TW200819466A

TW200819466A - Anti-activin a antibodies and uses thereof

Info

Publication number: TW200819466A
Application number: TW096133216A
Authority: TW
Inventors: Qing Chen; Hq Han; Keith Soo-Nyung Kwak; Xiaolan Zhou
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 2006-09-08
Filing date: 2007-09-06
Publication date: 2008-05-01
Also published as: PE20080914A1; CA2661878C; US20180371073A1; SI2064239T1; HRP20161300T1; AU2007294580B2; PT2064239E; CA2661878A1; EP3730517A1; ES2596184T3; US8753627B2; JP5497438B2; MX2009002571A; US20150086556A1; RS53819B1; US20090234106A1; JP5986518B2; EP2559705A2; ME02539B; EP2064239A2

Description

200819466 九、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明大體而言是關於活動素A之半胱胺酸結功能部

位（cysteine knot domains of activin A)以及能結合活動素 A 或其片段之抗原結合劑。【先前技術】許多嚴重的疾病狀態伴隨已知的惡病質狀況，其係指體細胞質量減少。體細胞質量（B CM)是由肌肉質量、內臟質量及免疫細胞質量所組成。BCM是人體最有活性的身體成分，總計全部代謝活性的百分之九十五。減少百分之五的B CM 可導致發病改變，肌肉強度減少，代謝改變以及增加感染風險。減少百分之四十能造成死亡。狀況之實例中惡病質扮演決定下列疾病結果的角色，包括現今多類的主要健康問題。類風濕性惡病質，類風濕性關節炎（RA)病患減少百分之13至15的BCM。三分之二的RA 病患具有惡病質，且此導致雨倍至五倍更高·的死亡率.。其他有關狀況包括類風濕性惡病質的肥胖及高細胞激素血症惡病質。癌症有關之惡病質顯著促成發病率及死亡率，也影響病患忍受可能地救命性治療的能力。由於活動素A在許多普’遍疾病扮演共同角色，他們全部具有高死亡率，因此技藝有長久需求用於預防或反轉疾病有關惡病質之組成物及方法。本文提供此等組成物及方法。【發明內容】在一方面，本發明提供一種單離之抗原結合蛋白質，含 200819466 • 有任一：a·—輕鏈CDR3，含有選自由下列所組群組之序列： i.一輕鏈CDR3序列，其與選自由L1-L14之輕鏈CDR3序列所組群組之CD R3序列差異不超過總計兩個胺基酸添加、取代、及/或刪除；η·Χ73 Q X74 X75 X76 X77 X78 X79 X8G; Hi· l QHNX8iYX82X83T;以及 iv· QAWDX84STX85X86; b.—重.鏈CD R3，含有選自由下列所組群組之序列：i·一重鏈 CDR3序列，其與選自由H1-H14之重鏈CDR3序列所組群組之CDR3序列差異不超過總計三個胺基酸添加、取代、及/ 或刪除；i i. Χ87 X88 X89 X90 X 9 1 X 9 2 X 9 3 X 9 4 F D Y 勢 · · * ，111 • X 9 5 X96 X97 Y X98 D X99 X10 0 G W X1〇i X102 X10 3 » i v. x 1 0 4 Xi 0 5 Xl〇6 Xl 0 7 X 1 0 8 X 1 0 9 Y X110 X 111 X 112 X 113 X 114 X 1 1 5 Xi 1 6 X117 X118 ;或c· (a)之輕鏈CDR3序列以及（b)之重鏈CDR3 序列；其中X73爲甲硫胺酸殘基，麩醯胺酸殘基，或精胺酸殘基，X74爲丙胺酸殘基，酪胺酸殘基，麩醯胺酸殘基，或絲胺酸殘基，X75爲白胺酸殘基，酪胺酸殘基，或天冬醯胺酸殘基.，X76爲麩醯胺酸殘基，絲胺酸殘基，或酥胺酸殘基， X77爲酥胺酸殘基，酪胺酸殘基，或異白胺酸殘基，X78爲脯胺酸殘基或絲胺酸殘基，X79爲半胱胺酸殘基，色胺酸殘基，白胺酸殘基，或脯胺酸殘基，X8Q爲絲胺酸殘基或酥胺酸殘基，x81爲酥胺酸殘基或絲胺酸殘基，x82爲脯胺酸殘基或酥胺酸殘基，x83爲苯丙胺酸殘基或色胺酸殘基，X84爲精胺酸殘基或絲胺酸殘基，X85爲纈胺酸殘基或丙胺酸殘基.，X8 6 爲纈胺酸殘基或沒有殘基，X87爲纈胺酸殘基或沒有殘基， X88爲麩醯胺酸殘基或沒有殘基，X89爲天冬胺酸殘基，色胺 -6· 200819466 酸殘基，或沒有殘基，X9Q爲絲胺酸殘基，白胺酸殘基，或沒有殘基，X9i爲異白胺酸殘基，麩胺酸殘基’或麩醯胺酸殘基，X92爲丙胺酸殘基，白胺酸殘基，或甘胺酸殘基，X93 爲丙胺酸殘基或白胺酸殘基，X94爲脯胺酸殘基’酪胺酸殘基，或甘胺酸殘基，X95爲天冬胺酸殘基或沒有殘基，X96 爲麩醯胺酸殘基或沒有殘基，X97爲天冬胺酸殘基或丙胺酸殘基，X98爲酪胺酸殘基或甘胺酸殘基，X99爲絲胺酸殘基或酪胺酸殘基，Xi 00爲絲胺酸殘基或精胺酸殘基，X1()1爲苯丙胺酸殘基或沒有殘基，Xi 02爲甘胺酸殘基或天冬胺酸殘基， Xi 03爲組胺酸殘基或脯胺酸殘基，X1()4爲甘胺酸殘基或沒有殘基，Xi 05爲絲胺酸殘基，麩胺酸殘基，或沒有殘基，Xi 06 爲精胺酸殘基，絲胺酸殘基，或沒有殘基，X1()7爲天冬胺酸殘基，天冬醯胺酸殘基，絲胺酸殘基，或麩醯胺酸殘基，Xi 08 爲絲胺酸殘基，精胺酸殘基，或色胺酸殘基，Xi 〇9爲甘胺酸殘基，天冬胺酸殘基，天冬醯胺酸殘基，酪胺酸殘基，或白胺酸殘基，Χηο爲絲胺酸殘基，甘胺酸殘基，天冬胺酸殘基，或沒有殘基，X i i i爲絲胺酸殘基，纈胺酸殘基，天冬醯胺酸殘基，或酪胺酸殘基，X112爲絲胺酸殘基，天冬醯胺酸殘基，酪胺酸殘基，或組胺酸殘基，X 1 1 3爲色胺酸殘基，酪胺酸殘基，或麩醯胺酸殘基，Xi Μ爲組胺酸殘基，天冬胺酸殘基，酪胺酸殘基，或沒有殘基’ X 1 1 5爲苯丙胺酸殘基，丙胺酸殘基，或甘胺酸殘基，Χ116爲天冬胺酸殘基，苯丙胺酸殘基，白胺酸殘基’或甲硫胺酸殘基，X i i 7爲酪胺酸殘基，或天冬胺酸殘基’ x 118爲異白胺酸殘基，纈胺酸殘基，或沒有殘基， 200819466 以及該抗原結合蛋白質專一結合人類活動素A。在另一方面，該單離之抗原結合蛋白質含有選自由下列所組群組之胺基酸序列：a·—輕鏈CDR1序列，其與L1-L14 之CDR1序列差異不超過總計六個胺基酸添加、取代、及/ 或刪除；b.—輕鏈CDR2序列，其與L1-L14之CDR2序列差異不超過總計兩個胺基酸添加、取代、及/或刪除；e. —輕鏈 CDR3序列，其與L1-L14之CDR3序列差異不超過總計三個胺基酸添加、取代、及/或刪除；d·—重鏈CDR1序列，其與 H1-H14之CDR1序列差異不超過總計兩個胺基酸添加、取代、及/或刪除；e.—重鏈CDR2序歹[]，其與H1-H14之CDR2 序列差異不超過總計五個胺基酸添加、取代、及/或刪除；以及f·一重鏈CDR3序列，其與H1-H14之CDR3序列差異不超過總計四個胺基酸添加、取代、及/或刪除。在另一方面，該單離之抗原結合蛋白質含有選自由下列所組群組;^胺基酸序列：a·—輕鏈CDR1序列，其與L1-L 14 之CDR1序列差異不超過總計五個胺基酸添加、取代、及/ 或刪除；b·—輕鏈CDR2序列，其與L1-L14之CDR2序列差異不超過總計一個胺基酸添加、取代、或刪除；c. 一輕鏈 CDR3序列，其與L1-L14之CDR3序列差異不超過總計兩個胺基酸添加、取代、及/或刪除；d · —重鏈C D R 1序列，其與 H1-H14之CDR1序列差異不超過總計一個胺基酸添加、取代、或刪除；e.—重鏈CDR2序列，其與H1-H14之CDR2 序列差異不超過總計四個胺基酸添加、取代、及/或刪除；以及f. 一重鏈CDR3序列，其與H1-H14之CDR3序列差異 200819466 不超過總計三個胺基酸添加、取代、及/或刪除。在另一方面，該單離之抗原結合蛋白質含有選自由下列所組群組之胺基酸序列：a·—輕鏈CDR1序列，其與L1-L14 之CDR 1序列差異不超過總計四個胺基酸添加、取代、及/ 或刪除；b — L1-L14之輕鏈CDR2 ; c.—輕鏈CDR3序列，其與L1-L14之CDR3序列差異不超過總計一個胺基酸添加、取代、或刪除；d·— H1-H14之重鏈CDR1序列；e.—重鏈CDR2序列，其與H1-H14之CDR2序列差異不超過總計三個胺基酸添加、取代、及/或刪除；以及f. 一重鏈CDR3 序列，其與H1-H1 4之CD R3序列差異不超過總計兩個胺基酸添加、取代、及/或刪除。又在另一方面，該單離之抗原結合蛋白質含有選自由下列所組群組之胺基酸序列：a.—輕鏈CDR1序列，其與L1-L14 之CDR 1序列差異不超過總計三個胺基酸添加、取代、及/ ’ 或刪除；b·— L1-L14之輕鏈CDR3序列；c.一重鏈CDR2序列，其與H1-H14之CDR2序列差異不超過總計兩個胺基酸添加、取代、及/或刪除；以及d.—重鏈CDR3序列，其與 H1-H14之CDR3序列差異不超過總計一個胺基酸添加、取代、或刪除。在另一方面，該單離之抗原結合蛋白質含有選自由下列所組群組之胺基酸序列：a·—輕鏈CDR1序列，其與L1-L14 之CDR1序列差異不超過總計兩個胺基酸添加、取代、及/ 或刪除；b·—重鏈CDR2序列，其與H1-H14之CDR2序列差異不超過總計一個胺基酸添加、取代、或刪除；以及e · -9- 200819466 一 HI-Η 14之重鏈CD R3序列。又在另一方面，該單離之抗原結合蛋白質含有選自由下列所組群組之胺基酸序列：a·—輕鏈CDR1序列，其與L1-L14 之CDR1序列差異不超過總計一個胺基酸添加、取代、或刪除；以及b.— Η14之重鏈CD R2序列。又在另一方面，該單離之抗原結合蛋白質含有一 L1-L14 之 CDR1 序歹[j。該單離之抗原結合蛋白質可含有選自由下列所組群組之序列：a.—輕鏈CDR1序列，選自由下列所組群組：i. (R/K)SSQS(L/I)L(H/Y)S(T/S)(G/N)(Y/N)(N/K)(-/K)YL(D/V) ；ii.RA(S/G)QGI(S/R)N(D/N)L-(V/G) ； iii. RASQSISNYLNT ；以及 iv. SG(D/E)K(L/W)G(D/E)K(F/Y)(A/V)(F/C); b·—輕鏈 CDR2 序列，選自由下列所組群組：i. (H/Q/L)D(T/N/S)KRPS ;以及 ii. X40 Χ4Γ S X42 X43 X44 S，其中X4〇爲丙胺酸殘基，色胺酸殘基，或白胺酸殘基，X41 爲酥胺酸殘基，丙胺酸殘基，或甘胺酸殘基，X42爲絲胺酸殘基，甲硫胺酸殘基，或苯丙胺酸殘基，X43爲白胺酸殘基或精胺酸殘基，X44爲麩醯胺酸殘基，麩胺酸殘基，或丙胺酸殘基；c.一重鏈 CDR1序列，選自由下列所組群組：i. GGS(I/F)(N/S)(S/A)(-/G)(-/G)(F/Y)YWS;ii, G X2 7 X2 8 F X29 X3〇 Y X31 X32 X33,其中X27爲酪胺酸殘基或苯丙胺酸殘基， X28爲酥胺酸殘基或絲胺酸殘基，X29爲酥胺酸殘基，絲胺酸殘基，或異白胺酸殘基，x30爲甘胺酸殘基或絲胺酸殘基， X3i爲酪胺酸殘基，甘胺酸殘基，或色胺酸殘基，x32爲異白 -10- 200819466 胺酸殘基或甲硫胺酸殘基，X33爲組胺酸殘基或甘胺酸殘基；以及 iii· G(Y/F)TF(T/S)-(S/A)Y(G/W)(L/M/I)(S/H); d. 一重鏈 CDR2 序列，選自由下列所組群組：i. (Y/E)I(S/Y/N)(Y/H)SG(S/G)T(Y/N)YNPSLK(S/R) ； ii. (V/N)I(K/W)(Y/Q)DGS(N/E/T)-(K/E)Y(H/Y)(A/V)DSVKG ；以及 iii· X60 I X 61 X62 X63 X64 X65 X66 T X67 X68 Χό9 X70 x71 X72 Q G，其中X6〇爲色胺酸殘基或異白胺酸殘基，χ61 爲天冬醯胺酸殘基，異白胺酸殘基，絲胺酸殘基，或酪胺酸殘基，X6 2爲脯胺酸殘基或丙胺酸殘基，X6 3爲天冬醯胺酸殘基，酪胺酸殘基，或甘胺酸殘基，x64爲絲胺酸殘基，天冬醯胺酸殘基，或天冬胺酸殘基，x65爲甘胺酸殘基或絲胺酸殘基’ X66爲甘胺酸殘基，天冬醯胺酸殘基，或天冬胺酸殘基’ X67爲天冬醯胺酸殘基或精胺酸殘基，χ68爲酪胺酸殘基或絲胺酸殘基’ X69爲丙胺酸殘基或絲胺酸殘基，X7G爲麩醯胺酸殘基或脯胺酸殘基，X7 i爲離胺酸殘基或絲胺酸殘基，以及Xu爲苯丙胺酸殘基或白胺酸殘基，其中圓括號所圍胺基酸殘基符號視爲序列中相同位置之替代殘基。在某@方面，該單離之抗原結合蛋白質含有一重鏈 CDR3序列’其與H1_H14之CDR3序列差異不超過總計兩個胺基酸添加 '取代、及/或刪除。在另-方面，該單離之抗原結合蛋白質含有一重鏈 CDR3序列’其與H1-H14之CDR3序列差異不超過總計一個胺基酸添加、取代、或刪除。〜方面，該單離之抗原結合蛋白質含有一 -11- 200819466 H1-H14之重鏈CDR3序列。在另一方面，該單離之抗原結合蛋白質含有兩胺基酸序列，選自由下列所組群組：a·—輕鏈CDR1序列，其與LI -L1 4 之CDR1序列差異不超過總計六個胺基酸添加、取代、及/ 或刪除；b·—輕鏈CDR2序列，其與L1-L14之CDR2序列差異不超過總計兩個胺基酸添加、取代、及/或刪除；c · 一輕鏈 CDR3序列’其與L1-L14之CDR3序列差異不超過總計三個胺基酸添加、取代、及/或刪除；d · —重鏈C D R 1序列，其與 Η 1 - Η 1 4之C D R 1序列差異不超過總計兩個胺基酸添加、取代、及/或刪除；e.—重鏈CDR2序列，其與Η1-Η14之CDR2 序列差異不超過總計五個胺基酸添加、取代、及/或刪除；以及f·一重鏈CDR3序列，其與H1-H14之CDR3序列差異不超過總計四個胺基酸添加、取代、及/或刪除。在另一方面，該單離之抗原結合蛋白質含有三胺基酸序列，選自由下列所組群組：a. —輕鏈C D R 1序列，其與L 1 - L 1 4 之CDR 1序列差異不超過總計六個胺基酸添加、取代、及/ 或刪除；b.—輕鏈CDR2序列，其與L1-L14之CDR2序列差異不超過總計兩個胺基酸添加、取代、及/或刪除；c. 一輕鏈 CDR3序列，其與L1-L14之CDR3序列差異不超過總計三個胺基酸添加、取代、及/或刪除；d·—重鏈CDR1序列，其與 H1-H14之CDR1序列差異不超過總計兩個胺基酸添加、取代、及/或刪除；e·—重鏈CDR2序列，其與H1-H14之CDR2 序列差異不超過總計五個胺基酸添加、取代、及/或刪除；以及f·一重鏈CDR3序列，其與H1-H14之CDR3序列差異 -12- 200819466 不超過總計四個胺基酸添加、取代、及/或刪除。在另一方面，該單離之抗原結合蛋白質含有四胺基酸序列，選自由下列所組群組：a · —輕鏈c D R 1序列，其與L 1 - L 1 4 之C D R 1序列差異不超過總計六個胺基酸添加、取代、及/ 或刪除；b·—輕鏈CDR2序列，其與L1-L14之CDR2序列差異不超過總計兩個胺基酸添加、取代、及/或刪除；c. 一輕鏈 CDR3序列’其與L1-L14之CDR3序列差異不超過總計三個胺基酸添加、取代、及/或刪除；d · —重鏈C D R 1序列，其與 H1-H14之CDR1序列差異不超過總計兩個胺基酸添加、取代、及/或刪除；e.—重鏈CDR2序列，其與H1-H14之CDR2 序列差異不超過總計五個胺基酸添加、取代、及/或刪除；以及f·一重鏈CDR3序列，其與H1-H14之CDR3序列差異不超過總計四個胺基酸添加、取代、及/或刪除。在另一方面，該單離之抗原結合蛋白質含有五胺基酸序列，選自由下列所組群組：a·—輕鏈CDR1序列，其與L1-L14 之CDR1序列差異不超過總計六個胺基酸·添加、取代、及/ 或刪除；b·—輕鏈CDR2序列，其與L1-L14之CDR2序列差異不超過總計兩個胺基酸添加、取代、及/或刪除；c. 一輕鏈 CDR3序列，其與L1-L14之CDR3序列差異不超過總計三個胺基酸添加、取代、及/或刪除；d·—重鏈CDR1序列，其與 H1-H14之CDR1序列差異不超過總計兩個胺基酸添加、取代、及/或刪除；e.—重鏈CDR2序列，其與H1-H14之CDR2 序列差異不超過總計五個胺基酸添加、取代、及/或刪除；以及f·一重鏈CDR3序列，其與H1-H14之CDR3序列差異 -13- 200819466 不超過總計四個胺基酸添加、取代、及/或刪除。又在另一方面’該單離之抗原結合蛋白質含有：a.一輕鏈CDR1序列’其與L1-L14之CDR1序列差異不超過總計六個胺基酸添加、取代、及/或刪除；b.—輕鏈CD R2序列，其與L1-L14之CDR2序列差異不超過總計兩個胺基酸添加、取代、及/或刪除；c · 一輕鏈C D R 3序列，其與L 1 - L 1 4 之CDR3序列差異不超過總計三個胺基酸添加、取代、及/ 或刪除；d · —重鏈C D R 1序列，其與Η 1 - Η 1 4之C D R 1序列差異不超過總計兩個胺基酸添加、取代、及/或刪除；e.—重鏈CDR2序列，其與H1-H14之CDR2序列差異不超過總計五個胺基酸添加、取代、及/或刪除；以及f.一重鏈CDR3 序列，其與H1-H14之CDR3序列差異不超過總計四個胺基酸添加、取代、及/或刪除。在另一方面，該單離之抗原結合蛋白質含有任一：a. 一輕鏈可變功能部位，含有：i. 一輕鏈C D R 1序列；i i. 一輕鏈CDR2序列；以及iii.一輕鏈CDR3序列；b.—重鏈可變功能部位，含有：i·一重鏈CDR1序列；ii.一重鏈CDR2序列；以及iii·一重鏈CDR3序列；或c· (a)之輕鏈可變功能部位及 (b)之重鏈可變功能部位。在一具體例中，該單離之抗原結合蛋白質含有一輕鏈可變功能部位及一重鏈可變功能部位之組合，其係選自由下列所組成之組合群組：L1H1，L2H2, L3H3, L4H4, L5H5, L6H6, L7H7， L8H8， L9H9， L10H10， L11H11， L12H12， L13H13 ，以及 L14H14。 -14- 200819466 在一具體例中，該單離之抗原結合蛋白質進一步含有： SEQIDNO: 84，100或108之κ輕鏈恆定序歹[|，及/或SEQ ID NO : 214，215或221之重鏈恆定序歹ij。在一具體例中，該單離之抗原結合蛋白質，當結合活動素A時：a ·抑制活動素A ; b ·與結合活動素A之關聯抗體交叉競爭；c·結合到如該關聯抗體之活動素A的相同抗原決定基；d·以如該關聯抗體之實質相同Kd結合活動素a ;或e. 以如該關聯抗體之實質相同脫落速率結合活動素A ;其中關聯抗體含有輕鏈及重鏈可變功能部位序列之組合，其係選自由下列所組成之組合群組：L 1 Η 1，L 2 Η 2，L 3 Η 3，L 4 Η 4，L 5 Η 5， L6H6，L7H7，L8H8，L9H9，L10H10，L11H11，L12H12， L13H13 ，以及 L14H14。在一具體例中，該單離之抗原結合蛋白質結合到人類活動素Α時，可抑制活動素Α結合到人類活動素Α受器（activiη A receptor);於忍受結腸腫瘤之小鼠減弱惡病質；於忍受結腸腫瘤之小鼠改善體重的減少；於膠原誘發之類風濕性關節炎動物模式中改善體重的減少；於膠原誘發之類風濕性關節炎動物模式中改善肌肉質量的損失；於膠原誘發之類風濕性關節炎動物模式中改善脂肪質量的損失；及/或於AAV-活動素A轉染之動物模式中改善體重的減少。在一方面’單離之抗原結合蛋白質含有：a.人類抗體； b.人類化抗體；c·嵌合型抗體；d.單株抗體；e·多株抗體；f. a 重組抗體；g·抗原結合抗體片段；h.單鏈抗體；i.雙鏈抗體 (diabody) ; j·三鏈抗體（triabody) ; k·四鏈抗體（tetrabody); -15- 200819466 1· Fab片段；m· F(ab’）2片段；η·功能部位抗體；〇· IgD抗體； p. IgE 抗體；q· IgM 抗體；r. IgGl 抗體；s· IgG2 抗體；t. IgG3 抗體；u. IgG4抗體；或v.具有至少一突變於樞紐區（hinge region)以緩和形成內部-Η鏈二硫鍵傾向之IgG4抗體。也提供一種專一於活動素A之人類抗原結合蛋白質，其中該抗原結合蛋白質具有人類抗-活動素A抗體之至少一活體內生物活性；例如惡病質之減弱。進一步提供一種人類抗原結合蛋白質，能於忍受結腸腫瘤之小鼠改善體重的減少，或於膠原誘發之類風濕性關節炎動物模式中改善體重的減少。也提供一種人類抗原結合蛋白質，能於膠原誘發之類風濕性關節炎動物模式中改善肌肉質量的損失，於膠原誘發之類風濕性關節炎動物模式中改善脂肪質量的損失或於AAV-活動素A轉染之動物模式中改善體重的減少。進一步提供一種專一於活動素A之人類抗原結合蛋白質，其中該抗原結合蛋白於活體外…抑制活動素A與活動素A受器之結合。也提供一種專一於活動素A之人類抗原結合蛋白質，其中該抗原結合蛋白於活體內抑制活動素A與活動素A受器之結合。在另一方面，提供一種單離之多核苷酸，含有編碼輕鏈、重鏈或本發明之兩抗原結合蛋白之序列；該多核苷酸可含有 SEQIDNO: 1，17，33，49，65，81，97，113，129, 145，161，177，19 3或209之輕鏈可變功能部位核酸序列及 -16- 200819466 /或 SEQ ID NO : 2，1 8，34，50，66，82，98，114，130， 146，162，178，194或210之重鏈可變功能部位核酸序列。也提供一種含有單離之多核苷酸之質體；該質體可爲表現載體；以及提供一種含有該多核苷酸之單離之細胞；該單離之細胞可爲融合瘤，以及該細胞可爲CHO細胞。進一步提供爲一種製造結合人類活動素A之抗原結合蛋白之方法，包括在使其表現該抗原結合蛋白之條件下培育該單離之細胞。也提供一種含有本發明抗原結合蛋白之醫藥組成物，一種在患者治療疾病之方法，包括對患者投與該醫藥組成物，其中經由降低患者之活動素A活性可治療該疾病；患者可爲人類，以及疾病可爲與腫瘤有關之惡病質，其中腫瘤爲性腺腫瘤例如卵巢癌，良性攝護腺肥大，前列腺上皮內贅瘤 (prostate intraepithelial neoplasj a)或前列腺癌；或其中腫瘤爲膀胱癌，威爾姆氏腫瘤（Wilm’s tumor)，胰臟癌，乳癌，骨癌，肺癌，結腸直腸癌，子宮頸癌，滑膜肉瘤（synovial sarcoma)，血管活性腸胜類分泌腫瘤（vasoactive intestinal peptide secreting tumors)，神經膠母細胞瘤（glioblastoma)，神經管母細胞瘤（medulloblastoma)，頭頸部上皮細胞癌（head and neck squamous cell cancer) » 口腔癌，口腔白斑症（oral leukoplakia)，肛門癌，食道癌，胃癌，骨癌，或轉移癌；該疾病可爲與類風濕性關節炎有關之惡病質；或該疾病可爲需要於患者減少活動素A活性。在另一方面，本發明提供一種保持患者肌肉質量之方 -17- 200819466 法，包括對該患者投與該醫藥組成物。在另一方面，本發明提供一種於有其需要之患者減少活動素A活性之方法，包括對該患者投與該醫藥組成物。在另一方面，本發明提供一種能於活體外或活體內專一結合活動素A胺基酸K13 — Y39之抗體。在另一方面，本發明提供一種能於活體外或活體內專一結合胺基酸 V82 — N107之抗體。發明之詳細說明本發明是關於包含經抗體（其亦結合至全長活動素A)辨認之半胱胺酸結功能部位之人類活動素A之區域，及/或重疊或包含活動素A半胱胺酸結區域之活動素之區域，以及製造及使用這些半胱胺酸結功能部位之方法。本發明也提供抗原結合劑，包括.專一結合活動素A或部分活動素A之抗體，以及使用此等結合劑之方法。該結合劑可用於阻礙或損害人類活動素A與一個或一個以上配體（ligand)結合。充血性心臟衰竭（CHF)的死亡率與惡病質有關。在一硏究中（Anker，S· D. and Coats，A· J.，Chest 115 : 836-847， 1 9 9 9) ’未篩選之C H F門診病患族群中百分之十六是惡病質的。此狀態預言出預後能力的減弱，不論年齢，功能性疾病分類，左心室射出分率（left ventricular ejection fraction)以及最大氧消耗。惡病質族群在18個月的死亡率是百分之五十。癌症、類風濕性關節炎、慢性腎衰竭、充血性心衰竭及惡病質是一因子之其他症狀之疾病進展的一共同途徑是活 -18- 200819466 動素A途徑。肌肉消耗及軟弱常見於許多疾病狀態及症狀，包括老化，癌症惡病質，毒血症，無神經支配（denervation)，廢棄（disuse)，不活動，燒傷，HIV-後天免疫不全症候群 (AIDS)，慢性腎或心衰竭，卸載重/微重力 (unloading/micro gravity)，以及肌肉失養症（muscular dystrophies)。活動素（Activins)及抑制素（inhibins)是 TGF-β 超級家族的成員。活動素及抑制素分別作用爲腦下垂體濾泡刺激素（FSH)分泌及生物合成的刺激劑及抑制劑。活動素a 是活動素的主要型。在生殖生物學中，活動素及抑制素是卵巢週期及排卵過程的重要調節劑，並可在胚胎植入及/或維持懷孕扮演扮角色。（O’ Connor et al·，i/wmanV. 14, No. 3, 827-832, March 1999; Draper et al.? Endocrin., V. 138, No. 7: 3042-3046;

Jones，et al” V· 147, No· 2: 724-732, Feb· 2006)。在廣泛各種組織中確認出抑制素及活動素，代表這些因子比FSH分泌的調控扮演更重要角色。活動素與兩結構相關種類之絲胺酸/酥胺酸激酶受器（I 型及II型）交互作用。抑制素可拮抗活動素，其係經由結合到蛋白多糖、β多糖並與之形成穩定複合物而藉此隔離π型活動素受器同時排除I型受器。活動素以兩種主要形式存在：活動素Α是βΑ-次單元之同質二聚體以及活動素8是βΒ_ 次單元之同質二聚體。（Vale，et al·，Pag V· 44: 1-34，1988)。不同於任一 β_次單元之a_次單元t的異質二聚體造成功能性拮抗物抑制素。文獻已顯示活動素A過度表現及/或局部化於癌症組 -19- 200819466 織。舉例而言，有子宮內膜及子宮頸癌的女性可見到高含量的血清活動素（Petraglia，F. et al·，hwr· C7in·五wdocrin. MeiW. 83: 1194-1200，1998)。活動素A過度表現於結腸直腸癌第期 IV(Wildi，S. et al.，Gt^ 49 : 409-4 1 7，200 1 )。已發表活動素A在卵巢癌的角色（Steller，M.D· W d.，Mo/. C α n c e r i? e s . 3 : 5 0 · 6 1，2 0 0 5 ) o 文獻也指出活動素A於腎臟疾病（Yamashita，S· MW/. J· jm. 5^c· A/^p/zro/· 15: 91-101，2004·)。正常對象及具疾病之病患中血清免疫反應性活動素 A之含量已發表於 Harada， K. e t a l. in J · Clin. Endocrin. and Me t a b. 81 · 2 1 25-2 1 3 0，1 996。活動素A是腎間質纖維母細胞之一有效活化劑（Harada，K. a/·，/. Jm. Soc. iVepAro/· 15: 91-101， 20 04)。腎絲球活動素A過度表現與抗-Thy 1腎絲球腎炎之纖維化有關（Gaedeke，J · e t al.，Neph. Dial· Tr an s p l. 20 · 319-328， 2005) 〇心臟衰竭病患之血清活動素A含量依據疾病嚴重度增力口（Yndestal et al. ， Circulation 109： 1 3 79- 1 3 8 5 ， 2004)。在心臟衰竭之大鼠模式中，心肌梗塞後血清活動素A立即提高並持續6個月，且活動素A之免疫染色法僅定位於心肌細包 (Yndestad et al·，2004)。已發表活動素A含量於心臟衰竭中提高（Yndestad，A. ei a/、Cz·πon 70P·· 1379-1385， 2004)°

本發明提供有關結合至活動素Α之分子的組成物、套組及方法，包括激化（agonize)或拮抗（antagonize)活動素 A -20- 200819466 之分子，例如抗-活動素A抗體、抗體片段、及抗體衍生物，例如拮抗性抗-活動素A抗體、抗體片段、或抗體衍生物。也提供有關專一結合至部分活動素A之分子的組成物、套組及方法，例如活動素 A的胺基酸 R13-Y39或胺基酸 V8 2-N 107。此等分子可包括抗體、抗體片段、及抗體衍生物。也提供核酸及前衍生物和片段，包括編碼結合至活動素A之全部或部分多肽的核苷酸序列，例如編碼全部或部分抗-活動素A抗體、抗體片段、抗體變異體、或抗體衍生物之核酸， ' 含有此等核酸之質體及載體，以及含有此等核酸及/或載體及質體之細胞或細胞系。提供之方法包括，例如製造、鑑定或單離結合至活動素A之分子（例如抗-活動素A抗體）之方法，測定一分子是否結合至活動素A之方法，製造組成物（例如醫藥組成物，含有結合至活動素A之分子）之方法，以及投與結合活動素A之分子至患者之方法，例如治療活動素a 仲介之疾病以及在活體內或活體外調制活動素A生物活性之方法。多核苷酸及多肽序列是使用標準一-或三-字母縮寫表不。除非其他指不，多肽序列具有其胺基末端在左邊及其竣基末端在右邊，以及單股核酸序列雙股核酸序列的上方股具有其5’末端在左邊及其3’末端在右邊。特殊的多肽或多核苷酸序列也能經由解釋其如何異於參考序列來說明。除非其他指示，需瞭解多核苷酸及多肽序列分別包括所列之每一核酸或胺基酸，以及插入之核酸或胺基酸。舉例而言，多肽序列R13-Y39提出包括胺基酸R13及Y39之多肽序列，以及 -21- 200819466 多肽序列中r 1 3及Υ 3 9間存在之胺基酸。相同地，多核苷酸序列C 1 一 Τ 5提出包括核酸C 1及Τ 5，以及該序列位置2，3 及4核酸之多核苷酸序列。因此，SEQ ID NO : 1—5之命名同樣地表明包括 SEQ ID NO: 1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO: 3，SEQ ID NO : 4及SEQ ID NO : 5在內之群組。最後除非其他指定，胺基酸群組也意指包括在內。舉例而言’ “SEQ ID NO : 28之胺基酸1-5 ”一詞包括SEQ ID NO : 28位置1，2， 3，4及5之胺基酸。特殊輕鏈及重鏈可變功能部位之多核苷酸及多肽序列示於下。.含有一輕鏈及重鏈之抗體是組合輕鏈名稱及重鏈可變功能部位名稱來命名。例如“L4H7”是指含有輕鏈可變功能部位L4及重鏈可變功能部位H7之抗體。 κ輕鏈恆定序列示於SEQ ID NO : 84，100及108，以及重鏈恆定序列示於SEQ ID NO : 214，215及221。編碼這些序列之多核苷酸分別示於SEQ ID NO : 222，223及239 (輕鏈），以及分別於SEQ ID NO : 240，241及242(重鏈）。如此除文中揭示之可變序列以外，抗體能含有SEQ ID NO : 84 及 214;或 SEQIDNO: 215 及 223;或 SEQIDNO: 108 及 221之一或二者。在其他具體例中，抗體可含有一專一重鏈或輕鏈，而互補的輕鏈或重鏈可變功能部位仍未特別指定。特別在文中某些具體例包括經由專一輕鏈或重鏈結合專一抗原（例如活動素A)之抗體，以致互補的重鏈或輕鏈可爲隨機或甚至無關係，但可由例如篩選組合的資料庫決定。Portolano et al.， -22- 200819466 J. Immunol. V. 15 0 (3)，pp. 8 8 0-8 8 7 ( 1 993 ) ； Clackson e t al.，Nature v. 3 5 2 p p. 6 2 4-628 (1 99 1 ) o 除非文中其他定義，有關本發明之科學及技術用語之意義將爲所屬技術領域具有一般知識者通常可瞭解者。再者，除非上下文中需要，單數用語將包括複數以及複數用語經包括單數。通常文中所述細胞及組織培養，分子生物學，免疫學，微生物學，遺傳學及蛋白質及核酸化學與雜化作用 (hybridization)有關聯及技術之命名所屬技術領域熟知且常用者。除非其他指示，本發明之方法及技術通常根據所屬技術領域熟知的慣用方法實施，例如敘於本說明從頭到尾所引用及討論的各種一般及更專一的參考資料。例如參閱 Sambrook et al. Molecular Cloning ^ A Laboratory Manual» 2d ed.» Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y. (1989)以及 Ausubel d al·，Current Protocols in Molecular Biology y Greene Publishing Associates (1992)，以及 Harlow and Lane Antibodies ·· A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y. (1990)，其倂入本文參考。酵素反應及純化技術是根據製造商的說明書實施，就如常完成於技藝或如文中所述一樣。文中所述實驗室程序及分析化學、合成有機化學、及藥學和醫藥化學之技術有關所用之術語爲所屬技術領域熟知且常用者。標準技術能用於化學合成，化學分析，醫藥製備，配方，及傳送，以及病患的治療。除非其他指示，將理解下列用語具有下列意義：用語“單離之分子”（其中該分子例如是一多肽，多核苷 -23- 200819466 酸或抗體）是由於其出處的起源（origin)或根源（source)之分子：（1)與附有其天然狀態之天然相關的成分無牽連，（2)實質上不含來自相同物種之其他分子，（3)經由不同物種的細胞表現’或（4)不出現於自然。因此，化學合成或在不同於其自然產生之細胞的細胞系統中合成之分子，將是“單離，，自其天然相關的成分。分子亦可使用技藝熟知的純化技術單離成爲實質上無天然相關的成分。分子純度或同質性可以許多技藝熟知的方法分析。舉例而言，多肽樣品的純度可使用技藝熟知的技術使用聚丙烯醯胺凝膠電泳分析並染色凝膠以看見多肽。爲此目的，使用HP LC或技藝熟知用於純化的其他方法可得到較高解析度。用語“活動素A抑制劑”及“活動素A拮抗劑”可交互使用。每一分子爲可察覺地抑制活動素A至少一功能。因此， “活動素A激動劑”是一分子可察覺地增加活動素A至少一功能。活動素A抑制劑引起之抑制不需完全，只要使用分析可偵測即可。能使用活動素A功能的任何分析，本文中提供其實例。能由活動素A抑制劑抑制，或由活動素A激動劑增加活動素A功能的實例包括結合至活動素A。活動素A抑制劑及活動素A激動劑之類型實例，包括但不限爲活動素A 結合多肽，例如抗原結合蛋白（例如活動素A抑制抗原結合蛋白），抗體，抗體片段以及抗體衍生物。用語“胜肽”、“多肽”及“蛋白質”各指含有兩個或兩個以上胺基酸殘基以胜肽鍵彼此連結之分子。這些用語包含例如天然及人造蛋白質，蛋白質片段及蛋白質序列的多肽類似物 -24- 200819466 (例如突變蛋白，變異體，以及接合蛋白（fusion protein))，以及轉譯後或其他共價或非共價、經修飾蛋白質。胜肽、多肽或蛋白質可爲單體或多體。文中使用之用語“多肽片段”是指相較於對應之全長蛋白質，具有胺基末端及/或羧基末端刪除之多肽。片段例如能爲至少 5， 6， 7， 8， 9， 10， 11， 12， 13， 14， 15， 20， 50，70，80，90，100，150或200個胺基酸長度。片段也能爲仿 U 如至多 1，000， 750， 500， 250， 200， 175， 150， 125， 100，90，80，70，60，50，40，30，20，15，14，13，12， 11，或10個胺基酸長度。片段能進一步在其一或兩末端含有一個或一個以上額外的胺基酸，例如來自不同天然存在之蛋白質（例如Fc或白胺酸拉鍊結_ (leucine zipper)功能部位）或人造胺基酸序列（例如人造連接體序列（artificial linker sequence))之胺基酸序列。本發明之多肽包括已於任何方式及爲任何理由經修飾之多肽，例如以期：（1)降低對蛋白水解的感受性，（2)降低 " 對氧化的感受性，（3)改變對形成之蛋白質複合體的結合親和力，（4)改變結合親和力，以及（4)給予或修飾其他物理化學或功能性特性。類似物包括多肽的突變蛋白。舉例而言，單一或多胺基酸取代（例如，保留性胺基酸取代）可製作於天然存在之序列（例如，在形成分子間接觸之功能部位外側之部分多肽）。“保留性胺基酸取代，，是沒有實質改變親代序列的結構特徵（例如，置換的胺基酸應不易毀壞存在於親代序列的螺旋，或瓦解親代序列特徵或其功能性所需之其他種二 -25- 200819466 級構）。技藝辯認多肽二級及三級之實例敘述於Proteins， Structures and Molecular Principles(Creighton5 Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze，eds·，Garland Publishing，New York，N.Y. (1991));以及 Thornton a/· Nature 354:105 (1991)，這些皆倂入本文參考。多肽之“變異體”（例如抗體）含有胺基酸序列中一個或一個以上胺基酸殘基是插入、刪除自及/或取代進入相對於天然多肽序列的胺基酸序列，且必需保留相同如天然多肽的生物活性。該多肽的生物活性能使用技藝之標準技術測量 (舉例而言，如果變異體是一抗體，其活性可經由如文中所述之結合分析來測試）。本發明之變異體包括片段，類似物，重組多肽，合成多肽，及/或接合蛋白。多肽之“衍生物”是已經過化學修飾，例如經由接合到另一化學部分（moiety)如聚乙二醇、白蛋白（例如人類血清白蛋白）、磷酸化及糖化之多肽（例如抗體）。除非其他指示，用語“抗體”除含有兩全長重鏈及兩全長輕鏈之抗體以外，包括其衍生物、變異體、片段及突變蛋白，其實例敘述於下。 “抗原結合蛋白”是一種蛋白質，含有結合至抗原的一部分以及可有一支架（scaffold)或骨架（framework)部分能使抗原結合部分採取促進該抗原結合蛋白結合至抗原之構形。抗原結合蛋白之實例包括抗體、抗體片段（例如，抗體之抗原結合部分）、抗體衍生物及抗體類似物。該抗原結合蛋白能含有，例如另一蛋白質支架或具有移植之CD Rs或CDR衍生物之人造支架。此等支架包括但不限爲衍生自抗體之支架 -26- 200819466 (含有突變導入例如以穩定該抗原結合蛋白三維結構）以及完全合成之支架（含有例如一生物可容性聚合物）。例如參閱 Korndorfer et al.，2003，Proteins: Structure，Function，and Bioinformatics, Volume 53, Issue 1:121-129; Roque et al.5 2004, Biotechnol. Prog^ 20:639-654。此外，能使用胜肽抗體擬態物（“PAMs”），以及依 .據抗體擬、態物利用纖維網蛋白成分作爲支架之支架。抗原結合蛋白能具有，例如天然存在之免疫球蛋白的結構。“免疫球蛋白”是四聚體分子。天然存在之免疫球蛋白中，每一四聚體由相同兩對多肽鏈所組成，每對具有一“輕鏈”（約2 5 kDa)及一 “重鏈”（約5 0-70 kDa)。每一鏈的胺基末端部分包括一個約1 〇〇至1 1 〇或以上胺基酸之主要負責抗原辨認之可變區域（可變區域）。每一鏈之羧基末端部分定義爲主要負責效應功能之恆定區域（恆定區域）*人類輕鏈分類爲 κ及λ輕鏈。重鏈分類爲μ、d、γ、a、或e，並分別定義爲抗體之同型物IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。輕鏈及重鏈中，可變及恆定區域是經由約1 2個或以上之胺基酸的“J”區域連結，以及重鏈也包括約10個或以上之胺基酸之“D”區域。槪括而言參閱 Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul，W·，ed. ’ 2nd ed. Raven Press，N.Y· (1989))(實際上其完全倂入參考）。每一輕鏈/重鏈對之可變區域形成抗體結合位置，以致一完整的免疫球蛋白具有兩個結合位置。天然存在之免疫球蛋白鏈展覌以三個高可變區域（也稱爲互補決定區域或CDR)連結之相當保留之骨架區域（FR)的相同一般構造。從N-末端至C-末端，輕鏈及重鏈二者皆含 -27- 200819466 有功能部位 FRl，CDRl，FR2，CDR2，FR3，CDR3 及 FR4。胺基酸對每一功能部位之分配是依據Kabat等人之定義，於 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.5 US Dept, of Health and Human Services，PHS，NIH，NIH Publication no. 91-3242，1991 o 除非其他具體指定，“抗體”是指一完整的免疫球蛋白或其抗原結合部分可與完整抗體競爭專一結合。抗原結合蛋白可由重組DNA技術或酵素或化學裂解完整抗體來製造。抗原結合蛋白包括，特別是Fab，Fab’，F(ab’）2，Fv，功能部位抗體（dAbs)，以及互補決定區域（CDR)片段，單鏈抗體 (scFv)，嵌合型抗體，雙鏈抗體（diabodies)，三鏈抗體 (triabodies)，四鏈抗體（tetrabodies)以及多肽，其至少含有足以賦予專一抗原結合至多肽之一部分免疫球蛋白。

Fab片段是具有VL，VH，Cl及CH1功能部位之單價片段；F(ab’）2片段是具有兩Fab片段在樞紐區以二硫橋連接之二價片段；Fd片段具有VH及CH1功能部位；Fv片段具有抗體單臂之VL及VH功能部位；以及dAb片段具有VH功能部位，V L功能部位，或V Η或V L功能部位之抗原結合片段（美國專利第6,846,634，6,696,245諕，美國專利申請案公開號 05/0202512 ， 04/0202995 ， 04/0038291 ， 04/0009507 ， 03 /003 995 8，Ward et al. ? Nature 341 * 544-546，1 989) 〇單鏈抗體（scFv)是抗體中VL及VH區域透過連接體（例如’胺基酸殘基之合成序列）連結以形成連續蛋白質鏈，其中連接體是長度足夠使蛋白質鏈在其本身摺疊返回必形成單價抗原結合位置（參閱例如 Bird M cz/·，1 98 8，Science -28- 200819466 242* 423-26 and Huston et aL^ 1 98 8» Proc. Natl. Acad. Sci · USA 85: 5879-83)。雙鏈抗體（diabo dies)是含有兩多肽鏈之

二價抗體，其中每一多肽鏈含有連接體連結之VH及Vl功能部位，由於連接體太短以致兩功能部位之間無法在相同鏈上配對，如此使每一功能部位與另一多肽鏈上互補的功能部位配對（參閱，例如 Holliger e，α/.，1993，Prac· Wi/. 5c/· USA 90:6444-48, and Poljak W a/.，1994, 2:1121-23)。如果雙鏈抗體 (diabody)的兩多肽鏈是一樣的，則其配對產生之雙鏈抗體 (diabody)將具有兩個相同抗原結合位置。具有不同序列之多肽鏈能用於製造具有兩不同抗原結合位置之雙鏈抗體 (diabody)。同樣地，三鏈抗體（tribodies)及四鏈抗體 (tetrabodies)分別爲含有三個及四個多肽鏈之抗體，且分別形成三個及四個抗原結合位置，其能爲相同或不同。所提供抗體之互補決定區域（CDR)及骨架區域（FR)可使用 Kab at 等人於 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.， US Dept, of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no. 91-3242，1991所述之系統鑑定。一個或一個以上CDR可共價或非共價倂入分子中以製造一抗原結合蛋白。抗原結合蛋白可倂入CDR(s)作爲較大多肽鏈的一部分，可共價連接cdr(s) 到另一多肽鏈，或可非共價倂入CD R(s)。CD Rs容許該抗原結合蛋白專一結合感興趣的特殊抗原。抗原結合蛋白可具有一個或一個以上結合位置。若有一個以上結合位置，則結合位置可彼此一樣或可不同。舉例而 s ’天然存在之人類免疫球蛋白典型具有兩個一樣的結合位 •29· 200819466 置，然而“雙專一性（bispecific)”或“雙功能（bifunctional)”抗體具有兩個不同的結合位置。用語“人類抗體”亦稱爲“完全人類抗體”包括具有一個或一個以上衍生自人類免疫球蛋白序列之可變及恆定區域之全部抗體。在一具體例中，全部的可變及恆定功能部位是衍生自人類免疫球蛋白序列（一完全人類抗體）。這些抗體可以各種方法製備，其實例敘述如下，包括透過以感興趣的抗 •原免疫小鼠，該小鼠經基因修飾以表現衍生自編碼人類重鏈及/或輕鏈基因之抗體。人類化抗體具有序列以一個或一個以上胺基酸取代、刪除及/或添加不同於衍生自非人類物種之抗體序列，以致當將其投與人類患者時，相較於非人類物種抗體，該人類化抗體較不可能引起免疫反應及/或引起較不嚴重的免疫反應。在一具體例中，非人類物種抗體之重鏈及/或輕鏈骨架及恆定功能部位中某些胺基酸經突變以產生人類化抗體。在另一具體例中，來自人類抗體的恆定功能部位是接合到非人類物種的可變功能部位。在另一具體例中，非人類抗體之一個或一個以上CDR序列中一個或一個以上胺基酸殘基是經改變，當將其投與人類患者時以降低可能的非人類抗體免疫原性，其中經改變胺基酸殘基並非抗體免疫專一結合至其抗原之關鍵者，或對該胺基酸序列所做的改變是保留性改變，以致人類化抗體結合至抗原沒有比非人類抗體結合至該抗原顯著惡化。如何製作人類化抗體之實例可見於美國專利第 6,054,297，5,886，152 及 5,877,293 號。 -30- 200819466 用語“嵌合型抗體，，是指含有一個或一個以上區域來自一抗體以及一個或一個以上區域來自一個或一個以上其他抗體之抗體。在一具體例中，一個或一個以上CDR是衍生自人類抗-活動素A抗體。在另一具體例中，全部cDR是衍生自人類ί几-活動素A抗體。在另一具體例中，來自一個以上人類抗-活動素A抗體之CDR是混合及相配於嵌合型抗體。例如’嵌合型抗體可含有來自第一人類抗-活動素A抗體輕鏈之CDR1，來自第二人類抗-活動素A抗體輕鏈之 CDR2及CDR3，以及來自第三抗-活動素a抗體重鏈之 CD R。再者，骨架區域可衍生自相同抗—活動素a抗體之一、一個或一個以上不同抗體（例如人類抗體）、或人類化抗體。在嵌合型抗體之一實例中，重鏈及/或輕鏈之一部分是一樣於、同源於（homologous)、或衍生自來自特殊物種之抗體或屬於特殊物種之抗體類型或亞型，而剩餘鏈是一樣於、同源於、或衍生自來自另一物種之抗體或屬於另一抗體類型或亞型。所包括亦爲展現所欲生物活性之此等抗體的片段（亦即能專一結合活動素A)。抗體之片段或類似物能經由所屬領域具有通常知識者依照本說明之教示及使用技藝熟知之技術輕易製備。較佳片段或類似物之胺基-及羧基-末端出現在靠近功能性功能部位的邊界。結構性及功能性功能部位能經由比對核苷酸及/ 或胺基酸序列數據與公用或私有之序列資料庫來鑑定之。電腦化之比對方法能用於鑑定出現在其他蛋白質已知結構及/ 或功能之序列模體（motif)或預料之蛋白質構形功能部位。摺 -31- 200819466 疊爲已知三維結構之蛋白質序列的鑑定方法是已知的。參閱，例如 Bowie et al. » 1991，Science 253 ： 164。此外，抗原專一性（亦即活動素A專一性）抗體能由技藝已知之方法經由使用專一性VL或VH功能部位篩選互補之可變功能部位資料庫來製造。製造抗體之此等方法爲已知技藝。舉例而言，抗體片段接合到另一蛋白質（例如次要外殼蛋白質）能用於藉抗原而增進噬菌體。然後使用抗原（例如活動素A)免疫小鼠之重新排列之重鏈（VH)及輕鏈（VL)的隨機組合之資·料庫，抗體片段的各種資料庫顯現在噬菌體表面。這些資料庫能用於篩選互補性可變功能部位，且該功能部位經由例如親和力管柱純化。參閱C1 a c k s ο n e t a 1.，# a〖w r e， V. 352 pp. 624-628 (1991) 〇在另一實例中，抗體（亦即活動素A抗體）之個別VL或 VH鏈能用於搜查可能形成抗原結合片段（或Fab)、具相同專一性之其他VH或VL鏈。因此，VH及VL鏈Ig基因之隨機組合能以抗原結合片段表現於細菌噬菌體資料庫（例如fd或 λ噬菌體）。例如組合的資料庫可利用親代VL或VH鏈資料庫分別組合抗原結合專一 VL或VH鏈資料庫來產生。然後可以慣用技術篩選組合的資料庫，例如經由使用放射性標記之探針（例如放射性標記之活動素Α)。參閱，例如P〇rt〇lan〇 et al·，J. Immunol. V. 150 (3) pp. 8 8 0 - 8 8 7 (1 9 9 3 )。 “CDR移植之抗體”是一抗體含有一個或一個以上衍生自特殊物種或同型物抗體之C D R以及相同或不同物種或同型物之另一抗體的骨架。 -32- 200819466 “多專一性抗體”是一抗體，可辨認一個或一個以上抗原上之一個以上抗原決定基。此型抗體之亞型是一“雙專一性抗體”，可辨認相同或不同抗原上之兩不同的抗原決定基。 “抗原結合功能部位”、“抗原結合區域，，或“抗原結合位置”是抗原結合蛋白的一部分，含有與抗原交互作用及提供該抗原結合蛋白專一性與對抗原之親和力的胺基酸殘基（或其他部分）。對於專一結合至其抗原之抗體，此將包括至少其CDR功能部位之一中至少一部分。 “抗原決定基”是一分子經由抗原結合蛋白（例如經由抗體）結合之部分。抗原決定基能含有分子之非連續部分（例如在一多肽中，胺基酸殘基在多肽一級序列中不連續，但在整個多肽的三級和四級結構中接近到足以彼此經由抗原結合蛋白結合），以及包括所列之末端序列胺基酸。舉例而言，多肽序列R13 — Y39包括胺基酸R13及Y39,以及序列中R13 與Y39間存在之胺基酸。在一具體例中分子的抗原決定基含有非連續部分，因此序列將註明。兩多核苷酸或兩多肽序列之“同一性百分比”是使用 GAP 電腦程式（GCG Wisconsin Package » version 10.3 (Accelrys，San Diego，CA)之一部分），使用其預設參數經由比對序列來決定。用語“多核苷酸，，、“寡核苷酸”及“核酸”在全文可交互使用且包括DNA分子（例如cDNA或基因體DNA)，RNA分子 (例如mRNA)，使用核苷酸類似物（例如，胜肽核酸及非天然存在之核苷酸類似物）所產生之DNA或RNA的類似物，及其 -33- 200819466 雜化物（hybrids)。核酸分子能爲單股或雙股。在一具體例中，本發明之核酸分子含有編碼本發明抗體或其片段、衍生物、突變蛋白或變異體之連續的開放譯讀架（open reading fr am e) 〇如果兩單股多核苷酸的序列在平行反方向能對齊 (aligned)以致一多核苷酸中每一核苷酸在另一多核苷酸之互補核苷酸對面，無間隔導入且在任一序列的5 ’或3 ’末端無未配對核苷酸，則兩單股多核苷酸是彼此“互補”。若兩多核苷酸在中度嚴格條件下（m〇derately stringent conditions) 能雜化到另一者，則一多核苷酸是“互補”於另一多核苷酸。因此，一多核苷酸能互補於另一多核苷酸而非其互補體。 “載體”是一核酸能用於將其連接的另一核酸導入細胞。載體之一類型是“質體”，其是指一線型或環型雙股DNA 分子，額外的核酸節段能連接（ligate)於其中。載體的另一類型是病毒載體（例如複製缺陷反轉錄病毒（replication defective retroviruses)，腺病毒以及腺相關病毒 (adeno-associated viruses))，其中額外的DNA節段能導入病毒基因體中。某些載體能於其所導入之宿主細胞中自主複製 (例如，含有細菌的複製起點之細菌載體以及附加型哺乳動物細胞載體（ePisomal mammalian vectors))。其他載體（例如非附加型晡乳動物細胞載體）隨導入宿主細胞時整合到宿主細胞的基因體，並藉此隨宿主基因體複製。“表現載體”是載體的一種，能指揮所選多核苷酸的表現。核音酸序列·是“可操作地連接（Op erably linked)”到一調 -34- 200819466 節序列，若該調節序列影響該核苷酸序列的表現（例如表現的程度、時點或位置）。“調節序列”是一核酸能影響對其可操作地連接之核酸的表現（例如表現的程度、時點或位置）。調節序列，例如能直接在所調節之核酸發揮其作用，或透過一個或一個以上其他分子的作用（例如，結合至調節序列及/ 或核酸之多肽）。調節序列之實例包括啓動子（p r 〇 m 〇 t e r)，增強子（enhancer)及其他表現控制要素（例如，聚腺苷酸化作用訊息）。進一步之調節序列實例敘述於例如Goeddel，1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA and Baron a/·，1995, da•办 23:3605 - 06。 “宿主細胞”是能用於表現核酸（例如本發明之核酸）之細胞。宿主細胞能爲原核細胞，例如大腸桿菌（S. ，或能爲真核細胞，例如單細胞真核細胞（例如酵母菌或其他真菌），植物細胞（例如菸草或蕃茄植物細胞），動物細胞（例如人類細胞，猴子細胞，倉鼠細胞，大鼠細胞，小鼠細胞或昆蟲細胞）或融合瘤。文中實施例3敘述使用CS-9細胞。其他宿主細胞的實例包括猴腎細胞 COS-7細胞系（ATCC CRL 1651)(參閱 Gluzmandfl/·，1981，Ce// 23: 175)，L 細胞， C127細胞，3T3細胞（ATCC CCL 163)，中國倉鼠卵巢（CHO) 細胞或其衍生物，例如Veggie CHO及相關之細胞系，其生長於無血清培養基（參閱Rasmussen e/a/·，1998，搜游: 28: 31)，HeLa 細胞，BHK(ATCC CRL 10)細胞系，衍生自非洲綠猴腎細胞系CV1(ATCC CCL 70)之CV1/EBNA細胞系 (參閱 McMahan d fl/·，1991，五M50 /. 1 0 : 282 1 )，人類胚 -35- 200819466

胎腎細胞例如2 93，293 EBNA或MSR 293 ^ 細胞，人類Co 1〇205細胞，其他轉形之靈長二倍體細胞，衍生自原始組織活體外培養之植體（primary explants)，HL-60，U93 7，HaK 典型的宿主細胞是經培養細胞，能經編碼多轉染，然後該核酸能表現於宿主細胞。“重糸] 能用於表示一宿主細胞已經由將表現之核酸主細胞也能是含有核酸之細胞，該核酸不以除非調節序列導入宿主細胞以致其變得可: 酸。需知用語宿主細胞不僅指特定對象細胞之後代或可能的後代。因某些修飾由於例如可出現於後繼世代，如此後代實際上可能胞’但仍包括在本文使用之用語範圍內。抗原結合蛋白在一方面，本發明提供結合至活動素素A)之抗原結合蛋白（例如抗體，抗體片段抗體突變蛋白，以及抗體變異體）。根據本發明之抗原結合蛋白包括抑制吞性之抗原結合蛋白。舉例而言，抗原結合質’以及當該抗原結合蛋白是完全人類，例時，能出現此活性。不同的抗原結合蛋白可結合至活動素或半胱胺酸結功能部位或經由不作用機轉來但不限爲抗原結合蛋白質，其能專一結合一人類表皮A43 1 類細胞系，正常細胞株，原始移或Jurkat細胞。肽之核酸轉形或 i宿主細胞”一詞轉形或轉染。宿所欲程度表現，操作地連接該核，也指如此細胞突變或環境影響不相同於親代細 A(例如人類活動，抗體衍生物， §動素A生物活蛋白可減弱惡病如完全人類抗體 A不同功能部位〔作用。實例包括個或一個以上特 -36- 200819466 殊半胱胺酸結功能部位，或散布於二硫鍵間之區域，包含包括從SEQ ID NO : 1約胺基酸4-12，胺基酸11-81，胺基酸 11-33，胺基酸13-39，胺基酸40-113，胺基酸44-115，胺基酸81-111及/或胺基酸82-107之區域。除非其他指示，尤其如文中所指示，功能部位區域是指例如將包含之群組。舉例而言，胺基酸4-12是指9個胺基酸··位置4及12之胺基酸以及序列中介入之7個胺基酸。其他實例包括抑制活動素A '與其受器結合之抗原結合蛋白。抗原結合蛋白不需完全抑制活動素A誘發之活性以得到本發明用途；當然，也考慮使用降低活動素A特殊活性之抗原結合蛋白。（活動素A_結合抗原結合蛋白於治療特殊疾病之作用的特別機制於文中討論僅爲舉例說明，以及文中提出之方法不因此受束縛）。在另一方面，本發明提供含有選自A 1-A 1 4所組群組之一輕鏈可變區域或選自A1-A 14所組群組之一重鏈可變區域之抗原結合蛋白質，及其片段，衍生物，突變蛋白及變異體。此等抗原結合蛋白能使用“LxHy”命名表示，其中“X”對應於輕鏈可變區域數，以及“y”對應於重鏈可變區域數，如他們標記於下面序列。換言之，舉例而言，“A1HC”表示抗體A1 的重鏈可變區域；“A1 LC”表示抗體A1的輕鏈可變區域等等。更大體言之，“L2H1”是指一抗原結合蛋白質，具有一含有L2胺基酸序列之輕鏈可變區域以及一含有Η 1胺基酸序列之重鏈可變區域。爲釐清，以一組至少兩成員表示之全部範圍包括組間的全部成員以及包括末端範圍成員。因此’組範圍Α1-Α14包括介於Α1及Α14間之全部成員，以及成員Α1 -37- 200819466 及A14本身。組範圍A4-A6包括成員A4，A5及A6等等。又下面顯示是CDR或產生抗原結合位置部分之互補決定區域（陰影及底線）的位置，而骨架區域（FRS)是這些可變功能部位序列的插入節段。輕鏈可變區域及重鏈可變區域二者有三個CDRs(CDR 1-3)及四個FRs(FR 1·4)。每一輕鏈及重鍵的CDR區域也以丨几體類型（Al ’ Α2，A3等等）分類。本發明之抗原結合蛋_包括，例如抗原結合蛋白質，具有選自由 L1H1(抗體 Al)，L2H2(抗體 Α2)，L3H3(抗體 A3)，L4H4(抗體 A4)，L5H5(抗體 A5)，L6H6(抗體 A6)，L7H7(抗體 A7)， L8H8(抗體 A8)，L9H9(抗體 A9)，L10H10(抗體 A10)， L11H11(抗體 All)，L12H12(抗體 A12)，L13H13(抗體 A13) 及L14H14(抗體A14)所組群組之輕鏈及重鏈可變功能部位的組合。抗體 A1-A14重鏈及輕鏈可變區域多核苷酸（文中也稱爲 H1-H14 及 L1-L14)·

Al HC

CAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTG

AAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGTTACACCTTTACCAGTTATGGTCTCAGCTGGGT

GCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCATCCCTTACAAT

GGTAACACAAACTCTGCACAGAAACTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCACAGAC

ACATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGGAGCCTGAGATCTGACGACACGG

CCGTGTATTTCTGTGCGAGAGACAGGGACTACGGTGTCAATTATGATGCTTTTGATA TCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCA(SEQIDNO ： 2) -38- 200819466

A1 LC

TCCTATGAGGTGACTCAGGCACCCTCAGTGTCCGTGTCCCCAGGACAGACAGCCA

GCATCACCTGCTCTGGAGATAAATTGGGGGATAAATATGCTTGTTGGTATCAGCAGA

AGCCAGGCCAGTCCCCTGTGCTGGTCATCTATCAAGATAGCAAGCGGCCCTCAGG

GATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGAAACACAGCCACTCTGACCATCA

GCGGGACCCAGGCTATGGATGAGGCTGACTATTACTGTCAGGCGTGGGACAGCAG CACTGCGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA (SEQ ID NO ： 1)

A2 HC

CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTG

AGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTACGGCATGCACTGGGT

CCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATGGTATGATGGA

AGTAATAAATACCATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAA

TTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAGTGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCT

GTGTATTACTGTGTGAGAAGTCGGAACTGGAACTACGACAACTACTACTACGGTCT GGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAG (SEQ ID NO ： 18)

A2 LC GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGT CACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGAAATAATTTAGGCTGGTATCAGC AGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCGCCTGATTTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAG TGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACA ATCAGCAGTCTGCAGCCTGAAGATTTTACAACTTATTACTGTCTACAGCATAATAGT TACCCGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA (SEQ ID NO ： 17) -39- 200819466

A3 HC

GAGGTGCAGTTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTG

AGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGTTATTGGATGAGCTGGGTC

CGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGCGTGGCCAACATAAAGCAAGATGGA

AGTGAGGAATACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACA

ACGCCAAGAATTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGC

TGTGTATTACTGTGCGAGAGGTAGCAGCAGCTGGTACTACTACAACTACGGTATGG ACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO ： 34)

A3 LC GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGT CACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGAAATGATTTAGGCTGGTATCAGC AGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCGCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAG TGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACA ATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCGACAGCAAAATAC TTACCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA (SEP ID NO ： 33)

A4HC

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTG

AAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCGGCTACTATATCCACTGGGT

GCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACCCTAACAGT

GGTGGCACAAACTATGCACAGAAGTTTCAGGGCAGGGTCACCATGACCAGGGAC

ACGTCCATCAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGATCTGACGACACGG -40- 200819466 CCGTGTATTTCTGTGCGAGAGATTCGGGGTATAGCAGCAGCTGGCACTTTGACTAC TGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA(SEQIDNO ： 50)

A4LC GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGC CTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCCTGCATAGTACTGGATACAACTATTT GGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATTTGGGTT CTTTTCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCAGGCACAGA TTTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCA TGCAAGCTCTCCAAACTCCGTGCAGTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAA G (SEQ ED NO : 49)

A5HC

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTG

TCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAATAGTTTCTACTGGAGCTGGATC

CGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGTATATCTATTACAGTGGGA

GCACCAACTACAATCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCC

AAGACCCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCTGCGGACACGGCCGTGT

ATTACTGTGCGAGAGACAGTATAGCAGCCCCCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAAC

CCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGC

CCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGA CTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCATGCGCCCT (SEQ ID NO ： 66)

A5LC -41- 200819466

GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGG

CCACCATCACCTGCAAGTCCAGCCAGAGTATTTTATACAGTTCCAACAATAAGAAG

TATCTAGTTTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGATCATTTACTG

GACATCTATGCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGG

ACAGATTTCACTCTCACCATCAACAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTA

CTGTCAGCAATATTATAGTACTCCGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAA TCAAA(SEQIDNO ： 65)

A6HC

CAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGGCGCAGGACTGTTGAAGCCTTCGGAGACCCTGT

CCCTCACCTGCGCTGTCTATGGTGGGTCCTTCAGTGCTTACTACTGGAGCTGGATC

CGCCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGGAAATCAATCATAGTGGAG

GCACCAACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTC

CAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCTGTG

TATTACTGTGCGAGAGTACAGTGGCTCGAACTGGCCTACTTTGACTACTGGGGCCA GGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO : 82)

A6LC

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGT

CACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAACTATTTAAATTGGTATCAGC

AGAGACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTACATCCAGTTTGCAAAGT

GGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCAT

CAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGTAAGTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTA TTTCGCCCACTTTCGGCGGCGGGACCAAGGTGGAGAACAAA (SEQ ID NO ： 81) -42- 200819466

A7HC

CAGGTGCAGCTGGTGGACTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTG

AGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCACCTTCATTAGCTATGGCATGCACTGGGTC

CGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATCTGGTATGATGGAA

GTACTGAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAAT

TCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTG

TGTATTACTGTGCGAGAGAGAGGCAGTGGCTCTACCACTACGGTATGGACGTCTGG GGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA(SEQIDNO ： 98)

A7LC

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGT

CACCATCACTTGCCGGGCAGGTCAGGGCATTAGAAATGATTTAGTCTGGTATCAGC

AGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCGCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAG

TGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACA

ATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCTACAACATAATACT TACCCATTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAA (SEQ ID NO ： 97)

A8 HC

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGGAGACCCTG

TCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAATAGTTTCTACTGGAGCTGGATC

CGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGTATATCTATTACAGTGGGA

GCACCAACTACAATCCCTCCCTCAAGAGGCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCC

AAGACCCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCTGCGGACACGGCCGTGT -43- 200819466 ATTACTGTGCGAGAGACAGTATAGCAGCCCCCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAAC CCTGGTCACCGTCTCCTCA(SEQIDNO ： 114)

A8LC

GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGG

CCACCATCACCTGCAAGTCCAGCCAGAGTATTTTATACAGCTCCAACAATAAGAAG

TATCTAGTTTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGTTGATCATTTACTG

GACATCTATGCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGG

ACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTA

CTGTCAGCAATATTATAGTACTCCGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAA TCAAA(SEQIDNO ： 113)

A9HC

CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTG

AGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTACGGCATGCACTGGGT

CCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATGGTATGATGGA

AGTAATAAATACCATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAA

TTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAGTGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCT

GTGTATTACTGTGTGAGAAGTCGGAACTGGAACTACGACAACTACTACTACGGTCT GGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO ： 130)

A9LC

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGT

CACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGAAATAATTTAGGCTGGTATCAGC -44- 200819466 AGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCGCCTGATTTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAG ^GGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGArCTGGGACAGAATTCACTCTCACA ATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTACAACTTATTACTGTCTACAGCATAATAGT TACCCGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA (SEQ ID NO ： 129)

A10HC

GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGAGGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTG

AAGATCTCCTGTCAGGGTTCTGGATACAGCTTTACCAGCTACTGGATCGGCTGGGT

GCGCCAGATGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATGGGGATCATCTATCCTGGTGAC

TCTGATACCAGATACAGCCCGTCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATCTCAGCCGACAA

GTCCATCAGCACCGCCTACCTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCTCGGACACCGCC

ATGTATTACTGTGCGAGACAAGGACTGGGGTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCC TGGTCACCGTCTCCTCA(SEQIDNO ： 146)

A10LC

TCCTATGAGCTGACTCAGCCACCCTCAGTGTCCGTGTCCCCAGGACAGACAGCCA

GCATCACCTGCTCTGGAGAAAAATGGGGAGAGAAATATGCTTGTTGGTATCAGCAG

AAGCCAGGCCAGTCCCCTGTGCTGGTCATCTATCAAGATAGGAAGCGGCCCTCCGG

GATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCATTTCTGGGAACACAGCCACTCTGACCATCA

GCGGGACCCAGGCTATGGATGAGGCTGACTATTATTGTCAGGCGTGGGACAGGAG CACTGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA (SEQ ID NO ： 145)

All HC

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTG -45- 200819466

TCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAGTGGTGGTTACTACTGGAG

CTGGATCCGCCAGCACCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGGTACATCTCTTAC

AGTGGGAGCACCTACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAGTTGA

CACGTCTAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAACTCTGTGACTGCCGCGGACACG

GCCGTGTATTACTGTGCGCGCGCTTACGGTGACTATCGCGGCTGGTTCGACCCCTG GGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA(SEQIDNO ： 162)

All LC

TCCTATGAGCTGACTCAGCCACCCTCAGTGTCCGTGTCCCCAGGACAGACAGCCA

GCATCACCTGCTCTGGAGATAAATTGGGGGATAAATTTGCTTTCTGGTATCAGCTGA

AGCCAGGCCAGTCCCCTGTGCTGGTCATCTATCAAGATAACAAGCGGCCCTCAGG

GATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACAGCCACTCTGACCATCA

GCGGGACCCAGGCTATGGATGCGGCTGACTTTTACTGTCAGGCGTGGGACAGCAG CACTGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA (SEQ ID NO ： 161)

A12 HL

CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTG

AGACTCTCCTGTGTAGCGTCTGGATTCACCTTCAGTGCCTATGGCATGCACTGGGT

CCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATGGTATGATGGA

AGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCATCATCTCCAGAGACAA TTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCT GTGTATTACTGTGCGAGAAGTCGGAACTGGAACTACGACTCCTACCAATACGGTTT GGACGTGTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO ： 178) -46- 200819466

A12LC GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGT CACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGAAATGATTTAGGCTGGTATCAGC AGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCGCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAG 1GGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACA ATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTGTGCAACTTATTATTGTCTACAGCATAATAGT TATACGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA (SEQ ID NO ： 177)

A13 HC

CAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTG

AAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGTTACACCTTTACCAGCTATGGTATCAGCTGGGT

GCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGAGGATGGGATGGATCAGCGCTTACAAT

GGTAACACAAACTATGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCACAGACA

CATCAACGACCACAGCCTACATGGAGCTGAGGAGCCTGAGATCTGACGACACGGC

CGTGTATTACTGTGCGAGAGATCAAGATTACTATGATAGTAGTGGTTGGGGCCACTG GGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA(SEQIDNO ： 194)

A13LC

TCCTATGAGCTGACTCAGCCACCCTCAGTGTCCGTGTCCCCAGGACAGACAGCCA

GCATCACCTGCTCTGGAGATAAATTGGGGGATAAATATGTTTGTTGGTATCAGCAGA

AGCCAGGCCAGTCCCCTGAACTGGTCATCTATCTAGATAACAAGCGGCCCTCAGGG

ATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACAGCCACTCTGACCATCAG

CGGGACCCAGGCTATGGATGAGGCTGACTATTACTGTCAGGCGTGGGACAGCAGC ACGGTATTCGGCGGAGGGACCAAACTGACCGTCCTG (SEQ ID NO ： 193) -47- 200819466

A14HC

CAGGTTCAGCTGGTGCAATCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGA

AGGTCTCCTGCAAGACTTCTGGTTACACCTTTACCAGCTATGGTATCAGCTGGGTG

CGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAGCCCTTACAATG

GTAACACAAACTATGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCACAGACAA

ATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGGAGCCTGCGATCTGACGACACGGCC

GTGTATTACTGTGCGAGAGATCAAGATTACTATGATAGTAGTGGTTGGGACCCCTGG GGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCG (SEQ ID NO ： 210)

A14LC

TCCTATGAGCTGACTCAGCCACCCTCAGTGTCCGTGTCCCCAGGACAGACAGCCT

CCATCACCTGCTCTGGAGATAAATTGGGGGATAAATATGCTTTCTGGTATCAGCAGA

AGCCAGGCCAGTCCCCTGTGCTGGTCTTCTATCATGATACCAAGCGGCCCTCAGGG

ATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACAGCCACTCTGACCATCAG

CGGGACCCAGGCTATGGATGAGGCTGACTATCACTGTCAGGCGTGGGACAGCAGC ACGGTCTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAC (SEQ ID NO ： 209) 杭體A1-A 14胺某酸序列，輕鏈可變區域。CDR區域是陰影及底線；插入節段或區域在文中稱爲骨架（FR)。 A1 SYEVTOAPSVSVSPGOTASITCSGDKLGDKYACWYOOKPGOSPVLVIYODSKRPSGIP ERFSGSNSGNTATLTISGTOAMDEADYYCQAWDSSTAVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO ： -48- 9) 200819466 A2 DIOMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASOGIRNNLGWYOOKPGKAPKRLIYAASSLOSGV PSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFTTYYCLOHNSYPWTFGOGTKVEIK (SEQ ID NO ： 25) A3 DIOMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASOGIRNDLGWYOOKPGKAPKRLIYAASSLOSGV PSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCROONTYPLTFGGGTKVEIK(SEO ID NO ： 41) A4 ................................... … DIVMTOSPLSLPVTPGEPASISCRSSOSLLHSTGYNYLDWYLOKPGOSPOLLIYLGSFR ASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMOALOTPCSFGOGTKLEIK (SEQ ID NO ： 57) A5 DIVMTOSPDSLAYSLGERATITCKSSOSILYSSNNKKYLVWYOOKPGOPPKLIIYWTSM RESGVPDRJSGSGSGTDFTUriNSLQAEDVAVYYCOOYYSTPWTFGOGTKVEIK (SEQ ID NO ·· 73) A6 DIOMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASOSISNYLNWYOORPGKAPKLLIYATSSLOSGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFVSYYCOQSYSISPTFGGGTKVENK (SEQ ID NO ·· 89) -49- 200819466 A7 DIOMTOSPSSLSASVGDRVTITCRAGOGIRNDLVWYOOKPGKAPKRLIYAASSLOSGV PSRFSGSGSGTEFTLTISSLOPEDFATYYCLOHNTYPFTFGPGTKVDIK (SEQ ID NO ： 105) A8 DIVMTOSPDSlJWSLGERAriTCKSSOSI^SSNNKKYIAr^QOKPGQPPmiYWTSii RESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOAEDVAVYYCOOYYSTPWTFGOGTKVEIK (SEQ ID NO ： 121) A9 DIOMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASOGIRNNLGWYOOKPGKAPKRLIYAASSLOSGV PSRFSGSGSGTEFTLTISSLOPEDFTTYYCLOHNSYPWTFGOGTKVEIK (SEQ ID NO ： 137) A10 SYELTOPPSVSVSPGOTASITCSGEKWGEKYACWYOOKPGOSPVLVIYODTKRPSGIPE RFSGSISGNTATLTISGTOAMDEADYYCOAWDRSTVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO ： 153)

All SYELTOPPSVSVSPGOTASITCSGDKLGDKFAFWYOLKPGOSPVLVIYODNKRPSGIPE RFSGSNSGNTATLTISGTOAMDAADFYCOAWDSSTWFGGGTKLTVL (SEQ ID NO ： 169) -50- 200819466 A12 ................................................... DIOMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASOGIRNDLGWYOOKPGKAPKRLIYAASSLOSGV PSRFSGSGSGTEFTLTISSLOPEDCATYYCLOHNSYTWTFGOGTKYEIK (SEQ ID NO ： 185) A13 SYEUr〇PPSVSVSPGOTASITCSGDKLGDKYVCWYOOKPGOSPELVIYM)NKRPSGIPE RFSGSNSGNTATLTISGTOAMDEADYYCOAWDSSTVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO ： 201) A14 SYELTOPPSVSVSPGOTASITCSGDKXGDKYAFWYOOKPGOSPVLVFYHDTKRPSGIPE RFSGSNSGNTATLTISGTOAMDEADYHCOAWDSSTVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO ： 217) 抗體A1-A14，重鏈可變區域之胺基酸序列。CDR區域是陰影及底線，其他區域在文中稱爲骨架（FR)。 A1 .................................................... OVOLYOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGLSWWOAPGOGLEWMGWIIPYN GNTNSAOKLOGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYFCARDRDYGVNYDAFDI WGQGTMVTVSS (SEQ ID NO ： 10) A2

OVOLVESGGGWOPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVROAPGKGLEWVAVIWYDG -51- 200819466 SNKYHADSVKGRFTISRDNSKNTLYLOVNSLRAEDTAVYYCVRSRNWNYDNYYYGL DVWGOGTTVTVSS (SEQ ID NO : 26) A3 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVROAPGKGLECVANIKODGSE EYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLOMNSLRAEDTAVYYCARGSSSWYYYNYGMDV WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO ： 42) A4 OVOLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYIHWYROAPGOGLEWMGWINPNS GGTNYAOKFOGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCARDSGYSSSWHFDYW GQGTLVTVSS (SEQ ID NO ： 58) A5 QVQLOESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSINSFYWSWIROPPGKGLEWIGYIYYSGSTNY NPSLKSRVTISVDTSKTOFSLKLSSVTAADTAVYYCARDSIAAPFDYWGOGTLVTVSS (SEQ ID NO ： 74) A6 OVOLOOWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSAYYWSWIRQPPGKGLEWIGEINHSGGT NYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARVOWLELAYFDYWGOGTL VTVSS (SEQ ID NO ： 90) A7 -52- 200819466 OVOLVDSGGGWOPGRSLRLSCAASGFTFISYGMHWVROAPGKGLEWVAVIWYDGS TEYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLOMNSLRAEDTAVYYCAREROWLYHYGMDW GQGTTVTVSS (SEQ ID NO ： 106) A8 OVOLOESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSINSFYWSWIROPPGKGLEWIGYIYYSGSTNY NPSLKRRVTISVDTSKTOFSLKLSSVTAADTAVYYCARDSIAAPFDYWGOGTLVTVSS (SEQ ID NO ： 122) A9 ............................................ ........................ OVOLVESGGGWOPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVROAPGKGLEWVAVIWYDG SNKYHADSVKGRFTISRDNSKNTLYLOVNSLRAEDTAVYYCVRSRNWNYDNYYYGL DVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO ： 138) A10 EVOLVOSGAEVKKPGESLKISCOGSGYSFTSYWIGWVROMPGKGLEWMGHYPGDSD TRYSPSFOGOVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCAROGLGFDYWGOGTLVTV SS (SEQ ID NO : 154)

All OVOLOESGPGLVKPSOTLSLTCTYSGGSISSGGYYWSWIROHPGKGLEWIGYISYSGS TYYNPSLKSRVTISVDTSKNOFSLKLNSVTAADTAVYYCARAYGDYRGWFDPWGOG TLVTVSS (SEQ ID NO ： 170) -53· 200819466 A12 OVOLVESGGGWOPGRSLRLSCVASGFTFSAYGMHWWOAPGKGLEWAVIWYDGS NKYYADSVKGRFIISRDNSKNTLYLOMNSLRAEDTAVYYCARSRNWNYDSYOYGLD iWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO ： 186) A13 QVOLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVROAPGOGLERMGWISAYNG NTNYAOKFOGRVTMTTDTSTTTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDODYYDSSGWGHW GQGTLVTVSS (SEQ ID NO ： 202) A14 QVOLVOSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFTSYGISWVROAPGOGLEWMGWISPYNG NTNYAOKFOGRVTMTTDKSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDODYYDSSGWDPW GQGTLVTVSS (SEQ ID NO ： 218) 抗體 A1-A14 之 CDR 共有序列（CDR consensus sequences)。輕鏈 CDR1序列 L4 RSSQSLLHSTGYN-YLD (SEQ ID NO : 59) L5，L8 KSSOSI LYSSNNKKYL V(SEQ ID NO ： 75) 共有序列：X! S S Q S X2 L X3 s X4 Xs Χό x? XgY L X9 (SEQ ID NO ： 115)

Xi爲精胺酸殘基或離胺酸殘基， -54- 200819466 X2爲白胺酸殘基或異白胺酸殘基， Χ3爲組胺酸殘基或酪胺酸殘基， Χ4爲酥胺酸殘基或絲胺酸殘基， Χ5爲甘胺酸殘基或天冬醯胺酸殘基， Χ6爲酪胺酸殘基或天冬醯胺酸殘基， Χ7爲天冬醯胺酸殘基或離胺酸殘基， χ8爲離胺酸殘基或沒有殘基， Χ9爲天冬胺酸殘基或纈胺酸殘基 L2，L9 RASQGIRNNLG (SEQ ID NO ： 27) L3，L12 RASQGIRNDLG (SEQ ID NO ： 43) L6 RASQSISNYL N (SEQ ID NO ： 91) L7_RAGOGIRNDL VrSEO ID NO ： 107) 共有序列：R A X1() Q Xu I X12 N X13 L X14 (SEQ ID NO : 116)

Xio爲絲胺酸殘基或甘胺酸殘基，

Xn爲絲胺酸殘基或甘胺酸殘基， x12爲絲胺酸殘基或精胺酸殘基，

Xl3爲酪胺酸殘基，天冬胺酸殘基，或天冬醯胺酸殘基 Xm爲天冬胺酸殘基，纈胺酸殘基，或甘胺酸殘基

L1 S G D K L G D L1 0 S G E K W G E L1 1 S G D K L G D K Y A C (SEQ ID NO ： 11) K Y A C (SEQ ID NO :155) K F A F (SEQ ID NO ： 171) -55- 200819466

Ll 3 SGDKLGDKYVC (SEQ ID NO ： 203) LI 4_SGDKLGDKYAF (SEO ID NO ： 219) 共有序列：s G Xi5 K X16 G Xi7 K Xi8 Xi9 X2〇(SEQ ID NO ： 123) X15爲麩胺酸殘基或天冬胺酸殘基， X16爲色胺酸殘基或白胺酸殘基， X17爲麩胺酸殘基或天冬胺酸殘基， X18爲酪胺酸殘基或苯丙胺酸殘基.， X19爲丙胺酸殘基或纈胺酸殘基， X2Q爲半胱胺酸殘基或苯丙胺酸殘基輕鏈 CDR2序列 L2 A T S s L Q S (SEQ ID NO ： 28) L3 ， L6 ， L7 ， L9 ， L12 A A s s L Q S (SEQ ID NO ： 44) L5，L8 W T s M R E S (SEQ ID NO ·· 76) L4 L G s F R A S (SEQ ID NO ： 60) 共有序列： X40 X41 s X42 X43 X44 S (SEQ ID NO: 124) X40爲丙胺酸殘基，色胺酸殘基，或白胺酸殘基， X4 1爲酥胺酸殘基，丙胺酸殘基，或甘胺酸殘基， X42爲絲胺酸殘基，甲硫胺酸殘基，或苯丙胺酸殘基， X43爲白胺酸殘基或精胺酸殘基， X44爲麩醯胺酸殘基，麩胺酸殘基，或丙胺酸殘基 -56- 200819466 L10 Q D T K R P S. (SEQ ID NO : 156) L11 Q D N K R P S (SEQ ID NO ： 172) L1 Q D S K R P S (SEQ ID NO ： 12) L13 L D N K R P S (SEQ ID NO ： 204) L14 Η D T K R P S (SEQ ID NO ： 220) 共有序列： Χ45 D X46 κ R P、 S (SEQ 丨 ID NO : 128) X45爲麩醯胺酸殘基，白胺酸殘基，或組胺酸殘基， X46爲酥胺酸殘基，天冬醯胺酸殘基，或絲胺酸殘基輕鏈 CDR3 序列 L1 Q A W D S s T A V (SEQ ID NO ： 13) L10 Q A w D R s T - V (SEQ ID NO ： 157) L11 Q A w D S s T V V (SEQ ID NO ： 173) L13 ， L14 Q A w D S s T V -(SEQ ID NO : 205) L2 L Q H N S Y P w T (SEQ ID NO ： 29) L7 L Q H N T Y P F T (SEQ ID NO : 109) L9 L Q H N S Y P W T (SEQ ID NO ·· 141) L12 L 0 H N S Y T W T (SEQ ID NO ： 189) 共有序列： L Q H N X81 Y X82 X83 T (SEQ ID NO ： 1 x8 i爲酥胺酸殘基或絲胺酸殘基， x82爲脯胺酸殘基或酥胺酸殘基， -57- 200819466 χ83爲苯丙胺酸殘基或色胺酸殘基 L3 R Q Q N T Y P L T (SEQ ID NO ： 45) L4 Μ Q A L Q T P c S (SEQ ID NO ： 61) L5 Q Q Y Y s T P w T (SEQ ID NO ： 77) L6 Q Q S Y s I s P T (SEQ ID NO ： 93) L8 0 〇 Y Y s T P w T (SEQ ID NO ： 125) 共有序列：Χ73 Q Χ74 Χ75 Χ76 Χ77 Χ78 Χ79 Χδ〇 (SEQ ID NO· 132) X73 爲甲硫胺酸殘基，麩醯胺酸殘基，或精胺酸殘基， X74 爲丙胺i 酸殘基，酸丨胺酸殘基，麩j 醯胺酸殘基，或絲胺酸殘基， X75 爲白胺酸殘基 5 酪胺酸殘基，或天冬醯胺酸殘基， X76 爲麩醯胺酸殘基，絲胺酸殘基，或酥胺酸殘基， X77 爲酥胺酸殘基 5 酪胺酸殘基，或異白胺酸殘基， X78 爲脯胺酸殘基或絲胺酸殘基， X79 爲半胱」胺酸殘基，色胺酸殘基，白胺酸殘基，或脯胺酸殘基， X8〇爲絲胺酸殘基或酥胺酸殘基重鏈 CDR1序歹(1 H5 G G S I N S - F Y W S (SEQ ID NO ：78) H6 G G S F S A - -Y Y W S (SEQ ID NO ： 94) H8 G G S I N S - - F Y W S (SEQ ID NO ：126) H11 G G S I S S G G Y Y W S (SEQ ID NO : 174) 共有序列= G G S X21 X22X23 X24 X25X26 Y W S (SEQ ID NO ：134) -58- 200819466 χ21爲異白胺酸殘基或苯丙胺酸殘基 X22爲天冬醯胺酸殘基或絲胺酸殘基 x23爲絲胺酸殘基或丙胺酸殘基 X24爲甘胺酸殘基或沒有殘基 X25爲甘胺酸殘基或沒有殘基 X26爲苯丙胺酸殘基或酪胺酸殘基 H7 G F T F I s Y G M H (SEQ ID NO ： 110) H4 G Y T F T G Y Y I H (SEQ ID NO ： 62) H2，H9 G F T F S s Y G M H (SEQ ID NO ： 30) H10 G Y s F T s Y W I GfSEOIDNO ： 158) 共有序列： G X27 X28 F X29X30 Y X31 X32X33 (SEQIDNO : 139) X27 爲酪胺酸殘基或苯丙胺酸殘基 5 X28 爲酥胺酸殘基或絲胺酸殘基 5 X29 爲酥胺酸殘基絲胺酸殘基 ) 或異白胺酸殘基， X30 爲甘胺酸殘基或絲胺酸殘基 X31 爲酪胺酸殘基甘胺酸殘基 5 或色胺酸殘基， X3 2 爲異白胺酸殘基或甲硫胺酸殘基 5 X3 3 爲組胺酸殘基或甘胺酸殘基 H13 GYTFTSYGL S (SEQ ID NO ： 206) H12 GFTFSAYGM H (SEQ ID NO ： 190) -59- 200819466 H3 GFTFSSYWM S (SEQ ID NO ： 46) HI，H14_GYTFTSYGI S (SEP ID NO ： 14) 共有序列： G X34T F X35X36 Y X37X38 X39 (SEQIDNO ： 140) X34爲酪胺酸殘基或苯丙胺酸殘基， X35爲酥胺酸殘基或絲胺酸殘基， X36爲絲胺酸殘基或丙胺酸殘基， X37爲甘胺酸殘基或色胺酸殘基， X3 8爲白胺酸殘基，甲硫胺酸殘基，或異白胺酸殘基， X39爲絲胺酸殘基或組胺酸殘基重鏈 CDR2序列 H11 Y I S Y S G S Τ Υ Υ Ν Ρ S L Κ S (SEQ ID NO ： 175) H5 Y I Y Y S G S Τ Ν Υ Ν Ρ S L Κ S (SEQ ID NO ：：79) H6 E I N Η S G G Τ Ν Υ Ν Ρ S L Κ S (SEQ ID NO :95) H8 Y I Y Υ S G S Τ Ν Υ Ν Ρ S L Κ R (SEQ ID NO :127) 共有序列：X47IX48X49 s G X50T X51Y N P S L K X52(SEQ Π) NO : 142) X47爲酪胺酸殘基或麩胺酸殘基， X48爲絲胺酸殘基，酪胺酸殘基，或天冬醯胺酸殘基， X49爲酪胺酸殘基或組胺酸殘基 X5〇爲絲胺酸殘基或甘胺酸殘基， x51爲酪胺酸殘基或天冬醯胺酸殘基， X52爲絲胺酸殘基或精胺酸殘基 -60- 200819466 H2，H9 VIWYDGSNKYHADSVKG (SEQ ID NO : 31) H12 VIWYDGSNKYYADSVKG (SEQ ID NO ： 191) H3 NIKQDGSEEYYVDSVKG (SEQ ID NO ： 47) H7_VIWYDGSTEYYADSVKG (SEQ ID NO ： 111) 共有序列：X53IX54X55DG S X56X57Y X58X59D S V K G (SEQ ID NO : 179) X53 爲天冬醯胺酸殘基或纈胺酸殘基， X54 爲色胺酸殘基或離胺酸殘基 5 X55 爲酪胺酸殘基或麩醯胺酸殘基 X56 爲天冬醯胺酸殘基 y 麩胺酸殘基，或絲胺酸殘基 X57 爲離胺酸殘基或麩胺酸殘基 X58 爲組胺酸殘基或酪胺酸殘基 1 X 5 9 爲丙胺酸殘基或纈胺酸殘基 H4 WINPNSGGTNYAQKFQ G(SEQIDNO ： 63) HI WII PYNGNTNSAQKLQ G(SEQIDNO ： 15) H13 WISAYNGNTNYAQKFQ G(SEQ ID NO ： 207) H14 WISPYNGNTNYAQKFQ G(SEQIDNO ： 223) H10_I IYPGDSDTRYSPSFO G(SEO ID NO ： 159) 共有序列：X60 IX61X62X63X64X65 X66 τ X67 X68 Χ69Χ7〇Χ7ΐΧτ2 Q G (SEQ ID NO ·· 180) X6〇爲色胺酸殘基或異白胺酸殘基， X6 i爲天冬醯胺酸殘基，異白胺酸殘基，絲胺酸殘基，或酪 -61- 200819466 胺酸殘基， X62爲脯胺酸殘基或丙胺酸殘基， X63爲天冬醯胺酸殘基，酪胺酸殘基，或甘胺酸殘基， X64爲絲胺酸殘基，天冬醯胺酸殘基，或天冬胺酸殘基， X65爲甘胺酸殘基或絲胺酸殘基， X66爲甘胺酸殘基，天冬酶胺酸殘基，或天冬胺酸殘基， X67爲天冬醯胺酸殘基或精胺酸殘基， X68爲酪胺酸殘基或絲胺酸殘基， X69爲丙胺酸殘基或絲胺酸殘基 X70爲麩醯胺酸殘基或脯胺酸殘基， X7 i爲離胺酸殘基或絲胺酸殘基， X72爲苯丙胺酸殘基或白胺酸殘基 CDR3序歹[| H5，H8 H6 H10 - -D SIAAPFDY (SEQ ID NO : 80) V Q W LELAYFDY (SEQ ID NO ： 96) - - --O G L G F D YfSEOIDNO ： 160) 共有序列： X87 X88 X89 X90 X91 X92X93 X94 F D Y (SEQ ID NO ： 187) X87爲纈胺酸殘基或沒有殘基， X88爲麩醯胺酸殘基或沒有殘基， X89爲天冬胺酸殘基，色胺酸殘基，或沒有殘基， X9〇爲絲胺酸殘基，白胺酸殘基，或沒有殘基， X9 i爲異白胺酸殘基，麩胺酸殘基，或麩醯胺酸殘基， -62- 200819466 X92爲丙胺酸殘基，白胺酸殘基，或甘胺酸殘基， X93爲丙胺酸殘基或白胺酸殘基’ X94爲脯胺酸殘基，酪胺酸殘基’或甘胺酸殘基 H13 D Q D Y Y D S s G W - G H (SEQ ID NO ：208) H14 D Q D Y Y D s s G W - D P (SEQ ID NO ： 22) Hll .„ A Y G D Y R G W F D P (SEQ ID NO ：176) 共有序列： X95 X% X97 Y X98 D X99 Xioo G W Xi〇i Xi〇2 Xi〇3 (SEQIDNO · 188) X95爲天冬胺酸殘基或沒有殘基， X96爲麩醯胺酸殘基或沒有殘基， X97爲天冬胺酸殘基或丙胺酸殘基， X98爲酪胺酸殘基或甘胺酸殘基， X99爲絲胺酸殘基或酪胺酸殘基，

Xi 00爲絲胺酸殘基或精胺酸殘基， Χ1(Π爲苯丙胺酸殘基或沒有殘基，

Xi 02爲甘胺酸殘基或天冬胺酸殘基， X! 03爲組胺酸殘基或脯胺酸殘基 H4 ---DSGYSSSWHFDY -(SEQIDNO : 64) HI -——DRDYGVNYDAFD I(SEQIDNO ： 16) H2 -SRNWNYDNYYYGLD V(SEQIDNO : 32) H12 -SRNWNYDSYQY GLD V(SEQIDNO ： 192) H9 -SRNWNYDNYYYGLD V(SEQ ID NO : 144) -63- 200819466 H3 H7_ 共有序列： NO ： 189) Xl04爲甘 X 1 0 5爲絲 X 1 0 6爲精 X 1 0 7爲天醯胺酸殘 X 1 0 8爲絲 X 109爲甘酸殘基， X 1 1 0爲絲基， X 1 1 1爲絲酸殘基， X 1 1 2爲絲酸殘基 X 1 1 3爲色 X 1 1 4爲組基， X 1 1 5爲苯 XH6天冬

GSSSWYY - YNGMDV- (SEQ ID NO ： 48) -EROWL Y——HYGMD VfSEOIDNO ： 112) X104X105X106X107X108X109YX110X111X112X113X114X115X116X117X118 (SEQ ID 胺酸殘基或沒有殘基胺酸殘基，麩胺酸殘基，或沒有殘基胺酸殘基，絲胺酸殘基，或沒有殘基，冬胺酸殘基，天冬醯胺酸殘基，絲胺酸殘基，或麩基胺酸殘基，精胺酸殘基，或色胺酸殘基，胺酸殘基，天冬胺酸殘基，天冬醯胺酸殘基，酪胺或白胺酸殘基，胺酸殘基，甘胺酸殘基，天冬胺酸殘基，或沒有殘胺酸殘基，纈胺酸殘基，天冬醯胺酸殘基，或酪胺胺酸殘基，天冬醯胺酸殘基，酪胺酸殘基，或組胺胺酸殘基，酪胺酸殘基，或麩醯胺酸殘基，胺酸殘基’天冬胺酸殘基，酪胺酸殘基，或沒有殘丙胺酸殘基，丙胺酸殘基，或甘胺酸殘基，胺酸殘基’苯丙胺酸殘基，白胺酸殘基，或甲硫胺 -64- 200819466 酸殘基 x 1 1 7爲酪胺酸殘基，或天冬胺酸殘基， X i 1 8爲異白胺酸殘基，纈胺酸殘基，或沒有殘基在一具體例中’本發明提供一種抗原結合蛋白質，含有一輕鏈可變功能部位其含胺基酸序列只在1 5，1 4，1 3，1 2， 11，10，9，8，7，6，5，4，3，2，或1殘基不同於選自由 L1至L1 4所組群組之輕鏈可變功能部位的序列，其中各個此種序列差異無關於任一個胺基酸殘基的刪除、插入、或取代。在另一具體例中，輕鏈可變功能部位含有胺基酸序列至少 70%，7 5%，80%，85%，90%，95%，97%，或 9 9%相同於選自由L1-L14所組群組之輕鏈可變功能部位之序列。在另一具體例中，輕鏈可變功能部位含有胺基酸序列編碼自一核苷酸序列，其至少 7 0 %，7 5 %，8 0 %，8 5 %，9 0 %，9 5 %， 97%，或99%相同於編碼選自由Ll-L14(其包括LI，L2，L3， L4 ， L5 ， L6 ， L7 ， L8 ， L9 ， L10 ， Lll ， L12 ， L13 及 L14) 所組群組之輕鏈可變功能部位之核苷酸序列。在另一具體例中，輕鏈可變功能部位含有胺基酸序列是編碼自一多核苷酸，其於中度嚴格條件下雜化至編碼選自由L1-L14所組群組之輕鏈可變功能部位之多核苷酸的互補體。在另一具體例中，輕鏈可變功能部位含有胺基酸序列是編碼自一多核苷酸，其於中度嚴格條件下雜化至編碼選自由L1-L14所組群組之輕鏈可變功能部位之多·核苷酸的互補體。在另一具體例中，輕鏈可變功能部位含有胺基酸序列是編碼自一多核苷 -65- 200819466 酸，其於中度嚴格條件下雜化至編碼選自由L1-L14所組群組之輕鏈可變功能部位之多核苷酸的互補體。在另一具體例中，本發明提供一種抗原結合蛋白質，含有一重鏈可變功能部位其含胺基酸序列只在1 5，1 4，1 3，1 2， 11，10，9，8，7，6，5，4，3，2，或1殘基不同於選自由 Η 1 -Η 1 4所組群組之重鏈可變功能部位的序列，其中各個此種序列差異無關於任一個胺基酸殘基的刪除、插入、或取代。在另一具體例中，重鏈可變功能部位含有胺基酸序列至少 7 0 %，7 5 %，8 0 %，8 5 %，9 0 %，9 5 %，9 7 %，或 9 9 % 相同於選自由Η 1 -Η 1 4所組群組之重鏈可變功能部位之序列。在另一具體例中，重鏈可變功能部位含有胺基酸序列編碼自一核苷酸序列，其至少 7 0 %，7 5 %，8 0 %，8 5 %，9 0 %，9 5 %， 9 7%，或99 %相同於編碼選自由Η1-Η14所組群組之重鏈可變功能部位之核苷酸序列。在另一具體例中，重鏈可變功能部位含有胺基酸序列是編碼自一多核苷酸，其於中度嚴格條件下雜化至編碼選自由Η 1 -Η 1 4所組群組之重鏈可變功能部位之多核苷酸的互補體。在另一具體例中，重鏈可變功能部位含有胺基酸序列是編碼自一多核苷酸’其於中度嚴格條件下雜化至編碼選自由Η 1 - Η 1 4所組群組之重鏈可變功能部位之多核苷酸的互補體。在另一具體例中’重鏈可變功能部位含有胺基酸序列是編碼自一多核苷酸’其於中度嚴格條件下雜化至選自由 SEQ ID NO: 10’ 26’ 42’ 58，74，90，106, 122，136，154，170，186，202，及218所組群組之重鏈多核苷酸的互補體。 -66- 200819466

本發明抗原結合蛋白之特別具體例含有一個或一個以上胺基酸序列是相同於一個或一個以上CDRs及/或FRs之胺基酸序列，例如本文中提及之來自一個或一個以上SEQ ID

Nos: 9-16，22，25-32，36，41-48-57-62，64，73-80，89-91， 93-96，105-107，109-112，115，116，121-128，131，132, 134， 137-142， 144， 153-160， 169-176， 179， 180， 185-192 ， 201-208，217-2 20，及 223 之一個或一個以上 CDR 或 FR。在一具體例中，該抗原結合蛋白質含有以上舉例說明之輕鏈 CDR1序列。在另一具體例中，該抗原結合蛋白質含有以上舉例說明之輕鏈CDR2序列。在另一具體例中，該抗原結合蛋白質含有以上舉例說明之輕鏈CDR3序列。在另一具體例中，該抗原結合蛋白質含有以上舉例說明之重鏈CDR1序列。在另一具體例中，該抗原結合蛋白質含有以上舉例說明之重鏈CDR2序列。在另一'具體例中，該抗原結合蛋白質含有以上舉例說明之重鏈CDR3序列。在另一具體例中，該抗原結合蛋白質含有以上舉例說明之輕鏈FR1序列。在另一具體例中，該抗原結合蛋白質含有以上舉例說明之輕鏈FR2 序列。在另一具體例中，該抗原結合蛋白質含有以上舉例說 . 明之輕鏈FR3序列。在另一具體例中，該抗原結合蛋白質含有以上舉例說明之輕鏈FR4序列。在另一具體例中，該抗原結合蛋白質含有以上舉例說明之重鏈FR1序列。在另一具體例中，該抗原結合蛋白質含有以上舉例說明之重鏈FR2序列。在另一具體例中，該抗原結合蛋白質含有以上舉例說明之重鏈FR3序列。在另一具體例中，該抗原結合蛋白質含有 -67- 200819466 以上舉例說明之重鏈FR4序列。在一具體例中’本發明提供一種含有一個或一個以上 CDR序列之抗原結合蛋白質，與以上所示CDR序列差異不超過5，4，3，2，或1個胺基酸殘基。在另一具體例中，該抗原結合蛋白的CDR3序列至少一者爲來自A1-A14之CDR3序列，如表1或表2所示。在另一具體例中’該抗原結合蛋白的輕鏈CDR3序列是來自表1 所示A1-A14之輕鏈CDR3序列以及該抗原結合蛋白的重鏈 CDR3序列是來自表2所示A1-A14之重鏈序列。在另一具體例中，該抗原結合蛋白質含有1，2，3，4，或5個CD R 序歹，其各自獨立以6，5，4，3，2，1，或0單一胺基酸添加、取代、及/或刪除不同於Α1-Α14之CDR序列，以及該抗原結合蛋白進一步含有1，2，3，4，或5個CDR序列，其各自獨立以6，5，4，3，2，1，或0單一胺基酸添加、取代、及/或刪除不同於C D R序列。抗體Α1-Α14之輕鏈CDR示於下列表1，以及抗體 Α1-Α14的重鏈CDR示於下列表2。 -68- 200819466 輕鏈抗體 CDR1 CDR2 CDR3 A1 SGDKLGDKYAC QDSKRPS QAWDSSTAV (SEQ ID NO: 11) (SEQ ID NO: 12) (SEQ ID NO: 13) A2 RASQGIRNNLG AASSLQS LQHNSYPWT (SEQ ID NO:27) (SEQ ID NO:28) (SEQ ID NO:29) A3 RASQGIRNDLG AASSLQS RQQNTYPLT (SEQ ID NO:43) (SEQ ID NO:44) (SEQ ID NO:45) A4 RSSQSLLHSTGYNYLD LGSFRAS MQALQTPCS (SEQ ID NO:59) (SEQ ID NO:60) (SEQ ID NO:61) A5 KSSQSILYSSNNKKYLV WTSMRES QQYYSTPWT (SEQ ID NO:75) (SEQ ID NO:76) (SEQ ID NO:77) A6 RASQSISNYLN ATSSLQS QQSYSISPT (SEQ ID NO:91) (SEQ ID NO:44) (SEQ ID NO:93) A7 RAGQGIRNDLV AASSLQS LQHNTYPFT (SEQ ID NO: 107) (SEQ ID NO:44) (SEQ ID NO: 109) A8 KSSQSILYSSNNKKYLV WTSMRES QQYYSTPWT (SEQ ID NO: 175) (SEQ ID NO:76) (SEQIDNO:125) A9 RASQGIRNNLG AASSLQS LQHNSYPWT (SEQ ID NO:27) (SEQ ID NO:44) (SEQIDNO:141) A10 SGEKWGEKYAC QDTKRPS QAWDRSTV (SEQ ID NO: 155) (SEQ ID NO: 156) (SEQ ID NO: 157) All SGDKLGDKFAF QDNKRPS QAWDSSTW (SEQ ID NO:171) (SEQ ID NO: 172) (SEQIDNO:173) A12 RASQGIRNDLG AASSLQS LQHNSYTWT (SEQIDNO:35) (SEQ ID NO:44) (SEQ ID NO: 189) A13 SGDKLGDKYVC LDNKRPS QAWDSSTV (SEQ ID NO:203) (SEQ ID NO:204) (SEQ ID NO:205) A14 SGDKLGDKYAF HDTKRPS QAWDSSTV (SEQ ID NO:219) (SEQIDNO:220) (SEQ ID NO:205) -69- 200819466

重鏈抗體 CDR1 CDR2 CDR3 Al GYTFTSYGLS WIIPYNGNTNSAQKLQ DRDYGVNYDAFDI (SEQ ID NO:14) G (SEQ ID NO: 15) (SEQ ID NO: 16) A2 GFTFSSYGMH * VIWYDGSNKYHADSV SRNWNYDNYYYGL (SE〇IDNO:30) KG(SEQIDNO:31) DV (SEQ ID NO:32) A3 GFTFSSYWMS NIKQDGSEEYYVDSVK GSSSWYYYNYGMD (SEQ ID NO:46) G (SEQ ID NO:47) V (SEQ ID NO:48) A4 GYTFTGYYIH WINPNSGGTNYAQKFQ DSGYSSSWHFDY (SEQIDNO:62) G (SEQ ID NO:63) (SEQ ID NO:64) A5 GGSINSFYWS YIYYSGSTNYNPSLKS DSIAAPFDY (SEQ ID NO:78) (SEQ ID NO:79) (SEQ ID NO:80) A6 GGSFSAYYWS EINHSGGTNYNPSLKS VQWLELAYFDY (SEQ ID NO:94) (SEQ ID NO:95) (SEQ ID NO:96) A7 GFTFISYGMH VIWYDGSTEYYADSV ERQWLYHYGMDV (SEQ ID NO: 110) KG (SEQ ID NO:111) (SEQ ID NO:112) A8 GGSINSFYWS YIYYSGSTNYNPSLKR DSIAAPFDY (SEQ ID NO:126) (SEQ ID NO:127) (SEQ ID NO:80) A9 GFTFSSYGMH VIWYDGSNKYHADSV SRNWNYDNYYYGL (SEQ ID NO: 130) KG (SEQ ID NO:31) DV (SEQ ID NO: 144) A10 GYSFTSYWIG IIYPGDSDTRYSPSFQG QGLGFDY (SEQ ID NO: 158) (SEQ ID NO: 159) (SEQ ID NO: 160) All GGSISSGGYYWS YISYSGSTYYNPSLKS AYGDYRGWFDP (SEQ ID NO: 174) (SEQ ID NO: 175) (SEQ ID NO: 176) A12 GFTFSAYGMH VIWYDGSNKYYADSV SRNWNYDSYQYGL (SEQ ID NO: 190) KG (SE〇IDNO:191) DV (SEQ ID NO: 192) A13 GYTFTSYGIS WISAYNGNTNYAQKF DQDYYDSSGWGH (SEQIDNO:206) QG(SEQ ID NO:207) (SEQ ID NO:208) A14 GYTFTSYGIS WISPYNGNTNYAQKFQ DQDYYDSSGWDP (SEQIDNO:222) G(SEQ ID NO:223) (SEQ ID NO:224) A 1 - A 1 4之核苷酸序列或A 1 - A 1 4之胺基酸序列能被改變，例如相較於未經突變之多核苷酸時，經由隨機突變或指定位置突變（例如，指定寡核苷酸之位置專一突變）以產生含有一個或一個以上特定核苷酸取代、刪除、或插入之經改變多核苷酸。製造此等變化的技術實例敘述於Walder Μ α/.，1986, Gene 42:133; Bauer et al. 1985, Gene 37:73; Craik, BioTechniques, January 1985, 12-19; Smith et al., 1981, Genetic Engineering: Principles and -70- 200819466

Me^oA，Plenumpress;以及美國專利第 4,5 1 8,584 及 4,737,462 號。這些及其他方法能用於製造例如抗-活動素A抗體的衍生物，相較於非衍生性抗體其具有所欲特性，例如增加對活動素A之親和力、活動性或專一性，增加活體內或活體外活性或穩定性，或降低活體內副作用。本發明範圍內之抗-活動素A抗體之其他衍生物包括抗 -活動素A抗體與其他蛋白質或多肽之共價或聚集共軛物或其片段，例如經由表現含有異質多肽接合到抗-活動素A抗體多肽的N-末端或C-末端之重組接合蛋白。舉例而言，共軛之胜肽可爲異質訊息（或前導（leader))多肽，例如酵母菌a-因子前導（a - factor leader)，或胜肽例如抗原決定基標籤。含抗原結合蛋白之接合蛋白能含有添加以促進抗原結合蛋白純化或鑑定之胜肽（例如聚-組胺酸）。抗原結合蛋白也能連接到女口敘述於 Hopp et al·，B i 〇/Te chn o l o gy 6:1 204， 1 9 8 8 以及美國專利第 5,011，912 號之 FLAG 胜肽 Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(DYKDDDDK)(SEQ ID NO : 22 6)。FLAG胜肽具高度抗原性且提供專一單株抗體 (mAb)可逆地結合之抗原決定基，能快速分析及易於純化所表現之重組蛋白質。可用於製備接合蛋白（其中FLAG胜肽接合到所給多肽）之試劑可獲自市售商品（Sigma，St. Louis， MO)。含一個或一個以上抗原結合蛋白之寡聚物可運用於作爲活動素A拮抗劑。寡聚物可爲共價連接或非共價連接之二聚體，三聚體，或更高寡聚物之形式。含有兩個或兩個以 -71- 200819466 上抗原結合蛋白之寡聚物的一實例是計畫以同質二聚體使用。其他寡聚物包括異質二聚體，同質三聚體，雜質三聚體，同質四聚體，雜質四聚體等等。一具體例是針對寡聚物，含有透過接合到該抗原結合蛋白之胜肽部分間共價或非共價交互作用連結之多抗原結合蛋白。此等胜肽可爲胜肽連接體（spacers)或具有促進寡聚物化作用之胜肽。白胺酸拉鍊及衍生自抗體的某些多肽是在能促進附著於抗原結合蛋白的寡聚物化作用之胜肽中，詳細如下所述。在特定具體例中，寡聚物含有二到四個抗原結合蛋白。該寡聚物之抗原結合蛋白可爲任何形式，例如上述之任何形式，例如變異體或片段。較佳爲寡聚物含有具有活動素A結合活性之抗原結合蛋白。在一具體例中，寡聚物是使用衍生自免疫球蛋白之多肽製備。含有某些異質多肽接合到抗體衍生之多肽（包括Fc功能部位）各種部分之接合蛋白的製備，已敘述於例如Ashkenazi et al » 1991 ^ PNAS USA 88 ： 10535 ； Byrn et al » 1990 ^ Nature 344 ： 677 ；以及 Hollenbaugh ei al,，1992 Curr. Prot.s in Immunol. ， Suppl. 4 ，pages 10.19.1 - 10.19.11。本發明之一具體例是針對經由接合抗-活動素A抗體之活動素A結合片段至抗體Fc區域所產生之含有兩接合蛋白之二聚體。該二聚體之製造能經由例如插入一編碼該接合蛋白之基因接合體至適當的表現載體，在以重組表現載體轉形之宿主細胞中表現該基因接合體，並使所表現之接合蛋白裝 -72- 200819466 配更像抗體分子，於是Fc部分間形成鏈間二硫鍵以產生二聚體。文中使用之用語“Fc多肽”包括衍生自抗體Fc區域多肽之天然及突變蛋白形式。也包括含有促進二聚體化之樞紐區之此等多肽的截頭形式（truncated forms)。含有Fc部分（以及從其形成之寡聚物）之接合蛋白提供以親和力色層分析經蛋白質A或蛋白質G管柱易於純化之優點。敘述於PCT申請案WO 93/1 0151(特此倂入參考）之一適當的Fc多肽，是單鏈多肽從人類IgGl抗體Fc區域之N-末端樞紐區延伸至天然C-末端。另一可用Fc多肽是Fc突變蛋白，敘述於美國專利第5,457,035號及Baum ei α/.，1 994， EMBO J· 1 3 : 3992-400 1。此突變蛋白之胺基酸序列相同於 WO 93/10151所示之天然Fc序列，除胺基酸19已從Leu改爲Ala，胺基酸20已從Leu改爲Glu，以及胺基酸22已從 Gly改爲Ala除外。突變蛋白對Fc受器展現降低的親和力。在其他具體例中，抗-活動素A抗體之重鏈及/或輕鏈的可變部分可替換抗體重鏈及/或輕鏈的可變部分。此外，寡聚物是含有多抗原結合蛋白及含或不含胜肽連接體（連接體胜肽）之接合蛋白。適宜之胜肽連接體爲美國專利第4,75 1，180及4,93 5,233號所述者。寡聚物抗原結合蛋白之另一製備方法包括使用白胺酸拉鍊。白胺酸拉鍊功能部位是促進其存在之蛋白質寡聚物化之胜肽。白胺酸拉鍊原始於數種DNA-結合蛋白中被識別 (Landschulz et al. » 1988，Science 240 ： 1759)，並自此於各 -73- 200819466 種不同的蛋白質中被發現。已知的白胺酸拉鍊爲天然存在之二聚體化或三聚體化之胜肽及其衍生物。適合用於製造可溶寡聚物蛋白之白胺酸拉鍊功能部位的實例敘述於pct申請案WO 9 4/10308，以及衍生自肺表面張力蛋白質D(SPD)之白胺酸拉鍊敘述方令 Hoppe et al. 5 1994’ FEB S Letters 344 ' 1 9 1，特此倂入參考。使用經修飾白胺酸拉鍊使能穩定的三聚體化其接合之異質蛋白質者敘述於Fanslow d ，1 994， Semin· Immunol· 6: 267-78。在一方法中，含有抗-活動素A 抗體片段或接合到白胺酸拉鍊胜肽之衍生物之重組接合蛋白，表現於適當宿主細胞中，且從培養的上清液回收可溶性寡聚物抗-活動素A抗體片段或形成之衍生物。在一方面，本發明提供抗原結合蛋白質，能妨礙活動素 A與活動素A受器之結合。能製作此等抗原結合蛋白對抗活動素A，或其片段、變異體或衍生物，並於慣用分析法中篩選能妨礙活動素A與活動素A受器結合者。適合的分析實例爲測試該抗原結合蛋白抑制活動素A與細胞表現之活動素A受器結合能力之分析，或測試抗原結合蛋白降低活動素 A與細胞表面活動素A受器結合所產生之生物或細胞反應的能力。舉例而言，如提出於第1 〇圖以及下列之實施例，能根據他們結合到固定抗體表面之能力篩選抗體（活動素A及/ 或活動素B)。本發明抗原結合蛋白之抗原結合片段可由慣用技術產生。此等片段之實例包括但不限爲Fab及F(ab，）2片段。以遺傳工程技術製造之抗體片段及衍生物也考慮其中。 -74- 200819466 額外的具體例包括嵌合型抗體，例如非人類（例如鼠科動物）單株抗體之人類化形式。此等人類化抗體可由已知技術製備，並當投與抗體到人類時給予降低免疫原性之優點。在一具體例中，人類化單株抗體含有鼠科動物抗體的可變功能部位（或其抗原結合位置全部或部分）以及衍生自人類抗體之恆定功能部位。另外，人類化抗體片段可含有鼠科動物單株抗體之抗原結合位置以及衍生自人類抗體之可變功能部位片段（缺乏抗原結合位置）。製造嵌合型之程序及進一步加工之單株抗體包括那些敘述於Riechmann以以，1988, Nature 332:323, Liu et al, 1987, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84:3439, Larrick et al., 1989, Bio/Technology 7:934，以及 Winter a/.，1993，TIPS 14 : 139。在一具體例中，該嵌合型抗體是CDR移植之抗體。人類化抗體之技術敘述於，例如美國專利第5,8 69,6 1 9，5,225,53 9， 5,821，3 3 7，5,8 59,205，· 6,881，5 5 7 號，Padlan et aL » 1 995， FASEB J· 9: 133-39，以及 Tamura et a l. 5 20005 J. Immunol. 164 ： 1432-41 ° 於非人類動物中已硏發產生人類或部分人類抗體之程序。例如經由各種方法已製備具一個或一個以上內生性免疫球蛋白基因之小鼠。人類免疫球蛋白基因已被導入小鼠中取代去活性小鼠基因。動物中製造之抗體倂入由導入動物之人類基因材料編碼之人類免疫球蛋白多肽鏈。在一具體例中’ 以活動素A多肽免疫非人類動物（例如基因轉殖老鼠），以致於動物中產生指向對抗活動素A多肽之抗體。適合之免疫原的一實例爲適合的人類活動素A’例如含 -75- 200819466 有SEQ ID NO: 225蛋白質之細胞外功能部位的多肽，或SEQ ID NO : 225蛋白質之其他免疫原性片段。製造技術及使用基因轉殖動物製造人類或部分人類抗體之實例敘述於美國專利第 5,814,318，5,569,825 及 5,545,806 號，Davis et al·，2003, Production of human antibodies from transgenic mice in Lo? ed. Antibody Engineering: Methods and Protocols, Humana Press, NJ: 191-200, Kellermann et al.5 2002, Curr Opin Biotechnol. 13:593-97, Russel et al.9 2000? Infect Immun. 68:1820-26, Gallo et al.? 2000, Eur J Immun, 30:534-40, Davis et al.9 1999, Cancer Metastasis Rev, 18:421-25, Green, 1999, J Immunol Methods. 231:11-23, Jakobovits, 1998, Advanced Drug Delivery Reviews 31:33-42, Green et al.5 1998, J Exp Med. 188:483-95, Jakobovits A, 1998, Exp. Opin. Invest Drugs. 7:607-14, Tsuda et al.5 1997, Genomics. 42:413-21, Mendez et al.? 1997, Nat Genet. 15:146-56, Jakobovits, 1994, Curr Biol 4:761-63, Arbones et al., 1994, Immunity. 1:247-60, Green et al.5 1994, Nat Genet. 7:13-21, Jakobovits et al., 1993, Nature. 362:255-58, Jakobovits et al.? 1993, Proc Natl Acad Sci USA. 90:2551-55. Chen, J.? M. Trounstine, F. W. Alt, F. Young, C. Kurahara, J. Loring, D. Huszar. Inter' l Immunol 5 (1993): 647-656, Choi et al.5 1993? Nature Genetics 4: 117-23, Fishwild et al.? 1996, Nature Biotech. 14: 845-51，Harding et al·，1995, Annals of the New York Academy of Sciences，Lonberg et al·， 1994, Nature 368: 856-59, Lonberg, 1994，Transgenic Approaches to Human Monoclonal Antibodies in Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101, Lonberg et al.5 1995, Internal Review of Immunology 13: 65-93, Neuberger, 1996, Nature Biotechnology 14: 826, Taylor et al.? 1992, Nucleic Acids Res. 20: 6287-95, Taylor et al., 1994, Interf l Immunol 6: 579-91, Tomizuka et al.? 1997, Nature Genetics 16: 133-43, Tomizuka et al.9 2000, Pro, Natf lAcad. Set USA 97: 722-27, Tuaillon et al., 1993, Pro.Natf lAcad.Sci. USA 90: 3720-24, and Tuaillon et al.? 1994, J.ImmunoL 152: 2912-20 ° -76- 200819466 在另一方面，本發明提供結合活動素A之單株抗體。單株抗體可使用技藝已知的任何技術製造，例如免疫行程安排完全後使收取自基因轉殖動物的脾臟細胞永生不死。能使用技藝已知的任何技術使脾臟細胞永生不死，例如經由融合他們與骨髓瘤細胞以製造融合瘤。用於製造融合瘤融合步驟之骨髓瘤細胞較佳爲非製造抗體、具有高融合效率且缺乏使他們無法生長於某些選擇性培養基而只支持所欲的融合細胞（融合瘤）生長的酵素。用於小鼠融合的適當細胞系實例包括 Sp-20，P3-X63/Ag8，P3-X63-Ag8.65 3，NSl/l.Ag 4 1， Sp210-Agl4，FO，NSO/U，MPC-11，MPC 1 1 -X45-GTG 1 .7 及S194/5XX0 Bui ;用於大鼠融合的適當細胞系實例包括 R210.RCY3，Y3-Ag 1·2·3，IR983F 及 4B210。可用於細胞融合的其他細胞系爲 U-266，GM 1 500-GRG2，LICR-LON-HMy2 及 UC729-6。在一具體例中，融合瘤細胞系之製造是以活動素A免疫原免疫動物（例如具有人類免疫球蛋白序列之基因轉殖動物）；從被免疫動物收取脾臟細胞；融合收取之脾臟細胞至骨髓瘤細胞系，藉此產生融合瘤細胞；從融合瘤細胞確定融合瘤細胞系並鑑定產生結合活動素A多肽之抗體的融合瘤細胞系。此等融合瘤細胞系及由他們產生之抗-活動素A單株抗體包含於本發明中。融合瘤細胞系分泌之單株抗體能使用技藝已知的任何技術純化。可進一步篩選融合瘤或單株抗體以鑑定具特殊性質之單株抗體，例如阻礙活動素A誘發活性之能力。此等篩 -77- 200819466 選的實例提供於以下實施例中。抗體結合位置中心中互補決定區域（CDR)的分子演化也已經用於單離具增加親和力之抗體，例如，對c-erbB-2 具增加親和力之抗體，敘述如8〇11丨61*6((3/.，1996，《/.^/0/· 以〇/· 263 : 55 1。因此，此等技術可用於製備對活動素A之抗體。指向對抗活動素A之抗原結合蛋白能用於活體外或活體內，例如分析偵測活動素A多肽的存在。該抗原結合蛋白亦可用於免疫親和力色層分析法純化活動素A蛋白質。額外能阻礙活動素A結合的那些抗原結合蛋白質，可用於抑制因此結產生的生物活性。阻斷抗原結合蛋白能用於本發明之方法。作用爲活動素A拮抗劑之此等抗原結合蛋白可用於治療任何活動素A有關症狀，包括但不限爲惡病質。在一具體例中，經由涉及免疫基因轉殖小鼠步驟所產生的人類抗-活動素A單株抗體，用於治療此等症狀。雖然人類、部分人類或人類化抗體應適於任何應用，特別是那些涉及投與抗體到人類患者，但其他種類的抗原結合蛋白應也適於某些應用。本發明之非人類抗體，例如‘能衍生自任何製造抗體的動物，例如小鼠，大鼠，兔子，山羊，驢，或非人類靈長類（例如猴子（例如獼猴或恆河猴）或大猩猩（例如黑猩猩））。本發明之非人類抗體能用於，例如在活體外及細胞培養系之應用，或任何其他應用，其中對本發明抗體之免疫反應不發生、是微小的、能預防的、是無影響的、或爲所欲的。在一具體例中，本發明之非人類抗體是對非人類患 -78- 200819466 者投與。在另一具體例中’非人類抗體在非人類患者不會引起免疫反應。在另一具體例中’非人類抗體是來自與非人類患者相同物種，例如本發明之小鼠抗體是對小鼠投與。來自特殊物種抗體之製造’例如能經由以所欲免疫原（例如’可溶性活動素A多肽）免疫該物種之動物；或使用產生該物種抗體用之人造系統（例如’產生特殊物種抗體用之細菌或噬菌體展現爲基礎之系統）；或從一物種轉換抗體爲來自另一物種的抗體，其係例如以來自其他物種的恆定區域取代該抗體的恆定區域，或經由取代抗體的一個或一個以上胺基酸殘基以致更接近來自其他物種抗體的序列。在一具體例中，該抗體是嵌合型抗體’含有衍生自來自兩種或兩種以上不同物種抗體之胺基酸序列。抗原結合蛋白可由數種常見技術之任一種製備。例如使用技藝已知的任何技術他們可純化自天然表現他們的細胞 (例如，能從產生他們的融合瘤純化抗體），或製造於重組表現系統。例如參閱 Monoclonal Antibodies，Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet et al. (eds.)5 Plenum Press, New York (1980); and Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Land (eds.)? Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，（1988) o 技藝已知的任何表現系統能用於製造本發明之重組多肽。一般言之，宿主細胞是經含有編碼所欲多肽之DNA的重組表現載體轉形。宿主細胞中可利用者爲原核細胞，酵母菌或更高等的真核細胞。原核細胞包括格蘭氏陰性或格蘭氏陽性微生物，例如大腸桿菌（E. 或桿菌（Baci//〇。更高 -79- 200819466 等的真核細胞包括昆蟲細胞及哺乳動物來源建立之細胞系。適當哺乳動物宿主細胞系之實例包括猴腎細胞COS-7 系（ATCC CRL 1 65 1 )(Gluzman et al.，1981，Cell 23 ： 175)， L 細胞，293 細胞，Cl 27 細胞，3T3 細胞（AT C C C C L 1 6 3)，中國倉鼠卵巢（CHO)細胞，HeLa細胞，BHK(ATCC CRL 10) 細胞系，以及衍生自非洲綠猴腎細胞系CVI之CVI/EBNA 細胞系（ATCC CCL 70)，敘述如 McMahan et al^ 1991^ EMBO J· 1 0 : 282 1。用於細菌，真菌，酵母菌及哺乳動物細胞宿主之合適的選殖及表現載體敘述於Pouwels a/. (C/onhg Vectors: A Laboratory Manual，Elsevier， New York, 1 98 5 )。經轉形細胞能於促進多肽表現之條件下培養，並以慣用蛋白質純化程序回收多肽。此等純化程序之一包括使用親和力色層分析法，例如，越過具有結合有活動素A全部或部分 (例如，細胞外功能部位）之基質。本文中考慮使用之多肽包括實質均一的重組哺乳動物抗-活動素A抗體多肽，其實質不含污染之內生性物質。可爲所欲特性經由數種已知技術製備及篩選抗原結合蛋白。某些技術涉及單離編碼感興趣抗原結合蛋白（例如抗_ 活動素A抗體）之多肽鏈（或其部分）的核酸，並透過重組〇ΝΑ 技術操作該核酸。舉例而言，核酸可被接合到另一感興趣的核酸’或經改變（例如，經由突變作用或其他慣用技術）以添加、刪除或取代一個或一個以上胺基酸殘基。在一方面，本發明提供本發明抗-活動素A抗體之抗原結合片段。此等片段能完全由抗體衍生之序列組成或能含有 -80- 200819466 額外序列。抗原結合片段之實例包括Fab，F(ab’）2，單鏈抗體，雙鏈抗體（diabodies) ’三鏈抗體（triabodies)，四鏈抗體 (tetrabodies)，以及功能部位抗體。其他實例提供於Lunde Μ a I.，2002，Biochem. S o c. Trans. 3 0 : 500-06 o 單鏈抗體可透過胺基酸橋（短胜肽連接體）經由連接重鏈及輕鏈可變功能部位（Fv區域）片段而形成，導致單一多肽鏈。此等單鏈Fvs(SCFvS)已於編碼兩可變功能部位多肽（Vl 及VH)之DNA間經由接合編碼胜肽連接體之DNA來製造。所得多肽能自行摺疊回去以形成抗原結合單體，或他們能形成多聚物（例如，二聚體，三聚體，或四聚體），視兩可變功能部位間之可彎曲連接體的長度而異（Kortt d α/.，1997， P rot, Eng · 10:423; Kortt et a L » 2001 > Biomol, Eng. 18 ^ 95- 1 08)。經由組合不同之含VL及VH的多肽，有一者能形成結合不同抗原決定基之多聚物型 scFvs(Kriangkxxm d al. ^ 200 1 ^ Biomol. Eng. 18 ： 31-40)。製造單鏈抗體已硏發之技術包括那些敘述於美國專利第4,946,778號；Bird，1988, Science 242:423; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879; Ward et al., 1989, Nature 334:544, de Graaf et al., 2002, Methods Mol Biol. 178:379-87。衍生自文中所提供抗體（包括但不限爲含有可變功倉g 咨β 位糸且合 L1H1， L2H2, L3H3, L4H4 , L5H5, L6H6, L7H7 ， L8H8, L9H9, L10H10, L11H11， L12H12, L13H13,及 L14H14 之scFvs)之單鏈抗體包含於本發明。· 本發明之抗原結合蛋白（例如，抗體，抗體片段及抗體衍生物）能含有技藝已知的任何恆定區域。輕鏈恆定區域能 -81- 200819466 爲，例如K-或λ-型輕鏈恆定區域，例如，人類K-或λ-型輕鏈恆定區域。重鏈恆定區域能爲，例如a-、d-、e-、γ-或μ-型重鏈恆定區域，例如人類a -、d -、e -、γ ·或μ -型重鏈恆定區域。在一具體例中，該輕鏈或重鏈恆定區域是天然存在之恆定區域的片段，衍生物，變異體，或突變蛋白。從感興趣抗體衍生不同亞型或同型物抗體的技術是已知的，亦即，亞型交換（subclass switching)。因此例如IgG 抗體可衍生自IgM抗體，反之亦然。此等技術使新抗體的製備具有所給抗體（親代抗體）之抗原結合特性，但也展現與抗體同型物或不同於親代抗體之亞型有關之生物特性。可運用重組DNA技術。編碼特殊抗體多肽之經選殖DNA可用於此等程序中，例如，編碼抗體所欲同型物恆定功能部位之 DNA。亦參閱 Lantto α/·，2002，心 Μο/· 178:303-16 。在一具體例中，本發明之抗原結合蛋白質含有任何 Α1-Α14(Η1-Η14)之 IgGl 重鏈功能部位或任何 A1-A14(H1-H14)之IgGl重鏈功能部位片段。在另一具體例中，本發明之抗原結合蛋白質含有A1-A14 (L1-L14)之κ輕鏈恆定鏈區域，或A1-A14 (L1-L14)之κ輕鏈恆定區域片段。在另一具體例中，本發明之抗原結合蛋白質含有A 1_A1 4 (L1-L14)之IgGl 重鏈功能部位或其片段以及 A1-A14 (L1-L14)之κ輕鏈功能部位或其片段。因此，本發明之抗原結合蛋白包括含有例如可變功能部位組合 L1H1 ’ L2H2，L3H3，L4H4，L5H5，L6H6，L7H7， -82- 200819466 L8H8，L9H9，L10H10，L11H11，L12H12，L13H13，RL14H14, 具有所欲同型物（例如，IgA，IgGl，IgG2，IgG3，IgG4，IgM， IgE，及IgD)及其Fab或F(ab’）2片段者。再者，若IgG4爲所欲，其亦可視需要導入點突變（CPSCP -> CPPCP)於樞紐區，如 Bloom d α/·，1 997，Pronin Sck/rce 6:407 所述，倂入本文參考）以減輕能導致IgG4抗體異源性之內部-H鏈二硫鍵形成的傾向。在一具體例中，.該抗原結合蛋白質具有〖。^爲1χ1(Γ4 s_1或更低。在另一具體例中，KQff爲5xl0_5 s·1或更低。在另一具體例中，KQff爲實質相同於具有選自由L1H1，L2H2， L3H3，L4H4，L5H5，L6H6，L7H7，L8H8，L9H9，L10H10， L11H11，L12]H12，L13H13，及 L14H14 所組組合群組之輕鏈及重鏈可變功能部位序列組合之抗體。在另一具體例中，抗原結合蛋白以如含有一種或一種以上CD Rs之抗體實質相同Κ。^結合至活動素 A，其中 CDRs係來自具有選自由 L1H1，L2H2，L3H3，L4H4，L5H5，L6H6，L7H7，L8H8， L9H9， L10H10， L11H11， L12H12， L13H13，及 L14H14 所組組合群組之輕鏈及重鏈可變功能部位序列組合之抗體。在另一具體例中，抗原結合蛋白以如含有一種上述舉例之胺基酸序列之抗體實質相同Κ。^結合至活動素A。在另一具體例中，抗原結合蛋白以如含有一種或一種以上CDRs之抗體實質相同Κ。”結合至活動素A，其中CDRs係來自含有一種上述舉例之胺基酸序列之抗體。

如文中使用，用語“人類活動素 A”意指包括SEQ ID -83- 200819466 Ν Ο : 1蛋白質及其對偶變異體。活動素A能從已經由編碼活動素A之基因轉形之宿主細胞，使用Heparin HP管柱，利用鹽梯度經由溶析宿主細胞培養液的過濾上清液純化出。用語“抗體”是指完整的抗體或其結合片段。抗體可含有完整的抗體分子（包括多株，單株，嵌合型，人類化，或具有全長重鏈及/或輕鏈之人類形式），或含有其抗原結合片段。抗體片段包括F(ab’）2，Fab，Fab’，Fv，Fc，及Fd片段，且能倂入單一功能部位抗體，單鏈抗體，最大抗體 (maxibodies)，最小抗體（minibodies)，內抗體（intrabodies)，雙鏈抗體（diabodies)，三鏈抗體（triabodies)，四鏈抗體 (tetrabodies)，v-NAR 及 bis-scFv(參閱例如，Hollinger and Hudson， 2005 ，， 23 ， 9， 1 1 26- 1 1 3 6)。抗體多肽也敘述於美國專利第6，7 0 3，1 9 9號，包括纖維網蛋白多肽單鏈抗體。其他抗體多肽揭示於美國專利公開第 2005/023 8646號，其爲單鏈多肽。衍生自抗體的抗原結合片段能獲自，例如經由抗體的蛋白質水解’例如依照慣用方法之整個抗體的胃蛋白酶或木瓜蛋白酶分解作用。經由實施例，以胃蛋白酶經由抗體的酵素裂解（酵素裂解）以提供5S片段稱爲F(ab，）2能產生抗體片段。能使用硫醇還原劑進一步裂解此片段以產生3.5 S F ab ’ 單價片段。視需要，能使用二硫鍵裂解產生之硫氫基 (sulfhydryl group)用阻斷基進行裂解反應。另外，使用木瓜蛋白酶的酵素裂解直接產生兩單價Fab片段及一 Fc片段。适些方法欽述於，例如 G ο 1 d e n b e r g的美國專利第號 -84- 200819466 4，3 3 1，ό 4 7，NisonofF et aL, Arch. Biochem. Biophys. 89:230, 1960; Porter, Biochem. J. 73:119, 1959; Edelman et al.^ in Methods in Enzymology 1:422 (Academic Press 1967); and by Andrews, S.M. and Titus, J.A. in Current Protocols in Immunology (Coligan J.E., et aL, eds)，John Wiley & Sons，New York (2003)，pages 2·8·1-2·8·10 and 2·10Α·1-2·10Α·5。裂解抗體之其他方法，例如分割重鏈以形成單價輕鏈-重鏈片段 (Fd)，亦可使用進一步的片段裂解，或其他酵素、化學、或遺傳技術，只要該片段結合至完整抗體可辯認之抗原。抗體片段亦可爲任何合成或基因工程蛋白質。舉例而言，抗體片段包括由輕鏈可變區域組成之經單離片段，由重鏈及輕鏈可變區域組成之“Fv”片段，重組單鏈多肽分子；其中輕鏈及重鏈可變區域是以胜肽連接體連接（scFv蛋白質）。抗體片段的另一形式是含有抗體之一個或一個以上互補決定區域（CDR)之胜肽。CDRs(也稱爲“最小辨認單位”或 “高可變區域”）能經由構築編碼感興趣CDR之多核苷酸來獲得。此等多核苷酸之製備是經由，例如使用聚合酶鏈鎖反應，利用產抗體細胞之mRNA爲模板形成可變區域（參閱例如 luarricii et al.. Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106, 1991; Courtenay-Luck, “Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies，” in Monoclonal

Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application^ Ritter et al (eds.)? page 166 (Cambridge University Press 1995); and Ward et al, “Genetic Manipulation and Expression of Antibodies，” in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al, (eds.)? page 137 (Wiley-Liss，Inc· 1995))。因此，在一具體例中，結合劑含有至少一如文中所述之 CDR。結合劑可含有至少如文中所述之二、三、四、五或六 -85- 200819466 CDR。結合劑進一步可含有至少一如文中所述之抗體可變區域功能部位。可變區域功能部位可爲任何大小或胺基酸組成物’且一般將含有至少一負責結合人類活動素A之CDR序列，例如文中專一敘述之 CDR-H1，CDR-H2，CDR-H3及/ 或輕鏈CDRs，且其鄰接於一個或一個以上骨架序列或於骨架中。在一般用語中，可變（V)區域功能部位可爲免疫球蛋白重鏈（VH)及/或輕鏈（VL)可變功能部位之任何適當排列。因此，例如V區域功能部位可爲單體及爲VH或VL功能部位，其能以如下所述親和力至少相當於1 X 1 (Γ7Μ或更低獨立結合人類活動素Α。另外，V區域功能部位可爲二聚體且含有 VH-VH、VH-VL或VL-VL之二聚體。V區域二聚體含有可爲非共價連結（本文以下稱爲Fv)之至少一 VH及至少一 Vl鏈。視需要，鏈可爲直接共價偶合，例如經由兩可變功能部位間之二硫鍵，或透過連接體（例如胜肽連接體）以形成單鏈 Fv(scFv) 0 可變區域功能部位可爲任何天然存在之可變功能部位或其經設計型。經設計型意指已使用重組DNA工程技術產生之可變區域功能部位。此等經設計型包括，例如產生自專一抗體可變區域經由插入、刪除或改變於或至專一抗體之胺基酸序列。特殊實例包括經設計可變區域功能部位，其含有至少一 CDR及可有一個或一個以上來自第一抗體之骨架胺基酸及來自第二抗體可變區域功能部位之剩餘者。可變區域功能部位可在C-末端胺基酸共價附著到至少一其他抗體功能部位或其片段。因此，例如存在於可變區域

V -86- 200819466 功能部位的VH功能部位可連接至免疫球蛋白CH 1功能部位或其片段。同樣地，VL功能部位可連接到CK功能部位或其片段。在此方面，例如該抗體可爲Fab片段，其中抗原結合功能部位含有關聯之VH及VL功能部位在他們的C-末端分別共價連接至CH1及CK功能部位。CH1功能部位可另以胺基酸延伸，例如以提供Fab片段存在之樞紐區或部分樞紐區功能部位，或以提供進一步的功能部位，例如抗體CH2及 CH3功能部位。如文中所述，抗體含有這些CD Rs至少一種。例如一種或一種以上CDR可倂入已知抗體骨架區域（IgGl，IgG2等等），或共軛與適當運載體（vehicle)以增強其半衰期。適當運載體包括但不限爲Fc，聚乙二醇（PEG)，白蛋白，鐵傳遞蛋白等等。這些及其他適食運載體爲技藝已知。此等共軛CDR 胜肽可爲單體，二聚體，四聚體，或其他形式。在一具體例中，一種或一種以上水溶性聚合物結合在一個或一個以上專一位置，例如在結合劑的胺基末端。在某些較佳具體例中，抗體含有一種或一種以上水溶性聚合物連接物，包括但不限爲聚乙二醇，聚氧乙二醇，或聚丙二醇。參閱，例如美國專利第4,640,8 3 5，4,496,689， 4,301，144，4,670，.417，4,791，192 及 4，1 79,3 3 7 號。在某些具體例中，衍生之結合劑含有一種或一種以上單甲氧基-聚乙二醇，蔔聚糖，纖維素，或其他碳水化合物系聚合物，聚 -(N -乙烯基吡咯酮）-聚乙二醇，丙二醇均聚物，聚環氧丙烷/ 環氧乙烷共聚物，聚氧乙基化多元醇（例如甘油）及聚乙烯 -87- 200819466 醇，以及此等聚合物之混合物。在某些具體例中，一種或一種以上水溶性聚合物是隨基附著於一個或一個以上側鏈。在某些具體例中，PEG能作用以促進結合劑（例如抗體）之治療能力。某些此等方法已討論於例如美國專利第6，1 3 3,426 號，其於任何目的特此倂入參考。應知如果抗體保留結合專性，本發明之抗體可具有至少一胺基酸取代。因此，抗體結構的修飾包括在本發明範圍內。這些可包括胺基酸取代，其可爲保留性或非保留性，且但不會破壞抗體的活動素A結合能力。保留性胺基酸取代可包含非天然發生的胺基酸殘基，其典型以化學胜肽合成倂入而非以生物系統合成。追些包括擬狀（peptidomimetics)及胺基酸部分之其他翻轉或顛.倒形式。保留性fl安基酸取代亦可包括以非天然殘基取代天然胺基酸殘基，以致在那位置對胺基酸殘基的極性或電荷有些微或無影響。非保留性取代可包括胺基酸或胺基酸模擬物的一類之成員交換爲來自具不同物理性質（例如大小，極性，疏水性，電荷）之另一類成員。此等經取代殘基可導入與非人類抗體同源之人類抗體的區域，或導入分子的非同源區域。再者，熟習該項技藝者可製造含有單一胺基酸取代於每一所欲胺基酸殘基之測試變異體。然後能使用熟習該項技藝者已知的活性分析法篩選變異體。此等變異體能用於收集有關適宜之變異體的資訊。舉例而言，若發現特定胺基酸殘基改變將造成破壞、不欲地降低或不適宜活性，則可避免具此變化之變異體。換言之，根據此等例行實驗所收集之資料， -88- 200819466 熟習該項技藝者能輕易決定應該避免胺基酸的進一步取代 (單獨或組合其他突變）。熟習該項技藝者使用熟知技術應能決定文中提出之多肽的適宜變異體。在某些具體例中，熟習該項技藝者經由對準對活性不被認爲重要的區域而可鑑定出可被改變但不破壞活性之分子的適當區域範圍。在某些具體例中，能鑑定出在類似多肽間是保留性之分子殘基及部分。在某些具體例中，即使對生物活性或結構可能是重要的區域範圍，可進行保留性胺基酸取代而未破壞生物活性或對多肽結構無不利影響。，此外，熟習該項技藝者能評論結構-功能硏究鑑定類似多肽中對活性或結構是重要的殘基。鑑於此等比較，能預測胺基酸殘基在·蛋白貧的重要性，其係對應於類似蛋白質中對活性或結構是重要的胺基酸殘基。爲此預測之重要的胺基酸殘基，熟習該項技藝者可選擇化學性類似胺基酸取代。熟習該項技藝者亦能分析有關類似多肽之結構的三維結構及胺基酸序列。鑑於此等資訊，關於其三維結構，熟習該項技藝者可預測抗體之胺基酸殘基的排列。在某些具體例中，熟習該項技藝者可選擇不對預測將在蛋白質表面之胺基酸殘基產生基團改變，因爲此等殘基可能涉及與其他分子的重要加互作用。已有許多科學發表致力於二級結構的預測。參閱Moult J. ^Curr. Op. in Biotech. ^ 7(4) ： 422-427 (1996) ^ Chou et al^Biochem. ^ 13(2) ： 222-245 (1974)； Chou et al. ^ Biochem. ^113(2)^211-222 (1974) i Chou et al^Adv. Enzymol Relat. Areas Mol -89- 200819466

Biol j 47 · 45-148 (1978) ； Chou etai » Ann. Rev. Biochem. » 47 * 251-276 and Chou et al. j 所J.，26 : 367-384 (1979)。再者，目前可得到電腦程式協助預測二級結構。預測二級結構之一方法是依據同源性模擬法 (homology modeling)。例如，具有序列相同性（identity)大於 3 0 %或類似性（s i m i 1 a r i t y )大於4 0 %之兩多肽或蛋白質，通常具有類似的結構拓樸學。蛋白質結構資料庫（PDB)的近曰成長已提供增強二級結構的預測性，包括多肽若蛋白質結構中的可能摺疊數。參閱 Holm d a/·，A^c/· 丄，27(1): 244-247 (1999)。已提議（Brenner ei α/.，Cwrr. Ο;?. 57 rwC. 5h/·，7(3): 369-376 (1997))所給多肽或蛋白質中具有有限的摺疊數，且一旦結構的關鍵性數目被解決，結構預測將引人注目地變得更準確。預測二級結構之額外方法包括“線程化（threading)” (Jones ? Ό. 1 Cur r. O pin. Struct. Biol. ^ 7(3)* 377-87 (1997)； Sippl er a/·，4(1):15-19 (1996))，“槪廓分析 (profile analysis) 5,( Bowie et ah 5 Science ^253 * 164-170 (1991) ； Gribskov et al. » Meth. Enzym. j 183 ' 146-159 (1990) ； Gribskov et al > Proc. Nat. Acad. Sci. j 84(13) * 4355-4358 (1987))，以及“演化關聯性（evolutionary linkage)”（參閱 Holm，supra (1 999)，and Brenner，supra ( 1 997)) o 在某些具體例中，抗體的變異體包括糖化變異體，其中相較於親代多肽的胺基酸序列，糖化位置數及/或類型已經改變。在某些具體例中，變異體含有比天然蛋白質更多或更少的N-連接之糖化位置數。N-連接之糖化位置之特徵爲有序列：Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中以X標示之胺基酸殘 -90- 200819466 基可爲任何胺基酸殘基，但脯胺酸除外。胺基酸殘基之取代以產生此序列，提供添加N-連接之碳水化合物鏈用的可能新位置。另外，消除此序列之取代可移除存在之N -連接之碳水化合物鏈。所提供亦爲重新排列之N-連接之碳水化合物鏈，其中一個或一個以上N —連接之糖化位置（通常爲那些天然產生的）被消除以及產生一個或一個以上新的N-連接位置。額外較佳之抗體變異體包括半胱胺酸變異體，其中相較於親代胺基酸序列，一個或一個以上半胱胺酸殘基被刪除或取代其他胺基酸（例如絲胺酸）。當抗體必須再摺疊爲生物活化構形時，半胱胺酸變異體可用於，例如單離不溶性包涵體之後。半胱胺酸變異體通常比天然蛋白質具有較少的半胱胺酸殘基，以及通常具有偶數以將未配對半胱胺酸造成的交互作用降至最低。所欲胺基酸取代（不論保留性或非保留性）能由熟習該項技藝者決定，當需要如此取代時。在某些具體例中，胺基酸取代能用於鑑定文中所述抗體對活動素A的重要殘基，或增加或減少抗體對活動素A的親和力。根據某些具體例，較佳的胺基酸取代爲：（1)降低對蛋白水解的感受性，（2)降低對氧化的感受性，（3)改變形成蛋白質複合體之結合親和力，（4)改變結合親和力及/或（4)賦予或修飾其他物化或功能特性於此等多肽。根據某些具體例，單一或多胺基酸取代（在某些具體例中，保留性胺基酸取代）可製作於天然存在之序列中（於某些具體例中，在形成分子間接觸之功能部位外部的多肽部分）。在某些具體例中，保 -91- 200819466 留性胺基酸取代通常可不實質改變親代序列的結構特徵（例如，取代的胺基酸不應易於毀壞存在於親代序列之螺旋，或瓦解親代序列特徵之其他類型的二級結構）。技藝辨認之多肽二級及三級結構的實例敘述於 Proteins，Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed.9 W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds.? Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)) ； liXRThomton etal. Nature 354 ： 105(1991) » 其各倂入本文參考。在某些具體例中，本發明之抗體可與聚合物、脂質或其他部分化學鍵結。結合劑可含有至少一文中所述CDRs倂入生物相容性骨架結構。在一實施例中，生物相容性骨架結構含有多肽或其中足以形成構形穩定結構支持者之部分，或骨架，賓嘗架，其能展現一個或一個以上的胺基酸序列結合到抗原（例如， CDRs，可變區域等等）於局部表面區域。此等結構能爲天然存在之多肽或多肽“摺疊”（結構模體），或相對於天然存在之多肽或摺疊能具有一個或一個以上修飾，例如胺基酸的添加、刪除或取代。這些支架能衍生自任何物種（或一種以上物種，例如人類，其他哺乳動物，其他脊椎動物，無脊椎動物，植物，細菌或病毒）的多肽. 典型的生物相容性骨架結構是依據除免疫球蛋白功能部位以外的蛋白質支架或骨架。例如，可使用那些依據纖維網蛋白，錨蛋白（ankyrin)，脂質傳載蛋白（lipocalin)，新卡立司達丁（neocarzinostain)，細胞色素 b，CP1 鋅指，PST1，捲曲螺旋（coiled coil)，LACI-D1，Z功能部位以及澱粉酶抑 -92- 200819466 肽（tendamistat)功會g 部位（參閱例如，Nygren and Uhlen， 1997 ， Curr. Op in. in Struct. Biol. 9 7 ? 463-469)。應知本發明之抗體包括文中敘述之人類化抗體。人類化抗體例如文中敘述能使用熟習該項技藝者已知技術製造者 (Zhang, W.5 et al, Molecular Immunology. 42(12):1445-1451^ 2005; Hwang W. et aL, Me从oife· 36(7力35-42, 2005; Dali’ Acqua WF，β a/·，·3(5(7):43-60, 2005;以及 Clark， Μ.，2/(^:397-402, 2000)。此外，熟習該項技藝者應辨認適當結合劑，包括這些抗體的部分，例如一個或一個以上如文中專一揭示之 CDR-H1，CDR-H2，CDR-H3，CDR-L1，CDR-L2 及 CDR-L3。至少一 CDR-H1，CDR-H2，CDR-H3，CDR-L1，CDR-L2 及 CD 的區域可具有至少一胺基酸取代，但該抗體保留非經取代之CDR的結合專一性。抗體的非CDR部分可爲非蛋白質分子，其中結合劑交叉阻斷文中揭示之抗體結合到活動素A及/或中和活動素A。抗體的非CDR部分可爲非蛋白質分子，其中該抗體以至少一抗體A1-A14顯現在競爭結合分析中對人類活動素A胜肽展現類似的結合模式，及/或中和活動素A。抗體的非CDR部分可由胺基酸組成，其中該抗體是重組結合蛋白質或合成胜肽，以及該重組結合蛋白質交叉阻斷文中揭示之抗體結合到活動素A及/或中和活動素 A。抗體之非CDR部分可由胺基酸組成，其中該抗體是一重組抗體，且該重組抗體以至少一抗體Ai_A14顯現在人類活動素A胜肽抗原決定基競爭結合分析中（敘述於下文中）對人類活動素A胜肽展現類似的結合模式，及/或中和活動素a。 -93- 200819466 當抗體含有如上所述一個或一個以上 CDR-H1， CDR-H2，CDR-H3，CDR-L1，CDR-L2 及 CDR-L3，其可從含有編碼這些序列的DNA之宿主細胞表現獲得。編碼每一 CDR序列的DNA可依據CDR的胺基酸序列決定，以及使用寡核苷酸合成技術、指定位置之突變及聚合酶鏈鎖反應（PCR) 技術與任何所欲抗體可變區域骨架及恆定區域DNA序列一起合成爲宜。編碼可變區域骨架及恆定區域之DNA對熟習該項技藝者可從基因序列資料庫例如GenBank®廣泛獲得。一旦合成，編碼本發明抗體或其片段之DNA可根據核酸切除、連接（ligation)、轉形及轉染用各種任何已知程序，使用任何已知表現載體來增殖及表現。因此，在某些具體例中抗體片段的表現較佳可於原核宿主，例如大腸桿菌 eo/i)(參閱例如，Pluckthun d α/·， 1989 心五nzymo/· 178:497-5 1 5)。在其他某些具體例中，抗體或其片段的表現較佳可於真核宿主細胞，包括酵母菌（例如， S a c ch a r o my c e s cerevisiae ， Schizosaccharomyces ，以及，動物細胞（包括哺乳動物細胞）或植物細胞。適宜之動物細胞實例包括但不限爲骨髓瘤細胞 (例如小鼠NSO系），COS，CHO，或融合瘤細胞。植物細胞的實例包括菸草，玉米，大豆及稻米細胞。一個或一個以上含有編碼抗體可變及/或恆定區域之 DNA之可複製表現載體，可製備並用於轉形適當的細胞系，例如，非製造型骨髓瘤細胞系，例如小鼠NSO系或細菌例如大腸桿菌（五· ，其中將出現抗體的製造。爲得到有效 •94- 200819466 的轉錄及轉譯，每一載體的DNA序列應包括適當的調節序列，特別是啓動子及前導序列操作性連接到可變功能部位序列。於此方面，製造抗體之特別方法爲一般熟知且例行使用者。例如基礎分子生物學程序，敘述於Maniatis ei a/. (Mo/ecw/ar Cloning 9 A Laboratory Manual » 2nd ed. » Cold Spring Harbor Laboratory 5 New York，1989 ;亦參閱 Maniatis a/，3rd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory’New York，（2001))。DNA 定序能如 Sanger d a/. (PNAS 7 4 : 5 4 6 3，（ 1 9 7 7))及 Am er s h am International pic 定序手冊所述進行，以及指定位置突變能根據技藝已知之方法進行 (Kramer et alf Nucleic Acids Res. 12:9441, (1984); Kunkel Proa Natl. Acad. Set USA 82:488-92 (1985); Kunkel et al, Methods in Enzymol 154:367-82 (1987); the Anglian Biotechnology Ltd. handbook)。此外，許多刊物敘述適用於經由D N A 操作、創造表現載體、以及轉形與適當的細胞培養來製備抗體之技術（Mountain A and Adair, J R in 所Gen抽 Reviews (ed. Tombs, M P5 105 Chapter 1? 1992, Intercept, Andover, UK); ^Current Protocols in Molecular Biology，, 1999, F.M. Ausubel (ed.)5 Wiley Interscience, New York) ° 此處希望改善根據本發明含有一個或一個以上上述 CDRs之抗體的親和力，其能經由數種親和力成熟方法達成，包括維持 CDRs(Yang 以 a/.，Μο/· ’ 2 54 ’ 392-403，1995)，鏈改組（chain shuffling)( Marks α/.，叹少，10，779-783，1 992)，使用大腸桿菌（五· α/ζ··) 突變株（Low a/·，J· Mo/· 5 ίο/.，250，350-368，1996)， DNA 改組（DNA shuffling)(Patten et al. ， Curr. Op in. 5 / ，8，724-733，1997)，菌體展現（Thompson ei -95- 200819466 al. ，J· Mol, Biol. ， 256， 7-88 ， 1 996)以及个生 PCR(sexual PCR)(Crameri，et al·，f w re，3 9 1，2 8 8 - 2 9 1，1 9 9 8 )。親和力成熟之全部此等方法討論於 Vaughan W Biotech. ， 16， 535-539 ， 1998)。根據本發明之其他抗體可經由文中所述及技藝已知的慣用免疫及細胞融合步驟獲得。本發明之單株抗體可使用各種已知技術產生。一般而言，結合專一抗原之單株抗體可由熟習該項技藝者已知的方法獲得（例如參閱Kohler W d，Atowe 256 · 495 »1975 i Coligan et al (eds.)» Current Protocols in ImmunologyJ1： 2.5.12.6.7 (John Wiley&Sonsl991);美國專利第 RE 32,011，4,902,614，4,543,439 及4,411，993號；單株抗體，歲合磨·· jTVew⑼Won m所o/ogica/乂脱如以， Plenum Press，Kennett，McKeam，and Bechtol (eds·) (1980);以及疏變：J Ια如rato/y Manual ^ Harlow and Lane (eds.) » Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988) ί Picksley et al j ^Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli^ in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition^ Glover et al (eds.)5 page 93 (Oxford University Press 1995))。使用任何適當的標準技術，例如蛋白水解作用，或可經由蛋白水解作用（例如使用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶）隨後緩慢還原二硫鍵並烷基化可從其衍生出抗體片段。另外，此等片段亦可由文所述之重組基因工程技術產生。單株抗體之獲得能根據技藝已知及文中所述方法，經由注射含有SEQ ID NO : 66之人類活動素A或其片段之免疫原於動物，例如大鼠，倉鼠，兔子，或較佳小鼠’例如包括基因轉殖或剔除如技藝已知。專一抗體製造的存在可在初次注射後及/或追加注射後監控，其係經由取得血清樣品並使 -96- 200819466 用技藝已知及文中所述數種免疫偵測方法之任何一種偵測結合人類活動素A或胜肽之抗體的存在。從製造所欲抗體之動物移除淋巴樣細胞（最常爲脾臟或淋巴結的細胞）以得到 B-淋巴細胞。然後B淋巴細胞與經藥敏化的骨髓瘤細胞融合搭檔融合，較佳爲與被免疫動物同源以及可有其他所欲性質 (例如，不能表現內生性Ig基因產物，例如 P3X63-Ag 8.653(ATCC No· CRL 1580); NSO，SP20)以製造融合瘤，其爲不死的真核細胞系。淋巴樣（例如脾臟）細胞及骨髓瘤細胞可以膜融合促進劑（例如聚乙二醇或非離子性清潔劑）結合數分鐘，然後以低密度置於支持融合瘤細胞生長但不支持未融合之骨髓瘤細胞生長之選擇性培養基。較佳的選擇性培養基爲HAT (次黃嘌呤，胺基蝶呤，胸腺核苷）。足夠時間後，通常約一至兩週可觀察細胞群落。單離單一群落，以及使用各種技藝已知及文中所述的免疫分析任一種經由細胞製造之抗體可測試對人類活動素A的結合活性。選殖融合瘤（例如經由有限稀釋選殖或經由軟瓊脂溶菌斑單離）並選擇及培養產生專一於活動素A之抗體的陽性選殖株。來自融合瘤培養之單株抗體可從融合瘤培養上清液單離。製造鼠科動物單株抗體的另一方法是注射融合瘤細胞到同源小鼠的腹膜腔〔例如經處理之小鼠（例如已接觸異十九烷）〕以促進含單株抗體之腹水的形成。單株抗體能經單離並經由各種已建立的技術純化。此等單離技術包括蛋白質-A Sepharose、尺寸排除色層分析法及離子交換色層分析 -97- 200819466 之親和力色層分祈（例如參閱 Coligan at pages 2·7· 1-2.7.12 and pages 2.9.1-2.9.3; Baines et al, “Purification of Immunoglobulin G (IgG)，” in Methods in %/· /0，pages 79-104 (The Humana Press, Inc· 1992))。使用依據抗體特殊性質選擇之適當配體（例如重鏈或輕鏈同型物，結合專一性等等），經由親和力色層分析可純化單株抗體。固定於固體撐體上之適合的配體實例，包括蛋白質A，蛋白質 G，抗恆定區域（輕鏈或重鏈）抗體，抗遺傳性型抗體，及TGF-β 結合蛋白質，或其片段或變異體。本發明之抗體亦可爲完全人類單株抗體。提供之經單離完全人類抗體專一結合至活動素A的半胱胺酸結區域（胺基酸C11-S33及/或胺基酸C81-E111)，其中該抗原結合蛋白質具有至少一人類抗-活動素A抗體的活體內生物活性。該生物活性可爲減弱惡病質，例如大腸癌之惡病質，例如文中所述小鼠模式之大腸癌。經得起如此治療之惡病質與體重減少，肌肉質量的損失及/或脂肪質量的損失有關。惡病質可與類風濕性關節炎有關聯性，例如於類風濕性關節炎之膠原誘發之動物模式。在類風濕性關節炎之膠原誘發之動物模式中，以文中所述完全人類抗體之治療在活體內改善體重的減少，肌肉質量的損失及/或脂肪質量的損失。在AAV-活動素 A轉染之動物模式中，文中所述之完全人類抗體改善體重的減少。文中所述專一結合至活動素A半胱胺酸結區域（胺基酸C11-S33及/或胺基酸C8 1-E111)之完全人類抗體，在活體外抑制活動素A與活動素A受器的結合。專一結合至活動素A半胱胺酸結區域（胺基酸C11-S33及/或胺基酸C81-E111) -98- 200819466 之完全人類經單離抗體，在活體內抑制活動素A與活動素A 受器的結合。完全人類單株抗體可由許多所屬領域具有通常知識者已知悉的技術製造。此等方法包括但不限爲，人類週邊血液細胞（例如含有B淋巴細胞）之Epstein Barr病毒（EBV)轉形，人類B-細胞的活體外免疫，融合帶有插入人類免疫球蛋白基因之已免疫的基因轉殖小鼠脾臟細胞，單離自人類免疫球蛋白V區域噬菌體資料庫，或技藝已知及依據本文揭示之其他程序。例如，完全人類單株抗體可獲自已經過加工能製造對抗原性挑釁有反應之專一人類抗體的基因轉殖小鼠。從基因轉殖小鼠獲得完全人類抗體之方法敘述於例如Green W aL » Nature Genet. 7 · 13 5 1994 i Lonberg et al. 5 Nature 368 · 856 » 1994 ； Taylor et al. 5 Int. Immun. 6 · 579 5 1994 ；美國專利第 5,877,397 號； Bruggemann et al. \ 1997 Curr, Opin. BiotechnoL 8 ' 455-58 ； Jakobovits et a/.，1995 Jnn.见 nW. Scz·. 764 : 525-35。在此技術中，將人類重鏈及輕鏈所在成分導入衍生自含有內生性重鏈及輕鏈所在標的性瓦解之胚胎幹細胞系的小鼠品系中（也參閱 Bruggemann et al. ， Curr. Opin. Biotechnol, 8 : 455-58 (1 9 9 7 ))。例如，人類免疫球蛋白轉殖基因可爲迷你基因構築，或移位在酵母菌人造染色體上，其經歷細胞-專一 DNA 重新排列及小鼠淋巴樣組織過度突變。完全人類單株抗體可獲自免疫基因轉殖小鼠，然後由其製造專一於活動素A之人類抗體。根據文中所述方法，經免疫基因轉殖小鼠的淋巴樣細胞能用於製造分泌人類抗體之融合瘤。含有完全人類抗體 -99- 200819466 之多株血清亦可獲自已免疫動物的血液。製備本發明人類抗體之另一方法，包括經由E B V轉形不死的人類週邊血液細胞。例如參閱美國專利第4,464，4 5 6 號。此等製造專一結合活動素A之單株抗體之不死的B細胞系（或淋巴母細胞系），能經由文中提供之免疫偵測方法鑑定，例如ELISA，然後經由標準選殖技術單離。製造抗-活動素A抗體之淋巴母細胞系的穩定性，可根據技藝已知之方法經由融合已轉形之細胞系與鼠科動物骨髓瘤細胞來改善以製造小鼠-人類混種細胞系（例如參閱 G1 a s k y e〖α /.， 8 : 3 77-89 (1989))。又製造人類單株抗體之另一方法是活體外免疫作用，其包括以人類活動素A最初接觸 (priming)人類脾臟細胞，隨後融合已接觸B-細胞與異質混種融合搭檔。例如參閱Boerner ei α/.，1991 147 ： 86-95 ° 在某些具體例中，根據技藝已知及文中所述分子生物學技術選擇產生抗人類活動素A抗體之B-細胞，並從B-細胞選殖輕鏈及重鏈可變區域（WO 92/025 5 1 ;美國專利第 5,627,052 號；Babcook e t a l ·，Proc. Natl. Acad. S ci. USA 93 : 78 43 -48 ( 1 996))。來自已免疫動物之B-細胞，可單離自脾臟，淋巴結或週邊血液樣品經由選擇產生專一結合至活動素A之抗體的細胞。B-細胞亦可單離自人類，例如來自週邊血液樣品。製造具所欲專一性抗體之單一 B-細胞的偵測方法是技藝已知，例如經由溶菌斑形成，螢光活化細胞分類，活體外刺激隨後偵測專一抗體等等。製造專一抗體之B-細胞的 -100- 200819466 篩選方法包括，例如製備B-細胞之單一細胞懸浮液於含有人類活動素A之軟瓊脂中。B-細胞製造之專一抗體結合至抗原結果形成複合物，其可以螢光沉澱物觀看到。根據技藝已知及文中所述方法於B-細胞製造所欲抗體之後篩選，經由單離及增幅DNA或1111^八可選殖專一抗體基因。獲得本發明抗體之額外方法是經由噬菌體展現。例如參閱 Win t er d α/· ， 1 9 9 4 d η n w · i?e V. /m m wπ (9/· 1 2 : 4 3 3 - 5 5 ; Burton et al. » 1 9 9 4 Adv. Immunol. 57 : 1 9 1 -28 0。人類或鼠科動物免疫球蛋白可變區域基因組合的資料庫可於製作於噬菌體載體，其能被篩選以選擇專一結合至TGF-β結合蛋白質或變異體.或其片段之Ig片段（Fab，Fv，sFv，或其多聚體）。例如參閱美國專利第 5,223,409 號；Huse et al·，1989 246 : 1275-81 ； Sastry et al » Proc. Natl Acad. Sci. USA 86 · 5728-32 (1989) ； Alting-Mees et al » Strategies in Molecular Biology 3*1-9 (1990) i Kang et al »1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 · 4363-66 ； Hoogenboom a/. j \992 J. Molec. Biol. 221 · 381-388 ； Schlebusch a/. » 1997母以/也16 : 47-52，及其中引用之參考資料。例如，含有編碼Ig可變區域片段之複數多核苷酸序列的資料庫可被插入到絲狀細菌噬菌體的基因體，例如Μ 1 3或其變異體，於骨架具編碼噬菌體外殼蛋白質之序列。接合蛋白可爲外殼蛋白質與輕鏈可變區域功能部位及/或與重鏈可變區域功能部位之融合物。根據某些具體例，免疫球蛋白Fab片段亦可展現於噬菌體顆粒上（例如參閱美國專利第5,698,426號）。重鏈及輕鏈免疫球蛋白cDNA表現資料庫亦可製備於λ 噬菌體，例如使用 XImmun〇ZapTM(H)及 XImmun〇ZapTM(L)載 • 101- 200819466 體（Stratagene，La Jolla，California)。簡言之 ’ mRNA 是單離自B-細胞族群，並用於產生重鏈及輕鏈免疫球蛋白cDNA 表現資料庫於XlmmunoZap(H)及XlmmunoZap(L)載體。這些載體可被單獨篩選或共表現以形成Fab片段或抗體（參閱如上Huse α/·;亦參閱如上Sastry d α/·)。陽性溶菌斑可隨後轉換爲能從大腸桿菌（& 高度表現單株抗體片段之非分解性質體。在一具體例中，在一融合瘤中，表現感興趣單株抗體基因之可變區域是使用核苷酸引子增幅。這些引子可由所屬領域具有通常知識者合成，或可購自市售商品。（例如參閱 Stratagene (La Jolla，California)，其販賣小鼠及人類可變區域用引子，尤其包括VHa，VHb，Vhc，VHd’ CHi，VL及 CL區域用引子）。這些引子可用於增幅重鏈或輕鏈可變區域，然後可分別插入到載體例如 ImmunoZAPTMH或 ImmunoZAPTML (Stratagene)。然後這些載體可導入表現用大腸桿菌（E. ，酵母菌，或哺乳動物系之系統。使用這些方法可製造大量之含有VH&VL功能部位接合之單鏈蛋白質 (參閱 Bird et al. ? Science 242 ' 423-426，1988)。一旦使用任何上述免疫作用及其他技術獲得製造如本發明抗體之細胞，則根據文中所述標準程序可從其經由單離及增幅DN A或mRNA以選殖專一抗體基因。可定序從其製造之抗體，且鑑定之CDRs及編碼該CDRs之DNA可如前述操作以產生根據本發明之其他抗體。本發明之活動素A結合劑較佳於文中所述之細胞系分 -102- 200819466 析中及/或文中所述活體內分析中調制活動素A功能，及/或結合至一個或一個以上文中所述之半胱胺酸結功能部位，及 /或交叉阻斷本案所述之一抗體的結合，及/或以本案所述之一抗體交叉阻斷活動素A的結合。因此此等結合劑能使用文中所述分析法鑑定。在某些具體例中，抗體是經由首次鑑定抗體產生，該抗體結合至一個以上文中提供之半胱胺酸結功能部位，及/或中和於文中所述細胞系及/或活體內分析，及/或交叉阻斷本案所述抗體，及/或以本案所述之一抗體交叉阻斷活動素A 的結合。然後使用這些抗體的CDR區域插入適當生物相容性骨架以產生活動素A結合劑。結合劑之非CDR部分可由胺基酸組成’或可爲非蛋白質分子。文中所述分析能識別結合劑特徵。本發明之結合劑較佳爲文中定義之抗體。熟習該項技藝者應瞭解，某些蛋白質例如抗體，可經歷各種轉譯後修飾。這些修飾的類型及程度常視用於表現蛋白質的宿主細胞系及培養條件而異。此等修飾可包括變化於糖化’甲硫胺酸氧化，二酮哌阱形成，天冬胺酸異構物化作用以及天冬醯胺酸脫醯胺作用。常見修飾爲羧肽酶作用之喪失竣基末端鹼性殘基（例如離胺酸或精胺酸）（敘述如Harris， R.J. Journal of Chromatography 705:1 29 - 1 34, 1 995)。核酸在一方面，本發明提供單離之核酸分子。該核酸含有例如編碼全部或部分抗原結合蛋白（例如本發明抗體之一或兩鏈’或其片段、衍生物、突變蛋白或變異體）之多核苷酸， -103- 200819466 足以用於作爲雜化探針之多核苷酸，用於鑑定、分析、突變或增幅編碼多肽之多核苷酸之PCR引子或定序引子，抑制多核苷酸表現之抗有意義核酸，以及前述的互補序列。該核酸能爲任何長度。他們能爲例如5，1 0，1 5，2 0，2 5，3 0，3 5， 40 ， 45 ， 50 ， 75 ， 100 ， 125 ， 150 ， 175 ， 200 ， 250 ， 300 ， 350，400，450，500，750，1,000，1，500，3,000，5,000 或以上之核苷酸長度，及/或能含有一個或一個以上額外序列，例如調節序列，及/或爲較大核酸的部分，例如載體。該核酸能爲單股或雙股，以及能含有RNA及/或DNA核苷酸，及其人造變異體（例如胜肽核酸）。編碼抗體多肽（例如，重鏈或輕鏈，僅可變功能部位，或全長）之核酸可單離自已被活動素A免疫的小鼠B-細胞。該核酸可經由慣用程序例如聚合酶、鏈鎖反應（PCR)單離。編碼重鏈及輕鏈可變區域之核酸序列顯示如上。熟習該項技藝者應知由於遺傳密碼的退化性（degeneracy)，文中揭示的每一多肽序列是由許多其他核酸序列編碼。本發明提供編碼本發明每一抗原結合蛋白之每一退化核苷酸序列。本發明進一步提供在特殊雜化條件下雜化到其他核酸 (例如，含有任何A1-A14核苷酸序列之核酸）之核酸。雜化核酸的方法爲技藝熟知。例如參閱 Cm”· Prot· in Mol· 5h/.，John Wiley & Sons，Ν·Υ· (1989)，6.3.1-6.3.6。如文中定義，中度嚴格雜化條件是使用含5X氯化鈉/檸檬酸鈉 (SSC)、0.5% SDS、1.0 mM EDTA(pH 8.0)之預洗液，約 50% 甲醯胺、6X S S C之雜化緩衝液，以及5 5 °C (或其他類似雜化 -104- 200819466 液，例如含有約50%甲醯胺、具42 °C的雜化溫度）的雜化溫度，以及6 0 °C於〇 · 5 X S S C、0 · 1 % S D S之清洗條件。一嚴格雜化條件是於6X SSC在45t：雜化，隨後在68t：於0.1X SSC、0.2% SDS清洗一次或一次以上。再者，熟習該項技藝者能操作雜化及/或清洗條件以增加或減少雜化的嚴格度，以致含有核苷酸序列彼此至少65，70，75，80，85，90，95， 98或99%相同之核酸通常仍雜化到彼此。影響雜化條件選擇的基本參數及設計適宜條件的指南提出於，例如 Sambrook， Fritsch，and Maniatis (1989，Molecular Cloning : A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y_，chapters 9 and 11;以及 Curr· Prot. in Mol· Biol. 1995，Ausubel 扣 fl/·，eds.，John Wiley & Sons，Inc·，sections 2.10 and 6.3-6.4)，且會g 輕易由所屬領域具有通常知識者依據例如，DNA的長度及/ 或驗基組成物來決定。經由突變作用能將變化導入核酸，藉此導致其編碼的多肽（例如抗原結合蛋白）胺基酸序列改變。使用技藝已知技術能將突變導入。在一具體例中，一個或一個以上特定胺基酸殘基是使用，例如指定位置之突變法來改變。在另一具體例中，一個或一個以上隨機選擇之殘基是使用，例如隨機突變法來改變。然而其經製作，爲所欲性質（例如，結合至活動素A)，突變多肽能被表現及篩選。突變能導入核酸中而無需顯著改變其編碼之多肽的生物活性。例如，能製造核苷酸取代造成胺基酸取代在非必需胺基酸殘基。在一具體例中，文中提供之A1-A14核苷酸序列，或其所欲片段、變異體或衍生物，經突變以致其編碼的 -105- 200819466 胺基酸序列含有文中所示A1-A14之胺基酸殘基有一個或一個以上刪除或取代爲殘基中有兩或兩以上序列差異。特別如文中所述，A1-A14是指14項序列，A1及A14與12項介於其中之胺基酸殘基。在另一具體例中，突變作用插入胺基酸鄰接於文中所示A 1 - A 1 4之一或一以上胺基酸殘基以使殘基中有兩或兩以上序列差異。另外，一個或一個以上突變能導入核酸以選擇性改變其編碼之多肽的生物活性（例如，活動素A之結合）。例如，突變能定量或定性改變生物活性。定量改變的實例包括增加，降低或消除活性。定性改變的實例包括改變抗原結合蛋白的抗原專一性。在另一方面，本發明提供核酸分子，其適用於作爲偵測本發明核酸序列用之引子或雜化探針。本發明之核酸分子能僅含有編碼本發明全長多肽之一部分的核酸序列，例如，能用於作爲探針或引子之片段或編碼本發明多肽活性部分（例如，活動素A結合部分）之片段。根據本發明之核酸序列的探針，能用於偵測核酸或類似核酸，例如編碼本發明多肽之轉錄體。該探針能含有一標識基’例如放射性同位素、螢光化合物、酵素或酵素輔因子。此等探針能用於鑑定表現該多肽之細胞。在另一方面’本發明提供載體，含有編碼本發明多肽或其一部分之核酸。載體之實例包括但不限爲質體，病毒載體，非附加型哺乳動物載體及表現載體，例如重組表現載體。本發明之重組表現載體能含有本發明之核酸以適於宿主細胞中表現核酸之形式。重組表現載體包括一個或一個以 -106- 200819466 上基於宿主細胞可用於表現而選擇之調節序列，其爲可操作地連接到欲表現之核酸序列。調節序列包括在許多種類宿主細胞（例如，SV40早期基因增強子，勞斯肉瘤病毒（Rous sarcoma virus)啓動子以及巨細胞病毒啓動子）中主導核苷酸序列之組成型表現（constitutive expression)者’只於某些宿主細胞主導核苷酸序列表現者（例如，組織專一調節序列，參閱 Voss α/·，1986，5cz·· 11: 287’

Maniatis et al ·，1987，Science 236: 1237，他們以全文倂入本文參考），以及對特別處理或條件反應主導核苷酸序列之誘發表現者（例如，哺乳動物細胞之金屬硫蛋白 (metallothionin)啓動子以及原核及真核系統中之四環黴素反應性及/或鏈黴素反應性啓動子）。熟習該項技藝者應知表現載體的設計能依此等因子決定作爲欲轉形之宿主細胞、所欲蛋白質表現程度的選擇等等。本發明之表現載體能導入宿主細胞藉此製造蛋白質或胜肽，包括由文中所述核酸編碼之接合蛋白或胜肽。在另一方面，本發明提供已導入本發明重組表現載體之宿主細胞。宿主細胞能爲任何原核細胞（例如大腸桿菌（& 〜/〇)或真核細胞（例如，酵母菌，昆蟲，或哺乳動物細胞（例如，CHO細胞））。載體DNA能經由慣用轉形或轉染技術導入原核或真核細胞。對於哺乳動物細胞的穩定轉染，已知隨所用的表現載體及轉染技術，只有小部分的細胞可整合外來 DNA到其基因體中。爲鑑定及選擇這些整合體，通常與感興趣基因一起導入編碼可篩選記號之基因（例如，抗生素之抗 -107- 200819466 性）至宿主細胞。較佳的可篩選記號包括那些對藥具抗性者，例如 G418，效高黴素（hygromycin)及甲氨蝶玲 (methotrexate)。在其他方法中，以導入的核酸穩定轉染之細胞能經由藥物篩選來鑑定（例如，已倂入可篩選記號基因之細胞將存活，而其他細胞死亡）。適應症在一方面，本發明提供治療患者之方法·。該方法能爲例如對患者健康具有廣泛利益，例如能增加患者的預期壽命。另外，該方法能爲例如治療、預防、治癒、減輕或改善（“治療”）疾病，病症，疾病狀況或患病狀態（“症狀”）。根據本發明欲治療的疾病狀況具有活動素A不當表現或活性之特徵。在某些此等疾病狀況中，該表現或活性程度太高，以及治療包括投與文中所述之活動素A掊抗劑。能使用本發明之方法及組成物治療之疾病狀況類型之一例是涉及細胞生長之疾病狀況，例如伴隨惡病質之癌症的疾病狀況。如此，在一具體例中，本發明提供治療癌症的疾病狀況之組成物及方法。特別是癌症的疾病狀況爲性腺癌症，包括卵巢及睪九的腫瘤。（Fujii，Y· d a/·，dm. J.尸 Metab. 9 286 ' E927-E931 » 2004 ； Reis » F. M. et al. ^ J. Clin. Endocrin. 87 ： 2277-2282，2005·)。已知活動素A作用於刺激FSH生物合成及分泌於腦下垂體，且具有調節性腺功能之生理角色。活動素 A與許多類型的人類癌症有關聯性，且尤其與生殖系統的腫瘤。詳言之，已知活動素A的過度表現或失去調節與卵巢癌有關聯性（Menon U，et al·，/«iera如Jowrna/ 〇/ (%你炉如凌 -108- 200819466

Gynaecology; 107(9):1069-14, 2000. Choi KC? et al.? Molecular & Cellular Endocrinology. 174(1-2):99-110^ 2001; Zheng W, et al.5 American Journal of Reproductive

Immunology.44(2):104-13, 2000; Lambert-Messerlian GM, et al., Gynecologic Oncology, 74(1):93-7f 1999; Steller MD, et al.? Molecular Cancer Research: MCR. 3(1):50-61, 2005; Corbellis L.? et al.? Journal of the Society for Gynecologic Investigation. 11(4):203-6, 2004; Welt CK5 et al.5 Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 82(11):3720-7, 1997; and Harada K.? et al.5 Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 81(6):2125-30, 1996f endometrial adenocarcinoma Otani, T，et a” (7):3/-5, 200人· Tanaka T5 et al.9 International Journal of Oncology, 23(3):657-63, 2003 and prostate cancer (Thomas TZ, et al., Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 82(11):3851-8, 1997; Zhang, Z? et al.? Biochemical & Biophysical Research Communications. 234(2):362-5, 1997; and Risbrid明:GP，et al； Molecular & Cellular Endocrinology. 180(1-2):149-53, 2001。癌症的疾病狀況能爲使用文中所含組成物（例如，活動素A抗原結合蛋白例如抗-活動素A抗體，抗體片段或抗體衍生物）可治療之任何癌症的疾病狀況。癌症的疾病狀況實例包括，例如急性淋巴細胞白血病，腎上腺皮質癌，AIDS-有關的癌症，AIDS-有關的淋巴瘤，肛門癌，兒童小腦星狀細胞瘤，兒童腦星狀細胞瘤，基底細胞癌，肝外膽管癌，膀胱癌，骨肉瘤/惡性纖維組織球瘤骨癌，腦腫瘤（例如，腦幹膠質細胞瘤，小腦星狀細胞瘤，腦星狀細胞瘤/惡性神經膠 ‘質瘤，室管膜瘤（ependymoma)，神經管母細胞瘤 (medulloblastoma)，天幕上原始神經外胚層腫瘤 (supratentorial primitive neuroectodermal tumors)，視覺途徑及下視丘性神經膠質瘤），乳癌，支氣管腺瘤/類癌，巴克 -109- 200819466 氏淋巴瘤（Burkitt’s Lymphoma)’類癌腫瘤’腸胃類癌腫瘤，不明類型之腫瘤，原發性中樞神經系統，小腦星狀細胞瘤，腦星狀細胞瘤/惡性神經膠質瘤，子宮頸癌，兒童癌症，慢性淋巴細胞白血病，慢性骨髓細胞白血病，骨髓增生性疾病，大腸癌，結腸直腸癌，皮膚T細胞淋巴瘤，子宮內膜癌，室管膜瘤（ependymoma)，食道癌，尤汶氏腫瘤家族（Ewing’ s family of tumors)，顱外生殖細胞腫瘤，性腺外生殖細胞腫瘤，肝外膽管癌，眼內黑色素瘤眼癌，視網膜母細胞瘤眼癌，膽囊癌，胃的（胃）癌，腸胃類癌腫瘤，生殖細胞腫瘤（例如，顱外的，性腺外的以及卵巢的），滋養層細胞腫瘤 (gestational trophoblastic tumor)，神經膠質瘤（例如成人、兒童腦幹，兒童腦星狀細胞瘤，兒童視覺途徑及下視丘的），毛細胞白血病，頭頸癌，肝細胞（肝）癌，何杰金氏淋巴瘤 (Hodgkin’s lymphoma)，下咽癌（hypopharyngeal cancer)，下視丘及視覺途徑神經膠質瘤，眼球內黑色素瘤，胰島細胞癌 (內分泌胰腺），卡波西氏肉瘤（Kaposi’s Sarcoma)，腎（腎細胞）癌，喉癌，白血病（例如，急性淋巴細胞性、急性骨髓性、慢性淋巴細胞性、慢性骨髓性、及毛細胞性），唇及口腔癌，肝癌，非小細胞肺癌，小細胞肺癌，淋巴瘤（例如，AIDS-有關的，巴克氏（Burkitt’s)，皮膚T細胞，何杰金氏、非何杰金氏淋巴瘤，以及原發性中樞神經系統），瓦德氏巨球蛋白血症（WaldenstrSm’s Macroglobulinemia)，骨 / 骨肉瘤之惡性纖維組織球瘤’神經管母細胞瘤（medulloblastoma)，黑色素瘤，眼球內（眼）黑色素瘤，麥克氏細胞癌（Merkel cell -110- 200819466 carcinoma)，間皮瘤，伴隨潛藏原發轉移性鱗狀細胞頸癌，多發性內分泌瘤綜合症，多發性骨髓瘤細胞/漿細胞癌，蕈狀肉芽腫，骨髓造血不良症候群，骨髓造血不良/骨髓增生性疾病，骨髓性白血病，慢性骨髓性白血病，多發性骨髓瘤細胞，骨髓增生性疾病，鼻腔及副鼻竇癌，鼻咽癌，神經母細胞瘤，口腔癌，或口咽癌，骨之骨肉瘤/惡性纖維組織球瘤，卵巢癌，卵巢的上皮細胞癌，卵巢的生殖細胞腫瘤，卵巢的低惡性度腫瘤，胰臟癌，島細胞胰臟癌，副鼻竇及鼻腔癌，副甲狀腺癌，陰莖癌，嗜鉻細胞瘤（pheochromocytoma)，松果體母細胞瘤（pineoblastoma)，腦下垂體腫瘤，漿細胞癌 /多發性骨髓瘤細胞，胸膜肺母細胞瘤，原發性中樞神經系統淋巴瘤，前列腺癌，直腸癌，腎細胞（腎臟）癌.，腎盂和輸尿管移形性細胞癌，視網膜母細胞瘤，橫紋肌肉瘤，唾腺癌，軟組織肉瘤，子宮肉瘤，賽拉症候群（Sezary syndrome)，非黑色素瘤皮膚癌，麥克氏細胞皮膚癌（Merkel cell skin carcinoma)，小腸癌，軟組織肉瘤，鱗狀細胞癌，皮膚T細胞淋巴瘤，睾九癌，胸腺瘤（thymoma)，胸腺癌，甲狀腺癌，滋養層細胞腫瘤（gestational trophoblastic tumor)，不明原發灶之腫瘤，不明原發灶之癌症，尿道癌，子宮內膜癌，子宮肉瘤，陰道癌，視覺途徑及下視丘性神經膠質瘤，外陰癌，瓦德氏巨球蛋白血症（WaldenstrSm’s Macroglobulinemia) 5 以及威爾姆氏腫瘤（Wilm’s tumor)。一寡胜肽或多肽是在本發明範圍內者爲，若其具有胺基酸序歹!1 至少 7 5 %，7 6 %，7 7 %，78%，7 9 %，8 0 %，81%，82%， -111- 200819466 8 3 %，8 4 %，8 5 %，8 6 %，8 7 % ’ 8 8 % ’ 8 9 % ’ 9 0 % ’ 9 1 % ’ 9 2 % ’ 9 3 〇/〇，9 4 %，9 5 %，9 6 %，9 7 % ’ 9 8 % 或 9 9 % 相同於抗體 A 1 - A 1 4 至少一 CDR ;及/或相同於活動素A結合劑的CDR，其交叉阻斷至少一抗體A1-A14與活動素A結合’及/或經由至少一抗體A1-A14交叉阻斷結合至活動素A ;及/或相同於活動素 A結合劑之CDR，其中結合劑能阻礙活動素A與活動素A 受器之結合。活動素A結合劑多肽及抗體是在本發明範圍內者爲，如果他們具有胺基酸序列爲至少85%，86%，87%，88%，89%， 9 0%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，9 8 %或 99% 相同於至少一抗體A1-A14的可變區域，且交叉阻斷至少一抗體A 1 - A 1 4與活動素A之結合，及/或經由至少一抗體 A 1-A14交叉阻斷結合至活動素A ;及/或能阻礙活動素A對活動素A受器之抑制效果。可使用專一結合完整活動素A之治療性抗體，其中約〇：11-333(第一環）及約（：814111(第二環）之區域的序列保留天然活動素A的構形。此等定圖譜及結合說明於下面實施例 6 ° 根據本發明之抗體可具有對人類活動素A的結合親和力少於或相當於1 X 1 〇 ·7 M，少於或相當於1 X〗〇 -8 Μ，少於或相當於1 χ 1 ^9 Μ，少於或相當於1 X 1 〇 -1 〇 μ，少於或相當於1 X ΗΓηΜ，或少於或相當於1 χ ι〇-12 %。 ί几體的親和力或結合搭檔以及抗體抑制結合的程度，能由所屬領域具有通常知識者使用慣用技術例如敘述於 -112- 200819466 S catchard e t al · (Ann. N. Y. Acad. S ci. 5 1 : 660-672 (1 9 4 9)) 或經由表面電漿共振（surface plasmon resonance)(SPR ; BIAcore，Biosensor，Piscataway，NJ)決定。對於表面電漿共振，靶分子固定於固相上並使接觸到隨流動細胞運行之移動相內的配體。如果發生配體結合到該固定的靶，則局部折射率改變導致SPR角度改變，其能經由偵測反射光強度變化而即時被監測到。SPR訊息的改變率能經分析以產生對於結合反應之結合及解離相之表面的速率常數。這些値的比例得到表面的平衡常數（親和力）（例如參閱Wolff et al.，Cancer Res. 53 : 2560-65 ( 1 993))。根據本發明之抗體可屬於任何種類免疫球蛋白，例如 IgG，IgE，IgM，IgD，或IgA。其可獲自或衍生自動物，例如家禽（例如雞）以及哺乳動物，其包括但不限爲小鼠，大鼠，倉鼠，兔子，或其他嚆齒動物，牛，馬，綿羊，山羊，駱駝，人類，或其他靈長類。該抗體可爲內部化抗體。抗體的製造槪括揭示於美國專利公開第2004/0 1 4688 8 A1號。特性分析上述產生根據本發明之抗體的方法，包括操作專一性 A1-A14 CDRs於新骨架及/或恆定區域中，可得到合適的分析法以選擇所欲抗體（亦即用於決定對活動素A結合親和力之分析；交叉阻斷分析；Biacore系競爭結合分析；活體內分析）。治療方法及抗原結合蛋白的投與文中提供之一些方法包括投與活動素A結合抗原結合 -113- 200819466 蛋白至患者，藉此降低活動素A-誘發之在特殊情況扮演角色的生物反應。在特定具體例中’本發明之方法包括將內生性活動素A接觸活動素A結合抗原結合蛋白質，例如經由投與至患者或以生體外（ex Wv0)程序。用語“治療”包括減輕或預防至少一症狀或疾病之其他方面，或降低疾病嚴重性等等。此外，“治療”進一步關於在有其需要之患者投與文中所述治療劑用於預防或減輕至少一症狀或疾病之其他方面。抗原結合蛋白不需達到完全的治癒或根絕每一症狀或疾病的表現以構成可行之治療劑。如有關領域認定，使用作爲治療劑之藥劑可降低所給疾病狀態之嚴重度，但不需徹底破壞疾病的每一表現則視爲可用之治療劑。同樣的，預防性投與之治療不需完全有效預防開始的症狀以構成可行的預防劑。純粹降低疾病的影響（例如，經由降低症狀量或嚴重度，或經由增加另一治療的有效性，或經由產生另一有利效果），或降低疾病發生或使換者惡化的可能性就足夠。本發明之一具體例是針對一方法，包括對病患投與一定量之活動素A拮抗劑一段時間足以誘發持續的改善超過反映特定疾病嚴重度之指標基線。如有關領域瞭解，含有本發明分子之醫藥組成物是以適於該適應症之方式投與至有其需要之患者。醫藥組成物可以任何適合的技術投與，包括但不跟爲非經腸地，局部地，或經由吸入。若爲注射，醫藥組成物之投能透過，例如關節內，靜脈內，肌肉內，病灶內，腹腔內或皮下路徑，經由快速注射（bolus injection)，或連續式輸注。局部投與，例如考慮在 -114- 200819466 疾病或受傷位置，以經皮傳送及從植入物持續釋放。經由吸入傳送包括，例如鼻或口吸入，使用噴霧器、氣溶膠形式吸入之拮抗劑等等。其他變化包括眼藥水；口服製備物包括藥九，糖漿，錠或口香糖；以及局部製備物例如外用藥水，凝膠，噴霧及軟膏。也考慮生體外使用抗原結合蛋白之方法。例如，可將病患的血液或其他體液接觸抗原結合蛋白質，其在生體外（ex Wv幻結合全長活動素a、一種或一種以上活動素 A異型、或其他部分長度的活動素a。該抗原結合蛋白可結合至適當不溶性基質或固體撐體材料。有利地’抗原結合蛋白是以組成物之形式投與，該組成物含有一個或一個以上額外成分，例如生理上可接受載劑 (carrier)，賦形劑或稀釋劑。該組成物可額外含有一種或一種以上生理活性劑’例如第二抑制活動素A受器之物質，抗血管新生物質，化學性治療物質，止痛的物質等等，其非限制實例提供於文中。在各種特殊的具體例中，該組成物除結合活動素A之抗原結合蛋白之外，含有一、二、三、四、五或六種生理活性劑。在一具體例中，醫藥組成物含有本發明之抗原結合蛋白與一個或一個以上物質選自由緩衝劑、抗氧化劑（例如抗壞血酸）、低分子量多肽（例如具有少於1 0胺基酸者）、蛋白質、胺基酸、碳水化合物（例如葡萄糖，蔗糖或糊精）、螯合劑（例如EDTA，穀胱甘肽（glutathione)，穩定劑）、以及賦形劑所組成之群組。中和緩衝鹽液或混與同種血清白蛋白之鹽液爲 -115- 200819466 適當稀釋劑之例。依照適宜之工業標準，亦可添加防腐劑，例如苄基醇。可使用適當賦形劑溶液（例如蔗糖）爲稀釋劑將組成物調配爲凍乾物。適合的成分爲所用劑量及濃度對接受者無毒性。可運用於醫藥調配物之成分的進一步實例描述於 Remington’s Pharmaceutical Sciences，16th Ed. ( 1 9 8 0) and 2 0th Ed. (2000)，Mack Publishing Company，Easton，PA。給開業醫生用之套組包括本發明之抗原結合蛋白以及一標示或其他用於治療文中所討論任何狀況之指示。在一具體例中，該套組包括一種或一種以上抗原結合蛋白之無菌製備物，其可爲如上揭示之組成物形式，以及可於一個或一個以上小瓶中。投與的劑量及頻率可根據投與路徑因子、使用特殊抗原結合蛋白、欲治療的疾病本質及嚴重度而異，不論疾病情況是急性或慢性，以及隨患者的大小及一般情況而異。適宜之劑量能由有關領域已知程序決定，例如可包括劑量逐步上升硏究之臨床試驗。本發明之抗原結合蛋白之投與可例如一次或超過一次，例如在一段期間內以規則的間隔。在特定具體例中，抗原結合蛋白經至少一個月或以上的期間投與，例如於一個月、兩個月、或三個月、或甚至無限期。對於治療慢性疾病情況，長期治療通常是最有效的。然而，對於治療急性疾病情況，較短期間之投與，.例如從一至六週可能是足夠的。一般而言，投與抗原結合蛋白直到病患顯示超過所選指標或指示的基線之醫學上有意義程度的改善。 -116- 200819466 本發明之特殊具體例包括投與抗原結合蛋白至患者的劑量從每天患者每公斤體重約1 ng抗原結合蛋白（“1 ng/kg/ 天”）至約1 0 mg/kg/天，更佳從約500 ng/kg/天至約5 mg/kg/ 天，以及最佳從約5 pg/kg/天至約2 mg/kg/天。在額外具體例中，抗原結合蛋白投與至成人爲每週一次、每週兩次或每週三或更多次，以治療活動素A仲介之疾病、狀況或症狀，例如文中揭示之醫學症狀。若爲注射，每位成人給與抗原結合蛋白之有效量範圍可爲1-20 mg/m2，以及較佳爲約5 -1 2 mg/m2。另外，可均一劑（flat dose)投與；量之範圍可從5-100 mg/劑。用於均一劑之範圍爲每劑約20-3 0 mg。本發明一具體例中，以25 mg/劑之均一劑經由注射反覆投與。若使用注射以外的投與路徑，依據標準醫學慣例適當調整劑量。治療療程之一實施例包括每週一至三次及經至少三週期間注射一劑約2 0 - 3 0 m g之抗原結合蛋白質，儘管可能需要更長期間的治療以誘發所欲程度的改善。對於兒童患者（年齡 4- 1 7)，一示範性適合的療程包括每週投與兩或三次之皮下注射0·4 mg/kg，至多最大劑25 mg的抗原結合蛋白。文中提供之方法的特殊具體例包括每週一或兩次皮下注射從〇.5mg至10mg，較佳從3至5mg的抗原結合蛋白。另一具體例是針對0巾的投與（例如經由噴霧器），每週—^次3 mg或以上的抗原結合蛋白。文中提供之治療療程之實施例，包括每週一次每劑1 · 5 至3 m g皮下注射抗原結合蛋白來治療以活動素a傳訊息扮演角色之疾病狀況。此等疾病狀況之例提供於文中以及包 -117- 200819466 括，例如惡病質，癌症，類風濕性關節炎，及全部狀況中體重、體質重、體脂肪質量的減少或無法維持體重、體質重、脂肪質量扮演角色者。每週投與抗原結合蛋白是持續的，直到達到所欲結果，例如患者的症狀消退。若需要，治療可重新開始，或另可投與保養劑。文中提供之治療療程的其他例包括皮下或靜脈內投與一劑爲每公斤患者體質量（mg/kg)之1，3，5，6，7，8，9, 1 0，1 1，1 2，1 5，或20 mg之本發明活動素A抑制劑。該劑能一次投與至患者，或在特定間隔超過一次投與，例如一天一次，一週三次，一週兩次，一週一次，一個月三次，一個月兩次，一個月一次，每兩個月一次，每三個月一次，每六個月一次，或一年一次。治療的期間及對治療的劑及/或頻率之任何變化，能治療過程中改變或修改以符合換者的特殊需求。在另一具體例中，抗原結合蛋白是以足以引起改善之一定量及經一段時間投與至患者，較佳爲持續的改善至少一反映欲治療之疾病嚴重度的指標。反映患者疾病狀態、疾病或病症程度之各種指標，可用於評估決定該治療的量及時間是否足夠。此等指標包括，例如疾病嚴重度、症狀之臨床辯認的指標，或討論之症狀的表現。在一具體例中，若患者於二到四週展現使至少兩不同起因疏遠之改善，則視爲改善是持續的。改善的程度通常由醫師決定，其可根據症候、症狀、切片檢體或其他測試結果決定，以及亦可運用提供給患者之問卷’例如對所治療疾病進展之生活品質問卷調查。 -118- 200819466 患者的活動素A程度可於以抗原結合蛋白治療之前、期間及/或之後監測，若有的話對其程度偵測變化。對於某些症狀’活動素A程度經提高之影響，可依據作爲疾病的階段或疾病的特殊形式之此等因子變化。可運用已知技術測量活動素A程度，例如在患者血清。血液樣品之活動素a程度可使用任何適合的技術（例如ELIS A)測量。本發明方法及組成物的特殊具體例，包括使用抗原結合蛋白及一種或一種以上額外活動素A拮抗劑，例如兩種或兩種以上本發明之抗原結合蛋白質，或本發明之抗原結合蛋白以及一種或一種以上其他活動素A拮抗劑。在進一步具體例中，抗原結合蛋白是單獨投與或與其他可用於治療病患受苦的疾病狀況之試劑組合。此等試劑之例包括蛋白質性及非蛋白質試劑兩種。當多樣治療劑是共投與時，於是可如有關領域認知調整劑量。“共投與”及組合治療不限於同時投與，但也包括治療療程是在治療過程中對病患至少投與一次抗原結合蛋白及包括投與至少一其他治療劑。可與抗原結合蛋白共投與之其他試劑之例，爲根據欲治療的特殊情況選擇之其他抗原結合蛋白或治療性多肽。另外，可用於治療以上討論之特殊情況之非蛋白質性藥劑可與活動素A拮抗劑共投與。組合治療在另一方面，本發明提供一種以活動素A抑制抗原結合蛋白與一種或一種以上其他治療之治療患者之方法。在一具體例中，此等組合治療經由例如在腫瘤中攻擊多位置或分 -119- 200819466 子靶，達到協同作用或加成效果。能用於連結本發明之組合治療類型包括抑制或活化（依適合情形）單一疾病有關途徑之多節點、靶細胞之多途徑、以及靶組織中（例如在腫瘤中）多細胞類型。例如，本發明之活動素A抑制劑能組合促進細胞凋亡（apoptosis)或抑制血管新生之治療。在另一具體例中’一靶試劑（當自身使用時無法引起所欲的治療效果）能用於，例如敏化癌症細胞或提高其他試劑的治療效果。在另一具體例中，根據本發明之活動素A抑制劑是與胞毒藥物或誘發細胞凋亡之其他靶試劑組合使用。在另一具體例中，活動素A抑制劑是與一種或一種以上抑制涉及細胞存活（例如， PKB ’ mTOR)之不同靶、不同受器酪胺酸激酶（例如，ErbBi， ErbB2，c-Met，c-kit)、或不同細胞類型（例如，KDR抑制劑， c-fms)的試劑組合。在另一具體例中，本發明之活動素a抑制劑是添加到特殊狀況用現存之照顧規範中。治療劑之實例包括但不限爲，吉司塔並（gemcitabine)，紫杉醇（taxol)，勉癌易（taxotere)，以及 CPT-11。在另一具體例中，該方法包括投與一種或一種以上文中所述活動素A拮抗劑及一種或一種以上其他治療劑（例如，治療性或緩和性治療），例如抗癌症治療（例如手術，超音波，放射線治療，化學治療，或含另一抗癌劑之治療）。該方法包括對患者提供一種以上治療，故應瞭解投與的順序、時點、數量、濃度及體積僅受限於醫學規定及治療極限，亦即，能提供兩種治療給患者，例如同時地、持續地、有變化地、或根據任何其他療法。能組合文中所述活動素A拮抗劑 -120- 200819466 投與之試劑的實例，包括但不限爲，嗜中性球促進劑，艾利諾康（irinothecan)，SN-38，吉司塔並（gemcitabine)，赫斯達汀（herstatin)或結合活動素A之赫斯達汀衍生物（敘述如美國專利第 05/0272637 號），AVASTIN®(Genentech，South San Francisco，CA)，HERCEPTIN®(Genentech)，RITUXAN®(Genentech)， ARIMIDEX®(AstraZeneca，Wilmington，DE)，IRESSA®(AstraZeneca)， BEXXAR®(Corixa，Seattle，WA)，ZEVALIN®(Biogen Idee，Cambridge， MA)，ERBITUX®(Imclone Systems Inc.，New York，NY)，GEMZAR®(Eli Lilly and Co.，Indianapolis，IN)，CAMPTOSAR®(Pfizer，New York，NY)， GLEEVEC®(Novartis) ， SU-11248(Pfizer) ， BMS-354825(Bristol-Myers Squibb)，單株抗體 panitumuinab(Abgenix，Fremont，CA/Amgen Inc.， Thousand Oaks，CA)，以及單株抗體 denosumab (Amgen Inc·，Thousand Oaks，CA) o 使用文中所述特殊組成物於各種治療療程之適合的給藥及治療療程發展，包括例如皮下、口服、非經腸、靜脈內、鼻內及肌肉內投與及調配物是技藝熟知，其中某些簡述於下僅作爲舉例說明之用。在某些應用中，文中揭示之醫藥組成物可透過口服投與運送到動物。就其本身而論，這些組成物可與惰性稀釋劑或與可吸收的可食用載劑調配，或可將他們包於硬-或軟-殻明膠膠囊，或可將他們壓縮爲錠劑，或可將他們倂入飮食的食物中。在某些情況將希望皮下地、非經腸地、靜脈內地、肌肉內地、或甚至腹腔內地運送文中揭示之醫藥組成物。此等方 -121- 200819466 法爲熟悉該項技藝者已熟知，其中某些進一步敘述於例如美國專利第5,543，158號；美國專利第5,641，515號及美國專利第5,3 99,3 63號。在某些具體例中，以游離鹼或藥理可接受鹽之活性化合物溶液可製備於水，適當混與界面活性劑’ 例如羥丙基纖維素。亦可製作分散液於甘油，液體聚乙二醇及其混合物以及於油中。在一般貯存及使用條件下，這些製備物通常含有防腐劑以防止微生物生長。適於注射用之示範用醫要形式包括無菌水溶液或分散液及臨時製備無菌注射液或分散液用之無菌粉末（例如，參閱美國專利第5,466,468號）。所有情況下該形式必須無菌且必須存在可易於注射之流動程度。在製造及保存的條件下必須穩定且必須保存防止微生物污染，例如細菌及真菌。該載劑能爲溶劑或分散液介質，含有例如水、乙醇、多元醇（例如甘油、丙二醇、及液體聚乙二醇等等）、其適合的混合物、及/或植物油。可維持適當液狀，例如經由使用塗層（例如卵磷脂），經由維持必要顆粒大小於分散液之情形及/或經由使用界面活性劑。預防微生物作用能以各種抗細菌及抗真菌劑來促進，例如羥基苯甲酸酯類（parabens)，氯丁醇 (chlorobutanol)，酸，山梨酸，硫柳萊（thimerosal)等等。在許多情形中，較佳爲包括等滲壓劑，例如糖或氯化鈉。延長吸收之注射用組成物能經由使用延緩吸收之試劑（例如單硬脂酸鋁及明膠）於組成物而產生。在一具體例中，對於非經腸投與水溶液，若需要該溶液應適當經緩衝，以及液體稀釋劑先經足夠鹽液或葡萄糖等滲 -122- 200819466 壓。這些特殊的水溶液尤其適於靜脈內，肌肉內，皮下及腹腔內投與。於此關係中，能使用之無菌水性介質爲熟悉該項技藝者根據本案揭示可知。例如，一劑量可溶解於1 ml等滲壓性 NaCl溶液並添加到 1 000 ml皮下補充水份液 (hypodermoclysis fluid)或注射在注入物之提議位置（例如參閱，Remington’s Pharmaceutical Sciences ， 15 th ed· ， pp. 1 03 5- 1 03 8 and 1 570- 1 5 80)。隨所治療患者之情況必然會發生劑量的某些改變。再者，用於人類投與，當然製備物較佳應符合FDA生物局要求之無菌測試，熱原測試，及一般安全性測試與純度標準之標準。本發明另一具體例中，文中揭示之組成物可調配於中性或鹽形式。示範的醫藥可接受鹽包括酸加成鹽（與蛋白質游離胺基形成）且其與無機酸（例如氫氯酸或磷酸）或有機酸（例如乙酸，草酸，酒石酸，扁桃酸）等等形成。與游離羧基形成之鹽亦能衍生自無機鹼（例如鈉，鉀，銨，鈣或氫氧化鐵），以及有機鹼（例如異並丙基胺，三甲基胺，組胺酸，普魯卡因（procaine))等等。隨調配，溶液可以適用於劑調配物的形式投與且此等量爲治療有效的。載劑能進一步含有任何及全部溶劑，分散液介質，運載體’塗層’稀釋劑，抗細菌及抗真菌劑，等滲壓性及吸收延遲劑，緩衝劑’載劑溶液，懸浮液，膠體等等。使用此等介質及試劑於醫藥活性物質爲技藝熟知。除在這個範圍內任何慣用介質或試劑是不容於該活性組成分，皆可考慮用於該治療性組成物。亦能倂入補充性活性組成分至此組成物。用語 -123- 200819466 “醫藥可接受，，是指分子實體及組成物投與到人類時不會產生過敏或類似的不宜反應。在某些具體例中，使用微脂粒、奈米膠囊、微顆粒、脂質顆粒、囊泡等等將本發明之組成物導入適當宿主細胞/有機體。尤其是本發明之組成物可調製爲膠囊化於脂質顆粒、微脂粒、囊泡、奈米球或、奈米顆粒等等用於傳送。另外，本發明之組成物能共價或非共價結合到此等載劑運載體的表面。形成及使用微脂粒及類似微脂粒之製備物作爲可能的藥物載劑一般爲熟悉該項技藝者已知（例如參閱Lasic， Biotechnol 76(7):307-21, 1998; Takakura, Nippon Rinsho 5(5(3):691-95, 1998; Chandran et al.? Indian J. Exp. Biol 35(8):801-09, 1997; Margalit, Crit. Rev. Then Drug Carrier Syst 72(2-3) : 233-61，1995 ;美國專利第 5,5 6 7，4 3 4號；美國專利第 5,552，157號；美國專利第 5,565,2 1 3號；美國專利第 5,73 8,86 8號及美國專利第5,795，5 8 7號，各以其全文具體倂入文中）。使用微脂粒於全身傳送後不會出現有關聯的自體免疫反應或不能接受的毒性。在某些具體例中，微脂粒形成自分散於水性介質之磷脂質並自動形成多層同心雙層囊泡 (亦稱爲多層囊泡（MLVs))。另外，在其他具體例中，本發明提供本發明組成物之醫藥可接受奈米膠囊調配物。奈米膠囊通常能以穩定及可再現的方式圍住化合物（例如參閱 Quintanar-Guerrero et al.， Drug Dev. Ind. P harm. 2 4 (12) · 1113-28， 1998)。爲避免因載入過多細胞內聚合物所引起之副作用，可使用活體內能降 -124- 200819466 解之聚合物設計此等超細顆粒（大小約0.1 μπι)。此等顆粒之製作欽述例如 ’ Couvreur et al·，CWi· 77zer· Camer 办对· 5(1): 1-20，1988; zur Muhlen et al.? Euk J. Pharm. Biopharm. ^5(2):149-55, 1998; Zambaux et al.? J. 50(1-3):31-40, 1998 ;以及美國專利第 5,145,684 號。此外’本發明之醫藥組成物可隨提供操作指南解釋該醫藥組成物使用之包裝材料置於容器內。一般而言，此等指示將包括明確表達敘述試劑濃度，以及在某些具體例中，包括再組成該醫藥組成物必要之相對量的賦形劑組成分或稀釋劑（例如，水，鹽液或P B S)。投與的劑量範圍可從〇·〇1 mg/kg體重至100 mg/kg體重。熟悉該項技藝者應明白投與的量及頻率當然將隨一些因子而異，例如所治療病症的本質及嚴重度，所欲反應，病患的健康狀況等等。通常組成物可以各種以上所載技術投與。本發明也提供一種診斷套組，含有至少一根據本發明之抗-活動素A結合劑。該結合劑可爲抗體。此外，此套組可選擇性含有一個或一個以上下列： (1) 對於使用一種或一種以上結合劑來篩選、診斷、預知、監控治療或這些應用之任何組合的操作指南； (2) 對抗-活動素A結合劑之標記結合搭檔； (3 )抗-活動素A結合劑固定於其上之固相（例如試劑條）；以及 (4)指示法規許可篩選、診斷、預知或治療用途或其任何組合的標籟或夾頁說明。若未提供對抗-活動素A結合劑之標記結合搭檔，該結 -125- 200819466 合劑本身能標記一種或一種以上可偵測記號，例如化學發光物，酵素，螢光物，或放射性部分（moiety)。提供下列實施例藉此舉例說明，且不因此限於此。【實施方式】實施例1 活動素A之重組表現條件培養基之超過濾及透析過濾（UF/DF)：卜Ρίχι活動素 A表現於中國倉鼠卵巢（CHO)細胞。進行一連串步驟以製造活化、經純化物質。使用Ami con S10Y10螺旋匣經由濃縮（透析過濾）條件培養基（C· Μ ·)於15至20倍之間開始純化過程。然透使用5體積10mM Tris緩衝劑Ph 7.0緩衝劑交換培養基 (經透析過濾），過濾及保存。陽離子交換色層分析法：在4-80°C以5 ml/分鐘將r-Hu 活動素A置入經10 mM Tris緩衝劑Ph 7.0平衡之2.6 X 7 cm (P harm a cia) S-Sep h arose速流管柱。以平衡緩衝劑清洗管柱。以超過20管柱量緩衝以10Mm Tris Ph 7.0之增加氯化鈉濃度至0.4M之梯度從管柱溶析r-Hu活動素A。集合各適當分層並保存在4-80°C。逆相 HPLC C4色層分析法：以三氟乙酸（TFA)調整 S-Seph arose管柱集合物pH至2.0。然後在室溫將此集合物置入經75% A緩衝劑（0.1% TFA於水）及25% B緩衝劑（90% 乙腈，0.1%丁戸八，9.9%水）平衡之1又25〇111¥7(1&〇€4管柱。然後以平衡緩衝劑清洗管柱。以5 ml/分鐘之流速，25% B 緩衝劑至50% B緩衝劑之梯度經50分鐘溶析：Γ-Hu活動素 A。集合各適當分層並凍乾。 -126- 200819466 高效陽離子交換色層分析法:在室溫以8M尿素，10 mM 磷酸鈉，Ph 7·0(Α緩衝劑）平衡5ml S Sepharose高效管柱。凍乾之C4集合物再懸浮於A緩衝劑並以5 ml/分鐘置入，及以A緩衝劑清洗。以超過3 q管柱量緩衝劑以8 Μ尿素，1 0 m Μ 磷酸鈉，pH 7 · 0之之增加氯化鈉濃度至〇. 1 5 Μ之梯度從管柱溶析r-Hu活動素Α。·集合各適當分層並保存在4-80。(3。逆相HPLC C4色層分析法：以三氟乙酸（TFA)調整 S-Sepharose管柱集合物pH至2.0。然後在室溫將此集合物置入經75% A緩衝劑（0，1 % TFA於水）及25% B緩衝劑（90% 乙腈，0.1%丁？人，9.9%水）平衡之1又25(：111¥7(1&(：€4管柱。然後廣泛以平衡緩衝劑清洗管柱移除尿素及鹽類。以5 ml/ 分鐘之流速，25% B緩衝劑至50% B緩衝劑之梯度經50分鐘溶析r-Hu活動素A。集合各適當分層，並凍乾最終經純化r-Hu活動素A並以分裝保存在-80 °C。SEQ ID NO: 225 提供活動素A胺基酸序列。實施例2 抗-活動素A融合瘤之製造於 XenoMouse® 小鼠（Abgenix，Fremont，Calif·，其含有人類免疫球蛋白基因之小鼠）引發對活動素A之抗體。使用XenoMouse®品系XMG2製造完全人類IgG2 κ抗體。使用第二品系製造完全人類IgG4 κ抗體。以活動素A免疫小鼠。根據標準程序（US 2005/0 1 1 8643; WO 2005/694879)於後腳掌（每腳掌5 jig)對小鼠注射抗原（活動素A)。初次注射液含有佐劑 TiterMax® Gold(Sigma，Cat # T2684)。於後續注射，對每一小鼠注射總量5 pg的抗原於佐劑鋁凝膠（磷酸 -127- 200819466 錦凝膠佐劑；Superfos Biosector a/s，Ε· M. Sargent Pulp and Chemical Co.，Clifton N.J.，cat # 1452-250 銷售）。最終注射液含有每一小鼠總量1 〇 gg的抗原且不包含佐劑。第六次注射兩天後對每一小鼠採血。來自這些採血之血液樣品經ELISA分析決定對活動素A之抗體力價。最終注射四天後，犧牲小鼠並收取流出的淋巴結以及回收淋巴細胞。分開集合來自三組之每一小鼠淋巴細.胞。爲提高淋巴細胞樣品之B -細胞量，添加抗-C D 9 0磁珠（M i 11 e n y i B i 〇 t e c h c a t # 491-01)使T-細胞減少，然後將淋巴細胞通過LS +管柱 (Miltenyi Biotech cat. # 424-0 1) 〇然後使用電子細胞融合儀（Genetronic，Inc.，模式ECM 200 1 )將富含B-細胞之各淋巴細胞樣品與P3骨髓瘤細胞融合以產生融合瘤。然後將三組已融合之融合瘤系置入96-井平板融合瘤培養基，敘述如（WO 2005/094879)，然而亦能使用其他技藝已知適當培養基。在37°C於15% C02培養融合瘤系1 4天。 14天後，以ELISA分析培養基上清液偵測對活動素A 之人類IgG抗體的存在。ELISA測試爲陽性之培養基上清液於第二次ELISA測試人類κ鏈的存在。在此第二次ELISA，除二級抗體是山羊抗-人類κ鏈抗體共軛璋菜過氧化酶之外，條件與第一次ELIS A相同。兩次ELISA分析測試皆爲陽性之融合瘤經進一步擴大以產生5 ml上清液用於後續測試。如以下實施例所述，使用細胞系功能性分析及BIAcore -128- 200819466 結合分析篩選衍生自XenoMouse®小鼠之共160個抗活動素 A融合瘤樣品。23個融合瘤進一步特性分析他們有關表現、純化、細胞系分析、結合分析、序列分析、MS及SEC的特性。從這些有三個有效能之單株抗體A 1、A2及A3 ’如下所述進一步測試鑑定。這些抗體的胺基酸序列如下：A 1 : SEQ ID NO : 9(輕鏈可變）；SEQ ID NO : 84(輕鏈恆定）；SEQ ID NO: 1〇(重鏈可變）；以及SEQ ID NO: 214(重鏈恆定）。A2 : EQ ID NO : 25(.輕鏈可變）；SEQ ID NO : 100(輕鏈恆定）；SEQ ID NO : 26(重鏈可變）r以及SEQ IDtNO : 21 5(重鏈恆定）。 A3: SEQ ID NO: 41(輕鏈可變）；SEQ ID NO: 108(輕鏈恆定）；SEQIDNO: 42(重鏈可變）；以及 SEQIDNO: 221(重鏈恆定）。

實施例3 於CHO細胞表現及純化人類抗-人類活動素A 抗體用於轉染抗-人類活動素A表現質體之CS-9細胞是無血清之懸浮液CHO細胞系。篩選宿主細胞系表現重組蛋白質之CS-9選殖株並存於無血清之培養基。測試此庫存之外來劑及無菌性，並處於無病毒、黴漿菌及微生物劑。使用典型的饋料批式法使表現抗-人類活動素A之細胞系提高規模。將細胞種入Wave生物反應器以擴展。以批式進料在約第3天、第5天及第9天投入培養基三次，並在第 11天採集。離心細胞且條件培養基透過1〇英吋〇 .45/〇 . 2 μιη 預濾器過濾，隨後透過6英吋〇·2 μπι濾器過濾。基（C.M·)辨·化簞株抗體： -129- 200819466

對介於7至10 ml的C.M.添力口 100 μΐ 1 : 2平衡於PBS 之單株抗體篩選樹脂泥狀物。將試管置於旋轉器上於4-8° C 隔夜。以1，〇〇〇 X g離心試管5分鐘並輕輕倒出未結合之分層。以5ml的PBS清洗樹脂，並如上離心及輕輕倒出。然後將樹脂轉移到SPIN-X，0.45 μπι，2ml試管。以0.5ml的PBS 另清洗樹脂兩次並離心。經由在室溫培育與偶爾混合1 〇分鐘而以〇.2ml的0.1M乙酸溶析單株抗體。試管經離心，以及添加30 μΐ的1M Tris緩衝劑，Ph 8.0至該溶析液。純化之單株抗體保存在4-8°C。實施例4 C2C12細胞系活動素活性分析此分析證明測試之抗體的活動素A中和能力，其係經由測量活動素A與其受器之結合被抑制的程度。活動素反應性報告子細胞系是以pMARE-luc構築轉染C2C12肌胚細胞 (ATCC No: CRL-1772)所產生。pMARE-luc構築之製造是經由選殖代表活動素反應要素（response element)之12個重複 CAGA 序列（Dennler et al. EMBO 17:3091-3100 (1998))進入 pLuc-MCS 報告子載體（Stratagene cat # 219087)的 T AT A b ο x 上游。肌胚細胞C2C 12細胞自然地表現活動素IIB受器 (actRIIB)於細胞表面。當活動素結合細胞受器時，Smad途徑被活化，且碟酸化之S m a d結合到反應要素（M a c i a s - S i 1 v a et al.細胞 87 : 1 2 1 5 ( 1 996))，導致蟲螢光素酶基因的表現。然後使用市售蟲螢光素酶報告子分析套組（cat # E4550， Promega，Madison，WI)，根據廠商操作手冊測量蟲螢光素酶活性。 -130- 200819466 使用已經pMARE-luc轉形之C2C12細胞穩定細胞系 (C 2 C 1 2 / p M A R E選殖株# 4 4 ) ’依據下歹ij程序測量活動素活性。將相同量的報告子細胞（C2C12/pMARE選殖株#44)置入 96井培養基。使用兩稀釋之含有抗體的條件培養基，以活動素A濃度固定在4 nM進行第一回篩選。在室溫分別以2 x 及5 X稀釋之條件培養基預培育重組的成熟活動素a達1小時。報告子細胞培養處以活動素及含或不含抗體達6小時。經由決定處理之培養基中蟲螢光素酶活性來測量活動素A 活性。使用此分析初次鑑定在報告子分析中能抑制活動素A 訊息活性之抗體。然後，將活動素A濃度固定在4 nM製造九點滴定曲線。各以下列9種濃度的純化抗體預培育活動素 A: 0.004 nM，0·04 nM，0.4 nM，4 nM，20 nM，40 nM，200 nM，40 0 nM及2 μΜ達1小時，即在添加該混合物至報告子細胞培養之前進行。一些抗體Al，Α2及A3之IC5〇値提供於表3。表3 單株抗體細胞 IC5〇 (nM) A1 <3 A2 <3 A3 <3 實施例5 BIAcore®分析在 BIAcore®3000(Biacore，Inc·，Piscataway，NJ)儀器，使用感應片 CM5及 0.005百分比之 P20界面活性劑 (Biacore，Inc.)爲運轉緩衝劑進行活動素A抗體Al，A2及 -131- 200819466 A3 之親和力分析。使用 Amine Coupling Kit(Biacore，Inc.)，根據廠商建議之方法步驟將重組的成熟活動素A蛋白質透過一級胺基固定在硏究等級的CM5感應片（Biacore，lnc.)。使用直接結合分析依序他們結合到固定之活動素A的能力篩選抗體。結合分析的進行是以50 μΐ/分鐘的流速注射兩種濃度（40及400 ηΜ)之每一候選抗體到定之活動素Α表面3分鐘。3分鐘的解離時間之後，重建表面。結合曲線經定性地比較結合訊息強度以及解離速率。使用 BIA evaluation 3.1電腦程式（Biacore，Inc·)決定包括ka(結合速率常數）、kd(解離速率常數）及KD (解離平衡常數）之抗體結合動力學參數。解離平衡常數越低（以ηΜ表示），對活動素 Α之抗體的親和力越大。實施例6 對單株抗體之活動素A結合區域定圖譜使用多種生化方法決定活動素A上的抗體結合區域，包括還原或非還原條件下西方點墨法，使用LysC之限制蛋白酶分解作用，經由MS之胜肽分析以及使用BIAcore之胜肽競爭。

Cys-結是TGF-β家族成員的關鍵結構特徵。以還原劑打斷S-S使活動素A結構退化及減少活動素A結合至中和性抗體（包括A-1)。此數據證明Cys-結對活動素A結合這些中和性抗體（相較於活動素B，其專一結合至活動素A)是重要的。Cys-結使序列的兩個遠環結構彼此鄰近。這兩區域爲接近Cll-S33(第一環）以及接近C81-E111(第二環）動素A(第7 圖）區域之序列。限制之Ly s C分解作用展現适兩區域經抗體 -132- 200819466 A-1保護’包括他們直接與中和性抗體交互作用。中和性抗體對活動素A之構形變化是敏感的，而提出他們結合到抗原之非線性決定基。進一步的胜肽分析指出活動素A中片段 G-1至K7以及S57-F74對於其直接結合中和性抗體並非必要。相較於活動素B之活動素A的序列比對顯示此區域出現部分序列差異。實施例7 選擇性分析使用BIAcore®技術進行這些分析，決定抗體Al，A2 及A3對各種活動素及其他TGF-13家族成員，包括活動素A、活動素B、活動素AB、抑制素A、GDF-8、GDF-n、TGF^-l、 TGFI3及BMP4(全來自硏發系統）之結合選擇性。根據廠商提議之手冊將ActRIIB/Fc共價偶合至硏究等級的感應片。由於BIAcore分析偵測折射率變化，在沒有任何抗體存在下，以注射液於固定之受器表面所偵測之反應相較於注射於對照組表面所偵測之反應間的差異，代表各種配體對受器的實際結合。以抗體及活動素及TGF-β分子之預培育，結合反應之變化（增加或減少）代表抗體結合至TGFB家族分子。抗體全部結合至活動素 A但非活動素B、GDF-8、GDF-11、 TGF-β-Ι、TGFU及BMP4,如此代表對活動素A之專一性。實施例8 KinEx Atm平衡分析

使用 KinExA™ 技術（Sapidyne Instiruments，Inc·)之溶液系平衡之結合分析，是用於決定活動素A結合至抗體分子的解離平衡（KD)。在某些情況，此溶液系分析被認爲比BIAcore 分析更靈敏。以約50 pg/ml活動素A預塗覆Reacti-Gel™ 6X -133- 200819466 隔夜，然後以B S A封阻。進行通過塗覆活動素a小珠之前， 30pM及ΙΟΟρΜ的抗體樣品與各種濃度活動素α(0·5 pM至5 nM)於樣品緩衝劑中在室溫培育8小時。經由螢光物（Cy5) 標gB之山羊ί/L人類-F c抗體，以1 m g / m 1於超封阻定量結合抗體的小珠含量。與已知活動素A濃度呈平衡時，結合訊息與游離抗體濃度成比例。使用KinEx Atm軟體（Sapidyne Instruments，Inc.)提供之雙曲線一位同次結合模式 (dual-curve one-site homogeneous binding model)，從競爭曲線之非線性回歸得到KD。結果示於第8圖。A 1顯示對活動素A(KD〜3 pM)之最強結合親和力。A2及A3分別以〜15 pM 至〜8 pM結合至活動素A。實施例9 膠原誘發之關節炎模式中抗活動素對體重及肌肉質量損失之保護效果此實施例是設計用於測試活動素抑制劑是否能挽救膠原誘發之關節炎所觀察到之肌肉消耗情形。膠原誘發之關節炎（CIA)是廣泛使用的小鼠模式與類風濕性關節炎（RA)共有嚴重的臨床及病理學特徵。CIA的確切機制尙不知，但有相當證據指出ClA是Th-Ι仲介之發炎性疾病。類風濕性關節炎是常見的自體免疫疾病，導致關節發炎及漸進式軟骨/骨腐蝕。縱使RA進行是在控制下，無額外、直接干涉時BCM 的損失不會被矯正。膠原誘發之關節炎模式如下製備。使用8週齡（2 〇_23g) 之 DBA/1J 雄小鼠（The Jackson Laboratory，Bar Harbor， ME)。免疫作用是在第1天及第21天進行經由在尾巴根部皮 -134- 200819466 膚內注射乳化於100 μΐ的CFA或ICFA之l〇〇〇g牛膠原II (Chondrex，Redmond，WA)。使用 3 組各 10 隻小鼠。第 1 組（對照組）只接受運載體。第2組（實驗組，注射膠原）只接受運載體作爲治療。第3組注射膠原及處以抗-活動素A抗體A1 〇使用之關節炎臨床指標爲：〇=正常關節，無關節炎症候 1= 一趾腫脹及/或紅腫 2=牽涉兩關節 3=超過兩關節 4=整個掌及趾之嚴重關節炎活動素抗體注射（s.c.)所構成之治療從第8天開始，一週兩次5mg/kg，s.c.。終點測量體重，肌肉/脂肪質量，食物吸收及發炎性細胞激素。體重··相較於正常動物，未經處理之CIA動物損失他們百分之二十五的體重及肌肉質量，此提供類風濕性惡病質的證據。相較於CIA對照組而非正常對照組動物，抗-活動素A (A -1 )治療顯著增加體重（p <；〇 . 〇 5 )。肌肉質量：相較於未經處理之CIA動物，以單株抗體 A1之治療於CIA動物顯著增加肌肉質量（p<〇〇5)。在ciA 對照組’在9 5天肌肉質量是1 · 5 g ;反之，抗體治療之c〗a動物’在95天肌肉質量是2 5g。結果示於第1圖。脂肪質量：抗-活動素A抗體無法使CIA動物的脂質損失反回。結果示於第2圖。 -135- 200819466 經治療動物中體重及肌肉質量的維持，給予支持活動素 A抗體作爲改善生活品質及於類風濕性關節炎患者降低死亡率之治療劑。實施例10 年輕成熟裸小鼠之肌肉內CHO/活動素異種移植 .以活動素A(CHO/活動素）穩定轉染之CHO細胞透過肌肉內注射以不同劑量lxl 〇6、5x1 06及1 Ox 106植入年輕成熟 CD1 nu/nu小鼠。相同劑量之未經轉形CHO細胞注射到分開組別的小鼠作爲對照組。相較於對照組，CHO/活動素植入引起快速且激烈的體重減少。在第12天，lxl 〇6細胞之CHO/ 對照組減少10 %的體重，反之CHO/抗-活動素A組體重增加 10%。5x1 06及10x1 06細胞抗-活動素A組別也顯示體重增加約10%，反之對照組5x1 06及10x1 〇6細胞組別體重減少 25 -3 0% ° 異種移植植入後第1 2天測量小鼠的血清活動素A程度。植入親代CHO之對照組小鼠中血清活動素A程度爲< 2 ng/m卜相較之下，含有CHO/活動素異種移植的小鼠顯示戲劇性提髙血清活動素A。如同統計分析所示血清活動素A程度與體重減少的嚴重度之間有顯著的關聯性，代表活動素A 過度表現是CHO/活動素異種移植小鼠體重減少可看見的原因。以CHO/活動素異種移植植入小鼠（每組n= 14)，隨後注射運載體或三種抗-活動素A單株抗體Al、A2及A3各一。 14隻運載體組小鼠中有12隻在植入CHO/活動素後25天以 -136- 200819466 前死亡，而42隻植入CHO/活動素小鼠於抗-活動素A單株抗體治療組中只有1隻小鼠在那時死亡。第3 8天以前，單株抗體治療組的大多數小鼠繼續良好的存活，存活率如下： 14隻A1組有13隻，A2或A3組爲14隻有10隻。體重數據顯示以抗-活動素A單株抗體之A1或A2治療，於含有CHO/活動素異種移植之小鼠完全防止體重減少，代表抗-活動素A單株抗體在活體內有效於中和活動素 A活性。如第3圖所示，NMR數據顯現以抗-活動素A單株抗體A1治療，在含有CHO/活動素之小鼠可防止漸進式淨體質（lean body mass)的損失。以此抗體治療亦導致食物吸收增加。. 驗屍數據指出以抗-活動素A單株抗體A1及A2之治療，在含有CH〇/活動素小鼠可防止淨屍重的嚴重減少（表 5)。最終驗屍數據指出以抗-活動素A單株抗體A1及A2之治療，在含有CHO/活動素異種移植小鼠可防止脂肪質量的嚴重減少（表5)。最終驗屍期間在植入CHO/活動素後第12天分析含有可見腫瘤在異種移植位置的動物百分比。如表5所示，數據顯現運載體組的小鼠有80 %發展肉眼可辨識的異種移植腫瘤在注射位置。在抗-活動素A單株抗體治療組觀察到的可見腫瘤形成率顯著減少。隨驗屍，從動物在CHO/活動素異種移植位置切出全部肉眼可辨識的腫瘤並稱重。相較於運載體組，在活動素A單株抗體治療組觀察到腫瘤質量顯著減少（表5)。 -137- 200819466 表5 治療窠12天之淨屍質量(g) 第12天之子宮周圍脂肪繊 (Periuterine fat tissue)(g) 第12天發展異種移植腫瘤之動物百分比第12天之腫瘤重量(g) 裸鼠+運載涵 9 士 0.25 0·18 土0·02 未實施未實施 CHO/運載體 +運載體 7.5±0.25 0·10±0·02 80% 0·11±·01 CHO/運載體 + A-1抗體 9.2 土 0.25 0·17土 0·04 20% 0·01 土 0.005 CHO/運載體1 + A-2抗體 8.9 土 0.25 0.16士0.03 50% 0.01 士 0.005 異種移植腫瘤發展之上述實驗，對於使用抗-活動素A 抗體改善癌症存活導出數個結論。活動素A在含有CHO/活動素異種移植之裸鼠惡病質症候的發展扮演導因角色。在此模式中，體重的減少與血清活動素程度增加極有關聯。含有 CHO/活動素異種移植腫瘤之小鼠中，抗-活動素A單株抗體可防止體重減少及惡病質症候。抗-活動素A單株抗體抑制異種移植物生長，藉此顯著降低含有看得見之異種移植腫瘤的小鼠百分比以及減少異種移植腫瘤大小。抗-活動素A單株抗體可防止CHO/活動素外移植物造成的死亡，顯著促進動物存活。實施例11 抗-活動素單株抗體A1於AAV-活動素小鼠出生後過度表現活動素A於C57B 1/6小鼠導致嚴重類惡病質消耗症狀。經第1、4、9及1 1天體重減少，從1 6克到14、12.5及最後在第11天爲10.5克。脂質重量、淨屍重及腓腸肌肌肉重也有損失。爲決定針對活動素A之抗體是否能減輕或防止活動素 -138- 200819466 A的作用，進行下列實驗。以1 x 1〇13 Pfu/小鼠’透過爲尾巴靜脈注射AAV-活動素或缺少AAV載體（對照組）於8週齢雄C5 7B1/6小鼠（n=10-12)。第5圖顯示於轉導小鼠在1、5、 8及1 2天，抗-活動素A單株抗體A1對體重變化的影響。在對照小鼠中觀察到該抗體防止體重變化。在此動物模式，抗體治療改善食物吸收。實施例12 抗-活動素A單株抗體A1於結腸-26癌症惡病質模式對抗體重及淨體質損失之保護效果此實施例證明抗-活動素A單株抗體A-1於鼠科動物癌症惡病質模式之肌肉維持效果。使用先天的鼠科動物結腸2 6 腺癌細胞在第〇天接種於8.5週齢雄CDF1小鼠（0.5 X 1〇6 細胞/小鼠）建立癌症惡病質模式。抗-活動素A單株抗體AU 治療（10 mg/kg，sc)在第4天開始並每週3次達18天。使用乙酸鈉緩衝劑（10 nm乙酸鈉，5%蔗糖，pH 5.0)爲運載體於含有腫瘤之對照組小鼠。使用年齢及體重與無腫瘤正常 C D F 1小鼠相配之一組作爲並行基線對照組。監測體重及食物吸收每週三次。每週以數位卡尺測量腫瘤大小三次。使用 NMR在硏究開始及結束測量身體組成，以監控痩肉及脂肪質量變化。實驗結束時，在C02室使小鼠安樂死。收集末端阻礙樣品並以ELISA分析血清活動素A程度。稱重淨屍重及記錄，稱重腓腸肌肌肉及腫瘤並適當地儲存。全部結果以平均±平均的標準誤差（SEM)表示。使用 Graph Pad Prizm軟體進行未配對之T_test決定各組間的統計差異。運載體之統計意義以p値少於0 · 0 5表示。 -139- 200819466 數據顯示處以A-1的小鼠比處以運載體的小鼠具有顯著較高的體重値（第15天，21.30 土〇·54 g對19.21 ± 0.38 g， Ρ<0·05;以及第 18 天，19.66 ± 〇·22 g 對 18·11 ± 〇·19 g’ P<0.05)。處以運載體之含腫瘤的小鼠比年齡相配之不含腫瘤的小鼠體顯著重減少（25.48 ± 0.35 g對18.11 土〇·19 g’ ρ<0· 00 5)。如此，盼望活動素A抗體治療可維持體重。以數位化卡尺測量來監測腫瘤生長並以等式：腫瘤尺寸 (mm3 = L (mm) * W (mm) * W (mm) * 0.5)計算腫瘤大小。處以抗體A 1及處以運載體兩組間之腫瘤大小沒有差異。接種C-26腫瘤細胞後，相較於不含腫瘤的小鼠’處以運載體的小鼠有戲劇性的體重減少（25.48 土 0.35 g對18.11 土 0.19 g，ρ<0·0 1)。然而，A-1治療減弱平均的體重損失（19.66 ± 0.22 g 對 18.11 ± 0.19g，Ρ<0·05)。 Α-1治療造成骨骼肌肉質量的顯著保存。處以Α-1的小鼠比處以C26運載體組具有較重的腓腸肌肌肉質量（0.099 土 0.002 g 對 0.093 土 0.001，p<0.05)。實驗結束時，進行末端組織解剖。具有腫瘤之對照組 C-26小鼠比處以抗體A1之小鼠（7.20 土 0.16 g，ρ<〇·〇5對 C-26 +運載體組）具有顯著較低淨屍重（6.75 it 0.11 g)。淨體質顯著損失於處以運載體之C-26組（-1.85 土 0.24 g相較於其初淨體質）。處以A-1治療之具有腫瘤的C-26小鼠顯著減弱淨體質損失（-0.60 ± 0.26 g，P<0.05對C26-運載體組）。抗-活動素A單株抗體A 1治療能有效減弱誘發整個體 -140- 200819466 重減少之癌症惡病質。在建立良好之鼠科動物癌症惡病質動物模式中，抗體A 1的保護效果與維持骨骼肌肉質量、淨屍質量及總淨體質有關。

本硏究提供臨床前證據’使用單株抗體A1之活動素A 中和作用能顯著減弱體重減少並維持骨骼肌肉和淨體質。實施例13 活動素A ELISA 對活動素A之抗體能用於分析及定量樣品中的活動素 A，例如生物樣品。重組人類活動素 A(100 ng/ml，型號 #1 0-8 5 1 06)及分析稀釋緩衝劑（〇 mg/ml，型號 #10-85101) 是購自DSLabs(Webster，Texas)並保存在4°C。標準品於實驗前當場經由稀釋於分析緩衝劑中製備。人類血清獲自 Bioreclamation Inc.(Hicksville，NY)。活動素A之血清測量是分裝於1 1 0 μΐ以減少因冷凍-解凍的變化差異。以分析緩衝劑以1/3稀釋樣品並於ELISA中測量。使用下列步驟進行活動素A ELISA(—步驟ELISA): 在室溫以100 μΐ的4 gg/mL抗-活動素A單株抗體（A2) 塗覆 Corning Costar 3590 96-井平板隔夜，並以 500-600 rpm 緩慢搖動。以含有0·02%(ν/ν) Tween 20之PBS清洗井（400 μ 1/井）三次。在室溫將井封阻於3 00 μΐ的I·阻斷緩衝劑兩小時，然後移除阻斷緩衝劑。添加100 μΐ標準物活動素A/或10〇 μ1稀釋樣品，並添加25 μΐ的〇·5 pg/mL HRP標識之抗-活動素Α單株抗體 (A1/HRP)於分析緩衝劑。對於無活動素a測量，以分析緩衝劑1 / 3稀釋血清。對於總活動素a測量，（1 )以2 0 % H C L (每 -141- 200819466 110 μΐ血清2 μ 1)酸化血清（pH 4-5)，（2)在室溫培育15分鐘’ (3)添加2 μΐ的5 N NaOH(每110 μΐ血清2 μΐ)中和’以及（4) 以分析緩衝劑1 /3稀釋。在室溫進行培育2小時同時以600-700 rpm搖動。以含有 0.02 % (v/v) Tween-20 之 PBS 清洗井（400 μΐ/井）三次。添加 100 μΐ 的 TMB(R&D System，Minneapolis’ ΜΝ)’ 隨後在室溫培育二十分鐘。添加 50 μ1終止溶液（R&D System， Minneapolis，MN)。使用 450 nm 於 Molecular Device SpectraMax M5 進行 OD 測量。使用Molecular Device之對數-對數（或五參數符號·.準·輯）曲線擬合（curve fitting)軟體，經由在450 nm吸收度對rh-活動素濃度之對數作圖產生標準曲線。樣品濃度値是從標準値經由內插他們的吸收値而得。捕獲抗體（Capturing Antibody)是A-3抗-活動素A單株抗體，20.78 mg/ml。偵測抗體（Detection Antibody)是 A-1 抗-活動素 A 單株抗體- HRP，0·65 HRP/Ab，12.05 mg/ml。阻斷緩衝劑是I-阻斷緩衝劑。清洗緩衝劑是PBS/0.1% Tween-20。分析緩衝劑（試劑稀釋劑）是〇 mg/mi活動素a緩衝劑。實施例14 活動素A蛋白酶保護分析進行蛋白酶保護分析以鑑定結合活動素A抗體之抗原決定基。以三種方法分析重組人類活動素A降解製備物。第一種方法檢驗純化期間已降解之活動素A製備物。第二種方法包括以離胺酸C、胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin)、胃蛋白 -142- 200819466 酶及嗜熱菌蛋白酶（thermo ly sin)蛋白水解活動素A製備物。第三種方法包括使用溴化氰之製備物的化學降解。如此，對於人類活動素及抗體複合物之蛋白水解，在以 2重量％經選擇之特殊蛋白酶處理前，將5 μ g活動素A及9 0 抗體混合於100 μΐ的0·1 Μ碳酸氫銨（pH 7.8)並保持在室溫約20分鐘。在37°C進行蛋白質的分解作用達9CT分鐘。單獨含有活動素A或單獨含有抗體之對照組樣品以相同方式進行。RP-HPLC分析之前酸化樣品。對於活動素A之溴化氰分解作用，在室溫培育1 〇 μ g 蛋白質與CNBr於100 μΐ的90 % T FA隔夜產生活動素A的 CNBr片段。培育期間樣品保持於暗處，並於rp-HPLC分析前在真空乾燥。利用RP-HP LC分析如上所述產生之片段。簡言之，以溶劑平衡管柱，注射樣品以及施用線性梯度前以溶劑清洗管柱。經由在21 5nm之吸收監測管柱流出物。溶析之樣品以手動收集並經由Edm an降解及質譜儀分析。純化期間已降解之製備物包括下列物種： 1 · Gly^His59 (6,45 6.2 Da) 2. Ser60-Tyr94 (4，102·9 Da) 3. Asp95-Ser116 (2,452.8 Da) 4. Gly^Tyr94 ( 1 0,5 4 1.1 Da) 已經由類胰凝乳蛋白酶活性降解之製備物具有下列物種在SEQ ID NO : 225所指位置裂解： 1 . iGLECDGKVNICCKKQFFVSFKDIGWNDWII30 •143- 200819466 2. 31APSGYHANYCEGECPSHIAGTSGSSLSFH i S6〇 3. 6iTVINHYRMRGHSPFANLKSCCVPTKLRPMS9〇 4. 91MLYY ^ DDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS116 第 9圖所示物種指出以胰凝乳蛋白酶、離胺酸 C(LysC)、或溴化氰（CNBr)降解活動素A製備物時之裂解位置的位置。實施例15 活動素A結合分析根據表6所列結合親和力，單株抗體A1、A2及A3結合至活動素A但不結合至活動素B。如此，進行活動素A抗體A 1、A2及A3的親和力分析以決定中和性抗體結合所需區域或結構。已知數種活動素A結合蛋白質，包括ActRII (A/B)，ActRI (A/B)(Alt4)，卵泡抑制素（follistatin)，以及卵泡抑制素有關基因（FLRG)。進行結合分析來篩選抗體以評估他們結合到固定之抗體表面（活動素A及/或活動素B)的能力。使用2 nM rh-活動素A及20 nM各固定於表面之抗體進行結合分析。下列抗體固定在表面並測試：AKA1 (可獲自市售商品），AKA2 (可獲自市售商品），A1及A3。抗體分析之結果示於第1〇圖。

抗-活動素A抗體 A2 A3 A1 ΑΚΑ1 ΑΚΑ2 活動素A KD〜25pM KD 〜ΠρΜ Κ〇〜3 ρΜ Kd 〜4 ρΜ Kd 〜4ρΜ 活動素B 實施例16 活動素A結合分析區域定圖譜（BIACORE) 如實施例5所述在固定之重組人類活動素RIB-Fc嵌合 -144- 200819466 體表面、重組人類活動素RIIB-Fc嵌合體表面以及重組人類 RIIA-Fc嵌合體重組表面進行阻斷分析。每一嵌合體表面上之單株抗體A卜A2、AKA1及AKA2與InM活動素A培育，以及測量相對的結合反應（％)。抗體存在下增加結合反應代表活動素A同時能結合至固定的受器表面及溶液中的抗體，其稱爲“繼續”。結果示於第7圖及第11圖，其中EC 50 意指產生50%結合之有效濃度。表7 EC50 (nM) rh活動素Rffi/Fc嵌合體 rh活動素RIIB/Fc嵌合體 rh活動素FIIA/Fc嵌合體 ΑΚΑ1 部分阻斷 0.30 0.35 AKA2 部分阻斷 0.36 0.37 A1 0.29 0.29 0.29 A2 0.18 繼續繼續實施例17 活動素A/B嵌合體如實施例5及1 6所述，製造活動素a/b嵌合體以進一步評估單株抗體Al、A2及A3的抗原決定基結合能力。如第12圖所示，測試.兩嵌合體：活動素a 13/3 9 B (含有活動素A胺基酸1 -1 1 6，但活動素A胺基酸位置1 3 - 3 9經活動素 B對應之胺基酸位置13-39取代除外一SEQ ID NO: 243)，以及活動素A 82/107 B (含有活動素A胺基酸1-116，但活動素A胺基酸位置8 2 - 1 0 7經活動素B對應之胺基酸位置 82-107 取代除外—SEQ ID NO : 244)。簡言之，使用全長活動素A選殖株爲模板，使用P fu -145- 200819466

超聚合酶（Stratagene)及引子（SEQ ID NO: 245 及 SEQ ID NO: 24 6)在成熟蛋白質序列的開始經由PCR增幅。所得PCR 產物經管柱純化（Qiagen)，以Sail及Xbal限制酵素（Roche) 分解及經凝膠單離（Qiagen)。經由使用Gene Designer程式 (Version 1·0·4，DNA 2.0，Inc.)(BMC Bioinformatics，7: 285 (2 0 0 6))，利用全長活動素A及活動素B的胺基酸序列並反轉譯爲在哺乳動物宿主細胞內最佳表現的DNA序列密碼以設計含有經修飾成熟蛋白質序列之合成基因卡夾（synthetic gene cassettes)。以Xbal及Notl分解序列並經凝膠單離。在標準反應條件下使用 T4 DNA連接酶（New England Biolabs，Inc·)與 13-39 合成基因片段（SEQ ID NO: 247)或 82-107合成基因片段（SEQ ID NO: 213)以及Sall/Notl分解之表現載體（pDRSa 24)連接活動素A的PCR產物以產生全長表現構築體。然後利用胺基酸1 3 - 3 9經活動素B序列置換的活動素A合成基因構築體（SEQ ID NO : 247)，以及胺基酸 8 2 —1 07經活動素B序列置換的活動素A合成基因構築體 (SEQ ID NO : 24 8)於抗原決定基定圖譜實驗（結果示於第12 圖）。從前述，雖然本發明之專一具體例已爲舉例說明敘述於本文’可製造各種修飾而未脫離本發明之精神及範圍。因此’除添附之申請專利範圍外本發明不受限制。揭示於文中之全部刊物，公開之專利申請案及專利文件特此倂入參考。 -146- 200819466 【圖式簡單說明】第1圖提供膠原誘發之關節炎小鼠處以抗-活動素A抗體A1之肌肉質量變化。第2圖提供膠原誘發之關節炎小鼠處以抗-活動素A抗體A1之脂肪質量變化。第3圖提供數據顯示於具有肌肉內CHO/活動素異種移植之年輕成熟裸小鼠（nude mice)，使用抗體A1、A2及A3 之抗-活動素A治療可防止體重減少。第4圖提供NMR數據顯示於具有肌肉內C Η 0/活動素異種移植之年輕成熟裸小鼠（n u d e m i c e)，抗-活動素Α治療可防止淨體質（lean body mass)的損失。第5圖提供經AAV-活動素A轉導小鼠中，抗-活動素A 抗體A1對體重改變的影響。第6圖提供CDF1小鼠結腸-26癌症惡病質模式中，接種腫瘤1 8天後，有及無抗-活動素A抗體A 1治療之緋腸肌肌肉質量。第7圖顯不活動素A f旲式，圈出抗體結合區域。K21， K 103及X94是指位於位置21及1〇3之離胺酸殘基以及位於位置94之酪胺酸殘基。第8圖是顯示使用KinExA測定之抗體Al，A2及A3 之結合親和力圖。解離平衡常數是使用雙曲線一位同次結合模式（dual-curve one-site homogeneous binding model)使用 KinExA軟體從競爭曲線之非線性回歸獲得。第9圖顯示經由抗體Al，A2或A3之結合未免受降解 -147- 200819466 之抗原決定基區域。第10圖顯示抗體A1，A2及A3對完整的活動素A(以 5 5批表示）之結合親和力圖，以及活動素a爲在胺基酸位置 94號酪胺酸殘基裂解（以38批表示）。第1 1圖顯示抗體Al，A2及A3之結合親和力圖，以及固定之抗體表面上活動素A或活動素B之兩市售抗體。第12圖顯示以抗體A1及A2結合至活動素a/活動素B 嵌合體之抗體，以及兩市售之活動素A抗體。第1 3圖顯示第1 1圖所述抗體測試所用之活動素A /活動素B嵌合體之胺基酸序列。第14圖顯示包括Al，A2及A3之數種抗體結合至活動素A的不问抗原決疋基，也測試兩巾售活動窣A抗體。【元件符號說明】

Ant 拱0 -148-

Claims

200819466 十、申請專利範圍： 1·一種單離之抗原結合蛋白質，含有任一： a·—輕鏈CDR3，含有選自由下列所組群組之序列： i. 一輕鏈CDR3序列，其與選自由SEQ ID NO:13、29、45、 61、 77、 93、 109、 125、 141、 157、 173、 189 及 205 之輕鏈CDR3序列所組群組之CDR3序列差異不超過總計兩個胺基酸添加、取代、及/或刪除； ii. X73 Q X74 X75 X76 X77 X78 X79 Χδ〇 » iii· L Q Η Ν Χ81 Υ Χ82 χ83 τ ;以及 iv. Q A W D Χ84 S Τ Χ85 Χ86 ;或 b·—重鏈CDR3，含有選自由下列所組群組之序列： i· 一重鏈CDR3序列，其與選自由SEQIDNO:16、32、48、 64、80、96、112、144 > 160、176、208 及 224 之 H1-H14 重鏈CDR3序列所組群組之CDR3序列差異不超過總計三個胺基酸添加、取代、及/或刪除； ϋ. Χ87 Χ88 Χδ9 X90 X91 X92 X93 X94 F D Y ； iii. X 9 5 X 9 6 X97 Y X98 D X 9 9 X 1 0 0 G W X 1 0 1 X 1 0 2 X 1 0 3 ; iv· X104 Xl05 Xl〇6 Xl〇7 Xl〇8 Xl09 Y XllO Xlll X112 X113 Xll4 Xll5 Xll6 Xll7 Xll8 ;或 C. (a)之輕鏈CDR3序列以及（b)之重鏈CDR3序列；其中 X73爲甲硫胺酸殘基，麩醯胺酸殘基，或精胺酸殘基， X74爲丙胺酸殘基，酪胺酸殘基，麩醯胺酸殘基，或絲胺酸殘基， X75爲白胺酸殘基，酪胺酸殘基，或天冬醯胺酸殘基， -149- 200819466 χ76爲麩醯胺酸殘基，絲胺酸殘基 x77爲酥胺酸殘基，酪胺酸殘基， x78爲脯胺酸殘基或絲胺酸殘基， Χ79爲半腕胺酸殘'基，色胺酸殘基酸殘基， Xsc爲絲胺酸殘基或酥胺酸殘基， X8 i爲酥胺酸殘基或絲胺酸殘基， X82爲脯胺酸殘基或酥胺酸殘基， x83爲苯丙胺酸殘基或色胺酸殘基 X84爲精胺酸殘基或絲胺酸殘基， X85爲纈胺酸殘基或丙胺酸殘基.， x86爲纈胺酸殘基或沒有殘基， x87爲纈胺酸殘基或沒有殘基， x88爲麩醯胺酸殘基或沒有殘基， X89爲天冬胺酸殘基，色胺酸殘基 X90爲絲胺酸殘基，白胺酸殘基， x91爲異白胺酸殘基，麩胺酸殘基 X92爲丙胺酸殘基，白胺酸殘基， X93爲丙胺酸殘基或白胺酸殘基， X94爲脯胺酸殘基，酪胺酸殘基， X95爲天冬胺酸殘基或沒有殘基， X96爲麩醯胺酸殘基或沒有殘基， X97爲天冬胺酸殘基或丙胺酸殘基 X98爲酪胺酸殘基或甘胺酸殘基，，或酥胺酸殘基，奕異白胺酸殘基，，白胺酸殘基，或脯 ’或沒有殘基，或沒有殘基， ’或麩醯胺酸殘基，或甘胺酸殘基，或甘胺酸殘基， -150- 200819466 χ99爲絲胺酸殘基或酪胺酸殘基， Xi 00爲絲胺酸殘基或精胺酸殘基， Χ1(η爲苯丙胺酸殘基或沒有殘基， Χ1〇2爲甘胺酸殘基或天冬胺酸殘基， Xi 03爲組胺酸殘基或脯胺酸殘基， Xi 04爲甘胺酸殘基或沒有殘基， Xi 05爲絲胺酸殘基，麩胺酸殘基，或沒有殘基， Xi 06爲精胺酸殘基，絲胺酸殘基，或沒有殘基， Xi 07爲天冬胺酸殘基，天冬醯胺酸殘基，絲胺酸殘基，或麩醯胺酸殘基， Xi 08爲絲胺酸殘基，精胺酸殘基，或色胺酸殘基， Xi 09爲甘胺酸殘基，天冬胺酸殘基，天冬醯胺酸殘基，酪胺酸殘基，或白胺酸殘基， Xno爲絲胺酸殘基，甘胺酸殘基，天冬胺酸殘基，或沒有殘基， XiU爲絲胺酸殘基，纈胺酸殘基，天冬醯胺酸殘基，或酪胺酸殘基， Xi ^爲絲胺酸殘基，天冬醯胺酸殘基，酪胺酸殘基，或組胺酸殘基， X 1 1 3爲色胺酸殘基，酪胺酸殘基，或鍵醯胺酸殘基， X114爲組胺酸殘基，天冬胺酸殘基，酪胺酸殘基，或沒有殘基， X 1 1 5爲苯丙胺酸殘基，丙胺酸殘基，或甘胺酸殘基，爲天冬胺酸殘基，苯丙胺酸殘基，白胺酸殘基，或甲 -151- 200819466 硫胺酸殘基， Χη7爲酪胺酸殘基，或天冬胺酸殘基， Χ118爲異白胺酸殘基，纈胺酸殘基，或沒有殘基；以及該抗原結合蛋白質專一結合人類活動素Α。 2.如申請專利範圍第1項之單離之抗原結合蛋白質，含有選自由下列所組群組之胺基酸序列： a. — 輕鏈 CDR1 序列，其與 SEQIDNO:U、27、43、59、 75、 91、107、155、171、203 及 219 之 L1-L14 之 CDR1 序列差異不超過總計三個胺基酸添加、取代、及/或刪除； b. — 輕鏈 CDR2 序列，其與 SEQIDNO:12、28、44、60、 76、 156、172、204 及 220 之 L1-L14 之 CDR2 序列差異不超過總計兩個胺基酸添加、取代、及/或刪除； c. 一輕鏈 CDR3 序列，其與 SEQIDNO:13、29、45、61、 77、 93、109、125、141、157、173、189 及 205 之 L1-L14 之CDR3序列差異不超過總計兩個胺基酸添加、取代、及/ 或刪除； d. — 重鏈 CDR1 序列，其與 SEQ ID NO:14、30、46、62、 78、 94、110、126、158、174、190、206 及 222 之 H1-H14 之C D R 1序列差異不超過總計兩個胺基酸添加、取代、及/ 或刪除； e. — 重鏈 CDR2 序列，其與 SEQIDNO:15、31、47、63、 79、 95、111、127、159、175、207 及 223 之 ΗκΗΐ4 之 CDR2序列差異不超過總計三個胺基酸添加、取代、及/或刪除；以及 -152- 200819466 f. 一重鏈 CDR3 序列，其與 SEQ ID NO:16、22、32、48、 64、 80、 96、 112、 144、 160、 176、 192、 208 及 244 之 HI-HI 4之CDR3序列差異不超過總計兩個胺基酸添加、取代、及/或刪除。 3.如申請專利範圍第1項之單離之抗原結合蛋白質，含有選自由下列所組群組之序列： a. —輕鏈CDR1序列，選自由下列所組群組： i. (R/K)SSQS(L/I)L(H/Y)S(T/S)(G/N)(Y/N)(N/K)(-/K)YL(D/V)； ii. RA(S/G)QGI(S/R)N(D/N)L(V/G)； iii. RASQSISNYLNT ;以及 iv. SG(D/E)K(L/W)G(D/E)K(F/Y)(A/V)(F/C)； b. —輕鏈CDR2序列，選自由下列所組群組： i. (H/Q/L)D(T/N/S)KRPS ;以及 ii. X4〇 X41 S X4 2 X 4 3 X4 4 S，其中 X40爲丙胺酸殘基，色胺酸殘基，或白胺酸殘基， X4 i爲酥胺酸殘基，丙胺酸殘基，或甘胺酸殘基， X42爲絲胺酸殘基，甲硫胺酸殘基，或苯丙胺酸殘基， X43爲白胺酸殘基或精胺酸殘基， X44爲麩醯胺酸殘基，麩胺酸殘基，或丙胺酸殘基； C.一重鏈CDR1序列，選自由下列所組群組： i. GGS(I/F)(N/S)(S/A)(-/G)(-/G)(F/Y)YWS ； ii. G X 2 7 X 2 8 F X29 X3。Y X 3 1 X 3 2 X 3 3，其中 X27爲酪胺酸殘基或苯丙胺酸殘基， x28爲酥胺酸殘基或絲胺酸殘基， -153- 200819466 Χ29爲酥胺酸殘基，絲胺酸殘基，或異白胺酸殘基’ Χ3〇爲甘胺酸殘基或絲胺酸殘基， x31爲酪胺酸殘基，甘胺酸殘基，或色胺酸殘基’ χ32爲異白胺酸殘基或甲硫胺酸殘基， X33爲組胺酸殘基或甘胺酸殘基；以及 iii. G(Y/F)TF(T/S)(S/A)Y(G/W)(L/M/I)(S/H)； d.—重M CDR2序列，選自由下列所組群組： i. (Y/E)I(S/Y/N)(Y/H)SG(S/G)T(Y/N)YNPSLK(S/R)； ii. (V/N)I(K/W)(Y/Q)DGS(N/E/T)(K/E)Y(H/Y)(A/V)DSVKG;以及 iii· X60 I X61 X62 X63 X64 X65 Χό6 T X67 X68 X69 X70 X7I X72 Q G Χ60爲色胺酸殘基或異白胺酸殘基， X6 i爲天冬醯胺酸殘基，異白胺酸殘基，絲胺酸殘基，或酪胺酸殘基， X62爲脯胺酸殘基或丙胺酸殘基， X63爲天冬醯胺酸殘基，酪胺酸殘基，或甘胺酸殘基， X64爲絲胺酸殘基，天冬醯胺酸殘基，或天冬胺酸殘基， / X65爲甘胺酸殘基或絲胺酸殘基， Χό6爲甘胺酸殘基，天冬醯胺酸殘基，或天冬胺酸殘基， Χ67爲天冬醯胺酸殘基或精胺酸殘基， Χ68爲酪胺酸殘基或絲胺酸殘基， Χ69爲丙胺酸殘基或絲胺酸殘基， Χ70爲麩醯胺酸殘基或脯胺酸殘基， Χ7 i爲離胺酸殘基或絲胺酸殘基，以及 X72爲苯丙胺酸殘基或白胺酸殘基， -154· 200819466 其中圓括號所圍胺基酸殘基符號視爲序列中相同位置之替代殘基。 4.如申請專利範圍第1項之單離之抗原結合蛋白質，含有下列任一： a. —輕鏈可變功能部位，含有： i SEQ ID ΝΟ:11、27、43、59、75、91、107、155、171、 203及219之輕鏈CDR1序列； ii · S EQ ID NO : 1 2、2 8、44、60、76、1 5 6、1 72、204 及 220 之輕鏈CDR2序列；以及 iii· SEQ ID NO: 13、29、45、61、77、93、109、125、141、 157、173、189 及 205 之輕鏈 CDR3 序列； b . —重鏈可變功能部位，含有： i· SEQ ID NO:14、30、46、62、78、94、110、126、158、 174、 190、206 及 222 之重鏈 CDR1 序列； ii. SEQ ID NO:15、31、47、63、79、95、111、127、159、 175、 191、207及223之重鏈CDR2序列；以及 iii. SEQ ID NO: 16、22、32、48、64、80、96、112、144、 160、176、192、208 及 2 44 之重鏈 CDR3 序歹ij ;或 c· (a)之輕鏈可變功能部位以及（b)之重鏈可變功能部位。 5 . —種單離之抗原結合蛋白質，含有任一： a·選自由下列所組群組之一輕鏈可變功能部位序列： i·一胺基酸序列至少80%相同於SEQ ID NO:9、25、41、 57、 73、 89、 105、 121、 137、 153、 169、 185、 201 及 217 之L 1 -L 1 4之輕鏈可變功能部位序列； -155- 200819466 i i · 一胺基酸序列，編碼它的多核苷酸序列至少8 0 %相同於編碼 SEQ ID NO:9、25、41、57、73、89、105、121、137、 153、 169、185、201及217之L1-L14之輕鏈可變功能部位序列之多核苷酸序列；以及 i i i · 一胺基酸序列’編碼它的多核苷酸序列在中度嚴格條件下雜化至由 SEQ ID ΝΟ:1、17、33、49、65、81、97、113、 129、. 145、161、177、193 及 209 之 L1-L14 之輕鏈可變功能咅15位序列所組成之多核苷酸的互補體； b ·選自由下列所組群組之一重鏈可變功能部位序列： i · 一胺基酸序列至少8 0 %相同於s E Q ID Ν Ο : 1 0、2 6、4 2、 5 8、74、90、10 6、122、138、154、170、1 8 6、202 及218 之Η 1 -Η 1 4之重鏈可變功能部位序列； ii·一胺基酸序列，編碼它的多核苷酸序列至少80%相同於編碼 SEQ ID NO:10、26、42、58、74、90、106、122、138、 154、 170、186、202及218之H1-H14之重鏈可變功能部位序列之多核苷酸序列；以及 iii· 一胺基酸序列，編碼它的多核苷酸序列在中度嚴格條件下雜化至由 SEQ ID NO:2、18、34、50、66、82、98、 114、130、146、162' 178、194 及 210 之 H1-H14 之重鏈可變功能部位序列所組成之多核苷酸的互補體； c.(a)之輕鏈可變功能部位以及（b)之重鏈可變功能部位；其中該抗原結合蛋白質結合至人類活動素A。 6 ·如申請專利範圍第5項之單離之抗原結合蛋白質，含有下列任一： -156- 200819466 a·選自由 SEQIDNO:9、25、41、57、73、89、105、121、 137、 153、169、185、201 及 217 之 L1-L14 所組群組之一輕鏈可變功能部位序列； b. 選自由 SEQIDNO:10、26、42、58、74、90、106、122、 138、 154、170、186、202 及 218 之 H1-H14 所組群組之一重鏈可變功能部位序列；或 c. (a)之輕鏈可變功能部位以及（b)之重鏈可變功能部位。 7.如申請專利範圍第1或5項之單離之抗原結合蛋白質，當結合活動素A時： a. 抑制活動素A ; b. 與結合活J力素A之關聯抗體交叉競爭； c. 結合到如該關聯抗體之活動素A的相同抗原決定基； d. 以如該關聯抗體之實質相同Kd結合活動素A ;或 e. 以如該關聯抗體之實質相同脫落速率結合活動素A 其中關聯抗體含有輕鏈及重鏈可變功能部位序列之組合，其係選自由下列所組成之組合群組：L1H1，L2H2，L3H3， L4H4, L5H5, L6H6, L7H7, L8H8, L9H9, L10H10, L11H11， L12H12， L13H13，以及 L14H14。 8 ·如申請專利範圍第1或5項之單離之抗原結合蛋白質，當其結合到人類活動素A時，可抑制活動素A結合到人類活動素 A 受器（activinAreceptor)。 9 .如申請專利範圍第1或5項之單離之抗原結合蛋白質，其中該抗原結合蛋白質具有人類抗-活動素A抗體之至少一活體內（in Wvo)生物活性。 -157- 200819466 ;例如 1 0 .如申請專利範圍第9項之單離之抗原結合蛋白質，其中該生物活性是惡病質之減弱。 1 1 ·如申請專利範圍第9項之單離之抗原結合蛋白質，其於具有結腸腫瘤之小鼠減弱惡病質。 1 2.如申請專利範圍第9項之單‘離之抗原結合蛋白質，其於具有結腸腫瘤之小鼠改善體重的減少。 1 3 .如申請專利範圍第9項之單離之抗原結合蛋白質，其於膠原誘發之類風濕性關節炎動物模式中改善體重的減少。 1 4·如申請專利範圍第9項之單離之抗原結合蛋白質，其於膠原誘發之類風濕性關節炎動物模式中改善肌肉質量的損失。 1 5 ·如申請專利範圍第9項之單離之抗原結合蛋白質，其於膠原誘發之類風濕性關節炎動物模式中改善脂肪質量的損失。 . . · —— 1 6·如申請專利範圍第9項之單離之抗原結合蛋白質，其於 AAV-活動素A轉染之動物模式中改善體重的減少° 17·—種經單離之完全人類抗體，其專一結合至活動'素A之半胱胺酸結區域（cysteine knot region)(胺基酸C11-S33及/ 或胺基酸C81-E111)，其中該抗原結合蛋白質具有至少一人類抗-活動素A抗體的活體內生物活性。 1 8 ·如申請專利範圍第1 7項之經單離抗體，其中該生物活性是惡病質之減弱。 19.如申請專利範圍第17項之經單離抗體，其於具有結腸腫 -158- 200819466 瘤之小鼠減弱惡病質。 2 0 ·如申請專利範圍第1 7項之經單離抗體’其於具有結腸腫瘤之小鼠改善體重的減少。 2 1 ·如申請專利範圍第1 7項之經單離抗體，其於膠原誘發之類風濕性關節炎動物模式中改善體重的減少。 2 2 ·如申請專利範圍第1 7項之經單離抗體，其於膠原誘發之類風濕性關節炎動物模式中改善肌肉質量的損失。 23 ·如申請專利範圍第1 7項之經單離抗體，其於膠原誘發之類風濕性關節炎動物模式中改善脂肪質量的損失。 ’ • . . - : ·、，- ., ' . 2 4.如申請專利範圍第1 7項之經單離抗體，其於八人^活勤素 .A轉染之動物模式中改善體重的減少。 25.—種完全人類抗體，其專一結合至活動素A之半胱胺酸結區域（cysteine knot region)(胺基酸C11-S33及/或胺基酸 C8 1-E111)，其中該抗原結合蛋白質在活體外（in Wiro)抑制活動素A與活動素A受器的結合。 2 6.—種完全人類經單離之抗體，其專一結合至活動素A之半胱胺酸結區域（cysteine knot region)(胺基酸C11-S33及/ 或胺基酸C81-El 11)，其中該抗原結合蛋白質在活體內 Wv幻抑制活動素A與活動素A受器的結合。 2 7.—種完全人類經單離之抗體，其專一結合至活動素A之胺基酸K1 3 —Y3 9，其中該抗原結合蛋白質在活體外（Z> Wiro) 抑制活動素A與活動素A受器的結合。 2 8 . —種完全人類經單離之抗體，其專一結合至活動素A之胺基酸V82 — N107,其中該抗原結合蛋白質在活體外v/iro) -159- 200819466 抑制活動素A與活動素A受器的結合。 2 9.—種完全人類經單離之抗體，其專一結合至活動素A之胺基酸K13—Y39，其中該抗原結合蛋白質在活體內Wvo) 抑制活動素A與活動素A受器的結合。 30.—種完全人類經單離之抗體，其專一結合至活動素A之胺基酸V8 2—N107，其中該抗原結合蛋白質在活體內（以Wvo) 抑制活動素A與活動素A受器的結合。 -160-