SK13122002A3 - Monoklonálne protilátky, spôsob ich prípravy a ich použitie - Google Patents

Description

Predložený vynález sa týka monoklonálnych protilátok, ktoré špecificky rozoznávajú ľudský receptor pre lipoproteíny s nízkou hustotou (LDLR). Tieto protilátky sú užitočné napr. na identifikáciu a purifikáciu ľudského rozpustného LDLR (hsLDLR) pri produkčných procesoch, ako aj pri identifikácii a liečbe ochorení, ako napríklad infekcie hepatitídy C (HCV).

Doterajší stav techniky

Cholesterol, zložka všetkých eukaryotických plazmatických membrán, je nevyhnutný pre rast a životaschopnosť buniek vo vyšších organizmoch. Avšak vysoké sérové hladiny cholesterolu spôsobujú ochorenie a smrť tým, že sa podieľajú na vytváraní aterosklerotických plakov v artériách v celom tele. Hlavným miestom syntézy cholesterolu u cicavcov je pečeň. Zreteľné množstvá cholesterolu sa vytvárajú aj v tenkom čreve. Rýchlosť vytvárania cholesterolu týmito orgánmi citlivo reaguje na množstvo cholesterolu absorbované z potravinových zdrojov. Bunky mimo pečene a tenkého čreva získavajú cholesterol z plazmy, a nesyntetizujú ho de novo. Cholesterol a iné lipidy sa transportujú telesnými tekutinami prostredníctvom lipoproteínov, ktoré sa klasifikujú podľa zvyšujúcej sa hustoty. Lipoproteín je častica pozostávajúca z jadra hydrofóbnych lipidov obkoleseného obalom polárnych lipidov a apoproteínov. Tieto lipoproteíny majú dve úlohy; rozpúšťajú vysoko hydrofóbne lipidy a obsahujú signály, ktoré regulujú pohyb konkrétnych lipidov do a von zo špecifických cieľových buniek a tkanív. Cholesterol sa transportuje v telesných tekutinách prostredníctvom lipoproteínov s nízkou hustotou (LDL), ktoré sa viažu na špecifický receptor na plazmatickej membráne iných ako pečeňových buniek. Komplex receptor-LDL sa potom internalizuje do buniek prostredníctvom transportného mechanizmu známeho ako receptorom sprostredkovaná endocytóza (Goldstein a ďalší 1979). Receptor lipoproteínov s nízkou hustotou (LDL) je prototypom rodiny štrukturálne príbuzných bunkových

-2povrchových receptorov, ktoré sprostredkúvajú endocytózu viacerých ligandov do cicavčích buniek.

LDL receptor pozostáva z 822 aminokyselinových zvyškov a vykazuje molekulovú hmotnosť 164000. Skladá sa z niekoľkých domén, z ktorých niektoré zdieľajú homológiu s inými proteínmi. Jeho NH^-koncová ligand viažuca doména pozostáva z 292 zvyškov zostavených v 7 imperfektných opakovaniach bohatých na cysteín. Každé opakovanie obsahuje šesť cysteínových zvyškov, ktoré sú spojené disulfidovou väzbou spôsobom prvý s tretím, druhý s piatym a štvrtý so šiestym (Bieri a ďalší, 1995). Po tejto doméne nasledujú štyri ďalšie domény: prvá pozostáva zo 400 aminokyselinových zvyškov a je homologická s EGF receptorom, druhá pozostáva z 58 aminokyselinových zvyškov a je bohatá na O-pripojené sacharidy, tretia je jedinou transmembránovou doménou s 22 aminokyselinovými zvyškami a štvrtá je cytoplazmatickou doménou s 50 aminokyselinovými zvyškami (Sudhof a ďalší, 1985), (Brown a ďalší 1986).

Fyziologickú dôležitosť LDL receptora odhalili štúdie Browna a Goldsteina zaoberajúcich sa rodinnou hypercholesterolémiou (FH). Zistilo sa, že ochorenie je spôsobené molekulovým genetickým defektom spôsobujúcim absenciu alebo nedostatok funkčných receptorov pre LDL (Brown a ďalší, 1976). Charakterizovalo sa niekoľko tried FH mutácii (Goldstein a ďalší, 1975).

V kultivačnom supematante interferónom indukovaných buniek (Fisher a ďalší, 1993) a v telesných tekutinách (Fisher a ďalší, 1994) sa identifikovala, a izolovala sa z nich, rozpustná forma sLDLR vykazujúca protivírusovú aktivitu. Identifikovalo sa niekoľko interferónom indukovaných proteínov, ktoré slúžia ako nástroje pri indukcii protivírusového stavu prostredníctvom IFNs. Jeden takýto protein vykazujúci protivírusovú aktivitu sa produkoval a akumuloval v kultivačnom supematante ľudských amniových WISH buniek. Tento protein sa purifikoval až kým nebol homogénny, a označil sa ako sLDLR (pozri EP 0 553 667 a Fisher a ďalší, 1993). Zistilo sa, že sLDLR sa vylučuje do média cicavčími bunkami, ktoré vstúpili do protivírusového stavu ako odpoveď na interferón. Na rozdiel od interferónu, sLDLR neindukuje protivírusový stav v bunkách, ale on, ako taký, je protivírusový. Zistilo sa, že sLDLR musí byť zjavne prítomný v priebehu celého procesu vírusovej replikácie, zretia a vylučovania nových vírusových častíc, čo naznačuje, že by sa

-3mohol podieľať na komplexnom procese, ktorý vedie k inhibícii zostavovania vírusu alebo vylučovania nových vírusových častíc (nezverejnené údaje). Nedávno sa ukázalo, že endocytóza vírusu hepatitídy C je sprostredkovaná LDL receptormi na kultivovaných bunkách (Agnelo a ďalší, 1999). Tieto a iné zistenia naznačujú, že rodina LDL receptorov môže slúžiť ako vírusové receptory. Preto protilátky vyvinuté proti sLDLR receptoru, môžu blokovať vstup vírusových častíc a vylučovanie nových vírusových častíc prostredníctvom viazania sa na bunkový LDL receptor.

Zatiaľ je jedinou dostupnou známou monoklonálnou protilátkou proti LDLR, C7, protilátka proti hovädziemu LDLR (Beisiegel a ďalší, 1981, komerčne dostupná od Amersham, UK), ktorá bola pripravená imunizáciou myší s LDLR z hovädzej kôry nadobličiek, ktorý bol purifikovaný do homogenity. Membrány z hovädzej kôry nadobličiek sa solubilizovali a receptor sa čiastočne purifikoval eluovaním z DEAEcelulózovej kolóny (Beisiegel a ďalší, 1981). Protilátka proti hovädziemu LDLR len slabo krížovo reaguje s ľudským LDLR.

V skutočnosti sa zistilo, že C7 Mab proti hovädziemu LDLR má významné nevýhody, keď sa používa na detekciu a kvantifikáciu rekombinantného ľudského LDLR:

a) má veľmi nízku afinitu voči ľudskému LDLR;

b) významne krížovo reaguje s nečistotami spôsobenými bunkovou kultiváciou.

Špecifické protilátky proti ľudskému LDLR neboli predtým dostupné. To sa zdá byť prekvapujúce, keďže je veľmi bežné vyvíjať protilátky proti novým proteínom, či už na účely purifikácie, identifikácie alebo na vyvíjanie testov. Je možné, že takéto protilátky neboli doteraz generované preto, že podmienkou generovania monoklonálnych protilátok je dostupnosť dostatočných cieľových množstiev vysoko purifikovaného antigénu, ktoré by umožňovali účinnú imunizáciu myší. Vysoko purifikovaným antigénom je antigén, ktorý sa objavuje ako jediný hlavný vrchol pri RP-HPLC. Okrem toho, nie je ľahké zistiť spôsoby na identifikáciu a kvantifikáciu antigénu v priebehu purifikačných procesov. V súlade s vynálezom bol využitý tu opísaný test protivírusovej aktivity na identifikáciu LDLR v priebehu purifikačných procesov.

Je potrebné generovať špecifické monoklonálne protilátky proti ľudskému rozpustnému LDLR, aby sa poskytol prostriedok na vývoj účinného imunologického

-4testu (ELISA) a na identifikáciu proteinu Western blotom. Tieto protilátky sú potrebné na monitorovanie a kvantifikáciu rekombinantného ľudského rozpustného LDLR v priebehu vývoja produkčných a purifikačných procesov rekombinantného proteinu a na detekciu prirodzeného proteinu.

i ' I

Podstata vynálezu

Predložený vynález umožňuje generovanie hybridómových bunkových línií produkujúcich monoklonálne protilátky, ktoré sú schopné špecificky rozoznávať a viazať ľudský LDL receptor a jeho fragmenty.

Konkrétnejšie, predložený vynález umožňuje generovanie hybridómových bunkových línií produkujúcich monoklonálne protilátky, ktoré sú schopné špecificky rozoznávať a viazať ľudský rozpustný LDL receptor.

, Podstatou vynálezu je teda monoklonálna protilátka, chimérna protilátka, humanizovaná protilátka, anti-anti-ld protilátka alebo ich fragmenty, ktoré špecificky rozoznávajú a viažu ľudský LDL receptor a jeho fragmenty, s výnimkou monoklonálnej protilátky C7.

Predložený vynález poskytuje také monoklonálne protilátky (Mabs), ktoré rozoznávajú a viažu ľudský rozpustný LDLR a spĺňajú nasledujúce potreby:

1. Mabs, ktoré môžu byť použité ako pár v ELISA teste, napr. v sendvičovom ELISA teste (s enzýmom spojený imunoabsorpčný test) na detekciu ľudského rozpustného LDLR.

2. Mabs, ktoré môžu byť použité na identifikáciu LDLR vo Western blot analýze.

3. Mabs, ktoré môžu byť použité na neutralizáciu protivírusovej biologickej aktivity ľudského rozpustného LDLR.

4. Mabs, ktoré môžu byť použité na inhibovanie vírusovej infekcie, ako napríklad HCV.

Predložený vynález ďalej poskytuje spôsob detekcie a/alebo kvantifikácie ľudského LDLR, ktorý zahŕňa použitie špecifických monoklonálnych protilátok podľa vynálezu spôsobom známym na tento účel.

-5Predložený vynález poskytuje aj klonovaný hybridom obsahujúci slezinovú bunku z cicavca imunizovaného rekombinantným ľudským LDLR a homogénnu alebo heterogénnu lymfoidnú bunku.

Monoklonálna protilátka podľa vynálezu sa pripravuje bežným spôsobom, napr. pestovaním klonovaného hybridómu, ktorý obsahuje slezinovú bunku z cicavca imunizovaného s hsLDL a homogénnu alebo heterogénnu lymfoidnú bunku, v kvapalnom médiu alebo v cicavčom abdómene, aby sa umožnila produkcia monoklonálnej protilátky hybridómom a jej akumulácia.

Ešte iný predmet vynálezu poskytuje spôsob purifikácie ľudského LDLR, ktorý zahŕňa uvedenie materiálu obsahujúceho surový LDLR do kontaktu s monoklonálnou protilátkou podľa vynálezu. V procese purifikácie rekombinantného proteínu môže byť ako afinitný purifikačný krok použitá kolóna s adsorbovanou LDLR špecifickou monoklonálnou protilátkou.

Spôsob na detekciu a meranie rekombinantného ľudského LDLR, ktorý zahŕňa použitie monoklonálnych protilátok podľa vynálezu ako protilátky v ELISA teste, ako je opísané v príklade 5.

Ako LDLR, alebo ako fragment LDLR na imunizáciu zvierat môže byť použitý akýkoľvek LDLR pokiaľ je to LDLR teplokrvného cicavca. Použitý môže byť aj muteín LDLR. Reprezentatívnym príkladom takéhoto cicavčieho ľudského rozpustného LDLR je rozpustná LDLR +291 forma, ktorá obsahuje aminokyselinovú sekvenciu začínajúcu aminokyselinou Asp v polohe +4 a končiacu aminokyselinou Glu v polohe +291 sekvencie ľudského LDRL. Použitá môže byť aj akákoľvek iná forma, ako napríklad +292 forma, atd.

Podrobný opis vynálezu

Generovali sa monoklonálne protilátky (Mabs) proti ľudskému rozpustnému LDLR (hsLDLR). Použitím týchto monoklonálnych protilátok sa vyvinula ELISA a Western blot na identifikáciu hsLDLR a neutralizačný test protivírusového účinku hsLDLR.

Monoklonálne protilátky sa generovali v myšiach imunizovaných s rekombinantnou formou hsLDLR, ktorá pozostáva z N-koncovej ligand viažucej domény ľudského rozpustného LDLR, od Asp +4 po Glu +291. Rekombinantné

-6+291 forma hsLDLR sa produkovala v CHO bunkách a purifikovala sa, až kým nebola homogénna.

Imunizované myši produkovali významné titre špecifických protilátok. Po skríningu hybridómov sa identifikovalo päť klonov (čísla 12, 28, 29, 30 a 50), ktoré mali najvyššiu produkciu protilátky. Tieto klony sa vybrali na ďalšie subklonovanie. Po subklonovaní sa izolovalo 29 subklonov, ktoré mali najvyššiu produktivitu protilátky a zmrazili sa ampulky s rodičovskými klonami a so subklonami.

Pár monoklonálnych protilátok sa vybral na ELISA pre r-hsLDLR. Monoklonálna protilátka 28 sa vybrala ako pokrývacia protilátka a monoklonálna protilátka 29.8, značená s biotínom, sa zvolila ako sekundárna protilátka. Zistilo sa, že monoklonálne protilátky 12.6 a 29.8 sú vhodné na identifikáciu natívneho a rekombinantného hsLDLR vo Western blot analýze, a že monoklonálne protilátky 28 a 30 sú vhodné na identifikáciu rekombinantného hsLDLR vo Western blot analýze. Zistilo sa, že monoklonálne protilátky 12.6 a 50.30 sú vhodné na inhibovanie protivírusovej aktivity hsLDLR.

V súlade s vynálezom sa tiež zistilo, že monoklonálne protilátky 12.6, 28 a 29.8 inhibujú replikáciu vírusového genómu vírusu hepatitídy C (HVC) v ľudských hepatocytových primárnych kultúrach. Takže tieto protilátky sa môžu použiť na liečbu infekcie hepatitídou C (obrázok 3).

Determinoval sa podtriedový izotyp monoklonálnych protilátok produkovaných klonami. Klony 12.6, 28, 29.8 a 30 boli identifikované ako IgG, zatiaľ čo kloň 50.30 ako IgM.

Monoklonálne protilátky vyvinuté proti +291 forme hsLDLR rozoznávali aj iné formy hsLDLR, tzn. +292 formu a +331 formu r-hsLDLR, produkované v rekombinantných CHO bunkách, v ELISA a Western blot analýzach. +292 forma zahŕňa N-koncovú časť receptora od aminokyselinového zvyšku Asp +4 po Cys +292 a +331 forma zahŕňa N-koncovú časť receptora od aminokyselinového zvyšku Asp +4 po Cys +331.

Antigénom použitým na imunizáciu myší na generovanie monoklonálnych protilátok bola r-hsLDLR +291 forma, ktorá bola produkovaná v CHO bunkách. Produkcia r-hsLDLR sa uskutočňovala v bioreaktoroch použitím stacionárneho

-7fázového Fibracel matricového systému. R-hsLDLR sa purifikoval až kým nebol homogénny a použil sa na imunizáciu myší.

Imunitné slezinové bunky z myši, ktorá najlepšie odpovedala, sa použili na fúziu a na generovanie hybridómov.

Čo Sa týka protilátok používaných v celom tomto texte, výraz monoklonálna protilátka zahŕňa monoklonálne protilátky, chimérne protilátky, úplne humanizované protilátky, protilátky proti anti-idiotypovým protilátkam (anti-anti-ld protilátky), ktoré môžu byť značené v rozpustenej alebo v naviazanej forme, ako aj ich fragmenty, poskytnuté akoukoľvek známou technikou, ako napríklad, ale bez obmedzenia na enzymatické štiepenie, peptidovú syntézu alebo rekombinantné techniky.

Monoklonálna protilátka zahŕňa v podstate homogénnu populáciu protilátok špecifických voči antigénom, ktorá obsahuje v podstate podobné epitopové viažuce miesta. Monoklonálne protilátky sa môžu získavať metódami, ktoré sú pre priemerného odborníka v oblasti známe. Pozri napríklad Kohler a Milstein, Náture, 256: 495-497 (1975) ; US patent č. 4376110; Ausubel a ďalší, vyd., Harlow and Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); a Colligan a ďalší, vyd., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience N.Y., (1992-1996), pričom obsahy týchto publikácií sú tu kompletne zahrnuté ich citáciou. Takéto protilátky môžu patriť do ktorejkoľvek imunoglobulínovej triedy vrátane IgG, IgM, IgE, IgA, GILD a ktorejkoľvek ich podtriedy. Hybridom produkujúci monoklonálnu protilátku podľa predloženého vynálezu sa môže kultivovať in vitro, in situ alebo in vivo. Tým, že in vivo alebo in situ sa produkujú vysoké titre monoklonálnych protilátok, je to v súčasnosti najvýhodnejší spôsob produkcie.

Chimérne protilátky sú molekuly, ktorých odlišné časti sú odvodené od rozličných živočíšnych druhov, ako napríklad protilátky majúce variabilnú oblasť odvodenú od myšacej monoklonálnej protilátky a humánnu imunoglobulínovú konštantnú oblasť. Chimérne protilátky sa primárne používajú na redukciu imunogénnosti pri aplikácii a na zvýšenie výťažkov pri produkcii, napríklad tam, kde majú myšacie monoklonálne protilátky vyššie výťažky z hybridómov, ale aj vyššiu imunogénnosť u ľudí, používajú sa takéto humánno-myšacie chimérne monoklonálne protilátky. Chimérne protilátky a spôsoby ich produkcie sú v oblasti známe

-8(Cabilly a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3273-3277 (1984); Morrison a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984); Boulianne a ďalší, Náture 312: 643-646 (1984); Cabilly a ďalší, európska prihláška vynálezu 125023 (zverejnená 4. novembra 1984); Neuberger a ďalší, AG 314: 268-270 (1985); Taniguchi a ďalší, európska prihláška vynálezu 171496 (zverejnená 19. februára, 1985); Morrison a ďalší, európska prihláška vynálezu 173494 (zverejnená 5. marca 1986); Neuberger a ďalší, PCT prihláška WO 86/01533 (zverejnená 13. marca 1986); Kudo a ďalší, európska prihláška vynálezu 184187 (zverejnená 11. júna 1986); Sahagan a ďalší, J. Immunol. 137: 1066-1074 (1986); Robinson a ďalší, medzinárodná prihláška vynálezu č. WO 87/02671 (zverejnená 7. mája 1987); Liu a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sci USA 84 : 3439-3443 (1987); Sun a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sci USA 84: 214-218 (1987); Better a ďalší, Science 240: 1041-1043 (1988); Riechmann a ďalší, Náture 332: 323327; a Harlow a Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, vyššie. Tieto publikácie sú tu kompletne zahrnuté ich citáciou.

Kompletne humanizované protilátky sú molekuly obsahujúce tak variabilnú, ako aj konštantnú oblasť z ľudského imunoglobulínu. Kompletne humanizované protilátky môžu byť potenciálne používané na terapeutické použitie, keď je potrebná opakovaná liečba chronických a vracajúcich sa ochorení, ako napríklad autoimunitných ochorení. Jeden spôsob na prípravu kompletne humánnych protilátok pozostáva z humanizácie myšacieho humorálneho imunitného systému, tzn. produkcie myšacích kmeňov, ktoré sú schopné produkovať humánnu Ig (Xenomyší), prostredníctvom zavedenia humánnych imunoglobulínových Ig lokusov do myší, v ktorých boli inaktivované endogénne Ig gény. Ig lokusy sú nesmierne komplexné, čo sa týka tak ich fyzikálnej štruktúry, ako aj procesov preusporiadavania a expresie génov potrebných na konečnú produkciu rozsiahlej imunitnej odpovede. Protilátkové diverzita sa primárne generuje kombinačným preskupovaním medzi rozličnými V, D a J génmi nachádzajúcimi sa v Ig lokusoch. Tieto lokusy obsahujú aj premiešavacie regulačné elementy, ktoré riadia expresiu protilátok, alelické vylučovanie, prepínanie medzi triedami a afinitné zretie. Zavedením nepreskupených ľudských Ig transgénov do myší sa demonštrovalo, že myšací rekombinačný systém je kompatibilný s ľudskými génmi. Okrem toho, je

-9možné imunizáciou Xenomyší s antigénom získať hybridómy vylučujúce antigén špecifické humanizované monoklonálne protilátky rôznych izotypov.

Kompletne humanizované protilátky a spôsoby ich produkcie sú v oblasti známe (Mendez a ďalší, Náture Genetics 15: 146-156 (1997); Buggemann a ďalší, Euu. J. Immunol. 21: 1323-1326 (1991); Tomizuka a ďalší, Proc. Natl.. Acad. Sci. USA 97: 722-727 (2000); vynález WO 98/24893.

Anti-idiotypová (anti-ld) protilátka je protilátka, ktorá rozoznáva unikátne determinanty vo všeobecnosti asociované s antigén viažucim miestom protilátky. Anti-ld protilátka sa môže pripraviť imunizáciou zvieraťa rovnakého druhu a genetického typu (napr. myšací kmeň) ako má zdrojová monoklonálna protilátka, ktorej anti-ld sa má pripraviť. Imunizované zviera bude rozoznávať a reagovať na idiotypové determinanty imunizačnej protilátky produkciou protilátky proti týmto idiotipovým determinantám (anti-ld protilátka). Pozri napríklad US patent č. 4699880, ktorý je tu kompletne zahrnutý prostredníctvom jeho citácie.

Anti-ld protilátka sa môže použiť aj ako imunogén na indukciu imunitnej odpovede aj v inom zvierati pričom sa produkuje takzvaná anti-anti-ld protilátka. Anti-anti-ld môže byť epitopovo identická s pôvodnou monoklonálnou protilátkou, ktorá indukovala anti-ld. Takže použitím protilátok proti idiotypovým determinantám monoklonálnej protilátky je možné identifikovať iné klony, ktoré exprimujú protilátky s rovnakou špecifitou.

Z toho vyplýva, že monoklonálne protilátky proti LDLR, jeho izoformám, analógom, fragmentom alebo derivátom, podľa predloženého vynálezu, môžu byť použité na indukciu anti-ld protilátok vo vhodných živočíchoch, ako napríklad BALB/c myšiach. Slezinové bunky z takto imunizovaných myší sa používajú na produkciu anti-ld hybridómov vylučujúcich anti-ld monoklonálne protilátky. Anti-ld monoklonálne protilátky sa môžu tiež spojiť s nosičom, ako napríklad hemocyanínom zo svätojánskej mušky (KLH) a môžu sa použiť na imunizáciu ďalších BALB/c myší. Séra z týchto myší budú obsahovať anti-anti-ld protilátky, ktoré majú väzobné vlastnosti pôvodnej monoklonálnej protilátky špecifickej pre epitop vyššie uvedeného LDLR proteínu, alebo jeho analógy, fragmenty a deriváty.

Anti-ld monoklonálne protilátky tak majú svoje vlastné idiotypové epitopy, alebo idiotopy štrukturálne podobné s hodnoteným epitopom. Výraz mono-10klonálna protilátka je mienený aj tak, že zahŕňa tak neporušené molekuly, ako aj ich fragmenty, ako napríklad Fab a F(ab')2, ktoré sú schopné viazať antigén. Fab a F(ab')2 fragmentom chýba Fc fragment intaktnej protilátky, rýchlejšie sa odbúravajú z obehu a menej sa viažu v nešpecifických tkanivách, v porovnaní s intaktnou protilátkou (Wahl a ďalší, J. Nucl. Acid. 24: 16-25 (1998)).

Bude zrejmé, že Fab a F(ab')₂ a iné fragmenty protilátok užitočných v predloženom vynáleze sa môžu používať na detekciu a kvantifikáciu LDLR proteínu spôsobmi, tu opísanými pre intaktné protilátkové molekuly. Takéto fragmenty sa typicky produkujú proteolytickým štiepením použitím enzýmov, ako napríklad papaínu (na produkciu Fab fragmentov) alebo pepsínu (na produkciu F(ab')₂ fragmentov).

O monoklonálnej protilátke sa hovorí, že je schopná viazať molekulu, ak je schopná špecificky reagovať s molekulou, a tým naviazať molekulu na protilátku. Výraz epitop je mienený ako označenie časti akejkoľvek molekuly, ktorá je schopná byť viazaná protilátkou, a ktorú je táto protilátka schopná rozoznávať. Epitopy alebo antigénové determinanty zvyčajne pozostávajú z chemicky aktívnych povrchových zoskupení molekúl, ako napríklad aminokyselín alebo sacharidových bočných reťazcov, a majú špecifické trojrozmerné štrukturálne vlastnosti, ako aj špecifické nábojové vlastnosti.

Antigén je molekula alebo časť molekuly, ktorá je schopná byť viazaná protilátkou, pričom antigén je okrem toho schopný indukovať zviera k tvorbe protilátky, ktorá je schopná viazať sa na epitop antigénu. Antigén môže mať jeden alebo viac ako jeden epitop. Vyššie uvedeným termínom špecifická reakcia sa mieni to, že antigén bude reagovať, vysoko selektívnym spôsobom, s epitopom na jemu zodpovedajúcej protilátke, a nie s rôznymi inými protilátkami, ktoré môžu byť vyvolané inými antigénmi.

Protilátky, vrátane fragmentov protilátok, užitočné v predloženom vynáleze, môžu byť používané na kvantitatívnu alebo kvalitatívnu detekciu LDLR proteínov vo vzorke alebo na detekciu prítomnosti buniek, ktoré exprimujú LDLR proteíny podľa predloženého vynálezu. Toto sa môže uskutočňovať imunofluorescenčnými technikami využívajúcimi fluorescenčné značenú protilátku (pozri nižšie) spolu s

-11 fluorescenčnou mikroskopiou, prietokovou cytometriou alebo fluorimetrickou detekciou.

Protilátky (alebo ich fragmenty), užitočné v predloženom vynáleze, sa môžu využívať histologický, ako napríklad v imunofluorescenčnej alebo imunoelektrónovej míkroskopii, na in situ detekciu LDLR proteínov podľa predloženého vynálezu. In situ detekcia sa môže uskutočňovať odobratím histologickej vzorky od pacienta a pridaním značenej protilátky podľa predloženého vynálezu ku takejto vzorke. Protilátka (alebo fragment) sa výhodne pridáva nanesením alebo preliatím značenej protilátky (alebo fragmentu) na biologickú vzorku. Prostredníctvom použitia takéhoto postupu je možné stanoviť nie len prítomnosť LDLR proteínov, ale aj distribúciu LDLR proteínu v skúmanom tkanive. Použitím predloženého vynálezu bude pre priemerného odborníka zrejmé, že za účelom dosiahnutia in situ detekcie je možné modifikovať široký rozsah histologických metód (ako napríklad farbiace postupy).

Takéto testy pre LDLR proteíny podľa predloženého vynálezu typicky zahŕňajú inkubovanie biologickej vzorky, ako napríklad biologickej tekutiny, tkanivového extraktu, čerstvo izolovaných buniek, ako napríklad lymfocytov alebo leukocytov, alebo buniek, ktoré boli inkubované v tkanivovej kultúre, v prítomnosti značenej protilátky schopnej identifikovať LDLR proteíny, a detegovanie protilátky ktoroukoľvek z množstva techník, ktoré sú v oblasti dobre známe.

Biologická vzorka môže byť spojená s tuhým fázovým podkladom alebo nosičom, ako napríklad nitrocelulózou, alebo s iným tuhým podkladom alebo nosičom, ktorý je schopný imobilizovať bunky, bunkové častice alebo rozpustné proteíny. Podklad alebo nosič sa môžu potom premyť s vhodnými tlmivými roztokmi a následne sa na nich pôsobí značenou protilátkou podľa predloženého vynálezu, ako je uvedené vyššie. Tuhý fázový podklad alebo nosič sa potom môžu druhýkrát premyť s tlmivým roztokom, aby sa odstránila nenaviazaná protilátka. Množstvo značky naviazanej na tuhom fázovom podklade alebo nosiči sa potom môže detegovať bežnými prostriedkami.

Tuhým fázovým podkladom, tuhým fázovým nosičom, tuhým podkladom, tuhým nosičom, podkladom alebo nosičom sa myslí akýkoľvek podklad alebo nosič, ktorý je schopný viazať antigén alebo protilátky. Dobre známe poklady alebo nosiče zahŕňajú sklo, polystyrén, polypropylén, polyetylén, dextrán, nylonové

-12amylázy, prirodzenú alebo modifikovanú celulózu, polyakrylamidy, gabro a magnetit. Na účely predloženého vynálezu môže byť povaha nosiča buď rozpustná v určitom rozsahu, alebo nerozpustná. V skutočnosti môže mať podkladový materiál akúkoľvek možnú štrukturálnu konfiguráciu, pokiaľ je ako pripájacia molekula schopný viazať antigén alebo protilátku. Takže konfigurácia podkladu alebo nosiča môže byť guľovitá, ako napríklad pri guľôčkach, valcovitá, ako napríklad na vnútornom povrchu skúmavky alebo na vonkajšom povrchu tyčinky. Alternatívne môže byť povrch plochý, ako napríklad fólia, testovací pásik, atď. Výhodné podklady alebo nosiče zahŕňajú polystyrénové guľôčky. Priemernému odborníkovi v oblasti môžu byť známe iné vhodné nosiče na viazanie protilátky alebo antigénu, alebo ich bude schopný určiť použitím rutinného experimentovania.

Väzobná aktivita danej šarže protilátky podľa vynálezu, ako je uvedené vyššie, sa môže stanoviť v súlade s dobre známymi metódami. Priemerný odborník v oblasti bude schopný stanoviť operatívne a optimálne testovacie podmienky pre každé stanovovanie využitím rutinného experimentovania.

Do testov sa môžu pridať aj iné kroky, ako je napríklad premývanie, miešanie, pretrepávanie, filtrovanie a podobne, ak je to obvyklé alebo nevyhnutné v konkrétnej situácii.

Jedným zo spôsobov, ktorými sa protilátka podľa predloženého vynálezu môže značiť, je spájanie protilátky s enzýmom a jej použitie v enzýmovom imunoteste (EIA). Tento enzým bude na druhej strane, keď sa neskôr vystaví príslušnému substrátu, reagovať so substrátom takým spôsobom, že bude produkovať chemickú zlúčeninu, ktorú bude možné detegovať napríklad spektrofotometrickými, fluorometrickými alebo vizuálnymi prostriedkami. Enzýmy, ktoré sa môžu použiť na detegovateľné označenie protilátky, zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na malát dehydrogenázu, alfa-glycerofosfát dehydrogenázu, triózofosfát izomerázu, chrenovú peroxidázu, alkalickú fosfatázu, asparaginázu, glukozo oxidázu, beta-galaktozidázu, ribonukleázu, ureázu, katalázu, glukózo-6-fosfát dehydrogenázu, glukoamylázu a acetylcholín esterázu. Detekcia sa môže uskutočňovať kolorimetrickými spôsobmi, ktoré využívajú chromogénny substrát pre enzým. Detekcia sa môže uskutočňovať aj vizuálnym porovnávaním rozsahu enzymatickej reakcie substrátu s rozsahom u podobne pripravených štandardných vzoriek.

-13Detekcia sa môže uskutočňovať použitím ktoréhokoľvek z rôznych imunotestov. Napríklad, rádioaktívne značenými protilátkami alebo protilátkovými fragmentárni je možné detegovať R-PTPázu použitím rádioimunotestu (RIA). Dobrý opis RIA je možné nájsť v Laboratory Techniques and Biochemistry v Molecular Biology, od Work, T. S. a ďalší, North Holland Publishing Company, NY (1978) konkrétne v kapitole s názvom An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques od Chard, T., pričom táto publikácia je tu zahrnutá prostredníctvom jej citácie. Rádioaktívny izotop sa môže detegovať takými prostriedkami, akými sú napríklad použitie gama-snímača alebo scintilačného snímača alebo autorádiografiou.

Možné je aj značenie protilátky podľa predloženého vynálezu s fluorescenčnou zlúčeninou. Keď sa fluorescenčné značená protilátka exponuje na svetle so správnou vlnovou dĺžkou, je možné vďaka fluorescencii detegovať jej prítomnosť. Medzi najbežnejšie používané fluorescentné značiace zlúčeniny patrí fluoresceín, izotiokyanát, rodamín, fykoerytrín, pykokyanín, alofykokyanín, o-ftaldehyd a fluorescamín.

Protilátka môže byť detegovateľne značená aj použitím fluoescenciu emitujúcich kovov, ako napríklad ¹⁵²E, alebo iných prvkov zo skupiny lantanoidov. Tieto kovy sa môžu ku protilátke pripájať použitím chelatačných skupín, akými sú napríklad kyselina dietyléntriamínpentaoctová (ETPA).

Protilátka môže byť detegovateľne značená aj jej pripojením k chemiluminiscentnej zlúčenine. Prítomnosť protilátky s chemiluminiscentným príveskom sa potom stanovuje prostredníctvom detekcie prítomnosti luminiscencie, ktorá vzniká v priebehu chemickej reakcie. Príkladmi výnimočne užitočných chemiluminiscentných značiacich zlúčenín sú luminol, izoluminol, teromatický akridíniový ester, imidazol, akridíniová soľ a oxalátový ester.

Podobným spôsobom môže byť na značenie protilátky podľa predloženého vynálezu použitá bioluminiscentná zlúčenina. Bioluminiscencia je typ chemiluminiscencie vyskytujúcej sa v biologických systémoch, pri ktorej katalytický proteín zvyšuje účinnosť chemiluminiscentnej reakcie. Prítomnosť bioluminiscentného proteínu sa stanovuje prostredníctvom detekcie prítomnosti luminiscencie. Na účely

-14značenia sú dôležitými bioluminiscenčnými zlúčeninami luciferín, luciferáza a ekvorín.

Protilátková molekula podľa predloženého vynálezu môže byť upravená na využitie v imunometrickom teste, známom aj ako dvojvrstvový alebo sendvičový test. V typickom imunometrickom teste sa určité množstvo nenaviazanej protilátky (alebo fragmentu protilátky) naväzuje na tuhý podklad alebo nosič a pridáva sa určité množstvo detegovateľne značenej rozpustnej protilátky, aby sa umožnila detekcia a/alebo kvantifikácia trojitého komplexu tvoreného tuhou fázovou protilátkou, antigénom a značenou protilátkou.

Imunometrické testy typicky a výhodne zahŕňajú priame testy, pri ktorých sa protilátka naviazaná na tuhú fázu najprv uvádza do kontaktu so vzorkou, ktorá sa testuje, aby sa extrahoval antigén zo vzorky prostredníctvom vytvorenia binárneho tuhého fázového komplexu protilátka-antigén. Po vhodnej inkubačnej dobe sa tuhý podklad alebo nosič premyje, aby sa odstránil zvyšok tekutej vzorky vrátane nezreagovaného antigénu, ak sa tam nejaký nachádza, a potom sa uvedie do kontaktu s roztokom obsahujúcim neznáme množstvo značenej protilátky (ktorá funguje ako reporterová molekula). Po druhej inkubačnej dobe, ktorá umožňuje vytvorenie komplexu značenej protilátky s antigénom naviazaným na tuhý podklad alebo nosič prostredníctvom značenej protilátky, sa tuhý podklad alebo nosič premyje druhýkrát, aby sa odstránila nezreagovaná značená protilátka.

V inom type sendvičového testu, ktorý môže byť taktiež užitočný s antigénmi podľa predloženého vynálezu, sa používajú takzvané simultánne a reverzné testy. Simultánny test zahŕňa len jeden inkubačný krok, keďže sa k vzorke, ktorá sa má testovať, súčasne pridáva tak protilátka naviazaná na tuhý podklad alebo nosič, ako aj značená protilátka. Po ukončení inkubovania sa tuhý podklad alebo nosič premyje, aby sa odstránil zvyšok tekutej vzorky a značených protilátok, ktoré nie sú v komplexe. Prítomnosť značenej protilátky spojenej s tuhým podkladom alebo nosičom sa potom stanovuje tak, ako v bežnom priamom sendvičovom teste.

V reverznom teste sa využíva postupné pridávanie najprv roztoku značenej protilátky k tekutej vzorke a potom, po vhodnej inkubačnej dobe, následné pridávanie značenej protilátky naviazanej na tuhý podklad alebo nosič. Po druhom

-15inkubovaní sa tuhá fáza premyje obvyklým spôsobom, aby sa zbavila zvyšku testovanej vzorky a roztoku nezreagovanej značenej protilátky. Stanovenie značenej protilátky spojenej s tuhým podkladom alebo nosičom sa potom uskutočňuje ako v simultánnom a priamom teste.

Vynález bude teraz ilustrovaný nasledujúcimi neobmedzujúcimi príkladmi.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1 znázorňuje vývojový diagram zobrazujúci vývoj monoklonálnych protilátok proti r-hsLDLR.

Obrázok 2 znázorňuje Western blot analýzu +291 formy r-hsLDLR v dráhe 1, močového hsLDLR v dráhe 2 a rekombinantného ľudského p55 TNF receptora, ako negatívnej kontroly (r-hTBP-1), v dráhe 3, s monoklonálnymi protilátkami uvedenými pod každým pruhom. Šípky naľavo od obrázku označujú polohu markerov molekulovej hmotnosti a šípky napravo od obrázku upozorňujú na polohu hsLDLR formy uvedenej nad každou šípkou.

Obrázok 3 znázorňuje vplyvy monoklonálnych protilátok 12.6, 25 a 29.8 na produkciu HCV (+) a (-) vlákien v kultúre FT167. Bunky sa ošetrovali 30 minút pred infekciou s Mab anti-LDLR (8 alebo 2 pg/ml). Potom sa bunky infikovali cez noc s 25 μΙ HCV (+) séra (N42; 1b). Deň po infekcii sa uskutočnili tri premývania a pridalo sa nové médium, ktoré sa menilo každých 48 hodín. Päť dní po infekcii sa zozbierali hepatocyty, purifikovala sa RNA a 1 pg bunkovej RNA sa analyzoval prostredníctvom rTth RT-PCR (Perkin Elmer). Testy sa uskutočňovali dvojmo. +SP: test RNA s pozitívnym vláknom; -SP: test RNA s negatívnym vláknom; X: blank.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Príprava CHO r-hsLDLR

Stabilné rekombinantné CHO bunky exprimujúce ľudský rozpustný LDLR sa generovali prostredníctvom kotransfekcie CHO-DUKX buniek, ktorým chýba

-16dihydrofolát reduktázový (DHFR) gén (Urlaub, G. a ďalší, 1980), dvoma expresnými vektormi: psLDLROl obsahujúcim N-koncovú ligand viažucu doménu LDLR začínajúcu aminokyselinovým zvyškom Asp (+4) a končiacu Glu (+291), a pDHRF, obsahujúcim myšací gén pre DHFR, pričom oba sú riadene promótorom a transkripčnými terminačnými elementárni SV40 skorej oblasti. Transfekcia sa uskutočňovala prostredníctvom katiónových lipozómov použitím LipofectAmine (Gibco BRL) v súlade s protokolom opísaným výrobcom. Sedemdesiatdva hodín po transfekcii sa bunky preniesli do selektívneho média bez deoxynukleozitov a ribonukleozitov, ktoré bolo obohatené o 10% dialyzované FCS. Bunky vykazujúce DHFR aktivitu boli schopné vytvárať kolónie, ktoré sa izolovali vytiahnutím buniek prostredníctvom papierových diskov nasiaknutých trypsínom. Bunky sa nechali rásť a skrínovali sa z hľadiska r-hsLDLR aktivity. Transfekované bunky sa potom podrobili génovej amplifikácii prostredníctvom MTX, nasledovalo subklonovanie a selekcia stabilných produkčných klonov.

R-hsLDLR (+291) forma sa produkovala bunkami stabilného CHO produkčného klonu označeného ako č. 33-10-29-21, v päťlitrovom CelliGen bioreaktore v médiu bez séra (Gibco CHO-A-SFM kat. č. 95-0091 DJ). Izoloval sa surový extrakt a vyčíril sa filtráciou cez 0,8μ až 0,2μ kartridžový filter (Gelman kat. č. CSS92DSCCK) a na 5kDa membráne sa stonásobne zakoncentroval. +291 forma r-hsLDLR použitá na prvé imunizácie sa purifikovala použitím purifikačného postupu v malom meradle. V tomto postupe sa používala DEAE-Sepharose katiónová výmenná kolóna, nasledoval hydrofóbny interakčný krok na Butyl-TSK kolóne, nasledovala HTP kolóna a krok veľkostnej vylučovacej chromatografie (SEC) na Sephacryl 100 kolóne. Vybrala sa SEC frakcia č. 27, keďže mala špecifickú protivírusovú aktivitu s hodnotou 780 jednotiek/pg, detegovanú protivírusovým testom opísaným v príklad 9, nižšie. Prostredníctvom N-koncovej analýzy sa proteín v tejto frakcii identifikoval ako r-hsLDLR.

Purifikovala sa druhá séria CHO +291 r-hsLDLR a použila sa na boosterové injektovanie myší. Purifikovala sa použitím prepracovaného procesu s vyšším výťažkom, ktorý zahŕňal nasledujúce kroky: a) vyčírenie a stonásobné zakoncentrovanie surového izolátu; b) HQ POROS aniónovú výmennú kolónu, a c) dva hydrofóbne interakčné (HIC) kroky: zachytenie na Butyl-TSK kolóne a prietok cez

-17Phenyl 5PW kolónu. Nenaviazaná frakcia z posledného HIC kroku sa dialyzovala a purifikovala na HS-POROS katiónovej výmennej kolóne. Posledným krokom bola hydroxyapatitová (HTP) kolóna. Takto získaný r-hsLDLR bol purifikovaný na približne 90 %, pričom eluoval ako jediný hlavný vrchol pri RP-HPLC.

Príklad 2

Imunizácia myší pg purifikovaného r-hsLDLR frakcie č. 27 zo SEC kolóny z príkladu 1, vyššie, s koncentráciou 100 pg/ml, sa homogenizovalo s kompletným Freundovým adjuvans (CFA, 50 % v/v) a injekčné sa podalo do labky každej z piatich sedemtýždňových samičiek BALB/c myší.

Štyri týždne po prvej imunizácii sa myšiam podala intramuskulárne boosterová injekcia 10 pg rovnakej frakcie purifikovaného r-hsLDLR, v 50% (v/v) roztoku CFA.

Dva týždne po druhej injekcii sa myšacie séra testovali na protilátky proti r-hsLDLR použitím priamej ELISA opísanej v príklad 3, nižšie.

Dvom myšiam, M-1 a M-2, s najvýznamnejšou špecifickou imunoreaktivitou voči r-hsLDLR, sa podala ďalšia boosterová injekcia, 10 týždňov po druhej injekcii, obsahujúca 10 pg purifikovaného r-hsLDLR získaného v prepracovanom purifikačnom procese opísanom vyššie, v príklade 1.

14 týždňov neskôr sa myšiam odobrala krv a testovala sa na protilátky proti r-hsLDLR. Potom dostali dve ďalšie boosterové dávky, 50 pg r-hsLDLR v PBS: prvú intraperitoneálne a druhú, o dva dni neskôr, aj intraperitoneálne, aj intravenózne.

Dva týždne po druhej injekcii sa myšiam odobrala krv a antisérum sa testovalo z hľadiska anti-r-hsLDLR aktivity priamou ELISA podľa príkladu 3 uvedeného nižšie. Každé antisérum sa sériovo nariedilo v pomere 1:100 až 1:32000 a dvojmo sa nanieslo na 96-jamkové platne pokryté s r-hsLDLR, ktorý bol purifikovaný použitím prepracovaného purifikačného procesu opísaného vyššie, v príklade 1, v množstve 10 U/jamku. V prvej jamke každého radu sa ako blanky použil testovací tlmivý roztok a DMEM + 10% HS obsahujúce PBS + 1% BSA alebo želatína + 0,05% Tween 20 + 0,05% timerozal. Ako negatívna kontrola sa do

-18posledných dvoch radov aplikovalo normálne myšacie sérum (NMS) v rovnakom rozsahu riedení. Absorbancia enzymatickej reakcie sa merala s ELISA snímačom pri 492 nm a 405 nm.

Z výsledkov tohto testu vyplynulo, že sérum od myši M-1 má vyššiu špecifickú imunoreaktivitu s r-hsLDLR, a preto sa táto myš usmrtila a odobrali sa slezinové bunky na fúziu s myelómovými bunkami (EshharZ., 1985)

Príklad 3

Priama ELISA na testovanie antisér a skríning hybridómových klonov

Priama ELISA na skríning pozitívnych antisér sa uskutočňovala nasledovne: 96-jamkové platne sa pokryli so 100 μΙ r-hsLDLR (purifikovaným prepracovaným purifikačným procesom podľa príkladu 1), 100 jednotiek/ml (10 U/jamka) v PBS + 1% želatína (Sigma kat. č. G-7765) + 0,9mM Ca⁺² a 0,5mM Mg⁺², pH 5,6, pričom tento roztok sa tu ďalej označuje ako testovací tlmivý roztok, na 90 minút pri 37 °C s pretrepávaním. Platne sa šesťkrát premývali v PBS + 0,05% Tween 20 (polyoxyetylénsorbitan monolaurát - Sigma P-1379), ktorý sa tu ďalej označuje ako premývací roztok.

Do jamiek sa pridali antisérove vzorky z ímunizovaných myší sériovo nariedené v pomere 1:100 až 1:32000, alebo supernatant z hybridómových bunkových kultúr a inkubovali sa 90 minút pri 37 °C, pričom sa pretrepávali, a nasledovalo šesť premývaní v premývačom roztoku.

Do jamiek sa pridalo 100 μΙ kozej protilátky proti myšacej Fab konjugovanej s chrenovou peroxidázou (HRP)-APA (Sigma kat. č. 4601-1), ktorá bola nariadená v pomere 1:1200, a inkubovalo sa 90 minút pri 37 °C, pričom sa pretrepávalo, a potom nasledovalo šesťnásobné premývanie s premývacím roztokom.

Do jamiek sa pridalo 100 μΙ substrátového roztoku (pripraveného rozpustením jednej tabletky OPD ajednej tabletky H2O2 v 90 ml vody) a inkubovali sa pri laboratórnej teplote 30 minút. Enzymatická reakcia sa zastavila pridaním 100 μΙ/jamku 4N HCI.

-19Absorbancia v 96-jamkových platniach sa odčítavala použitím ELISA snímača pri 492 a 405 nm a výsledky sa vypočítali použitím štvorparametrového logistického algoritmu prostredníctvom MultiCalc softwaru na PC počítači prepojenom s ELISA snímačom.

Príklad 4

Fúzia, príprava hybridómov, selekcia klonov a purifikácia protilátok s ascitických tekutín

Fúzovací proces a selekcia hybridómových buniek sa uskutočňovali podľa protokolov v Eshhar Z, 1985. Stručne: slezinové bunky z myši M-1, ktorej sa podala boosterová injekcia 2 až 4 dni pred fúziou, sa fúzovali s myelómovými bunkami prostredníctvom krátkeho inkubovania s PEG. PEG sa najprv pomaly nariedil s DMEM a potom sa úplne odstránil centrifugáciou. Bunky sa znova rozsupendovali v DMEM HAT médiu, rozdistribuovali sa do 96-jamkových platní v koncentrácii približne 3,4x10⁴ buniek/jamku a inkubovali sa 10 až 14 dní v inkubátore s 8% CO2 pri 37 °C. Do desiatich dní sa médium vo všetkých hybridómových jamkách zamenilo za DMEM doplnené s 10% koňským sérom (HS). Vzorky hybridómových kultivačných supernatantov sa skrínovali z hľadiska prítomnosti monoklonálnych protilátok proti r-hsLDLR prostredníctvom priamej ELISA opísanej vyššie, v príklade

3. Ako blanky sa použili testovací tlmivý roztok a DMEM+10% HS. Ako pozitívne kontroly sa použili monoklonálna protilátka C7 (komerčne dostupná od Amersham) a M-1 myšacie antisérum, pričom monoklonálna protilátka proti rozpustnému p55 TNF receptoru bola použitá ako negatívna kontrola. Bunky z jamiek, v ktorých sa detegovala prítomnosť protilátok v kultivačnom supernatante, sa preniesli do 24jamkových platní a potom do 25cm² T-fľaší. Expandované kultúry sa monitorovali z hľadiska vylučovania monoklonálnych protilátok proti r-hsLDLR. Ampulky buniek z pozitívnych kultúr sa zmrazili a uskladnili v kvapalnom dusíku.

Celkovo sa na detekciu protilátok proti r-hsLDLR skrínovalo približne 1000 kultúr. 54 kultúr s najvyššou imunologickou aktivitou sa opätovne testovalo niekoľko krát. Päť kultúr (12, 28, 29, 30 a 50) s najvyššou aktivitou sa klonovalo prostredníctvom limitného riedenia v 96-jamkových platniach. Supernatanty z

-20pestovaných klonov sa niekoľko krát testovali na protilátky proti r-hsLDLR prostredníctvom priamej ELISA.

Bunky pozitívnych hybridómových klonov sa pestovali v tkanivových kultivačných fľašiach v DMEM obsahujúcom 15% koňské sérum a ampulky z časti kultúr sa zmrazili. Paralelne sa bunky rôznych hybridómových klonov injektovali do 2 až 4 myší (pre každý kloň), aby sa získali ascitické tekutiny. Protilátky sa z ascitickej tekutiny purifikovali buď precipitáciou prostredníctvom síranu amónneho, alebo na proteín G kolóne. Stručne: 7,5 ml ascitickej tekutiny sa nariedilo v pomere 1:3 v 20mM fosfátovom tlmivom roztoku, pH 7, a nanieslo sa na 5ml proteín G kolónu (C10/10). Kolóna sa premyla s 20mM fosfátovým tlmivým roztokom, pH 7, a monoklonálne protilátky sa eluovali so 100mM glycínovým tlmivým roztokom, pH 2,7. pH elučnej frakcie sa nastavilo na 7 až 7,5 s 1M Tris tlmivým roztokom, pH 9,3.

Príklad 5

Skríning párov monoklonálnych protilátok na použitie v ELISA a optimalizácia ELISA parametrov

Monoklonálne protilátky purifikované z ascitických tekutín podľa vyššie uvedeného príkladu 4 sa použili na uskutočňovanie sady experimentov v matricovom formáte na selekciu najvhodnejšieho páru monoklonálnych protilátok na použitie ako prvá a sekundárna protilátka v sendvičovej ELISA pre r-hsLDLR, ktorá je opísaná nižšie, v príklade 6. Stručne: do 96-jamkových platní sa pridala ascitická tekutina odvodená od piatich hybridómov (č. 12, 28.28, 29.08, 30 a 50.05), ktoré boli purifikované buď prostredníctvom precipitácie so síranom amónnym, alebo na proteín G kolóne. Protilátky sa skrínovali použitím +291 formy, ako aj +292 (od aminokyselinového zvyšku Asp+4 po Cys+292) formy a +331 (od aminokyselinového zvyšku Asp +4 po Cys +331) formy r-hsLDLR, ktoré boli produkované v CHO bunkách, ako antigénov. Jeden ml každej z vyššie uvedených čiastočne purifikovaných monoklonálnych protilátok sa označil biotínom na rýchly skríning ich vhodnosti ako sekundárnych protilátok v sendvičovej ELISA. Stručne: 1,5 gg monoklonálnych protilátok purifikovaných precipitáciou na sírane amónnom sa nastavilo na pH 8,5 s 30 μΙ 0,5M NaHCO3· Pridalo sa 0,75 mg Biotín-OSu, N-21 hydroxysukcínimido-biotínu (Biotin-Osu, Sigma, kat. č. H1759, z roztoku 5 mg v 200 ml DMSO) k protilátkovému roztoku a inkubovalo sa dve hodiny pri laboratórnej teplote za mierneho pretrepávania, nasledovalo inkubovanie cez noc pri 2 až 8 °C. Reakčný roztok sa naniesol na Sephadex G-25M (Pharmacia kat. č. 17-0851-01) PD10 kolónu, aby sa oddelili biotinylované monoklonálne protilátky a nadbytok nezreagovaného biotín-OSu.

Prvé predbežné experimenty naznačovali, že monoklonálne protilátky 29.08 a 30 produkujú najvyšší signál oproti pozadiu, keď sa použijú ako sekundárne protilátky v ELISA.

Reakcia týchto dvoch klonov sa znova testovala vo forme sekundárnych protilátok, pričom na platniach boli nanesené protilátky 12, 28, 29.8 a 50. Výsledky tohto experimentu jasne ukázali, že monoklonálna protilátka 28 je najvhodnejšia na pokrývania.

Najlepšie výsledky, čo sa týka intenzity a špecifickosti signálu, sa dosiahli s monoklonálnou protilátkou 28, použitou na pokrývanie mikrotitračnej platne, a monoklonálnou protilátkou 29.08, značenou s biotínom, ako sekundárnou protilátkou. Použitím týchto monoklonálnych protilátok sa získali dobré výsledky zo všetkými troma formami (+291, +292 a +331) r-hsLDLR. Pri všetkých formách bola absorbancia pri 492/405 nm približne 1,3 OD.

Analyzovali sa tri formy r-hsLDLR antigénu v sériových riedeniach v koncentračnom rozsahu 0,9 až 1000 ng/ml. Získala sa dávková odpoveďová krivka s monoklonálnou protilátkou použitou na pokrývanie a s biotinylovanou monoklonálnou protilátkou 29.08 ako sekundárnou protilátkou. Výsledkom tejto kombinácia bola lineárna odpoveď v koncentračnom rozsahu 1 až 10 ng/ml r-hsLDLR

Prostredníctvom testovania nasledujúcich parametrov sa optimalizovali rôzne parametre, ktoré môžu ovplyvňovať ELISA test, ako napríklad koncentrácia reakčných činidiel, inkubačné časy, výber tlmivých roztokov a platní:

- Pokrývanie jamiek v mikrotitračnej platni s 5 až 10 μg/ml monoklonálnej protilátky 28 v PBS.

- Zloženie tlmivých roztokov:

a) PBS+Tween 20

-22b) Tris+Ca⁺²+NaCI+Tween 20

- Blokovacie roztoky:

a) 1 % želatína v PBS, 0,05% Tween, 0,005% timerozal

b) 1% BSA v PBS, 0,05% Tween, 0,005% timerozal

c) 1% FBS v PBS, 0,05% Tween, 0,005% timerozal

d) 1% mlieko v PBS, 0,05% Tween, 0,005% timerozal

e) I Block, Hy Pep a Hy Yeast

- Sekundárna monoklonálna protilátka 29.08, značená s biotínom, v koncentráciách 1:500, 1:1000, 1:2000, 1:4000, 1:8000, 1:10000, čo sa rovná koncentračnému rozsahu 10,74 až 0,537 ng/ml.

- Extravidínové koncentrácie: 1:500,1:1000,1:2000, 1:4000, 1:8000, 1:10000, čo sa rovná koncentračnému rozsahu 4 až 0,2 μg/ml.

Na základe týchto experimentov sa zaviedol konečný postup pre sendvičový ELISA test, opísaný nižšie, v príklade 6.

Príklad 6

Zavedenie sendvičovej ELISA pre r-hsLDLR

Zaviedla sa sendvičová ELISA pre r-hsLDLR použitím monoklonálnych protilátok 28 a 29.08. Stručne: 96-jamkové platne sa pokrývali so 100 μΙ monoklonálnej protilátky 28, purifikovanej na proteíne G ^g^l), cez noc pri 2 až 8 °C, alebo 3 hodiny pri 37 °C. Platne sa potom päťkrát premyli s PBS+0,05% Tween 20. Platne sa inkubovali s 200 μΙ blokovacieho roztoku (PBS+1% BSA alebo želatína + 0,05% Tween 20 + 0,05% timerozal) jednu hodinu pri 37 °C, alebo cez noc pri 4 °C, a päťkrát sa premývali s PBS+0,05% Tween 20. Do každej jamky sa pridalo 100 μΙ vzoriek alebo antigén na kalibračnú krivku (CHO +291 r-hsLDLR, 0,5 až 32 ng/ml, nariedený v blokovacom roztoku) a inkubovalo sa 90 minút pri 37 °C s pretrepávaním. Platne sa potom päťkrát premyli s PBS+0,05% Tween 20.

Pridalo sa 100 μΙ/jamku biotinylovanej monoklonálnej protilátky 29.08 (0,67 μg/ml) v blokovacom tlmivom roztoku a inkubovalo sa s pretrepávaním hodinu pri 37 °C. Platne sa päťkrát premyli s PBS+0,05% Tween 20. Do jamiek sa pridalo 100 μΙ

-23komerčného konjugátu extravidín-peroxidáza (ExtrAvidin™-Peroxidase BioMakor, kat č. 0645-1), nariedeného v pomere 1:10000, a inkubovalo sa s pretrepávaním jednu hodinu pri 37 °C. Platne sa potom päťkrát premyli s PBS+0,05% Tween 20. Do každej jamky sa pridalo 125 μΙ vyššie uvedeného substrátového roztoku a inkubovalo sa približne 10 minút, až kým sa nevyvinula farba požadovanej intenzity. Reakcia sa zastavila pridaním 125 μΙ 4N HCI. Absorbancia v 96-jamkových platniach sa odčítavala použitím ELISA snímača pri 492 a 405nm vlnových dĺžkach a výsledky sa vypočítavali prostredníctvom MultiCalc softwaru PC počítača pripojeného na ELISA snímač.

Príklad 7

Izotyp monoklonálnych protilátok

Ig izotyp monoklonálnych protilátok sa stanovoval použitím komerčného izotypovacieho kitu (PharMingen International) v súlade s testovacím postupom podľa inštrukcií výrobcu. Klony 12.6, 28, 29.8 a 30 sa identifikovali ako IgG, zatiaľ čo kloň 50.30 sa identifikoval ako patriaci do triedy IgM.

Príklad 8

SDS-PAGE Western blot analýza +291 forma purifikovaného r-hsLDLR a natívneho LDLR purifikovaného z ľudského moču sa analyzovali Western blot analýzou s monoklonálnymi protilátkami vyvinutými proti r-hsLDLR. Stručne: na 12% SDS polyakrylamidový gél sa naniesla CHO +291 forma r-hsLDLR, alebo natívny močový hsLDLR alebo TBP-1 surový izolát (ako negatívna kontrola), v množstve 100 μg/dráhu, v redukujúcich podmienkach (40mM DTT). Do jednej dráhy sa naniesol marker malých molekulových hmotností (LMW). Táto sada vzoriek sa nechala bežať päťkrát. Proteíny separované na géle sa preniesli elektroelúciou na niťrocelulózové membrány. Membrány sa inkubovali v PBS obsahujúcom 10% mlieko s nízkym obsahom tuku, 0,1% Tween 20, 16 hodín. Membrány sa postrihali na pásy a každý pás sa inkuboval 2 hodiny pri laboratórnej teplote s jednou z piatich vybraných

-24monoklonálnych protilátok: 12.6, 30, 50.30, 28 alebo 29.08 (ascitická tekutina nariedená v pomere 1:4000).

Membránové pásy sa premývali s PBS obsahujúcim 0,1% Tween 20 (3 x 15 minút) a hodinu sa inkubovali so sekundárnou kozou protimyšacou protilátkou

I I konjugovanou s komplexom chrenovej peroxidázy a alkalickej fosfatázy (nariadená v pomere 1:10000, BioMakor) 2 hodiny pri laboratórnej teplote.

Pásy sa premývali s PBS obsahujúcim 0,1% Tween 20 (3 x 5 minút). Pozitívne pásy sa detegovali prostredníctvom zosilnenej chemiluminiscencie (ECL, Amersham).

Monoklonálne protilátky č. 12.6 a 29.8 rozoznávali tak močovú, ako aj +291 formu purifi ková ného r-hsLDLR vo Western blot analýze (obrázok 2). Monoklonálne protilátky 28 a 30 rozoznávali +291 formu purifikovaného r-hsLDLR.

Príklad 9

Inhibovanie r-hsLDLR protivírusovej aktivity monoklonálnymi protilátkami

Monoklonálne protilátky, ktoré špecificky reagujú s r-hsLDLR, sa testovali z hľadiska ich schopnosti blokovať protivírusovú aktivitu r-hsLDLR (+291 forma) in vitro, použitím cytopatického účinku (CPE) inhibičného testu vo VSV/WISH systéme.

WISH bunky (humánneho amnionového pôvodu) sa kultivovali v MEM doplnenom s 10% FBS a 4mM glutamínom ph 37 °C, v inkubátore s 5% CO2. Exponenciálne rastúce bunky sa vysiali na 96-jamkové tkanivové kultivačné platne, s hustotou 40000 buniek/jamku, 24 hodín pred začiatkom testu. Testované vzorky a štandard sa nariedili a rozdistribuovali sa do jamiek obsahujúcich bunky. Do jamiek sa okamžite pridal VSV s multiplicitou infekcie (MOI) 0,5 pfu/bunku. Platne sa inkubovali 16 až 18 hodín pri 37 °C a potom sa premyli s etanolom. Monovrstva prežívajúcich buniek sa vizualizovala prostredníctvom farbenia s Gram kryštalickou fialovou. Kvantifikácia cytopatického účinku vo vzťahu ku štandardu sa uskutočňovala grafickým zaznamenaním farebnej hustoty oproti štandardnej koncentrácii.

-25Na analýzu neutralizačného účinku protilátok sa r-hsLDLR predinkuboval 30 minút pri 37 °C so zvyšujúcimi sa koncentráciami ascitickej tekutiny s testovanou monoklonálnou protilátkou. Tieto roztoky sa potom pridali ku kultúram WISH buniek v 96-jamkových mikrotitračných platniach a nasledovalo pridanie vírusu vezikulárnej stomatitídy (VSV). Po 18 hodinách irikubovania sa determinovala lýza buniek sprostredkovaná VSV prostredníctvom farbenia zostávajúcich buniek kryštalickou violeťou. Semi-kvantitatívna analýza cytopatického účinku vo vzťahu k štandardu sa uskutočňovala grafickým znázornením farebnej intenzity (stanovenej ELISA snímačom) oproti štandardnej koncentrácii.

Účinok monoklonálnych protilátok sa testoval so zvyšujúcimi sa koncentráciami r-hsLDLR. Ako je uvedené v tabuľke I, zistilo sa, že dve monoklonálne protilátky (12.6 a 50.30) vykazujú neutralizačnú aktivitu.

V experimente uvedenom v tabuľke 1 sa testoval inhibičný účinok dvoch monoklonálnych protilátok v riedení ascitických tekutín 1:40. Pri tomto riedení vykazovala monoklonálna protilátka 12.6 o niečo vyššiu aktivitu ako monoklonálna protilátka 50.30. To môže byť dôsledkom vlastností monoklonálnych protilátok, ako aj rozdielov ich koncentrácií v ascitickej tekutine.

Inhibičný účinok monoklonálnych protilátok by sa mohol prekonať zvýšením rhsLDLR vo vzťahu ku koncentrácii monoklonálnych protilátok. V skutočnosti, pri koncentrácii r-hsLDLR 62,5 U/ml, nemala žiadna monoklonálna protilátka vplyv na rhsLDLR aktivitu v koncentrácii, ktorá bola analyzovaná.

Tabuľka 1

Inhibícia r-hsLDLR protivírusovej aktivity klonmi 12.6 a 50.30*

VSV/Mab	Koncentrácia LDLR (U/ml)
0	2,5	12,5	62,5
-VSV	1,5	1,2	1,6	1,5
+VSV	(0,25)	1	7(1,7)	1,7
+VSV + kloň 50.30	6(0,4)	0,88	(1,25)	1,62
+VSV + kloň 12.6	5(0,5)	0,77	7(0,7)	1,67

-26Inhibícia r-hsLDLR protivírusovej aktivity oproti VSV sprostredkovanej bunkovej lýze WISH buniek. Inhibičný účinok monoklonálnych protilátok pri riedení ascitickej tekutiny 1:40. Počet životaschopných buniek je v tabuľke vyjadrený vo forme OD hodnôt. Čísla v zátvorkách predstavujú opakovanie uskutočňované s koncentráciami LDLR 0 a 12,5 U/ml.

Inhibícia protivírusovej aktivity r-hsLDLR sa stanovovala použitím zvyšujúcich sa koncentrácií monoklonálnych protilátok 12.6 a 50.30. Monoklonálna protilátka 12.6 inhibovala protivírusovú aktivitu r-hsLDLR na 60 % pri riedení 1:40 (riedenie ascitickej tekutiny) a na 35 % pri riedení 1:20500. Kloň 50.30 inhiboval r-hsLDLR aktivitu na 45 % pri riedení 1:40 a na 15 % pri riedení 1:20500.

Dávkové odpoveďové krivky získané pre obe monoklonálne protilátky, a pozorovanie toho, že ich inhibičný účinok je oslabený nadbytkom r-hsLDLR, naznačujú, že tieto monoklonálne protilátky účinkujú prostredníctvom viazania sa na r-hsLDLR.

Príklad 10

Inhibícia HCV replikácie monoklonálnymi protilátkami

Monoklonálne protilátky špecifické pre r-hsLDLR sa testovali z hľadiska ich schopnosti inhibovať HCV replikáciu v ľudských hepatocytoch v primárnej kultúre. FT167 bunková kultúra sa získala od 57 ročného mužského pacienta po liečebnej lobektómii (metastázy nádora hrubého čreva, pravý lalok).

Primárne kultúry humánnych hepatocytov sa pripravili dvojkrokovou kolagenázovou perfúznou metódou (Maurel P., Adv. Drug Del. Rev. 22: 105-132 (1996), Richard L. a ďalší, Mol. Pharmacol. 41: 1047-1055 (1992), Ferrini J.B. a ďalší, Chem Biol Interactions 107: 31-45 (1997)). Životaschopnosť buniek sa pred nanášaním na platne stanovovala použitím trypánového modrého vylučovacieho testu. Štyri milióny buniek v 3 ml kultivačného média sa vysiali na 60mm plastové platne pred tým potiahnuté kolagénom v dlhotrvajúcom kultivačnom médiu bez séra pozostávajúcom z Williams'E, doplnenom ako bolo zverejnené v Lanford R. a ďalší, In Vitro Celí Dev. Bio. 25: 174-182 (1989). Toto médium sa následne obnovovalo každých 48 hodín. Kultúry sa udržiavali pri 37 °C vo zvlhčenej vzduchovej atmosfére

-27a 5% oxide uhličitom. V týchto kultivačných podmienkach si ľudské hepatocyty zachovávajú svoj diferenciačný fenotyp aspoň 35 dní (Ferrini J.B. a ďalší, ChemBiol Interactions 107: 31-45 (1997)) a sú citlivé na HCV infekciu a umožňujú replikáciu vírusového genómu (Fournier C. a ďalší, J. Gen Virol. 79: 2367-2374 (1998)).

HCV-pozitívna sérová vzorka: Zaviedla sa banka ľudských sér od pacientov otestovaných ako pozitívnych anti-HCV protilátkou prostredníctvom EIA HVC 3.0 a Chiron RIBA HCV 3.0 SIA. Žiadny z týchto pacientov nebol infikovaný aj s HBV alebo HIV. V každej sérovej vzorke sa kvantifikovala HCV RNA prostredníctvom Roche monitora a určil sa jej genotyp prostredníctvom líniového sondového testu (Inno-Lipa HCV II, Innogenetics). Sérové vzorky sa uskladňovali pri -80°C, v malých alikvotách, aby sa zamedzilo cyklickému rozmrazovaniu a zmrazovaniu. V týchto experimentoch sa použila vzorka S42 (genotyp Ib; vírusová dávka 410000 kópií/ml).

Na infekciu a následné ošetrenia sa hepatocytové kultúry preniesli v sterilných podmienkach do P3-laboratória (striktne vymedzené pre ľudské infekčné organizmy). O tri dni neskôr, po vysiati na misku, keď sa bunky zotavili z izolačnej traumy, uskutočnila sa in vitro infekcia hepatocytov prostredníctvom inkubovania cez noc s 25 μΙ HCV-pozitívnej sérovej vzorky (S42) v 3 ml média. Po infekcii sa bunky trikrát premyli s 3 ml čerstvého média a kultivácia pokračovala v normálnych podmienkach v dlhodobom kultivačnom médiu.

Bunky sa ošetrovali s 3 rozličnými monoklonálnymi protilátkami proti r-hsLDLR, Mab 12.6, Mab 28 a Mab 29.8. Tridsať minút pred infekciou sa bunky vystavili 2 alebo 8 pg/ml každej z rozličných monoklonálnych protilátok. Potom sa bunky infikovali ako je opísané vyššie.

Kontrolné kultúry sa infikovali v podobných podmienkach, ale chýbalo protivírusové ošetrenie. V paralelných experimentoch sa rovnaké kultúry ošetrovali s 5000 U/ml IFNa, v podobných podmienkach na porovnanie (IFNa silne inhibuje HCV replikáciu v bunkách). Všetky ošetrenia sa uskutočňovali dvojmo.

Na piaty deň po infekcii sa médium odstránilo a kultúry sa trikrát premývali so studeným fosfátom tlmeným fyziologickým roztokom. RNA sa purifikovala z 4x10⁶ hepatocytov použitím extrakčného postupu so zmesou guanidinium izotiokyanátu a kyslého fenolu (Chomczynski P.N. a Sacchi N., Analyt. Biochem. 162: 156-159

-28(1987)). Precipitovaná RNA sa rozpustila v 50 μΙ dietylpyrokarbonátom (DEPC) ošetrenej vody a kvantifikovala sa. Jeden pg RNA sa analyzoval vo vláknovo špecifickom rTth RT-PCR teste.

Na vylúčenie možnej kontaminácie sa vláknovo špecifický RT-PCR test uskutočňoval postupne, použitím troch oddelených priestorov: pre-PCR priestoru, PCR priestoru a post-PCR priestoru. RNA rozpustená v 10 μΙ DEPC-ošetrenej vody sa pokryla minerálnym olejom a zahrievala sa na 95 °C 1 minútu. Teplota sa udržiavala na 70 °C a pridalo sa 10 μΙ predhriatej cDNA reakčnej zmesi. Teplota sa potom znížila na 60 °C na 2 minúty na anelovanie a cDNA reakcia sa uskutočňovala 20 minút pri 70 °C použitím rTth DNA polymerázy (Perkin-Elmer). Teplota sa udržiavala na 70 °C, pričom sa pridalo 40 μΙ predhriateho tlmivého roztoku obsahujúceho EGTA ako chelatátor Mn²⁺, na suprimovanie rTth RT aktivity. Reakčné skúmavky sa udržiavali na teplote 70 °C, pričom sa pridalo 40 μΙ predhriatej PCR zmesi. PCR podmienky, uskutočňované na Gene Amp9 PCR systéme 9600 (Perkin-Elmer) pozostávali z iniciačného cyklu pri 94 °C počas 1 minúty, 50 cyklov pri 94 °C počas 15 sekúnd, pri 58 °C počas 30 sekúnd, pri 72 °C počas 30 sekúnd, a z finálneho predlžovacieho kroku pri 72 °C počas 7 minút. Na RNA test pozitívneho vlákna HCV bola sekvencia reverzného primera P3 nasledovná:

5'-TGG/ATGCACGGTCTACGAGACCTC-3', (nukleotidy 342-320);

a sekvencia priameho primera P4 bola nasledovná:

5'-CACTCCCCTGTGAGGAACT-3' (nukleotidy 38-56) (Laskus T., a ďalší, J. Gen. Virol. 78: 2747-2750 (1997)). Rovnaké priméry sa použili v opačnom poradí na detekciu negatívneho vlákna. Jedna desatina amplifikovaného produktu sa analyzovala gélovou elektroforézou na agaróze (2%), nasledovalo farbenie s BET a fotografovanie pod UV svetlom. Vo všetkých sériách experimentov sa urobili sériové riedenia syntetických HCV RNA (+) a (-) vlákien a pridal sa 1 pg celkovej pečeňovej RNA, aby sa napodobnili podmienky na analýzu kultivovaných hepatocytov. Tieto zmesi sa použili ako pozitívne kontroly RT-PCR testu a analýzy.

-29Obrázok 3 ukazuje, že produkcia HCV negatívneho vlákna bola v kultúre FT167 úplne inhibovaná v prítomnosti monoklonálnych protilátok proti LDLR. Takže replikácia vírusového genómu bola silne inhibovaná. Výsledky sú v súlade s názorom, že LDLR by mohol byť receptorom pre HCV.

Príklad 11

Produkcia chimérnych protilátok proti LDLR mRNA sa purifikovala z hybridómovej línie produkujúcej monoklonálnu protilátku špecifickú pre LDLR.

Syntetizovala sa špecifická cDNA s oligonukleotidmi komplementárnymi s 5' koncom exónu CHI z ťažkého reťazca variabilnej domény (oligo 1) a s 5' koncom Cichexónu ľahkého reťazca variabilnej domény (oligo 2), použitím purifikovanej mRNA ako templátu.

Získali sa dve cDNA, z ktorých jedna kóduje variabilnú oblasť (špecifickú pre LDLR) ťažkého reťazca, a druhá variabilnú oblasť (špecifickú pre LDLR) ľahkého reťazca. cDNA sa klonovali a sekvenovali.

Na konštrukciu chimérneho ťažkého reťazca sa variabilná oblasť klonovaného génu ľudského lg ťažkého reťazca vymenila (použitím genetických manipulácii) za klonovanú DNA kódujúcu myšaciu variabilnú doménu (špecifickú pre LDLR) ťažkého reťazca. Genetické manipulácie zahŕňajú vystrihnutie variabilnej oblasti z ľudského lg, použitím špecifických reštrikčných enzýmov, a ligáciu myšacej variabilnej oblasti. Rovnaký postup sa uskutočňuje na získanie chimérneho ľahkého reťazca.

Skonštruovali sa dva cicavčie expresné plazmidy, jeden, obsahujúci gén chimérneho ťažkého reťazca, a druhý, zahŕňajúci gén chimérneho ľahkého reťazca. Oba vektory sa použili na kotransfekciu hybridómovej bunkovej línie (SP6).

Produkcia LDLR špecifického lg sa testovala prostredníctvom ELISA alebo Western blotmi použitím kultivačného média transfektantových buniek ako sekundárnej protilátky. Afinita chimémej protilátky voči jej ligandu sa monitorovala prostredníctvom Biacore.

-30Príklad 12

Príprava transgénnych myší, ktoré sú konštruované tak, aby obsahovali lokus ľudského imunoglobulínového génu (xenomyši), a príprava ľudskej monoklonálnej protilátky proti hLDLR

Príprava xenomyši je opísaná vo WO 98/24893 a v Mendez M, J. a ďalší, Náture genetics 15: 146-56 (1997).

Humánno-kvasinkové umelé chromozómové (YAC) knižnice sa skrínovali, aby sa vyhľadali YAC obsahujúce ľudský variabilnú oblasť ťažkého reťazca (približne 1000 kb) (YAC klonovacou metódou je metóda voľby, pri ktorej je potrebná veľkosť inzertov väčšia ako 100 kb).

YAC-y sa charakterizovali Southern blot analýzou a elektroforézou v pulznom poli (PFGE). YAC-y by mali obsahovať Cp Cô, Dh a Vh oblasti v konfigurácii zárodočnej línie.

Prostredníctvom využitia prekrývajúcich sa sekvenčii obsiahnutých v YACoch sa YAC-y rekombinovali v kvasinkách postupnou rekombinačnou stratégiou. Pred rekombináciou sa 3' koniec YAC-u (s V oblasťou) ligoval s HPRT selektovateľným markerom. Štruktúra rekombinovaného YAC-u sa potvrdila prostredníctvom PFGE a Southern blot analýzou (prítomnosť lokusu ľudského ťažkého reťazca od C oblasti po Vh oblasť v zárodočnej konfigurácii).

YAC acentrické rameno sa zameriava vektorom nesúcim kompletnú γ2 konštantnú oblasť, myšací zosilňovač, gén neomycínovej rezistencie, aby sa získal konečný ťažký reťazec obsahujúci celú variabilnú oblasť, tzn. 82 Vh génov, 6 Jh génov a 3 rozličné konštantné oblasti Cp Cô Cy s ich rozpovedajúcimi regulačnými sekvenciami. Tento YAC sa označil ako yH2. Tento konštrukt sa použil na produkciu xenomyši.

Podobná stratégia, ako tá, ktorá bola použitá vyššie, sa využila na rekonštrukciu kapa lokusu, len s tým, že neomycínový selekčný markér sa ligoval s rekonštruovaným YAC-om obsahujúcim celý kapa lokus. Tento YAC sa označil ako yK2.

YAC-y obsahujúce yH2 sa zaviedli do ES bunky prostredníctvom fúzie YACu, obsahujúceho kvasinkový sferoplast, s HPRT deficientnými E14.TG3B myšacími

-31 ES bunkami. Selektovali sa HPRT pozitívne bunky. Pozitívne klony sa rozmnožili a analyzovali sa Southern blotmi a CHEF blot analýzou. Vybrali sa klony obsahujúce intaktný yH2 YAC.

Zavedenie a selekcia yK2 YAC-u v ES bunkách sa uskutočňovala podobne ako je opísané pre yH2 YAC.

ES bunky obsahujúce YH2 sa mikroinjektovali do myšacích C57BL/6J1 blastocytov. Vyprodukované chimérne samčeky sa hodnotili z hľadiska prenosu zárodočnej línie na potomstvo.

yH2 a/alebo yK2-transgénne myši sa párili s Dl myšami (homozygotné v géne cieľovo inaktivovaného myšacieho lokusu ťažkého a kapa reťazca). Každý z yH2;DI transgénnych kmeňov sa páril s yK2;DI transgénnym kmeňom, aby sa generovali xenomyšacie kmene.

Rekonštrukcia vývoja B buniek a produkcie protilátok v xenomýšiach sa hodnotili prietokovou cytometriou a prostredníctvom ELISA. Imunizácia xenomyší sa uskutočňovala ako je opísané v príklade 2.

Spôsoby prípravy hybridómov a skríningu pozitívnych klonov sú podobné spôsobom opísaným v príkladoch 3 a 4.

Hybridómové klony 12.6, 28, 29.8, 30 a 50.30 sa deponovali v Collection nationalp de Culture de Microorganismes (CNCM), Inštitút Pasteur, Paríž, v súlade s Budapeštianskou dohodou a bolo im priradené depozitné číslo I-2390, 1-2391, I-2392,1-2393, respektíve I-2394.

32.

Použitá literatúra

Agnello, V., Ábel. G., Elfahal, M., Knight, G. B. a Zhang, Q. X. (1999). Hepatitis C virus and other flaviviridae viruses enter celíš via low density lipoprotein receptor [In Process Citation]. Proc Natl Acad Sci U S A, 96 (22), 12766-71.

Beisiegel, U., Schneider, W. J., Goldstein, J. L., Anderson, R. G. a Brown, M. S. (1981). Monoclonal antibodies to the low density lipoprotein receptor as probes for study of receptor-mediated endocytosis and the genetics of familial hypercholesterolemia. J Biol Chem, 256 (22), 11923-31.

Bieri, S., Djordjevic. J. T., Daly, N. L., Smith, R. a Kroon, P. A. (1995). Disulfide bridges of a cysteine-rich repeat of the LDL receptor ligand-binding domain. Biochemislry 34 (40), 13059-65.

Brown, M. S. a Goldstein, J. L. (1976). Familial hypercholesterolemia: A genetic defect in the low-density lipoprotein receptor. N Engl J Med, 294 (25), 1386-90.

Brown, M. S. a Goldstein, J. L. (1986). A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis. Science, 232 (4746), 34-47.

Chomczynski, P. N. a Sacchi, N. (1987). Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analyt. Biochem. 162: 156-9.

Eshhar Z, 1985 Monoclonal Antibody Strategy and Techniques v Hybridoma technology in the bioscience and medicíne, vyd. Timothy A. Springer (Plénum Publishing Corporation, 1985 ; kapitola 1)

Fischer. D. G., Tal. N., Novick, D., Barak, S. a Rubinstein, M. (1993). An antiviral soluble form of the LDL receptor induced by interferon'. Science, 262 (5131), 2503.

Fischer. D. G., Novick, D., Cohen, B, Rubinstein, M. (1994). Isolation and characterization of a soluble form of the LDL receptor, an interferon-induced antiviral protein. Proc Soc Exp Biol Med 206 (3). 228-32.

tt

Ferrini. J. B., Pichard, L., Domergue, J. a Maurel, P. (1997). Long-term primary cultures of adult human hepatocytes. Chem-Biol Interactions 107: 31-45.

Fournier. C., Sureau. C., Coste. J., Ducos, J., Pageaux G., Larrey. D., Domergue, and Maurel. P. (1998). In vitro infection of adult normál human hepatocytes in primary culture by hepatitis C virus. J. Gen Virol. 79 : 2367-74.

Goldstein, J. L., Anderson. R. G. a Brown. M. S. (1979). Coated pits, coated vesicles, and receptor-mediated endocytosis. Náture, 279 (5715). 679-85.

Goldstein. J. L., Dana, S. E., Brunschede, G. Y. a Brown, M. S. (1975). Genetic heterogeneity in familial hypercholesterolemia : evidence for two different mutations affecting functions of low-density lipoprotein receptor. Proc N Acad Sci US. 4, 72 (3), 1092-6.

Lanford R. E., Carey, K. D., Estlack, L. E., Smith, G. C. a Hay, R. V. (1989) Analysis of plasma protein and lipoprotein synthesis in long-term primary cultures of baboon hepatocytes maintained in serum-free médium In Vitro Celí Dev. Biol. 25: 174-82.

Laskus T., Radkowski, M., Wang, L. F., Cianciara, J., Vargas, H. a Rakela, J. (1997). Hepatitis C virus negatíve strand RNA is not detected in peripheral blood mononuclear cells and viral sequences are identical to those in sérum: a čase against extrahepatic replication. J. Gen. Virol. 78 : 2747-50.

Maurel P. (1996) The use of adult human hepatocytes in primary culture and other in vitro systems to investigate drug metabolism in man. Adv. Drug Del. Rev. 22: 105-132.

Mendez. M. M., Green, L. L., Corvalan, J. R. F., Jia X-C., Maynard-Currie, E. E., Yang, X-D., Gallo. M. L., Louie, D. M., Lee, D. V., Erickson, K. L., Luna, J., Roy, C. M-N., Abderrahim, H., Kirshenbaum, F., Noguchi, M., Smith, D. M., Fukushima, A., Hales, J. F., Finer, M. H., Davis, C. G., Zsebo, K. M. a Jakobovits, A. (1997). Functional transplant of megabase human immunoglobulin loci recapitulates human antibody response in mice. Náture Genetics, 15, 146-56.

S²/

Richard. L., Fabre. I., Daujat, M., Domergue, J., Joyeux, H. a Maurel, P. (1992). Effect of corticosteroids on the expression of cytochromes P450 and on cyclosporin A oxidase activity in primary cultures of human hepatocytes. Mol. Pharmacol. 41: 1047-55.

Riachmann, L., Clark, M., Waldmann, H., and Winter, G. (1988). Reshaping human antibodies for therapy. Náture, 332, 323-27.

Sudhof, T. C., Goldstein. J. L., Brown, M. S. a Russell. D. W. (1985).The LDL receptor gene: a mosaic of exons shared with different proteins.Science, 228 (4701),815-22.

Urlaub, G. a Chasin, L. A. (1980) Isolation of Chinese Hamster Celí Mutants Deficient in Dihydrofolate Reductase Activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-

Claims (25)

1. Monoklonálna protilátka, chimérna protilátka, kompletne humanizovaná protilátka, anti-anti-ID protilátka alebo ich fragment, ktoré špecificky rozoznávajú a viažu ľudský LDL receptor a jeho fragment, s výnimkou monoklonálnej protilátky C7.

2. Monoklonálna protilátka podľa nároku 1, ktorá špecificky rozoznáva a viaže ľudský rozpustný LDL receptor.

3. Monoklonálna protilátka podľa nároku 1, ktorou je monoklonálna protilátka exprimovaná hybridómovým klonom 12.6 deponovaným v CNCM pod číslom I-2390.

4. Monoklonálna protilátka podľa nároku 1, ktorou je monoklonálna protilátka exprimovaná hybridómovým klonom 28 deponovaným v CNCM pod číslom 1-2391.

5. Monoklonálna protilátka podľa nároku 1, ktorou je monoklonálna protilátka exprimovaná hybridómovým klonom 29.8 deponovaným v CNCM pod číslom I-2392.

6. Monoklonálna protilátka podľa nároku 1, ktorou je monoklonálna protilátka exprimovaná hybridómovým klonom 30 deponovaným v CNCM pod číslom I-2393.

7. Monoklonálna protilátka podľa nároku 1, ktorou je monoklonálna protilátka exprimovaná hybridómovým klonom 50.30 deponovaným v CNCM pod číslom I-2394.

8. Monoklonálne protilátky podľa ktoréhokoľvek z nárokov 3 až 7 patriace k imunoglobulínovému izotupu IgGi alebo IgM.

Μ

9. Spôsob detekcie a/alebo kvantifikácie ľudského LDLR, vyznačujúci sa t ý m, že zahŕňa použitie monoklonálnej protilátky podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov 1 až 8.

10. Monoklonálne protilátky podľa nároku 1, ktoré je možné použiť ako párovacie v ELISA teste.

11. Monoklonálne protilátky podľa nároku 10, ktoré sú generované hybridómovým klonom 28 alebo hybridómovým klonom 29.8.

12. Monoklonálne protilátky podľa nároku 1, ktoré sú schopné identifikovať LDLR vo Western blot analýze.

13. Monoklonálne protilátky podľa nároku 12, ktoré sú generované hybridómovým klonom 12.6, hybridómovým klonom 28, hybridómovým klonom 29.8 alebo hybridómovým klonom 30.

14. Monoklonálne protilátky podľa nároku 1, ktoré sú schopné neutralizovať protivírusovú biologickú aktivitu r-hsLDLR.

15. Monoklonálne protilátky podľa nároku 14, ktoré sú generované hybridómovým klonom 12.6 alebo hybridómovým klonom 50.30.

16. Monoklonálne protilátky podľa nároku 1, ktoré sú schopné inhibovať replikáciu vírusu hepatitídy C.

17. Monoklonálne protilátky podľa nároku 16, ktoré sú generované hybridómovým klonom 12.6, hybridómovým klonom 28 alebo hybridómovým klonom 29.8.

18. Hybridómový kloň 12.6, ktorý je deponovaný v CNCM pod číslom I-2390.

19. Hybridómový kloň 28, ktorý je deponovaný v CNCM pod číslom 1-2391.

20. Hybridómový kloň 12.6, ktorý je deponovaný v CNCM pod číslom I-2392.

21. Hybridómový kloň 30, ktorý je deponovaný v CNCM pod číslom I-2393.

22. Hybridómový kloň 50.30, ktorý, je deponovaný v CNCM pod číslom I-2394.

23. Spôsob prípravy monoklonálnej protilátky podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa pestovanie klonovaného hybridómu, obsahujúceho zlezinovú bunku z cicavca imunizovaného s hsLDL a homogénnu alebo heterogénnu lymfoidnú bunku, v kvapalnom médiu alebo v cicavčom abdoméne na umožnenie produkcie monoklonálnej protilátky hybridómom a na umožnenie jej akumulácie.

24. Spôsob podľa nároku 23, vyznačujúci sa tým, že LDLR imunogénom je vysoko purifikovaný ľudský LDLR.

25. Spôsob purifikácie ľudského LDLR, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa uvedenie materiálu obsahujúceho ľudský LDLR do kontaktu s monoklonálnou protilátkou podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8.