SU1055770A1 - Способ получени иммобилизованного гемицеллюлазного комплекса - Google Patents

Abstract

ПОЛУЧгаМЯ ИГОЮБИЛИЭОВАННОГО ГБЮЩЕЯЛЮЛАЗНОГО КЭМПЛЕКСА путед4 ковгшентного св зывани  ферментного препарата с HepacitBOpHhAM носнтеле, о т л   ч а ю ц и и с   тем/ что, с целью повышени  выхода целевого продукта и комплексного использовани  исходного сырь , и польч зупт ферментный препарат AsperglCtuS higer 15, содержащий ксиланазу,арабиигиэу , галАктаназу и маннаназу, а в качестве носител  используют бензохйноновый силохром при соот- .:НОй1еиии носитель:фермент - lt

Description

СП

сд 41

о

Изобретение относитс  к получению иммобилизованных ферментов, например гёмицеллголаэного комплекса.

Гемицеллюлазы используютс  при гидролизе гемйцеллюлозны:с компонен- тов растительной ткани,,Продукты гидролиза  вл ютс  исходным сырьем дл  производства фурфурола, этилового спирта, кормовых дрожжей, кристаллической ксилозы, триоксиглутаровой кислоты, п тиатомного спирта ксилита, метилглиоксал , эритроновой :и глицериновой кислоты, глицерина , гликол , пропиленгликол  и целого р да органических соединений. Иммобилизаци  гемицеллюлазы обеспечивает создание более эффективных гидролизующих ai eHTOB,

Известен способ иммобилизации ксилаказы совместно с В-ксилозидазой и ферментом, разрушающим урановые кислоты, на пористом стекле с помощью глутарового альдегида Y) .

Недостатком способа  вл етс  низ кий выход иммобилизованной ксиланазы - 10%.

,Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому эффекту  вл етс  способ получени  иммобилизованного гемицеллюлазного комплекса путем ковалентного св зывани  ферментного препарата с нерастворимым носителем, в качестве которого,идпользугот сополимер ангидрида малеиновой. кислоты и бутандиолг. дивинилэфира в среде 6 ,05 М фосфатного буфера, рН 7, при соотношении носи- тель:фермент « 1:0,5. Св зываетс  50% от вз того количества белка, Ксиланазна  активность полученногй, иммобилизованного препарата 58-59% от исходной активности 2J .

Недостатками способа  вл ютс  большие потери фермента, так как ковалентное .св зывание фермента с носителем осуществл етс  через ангидридные группы, которые крайне неустойчивы в водных растворах, а также низкий выход по активности (58-59% от исходной).

Цель изобретени  - повышение выхода целевого продукта и комплексное использование исходного сырь .

Поставленна  цель достигаетс  предлагаемым способом получени  иммобилизованного гемицеллюлазного комплекса, эаключа ицимс.  в ковалентном св зываний ферментного препарата с нерастворимым носителем, с использованием ферментного препарата AspergifKus niger 15, содержащего ксилана эу, арабиназу, галактаназу и маннаназу , причем в качестве носител  используют бензохиноновый силохром при соотношении носитель:фермент 1:(0,02 - Of03) и процесс провод т в 0,1 М ацетатном буфере при рН 4,05 ,0.

Дл  иммобилизации используют технологический препарат Asp. nlger, содержащий 4 фермента с достаточно высокой активностью.

Иммобилизаци  предлагаемым способом обеспечивает сохранение всех 4 ферментных, активностей, крометого по отношению к арабиназной, галактаназной и манианазной активност м наблюдаетс  повышение активности за счет очистки препарата в процессе иммобилизации.

Ксиланаза иммобилизуетс  с сохранением 89% активности от исходной (по 4-0-метилглюкуроноксилану), арабиназа - с сохранением 113% активности от исходной (по арабинану), галактаназа - с сохранением 114% активности от исходной (по галактану), маннаназа - с сохранением 142% активности от исходной (по галактоманнану ) .

Силохром, активированный П -бензохиноном ,  вл етс  электронноакцепторным соединением и легко вступает в реакции с нуклеофильными реагентами . Схема реакции следующа ;

О

Силохром П n-J-VHi-гемицеллюлаза- ,

силохром-NH f| -гемицеллюлаза

В результате высокой реакциониоспособности хинойОв реакци  ковалеитного св зывани  фермента с носителем происходит быстро и с небольшими потер ми фермента.

Продолжительность реакции св зывани  2 ч. Св зываетс  до 80% от вз того количества белка.

Hk данном носителе хорошо иммобилизуютс  все компоненты гемицеллюлазного комплекса. Услови  иммобилизации и свойства носител  обеспечивают сохранение вьасоких активностей иммобилизованного препарата. Св зывание большей, чем балластных белков, части белков-ферментов-обеспечивает Ъовышенную активность иммобилизованного гемицеллюлазного комплекса по сравнению с соответствующими активност ми в исходном препарате .

Способ осуществл ют следук цим образом.

При контактировании раствора ферментного пр парата Asp. niger 15 с бемзохинонбвым силохромом при весовых соотношени х носитель:фермент. (0,02 - 0,03) в среде 0,1 М ацетатного буфера (рН 4-5) получают имобилизованный ферментный препарат | . с ксилаиазной активностью не менее 89% от исходной} арабиноэидаэной 113% , галактозИдаэной - 114%, маннозидазной - 142% от исходной активности . - . 5

В результата имеет Место более комплексное использование исходного сырь .

Пример 1. К0,5г бензохиноинового силохрома прибавл ют раст- tO вор 0,05 г ферментного препарата гемицеллюлазы в 2. мл 0,1 М ацетатного буфера, рН 4,6. Весовое соотношение носитель 5 белок 1«0,02. Используют геммицеллюлазный препарат из 15 AspergiBeus niger ISvc содержанием белка 20% и ксиланазной активностью 0,985 ед/мг белка, арабиназной 0 ,194 ед/мг белка, галактаназной0 ,081 ед/мг белка, Маннаназной - 20 0,026 ед/мг белка.

Внадерживают 2 ч при и отфильтровывают . Промывают мл 1 Н раствора NaC8 и 2 5 мл ацетатного, буфера.25

Полученный препарат иммобилизованной гемицеллюлазы содержит 1-6 мг белка на г носител  (80%.выход по белку).

Активность препарата: ксиланазна  - 0,88.0 ед/мг белка (89,3% от исходной); арабиназна  - 0,220 ед/мг белка (113,4% от исходиой); галактаназна  - 0,093 ед/мг белка (114,8% от исходно) ,маннаназна  - 0,037 ед/мг белка (142,3% от исходной). 35

Пример 2. К2г бензохиноинового силохрома прибавл ют раствор 0,30 г ферментного препарата гемицеллюлазы из AspergiC6us niger 15 в 8 мл 0,1 М ацетатного буфера, рН 5,0.40 Отношение носитель: белок 1:0,03.

Выдерживают 2 ч при 20с и отфильтровывают . Промывают 330 мл 1 М раствора NaC и 2 15 мл ацетатного -, буфера. Полученный препарат иммоби- 45 изованной гемицеллюлазы содержит 24 мг белка на г носител  ( выхода ) .

Активность иммобилизованной ге- { ицеллюлазы: ксиланаз на  - 0,883 ед/Mv CQ белка (89,7% от исходной); арабиназна  - 0,221 ед/мг белка (113,9% от сходной); галактаназна  0 ,092 ед/мг белка (114,9%от исходной ); маннаназна  - 0,037 -ед/мг белка (142,7% от исходной).

Примерз. К 1г бензохиноин ового силохрома прибавл ют раствор ,125 г ферментного препарата гемицеллкшаза из Г AsperglCEus niger 15 4 МП 0,1 М ацетатного буфера рН 4 60 (отношение 1:0,025).

Выдерживают 2 ч при и отильтровывают . Промывают 3-15 мл 1 М, аствора NaCB и 2-10 мл ацетатного уфера.65

Полученный препарат иммобилизованной гемицеллюлаэы содержит 20 мг белка на г носител  (выход 80%).

. Активность иммобилизованной гемицеллюлазы: ксиланазна  - 0,886 ед/мг белка (90% от исходной); арабиназна  - 0,219 ед/мг белка (119% от исходной),галактаназна  - 0,093 ед/мг белка (115%.от исходной); маннаиаэна  - 0,038 ед/мг белка (146,1% от исходной.

Определение гемицеллюлазных активностей .

Ксилан.азна  активность.

К 5 мг 4-0-метилг юкуропоксилана добавл ют 1 мл 0,1 М ацетатного буфера , рН 4,2. Навеска влажного иммобилизованного фермента 5 мг (содержание сухих веществ 30%). Инкубаци  30 мин при 40с. Реакцию останавливают 15-минутным кип чением на вод ной бане. Редуцирующие сахара определ ют по методу Сомоги-Нельсона.

Арабиназна  активность.

К 5 мг арабинана добавл ют 1 мл 0,1 ацетатного буфера, рН 4,2. Навеска иммобилизованного фермента ;5 мг. Инкубаци  30 мин при 4-0°С, Реакцию останавливают 15-минутнь1М ки:п чением на вод ной бане. Редуцирующие сахара определ ют по методу Сомоги-Нельсона ,

Галактаназна  активность.

К 5 мг галактана (из белого люцина ) добавл ют 1 мл 0,1 М ацетатного буфера, рН 4,2. Навеска И1и№1обилизованного фермента 5 мг. Инкубаци  30 мин при-40с. Реакцию останавливают 15-минутным кип чением на ifoaaной бане. Редуциру о|дие сахара определ ют по методу Сомоги-Нельсона.

Маннаназна  активность.

К 5 мг галактоманнана (из сем н ;люцерны) добавл ют 1 мл 0,1 И ацетатного буфера, рН 4,2. Навеска иммобилизованного фермента 5 мг« Инкубгщи  30 мин при .-Реакцию останавливают 15-минутным кип ченией на вод аОй бане. Редуцирук цие сахара определ ют п-о методу Сомоги-НельсонаЗа единицу активности принимеиот такое количество фермента, которое катализирует образование 1 мкмоль эквивалента ксилозы за 1 мин при данных услови х. Технико-эконокшческий эффект преД лагаемого изобретени  заключаетс  в экономии и комплексном испольэо 9ании ферментного препарата, т.е. в св зывании четырех компонентов с высоким выходом, а также в повышении выхода ксилоназы.

Высокие показатели всех актицносfей иммобилизованной гемицеллюлаэы .  вл ютс  предпосылкой практического использовани  иммобилизованного препарата.

5 10557706

Иммобилизованный препарат теми-использованы в качестве источника

целлюлаэы можно примен ть дл  осаха-.углеводородов дл  выращивани  корривани  растительных отходов, вмовЫх дрожжейf в микробиологической

частности дл  осахаривани  водораст-промышленности. Ксилоза легко может

воримых олигосахаридов - отходов пробыть превращена в ксилит и Фурфурол,

изводства целлюлозы, с получением широко примен емые в фармацевтическсилозы , арабинозы и маннозы. Этикой и химической промышленносмоносахариды в дальнейшем могут бытьти.

Claims (1)

1. 754) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОГО ГЕМИЦЕЛЛЮЛАЗНОГО КОМПЛЕКСА путем ковалентного связывания ферментного препарата с нерастворимым носителем, о т л и ч а ю щи й с я тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта и комплексного использования исходного сырья, испольг зуют ферментный препарат AspergiCtuS Higer 15, содержащий ксйланаэу,арабиназу, галактанаэу и маннаказу, а в качестве носителя используют бензохиноновый силохром при соот- :ношении носитель:фермент - lt(0,Q20,03), причем процесс проводят в ;0,1 И ацетатном буфере при pH 4,05,0.