TW200924791A - Vaccines - Google Patents

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200924791 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於瘧疾抗原用於使得對癔疾疾病免疫之新穎 用途。本發明尤其係關於來自，惡磔蘑及蠤（户介 之環子抱子（cs)蛋白質或其片段用於使嬰兒對瘧疾疾病免 疫之用途。 【先前技術】 瘧疾為世界主要健康問題之一。在2〇世紀期間，經濟及 社會發展以及抗瘧疾運動，已導致世界上大範圍區域的瘧 疾根除，使世界表面受影響區域自5〇%減少至27%。儘管 如此，若預期人口增長，則預計到2〇1〇年，半數世界人口 (近3 5億人）將生活在瘧疾傳播區域、目前之估算表明，每 年由瘧疾引起大大超過1，000,000的死亡，且認為僅非洲之 經濟損失即為驚人的，且每年大約為至少數十億美元2。 此等數字突暴頁出全球瘧疾危機及其對國際健康社區造成 的挑戰。此危機之原因為多樣的且範圍延及對可用、買得 ，及先前高度有效之藥物之普遍抗性的出現、健康系統之 崩潰及不足以及資;除非發現控制此疾病之方 式，否則提高健康與兒童存活率、減少貧窮、增加安全性 及加強最弱勢群體保護之全球努力將會失敗。 該疾病的最急性形式中之—者係由寄生性原生蟲惡性癔 原蟲引起，後者可造成大多數歸因於瘧疾之死亡。 癔原蟲之生命週期為複雜的，其需要兩種宿主(人類及 蚊蟲）以便完成其生命週期。人類之感㈣由自叮咬且受 133262.doc 200924791 感染的蚊蟲之唾液中引入子孢子而引發。該等子孢子遷移 至肝臟且於此處感染肝細胞，在此處該等子孢子經由細胞 内紅血球外期分化且繁殖’進入裂殖子期，該裂殖子期感 染紅血球（RBC),從而於無性血液期引發循環複製。該週 、 ㈣藉由大量裂殖子於賦中分化成有性期配子母細胞來 • $成’㈣配子母細胞被蚊蟲所攝取’在蚊蟲體内該等配 子母細胞經由一系列階段於中腸中發育以產生子孢子，該 等子孢子向唾液腺遷移。 瘧原蟲之子孢子期已鑑別為瘧疾疫苗之潛在標靶。使用 滅活（經輻照）子孢子之疫苗接種已顯示誘發抵禦實驗性人 類瘧疾之保護作用（Am· J，Trop. Med. Hyg 24: 297-402, 1975)。然而，實際上且邏輯上尚不可能基於此方法採用 經輻照子抱子製造用於一般人群之癔疾疫苗。 子孢子之主要表面蛋白質被稱為環子孢子蛋白（(：：8蛋 白）。認為環子孢子蛋白與子孢子在其藉助於蚊蟲自接種 e 初始部位轉移至循環中之期間（其中該子孢子遷移至肝臟） 的運動性及侵染有關。 瘧原蟲物種之CS蛋白特徵在於側接有非重複胺基（1^_末 端）及羧基（C-末端）片段之中心重複域（重複區域）。惡性瘧 原蟲中之CS蛋白具有高度保守之中心重複區。

若干群體已φζ出基於環子抱子蛋白的各種形式或部分之 亞單位疫苗。僅基於中心重複序列之此等疫苗中之兩者已 在20世紀80年代早期經歷臨床測試；一者為合成肽，另一 者為重組蛋白（Ball〇u等人，Lancet: 6月6日（1987年）第GW 133262.doc 200924791 頁之前，及Herrington 等人 Nature 328:257 (1987))。此等 疫苗可成功刺激抗子抱子反應。儘管如此，反應量值仍令 人失望，其中一些疫苗根本未發生反應。此外，後續注射 後抗體含量之"增強"的不存在及活體外淋巴細胞增殖檢定 • 之結果表明大多數此等志願者之T細胞不識別免疫顯性重 - 複。此外’此兩種疫苗之功效很微小，其中僅一名受疫苗 接種之志願者未患上寄生蟲血症。因此不再推行此等疫 苗。 ❹ WO 93/1 01 52及WO 98/05355描述一種源自惡性瘧原蟲 之CS蛋白之疫苗且顯然已存在一些針對使用其中所述之方 法接種疫苗以抵禦惡性瘧原蟲所取得的進展，亦參見

Heppner等人，2005, Vaccine 23, 2243-50 ° 已針對各種菌株選殖、表現及定序來自惡性瘧原蟲之cs 蛋白，例如，NF54菌株純系3D7 (Caspers等人，Mol. Biochem. Parasit〇l· 35, 185-190, 1989)。來自菌株3D7之蛋 φ 白質特徵為具有中心免疫顯性重複區，該區包含重複4〇次 之四肽Asn-Ala-Asn-Pro，但其間散布有四個次要重複Asn_ Val-Asp-Pro。在其他菌株中，主要及次要重複之數目以及 其相對位置改變。此中心部分側接有由指定為〇8蛋白之無 重複部分的非重複胺基酸序列構成之N及c末端部分。 基於CS蛋白的GlaxoSmithKline Biol〇gicals之尺以义瘧疾 疫苗已自1987年起處於研發中，且其為正被研究之目前最 先進的瘧疾疫苗候選物4。此疫苗特異性靶向惡性瘧原蟲 之紅血球前期，且賦予保護作用以防無癔疾成人志願者為 133262.doc 200924791 經由實驗室飼養之受感染蚊子傳播的惡性瘧原蟲子孢子所 感染且以免半免疫成人之天然曝露5’6。 在岡比亞（Gambia)執行之涉及6-11歲及1-5歲兒童的連續 I期研究中使用RTS，S/AS02A (RTS，S加上佐劑系統），此等研 究確認該疫苗為安全的，可被良好耐受且為免疫原性的7。 隨後，選擇兒科疫苗劑量且在涉及1-4歲莫桑比克兒童之I 期研究中加以研究，其中發現該劑量為安全的，可被良好 耐受且為免疫原性的8。 WO 2006/02988*7描述RTS，S用於治療1至4歲兒童之嚴重 瘧疾的用途。 嚴重瘧疾疾病描述於WHO臨床實踐指導中（第4頁World Health Organization. Management of severe malaria, a practical handbook > 第 2版 ’ 2000年。http://mosquito.who.int/docs/hbsm.pdf)。根據基於 WHO之定義，對嚴重瘧疾之兒童的分類鑑別極其虛弱且處 於高死亡風險之兒童。高風險可視為意謂約30%或更高之 死亡風險。 在莫桑比克026臨床研究（兒童年齡1-4歲）中，如根據開 始在相關兒童血液中偵測到寄生蟲之時間的延遲所量度， 疫苗抵禦感染之總功效經計算在45%範圍内。對抗臨床疾 病之保護百分比在3 5 %範圍内且對抗嚴重瘧疾疾病之保護 百分比在50%範圍内。發現此功效水準持續約1 8個月之時 期。（Alonso 等人 Lancet: 204，364，第 1411-1420 頁 205 及 Lancet 366第 2012-2018頁。） 在026試驗中’年齡與抵紫非嚴重臨床癌疾疾病之一般 133262.doc 200924791 疫苗功效之間不存在相互作用的跡象，此表明功效不會隨 著年齡增長而顯著變化。然而，進行另一探索性亞群分析 來估算癌疾疾病首當其衝之受害年輕群中之疫苗功效。 有趣地是’此亞分析在試驗中看似表明對抗嚴重瘧疾之 • 功效在年少兒童令可能較高。此分析並未表明對抗感染之 • 保護作用或一般功效（亦即，對臨床瘧疾症狀之發展的阻 滞）一般在年輕群中較佳。 Φ 據本發明者所瞭解’由於若干原因僅給予不到1歲之嬰 兒一種癌疾疫苗，該等原因包括關乎含有新穎佐劑之實驗 性調配物的潛在毒性，及/或嬰兒免疫系統不成熟且因此 該疫田接種將不會引起針對瘧疾感染之有效保護的理論。 瘧疾調配物中所採用之強效佐劑（例如，包含卩“丨及/或 MPL) —般不用於兒科疫苗中。相反地，嬰兒用疫苗一般 採用較老的鋁鹽佐劑。 然而’在岡比亞人（Gambian)中於6至11個月大的嬰兒中 Q 執行一項採用癔疾疫苗SPf66之試驗（Alonso等人，parasite

Immunology，1997:19: 579-581)。在坦桑尼亞（Tanzania)密 集傳播區域内’ SPf66已在1至4歲之兒童中顯示3 1 %的對抗 癔疾首次發作之保護率。然而，當在6至11個月大嬰兒中 測試時，結果看似指示已接受SPF66疫苗之兒童的臨床癔 疾之發病率比彼等接受對照調配物（其為滅活小兒麻痨疫 苗）之嬰兒高。影響在接受高劑量SPf66之嬰兒中最顯著。 在一些10週大之嬰兒中以第一次疫苗投與進行一項新近 臨床試驗（本文中稱為03 8研究），獲得一些令人驚奇的結果 133262.doc • 10· 200924791 (參見下文論述）。 【發明内容】 本發明提供源自惡性瘧原蟲之cS蛋白之抗原與醫藥學上 可接受之佐劑相組合的用途，其係用於製造用以接種嬰兒 以防瘧疾之藥物。 【實施方式】 在圖3中’表格呈現對ATp群組在RTSS4Engerix第三劑 ❹ ❹ 給藥後14天直至第6個月（橫斷式拜訪）之整個隨訪期間的 VEs平估結果。此包括接受至少3劑RTS,S或Engerix-B清除 藥物且在ADI中具有隨訪時間之個體。呈現針對感染與疾 病之VE的汗估結果。針對Ιττ群在第〇個月（第一次接種疫 苗之日）至第6個月之時間範圍内評估疾病的方案探索性端 點經呈現為疾病3 ^ 在圖3中： PYAR :風險中之發作/人年； VE :疫苗功效； ·信賴區間 3第一次發作之時間；每微升大於Q之,錄癔原蟲無性寄生 蟲血症之存在 b第-次發作之時間；不適且接受治療之兒童中每微升大 於500之惡、性癔原蟲無性寄生蟲血症之存在 於之發熱之存在 〇於或4 C第一次發作之時間；不適且接受治療之兒童中任何水準 之-陡瘧原蟲無性寄生蟲血症及存在有高於或等於37·5。。 I33262.doc 200924791 之發熱或24小時内之發熱史 d第一次發作之時間，·不適且接受治療（ITT 〇 6)之兒童中 每微升大於500之惡性癔原蟲無性寄生蟲血症之存在以及 高於或等於37.5 °C之發熱之存在 . 來自健康中心針對區域及距離之調整估算值 . 在本說明書内容中，瘧疾意欲係指瘧疾感染（下文所定義） 及/或臨床瘧疾疾病（亦如下文定義）。 ❹ 在一實施例中，本發明之疫苗接種提供降低之瘧疾感染 風險。在一態樣中，在疫苗接種後計算之感染風險之降低 率為至少約30%、40。/。、50%，例如6〇%，諸如65%。 在一實施例中，本發明之疫苗接種提供降低之發展瘧疾 臨床症狀之風險。在一態樣中，（例如）在3個月研究間隔内 接文二劑給藥後臨床疾病之風險在第三劑給藥後可降低至 少約 30。/。、40%、50。/〇 ’ 例如 60%，諸如約 65〇/〇。 在一實施例中，瘧疾為非嚴重瘧疾。 〇 在一實施例中，疫苗接種提供降低之發展以下臨床疾病 症狀之風險：任何水準之惡性瘧原蟲無性寄生蟲血症及存 在有局於或等於37.5C之發熱或24小時内之發熱史。 在一態樣中，在最終疫苗接種後3個月内評估降低之瘧 •疾感染風險及/或降低之發展遽疾臨床症狀之風險。 在038研究中，以大致每月之間隔（或4週間隔）以三個時 間點（名義上為時間點0個月、1個月且接著2個月）向嬰兒給 予兒科調配物中之RTS，S及佐劑的3劑給藥。後一方案形成 本發明之一態樣。 133262.doc -12· 200924791 疫苗可按適當時間間隔（例如2、3、4或5週間隔，諸如4 週間隔）以1劑、2劑或3劑給藥投與。 許多此等嬰兒極可能實際上未受瘧疾感染，此係因為其 事實上未曾曝露於受感染蚊子。 ， 未出現重大安全性或毒性問題，且實際上研究中之瘧疾 - 疫#顯示與.通常所用之來自Aventis Pasteur之嬰兒疫苗 TETRActHib™(其含有至少針對白喉、破傷風、百曰咳之 ❹ 抗原）類似的反應原性概況且亦顯示與B型肝炎疫苗

Engerix-BTM類似之反應原性。 此外且令人驚奇地’ 〇3 8研究中採用之瘧疾疫苗針對臨 床遽疾（亦即’一般/非嚴重之癔疾）的計算功效相較於對照 組（表3中之資料）為約65%(經調整之疫苗功效）。此功效比 026試驗之年長兒童中所觀測到的針對臨床非嚴重疾病之 功效結果高約30%，在後者中針對非嚴重瘧疾之功效介於 30與35%之間》後面之數字反映針對非嚴重臨床瘧疾症狀 ❹ 之功效而非針對嚴重瘧疾之功效，其係在026試驗中作為 亞分析進行。因此’本發明之疫苗接種似乎可解釋為相較 於此研究中之對照群且此外相較於〇26試驗中已被疫苗接 種之年長兒童而δ患上癌疾之非嚴重臨床形式之風險降 低。 在本文中臨床瘧疾係定義為高於或等於37 5。〇之發熱， 其中惡性瘧原蟲之無性寄生蟲血症為每微升血液存在5〇〇 或更多（例如，例如敏感性及特異性高於9〇%)。 亦令人驚奇的是如下事實：038試驗中所見之對抗感染 133262.doc 13 200924791 之保護百分比為約65%(表3)，由於〇26試驗尹可比較之結 果為約45% ’故本發明者咸信前者為前所未有的且意外 的。 兩個試驗之功效資料_，參見表3，及〇26)係源自時 ' 間長短上不同之觀測期。 . 在本文内容中，瘧疾感染意欲係指藉由主動感染偵測 (ADI)或被動案例偵測（pCD)而偵測的任何無性惡性瘧原蟲 寄生蟲血症。 在3個月監測時間點（亦即最後一次疫苗接種後3個月）， 在03 8 „式驗宁小於2〇。/。，約丨7%以瘧疾疫苗接種疫苗之嬰兒 相較於接受比較劑/對照疫苗接種之群中的4〇〇/。以上而言顯 示任何感染跡象。 此等觀測結果使本發明者得出結論，實際上，旨在提供 針ί癔疾寄生蟲感染及臨床癌疾之保護作用的疫苗接種之 最佳年齡群為嬰兒。 Ο 在本說明書内容中’嬰兒小於1歲，諸如約1、2、3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、19、20、25、30、35、40、45、50週大。更特定言 之’約10週、約14週及/或約18週大。 在—實施例中’在出生後大約6至1 〇週，諸如1 〇週給予 嬰兒第一次疫苗接種。 在—實施例中’在出生後大約1〇至14週，諸如14週給予 婴兒第二次疫苗接種。 在一實施例中，在出生後大約14至18週，諸如16-18週 133262.doc -14- 200924791 給予嬰兒第三次疫苗接種。 在已投與首程疫苗接種後，可提供加強疫苗接種。此加 強可在該主要過程完成後6至24個月投與。 儘管不希望受理論束缚，但是此〇38試驗中可獲得之證 ' 據並未表明抗（^效價顯著不同於026試驗中所觀測之彼等 - 效價，儘管在038中在第三劑給藥後於達3個月之試驗資料 中可見較高GMT之趨勢亦然。 φ 因此，在顯著天然曝露於瘧疾感染之前向原初（nai.ve)嬰 兒提供瘧疾疫苗可為有利的。 在本說明書内容中，”原初”意欲意謂嬰兒（例如）如藉由 ELISA所測定不具有或具有極低針對以蛋白之可偵測抗 體，或嬰兒太年幼以至於有理由相信其在出生後未曾經歷 惡性瘧原蟲寄生蟲感染。

低含量係低於針對相關抗cs ELIS 與合適檢定有關之進-步資訊（例如）參見GGrdl等3人量J.

❹ InfeCti〇US Disease 1995; 171:1576_1585 或 St〇utf 人 J

Infectious Diseases 1998; 178: 1139 1144。 在本發明之一態樣中，用疫苗治療之嬰兒中至少65%(諸 如75、85、90、95或99%)為原初的。 出生後，可有利地藉由以諸如DDT之殺昆蟲劑喷淋家及 住七區/臥至及其類似場所來保護嬰兒免於曝露於遽疾感 染或者或另外，亦可藉由蚊帳來提供保護，該等蚊帳亦 可用口適殺昆蟲劑處理。此等步驟可幫助保持嬰兒為原初 狀態直至可投與癔疾疫苗。 133262.doc 200924791 有趣地是’在038試驗中似乎表明在所產生之抗體含量 與由該疫苗接種提供之保護之間存在相關性。cs抗體含量 為最尚三分位組之嬰兒相較於較低三分位組之彼等具有低 71%的感染風險。

❹ 在一態樣中’本發明提供疫苗接種用於產生針對cs蛋白 之適當抗體反應之用途，（例如）其中8〇、85、9〇、95、 96、97或98%根據本發明接種之嬰兒在接受最後一次疫苗 接種後約1個月至約4個月，諸如其後丨個月及4個月，具有 高於針對相關ELISA所定義之載止界限（諸如，GSK在臨床 試驗中所用者）的抗CS抗體。 在一實施例中，抗體反應足以在受接種之嬰兒中提供降 低之瘧疾感染風險及/或降低之臨床瘧疾風險。 在-態樣中’本發明提供疫苗用於延遲嬰兒受癌疾寄生 蟲感染及/或延遲瘇疾臨床症狀發展之用途。第一次瘧疾 感染發作或臨床癌疾之時間可（例如m_x回歸模Μ 量測。 本發明尤其係關於降低惡性癔原蟲之臨床瘧疾（諸如其 嚴重及/或輕度形式）之發生率。然而在一態樣中，本發明 提供針對非嚴重瘧疾之臨床症狀的保護。

在本文中，非嚴重癌疾係定義為不嚴重之癌 床案例。 有L 本發明之CS抗原可與選自表現於寄生蟲生命 肝期）之子孢子或紅血球前期的任何抗原之另-抗原社人 使用，該另-抗原例如有肝期抗原·i (LSA])、肝期抗原- 133262.doc 200924791 3 (LSA-3)、jk小板反應素相關未名蛋白（TRAP)、裂殖子 表面蛋白-1 (MSP1)(主要裂殖子表面蛋白）及頂端裂殖子抗 原-1 (AMA-1)(最近已顯示其存在於肝期（除紅血球期 外））。所有此專抗原在此項領域中係熟知的。抗原可為整 ’ 個蛋白質或其免疫原性片段。瘧疾抗原之免疫原性片段為 . 熟知的，例如來自ΑΜΑ-1之胞外域。 在一實施例中，惡性瘧原蟲抗原與來自Β型肝炎之表面 ❹抗原（HBsAg)融合。因此，適用於本發明之環子孢子（cs) 蛋白抗原為與HBsAg之融合蛋白形式。抗原可為來自惡性 癌原蟲之整個CS蛋白或其部分，包括可融合在一起的以 蛋白之片段。 在一實施例中’基於CS蛋白之抗原為雜交蛋白形式，該 雜交蛋白包含惡性瘧原蟲之CS蛋白的實質上所有C末端部 分、CS蛋白免疫顯性區之四個或四個以上串聯重複及來自 •肝炎之表面抗原（HBsAg)。在一態樣中，融合蛋白包 〇 含含有至少160個胺基酸之序列，該序列與cs蛋白之〇末 端部分實質上同源。 詳言之，CS蛋白之"實質上所有"c末端部分包括缺乏疏 水性錨定序列之C末端。cs蛋白可能缺乏c末端之最後12 至14個（諸如12個）胺基酸。 在實施例中，用於本發明之融合蛋白為包含惡性瘧原 蟲之cs蛋白的一部分（實質上如對應於惡性瘧原蟲3D7純系 之胺基酸207-395)之蛋白質，其係由經由線性連接子與 HBsAg之N末端同框融合之菌株NF54 (Caspers等人，上文） 133262.doc •17. 200924791 產生。連接子可包含來自HBsAg之部分或所有preS2區。 適用於本發明之CS構築體係如WO 93/10152中所概述。 尤其合適的為稱為rts之雜交蛋白，此如W〇 93/10152(其 中將其表示為RTS*)及WO 98/05355中所述，該兩文獻之全 • 部内容以引用的方式併入本文中。 . 尤其合適之融合蛋白為稱為RTS之融合蛋白，其由以下 者組成： φ •曱硫胺酸殘基’其係由核苷酸1059至1061編碼，由釀 酒.酵母（Saechromyes cerevisiae) TDH3基因序列產 生。（Musti A_m.等人Gene 1983 25 133-143)。 •三個胺基酸（Met Ala Pro)，其係源自核苷酸序列（1062 至1070)且藉由用於建構雜交基因之選殖程序形成。 •一段189個胺基酸，其係由核苷酸1〇71至1637編碼且 表示惡性瘧原蟲菌株3D7之環子孢子蛋白（CSP)之胺基 酸207至395 (Caspers等人，上文）。 〇 ·胺基酸（Gly)’其係由核苷酸1638至164〇編碼且藉由 用於建構雜交基因之選殖程序形成。 •四個胺基酸（Pro Val Thr Asn)，其係由核苷酸1641至 1652編竭’且表示b型肝炎病毒（adw血清型）preS2蛋 白之四個幾基末端殘基（Nature 280: 815-819，1979)。 •一段226個胺基酸，其係由核苷酸1653至233〇編碼， 且表示B型肝炎病毒（adw血清型）之S蛋白。 在一實施例中’ RTS為RTS，S之免疫原性粒子形式。 RTS，S構築體可（例如）包含兩個多肽rTS及s，其同時且 133262.doc -18- 200924791 自發地被合成形成複合顆粒結構（RTS，S)。 RTS蛋白較佳表現於基因工程化酵母細胞，最佳為釀酒 酵母或畢赤酵母（Pic/m juasioriiS)。在此類宿主中，RTS將 表現為脂蛋白粒子（本文中亦稱為免疫原性粒子或病毒樣 粒子）。較佳接受體酵母菌株較佳已在其基因組中攜帶B型 肝炎S表現盒之幾個整合複本。因此，所得菌株合成兩個 多肽’ S及RTS，其自發地共同裝配為混合（rTS，S)脂蛋白 粒子。此等粒子有利地在其表面呈現雜交CSP序列《有利 地’此等混合粒子中RTS:S比率為例如1:4。 咸信B型肝炎之表面抗原的存在及RTS，S粒子之形成增強 雜交蛋白之CS蛋白部分的免疫原性’有助於該蛋白質之穩 定性’及/或有助於該蛋白質之再生製造。 或者，雜交蛋白可含有惡性瘧原蟲之cs蛋白的N端片 段。 在一態樣中，雜交蛋白可包含惡性瘧原蟲之中心區的一 或多個重複單元。例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或 更多個重複單元。 或者，雜交蛋白可含有惡性瘧原蟲之cs蛋白的c端片 段》 雖然不希望受理論束縛，但認為c端及中心重複片 段可包括幾個T及B細胞抗原決定基。 在重組蛋白中，非天然胺基酸通常引入選殖過程中且於 最終表現之蛋白質中觀察到。舉例而言，幾個（諸如】、' 2、3、4或5個）胺基酸可插入蛋白質之起始端⑺端）。若4 133262.doc 19· 200924791 個胺基酸插入蛋白質之起始端，則彼等可為例如MMAP。 此外或或者，1、2或3個（諸如丨個）胺基酸可插入蛋白質主 體/中間，其限制條件為蛋白質活性及特性（諸如免疫原性） 未受不利影響。 ' 纟文所述之癔錢苗之使用亦可與-或多種其他通常向 . /]、於1歲之嬰兒投與之疫苗組合以(例如)提供針對以下一或 多者之保護.白喉、破傷風、百曰咳、麻療、口服脊髓灰 ❹ f炎及/或㈣肝炎。舉例而言，該等疫苗可W、2、3、 4、5、6、7、8或9個月大時，若適當則（諸如）在6、1〇及14 週時給予。在-態樣中，所提供之該嬰兒疫苗為視情況具 有口服脊髓灰質炎疫苗之DTPw_Hib。 本發明之瘧疾疫苗亦可與BCG疫苗組合使用，該bcg疫 苗例如在本發明疫苗前丨週、2週或更長時間之前給予。 諸如口服脊髓灰質炎、BCG及/或8型肝炎疫苗之疫苗可 在出生後約1週或1週以内給予。 〇 當本發明之瘧疾疫苗與其他-或多種嬰兒疫苗結合給予 時，則該等疫苗可同時或間隔約15、2G、25天或更多天給 予。後者可避免兩種或兩種以上疫苗之任何不利相互作 用。 本發明亦係關於-種治療方法，其包含向嬰兒投與治療 有效量之本文所述之疫苗以提供針對感染及/或發展臨床 瘧疾之保護。 適用於本發明之疫苗接種時程包括以（個月Μ隔投與3劑 疫苗。在本發明之替代性實施例，，採们個、2個、3個 133262.doc •20· 200924791 或3個以上劑量，其係間隔！、2、3、4、5、6、7、8週戋8 週以上加以給予。可採用相同之加強劑量以對上述主要疫 苗接種過程進行補充。 使用用於預防瘧疾之一般良好做法以及本文所述之遽疾 • 疫苗亦可為適當的。最佳做法將包括諸如以殺昆蟲劑喷淋 * 臥室等及/或採用蚊帳來減少個體對蚊蟲之曝露的做法。 在038試驗中，該等做法係與基於RTS，S之瘧疾疫苗結合使 用。 ❹ 作為03 8試驗中之主要端點，瘧疾之臨床發作可能（例 如）需要在吉姆沙染色（Giemsa stained)之厚血臈上存在有 每微升500以上或〇以上之惡性瘧原蟲無性寄生蟲血症且存 在有發熱（溫度高於或等於37.5。〇。 嚴重瘧疾之定義可（例如）包括以下項中之一或多者的存 在.嚴重瘧疾貧血（PCV<15%)、腦型瘧疾（布蘭太爾 (Blantyre)昏迷評分<2)或其他身體系統之嚴重疾病，其可 Ο 包括多次發作（在先前24小時内兩次或兩次以上全身性抽

搐）、虛脫（定義為不能獨立坐起）、低血糖（<22 mmwdL 或<40 mg/dL)、臨床上疑診之酸中毒或循環衰竭。此等在 以下表1中給出。 133262.doc -21 · 200924791 嚴重瘧疾 貧血 •無性寄生蟲血症確定 性讀取 •血容比<15% •無其他較具可能性之 疾病起因 雎型瘧疾 •無性寄生蟲血症確定 在低血糖校正後且在痙攣(fit)控制後6〇 性讀取 分鐘評定昏迷評分。若30分鐘内不能 •昏迷評分S2 •無其他可識別之意識 喪失的起因 控制痙攣，則兒童包括在内。 嚴重癌疾 •無性寄生蟲血症確定 (其他） 性讀取 •無其他較具可能性之 疾病起因 •不符合嚴重瘧疾貧血 或腦型瘧疾之標準 •以下項中之一者： •多次發作 在入院之前24小時時期内2次或2次以 上全身性抽搐 *虛脫 不能獨立坐起 -低血糖 <2.2 mmol/dL 或 <40 mg/dL -酸中毒 文件支持性信號及/或實驗室讀數 -循環衰竭 文件支持性信號及/或實驗室讀數 ❹ ❹ 根據本發明’經純化雜交蛋白質之水溶液可直接加以使 用且與合適佐劑或載劑組合使用。或者，該蛋白質可在與 合適佐劑或載劑混合之前被凍乾。 本發明之合適疫苗劑量係介於每劑（例如）25〇至5〇〇 μΐ(最終液體調配物）中1-100 pg抗原（例如，rts,s)之間， 諸如5至75 pg抗原（例如，RTS，S)，尤其25 抗原（例如 RTS，S蛋白）之劑量。 133262.doc -22- 200924791 尤其適合於本發明之兒科調配物的抗原劑量為（例如）0.5 ml最終體積中之25 。 在本發明之一態樣中’抗原係與佐劑或載劑組合。 特定言之’存在佐劑’諸如為Thl型反應之較佳刺激劑 * 的佐劑。 • 合適佐劑包括（但不限於）任何來源之經去毒脂質A及脂 質A之無毒衍生物、皂素及其他免疫刺激劑，其為Thl細 胞反應（本文亦稱為Thl型反應）之較佳刺激劑。 免疫反應可廣泛分為兩種極端類別，即體液或細胞介導 之免疫反應（通常特徵為產生抗原特異性抗體之B淋巴細胞 及充當抗原特異性細胞保護效應子之T淋巴細胞β TH1型 反應（有利於細胞介導之效應子免疫反應）及TH2型反應（有 利於引發抗體反應）。 極端TH1型免疫反應之特徵可在於產生抗原特異性、單 倍型限制性細胞毒素T淋巴細胞及天然殺手細胞反應。在 ❹ 小鼠中，TH1型反應之特徵通常為產生IgG2a亞型抗體， 而在人類中，此等對應於IgG 1型抗體^ TH2型免疫反應之 特徵為產生小鼠IgGl内包括之一系列免疫球蛋白亞型。 可認為此等兩種免疫反應類型發展背後之驅動力為細胞 因子。高含量之ΤΗ 1型細胞因子傾向於促進針對給定抗原 之細胞介導之免疫反應的誘發’而高含量之TH2型細胞因 子傾向於促進針對抗原之體液免疫反應的誘發。 TH1型及TH2型免疫反應之區別並不絕對，且可為此兩 個極端之間的連續體形式。實際上，個體將支持被描述為 133262.doc -23- 200924791

主要為TH1或主要為TH2之免疫反應。然而，通常便利地 考慮由 Mosmann 及 Coffman (Mosmcmw, !Γ_ 兄及 (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual 及 eWew 反y, 7，著_/彳 5-/731)在鼠類 CD4 陽性 T 細胞純系中所述之細胞因子家族。通常，TH1型反應與T-淋巴細胞產生INF-γ細胞因子有關。通常與引發ΤΗ1型免疫 反應直接有關之其他細胞因子不由Τ-細胞產生，諸如IL-12。相反，ΤΗ2型反應與IL-4、IL-5、IL-6、IL-10及腫瘤 壞死因子-β (TNF-β)之分泌有關。 已知某些疫苗佐劑尤其適於刺激ΤΗ1或ΤΗ2型細胞因子 反應。通常，在免疫接種或感染後免疫反應之ΤΗ1:ΤΗ2平 衡的指示包括對在以抗原再刺激後由Τ淋巴細胞活體外產 生之ΤΗ1或ΤΗ2細胞因子的直接量測，及/或對抗原特異性 抗體反應之IgGl:IgG2a比率（至少在小鼠體内）的量測。 因此，TH1型佐劑為當以抗原活體外再刺激時刺激經分 離T細胞群產生高含量TH1型細胞因子且引發與TH1型同型 有關之抗原特異性免疫球蛋白反應的佐劑。 能優先刺激TH1細胞反應之佐劑描述於WO 94/00153及 WO 95/17209 中。 可經調配產生適用於本發明之佐劑的較佳之Thl型免疫 刺激劑包括且不限於以下各物。 長期以來，已知腸細菌脂多醣（LPS)為免疫系統之有效 刺激物，不過其在佐劑中之使用已因其毒性效應而縮減。 133262.doc -24- 200924791

LPS之無毒衍生物，即單磷醯基脂質A(MPL)(藉由自還原 端葡糖胺移除核心碳水化合物基團及磷酸根產生）已由Ribi 等人(1986, Immunology and Immunopharmacology of bacterial endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY，第 407-419 頁）描述且具有以下結構：

(CH2)l4 u

MPL之另一經去毒形式係由自二醣骨架之3位置移除醯 基鏈而產生且被稱為3-0-脫醯基化單磷醢基脂質A (3D-MPL)。其可藉由GB 2122204B中所教示之方法純化及製 備，該參考文獻亦揭示二磷醯基脂質A及其3-0-脫醯基化 變體之製備。 3D-MPL之較佳形式為乳液形式，該乳液具有直徑小於 0.2 μπι之小粒徑，且其製造方法描述於WO 94/2 1292中。 包含單磷醯基脂質Α及界面活性劑之水性調配物已描述於 133262.doc -25- 200924791 WO 98/43670 中。 本發明待使用之細菌脂多醣源性佐劑可自細菌來源純化 及加工，或其可為合成的。舉例而言，經純化單磷醯基脂 質A描述於Ribi等人，1986(上文）中，且由沙門氏菌屬 ίρ.)產生之3-0-脫醯基化單磷醯基脂質或二碟 醯基脂質Α描述於GB 2220211及US 4912094中。已描述其 他純化及合成脂多醣（Hilgers等人，1986，/«i. /wmwwo厂，79(4):392-6 ; Hilgers 等人，1987

Immunology, 60(1):141-6 ;及 EPO 549 074 Bl)。一種尤其 較佳之細菌脂多醣佐劑為3D-MPL。 因此’可用於本發明之LPS衍生物為彼等結構上類似於 LPS或MPL或3D-MPL之免疫刺激劑。在另一替代性選擇 中，LPS衍生物可為經醯化單醣，其為上述MPL結構之子 部分。 皂素亦為本發明之合適Thl免疫刺激劑。皂素為熟知之 佐劑且於 Lacaille-Dubois，Μ及 Wagner H.(1996. A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine，第2卷，第363-386頁）中有教示。例如， Quil A(源自南美息皮樹（Quillaja Saponaria Molina)之樹皮） 及其片段在美國 5,057,540 及"Saponins as vaccine adjuvants", Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2): 1-55及EP 0 362 279 B1 中予以描述。溶血性 皂素QS21及QS17(Quil A之HPLC純化片段）已作為有效之 系統佐劑加以描述，且其製造方法揭示於美國專利第 133262.doc -26- 200924791 5,057,540號及EP 〇 362 279 B1中。此等參考文獻中亦描述 QS7 (Quil-A之非溶血性片段）之用途，其用作系統疫苗之 有效佐劑。QS21之用途另外描述於Kensil等人（1991. J, Immunology第146卷，431-437)中。QS21及聚山梨醇酯或 環糊精之組合亦為已知的（WO 99/10008)。包含QuilA片段 (諸如QS21及QS7)之微粒佐劑系統描述於w〇 96/33739及 WO 96/11711 中。 另一免疫刺激劑為含有未甲基化之CpG二核苷酸之免疫 刺激性寡核苷酸（"CpG”）。CpG為DNA中存在之胞嘧啶-鳥 苷二核苷酸基元之縮寫。當藉由全身性及黏膜途徑投與 時，CpG在此項技術中已知為佐劑（w〇 96/02555、EP 468520、Davis等人，乂 /爪則„〇/，1998，160(2):870-876 ; McCluskie及 Davis，《/· /wmwno/.，1998，161(9):4463-6)。過 去，已觀測到BCG之DNA片段可發揮抗腫瘤作用。在另一 研究中’源自BCG基因序列之合成寡核苷酸顯示能引發免 疫刺激作用（活體外及活體内）。此等研究之作者得出結 論，某些迴文序列（包括中心CG基元）帶有此活性。CG基 元在免疫刺激中之中心作用後來在Krieg之出版物，Nature 374，第546頁，1995中闡明。詳細分析已顯示CG基元必 需在某一序列範圍内，且該等序列為細菌DNA所共有但在 脊椎動物DNA中很少見。免疫刺激性序列通常為：嘌呤、 嘌呤、C、G、嘧啶、嘧啶；其中CG基元未經曱基化，而 其他未曱基化CpG序列已知為免疫刺激性的且可用於本發 明中。 133262.doc -27- 200924791 在六核苷酸之某些組合中，存在迴文序列。若干此等基 元’可作為一個基元之重複或不同基元之組合存在於同一 寡核苷酸中。此等含有寡核苷酸之免疫刺激性序列中之一 或多者的存在可活化各種免疫子集，包括天然殺手細胞 (其產生干擾素γ且具有溶胞活性）及巨噬細胞（Wooldrige等 人’第89卷（第8號），1977)。不具有此一致序列的其他含 有未甲基化CpG之序列現亦展示具有免疫調節性。 當調配入疫苗中時’ CpG —般與游離抗原一起以自由溶 液投與（W0 96/02555 ; McCluskie及Davis，上文）或與抗原 共價結合（WO 98/16247)，或與諸如氫氧化鋁之載劑一起 調配（（肝炎表面抗原）Davis等人。J：文；Brazolot-Millan等 人 ’ Proc. iVa". Jcad. 5W., USA，1998, 95(26)，15553-8)。

如上文所述之該等免疫刺激劑可與載劑一起調配，該等 載劑諸如有脂質體、水包油乳液及/或金屬鹽，包括鋁鹽 (諸如，氫氧化鋁）。舉例而言，3D-MPL可與氫氧化鋁（EP 0 689 454)或水包油乳液（WO 95/17210)—起調配；QS21可 有利地以含有膽固醇之脂質體（WO 96/33739)、水包油乳 液（WO 95/17210)或礬（WO 98/15287)加以調配；CpG可以 礬（Davis等人，/Brazolot-MillanJhjt)或其他陽離子 載劑調配。 免疫刺激劑之組合亦較佳，尤其單磷醯基脂質A與皂素 衍生物之組合（W0 94/00153 ; WO 95/17210 ; W0 96/33739 ； WO 98/56414 ； WO 99/12565 ； WO 99/11241) » 更尤其WO 94/00153所揭示之QS21與3D-MPL之組合。或 133262.doc -28- 200924791 者’ CPG+皂素（諸如QS21)之組合亦形成用於本發明之有 效佐劑。 因此’合適佐劑系統包括（例如）單磷醯基脂質A(較佳 3D-MPL)以及鋁鹽之組合。 ' 一種強化系統包括單碟醯基脂質A與皂素衍生物之組 . 0，尤其WO 94/00153中所揭示之QS21與3D-MPL之組 合，或如WO 96/33739中所揭示在含有膽固醇之脂質體 中QS21被抑制之低反應原性組合物。 〇 I括水包油乳液中之QS21、3D_MPL及生育酚的尤其有 效之佐劑調配物描述於W〇 95/1721〇中，且為用於本發明 之另一較佳調配物。 另一較佳調配物僅包含Cpg寡核苷酸或同時包含QS21、 3D-MPL或同時包含鋁鹽。 因此，在本發明之一實施例中，提供脫毒脂質A或脂質 A之無毒知生物、更佳為單磷醯基脂質a或其衍生物（諸如 © 3D MPL)以及本文所述之瘧疾抗原的用途，其係用於製造 用以預防嬰兒之遽疾疾病及/或感染之疫苗。 在本發明之一實施例中，皂素（諸如QS21)係與本文所述 之遽疾抗原組合用於製造用以預防嬰兒之瘧疾疾病及/或 &染之疫苗或用於採用前述者治療嬰兒之方法。 /在實施例中’本發明提供脫毒脂質a或脂質A之無毒 千了生物、更佳為單磷醯基脂質A或其衍生物（諸如3D_MpL) 、及專諸如QS21)，及本文所述之瘧疾抗原的用途，其 糸用於製&用以預防嬰兒之瘧疾疾病及/或感染之疫苗。 133262.doc -29· 200924791 本發明亦延及一種採用此等態樣治療嬰兒之方法。 在一實施例中’本發明進一步採用水包油乳液或脂質 體。 適用於本發明之佐劑組合為： - 1 · 3D-MPL、QS21及水包油乳液。 . 2.脂質調配物中之3D-MPL及QS21。 3.脂質調配物中之3D-MPL、QS21及CpG。 ©所用3D-MPL之量一般較小，但視疫苗調配物而定可大 約為每劑1-1000 ’ 一般每劑υοο ，諸如介於每劑1 pg至 100 (每劑 10、15、20、25、30、35、4〇、45、5〇、 60、70、80 或 90 pg)。 用於本發明佐劑之皂素的量可大約為每劑1-1000 ，通 常為每劑丨·500叩，更多諸如每劑1-250 pg且更特定言之 介於每劑1 至1〇〇吨之間（每劑1〇、15、2〇、25、3〇、 35、40、45、50、60、70、80或 90 μ8)。 〇 本發明之佐劑或疫苗中CpG或免疫刺激性寡核苷酸的量 通币較小，但視疫苗調配物而定可大約為每劑1-1000 ， 般每劑丨·500叫，且更多諸如介於每劑1 pg至100 之 間（每劑 1〇、15、2〇、25、3〇、％、、Μ、、 70、80或 9〇 μβ)。 在本發明之一態樣中，劑量具有〇 5 ml之最終體積。 本發明之疫苗可藉由各種途徑中之任一種提供，諸如口 局。P、皮下、黏膜、靜脈内、肌肉内、鼻内、舌下及 皮内。 133262.doc •30· 200924791 免疫可為預防性的或治療性的。本文所述之發明主要 (但並非唯獨）關於針對癔疾之預防性疫苗接種，更尤其關 於旨在預防或降低瘧疾感染及/或瘧疾疾病可能性之預防 性疫苗接種。 適用於本發明之醫藥學上可接受之載劑或賦形劑在此項 技術中係熟知的且包括（例如）水或緩衝液。疫苗製劑一般 描述於 Pharmaceutical Biotechnology，第 61 卷 Vaccine Design-the subunit and adjuvant approach, Powell 及

D

Newman編，Plenum Press New York, 1995。New Trends and Developments in Vaccines，Voller等人編，University Park Press, Baltimore，Maryland，U.S.A. 1978。脂質體内 之封裝係由（例如汗11141^〇11，美國專利4,235,877所描述。 蛋白質與大分子之結合係（例如）由Likhite，美國專利 4,372,945及Armor等人，美國專利4,474,757所揭示。 在本說明書之内容中，包含應解釋為包括。 0 包含某一要素之本發明之態樣亦意欲延及由相關要素組 成或基本上由相關要素組成之該等態樣，且（若適當時）反 之亦然。 實例 研究設計

研究係在2005年6月與2007年3月之間在Ilha Josina及 Taninga 之 Centro de Investigapao em Saude de Manhifa (CISM，Manhipa Health Research Centre)進行，Ilha Josina 及Taninga為兩個在Manhipa鎮以北約50 km的社區，CISM 133262.doc -31 - 200924791

總部坐落於該鎮。整個研究區域及uha Josina之特徵先前 已有描述（Alonso PL, Sacarlal J，Aponte JJ，Leach A, Macete E, Milman J等人，Efficacy of the RTS,S/AS02A vaccine against Plasmodium falciparum infection and disease in young African children: randomised controlled • tria1· Lancet 2004 年 Ϊ0 月 16-22 曰；364(9443):1411-20)。

Taninga為面向直接跨越因科馬蒂河（Inc〇mati River)氾濫平 ❹ 原之Ilha Jossina的農村社區。其為亞熱帶氣候，具有兩個 獨特的季節：11月至4月之溫暖多雨的季節，及一年中其 餘時間期間_般為涼爽且乾燥的季節。瘧疾傳播四季不斷 且具有某種季節性，且主要由惡性瘧原蟲引起。不旁#奴 咖吵心心5 /M«如叫為主要載體。基於阿莫地喹 (amodiaquine)與周效磺胺 _ 乙胺權 〇定（sulphad〇xine_ pmmethamine)之組合療法一直為簡單瘧疾之一線治療方 案，直至2006年9月才將其換為使用青蒿琥酯及周效磺胺_ 〇 乙胺嘧啶的基於青蒿素之組合療法（ACT)。自2005年起， 每年數輪之室内殘留噴灑（IRS)已作為健康部（Ministry 〇f Health)之瘧疾控制活動的部分來進行。在別仍年η月之第 一輪期間’ IRS係基於Carbamates (ICON®)’但此在2006年 12月換為DDT。作為研究活動之部分且根據國家推薦，在 篩檢時給予孕婦經殺昆蟲劑處理之蚊帳（ITN)以及其使用 說明。版Josina及Taninga具有提供基本治療及預防護理 2主要㈣站及產科。為研究之目的，將設施升級，可獲 得24小時鐘點護理，且提供轉診至叫_近之曼海卡區 133262.doc •32- 200924791 醫院（Manhica District Hospital)的運輸0 研究為在向嬰兒投與時藉由在1〇、14及18週大時給予免 疫處理來評定RTS，S/AS02D候選瘧疾疫苗之安全性、免疫 原性及功效概念測試的I/IIb期雙盲隨機受控試驗。方案經 莫桑比克國家生物倫理委員會（Mozambican National Bioethics Committee)、巴塞羅那醫院臨床倫理評述委員會 (Hospital Clinic of Barcelona Ethics Review Committee)及 PATH人類個體保護委員會（PATH Human Subjects Protection Committee)批准。試驗登記號為NCT00197028 且IND號為BB-IND 10514。根據關於協調良好臨床實踐方 針之國際會議（International Conference of Harmonization

Good Clinical Practices guidelines)進行試驗且試驗受 GSK Biologicals監控。地方安全監控（Local Safety Monitor)以 及資料及安全監控委員會（Data and Safety Monitoring Board)仔細地評述了試驗的設計實施與結果。 參舆者

CIS Μ在約一半地區（包括兩研究位置）操作人口統計監控 系統。請求居住於研究區域之姓娘第三期（third trimester) 孕婦（其考慮登記嬰兒）參與知情同意過程。在第一次拜訪 時’由經專門訓練之職員向孕婦群宣讀且解釋資訊單。僅 在婦女通過設計用以檢驗對資訊明瞭的個人口頭理解測試 後尋求個人同意《請求簽署（或若不識字則按拇指印）知情 同意文件。一位與研究無關之社區成員充當公正見證人且 連名簽署同意書。表明知情同意者接受諮詢且針對HIV 133262.doc •33· 200924791

(Determine™ HIV 1-2，Abbot Laboratories 及 UNI-GOLD HIV，Trinity Biotech PLC)及 B型肝炎（DetermineTM HBsAg，

Abbot Laboratories)進行篩選。將發現呈HIV陽性之婦女送 至Manhi<?a區醫院之政府健康服務處，根據國家方針進行 • 醫學評估及管理。此等包括減少母子傳播以及向符合臨床 . 及社會標準者免費提供抗逆轉錄病毒療法。忠告B型肝炎 陽性母親關於傳播給下一代之風險，且在出生時向新生兒 提供B型肝炎疫苗。

Q 繼另一份母親知情同意書後，使用上文所述類似之程 序，篩選6個月大與12個月大之間的嬰兒。此包括簡要病 史及體檢以及由足跟扎針或靜脈穿刺進行血液取樣以供基 礎血液學、生物化學及免疫學分析。納入標準中包括正常 妊娠期及不存在明顯醫學異常。因為B型肝炎及HIV陽性 母親生出之兒童處於新生兒獲得病毒的高風險之中，所以 其未包括於試驗中。在其他標準中，若在開始疫苗接種研 ϋ 究前至少一週未給予BCG，或若在登記之前，除在出生時 與BCG—起給予之第一劑量OPV外，進行過任何其他疫苗 接種，則排除該等兒童之參與。 在募集後立刻提供個體相片識別卡。此包括兒童及母親 姓名以及人口普查之個人識別號（Alonso P，Saute F，Aponte JJ. Manhi9a DSS, Mozambique. In: Sankoh OA, Ngom P, Nyarko P，Mwageni E，Kahn K編。Population and health in developing countries ；第 1卷 > population, health and survival at INDEPTH sites. Ottawa: International development research 133262.doc -34- 200924791 center (IDRC); 2002，第189-95頁）及在篩選拜訪時頒予之 唯一研究號。現場活動在2005年6月24曰開始。第一名嬰 兒係在2005年8月23日登記且最後一名係在2006年9月12曰 登記。雙盲期的隨訪活動係在2007年3月6日當最後一名募 集之兒童達到其6個月研究拜訪時完成。 程序 莫桑比克之EPI包括出生時之BCG疫苗及口服脊髓灰質 炎疫苗（OPV)、三劑在8、12及16週大時與OPV共同投與之 白喉-破傷風-百日咳全細胞（DTPw)及B型肝炎疫苗以及9個 月大時之麻疹疫苗。為研究之目的，吾人向此方案中引入 2個變化。若在數目增長之非洲國家中Hib疫苗之使用快速 擴增且逐漸成為EPI之部分，則吾人決定將其與DTPw組合 而包括在内，此係因為其將向參與試驗之兒童提供額外益 處。B型肝炎疫苗未與DTPw—起給予，因為RTS，S已顯示 誘發相當效價之抗HBsAg。圖la呈現試驗設計及隨訪流 程。在以 DTPw/Hib [TETRAetHib™ Aventis Pasteur]第一 次疫苗接種之曰登記合格兒童。在以DTPw/Hib第一次疫 苗接種時將兒童隨機分配，使其接受三劑以DTPw/Hib及 OPV疫苗交又2週且在10、14及18週大時投與之 RTS，S/AS02D (GSK Biologicals，Rixensart. Belgium)或 B型 肝炎疫苗（Engerix-BTM，GSK Biologicals, Rixensart, Belgium)。在GSK Biologicals以SAS軟體第8版進行區組隨 機化（1:1比率，區組尺寸為2)。一旦資料庫經監測、清潔 及鎖定後，就將隨機碼發布給研究者》 133262.doc -35- 200924791 針對癔疾疫苗群之兒科調配物隨機化之嬰兒接受〇·5 ml 含有25 pg RTS，S及佐劑系統AS02D之RTS，S/AS02D調配 物。RTS,S為由惡性瘧原蟲cs蛋白中心串聯重複及與B型 肝炎病毒之S抗原（HBsAg)之胺基末端融合的羧基末端區組 成之雜交重組蛋白。蛋白質自動裝配形成亦包括未融合S 抗原之粒子。抗原及GlaxoSmithKline之專有AS02D佐劑系 ，统詳多田描述於另'J 處（Macete EV, Sacarlal J，Aponte JJ，Leach A, Navia MM, Milman J 等人，Evaluation of two formulations of adjuvanted RTS, S malaria vaccine in children aged 3 to 5 years living in a malaria-endemic region of Mozambique: a Phase I/IIb randomized double-blind bridging trial· Trials 2007年 3 月 26 日；8:11) 〇 將DTPw/Hib藉由肌肉内（IM)途徑在大腿右前外側投 與，而RTS，S/AS02D或Engerix-BTM係在大腿左前外側IM投 與。RTS，S/AS02D或Engerix-BTM疫苗接種係以雙盲方式 (觀測者盲，參與者盲）傳遞。疫苗接種組製備疫苗且在將 注射器提供給使嬰兒免疫之臨床組之前以不透明膠帶遮蔽 注射器内容物。因為研究中所用之兩種疫苗外觀截然不 同，所以疫苗接種組為非盲且不涉及於任何其他研究程序 中〇 每次疫苗接種後，觀測嬰兒歷時至少1小時。隨後6天， 經訓練之現場工作者每天拜訪在家中之嬰兒以記錄任何不 利事件（AE)。在此期間記錄誘發（solicited)局部及全身不 利事件。每次給藥後經由基於衛生機構之發病率監控系統 133262.doc •36- 200924791 記錄非誘發（unsolicited)不利事件歷時30天。在整個研究 過程中以類似方式偵測且記錄嚴重不利事件（SAE)。誘發 及非誘發不利事件以及SAE之定義的詳細描述可見於別處 11。經由血液學及生物化學評定進行另一安全性評定，包 . 括如圖la所示在若干時間點量測之腎及肝功能。在基線時 且在RTS，S/AS02D或Engerix-B™第3次給藥後1個月量測抗 HBsAg抗體效價。在基線時且在RTS，S/AS02D或Engerix-B™第3次給藥後1個月及三個半月量測抗CS抗體效價。在 © DTPw/Hib第3次給藥後1個月量測針對白喉及破傷風毒素 之抗體及b型流咸f #磨(7/. /«//wewzaej之麟酸聚核糖基 核糖醇（PRP)抗體。在基線時且在DTPw/Hib第3次給藥後1 個月量測針對百日咳桿菌（5. 之抗體。 惡性瘧原蟲之瘧疾感染案例在研究區域之衛生機構處係 藉由主動感染偵測（ADI)及被動案例偵測（PCD)來監測。 ADI由以預定間隔針對研究參與者之反覆拜訪組成（圖 1 a)。每次拜訪時，不管是否存在症狀均收集用於寄生蟲 血症測定之血液玻片，且記錄腋下體溫。不管是否存在症 狀且排除另一 ADI評定，將具有陽性玻片之兒童以第一線 治療進行治療。在開始ADI隨訪之前，假定在所有兒童中 以在RTS，S/AS02D或Engerix-B™第三次及最終給藥之前兩 週投與的阿莫地喹（每天10 mg/kg，歷時3天）與單劑量周效 續胺-乙胺嘧啶（周效績胺25 mg/kg且乙胺嘧啶1,25 mg/kg) 之組合清除無症狀性寄生蟲血症。在2週後在第3次給藥時 檢驗寄生蟲血症，且若存在，則以基於Coartem®之第二線 133262.doc -37- 200924791 治療進行治療。僅不患有寄生蟲血症之兒童開始ADI， ADI在RTS，S/AS02D或Engerix-B™第3次給藥後2週開始且 每隔1週進行，歷時12週。 在Manhiga區醫院、Ilha Josina及Taninga保健站設立基 於衛生機構之發病率監控系統，使能進行所有到衛生機構 者之被動案例偵測（PCD)且探查臨床瘧疾之發作。此監控 系統已詳細描述於別處（Alonso PL，Sacarlal J，Aponte JJ, Leach A, Macete E，Milman J 等人，Efficacy of the RTS,S/AS02A vaccine against Plasmodium falciparum infection and disease in young African children: randomised controlled trial· Lancet 2004年 10 月 16-22 日；364(9443):1411-20)。簡 言之，三個機構具有經訓練而能經由個人識別卡鑑別研究 參與者且能確保整個隨訪期間之標準化評定、管理及記錄 工作的24小時醫務人員。對記錄有發熱（37.5°C或更高）或 先前24小時内具有發熱史或面色蒼白之所有兒童抽血以供 寄生蟲測定及壓積細胞體積（PCV)測定。將符合入院標準 之兒童提送至Manhi9a區醫院以供住院治療。根據標準國 家方針提供臨床管理。在入院與出院時，所有相關資訊係 以標準化形式記錄。 為測定寄生蟲之存在及惡性瘧原蟲無性期之密度，根據 別處描述之標準品質控制程序讀取吉姆沙染色之血液玻片 (Alonso PL, Sacarlal J, Aponte JJ, Leach A, Macete E， Milman J 等人，Efficacy of the RTS,S/AS02A vaccine against Plasmodium falciparum infection and disease in 133262.doc • 38 - 200924791 young African children: randomised controlled trial. Lancet 2004 年 10 月 16-22 日；364(9443):1411-20)。使用乾式生物 化學光度計 VITROS DT II (Orto Clinical Diagnostics, Johnson & Johnson Company, USA)量測生物化學參數。使 用 Sysmex KX-21N細胞計數器（Sysmex Corporation Kobe, Japan)進行血液學測試。在離心分離後，在肝素化微毛細 管中使用Hawksley血容比讀取器量測PCV。 藉由樣準ELISA使用經含有序列[NVDP(NANP)15]2LR之 重組抗原R32LR吸附之培養盤量測對CS蛋白串聯重複抗原 決定基具特異性之抗體。將檢定截止值設為0.5 EU/ml。使 用市售放射性免疫檢定（AUSAB，Abbott)將檢定截止值設 為10 IU/ml來量測抗HBsAg抗體含量。藉由ELISA以設為 0.15 pg/ml之截止值量測抗-PRP抗體。藉由ELISA以設為 0.1 0 IU/ml之檢定截止值量測抗白喉及抗破傷風抗體效 價。藉由ELISA (Labsystems)以設為15 EL.U/ml之檢定截 止值測定抗全細胞百日咳桿菌抗體效價。 統計分析 試驗之主要端點為RTS，S/AS02D疫苗候選物之安全性及 耐受性。意向處理（ITT)安全性分析中包括接受至少一劑 DTPw/Hib給藥之所有兒童。 抗-CS及抗-HBsAg抗體資料係藉由平均幾何效價（GMT) 以95% CI概述。抗-CS血清陽性係定義為20.5 EU/ml，而B 型肝炎之血清保護係定義為210 IU/ml。 疫苗功效（VE)之概念測試係基於針對根據方案 133262.doc -39· 200924791 iAee〇fding t() Protoc〇〗’ ATp)群進行的前瞻性確定之報導 與分析計劃（RAP)。ATP群包括符合所有合格標準、完成 疫田接種過程且在ADI期間提供出隨訪時間之個體。該分 析包括在RTS，S/AS〇2D或Engerix-B™第3次給藥後η天開 • 始且以在研究第6個月時之拜訪為結束的隨訪期（約3個月 • 隨訪期）期間所偵測的所有第一次或僅有一次無性惡性瘧 原蟲感染。此分析中包括之癔疾感染係由ADI或pCD偵 測。 ❹ 另一探索性分析研究ITT群中針對臨床瘧疾之疫苗功 效，該ITT群包括自登記之時起直至最後登記之嬰兒完成 其ADI隨訪之曰（2007年3月6曰）為止的期間之第一次或僅 有_人發作。此外’在與新感染之功效評估中相同的ατΡ 群中及隨訪期内進行臨床癔疾之探索性分析。臨床瘧疾之 原發病例定義為發熱（腋下體溫237：rc)，惡性瘧原蟲之無 性寄生蟲血症為每微升5〇〇或更高。此定義具有經報導大 φ 於 9〇%之敏感性及特異性（Saute F, Aponte j，Almeda j，

Ascaso C，Abellana R，Vaz N等人，Malaria in southern

Mozambique: malariometric indicators and malaria case definition in Manhica district. Trans R Soc Trop Med Hyg 2003年11-12月；97(6):661-6)。其他探索性功效分析使用 臨床瘧疾之繼發病例定義，包括發熱或先前24小時内之發 熱史加上任何無性惡性瘧原蟲寄生蟲血症。為自研究區域 消失且為如先前所述之抗瘧疾藥的用途調整處於風險中之 時間（報導為處於風險中之人年（PYAR))(Al〇ns〇 pL， 133262.doc -40- 200924791

Sacarlal J，Aponte JJ，Leach A, Macete E，Milman J等人， Efficacy of the RTS,S/AS02A vaccine against Plasmodium falciparum infection and disease in young African children: randomised controlled trial. Lancet 2004年 10月 16-22 日； 364(9443):1411-20)，此係因為此等為不能期望嬰兒提供 研究終點之時間段。 VE係定義為1減去比率。藉由與衛生機構（根據先前所述 之方法計算（Alonso PL，Sacarlal J，Aponte JJ，Leach A， Macete E，Milman J等人，Efficacy of the RTS,S/AS02A vaccine against Plasmodium falciparum infection and disease in young African children: randomised controlled trial. Lancet 2004 年 10 月 16-22 日；364(9443):1411-20))及 居住社區之距離調整疫苗功效。除非另外說明，否則在本 文整個内容中報導使用Cox回歸模型評定之經調整疫苗功 效。在接受RTS，S/AS02D之群中藉由比較最低反應三分位 組之嬰兒之危險比（HR)與彼等最高反應三分位組之嬰兒之 危險比且使用Cox回歸模型估算每雙倍抗CS抗體效價之HR 來評估抗CS抗體效價對瘧疾感染風險之影響。最終，使用 魏克森等級和測試（Wilcoxon Rank Sum test)將具有至少一 次瘧疾感染發作之兒童的平均幾何效價與彼等未記錄有瘧 疾感染之兒童的平均幾何效價進行比較。 樣本尺寸係基於疫苗安全性之評估。若Engerix-BTM組中 一事件之頻率為10%或更高，則各組中100名個體之試驗 對偵測26%或更高之不利事件比例的差異具有80%能力。 I33262.doc -41 · 200924791 此尺寸之試驗亦對偵測45%或更高之針對瘧疾感染的功效 具有90%之能力，其中假定監控期内對照組中之發生率為 75%或更高。分析係使用SAS及STATA進行。 經费來源之作用 GSK及CISM皆接受財政支持以執行此來自PATH瘧疾疫 苗規劃署（PATH Malaria Vaccine Initiative，MVI)之原稿中 所述之工作，其涉及於研究設計及解釋之所有態樣中（根 據原作者方針）。MVI經Bill & Melinda Gates基金會授權資 助此項工作。CISM之核心資助係由西班牙國際合作署 (Spanish Agency for International Cooperation，AECI)提 供。 結果 圖1展示試驗概況。446名孕婦中326名符合合格標準且 產下329名新生兒。在彼等新生兒中，篩檢251名嬰兒且所 篩檢兒童中之214名（85%)在試驗中予以登記，且接受 DTPw/Hib疫苗之第1次給藥。RTS，S/AS02D組中之93名 (86%)兒童及Engerix-B™組中之92名（85%)兒童進入ADI隨 訪期。在隨訪期間，RTS，S/AS02D組中有7名兒童撤回同 意書且Engerix-B™組中有8名兒童撤回同意書。各組中3名 兒童在RTS，S/AS02D或EngeΓix-BTM第2次給藥時接受錯誤 疫苗。其不包括於ATP分析中。兩組之基線特徵呈現於表1 中〇 圖2c展示關於所有投與之給藥之比例關係，其中記錄誘 發症狀。該圖呈現4組，DTPw/Hib及OPV之資料係藉由隨 133262.doc -42- 200924791 機分配分開。具有疼痛之兒童比例較高且在所有組中類 似。RTS，S/AS02D每次注射後症狀之相對比例類似且量值 相當（資料未顯示）。在RTS，S/AS02D組中未記錄到3級誘發 症狀，且其他組中發病率極低（資料未顯示）。在經隨訪直 至2007年3月6曰之隨訪結束點的ITT群中，在 RTS，S/AS02D組中存在31名SAE且Engerix-B™組中存在30 名SAE。其中無一例報導與疫苗接種有關。在此同一隨訪 期有四例死亡；其在ADI期後均已結束第6月之研究（在 RTSS/AS02D組中為2例且在Engerix-B™組中為2例）。所有 死亡均在家中發生。口頭屍檢表明RTS，S/AS02D組中1例 死亡係由於敗血性休克，且剩餘3例係由於腸胃炎及嚴重 脫水。第1次給藥及第3次給藥後兩組中異常血液學值及生 物化學值的數值及比例類似且未產生任何安全性信號（資 料未顯示）。 對於試驗中所登記之214名個體（107名RTS，S/AS02D及 107名Engerix-B™)而言，在第3次給藥後可獲得151名個體 的EPI抗原反應之資料（在RTS,S/AS02D組中為76名且在對 照組中為75名）。兩組個體之間的血清保護/血清陽性及效 價無差異（Aide等人，manuscript in preparation)。所有兒 童（但3名兒童除外）針對所有EPI抗原達到血清保護水準。 此等3名兒童將以其未能產生反應之抗原再免疫。 所量測之針對CS及HBsAg的抗-CS及抗-HBsAg抗體含量 展示於表2中。篩檢時，RTS，S/AS02D組及Engerix-B™組 中分別24/76 (32%)及26/77 (34%)嬰兒具有可偵測抗CS抗體 133262.doc • 43· 200924791 之低效價。第3次給藥後1個月，99% (7001)接受 RTS，S/AS02D之嬰兒具有可偵測之抗-CS抗體，而接受 Engerix-B™之嬰兒中對應數字為4% (3/68)。第3次給藥後3 個半月（研究第6個月）’ RTS，S/AS02D中抗-CS陽性之比例 仍為較高（98%)但GMT降低。即使可偵測抗體之發生率增 加至20% (12/61)，中之抗-CS GMT亦仍然較 低。兩組中B型肝炎之反應良好（表2)。 圖4展示在ADI隨訪期間（於RTS，S/AS02D或Engerix-B™ 第3次給藥後14天開始直至研究第6個月）具有至少一次瘧 疾感染發作之兒童的比例。在此隨訪期間記錄到總共68例 新感染，在RTS，S/AS02D組中有22例且在Engerix-B™組中 有46例。經3個月隨訪期，粗疫苗功效（VE)估算值為62.2% (95% CI 3 7.1% ; 77.3%，p=0.0002)。藉由與衛生中心及居 住社區之距離所調整，VE為65.9% (95% CI 42.6% ; 79.8%，p<0.0001)(表3)。兩組之間在研究第6個月時感染 之點發生率類似（RTS，S/AS02D組中為5%，對照組中為 8%，p=0.536)，平均寄生蟲密度之間亦不存在差異（在 RTS，S/AS02D組中為每微升2082個寄生蟲（SD 5604)，對照 組中為 2579個 /微升（SD 6088)，p=0.85)。 RAP中所含之探索性端點包括使用不同群及病例定義針 對臨床瘧疾之功效估算值。使用經由ADI及PCD偵測之瘧 疾的原發病例定義（第一次或僅有一次發熱發作，其中每 微升大於500個寄生蟲）基於自第0個月至第6個月隨訪之 ITT群的功效為 35.5% (95% CI -7.5% ; 61.3%，p = 〇.093)。 133262.doc -44- 200924791 表3中展示ATP群中於RTS，S/AS02D或Engedx-βΤΜ之第3次 給藥後14天開始直至第6個月時之研究拜訪（與針對感染之 主要VE估算所用相同之隨訪期）期間的針對臨床瘧疾之另 一功效估算值。表4給出第3次給藥後12個月（亦即3 _丨4個 月）内之另一隨訪的細節。 以若干方式檢驗抗CS抗體效價與瘧疾風險之關係。首 先，吾人將在隨訪期間未記錄到瘧疾感染之嬰兒組於 RTS，S/AS02D或Engerix-BTM第3次給藥後的抗以抗體效價 與彼等具有至少一次發作者之抗cs抗體效價比較。前一組 之平均抗CS抗體效價較高（2〇8比132，p=0.026)。其次， 較高抗體分布三分位組之嬰兒的危險比比較低三分位組之 嬰兒低71% (95% CI 8.4% ; 90.7%，p=0,035)。最後，吾人 檢驗與抗體效價增加有關之瘧疾感染風險^抗體效價加倍 與新感染風險降低6.4% (95% CI 10.8 ; 1.8) p=0.007有關。 抗-CS效價增加1〇倍與新感染風險降低19 8% (95。/〇 CI 31·6 ; 5.9)有關。 基於結果分析’在免疫處理完成後3個月之隨訪期内針 對新感染之疫苗功效為65%。此功效估算值比先前試驗 (026試驗）中報導之45%降低來得高，其中該先前試驗係在 相同研究區域之相當ADI系統中隨訪的1至4歲年長兒童中 進行（Alonso PL，Sacarlal J，Aponte JJ，Leach A, Macete Ε， Milman J 等人，Efficacy of the RTS，S/AS02A vaccine against Plasmodium falciparum infection and disease in young African children: randomised controlled trial. Lancet 133262.doc -45- 200924791 2004 年 10月 16-22 日；364(9443):1411-20)。此試驗及 026 試 驗之隨訪期並不相同，在嬰兒中比在年長兒童中略短。其 次，兩個估算值之信賴區間重疊。

133262.doc -46- 200924791 ❹ ο -¾ 133262.doc

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Z.I 6.1 Γ8Ι ςε £ 忘堪肩碯釗椒wo食γθν戚 _ 蝌垅 133262.doc -49- 200924791 【呎筚2^ε&侩* Μ^-ϊ麵镰籴-^ε蛛】dHv絮龙海^8STf< 133262.doc 未針對協變量調整之VE的點估算值 S 0.060 0.007 0.1645 95% CI 57.631 60.719 53.6 -1.838 14.044 -14.0 34.313 41.893 27.2 針對協變量調整之VE的點估算值 ¢4 0.074 0.007 0.1918 95% CI 57.017 60.965 53.3 -4.056 13.754 -16.6 33.122 41.978 26.2 Engerix-B 齋 0.878 1.379 1.08 PYAR 51.27 41.34 68.83 事件數 sp； 個 «(N) (N Os s (N ON 1 XI ίΛ cS 齋 -£ 0.582 0.786 0.80 PYAR 61.83 57.26 72.69 事件數 1__ m »〇 00 個體 (N) m 〇\ cn ON cn On 疾病1a 疾病2b 疾病le aud^Iavs 5wiwoo^s^^^^^swl<^^s<^l^-woosv-s# - (uossajgaluossod)麽 B^-cnn^xi-^呤：一>aw 别總 Hdxou: Ensrfi- : 13:(自-1)該贫坩嚓：3Λ :4-Ύ/4ΗΙ^·δ-^1ί :oiVAd -50- 200924791 參考文獻 1. Hay SI, Guerra CA, Tatem AJ, Noor AM, Snow RW. The global distribution and population at risk of malaria: past, present, and future. The Lancet Infectious Diseases 2004;4(6):327-336 〇 2. Breman JG, Alilio MS, Mills A. The intolerable burden of malaria: what's new, what's needed. Am J Trop Med Hyg 2004;71 (2—增子丨J):0-i-。

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Claims (1)

1. 200924791 十、申請專利範圍： 1. 一種源自表現於瘧疾感染之紅血球前期的惡性瘧原蟲 函之環子抱子蛋白（CS)蛋白質之 抗原與醫藥學上可接受之佐劑組合的用途，其係用於製 造用以接種嬰兒以防瘧疾之藥物。 2. 如請求項1之用途，其中該目標群體為約1週大至約5〇週 大的嬰兒。 3. 如3青求項1或2中任一項之用途’其中該抗原與該佐劑之 調配物進一步包含選自由CS、LSAq、LSA-3、ama_ 1、MSP-i、TRAP、Exp-1或其免疫原性片段組成之群的 抗原。 4·如請求項1或2之用途’其中該CS抗原與B型肝炎之表面 抗原（HBsAg)融合。 5·如請求項1或2之用途，其中該CS蛋白或片段為雜交蛋白 形式’包含瘧原蟲之CS蛋白的實質上所有c端部分、cs 蛋白免疫顯性區之四個或四個以上串聯重複（tandem repeats)及b型肝炎之表面抗原（HBsAg) 〇 6.如請求項5之用途，其中該雜交蛋白包含惡性瘧原蟲之 CS蛋白之序列，實質上對應於惡性瘧原蟲菌株3D? 純系cs蛋白之胺基酸207-395，經由一個線性連接子與 HBsAg之n端同框(in frame)融合。 7·如請求項6之用途，其中該雜交蛋白包含惡性癌原蟲之 cs蛋白之序列，實質上對應於惡性瘧原蟲仰54菌株 純系cs蛋白之胺基酸207·395 ’經由一個線性連接子與 133262.doc 200924791 HBsAg之N端同框融合。 月求項7之用途，其中該雜交蛋白為rts。 9. 如"月求項8之用途，其中該RTS為混合粒子rts，s之形 式。 10. 如2求項9之用途，其+RTS，S之量為每劑25叩。 U.如叫求項1或2之用途，其中該佐劑為Thl細胞反應之較 佳刺激劑。 12·如*月求項11之用途，其中該佐劑包含3D-MPL、QS21、 或3D-MPL與QS21之組合。 13. 如吻求項12之用途，其中該佐劑進一步包含水包油乳 液。 14. 如請求項12之用途，其中該佐劑進一步包含脂質體。 15 ·如請求項1或2之用途，其中該佐劑以兒科劑量調配。

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