SK284932B6 - Monoklonálna protilátka, jej fragment, spôsob jej prípravy a použitie, farmaceutický prostriedok, hybridómová bunková línia, aminokyselinová a DNA sekvencia - Google Patents

Abstract

Je opísaná monoklonálna protilátka a jej fragment obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu úsekov základnej štruktúry (FR) a komplementaritu určujúcich úsekov (CDR) ľahkého reťazca SEQ ID NO:1 a ťažkého reťazca SEQ ID NO:9. Hybridómová bunková línia schopná ju produkovať, aminokyselinová sekvencia obsahujúca sekvenciu, ktorá je uvedená v SEQ ID NO:1 alebo SEQ ID NO:9. Zodpovedajúca DNA sekvencia, farmaceutický prostriedok obsahujúci uvedenú protilátku, spôsob jej prípravy a použitie na výrobu lieku na liečenie nádorov.

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka monoklonálnej protilátky a jej fragmentu, hybridómovej bunkovej línie schopnej ju produkovať, aminokyselinovej sekvencie a zodpovedajúcej DNA sekvencie, farmaceutického prostriedku, obsahujúceho uvedenú protilátku, spôsobu jej prípravy a použitia na výrobu liečiva na liečenie nádorov.

Doterajší stav techniky

Integríny sú špeciálnou rodinou receptorov s adhéziou k povrchu buniek, ktorc riadia väzbu buniek s pevným cxtracelulámym okolím - tak s extracelulámou matricou (ECM), ako s ostatnými bunkami. Adhézia má pre bunku základný význam; zaisťuje ukotvenie, kľúč na migráciu a signály pre rast a diferenciáciu. Integríny sa zúčastnia priamo početných normálnych a patologických stavov a samé osebe sú prvoradým cieľom na terapeutické zásahy. Integríny sú integrálne transmembránové proteíny, heterodiméry, ktorých väzbová špecifickosť závisí od toho, ktorý z asi 14 α-reťazcov je skombinovaný s ktorým z niekoľkých 8 β-reťazcov. Integríny sa členia do štyroch navzájom sa prekrývajúcich podskupín obsahujúcich reťazce β 1, β2, β3 alebo aV a určitá bunka môže expresovať niekoľko rôznych integrínov z každej podskupiny. V poslednom desaťročí sa ukázalo, že integríny sú hlavnými receptormi podieľajúcimi sa na adhézii buniek. Správy týkajúce sa integrínov, opísal napríklad E. Ruoslahti (J. Clin. Invest., 1991, str. 87) a R. O. Hynes (Celí, 1992, str. 69), pričom integríny môžu byť vhodnými cieľmi terapeutického zásahu.

S výnimkou erytrocytov expresujú všetky ľudské bunky jeden alebo niekoľko integrínov. Ich funkcie sú regulované v mnohých hladinách, ale primáme závisí ich ligandová špecifickosť od toho, ktorý α-reťazec asociuje s ktorým β-reťazcom v heterodimére a od aktivačného stavu integrínov (Hynes, 1992, Diamond a Springer, 1994). Bunkový základ, na ktorom intergíny operujú (Chán a Hemler, 1993) a variant zostrihu, z ktorého je integrín použitý (Delwel a kol., 1993) môže špecifickosť rovnako ovplyvňovať. Za týchto daných komplexností, jedna z mála spoľahlivých indikácií špccificity integrínu, je priamo rozrušovať, integrínovú funkciu a analyzovať, ktoré bunkové odozvy sú ovplyvnené. História výskumu integrínu ukazuje, že reakčné činidlá, ktoré môžu špecificky blokovať integrínovú funkciu, sú rozhodujúcimi činiteľmi vo funkčnej analýze, od funkcie blokovať CSAT-protilátky, ktorá prvá definovala integrínový βΐ-reťazec (Neff a kol., 1982) až po počerné významné neskoršie príklady (napríklad P1D6, P1B5 [Wayner a Carter, 1987], P4C10 [Carter a kol., 1990], AIIB2 [Halí a kol., 1990], 3A3 [Tumer a kol.,1989], GOH3 [Sonnenberg a kol., 1987] a LM609 [Cheresh a Spiro, 1987]) oblasť je absolútne závislá od takých reakčných činidiel.

aV-séria integrínov je teraz považovaná za nadriadenú subrodinu tak s klasickými ako s novými funkciami. Rovnako ako klasické integríny, sprostredkujúce väzbu buniek a predlžovanie (Pytela a kol., 1985; Cheresh, 1991) sa aV-integriny podieľajú na lokomócň (Seftor a kol., 1992), v receptorovej internalizácii (Panetti a McKeown Longo, 1993a; Panetti a McKeown Longo, 1993b), ako vírusové koreceptory (Wickham a kol., 1993), pri riadení extracelulámych proteázových kaskád a ako regulátory progresie nádorov (Felding-Habermann a kol., 1992). Špecifickosť piatich známych aV-sérií integrínov, ανβΐ (Zhang a kol., 1993), -β3 (Pytela a kol., 1985; Cheresh a kol., 1987), -β5 (Cheresh a kol. 1989), -β6 (Busk a kol., 1992) a -β8 (Moyle a kol., 1987) bola čiastočne definovaná a zdá sa, že výlučne rozpoznávajú ligandy nesúce RGD-(NH₂-arginínglycín-asparágová kyselina-COOH) tripeptidové sekvencie, vrátane sekvencii vo vitronektíne (ανβΐ, ανβ3, ανβ5), vo fibronektine (ανβΐ, ανβ3, ανβ5, ανβ6) a von Wilebrandovom faktore, fibrinogéne a osteopontíne (ανβ3) (napríklad 1991; Busk a kol., 1992; Zhang a kol., 1993; Denhardt a Guo, 1993; Smith a Cheresh, 1990). Diméry s podobnými špecifickosťami môžu byť koexpresované na rovnakej bunke (napríklad avfil a av[15 pre vitronektín na M21 bunkách) (Wayner a kol., 1991) môžu však riadiť nezávislé funkcie. Ale prekrývajúce sa ligandové špecificity v rámci samotnej αν rodiny a tiež medzi αν a βΐ radami integrínov znamenajú, že určenie funkcie na definovaný receptor v rámci určitej bunkovej oblasti je problematické. Funkcia blokovania protilátok je nevyhnutná na objasnenie funkcie ανβ3 (Cheresh a Spiro 1987; Chuntharapai a kol., 1993) a ανβ5 (Wayner a kol., 1991). Ale pre iné αν integríny nie sú známe žiadne protilátky, ktoré špecifikujú komplex a rozrušujú funkciu. Najmä je málo reakčných činidiel, ktoré špecifikujú aV reťazec komplexu a sú schopné narušiť funkciu integrínu celej rodiny. Lehmann a kol. (1994) opisujú avpx protilátku, ktorá nemá reverznú bunkovú matricovú interakciu a žiadnu aktivitu blokujúcu vývoj nádoru.

Preto je trvalý záujem o vývoj funkcie aV-série integrínov v súvislosti s vývojom nádorov. Ľudský maligný melanóm sa stáva prevažnou agresívnou rakovinou kože. Zvýšené hladiny integrínov α2β1 (Daanen a kol., 1993; Etoh a kol., 1992), α3β1 (Natali a kol., 1993, Yoshinaga a kol., 1993) α4β1 (Hart a kol., 1991) a α6β1 (Hart a kol., 1991) sa vždy podieľajú na progresii melanómu, ale z integrínov sa najkonzistentnejšie podieľajú integríny αν radu. Osobitne ako invázia z primárneho nádoru tak vzdialené metastázy sú histologický charakterizované zvýšenou expresiou ανβ3 integrínu „vitronektínového receptoru“. Primáme neinvazívne nádory a nemaligný melanotický nevi expresujú málo zistiteľný ανβ3, čo je receptor vzácny v zrelom dospelom tkanive (Brooks a kol. 1994; Buck a kol. 1990; Pignatelli a kol., 1992; Lessey a kol., 1992; Korhonen a kol., 1991; Nesbitt a kol., 1993). Imunohisto-chémia nádorov a metastáz dokladá postupný nárast ανβ3 s inváznym štádiom (Albelda a kol., 1990; Si a Hersey 1994), skríning radov melanómov má rovnomerne vysokú expresiu integrínov αν série (Sanders a kol., 1992; Gehlsen a kol., 1992; Marshall a kol.,1991) a okrem toho krvné kapiláry expresujú ανβ3 v priebehu angiogenéze nádoru (Brooks a kol., 1994).

Štúdie in vivo rovnako preukazujú ανβ3 vo vývoji melanómu. V myšom B16-F10 systéme melanómu sa môžu experimentálne metastázy pľúc potlačiť vysokými hladinami RGD-peptidov (Hardan a kol., 1993; Humphries a kol., 1986), čo sú mocné blokátory αν integrinovej funkcie. Najnovšie Felding-Habermann a kol. doložili, že αν série integrínov podporujú rast subkutánneho nádoru M21 ľudského melanómu pri myšiach s oslabenou imunitou. Systém M21 je elegantný a skladá sa zo sledu buniek expresujúcich rôzne integríny aV série (Kieffer a kol., 1991; Felding-Habermann a kol., 1992; Cheresh a Spiro, 1987). Materinský M21 expresuje ανβ3 a ανβ5 ( Wayner a kol., 1991): viaže sa na vitronektín a rastie ako subkutánny nádor. Somatický variant M21, M21-L nemá žiadny zistiteľný α V (Cheresh a Spiro, 1987): nemôže viazať vitronektín a vyvíja pomaly rastúce nádory. M21-L4 je transfektant M21-L, stabilne reexpresujúci aV-reťazec plnej dĺžky: viaže vitronektín a rýchlo rastie ako subkutánny nádor (FeldingHabermann a kol., 1992). Preto prítomnosť bunkových povrchových av-integrínov má priamy vzťah k M21 subkutánnemu rastu.

Ale M21 boli podrobené extrémnym selekčným tlakom v priebehu zavedenia variantných línií M21-L a M21-L4. Podľa vynálezu sa zistilo, že αν-integrínová funkcia na natívnu populáciu M21 sa môže blokovať a že sa dá zistiť prekvapivý účinok na správanie bunky a na vývoj nádoru. Peptidické antagonisty sa môžu ľahko syntetizovať, ich použitie je však obmedzené pre ich zlú biologickú dostupnosť, krátky polčas in vivo a rýchle vylučovanie živočíchmi (Humphries a kol., 1988). Syngénické protilátky ponúkajú zaujímavú alternatívu za peptidy. Majú in vivo dlhý polčas (Tao a Morrison, 1989; Haba a kol., 1985) a ich väzbová špecificita sa môže ľahko doložiť známymi spôsobmi. Nanešťastie i keď sú vynikajúce aV-špecifické protilátky ako LM142 (Cheresh a Spiro, 1987), je málo protilátok, ktoré účinne blokujú aV-integrínové funkcie.

O špecificite a biologickej funkcii členov rodiny av bolo mnohokrát písané, predovšetkým z dôvodu neexistujúcich reakčných činidiel, ktoré by rýchlo vyradili z funkcie celú triedu - neexistuje žiadna mocná protilátka blokujúca αν. Objav, že klasické receptory adhézie rodiny integrínov podporujú iné málo obvyklé biologické funkcie zintenzívnil výskum ich molekulárnych mechanizmov pôsobenia. Výskum objavil niektoré nepredpovedateľné oblasti integrínov, ktoré alostericky opisujú ich aktivačný stav alebo pri ligácii môžu aktivovať integrínovú funkciu. Inhibítory integrínovej funkcie na rozdiel od toho všeobecne okludujú aktívne miesto, pričom klasickým príkladom sú RGD-peptidy, ktoré replikujú poznanie integrínového miesta početných ligandov integrínov sérii αν a α5β1.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu je predovšetkým monoklonálna protilátka obsahujúca aminokyselinovú sekvenciu úsekov základnej štruktúry (FR) a komplementaritu určujúcich úsekov (CDR) ľahkého reťazca SEQ ID NO: 1 a ťažkého reťazca SEQ ID NO:9. Táto protilátka má prednostne nasledujúce vlastnosti

- reaguje len s αν-reťazcom ľudských av-integrínov,

- blokuje väzbu na integrínový substrát buniek nesúcich av-integrín,

- spúšťa reverzáciu zavedenej interakcie matrix buniek spôsobenú aV-integrinmi,

- blokuje vývoj nádorov a

- nemá cytotoxickú účinnosť

Integrínovým substrátom je výhodne vitro-nektín, fibrinogén alebo fibronektín a nádorom, ktorého rast buniek sa má blokovať, je prednostne melanóm.

Predmetom vynálezu je okrem toho tiež monoklonálny protilátkový fragment obsahujúci uvedené aminokyselinové sekvencie, ktorý má tie samé vlastnosti, pričom tento fragment je bivalentný.

Predmetom vynálezu je ďalej hybridómová bunková línia majúca označenie 272-17E6 a uložená pod prírastkovým číslom DSM ACC2160, schopná produkovať uvedenú monoklonálnu protilátku.

Monoklonálna protilátka, pripraviteľná hybridómovou bunkovou líniou DSM ACC2160 tiež patrí do rozsahu vynálezu.

Ďalším predmetom vynálezu je aminokyselinová sekvencia obsahujúca sekvenciu, ktorá je uvedená v SEQ ID NO : 1 alebo sekvenciu, ktorá je uvedená v SEQ ID NO:9.

Predmetom vynálezu je tiež DNA sekvencia obsahujúca DNA sekvenciu SEQ ID NO:1, kódujúca FR a CDR úseky ľahkého reťazca variabilnej oblasti monoklonálnej protilátky majúcej definované vlastnosti, ako aj DNA sekvencia obsahujúca DNA sekvenciu SEQ ID NO:9, kódujúca FR a CDR úseky ťažkého reťazca variabilnej oblasti monoklonálnej protilátky majúcej definované vlastnosti. Tieto DNA sekvencie prednostne obsahujú vedúcu sekvenciu uvedenú v SEQ ID NO:1 alebo SEQ ID NO:9.

Ďalším predmetom vynálezu je farmaceutický prostriedok, ktorého podstata spočíva v tom, že obsahuje definovanú monoklonálnu protilátku a farmaceutický vhodný nosič.

Ešte ďalším aspektom predmetu vynálezu je spôsob prípravy definovanej monoklonálnej protilátky, ktorého podstata spočíva v tom, že sa prevedú nasledujúce kroky:

i) myš sa imunizuje purifikovaným α_νβ3 integrínom, ii) produkujú sa hybridomálne bunky.

Vynález teda opisuje takú novú protilátku blokujúcu funkciu zameranú proti ľudskému αν integrínovému reťazcu, ktorá sa označuje ako 17E6. V početných správach sa pojednávalo o ireverzibilnej povahe interakcie medzi ανβ3 a jeho ligandom, napríklad vitronektínom. Zistilo sa, že 17E6 rýchlo spúšťa zmenu svojej tak nazývanej ireverzibilnej interakcie medzi integrínmi sérií αν a ich substrátmi, čo naznačuje terapeutické použitie. Vynález analyzuje mechanizmus pôsobenia 17E6 a zisťuje, že je mimoriadne slabým kompetitorom pre ligandovú väzbu k ανβ3, zatiaľ čo vitronektín a vzorky aktívnych miest na báze RGD majú silnú vzájomnú kompetíciu na receptore. A iné protilátky sa silne uchádzajú o 17E6. Preto 17E6 pôsobí ako alosterický inhibítor. Pokusy so zosictcním dokladajú, že ανβ3, ale nie ανβΐ alebo ανβ5 potrebuje byť dimérovaný skôr, ako môže blokovať 17E6. Tento objav ukazuje, že 17E6 funguje novým mechanizmom zahŕňajúcim manipuláciu integrínom navodených signálnych transdukčných ciest.

Protilátka podľa vynálezu blokuje vývoj nádorov, pričom však nemá cytotoxické pôsobenie.

Všeobecné poznatky, materiály, obrázky, tabuľky a skratky

Mikroorganizmy, bunkové rady, plazmidy, fágemidy, promotóry, signálne znaky rezistencie, replikačné počiatky alebo iné fragmenty vektorov, ktoré sú tu uvádzané, sú normálne obchodne alebo inak všeobecne dostupné. V niektorých prípadoch nie je možné uvádzané materiály priamo kúpiť. Používajú sa však len ako príklady na účely doloženia vlastnosti alebo pôsobenia na objekty vynálezu a nie sú teda podstatné pre realizáciu vynálezu. Môžu byť nahradené spravidla inými všeobecne dostupnými látkami a biologickými materiálmi.

Monoklonálnou protilátkou 17E6 je protilátka, ktorá sa produkuje bunkovým radom hybridómu majúcim označenie 272-17E6. Bunkový rad je uložený pod objednávacím číslom DSM ACC216O v kolekcii mikroorganizmov Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen, Braunschweig, Nemecko.

Techniky a spôsoby, ktoré sú pre vynález podstatné, sú v opisnej časti podrobne opísané. Iné techniky, ktoré podrobne opísané nie sú, zodpovedajú všeobecným známym spôsobom, ktoré pracovníci v odbore dobre poznajú alebo ktoré sú podrobne opísané v odkazoch na patentovú a všeobecnú technickú literatúru.

DNA a aminokyselinové sekvencie zahŕňajú tiež mierne obmenené alebo modifikované sekvencie, ako mutanty a varianty, ktoré sa môžu získať zámerne alebo náhodne chemickými alebo fyzikálnymi procesmi. Všeobecne sú zahrnuté všetky také mutanty a varianty, ktoré majú opísané vlastnosti a funkcie.

Výraz protilátka zahŕňa tiež fragmenty protilátky, napríklad Fab', F(ab')₂ alebo jednoreťazcové Fv. Tieto fragmenty sa môžu produkovať známymi spôsobmi. Používané skratky majú nasledujúci význam: αΙΙύβ3 integrin ανβΐ integrin ανβ3 integrin ανβ5 integrin ανβ6 integrin ανβ8 integrin

10G2 Mab

14.18 G2a Mab 14D9.F8 Mab

14E2 Mab

17E6 Mab

20A9 Mab

23G5 Mab

3A3 Mab

9.2.27 Mab

ADCC protilátkovo zameraná bunková cytotoxicita

AECM protilátka a efektor bunkovo závislej cytostatis

AIIB2 Mab

AP3 Mab

ATCC Americká kolekcia typov kultúr

B16F10 bunková línia

CP8 Mab

CSAT Mab cRGDfV cyklický peptid: Arg-Gly-Asp-DPhe-Val cRGDfK cyklický peptid: Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys EMM31 bunková línia

G0H3 Mab

GRGDSPK peptid: Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys LM142 Mab

LM609 Mab

M21 bunková línia M21-L bunková línia M21-L-IIb bunková línia M21-L4 bunková línia MAb monoklonálna protilátka

MTT 3-(4,5-dimetyltziazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazóliumbromid

NBT-BCIP nitro modrosť tetrazóliumbrómchlórindolylfosfát

NP18	bunková línia
OG	oktylglukozid-(detergent)
P1D6	Mab
P1H6	Mab
P4C1O	Mab
P5H9	Mab
PMSF	fenylmetylsulfonyl fluorid
RGD	peptid: NH2-arginín-glycín-asparágová kyselina-COOH
SDS-PAGE sódiumdodecylsulfátpolyakrylamidová gólová elektroforéza
UCLAP-3	bunková línia
WM164	bunková línia
WM793	bunková línia
V+B2	bunková línia

Vysvetlenie tabuliek

Tabuľka I

Protilátky sú porovnávané v ELISA a bunkovej ELISA. O reakčných činidlách a špccificitách jc plne pojednané v opise. Symbol + znamená pozitívnu reakciu, žiadnu reakciu.

Kľúč: Protilátka

Protilátky charakterizované v tejto štúdii (podtrhnuté), štandardné reagencie (vytlačené kurzívou). Imunogén; ανβ3 = imobilizovaný ľudský placentámy integrin ανβ3. M21 = intaktné M21 bunky. Čistené ctvB3 a aIIbvB3 boli imobilizované na 96 jamkových doštičkách pre ELISA - bunkové rady M21, M21-L a M21-L-llb a UCLAP3 sa nechávajú rásť a fixujú sa na doštičkách a skúšajú sa na proti látkovú reaktivitu spôsobom ELISA. Specificita: (pozri opisnú časť) αν = αν reťazec integrínov cicavca. 200KDa = neznámy 200000 MW povrchový proteín buniek melanómu. ανβ5 = integrin ανβ5.β1 = integrínový βΐ reťazec β3 = integrínový β3 reťazec.

Tabuľka II

Hladiny reaktivity s ohľadom na kontrolu (len sekundárna protilátka) boli takto odstupňované: 1-2 (-), 2-4 (+), 4-9 (++), väčší ako 9 (+++)· Napríklad na M21 je relatívna fluorescenčná intenzita kontroly typicky 30-50 jednotiek a LM14 2 väzby 300 až 500 jednotiek, čo dáva strednú relatívnu reaktivitu približne 10 (400/40). (*) M21-L bol permeabilizovaný 70 % etanolom pri teplote -20 °C. (@)M21-L zahŕňa intracelulámy súhrn β3 reťazca VNR integrínu.

Tabuľka III

M21 a M21-L bunky sa zhromaždia so systémom trypsin/EDTA, inkubujú sa protilátkou 17E6, premyjú sa a vstrekujú sa do cievy chvostu holej myši („nude mice“). Po siedmim týždňoch sa myši usmrtia a pľúca sa skúšajú s ohľadom na tumor foci. Predbežné ošetrenie 17E6 znižuje počet vyvinutých foci. Podobné čísla vývoja foci sa zistia, keď sa vstreknú bunky M21-L (ktoré nemajú αν na bunkovom povrchu). * = porovnané s kontrolou: žiadna závislosť od protilátky.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1

Fluorescenčné aktivované bunkové triediace (FACS) analýzy skupiny protilátok α V a kontrol s ohľadom na bunky M21 a M21L ľudského melanómu.

Bunky sa inkubujú s 10 pg mľ¹ primárnych protilátok, ofarbené fluorescenčné značenými sekundárnymi protilátkami, opačne ofarbene propidiumjodidom na umožnenie vytriedenia nckrotických buniek, analyzovaných bolo 10000 buniek na analyzovanú vzorku. Otvorený pik znamená intenzitu sekundárnej vrstvy samotnej protilátky. Uzatvorený pik znamená intenzitu spoločne primárnej a sekundárnej vrstvy. Na zvislej osi je počet buniek na kanál, na vodorovnej log fluorescenčné intenzity v tomto kanáli. M21 nesie povrchový αν integrin, M21-L ho nemá. Obrazec zafarbenia pre aV skupinu protilátok tesne súhlasí s LM14 2 (αν-špecifická) a LM6O9 (ax^3-špecifická) zafarbeniami. Najmä reagujú s M21, ale minimálne s M21-L. Protilátka 9.2.27 reaguje s povrchovým proteoglykánom. 14E2 a 21H6 rozpoznáva inak nedefinovaný 200KDa me lanómu povrchový proteín. Ich obrazce zafarbenia sú oddelené od obrazcov zafarbenia skupiny aV. Najmä reagujú podobne tak s M21, ako s M21-L.

Obr. 2

Skupina α V protilátok imunoprecipituje podobné proteíny.

Živé M21 melanómu (A) sa na povrchu buniek značia biotínom, extrahujú sa dctcrgentom a podrobujú sa imunoprecipitácii a štepeniu na neredukčnej 7,5 % SDS-PAGE. Zároveň sa spracovávajú štandardy a hmotnosti v KDa sú uvádzané vľavo. Precipitácia je s kontrolnými protilátkami LM142 (anti- αν: pruh b) a LM6O9 (anti- ανβ3: pruh c) a 21H6 (pruh d), 10G2 (pruh e), 20A9 (pruh f), 23G5 (pruh g) 17E6 (pruh h), 14D9 (pruh i) a 14E2 (pruh j). LM142 a LM6O9 precipituje podobný obrazec proteínov k 10G2, 20A9, 23G5 a 17E6 zatiaľ čo 21H6 a 14E2 precipituje pás približne pri 200 KDa. 14D9 precipituje obidva obrazce. M21 melanómu (B), M21-L αν deficientná melanoma (C) a UCLAP-3 bunky (D) sú bunky s povrchom značeným biotínom a imunoprecipitujú ako v (A). Precipitácia je s protilátkou LM142 (anti- αν: pruh b), LM6O9 (anti- ανβ3: pruh c) 17E6 (pruh d), AP3 (anti- β3: pruh e) a 20A9 (pruh f). Molekulová hmotnosť je vyznačená v pruhu (a) a hmotnosti v KDa sú vľavo. Pozície pásov αν, βΐ, β3, β5 je uvedená.

Obr. 3

17E6 interferuje s počiatočnou väzbou buniek na vitronektín.

Séria bunkových línií melanómu (Mels.) a bunkových línií karcmómu (Cars.) sa testuje FACS na reaktivitu s 17E6 Mab. FACS intenzity sú opísané v tabuľke II. Bunky sa nechajú viazať na vitronektínom potiahnuté substráty (0,5 pg mľ¹ povlak) v prítomnosti supematantov hybridómu z 17E6 (otvorený) alebo 14E2 (pevný). Po premytí sa počítajú viazané bunky spôsobom opísaným v časti materiály a spôsoby a hodnoty sa normalizujú s ohľadom na väzbu v neprítomnosti protilátok. S výnimkou EJ16F10 (myší melanóm) sú všetky bunky ľudského pôvodu. Malme 3 je fibroblastová línia. Absolútne percento viazaných buniek v neprítomnosti protilátok je pre M21 (70 %), WM 164 (68 %), A375 (75 %), EMM31 (67 %), WM793 (65 %), MalMe3 (67 %), B16F10 (70 %), UCLA-P3 (76 %), NP-18 (65 %), SW1116 (68 %), HT29 (65 %). Na vodorovnej osi je percento bunkovej väzby kontroly.

Obr. 4

17E6 narušuje adhéziu sprostredkovávanú tak ανβ3, ako ανβ5 integrínmi.

Čistené monoklonálne protilátky (Mab) alebo myšie ascity sa koinkubujú v priebehu väzby buniek na vitronektínom potiahnuté substráty (5 mg ml'¹). Bunkové línie (A, B) M21; (C, D) UCLAP-3; (E, F) WM-793. Symboly znamenajú nasledujúce protilátky (špecificity): (plné koliesko) = 17E6 (av); (plný trojuholníček) = LM6O9 (ανβ3); (plný kosoštvorček) = 14D9.F8 (av); (prázdne koliesko) = = P4C10 (βΐ); (prázdny štvorček) = P5H9 (ανβ5); (prázdny trojuholníček) = P5H9 + LM6O9 [zriedenie vychádza od 10 pg ml'¹] (ανβ3, ανβ5). Zvislá os: viazané bunky (%), vodorovná os: ľavá strana Mab (pg/ml), pravá strana: zriedenie ascitu (1/x).

Obr. 5

17E6 narušuje adhéziu na vitronektín nie však na iné matricové zložky.

Študuje sa vplyv 17E6 (αν, plné koliesko) a P4C10 (βΐ, prázdne koliesko) na väzbu buniek na vitronektín (A), na laminín (B) alebo na kolagénový typ I (C). Len VN potiahnuté povrchy neblokujú 17E6 väzbu buniek. Len kolagénový typ I a laminín P4C10 blokuje väzbu buniek. Zvislá os: viazané bunky (%), vodorovná os: P4C10 zriedenie (1/x) (horná os) a Mab (pg/ml) (spodná os), zvislá os: percento viazaných buniek.

Obr. 6

17E6 reverzuje kontakty ustaveného systému bunka-vitronektín. M21 melanóm sa nechá viazať počas 24 hodín na povrchy potiahnuté vitronektínom (VN horný rad) alebo fibronektínom (FN spodný rad). Bunky sa viažu v priebehu 30 minút, a sú dobre pretiahnuté a proliferujú sa v 24 hodinách (a, e) keď sa 17E6 pridá do kultivačného prostredia (b, f). Po 30 minútach na vitronektíne (b) sa bunky zaokrúhlia, zatiaľ čo na fibronektíne (f) zostávajú pretiahnuté. LM509 (c, g) a 14E2 (d, h) majú malý vplyv na obidva substráty. Koncentrácia protilátok: (b): 0,1 pg ml⁴, (c, d, f, h) 100 pg mľ¹

Obr. 7

Vývoj M21 ľudského melanómu v BALB/c holej myši sa moduluje av-integrinmi.

A. B. Vplyv 17E6 na subkutánny M21 vývoj. 0,5 x 10⁶ M21 (A) alebo M21-L (B) sa inkubuje s tlmivým roztokom (prázdne koliesko), s protilátkami 17E6 (plné koliesko) alebo s 14E2 (prázdny trojuholníček) a vstrekuje sa subkutánne holej myši. V priebehu času sa merajú rozmery nádoru a zaznamenáva sa jeho objem. Je znázornený typický pokus. Chybné tyčinky ukazujú s.e.m. 8 zvierat na skupinu. Na zvislej osi je objem nádoru v mm³, na vodorovnej osi počet dní po vstreknutí.

C. Vplyv αν na M21 experimentálne metastázy

0,32 x 10⁶ (plný štvorček, plný kosoštvorček) alebo lxlO⁶ (prázdny štvorček, prázdny kosoštvorček) buniek M21 (plný kosoštvorček, prázdny kosoštvorček) alebo M21L (plný štvorček, prázdny štvorček) sa vstrekne do cievy chvostu holej myši. V danom čase sa myši usmrtia a pľúca sa skúšajú na nádorové noduly. Všetky M21 myši sa usmrtia 42. deň. V prípade M21-L myší sa 3 až 6 myší usmrtí v každom bode. Nádorov po 6 týždňoch je v prípade M21 myši príliš vysoký počet (» 2150 na pľúca), takže T-štatistiky sú doložené pre hypotézu, že M21-L skupina je od rovnakej populácie ako kontrolné M21 skupiny v 42 deň na úrovni <0,001 (**) alebo <0,02 (*). Kde tak Hi ako Io injektovaných skupín majú rovnaký význam, uvádza sa len jedna hodnota. Tyčinky ukazujú stredný počet nádorov na skupinu. Na zvislej osi je počet nádorov na pľúca, na vodorovnej osi dno po vstreknutí.

Obr. 8

17E6 nie je cytotoxický.

A Vplyv 17E6 na M21 bunkovú proliferáciu

Očkuje sa 5 x ΙΟ⁴ M21 v DMEM/FCS s nosičom (prázdne koliesko) alebo v prítomnosti 50 pq ml protilátky 17E6 (plné koliesko) alebo 14E2 (prázdny trojuholníček) a denne sa počíta počet buniek. Kinetika a saturačná hustota proliferácie sú protilátkami neovplyvnené. Na zvislej osi je počet buniek na vodorovnej počet dní.

B. Na 17E6 závislá lýza M21 buniek mikrogliálnymi bunkami

Tymidínom značené bunky M21 sa zmiešajú s BALB/c-odvodenými mikrogliálnymi mozgovými makrofágmi, pridajú sa sériovo riedené protilátky a po inkubácii sa meria uvoľňovanie tymidínu. Kontroly: (prázdny trojuholničck) M21 bunky samotne; (plný kosoštvorček) M21 + 17E6 (100 nM); (prázdny štvorček) M21 + 14,18 G2a; (plný trojuholníček) M21 + mikroglia. Stred ± s.d. (n=6). Experimentálne podmienky: (plné koliesko) M21 + mikroglia + 17E6; (prázdny štvorček) M21 + mikroglia + 14,18 G2a. 17E6 nenavodzuje od protilátky závislú lýzu buniek. Stred ± s.d. (n=3). Na zvislej osi je cytotoxicita (%) na vodorovnej koncentrácia protilátky (M).

C. Od 17E6 závislá cytostasis M21 buniek mikrogliálnymi bunkami M21

Bunky sa inkubujú s mikrogliálnymi bunkami a so sériovo zriedenou protilátkou a potom sa pulzujú s [H³]-tymidínom na meranie DNA syntézy. Meria sa včlenenie tymidínu ([H³]-thy). Symboly majú rovnaký význam ako v odseku B. Zaznamenáva sa cytostatická aktivita samotných efektorových buniek (plný trojuholníček). Mikroskopické pozorovania pri skúške dokladajú, že oblasti homogénnych mikrogliálnych buniek pri 1418 G2a > 1O¹⁰ M, žiadne M21 bunky neprežívajú. Na zvislej osi je vnesený [H³]- tymidin (cpm x 10) na vodorovnej osi koncentrácia protilátky (M).

Obr. 9

17E6 neovplyvňuje DNA syntézu M21 bunkami.

Bunkové línie (A) M21, (B) M21-L, (C) M21-L4 a (D) M21-LGpllb sa kultivujú a tlmia (prázdne koliesko) alebo sa pridávajú protilátky 17E6 (plné koliesko), LM6O9 (plný trojuholníček) alebo 14E2 (prázdny trojuholníček) v uvedených koncentráciách. (B) a (D) sú rutinné pozitívne kontroly, taxol (prázdny kosoštvorček). Po 48 hodinách sa bunky pulzujú s [H³]-tymidínom a meria sa zavedená rádioaktivita. Protilátky nemajú žiadny vplyv na syntézu DNA. Taxol ju dokonale potlačuje. Porovnaj s obr. 8: 90 pg mľ¹ Mab = 600 nM. Na zvislej osi je vnesený [H³]tymidín (cpm x 10'³), na vodorovnej koncentrácia Mab (pg/ml).

Obr. 10

ELISA 17E6 a fragmentov na čistenom ανβ3.

Intaktný 17E6 (prázdny trojuholníček) a jeho fragmenty F(ab')₂ (prázdne koliesko) alebo F(ab') (prázdny štvorček) v uvedených koncentráciách sa nechajú viazať na slepých doštičkách potiahnutých 1 mg mľ¹ s ανβ3 a zisťuje sa viazaná protilátka. Na zvislej osi je optická hustota (OD) pri 450 nm, na vodorovnej osi protilátka (log₁₀ pg/ml).

Obr. 11

Väzba buniek, sprostredkovávaná ανβΐ a ανβ5, ale nie ανβ3, je blokovaná 17E6 F(ab').

Bunky, ako je to uvedené, sa nechajú viazať, na 5 mg mľ¹ povlak vitronektinu v prítomnosti uvedených koncentrácií 17E6 a jeho fragmentov F(ab')₂ alebo F(ab'). 100 % väzba sa mení od približne 85 % (WM164) do približne 50 % (V + B2) všetkých pridaných buniek. Na zvislej osi je percento maximálne viazaných buniek, na vodorovnej osi koncentrácia protilátky (pg/ml).

Obr. 12

Väzba M21 na vitronektín je blokovaná zosietením 17E6 F(ab').

V priebehu väzby buniek M21 na vitronektín (obr. 4, 11), 17E6 F(ab') fragmenty alebo nedotknutá AP3 protilátka za 0 (prázdne koliesko), 0,1 (prázdny trojuholníček stojaci na vrchole), 1,0 (prázdny štvorček) alebo 10 pg pľ^l (prázdny trojuholníček stojaci na podstave) sa koinkubujú s uvedenými koncentráciami zosieťujúcej protimyšej sekundárnej vrstvy protilátky. Zosietenie má identické ELISA afínity pre 17E6 F(ab') a AP3, (neznázomené). Na zvislej osi jc optická hustota (OD) pri 405 nm, na vodorovnej koncentrácia kozej protimyšej protilátky (pg/ml).

Obr. 13

Ligandové aktívne miesto mimetík a vitronektinu konkurujú s iným miestom pre väzbu na οώβ3 v priamej konkurenčnej skúške.

Vzrastajúca koncentrácia vitronektinu (prázdny trojuholniček stojaci na vrchole) alebo peptidov GRGDSPK (prázdne koliesko, plné koliesko) alebo cRGDfV (plný kosoštvorček, prázdny kosoštvorček) sa koinkubujú s biotinylovaným vitronektinom (1 pg mľ¹ = 1,5 nM) alebo s biotinylovaným cRGDfV derivátom (cRGDfK-bio: 50 nM) na οώβ3 potiahnutých doštičkách. Viazaný biotín sa zisťuje s antibiotínovou protilátkou. Obr. predpokladá stredný M_r pre jednomocný multimémy vitronektín 0,65 MDa. Na zvislej osi je percento ligandovej väzby, na vodorovnej osi peptid/VN (log [(pM]).

Obr. 14

17E6 nekonkuruje s vitronektinom pre väzbu k ab[13 v priamej konkurenčnej skúške.

Vzrastajúca koncentrácia 17E6 (plné koliesko) iných anti ctbp3 protilátok (prázdny štvorček, prázdny kosoštvorček, prázdny trojuholníček stojaci na vrchole, prázdny trojuholníček stojaci na podstave) alebo ligandových mimetických cRGDfV (plný kosoštvorček) sa koinkubujú s biotinylovaným vitronektinom (1 pg mľ') na εώβ3 potiahnutých doštičkách. Viazaný biotín sa detektuje s antibiotínovou protilátkou (porovnaj profil nasýtenia v rovnakých οώβ3 podmienkach potiahnutia pre 176: obr. 10). Na zvislej osi je percento viazaného VN, na vodorovnej osi [Mab] pg/ml -[cRGD] pM.

Obr. 15

Ligandy a aktívne miesta mimetík nekonkurujú s protilátkami pre väzba na οώβ3 v predblokovanej konkurenčnej skúške.

Vzrastajúca koncentrácia vitronektinu (VN prázdne koliesko), fibrinogénu (FG, prázdny trojuholníček stojaci na vrchole), fibronektínu (FN prázdny štvorček), cRGDfV (66203, plný trojuholníček stojaci na podstave) alebo indikované protilátky (plný kosoštvorček) sa preinkubujú počas jednej hodiny na οώβ3 potiahnutých doštičkách a potom sa skúma pridaním (žiadne premytie) biotinylovanej protilátky (1 pg mľ¹), ako je to ukázané. Zisťuje sa viazaný biotín. Hodnota viazanej protilátky 100 % naznačuje, že väzba protilátky v prítomnosti koncentrácií kompetitívnej látky je rovnaká ako v kontrolnej skúške bez kompetitoru. Ligandy neovplyvňujú väzbu protilátky. Na zvislej osi je percento skúšanej viazanej protilátky, na vodorovnej osi (na ľavej i na pravej strane) koncentrácia Ugandu (pg/ml).

Obr. 16

Protilátky si konkurujú navzájom pre väzbu na οώβ3 v predblokovej konkurenčnej skúške.

Vzrastajúca koncentrácia protilátok 17E6 (plné koliesko), LM6O9 (prázdny trojuholníček stojaci na vrchole), AP3 (prázdny štvorček) alebo 14D9.F8 (prázdny trojuholníček stojaci na podstave) v uvedenej výške sa preinkubujú počas jednej hodiny na αύβ3 potiahnutých doštičkách a potom sa skúšajú pridaním (žiadne premytie) biotinylova6 nej protilátky (1 pg ml') ako je to ukázané na každom paneli. Zisťuje sa viazaný biotín. Hodnota viazanej protilátky 100 % naznačuje, že väzba protilátky v prítomnosti koncentrácií konkurenčnej látky je rovnaká ako v neprítomnosti konkurenčnej látky. Protilátky si konkurujú navzájom v konkurenčných skupinách. Na zvislej osi je percento skúšanej viazanej protilátky, na vodorovnej osi (na ľavej i na pravej strane) koncentrácia protilátky (pg/ml).

Obr. 17 a, b

Sekvencia cDNA variabilných (Fv) oblasti Mab 17E6 Ľahký reťazec: VL17E6 ťažký reťazec (a) a ťažký reťazec VH17E6 (b). Je ukázaný kompletný nukleotid a dedukovaná aminokyselinová sekvencia variabilných oblastí (vrátane vedúcej sekvencie). Vedúce sekvencie sú vyznačené výrazne; CDR sekvencie sú v kurzíve. Ťažký reťazec má charakteristickú štruktúru skupiny II B a ľahký reťazec kappa skupiny V, podľa Kabátovej klasifikácie.

Obr. 18

Schematická reprezentácia klonovacieho procesu mRNA kódujúce Fv domény protilátky 17E6 ťažkého a ľahkého reťazca sa extrahujú z 17E6 buniek hybridómu, transkribovaných do cDNA a PCR sa používa na zosilnenie variabilných oblastí. Tieto oblasti sa klonujú a sekvenujú. A = antigén viažúce miesto

L = ľahký reťazec

H = ťažký reťazec = hlava v = variabilná oblasť c = konštantná oblasť h a 1 = ťažký a ľahký reťazec p = primérový mix pr = primér

PCR A = PCR zosilnenie

C = klonovanie a sekvenovanie

Odkazy na literatúru (a. k. = a kolektív)

Albelda, S.M., a. k. (1990), CancerRes. 50, 6757-6764. Bhattacharya, S. a. k. (1995) J.Biol. Chem. 270: 16781-16787

Brooks, P.C. a. k. (1994), Science 264, 569-571. Buck, C, a. k. (1990), Celí Differ. Dev. 32, 189-202. Busk, M. a. k, (1992), J. Biol. Chem. 267, 5790-5796. Carter, W.G. a. k . (1990), J. Celí Biol. 110, 1387-1404. Chán, B.M. a. k . Hemler, M.E. (1993), J. Celí Biol. 120, 537-543.

Charo, I.F. a. k. (1990), J. Celí Biol. 111, 2795-2800. Cheng, Y.F. a. k. (1991), Exp. Celí Res. 194, 69-77. Cheresh, D.A. a. k. (1987), J. Celí Biol. 105, 1163-1173. Cheresh, D.A. a. k. (1989), Celí 57, 59-69.

Cheresh, D.A. (1991), Cancer Metastasis Rev. 10, 3-10.

Cheresh, D.A. a. k. Harper, J.R. (1987), J. Biol. Chem. 262, 1434.

Cheresh, D.A. a Spiro, R.C. (1987), J. Biol. Chem. 262, 17703.

Chemy, R.C .a. k. 1993, J. Biol. Chem. 268, 9725-9729. Chirgwin, J.M. a k. (1979), Biochemistry 15, 5294-5299. Chuntharapai, A. a. k. (1993), Exp. Celí Res. 205, 345-352. Danen, E.H. a. k.(1993), Int. J. Cancer 54, 315-321. de Boer, H.C. a. k. (1993), J. Biol. Chem. 268, 1279-1283. Delwel, G.O. a k.(1993), J. Biol. Chem. 268, 25865-25875. Denhardt, D.T. a. k. Guo, X. (1993), FASEB J. 7, 14751482. Diamond, M.S. a.k. Springer, T.A. (1994), Current Biology 4, 506

Dougall, WC.,1994, Oncogene., 9: 2109-23

Etoh, T. a. k. (1992), J. Dermatol. 19, 841-846.

Felding-Habermann, B. a. k. (1992), J. Clin. Invest. 89, 2018-2022.

Fidler, U. (1986), Cancer Metastasis Rev. 5,29-49.

Fidler, U. (1988), Isr. J. Med. Sci. 24, 456-463.

Furihata, K. a. k. (1987), J. Clin. Invest. 80, 1624-1630. Gehlsen, K.R. a. k. (1992), Clin. Exp. Metastasis 10, 111-120.

Goodman, S.L. a. k.(1991), J. Celí Biol. 113, 931-941. Gussow, D. a.k. Clackson, T. (1989), Nucleic. Acids. Res. 77,4000

Haba, S. a. k. (1985), J. Immunol. 134, 3291-3297.

Halí, D.E. a. k. (1990), J. Celí Biol. 110, 2175-2184. Hardan, I. a. k. (1993), Int. J. Cancer 55, 1023-1028.

Harel, W. a. k. (1990), Cancer Res. 50,6311-6315.

Harlow, E. a. k. Lane, D. (1988). Antibodies - a laboratory Manual (Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory).

Hart, I.R. a. k. Birch (1991), Cancer Metastasis Rev. 10, 115-128.

Herlyn, D. a. k. (1985), Celí Immunol. 92, 105-114. Herlyn, D. a. k. (1990), Cancer Res. 50, 2296-2302. Humphries, M. J. a. k. (1986), Science 233, 467-470.

Humphries, M.J. a. k. (1988), J. Clin. Invest. 81, 782-790. Hynes, R.O. (1992), Celí 69, 11-25.

Jones, S.T. a. k Bendig, M. M. (1991), Biotechnology 9, 88-89.

Kabát, E.A. a. k. (1987), US dept. health and human services, US gouvemment Printing offtces).

Kázal, L.A. a. k. (1963), Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 113, 989-994.

Kieffer, N. a. k. (1991), J. Celí Biol. 113, 451-461. Korhonen, M. a. k. (1991), Lab. Invest. 65, 347-356. Landegren, U. (1984), J. Immunol. Methods 67, 379-388. Lehmann, M. a. k. (1994). Cancer Research 54, 2102-2107. Lessey, B.A. a. k. (1992), J. Clin. Invest. 90, 188-195. Liotta, L.A. a. k.(1991), Celí 64, 327-336.

Marshall, J.F. a. k. (1991), Int. J. Cancer 49, 924-931. Melvaer, K.L. a. k. Fysíro, D. (1982), Appl. Environ. Microbiol. 43,493-494.

Mosmann, T. (1983), Methods 65, 55-63.

Moyle, M. a. k. (1991), J. Biol. Chem. 266, 19650-19658. Mujoo, K. a. k. (1989), CancerRes. 49, 2857-2861.

Natali, P.G. a. k. (1993), Int J. Cancer 54, 68-72. Neff, N.T. a. k. (1982), J. Celí Biol. 95, 654-666.

Nesbitt, S. a. k. (1993), J. Biol. Chem. 268, 16737-16745. Orlando, R.A. a. k. Cheresh, D.A. (1991), J. Biol. Chem. 266, 19543

Panetti, T.S. a. McKeown Longo, P.J. (1993a), J. Biol. Chem. 265,11988-11993.

Panetti, T.S. a McKeown Longo, P.J. (1993b), J. Biol. Chem. 265,11492-11495.

Paulsson, M. a. k. (1987), Eur. J. Biochem. 166, 11-19. Pignatelli, M. a. k. (1992), Hum. Pathol. 23, 1159-1166. Poste, G. a. k. (1980), Cancer Res. 40, 1636-1644. Preissner, K.T. (1991), Annu. Rev. Celí Biol. 7, 275-310.

Pytela, R. a. k .(1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 5766-5770.

Pytela, R. a. k (1986), Science 231, 1559-1562.

Rodeck, U. a. k. (1985), J. Immunology 134, 1300-1304. Ruoslahti, E. a. k. (1982), Methods Enzymol. 52 PtA, 803-831.

Ruoslahti, E., (1991), J. Clin. Invest. 87.)

Sambrook, J. a. k.(1989). Molecular Cloning, a laboratory manual (Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Sanders, L.C. a k. (1992), Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 57, 233-240.

Sanger, F. a. k.(1977), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74, 5463

Seftor, R.E. a. k. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 1557

Si, Z. a. Hersey, P. (1994), Pathology. 26, 6-15.

Smith, J.W. a. k.(1990),. J. Biol. Chem. 265, 11008-11013. Smith, J.W. a. k. Cheresh, D.A. (1988), J. Biol. Chem. 263, 18726

Smith, J.W. a. k. Cheresh, D.A. (1990), J. Biol. Chem. 265, 2168

Sonnenberg, A. a. k. (1987), J. Biol. Chem. 262, 10376-10383.

Sonnenberg, A. a. k . (1988), . Náture (London) 336, 487-489.

Sonnenberg, A. (1993), Curr. Top. Microbiol. Immunol. 184, 7-35.

Stetler Stevenson, W.G., a. k. (1993), Annu. Rev. Celí Biol. 9, 541

Stockmann, A. a. k.1993, J-Biol-Chem., 268: 22874-82 Sutter, A. a. k. (1991), Pathobiology 59, 254-258.

Takada, Y. a. k. (1987), J. Celí. Biochem. 37. 385-393. Tao, M.H. and Morrison, S.L. (1989), J. Immunol. 143, 2595-2601.

Towbin, H. a. k. (1979), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354.

Tumer, D.C. a. k, (1989), J. Neurosci. 9, 3287-3296. Wayner, E.A. a. k. (1991), J. Celí Biol. 113, 919-929. Wayner, E.A. a. k. Carter, W.G. (1987), J. Celí Biol. 105, 1873-1884.

Wickham, T.J. a. k. (1993), Celí 73, 309-3 1 9. Yatohgo, T. a. k. (1988), Celí Struct. Funct. 13, 281-292. Yoshinaga, I.G. a. k. (1993), Melanoma Res. 3, 435 - 441. Zambruno, G. a. k. (1993), J. Celí Sci. 105, 179 -190. Zhang, Z . a. k. (1993), J. Celí Biol. 122, 235 - 242.

Podrobný opis vynálezu

Skupina αν monoklonálnych protilátok reaguje s integrínovým αν reťazcom. Protilátkový skríening ELISA čistených ανβ3 a αΙΙβ3 ukazuje päť klonov, 17E6, 20A9, 23G5, 14D9.F8, 10G2, ktoré reagujú špecificky s ανβ3 (tabuľka I). Tieto Mab sú ukončené „α-V skupinou“. Všetky sú IgGl izotypmi. Pri rovnakej skúške ELISA antiintegrínovej protilátky známej špecificity proti ανβ3 komplexu (LM6O9), aV reťazca (LM142), ανβ5 komplex (P5H9), αΙΙβ3 komplex (CP8), β3 reťazca (AP3) a βΐ reťazca (P4C10) reagujú ako je to predpovedané v literatúre (tabuľka I). Pri ELISA na fixovaných bunkách („CELISA“) s bunkami expresujúcimi ανβ3 a ανβ5 (M21) ανβ5, ale nie ανβ3 (UCLAP3) ani ανβ3, ani ανβ5 (M21-L) a αΙΙβ3 (M21-L-IIb), α-V skupina má reakčný obrazec konzistentný s ich rozpoznaním αν-integrínového reťazca a jasne odlišuje od reakcie s β3, β5, βΐ alebo s inými a-reťazcami (tabuľka I). Výsledky potvrdzujú hodnoty ELISA s čistenými receptormi. Mab so špecificitami pre β3 a GpIIb sa rovnako získajú na skríningu (hodnoty neukázané) a reagujú jasne oddeleným spôsobom od αν skupiny. 17E6, 14D9.F8, 2OA9 a 23G5 viažu ανβ3 s podobnou zdanlivou afinitou. 50 % väzby sa dosahuje pri približne 10 až 20 ng mľ¹ (približne 50 až 100 pM - podobne k LM6O9). 10G2 sa viaže podobne na LM142 s približne 10-krát nižšou afinitou). CP8, proti αΙΙβ3 a 14E2 (pozri ďalej), majú minimálnu väzbu na ανβ3 pri koncentráciách až do 100 nM.

Schopnosť α-V skupiny rozpoznávať natívne av-integríny sa testuje FACS (obr. 1, tabuľka II) a imunoprecipitáciou z povrchovo značených buniek (obr. 2). V FACS analýze (obr. 1) αν-expresná línia (M21) reaguje silne s 17E6, 14D9.F8, 2OA9, 23G5 a s av-definujúcimi protilátkami LM142 a LM6O9, mierne s 10G2 a tiež s kontrolnými Mab 14E2 a 21H6 a Mab 9.2.27. Na rozdiel, av-deficientný variant (M21-L) reaguje slabo s α-V skupinou a s LM142 a LM6O9, má však podobnú reaktivitu ako M21 s 14E2, 21H6 a s 9.2. 27. M21-L má intracelulámu oblasť β3 subjednotiek, ktoré sa zisťujú len vo FACS, keď sú bunky permeabilizované (tabuľka II). V analýze FACS M21-L4 (av-retransfektovaných M21-L bunkách [Fel-dingHabermann a kol., 1992]) α-V skupina poskytuje reakčné obrazce ako MS21. Kontrolné vektorové transfektanty, M21-L12 a GpIIb transfektanty, M21-L-IIb (Kieffer a kol., 1991), nemajú žiadne reakcie s α-V skupinou (tabuľka I). UCLAP-3 adenokarcinóm reaguje s α-V skupinou, s LM14 2 a P5H9, nie však s LM6O9. UCLAP-3 neexpresuje (33 (pozri úvod). Melanóm WM793 má rovnaký reakčný obrazec ako M21. V imunoprecipitačnom skríningu M21 buniek, α-V skupina dáva rovnaké imunoprecipitačné obrazce ako LM14 2 (anti-αν) a LM6O9 (anti-av[J3) (obr. 2a). Silný široký pás je pozorovaný pri približne 92kDa a slabší pás pri približne 145kDa so slabými doprovodnými pásmi pri približne 100 kDa, čo je charakteristický obrazec povrchu značených integrínov ανβ3 a ανβ5 (Wayner a kol., 1991). Pri porovnaní s precipitačnými obrazcami M21-L žiadna skupina α-V neprecituje (hodnoty z 17E6 a 20A9 sú ukázané) a žiadna neudáva LM14 2 alebo LM6O9 (obr. 2c). Podobné precipitačné obrazce dávajú βΐ-špecifické protilátky z obidvoch bunkových línií. V M21-L precipitácii s anti-fi3 protilátkami poskytuje pás pri približne 92kDa, v dôsledku intracelulámeho P3-značcriia v permeabilných (možno nekrotických) bunkách. UCLAP3 (obr. 2d) neposkytuje žiadny precipitát s LM6O9, ale komplex približne 95kDA/145kDa sa vyzráža α-V skupinou a LM142 (obr. 2d). Súhrnne analýzy ELISA, CELISA, FACS a imunoprecipitácie poskytujú konzistentné reakčné obrazce a silne dokladajú, že Maby α-V skupiny reagujú s extracelulámymi oblasťami ľudských αν-integrínových reťazcov.

Mab 17E6 je mocnou protilátkou blokujúcou funkcie 17E6 môže modifikovať počiatočnú väzbu buniek k ligandom αν αν-Integríny môžu fungovať ako receptory vitronektínu, takže skríning α-V skupiny sa vykonáva s ohľadom na možné vplyvy na väzbu buniek na vitronektinové substráty. Po intcgrinovcj analýze FACS sa skúšajú bunky vo väzbových testoch (tab. II, obr. 3). Vo FACS reagujú bunky línií ľudského melanómu a karcinómu podobne s α-V skupinou. Reakcia s 17E6 je sumarizovaná (obr. 3). Počiatočná väzba k vitronektínu buniek reagujúcich vo FACS s 17E6 je silne blokovaná touto protilátkou, ale len slabo ovplyvnená kontrolnou protilátkou 14E2 (obr. 3). Iné členy α-V skupiny sú menej silné (hodnoty neuvedené). Búrlivá väzba myších buniek B16F10 na vitronektín nie je ovplyvňovaná 17E6 a B16F10 nereaguje s 17E6 vo FACS. Ako bolo predpovedané (Cheresh a Harper, 1987), B16F10 väzba na vitronektín je citlivá na mikromoláme koncentrácie RGD-peptidov, čo poukazuje na prítomnosť funkčného povrchu ανβ3 (SLG a B. Diefenbach). Preto 17E6 a α-V skupina reagujú s ľudským, ale nie s myším αν.

Skúmal sa vplyv 17E6 na bunkovú väzbu. 17E6 blokuje M21 väzbu (približne 85 %) na vitronektín s IC₅₀ približne 0,1 pg mľ¹ (obr. 4a). Vynález potvrdzuje skoršie štúdie (Wayner a kol., 1991) poukazom, že M21 väzba je špatné blokovaná protilátkami na ανβ3 (LM6O9) alebo ανβ5 (P5H9) samotnými, ale silne blokovaná, keď sa pridajú spoločne (obr. 4a, b). Anti-βΐ integrínové protilátky (P4C10) nemajú žiadny vplyv na M21 väzbu na vitronektín (obr. 4b). Línie UCLAP3 a WM793 sa viažu na vitronektín a táto väzba sa blokuje 17E6 a tiež komplementárnymi ravflí-špecifickými (P5H9/UCLAP3) alebo ανβ3špecifíckými protilátkami (LM6O9/WM793) (Obr. 4c-f). Na ανβ5 (UCLAP3) 17E6 má IC₅₀ približne 30 ng ml'¹. Na WM793 má približne 60 ng ml¹ a pre LM6O9 1C_5O približne 600 ng ml’¹. UCLAP3 expresuje ανβ5, ale žiadny ανβ3 (Wayner a kol., 1991), zatiaľ čo WM 793 expresuje vysoké hladiny ανβ3 (tabuľka I). Blokovacia špecificita 17E6 sa potvrdzuje jeho nedostatkom vplyvu na väzbu bunky na iné matricové substráty (obr. 5) P4C10 (anti-βΐ) ruší väzbu M21 na laminín a kolagén. Bunková adhézia k týmto dvom substrátom môže byť sprostredkovaná β 1 sériou integrínov (Sonnenberg a kol., 1988; Takadaakol., 1987).

Súhrnne s biochemickými údajmi sú tieto výsledky konzistentné s teóriou, že 17E6 viaže αν reťazec rôznych integrínových komplexov a rozrušuje ich interakciu s ich ligandmi.

17E6 spúšťa zmenu zavedených bunkových matricovych interakcii sprostredkovaných av-integrínmi

Ďalej sa skúmalo, či 17E6 môže ovplyvňovať zavedené interakcie bunka - matrica. Keď sa 17E6 pri nízkych koncentráciách (približne 0,1 pg mľ¹) pridá do M21 buniek, navodzuje extenzívne zaobľovanie buniek po 0,5 hodine až po jednej hodine pri teplote 37 °C v M21 kultúrach i po 24 hodinách väzbu (obr. 6). Vplyv je plne reverzibilný a po premytí sa bunky vracajú do pretiahnutého stavu v priebehu 48 hodín. Na rozdiel od toho, protilátky LM6O9 a 14E2 ovplyvňujú morfológiu len mierne i vo vysokých koncentráciách (100 pg ml). Protilátky žiadnym spôsobom morfologicky neovplyvňujú ani v koncentrácii 100 pg mľ¹ fibronektínom potiahnuté substráty (obr. 6). M21-L4 (a iné bunky viazané cez αν) sú podobne ovplyvňované 17E6 na vitronektínových povrchoch, ale nie na fíbronektíne, kolagéne alebo laminíne.

17E6 blokuje M21 nádorový vývoj pri holej myši

Skúma sa vplyv αν-blokujúcej protilátky 17E6 na subkutánny vývoj M21 nádorov v prípade BALB/c nu/nu myši (obr. 7). Na zvieracích modeloch vývoj M21 nádorov v prípade holej myši sa uvádza do vzťahu s expresiou bunkového povrchu αν sérii integrínov (pozri úvod). M21 bunky sa subkutánne koinjektujú s protilátkami zbavenými endotoxinu. 17E6 konzistentne (4/4 pokusy) blokuje subkutánny vývoj M21 nádorov (obr. 7a). V prítomnosti 17E6 nie sú žiadne nádory (0/32) a zvieratá zostávajú bez nádorov dlhšie ako 6 mesiacov. Kontrolný nádor sa vyskytuje v 75 až 90 %. Neblokujúce protilátky proti αν reťazcu samotnému a kontrolné protilátky proti melanómu bunkového povrchu majú premenlivé a nekonzistentné účinky na vývoj nádoru. Pri kontrolách, ošetrených 14E2 sa nádory zmenšujú v závislosti od pokusu o 30 až 60 %, rast nádoru však zotrváva ako pri neošetrených kontrolách a podobne ako v prípade kontrol tieto zvieratá majú pulmonálne mikro-metastázy, keď sa pľúca vnesú do tkanivovej kultúry (neznázomené). Na rozdiel od toho zvieratá ošetrené 17E6 nemajú ani subkutánny nádory ani metastázy v pľúcach, v pečeni, v obličkách, v slezine, v črevách, v žalúdku ani v hrudných ani v brušných telesných dutinách, keď sa po 6 mesiacoch usmrtia. Línie M21-L deficitné na ανβ3 rastú subkutánne mnohom pomalšie ako M21 a nie sú ovplyvnené 17E6. M21-L kontroly, ošetrené 14E2 vykazujú zmenšenie v porovnaní s neošetrenými zvieratami, podobne ako je to pozorované pri M21 bunkách (obr. 7b).

Rast M21 a M21-L a vplyv protilátky 17E6 sa porovnáva na prípade „experimentálnej metastázy“ pri použití vstreknutia do cievy chvostu ako modelu. M21 vytvára početné kolónie v závislosti od dávky, zatiaľ čo M21-L vytvára významne menej kolónií, ale vytvára pľúcne moduly pri vstreknutí vo vyššej dávke (obr. 7c). Inak povedané, rast nádoru v pľúcach sa rovnako podporuje prítomnosťou bunkového povrchu αν-integrínov a predinkubácia M21 s 17E6 znižuje (o 90 %) počty vytvorených nádorových kolónií. Je zaujímavé, že úroveň vytvárania nádoru je podobná ako sa dosahuje M21-bunkami v rovnakom pokusu. Protilátka nemení počty zvierat, v ktorých nádor rástol (tabuľka III).

Súhrne sa dá konštatovať, že prítomnosť αν na povrchu buniek podporuje vytváranie nádoru M21 tak na subkutánnych ako na experimentálnych metastázových modeloch a αν blokovanie a reverzovanie protilátky 17E6 búrlivo potlačuje rast M21. V modeloch experimentálnych metastáz s bunkami M21 búrlivý rast M21 a slabý rast M21-L tesne sleduje subkutánny obrazec rastu nádoru a M21 rast je tiež potláčaný predbežným ošetrením 17E6. Tieto údaje zosilňujú súvislosť medzi αν-integrínmi a vývojom ľudského melanómu.

Pôsobenie 17E6 nespôsobuje cytotoxicitu

Po zistení silných vplyvov na väzbu, morfológiu a vývoj nádoru sa skúšalo zistenie mechanizmu pôsobenia 17E6. Skúšala sa cytotoxicita 17E6 (obr. 8). Kinetika bunkového rastu a hustota konečného dosiahnutého nasýtenia nie je značne ovplyvnená prítomnosťou 17E6 alebo kontrolnej protilátky (obr. 8a).

Holá myš je imunologický deficientná. Z niekoľkých buniek smerodajných pre imunitu, ktoré zostali, sú makrofágy najochotnejšie riadiť cytotoxicitu, odozvu sprostredkovanú protilátkou. Pri skúšaní možnosti, že protilátky riadia bunkovú cytotoxicitu (ADCC) sa skúšajú myšie makrofágy syngénne k protilátke v ADCC proti M21 bunkám. Ako efektorové bunky sú myšie mozgové makrofágy (mikroglia) osobitne silnými mediátormi ADCC (Sutter a kol., 1991). Pozitívna kontrola Mab 14.18 G2a spôsobuje takmer dokonalú lýzu M21 pri <10‘⁹M, zatiaľ čo 17E6 až pri 10’⁷ M nesprostredkováva ADCC (obr. 8b).

Na účely hodnotenia, či 17E6 môže vyvíjať cytostatickú účinnosť, v prítomnosti efektorových buniek, sa meria DNA syntéza M21 mikrogliálnych kokultúr v prítomnosti protilátok (obr. 8c). 14.18 G2a spôsobuje pri 1O'^WN >90 % inhibíciu v začleňovaní do [³H]-tymidínu.

Po skúškach vplyvu na proliferáciu buniek ADCC a AECM sa skúša s ohľadom na to, či sa ovplyvnia hladiny syntézy DNA v M21 bunkách pôsobením Mab. Na včleňovanie tymidínu nemá žiaden vplyv 17E6, 14E2 a LM6O9 v koncentrácii 0,5 μΜ (obr. 9). Protilátkami nie je rovnako ovplyvnená syntéza DNA v M21-L, M21-L4 a M21-L-IIb bunkách. M21-L a M21-L-IIb nereaguje ani s 17E6 ani s LM6O9 ale reaguje s 14E2 (obr. 1). Početné iné bunkové línie melanómu sa rovnako skúšajú a ich DNA syntéza nemá zrejmé ovplyvnenie α-V skupinou (neznázomené).

17E6 a 14E2 sú lgGl izotypy a neovplyvňujú komplementom sprostredkovávanú lýzu na M21 bunkách. Je možné usúdiť, že 17E6 sú špecifické proti αν-integrínom a nemajú drastické toxické pôsobenie na iné bunkové systémy.

Pôsobenie I7E6 na bunkový ανβ3 vyžaduje zosietenie receptoru ale nie pri ανβΐ alebo ccvB5

V početných biologických systémoch je transmembránový signál iniciovaný dimerizáciou receptorov. Ale multimerizácia ανβ3 mení fosfotyrozinylové obrazce HUVEC (Bhattacharya a kol., 1995). Preto sa skúmalo, či je receptorová agregácia zahrnutá v priebehu 17E6 pôsobenia. 17E6 inhibuje bunkové integrály ανβ3, ανβ5 a ανβΐ (obr. 4). Intaktný 17E6 a jeho F(ab')₂ a F(ab') fragmenty majú podobné väzbové charakteristiky v ELISA na izolovaný ανβ3 (obr. 10) s 50 % sýtením dosahovaným pri približne 1 ng mľ¹ (približne 7pM intaktný Mab). Podobné titračné krivky ELISA naznačujú monovalentnú interakciu medzi 17E6 a ELISA doštičkami. Ale pri skúškach väzby sa fragmenty správajú odlišne. F(ab')2 fragmenty a intaktný 17E6 blokujú väzbu buniek sprostredkovávanú ανβΐ (V + B2 bunky) a ανβ5 (UCLA-P3 bunky) (IC50 približne 0,1 pg mľ¹: približne 700 pM) a ανβ3 väzba (WM164 a M21 bunky) (IC50 približne 0,5 pg mľ¹: približne 3 nM) a F(ab') fragment je aktívnou a tiež dimémou protilátkou na ανβΐ a ανβ5 (obr. 11). Ale fragment F(ab') má aspoň 1 x 10⁴ väčšiu účinnosť tak na ανβΐ ako na ανβ5, ale nie na ανβ3, kde len blokuje 25 + 10 % pri najvyšších skúšaných koncentráciách (50 pg mľ¹: IC₅₀ » 50 pg mľ¹: » 400 nM) - pri týchto hladinách irelevantné protilátky rovnako produkujú podobný stupeň blokovanie (neznázomené), čo naznačuje, že tento okrajový efekt nie je špecifický.

Chýbajúca biologická aktivita fragmentu F(ab') protilátky, ktorý je schopný viazať (ako 17E6F(ab'): (obr. 10)) je klasickým indikátorom, že k protilátkou sprostredkovanej funkcii je nutná dimerizácia. Na potvrdenie, že zosietenie bolo skutočne nutné na pôsobenie 17E6 na ανβ3, bol 17E6F(ab') zosietený v priebehu skúšky bunkovej väzby prísadou polyklonálnej protilátky F(ab'). Klasický efekt podobný prozonu sa pozoruje, keď pri kritickej koncentrácii tak primárnych, ako sekundárnych protilátok, a len vtedy je zrejmá silná inhibícia bunkovej väzby. Adhéziu buniek neovplyvňujú vysoké množstvá druhej vrstvy protilátky samotnej alebo samotného F(ab'). Skôr nebol efekt špecifickým výsledkom zosietenia integrínov ανβ3: zosietenie ανβ3 väzbou neinhibičnej protilátky AP3 však nemalo vplyv na pripojenie buniek (obr. 12). Koncentrácia aktívneho F(ab') po pridaní sekundárnej protilátky v zosieťovacích experimentoch koinciduje s IC₅₍₎ intaktného 17E6 na ανβ3 sprostredkované pripojenie (pozri obr. 11).

Tieto údaje spoločne ukazujú, že zosietenie integrínu ανβ3 je nutné na prevenciu pripojenia WM164 a M21 ku kognatovým ligandom, zatiaľ čo ανβ5 a ανβΐ nevyžadujú pre aktiváciu zosietenie.

17E6 je zlým blokátorom receptorovych funkcií v teste izolovaného receptoru

Neobvyklá povaha funkcie 17E6 na ανβ3 sa študuje podrobne testami izolovaného receptoru. Rozdiel medzi klasickými blokátormi aktívnych miest a 17E6 je výrazný. Väzba vitronektínu na ανβ3 sa nasycuje pri približne 5 pg mľ¹ (približne II) nM: za predpokladu priemernej veľkosti vitronektínového multiméru 10 monomérov) (obr. 13) a táto väzba je špecificky ukončená tak s klasickými lineárnymi ligandovými mimetickými peptidmi (GRGDSPK:IC₅₀ približne 2 pM), ako s cyklizovanými peptidmi (cRGDfV: ICy, približne 5 nM) . Pri použití biotínom značeného variantu cRGDfV, biotinu cRGDfK, je možné priamo dokázať, že vitronektinová väzba konkuruje nielen inhibítorom, ale že vitronektin konkuruje väzbe inhibítoru (obr. 13), čo znamená, že systém je symetrický. V skutočnosti tak vitronek tín, ako GRGDSPK a cRGDfV si konkurujú navzájom a robia tak „racionálne“ a „symetricky“ tým, že IC₅₀ pre konkurenciu zrkadlí IC₅₀ na inhibíciu vitronektínovej väzby ku komplexu ανβ3 (obr. 13).

Väzba 17E6 saturuje ανβ3 pri 0,01 - 0,1 pgmľ*(700 až 70 pM) (pozri obr. 10). Protilátka je však len slabým inhibítorom ligandovej väzby. I pri 70 nM protilátky je menej ako 30 (+10) % inhibicie vitronektínovej väzby. LM6O9 sa správa podobne, zatiaľ čo ανβ3 väzba neinhibujúcich protilátok (14D9.F8, 2OA9 a WAM2-4) je neúčinná. Ligandový mimetický cyklický peptid cRGDfV blokuje účinne interakciu receptoru a ligandu (IC₅₀ približne 10 nM ) (obr. 14), neovplyvňuje však väzbu 17E6. Neinhibuje ani intaktný, ani monovalentný 17E6 (neznázomené).

17E6 viaže ανβ3 v prítomnosti saturačných množstiev podnecujúceho ligandu

Slabá konkurencia 17E6 pre ligand v teste izolovaného receptoru a dostupnosť silných konkurenčných inhibítorov, ako cRGDfV vyvoláva otázku, akým spôsobom ovplyvňuje 17E6 funkciu αν. Blokujúce pôsobenie 17E6 a jeho fragmentov pri testoch bunkových väzieb pre integrín ανβ3 vyžaduje zosietenie, čo je správanie, ktoré sa plne nezlučuje s inhibíciou konkurenciou. Najskôr sa skúma, či ligandy ανβ3 interferujú priamo s väzbou 17E6.

Ligandy sa vopred viažu na receptor a pridá sa nízka koncentrácia priamo značeného 17E6 (obr. 15). Väzba 17E6 nie je ovplyvnená (<10 % bloku) vysokou koncentráciou vitronektínu, fibronektínu alebo fibrinogénu (čo sú natívne ligandy ανβ3 {Cheresb a Spiro,1987}) v 100-násobku potrebného množstva k nasýteniu špecifických väzbových miest na ανβ3. Na rozdiel od toho vopred viazaný 17E6 konkuruje silne s väzbou následne pridaného značeného 17E6 (obr. 15, 16) a natívne ligandy ανβ3 si tiež navzájom dobre konkurujú (neznázomené). To robí falošným náš predpoklad, že 17E6 si konkuruje s vitronektinom na aktívnej strane ανβ3. Skôr silné, aktívne miestne konkurenti, ako cyklický peptid cRGDfV pri 200 pM tiež nepôsobia na väzbu 17E6, ale blokujú vitronektínovú väzbu na ανβ3 s IC₃₀ 2nM (obr. 13).

Údaje ELISA (obr. 10) značia, že interakcie 17E6 - ανβ3 sú monovalentné, čo znižuje možnosť, že konkurenčný artefakt je pozorovaný vplyvom veľmi vysokej afinity protilátky kombinovanej s nízkou afinitou ligandu. Označia sa však iné αν a B3-špecifické protilátky a použijú sa na podnietenie vopred viazaného ligandu (obr. 15), vrátane protilátok samotných (obr. 16). Protilátky si navzájom úspešne konkurujú a patria jasne do konkurenčných skupín (16). β3 špecifická protilátka AP3 konkuruje so svojou vlastnou väzbou, ale neovplyvňuje väzbu a nie je ovplyvnená protilátkami špecifickými buď pre komplex ανβ3 (LM609), alebo αν-reťazec samotný (17E6, 14D9.F8); pričom LM6O9, 17E6 a 14D9.F8 konkurujú silne. Na rozdiel od toho vopred viazané ligandy neovplyvňujú väzbu 17E6 na ανβ3. Musí sa prijať záver, že 17E6 nepôsobí priamou konkurenciou na ligandovom väzbovom mieste.

Klonovanie a sekvenovanie premenných oblasti 17E6

Na klonovanie knižníc cDNA obohatených imunoglobulínom pre oblasti ťažkých a ľahkých reťazcov hybridómu 17E6 sa použije primárna knižnica určená na posilnenie PCR premenlivých oblastí imunoglobulinu. Priméry redundantnej premenlivej oblasti končia na počiatku lídru. Reverzné priméry konštantnej oblasti končia 30 bp v konštantnej oblasti. Priméry sú označené terminálom Sal I alebo Xma I reštrikčných miest na klonovanie. Získajú sa pro dukty PCR očakávanej veľkosti (420 až 450 bp) (Jones a Bendig, 1991), klonujú sa a sekvenujú sa (obr.l7). Dĺžka ľahkého reťazca variabilnej oblasti imunoglobulinu 17E6, VL17E6 je 381 bp. Dĺžka variabilnej oblasti ťažkého reťazca 17E6, VH17E6 je 411 bp. Variabilné sekvencie ťažkého reťazca sú charakterizované imunoglobulínmi Kabátovej skupiny 11b a sekvencie ľahkého reťazca sú charakterizované imunoglobulínmi Kabátovej skupiny V. (Kabát a kol. 1987). Klonovacia stratégia je naznačená schematicky na obr. 18.

Progres nádoru a metastázy je klasickým ochorením, kedy sa bunky vymknú normálnym rastovým a adhéznym kontrolám a opustia, migrujú, pripojujú sa a rastú na nesprávnom mieste. Teraz sa pozná to, že integríny ovládajú mnohé adhézne okolnosti a adhézia môže mechanicky regulovať vzájomne previazané okolnosti vrátane rastu, diferenciácie, pohybu buniek a aktivity proteázových sietí vývojových okolností, ktoré sú repetované do metastatickej kaskády (Liota a kol. 1991; Stetler Stevenson a kol. 1993; Fidler, 1988).

V tejto štúdii sa opisujú protilátky zamerané proti integrínom aV série, z ktorých jedna, 17E6 narušuje pôvodné pripojenie buniek, pretrháva stabilné aV-ligandové interakcie a interferuje s vývojom ľudského melanómu v zvieracom modele in vivo (Fidler, 1986).

V biochemických analýzach ukázali protilátky skupiny α-V reakčné obrazce veľmi blízke k LM142, čo je dobre definovaná protilátka ľudskej αν, líši sa však od reakčných obrazcov avft3-špecifickcj (LM6O9) a ανβ5- špecifickej (P5H9) a od iných definovaných anti-integrínových protilátok. Protilátky skupiny α-V preto pravdepodobne rozpoznajú ľudský reťazec aV. Klonovanie cDNA imunoglobulínu 17E6 transkribuje prejavené jedinečné nepochybné sekvencie. Sekvencie ťažkého reťazca sú charakterizované imunoglobulinmi Kabátovej skupiny Ilb a sekvencie ľahkého reťazca sú charakterizované imunoglobulínmi Kabátovej skupiny V (Kabát a kol., 1987). Protilátka je preto jednoznačne definovaná.

17E6 silne narušuje bunkové interakcie sprostredkovávané aV. Na pochopenie funkcie integrínov boli rozhodujúce protilátky, ktoré narušujú funkciu, ale aV-oblasť nemala mocnú, pre triedu špecifickú, protilátku. 17E6 blokuje aV-sprostredkované spojenie buniek s IC₅₀ približne 0,3 až I nM (protilátka MW 150 000); na porovnanie peptidický blokátor GRGDSPK má IC₅₀ približne 5 nM. Línie buniek expresujúce hlavne ανβ3 (WM793) alebo ανβ5 (UCLAP3) sú blokované 17E6, ako je tomu pri bunkách expresujúcich hlavne ανβΐ. 17E6 je preto generálnym inhibítorom av-integrínov.

17E6 nielenže bráni počiatočnej interakcii av-integrínov s ich ligandami, ale spôsobuje tiež retrakciu dobre ustálených interakcií buniek pripojených k vitronektínu. Interakcie ανβ3 s vitronektínom boli opísané ako „nedisociovateľné“, prebiehajúce v dvoch krokoch, s počiatočnou blokovateľnou interakciou, za ktorou nasledujú rýchle stabilizačné reakcie (Orlando a Cheresh, 1991). Na rozdiel od toho spôsobuje 17E6 rýchlo retrakciu a čiastočné oddeľovanie M21 a mnohých iných buniek (nepublikované poznatky) z vitronektinových substrátov. Zaokrúhľovanie sa reverzuje, keď sa protilátka odstráni. Počiatočné pripojenie M21 na vitronektín je nedokonale blokované (približne z 90 %) pôsobením 17E6, ale jeho zaobľovací účinok postihuje v podstate všetky pripojené bunky. Mohli byť potvrdené skoršie štúdie, kde počiatočné pripojenie M21 k vitronektínu bolo plne blokované zmesami protilátok antiανβ3 a anti-avP5 a peptidmi RGDS, čo znamenalo, že sa to týkalo tak ανβ3, ako ανβ5 (Wayner a kol., 1991). Ako sa ukázalo v tejto štúdii, blokuje 17E6 niekoľko av-receptorov a môže reverzovať stabilné interakcie nimi sprostredkované. Rozdiel v pôsobení 17E6 na pripojené a pripojované M21 bunky môže spočívať v rozdielnej funkcii a umiestnení ανβ3 a ανβ5 v každej situácii. Pri pripojovaní buniek sú obidva difúzne rozdelené, zatiaľ čo v pripojených bunkách sa zisťujú vo fokálnych kontaktoch ανβ3 a ανβ5 je difúzne rozdelený (Wayner a kol., 1991; Zambruno a kol. 1993). Skúmalo sa ďalej, či 17E6 selektívne rozrušuje jeden z týchto kontaktov.

Rast nádorov M21 v holej myši závisí silne od aV-integrinov (Felding-Habermann a kol. 1992; Sanders a kol., 1992). Pretože 17E6 mohol modulovať stabilnú interakciu aV-ligandov a mal dlhotrvajúci účinok, skúmalo sa jeho pôsobenie na vývoj nádorov. Zistilo sa, že 17E6 blokuje vývoj subkutánnych nádorov M21 v holej myši, čo silne podporilo štúdie Feldinga, Habermanna a kol. Okrem toho sa dalo dokázať, že αν tiež podporuje a 17E6 inhibuje vývoj na experimentálnych metastázach pľúc. Tento vynález preto nezávisle potvrdil skoršiu významnú štúdiu a rozšíril ju pomocou syn-génickej protilátkou sprostredkovanej „terapie“ pôsobením 17E6. Tieto výsledky zdôrazňujú význam aV-integrínov vo vývoji nádoru M21 a eliminujú možnosť, že skoršie výsledky vznikli ako artefakty selekcie klonovania.

Pôsobenie 17E6 in vitro pokračuje počas viacej ako 24 hodín s následným preplachom. Pri objemu myši 20 ml je koncentrácia počiatočnej protilátky in vivo približne 10 nM, čo je rádovo nadbytočné proti IC₅o na reverzovanie interakcie bunka - ligand v kultúre. 17E6 je syngénický pre ošetrované zviera, BALB/C nu/nu a polčas života lgGl myši je 20 až 200 hodín (Tao a Morrison, 1989; Haba a kol, 1985). Preto IC₅₀ na reverzáciu interakcie M21-ligand sa mohlo v tomto modeli zvýšil o najmenej 100 hodín (5 polčasov života). Je zaujímavé porovnať 17E6 s peptidmi RGD. V modeli myšieho melanómu B16F10-C57blk6 spoločne injektované peptidy inhibujú vývoj pľúcnych nádorov B16-F10 (Humphries a kol., 1986; Hardan a kol. 1993). Pri rovnakom predpoklade ako pre 17E6, je prítomných približne 100 μΜ peptidov RGD (Hardan a kol., 1993) približne o dva rady nad dávkou potrebnou na blokovanie pripojenia buniek na vitronektín. Ale RGDS má sérový polčas života 8 minút (Humphries a kol. 1988). Ako všeobecný terapeutický cieľ by mohlo byť výhodné vytvoriť dlhodobé blokátory na potlačenie vývoja nádorov.

Akým spôsobom môže 17E6 ovplyvniť vývoj nádoru? Pretože nereaguje s myšími bunkami, pôsobenie na nádorové bunky a zrejmé účinky protilátky na nádorovú angiogenézu môžu byť vylúčené (Brooks a kol. 1994). Jedinými účinkami 17E6, ktoré je možné identifikovať sú: a) jeho väzba na extracelulámu oblasť aV-integrínov, b) jeho schopnosť narušovať aV-sprostredkované bunkové interakcie. Dá sa predpokladať, že bola eliminovaná väčšina zdrojov protilátkou sprostredkovaného zabíjania holej myši. 17E6 neovplyvňuje chronicky ani akútne rast a životnosť buniek M21, nesprostredkovaná komplementárnu fixáciu, neovplyvňuje syntézu DNA a nesprostredkováva syngénickú makrofágom vyvolávanú cytotoxicitu. Bunky M21 sú citlivé na ADCC, pretože boli účinne zabíjané mikrogliálnymi bunkami v prítomnosti Mab 14.18 G2a. MAb lgGl (podobne ako 17E6) efektívne sprostredkujú myší makrofág ADCC (Herlyn a kol. 1985). Počet miest ανβ3, expresovaných na bunku, môže byť pod kritickou hranicou pre výskyt ADCC. Skoršie štúdie ukázali, že účinnosť ADCC koreluje s hustotou cieľového antigénu (Rodeck a kol. 1985). Makrofágy na rozdiel od iných myeloidov alebo lymfocytických efektorových buniek expresujú všetky tri triedy Fcgama receptorov. Údaje argumentujú proti ADCC ako mechanizmu vysvetľujúcemu inhibíciu nádorového rastu pozorovaného in vivo s 17E6. Protilátka je zbavená endotoxínu. Nemôže byť vylúčené, že zabíjanie sprostredkované NK-bunkami je aktivované 17E6, ale v prípade, že je tomu tak, je podstatne menej aktivovaný syngénickými riadiacimi protilátkami s izotypom, ktoré byli použité.

17E6 preto pôsobí pravdepodobne zhoršovaním funkcie αν-integrínov. Funkcie, ktoré môže 17E6 blokovať a kde sa môže podieľať αν zahŕňa adhéziu buniek, interakciu s rozpustnými matričnými zložkami (Seftor a kol. 1992), moduláciu inhibítorovej siete proteáza/proteáza (Gehlsen a kol. 1992; de Boer a kol. 1993; Preiss-ner, 1991), podporovanie pohybu buniek (Seftor a kol. 1992; Gehlsen a kol. 1992) alebo ovplyvňovanie intemalizácie receptorov (Wickham a kol. 199 3; Panetti a McKeown Longo, 199 3a; Panetti a McKeown Longo, 1993b), ale ktorý z týchto vplyvov je zúčastnený, pokiaľ vôbec niektorý, to bude predmetom ďalšieho bádania.

Blokujúci účinok 17E6 na ανβ3, nie však na ανβΐ a ανβ5 vyžaduje dimerizáciu cieľa. I keď sú monovalentné a divalentné fragmenty protilátky 17E6 rovnako aktívne vo väzbe ανβ3 integrínu v ELISA a v blokovaní bunkovej adhézie sprostredkovanej ανβΐ a ανβ5, sú proti ανβ3 monovalentné fragmenty takmer neúčinné. Navyše, keď sa pridajú k monovalentným fragmentom zosieťujúce protilátky, získajú opäť schopnosť blokovať ανβ3 sprostredkovanú adhéziu a pri tom majú klasický prozónový efekt. Samotné zosietenie ανβ3 však nestačí na blokovanie aktivity, pretože zosietenie AP3 neúčinkuje na adhéziu sprostredkovanú ανβ3: AP3 viaže reťazec β3 (pozri obr. 2B:e).

Prechod od monovalentnej k bivalentnej interakcii spôsobuje ostrý nárast afinity protilátky k jej cieľu (Lane a Harlow, 1988). Titrácia ELISA 17E6 na izolovanom ανβ3 tento prechod neukáže a naznačuje preto, že v tejto konfigurácii sa vyskytuje monovalentná interakcia tak s monovalentnými, ako divalentnými elementmi 17E6. V testoch ligand-viazajúcich receptorov, ktoré používajú rovnaké usporiadanie ELISA, je 17E6 prekvapivo slabým blokujúcim činidlom, v porovnaní s peptidickými ligandovými mimetikmi EMD662O3:cRGDFv. Na uvedenie do kontextu: zatiaľ čo cRGDfV získava 2 až 3 rady v aktivite (IC₅o od približne 1 μΜ do približne 1 nM) pri prechode od bunkového testu k izolovanému receptorovému testu, 17E6 stráca najmenej 3 rady zdanlivej aktivity (IC₅₀ od približne 100 ng mľ¹ do > 100 pg mľ¹) a stáva sa v podstate neaktívnym.

Táto anomália a relevancia údajov zosieťovania bunkovej protilátky bola vyriešená konkurenčnými experimentmi. Tie naznačujú, že 17E6 na rozdiel od peptidických blokátorov neinterferuje priamo s miestami viažúcimi ligand. Pokiaľ nie je priamy výskyt, predpokladá sa obyčajne, že blokujúce činidlo funguje stérickou okluziou ligand-receptorových interakčných miest, čo je názor zhodnotený v integrínovej oblasti ligand-aktívnymi miestnymi mimetikmi ako sú RGD-obsahujúce peptidy (Hynes, 1992) a ligandovou inaktiváciou spôsobenou mutagenéziou tohto miesta vo vitronektíne (Chemey a kol., 1993). Teraz zistené údaje silne naznačujú, že pri mocnej blokujúcej protilátke 17E6 tomu tak nie je. V súhme: pri ανβ3 integríne a) si ligandové mimetické peptidy navzájom konkurujú a konkurujú ligandom samotným, b) Iigandy konkurujú peptidom, c) ani peptidy, ani Iigandy nekonkurujú väzbe 17E6, d) 17E6 nekonkuruje ligandovej alebo ligand-mimetickej väzbe, e) 17E6 je plne konkurujúci sám sebe a iným av-väzbovým protilátkam.

17E6 je extrémne slabým konkurentom pre ligandovú väzbu na ανβ3, zatiaľ čo vitronektin a vzorky aktívnych miest založených na RGD si silne konkurujú navzájom a s receptorom. A ostatné protilátky konkurujú silne 17E6. 17E6 preto pôsobí ako alosterický inhibítor. Zosieťovacie pokusy ukazujú, že ανβ3 musí byť dimenzovaný, kým môže 17E6 blokovať, nie tak ανβΐ a ανβ5. Tento objav ukazuje, že 17E6 funguje novým mechanizmom zahŕňajúcim manipuláciu s integrínom navodenými signálnymi transdukčnými cestami skôr ako prostým antagonizovaním interakcií integrín-ligand.

Pretože Iigandy ανβ3 sú homopolyméry v svojom aktívnom tvare a sú inaktívne ako monoméry, (Preissner, KT, 1991; Stockmann, A. a kol., 1993), môže byť multimerizácia integrínov substrátom nevyhnutná pre ich funkciu a skutočne dimerizácia kináza-receptorového tyrozinu rodiny receptora rastového faktora Iigandy je kľúčovou okolnosťou v iniciácii signálnej transdukcie (Dougall, WC a kol. 1994). Intuitívne je zrejmé, že stereochémia polymérového substrátu sa stane rozhodujúcou v orientovaní integrínov v membráne a určujúcou v tvorení signálneho komplexu. Z tejto zábrany môže povstať biologická „logika“ multimérického vitronektínu pre adhéziu buniek. Vitronektínové multiméry majú veľkosť 3 až 16 jednotiek (Stockmann A. a kol., 1993) a dá sa predpovedať vytvorenie usporiadaných radov integrínov na povrchu buniek a nutne zlepšená afinita multimérickými interakciami. Individuálna životnosť interakcie monomémeho vitronektínu-avP3 je krátka a afinita nízka, zatiaľ čo rotácia neligovaného integrínu v rovine membrány je rýchla a protilátková afinita je vysoká. Dá sa preto predpovedať, že divalentné protilátky, spojené s jedným integrínom na povrchu bunky, môžu zachytávať disociované integriny pri rotácii a pohlcovať ich v konformácii, ktorá nemôže viazať ligand. To spôsobuje progresívne oslabovanie molekulového radu ανβ3 a vitronektínových väzieb a destabilizuje interakciu bunka-vitronektín - ako by sa odlupovala molekulárna prilípavá časť („velcro“). To môže vysvetľovať nedostatok funkcie 17E6 v receptorových testoch, kde receptor nemôže rotovať v potrebnej orientácii pre získanie divalentnej väzby (zrejmé z údajov ELISA) a jeho účinnosť v bunkovom teste, vysvetľovať pozorovanú chýbajúcu potrebnosť konkurencie pre aktívne miesto v bunkovom teste a vysvetliť neúčinnosť fragmentov F(ab') v blokovaní adhézie k bunkám sprostredkovanej ανβ3.

Implicitne je tiež zrejmé, že pretože ανβ5 a ανβΐ (ανβ6, ανβ8 a ανβΐ) vytvárajú prekrývajúce sa ligandové spektrum s ανβ3, je mysliteľné, že navzájom riadia svoje funkcie, spôsobom priamo analogickým vzájomnej regulácii heterodimerizácie receptorov v rodine rastových faktorov RTK (Dougall, WC a kol., 1994). Napríklad ανβ5 tým, že má k vitronektínu väčšiu afinitu ako ανβ3, môže konkurovať, s väzbovými miestami ανβ3 na individuálnych multiméroch tohto substrátu, pričom zamedzuje homodimérom ανβ3 potrebným na vytvorenie signálu, alebo uchovanie adhézie k bunkám tým, že ich nahradí heterodimérmi ανβ5-ανβ3. Ostatné αν-integríny môžu fungovať podobným vzájomne sa regulujúcim spôsobom, overené údaje na potvrdenie tejto teórie však chýbajú.

Bol teda vytvorený sled monoklonálnych protilátok proti reťazcu ľudského aV-integrínu. Jedna z nich, 17Ľ6, jednak blokuje, jednak reverzuje aV-sprostredkované procesy in vivo. Je zaujímavé, že tiež blokuje vývoj menalómu závisiaceho od α V v holých myšiach. To naznačuje, že uV

-integríny môžu byť účinnými kandidátmi v liečení nádorov. Keď bol tento rukopis pripravovaný, opísal Lehmann a kol. (Lehmann a kol. 1994) αν-špecifické protilátky s niektorými vlastnosťami príbuznými 17E6. Bude zaujímavé sledovať, či bude tiež schopný reverzovať av-sprostredkované interakcie a narušovať vývoj menalómu.

Terapetické a diagnostické využitie

Protilátka podľa vynálezu sa môže podávať ľuďom na účely liečby. Preto sa vynález tiež týka farmaceutického prostriedku, obsahujúceho ako účinnú látku aspoň jednu protilátku alebo protilátkový fragment definovaný spolu s jedným alebo s niekoľkými farmaceutický vhodnými nosičmi, excipientmi alebo riedidlami. Spravidla sa protilátka podľa vynálezu podáva intravenózne vstrekovaním alebo parenterálne. Všeobecne sa podáva dostatočne veľká dávka protilátky (alebo jej fragmentu) na dosiahnutí žiadaného potlačenia alebo rozrušenia nádoru. Taká dávka závisí od veku, od podmienok, od pohlavia a od rozsahu ochorenia a môže byť 0,1 mg/kg až 200 mg/kg, výhodne je 0,1 mg/kg až 100 mg/kg. Účinná látka sa podáva raz alebo niekoľkokrát denne a buď vo forme jednej dávky, alebo niekoľko dní.

Prostriedky na parenterálne podanie zahŕňajú sterilné vodné alebo nevodné roztoky, suspenzie alebo emulzie. Ako príklady ne vodných rozpúšťadiel sa uvádzajú propylénglykol, polyetylénglykol, rastlinné oleje napríklad olivový olej, a vstrekovateľné organické estery napríklad etyloleát, pričom sú vhodné tiež iné rozpúšťadlá, známe v odbore na tento účel. Protilátky podľa vynálezu sa môžu používať: vo forme farmaceutického prostriedku obsahujúceho fyziologicky vhodný nosič. Ako príklady takých fyziologicky vhodných nosičov sa uvádzajú roztok chloridu sodného, PBS, Ringerov roztok alebo laktátovaný Ringerov roztok. Farmaceutický prostriedok môže obsahovať tiež konzervačnú prísadu a iné ďalšie prísady, ako sú antibiotiká, antioxidanty a chelatačné činidlá.

Protilátka (alebo jej fragment) sa tiež môže konjugovať známymi spôsobmi na cytokíny napríklad IL-2 k podpore svojej cytotoxicity.

Farmaceutické prostriedky podľa vynálezu sú vhodné na ošetrovanie nádorov všetkých druhov, vrátane melanómu, glioma a karcinómu a tiež nádorov obehového systému a pevných nádorov.

Na diagnostické účely sa protilátka podľa vynálezu môže konjugovat napríklad na rádioaktívne farbivo alebo sa môže rádioaktívne značiť. Výhodným spôsobom značenia je spôsob „lodogen“. Výhodne sa protilátka podáva na diagnostické účely ako scFv fragment. Tak sa dosahujú lepšie výsledky, takže substrakcia pozadia nie je nutná.

Nasledujúce tabuľky sú podrobne vysvetlené na str. 4.

Tabuľka I

Reakčný obrazec MAbs v ELISA a CELISA

ANTISODY	IMMUNO GEM	ISOTVF	αΆ3	UMM	M21 M21-L	M214-· II b	LÍCIA -PJ	SPECIF1CΠΎ
1ZE6	avB3	IgGIA					*	cV
20A5	M21	IgGIA		-	*		4	uV
23G5	M21	IgGI/x			-		*	«V
14D9.FB	M21	IgGI/K					♦	cV
10C2	M21	tgGVtt			*		*	aV
14E2	M21	IgGIK:			+			200 KDa
21H6	M21	lgG2a/»t			*			200 KDa
LMČC9		lgGI/κ			+·			aVJ3
LM142		lgG1/K					4	cV
PSHS		lgGI/κ			-			ovftS
CP8		IgGUvt		*				alib53
PÍC10		ΙςΟΙ/κ			*	-	*	01
AP3		IgGIA-			*	4		C3

Tabuľka II

Zhrnutie monoklonálnej protilátkovej reaktivity v prietokovej cytometrii

		M21-L	M214. (p}	M21- l-llb	M21- 14	M21- 112	UCLA- F3	WM793
Antibody	tpecificity
αν53; ανβ5	Tu)3'	ΤΞϊβ-	olIbOJ	ανβ3; avtó		av35	avG3; avSS
17E6 20A9 23G5 14O9.F8 14E2	αν αν αν ŽOOKOa	+ ♦ + + ♦ +++ ** .-.++. ♦♦+ +++ *+ --.++- ♦♦+ +++
LM509 LM142 P5H9 P4CI0 AP3 CP3	ανβ3 αν ανβ5 βΐ β3 α1!0β3	*++ ---*+.+ + ,++

antibody = protilátka spccificity = špecificita

Tabuľka III

Inhibícia vývoja M21 nádoru (tumor foci) prostredníctvom 17E6 Mab v prípade pľúcnej kolonizačnej experimentálnej metastázovej skúšky myši BALB/C nu/nu

Bunky a Úbytok Počet tumoru foci %

ošetrenie	nádoru	Stred	+	SEM	Medián	Rozsah	kontrola
M21 (kontrola)	99	87		110	30	(3-378)	100
M21 + 17E6	78	8	i	7,7	5	(0-21)	9
M21-L	56	19	+	22	8,5	(0-60 J	22*

* = porovnané s kontrolou: žiadna závislosť od protilátky. Vynález objasňujú, žiadnym spôsobom však neobmedzujú nasledujúce príklady praktického rozpracovania.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Materiály

Zvieratá

Ako myši na produkciu protilátky (samička BALB/c, 8 týždňov stará) a pre nádorové modely („holá myš“, samička homozygotická atymická BALB/c nu/nu, 4 až 5 týždňov stará) sa používajú myši od Criffa (Barcelona Španielsko). Holá myš sa udržuje v sterilnej miestnosti v mikroizolátorovej klietke a má k dispozícii sterilizovanú potravu a vodu podľa potreby. Všetky manipulácie sa vykonávajú v zariadení s laminámym prietokom.

Proteíny

Fibronektín (Ruoslahti a kol., 1982), vitronektín (Yatohgo a kol., 1968) sa získa z čerstvo zmrazenej ľudskej plazmy a fibrinogén (Kazal a kol., 1963) z krvi ako celku. Laminin sa získa z Engelbreth-Holm-Swarmových myších nádorov (Paulsson a kol., 1987). Pokiaľ nie je uvedené inak, vykonávajú sa všetky manipulácie pri teplote 20 °C a všetko premývanie pomocou PBS bez vápnika a horčíka („PBS“: 137 mM chloridu sodného, 2,8 mM chloridu draselného, 8,1 mM dinátriummonohydrogenfosfátu, 1,5 mM monokálium-dihydrogenfosfátu, hodnota pH 7,4). PBS++ je PBS s pridaným 1 mM chloridom horečnatým a 1 mM chloridom vápenatým. Pokiaľ nie je inak uvedené, používajú sa chemikálie najvyššej dostupnej čistoty (Merck KGaA, Darmstadt). Cyklické peptidy napríklad cRGDíV a cRGDfK sa syntetizujú známymi spôsobmi (napríklad FEBS Let. 291, str. 50 až 54, 1991). Lineárny peptid GRGDSPK, ktorý sa používa ako porovnávacia zlúčenina, je obchodne dostupný (napríklad ako produkt spoločnosti Bachem, Švajčiarsko).

Nádorové bunky a kultúry

Americká organizácia Američan Type Culture Collection (ATCC) dodáva SW1116, HT29 ľudský karcinóm a A375 ľudský melanóm a nasledujúce bunkové rady sú darmi kolegov: M21 malanóm, jeho varianty M21-L a M2I-L4 (Cheresh a Spiro, 1987), M21-L-Ilb (pripravené podľa Kieffera a kol., 1991) a UCLA-P3 ľudský pľúcny adenokarcinóm (Ceresh a kol., 1989) (Dr. D.A. Cheresh, Scripps), WM793 a WM164 melanóm (Dr. M. Ilerlyn, Wistar) (Herlyn a kol., 1990). NP18, karcinóm pankreasu (Dr. G. Cappella, Hospital Sant Pau, Barcelona). B16F10 myší melanóm od Dr. I. Fidlera (Poste a kol., 1980) (Dr. S. Aliňo, University of Valencia). EMM31 je preukázateľný v našej skupine z nádorovej vzorky podľa štandardných histologických kritérií ako primárny melanóm (Jôggle a kol., nepublikované pozorovania). Všetky bunky sa kultivujú pri teplote 37 “C v prostredí obsahujúcom 7,5 % oxidu uhličitého a 92,5 % vzduchu v 90 % RPMI 1640, 10 % zárodočného teľacieho séra (FCS) plus 2 mM L-glutamínu a sú zbavené mykoplazmy podľa patentovaného testu (Mycotect Kit, Gibco).

Protilátky

Monoklonálne protilátkové (MAb) fúze, ELISA skríning, subklonovanie a udržiavanie kultúr sa vždy uskutočňuje známymi spôsobmi (Harlow a Lane, 1988), pokiaľ nie je inak uvedené.

Príklad 2

Imunizácia

MAb proti ανβ3 sa produkuje intraperitoneálnou (ip) injekciou čistenej placentámej ανβ3 imobilizovanej na Sepharose (80 pg ανβ3 na 80 pl Sepharose v 200 pl PBS) alebo živých M21 buniek (1 x 10⁶ buniek v 0,5 ml PBS) každé dva týždne počas dvanástich týždňov. Štyri dni po poslednom vstreknuti sa vykoná PEG navodená fúzia pri použití Friendly Myeloma (Ventrex) ako partnera. Protilátky k 200 kDa melanómu asociovanému povrchovému proteínu sa produkujú imunizáciou nedotknutých M21 buniek (1 x 10⁶ buniek v 0,5 ml PBS).

Skrlning

Používa sa ELISA na receptoroch a na fixovaných M21 bunkách. Pre receptor ELISA sa potiahnu 96 jamkové ELISA doštičky (Dyna-tech) čisteným av(3 3 (1 pg/ml v PBS, 16 hodín pri teplote 4 °C), blokujú sa (1,5 % odstredené mlieko v PBS, 1 hodina pri teplote 4 °C) a inkubujú sa supematanty hybridómu. Zistia sa viazané imunoglobulíny alkalickým fosfatázovým konjugátom pritimyšieho lg (Dáko) pri použití p-nitrofenylfosfátu ako substrátu. Pre celulámu ELISA, M21 alebo M21-L, M21LIIb alebo UCLAP-3 bunky sa fixujú na 96 jamkovej tkanivovej kultivačnej doštičke (4 % para-formaldehydu v PBS, 15 minút, teplota 20 °C) a blokujú sa (3 % BSA, PBS, 1 hodina, teplota 4 °C) pred inkubáciou so supematantmi hybridómu a detektujú sa ako v receptore ELISA. Pozitívne hybridy sa subklonujú trikrát limitujúcim riedením a prispôsobia sa prostrediu RPMI. Stanoví sa imunoglobulínový izotyp pri použití pro tilátok s ťažkým reťazcom špecifických pre podtriedu (Zymet) alebo protilátok s ľahkým reťazcom (Promega).

Iné myšie MAb, použité pri štúdii, sú kolegiálnym darom LM6O9 k ανβ3 a LM142 k αν (Cheresh a Spiro,

1987) (Dr. D.A. Cheresh, Scripps), P4C1O k βΐ integrínu (Carter a kol., 1990) (Telios) a P5H9 k ανβ5 integrínovému komplexu (Wayner a kol., 1991) (Dr. E. Wayner, University of Minesota). CP8 k allbvp3 komplexu (Dr. Ruggieri, Scripps), AP3 k β3 reťazcu (Furihata a kol., 1987) (ATCC), 9.2.27 protimelanóm bunkovému povrchovému proteoglykánu (Harel a kol., 1990) (Dr. R. Reisfeld, Scripps) a 14.18 G2a proti gan-gliozidu GD2 (Mujoo a kol., 1989).

Príklad 3

Čistenie a odlupovanie protilátky

Na čistenie vo veľkom meradle sa supematanty protilátky zhromaždia z exponenciálneho fázového kultivačného rastu v bankách („roller bottle“). Protilátky sa čistia na proteínovej A-Sepharose CL-48 (Pharmacia), dialyzujú sa proti PBS pred sterilnou filtráciou (0,45 p.m) a skladovaním pri teplote -70 °C (Harlow a Lane, 1988). Čistené protilátky sa zbavia endotoxínov vedením cez Kurimnover-II stĺpce (Kurita-Vater, Tokyo). Tak sa zníži koncentrácia endotoxinu z viacej ako 250 IJ endotoxínu v mg’¹ protilátky na menej ako 0,2 IJ mg pri Limulusovej skúške (Melvaer a Fystro, 1982). Fragmenty 17E6 F(ab'b a F(ab)' (myší lgG|) sa pripravia známym spôsobom štiepenia pepsinu a delenia na stĺpcoch proteínu A (Pharmacia) s následným papaínovým štiepením a separáciou gélovou filtráciou (Harlow a Lane 1988).

Čistenie avB3 a ct!IbB3 integrínu

Získa sa ανβ3 z ľudskej placenty (Smith a Cheresh,

1988) . Placenta sa rozkrája a premyje v približne dvoch objemoch ľadového roztoku A (0,05 % [hmotnosť/objem] digitonínu, 2mM chloridu vápenatého, 2mM PMSF, hodnota pH 7,4) a sfiltruje sa. Zadržaný materiál sa extrahuje do približne štyroch objemov studeného tlmivého roztoku B (100 mM oktyl-B-D-glukopyranozidu [OG], 1 mM chloridu vápenatého, 2 mM PMSF, v PBS) a odstred’uje sa (12000 gmax, 45 minút, 4 °C). Supematant sa recirkuluje cez LM609 stĺpec protilátky (16 hodín, 4°C). Po premytí tlmivým roztokom C (0,1 % NP-40 v PBS, približne 10 cv) a tlmivým roztokom D (0,1 % NP-40, 2 mM chloridu vápenatého, 10 mM octanu sodného, hodnota pH 4,5, približne 10 cv), sa viazaný materiál eluuje tlmivým roztokom E (tlmivý roztok D nastavený na hodnotu pH 3,1). Eluát sa neutralizuje 3M Tris(hodnota pH 8,8), dialyzuje sa proti tlmivému roztoku C a koncentruje sa približne 10 x pri použití Aquacidu II (Calbiochem). Čistený receptor sa skladuje pri teplote -70 °C.

Z ľudských doštičiek sa pripraví αΙΙβ3 (Pytela a kol., 1986). Prešlé koncentráty doštičiek sa zmiešajú s jedným objemom tlmivého roztoku Tyrodes, peletujú sa (1200 gmax) a peleta sa extrahuje (počas jednej hodiny, 20° C) s lýzovacím tlmivým roztokom (50 mM OG, 1 mM chloridu horečnatého, 1 mM chloridu vápenatého, 1 μΜ chloridu mangánatého, 2 mM PMSF, 150 mM chloridu sodného, 50 mM Tris-HCl, hodnota pH 7,4) . Po odstredení (3 2000 gmax, 30 minút, 4 °C) sa supematant recirkuluje (16 hodín, teplota 4 °C) cez GRGDSPK konjugovanú CL-4B Sepharosovú kolónu. Kolóna sa premyje lýzovacím tlmivým roztokom (približne 10 cv) a eluuje sa GRGDSPK (3 mg mľ¹ v 90 % lýzovacieho tlmivého roztoku, 10 % dimetylsulfoxidu). Pik sa koncentruje pätkrát, dialyzuje sa proti modifikovanému lýzovaciemu tlmivému roztoku (0,1 % NP-40 miesto OG) a uloží sa pri teplote -70 °C. Integrínové preparáty majú čistotu približne 98 % podľa antiintegrínovej ELISA pri použití a a β reťazcov špecifických monoklonálnych protilátok a SDS-PAGE.

Príklad 4 Povrchové značenie a imunocharakterizácia Bunková povrchová biotinylácia a extrakcia

Bunky v exponenciálnom raste sa zhromaždia pri použití EDTA, premyjú sa a 5 x 10⁶ buniek v PBS (1 ml), povrchovo sa značia biotín-N-hydroxysukcínimidoesterom (10 pg/ml, Sigma) na nekonečnom rotátore (2 hodiny, 20 °C), premyjú sa a 5 x 10⁶ buniek na mililiter sa lýzuje počas jednej hodiny pri teplote 20 °C v extrakčnom tlmivom roztoku (100 mM OG 2 mM chloridu vápenatého, 1 mM chloridu horečnatého a 1 mM PMSF v PBS). Po odstredení (12000 g, 20 minút) sa použije supematant pre imunoprecipitáciu.

ímunoprecipitácia

Biotinylované bunkové extrakty sa imunoprccipitujú čisteným antiintegrínom Mab kopulovaným s guľôčkami Affigelu-10 (Biorad) alebo viazanými na proteín-G Sepharosu (Pharmacia). Inkubuje sa 10 mg kopulovaného MAb s 5E6 bunkovými ekvivalentmi biotinylovaných bunkových extraktov cez noc pri teplote 4 °C. Premyté guľôčky sa varia v neredukčnom SDS vzorkovom tlmivom roztoku, odstredia, sa štiepia sa na 7,5 % SDS-PAGE. Po elektroforetickom prenose na nitrocelulózu (Towbin a kol., 1979) sa pruhy zviditeľnia kozím anti-biotín alkalickým fosfatázovým konjugátom (Dáko) pri použití NBT-BCIP (Biorad) ako substrátu.

Prietoková cytometria

Bunky sa zhromaždia pri použití EDTA, premyjú sa a 10⁶ buniek v PBS-1 % BSA sa inkubujú s MAb (10 pg ml¹, 20 minút, 4 °C). Po premytí a značení (20 minút, 4 °C) s kozím anti-myším lg-FITC (Becton Dickinson) sa bunky inkubujú s propidiumjodidom pred analýzou prietokovou cytometriou (EPICS Profile II, Coulter). Živé bunky sa oddelia vhodným spôsobom na stranu a vopred sa rozmelnia. Excituje sa fluorescín pri 480 nm s argónovým iónovým laserom a zaznamená sa emitovaná fluorescencia (525 nm). V niektorých skúškach sa M21-L bunky zafarbia po krátkej fixácii a po permeabilizačnom stupni (70 % etanol, 5 minút x -20 °C).

Od komplementu závisiaca cytotoxicita (CDC)

Bunky M21 (10000) sa nanesú na 96 jamkovú doštičku s 50 μΐ kompletného prostredia a s 20 μΐ protilátok. Ako zdroj komplementu sa pridá králičie sérum (50 μΐ, 1 : 5, Behring) a doštičky sa inkubujú (teplota 37 °C, 60 minút). Lýza sa kvantifikuje technikou MTT (Mosmann, 1983). Percento lýzy sa vypočíta pri použití jamiek s 1 % Tween-20 ako 100 % kontrola lýzy a bez protilátky ako 0 % kontrola lýzy.

Príklad 5

Rast buniek, životnosť a aktivácia

Skúšky proliferácie: Na testovanie chronického pôsobenia protilátok sa inkubuje 10⁶ buniek v prítomnosti MAb (70 gq mľ¹ PBS, 1 hodina, teplota 20 °C na nekonečnom rotátore, premyje sa a resuspenduje sa a ďalej sa kultivuje v prostredí RPMI. Rast a životnosť sa stanovuje vylučovaním trypánovej modrosti. Aktivácia sa meria MTT opísanou skúškou, a počet buniek sa vypočítava denne pri použití počítača buniek (Coulter electronics).

Detektujú sa prilipnuté bunky melanómu (systém 0,05 % trypsín/0,02 % EDTA). Premyté bunky sa očkujú do 96 jamkovej mikro-testovacej doštičky s plochým dnom (1 x 10⁴ buniek na jamku) a kultivujú sa bez prítomnosti (kontrola) alebo v prítomnosti sériovo riedených protilátok v RPMI prostredí s 10 % FCS. Po 48 hodinách sa bunky pulzačne značia počas 18 hodín (18,5 kBeq [³H]tymidínu na jamku) a zhromaždia sa. Vnesená rádioaktivita sa meria vyjadruje sa ako počet signálov za minútu.

Príklad 6

Skúška protilátkou riadenej bunkovej cytotoxicity (ADCC)

Príprava BALB/C mikrogliálnych buniek a podmienky pre ADCCC a pre cytostázu sprostredkovávanú protilátkovou efektorovou bunkou (AECM) sa vykonáva v podstate ako je to opísané (Sutter a kol., 1991). Bunky M21 sa pulzujú počas 18 hodín [’HJtymidínom (18,5 kBq na 4 x 10 buniek na jamku) a inkubujú sa na 96 jamkových doštičkách s BALB/C mikroglia (5 x 10⁴ na jamku) v 200 μΐ DMEM/FCS (10%) v prítomnosti protilátky. Po 48 hodinách [³H] sa meria značenie zotrvávajúce v nukleárnej oblasti štítových buniek. MAb závislá cytotoxicita sa vypočíta pri použití vzorca:

[(experimentálna ccpm - spontánna ccpn)/ (maximálna ccpm - spontánna ccpm)] x 100

Príklad 7

Od protilátky a od efektorovej bunky závislá cytostasis (AECM)

Postupuje sa rovnako ako v prípade ADCC, používajú sa však miesto pulzovaných buniek čerstvo pasážované neznačené M21 bunky. Po 24 hodinách sa efektorové štítové bunkové kokultúry pulzujú s [³H]tymidínom (18,5 kBq na jamku) po ďalších 24 hodinách sa meria vnesené [³H] nukleárne značenie.

Skúška väzby buniek

Skúška sa vykonáva skôr opísaným spôsobom (Goodman a kol., 1991) pri použití hexózaminidazovej aktivity (Landegren, 1984) na zistenie viazaných buniek. Zriedenie a bunkové suspenzie sú v pripojovacom tlmivom roztoku (RPMI, 1 % BSA, 25 mM HEPES, hodnota pH 7,4). Matricové proteíny sa poťahujú na 96 a 48 jamkové doštičky, jamky sa blokujú BSA a sériovo zriedený MAb sa pridá do jamiek s následným pridaním buniek (2,5 x 10⁴ až 5 x 10). Po jednej hodine pri 37 °C sa neprilipnuté bunky vymyjú a viazané bunky sa počítajú proti štandardnej paralelnej krivke. Inhibícia väzby sa vypočíta pri použití jamiek bez MAb ako porovnávacími vzorkami. Spravidla sa 70 % pridaných buniek viaže na vitronektín za hodinu. Väzba buniek k potiahnutým jamkám samotným BSA je rutinne menšia ako 5 % špecificky viazaných buniek.

Skúšky zosietenia

Ako pri skúške väzby buniek sa bunky nechávajú viazať na doštičky potiahnuté matricou v prítomnosti sériovo riedeného 17E6 alebo jeho fragmentov F(ab')₂ alebo F(ab') a vzrastajúceho množstva kozieho protimyšieho F(ab') ako zosieťujúceho činidla. Premytie a detekcia viazaných buniek sú rovnaké ako pre skúšku normálnej väzby buniek.

Reverzálna skúška väzby

Bunky sa nanesú v pripojovacom tlmivom roztoku na jamky potiahnuté a blokované ako pri skúške väzby buniek a inkubujú sa pri teplote 37 °C. Po pretiahnutí (60 až 75 minút) sa pridajú sériovo riedené MAb a bunky sa vrátia do inkubátora, alebo sa bunky nechajú viazať počas 24 hodín pred pridaním protilátky. Po dvoch až troch hodinách v prítomnosti protilátky sa supematanty dôkladne odstránia a nahradia sa 5-krát čerstvým, predhriatym viazacím tlmivým roztokom za získania konečného faktora zriedenia >1 x 10⁵.

Vývoj nádoru in vivo

Nádorové bunky v exponenciálnom raste sa zhromaždia pomocou EDTA, premyjú sa a skúšajú sa s ohľadom na životnosť vylučovaním farbiva tryptánová modrosť. Životnosť je 96 až 99 %. Pre primárny rast nádoru sa bunky (0,5 x 10⁶ buniek v 0,2 ml PBS++) vstrekujú subkutánne do boku holej myši. Rast nádoru sa sleduje meraním priemeru nádoru meradlom a objem nádoru sa vypočíta aproximačným vzorcom pre pretiahnutý elipsoid objem = [(a.b²)/2], kde znamená a najdlhšiu os nádoru a b najkratšiu os nádoru. Vždy sa skúša aspoň 8 zvierat zo skupiny.

Na experimentálne pľúcne metastázy sa zhromaždia bunky (0,05 % trypsínu/0,02 % EDTA) a vstrekujú sa do cievy chvostu holej myši (0,5 x 10⁶ buniek v 0,2 ml PBS++). Po siedmich týždňoch sa myši usmrtia, pľúca sa vyberú a fixujú sa v Bouinsovom roztoku a počítajú sa tumor foci na povrchu pľúc. Na ošetrenie protilátkou sa zhromaždené a premyté bunky inkubujú s čisteným endotoxínom zbaveným MAb (70 pg na 10⁶ buniek 0,5 ml PBS++) počas 30 minút pri teplote 20 °C v nekonečnom rotátore pred zriedením na 0,5 x 10⁶ buniek v 0,2 ml PBS a pred vstrekovaním. Životnosť buniek sa posudzuje vylučovaním trypánovej modrosti pred ukončením projektu vstrekovania, pričom sa nezistia žiadne podstatnejšie rozdiely (životnosť pred vstreknutim = životnosť po vstreknutí ± 5 %). Posudzujú sa hodnoty inhibície nádoru pri použití 2-chvostových T testov podľa Študenta.

Príklad 8

Molekulárne biologické techniky

Pokiaľ to nie je uvedené inak, všetky molekulárne biologické techniky sú skôr podrobne opísané (Sambrook a kol., 1989).

Príprava RNA a cDNA

RNA sa ako celok izoluje z buniek 17E6 guanidíniumtiokanátovou extrakciou a RNA sa izoluje ultraodstredením gradientu hustoty céziumchloridu (Chirgwin a kol., 1979). cDNA v prvom reťazci sa syntetizuje pri použití obchodnej súpravy (Pharmacia). Syntéza sa uskutočňuje v objeme 15 pl s 5 pq RNA počas jednej hodiny pri teplote 37 °C. Prvý reťazec DNA sa používa priamo na zosilnenie PCR.

PCR zosilnenie

Oblasti obmeny myšieho ľahkého reťazca a obmeny ťažkého reťazca sa zosilňujú pri použití nadbytkových a semidegenerovaných súborov PCR primérov určených na hybridizáciu myších lg vodcovských sekvencii (Jones a Bendig, 1991). Zmes 61 oligonukleotidov slúži ako 5' priméry alebo variabilné oblasti ťažkého reťazca a zmes 405 oligonukleotidov slúži ako 5' priméry pre kappa variabilnú oblasť reťazca. Priméry 3' sú určené na teplotnú hybridizáciu v konštantnej oblasti: používa sa špecifický IgGl a kappa myšie priméry.

Na zosilnenie s termostabilnou DNA polymerázou sa 25 μΙ reakčnej zmesi obsahujúcej: 1 μΐ cDNA-RNA hybridu, 250 nM vhodnej zmesi 5' a 3' primérov, 200 μΜ každého dNTP, 1 mM chloridu horečnatého (pre ľahký reťazec), 2 mM chloridu horečnatého (pre ťažký reťazec) a 1 J Taq polymerázy (Cetus) prevrství minerálnym olejom a podrobí sa pôsobeniu hybridizačnej teploty 55 až 60 °C. Po 30 cykloch (1 x 55 °C: 1,5' x 72 °C: 45 s x 92 °C), jedna desa tina reakcie PCR sa vykoná elektroforézou na 1% agarózovom TAE géle a výsledné PDR produkty sa zviditeľňujú etídiumbromidovým zafarbením.

Molekulárne klonovanie a sekvenovanie

Ligatuje sa 1 μΐ každého PCR produktu do TA vektoru (Invi-trogen, San Diego). Dve DNA ligačné reakcie pre variabilné oblasti ťažkého a ľahkého reťazca sa transformujú tepelným šokom do príslušného kmeňa E. coli ZG1 buniek na vytvorenie dvoch DNA knižníc: jednej pre ľahkú variabilnú oblasť 17E6 Mav a druhej pre ťažkú variabilnú oblasť 17E6 Mab. Kolónie sa selektujú na LB doštičkách so 100 pg/ml karbenicilínu a používajú sa pre ďalšiu analýzu. Pozitívne kolónie sa detektujú PCR skríningom alebo digesciou s plazmidom (Gussow a Clackson, 1989). Dvojreťazcový plazmid DNA sa pripraví (Wizard preps, Promega Corp.) na sekvenovanie z transformantov. Vykoná sa tepelné cyklické sekvenovanie pri použití spôsobu dideoxynukleotidového reťazcového zakončenia (Sanger a kol., 1977) pri použití Taq polymerázy. Používajú sa rovnoprúdové a protiprúdové sekvenujúce priméry komplementárne pre TA vektor.

Skúšky väzby integrínového Ugandu a kompetície

Biotinylácia ligandov Ligand v PBS sa zriedi päťnásobnou koncentráciou ligačného tlmivého roztoku (konečná koncentrácia: 1 mg ml proteínu, 100 mM chloridu sodného, 100 mM hydrogenuhličitanu sodného, hodnota pH 8,2) v konečnom objeme 1 ml. Čerstvo pripravený N-hydroxysukcínimidobiotínový roztok (100 μΐ, 1 mg mľ¹ v dimetylsulfoxide) sa pridá počas miešania a reakcia sa nechá prebiehať počas dvoch hodín pri teplote 20 °C s rotáciou. Po vyčerpávajúcej dialýze pri teplote 4 °C, PBS, 0,05 % nitridu sodného) sa posudzuje koncentrácia proteínu a biotinylovaný ligand sa uchováva pri teplote 4 °C a použije sa v priebehu 21 hodín. Syntéza biotinylovaného peptidu cRGDfK (cyklický-Arg-Gly-Asp-Dphe-Lys = N-biotinaminohexanová kyselina) je opísaná v známom stave techniky a možno ju získať osebe známymi štandardnými spôsobmi.

Priama kompetičná skúška: Táto skúška je založená na niektorých modifkáciách skorších spôsobov (Smith a kol., 1990). Zriedi sa a v β3 na 1 pg mľ¹ v pufri A (150 mM chloridu sodného, 1 mM chloridu horečnatého, 1 mM chloridu vápenatého, 10 μΜ chloridu manganatého, 20 mM Tris-HCl, hodnota pH 7,4) a 100 ml sa nanesie cez noc pri teplote 4 °C na 96 jamkové mikrotitračné doštičky. Doštička sa premyje raz pufrom B (3 % BSA [hmotnosť/objem], 100 mM chloridu sodného, 1 mM chloridu horečnatého, 1 mM chloridu vápenatého, 10 μΜ chloridu manganatého, 50 mM Tris-HCl, hodnota pH 7,4) a inkubuje sa na čas dvoch hodín pri teplote 20 °C v tom istom pufri.

Na prepláchnutie pufrom C (pufor B s BSA s koncentráciou 0,1 % [hmotnosť/objem] sa pridá biotinylovaný ligand (1 pg mľ¹ konečná koncentrácia) a sériovo riedené testované peptidy alebo proteíny. Po inkubácii (3 hodiny, teplota 30 °C) sa neviazaný ligand vymyje z doštičky trojnásobným prepláchnutim pufrom C a v inkubovaní sa pokračuje počas dalšej jednej hodiny s antibiotinalkalickou fosfatásovou konjugovanou protilátkou (1:10000 v pufri C) (Sigma) s následným premytím PBS a detekciou viazanej protilátky NBT-BCIP (Biorad) ako substrátom. Molekuly ECM a protilátky sa rutinne biotinylujú a používajú sa samé osebe pri skúške konfigurácie.

Skúšky sa rutinne vykonávajú trojnásobne až štvornásobne a opakujú sa najmenej trikrát na odvodenie IC₅₀ z neváženého súhlasu sigmoidnej krivky. Výsledky sa nor16 malizujú proti externým kontrolným peptidom na umožnenie intraskúškového porovnania. Lineárny RGD peptid GRD a GRGDSPK a cyklický peptid cRGDfV sa rutinne zavádzajú do titrácií ako externé štandardy, ako tomu bolo pri kontrolných jamkách, kde sa uskutočnila väzba biotinylovaných ligandov k blokovaným, ale integrínov zbavených jamiek, a meria sa antibiotínová protilátka k ligandu zbavenému integrínu: signál z kontrolných jamiek je < 7,5 % špecifickej ligandovej väzby. Predblokované kompetičné skúšobné doštičky, potiahnuté receptorom a blokované ako pre priamu kompetičnú skúšku sa predinkubujú dvojnásobne koncentrovanými protilátkami, matricovými molekulami alebo kompetitívnymi peptidmi (50 μΐ v tlmivom roztoku C, jedna hodina, teplota 30 °C) pred pridaním biotinylovaného skúšacieho ligandu alebo protilátky (50 μΐ v tlmivom roztoku C) a v inkubácii sa pokračuje (3 hodiny, teplota 30 °C) s následným premytím a detekciou viazaného biotínu, ako je to opísané pre priamu kompetičnú skúšku.

Zoznam sekvencii (1) Všeobecné informácie

i) Prihlasovateľ

A. meno: Merck Patent GmbH

B. ulica: Frankfurter Str. 250

C. mesto: Darmstadt

E. štát: Nemecko

F. poštové údaje: (ZIP): 64271

G. telefón: 49-6151-727022 H. telefax: 49-6151-727191 ii) Názov vynálezu

Monoklonálna protilátka, jej fragment, spôsob jej prípravy a farmaceutický prostriedok, ktorý ju obsahuje iii) Počet sekvencii: 17 iv) Forma pre počítač

A. Typ média: Floppy disk

B. Počítač: IBM PC kompatibilný

C. Operačný systém: PC-DOS/MS-DOS

D. Software: Patentln Release #1.0, verzia # 1,30 (EPO)

2. Informácie o sekv. ID. č. 1:

i) Charakteristiky sekvencie

A. Dĺžka: 381 párov báz

B. Typ: nukleová kyselina

C. reťazce:jeden

D. Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: cDNA iii) Hypotetická: žiadna iv) Anti-zmysel: žiadny

v) Typ fragmentu:N-zakončenie vi) Zdroj pôvodu

A. Organizmus: myš

B. Kmeň: Balb/c vii) Bezprostredný zdroj

B. Kloň: 72-17E6 ix) Charakteristika

A. Meno/kľúč: CDS

B. Lokácia: L. 129

D. Ďalšie informácie:/funkcia=vedúca - aFR-1 sekvencia (vedúca: 1 až 60, FR-1: 61-129) ix) Charakteristika

A. Meno/kľúč: CDS

B. Lokácia: 130..162

D. Ďalšie informácie:/funkcia=CDR-l sequence ix) Charakteristika

A. Meno/kľúč: CDS

B. Lokácia: 163..207

D. Ďalšie informácie:/funkcia=FR-2 sequence ix) Charakteristika

A. Meno/kľúč: CDS

B. Lokácia: 208...228

D. Ďalšie informácie:/funkcia=CDR-2 sequence ix) Charakteristika

A. Meno/kľúč: CDS

B. Lokácia: 229...324

D. Ďalšie informácie:/funkcia=FR-3 sequence ix) Charakteristika

A. Meno/kľúč: CDS

B. Lokácia: 325...351

D. Ďalšie informácie:/funkcia=CDR-3 sequence ix) Charakteristika

A. Meno/kľúč: CDS

B. Lokácia: 352...381

D. Ďalšie informácie:/funkcia=FR-4 sequence xi) Opis sekvencie ID. č. 1

ATG GTG TCC TCA CCT CZiG

TTC CTT

GGT CTC CTG TTG CTC TGT TTT CAA

48

Met Val Ser Ser 1

Ala 5

Gin

Phe

Leu

Gly Leu 10

Leu

Leu Leu

Cys Phe Gin 15

GTT

ACC

AGA

TGT

GAT

ATC

CAG

ATG

ACA

CAG

ACT

ACA

TCC

TCC

CTG

TCT

96

Val

Thr

Arg

Cys

ABp

íle

Gin

Met

Thr

Gin

Thr

Thr

ser

ser

Leu

ser

20

25

30

CCC

TCT

CTG

GCA

GAC

AGA

GTC

ATC

ATC

AGT

TGC

AGG

GCA

AGT

CAG

GAC

144

Ala

Ser

Leu

Gly

Asp

Arg Val

íle

íle

Ser

Cya

Arg

Kla

Ser

Gin

A.sp

35

40

1

5

ATT

AGC

AAT

TAT

TTA

AGC

TGG

TAT

CAA

CAG

AAG

CCA

GAT

GGA

ACT

GTT

192

íle

Ser

Asn

Tyr

Leu

Ser

Trp Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Asp Gly Thr

VaL

10

1

5

10

AAA

CTC

CTG

ATC

TTC

TAC

ACA

TCA

AAA

TTA

CAC

TCA

GGA

GTC

CCA

TCA

240

Lys

Leu

Leu

íle

Pbe

Tyr

Thr

Ser

Lys

Leu

His

Ser

Gly Val

Pro

Ser

15

1

5

1

ACA

TTC

AGT

GGC

AGT

GGG

TCT

GGA

ACA

GAT

TAT

TCT

CTC

ACC

ATT

AGT

288

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly Ser Gly

Thr

Asp

Tyr

Ser

Leu

Thr

íle

Ser

5

10

15

20

AAC

CTG

CAC

CAA

GAA

GAT

ATT

GCC

ACT

TAC

TTT

TGC

CAA

CAG

GGT

AAT

33ó

Asn

Leu

Asp Gin Glu

Asp

íle

Ala

Thr

Tyr

Phe

Cys

Gin

Gin Gly

Asn

30

ACG

TTT

CCG

TAC

ACG

TTC

GGA

GGG

GGG

ACA

AAG

GTG

GAA

ATG

AGA

3B1

Thr

Phe

Pro

Tyr

Thr

Phe

Gly

Gly Cly

Thr

Lys

Val

Glu

Met Arg

S 1 S 10

2. Informácie o sekv. ID. č. 2:

i) Charakteristiky sekvencie

A. DÍžka: 43 aminokyselín

B. Typ: aminokyselina

D. Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: protein xi) Opis sekvencie ID. č. 2

Het

Val

Ser

Ser

Ala

Gin

Phe

Leu

Gly

Leu

Leu Leu

Leu Cys

Phe Gin

1

S

10

15

Val

Thr

Arg

Cys

Asp

íle

Gin

Met

Thr

Gin

Thr Thr

Ser Ser

Leu Ser

20

25

30

Ala

Ser

Leu

Gly

Asp

Arg

Val

íle

íle

Ser

Cys

35

40

2. Informácie o sekv. ID. č. 3:

i) Charakteristiky sekvencie

A. DÍžka: 11 aminokyselín

B. Typ: aminokyselina

D. Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: protein xi) Opis sekvencie ID. č. 3

Arg Ala Ser Gin Asp íle Ser Asn Tyr Leu Ser

5 10

2. Informácie o sekv. ID. č. 4:

i) Charakteristiky sekvencie

A. Dĺžka: 15 aminokyselín

B. Typ: aminokyselina

D. Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: proteín xi) Opis sekvencie ID. č. 4

Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu íle Phe

10 15

2. Informácie o sekv. ID. č. 5:

i) Charakteristiky sekvencie

A. Dĺžka: 7 aminokyselín

B. Typ: aminokyselina

D. Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: proteín xi) Opis sekvencie ID. č. 5

Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser

5

2. Informácie o sekv. ID. č. 6:

i) Charakteristiky sekvencie

A. Dĺžka: 3 2 aminokyselín

B. Typ: aminokyselina

D. Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: proteín xi) Opis sekvencie ID. č. 6

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Cly Thr Asp Tyr Ser

S 10 15

Leu Thr íle Ser Asn Leu Asp Gin Glu Asp íle Ala Thr Tyr Phe Cys

25 30

2. Informácie o sekv. ID. č. 7:

i) Charakteristiky sekvencie

A. Dĺžka: 9 aminokyselín

B. Typ: aminokyselina

D. Topológia: lineárna i i) Typ molekuly: proteín xi) Opis sekvencie ID. č. 7

Gin Gin Gly Asn Thr Phe Pro Tyr Thr

5

2. Informácie o sekv. ID. č. 8:

i) Charakteristiky sekvencie

A. Dĺžka: 10 aminokyselín

B. Typ. aminokyselina

D. Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: proteín xi) Opis sekvencie ID. č. 8

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Met Arg

5 10

2. Informácie o sekv. ID. č. 9:

i) Charakteristiky sekvencie

A. Dĺžka: 339 párov báz

B. Typ: nukleová kyselina

C. Reťazce: jeden

D. Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: cDNA iii) Hypotetická: žiadna iv) Anti-zmysel: žiadny

v) Typ fragmentu :N-zakončenie vi) Zdroj pôvodu

A. Organizmus: myš

B. Kmeň: Balb/c vii) Bezprostredný zdroj

B. Kloň: 272-17E6 ix) Charakteristika

A. Meno/kľúč: CDS

B. Lokácia: L.57

D. Ďalšie informácie:/funkcia=vedúca sekvencia ix) Charakteristika

A. Meno/kľúč: CDS

B. Lokácia: 58..147

D. Ďalšie informácie:/funkcia=FR-l sequence ix) Charakteristika

A. Meno/kľúč: CDS

B. Lokácia: 148..162

D. Ďalšie informácie:/funkcia=CDR-l sequence ix) Charakteristika

A. Meno/kľúč: CDS

B. Lokácia: 163...204

D. Ďalšie informácie:/funkcia=FR-2 sequence ix) Charakteristika

A. Meno/kľúč: CDS

B. Lokácia: 205...255

D. Ďalšie informácie:/funkcia=CDR-2 sequence ix) Charakteristika

A. Meno/kľúč: CDS

B. Lokácia: 256...351

D. Ďalšie informácie:/funkcia=FR-3 sequence ix) Charakteristika

A. Meno/kľúč: CDS

B. Lokácia: 352...378

D. Ďalšie informácie:/funkcia=CDR-3 sequence ix) Charakteristika

A. Meno/kľúč: CDS

B. Lokácia: 379...411

D. Ďalšie informácie:/funkcia=FR-4 sequence xi) Opis sekvencie ID. č. 9

ATG

CGA

TCG

ACC

TGG

GTC TTT

ATC

TTC CTG

TTT

TCA

GTA

ACT

GCA

GGT

4S

Met Gly

Trp

Ser

Trp

Val Phe

íle

Phe Leu

Phe

Ser

Val

Thr

Ala

Gly

15

20

25

GTC

CAC

TCC

CAG

GTC

CAG CTT

CAG

CAG TCT

GGG

GCT

GAA

CTG

CCA

GAG

96

Val

His

Ser

Gin

val

Glr. Leu

Gin

Gin Ser

Gly Ala

Glu

Leu

Ala

Glu

i

5

10

CCT

GGG

GCC

TCA

GTC

AAG ATG

TCC

TCC AAG

GCT

TCT

GGC

TAC

ACC

TTT

144

Pro

Gly

Ala

5er

Val

Lys Het

Ser

Cys Lys

Ala

Ser

Cly Tyr

Thr

Phe

15

20

25

AGT

AGT

TTC

TGG

ATG

CAC TCG

GTA

AAA CAG

AGG

CCT

GGA

CAG

GGT

CTG

192

Ser

Ser

Phe

Trp

Met

His Trp

Val

Lys Gin

Arg

Pro Gly Gin Gly

Leu

30

1

5 1

S

10

CAA

TGG

ATT

GGA

TAC

ATT AAT

CCT

AGA TCT

GGT

TAT

ACT

GAG

TGT

AAT

240

Glu

Trp

íle

Gly

Tyr

íle Asn

Pro

Arg Ser

Gly

Tyr

Thr

Glu

Cys

Aso

1

5

20

CAG

ΛΤΑ

TTC

AGC

CAC

AAG GCC

ACA

ATG ACT

GCA

GAC

ACC

TCC

TCC

AGC

263

Glu

íle

Phe

Arg

Asp

Lys Ala

Thr

het. Thr

Ala

Asp

Thr

Ser

Ser

Ser

15

1

5

10

ACA

GCC

TAC

ATG

CAA

CTG AGT

GGT

CTG ACA

TCT

CAG

GAC '

TCT GCA CTC 336

Thr

Ala

Tyr

Het

Gin

Leu Ser

Gly

Leu Thr

Ser

Glu

Asp :

Ser Ala val

1S

20

2S

TAT

TAC

TGT

GCA

AGT

TTT CTG

GGA

CGA GGG

CCT

ATG

GAC 1

TAC TGG GGT 38-4

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Ser

Phe Leu

Gly

Arg Gly

Ala

Met Asp '

Tyr Trp Gly

30

5

CAA

GGA

ACC

TCA

GTC

ACC GTC

TCC

TCA

411

Gin

Gly

Thr

ser

Val

Thr Val

Ser

Ser

5

10

2. Informácie o sekv. ID. č. 10:

i) Charakteristiky sekvencie

A. Dĺžka: 19 aminokyselín

B. Typ: aminokyselina

D. Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: proteín xi) Opis sekvencie ID. č. 10

Het Gly Trp Ser Trp Val Phe íle Phe Leu Phe Ser Val Thr Ala Gly

5

Val His Ser

2. Informácie o sekv. ID. č. 11:

i) Charakteristiky sekvencie

A. Dĺžka: 30 aminokyselín

B. Typ: aminokyselina

D. Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: proteín xi) Opis sekvencie ID. č. 11

Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala

S

Ser Val Lys Het Ser Cys Lys Ala Ser

25

2. Informácie o sekv. ID. č. 12:

i) Charakteristiky sekvencie

A. Dĺžka: 5 aminokyselín

B. Typ: aminokyselina

D. Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: proteín xi) Opis sekvencie ID. č. 12

Ser Phe Trp Met His

5

Glu Leu Ala Glu Pro Gly Ala

1C 15

Gly Tyr Thr Phe Ser

2. Informácie o sekv. ID. č. 13:

i) Charakteristiky sekvencie

A. Dĺžka: 14 aminokyselín

B. Typ: aminokyselina

D. Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: proteín xi) Opis sekvencie ID. č. 13

Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp íle Gly ¹ 5 to

2. Informácie o sekv. ID. č. 14:

i) Charakteristiky sekvencie

A. Dĺžka: 17 aminokyselín

B. Typ: aminokyselina

D. Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: proteín xi) Opis sekvencie ID. č. 14

Tyr íle Asn Pro Arg Ser Gly Tyr Thr Glu Cys Asn GLu íle Phe Arg

10 15

Asp

2. Informácie o sekv. ID. č. 15:

i) Charakteristiky sekvencie

A. Dĺžka: 32 aminokyselín

B. Typ: aminokyselina

D. Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: proteín xi) Opis sekvencie ID. č. 15

Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gin

10 15

Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser

25 30

2. Informácie o sekv. ID. č. 16:

i) Charakteristiky sekvencie

A. Dĺžka: 9 aminokyselín

B. Typ: aminokyselina

D. Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: proteín xi) Opis sekvencie ID. č. 16

Phe Leu Gly Arg Gly Ala Met Asp Tyr

5

2. Informácie o sekv. ID. č. 17:

i) Charakteristiky sekvencie

A. Dĺžka: 11 aminokyselín

B. Typ: aminokyselina

D. Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: proteín xi) Opis sekvencie ID. č. 17

Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

5 10

Priemyselná využiteľnosť

Monoklonálna protilátka, bunková línia hybridómu produkujúca túto protilátku, DNA sekvencie kódujúce pre túto protilátku a aminokyselinové sekvencie. Monoklonálna protilátka, ktorej výhodné predvedenie sa označuje ako 17E6, majúca nasledujúce vlastnosti - reaguje len s aV-

- reťazcom ľudských aV-integrínov,

- blokuje väzbu na integrínový substrát buniek nesúcich aV-integrín,

- spúšťa rcvcrzáciu zavedenej interakcie matrici buniek spôsobenú aV-integrínmi,

- blokuje vývoj nádorov a

-je zbavená cytotoxických účinkov, je vhodná na prípravu farmaceutického prostriedku proti nádorom, najmä proti melanómu alebo na diagnostickú lokáciu a na posúdenie rastu nádoru.

Claims (20)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Monoklonálna protilátka obsahujúca aminokyselinovú sekvenciu úsekov základnej štruktúry (FR) a komplementaritu určujúcich úsekov (CDR) ľahkého reťazca SEQ ID NO : 1 a ťažkého reťazca SEQ ID NO:9.
2. 2. Monoklonálna protilátka podľa nároku 1, ktorá má nasledujúce vlastnosti

   - reaguje len s aV-reťazcom ľudských aV-integrínov,

   - blokuje väzbu na integrínový substrát buniek nesúcich aV-integrín,

   - spúšťa reverzáciu zavedenej interakcie matrix buniek spôsobenú aV-integrínmi,

   - blokuje vývoj nádorov a

   - nemá cytotoxickú účinnosť.
3. 3. Monoklonálna protilátka podľa nároku 1 alebo 2, pričom integrínovým substrátom je vitro-nektín, fibrinogén alebo fibronektín.
4. 4. Monoklonálna protilátka podľa nárokov 1 až 3, kde nádorom, ktorého rast buniek sa má blokovať, je melanóm.
5. 5. Monoklonálny protilátkový fragment obsahujúci aminokyselinové sekvencie podľa nároku 1, majúci vlastnosti opísané v nárokoch 2 až 4, pričom tento fragment je bivalcntný.
6. 6. Hybridómová bunková línia majúca označenie 272-17E6 a uložená pod prírastkovým číslom DSM ACC2160, schopná produkovať monoklonálnu protilátku podľa nárokov 1 až 4.
7. 7. Monoklonálna protilátka, pripraviteľná hybridómovou bunkovou líniou DSM ACC2160.
8. 8. Aminokyselinová sekvencia obsahujúca sekvenciu, ktorá je uvedená v SEQ ID NO: 1.
9. 9. Aminokyselinová sekvencia obsahujúca sekvenciu, ktorá je uvedená v SEQ ID NO:9.
10. 10. Aminokyselinová sekvencia podľa nároku 8, začínajúca od polohy 21.
11. 11. Aminokyselinová sekvencia podľa nároku 9, začínajúca od polohy 20.
12. 12. DNA sekvencia obsahujúca DNA sekvenciu SEQ ID NO: 1 , kódujúca FR a CDR úseky ľahkého reťazca variabilnej oblasti monoklonálnej protilátky majúcej vlastnosti definované v nároku 2.
13. 13. DNA sekvencia obsahujúca DNA sekvenciu SEQ ID NO.9, kódujúca FR a CDR úseky ťažkého reťazca variabilnej oblasti monoklonálnej protilátky majúcej vlastnosti definované v nároku 2.
14. 14. DNA sekvencia podľa nároku 12, obsahujúca vedúcu sekvenciu uvedenú v SEQ ID NO : 1 .
15. 15. DNA sekvencia podľa nároku 13, obsahujúca vedúcu sekvenciu uvedenú v SEQ ID NO: 9 .
16. 16. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa t ý m , že obsahuje monoklonálnu protilátku podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5 alebo 7 a farmaceutický vhodný nosič.
17. 17. Spôsob prípravy monoklonálnej protilátky podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5 alebo 7, vyznačujú c i sa t ý m , že sa uskutočnia nasledujúce kroky:

    i) myš sa imunizuje purifíkovaným α_νβ₃ integrínom, ii) produkujú sa hybridomálne bunky, iii) selektujú sa klony, supematant ktorých má pozitívne výsledky a reakčný profil ktorých je konzistentný s ich rozpoznaním a_v-integrínového reťazca, iv) selektujú sa klony, supematant ktorých blokuje pripojenie a_v reťazcový integrín exprimujúcich buniek na matrix proteín,

    v) selektujú sa klony, supematant ktorých blokuje vývoj nádoru, vi) selektujú sa klony, supematant ktorých nemá žiadnu cytotoxicitu, vii) selektujú sa klony, supematant ktorých spúšťa reverziu ustálenej integrínom mediovanej interakcie bunkové matrix, viii) produkuje sa špecifická bunková línia a ix) z tejto bunkovej línie sa izoluje monoklonálna protilátka.
18. 18. Použitie monoklonálnej protilátky podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5 alebo 7 na výrobu lieku na liečenie nádorov.
19. 19. Použitie podľa nároku 18, kde nádorom je melanóm.
20. 20. Použitie monoklonálnej protilátky podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5 alebo 7 na výrobu diagnostickej zlúčeniny na lokalizáciu a určenie rastu nádoru.