FI61718B - Foerfarande foer framstaellning av xylos genom enzymatisk hydrolys av xylaner - Google Patents

Description

fai /44\ icuulutusjuLKAisu

JgTA lBJ (11) UTLAGGN INGSSKRI FT 0\ /10 2¾¾ (45) k%i^/ C Patentti -lyör.eity 10 09 1902 ’ (S1)Pli«kn/btdPfca d eQ a 2 P 19/14, C 12 N 9/42, 11/14 SUOMI —FINLAND (21) Pmnttlh«k.mu._P*«fttt»»eki»lni 772828 (22) HtktmltpUvl — Α|ΝβΙ(ηΙηρ4·| 25 Qg γγ ^ ^ (M) AlkuplWt — Glttlgb«ttd»| 2£ ^ (41) Tullut julklMksI — tllvit off«ntHg

Patentti· ja rekisterihallitut (44) NUttfvttulpmo» |t kuuL|ulk*l*uii pvm. — 3 ^

Patent* och registerstyrelsen Aiweku utlagd oeh utUkrtfwn pubUcwad 31.05.82 (32)(33)(31) Pyydetty Stuellwu»—faginf prlortttt 29.09.76

Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) P 26U3800.6 (71) Projektierung Chemische Verfahrenstechnik Gesellschaft mit beschränkter Haftung, Grabenstr. 5» D-^000 Dusseldorf 1, Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) (72) Jurgen Puls, Pinneberg, Michael Sinner, Dassendorf, Hans-Hermann Dietrichs, Reinbek, Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepubliken Tysk-land(DE) (7*0 Berggren Oy Ab (5*0 Menetelmä ksyloosin valmistamiseksi hydrolysoimalla entsymaattisesti ksylaaneja - Förfarande för framställning av xylos genom enzymatisk hydrolys av xylaner Tämä keksintö koskee menetelmää ksyloosin valmistamiseksi hydrolysoimalla ksylaaneja immobilisoitujen ksylonolyyttis-ten entsyymien avulla.

Natiivien, liukoisten entsyymien käyttö puun soluseinämän polysakkaridien sokeroimiseen on tunnettua (vrt. H.H. Dietrichs: Enzymatischer Abbau von Holzpolysacchariden und wirtschaft-liche Nutzungsmöglichkeiten. Mitt. Bundesforschungsanstalt fur Forst- und Holzwirtschaft Nr. 93, 1973, 153-169). Toisaalta on tunnettua entsyymien immobilisointi kiinnittämällä ne liukenemattomaan kantajaan. Immobilisoidut entsyymit ovat pysyvämpiä ja ovat helpommin käsiteltäviä kuin liukoiset entsyymit. Kuitenkaan toistaiseksi ei ole tunnettua, että immobilisoituja entsyymejä käytettäisiin liukoisten solu-seinämäpolysakkaridien sokeroimiseen.

, * ^

Kasvien soluseinämäpolysakkaridien hydrolysointiin soveltuvat erityisesti mikro-organismien viljelmäsuodoksista saatavat entsyymit (Sinner, M.: Mitteilung der Bundes- 2 61 71 8 forschungsanstalt fiir Forst- und Holzwirtschaft Reinbek-Hamburg Nr 104, tammikuu 1975, Claeyssens, M. ym., FEBS Lett. 1^., 1970, 336-338. Reese, E.T. ym. Can.J. Microbiol.

19, 1973, 1065-1074) .

Mikro-organismit tuottavat lukuisia proteiineja, mm. hemiselluloosaa pilkkovia entsyymejä. Nämä vapaat, sitomattomat entsyymit ovat kuitenkin optimireaktio-olosuhteissaan aktiivisia vain suhteellisen lyhyen aikaa, enintään muutaman päivän ajan. Ne eivät sen vuoksi sovellu käytettäviksi teknillisessä mittakaavassa. Jos mikro-organismien viljelmä-suodoksista saatavat entsyymit, so. puhdistamattomat "raaka-entsyymit" yritetään kiinnittää kantajalle, kiinnittyisivät kantajalle pääasiallisesti kaikki raakaentsyymissä olevat proteiinit, so. myöskin entsyymit, jotka eivät ole toivottavia. Jos ksylaaneja, esim. lehtipuun ksylaaneja yritetään muuttaa tällaisin kantajalle sidotuin entsyymiprepa-raatein entsymaattisesti hydrolysoimalla ksyloosiksi, tarvittaisiin tällaisia immobilisoituja entsyymejä tavattoman suuria määriä, koska suuri osa tarpeettomista entsyymeistä varaa hyödyttömästi kantajan pintaa, vain pienen osan kiinnittyneistä entsyymeistä, nimittäin ksylanolyyttisten entsyymien, päästessä vaikuttamaan katalyyttisesti.

Tunnetaan menetelmiä, joilla entsyymiseoksesta saadaan talteen tiettyjä haluttuja entsyymejä puhtaassa muodossa, ja joissa käytetään hyväksi entsyymien erilaista sähkövarausta, molekyylikokoa tai entsyymien affiniteettia affektoriin (Sinner, M. ja H.H. Dietrichs, Holzforschung 2j), 1975, 168-177, Robinson, P.J. ym., Biotechnol. Bioeng. JL6, 1974, 1103-1112).

Edelleen on tunnettua, että kasviperäisten vesiliukoisten solusetnämäpolysakkaridien pilkkoutuessa sokerimonomeereiksi, reaktioon osallistuu ainakin kaksi entsyymiryhmää, nimittäin glykanaaseja, jotka pilkkovat polysakkaridin sisäisiä > ?.

sidoksia umpimähkään lukuun ottamatta ketjun päässä olevia sidoksia, ja glykosidaaseja, jotka pilkkovat glykanaasien 3 61718 vapauttamia oligosakkarideja sokerimonomeereiksi. Siten ksylaanin pilkkoituessa tarvitaan sekä β-l,4-ksylanaaseja että B-ksylosidaaseja. Jos läsnä on ksylaaneja, joissa on sivuryhmiä 4-0-metyyliglukuronihappo, tarvitaan lisäksi toistaiseksi tuntematonta uronihappoa pilkkovaa entsyymiä. Tiedetään, että molemmat entsyymiryhmät eroavat toisistaan molekyylipainonsa suhteen sekä olosuhteiden suhteen, joissa ne kehittävät optimiaktiivisuutensa (vrt. Ahlgren, E. ym.,

Acta Chem. Scandinavica 21, 1967, 937-944).

Immobilisoitua ksylanaasia on käytetty ksylaanien hydroly-soimiseksi, jölloin lopputuotteena on saatu ksylobioosia sekä eräitä muita pilkkoumistuotteita (ks. Chem.Abstr. 8JL

(1974) ref. 116603 a).

Tämä keksintö perustuu tarpeeseen löytää menetelmä ksyloosin valmistamiseksi hydrolysoimalla ksylaaneja entsymaattisesti, joka menetelmä on suoritettavissa yksinkertaisella tavalla erittäin tehokkaasti ja suurin saannoin käyttämällä erittäin tehokkaita immobilisoituja entsyymejä. Keksintö perustuu edelleen tarpeeseen löytää menetelmä kantajille sidottujen puhdistettujen entsyymien valmistamiseksi, jotka soveltuvat ksyloosin valmistamiseen ksylaaneista entsymaattisen hydro-lyysin avulla. Yllättäen keksittiin, että tämä tehtäväasetel-ma voidaan ratkaista yksinkertaisella tavalla jos erilaisten kantajille sidottujen erilaisen vaikutuksen omaavien entsyymi-systeemien annetaan vaikuttaa ksylaaniliuokseen. Edelleen keksittiin, että tällaisia entsyymisysteemejä voidaan valmistaa tavattoman yksinkertaisella tavalla raakaentsyymistä puhdistamalla ja sitomalla tämä kantajalle.

Tämän keksinnön kohteena on menetelmä ksyloosin valmistamiseksi hydrolysoimalla entsymaattisesti ksylaaneja, jolloin annetaan immobilisoitujen ksylanolyyttisten entsyymien vaikuttaa ksy- 4 6171 8 läänin vesiliuokseen, joka menetelmä keksinnön mukaisesti on tunnettu siitä, että a) kantajan, jossa on siihen kiinnittyneenä ksylanolyytti-sistä entsyymeistä pääasiallisesti vain ksylanaasia, ja b) kantajan, jossa on siihen kiinnittyneenä ksylanolyyt- tisistä entsyymeistä pääasiallisesti vain 3-ksylosidaasia ja mahdollisesti uronihappoa pilkkovaa entsyymiä, annetaan vaikuttaa samanaikaisesti ksylaanin vesiliuokseen, ja otetaan talteen muodostunut ksyloosi sinänsä tunnetulla tavalla.

On olemassa uronihappoa sisältäviä ksylaaneja ja ksyläänejä, jotka eivät sisällä lainkaan uronihappoa. Jos tarkoituksena on pilkkoa keksinnön mukaisesti entsymaattisesti ksylaaneja, jotka sisältävät uronihappoa, kohdassa b) mainitulla kantajalla on oltava sidottuna myös uronihappoa pilkkovaa entsyymiä. Jos ksylaanit eivät sisällä lainkaan uronihappoa, uronihappoa lohkaisevaa entsyymiä ei tarvita.

Kantajalle sidottuja puhdistettuja entsyymejä voidaan valmistaa siten, että ksylanaasia, β-ksylosidaasia ja mahdollisesti uronihappoa lohkaisevaa entsyymiä sisältävä raakaent-syymi erotetaan ultrasuodatusta käyttäen fraktioksi, joka sisältää pääasiallisesti vain ksylanaasia, ja fraktioksi, joka sisältää pääasiallisesti vain β-ksylosidaasia ja mahdollisesti uronihappoa lohkaisevaa entsyymiä, ja nämä molemmat fraktiot sidotaan erikseen kantajalle.

Keksinnön mukainen menetelmä avaa poikkeuksellisen yksinkertaisen ja tehokkaan keinon valmistaa suurin määrin saatavissa olevista, kasvisraaka-aineista peräisin olevista ksylaaneista ksyloosi-monosakkaridia. Ksyloosi on arvokas sokeri, jota voidaan käyttää sellaisenaan tai joka voidaan haluttessa pelkistää ksylitoliksi. Ksylitoli on arvokas aine, jota toistaiseksi on ollut vain suhteellisen vaikeasti saatavissa suurin määrin.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä lähtötuotteena käytettävät ksylaanit tai ksylaaniosaset ovat puoliselluloosaa, ν' * 61 71 δ 5 jota voidaan saada erilaisista kasvisraaka-aineista. Esimerkkejä tällaisista kasvisraaka-aineista ovat lehtipuut, olki, sokeriruo'on murskausjäte, jyvien kuoret, maissin-tähkäjätteet, maissinolki jne. Jos kasvisraaka-aineena käytetään raaka-aneita, jotka sisältävät hemiselluloosana ensisijaisesti ksylaaneja, esim. raaka-aineita, joiden ksylaa-nipitoisuus on suurempi kuin noin 15 paino-%, lähinnä suurempi kuin noin 25 paino-%, keksinnön mukaisessa menetelmässä voidaan käyttää edullisella tavalla uuton aikana ve-sifaasiin siirtyviä ksylaaneja ja ksylaanilohkeita. Ksylaa-niliuos saadaan tällöin siten, että ksylaanipitoisia kas-visraaka-aineita käsitellään höyry-painekäsittelyä käyttäen kyllästetyllä höyryllä, lämpötilojen ollessa noin 160-230°C, noin 2-60 minuutin ajan ja näin käsitellyt kasvis-raaka-aineet uutetaan vesiliuoksella.

Kantajalle sidottujen entsyymien avulla tapahtuvan ksylaa-nihydrolyysin olosuhteet poikkeavat vapaita entsyymejä käytettäessä tapahtuvasta hydrolyysistä pääasiallisesti siinä suhteessa, että sidottujen entsyymien suuremmasta stabiili-suudesta johtuen lämpötilat voidaan valita korkeammiksi, minkä ansiosta reaktio nopeutuu. Optimitulokset saavutetaan yleensä lämpötilojen ollessa rajoissa 30-60°C, lähinnä rajoissa 40-45°C.

Edelleen on edullista, että päinvastoin kuin vapaita entsyymejä käytettäessä, joiden optimi-pH-alue on suhteellisen kapea, sidottuja entsyymejä käytettäessä työskentely on mahdollista huomattavasti laajemmalla pH-alueella. Kulloinkin käytettävät ylä- ja alaraja-arvot riippuvat kulloinkin kysymyksessä olevan entsyymin luonteesta. Yleensä työskennellään pH-alueella 3-8, lähinnä alueella 4-5, jolloin hydrolyysi saadaan tapahtumaan edullisimmin. Tällöin ei yleensä tarvitse lisätä puskuria pH-arvojen säätämiseksi tarkemmin.

Liuoksessa olevan ksylaanin konsentraatio voi vaihdella suhteellisen laajoissa rajoissa. Ylärajan määrää liuosten viskositeetti ja tämän puolestaan ksylaanien DP (keskimää- 6 61 71 8 räinen polymeroitumisaste); ylärajana voidaan pitää keskimäärin noin 8 paino-%, useissa tapauksissa noin 6 paino-%. Alaraja määräytyy pääasiallisesti sen perusteella, että työn suorittaminen liian laimeissa liuoksissa voi muodostua epätaloudelliseksi .

Entsymaattista hydrolyysiä jatketaan kunnes pääasiallisesti koko ksylaanimäärä on pilkkoutunut ksyloosiksi, mikä on helposti todettavissa analysoimalla liuosta. Lisäksi on tarkoituksenmukaista suorittaa vertailukoe. Panosmenetelmää käytettäessä täydellinen pilkkoutuminen ksyloosiksi on saavutettavissa noin 4 tunnin kuluttua.

Keksinnön mukainen menetelmä on kuitenkin toteutettavissa myös jatkuvatoimisena menetelmänä siten, että ksylaaniliuos ohjataan pylvään läpi, joka on täytetty keksinnön mukaisesti käytettävillä entsyymipreparaateilla. Pylväsprosessissa inkubaatioaikaa voidaan helposti säätää pylvään mitoituksin ja läpivirtausnopeuden avulla.

Erityisen hyviä tuloksia saadaan keksinnön mukaisella menetelmällä, jos käytetään edellä selostetulla menetelmällä valmistettuja entsyymipreparaatteja, joita saadaan siis siten, että ksylanaasia, $-ksylosidaasia ja mahdollisesti uro-nihappoa lohkaisevaa entsyymiä sisältävä raakaentsyymi erotetaan ultrasuodatusta käyttäen fraktioksi, joka sisältää ksylanolyyttisistä entsyymeistä pääasiallisesti vain ksylanaasia, ja toiseksi fraktioksi, joka sisältää ksylanolyyttisistä entsyymeistä pääasiallisesti vain 0-ksylosidaasia ja mahdollisesti uronihappoa lohkaisevaa entsyymiä, ja nämä molemmat fraktiot sidotaan kantajille erikseen. Raakaent-syymeinä käytetään tällöin lähinnä näitä entsyymejä tuottavien mikro-organismien viljemäsuodoksia. Tarkoitukseen sopivia mikro-organismeja on monia, esim. Tricoderma viride, Bacillus pumilus, erilaiset Aspergillus-suvun lajit ja Penicillium-lajit. Mikro-organismeista saatavia raakaent-syymipreparaatteja saadaan jo monin paikoin kaupan olevina tuotteina, ja niitä voidaan käyttää keksinnön mukaisesti.

7 61718

Erityisen edullisia ovat luonnollisesti preparaatit, joiden ksylanolyyttinen vaikutus on erityisen voimakas. Esimerkkejä näistä ovat Celluzyme 450 000 (Nagase), Cellulase 20 000 ja 9 x (Miles Lab., Elkhart. Indiana), Cellulase Onozuka P 500 ja SS (Ali Japan Biochem. Co., Japani), Hemicellulase NBC (Nutritional Biochem. Co., Cleveland, Ohio).

Seuraavassa luettelossa esitetään yhteenveto mikro-organismeista, jotka tuottavat erityisen paljon ksylanolyyttistä vaikutusta omaavaa entsyymiä. Lisäksi on mainittu kirjalli-suuskohdat, joissa on esitetty tällaisia mikro-organismeja ja niiden optimaalisia viljelyolosuhteita.

Aspergillus niger QM 877 ) g-ksylosidaasin valmista- ) miseksi

Penicillium wortmanni QM 7322 ) Reese ym., Can.J. Micro- ) biol. 19, 1973, 1065-1074

Tricoderma viride QM 6 a ksvlanaasin valmistamiseksi

Reese ja Mandels, Appi. Microbiol. T_, 1959, 378-387

Culture Collection of US, Natick Laboratories Natick, Massachusetts 01760, USA

Fusarium roseum QM 388 ksylanaasin valmistamiseksi

Philadelphia QM Depot

Tricoderma viride CMI 45553 ksylanaasin valmistamiseksi

Gascoigne ja Gascoigne, J. Gen. Microbiol. 22, 1960 242-248

Commonwealth Mycological Institute, Kew Fusarium moniliforme CMI 45499 ksylanaasin valmistamiseksi

Bacillus pumilus PRL B 12 g-ksylosidaasin valmistamiseksi

Simpson, F.J., Canadian J. Microbiol. 2, 1956, 28-38 '‘· Prairie Regional Laboratory Saskatoon,

Saskatchewan, Kanada 8 61 71 8

Coniophora cerebella ksylanaasin valmistamiseksi

King, Fuller, Biochem. J.

108, 1968, 571-576

F.P.R.L. culture n:o 11 E

Forest Products Reserach Laboratory

Princess Risborough, Buck.

Bacillus n:o C-59-2 ksylanaasin valmistamiseksi äärimmäisen lämpö-stabiili leveä pH-optimi 2 vrk:n viljely

Institute of Physical and Chemical Research Wako-shi, Saitama 351 K. Horikoshi ja Y. Atsukawa, Agr. Biol. Chem. £7, 1973 2097-2103

Muita tietoja tehokkaita ksylanolyyttisiä entsyymejä tuottavista mikro-organismeista voidaan saada seuraavista kirjan isuuskohteista: β-ksylosidaasit

Botryodiplodia sp. Reese, E.T. ym., Can. J. Microbiol.

19, 1973, 1065-1074

Chaetomium trilateraie Kawaminami, I. ja H. Izuka, J. Ferment.

Technol. £8, 1970, 169-176 8-1—> 4-ksylanaasit

Trichoderma viride Nomura, K. ym., J. Ferment. Technol.

46, 1968, 634-640

Takeniski, S. ym., J. Biochem.

(Tokyo) 73, 1973, 335-343 A. batatae Fukui, S. ja M. Sato, Bull. Agric.

chem. Soc. Japan 2JL, 1957, 392-393 A. oryzae Fukui, S., J. Gen. Appi. Microbiol.

4, 1958, 39-50 " Λ rt;·

Fusarium roseum Gascoigne, J.A. ja M.M. Gascoigne, J. Gen Microbiol. 22, 1960, 242-248 61718

Penicillium janthinellum Takenishi, S. ja Y. Tsujisaka. J. Ferment. Technol. 51, 1973, 458-463

Chaetomium trilaterale Iizuka, H. ja Kawaminami, Agr. Biol.

Chem. 33, 1969, 1257-1263

Coniophora cerebella King, N.J., Biochem. J. 100, 1966 784-792

Trametinae Kawai, M., Nippon, Nogei Kagaku

Kaishi £7, 1973, 529-34

Coriolinae (kantasienien seulontakokeesta)

Lentineae

Tricholomateae

Coprinaceae

Fomitinae

Polyporinae

Streptcnyces xylophagus Iizuka, H. ja T. Kawaminami, Agr.

Biol. Chem. 29, 1965, 520-524

Bacillus subtilis Lyr. H.f Z. Allg. Mikrobiol. 12, 1972, 135-142

Kantajalle sidottua puhdistettua entsyymiä valmistetaan lähinnä siten, että raakaentsyymiliuos erotetaan liukenemattomista aineosista, tarkoituksenmukaisimmin tavallisen suodatuksen avulla, liuos suodatetaan ultrasuodattimen läpi, jonka erotuskyky on noin MP 80000 - 120000, edullisesti noin MP 100000, supernatantti suodatetaan ultrasuodattimen läpi, jonka erotusalue on noin MP 250000 - 350000, edullisesti noin 300000 ja pääasiallisesti 8-ksylosidaasia ja mahdollisesti uronihappoa lohkaisevaa entsyymiä sisältävä suo-dos sidotaan kantajalle. Ensiksi mainittua erotusaluetta vastaavan ultrasuodatuksen suodos suodatetaan ultrasuodattimen läpi, jonka erotusalue on noin MP 10000 - 50000, edullisesti noin 30000 ja pääasiallisesti ksylanaaseja sisältävä suodos sidotaan kantajalle. Tämän menetelmän suorittamiseksi raakaentsyymi liuotetaan edullisesti noin 10-30i-kertaiseen, mieluimmin noin 20-kertaiseen vesimäärään.

Pääasiallisesti ksylanaasia sisältävän fraktion vieläkin perusteellisempi puhdistus voidaan suorittaa siten, että 10 61 71 8 pääasiallisesti ksylanaasia sisältävä suodos, joka on saatu suodattamalla ultrasuodattimen läpi, jonka suodatusalue on välillä noin MP 10000-50000, suodatetaan ultrasuodattimen läpi, jonka erotusalue on noin MP 300 - 700, edullisesti noin 500 ja suodattimena oleva osa sidotaan kantajalle.

Tämän lisäsuodatuksen avulla ksylanaasi konsentroituu. Samanaikaisesti suurin osa hiilihydraateista, joiden määrä voi olla enintään noin 40 % lähtöaineesta, erottuu ultrasuoda-tuksen aikana. Käytettäessä mainittujen entsyymien yhteydessä sanaa "pääasiallisesti", tällä tarkoitetaan, että kysymyksessä olevan fraktion sisältämät entsyymit ksylanolyyt-tisen vaikutuksen huomioon ottaen ovat pääasiallisesti kulloinkin mainittua entsyymiä tai että kyseinen fraktio sisältää ensisijaisesti kulloinkin mainittua entsyymiä. Esim. puhdistustoimenpiteen suorittamisen jälkeen saadaan ksyla-naasi-fraktiota, jossa käytännöllisesti katsoen ei voida enää osoittaa olevan 0-ksylosidaasia. Sama koskee käänteisessä mielessä β-ksylosidaasi-fraktiota. Valmistettaessa ksyloosia hydrolysoimalla entsymaattisesti ksylaaneja, voidaan kuitenkin käyttää myös kantajiin sidottuja entsyymejä, joiden puhtausaste ei ole näin korkea. Edullisia tuloksia voidaan saada keksinnön mukaisesti esimerkiksi silloinkin, jos käsitteellä "pääasiallisesti" tarkoitetaan, että kulloinkin kysymyksessä olevan entsyymin aktiivisuus vastaa vähintään noin 80 %, edullisesti vähintään noin 90 % ja mieluimmin vähintään noin 95 % kulloinkin kysymykseen tulevasta halutusta pääaktiivisuudesta.

On yllättävää, että yksinkertaisella ultrasuodatuksella voidaan raakaentsyymi erottaa halutuiksi komponenteiksi, joita tällä tavalla saadaan erittäin puhtaina. On erityisen yllättävää ja edullista, että fraktio, joka sisältää 8-ksylosidaasia sisältää myös uronihappoa lohkaisevan entsyymin. Ksylanaasi ja 8-ksylosidaasi eivät pysty yksinään pilkkomaan happamia ksylaanifragmentteja, joita mahdollisesti myös syntyy ksylanaasin vaikuttaessa ksylaaniketjuun, edelleen ksyloosimonomeereiksi. Happamat ksylo-öligomeerit on ensin vapautettava uronihappoa lohkaisevan entsyymin ka- 61718 talyyttisen vaikutuksen avulla happotähteestä, ennen kuin ne hydrolysoidaan edelleen ksyloosiksi.

Puhdistettujen entsyymitraktioiden liittäminen kantajiin tapahtuu tunnetuin menetelmin. Edullisia ovat menetelmät, joilla saadaan syntymään kestävä sidos (kovalenssisidos) ja joita käytettäessä suurimolekyylisilläkin substraateilla diffuusioestymät ovat vähäisiä, ja jotka menetelmät ovat suoritettavissa yksinkertaisella tavalla. Keksinnön mukaisen menetelmän osalta erityisen edullisiksi ovat osoittatu-neet: 1. Sidos glutaarialdehydin välityksellä (Weetall, H.H., Science 166, 1969, 615-617), 2. sidos sykloheksyylimorfoliinoetyyli-karbodi-imidi-tolueenisulfonaatin välityksellä (CMC) Line, W.F. ym., Biochem. Biophys. Acta 242, 1971, 194-202), 3. sidos TiCl4:n välityksellä (Emery, A.N. ym., Chem.

Eng. (London) 258, 1972, 71-76).

Keksinnön mukaisessa menetelmässä kantajina voidaan käyttää kaikkia immobilisointitekniikassa tavallisesti käytettäviä kantajia, kuten teräspölyä, titaanioksidia, maasälpää ja muita mineraaleja, merihiekkaa, piimaata, huokoista lasia ja piihappogeeliä. Käyttökelpoiset kantajat eivät kuitenkaan rajoitu näihin esimerkkehin. Huokoisena lasina voidaan käyttää esim. kaupan olevaa tuotetta CPG-550, Corning Glass Works, Corning N.Y., ja piihappogeelinä kaupan olevaa tuotetta Merckogel SI-1000, Merck AG, Darmstadt. Kantaja-entsyymi-sidoksen aikaansaamiseksi menetelmän 1 ja 2 mukaisesti kantajaa on edullista lämmittää palautusjäähdyttäen yön ajan seoksen kanssa, jossa on noin 5-12 %, lähinnä 10 % γ-aminopropyylitrietoksisilaania tolueenissa. Tämän vaiheen avulla kyseiseen kantajamateriaaliin saadaan liitetyksi , primäärinen aminoryhmä. Menetelmässä n:o 3 tämä vaihe ei ole välttämätön.

Γ' 6171 8 12

Sopivilla liuottimilla kuten tolueenilla ja asetonilla suoritetun perusteellisen pesun jälkeen seuraa kantajan aktivointi. Menetelmässä 1 tämä vaihe tapahtuu sekoittamalla kyseistä kantajaa kiinnittämispuskurin noin 3-7-prosentti-sessa, edullisesti noin 5-prosenttisessa glutaari-aldehydi-liuoksessa. Puskurin pH-arvo 6,5 on osoittautunut edullisemmaksi kuin puskurin pH-arvo 4. Mitä suurempi pH-arvo on kiinnityksessä, sitä enemmän proteiinia sitoutuu. Koska kuitenkin entsyymit ovat stabiileja heikosti happamalla alueella, kiinnittämistä suoritettaessa kysymykseen tulee välillä 6-7,5 oleva pH-arvo, edullisesti 6,5.

60 minuutin inkubointiajan kuluttua, joka tapahtuu osittain vakuumissa, on osoittautunut edulliseksi, että ylimääräinen glutaarialdehydi-liuos imetään pois. Kantajamateriaalia on tarkoituksenmukaisinta pestä vielä kerran perusteellisesti, ennen kuin suoritetaan inkubointi entsyymiliuoksen kanssa.

Menetelmässä 2 alkyyliamiini-kantajaa on tarkoituksenmukaisinta ensin sekoittaa hyvin liitettävän entsyymin kanssa 5 minuutin ajan, ennen kuin lisätään liittymisen käynnistävä CMC-reagenssi. Lisättävän CMC:n määrällä on ratkaiseva vaikutus. CMC-lisäyksen ollessa liian vähäinen entsyymiä sitoutuu vain vähän. CMC-lisäyksen ollessa liian suuri on olemassa vaara, että tapahtuu poikittaista sitoutumista entsyymiaktiivisuuden heikentyessä. Kun kantajan määrä on 1 g ja entsyymin 150 mg, on osoittautunut edulliseksi, että CMC:n määrä on noin 350-450 mg, lähinnä noin 400 mg. pH-arvo on tarkoituksenmukaista pitää inkuboinnin 30:n ensimmäisen minuutin aikana 0,1-normaalisella HCl:lla välillä 3-5, lähinnä noin 4,0:ssa. Tämä pH-arvo on osoittautunut edullisemmaksi kuin pH-arvo 6,5. CMC-menetelmä ja TiCl4~ menetelmä soveltuvat erityisesti entsyymeille, jotka ovat stabiileja happamella alueella. Proteiinia sitoutuu eniten happamalla pH-alueella.

Menetelmässä 3 kantaja aktivoidaan siten, että käsittelemätöntä kantajaa sekoitetaan noin 6-15-prosenttisessa, lä- 13 6171 8 hinnä noin 12,5-prosenttisessa vesipitoisessa TiCl4~ liuoksessa. Ylimääräinen vesi haihdutetaan pois ja reaktiotuote kuivataan 45°C:ssa vakuumikuivauskaapissa. Tämän jälkeen se pestään perusteellisesti liitospuskurin kanssa ennen liitettävän entsyymin liuoksen kanssa inkubointia.

Aktiivisen kantajan inkubointi entsyymiliuoksen kanssa on valmis usean tunnin, esim. yön jälkeen. Inkubointiajalla ei ole erityisen ratkaisevaa merkitystä. Inkubointi suoritetaan tarkoituksenmukaisimmin normaalilämpötilassa.

Liittämistapahtuman jälkeen entsyymipreparaatti on tarkoituksenmukaista pestä lasisuodattimella liuoksen kanssa, jossa on 1 mooli NaCl:a 0,02-mol fosfaattipuskurissa, jonka pH on 4 ja sen jälkeen 0,02-mol fosfaattipuskurilla, jonka pH on 5, kunnes entsyymiä ei enää ole osoitettavissa pesuvedessä .

Keksinnön mukaisella menetelmällä entsyymi saadaan verrattoman hyvin puhdistetuksi, mikä on välttämätöntä ksylaanin pilkkomiseksi. Täten saadaan kantaja, jonka spesifinen katalyyttinen aktiivisuus on erittäin suuri, ja ksylaanien entsymaattinen hydrolyysi voidaan suorittaa edullisella tavalla. Erityisen yllättävää on, kuten seuraavassa selostettava vertailukoe osoittaa, että menetelmän mukaisesti saatavan ksyloosin saanto on huomattavasti suurempi kuin silloin, kun ksylanaasia, β-ksylosidaasia ja uronihappoa lohkaisevaa entsyymiä liitetään yhdessä kantajalle ja ksylaanien entsymaattinen hydrolyysi yritetään suorittaa siten, että näitä kaikkia kolmea entsyymiä sisältävän kantajan annetaan vaikuttaa ksylaanin vesiliuokseen.

Selostuksessa ja esimerkeissä % tarkoittaa paino-%:a, ellei toisin ole ilmoitettu. Haluttujen liuoksessa olevien aineiden talteenotto tai eristäminen ja puhdistus tapahtuu, sikäli kuin se on tarkoituksenmukaista, sokerikemian alalla tavallisesti käytettävin menetelmin, esim. konsentroimalla liuoksia, lisäämällä nesteitä, joihin halutut tuotteet 61718 14 eivät liukene tai liukenevat huonosti, kiteyttämällä uudelleen jne. "Atro" merkitsee "absoluuttisen kuiva".

Esimerkki 1: Ksylaaniliuoksen valmistus 400 grammaa hakesilpun muodossa olevaa ilmakuivaa punapyök-kiä käsiteltiin Asplund-kuiduttimessa vesihöyryllä 6-7 minuuttia 185-190°C:ssa, mikä vastasi noin 12 atm:n painetta, ja kuidutettiin noin 40 sekunnin ajan. Näin saatu kostea kuituaines huuhdeltiin kuiduttimesta yhteensä 4 litralla vettä ja pestiin seulalla. Kuitusaanto oli 83 %, käytetystä puusta (atro) laskien.

Pesty ja puserrettu kuituaines suspendoitiin tämän jälkeen huoneen lämpötilassa 5 litraan 1-prosenttista NaOH:n vesi-liuosta ja erotettiin 30 minuutin kuluttua suodattamalla ja pusertamalla alkalisesta suodoksesta. Vedellä, laimealla hapolla ja uudelleen vedellä suoritetun pesun jälkeen kuitusaanto oli 66 %, käytetystä puusta (atro) laskien.

Vastaavalla tavalla käsiteltiin, niin ikään karkeina saha-lastuina, muita puulajeja sekä olkia silppuna. Kuituainesten saantojen keskiarvot, lähtöaineista (atro) laskien, olivat: Lähtöaine Kuituainesjäännökset (%) H20:lla pesemisen NaOH:lla käsittelyn jälkeen jälkeen

Punapyökki 83 66

Poppeli 87 71

Koivu 86 68

Tammi 82 66

Eukalyptus 85 71

Vehnänolki 90 67

Ohranolki 82 65

Kauranolki 88 68 ’V '·* λ

Vesi- ja alkaliuutteiden hillihydraattikoostumus

Tasaosia edellä saaduista vesi- ja alkaliuutteista hydrolysoitiin täydellisesti. Erillisten sokerien ja kokonaissokerin kvanti- 61 71 8 15 tatlivinen määritys tapahtui Biotronic-Autoanalyzers-laitteen avulla (vrt. M. Sinner, M.H. Simatupang ja H.H. Dietrichs, Wood Science and Technology 9, (1975), s. 307-322). Auto-analysaattorilla tutkittiin myös täysin hydrolysoitua puuta. Piirros 1 esittää punapyökin osalta saatuja diagrammoja.

Uute Liuenneet hiilihydraatit

Yhteensä (%, Osuudet (%, uutteesta laskien) lähtöaineesta atro laskien) Ksyloosi Glukoosi

Punapyökki, H00 13,5 69 13

NaOH 7,0 83 3

Tammi, H?0 13,2 65 11

NaOH 6,8 81 5

Koivu, H-0 11,2 77 8

NaOH 7,3 84 3

Poppeli, H~0 8,3 76 6

NaOH 6,5 83 3

Eukalyptus, H~0 9,5 71 8

NaOH 5,0 80 3

Vehnä, H„0 7,0 53 21

NaOH 8,3 88 3

Ohra, H^O 6,1 41 25

NaOH 9,5 88 3

Kaura, H~0 5,1 44 20

NaOH 4,4 88 3

Esimerkki 2: Kaupan olevasta entsyymipreparaatista saatavan ksylanaasin ja β-ksylosidaasin erottaminen ja _konsentrointi_ 220 g kaupan olevaa raakaentsyymi-preparaattia "Celluzyme", Nagase-yhtiön valmistetta, liuotettiin 4,8 litraan 0,02-mol ammoniumasetaatti-puskuri, jonka pH on 5. Liukenematon jäännös poistettiin osittain lasisuodattimella. Tämän jälkeen entsyymiliuos suodatettiin kirkkaaksi teflon-suodattimella (Chemware 90 CMM Coarse). Sitten seurasi entsyymiliuoksen ultrasuodatus ultrasuodatuslaitteella TCF-10, Amincon-yhtiön valmiste (Lexington, Massachusetts).

6171 8 16 Käytettiin seuraavia Amincon-ultrasuodattimia (käyttöjär-jestyksessä): XM 100 A (erotusalue MP 100 000) XM 300 (erotusalue MP 300 000) PM 30 (erotusalue MP 30 000) DM 5 (erotusalue MP 500)

Puhdistettu raakaentsyymi-liuos suodatettiin siis ensin suodattimena, jonka erotusalue oli MP 100 000. Sen jälkeen ksylanaasi oli pääasiallisesti ultrasuodoksessa. e-ksylosi-daasi ja toistaiseksi tuntematon entsyymi, jonka ansiosta happamista ksylo-oligomeereista lohkeaa 4-0-metyyliglukuro-nihappoa, olivat pääasiallisesti supernatantissa.

Tässä hienosuodatuksessa saatua supernatantti suodatettiin nyt hienosuotimen läpi, jonka erotusalue on MG 300 000.

Tämän käsittelyn lopussa β-ksylosidaasia ja uronihappoa lohkaisevaa entsyymiaktiviteettia oli osoitettavissa vain ultrasuodoksen kirkkaassa liuoksessa, kun sen sijaan paksu-juoksuisessa, tummanruskeassa supernatantissa ei ollut lainkaan jäljellä β-ksylosidaasiaktiivisuutta eikä uronihappoa lohkaisevaa aktiivisuutta.

Ensimmäisessä ultrasuodatuksessa saatua suodosta käsiteltiin edelleen seuraavalla tavalla:

Ultrasuodatus PM 30:llä ksylanaasi oli tämän vaiheen jälkeen jälleen ultrasuodoksessa. Aineet joilla ei esiintynyt ksylanaasi-aktiivisuutta, erottuivat supernatanttiin.

Ultrasuodatus DM 5:llä: ksylanaasi oli supernatantissa; se konsentroitui tässä vaiheessa. Samanaikaisesti suurin osa hiilihydraateista (lähtöaineessa: 39 %) erottui ultrasuodok-seen.

Seuraavansa taulukossa on ilmoitettu ksylanaasin, β-ksylo-sidaasin ja uronihappoa lohkaisevan entsyymin aktiivisuudet. Ilmoitetut arvot tarkoittavat "yksikköjä". 1 yksikköä on entsyymimäärä, joka lisää substraattiliuoksen (1 % pyökki-puuksylaania ksylanaasia varten, 2 mmoolia p-nitrofenyyli- 61 71 8 17 ksylopyranosidia $-ksylosidaasia varten, 0,2 ^ug/^ul 4-0-roetyyliglukuronosyyliksyl°trioosia happoa lohkaisevaa entsyymiä varten sokeripitoisuutta 37°C:ssa 1 ^umoolilla ksyloosia ksylanaasin ja β-ksylosidaasin ollessa kysymyksessä ja 1 ^umooli 4-0-metyyliglukuronihappoa .uronihappoa lohkaisevan entsyymin ollessa kysymyksessä.

Ksylanaasi β-ksylosidaasi Glukuronihap- poa pilkkova aktiivisuus

Celluzyme

liuennut 34 560 U 1541 U 2568 U

XM 100 A super-

natantti 7 968 U 1290 U 1996 U

XM 100 A

ultrasuodos 24 480 U 13 U 524 U

XM 300

ultrasuodos - 1011 U 1817 U

PM 30

ultrasuodos 21 173 U

DM 5 super-

natantti 19 730 U

Aktiivisuuksien osoittaminen tapahtui seuraavassa selostetulla menetelmällä:

Ksylanaasin osoittaminen pyökkipuuksylaanin ollessa substraattina tapahtui reduktometrisesti (Sumner, vgl. Hos-tettler, F., E. Borel ja H. Deuel, Helv. Chim. Acta 34, 1951, 2132-39). β-ksylosidaasiaktiivisuuden mittaamiseksi 1 ml p-nitrofenyyliksylosidi-liuosta laimennettiin 0,5 ml:lla entsyymiliuosta ja reaktio pysäytettiin lisäämällä 2 ml 0,1 M boraattipuskuria pH 9,8. Vapautuneen p-nitro-fenolin ekstinktio mitattiin aaltopituudella 420 nm. p-nitrofenolin määrä luettiin vertailukäyrän avulla ja laskettiin ksyloosiksi. Uronihappoa pilkkovan entsyymin substraattina oli 4-0-metyyliglukuronosyyliksylotrioosi. Reaktion . jälkeen liuokset analysoitiin pylväskromatograafisesti Durrum DA X-MHLaitteella (Sinner, M., M.H. Simatupang ja H.H. Dietfi'cks, Wood. Sei. Tecnol. 9, 1975, 307-22). Vapautu- 6171 8 18 nut 4-0-metyyliglukuronihapon määrä laskettiin yksikkönä yUmoolia/min.

Esimerkki 3: Entsyymin liittäminen kantajaan Entsyymien kantajaksi valittiin huokoinen lasi (CPG-550,

Corning Glass Works, Corning, N.Y.). Ksylanolyyttiset entsyymit sidottiin entsyymikantajalle glutaarialdehydin avulla (Weetall, H.H., Science 166, 1969, 615-17).

1 g kantajana käytettävää huokoista laäia lämmitettiin yön ajan kiehuttaen 10-prosenttisen γ-aminopropyylitrietoksisi-laanin tolueeniliuoksen kanssa. Kantaja saatiin täten varustetuksi primäärisellä aminoryhmällä. Sen jälkeen pestiin peräkkäin perusteellisesti tolueenilla ja asetonilla. Tämän jälkeen kantajaa sekoitettiin 20 ml:n kanssa 5-prosenttista glutaarialdehydiliuosta 0,02-mol fosfaattipuskurissa pH:n ollessa 6,5. Ensin sekoitettiin 15 minuuttia vakuumissa (300 torria), minkä jälkeen inkuboitiin edelleen 45 minuuttia normaalipaineessa. Sen jälkeen suodatettiin ja kantajämateriaali oestiin perusteellisesti 200 ml:11a puskuria.

Käyttämällä näin aktivoitua kantajamateriaalia valmistettiin kaksi kantajaan sidottua entsyymipreparaattia: a) 1 g aktivoitua kantajaa sekoitettiin yön ajan 5 ml:n kanssa esimerkin 2 mukaisesti saatua 657 yksiön ksylanaasia sisältävää entsyymiliuosta. Sen jälkeen pestiin lasisuodat-timella 1-mol NaCl:lla 0,02-molaarisessa fosfaattipuskurissa, jonka pH oli 4 ja sen jälkeen 0,02-molaarisella fosfaattipuskurilla, jonka pH oli 5 kunnes pesuvedessä ei enää voitu osoittaa olevan entsyymiä.

Näin saadussa preparaatissa 1 on sitoutuneena grammaa kohden 64 yksikköä aktiivista ksylanaasia.

b) ^ Menetellään kuten kohdassa a) käyttämällä kuitenkin 5 ml esimerkin 2 mukaisesti saatua liuosta, jossa on 33 yksikköä β-ksylosidaasia ja 60 yksikköä uronihappoa lohkaisevaa entsyymiä. Saatu preparaatti 2 sisältää sitoutuneena 19 61 71 8 grammaa kohden noin 33 yksikköä β-ksylosidaasia ja 60 yksikköä uronihappoa lohkaisevaa entsyymiä.

Esimerkki 4; Pyökkipuuksyläänin hydrolyysi 2 ml esimerkin 1 mukaisesti vedellä pesemällä saatua pyökkipuun liuotuksen ksylaaniliuosta (liuos sisältää 1,3 % ksylaania) inkuboitiin 60 mg:n kanssa preparaattia 1 ja 60 mg:n kanssa preparaattia 2, jota oli saatu esimerkin 3 mukaisesti, 40°C:ssa ravistusvesihauteessa. Ksylaanin hydrolysoitumista seurattiin analyyttisesti pylväskromatograafi-sin menetelmin käyttämällä ioninvaihtohartsia (Kauppatuote Durrum DA X.4, valmistaja Durrum). (Sinner, M., M.H. Somatu-pang ja H.H. Dietrchs, Wood Sei. Technol. 2' 1975, 307-22). Neljän tunnin kuluttua pyökkipuuksylaani oli hydrolysoitunut monomeeriosikseen ksyloosiksi ja 4-0-metyyliglukuroni-hapoksi. Piirros 2 esittää kromatogrämmiä nelituntisen inku-boinnin jälkeen. Siitä nähdään, että ksylaani on hajonnut liuoksessa täydellisesti ksyloosiksi. Liuos ei sisällä lainkaan ksylobioosia.

Vertailukoe 1

Meneteltiin kuten esimerkissä 4 käyttämällä entsyymi-preparaattia, joka oli valmistettu esimerkissä 3 selostetulla tavalla paitsi, että ksylanaasia sekä β-ksylosidaasia ja uronihappoa lohkaisevaa entsyymiä sisältävät liuokset sidottiin kantajalle yhdessä. 2 ml esimerkissä 4 käytettyä ksylaaniliuosta inkuboitiin 40°C:ssa 60 mg:n kanssa preparaattia, joka sisälsi yhdessä ksylanaasia, β-ksylosidaasia ja uronihappoa pilkkovaa entsyymiä.

Lisäksi suoritetussa vertailukokeessa meneteltiin samalla tavalla käyttämällä kuitenkin ainoastaan 60 mg esimerkin 3 mukaisesti valmistettua preparaattia 1 (kantajalle sidottua ksylanaasia).

Näid^n^kolmen liuoksen ksylaanin pilkkoutumista seurattiin esimerkissä 4 selostetulla tavalla pylväskromatograafisesti kolmen tunnin ajan. Liuosten ksylobioosi- ja ksyloosipitoi- 6171 8 20 suudet on esitetty kuvassa 3. Tässä piirroksessaon esitetty on esitetty myös esimerkin 4 liuoksen ksylobioosi- ja ksy-loosipitoisuudet (ksylanaasi ja β-ksylosidaasi sekä uroni-happoa lohkaiseva entsyymi immobilisoitu erikseen, inkuboitu yhdessä). Piirroksesta 3 havaitaan seuraavaa:

Yhdessä immobilisoidub entsyymit olivat toiin hydrolysoineet tunnin kuluttua jo suurimman osan läsnä olleesta ksylaanis-ta (13 mg/ml) ksylobioosiksi; halutun lopullisen hajaantu-mistuotteen ksyloosin konsentraatio ei kuitenkaan jatkanut suurentumistaan inkubointiajan pidentyessä.

Kantajalle sidottu ksylanaasi on pilkkonut jo 30 minuutin kuluttua suurimman osan läsnäolleesta ksylaanista oligomee-risiksi sokereiksi. Ksyloosipitoisuus ei luonnollisestikaan jatkanut kohoamistaan, sillä ksylanaasin lopullinen hajaan-tumistuote on pääasiallisesti ksylobioosia.

Esimerkin 4 mukaisesti, so. keksinnön mukaisesti erikseen kiinnitetyt, mutta yhdessä inkuboidut entsyymit olivat pilkkoneet ksylaaniliuoksen 30 minuutin kuluttua ksylobioosiksi ja ksyloosiksi ja happamiksi sokereiksi. Inkubointiajan kasvaessa ksyloosikonsentraatio lisääntyi β-ksylosidaasin vaikutuksesta, jota vastaten reaktioliuoksen ksylobioosi-pitoisuus pieneni. Hydrolysoituminen ksyloosiksi ja 4-0-metyyliglukuronihapoksi oli tapahtunut täydellisesti 4 tunnin kuluttua, kuten kuvasta 2 (vrt. esimerkkiin 4) havaitaan.

. .. » V' y

Claims (6)

61 71 8 21

1. Menetelmä ksyloosin valmistamiseksi hydrolysoimalla ksyläänejä immobilisoitujen ksylanolyyttisten entsyymien avulla, tunnettu siitä, että a) kantajan, jossa on siihen kiinnittyneenä ksylano-lyyttisistä entsyymeistä pääasiallisesti vain ksylanaasia, ja b) kantajan, jossa on siihen kiinnittyneenä ksylanolyyt- tisistä entsyymeistä pääasiallisesti vain 8-ksylosidaasia ja mahdollisesti uronihappoa pilkkovaa entsyymiä, annetaan vaikuttaa samanaikaisesti ksyläänin vesiliuokseen, ja otetaan talteen muodostunut ksyloosi sinänsä tunnetulla tavalla.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että ksyläänin vesiliuos on saatu käsittelemällä ksylaanipitoisia kasvisraaka-aineita höyry-paine-käsittelyn avulla kyllästetyllä vesihöyryllä lämpötilojen ollessa 160-230°C 2-60 minuutin ajan, ja uuttamalla näin hajotetut kas-visraaka-aineet vesiliuoksella.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että kantajille sidotut entsyymit on valmistettu erottamalla ksylanaasia, 3-ksylosidaasia ja mahdollisesti uronihappoa pilkkovaa entsyymiä sisältävä raakaentsyymi ultrasuodatuksen avulla kahdeksi fraktioksi, joista toinen sisältää pääasiallisesti vain ksylanaasia ja toinen pääasiallisesti vain 6-ksylosidaasia ja mahdollisesti uronihappoa pilkkovaa entsyymiä, ja sitomalla kumpikin fraktio erikseen omalle kantajalleen.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että raakaentsyymi liuotetaan puskuriliuokseen, jonka pH-arvo on noin 4-6, edullisesti 5, ja poistetaan liukenemattomat osat, liuos suodatetaan ultrasuodattimen läpi, jonka erotusalue on noin MP 80 000 - 120 000, edullisesti innoin MP 100 000, supernatantti suodatetaan ultrasuodattimen läpi, jonka erotusalue on noin MP 250 000 - 350 000, edullisesti noin MP 300 000, ja pääasiallisesti 22 61 71 8 β-ksylosidaasia ja mahdollisesti uronihappoa pilkkovaa entsyymiä sisältävä suodos sidotaan kantajalle, ensimmäisen ultrasuodatuksen suodos suodatetaan ultrasuodattimen läpi, jonka erotusalue on noin MP 10 000 - 50 000, edullisesti noin MP 30 000,ja pääasiallisesti ksylanaasia sisältävä suodos sidotaan erikseen omalle kantajalleen.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että pääasiallisesti ksylanaasia sisältävä suodos suodatetaan ultrasuodattimen läpi, jonka erotusalue on noin MP 300-700, edullisesti noin MP 500,ja supernatantti sidotaan kantajalle.

6. Patenttivaatimusten 3-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kantaja aktivoidaan glutaarialdehy-dillä, sykloheksyyli-morfolinoetyyli-karbodi-imidi-tolueeni-sulfonaatilla tai Tielailla.