TW200840821A - Methods of purifying anti A beta antibodies - Google Patents

Description

(1) 200840821 昜 ’ 九、發明說明 相關申請案 本申請案主張美國臨時專利申請案號 60/69 1821 ( 2〇〇5年6月17日申請，發明名稱爲“純化含有Fc區域的 蛋白質之方法”）之優先權。該臨時專利申請案之全部內 容係倂入本申請案中。 【發明所屬之技術領域】 本發明關於純化抗Αβ抗體類之方法。 【先前技術】 阿茲海默氏疾病（“AD”）係一種神經變性疾病，其 特徵爲出現澱粉樣斑、神經原纖維纏結及顯著之神經元喪 失。β-澱粉樣蛋白質（亦稱爲Αβ肽）係老年斑之主要成 分，其係關連阿兹海默氏疾病之發病機制（Selkoe (19 89) Cell 5 8: 611-612; Hardy (1997) Trends N eur o s ci, 20: 1 54-159 )。已顯示β-澱粉樣對經培養的神經元之直接毒性（ Lorenzo and Yankner ( 1 9 9 6) Ann. NY Acad. Sci. 777: 89-95)及經由不同之遞質之間接毒性（Koh et al. (1 990) Brain Research 5 3 3: 315-320; Mattson et al. (1 992) J · iVewroarences 1 2: 3 76-3 89 )。此外，活體模式（其包括 PDAPP小鼠和大鼠模式）已連結β-澱粉樣與學習缺陷、認 知功能改變及長期對大腦海馬強化之抑制作用之關係（

Chen et al· (2000) Nature 408: 975-985; Walsh et al. (2) 200840821 m (2002) 416: 535-539)。因此’許多焦點係放在改 變β -澱粉樣量以有效地降低嚴重性或甚至除去該疾病本身 之治療上。 爲回應PDAPP小鼠和大鼠實驗模式所得之成功硏究 結果，近來已提出之一種AD治療策略係使個體被動免疫 以提供免疫球蛋白（諸如對β-澱粉樣具專一性之抗體）（ 參閱例如 Bard d β/· (2000) iVw· Μ以.6: 916-919 和 Bard φ et al· (2003) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 1 00: 2023-2028 )。近來，亦已顯示於阿茲海默氏疾病之轉基因小鼠模式 中，藉由被動免疫以減少Αβ係提供拮抗突觸變性之持續 性喪失的保護作用（Buttini ef α/· (2005) J· μ r os e ζ·. 2 5 : 9096-101) ° 近來在重組技術上之進展已能產製實質上拮抗任何標 的（例如癌細胞、細菌及病毒）之抗體。典型上，利用細 胞株以產製抗體，該細胞株係經改造以大量表現該抗體。 φ 經改造之細胞株隨後係於培養基中生長，該培養基包含糖 、胺基酸、生長因子及各種不同之蛋白質（包括例如血清 蛋白質）之複合混合物。然而，自細胞副產物和培養基成 分中分離完整之抗體至足供用於硏究或作爲治療劑之純度 係成爲艱難的挑戰。若該抗體係作爲投遞至人體之藥物， 則該抗體分子之純化係特別重要。 傳統之抗體純化流程（或順序）通常包含層析步驟， 該層析步驟係利用抗體分子選擇性與層析管柱之固相（或 功能性固相）結合或被該固相（或功能性固相）保留的能 -5- (3) 200840821 m 力（其係與各種不同之雜質的結合或保留能力相比）。已 提出或實施用於純化抗體之流程’其中首先係使含有 CH2/CH3區域之蛋白質與固定在固相上之蛋白質A結合 ，隨後藉由利用疏水性電解質溶劑沖洗該固相以除去與該 固相結合之雜質，及隨後自該固相回收含有該CH2/CH3 區域之蛋白質。然而，該流程係受限於用於選擇性結合含 有CH2/CH3區域之蛋白質之條件亦支持雜質（例如含有 φ 不完全CH2/CH3區域之抗體）之結合。對開發人體治療 劑而言，該雜質係極不受歡迎的。 於是，需要改善由細胞培養所產製之具有恆定區的蛋 白質或多肽（特別是含有Fc區域之蛋白質（例如抗體） )之純化方法。 【發明內容】 發明簡述 本發明關於純化Αβ結合蛋白質（特別是Αβ結合抗 體）之方法。本發明之方法係特別適於純化用於投遞至人 體之蛋白質（例如抗體）。特別地，本發明關於純化經細 胞培養所產製之含有恆定區之蛋白質（特別是含有Fc區 域之蛋白質，例如抗體）。 在不同方面’本發明關於自來源液體分離含有FC區 域之Αβ結合蛋白質（諸如抗Αβ抗體）之方法，該來源 液體包含該蛋白質和一或多種雜質。於本發明之方法中， 該Αβ結合蛋白質係被Fc結合劑所吸附，並隨後利用含 -6 200840821 (4) 有二價陽離子鹽之緩衝液沖洗該Fc結合劑以除去一或多 種雜質。隨後自該Fc結合劑且於流洗液中回收該蛋白質 。本發明之方法係特別用於除去雜質，諸如內含子通讀變 異體（IRT )、二硫鍵結變異體（UDB )及/或低分子量變 異體（LMW )。本發明之方法亦有效地除去雜質，諸如 宿主細胞蛋白質（HCP )和DNA。 本發明之方法包含一或多個層析分離步驟並此外可包 含一或多個過濾步驟。該層析分離步驟可爲連續或不連續 (例如批式），或該兩者之組合。於不同之較佳體系中， 該方法包含一或多個過濾步驟以例如除去病毒、濃縮及緩 衝化含有標的蛋白質之溶液，及除去微生物污染物。 於不同之較佳體系中，該抗Αβ抗體係鼠抗體、嵌合 抗體、人化抗體或人抗體。於某些較佳體系中，該抗Αβ 抗體係與位於 Αβ 殘基 1-7、1-5、3-7、3-6、13-28、15-24 、16-24、16-21、19-22、33-40 或 33-42 之抗原決定部位 專一性結合之抗體。例示之抗Αβ抗體係與位於Αβ殘基1-10之抗原決定部位（諸如例如位於Αβ殘基1-7、1-5、3-7 或3 -6之抗原決定部位）專一性結合。其他例示之抗Αβ 抗體係與位於Αβ殘基13-28之抗原決定部位（諸如例如 位於Αβ殘基16-21或19-22之抗原決定部位）專一性結 合。再者，其他例示之抗Α β抗體係與位於Α β的C端之抗 原決定部位（諸如例如位於Αβ殘基33-40或33-42之抗 原決定部位）專一性結合。於某些較佳體系中，該抗Αβ 抗體係與不連續之抗原決定部位結合，該不連續之抗原決 200840821 (5) 定部位包括Αβ殘基1-7和13-28。其他較佳體系關於抗 Αβ抗體之Fab、Fab’（2)或Fv片段。於某些該等較佳體 系中，該抗體係雙特異性抗體或經國際專利公開案號WO 03/070760描述之方法所製備之抗體。 於一較佳體系中，該抗體係人化抗Αβ抗體，且於某 些較佳體系中，該抗體係選自3D6、10D5、12Β4、12Α11 、15C1 1或266之抗Αβ抗體。該抗體之同型可爲IgM、 φ IgGl、IgG2、IgG3、IgG4或任一其他醫藥上可接受之同 型。於較佳體系中，該同型係人IgGl或人IgG4。 於不同之較佳體系中，該Αβ結合蛋白質係經重組產 製。於不同之較佳體系中，該Αβ結合蛋白質係於中國倉 鼠卵巢（CHO )細胞中經重組產製。 於不同之較佳體系中，該一或多種雜質包含一或多種 宿主細胞蛋白質、宿主細胞DNA、細胞培養蛋白質、不 欲之Αβ結合蛋白質、及彼等之混合物。例如，於不同之 φ 較佳體系中，該不欲之Αβ結合蛋白質包含一或多種含有 內含子通讀序列之抗體鏈或其片段、一或多種含有不適當 之二硫鍵的抗體鏈或其片段、半抗體或其片段、輕鏈二聚 體或其片段、及重鏈二聚體或其片段。 於一方面，本發明之方法係自來源液體純化Αβ結合 蛋白質（適宜的是抗Αβ抗體），該來源液體包含該蛋白 質和一或多種雜質，該純化首先係藉由吸附該蛋白質至 Fe結合劑上，隨後藉由利用含有二價陽離子鹽之緩衝液 沖洗該Fc結合劑以除去一或多種雜質，及隨後自該Fc結 -8 - (6) 200840821 合劑回收該蛋白質。於不同之較佳體系中，係於約2 °C至 約24°C間之溫度下進行吸附該蛋白質至Fc結合劑上及利 用含有二價陽離子鹽之緩衝液沖洗該Fc結合劑之步驟。 於不同之較佳體系中，自該Fc結合劑回收該蛋白質之步 驟包含利用流洗緩衝液流洗該蛋白質，該流洗緩衝液之 pH係介於約2.0至約6.5之間。

於不同之較佳體系中，該Fc結合劑包含一或多種蛋 白質A和蛋白質G。於一較佳體系中，該Fc結合劑係固 定於固相上。該固相可包含例如一或多種珠、瓊脂糖載體 存在於用於沖洗該Fc結合劑之緩衝液中的二價陽離 子鹽可包含例如促溶鹽。用於製備該沖洗緩衝液之適當二 價陽離子鹽包括但不限於氯化鎂、氯化錦、氯化鎳、及彼 等之混合物。於不同之較佳體系中，用於製備該沖洗緩衝 液之適當二價陽離子鹽包括但不限於二價第II族（例如 鎂、鈣、鋇等）陽離子、二價過渡金屬（例如銅、鎳、錳 等）陽離子及彼等之混合物的硫代氰酸根（SCN·)鹽、過 氯酸根（C104_ )鹽、硝酸根（ΝΟΓ )鹽、氯化物及溴化 物鹽、及該等鹽之組合物。 於不同之較佳體系中，該含有二價陽離子鹽之緩衝液 之pH係介於約4至約9之間，且於某些較佳體系中係介 於約4至約8之間、介於約4.5至約7.5之間或介於約6 至約8之間。本文所述之範圍內所包括的値和範圍及/或 該範圍之中間値亦涵蓋於本發明之範圍內。例如，該二價 -9 (7) 200840821 φ 陽離子鹽之ΡΗ値係介於約7.1至約7·9之摩 至約7.9之間、介於約7·3至約7.7之間、 至約7.6之間。 再者，本文所述之具有上限或下限値的 本發明之範圍內。例如，該二價陽離子鹽之 約（或約）4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5 或 於不同之較佳體系中，該緩衝液中二價 φ 度係介於約0.1Μ至約5Μ之間，且於某些 介於約0.5Μ至約3Μ之間、介於約1.0Μ至 或介於約0.6Μ至約2.5Μ之間。例如，該 衝液可包含至少約〇.6M CaCl2或至少約2Μ 約2M CaCl2。本文所述之範圍內所包括的1 該範圍之中間値亦涵蓋於本發明之範圍內。 液中二價陽離子鹽之濃度係介於約0.5M至: 、介於約0.5M至約0.8M之間、介於約0. Φ 之間、介於約〇 · 5 Μ至約1 · 0 Μ之間、介於 2Μ之間、介於約1.5 Μ至約2.0Μ之間、价 約2·5Μ之間、介於約1 ·5Μ至約3.0Μ之 2.5Μ至約3.0Μ之間。 再者，本文所述之具有上限或下限値的 本發明之範圍內。例如，該緩衝液中二價陽 係至少約（或約）〇 · 6 Μ、1 Μ、1 . 5 Μ、2 Μ、 於不同之較佳體系中’該含有二價陽離子鹽 度係介於約2°C至約24°C之間。 3、介於約7.2 或介於約7.4 範圍係涵蓋於 pH値係至少 8 〇 陽離子鹽之濃 較佳體系中係 約3 Μ之間、 二價陽離子緩 MgCl2或至少 暄和範圍及/或 例如，該緩衝 約0.7 5 Μ之間 5Μ至約 0.9Μ 約0.5 Μ至約 、於約1 . 5 Μ至 間、或介於約 範圍係涵蓋於 離子鹽之濃度 2.5Μ 或 3Μ。 .之緩衝液的溫 10- 200840821 (8) 於不同之較佳體系中，自該Fc結合劑回收該抗體之 步驟包含利用流洗緩衝液流洗該抗體，該流洗緩衝液之 pH係介於約2.0至約6.5之間，適宜地係介於約2.0至約 4·〇之間，較適宜地係介於約2.5至約3.5之間。本文所 述之範圍內所包括的値和範圍及/或該範圍之中間値亦涵 蓋於本發明之範圍內。例如，該流洗緩衝液之pH係介於 約2至約3之間或介於約3至約4之間。 φ 再者，本文所述之具有上限或下限値的範圍係涵蓋於 本發明之範圍內。例如，該流洗緩衝液之pH係至少約（ 或約）2、2.5、3、3.5 或 4。 於不同之較佳體系中，在該Fc結合劑層析步驟之前 或之後，可令回收之蛋白質經額外之純化步驟。例如，例 示之其他純化步驟包括但不限於陰離子交換層析、陽離子 交換層析、固定化金屬親和性層析、疏水性交互作用層析 (HIC )、羥磷灰石層析、透析、親和性層析、硫酸銨沉 φ 澱、乙醇沉澱、逆相HPLC ( RP-HPLC )、層析聚焦、超 過濾、透析過濾、微過濾、及凝膠過濾。於不同之較佳體 系中，在該Fc結合劑層析步驟之後係陰離子交換層析和 HIC步驟。於不同之較佳體系中，該等層析步驟之後係病 毒過濾步驟、超過濾/透析過濾步驟、及/或微生物污染物 過濾步驟。 於一方面，本發明提供自含有雜質之Αβ結合蛋白質 (適宜的是抗Αβ抗體）溶液純化該Αβ結合蛋白質（適 宜的是抗Αβ抗體）之方法。於不同之較佳體系中，該方 -11 - 200840821 ⑼ 法包含首先吸附該蛋白質至Fc結合劑上，隨後利用含有 二價陽離子鹽之緩衝液沖洗該Fc結合劑以除去一或多種 雜質，及自該Fc結合劑回收該蛋白質以生成第一個流洗 液庫。 於不同之較佳體系中，該純化方法繼續令該第一個流 洗液庫經離子交換層析，其係藉由令離子交換樹脂與該第 一個流洗液庫接觸，使得標的蛋白質不會吸附至該樹脂上 φ 並回收通過之標的蛋白質以生成第二個流洗液庫。於不同 之較佳體系中，該離子交換層析步驟進一步包含利用緩衝 沖洗液沖洗該離子交換樹脂以回收至少一部分之任何被吸 附之標的蛋白質。 於不同之較佳體系中，該純化方法繼續令該第二個流 洗液庫經疏水性交互作用層析，其係藉由吸附標的蛋白質 至疏水性交互作用樹脂（例如經疏水性配體功能化之固相 )上、利用緩衝沖洗液沖洗該疏水性交互作用樹脂（其中 • 該緩衝沖洗液之離子強度實質上係不會流洗該標的蛋白質 )、及回收經純化之標的蛋白質（典型上所使用之流洗緩 衝液的離子強度低而足以自該疏水性交互作用樹脂解吸附 標的蛋白質）。 於本發明之不同方面的較佳體系中，該Fc結合劑係 固定於固相上，該固相與來源液體接觸前係適宜地經適當 之緩衝液平衡。該固相適宜地係管柱，該管柱包含固定該 Fc結合劑之瓊脂糖。於不同之較佳體系中，該管柱係經 試劑（諸如甘油）塗覆以減少或預防對該管柱之非專一性 -12- (10) 200840821 Λ- 黏附。 於不同之較佳體系中，藉由本發明之方法所純化的蛋 白質可經藥學上可接受之載體調製並可用於不同之診斷、 治療或該分子所習知的其他用途。 於不同方面，本發明提供自溶液純化Αβ結合蛋白質 (適宜的是抗Αβ抗體）之方法，該溶液含有該蛋白質及 其內含子通讀變異體（IRT)。於特定方面，本發明之方 • 法係用於減少蛋白質製劑（例如抗體製劑）中一或多種內 含子通讀變異體之量。於不同之較佳體系中，自該Fc結 合劑所回收之蛋白質中內含子通讀變異體之量係比來源液 體中內含子通讀變異體之量至少低5倍，且於某些較佳體 系中係比來源液體中內含子通讀變異體之量至少低10倍 。於不同之較佳體系中，在含有自該Fc結合劑所回收之 蛋白質的溶液中，該內含子通讀變異體之量係低於該蛋白 質之約 1.0 %、0 · 8 %、0.5 %、0 · 2 % 或 0 · 1 %。 • 於不同方面，本發明提供自溶液純化Αβ結合蛋白質 (適宜的是抗Αβ抗體）之方法，該溶液含有該蛋白質及 其低分子量變異體（LMW )。於特定方面，本發明之方 法係用於減少蛋白質製劑（諸如抗體製劑）中一或多種低 分子量變異體之量。於不同之較佳體系中，自該Fc結合 劑所回收之蛋白質中低分子量變異體之量係比來源液體中 低分子量變異體之量至少低5倍，且於某些較佳體系中係 比來源液體中低分子量變異體之量至少低1 0倍。於不同 之較佳體系中，在含有自該Fc結合劑所回收之蛋白質的 13- 200840821 (11) 溶液中，該低分子量變異體之量係低於該蛋白質之約 1 · 0 %、0 · 8 %、0 · 5 %、〇 · 2 % 或 0 · 1 %。 於不同方面，本發明提供自溶液純化Αβ結合蛋白質 (適宜的是抗Αβ抗體）之方法，該溶液含有該蛋白質及 其二硫鍵結變異體（UDB )。於特定方面，本發明之方法 係用於減少蛋白質製劑（諸如抗體製劑）中一或多種二硫 鍵結變異體之量。於不同之較佳體系中，自該Fc結合劑 所回收之蛋白質中二硫鍵結變異體之量係比來源液體中二 硫鍵結變異體之量至少低5倍，且於某些較佳體系中係比 來源液體中二硫鍵結變異體之量至少低1 〇倍。於不同之 較佳體系中，在含有自該Fc結合劑所回收之蛋白質的溶 液中，該二硫鍵結變異體之量係低於該蛋白質之約20%、 15%、10%、5 %、2 % 或 1 %。 於另一方面，本發明提供經任一方法純化之Αβ結合 蛋白質（適宜的是抗Αβ抗體），該方法包含至少下述之 步驟：首先吸附該蛋白質至Fc結合劑上、利用含有二價 陽離子鹽之緩衝液沖洗該Fc結合劑以除去一或多種雜質 、及隨後自該Fc結合劑回收該蛋白質。於不同之較佳體 系中，該抗Αβ抗體係選自3D6、10D5、12Β4、12Α11、 15C11或266之人化抗Αβ抗體。於不同之較佳體系中， 該抗Αβ抗體係選自3D6、10D5、12Β4或12Α11之人化 抗Αβ抗體。 於另一方面，本發明提供適於實施任一上述方法之系 統，該方法包含至少下述之步驟：首先吸附該含有Fc區 14- 200840821 (12) 域之Αβ結合蛋白質（適宜的是抗Αβ抗體）至結合劑 上、利用含有二價陽離子鹽之緩衝液沖洗該Fc結合劑以 除去一或多種雜質、及隨後自該Fe結合劑回收該蛋白質 〇 於另一方面，本發明提供實施任一上述方法之純化順 序，該方法包含至少下述之步驟：首先吸附該Αβ結合蛋 白質（適宜的是抗Αβ抗體）至Fc結合劑上、利用含有 • 二價陽離子鹽之緩衝液沖洗該F c結合劑以除去一或多種 雜質、及隨後自該Fc結合劑回收該蛋白質。 於不同方面，本發明亦關於實施本發明之一或多種方 法之組套。於不同之較佳體系中，該組套包含至少一種試 劑及使用指示說明。例如，組套可包含一或多種試劑（諸· 如Fc結合劑、二價陽離子鹽及製備含有二價陽離子鹽之 緩衝沖洗液的試劑）及使用指示說明以純化例如Αβ結合 蛋白質（例如抗Αβ抗體）。 發明詳述 在進一步描述本發明之前，說明本文所使用之某些術 語的定義對瞭解本發明係有幫助的。本文所說明之定義係 經分類以易於參閱而非作爲限制。 蛋白質相關定義 本發明關於純化Α β結合蛋白質（特別是a β結合抗 體）之方法。特別地，本發明關於純化經細胞培養所產製 -15- 200840821 (13) 之含有恆定區之蛋白質（特別地含有Fc區域之蛋白質（ 例如抗體））。於不同方面，本發明提供自溶液純化含有 Fc區域之Αβ結合蛋白質（諸如抗Αβ抗體）之方法，該 溶液含有該蛋白質及其一或多種通讀變異體（諸如例如內 含子通讀變異體）。於特定方面，本發明之方法係用於減 少蛋白質製劑（例如抗體製劑）中一或多種內含子通讀變 異體（IRT )之量。“內含子通讀變異體”和“內含子通讀變 φ 異體物”於本文中係交互使用且係指方法之產物，其中對 合成所欲之Αβ結合蛋白質，在轉錄編碼區之前藉由該編 碼區之前的內含子中之終止密碼子中止多肽鏈延長。其結 果係產生含有一或多個不完整結構區或失去結構區之所欲 蛋白質的變異體（即內含子通讀變異體）。該內含子可含 有一個以上之終止密碼子而造成可能生成數種不同之內含 子通讀變異體。 “二硫鍵結變異體”或“UDB”係指任一變異體（物）， # 其中失去至少一個二硫鍵。該失去之二硫鍵可爲鏈間二硫 鍵或鏈內二硫鍵或該二者之組合。 “低分子量變異體”或“LMW”係指Αβ結合蛋白質（例 如抗Αβ抗體）之變異體，該Αβ結合蛋白質所包括之蛋 白質係由游離重鏈、游離輕鏈、IRT、半分子或3/4分子 、或彼等之混合物所組成。 蛋白質 Α係發現於大多數金黃色葡萄球菌（ Staphylococcus aureas )菌株中的，約 42 kD 之細胞壁蛋白質 ，其可與抗體之Fc區域高親和性地結合（對人IgG約1〇_8 -16· 200840821 (14) 鲁 Μ)。本文所使用之”蛋白質A”包含自天然來源所回收之 蛋白質A、合成方法（例如藉由重組技術之肽合成法等） 所產製之蛋白質A、及彼等之保留可結合含有CH2/CH3 區之蛋白質的能力之變異體。 蛋白質G係G鏈球菌群之細胞壁蛋白質。蛋白質G 係第III型Fc受體，其係高親和性地與抗體（特別是IgG 抗體）之Fc區域結合。本文所使用之”蛋白質G"包含自 φ 天然來源所回收之蛋白質G、合成方法（例如藉由重組技 術之肽合成法等）所產製之蛋白質G、及彼等之保留可結 合含有Fc區之蛋白質的能力之變異體。 “β-澱粉樣蛋白質”、“β-澱粉樣肽”、“β-澱粉樣”、 “Αβ”及“Αβ肽”於本文中係交互使用。 本文所使用之“Αβ結合蛋白質”欲指能夠與Αβ肽或該 Αβ肽中之抗原決定部位專一性結合或對Αβ具有少許結合 親和性之蛋白質。於例示之較佳體系中，該Αβ結合蛋白 貝3有F c Ε域’使侍該Α β結合蛋白質依據本發明之方法 可與Fc結合劑結合。 “抗體”或“免疫球蛋白”（於本文中可交互使用）係指 抗原結合蛋白質，其具有基本四多肽鏈結構，該四多肽鏈 結構係由二個重鏈和二個輕鏈所構成，且該等鏈係藉由例 如鏈間二硫鍵而安定，該抗原結合蛋白質具有與抗原專一 性結合之能力。該重鏈和輕鏈係經折疊而形成結構區。‘‘ 抗體”或“免疫球蛋白”包括單株抗體（其包括全長單株抗 體）、多株抗遒、多特異性抗體（例如雙特異性抗體）、 -17- (15) 200840821 m 嵌合抗體、CDR嫁接抗體、人化抗體、人抗體及單鏈抗 體（scFvs)。本文所使用之“單株抗體”或“單株抗體組成 物”係指僅含有一個抗原結合部位之抗體分子群，該抗原 結合部位能夠辨識標的抗原之特定抗原決定部位（例如 Αβ之抗原決定部位）並與其結合。因此，單株抗體組成 物典型上對與其行免疫反應之特定標的抗原顯現單一結合 專一性和親和性。藉由例如美國專利號5,22 5,5 3 9所描述 φ 之方法，可將非人抗體人化。於一方法中，將非人CDR 插入至人抗體或共有性抗體構架序列中。隨後可將進一步 之改變導入至該抗體構架中以調節親和性或免疫原性。 “抗 Αβ抗體”欲指對人澱粉樣前體蛋白質（ΑΡΡ)之 Αβ肽具有結合專一性之抗體。Αβ肽於此技藝中亦稱爲β澱 粉樣肽。Αβ肽係ΑΡΡ之39至43個胺基酸的約4 kD內部 片段（即分別爲 Αβ39、Αβ4〇、Αβ41、Αβ42 及 Αβ43)。“抗 Αβ抗體”欲包含對任一該等Αβ肽型式具有結合專一性之抗 φ 體。特定之所欲抗 Αβ抗體包括但不限於3D6、10D5、 12Β4、12Α11、1 5 C 1 1及2 6 6，以及彼等之人化抗體。抗 Αβ抗體之實例係描述於西元2001年12月6日申請之美 國專利申請案號 1 0/01 0,942 (美國專利公開案號 200301654 9 6Α1 ;亦參閱 PCT 公開案號 WO 20 0 2/4 6 237Α2 )、西元2003年3月12日申請之美國專利申請案號 10/388,389 (美國專利公開案號20040087777Α1 ;亦參閱 PCT 公開案號 WO 2004/08041 9Α2)、西元 2003 年 3 月 12日申請之美國專利申請案號1 0/3 8 8,2 1 4 (美國專利公 -18- 200840821 (16) 開案號 20040082762A1 ;亦參閱 PCT公開案號 WO 2003/077858A2)、西元2004年6月1日申請之美國專利 申請案號1〇/8 5 8,8 5 5 (美國專利公開案號200501 1 865 1 A1 ;亦參閱PCT公開案號WO 2004/ 1 08 895A2)——及西元 2 00 5年12月15日申請之美國專利申請案號u/3 04 986( 亦參閱西元2005年12月15日申請之PCT/US05/45515) 中，該等專利前案之全部內容係倂入本申請案中作爲參考

另外之抗Αβ抗體之實例係描述於西元200 1年2月 26日申請之美國專利申請案號1〇/226,43 5 (美國專利公 開案號 2004 0043418Α1 ;亦參閱 PCT公開案號 WO 0 1 /0628 0 1 Α2)、西元2002年8月14日申請之美國專利 申請案號1〇/487,322 (美國專利公開案號200401 92898Α1 ;亦參閱PCT公開案號WO 03/01 6466Α2)、西元2002 年4月26日申請之美國專利申請案號1〇/4 76,265 (美國 專利公開案號20050090648 A1 ;亦參閱PCT公開案號WO 02/08 8 3 06 A2 )、西元2002年4月26日申請之美國專利 申請案號1 〇/497,475 (美國專利公開案號20050 1 42 1 3 1A1 ;亦參閱PCT公開案號WO 02/08 8 3 07A2)、及西元2003 年2月20日申請之美國專利申請案號1〇/5〇5,313(美國 專利公開案號 2〇〇5〇1 69925 ;亦參閱 PCT公開案號 WO 03/070760A2 )中。 “抗體片段”係指包含數個胺基酸殘基之抗體或抗體鏈 的一部或部分，而非完整或完全之抗體或抗體鏈。完整或 -19- 200840821 * (17) 完全之抗體或抗體鏈經化學處理或酶催化處理可得到片段 。藉由重組方法亦可得到片段。片段實例包括Fab、Fab’ 、F ( ab’）2、Fabc及/或Fv片段。構築Fab片段之方法 係描述於例如文獻 Huse，et al. ( 1 9 8 9) Science 246: 1 275-1281中。可藉由此技藝習知之技術而製造之其他抗體片 段包括但不限於：（i)藉由胃蛋白酶酶切抗體分子所產 生之F(ab’）2片段；（ii)藉由還原F(ab’）2片段之二硫橋 φ 所產生之Fab片段；（iii )藉由使用木瓜蛋白酶和還原劑 處理抗體分子所產生之Fab’片段；及（iv) Fv片刻。“抗 原結合片段”係指免疫球蛋白或抗體之多肽片段，其能與 抗原結合或與該其來源之完整抗體競爭專一性抗原結合。 “結構區”係指包含肽環（例如包含3至4個肽環）的 重鏈或輕鏈多肽之球狀區，該肽環係藉由例如β -折疊及/ 或鏈內二硫鍵而安定。結構區進一步係指“恆定結構區”或 “可變結構區，，，其係基於在恆定結構區之不同類型構件的 φ 結構區中相對上缺少序列變化，或基於在可變結構區之不 同類型構件的結構區中具有顯著之序列變化。輕鏈上之恆 定結構區可交替地稱爲“輕鏈恆定區”、“輕鏈恆定結構區” 、“CL”區或“CL”結構區。重鏈上之恆定結構區可交替地 稱爲“重鏈恆定區，，、“重鏈恆定結構區”、“CH”區或“CH” 結構區。輕鏈上之可變結構區可交替地稱爲“輕鏈可變區” 、“輕鏈可變結構區”、“VL”區或“VL”結構區。重鏈上之 可變結構區可交替地稱爲“重鏈可變區”、“重鏈可變結構 區”、“VH”區或“VH”結構區。 -20 - 200840821 (18) “區/區域”亦可指抗體鏈或抗體鏈結構區之一部或部 分（例如本文中定義之重鏈或輕鏈之一部或部分或恆定結 構區或可變結構區之一部或部分）以及該等鏈或結構區中 更爲分開之多部或多部分。例如，重鏈和輕鏈或重鏈和輕 鏈之可變結構區包括本文中定義之散佈於多個構架區或 “FR”中之多個“互補性決定區，，或“cdr”。 “構型”係指蛋白質或多肽（諸如例如抗體、抗體鏈、 結構區或彼等之區域）之三級結構。例如，“輕鏈（或重 鏈）構型”係指輕鏈（或重鏈）可變區之三級結構，且“抗 體構型”或“抗體片段構型，，係指抗體或其片段之三級結構 〇 抗體之“專一性結合”意謂抗體對特定之抗原或抗原決 定部位顯現可評價之親和性且通常不會顯現顯著之交叉反 應。於例示之較佳體系中，抗體不會顯現交叉反應（例如 不會與非Αβ肽或與Αβ上疏遠或遠距離之抗原決定部位 交叉反應）。“可評價之”或適當之結合包括親和性至少爲 10_6、10_7、1(Γ8、10_9Μ 或 10·1()Μ 之結合。親和性大於 10〃 Μ (適宜地大於1(Γ8Μ )係較爲適宜的。上述數値間之 中間値亦欲包含於本發明之範圍內，且較佳之結合親和性 可爲例如1(Γ6至1〇_1ί)Μ (適宜地10·7至1(T1gM、較適宜 地1(Γ8至1(Γ1()Μ)之範圍內之親和性。“不會顯現顯著之 交叉反應”之抗體係指不會可評價地與不欲之部分（例如 不欲之蛋白質、多肽或肽）結合之抗體。例如，與Αβ專 一性結合之抗體將會可評價地與Αβ結合但將不會顯著地 21 - 200840821 (19) 與非Αβ蛋白質或肽（例如斑所包括之非Αβ蛋白質或肽） 反應°對特定抗原決定部位具有專一性之抗體將例如不會 顯著地與相同蛋白質或肽上之疏遠或不同的抗原決定部位 行交叉反應。依據用於測定專一性結合之任一此技藝所認 疋之方式可測定專一性結合。適宜地，依據Scatchard分 析及/或競爭性結合分析測定專一性結合。 不同於“雙特異性，，或“雙功能性，，免疫球蛋白或抗體， φ 免疫球蛋白或抗體被瞭解是皆具有相同之結合部位。“雙 特異性”或“雙功能性”抗體係人造之雜合抗體，其具有兩 個不同之重鏈/輕鏈對和兩個不同之結合部位。藉由不同 之方法（其包括融合瘤融合或連接Fab，片段）可製造雙特 異性抗體。參閱例如文獻Songsivilai & Lachmann，C7in. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1 990)和 Kostelny N a/·，J. Immunol. 148，1 5 4 7- 1 5 53 ( 1 992)。 “抗原”係含有抗原決定簇之分子（例如蛋白質、多肽 φ 、肽、碳水化合物或小分子），且抗體係與抗原決定簇專 一性結合。 “抗原決定部位”或“抗原決定簇”係指抗原上與免疫球 蛋白或抗體（或其抗原結合片段）專一性結合之部位。藉 由蛋白質之三級折疊所並列之連續胺基酸或非連續胺基酸 可形成抗原決定部位。自連續胺基酸所形成之抗原決定部 位典型上係維持曝露於變性溶劑中，而自三級折疊所形成 之抗原決定部位典型上經變性溶劑處理後將會喪失。抗原 決定部位典型上包括唯一空間構型中至少3、4、5、6、7 -22- (20) 200840821 im ♦ 、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸。決定抗原 決定部位的空間構型之方法包括例如X射線晶體繞射法 和二度空間核磁共振。參閱例如文獻 “ i g

Protocols in Methods in Molecular Biology y V 〇 1. 6 6 , G . E . Morris, Ed. (1 996)0 除了上述之抗Αβ抗體之外，其他之Αβ結合蛋白質包 括抗體融合蛋白質。“抗體融合蛋白質”和“融合抗體”係指 φ 融合蛋白質，其包括與至少一種非抗體蛋白質部分或多肽 融合之完整抗體或其部分。通常係藉由基因工程編碼該蛋 白質之基因而完成融合。額外之抗體融合蛋白質的實例包 括與另一可溶性或細胞性生物蛋白質之全部或部分（例如 細胞性或可溶性受體或其部分、細胞因子或其部分、酶或 其部分等）融合的抗體（包括Fc區域）之細胞受體結合 部分。特別的是本發明之可包含抗體的Fc區域之抗體融 合蛋白質，該抗體係與能夠與Αβ結合之非抗體蛋白質部 _ 分或多肽融合。 “Fc結合劑”係指能與抗體（例如IgG抗體）之Fc區 域結合的分子，其包括但不限於對抗體之Fc區域具有高 親和性之補體蛋白質、Fc受體或衍生自細菌之蛋白質（ 諸如蛋白質A或蛋白質G)。 “Fc區域”係指IgG抗體之C端區，特別是該IgG抗 體之重鏈C端區。雖然igG重鏈之Fc區域的界限可些微 地改變’但是FC區域典型上係定義爲lgG重鏈自約胺基 酸殘基Cys226至羧基終端之區域。 -23- 200840821 • (21) 層析相關定義 本文所使用之”來源液體”係指含有至少一種標的物之 液體’該標的物係欲與亦存在於該液體中之其他物質分離 而被純化。來源液體可爲例如水溶液、有機溶劑系統、或 水溶性/有機溶劑混合物或溶液。來源液體通常係含有許 多生物性分子（諸如蛋白質、抗體、激素及病毒）、小分 子（諸如鹽、糖、脂質等）及甚至顆粒物之複合混合物或 溶液。生物來源之典型來源液體起始時可爲水溶液或懸浮 液，該來源液體亦可含有早期分離步驟（諸如溶劑沉澱、 萃取及類似步驟）所使用之有機溶劑。含有可藉由本發明 之不同較佳體系所純化的有價値之生物物質的來源液體之 實例包括但不限於生物反應器之培養上清液、均質化細胞 懸浮液、血漿、血漿分級液及乳。 ”標的物”或“標的蛋白質”或”標的抗體”係指自該來源 液體而被純化之一或多種所欲的Α β結合蛋白質（例如抗 Αβ抗體）。該標的物可存在於懸浮液或溶液之來源液體 中〇 “雜質”係指該來源液體中之物質，該物質係與標的物 不同且係欲排除於最終標的產物之外。典型之雜質包括核 酸、蛋白質（包括內含子通讀物、低分子量物及二硫鍵結 物）、肽、內毒素、病毒及小分子。 “副產物”包括不欲之產物，其降低或減少本發明之治 療性蛋白質之比例。 -24 - 200840821 (22) 秦 “高分子量變異體”係指蛋白質複合物，其分子量係大 於本發明之所欲蛋白質的分子量。對抗體（例如IgG抗體 )而言，該聚集體大於約150 kD。 “低分子量變異體”係指蛋白質（例如降解產物），其 分子量係低於本發明之所欲蛋白質的分子量。對抗體（例 如IgG抗體）而言，該降解產物低於約15〇kD。 本文所使用之”固相”係指非水溶性載體，該載體於標 φ 的物純化期間係與標的物交互作用或F c結合劑可附著至 該載體上。適當之固相材料包括但不限於玻璃、二氧化矽 (例如矽膠）、多糖類（例如多糖載體；諸如瓊脂糖和纖 維素）、有機聚合物（諸如聚丙烯醯胺）、甲基丙烯酸甲 酯、及聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物（諸如例如 Amberlite™ 樹月旨（可購自 Rohm & Haas Chemical Co ·， Philadelphia，Pa·)。該固相可選自任何一般所描述之樹 脂，如親和性樹脂、離子交換樹脂及離子補獲樹脂。該固 φ 相可爲例如純化管柱、個別顆粒之不連續相、或彼等之組 合。該固相可具有多孔性或不具有多孔性且可經壓縮或不 可經壓縮。於不同之較佳體系中，該固相係聚合載體或瓊 脂糖顆粒或珠。於不同之較佳體系中，該固相可經試劑（ 諸如甘油）塗覆以例如防止雜質非專一性附著至該固相上 。Fe結合固相僅需具有將允許Fc結合劑附著該固相表面 之化學結構或組合配體。適宜之固相材料於物理上和化學 上能適應純化方法所使用之條件，其包括泵送和錯流過濾 、及溫度、pH以及所使用液體之其他方面。 25- 200840821 (23) 參 "親和性配體”係指經由與來源液體中的成分之結合部 位的專一性交互作用能選擇性或差異性與該成分結合之部 分。於本發明中，該親和性配體（例如Fc結合劑）典型 上係固定於固相（諸如樹脂）上。可與樹脂載體結合以提 供本發明之方法中的層析樹脂之親和性配體的實例包括但 不限於蛋白質A、蛋白質G、及彼等可選擇性與蛋白質Fc 區域結合之類似物。使親和性配體與固體載體材料結合之 φ 方法係爲純化技藝所習知。參閱例如文獻 Affinity Separations: A Practical Approach (Practical Approach Series)， Paul Mat ej ts chuk (Editor)， Irl Pr: 1 997 和

Affinity Chromatography, Herbert Schott，Marcel Dekker， New York: 1997。 ”親和性層析樹脂”或”親和性樹脂”係指層析樹脂，其 包含具有與表面結合的親和性配體之固相或作用物。 ’’離子交換層析樹脂”或”離子交換樹脂”係指固體載體 φ 且帶有正電荷或負電荷之配體係與該固體載體共價結合， 因此當該離子交換樹脂與溶液接觸時，該固體載體含有自 由反荷離子（counterions )以與該溶液中之離子交換。 ”陽離子交換樹脂”係指具有共價結合的負電荷配體之 離子交換樹脂，其含有自由陽離子以供交換與該樹脂接觸 的溶液中之陽離子。各種不同之陽離子交換樹脂係爲此技 藝所習知，例如其中共價結合之基團係羧酸鹽或磺酸鹽者 。可購得之陽離子交換樹脂包括 CMC纖維素、SP-Sephadex™ 及 Fast S-Sepharose™ (後兩者係購自 26- 200840821 (24)

Pharmacia ) 〇 ”陰離子交換樹脂”係指具有共價結合的正電荷基團之 離子交換樹脂，該正電荷基團係諸如四價胺基。可購得之 陰離子交換樹脂包括 DEAE纖維素、TMAE、QAE Sephadex™ 及 Fast Q Sepharose™ (後兩者係購自 Pharmacia ) 〇 本文所使用之’’促溶鹽”係指包含一或多種離子成分之 φ 鹽，該離子成分於能夠穿透蛋白質水合殼並直接與其表面 結合之離子促變順序中係低。促溶鹽使共水合結合破裂並 促使蛋白質溶解。促溶鹽之實例包括但不限於第II族元 素之鹵化物鹽（例如氯化鈣、氯化鎂、氯化鋇、溴化鈣、 溴化鎂、溴化鋇、碘化鈣、碘化鎂及碘化鋇）。 適當二價陽離子鹽之實例包括但不限於Mn2+、Ni2+、 Cu2+、Mg2+、Ca2 +及Ba2 +與硫代氰酸根（SCN·)、過氯酸 根（C10V )、硝酸根（ΝΟΓ )、氯離子（Cl_ )及溴離子 (Br_)之鹽、及彼等之組合。 於某些較佳體系中，該二價陽離子鹽包含二價陽離子 (例如Mg2+、Ca2+、Ni2 +或Ba2+)。用於本發明之方法中 的適宜之促溶鹽係MgCl2、NiCl2及CaCl2。於該二價陽離 子鹽沖洗步驟後，自親和性層析載體流洗標的蛋白質。 “緩衝液”係存在於溶液中可增加酸量或鹼量之物質， 且必須藉由加入該酸或鹼以造成PH之單位改變。緩衝液 藉由其酸鹼共軛成分之作用抵抗PH之改變。與生物性試 劑倂用之緩衝液通常係能夠維持一定之氫離子濃度，使得 -27- 200840821 (25)

該溶液之pH係於生理範圍內。“生理pH”係指哺 液之pH (即7.38或約7.4 )。因此，生理pH範 7.2至7.6。傳統緩衝液成分包括但不限於有機 類、酸及鹼。用於純化生物性分子（例如蛋白質 緩衝液的實例包括兩性離子緩衝液或“Good”緩衝 例J 如 Good e t a l. ( 1 9 6 6) Biochemistry 5:467 fP

Izawa ( 1 972) Methods EnzymoL 2 4:62 ) 〇 緩衝液 _ 括但不限於 TES、MES、PIPES、HEPES、MOPS 、TRICINE 及 BICINE。

”平衡緩衝液”係用於製備Fc結合劑、固相 以負載含有標的蛋白質之來源液體的緩衝液。平 適宜係具等滲性且一般具有之pH係介於約6至 。”負載緩衝液”係用於負載含有該Αβ結合蛋白 抗Αβ抗體）和雜質的來源液體至固相上之緩衝 該Fc結合劑係固定於該固相上。通常該平衡緩 • 載緩衝液係相同。”流洗緩衝液"係用於自經固定 合劑流洗出該Αβ結合蛋白質。該流洗緩衝液適 低pH値，因而破壞該Fc結合劑與所欲蛋白質 互作用。該低pH流洗緩衝液之pH適宜地係介 約5之間，最適宜地係介於約3至約4之間。g 該範圍內之緩衝液實例包括甘胺酸、磷酸鹽、乙 檬酸鹽及銨緩衝液，以及彼等之組合。其中適宜 係檸檬酸鹽和乙酸鹽緩衝液，最適宜的是檸檬_ 鈉緩衝液。欲使用之其他流洗緩衝液包括高pH 乳動物血 圍係自約 和無機鹽 分子）之 液（參閱 Good and 之實例包 、MOP SO 或其二者 衡緩衝液 約8之間 質（例如 液，其中 衝液和負 之Fc結 宜地具有 之間的交 於約2至 含制pH於 酸鹽、檸 的緩衝液 :鈉或乙酸 緩衝液（ -28-

200840821 (26) 例如pH爲9或高於9者）或包 化合物或組成物（諸如Mgc〗2 ( 本文所使用之”沖洗液”或’’ 層析樹脂排除雜質之液體，其中 合。可先後使用超過一種沖洗液 之不同性質（諸如PH、傳導性 )以解離並除去非專一性與該層 質。 ”流洗液"或’’流洗緩衝液’’ 洗液沖洗後用於自該層析樹脂 液之作用係解離標的物且未使 之流洗液係爲層析技藝所習知 由親和性配體或類似物、或促 之其他物質。’’流洗條件”係指 使該標的物自該層析樹脂解離 標的物之層析樹脂與流洗液或 離。 ”清洗液”或”清洗緩衝液” 洗層析樹脂之液體。該清洗液 劑、或相對高之鹽濃度，且可 體爲較高或較低之pH。使用 脂除去污染物而使其可再使用 藝所習知。 ”儲存液”或”儲存緩衝液” 含用於流洗所欲蛋白質之 2mM))的緩衝液。 中洗緩衝液”皆係指用於自 標的物係與該層析樹脂結 (例如連續使用具有所欲 、溶劑濃度等）的沖洗液 析樹脂連接之不同類型雜 指層析樹脂經一或多種沖 :離標的物之液體。該流洗 :發生不可逆之變性。典型 .可含有較高之鹽濃度、自 ;標的物自該層析樹脂解離 已結合標的物之層析樹脂 :方法條件，諸如令已結合 [洗緩衝液接觸以產生該解 :指完成純化過程後用於沖 「含有去污劑、病毒去活化 I有比純化過程所使用之液 洗液之目的係使該層析樹 典型之清洗液係爲層析技 〖指使層析樹脂於使用之間 -29- (27) (27)200840821 .餹 懸浮的液體。儲存液除了含有緩衝離子外，亦可含有殺微 生物劑或其他之保存劑。該等儲存液係爲層析技藝所習知 〇 於不同方面，本發明之特徵在於自來源液體純化Αβ 結合蛋白質（適宜地抗Αβ抗體）之方法，該來源液體包 含該蛋白質和一或多種雜質，該方法包含步驟：吸附該蛋 白質至FC結合劑上、利用含有二價陽離子鹽之緩衝液沖 洗該Fc結合劑以除去一或多種雜質、及隨後自該Fc結合 劑回收該蛋白質。適當之F c結合劑包括但不限於蛋白質 A和蛋白質G。 本發明之特徵在於純化Αβ結合蛋白質（特別是抗Αβ 抗體）之方法。該純化方法之實例包括親和性層析步驟。 該親和性層析步驟可爲連續、不連續、或該二者之組合。 例如’該親和性層析步驟可以不連續之方式（諸如例如批 式方式）實施。親和性層析係生物選擇性吸附及隨後自固 定化配體回收標的化合物之方法。該方法可高度專一性且 有效地純化標的化合物。該方法需要使用具適當選擇性之 配體（例如Fc結合劑），該配體將與該標的化合物（例 如抗Αβ抗體）結合，通常該結合之解離常數係介於10-4 至1 〇-8之間，使得可於溫和之條件下進行回收。該配體 通常係固定在珠狀和多孔載體上，該載體可爲管柱塡充或 批式吸附基質之型式。 適宜之結合劑係蛋白質Α。蛋白質Α係與免疫球蛋白 之F c區域結合。蛋白質a係由6個區域所構成，其中之 -30- (28) 200840821 ♦ 5個區域係與IgG結合。蛋白質A係高親和性地與人IgGi 、IgG2及IgG4以及鼠IgG2a、Ig〇2b及IgG3結合。蛋白質 A係中度親和性地與人IgD、IgM、IgA及IgE以及鼠

IgG1結合。蛋白質A作爲親和性配體係固定於載體上， 使得該等區域係供自由結合。一個分子之固定化蛋白質A 可與至少二個IgG分子結合。天然和重組型式之蛋白質A 對IgG之Fc區域具有相似之專一性。重組蛋白質A可經 φ 改造以包括例如C端半胱胺酸，且可經硫酯偶合至固相載 體上而被固定化。該偶合造成蛋白質A增強之結合能力 〇 另一結合劑係蛋白質G。蛋白質G對IgG具有專一性 ，且係高親和性地與人IgGi、IgG2 ' IgG3及IgG4以及鼠 IgGi和IgG3結合。蛋白質G PLUS對人IgG4和鼠IgG2a 、IgG2b及IgG3具有中度親和性。重組蛋白質G可經改造 以除去天然蛋白質之白蛋白結合區。重組蛋白質G含有 _ 二個Fc結合區。 另一結合劑係蛋白質A/G。蛋白質A/G係經基因工程 改造之蛋白質，其係結合蛋白質A和蛋白質G之IgG結 合輪廓。蛋白質A/G係由非致病性桿菌（所分 泌之基因融合產物。蛋白質A/G含有蛋白質A之四個Fc 結合結構區和蛋白質G之二個Fc結合結構區。不像蛋白 質A，蛋白質A/G非取決於pH，但是在其他方面具有蛋 白質A和G之加成性質。 蛋白質A/G係與所有之人IgG次類結合，特別係適 •31 - 200840821 (29) 於純化多株或單株IgG抗體，該等抗體之次類尙未決定。 此外，蛋白質A/G係與IgA、IgE、IgM及（較少地）IgD 結合。蛋白質A/G亦與所有之鼠IgG次類結合，特別係 適於自IgG次類純化鼠單株抗體而未受IgA、IgM及鼠血 清白蛋白干擾（參閱例如Sikkema. (1989) Jmer. 5/ofecA. 7，42 )。鼠單株抗體之各別次類對嵌合蛋白質A/G 相對於比對蛋白質A或蛋白質G具有較強之親和性（參 • 閱例J $口 Eliasson et al. ( 1 988) J. Biol. Chem· 263， 4323- 4327 ) 〇 於本發明中，使用二價陽離子鹽溶液沖洗經固定之 Fc結合劑（例如蛋白質A )以除去雜質。特別的是，經 發現使用二價陽離子鹽沖洗步驟可除去因重組抗體表現技 術所產生之不欲雜質。 本發明之方法在親和性層析和二價陽離子鹽沖洗步驟 之後可選擇地包括純化步驟。隨後之純化步驟可包括離子 φ 交換層析步驟及/或疏水性交互作用層析（HIC )步驟。隨 後之層析步驟可爲連續、不連續（例如諸如批式程序）、 或該二者之組合。離子交換層析係基於蛋白質總電荷間之 差異以分離分子。爲能夠結合，標的蛋白質必須具有與連 接該樹脂之官能基的電荷爲相反之電荷。例如，通常具有 總正電荷之抗體將與陽離子交換樹脂結合，該陽離子交換 樹脂含有負電荷官能基。因爲此交互作用係屬離子性，結 合必須於低離子條件下發生。藉由增加離子強度以破壞該 離子交互作用或藉由改變該蛋白質之PH以達成流洗。鑒 -32- (30) 200840821 # 於離子交換層析係取決於欲被分離之蛋白質的電荷，疏水 性交互作用層析係使用某些蛋白質之疏水性質。蛋白質上 之疏水性基團係與管柱上之親水性基團結合。蛋白質含有 愈多之疏水性基團，該蛋白質愈能強烈地與該管柱結合。 該HIC步驟除去例如宿主細胞所衍生之雜質（例如DNA 和其他與產物相關之高分子量和低分子量附屬產物）。進 一步之純化步驟可包括本文所描述之病毒除去步驟及超過 爐及/或透析過灑步驟。 於不同之較佳體系中，該含有Fc區域之蛋白質係含 有Fc區域之抗體或抗體融合蛋白質，該Fc區域係與Fc 結合劑之Fc受體結合。使用含有二價陽離子鹽之緩衝液 以沖洗該Fc結合劑可大量除去雜質，諸如例如所欲蛋白 質（例如來源液體中之標的物）之通讀變異體和含有恆定 區之片段（其包括LMW和UDB )。 本發明之方法包含一或多個層析分離步驟且此外可包 φ 含一或多個過濾步驟以使來源液體中之Αβ結合蛋白質（“ 標的蛋白質”）與雜質分離。 例如，該來源液體與該Fc結合劑接觸前可經過濾、 離心或其他程序以除去顆粒性碎屑及類似物。例如，使用 重組技術可於細胞內或周質間隙產製蛋白質或使蛋白質直 接分泌至培養基中。若該蛋白質係於細胞內產製，該顆粒 性碎屑（宿主細胞或裂解片段）可藉由例如離心或超過濾 除去。若該蛋白質係分泌至培養基中’可藉由例如切線流 過濾自細胞培養基分離重組宿主細胞。 -33-

200840821 (31) 於不同之較佳體系中，含有標的蛋白質之來源液 與Fc結合劑（適宜地係固定於固相上且經適當之緩 平衡）接觸，使得該標的蛋白質吸附至該Fc結合劑 如經固定之Fc結合劑）上。該來源液體係與負載緩 中之Fc結合劑（例如經固定之Fe結合劑）接觸，該 緩衝液可與平衡緩衝液相同。當含有雜質之來源液體 該固相時，標的蛋白質係被吸附至Fc結合劑上且不 其他雜質（諸如宿主細胞蛋白質（其中該標的蛋白質 重組宿主細胞產製）或其他方法所衍生之雜質）流經 相或非專一性與該固相結合。於不同之較佳體系中 Fc結合劑係蛋白質A，且該平衡緩衝液可爲20 mM 、0.15 M NaCl、pH 7.5。其他適當之平衡緩衝液包 如生理濃度（例如濃度介於約0.5 mM至約100 mM 如10 mM、20 mM、50 mM等））和生理鹽濃度（例 0.15 mMNaCl)及 pH 5.0 至 9.0 下之 BIS、HEPES 等 該固相適宜地係供固定Fc結合劑之瓊脂糖（ Seph arose )珠或顆粒。於不同之較佳體系中，管柱 試劑（諸如甘油）塗覆以減少或防止對該管柱之非專 黏附。於不同之較佳體系中，該Fc結合劑係蛋白質 可自 Amersham Biosciences 購得之 rmp 蛋白] Sepharose™ Fast Flow ( FF )管柱係供本發明之方法 之適當蛋白質A管柱的實例。 隨後該Fc結合劑係經含有二價陽離子鹽之緩衝 液沖洗以除去與該固相或F c結合劑結合之蛋白質變 體係 衝液 (例 衝液 負載 流經 同之 係經 該固 ，該 T r i s 括例 (例 如約 〇 例如 係經 一性 A 〇 隊 A 使用 沖洗 異體 34 - 200840821 (32) 。詳言之，已經發現使用一價陽離子鹽沖洗步驟可除去大 量之不欲雜質。特別是，已經發現使用二價陽離子鹽沖洗 可除去抗Αβ抗體之內含子通讀變異體、低分子量變異體 及二硫鍵結變異體。再者，使用二價陽離子鹽沖洗亦可除 去宿主細胞蛋白質（HCP )和DNA。於不同之較佳體系中 ，沖洗液中之二價陽離子鹽含有促溶鹽。適當之促溶鹽實 例包括但不限於氯化鈣（CaCl2 )、氯化鎳（NiCl2 )及氯 φ 化鎂（MgCl2 )。雖然單一二價陽離子鹽可存在於沖洗液 中，但是於不同之較佳體系中可使用二或多種二價陽離子 鹽。 於不同之較佳體系中，除了使用該含有二價陽離子鹽 之沖洗液外，亦可使用沖洗液以除去雜質。例如，於不同 之較佳體系中，在使用含有二價陽離子鹽之沖洗液沖洗該 Fc結合劑之前、之後或之前且之後，使用20至50 mM Tris、0·75 至 2.0 M NaCl，pH 5·0 至 9.0 溶液及 /或 10 φ mM Tris，pH 7.5溶液以沖洗該Fc結合劑。 於不同之較佳體系中，適宜地係將濃度介於約0.5 Μ 至約2.5 Μ之該二價陽離子鹽加入至pH介於約5至約9 (適宜地介於約7至約8 )之pH緩衝液中。該二價陽離 子鹽之適宜濃度包括但不限於〇·6 M、2.0 Μ及2.5 M。對 此，適當之緩衝液包括但不限於濃度介於20至50 mM之 Tris或乙酸鹽緩衝液。 經沖洗步驟後，自Fc結合劑回收標的蛋白質。正常 情況下係使用適當之流洗緩衝液回收標的蛋白質。可使用 -35- 200840821 ^ (33) 例如低pH (例如介於約2至約6.5，適宜地介於約2.5至 約3.5 )之流冼緩衝液自管柱流洗出標的蛋白質。 於不同之較佳體系中，所回收之標的蛋白質可經藥學 上可接受之載體調製且可用於不同之診斷、治療或該分子 習知之其他用途。 於不同之較佳體系中，在Fc結合劑層析步驟後，經 流洗之標的蛋白質製劑可經額外之純化步驟。例如，進一 φ 步純化步驟之實例包括但不限於陰離子交換層析、陽離子 交換層析、疏水性交互作用層析（HIC )、羥磷灰石層析 、透析、親和性層析（包括固定化金屬親和性層析）、大 小互斥層析（SEC )、硫酸銨沉澱、乙醇沉澱、逆相 HPLC ( RP-HPLC )、層析聚焦、超過瀘、透析過濾及凝 膠過濾。於不同之較佳體系中，在該F c結合劑層析步驟 之後係陰離子交換層析和HIC步驟。於不同之較佳體系 中，在該等層析步驟之後係進一步之病毒過濾步驟、超過 φ 濾/透析過濾步驟及微生物污染物過濾步驟。於不同之較 佳體系中，該等額外之純化步驟可於該Fc結合劑層析步 驟之前進行。 於不同之較佳體系中，純化Αβ結合蛋白質（適宜地 抗Αβ抗體）之方法係起始自吸附標的蛋白質至已固定在 固相上之包含蛋白質Α的Fc結合劑上，使用含有二價陽 離子鹽之緩衝液沖洗該Fc結合劑以除去一或多種雜質， 隨後自該蛋白質A回收該蛋白質以產生第一個流洗液庫 -36- 200840821 (34) 於不同之較佳體系中，該純化方法繼續令該第一個流 洗'液庫經陰離子交換層析，其係藉由令陰離子交換樹脂與 該第一個流洗液庫接觸，使得雜質吸附至該樹脂上，而標 的蛋白質並未吸附至該樹脂上。因此，可經流洗回收該標 的蛋白質以產生第二個流洗液庫。於不同之較佳體系中， Μ胃離子交換層析步驟進一步包含使用緩衝沖洗液沖洗該 陰離子交換樹脂以回收至少一部分之經吸附之標的蛋白質 φ ’隨後該回收之經吸附之標的蛋白質係與該第二個流洗液 庫結合。可替代地，該第一個流洗液庫可與該陰離子交換 樹脂接觸，使得該抗體吸附而允許任何雜質通過，隨後可 選擇地沖洗並流洗所吸附之抗體。 於不同之較佳體系中，該純化方法繼續令該第二個流 洗液庫經HIC，其係藉由吸附標的蛋白質至疏水性交互作 用樹脂（例如經疏水性配體功能化之固相）上、利用緩衝 沖洗液沖洗該疏水性交互作用樹脂（其中該緩衝沖洗液之 φ 離子強度實質上係不會流洗該標的蛋白質）、及自第三個 流洗液庫回收該標的蛋白質（典型上所使用之流洗緩衝液 的離子強度低而足以自該疏水性交互作用樹脂解吸附標的 蛋白質）。可替代地，該第二個流洗液庫可與該HIC管 柱接觸，使得該標的蛋白質不會吸附並回收通過之標的蛋 白質爲第二個流洗液庫。 於不同之較佳體系中，該純化方法包括一或多個過濾 步驟以例如除去病毒、濃縮並緩衝含有標的蛋白質之溶液 、及除去微生物污染物。 -37- 200840821 (35) 於不同之較佳體系中，本發明提供自包含Αβ結合蛋 白質（適宜地抗Αβ抗體）和一或多種雜質的來源液體純 化該蛋白質之方法，其中該雜質包含一或多種IRT變異體 。於一較佳體系中，該方法提供減少該來源液體中之IRT 變異體量達約2至約20倍。適宜地，IRT變異體之量係 減少至少5倍，且較適宜地IRT變異體之量係減少至少 1 〇倍。例如，於含有約3至5 % IRT抗體變異體之來源液 φ 體（起始樣品）中（其中該％係該來源液體中物質總量的 % ) ，IRT抗體變異體可減少至約0.3至約0.5 %。於不同 之較佳體系中，IRT變異體係減少至低於1%、低於0.8% 、低於0.5%、低於0.3%、低於0.2%及/或低於0.1%。適 宜地，於純化來源液體以製備蛋白質中，IRT變異體係減 少至低於1 %、低於〇 . 8 %、低於0.5%、低於0.3%、低於 0.2 %及/或低於〇 . 1 % (其中該％係該來源液體中物質總量 的％ )。 φ 於不同之較佳體系中，本發明提供自包含Αβ結合蛋 白質（適宜地抗Αβ抗體）和一或多種雜質的來源液體純 化該蛋白質之方法，其中該雜質包含一或多種LMW變異 體。於一較佳體系中，該方法提供減少該來源液體中之 LMW變異體量達約2至約20倍。適宜地，LMW變異體 之量係減少至少5倍，且較適宜地LMW變異體之量係減 少至少1 〇倍。例如，於含有約3至5 % LMW抗體變異體 之來源液體（起始樣品）中（其中該％係該來源液體中物 質總量的％ ) ，LMW抗體變異體可減少至約 0·3至約 -38- 200840821 (36) 0.5 %。於不同之較佳體系中，LMW變異體係減少至低於 1 %、低於〇 . 8 %、低於〇 · 5 %、低於〇 · 3 %、低於〇 . 2 %及/或 低於0 · 1 %。適宜地，於純化來源液體以製備蛋白質中， LM W變異體係減少至低於1 %、低於〇 · 8 %、低於0 · 5 %、 低於0.3%、低於0.2%及/或低於〇·1% (其中該％係該來源 液體中物質總量的％)。 於不同之較佳體系中，本發明提供自包含Αβ結合 0 蛋白質（適宜地抗Αβ抗體）和一或多種雜質的來源液體 純化該蛋白質之方法，其中該雜質包含一或多種UDB變 異體。於一較佳體系中，該方法提供減少該來源液體中之 UDB變異體量達約2至約20倍。適宜地’ UDB變異體之 量係減少至少5倍，且較適宜地UDB變異體之量係減少 至少1 〇倍。 例如，於含有約20% UDB抗體變異體之來源液體（ 起始樣品）中（其中該％係該來源液體中物質總量的％ ) φ ，UDB抗體變異體可減少至約1〇%至約2%。於不同之較 佳體系中，u D Β變異體係減少至低於2 0 %、低於1 5 %、低 於10%、低於5%、低於2%及/或低於1%。適宜地’於純 化來源液體以製備蛋白質中，UDB變異體係減少至低於 2 0 %、低於1 5 %、低於1 0 %、低於5 %、低於2 %或低於1 % (其中該％係該來源液體中物質總量的％ )。 亦例如’於含有約3至5 % U D Β抗體變異體之來源液 體（起始樣品）中（其中該％係該來源液體中物質總量的 %) ，UDB抗體變異體可減少至約〇·3至約〇·5%。於不同 -39- 200840821 (37) Φ 之較佳體系中，UDB變異體係減少至低於1 %、低於0.8 % 、低於0.5%、低於0.3%、低於0.2%及/或低於0.1%。適 宜地，於純化來源液體以製備蛋白質中，UDB變異體係 減少至低於1 %、低於0 · 8 %、低於0.5 %、低於〇 · 3 %、低 於0.2%及/或低於0.1% (其中該％係該來源液體中物質總 量的％ )。 φ 用於本發明之純化方法中之Α β結合蛋白質 利用此技藝已建立之技術（其包括例如合成技術（諸 如重組技術和肽合成或該等技術之組合））可製備本發明 將被純化之Αβ結合蛋白質（例如抗Αβ抗體），或該Αβ 結合蛋白質（例如抗Αβ抗體）可自該蛋白質之內源性來 源分離。於不同之較佳體系中，該抗體可爲例如多株抗體 製備物、單株抗體、重組抗體、嵌合抗體、人化抗體或人 抗體。產製抗體之技術係進一步描述如下。於其他較佳體 φ 系中’該AP結合蛋白質可爲抗體融合蛋白質，該抗體融 合蛋白質包含與能夠與Αβ結合的蛋白質或多肽之一部分 融合之抗體Fc區域。抗體融合蛋白質之製造亦進一步描 述如下。 多株抗體 藉由使用免疫原免疫適當之個體可製備多株抗體。藉 由使用標準技術（諸如酶聯免疫吸附測定（ELIS a )且使 用固定化之標的抗原）可經時監測經免疫之個體體內之抗 -40- 200840821 (38) 體效價。如所欲地，自哺乳動物（例如自血液）可分離出 直接拮抗標的抗原之抗體分子，且該抗體分子藉由習知技 術（諸如蛋白質A Sepharose層析）可被進一步純化而得 到該抗體（例如I g G部分）。於經免疫後之適當時間，例 如當拮抗抗原之抗體效價係最高時，自該個體可得到產製 抗體之細胞且該細胞藉由標準技術（諸如 Kohler and Milstein (1975) “re 256:495-49 7 原先描述之融合瘤技 術）可用於製備單株抗體（亦參閱Brown μ (1981) J. Immunol. 127:539-46 ； Brown et al. ( 1 9 8 0) J. Biol· C hem. 2 5 5: 49 80-8 3 ； Y eh et a l. ( 1 976) Proc. Natl. A cad. Sci. USA 7 6:2927-3 1 及 Yeh et al. ( 1 982) Int. J. Cancer 29: 26 9-75)。嵌合多株抗體之製備係參閱 Buechler a/. 美國專利號6,420，1 13。 單株抗體 許多用於融合淋巴細胞和無限增殖細胞株之習知方法 可用於產製單株抗體（參閱例如G· Galfre d «/· (1 977) Nature 266: 55052 ； G efter e t a l · S o m a t i c C e 11 G e n e t ·，如 上述；Lerner，Fa/e ·/. Mei/.，如上述；及 Kenneth，

Mo no clonal 如上述）。再者，熟習此技藝之 人士當能瞭解該等方法存有許多變化且該等變化亦是有益 。典型上，無限增殖細胞株（例如骨髓瘤細胞株）係衍生 自相同之哺乳動物細胞（如淋巴細胞）。例如，藉由經本 發明之致免疫製劑免疫之鼠的淋巴細胞與無限增殖鼠細胞 -41 - 200840821 (39) -m 株融合可製備鼠融合瘤。適宜之無限增殖細胞株係鼠骨髓 瘤細胞株，該鼠骨髓瘤細胞株係對含有次黃嘌呤、胺基蝶 呤及胸苷之培養基（即HAT培養基）敏感。依據標準技 術，許多骨髓瘤細胞株可作爲融合伴，例如P3-NS 1/1-Ag4-1、P3-x63-Ag8.65 3 或 Sp2/0-Agl4 骨髓瘤細胞株。 該等骨髓瘤細胞株可自ATCC獲得。典型上，使用聚乙二 醇（PEG )使對HAT敏感之鼠骨髓瘤細胞與鼠脾臟細胞 Φ 融合。利用HAT培養基選取自該融合所產生之融合瘤細 胞，該HAT培養基殺死未融合和不具生產性之融合骨髓 瘤細胞（未融合之脾臟細胞因未經轉形而經數天後死亡） 。利用標準ELISA測定，藉由自融合瘤培養上清液篩選 可結合標的抗原之抗體，可偵測本發明之產製單株抗體的 融合瘤細胞。 重組抗體 φ 對製備分泌單株抗體之融合瘤的另一選擇是，可藉由 利用標的抗原飾运重組組合免疫球蛋白庫（例如抗體職菌 體展示庫）以分離與該標的抗原結合之免疫球蛋白庫成員 而鑑別並分離單株抗體。產生並篩選U筮菌體展示庫之組套 係爲可購得者（例如 the Pharmacia

Antibody System，Catalog N o . 2 7 - 9 4 0 0 - 0 1 the Stratagene

SurfZAP™ Phage Display Kit, Catalog No.24061 2 )。此外 ，特別適用於產生及篩選抗體展示庫之方法和試劑的實例 係描述於例如Ladner W fl/·美國專利號5,223,409; Kang 42- 200840821 (40)

W fl/· PCT 國際公開案號 w 0 92/18619 ; Dower fl/，PCT 國際公開案號WO 91/17271 ; Winter d fl/. PCT國際公開 案號 WO 92/20791 ; Markland N a/. PCT 國際公開案號 WO 92/1 5679; Breitling ei fl/· PCT 國際公開案號 WO 93/01288; McCafferty ei a/. PCT 國際公開案號 WO 92/01047; Garrard a/· PCT 國際公開案號 WO 92/09690 ;Ladner d a/. PCT 國際公開案號 WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9: 1 3 7 0- 1 372 ； Hay et al. (1 9 9 2) Hu m. Antibod. Hy bridomas 3: 81-85; Hu s e et a l. ( 1 989) Science 24 6: 1 275- 1 28 1 ； Griffiths et al, (1 993) EMBO J 1 2: 725-734 ; Hawkins et al. (1 992) J. Mol· Biol. 2 2 6: 889-896 ; Clarkson et al. (1991) N a ture 352: 624-628 ;Gram et aL (1 9 9 2) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3576-3580 ; Garrad e t a l · (19 9 1) Bio/Technology 9: 1 3 7 3 -1377 ; Hoogenboom et al, (1991) Nuc. Acid Res. 19: 4133-413 7 ; Barbas a/. (19 9 1) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7978 -7982 ;及 McCafferty et al. Nature ( 1 9 9 0) 348: 552-554 ° 嵌合和人化抗體 此外，本發明之範圍包括包含人和非人部分之重組抗 體（諸如嵌合和人化單株抗體），該重組抗體可藉由利用 標準重組DNA技術加以製備。 “人化免疫球蛋白”或“人化抗體”係指包括至少一個人 -43- 200840821 (41) 化免疫球蛋白或抗體鏈（即至少一個人化輕鏈或重鏈）之 免疫球蛋白或抗體。“人化免疫球蛋白鏈，，或“人化抗體鏈，， (即“人化免疫球蛋白輕鏈”或“人化免疫球蛋白重鏈，，）係 指含有可變區之免疫球蛋白或抗體鏈（即分別爲輕鏈或重 鏈）’該可變區包括本質上源自人免疫球蛋白或抗體之可 變構架區及本質上源自非人免疫球蛋白或抗體之互補性決 定區（CDR)(例如至少一個 CDR，適宜地二個 CDR， • 較適宜地三個CDR)，且該“人化免疫球蛋白鏈，，或“人化 抗體鏈”進一步包括恆定區（例如對輕鏈係包括至少一個 恆定區或其部分，而對重鏈係包括三個恆定區）。“人化 可變區”（例如“人化輕鏈可變區”或“人化重鏈可變區”） 係指包括本質上源自人免疫球蛋白或抗體之可變構架區及 本質上源自非人免疫球蛋白或抗體之互補性決定區（CDR )的可變區。 “本質上源自人免疫球蛋白或抗體”或“本質上人”係指 φ 當倂列人免疫球蛋白或抗體之胺基酸序列以進行比對時， 該區具有與人構架區或恆定區序列至少80至90%、90至 95%或95至99%之同一性（即局部序列同一性），其允 許例如保守性置換、共有序列置換、生殖系置換、回復突 變、及類似方式。導入保守性置換、共有序列置換、生殖 系置換、回復突變、及類似方式通常係指人化抗體或鏈之 “最佳化”。“本質上源自非人免疫球蛋白或抗體”或“本質 上非人”係指所含有之免疫球蛋白或抗體序列係至少8 0至 9 5 %、適宜地至少9 0至9 5 %、較適宜地9 6 %、9 7 %、9 8 % -44- 200840821 ^ (42) * 或99%相同於非人生物體（例如非人哺乳動物）之免疫球 蛋白或抗體序列。 於是，人化免疫球蛋白或抗體或人化免疫球蛋白或抗 體鏈之所有區或殘基’除了 CDR之外，本質上係相同於 一或多種天然人免疫球蛋白序列之對應區或殘基。當第一 個和第二個胺基酸或核苷酸序列係最適倂列以進行比對時 ，“對應區”或“對應殘基”係指第二個胺基酸或核苷酸序列 φ 上之區或殘基，其佔據與第一個胺基酸或核苷酸序列上之 區或殘基相同（即對等）的位置。 “顯著相同/同一 ”係指二個多肽序列，當藉由諸如 GAP或BESTFIT程式並使用缺少間隙權重之最適倂列時 ，具有至少5 0至6 0 %序列同一性、適宜地至少6 0至7 0 % 序列同一性、較適宜地至少7 0至8 0 %序列同一性、較適 宜地至少80至90%序列同一性、更較適宜地至少90至 95%序列同一性、及更較適宜地至少95%或高於95%序列 φ 同一性（例如9 9 %或高於9 9 %序列同一性）。“實質/本質 相同/同一 ”係指二個多肽序列，當藉由諸如GAP或 BESTFIT程式並使用缺少間隙權重之最適倂歹丨J時，具有至 少8 0至9 0 %序列同一性、適宜地至少9 0至9 5 %序列同一 性、及較適宜地至少9 5 %或高於9 5 %序列同一性（例如 99%或高於99%序列同一性）。對序列比對，典型上一個 序列作爲參考序列，測試序列與該參考序列比對。當使用 序列比對演算規則時，將測試和參考序列輸入電腦，（如 有需要）指定次序列座標，及指定序列演算程式參數。隨 -45- 200840821 (43) 後基於指定之程式參數，該序列比對演算規則計算出測試 序列相對於參考序列之序列同一性％。 可藉由例如 Smith & Waterman，ddv. Μα 2: 482 ( 1 98 1 )所描述之局部同源性演算規則、Needleman & Wunsch，J· Mo/· 48: 443 ( 1 970 )所描述之同源性倂 列演算規則、Pearson & Lipman，Proc. iVfli’/. dead. Sc ζ·.

8 5: 2444 ( 1 98 8 )所描述之相似性搜尋方法、該等演 算規則之電腦化實施方法（GAP、BESTFIT、FASTA及 TFASTA， Wisconsin Genetics 套裝軟體，Genetics

Computer Group，5 75 Science Dr.，Madison，WI)或目視 檢查法（通常參閱 Ausubel N fl/·，Current Protocols in Molecular Biology)進行序列比對之最佳倂列。適於測定 序列同一性％和序列相似性％之一個演算規則實例係 BLAST演算規則，其係描述於文獻 Altschul Μ β/.，J. Mo l. Biol· 2 1 5:403 ( 1 990 )中。自 National Center for Biotechnology Information可公開取得實施BLAST分析之 軟體（經 National Institutes of Health NCBI 之網路伺服 器公開取得）。典型上可使用缺少程式參數以實施序列比 對（雖然亦可使用慣用之參數）。對胺基酸序列，該 BLASTP程式使用3個字長（W)作爲缺少、10個字長作 爲預期（E)、及BLOSUM62分數矩陣（參閱Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1 09 1 5 (1989)) 適宜地，不一致之殘基位置係經由保守性胺基酸置換 -46- 200840821 (44) 而不同。對區分胺基酸置換爲保守性或非保守性，胺基酸 係分類如下：第I組（疏水性側鏈）：leu、met、ala、 val、leu、ile ;第II組（中性親水性側鏈）：cys、ser、 thr ;第 III組（酸性側鏈）：asp、glu ;第 IV組（鹼性 側鍵）：asn、gin、his、lys、arg;第V組（殘基影響鍵 定向）：gly、pro;及第VI組（芳香族側鏈）：trp、tyr 、phe。保守性置換涉及相同類型之胺基酸間的置換。非 φ 保守性置換係交換該等類型之一中的一員與另一類型中的 一員。 適宜地，人化免疫球蛋白或抗體與抗原結合之親和性 係3倍、4倍或5倍高於對應之非人化抗體與抗原結合之 親和性。例如，若非人化抗體之結合親和性係1 (Γ9 Μ，則 人化抗體之結合親和性係至少3 X 10·8 Μ、4 X 1(Γ8 Μ、5 X 1〇_8 Μ、或1(Γ9 Μ。當免疫球蛋白鏈賦予完整免疫球蛋 白或抗體（或其抗原結合片段）專一之結合性或結合親和 • 性時，該免疫球蛋白鏈將“直接與抗原結合”。若突變（例 如回復突變）影響（例如降低）包含重鏈或輕鏈之完整免 疫球蛋白或抗體（或其抗原結合片段）的結合親和性與包 含對等鏈但缺少該突變之抗體（或其抗原結合片段）的結 合親和性相比較達至少1個次方大小之程度，則該突變將 實質上影響該重鏈或輕鏈直接與抗原結合之能力。若突變 影響（例如降低）包含鏈之完整免疫球蛋白或抗體（或其 抗原結合片段）的結合親和性僅達包含對等鏈但缺少該突 變之抗體（或其抗原結合片段）的結合親和性之2、3或 -47- 200840821 • (45) ^ 4倍，則該突變“實質上不會影響（例如降低）該鏈直接 與抗原結合之能力”。 “嵌合免疫球蛋白”或抗體係指免疫球蛋白或抗體，其 可變區係衍生自第一物種且其恆定區係衍生自第二物種。 可藉由例如基因工程自屬於不同物種之免疫球蛋白基因片 段構築嵌合免疫球蛋白或抗體。“人化免疫球蛋白”或“人 化抗體”不欲包含下述定義之嵌合免疫球蛋白或抗體。雖 φ 然人化免疫球蛋白或抗體於構成上係經嵌合（即包含源自 超過一個蛋白質物種之區），但是該人化免疫球蛋白或抗 體包括如本文所描述之未發現於嵌合免疫球蛋白或抗體的 額外特徵（即可變區包含供給者CDR殘基和接受者構架 區殘基）。 可藉由此技藝習知之重組DNA技術以製造該嵌合和 人化單株抗體，例如使用描述於Robinson d α/.國際專 利號PCT/US86/02269 ; Akira，d fl/.歐洲專利申請案號 φ 1 84,1 87 ; Taniguchi，Μ·,歐洲專利申請案號 1 7 1,496 ;

Morrison et al.歐洲專利申請案號 173,494; N euberger W fl/. PCT 國際公開案號 WO 86/0 1533 ; Cab illy d fl/.美 國專利號4,8 1 6,567 ; Cabilly d fl/.歐洲專利申請案號 125,023; Better e t al · ( 1 9 8 8 ) Science 240: 1041-1 043 i Liu et al. ( 1 9 8 7) Proc. Natl, Acad. Sci, USA 84: 343 9-3 443 ； Liu et al. ( 1 987) J. Immunol. 1 3 9: 3521-3526 J Sun et al. (1 9 8 7) Proc· Natl. Acad. Sci. USA 84: 214-218 ; N i shimur a et al. (1 9 8 7) Cane. Res. 47: 999-1005; Wood -48- (46) 200840821 -½ et al. ( 1 985) Nature 3 1 4: 446-449 ; Shaw et al. ( 1 98 8) J· Natl· Cancer Inst· 8 0: 1553-1559 ) ; Morrison, S. L. (1985) Science 229: 1202-1207 ； Oi et aL (1986) 以 4: 214; Winter 美國專利號 5,225,539;

Jones et a l · (1 9 8 6) Nature 32 1: 552-525 ; V erho eyan et a l. ( 1 9 8 8) Science 23 9: 1534 ;及 Beidler et a l. ( 1 98 8) J. Immunol. 141: 4053-4060 之方、法。 源自轉基因動物和噬菌體展示庫之人抗體 另一方面，亦可製造轉基因動物（例如鼠），該動物 經免疫後能夠不製造內源性免疫球蛋白而製造完整類型之 人抗體。例如，已描述嵌合和生殖系突變鼠中抗體重鏈接 合區（J Η )基因之同型合子的刪除係導致完全抑制內源性 抗體之製造。轉移人生殖系免疫球蛋白基因列至該生殖系 突變鼠體內導致製造人抗體以對抗抗原攻擊。參閱例如美 φ 國專利號 6，150,584、6，114,598 及 5,770,429。 完整人抗體亦可源自菌體展示庫（Hoogenboom a l ·，J. Mol. Biol·，2 2 7: 3 8 1 (1991 ); Marks et al., J. Mol. Biol·，222: 58 1 -597 (1 991 ))。嵌合多株抗體亦可得自於 噬菌體展不庫（Buechler ei fl/.美國專利號6,420，113)。 雙特異性抗體和抗體共軛物 雙特異性抗體（BsAbs )係對至少兩種不同之抗原決 定部位具有結合專一性之抗體。該抗體可源自全長抗體或 49· (47) (47)200840821 m 抗體片段（例如F(ab)’2雙特異性抗體）。製造雙特異性 抗體之方法係此技藝所習知。傳統製造全長雙特異性抗體 之方法係基於共同表現兩個免疫球蛋白之重鏈輕鏈對，其 中該兩個鏈具有不同之專一性（Millstein ei β/.，Nature， 3 05: 5 3 7-5 3 9 ( 1 98 3 ))。因隨機分配免疫球蛋白之重鏈和 輕鏈，該等融合瘤（兩個融合瘤之融合產物）製造不同抗 體分子之可能混合物（參閱 W 0 93/08829和 Traunecker et al., EMBO J., 1 0: 3 655-3 659 ( 1 99 1 ))。 雙特異性抗體亦包括交聯或“雜共軛”抗體。例如，雜 共軛中抗體之一可與抗生物素蛋白偶合，而其中另一抗體 可與生物素或其他化合物偶合。使用任何慣用之交聯方法 可製造雜共軛抗體。適當之交聯劑係此技藝所習知且已揭 示於美國專利號 4,676,980及許多交聯技術中。 於另一較佳體系中，該抗體可藉由化學或基因方式與 諸如具反應性、可偵測、或功能性部分之化合物（例如免 疫毒素）共軛以製造抗體共軛物。該化合物包括例如免疫 毒素、化學治療劑及放射性同位素，上述物質皆爲此技藝 所習知。 抗體融合蛋白質 本發明所使用之含有Fc區域之Αβ結合蛋白質可爲 融合蛋白質’其含有至少抗體之Fc部分，該抗體係與能 夠與Αβ結合之非抗體蛋白質或多肽融合。因此，製造一 個可溶性融合蛋白質，該可溶性融合蛋白質能與Αβ結合 50- (48) 200840821 m. 且具有Fc相關之功能（諸如血清安定性、Fc受體結合性 、及類似功能）。使用標準重組DNA技術可製備抗體融 合蛋白質（於此技藝中亦稱爲Fc融合蛋白質或Ig融合蛋 白質），且該抗體融合蛋白質已描述於此技藝中（參閱例 如 Capon ei α/·美國專利號 5，1 1 6,964、5,225,5 3 8、 5,3 3 6,603 及 5,428，130 )。 抗Αβ抗體 一般而言，本發明之抗體包括藉由標的Α β肽以治療 致澱粉樣變性病（特別是阿茲海默氏疾病）之多種抗體。 “Αβ抗體”、“抗Αβ抗體”及“抗Αβ”於本文中係交互使 用且係指與人澱粉樣前體蛋白質（ΑΡΡ ) 、Αβ蛋白質或該 二者之一或多個抗原決定部位或抗原決定簇結合之抗體。 實際之抗原決定部位或抗原決定簇可位於ΑΡΡ中，但適 宜地係位於ΑΡΡ之Αβ肽中。存在ΑΡΡ之多種同型異構體 ，例如 ΑΡΡ 6 9 5、ΑΡΡ751 及 ΑΡΡ77()。依據 ΑΡΡ77()同型異構 體之序列，指定ΑΡΡ之胺基酸編號（參閱例如GenBank Accession No. P05067 )。現今已知存在於人體內之 ΑΡΡ 的特殊同型之實例係695個胺基酸之多肽（稱爲正常型 ΑΡΡ，其描述於文獻 Kang αΛ ( 1 987) iVaiwre 325: 73 3 -73 6中）、751個胺基酸之多肽（其描述於文獻Ponte N α/· ( 1 98 8) iVaiwre 3 3 1: 525-527 ( 1 988)和 Tanzi d fl/. ( 1 9 8 8) iVfliwre 3 3 1 : 52 8-53 0 中）及 770 個胺基酸之多肽（ 其描述於文獻 Kitaguchi ei. fl/. ( 1 98 8) iVaiwa 3 3 1: 53 0- -51 - 200840821 ‘ (49) ^ 532中）。於活體內或於原位（“ ha )藉由不同之分泌 酶（secretase)對APP作蛋白水解處理之結果係發現Αβ 存有長度爲40個胺基酸之“短型”和長度爲42或43個胺 基酸之“長型”。該短型Αβ4〇係由ΑΡΡ之胺基酸殘基672 至711所構成。該長型（例如Αβ42或Αβ43)分別係由 ΑΡΡ之胺基酸殘基672至713或672至714所構成。ΑΡΡ 之部分疏水性結構區係位於Αβ之羧基終端且其可說明Αβ φ (特別是長型）聚集之能力。可於人體和其他哺乳動物（ 其包括正常之個體和患有致澱粉樣變性病之個體）之體液 (例如腦脊髓液）中發現Αβ肽並可自該體液純化出Αβ肽 〇 “β澱粉樣蛋白質”、“β澱粉樣肽”、“β澱粉樣”、“Αβ” 及“Αβ肽”於本文中可交互使用。Αβ肽（例如Αβ39、Αβ40 、Αβ41、Αβ42及Αβ43)係ΑΡΡ之39至43個胺基酸的 約4 kDa內部片段◦例如，Αβ40係由ΑΡΡ之胺基酸殘基 φ 672至71 1所構成，且Αβ42係由ΑΡΡ之胺基酸殘基672 至713所構成。Αβ肽包括經分泌酶切割ΑΡΡ所生成之肽 及具有與該切割產物相同或實質上相同之序列的合成肽。 Αβ肽可源自多種來源（例如組織、細胞株、或體液（例 如血清或腦脊髓液））。例如，Αβ可源自表現ΑΡΡ之細 胞，諸如經APP717V — f穩定轉染之中國倉鼠卵巢（CHO) 細胞，其描述於例如文獻 Walsh d α/. (2002) Wdwre，

416，pp 53 5-53 9中。利用上述之方法（參閱例如文獻 Johnson-Wood et aL (1 997) Proc. Natl· Acad · Sci · USA 52- 200840821 * (50) % 94: 1 550 )可自組織來源得到Αβ製備物。另一方面，利用 此技藝習知之方法可合成Αβ肽（參閱例如文獻Fields ei β/.，Synthetic Peptides: A User’s Guide，ed. Grant，W.H· Freeman & Co.，New York，NY，1992，p 77)。因此，藉 由例如Applied Biosystems肽合成儀（機型430A或431 )及固相合成之自動化Merri field技術，使用側鏈經保護 之胺基酸，可合成α胺基經t-Boc或F-moc化學保護之肽 φ 。利用習知之重組DNA技術可合成較長之肽抗原。例如 ，可合成或分子選殖出編碼該肽或融合肽之多核苷酸，並 將該多核苷酸插入至適當之表現載體中，該表現載體係用 於轉染適當之宿主細胞且該宿主細胞係進行異源表現。 Αβ肽亦指正常基因之Αβ區域的突變所產生的相關Αβ序列 〇 與Αβ抗體結合之實際抗原決定部位或抗原決定簇可 位於人澱粉樣前體蛋白質（ΑΡΡ )上，但適宜地係位於 φ ΑΡΡ之Αβ肽上。Αβ上實際之抗原決定部位或抗原決定簇 係位於Αβ之Ν端、中間區域或C端。“Ν端抗原決定部位 ”係位於Αβ肽之Ν端或包括Αβ肽之Ν端的抗原決定部位 或抗原決定簇。實際之Ν端抗原決定部位包括位於Αβ之 胺基酸1至1〇或1至12之殘基，適宜的是Αβ 42之胺基 酸1至3、1至4、1至5、1至6、1至7、2至6、2至7 、3至6或3至7之殘基。其他實際之Ν端抗原決定部位 起始於Αβ之殘基1至3且終止於Αβ之殘基7至11。額 外之實際Ν端抗原決定部位包括Αβ之殘基2至4、5、6 -53- 200840821 (51) * 、7或8、Αβ之殘基3至5、6、7、8或9、或Αβ42之殘 基4至7、8、9或1 0。“中間抗原決定部位”係包含位於 Αβ肽之中間或中間部分的殘基之抗原決定部位或抗原決 定簇。實際之中間抗原決定部位包括位於Αβ之胺基酸1 3 至28之殘基，適宜的是Αβ之胺基酸14至27、15至26 、16至25、17至24、18至23或19至22之殘基。其他 實際之中間抗原決定部位包括Αβ之胺基酸16至24、16 • 至 23、16 至 22、16 至 21、18 至 21、19 至 21、19 至 22 、19至23或19至24之殘基。“C端抗原決定部位或抗原 決定簇，，係位於Αβ肽之C端或包括Αβ肽之C端且包括Αβ 之胺基酸33至40、33至41或33至42之殘基。“C端抗 原決定部位，，係包括位於Αβ肽之C端殘基（例如Αβ之約 胺基酸30至40或30至42)之抗原決定部位或抗原決定 簇。額外之實際C端抗原決定部位或抗原決定簇包括Αβ 之殘基33至40或33至42。 φ 若抗體係與位於特定殘基（諸如Αβ之3至7 )之抗 原決定部位結合，其意謂該抗體與含有該特定殘基（於此 實例中即爲Αβ之3至7)之多肽專一性結合。該抗體無 需與Αβ之3至7中之每一個殘基接觸。Αβ之3至7中之 每一個單一胺基酸替代或刪除並不必然顯著影響結合親和 性。於不同之較佳體系中，Αβ抗體係終端專一性。本文 所使用之“終端專一性”係指與Αβ肽之Ν端或C端殘基專 一性結合但不會辨識存在於包含相同殘基之較長Αβ變異 體或ΑΡΡ中的該相同殘基之抗體。於不同之較佳體系中 -54- 200840821 (52) ，Αβ抗體係“C端專一性，，。本文所使用之“C端專一性”係 指專一性辨識Αβ肽之自由C端之抗體。具有C端專一性 之Αβ抗體的實例包括：辨識終端爲殘基40之Αβ肽但不 會辨識終端爲殘基41、42及/或43之Αβ肽的Αβ抗體、 辨識終端爲殘基42之Αβ肽但不會辨識終端爲殘基40、 41及/或43之Αβ肽的Αβ抗體等。 於一較佳體系中，該Αβ抗體可爲3D6抗體或其變異 φ 體或10D5抗體或其變異體，該兩種抗體係描述於美國專 利公開案號 20030165496Α1、美國專利公開案號 200400 8 7 777Α1、國際專利公開案號WO 02/4623 7Α3及國 際專利公開案號WO 04/Ό804 1 9Α2中。3D6和10D5抗體 之描述亦可見於例如國際專利公開案號WO 02/088306Α2 和國際專利公開案號WO 02/08 83 07 Α2。額外之3D6抗體 係描述於美國專利申請案號1 1 /3 03,478和國際專利申請 案號PCT/US05/45614中。3D6係單株抗體（mAb)，其 φ 係與位於人β澱粉樣肽之N端抗原決定部位（特別是殘 基1至5 )專一性結合。相比較下，10D5係mAb，其係 與位於人β澱粉樣肽之N端抗原決定部位（特別是殘基3 至6)專一性結合。產製3D6單株抗體（RB96 3D6.32.2.4 )之細胞株已於西元2003年4月8日依據Budapest條約 寄存於寄存機構 American Type Culture Collection ( ATCC)，Manassas，VA 20 1 08，USA 中，且其寄存號碼爲 PTA-5130。產製 10D5 單株抗體（RB44 10D5.19.21 )之 細胞株已於西元2003年4月8日依據Budapest條約寄存 -55- 200840821 (53) 於該寄存機構ATCC中，且其寄存號碼爲PT A-5129。

實際之3D6抗體變異體係具有例如包含如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5所示之可變區胺基酸序列的人化輕 鏈和包含如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示之可變區 胺基酸序列的人化重鏈。其他實際之3D6抗體變異體係 具有例如 SEQ ID NO:7所示之人化輕鏈胺基酸序列和 SEQ ID NO:8所示之人化重鏈胺基酸序列。 φ 實際之10D5抗體變異體係具有例如包含如SEQ ID NO:9或SEQ ID ΝΟ:11所示之可變區胺基酸序列的人化輕 鏈和包含如SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12所示之可變 區胺基酸序列的人化重鏈。其他實際之l〇D5抗體變異體 係具有例如SEQ ID NO: 13所示之人化輕鏈胺基酸序列和 SEQ ID NO: 14所示之人化重鏈胺基酸序列。該抗體變異 體係進一步描述於WO 02/088306A2中。 於另一較佳體系中，該抗體可爲12B 4抗體或其變異 φ 體，其係描述於美國專利公開案號20〇4〇082762Α1和國 際專利公開案號wo 03/077858A2中。12B4係mAb ’其 係與位於人β ®粉樣肽之N端抗原決定® Η立（特^是歹羞 基3至7)專一性結合。 實際之12Β4抗體變異體係具有例如包含如SEQ ID >^0:15或SEQ ID NO:17所示之可變區胺基酸序列的人化 輕鏈（或輕鏈）和包含如SEQ ID N〇:16、SEQ ID N〇:18 q ID N O : 1 9所示之可變區胺基酸序列的人化重鏈。 於另一較佳體系中，該抗體可爲12A 11抗體或其變 -56- 200840821 (54) 異體，該抗體係描述於美國專利公開案號2005 0 118 651A1 、美國專利申請案號1 1 /3 03,478、國際專利公開案號WO 04/1 08 8 95A2及國際專利申請案號PCT/US05/456 1 4中。 12A11係mAb，其係與位於人β澱粉樣肽之N端抗原決 定部位（特別是殘基3至7)專一性結合。產製12Α11單 株抗體之細胞株已於西元 2005年 12月 13日依據 Budapest條約寄存於該寄存機構ATCC中，且其寄存號碼 •爲 PTA-7271 。 實際之12A11抗體變異體係具有例如包含如SEQ ID NO:20所示之可變區胺基酸序列的人化輕鏈和包含如SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、 SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、 SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID • NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40 或 SEQ ID NO:41 所示之可變區胺基酸序列的人化重鏈。 於另一較佳體系中，該抗體可爲6C6抗體或其變異體 ，該抗體係描述於美國專利申請案號1 1 /3 05,899和國際 專利申請案號PCT/US05/45 860 (其發明名稱爲“辨識β澱 粉樣肽之人化抗體”）中。6C6係mAb，其係與位於人β 澱粉樣肽之Ν端抗原決定部位（特別是殘基3至7)專一 性結合。產製6C6抗體之細胞株已於西元2005年11月1 日依據Budapest條約寄存於該寄存機構ATCC中，且其 -57- 200840821 ^ (55) 寄存號碼爲PTA-7200。 於另一較佳體系中，該抗體可爲2H3抗體，該抗體 係描述於美國專利申請案號11/305,899和國際專利申請 案號PCT/US〇5/45860 (其發明名稱爲“辨識β澱粉樣肽之 人化抗體”）中。2Η3係mAb，其係與位於人β澱粉樣肽 之Ν端抗原決定部位（特別是殘基2至7)專一性結合。 於另一較佳體系中，該抗體可爲3Α3抗體，該抗體 • 係描述於美國專利申請案號1 1 /305,8 99中。3 A3係mAb ’其係與位於人β澱粉樣肽之N端抗原決定部位（特別 是殘基3至7 )專一性結合。 產製該抗體2Η3和3Α3之細胞株已於西元2005年12 月13日依據Budapest條約寄存於該寄存機構ATCC中， 且其寄存號碼分別爲PTA-7267和PTA-7269。 於另一較佳體系中，該抗體可爲15C11抗體或其變異 體，該抗體係描述於美國專利申請案號1 1 /3 04,986和國 φ 際專利申請案號PCT/US 05/455 1 5 (其發明名稱爲“辨識β 澱粉樣肽之人化抗體”）中。15C11係mAb，其係與位於 人β澱粉樣肽之中間抗原決定部位（特別是殘基1 9至22 )專一性結合。產製15C11單株抗體之細胞株已於西元 2005年12月13日依據Budapest條約寄存於該寄存機構 ATCC中，且其寄存號碼爲PTA-7270。 於另一較佳體系中，該抗體可爲2 6 6抗體，該抗體係 描述於美國專利公開案號20050249725A1和國際專利公 開案號WO 01/628 0 1 A2中。266係mAb，其係與位於人β -58- 200840821 (56) 澱粉樣肽之中間抗原決定部位（特別是殘基1 6至24 )專 一性結合。產製266單株抗體之細胞株已於西元2004年 7月20日依據Budapest條約寄存於該寄存機構ATCC中 ，且其寄存號碼爲PTA-6123。 實際之266抗體變異體係具有例如包含如SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44所示之可變區胺基酸序列的人化 輕鏈和包含如SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:45所示之可 φ 變區胺基酸序列的人化重鏈。其他實際之266抗體變異體 係具有例如SEQ ID NO:46所示之人化輕鏈胺基酸序列和 SEQ ID NO: 47所示之人化重鏈胺基酸序列。該抗體變異 體係進一步描述於美國專利公開案號20050249725A1和 國際專利公開案號WO 01 /6280 1 A2中。 於另一較佳體系中，該抗體可爲2B1抗體或其變異體 ，該抗體係描述於美國專利申請案號1 1 /3 05,8 99和國際 專利申請案號PCT/US05/45860 (其發明名稱爲“辨識β澱 φ 粉樣肽之人化抗體”）中。2Β1係mAb，其係與位於人β 澱粉樣肽之中間抗原決定部位（特別是殘基1 9至23 )專 一性結合。 於另一較佳體系中，該抗體可爲1C2抗體或其變異體 ，該抗體係描述於美國專利申請案號1 1 /3 05,899和國際 專利申請案號PCT/US05/45 860 (其發明名稱爲“辨識β澱 粉樣肽之人化抗體”）中。1 C2係mAb，其係與位於人β 澱粉樣肽之中間抗原決定部位（特別是殘基1 6至23 )專 一性結合。 -59- 200840821 (57) 於另一較佳體系中，該抗體可爲9G8抗體或其變異 體，該抗體係描述於美國專利申請案號1 1/304,986和國 際專利申請案號PCT/US05/455 1 5 (其發明名稱爲“辨識β 澱粉樣肽之人化抗體”）中。9G8係mAb，其係與位於人 β澱粉樣肽之中間抗原決定部位（特別是殘基1 6至2 1 ) 專一性結合。 產製該抗體2Β1、1C2及 9G8之細胞株已於西元 φ 2005年1 1月1曰依據Budapest條約寄存於該寄存機構 ATCC中，且其寄存號碼分別爲PTA-7202、PTA-7199及 PTA-7201 。

本發明所使用之與位於人β澱粉樣肽之C端抗原決定 部位專一性結合之抗體包括但不限於369.2Β，該抗體係 描述於美國專利案號5,7 86,1 80 (其發明名稱爲“對βΑ4肽 具專一性之單株抗體3 69.2Β”）。用於本發明之抗體的進 一步描述可參見文獻例如Bussiere et al., (Am· Pathol. φ 1 65(3): 987-95 (2004) ) 、Bard et al, ( PNAS 100(4): 2023 -8 (2003) ) 、Kajkowski et al. ( J. Biol. Chem. 2 7 6(22): 1 8748-56 (200 1 ) ) 、Games et al. ( Ann. NY

Acad. Sci. 920: 274-84 (2000) ) 、Bard et al. ( Nat. Med. 6(8): 91 6-9 (2000))及國際專利申請案號 WO 03 01 5691 A2 (其發明名稱爲“包含投遞抗Αβ抗體使患有阿茲海默氏疾 病、Down氏徵候群、腦澱粉樣血管病或中度認知損傷之 個體迅速改善認知能力”）。用於本發明之抗體片段的進 一步描述可參見文獻例如Bales et al.(摘要P4-396，S587 -60- (58) 200840821 % 頁，佈告區 P4: Therapeutics and Therapeutic Strategies-Therapentic Strategies，Amyloid-Based )和 Zameer e t al. (摘要 P4-420，S593 頁，佈告區 P4: Therapeutics and Therapeutic Strategies-Therapeutic Strategies， Amyloid-Based )。 用於本發明之抗體可經重組或合成產製。例如，可藉 由重組細胞培養方法並使用例如CHO細胞、NIH 3T3細 φ 胞、PER C6®細胞、NS0細胞、VERO細胞、雞胚成纖維 細胞或BHK細胞以產製該抗體。此外，本發明包括經少 許修飾仍保留結合Αβ肽之主要功能性質之抗體。於一特 別較佳體系中，該抗體係與Αβ肽專一性結合之人化抗Αβ 肽3D6抗體。更特定地，該人化抗Αβ肽3D6抗體係與個 體（例如患有阿茲海默氏疾病之病患）之腦內斑沉積中的 人β澱粉樣肽1 -40或1 -42之Ν端抗原決定部位（例如胺 基酸殘基1至5 )專一性結合。 Φ 實際之人化抗Αβ肽抗體係人化3D6第2代（h3D6v2 )。自對應表現載體之DNA序列所預測之該h3D6v2輕鏈 和重鏈之完整胺基酸序列係示於圖1 (其中自輕鏈和重鏈 之N端起算殘基編號爲1 )且分別示於SEQ ID NO: 1和 SEQ ID NO :2。重鏈DNA序列編碼之最後一個胺基酸殘基 Lys 44 9並未顯現於h3D6v2之成熟分泌型式，且在未限於 任何特定之理論的情況下，推測該胺基酸殘基Lys44 9係於 細胞內加工處理期間藉由CHO細胞蛋白酶除去。因此， 該h3D6v2重鏈之C端可選擇地係Gly4 4 8。已於重組和血 -61 - (59) 200840821 霉 漿衍生之抗體中觀察到該c端Lys之加工處理，且該C 端 Lys之加工處理並未顯示損害抗體之功能（Harris (1 995) J. Chromatogr. A. 705:1 29- 1 34 )。藉由將 N 端連 接之聚糖加至重鏈之Fc部分對純化之h3D6v2進行轉譯 後修飾，該重鏈之Fc部分已知係含有單一之N-糖基化共 有部位。該N-糖基化部位顯現3個主要之複合雙觸角中 性寡糖結構，該結構一般於哺乳動物之IgG蛋白質的類似 % N-糖基化部位可觀察到。 另一實際之人化抗Αβ肽抗體係人化3D6第1代（ hWDhl)，其具有圖i所示之序列但於輕鏈之第〗位置 係經D + Y替代、於重鏈之第75位置（Kab at編號係第74 位置）係經S + A替代、於重鏈之第78位置（Kabat編號 係第7 7位置）係經τ + S替代、及於重鏈之第9 3位置（ Kabat編號係第89位置）係經V + L替代。 本發明之不同方面和較佳體系係進一步經由下述之實 ® 施例加以說明。該等實施例係用於說明而非作爲限制。 【實施方式】 下述實施例僅用於說明。使用2種不同之抗Αβ單株 抗體作爲實例。描述6個各別之實驗，每個實驗代表一個 抗體組合和雜質去除。 材料和方法 一般而言’除非另有說明，實施本發明係使用化學、 -62- 200840821 (60) 分子生物學、重組DNA技術、免疫學（特別是例如免疫 球蛋白技術）及電泳標準技術之慣用技術。參閱例如

Sambrook, Fritsch and Maniatis，Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press ( 1 9 8 9) ; Antibody

Engineering Protocols ( Methods in Molecular Biology )， 510，Paul, S., Humana Pr (1996) ; Antibody Engineering: A Practical Approach ( Practical Approach Series, 169)， McCafferty，Ed.，Irl Pr ( 1 9 9 6) ； Antibodies : A Laboratory Manual， Harlow et al., C.S.H.L. Press, Pub. (1 9 9 9)；

Current Protocols in Molecular Biology, e d s. Ausub el et a l.，John Wiley & Sons (1 992) ； Bousse et a l ·，Protein

Sizing on a Microchip, Anal. Chem. 73， 1207-1212 (200 1 ) ；Knapp e t a l.，Commercialized and Emerging Lab-on-a-Chip Applications ; In: Proceedings of the μΤAS 2001 Symposium, Ramsey, J.M. & van den Berg, A.，7-10 (2001 ) ；及 Mhatre et al., Strategies for locating disulfide bonds in a monoclonal antibody via mass spectrometry, Rapid C ommun . Mass Spectrom, 1 3 ( 2 4 ) 2 5 0 3 - 2 5 1 0 ( 1 9 9 9 ) o 產製標的抗體 例如使用於懸浮培養中生長之重組哺乳動物細胞株可 產製標的抗體。於生產生物反應器中產生含有該所欲抗體 之培養液。可收取所生成之產物並經任何適當之澄清步驟 (諸如例如微過濾和0.22 μιη過濾或離心、或墊過濾及 -63- 200840821 (61) 0.22 μιη過濾）加以澄清。 純化標的抗體 本發明例示之標的單株抗體（ΑΑΒ和12Α11)的純化 係由在蛋白質Α親和性層析上捕捉標的分子所組成。該 蛋白質A親和性層析可由rmp蛋白質A Sepharose™ Fast Flow、蛋白質 A Sepharose™ Fast Flow、或 MabSelect 蛋 白質A所組成。隨後如每個實驗所描述般沖洗該樹脂， 流洗出產物並測定雜質量。 分析標的抗體 使用逆相HPLC ( RP-HPLC )定量AAB單株抗體樣品 中存在之IRT量。使用大小互斥層析（SEC-HPLC )以測 定單元體蛋白質（單元體IgG)、高分子量（HMW )和低 分子量（LMW )變異體之百分比。使用變性SEC-HPLC 分析以測定樣品中二硫鍵結變異體（UDB )之相對量。使 用酶聯免疫吸附測定（ELIS A )以測定測試樣品中HCP量 分析性測定：IRT和UDB 逆相HPLC ( AAB IRT分析） RP-HPLC之進行如下。於40°C和2.5 mM DTT之存 在下培育每個樣品60分鐘以還原二硫鍵。藉由於室溫和 5.5 mM碘乙酸之存在下培育以進行烷基化反應。在該還 -64- (62) 200840821 原和烷基化反應後，所有樣品係經5 W之1 M DTT驟冷。 該測定之定量限制係〇 · 5 %。每個經還原及烷基化之樣品 (約40 pg)係注入至P〇R〇S Rl/H RP-HPLC管柱上並於 下述之條件下層析70分鐘：

管柱：Poros Rl/H RP-HPLC 管柱溫度：5 0 °C

流動相A : 0.1 % TFA ( w/v )之水溶液 流動相B : 0.1 % T F A ( w / v )之9 5 %乙腈溶液 流速：l.OmL/分 偵測：217 nm 層析時間：7 0分鐘 注入：三重複每次40 pg 梯度時間係示於表1。

表1 : RP-HPLC方法之梯度時間 梯度時間 %A %B 0-1 95 5 2 70 3 0 54 60 40 55.1-70 95 5 dSEC-HPLC ( AAB UDB 分析） 變性S E C - Η P L C之進行如下。對變性S E C測定之樣 品預處理涉及試劑/樣品混合物（其中蛋白質之最終濃度 -65- 200840821 (63) 係 20 0 pg/mL) 、3M 鹽酸胍、及 100 mM Tris，pH 7.4。 於80°C下且藉由倒置混合之方式加熱樣品20分鐘。對該 測定，使用兩個對照組以一倂處理（藉由加括弧）UDB 量。使用低量和高量UDB之內部參考値作爲對照組。層 析/測定條件如下： 管柱：Tosoh BioSep G3 000 SWxl

管柱溫度：周溫 流動相·· 3M 鹽酸胍、25 mM NaP04，pH 6.8 梯度：同溶劑 流速：0.5 mL/分 偵測：2 8 0 nm 層析時間：5 0分鐘 注入：三重複50 pL ( 10 pg) 實施例1 :比較IRT除去用之沖洗緩衝液 於此實施例中，純化含有抗Αβ單株抗體AAB之含雜 質溶液係藉由吸附至蛋白質Α管柱上，隨後經含有CaCl2 、MgCl2、NaCl或丙二醇之沖洗緩衝液第一次沖洗。 使用與 GE Healthcare AKTA FPLC層析系統連接之 rmp蛋白質A Sepharose™ FF管柱（8.9 mL )小量純化含 有該單株抗體之培養液。實施例1中所描述之所有rmp蛋 白質A Sepharose™ FF層析步驟係使用下述之條件。（例 外係註記於個別之實驗敘述）。 66 - 200840821 (64) 管柱規格-1.0 cm X 11.4 cm 操作流速 -1 50 cm/小時 平衡液 1— 20mMTris、150mMNaCl，pH7.5(5 倍 管柱體積） 沖洗液-20 mM Tris、1 50 mM NaCl，pH 7.5 ( 1 倍 管柱體積） • 沖洗液1 -可變（參閱表2 )，除了層析#1無沖洗 液1外 沖洗液 2 - 20 mM Tris、1 ·0 M NaCl，pH 7.5 ( 5 倍 管柱體積） 沖洗液 3 - 1〇 mM Tris、75 mM NaCl，pH 7·5 (7 倍 管柱體積） 流洗液-50 mM 甘胺酸、75 mM NaCl，pH 3.1(6 倍管柱體積） # 剝離液1 - 20 mM檸檬酸鈉，pH 2·7 ( 5倍管柱體積） 剝離液2 - 6 Μ鹽酸胍（2倍管柱體積） 剝離沖洗液-20 mM Tris、1 50 mM NaCl，pH 7.5 ( 5倍管柱體積） 儲存液 -16%乙醇（5倍管柱體積）

層析溫度：2 - 8 °C 該rmp蛋白質A Sepahrose™ FF管柱層析係經5倍管 柱體積之 20 mM Tris、150 mM NaCl，pH 7.5 平衡。該管 -67- 200840821 (65) 柱係載入約l〇 mg產物/mL樹脂。隨後載入1倍管柱體積 之沖洗和平衡緩衝液及5倍管柱體積之沖洗液1。所有測 試之沖洗液1係示於表2。除了層析#1外，所有層析皆包 括沖洗液1。在沖洗液1之後係5倍管柱體積之20 mM Tris、1·0 M NaCl，pH 7.5 和 7 倍管柱體積之 10 mM Tris ，75 mM NaCl，pH 7.5。使用 50 mM 甘胺酸、75 mM NaCl，pH 3.1自該管柱流洗出單株抗體。利用2 M Tris ( pH 8.5 )中和產物集中液至pH 7.9-8.1。隨後令該管柱經 剝離、沖洗及儲存。表2列示自不同層析所得之產物集中 液中存在的IRT變異體和LMW變異體之量。氯化鎂和氯 化鈣沖洗減少IRT和LMW變異體量。 表2 :不同沖洗液1緩衝液層析後IRT變異體和LMW變異體之量 層析# 條件 %LMW %IRT 1 對照組（無沖洗液1) 4.4 2.5 2 20% 丙二醇，pH 7.5 4.7 2.5 3 50 mM Tris、2.0 Μ 氯化鎂，pH 7.5 1.6 1.5 4 5 0 mM Tris、2.5 Μ 氯化鎂，pH 7.5 1.5 1.3 5 50 mM乙酸鹽、2·0 Μ氯化鎂，pH 4.5 0.9 0.8 6 50 mM Tris、4.0 Μ 氯化鈉，pH 7.5 4.4 2.5 7 50 mM Tris、2.0 Μ 氯化 ，pH 7.5 1.8 1.4 8 50 mM Tris、2.5 M 氯化，pH 7.5 0.8 0.8

結果顯示氯化鎂和氯化鈣沖洗減少IRT和LMW變異 體量，而氯化鈉和丙二醇沖洗並未減少IRT和LMW變異 體量。 -68- 200840821 (66) 實施例2:蛋白質A層析經CaCl2沖洗以除去IRT變異體 此實施例中，較大量之抗體純化係使用蛋白質A層 析經CaCl2沖洗以除去IRT變異體。

以中間工廠規模（pilot scale )，使用與 Millipore K-P rime 4 00層析系統連接之Mab Select蛋白質A管柱（ 2.4 L )純化含有單株抗體之培養液。依下述之方式實施 兩次MabSelect層析。 管柱規格 -13 cmx 18 cm 操作流速 -150 cm/小時、300 cm/小時 平衡液 1 - 2 0 m Μ T r i s、1 5 0 m Μ N a C 1，p Η 7 · 5 ( 5 倍 管柱體積） 沖洗液-20 mM Tris、150 mM NaCl，pH 7.5 (2 倍 管柱體積） 沖洗液 1 -層析 #1 l50mMTris、2MCaCl2，pH 7.5且層析#2無沖洗液1 沖洗液 2 - 20 mM Tris、1·0 M NaCl，pH 7.5(5 倍 管柱體積） 沖洗液 3 - 10 mM Tris、75 mM NaCl，pH 7·5 ( 5 倍 管柱體積） 流洗液-50mM甘胺酸、25mMNaCl，pH3·l(6 倍管柱體積） 剝離液 1 - 50 mM 甘胺酸、0.5 M NaCl，pH 2.7 ( 5 -69 - 200840821 (67) 倍管柱體積） 剝離液2 - 6 Μ鹽酸胍（2倍管柱體積） 剝離沖洗液-20 mM Tris、150 mM NaCl，pH 7.5 ( 5倍管柱體積） 儲存液 -1 6%乙醇（5倍管柱體積）

層析溫度：2 - 8 °C 該M ab Select蛋白質A管柱係經5倍管柱體積之20 mM Tris、150 mM NaCl，pH 7.5平衡。該管柱係載入約 1 〇 mg產物/mL樹脂。隨後載入2倍管柱體積之沖洗和平 衡緩衝液及5倍管柱體積之沖洗液1。該沖洗液1係由5 0 mM Tris、2·0 M CaCl2，pH 7.5(對層析 #1)所構成，而 層析#2完全無該沖洗液1。該沖洗液1之後係5倍管柱體 積之50 mM Tris、1.0 M NaCl，pH 7.5和5倍管柱體積之 10 mM Tris，75 mM NaCl，pH 7.5。使用 50 mM 甘胺酸 、25 mM NaCl，pH 3.1 自該 Mab Select 蛋白質 A 管柱流 洗出單株抗體。利用2 M Tris ( pH 8 ·5 )中和產物集中液 至pH 7·8-8 ·2。隨後令該管柱經剝離、沖洗及儲存。結果 示於表3。 表3 :中間工廠規模層析經與不經氯化鈣沖洗後IRT變異體量 層析# 沖洗液1緩衝液 %IRT 1 50 mM Tris、2 M CaCl2，pH 7.5 0.8 2 對照組（無） 1.9 70· 200840821 (68) 結果顯示中間工廠規模下經氯化鈣沖洗自產物集中液 除去IRT變異體。 實施例3 : DNA除去 此實施例中，檢驗CaCl2沖洗自含有AAB單株抗體 之製備物中除去宿主細胞DNA之能力。 使用與GE Healthcare AKT A FPLC層析系統連接之 馨 MabSelect蛋白質A管柱（19 mL)，小量純化含有該單 株抗體之培養液。以下述之方式進行三次Mab Select層析 管柱規格 -1.1 cmx20 cm 操作流速 -3 00 cm/小時 平衡液 1 — 20 mM Tris、150 mM NaCl，pH 7.5 ( 5 倍 管柱體積）

沖洗液—20 mM Tris、150 mM NaCl，pH 7.5 (2 倍 管柱體積） 沖洗液 1 - 50 mM Tris、2·0 M CaCl2，pH 7.5(5 倍 管柱體積）（僅層析2和3 ) 沖洗液 2 - 20 mM Tris、1.0 M NaCl，pH 7.5(5 倍 管柱體積）（僅層析1和3 ) 沖洗液 3 — 10 mM Tris、75 mM NaCl，pH 7.5 ( 7 倍 管柱體積） 流洗液-50 mM 甘胺酸、75 mM NaCl，pH 3 ·0 ( 6 -71 - 200840821 (69) ' 倍管柱體積） 剝離液-50 mM 甘胺酸、0·5 M NaCl，pH 2.7 ( 5 倍 管柱體積） 剝離沖洗液-20mMTris、150mMNaCl，pH7.5( 5倍管柱體積） 儲存液 -1 6 %乙醇（5倍管柱體積） 層析溫度：18-24。〇 該M ab S e 1 e c t蛋白質A管柱層析係經5倍管柱體積之 20 mM Tris、1 50 mM NaCl，pH 7.5 平衡。隨後該管柱係 載入約40 mg產物/mL樹脂。隨後載入2倍管柱體積之沖 洗和平衡緩衝液。對層析2和3，此步驟之後係5倍管柱 體積之沖洗液1。對層析1和3，係使用5倍管柱體積之 沖洗液2。所有該3種層析係使用7倍管柱體積之沖洗液 3。使用 50 mM甘胺酸、75 mM NaCl，pH 3.0 自該 φ MabSelect蛋白質Α管柱流洗出該單株抗體。利用2 Μ Tris (pH 8.5)中和產物集中液至pH 7.5-8.0。隨後令該 管柱經剝離、沖洗及儲存。結果示於表4。

表4 :經氯化鈣沖洗以除去DNA 層析 # 沖洗液1 沖洗液2 DNA (ng/mL) DNA (PPm) 1 無（對照組） 20mMTris、1 MNaCl，pH7.5 3.6 0.37 2 50 mM Tris、2 M CaCl2，pH 7.5 M j\\\ 0.9 0.09 3 50 mM Tris、2 M CaCl2，pH 7·5 20 mM Tris、1 M NaCl，pH 7.5 0.3 0.03 -72- (70) (70)200840821 m 結果顯示與沖洗液中使用N a C1相比較，加入5 0 m Μ Tri s、2.0 Μ氯化鈣，pH 7.5係減少DNA量達10倍。 實施例4 :宿主細胞蛋白質（HCP)除去 於此實施例中，純化層析係使用第2種抗Αβ單株抗 體1 2 A 1 1，其中測試不同之沖洗條件對除去宿主細胞蛋白 質（HCP )之能力。 實施96孔槽濾盤之高產出篩選（HTS )以鑑別出除 去Mab Select步驟之雜質（諸如HCP)之最佳沖洗條件。 該篩選係改變沖洗賦形劑、賦形劑濃度及pH以測定該等 因素對處理相關雜質（諸如HCP )之功效。 使用 5 mM Tris、10 mM NaCl，pH 7.3 平衡該 MabSelect樹脂並與產物載入管柱中。取出該樹脂，經混 合且將50 μΕ之樹脂分配於96孔槽濾盤之每個孔槽中。 每個孔槽中之樹脂係經5 mM Tris、1 0 mM NaCl，pH 7.3 之溶液平衡，隨後經三階段使用每種不同之賦形劑沖洗液 沖洗，每種係使用3 00 μ。之沖洗緩衝液。經賦形劑沖洗 後，經四階段使用5 mM Tris、10 mM NaCl，pH 7.3之緩 衝液（每次3 00 μ!〇進行第二次沖洗。經三階段（每次 3 00 pL )自該樹脂流洗出產物。結合流洗階段1和2並測 試HCP量。 樹脂體積 -50 μί -73- 200840821 (71) 沖洗賦形劑-氯化鈉、氯化鈣、氯化鎂

賦形齊!!濃度-100、250、500、1000、1500 及 2000 mM 賦形劑pH - 6.0和7.5 流洗緩衝液-25 mM Hepes、1 0 mM NaCl，pH 3.0、

25 mM Hepes、100 mM NaCl，pH 3.0 、50 mM 甘胺酸、10 mM NaCl，pH 3.0、50 mM 甘胺酸、100 mM NaCl， pH3.0、lOOmM 精胺酸、lOmMNaCl ，pH 3.0、100 mM 精胺酸、100 mM NaCl，pH 3.0 處理溫度：18-24°C 結果示於表5和6。 表5 :於pH 6.0下經氯化鈉、氯化鈣或氯化鎂沖洗MabSelect樹脂後之HCP量 流洗緩衝液 流洗 NaCl濃度 (mM) 沖洗賦形 劑濃度 (mM) 沖洗賦形劑 NaCl CaCl2 MgCl2 HCP(ppm) 50mM甘胺酸 10 100 46,800 28,500 30,800 25 mM HEPES 250 35,300 17,900 22,000 lOOmM精胺酸 500 40,900 17,700 18,400 50mM甘胺酸 1000 34,300 12,600 14,200 25 mM HEPES 1500 37,000 7,800 10,700 lOOmM精胺酸 2000 43,900 5,800 9,300 -74 - 200840821 (72) 表6 :於pH 7.5下經氯化鈉、氯化鈣或氯化鎂沖洗MabSelect樹脂後之HCP量 流洗緩衝液 流洗 NaCl濃度 (mM) 沖洗賦形 劑濃度 (mM) 沖洗賦形劑 NaCl CaCl2 MgCl2 HCP(ppm) 50mM甘胺酸 100 100 27,900 17,900 21,800 25 mM HEPES 250 24,700 16,600 18,200 100 mM精胺酸 500 26,500 14,000 17,300 50mM甘胺酸 1000 30,100 14,500 17,700 25 mM HEPES 1500 35,300 12,000 12,500 100 mM精胺酸 2000 41,700 8,200 11,700

結果顯示於pH 6.0 (表5 )和pH 7.5 (表6 )下，與 氯化鈉相比較，氯化鈣和氯化鎂降低該M ab S e 1 e c t峰集中 液中之HCP量。 實施例5 :除去二硫鍵結變異體（UDB ) 於此實施例中，檢驗CaCl2沖洗以除去二硫鍵結變異 體（UDB )之能力。 如述於實施例1，本質上係實施兩個rmp蛋白質 A Sepharose™ FF 層析。 管柱規格-1.0 cm x 11.4 cm 操作流速 -150 cm/小時 平衡液 l-20mMTris、150mMNaCl，pH7.5(5 倍 管柱體積） 沖洗液- 20mMTris、15 0mMNaCl，pH7.5(l 倍 -75- 200840821 (73) 管柱體積） 沖洗液1 -對層析1係50 mM乙酸鹽、2.0 M CaCl2 ，pH 5.0 ;對層析2未使用 沖洗液 2 - 20 mM Tris、1.0 M NaCl，pH 7.5 ( 5 倍 管柱體積） 沖洗液 3 一 10 mM Tris、75 mM NaCl，pH 7.5 (7 倍 管柱體積） φ 流洗液—50mM 甘胺酸、75mMNaCl，pH3.1(6 倍管柱體積） 剝離液1 - 20 mM檸檬酸鈉，pH 2.7 ( 5倍管柱體積） 剝離液2 - 6 Μ鹽酸胍（2倍管柱體積） 剝離沖洗液—20 mM Tris、150 mM NaCl，pH 7.5 ( 5倍管柱體積） 儲存液 -1 6%乙醇（5倍管柱體積）

層析溫度：2 - 8 °C 該rmp蛋白質A S epharose FF管柱係經5倍管柱體 積之 20 mM Tris、150 mM NaCl，pH 7.5 平衡。該管柱係 載入約10 mg產物/mL樹脂。隨後載入1倍管柱體積之沖 洗和平衡緩衝液及5倍管柱體積之沖洗液1。該沖洗液1 係由50 mM乙酸鹽、2·0 M CaCl2，pH 5.0 (對層析#1 ) 所構成，而層析#2完全無該沖洗液1。該沖洗液〗之後係 5 倍管柱體積之 20 mM Tris、1.0 M NaCl，pH 7.5 和 7 倍 管柱體積之 1 〇 mM Tris，75 mM NaCl，pH 7.5。使用 50 -76- 200840821 * (74) 111]^甘胺酸'75 111^1&0：1，？113.1自該1*1111)蛋白質八

Sepharose FF管柱流洗出單株抗體。利用2 M Tris(pH 8.5 )中和產物集中液至pH 7.8-8.2。隨後令該管柱經剝離 、沖洗及儲存。結果示於表7。 表7 :經或不經鈣沖洗之樣品中的UDB ( % ) 層析# 樣品 %UDB 1 50 mM 乙酸鹽、2.0 M CaCl2，pH 5.0 9.5 2 無（對照組） 20.8

對含有額外之50 mM乙酸鹽、2.0 M CaCl2，pH 5.0 沖洗之層析，觀察到UDB量減少2倍。

實施例6 :使用其他之二價陽離子鹽沖洗以除去HCP和 IRT 於此實施例中，檢驗含有MnCl2或NiCl2之沖洗液自 含有該Αβ單株抗體AAB之製備物中除去雜質之能力。 實施兩個層析以評估含有其他二價陽離子鹽（諸如 MnCl2和NiCl2 )之沖洗液的功效。亦實施兩個對照組層 析：一個係使用 50 mM Tris、1.0 M NaCl，pH 7·5 沖洗液 (無預期能除去IRT或HCP )且另一個係使用50 mM Tris、2.0 M CaCl2，pH 7.5 沖洗液。 使用與GE Healthcare AKTA FPLC層析系統連接之 Mab Select蛋白質A管柱（9 mL)，小量純化含有該卓株 -77- 200840821 (75). 抗體之培養液。依下述之方式進行該Mab Select層析。如 下所述，除了沖洗液1 (其爲可變，參閱表8)之外，所 有操作參數於4個層析皆相同。 ’ 管柱規格-1.0 cmx 11.5 cm(9mL) 操作流速 -3 0 0 c m /小時（平衡，沖洗液2，流洗， 再生，儲存） • 操作流速 -230 cm/小時（載入，沖洗，沖洗液1 ) 平衡液 l-5 0mMTris、150mMNaCl，pH7.5(5 倍 管柱體積） 沖洗液1 -可變（參閱表8所示之組成） 沖洗液 2 — 50 mM Tris、10 mM NaCl，pH 7.5(5 倍 管柱體積） 流洗液 - 50 mM 甘胺酸、10 mM NaCl，pH 3.0 ( 3 倍管柱體積） _ 再生液-50 mM NaOH、0·5 M Na2S04 ( 5 倍管柱體 積）

儲存液一 16%乙醇、50 mM Tris、150 mM NaCl，pH 7.5 ( 5倍管柱體積）

層析溫度：18-24°C 該MabS elect蛋白質A管柱係經5倍管柱體積之50 mM Tris、150 mM NaCl，pH 7.5平衡。該管柱係載入約 40 mg產物/mL樹脂。使用5倍管柱體積之50 mM Tris、 -78- 200840821 (76)

150 mM NaCl，pH 7·5自該管柱沖洗出殘留負載。隨後使 用表8所描述之溶液之一沖洗該管柱。於流洗前，該管柱 係經5倍管柱體積之50 mM Tris、10 mM NaCl，pH 7.5 沖洗。使用50mM甘胺酸、10mMNaCl，pH3·0自該 MabSelect蛋白質A管柱流洗出產物。隨後利用2 M Tris (pH 9·0)中和產物集中液至pH 8·0。使用5倍管柱體積 之50 mM NaOH、0.5 M Na2S04剝離該管柱，隨後使用5 倍管柱體積之 16%乙醇、50 mM Tris、150 mM NaCl，pH 7·5進行儲存。結果示於表8 ( HCP除去）和表9 ( IRT除 去）中。

表8 :使用不同之沖洗液除去HCP 層析# 沖洗液1條件 HCP ( PPM) 1 50 mM Tris ' 1.0 M NaCl 5 pH 7.5 17,600 2 50 mM 乙酸鈉、1·5 M MnCl2，pH 5.0* 10,600 3 5 0 mM 乙酸鈉、1.5 M NiCl2，pH 5.0* 4,700 4 50 mM Tris、2.0 M CaCl2，pH 7.5 6,500 *選擇pH 5.0係基於MnCl2和NiCl2之溶解度

表9 :使用不同之沖洗液除去IRT 層析# 沖洗液1條件 IRT ( %) 1 50 mM Tris、1·0 M NaCl，pH 7·5 2.78 2 50 mM 乙酸鈉、1.5 M MnCl2，pH 5·0* 0.77 3 50 mM 乙酸鈉、1.5 Μ NiCl2，pH 5.0* 0.47 4 50 mM Tris、2·0 M CaCl2，pH 7.5 0.8 7 *選擇pH 5.0係基於MnCl2和NiCl2之溶解度 -79- 200840821 ‘ (77) 表8顯示經含有二價陽離子之溶液沖洗的層析中所存 在之HCP量比對照組（1.0 M NaCl沖洗）之HCP量係低 1.5至3.5倍。表9顯示與使用含有1.0 M NaCl之沖洗液 的層析相比較，使用含有二價陽離子鹽溶液之沖洗液的層 析亦提供大於3.5倍之IRT去除。因此，該等結果證實含 有非CaCl2之其他二價陽離子鹽（例如MnCl2或NiCl2) 的沖洗液亦能有效地除去雜質。 對等體系 熟習此技藝之人士僅使用慣常性實驗即能瞭 解或能確定所描述之本發明之特定較佳體系的許多對等體 系。該等對等體系係包括於下述之申請專利範圍中。 【圖式簡單說明】 圖1顯示分別爲SEQ ID ΝΟ:1和SEQ ID NO:2之人 化3D6版本2(hu3D6.v2)抗Αβ抗體輕鏈和重鏈之完整 φ 胺基酸序列。輕鏈互補性決定區（CDR )(即 CDR1、 CDR2及CDR3 )係分別位於殘基位置24-3 9、55-61及 94-102 (上段）。重鏈互補性決定區（CDR)(即 CDR1 、CDR2及CDR3)係分別位於殘基位置40-44、50_65及 99-108 (下段）。預期之分子內二硫鍵係以其中之半胱胺 酸殘基的連接表示。被預期形成分子間二硫鍵之半胱胺酸 係以底線表示並說明連接處。抗體重鏈之N-連接糖基化 作用共有部位於殘基位置299-30 1係以斜體字表示（下段 )。預期之重鏈C端離胺酸係以括弧表示。 -80-

Claims (1)

1. (1) 200840821 • 十、申請專利範圍 1 一種自來源液體純化含有FC區域之Αβ結合蛋白質 之方法’該來源液體包含該蛋白質和一或多種雜質，該方 法包含步驟： 吸附該Αβ結合蛋白質至Fc結合劑上； 利用含有二價陽離子鹽之緩衝液沖洗該Fc結合劑以 除去一或多種雜質；及 φ 自該Fc結合劑且於流洗液中回收該蛋白質。 2 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中該一或多種雜 質選自內含子通讀變異體（IRT )、二硫鍵結變異體（ UDB )或低分子量變異體（LMW )。 3 ·如申請專利範圍第2項之方法，其中該一或多種雜 質係IRT。 4 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中該Α β結合蛋 白質係抗體。 • 5·如申請專利範圍第4項之方法，其中該抗體選自融 合抗體、鼠抗體、嵌合抗體、人化抗體或人抗體。 6·如申請專利範圍第1項之方法，其中該Αβ結合蛋 白質係人化抗Α|5抗體。 7. 如申請專利範圍第6項之方法，其中該人化抗Αβ 抗體選自 3D6、10D5、12Α11 或 12Β4。 8. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該含有Fc區 域之Αβ結合蛋白質係經重組產製。 9·如申請專利範圍第1項之方法，其中該含有Fc區 -81 - 200840821 (2) 域之Α β結合蛋白質係於中國倉鼠卵巢（c η 〇 )細胞中經 重組產製。 10·如申請專利範圍第1項之方法，其中該！結合劑 包含一或多種蛋白質A和蛋白質G。 1 1 .如申請專利範圍第1項之方法，其中該F c結合劑 係固定於固相上。 1 2 .如申請專利範圍第丨丨項之方法，其中該固相包含 Φ 一或多種珠、凝膠、樹脂及顆粒。 1 3 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中該二價陽離 子鹽包含促溶鹽。 1 4 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中該二價陽離 子鹽選自CaCl2、NiCl2、MgCl2、或彼等之混合物。 1 5 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中該含有二價 陽離子鹽之緩衝液之pH係介於約4至約8之間。 16·如申請專利範圍第1項之方法，其中該含有二價 # 陽離子鹽之緩衝液之pH係介於約4.5至約7.5之間。 1 7 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中該緩衝液中 二價陽離子鹽之濃度係介於約〇. i Μ至約5 Μ之間。 1 8 .如申請專利範圍第1 7項之方法，其中該緩衝液中 二價陽離子鹽之濃度係介於約〇. 5 Μ至約3 Μ之間。 1 9 .如申請專利範圍第1項之方法，其中該含有二價 陽離子鹽之緩衝液包含至少約〇.6MCaCl2。 20·如申請專利範圍第1項之方法，其中該含有二價 陽離子鹽之緩衝液包含至少約2MMgCl2。 -82- 200840821 (3) 21·如申請專利範圍第1項之方法，其中該含有二價 陽離子鹽之緩衝液包含至少約2Μ CaCl2。 22·如申請專利範圍第1項之方法，其中係於約2°C至 約24°C間之溫度下進行吸附該Αβ結合蛋白質至Fc結合 劑上及沖洗該F c結合劑之步驟。 2 3 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中該一或多種 雜質包含一或多種宿主細胞蛋白質、宿主細胞D N A、細 φ 胞培養蛋白質、及彼等之混合物。 24·如申請專利範圍第1項之方法，其中該一或多種 雜質包含不欲之含有Fc區域之蛋白質。 2 5 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中該不欲之a β 結合蛋白質包含一或多種含有內含子通讀序列之抗體鏈 或其片段、一或多種含有不適當之二硫鍵的抗體鏈或其片 段、半抗體或其片段、輕鏈二聚體或其片段、及重鏈二聚 體或其片段。 • 26·如申請專利範圍第1項之方法，其中自該Fc結合 劑回收該Αβ結合蛋白質之步驟包含利用流洗緩衝液流洗 該蛋白質，該流洗緩衝液之pH係介於約2.0至約6.5之 間。 27.如申請專利範圍第1項之方法，其中該方法進一 步包含層析步驟，該層析步驟選自陰離子交換層析、陽離 子交換層析、固定化金屬親和性層析或疏水性交互作用層 析（HIC )。 2 8 .如申請專利範圍第1項之方法，其中該方法進一 -83· 200840821 (4) 步包含層析步驟’該層析步驟選自羥磷灰石層析、透析、 親和性層析、硫酸銨沉澱、乙醇沉澱、逆相HP LC ( RP- HPLC )或層析聚焦。 2 9 .如申請專利範圍第1項之方法，其中該一或多種 雜質包含該蛋白質之一或多種內含子通讀變異體，且含有 該蛋白質之流洗液中內含子通讀變異體之量係比來源液體 中內含子通讀變異體之量低至少5倍。 φ 30.如申請專利範圔第29項之方法，其中含有自該流 洗液回收之該蛋白質的溶液中內含子通讀變異體之量係比 來源液體中內含子通讀變異體之量低至少1〇倍。 3 1 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中該一或多種 雜質包含該蛋白質之一或多種內含子通讀變異體，且該內 含子通讀變異體量低於流洗液中該蛋白質變異體量之約 1%。 3 2·如申請專利範圍第31項之方法，其中該內含子通 φ 讀變異體量低於流洗液中該蛋白質變異體量之約〇·8%。 33. 如申請專利範圍第32項之方法，其中該內含子通 讀變異體量低於流洗液中該蛋白質變異體量之約〇. 5 %。 34. 如申請專利範圍第33項之方法，其中該內含子通 讀變異體量低於流洗液中該蛋白質變異體量之約〇·2%。 3 5 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中該一或多種 雜質包含該蛋白質之一或多種低分子量變異體，且該低分 子量變異體量低於流洗液中該蛋白質變異體量之約1 %。 3 6.如申請專利範圍第35項之方法，其中該低分子量 •84- 200840821 (5) 變異體量低於流洗液中該蛋白質變異體量之約0 · 8 % ° 3 7.如申請專利範圍第36項之方法，其中該低分子量 變異體量低於流洗液中該蛋白質變異體量之約〇 ·5 % ° 3 8.如申請專利範圍第37項之方法，其中該低分子量 變異體量低於流洗液中該蛋白質變異體量之約〇·2% ° 3 9 .如申請專利範圍第1項之方法，其中該一或多種 雜質包含該蛋白質之一或多種二硫鍵結變異體’且該二硫 φ 鍵結變異體量低於流洗液中該蛋白質變異體量之約1 5% ° 4〇.如申請專利範圍第3 9項之方法，其中該二硫鍵結 變異體量低於流洗液中該蛋白質變異體量之約1 0% ° 4 1 .如申請專利範圍第4 0項之方法，其中該二硫鍵結 變異體量低於流洗液中該蛋白質變異體量之約5 % ° 4 2 .如申請專利範圍第4 1項之方法，其中該二硫鍵結 變異體量低於流洗液中該蛋白質變異體量之約2%。 4 3.—種依申請專利範圍第1項之方法所純化之Αβ結 φ 合蛋白質。 44.如申請專利範圍第43項之蛋白質，其中該蛋白質 係抗體。 45·—種包含用於自雜質純化含有Fc區域之Αβ結合 蛋白質的試劑之組套，其包含 選自二價陽離子鹽或Fc結合劑之試劑’及 使用指示說明。 -85-