mL，1.7 mol)中之溶液中添加氯磺醯胺(6.64 g，0.0575 mol)，且在室溫下將反應物攪拌1小時。然後將反應混合物冷卻至0℃，此時經由添加漏斗經25 min逐滴添加12 M鹽酸(90 mL，1.1 mol)，保持內部反應溫度低於50℃。一旦添加完成，即去除冷卻浴且在攪拌下使反應物升溫至室溫，持續2小時。接著小心地經由緩慢添加碳酸鈉(70.30 g，0.6633 mol)存於水(200.0 mL，11.10 mol)中之懸浮液來使反應淬滅。過濾所得懸浮液，且用EtOAc(3此沖洗，總共800 mL)沖洗固體。將固體擱置一旁，且將濾液轉移分液漏斗，且分離各層。用 3×EtOAc(總EtOAc-2000 mL)萃取水性層，將合併有機層經Na₂SO₄乾燥，過濾並在真空下濃縮。經由管柱層析法(施加有CH₂Cl₂，400 g管柱，溶析液為0-10% MeOH：CH₂Cl₂經80 min然後係10% MeOH：CH₂Cl₂經20 min)純化粗殘餘物，從而提供胺磺酸{(1S,2S,4R)-4-[(6-{[(1R,2S)-5-氯-2-甲氧基-2,3-二氫-1H-茚-1-基]胺基}嘧啶-4-基)氧基]-2-羥基環戊基}甲酯(10.3 g，96%)。LCMS：(FA)ES+485；¹H NMR(400 MHz,MeOD)δ 8.16(s,1H),7.25(s,1H),7.22-7.13(m,2H),5.98(s,1H),5.52(d,J=32.8,1H),5.34(s,1H),4.43-4.35(m,1H),4.32(dd,J=7.5,9.8,1H),4.22(td,J=2.5,5.0,1H),4.16(dd,J=7.3,9.8,1H),3.34(s,4H),3.10(dd,J=2.1,16.6,1H),3.02(dd,J=4.8,16.6,1H),2.58-2.46(m,1H),2.28(ddd,J=2.2,6.9,14.8,1H),2.12-1.90(m,4H)。

步驟9：胺磺酸{(1S,2S,4R)-4-[(6-{[(1R,2S)-5-氯-2-甲氧基-2,3-二氫-1H-茚-1-基]胺基}嘧啶-4-基)氧基]-2-羥基環戊基}甲酯HCl鹽(I-216 HCl形式I)

將胺磺酸{(1S,2S,4R)-4-[(6-{[(1R,2S)-5-氯-2-甲氧基-2,3-二氫-1H-茚-1-基]胺基}嘧啶-4-基)氧基]-2-羥基環戊基}甲酯(I-216)(24.1 g，0.0497 mol)置於配備有攪拌棒之500-ml rbf中。在攪拌下添加乙腈(500 mL)。對混合物進行1分鐘超音波處理，且然後在室溫下在氮之氣氛下將其攪拌1小時，以確保固體完全分散。以緩慢物流添加鹽酸水溶液(6.0 M，9.15 mL，0.0549 mol)該溶液變得更稀，但整個溶液不會如此。用先前製得之I-216 HCl鹽(如下文實例3中所述製備)之少量晶體加晶種混合物，且對混合物進行1分鐘聲處理，然後在室溫下在氮之氣氛下攪拌2小時；混合物變得極濃，在此期間以白色固體形式自溶液沈澱。將經攪拌混合物用二乙醚(500 mL)稀釋且然後儲存於冷凍機中過夜。將沈澱物收集於燒結玻璃漏斗上，用醚洗滌，然後在真空下在40℃下乾燥過夜，從而留下24.37 g(94%產率)呈白色蓬鬆結晶粉末之標題化合物。¹H NMR(400 MHz,DMSO)δ 8.44(s,1 H),8.38(s,2 H),7.43(s,2H),7.36(s,1H),7.23(dd,J=20.1,8.1 Hz,3H),6.22(s,1H),5.68(s,1H),5.26(s,1H),4.31-4.12(m,4H),4.09-3.92(m,1H),3.05(s,3H),2.36(dt,J=18.8,7.6 Hz,1H),2.21(dd,J=14.0,6.5 Hz,1H),2.05-1.93(m,2H),1.89(dd,J=13.3,8.3 Hz,1H)。LCMS：甲酸，[M+H+]=485.3。對掌性HPLC(Chiralcel OJ 4.6×250管柱，利用60/40/0.1%環己烷/EtOH/DEA溶析，以0.75 ml/min-60 min運行)表明產物為99.7% ee。HPLC分析表明產物為99.2%純。此實例2中產生之I-216 HCl形式I之XRPD數據係顯示於圖7中。圖7中所鑑別之峰包括彼等表5中所列示者。

此實例2中產生之I-216 HCl形式I之DSC數據係顯示於圖 8中，且此實例2中產生之I-216 HCl形式I之TGA數據係顯示於圖9中。

實例3.胺磺酸{(1S,2S,4R)-4-[(6-{[(1R,2S)-5-氯-2-甲氧基-2,3-二氫-1H-茚-1-基]胺基}嘧啶-4-基)氧基]-2-羥基環戊基}甲酯鹽酸鹽(I-216 HCl)之合成。

將胺磺酸{(1S,2S,4R)-4-[(6-{[(1R,2S)-5-氯-2-甲氧基-2,3-二氫-1H-茚-1-基]胺基}嘧啶-4-基)氧基]-2-羥基環戊基}甲酯I-216(4.44 g，0.00916 mol)置於配備有攪拌棒之250-ml圓底燒瓶。在攪拌下添加乙腈(82.5 mL)。攪拌混合物，並對其進行幾分鐘聲處理(固體未完全溶解)。將燒瓶浸泡於冰浴中，且然後在攪拌下以緩慢物流添加鹽酸水溶液(6.0 M，1.69 mL，0.0101 mol)，在此期間固體部分溶解。去除冰浴，且在室溫下在氮之氣氛下將反應混合物攪拌2小時，在此期間形成白色緻密沈澱物。在攪拌下添加二乙醚(82.5 mL)，且將所得混合物儲存於冷凍機中過夜。將所沈澱產物收集於燒結漏斗上，用冷醚洗滌，然後在42℃下在高真空下乾燥24小時，從而提供3.84 g(80%產率)呈白色蓬鬆粉末之標題化合物。LCMS：甲酸，[M+H+]=485.2。

¹H NMR(400 MHz,MeOD)δ 8.42(s,1H),7.30(s,1H),7.27-7.18(m,2H),6.26(s,1H),5.78(s,1H),5.30(s,1H),4.46-4.38(td,J=5.2,2.0 Hz,1H),4.39-4.25(m,2H),4.23-4.13(dd,J=9.9,7.4 Hz,1H),3.37(s,3H),3.18-3.04(m,2H),2.62-2.47(m,1H),2.42-2.31(ddd,J=15.0,6.9,2.0 Hz,1H),2.24-2.14(dt,J=15.0,4.6 Hz,1H),2.14-2.02(dd, J=10.3,5.9 Hz,2H)。

實例4.(1R,2S)-5-氯-2-甲氧基-2,3-二氫-1H-茚-1-胺鹽酸鹽(20)之合成

步驟1：5-氯-2-甲氧基-2,3-二氫-1H-茚-1-酮(18)

向配備有溫度探針、氮入口、冷卻浴及頂置式機械攪拌器之22 L多頸反應器中裝填甲醇(2400 mL)，並將其冷卻至-20℃。經由添加漏斗經1小時裝填硫酸(384 mL，7.22 mol)。將溫度維持在約-25℃下，並以-18℃為頂點並持續約5分鐘。經10分鐘添加原甲酸三甲酯(906 mL，8.3 mol)，接著添加呈固體之5-氯-2,3-二氫-1H-茚-1-酮(17)(600.00 g，3.61 mol)。內部溫度稍微升高2℃。經20分鐘將Koser試劑(1553 g，3.97 mol)溶解於甲醇(2400 mL)中，將其經1小時15分鐘添加至反應容器中。添加為放熱的，且將內部溫度維持在約-20℃下。添加完成後，在-20℃下將深紅色溶液攪拌1小時，此時HPLC分析表明完全轉化成期望產物。以小份形式添加水(7200 mL)。添加少量水(約50 mL)後，產物突然沈澱。攪動變得緩慢且困難。在0~10℃下將混合物攪拌1小時，並藉助3000 mL粗孔燒結漏斗過濾。過濾在2小時後完成，且用水(7200 mL)沖洗濾餅，直至濾液之pH達到約5為止。將濕濾餅添加回反應器中，且添加庚烷(3000 mL)。在-20℃下將混合物攪拌1 h並過濾。將濾餅用庚烷(1200 mL)沖洗並條件化30分鐘。在高真空下將濕濾餅乾燥3天，以完全去除庚烷並將水含量降低至<2%。材料具有藉由wt%分析得到之99%(藉由 HPLC得到之AUC)及93 wt%之純度(622.88 g，88%)。¹H NMR(300 MHz,CDCl3,δ)：7.69(m,1H),7.43(s,1H),7.38(m,1H),4.18(m,1H),3.63(s,3H),3.47(m,1H)及2.99(m,1H)。

步驟2：(R,E)-N-((S)-5-氯-2-甲氧基-2,3-二氫-1H-茚-1-亞基)-2-甲基丙烷-2-亞磺醯胺(19)

向配備有冷凝器、氮入口、加熱套膜及頂置式機械攪拌器之22 L多頸反應器中裝填5-氯-2-甲氧基-2,3-二氫-1H-茚-1-酮(18)(622.88 g，3.17 mol)及(R)-第三丁基亞磺醯胺(460.7 g，3.8 mol)。將四氫呋喃(3100 mL)添加至混合物中，且溫度下降至9℃。經10分鐘添加Ti(OEt)₄(985 mL，4.76 mol)。將混合物加熱至68℃，且所有固體在約35℃下溶解。5小時後，反應達成50%產率，如藉由HPLC wt%分析所測定。在68℃下將反應物再攪拌5小時，直至不期望非鏡像異構體分解至小於5%(AUC)為止。經2小時將反應物冷卻至室溫並攪拌16小時。HPLC分析表明在此期間反應曲線無明顯變化。此粗反應混合物未經進一步純化即用於下一步驟中。

步驟3及4：(1R,2S)-5-氯-2-甲氧基-2,3-二氫-1H-茚-1-胺鹽酸鹽(20)

向配備有氮入口、冷卻浴及頂置式機械攪拌器之22 L多頸反應器中裝填存於四氫呋喃(4000 mL)中之粗(R,E)-N-((S)-5-氯-2-甲氧基-2,3-二氫-1H-茚-1-亞基)-2-甲基丙烷-2-亞磺醯胺(21)[大約475 g，大約1.58 mol]。以小份形式添加甲醇(9300 mL)。未觀測到明顯溫度變化。使用丙酮/乾冰浴將混合物冷卻至-24℃。向2 L三頸圓底燒瓶中裝填三甘醇二甲醚(528 mL)並冷卻至9℃。以小份形式添加NaBH₄(60.2 g，1.58 mol)。溫度稍微升高1℃。將混合物升溫至室溫並攪拌2小時，直至所有固體溶解為止，從而提供稍微渾濁溶液。在-24℃下經50分鐘將NaBH₄溶液裝填至22 L反應器中。藉由添加速率控制放熱。未觀測到明顯氣體釋放。添加完成後，在-24℃下將混合物再攪拌2小時，此時HPLC分析指示反應完全及92% dr。經3小時將混合物升溫至室溫並攪拌16小時。將反應物再次冷卻至約7℃，且以份形式添加水(950 mL)，從而使得內部溫度升高5℃。添加矽藻土(475 g)且將混合物攪拌1小時。然後藉助大臺式過濾器(內徑：19 in)過濾混合物，且用甲醇(4000 mL)沖洗過濾器濾餅。最後一份濾液之HPLC分析表明無顯著量之產物。在減壓下將合併濾液濃縮至約6 L之體積。添加乙酸異丙酯(950 mL)，且允許層分離。用乙酸異丙酯(900 mL)萃取水性層，且用飽和鹽水(2000 mL)洗滌合併有機層。然後將溶液經硫酸鈉乾燥並濃縮至約2 L。然後將混合物與四氫呋喃(3000 mL×2)一起以共沸方式蒸餾。卡耳-費雪(Karl-Fischer)分析指示約0.2%之水含量。

向配備有氮入口、冷卻浴及頂置式機械攪拌器之22 L多頸反應器中裝填粗磺醯基中間物(大約475 g，大約1.58 mol)及2-甲基-四氫呋喃(9500 mL)。將溶液冷卻至-20℃，且經40分鐘添加存於二噁烷(800 mL，3.16 mol)中之4 M鹽酸。放熱不明顯。添加快結束時產物沈澱出。在-20℃下將混合物再攪拌1小時，此時HPLC分析表明轉化完全。藉助大Büchner漏斗(內徑：11 in)過濾混合物。過濾花費2小時。將過濾器濾餅用丙酮(1000 mL)沖洗並條件化1小時。然後將固體轉移回反應器中，且添加丙酮(3500 mL)。在室溫下將混合物攪拌16小時且然後過濾。將濾餅用丙酮(500 mL)沖洗，且然後在真空下乾燥16小時。提供大約293 g呈灰白色固體之產物。HPLC分析指示96%純度及96% ee。向配備有冷凝器、氮入口、加熱套膜及頂置式機械攪拌器之22 L多頸反應器中裝填(1R,2S)-5-氯-2-甲氧基-2,3-二氫-1H-茚-1-胺鹽酸鹽(20)(290 g，1.24 mol)及乙醇(5200 mL)。將混合物攪拌1小時，且提供稍微渾濁溶液。藉助細粒燒結漏斗過濾混合物，且將澄清濾液裝填回反應器中。將溶液加熱至55℃並攪拌30分鐘。經1.5小時添加2-甲氧基-2-甲基丙烷(5200 mL)，且在添加期間將溫度維持在55℃下。在添加快結束時固體沈澱。在55℃下將所得白色懸浮液再攪拌1小時，並經2小時緩慢冷卻至室溫。在室溫下將混合物攪拌2天，且然後藉助大Büchner漏斗(內徑：11 in)過濾。將濾餅用MTBE(1000 mL)沖洗並在真空下乾燥16小時。提供呈白色固體之產物(184.4 g，50%,>99% AUC,>99% ee)。¹H NMR(300 MHz,CD3OD,δ)：7.50(m,1H),7.37(m,2H),4.78(m,1H),4.40(m,1H),3.51(s,3H)及3.19(m,1H)。

實例5.胺磺酸((1S,2S,4R)-4-(6-((1R,2S)-5-氯-2-甲氧基-2,3- 二氫-1H-茚-1-基胺基)嘧啶-4-基氧基)-2-羥基環戊基)甲酯鹽酸鹽形式I(I-216 HCl形式I)之合成

步驟1：((1R,4S)-4-(苄基氧基)-3-(苄基氧基甲基)環戊-2-烯基氧基)三甲基矽烷(22)

在-15℃下在氮之氣層下向二丙胺(212 mL，1.55 mol)存於2-甲氧基-2-甲基丙烷(2000 mL)中之溶液中，經10分鐘緩慢添加存於環己烷(567 mL，1.42 mol)中之2.50 M n-丁基鋰，維持小於-10℃之溫度。在-15℃下將所得白色懸浮液攪拌30分鐘。經30分鐘向此懸浮液中以存於甲基第三丁基醚(1200 mL)中之溶液形式緩慢添加(1S,2R,3S,5R)-3-(苄基氧基)-2-(苄基氧基甲基)-6-氧雜雙環[3.1.0]環己烷(21)(400.00 g，1.29 mol)，維持小於-10℃之內部溫度。在-15℃下將反應混合物攪拌30分鐘。TLC分析表明無剩餘起始材料(20%乙酸乙酯/庚烷)。添加氯三甲基矽烷(204 mL，1.61 mol)，同時維持小於-10℃之溫度。使混合物升溫至0℃並攪拌30分鐘。TLC分析表明無醇中間物(20%乙酸乙酯/庚烷)。利用緩慢添加水(4 L)使反應混合物淬滅，同時維持小於8℃之內部溫度。分離水性層，且將有機層用水(3×4 L)萃取3次並用存於水(4 L)中之飽和氯化鈉萃取1次。在減壓下濃縮有機層，從而得到橙色油狀物(480 g，97.4%)，不進一步純化即使用該油狀物。¹H NMR(300 MHz,CD3OD,δ)：7.18(m,10H),5.65(s,1H),4.55(t,1H),4.30(m,5H),4.02(s,2H),2.58(m,1H),1.47(m,1H)及0.00(s,9H)。

步驟2：(1S,3S,4S)-3-(苄基氧基)-4-(苄基氧基甲基)環戊醇(23)

向((1R,4S)-4-(苄基氧基)-3-(苄基氧基甲基)環戊-2-烯基氧基)三甲基矽烷(22)(478.00 g，1.2494 mol)存於四氫呋喃(9.6 L)中之溶液中，添加5 wt%在硫酸鋇上之Pd(265.9 g，0.1249 mol)，且在100 psi之氫下在室溫下將混合物攪拌18小時，以200 rpm攪拌。18小時後HPLC分析指示起始材料之消耗。藉助中等燒結漏斗過濾反應混合物，且用四氫呋喃(2000 mL)洗滌該床。濃縮濾液，從而得到黃色油狀物。將所得油狀物吸收於其中添加2.0 M存於水(2000 mL)中之鹽酸之乙酸乙酯(2000 mL)中，且將雙相混合物攪拌1小時。將有機層分離，並用存於水(2000 mL)中之飽和碳酸氫鈉萃取1次，用2.0 M存於水(2000 mL)中之氫氧化鈉萃取2次，且最後用存於水(2000 mL)中之飽和氯化鈉萃取。濃縮有機層，從而得到褐色油狀物(344 g，88%)，不進一步純化即使用該油狀物。¹H NMR(300 MHz,CD3OD,δ)：7.18(m,10H),4.38(m,4H),4.12(m,1H),3.85(t,1H),3.68(m,1H),3.44(m,1H),2.00(m,3H),1.75(m,1H)及1.42(m,1H)。

步驟3：(1R,3S,4S)-3-(苄基氧基)-4-(苄基氧基甲基)環戊醇(24)

在0℃下在氮之氣層下，向(1S,3S,4S)-3-(苄基氧基)-4-(苄基氧基甲基)環戊醇(23)(340.00 g，1088.3 mmol)存於二氯甲烷(3400 mL)及三乙胺(455.08 mL，3265.0 mmol)中之溶液中，緩慢添加甲磺醯氯(92.661 mL，1197.2 mmol)，維持小於10℃之溫度。使反應物升溫至室溫並攪拌1小時。HPLC表明起始材料消耗完全。將反應混合物冷卻至0℃並利用水(1700 mL)淬滅，維持小於10℃之溫度。將有機物分離，並用水(1700 mL)萃取2次並用存於水(1700 mL)中之飽和碳酸氫鈉萃取2次。添加硫酸鈉(50 g)，並將混合物攪拌10分鐘。過濾漿液且濃縮濾液，從而得到褐色油狀物。將油狀物吸收於其中添加乙酸四丁基銨(656.28 g，2176.7 mmol)之四氫呋喃(3400 m)中，且在室溫下將混合物攪拌20小時。HPLC分析表明起始材料消耗完全。將反應混合物濃縮至約2體積(700 mL)，且添加乙酸乙酯(3400 mL)，且將混合物用水(1700 mL)萃取3次並用存於水(1700 mL)中之飽和氯化鈉萃取1次。濃縮有機物，且藉助矽膠塞(1 kg)利用0-20%乙酸乙酯/環己烷[乙酸乙酯(4 L)+環己烷(16 L)]溶析所得殘餘物。將期望部分合併並濃縮，從而得到褐色殘餘物。向所得殘餘物中添加甲醇(4000 mL)，接著添加氫氧化鈉(130.59 g，3265.0 mmol)存於水(2000 mL)中之混合物，且在室溫下將反應混合物攪拌1小時。HPLC分析表明起始材料消耗完全。濃縮反應混合物中之大部分甲醇，且添加水(1700 mL)。將混合物用乙酸乙酯(3×1700 mL)萃取3次。將合併有機物用存於水(1700 mL)中之飽和氯化鈉洗滌，並經硫酸鈉(50 g)乾燥。將所得漿液過濾並濃縮，從而得到淺褐色油狀物(238 g，70%)。¹H NMR(300 MHz,CD3OD,δ)：7.28(m,10H),4.50(m,3H),4.38 (m,2H),4.12(t,1H),3.70(m,1H),3.45(m,1H),2.52(m,1H),2.11(m,1H)及1.75(m,3H)。

步驟4：4-((1R,3S,4S)-3-(苄基氧基)-4-(苄基氧基甲基)環戊基氧基)-6-氯嘧啶(25)

在0℃下，在氮之氣層下，向(1R,3S,4S)-3-(苄基氧基)-4-(苄基氧基甲基)環戊醇(24)(226.500 g，725.026 mmol)存於四氫呋喃(1150 mL)中之溶液中，逐份添加60%存於礦物油中之NaH(86.995 g，2175.1 mmol)，維持小於10℃之溫度。然後經30分鐘添加4,6-二氯嘧啶(118.81 g，797.53 mmol)存於四氫呋喃(1150 mL)中之溶液，維持小於5℃之溫度。使混合物升溫至室溫並攪拌24小時。HPLC分析表明反應混合物含有74%起始材料。利用水(1150 mL)與存於水(1150 ml)中之飽和氯化銨之混合物使反應混合物淬滅，維持小於10℃之溫度。將四氫呋喃層分離並濃縮至約2體積(500 mL)。將水層用乙酸乙酯(1150 mL)萃取2次。將有機層合併，並用水(1150 mL)洗滌2次並用存於水(1150 mL)中之飽和氯化鈉萃取1次。然後濃縮有機物。將殘餘物吸收於四氫呋喃(2300 mL)中並在氮之氣層下冷卻至0℃。逐份添加60%存於礦物油中之NaH(86.995 g，2175.1 mmol)，維持小於10℃之溫度。使混合物升溫至室溫並攪拌16小時。HPLC分析表明反應完全。利用水(1150 mL)與存於中水(1150 mL)之飽和氯化銨之混合物使反應混合物淬滅。將四氫呋喃層分離並濃縮至約2體積(500 mL)。將水層用乙酸乙酯(1150 mL)萃取2次。將有機層合併，並用水(1150 mL)洗滌2次並用存於水(1150 ml)中之飽和氯化鈉萃取1次。然後濃縮有機物，從而得到粗中間物4-((1R,3S,4S)-3-(苄基氧基)-4-(苄基氧基甲基)環戊基氧基)-6-氯嘧啶。此粗反應混合物未經進一步純化即用於下一步驟中。

步驟5：(1S,2S,4R)-4-(6-氯嘧啶-4-基氧基)-2-(羥基甲基)環戊醇(26)

將粗中間物4-((1R,3S,4S)-3-(苄基氧基)-4-(苄基氧基甲基)環戊基氧基)-6-氯嘧啶(25)吸收於二氯甲烷(3000 mL)中，且將混合物冷卻至0℃。緩慢添加1.0 M存於二氯甲烷(1087.538 mL，1087.538 mmol)中之三氯-硼烷，維持<10℃。在0℃下允許所得混合物攪拌1小時。HPLC分析指示起始材料之消耗。將反應混合物緩慢添加至存於水(2300 mL)中之飽和碳酸氫鈉中，且允許雙相混合物攪拌20分鐘。分離二氯甲烷層，且用二氯甲烷(2300 mL)將水層萃取2次。將有機物合併並濃縮。藉助矽膠(1 kg)塞利用50%至100%乙酸乙酯/環己烷(環己烷(6 L)+乙酸乙酯(14 L)溶析來純化殘餘物。將期望部分合併並濃縮，從而得到紅色固體(124 g，70%)。¹H NMR(300 MHz,CD3OD,δ)：8.58(s,1H),6.91(s,1H),5.61(m,1H),4.39(t,1H),3.75(m,1H),3.61(m,1H),2.25(m,3H)及2.00(m,2H)

步驟6：(1S,2S,4R)-4-(6-((1R,2S)-5-氯-2-甲氧基-2,3-二氫-1H-茚-1-基胺基)嘧啶-4-基氧基)-2-(羥基甲基)環戊醇(27)

向500 ml Parr壓力容器中添加存於N-甲基吡咯啶酮(200 mL)中之(1S,2S,4R)-4-(6-氯嘧啶-4-基氧基)-2-(羥基甲基)環戊醇(26)(25.00 g，102.2 mmol)。向此混合物中添加(1R,2S)-5-氯-2-甲氧基-2,3-二氫-1H-茚-1-胺鹽酸鹽(31.10 g，132.8 mmol)，接著添加N,N-二異丙基乙基胺(88.99 mL，510.9 mmol)。然後將溶液密封，利用30 psi之氮加壓並加熱至130℃，持續22小時。在反應物達到溫度時壓力升高至50 psi，並在反應過程期間保持。22小時後，將反應物冷卻至室溫，且排出壓力。將二氯甲烷(250 mL)添加至反應混合物，且然後用存於中水(250 mL)之飽和碳酸氫鈉萃取此。然後將有機層用水(250 mL)萃取4次並用存於中水(250 mL)之飽和氯化鈉萃取1次。然後將有機層經硫酸鈉(7.5 g)乾燥、過濾並濃縮。向黑色半固體油狀物中添加乙腈(250 mL)，且在室溫下將混合物攪拌2小時。在此期間灰棕色固體沈澱，並將其過濾並在減壓下在40℃下乾燥16小時。提供淺灰棕色固體(17 g,41%)。¹H NMR(300 MHz,CD3OD,δ)：8.19(s,1H),7.25(s,1H),7.18(m,2H),5.97(s,1H),5.58(m,1H),5.30(m,1H),4.41(m,1H),4.22(m,1H),3.76(m,1H),3.61(m,1H),3.30(s,3H),3.05(m,2H),2.30(m,2H)及1.97(m,3H)。

步驟7：胺磺酸((1S,2S,4R)-4-(6-((1R,2S)-5-氯-2-甲氧基-2,3-二氫-1H-茚-1-基胺基)嘧啶-4-基氧基)-2-羥基環戊基)甲酯(I-216)

將(1S,2S,4R)-4-(6-((1R,2S)-5-氯-2-甲氧基-2,3-二氫-1H-茚-1-基胺基)嘧啶-4-基氧基)-2-(羥基甲基)環戊醇(27)(85.00 g，209.4 mmol)溶解於3 L反應器中之N-甲基吡咯啶酮(510 mL)中。以1份形式向此溶液中添加(4-氮雜-1-氮鎓雙環[2.2.2]辛-1-基磺醯基)(第三丁氧基羰基)氮基-1,4-二氮雜雙環[2.2.2]辛烷(1：1)鹽酸鹽(如實例6中所述製得)(368 g，838 mmol)，接著緩慢添加乙腈(255 mL)。在室溫下將所得濃漿液攪拌3小時。反應完成後，在室溫下緩慢添加水(595 mL)。向所得混合物中添加乙酸乙酯(1.70 L)。將有機層分離，並用水(2×595 mL)洗滌2次並用存於水(595 mL)中之飽和氯化鈉洗滌1次。將合併水性層用乙酸乙酯(850 mL)萃取3次。將合併有機層經硫酸鈉(20 g)乾燥、過濾並濃縮。將殘餘物吸收於乙腈(680 mL)中，將所得溶液冷卻至小於5℃之溫度。緩慢添加存於水(255 mL，3060 mmol)中之12.0 M鹽酸，維持小於10℃之內部溫度，且在室溫下將所得混合物攪拌13小時。HPLC表明無Boc保護中間物剩餘。將反應混合物緩慢添加至存於水(850 mL)中之飽和碳酸鈉與水(850 mL)之混合物中，維持<20℃。然後添加乙酸乙酯(850 mL)。將有機層分離，並用水(850 mL)萃取2次並用存於水(850 mL)中之飽和氯化鈉萃取1次。將水性層合併，並用乙酸乙酯(850 mL)萃取2次。將有機物合併，並經硫酸鈉(20 g)乾燥，過濾並濃縮。將所得殘餘物溶解於二氯甲烷(170 mL)中，並藉助二氧化矽塞(1 Kg)利用4 L之二氯甲烷、4 L之二氯甲烷/乙酸乙酯(1：1) 及最後8 L乙酸乙酯溶析。將期望部分合併並濃縮，從而得到黃色半固體(71 g)，含有殘餘NMP。¹H NMR(300 MHz,CD3OD,δ)：8.19(s,1H),7.25(s,1H),7.18(m,2H),5.97(s,1H),5.58(m,1H),5.35(m,1H),4.35(m,2H),4.15(m,2H),3.30(s,3H),3.05(m,2H),2.51(m,1H),2.30(m,2H)及2.00(m,2H)。

步驟8：胺磺酸((1S,2S,4R)-4-(6-((1R,2S)-5-氯-2-甲氧基-2,3-二氫-1H-茚-1-基胺基)嘧啶-4-基氧基)-2-羥基環戊基)甲酯鹽酸鹽形式I(I-216 HCl形式I)之製備

在3頸3 L反應器中，使來自步驟7之粗I-216(142.00 g，292.81 mmol)在異丙基醇(710 mL)中成漿，且將混合物加熱至60℃，持續20分鐘。然後極緩慢添加存於水中之6.0 M鹽酸(97.604 mL，585.62 mmol)，且在60℃下將混合物攪拌10分鐘。添加10 ml之6 M HCl後觀測到完全溶解，其中放熱為7℃。將反應混合物冷卻至50℃，並用先前製得之I-216 HCl形式I(如下文實例7中製得)(100 mg)加晶種。固體開始緩慢沈澱，且允許在50℃下將此漿液攪拌60分鐘。經1小時緩慢添加乙酸異丙酯(1420 mL)，維持>45℃。使混合物冷卻至室溫並攪拌2小時，冷卻至<5℃並攪拌2小時。過濾固體，且重力洗滌用乙酸1-甲基乙酯(710 mL)該床。在減壓下在45℃下將固體乾燥16小時，從而得到白色固體(113.5 g，經2個步驟後為51%)。¹H NMR(300 MHz,CD3OD,δ)：8.48(s,1H),7.33(s,1H),7.22(m,2H),6.30(m,1H),5.82(m,1H),5.31(m,1H),4.44(t,1H),4.30 (m,2H),4.18(m,1H),3.35(s,3H),3.15(m,2H),2.55(m,1H),2.38(m,1H)及2.17(m,3H)。LCMS：R_f=9.30 min,ES⁺=485(FA)。形式I之XRPD數據係顯示於圖4中。形式I之DSC數據係顯示於圖5中，且形式I之TGA數據係顯示於圖6中。

實例6：(4-氮雜-1-氮鎓雙環[2.2.2]辛-1-基磺醯基)(第三丁氧基羰基)氮基-1,4-二氮雜雙環[2.2.2]辛烷(1：1)鹽酸鹽之合成

將氯磺醯基異氰酸酯(45.2 Kg，319.4 mol)添加至甲苯(194.2 Kg)中，且將所得溶液冷卻至約0-6℃之間。然後經90分鐘之時期添加第三丁醇(23.6 Kg，318.4 mol)存於甲苯(48.0 Kg)中之溶液，維持介於約0-6℃之間之溫度。然後攪拌混合物，直至第三丁醇消耗完全(大約80分鐘)為止。然後經2.5小時之時期將三乙二胺(DABCO，71.4 Kg，636.5 mol)存於甲苯(293.0 Kg)中之溶液添加至混合物中，維持介於約0-6℃之間之溫度。然後將混合物升溫至20-25℃並攪拌8小時。在氮氣氛下將固體產物藉由離心過濾分離，並用(180.8 Kg)且然後第三丁基甲基醚(51.0加侖(gallon))洗滌，並旋轉，直至不再有廢液排出(大約60分鐘)為止。然後在真空下進一步乾燥固體，從而提供132.9 Kg之(4-氮雜-1-氮鎓雙環[2.2.2]辛-1-基磺醯基)(第三丁氧基羰基)氮基-1,4-二氮雜雙環[2.2.2]辛烷(1：1)鹽酸鹽。

實例7：實例5中所用之晶種I-216鹽酸鹽形式I之合成

步驟1：[({(1S,2S,4R)-4-[(6-{[(1R,2S)-5-氯-2-甲氧基- 2,3-二氫-1H-茚-1-基]胺基}嘧啶-4-基)氧基]-2-羥基環戊基}甲氧基)磺醯基]胺基甲酸第三丁酯

向500 mL反應器中(4-氮雜-1-氮鎓雙環[2.2.2]辛-1-基磺醯基)(第三丁氧基羰基)氮基-1,4-二氮雜雙環[2.2.2]辛烷(1：1)鹽酸鹽(43.4 g，98.6 mmol)存於乙腈(30 mL)中之溶液中，添加存於N-甲基吡咯啶酮(60 mL)中之(1S,2S,4R)-4-(6-((1R,2S)-5-氯-2-甲氧基-2,3-二氫-1H-茚-1-基胺基)嘧啶-4-基氧基)-2-(羥基甲基)環戊醇(27)(10 g，24.6 mmol)。在室溫下將所得濃漿液攪拌3小時。反應完成後，在室溫下緩慢添加水(66.6 mL)。向所得混合物中添加乙酸乙酯(66.7 mL)。將水層用乙酸乙酯(3×66.6 mL)萃取3次。將合併有機層用水(66.7 mL)洗滌1次並用存於水(66.7 mL)中之飽和氯化鈉萃取1次。將合併有機層經硫酸鎂(3 g)乾燥、過濾並濃縮。此產物未經進一步純化即用於下一步驟中。

步驟2：胺磺酸((1S,2S,4R)-4-(6-((1R,2S)-5-氯-2-甲氧基-2,3-二氫-1H-茚-1-基胺基)嘧啶-4-基氧基)-2-羥基環戊基)甲酯鹽酸鹽形式I(I-216 HCl形式I)之製備

將來自步驟1之殘餘物(10 g)吸收於乙腈(81.5 mL)中，且將所得溶液冷卻至小於5℃之溫度。緩慢添加12.0 M鹽酸(27.7 mL，904 mmol)，維持小於10℃之內部溫度，且在0℃下將所得混合物攪拌4小時，然後升溫至室溫並攪拌15 h。HPLC表明無Boc保護中間物剩餘。向反應混合物中添加水(20 mL，1110 mmol)，且將溫度升高至60℃。一旦在該溫度下，即用如實例8中所述製得之材料加晶種該反應。保持晶種且使反應物緩慢冷卻至室溫並攪拌16 h。將反應物過濾，並用水(66 mL)洗滌，並在減壓下乾燥過夜。此提供白色固體(5.3 g，9.8 mmol)且60%產率之產物。¹H NMR(300 MHz,CD3OD,δ)：8.19(s,1H),7.25(s,1H),7.18(m,2H),5.97(s,1H),5.58(m,1H),5.35(m,1H),4.35(m,2H),4.15(m,2H),3.30(s,3H),3.05(m,2H),2.51(m,1H),2.30(m,2H)及2.00(m,2H)。

實例8：實例7中所用之晶種I-216鹽酸鹽形式I之合成

且[({(1S,2S,4R)-4-[(6-{[(1R,2S)-5-氯-2-甲氧基-2,3-二氫-1H-茚-1-基]胺基}嘧啶-4-基)氧基]-2-羥基環戊基}甲氧基)磺醯基]胺基甲酸第三丁酯(1 g；以類似於實例7步驟1中所述者類似之方式製得)吸收於乙腈(8.12 mL)中，且將所得溶液冷卻至小於5℃之溫度。緩慢添加12.0 M鹽酸(2.7 mL，89 mmol)，維持小於10℃之內部溫度，且在0℃下將所得混合物攪拌4小時，然後升溫至室溫並攪拌15 h。HPLC表明無Boc保護中間物剩餘。向反應混合物中添加少量水及碳酸氫鈉來中和，但此量並不完全中和溶液。在40℃下濃縮反應混合物，且然後將溶液冷卻至室溫並攪拌過夜。進一步添加水，且將溶液再攪拌小時。將反應物過濾，並用水洗滌並在減壓下乾燥過夜，從而得到白色固體(0.598 g，1.15 mmol)且68%產率之產物。¹H NMR(300 MHz,CD3OD,δ)：8.19(s,1H),7.25(s,1H),7.18(m,2H),5.97(s,1H),5.58(m,1H),5.35(m,1H),4.35(m,2H),4.15(m,2H),3.30(s,3H),3.05(m,2H),2.51(m,1H),2.30(m, 2H)及2.00(m,2H)。

將此白色固體(250 mg，0.479 mmol)懸浮於異丙基醇(2.5 mL，32.6 mmol)中，並加熱至60℃。添加存於水(0.120 mL，0.959 mmol)中之8.0 M HCl，且發生一些溶解。15分鐘後，去除加熱，且將懸浮液冷卻至室溫並攪拌過夜。將固體過濾，並用5%水性IPA洗滌並在減壓下乾燥過夜。此提供81.6%產率之標題化合物(0.204 g，0.391 mmol)。¹H NMR(300 MHz,CD3OD,δ)：8.19(s,1H),7.25(s,1H),7.18(m,2H),5.97(s,1H),5.58(m,1H),5.35(m,1H),4.35(m,2H),4.15(m,2H),3.30(s,3H),3.05(m,2H),2.51(m,1H),2.30(m,2H)及2.00(m,2H)。

實例9：胺磺酸((1S,2S,4R)-4-(6-((1R,2S)-5-氯-2-甲氧基-2,3-二氫-1H-茚-1-基胺基)嘧啶-4-基氧基)-2-羥基環戊基)甲酯鹽酸鹽形式II(I-216 HCl形式II)之製備

在室溫下使I-216 HCl形式I(0.5 g，如上文實例5中所述製得)在水(10 mL)中成漿18 h。將所得固體過濾，用水(2.5 mL)洗滌，並在減壓下在室溫下乾燥16 h。此提供呈白色固體(0.45 g)且90%產率之I-216 HCl之形式II。¹H NMR(300 MHz,CD₃OD,δ)：8.35(s,1H),7.30(s,1H),7.21(m,2H),6.17(m,1H),5.65(m,1H),5.35(m,1H),4.41(t,1H),4.30(m,2H),4.17(m,1H),3.36(s,3H),3.10(m,2H),2.55(m,1H),2.35(m,1H)及2.10(m,3H)。LCMS：R _f=9.29 min,ES⁺=485(FA)。形式II之XRPD數據係顯示於圖10中。

實例10：活體內腫瘤藥效動力學模型

使用26號針頭將100 μL磷酸鹽緩衝鹽水中之HCT116腫瘤細胞(2×10⁶)(ATCC CCL-247號)無菌注射至雌性Ncr裸小鼠(年齡5-8週，Charles River)之右背側之皮下空間中。在接種後第7天開始，使用游標卡尺每週一次量測腫瘤。使用標準程序(0.5×(長度×寬度²))計算腫瘤體積。當腫瘤達到大約3-700 mm³之體積時，將小鼠隨機分組並經皮下注射各種劑量之化合物抑制劑(200 μL)。收穫腫瘤並在Covaris袋中壓碎，且然後轉移至乾冰上之玻璃管中，用於在Covaris E200中進行超音波處理。哺乳動物蛋白質提取試劑(MPER)溶解緩衝液(Pierce,78501)補充有以下物質(最終濃度)：1×蛋白酶抑制劑混合組(Calbiochem,539134)，存於二甲亞碸(DMSO)中之5 mM鄰啡啉(Sigma P1294號及Sigma DMSO D2650號)，10 mM碘乙醯胺(Sigma)，2 mM正釩酸鈉(Sigma,S6508號)，25 mM氟化鈉，及25 mM β-甘油磷酸酯。在即將進行超音波處理之前才將冷溶解緩衝液(300-800 μL)添加至腫瘤中。超音波處理步驟係：10秒，1% 500 mV50；20秒，20% 500 mV50；20秒，10% 500 mV50。超音波處理後，將樣品置於濕冰上，傾倒至Eppendorf管中，並在4℃下於微量離心機中以14000 rpm旋轉20 min。將上清液轉移至新管中，且使用Pierce聯辛可寧酸(Pierce bicinchoninic acid BCA)試劑及蛋白質標準物測定蛋白質濃度。將腫瘤溶解產物儲存於-80℃下。

定量分析nedd分子接合化之cullin之程序如下：將20 μg具有十二烷基硫酸鋰(LDS)加載緩衝液之腫瘤溶解產物及樣品還原劑(Invitrogen NP0007及NP0004)加載至4-12% bis-tris凝膠(1.5 mM，10孔凝膠，Invitrogen NP0315Box)上。凝膠在150 V下於2-(N-嗎啉基)乙磺酸(MES)電泳緩衝液(Invitrogen NP0002)中運行。在適當分子重量標記處切割凝膠，並使用半乾轉移裝置(Amersham Biosciences,TE70)將其轉移至PVDF-FL(Millipore,IPFL00010)。轉移後，在Odyssey阻斷劑(LI-COR Biosciences 927-40000號)中阻斷膜，然後在4度下在Odyssey阻斷劑+0.1% Tween-20(Sigma P7949號)中利用一級抗體將該膜培育過夜。將膜在tris緩衝鹽水中，利用Tween-20(TBST)洗滌3次，且然後利用Alexa Fluor 680標記之山羊抗兔免疫球蛋白G重鏈及輕鏈(IgG(H+L))抗體(Molecular Probes目錄編號A-21109)培育。利用二級抗體在黑暗中培育1小時後，將膜用TBST洗滌5次並用tris緩衝鹽水(TBS)洗滌1次，避光。將膜乾燥至少1個小時，且然後利用Odyssey Infrared Imaging System(LI-COR Biosciences)掃描。使用以下一級抗體：Anti-Nedd-8(MIL10純系52-9-5，利用Epitomics研發，稀釋1：4000)。以1：2000使用二級抗體。利用Odyssey軟體實施西方墨點(Western blot)上信號之定量。

本文所提及之專利及科學文獻建立熟習此項技術者可獲得之知識。除非另有定義，否則本文所用之所有技術及科學術語的含義與本發明所屬領域內之熟習此項技術者所通常瞭解之含義相同。本文所引用之所頒佈專利、申請案及文獻均以引用的方式併入，其併入程度如同每一者均特別且個別指明以引用方式併入一般。在不一致之情形下，本發明(包括定義)意欲控制。

儘管已闡述許多本發明實施例，但應瞭解所提供基本實例可經改變以表達利用本發明化合物、方法等之其他實施例。因此，應瞭解本發明之範疇在本文中已藉助實例代表，且並不意欲受具體實施例限制。

圖1顯示在以30 mg/kg單一皮下投與後胺磺酸{(1S,2S,4R)-2-羥基-4-[(6-{[(1R,2S)-2-甲氧基-2,3-二氫-1H-茚-1-基]胺基}嘧啶-4-基)氧基]環戊基}甲酯(I-115)在帶有HCT116腫瘤異種移植物之雌性Ncr裸小鼠中之藥效動力學及藥物動力學參數。

圖2顯示在以10 mg/kg單一皮下投與後胺磺酸{(1S,2S,4R)-4-[(6-{[(1R,2S)-5-氯-2-甲氧基-2,3-二氫-1H-茚-1-基]胺基}嘧啶-4-基)氧基]-2-羥基環戊基}甲酯(I-216)在帶有HCT116腫瘤異種移植物之雌性Ncr裸小鼠中之藥效動力學及藥物動力學參數。

圖3顯示在以30 mg/kg單一皮下投與後胺磺酸{(1S,2S,4R)-4-[(6-{[(1R,2S)-5-氯-2-甲氧基-2,3-二氫-1H-茚-1-基]胺基}嘧啶-4-基)氧基]-2-羥基環戊基}甲酯(I-216)在帶有HCT116腫瘤異種移植物之雌性Ncr裸小鼠中之藥效動力學及藥物動力學參數。

圖4顯示結晶形式I胺磺酸{(1S,2S,4R)-4-[(6-{[(1R,2S)-5-氯-2-甲氧基-2,3-二氫-1H-茚-1-基]胺基}嘧啶-4-基)氧基]- 2-羥基環戊基}甲酯(I-216)鹽酸鹽之x-射線粉末繞射(XRPD)圖案。

圖5顯示結晶形式I胺磺酸{(1S,2S,4R)-4-[(6-{[(1R,2S)-5-氯-2-甲氧基-2,3-二氫-1H-茚-1-基]胺基}嘧啶-4-基)氧基]-2-羥基環戊基}甲酯(I-216)鹽酸鹽之示差掃描量熱法(DSC)溫度記錄圖。

圖6顯示結晶形式I胺磺酸{(1S,2S,4R)-4-[(6-{[(1R,2S)-5-氯-2-甲氧基-2,3-二氫-1H-茚-1-基]胺基}嘧啶-4-基)氧基]-2-羥基環戊基}甲酯(I-216)鹽酸鹽之熱重分析(TGA)溫度記錄圖。

圖7顯示上文實例2中所產生之結晶形式I胺磺酸{(1S,2S,4R)-4-[(6-{[(1R,2S)-5-氯-2-甲氧基-2,3-二氫-1H-茚-1-基]胺基}嘧啶-4-基)氧基]-2-羥基環戊基}甲酯(I-216)鹽酸鹽之x-射線粉末繞射(XRPD)圖案。

圖8顯示上文實例2中所產生之結晶形式I胺磺酸{(1S,2S,4R)-4-[(6-{[(1R,2S)-5-氯-2-甲氧基-2,3-二氫-1H-茚-1-基]胺基}嘧啶-4-基)氧基]-2-羥基環戊基}甲酯(I-216)鹽酸鹽之示差掃描量熱法(DSC)溫度記錄圖。

圖9顯示上文實例2中所產生之結晶形式I胺磺酸{(1S,2S,4R)-4-[(6-{[(1R,2S)-5-氯-2-甲氧基-2,3-二氫-1H-茚-1-基]胺基}嘧啶-4-基)氧基]-2-羥基環戊基}甲酯(I-216)鹽酸鹽之熱重分析(TGA)溫度記錄圖。

圖10顯示結晶形式II胺磺酸{(1S,2S,4R)-4-[(6-{[(1R,2S)-5-氯-2-甲氧基-2,3-二氫-1H-茚-1-基]胺基}嘧啶-4-基)氧基]-2-羥基環戊基}甲酯(I-216)鹽酸鹽之x-射線粉末繞射(XRPD)圖案。

Claims

一種化學實體，其包含化合物胺磺酸{(1S,2S,4R)-4-[(6-{[(1R,2S)-5-氯-2-甲氧基-2,3-二氫-1H-茚-1-基]胺基}嘧啶-4-基)氧基]-2-羥基環戊基}甲酯。
如請求項1之化學實體，其中該化學實體係其鹽酸鹽或醫藥上可接受之溶劑合物。
如請求項2之化學實體，其中該化學實體實質上係結晶形式I。
如請求項2之化學實體，其中至少70重量%係結晶形式I。
如請求項2之化學實體，其中至少80重量%係結晶形式I。
如請求項2之化學實體，其中至少90重量%係結晶形式I。
如請求項2之化學實體，其中至少95重量%係結晶形式I。
如請求項3至7中任一項之化學實體，其中形式I之特徵在於具有2θ角為4.5°、15.2°、21.3°、21.8°及24.0°之峰之x-射線粉末繞射(XRPD)圖案。
如請求項8之化學實體，其中形式I之特徵在於具有2θ角4.5°、7.5°、14.4°、14.6°、15.2°、15.9°、19.5°、21.3°、21.8°、22.4°、22.7°、24.0°及24.8°為之峰之XRPD圖案。
如請求項8之化學實體，其中形式I之特徵在於具有2θ角為4.5°、7.5°、8.9°、9.8°、13.3°、14.4°、14.6°、15.2°、15.9°、17.2°、19.5°、20.0°、21.3°、21.8°、22.4°、22.7°、24.0°、24.8°、25.7°及26.4°之峰之XRPD圖案。
如請求項3至7中任一項之化學實體，其中形式I之特徵在於具有2θ角為4.5±0.3°之參考峰且具有相對於該參考峰2θ角為10.7°、16.8°、17.3°及19.5°之峰之x-射線粉末繞射(XRPD)圖案。
如請求項3至7中任一項之化學實體，其中形式I之特徵在於具有2θ角為4.5±0.3°之參考峰且具有相對於該參考峰2θ角為3.0°、9.9°、10.1°、10.7°、11.4°、15.0°、16.8°、17.3°、17.9°、18.2°、19.5°及20.3°之峰之x-射線粉末繞射(XRPD)圖案。
如請求項3至7中任一項之化學實體，其中形式I之特徵在於具有2θ角為4.5±0.3°之參考峰且具有相對於該參考峰2θ角為3.0°、4.4°、5.3°、8.8°、9.9°、10.1°、10.7°、11.4°、12.7°、15.0°、15.5°、16.8°、17.3°、17.9°、18.2°、19.5°、20.3°、21.2°及21.9°之峰之x-射線粉末繞射(XRPD)圖案。
如請求項3至7中任一項之化學實體，其中形式I之特徵在於XRPD圖案實質上如下表所顯示。
如請求項3至7中任一項之化學實體，其中形式I之特徵在於示差掃描量熱法(DSC)溫度記錄圖之特徵在於具有在約135.7℃處之峰及在約129.6℃處開始吸熱。
如請求項3至7中任一項之化學實體，其中形式I之特徵在於DSC溫度記錄圖之特徵在於在約129.8℃開始吸熱及在約135.6℃處出現波峰，及在約181.6℃開始吸熱及在約195.5℃處出現寬峰，及在約275.3℃開始吸熱及在約275.5℃處出現尖峰。
如請求項3至7中任一項之化學實體，其中形式I之特徵在於熱重分析(TGA)溫度記錄圖之特徵在於在約100℃至約150℃下約3.7%之重量損失。
如請求項3至7中任一項之化學實體，其中形式I之特徵在於TGA溫度記錄圖實質上如圖6中所顯示。
一種化學實體之前藥，其中：該化學實體係化合物胺磺酸{(1S,2S,4R)-4-[(6-{[(1R,2S)-5-氯-2-甲氧基-2,3-二氫-1H-茚-1-基]胺基}嘧啶-4-基)氧基]-2-羥基環戊基}甲酯或其醫藥上可接受之鹽；且該前藥係該化學實體之-NH-基團之胺基甲酸酯或醯胺，或該化學實體之-OH基團之醚或酯。
一種組合物，其包含如請求項1至18中任一項之化學實體或如請求項19之前藥，及醫藥上可接受之載劑。
如請求項20之組合物，其適於經口投與。
一種如請求項1至18中任一項之化學實體或如請求項19之前藥之用途，其用於製造用於治療癌症之醫藥。