CZ20023098A3 - Monoklonální protilátky proti receptoru lidského LDL, jejich produkce a použití - Google Patents

Description

Vynález se týká monoklonálních protilátek, které specificky rozeznávají lidský receptor pro lipoproteiny s nízkou hustotou (LDLR). Tyto protilátky je možné použít například při identifikaci a čištění lidského rozpustného LDLR (hsLDLR) při jeho produkci stejně jako při identifikaci a léčbě onemocnění jako je hepatitida C (HCV).

Dosavadní stav techniky

Cholesterol, který je komponent všech eukaryontních plazmatických membrán, je podstatný pro růst a životaschopnost vyšších organizmů. Avšak velké množství cholesterolu v séru způsobuje onemocnění a smrt tím, že se podílí na tvorbě aterosklerotických plaků v arteriích celého těla. Hlavní místo syntézy cholesterolu jsou u savců játra. Výrazné množství cholesterolu se také tvoří ve střevech. Rychlost tvorby cholesteroluv těchto orgánech velmi záleží na množství cholesterolu absorbovaného z potravy. Buňky vně jater a střev získávají cholesterol z plazmy spíše než syntézou de novo. Cholesterol a jiné lipidy se transportují do tělních tekutin lipoproteiny, které se dělí na základě zvýšené hustoty. Lipoprotein je částice obsahující jádro fydrofóbních lipidů obklopené skořápkou polárních lipidů a apoproteinů. Tyto lipoproteiny mají dvě úlohy: rozpouštějí vysoce hydrofóbní lipidy a obsahují signály, které regulují pohyb určitých lipidů do a z specifických cílových buněk a tkání. Cholesterol se transportuje do tělních tekutin pomocí lipoproteinů s nízkou hustotou (LDL), které se váží na specifický receptor na plazmatické membráně buněk, které nejsou jaterní buňky.

receptorem Anderson, R vesicles, and (5715), 679-85) je prototyp (popisuj e

G. ,

Komplex receptor LDL pak vstupuje do buněk transportním mechanizmem, který je znám jako endocytóza zprostředkovaná se v publikaci Goldstein, J. L., and Brown, M. S. (1979). „Coated pits, coated receptor-mediated endocytosis. Nátuře, 279 Rceptor lipoproteinů s nízkou hustotou (LDL) rodiny strukturálně příbuzných buněčných receptorů, které zprostředkovávají endocytózu mnoha ligandů v savčích buňkách.

Receptor LDL obsahuje 822 aminokyselinových zbytků a vykazuje molekulovou hmotnost 164 000. Skládá se z několika domén, kdy některé z nich jsou homologní s jinými proteiny. Jeho doména vázající ligand NH₂ obsahuje 292 zbytků, které jsou uspořádány do 7 imperfektních repetic bohatých na cystein. Každá repetice obsahuje šest cysteinových zbytků, které jsou spojeny disulfidovým můstkem v konfiguraci 1 až 3, dva až pět a čtyři až šest (Bieri, S., Djordjevic, J. T., Daly, N. L., Smith, R., and Kroon, P. A. (1995). „Disulfide bridges of a cysteine-rich repeat of the LDL receptor Ligand-binding domain. Biochemistry, 34(40), 13059-65). Po této doméně následují čtyři další domény: první . obsahuje 400 aminokyselinových zbytků a je homologní s receptorem EGF, druhá obsahuje 58 aminokyselinových zbytků bohatých na cukry spojené přes kyslík, třetí je jedinou transmembránovou doménou obsahující 22 aminokyselinových zbytků a čtvrtá je cytoplazmatická doména obsahující 50 aminokyselinových zbytků (popisuje se v publikaci Sudhof, T.C., Goldstein, J. L., Brown, M. S., and Russell, D. W. (1985), „The LDL receptor gene: a mosaic of exons shared with defferent proteins.

Science, 228(4701), 815-22, Brown, M. S., and Goldstein, J. L. (1986). „A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis. Science, 232 (4746), 34-47).

··* · ·· ·· · · · ··· · · ·· · ···· · ···· · ··· · · ··· ··· ·· · · · ··· ·· ····

Fyziologická důležitost receptoru LDL je zřejmá ze studie provedené Goldsteinem a Brownem u rodinné hypercholesterolémii (FH). Zjistilo se, že toto onemocnění je způsobeno molekulárním genetickým defektem, který má za následek nepřítomnost nebo nedostatečnou funkci receptorů pro LDL (popisuje se v publikaci Brown, M. S., and Goldstein, J. L. (1976). „Familial hypercholesterolemia: A genetic defect in the low density lipoprotein receptor. A Engl J Med, 294(25), 1386-90) . Charakterizovalo se několik tříd mutací FH (Goldstein, J. L., Dana, S. E., Brunschede, G. Z., and Brown,

M. S. (1975). „Genetic heterologeneity in familial hapercholesterolemia: evidence for twodifferent mutations affecting functions of low-density lipoprotein receptor. Proč Nati Acad Sci USA, 72(3), 1092-6.

Identifikovala se rozpustná forma sLDLR vykazující antivirovou aktivitu a izolovala se ze supernatantu kultury buněk indukovaných interferonem (popisuje se v publikaci Fischer, D. G., Tal, N., Novick, D., Barak, S., and Rubinstein, M., (1993). „An antiviral soluble form of the LDL receptor, an interferon-induced antiviral protein. Proč soc Exp Biol Med 206 (3), 228-32) a v tělních tekutinách (popisuje se v publikaci Fisher, D. G., Novick, D., Cohen, B, Rubinstein, M. (1994). „Isolatíon and characterization of a soluble form of the LDL receptor, an interferon-induced antiviral protein. Proč Soc Exp Biol Med 206 (3), 228-32).

Zjistilo se, že sLDLR se vylučuje do kultivačního média savčími buňkami, které vstupují do antivirového stádia jako odezva na interferon. Na rozdíl od interferonu sLDLR nevyvolá u buněk antivirové stádium, ale působí proti virům sám o sobě. Zjistilo se, že sLDLR musí být přítomen během celého procesu virové replikační maturace a pučení, což naznačuje, že se může podílet na komplexním postupu, který vede k inhibici uspořádání viru nebo pučení (nepublikovaná data). Ukázalo se, že endocytóza viru hepatitidy C je zprostředkována receptory

LDL na kultivovaných buňkách (popisuje se v publikaci Agnello, V., Ábel, G., Elfahal, M., Knight, G. B., and Zhang, Q. X. (1999) . „Hepatitis C virus and other flaviviridae viruses enter cells via low density lipoprotein receptro (In Process Citation). Proč. Nati. Acad. Sci USA, 96(22), 12766-71). Tato a jiná zjištění naznačují, že rodina receptoru LDL může sloužit jaké virové receptory. Proto protilátky vzniklé proti receptoru sLDLR mohou blokovat vstup a pučení virových částic navázáním na receptor LDL.

Jediné dostupné monoklonální protilátky proti LDLR jsou C7, což jsou protilátky proti bovinnímu LDLR (popisuje se v publikaci Beisiegel, U. , Schneider, W. J. , Goldstein, J. L., Anderson, R. G. and Brown, M. S. (1981). „Monoclonal antibodies to the low density lipoprotein receptor as probes for study of receptor-mediated endocytosis and the genetics of familial hypercholesterolemia. J. Biol Chem, 256(22), 1192331, komerčně dostupné od firmy Amersham, UK), které se připravily imunizací myší bovinním adrenalinovým kortexem LDLR, který se čistil až do dosažení homogenity. Rozpustily se membrány z bovinního adrenalinového kortexu a receptor se částečně čistil elucí na koloně naplněné celulózou s DEAE (popisuje se v publikaci Beisiegel, U., Schneider, W. J., Goldstein, J. L., Anderson, R. G. and Brown, M. S. (1981). „Monoclonal antibodies to the low density lipoprotein receptor as probes for study of receptor-mediated endocytosis and the genetics of familial hypercholesterolemia. J. Biol Chem, 256(22), 11923-31). Protilátky proti bovinnímu LDLR pouze slabě zkříženě reagují s lidským LDLR.

Zjistilo se, že ve skutečnosti monoklonální protilátky C7 proti bovinnímu LDLR mají podstatné nevýhody, když se používají při detekci a kvantifikaci rekombinantního lidského LDLR:

a) mají velmi nízkou afinitu vůči lidskému LDLR

b) podstatně zkříženě reagují s nečistotami, které pocházejí z buněčné kultury.

Specifické protilátky proti lidskému LDLR nebyly před tím dostupné. To se jeví jako překvapení, protože je běžné vytvořit protilátky proti novým proteinům, které slouží při jeho čištění, identifikaci nebo pro účely dalšího vývoje. Je možné, že takové protilátky se doposud nevytvořily, protože podmínky pro vytvoření monoklonálních protilátek jsou hlavně dostatečně velké množství vysoce čistého antigenu, který umožňuje dostatečnou imunizaci myší. Vysoce čistý antigen je ten, který se jeví jako jediný hlavní pík při použití RP-HPLC. Není jednoduché zavést metody identifikace a kvantifikace antigenu během postupu čištění. Během postupu čištění se za účelem identifikace LDLR použil zde popsaný test antivirové aktivity.

Je nutné vytvořit specifické monoklonální protilátky proti lidskému rozpustnému LDLR, které budou sloužit pro vývoj účinného imunologického testu (ELISA) a pro identifikaci proteinu westernovým přenosem. Tyto protilátky jsou nutné při sledování a kvantifikaci rekombinanntího lidského rozpustného LDLR během vývoje postupu produkce a čištění rekombinantního proteinu a při detekci přirozeného proteinu.

Podstata vynálezu

Vynález umožňuje vytvořit buněčnou linii hybridomů, které produkují monoklonální protilátky schopné specificky rozeznávat a vázat se na lidský receptor LDL a jeho fragmenty.

Vynález umožňuje vytvořit buněčné linie hybridomů produkující monoklonální protilátky schopné specificky rozeznávat a vázat lidský rozpustný receptor LDL.

··· · · ··· ··· · · ··· ··· ·» ····

Vynález popisuje monoklonální protilátky, chimérické protilátky, humanizované protilátky, anti-anti-Id protilátky nebo jejich fragmenty, které specificky rozeznávají a váží se na · lidský receptor LDL a jeho fragmenty s výjimkou monoklonálních protilátek Cl.

Vynález popisuje takové monoklonální protilátky, které rozeznávají a váží se na lidský rozpustný LDLR a splňují následující potřeby:

1. monoklonální protilátky se mohou použít jako pár v testu ELISA, například v sendvičovém testu ELISA, za účelem detekovat lidský rozpustný LDLR.

2. monoklonální protilátky se mohou použít při identifikaci LDLR analýzou westernovým přenosem.

3. monoklonální protilátky se mohou použít při neutralizaci antivirové biologické aktivity lidského rozpustného LDLR.

4. monoklonální protilátky se mohou použít při inhibici virové infekce, jako je HCV.

Vynález dále popisuje způsob detekce a/nebo kvantifikace lidského LDLR, který zahrnuje použití specifických monoklonálních protilátek podle vynálezu.

Vynález dále popisuje klonované hybridomy obsahující buňku sleziny, která pochází ze savce imunizovaného rekombinantním lidským LDLR a homogenní nebo heterogenní lymfoidní buňku.

Monoklonální protilátka podle vynálezu se připravila běžným způsobem, například růstem klonovaného hybridomu, který obsahuje buňku sleziny ze savce imunizovaného hsLDL a homogenní nebo heterogenní lymfoidní buňku v kapalném médiu nebo buňku z břicha savce, aby umožnila hybridomu produkovat a akumulovat monoklonálná protilátky.

vynález dále popisuje způsob čištění lidského LDLR, který zahrnuje kontakt materiálu, který obsahuje surový LDLR s monoklonální protilátkou podle vynálezu. Kolona s adsorbovanými monoklonálními protilátkami specifickými pro LDLR se může použít jako afinitní čistící krokpři postupu čištění rekombinantního proteinu.

Způsob detekce a měření rekombinantního lidského LDLR, který zahrnuje použití monoklonálních protilátek podle vynálezu v testu ELISA, jak se popisuje v příkladu 5.

V případě imunizace savců se jako LDLR nebo jeho fragment může použít libovolný LDLR teplokrevných zvířat. Může se také použít mutein LDLR. Reprezentativní příklad takového savčího lidského rozpustného LDLR je rozpustná forma LDLR +291, který zahrnuje aminokyselinovou sekvenci začínající aminokyselinou Asp v poloze +4 a končí aminokyselinou v poloze +291 sekvence lidského LDLR, může se použít libovolná jiná forma, jako je například +292.

Vytvořily se monoklonální protilátky proti lidskému rozpustnému LDLR (hsLDLR). Použitím uvedených monoklonálních protilátek se vyvinuly testy pro identifikaci hsLDLR ELISA a westernův přenos a neutralizační test za účelem zjištění antivirové aktivity hsLDLR.

U myší imunizovaných rekombinantní formou hsLDLR +291 se vytvořily monoklonální protilátky, které obsahují vazebnou doménu N-terminálního ligandu lidského rozpustného LDLR od aminokyseliny Asp v poloze +4 do aminokyseliny Glu v poloze +291. Rekombinantní formy +291 hsLDLR se produkovaly v buňkách CHO a čistila se až do dosažení homogenity.

Imunizované myši produkovaly podstatné titry specifických protilátek. Po testování hybridomů se identifikovalo pět klonů (počet 12, 28, 29, 30 a 50), který produkují největší množství protilátek. Tyto klony se vybraly za účelem dalšího klonování. Po subklonování se izolovalo 29 klonů, které produkují nejvíce protilátek a zamrazily se ampule obsahující rodičovské klony a subklony.

V případě testu ELISA se vybral pár monoklonálních protilátek proti r-hsLDLR. Jako potahové protilátky se vybraly monoklonální protilátky 28 a monoklonální protilátky 29.8 značené biotinem sloužily jako sekundární protilátky. Zjistilo se, že monoklonální protilátky 12.6 a 29.8 jsou vhodné pro identifikaci přirozeného a rekombinantního hsLDLR v testu westernovým přenosem. Zjistilo se, že monoklonální protilátky

12.6 a 50.30 jsou vhodné pro inhibici antivirové aktivity hsLDLR.

Dále se zjistilo v souladu s vynálezem, že monoklonální protilátky 12.6, 28 a 29.8 inhibují v primárních kulturách hepatocytů replikaci virového genomu viru hepatitidy C (HCV). Tyto protilátky se pak mohou použít při léčbě infekce hepatitidy C (obrázek č. 3).

Stanovila se subtřída izotypu monoklonálních protilátek produkovaných klony. Klony 12.6, 28, 29.8 a 30 se identifikovaly jako IgGi, zatímco klony 50.30 jsou IgM.

Monoklonální protilátky vyvinuté proti formě +291 hsLDLR rozeznávají také jiné formy hsLDLR. To je formu +292 a +331 rhsLDLR produkovanou v rekombinantních buňkách CHO, v testu ELISA a analýzou westernovým přenosem. Forma +292 obsahuje Nterminální část receptorů od aminokyselinového zbytku Asp v poloze +4 až do aminokyselinového zbytku Cys v poloze +292 a forma +331 obsahuje N-terminální část receptorů z aminokyselinového zbytku Asp od polohy +4 do aminokyselinového zbytku Cys v poloze +331.

Antigen používaný při imunizaci myší v případě vytvoření monoklonálních protilátek byla forma +291 lipoproteinu rhsLDLR, kterou produkovaly buňky CHO. Produkce r-hsLDLR se provedla bioreaktoru za použití stacionární fáze matricového systému Fibracel. Lipoprotein r-hsLDLR se čistil až do dosažení homogenity a použil se pro imunizaci myší.

Imunitní slezinné buňky z myší, které nejlépe odpovídají na imunizaci se použily pro fúzi a vytvoření hybridomů.

S ohledem na popsané protilátky termín „monoklonální protilátka znamená monoklonální protilátky, chimerové protilátky, zcela humanizované protilátky, protilátky vůči anti-idiotypickým protilátkám (anti-anti-Id protilátky), které se mohou značit v rozpustné nebo vázané formě, stejně jako jejich fragmenty poskytované libovolnou známou metodou, kterou může být enzymatické štěpení, syntéza peptidu nebo rekombinantní postupy.

Monoklonální protilátky obsahují v podstatě homogenní populaci protilátek specifických pro antigeny, které obsahují vazebná místa vázající v podstatě podobný epitop. Monoklonální protilátky se mohou získat způsoby známými v oboru. Popisuje se například v publikaci Kohler and Milstein, Nátuře, 256: 495-497 (1975), v patentovém dokumentu USA č. 4 376 110, Ausubel et al., eds., Harlow and Lané Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) a Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience N.Y., (1992-1996). Takové protilátky mohou pocházet z libovolné třídy imunoglobulinů, které zahrnují IgG, IgM, IgE, GILD a libovolnou jeho podtřídou. Hybridomy produkující monoklonální protilátku podle vynálezu se mohou kultivovat in vitro, in šitu nebo in vivo. Produkce vysokých titrů monoklonálních protilátek in vivo nebo in šitu zvýhodňuje tuto metodu produkce před ostatními.

Chimerové protilátky jsou molekuly, jejichž různé části se získaly z různých zvířecích druhů. Mezi ně patří variabilní oblasti získané z myších monoklonálních protilátek a z konstantní oblasti lidského imunoglobulinu. Chimerové protilátky se primárně používají za účelem snížení imunogennosti při aplikaci a zesílení produkce například, když hybridomy produkují vyšší výtěžek myších monoklonálních protilátek, ale uvedené monoklonální protilátky vykazují vyšší imunogennost u lidí, pak se použijí lidské/myší chimerové monoklonální protilátky. Chimerové protilátky a způsoby jejich produkce jsou dobře známy v oboru (popisuje se v publikaci Cabilly et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81: 3273-3277 (1984, Morrison et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81: 68516855 (1984), Boulianne et al., Nátuře 312: 643-646 (1984), Cabilly et al., European Patent Application 125023 (publikováno 14.11.1984), Neuberger et al., Nátuře 314: 268270 (1985), Taniguchi et al., přihláška EP č. 171 496 (publikováno 19.1.1985), Morrison et al., přihláška EP č. 173 494 (publikováno 5.3.1986), Neuberger et al., přihláška PCT WO 8 601 533 (publikováno 13.3.1986), Kudo et al., přihláška EP č. 184 187 (publikováno 11.6.1986), Sahagan et al. , J. Immunol. 137: 1066-1074 (1986), Robinson et al., Mezinárodní patentová přihláška WO 8 702 671 (publikováno 7.5.1987), Liu et al. , Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443 (1987), Sun et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84: 214-218 (1987), Better et al., Science 240: 1041-1043 (1988), Riechmann et al., Nátuře 332: 323-327 a Harlow and Lané, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) a Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience N.Y., (1992-1996).

Termín „zcela humanizované protilátky jsou molekuly obsahující jak variabilní tak konstantní oblast lidského imunoglobulinu. Zcela humanizované protilátky se mohou potencionálně použít při terapii, kde je nutná opakovaná léčba v případě chronického a recidivujícího onemocnění, jako je autoimunitní onemocnění. Způsob vhodný pro přípravu zcela humanizujících protilátek zahrnuje „humanizaci myšího ··«· · ···· · ··· * · · · · ··· · · ··· ··· ·» ···· humorálního imunitního systému, to je například produkce myších kmenů schopných produkovat lidské Ig (xenomyš) zavedením loci lidského imunogíobulínu (Ig) do myší, kterým se deaktivovaly endogenní geny Ig. Loci Ig jsou nadmíru komplexní, co se týče jejich fyzikální struktury a uspořádání genu a způsobu exprese nutného k produkci široké imunitní odezvy. Protilátková diverzita se primárně tvoří kombinačním uspořádáním mezi různými geny V, D a J přítomnými v loci Ig. Tyto loci také obsahují roztroušené regulační elementy, které řídí expresi protilátek, exkluzi alel, přechod tříd a afinitní maturaci. Zavedení neuspořádaných transgenů lidského Ig do myší demonstrovalo, že mechanizmus rekombinace u myší je kompatibilní s lidskými geny. Hybridomy vylučující antigen specifický pro humanizované monoklonální protilátky různých izotypů se mohou získat imunizací xenomyší antigenem.

Zcela humanizované protilátky a způsoby jejich produkce jsou dobře známy v oboru (popisuje se v publikaci Mendez et al., Nátuře Gentics 15: 146-156 (1997), Buggemann et al., Eur.

J. Immunol. 21: 1323-1326 (1991), Tomizuka et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 97: 722-727 (2000), patent WO 98/24 893.

Anti-idiotypické protilátky (anti-Id) jsou protilátky rozeznávající jedinou determinantu obyčejně spojenou s místem protilátky, na které se váže antigen. Protilátky Id se mohou připravit imunizací zvířat odlišných druhů a genetického typu (například kmeny myší) a mohou sloužit jako zdroj monoklonálních protilátek, proti kterým se anti-Id připravují. Imunizované zvíře bude rozeznávat a odpovídat na idiotypické determinanty imunizačních protilátek produkcí protilátek proti uvedeným idiotypickým determinantám (anti-Id protilátky) (popisuje se například v patentovém dokumentu č. 4 699 880).

Anti-Id protilátka se může také použít jako „imunogen za účelem vyvolat imunitní odezvu u jiného zvířete, které • * « · · · 0 · · ··· · ·· · · · » » ··· · · ·· · ···· · ···· · ··· · * «·· ··· ·· ··· ··· ·· ···· produkuje tzv. anti-anti-Id protilátky. Anti-anti-Id protilátky jsou svým epitopem shodné s původní monoklonální protilátkou, která vyvolává anti-Id. Použití protilátek proti idiotypickým determinantám monoklonálních protilátek je možné určit jiné klony exprimující protilátky shodné specifity.

Monoklonální protilátky vytvořené proti LDLR, jejich izoformy, analogy, fragmenty a deriváty podle vynálezu se mohou použít k vyvolání anti-Id protilátek u vhodného zvířete, jako je myš BALB/c. Buňky sleziny, které pocházejí z takových imunizovaných myší se použily k produkci anti-Id hybridomů, které vylučují anti-Id monoklonální protilátky. Anti-Id monoklonální protilátky mohou být dále spojeny s nosičem, jako je hemocyanin přílipkovitých plžů (KLH) a použily se k imunizaci dalších myší BALB/c. Séra z těchto myší budou obsahovat anti-anti-Id protilátky, které mají vazebné vlastnosti původních monoklonálních protilátek specifických pro epitop shora uvedeného proteinu LDLR nebo jeho analogů, fragmentů a derivátů.

Hodnotily se anti-Id monoklonální protilátky, které mají své vlastní idiotypické epitopy nebo „idiotopy strukturou podobné epitopu. Termín „monoklonální protilátka také zahrnuje intaktní molekuly, stejně jako jejich fragmenty, jako je například Fab a F(ab')2, které jsou schopny vázat antigen. Fragmentům Fab a F(ab')2 chybí fragment Fc intaktní protilátky, rychle se uvolňují z cirkulace, a mohou vykazovat menší nespecifické navázání na tkáň ve srovnání s intaktními protilátkami (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24: 316-325 (1983)).

Je výhodné, že se fragmenty Fab a F(ab')2 a jiné fragmenty protilátek mohou použít podle vynálezu k detekci a kvantifikaci proteinu LDLR podle způsobů popsaných pro molekuly intaktních protilátek. Takové fragmenty se v typickém případě produkují proteolytickým štěpením za použití enzymů, jako je papain (za vzniku fragmentů Fab) nebo. pepsinu (za vzniku fragmentů F(ab')2).

. Uvádí se, že monoklonální protilátky jsou schopné se vázat na molekulu, která je schopná specificky reagovat s molekulou, čímž se váže na protilátku. Termín „epítop znamená, že část libovolné molekuly je schopna se vázat na protilátku, která může být rozeznávána protilátkou. Epitopy nebo „antigenní determinanty obvykle obsahují chemicky aktivní povrchové skupiny molekul, jako jsou aminokyseliny cukerné vedlejší řetězce a mají specifické třírozměrné strukturální charakteristiky, stejně jako specifické nábojové charakteristiky.

Termín „antigen je molekula nebo část molekuly schopná vázat se na protilátku, jejíž antigen je dále schopný vyvolat u zvířete produkci protilátek, které se mohou vázat na epitop uvedeného antigenu. Antigen může mít jeden nebo více epitopů. Specifická reakce popsaná shora v textu znamená, že antigen bude reagovat vysoce selektivním způsobem s epitopem na své odpovídající protilátce a nikoli s velkým množstvím jiných protilátek, které mohou být vyvolány jinými antigeny.

Protilátky zahrnující fragmenty protilátek použitelné podle vynálezu se mohou použít pro kvantitativní nebo kvalitativní detekci proteinů LDLR ve vzorku nebo při detekci přítomnosti buněk, které exprimují proteiny LDLR podle vynálezu. To je možné dosáhnout imunofluorescenčními metodami, které používají fluorescenčně značené protilátky (popisuje se dále v textu) spojené s fluorescenční mikroskopií, průtokovou cytometrickou nebo fluorometrickou detekcí.

Protilátky (nebo jejich fragmenty) použitelné podle vynálezu se mohou použít při histologických testech, jako je například imunofluorescence nebo imunoelektronová mikroskopie v případě detekce in šitu proteinů LDLR podle vynálezu.

Detekce in sítu se může uskutečnit izolací histologických preparátů pocházejících z pacienta a použitím značených protilátek podle vynálezu. Protilátka (nebo fragment) se s výhodou získal aplikací nebo přelitím značených protilátek (nebo fragmentu) na biologický vzorek. Použitím takového postupu je možné stanovit ne pouze přítomnost proteinů LDLR, ale také jeho distribuci do testované tkáně. Odborníkovi je zřejmé, že libovolná z histologických metod (jako jsou například barvící postupy) se mohou upravit za účelem dosažení detekce in šitu.

Takové testy vhodné pro proteiny LDLR podle vynálezu v typickém případě obsahují inkubaci biologického vzorku, jako je biologická tekutina, tkáňový extrakt, čerstvě shromážděné buňky, jako jsou lymfocyty nebo leukocyty nebo buňky, které se inkubovaly v tkáňových kulturách, v přítomnosti značených protilátek schopných identifikovat proteiny LDLR a detekovat protilátky libovolným způsobem, který je dobře znám v oboru.

Biologický vzorek se může spojit s povrchem pevné fáze nebo nosičem, jako je nitrocelulóza, nebo s jiným pevným povrchem nebo nosičem, který je schopný imobilizovat buňky, buněčné částice nebo rozpustné proteiny. Takový povrch nebo nosič se může pak promýt s vhodnými pufry a pak následuje léčba se značenými protilátky v souladu s vynálezem, jak se popisuje shora v textu. Povrch pevné fáze nebo nosiče se pak může znova promýt pufrem, aby se odstranily nevázané protilátky. Množství vázaného značení na uvedeném pevném povrchu nebo nosiči se pak může detekovat běžným způsobem.

Termín „podklad tvořený pevnou fází, „nosič tvořený pevnou fází, „pevný podklad, „pevný nosič, „podklad nebo „nosič znamená podklad nebo nosič schopný vázat se na antigen nebo protilátky. Dobře známé podklady nebo nosiče zahrnují sklo, polystyren, polypropylen, polyetylén, dextran, nylonové «« · · ·· · · ·· ·· ·· · · · • · · · · » · ··· · ···· * ··· · · ··· ··· ·· »»· ··* ·· ···· amylázy, přirozené a upravené celulózy, polyakrylamidy, gabro a magnetit. Nosič podle vynálezu může být buď částečně rozpustný nebo nerozpustný. Podkladový materiál může mít libovolnou strukturální konfiguraci, pokud navázaná molekula je schopna se vázat na antigen nebo protilátku. Konfigurace podkladu nebo nosiče může být sférická, jako jsou kuličky, cylindrická, jako je vnitřní povrch testované zkumavky nebo vnější povrch tyčinky. V jiném případě může být povrch rovný, jako je list, testovací proužek. Výhodné podklady nebo nosiče zahrnují polystyrénové kuličky. Odborníkovi jsou známé další nosiče, které jsou vhodné pro navázání protilátek nebo antigenú a odborník je schopen zjistit to samé použitím rutinních experimentů.

Vazebná aktivita daných protilátek podle vynálezu se může stanovit pomocí dobře známých metod. Odborníci budou schopni stanovit optimální podmínky testů na základě výsledků rutinních experimentů.

Je-li to nutné, mohou se v testech použít další takové kroky, jako je promývání, míchání, kolébání, filtrace a podobně se mohou v testech použít, když je potřeba.

Jeden ze způsobů, který se může použít pro značení protilátek je navázání enzymu na protilátku a použití v enzymatickém imunotestu (EIA). Tento enzym naopak, když se vystaví působení vhodného substrátu bude reagovat se substrátem takovým způsobem, aby se produkovaly chemické části, které se mohou detekovat například spektrofotometricky, fluorometricky nebo vizuálně. Enzymy, které se mohou použít při detekci značených protilátek zahrnují, ale nejsou omezeny na malátovou dehydrogenázu, stafylokokovou nukleázu, delta-5steroidní izomerázu, kvasinkovou alkoholovou dehydrogenázu, alfa-glycerofosfátovou dehydrogenázu, triózofosfátovou izomerázu, křenovou peroxidázu, alkalickou fosfatázu, peroxidázu, asparaginázu, glukozovou oxidázu, beta-galaktozidázu, ribonukleázu, ureázu, katalázu, glukóza-6-fosfátovou dehydrogenázu, glukoamylázu a acetylcholinovou esterázu. Detekce se může provést kolorimetrickými metodami, které používají pro enzym chromogenní substrát. Pak se může použít vizuální porovnání rozsahu enzymatické reakce substrátu v porovnání s podobně připravenými standardy.

Detekci je možné provést použitím různých jiných imunologických testů. Radioaktivní značení protilátek nebo protilátkových fragmentů je možné detekovat například RPTPázou použitím radioaktivního imunologického testu (RIA). Popis testu RIA je možné nalézt v publikaci Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, Work, T.S. et al., North Holland Publishing Company, NY (1978) v kapitole s názvem „An Introduction to Radioimmune Assay and Related techniques,jejímž autorem je Chard, T. . Radioaktivní izotop se může detekovat použitím g-počítače nebo scintílačního počítače nebo autoradiografií.

Je také možné značit protilátku podle vynálezu fluorescenční sloučeninou. V případě, že fluorescenčně značená protilátka se vystaví působení světla s vhodnou vlnovou přítomnost se může detekovat na základě Mezi nejběžněji používané fluorescenční patří fluorescein isothiokyanát, rhodamin, pykocyanin, allofykocyanin, o-ftaldehyd a délkou, její fluorescence. sloučeniny fykoerytrin, fluorescamin.

Protilátku je možné také detekovatelně značit použitím kovů, které emitují fluorescenční záření, jako je ¹⁵²E nebo jiné série lentanidů. Takové kovy se mohou zachytit na protilátkách použitím chelatačních skupin kovů, jako je dietylentriaminkyseliny pentaoctové (ETPA).

• v

Protilátky se mohou také detekovatelně značit spojením s chemiluminiscenční sloučeninou. Přítomnost chemiluminiscenčně značených protilátek se pak stanoví detekcí přítomnosti luminiscence, která vzniká během chemické reakce. Příklady vhodných sloučenin vhodných pro chemoluminiscenční značení jsou luminol, izoluminol, teromatický akridiniumester, imidazol, sůl akridinia a oxalátesteru.

Bioluminiscenční sloučenina se může použít ke značení protilátek podle vynálezu. Biologická luminiscence je typ chemoluminiscence zjištěné v biologických systémech, kde katalytický protein zvyšuje účinnost chemoluminiscenční reakce. Přítomnost bioluminiscenčního proteinu se stanoví detekcí přítomností luminiscence. Důležité bioluminiscenční sloučeniny, které se používají pro účely značení jsou luciferin, luciferáza a ekvorin.

Molekula protilátky podle vynálezu se může upravit, aby mohla být využita v imunometrickém testu, který je také znám jako sendvičový test. V typickém imunometrickém testu se na pevný podklad nebo nosič váže určité množství neznačené protilátky (nebo fragmentu protilátky) a přidá se takové množství detekovatelně značených rozpustných protilátek, aby se mohla provést detekce a/nebo kvantifikace ternárních komplexů vytvořených mezi protilátkou na pevném podkladu, antigenem a značenou protilátkou.

Typické a výhodné imunometrické testy zahrnují „forward testy, kde protilátka vázána na pevné fázi nejdříve přichází do kontaktu s testovaným vzorkem, přičemž se extrahuje antigen ze vzorku za vzniku binárního komplexu protilátky vázané na pevném podkladu a antigenu. Po vhodné inkubační době se pevný podklad nebo nosič odstraní promytím, aby se odstranil zbytek kapalného vzorku, který zahrnuje zbylý nezreagovaný antigen a pak přichází do kontaktu s roztokem, který obsahuje neznámé

I» · · · · množství značené protilátky (která funguje jako reportní molekula. Po druhé inkubaci, kdy značené protilátky tvoří komplex s antigenem vázaným na pevný podklad nebo z nosičem prostřednictvím neznačené protilátky, se pevný podklad a nosič podruhé promyje a odstraní se nezreagované značené protilátky.

V jiném typu sendvičového testu, který je možný také použít s antigeny podle vynálezu, se mohou použít tzv. simultánní a reverzní testy. Simultání testy zahrnují jediný krok inkubace, kdy do testovaného vzorku ve stejný okamžik přidá protilátka vázaná na pevný povrch nebo nosič a značená protilátka. Po ukončení inkubace se pevný podklad nebo nosič promyje a odstraní se zbytek kapalného vzorku a značené protilátky, které netvoří komplex. Pak se stanoví přítomnost značených protilátek spojených s pevným podkladem nebo nosičem, jako je tomu v běžném „forward sendvičovém testu.

V „reverzním testu se nejdříve do kapalného vzorku přidá roztok značených protilátek a pak se přidají neznačené protilátky vázané na pevný podklad nebo nosič. Po druhé inkubaci se pevná fáze promyje běžným způsobem a odstraní se zbytek testovaného vzorku a nezreagované značené protilátky. Stanovení značených protilátek spojených s pevným podkladem nebo nosičem se pak stanoví jako v simultánním nebo „forward testu.

Popis obrázků na výkrese

Obrázek č. 1 znázorňuje blokové schéma vývoje monoklonálních protilátek proti r-shLDLR.

Obrázek č. 2 zobrazuje v dráze 1 analýzu formy +291 lipoproteinu r-hsLDLR westernovým přenosem, v dráze 2 hsLDLR z moče a v dráze 3 negativní kontrolu rekombinantní receptor p55 TNF (r-hTBP-1) pomocí monoklonálních protilátek označených '··« · « · » « * • · *. » · · · « ··· ·· ··· ··· *« ·*<· pod každým proužkem. Šipky na levé straně obrázku označují polohu markéru molekulové hmotnosti a šipky na pravé straně obrázku značí polohu formy hsLDLR označenou nad každou šipkou.

Obrázek č. 3 znázorňuje účinky monoklonálních protilátek 12.6, 28 a 29.8 na produkci řetězců HCV(+) a (-) v kultuře FT167. Buňky se ošetřily 30 minut před infekcí monoklonálními protilátkami proti LDLR (8 nebo 2 μς/ιηΐ) . Pak se buňky infikovaly přes noc 25 μΐ séra HCV(+) (č. 42, lb) . Den po infekci se buňky třikrát promyly a přidalo se nové médium a měnilo se každých 48 hodin. Pět dní po infekci se shromáždily hepatocyty, izolovala se RNA a analyzoval se 1 pg buněčné RNA pomocí rTth RT-PCR (Perkin Elmer). Testy se provedly ve dvou provedeních.

+SP: test pozitivního řetězce RNA

-SP: test negativního řetězce RNA X: slepé stanovení

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Příprava CHO r-hsLDLR

Stabilní rekombinantní buňky CHO exprimující lidský rozpustný LDLR se vytvořily společnou transfekcí buněk CHODUKX, kterým chybí gen dihydrofolátové reduktázy (DHFR) (popisuje se v publikaci Urlaub, G. and Chasin, L. A. (1980) Isolation of Chinese Hamster Cell Mutants Deficient in Dihydrofolate Reductase Activity. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220) s dvěmi expresívními vektory psLDLROl, obsahujícími N-terminální doménu vázající ligand LDLR začínající aminokyselinovým zbytkem Asp v poloze +4 až do aminokyseliny Glu 291 (+291) a pDHFR obsahující myší gen DHFR.

Oba vektory řídí promotor a transkripční terminační elementy časné oblasti SV40. Transfekce se uskutečnila pomocí »

·« » * ·· ·· • * « · ·Γ· ·« β «* • » ·*< · kationických liposimů použitím prostředku LipofectAmine (Gibco BRL) podle protokolu popsaného výrobcem. 72 hodin po transfekci se buňky přenesly do selektivního média, kde chybí deoxyribonukleotidy a ribonukleotidy a doplnily se 10% dialyzovaným FCS. Buňky exprimující aktivitu DHFR byly schopné tvořit kolonie, které se izolovaly na papírových discích nasáklých trypsinem. Buňky se nechaly růst a testovala se jejich r-hsLDLR aktivita. Transfekované buňky se pak vystavily amplifikaci genu pomocí MTX a pak následovalo subklonování a selekce stabilně produkovaných klonů.

r-hsLDLR (formy +291) se produkoval z buněk stabilně produkovaných klonů CHO označených #33-10-29-21 v biologickém reaktoru CelliGen o objemu 5 1 v kultivačním médiu, které neobsahuje sérum (Gibco CHO-A-SFM kat. č. 95-0091DJ). Surový produkt se čistil filtrací přes filtr s póry 0,8 až 0,2 mikronů (Gelman Kat. č. CSS92DSCCK) a jejich koncentrace se zvýšila 100 krát za použití membrány zachycující molekuly o molekulové hmotnosti 5 000. Forma r-hsLDLR +291 používané při první imunizaci se čistila použitím čistícího postupu v malém měřítku. Při tomto postupu se použila kolona vhodná k výměně kationtů naplněná DEAE-Sefarózou, pak následuje krok hydrofóbní interakce na koloně Butyl-TSK následovaný kolonou HTP a chromatografie založená na dělení molekul podle velikosti (SEC) na koloně Sephacryl 100. Vybraly se frakce #27 SEC, protože obsahují specifickou antivirovou aktivitu 780 jednotek na jeden mikrogram, což se detekovalo v antivirovém testu popsaném dále v textu v příkladu 9. Protein se v této frakcí identifikoval N-terminální analýzou jako r-hsLDLR.

Dále se CHO +291 r-hsLDLR čistil a aplikoval se myším jako zesilující injekce. Čistil se zdokonaleným postupem, který vykazuje zlepšený výtěžek. Tento postup zahrnuje následující kroky: a) čištění a stonásobné koncentrování surového extraktu, b) výměnu aniontů na koloně HQ POROS, c) dva kroky • · hydrofóbních interakcí (HIC): zachycení na koloně s butyl-TSK a průtok kolonou Phenyl 5PW. Nevázané frakce z posledního kroku HIC se dialyzovaly a čistily se na koloně s výměnou kationtů HS-POROS. Poslední krok se provedl na koloně naplněné hydroxyapatitem (HTP). Získaný r-hsLDLR se čistil až do

dosažení	90% čistoty elucí	jako jediný hlavní	pík	použitím RP-
HPLC.
Příklad	2: Imunizace myší
10	pg čištěné frakce	r-hsLDLR #27 z kolony	SEC popsané
shora v textu v příkladu	1 v koncentraci	100 pg/ml se

homogenizovalo s úplným Freundovýn adjuvans (CFA, 50 %) a zavedlo se injekcí do tlapky každé z pěti samic myší Balb/c ve věku sedmi týdnů.

Čtyři týdny po první imunizaci se myším aplikovala intramuskulárně zesilující injekce, která obsahovala 10 pg stejné frakce čištěného r-hsLDLR v 50% (objem/objem) roztoku CFA.

Dva týdny po druhé injekci se v myším séru testovala přítomnost protilátek proti r-hsLDLR za použití přímého testu ELISA popsaného v příkladu 3 dále v textu.

Dvou myším M-l a M-2, které vykazují nejpodstatnější specifickou imunoreaktivitu s r-hsLDLR, se dále deset týdnů po druhé injekci aplikovala zesilují injekce obsahující 10 pg čištěného r-hsLDLR získaného zdokonaleným čistícím postupem popsaném v příkladu 1 shora v textu.

O 14 dní později se myším odebral vzorek krve a testovala se v nich přítomnost protilátek proti r-hsLDLR. Pak se myším aplikovaly dvě další zesilující injekce obsahující 50 pg r22 hsLDLR v PBS. První injekce se aplikuje intraperitoneálně a druhá o dva dny později se aplikovala intravenózně.

Dva týdny po druhé injekci se odebraly vzorky krve a v antiséru se prokazovala aktivita proti r-hsLDLR přímým testem ELISA, což se popisuje v příkladu 3 dále v textu. Každé antisérum se sériově ředilo v poměru 1:1 000 až 1:32 000 a aplikovalo se ve dvou provedeních na destičky s 96 prohlubněmi potaženými r-hsLDLR v množství 10 jednotek do jedné prohlubně, který se čistil zdokonaleným čistícím postupem popsaným v příkladu 1 shora v textu. V první prohlubni každé řady se použil jako slepé stanovení testovací pufr a DMEM plus 10% HS obsahující PBS plus 1% BSA nebo želatina plus 0,05% Tween 20 plus 0,05% thimerosal. Do dvou posledních řad se aplikovalo jako negativní kontroly normální myší sérum (NMS) ve stejném rozmezí ředění. Absorbance enzymatické reakce se měřila čtecím zařízením vhodným pro test ELISA při vlnové délce 492 a 405 nm.

Výsledky tohoto testu indikují, že sérum z myši M-l měly vyšší specifickou imunoreaktivitu s r-hsLDLR a z toho důvodu se usmrtily a izolovaly se buňky sleziny a použily se za účelem fúze s buňkami myelomu (Eshhar Z, 1985, „Monoclonal Antibody Stratégy an Techniques in „Hybridoma technology in the bioscience and medicine, Edited by Timothy A. Springer (Plenům Publishing Corporation, 1985, Chapter 1).

Příklad 3: Přímý test ELISA vhodný pro testování antiséra a klonů hybridomů

Přímý test ELISA vhodný pro testování pozitivního antiséra se provedl následujícím způsobem: destičky s 96 prohlubněmi se potáhly 100 μΐ r-hsLDLR (čištěný zdokonaleným čistícím způsobem popsaným v příkladu 1) v koncentraci 100 jednotek/ml (10 jednotek v jedné prohlubni) v PBS plus 1% želatinou (Sigma, ··· · · ··* ..... ··· ··· ·· ···· kat. č. G-7765) plus 0,9 mM Ca²⁺ a 0,5 mM Mg²⁺, pH5,6 (testovací pufr) po dobu 90 minut při teplotě 37 °C za stálého míchání. Destičky se šestkrát promyly promývacím roztokem, který obsahuje PBS plus 0,05% Tween 20 (polyoxyetylensorbitanmonolaureát, Sigma P-1379) .

Do prohlubní se přidal vzorky antiséra z imunizovaných myší sériově ředěné v poměru 1:1 000 až 1:32 000 nebo supernatanty s kultury hybridomů a vše se inkubovalo po dobu 9 minut při teplotě 37 °C za stálého míchání, pak následovalo šest promytí v promývacím roztoku.

Do prohlubní se přidalo 100 μΐ kozích protilátek konjugovaných s křenovou peroxidázou (HRP)-APA proti myšímu fragmentu Fab (Sigma, kat. č. 4 601-1) ředěných v poměru 1:1 200 a vše se inkubovalo po dobu 90 minut při teplotě 37 °C za stálého míchání a pak se vše promylo šestkrát promývacím roztokem.

Do prohlubní se přidalo 100 μΐ substrátového roztoku (připraveného rozpuštěním jedné tablety OPD a jedné tablety peroxidu vodíku ve 20 ml vody) a vše se inkubovalo při teplotě místnosti po dobu 30 minut. Enzymatická reakce se zastavila přidáním 100 μΐ 4 N HC1 do jedné prohlubně. Absorbance v 96 prohlubních destičky se odečítala čtecím zařízením vhodným pro test ELISA při vlnové délce 492 a 405 nm a výsledky se vypočítaly za použití logických algoritmů se čtyřmi parametry použitím software MultiCalc v počítači, který je spojený se čtecím zařízením.

Příklad 4: Fúze, příprava hybridomů, selekce klonů a čištění protilátek z ascitické tekutiny

Způsob fúze a výběr hybridomů se uskutečnil podle protokolů uvedených v publikaci (Eshhar Z, 1985, „Monoclonal

Antibody Stratégy an Techniques in „Hybridoma technology in the bioscience and medicine, Edited by Timothy A. Springer (Plenům Publishing Corporation, 1985, Chapter 1). Buňky sleziny pocházející z myší M-l, kterým se 2 až 4 dni před fúzí aplikovala zesilující injekce, se fúzovaly s buňkami myelomu krátkou inkubací s PEG. PEG se nejdříve ředil s DMEM a pak se zcela odstranil centrifugací. Buňky se resuspendovaly v médiu DMEM-HAT, rozdělily se do 96 prohlubní na destičkách v koncentraci přibližně 3,4xl0^-4 buněk v prohlubni a inkubovaly se po dobu 10 až 14 dní v inkubátoru s atmosférou 8% CO₂ při teplotě 37 °C. Během deseti dní se kultivační médium ve všech prohlubních s hybridomy zaměnilo za kultivační médium DMEM doplněné 10% horským sérem (HS). Ve vzorcích supernatantů kultury hybridomů se testovala přítomnost monoklonálních protilátek proti r-hsLDLR přímým testem ELISA popsaným v příkladu 3 shora v textu. Testovací pufr a DMEM plus 10% HS se použily jako slepé stanovení. Monoklonální protilátky C7 (běžně dostupné u firmy Amersham) a myší anti-sérum M-l se použily jako pozitivní kontroly, zatímco jako negativní kontrola se použily monoklonální protilátky proti rozpustnému receptoru p55 TNF. Buňky z prohlubní, kde se detekovala přítomnost protilátek v supernatantu kultury, se přenesly na destičky s 24 prohlubněmi a pak do T-nádob o objemu 25 cm³. V kulturách se sledovalo vylučování monoklonálních protilátek proti r-hsLDLR. Ampule buněk pocházející z pozitivních kultur se zamrazily a uložily se do kapalného dusíku.

Celkem přibližně u 1 000 kultur se testovala přítomnost protilátek proti r-hsLDLR. imunologickou aktivitou se

U 54 kultur několikrát znovu s nejvyssi testovala 30 a 50) přítomnost protilátek. Pět kultur (12, 28, 29, s nejvyšší aktivitou se klonovalo v limitujícím ředění na destičkách s 96 prohlubněmi. V supernatantech z rostoucích klonů se několikrát testovala přítomnost protilátek proti rhsLDLR přímým testem ELISA.

• ·

Buňky pozitivních klonů hybridomů se nechaly růst v tkáňových kultivačních nádobách v kultivačním médiu DMEM, které obsahuje 15% horského séra a zamrazily se ampule obsahující část kultury. Paralelně se buňky různých klonů hybridomů zavedly injekcí do 2 až 4 myší za účelem získání ascitické tekutiny. Protilátky se čistily z ascitické tekutiny srážením síranem amonným nebo na koloně s proteinem G. 7,5 ml ascitické tekutiny se ředilo v poměru 1:3 v 20 mM fosforečnanovém pufru pH7 a nanesly na kolonu s proteinem G o objemu 5 ml (C10/10). Kolona se promyla 20 mM fosforečnanovým pufrem pH 7,0 a monoklonální protilátky se eluovaly 100 mM glycinovým pufrem pH2,7. Hodnota pH eluované frakce se upravila na 7 až 7,5 1 M pufrem Tris pH 9,3.

Příklad 5: Vyhledávání párů monoklonálních protilátek vhodných pro použití v testu ELISA a optimalizace parametrů testu ELISA

Monoklonální protilátky izolované z ascitické kapaliny, jak se popisuje v příkladu 4 shora v textu, se použily v experimentech v matricovém formátu při selekci nejvhodnějšího páru monoklonálních protilátek, které se mohou použít jako první a druhé v sendvičovém testu ELISA v případě r-hsLDLR popsaném v příkladu 6 dále v textu. Destičky obsahující 96 prohlubní se potáhly ascitickými tekutinami získanými z pěti hybridomů (//12, 28.28, 29.08, 30 a 50.05) čištěných buď srážením síranem amonným nebo na koloně s proteinem G. Protilátky se testovaly za použití formy +291, +292 (od aminokyselinového zbytku Asp +4 do Cys +292) a +331 (z aminokyselinového zbytku Asp +4 do Cys +331) r-hsLDLR produkované buňkymi CHO, které se použily jako antigeny. Jeden mililitr každé ze shora uvedených částečně čištěných monoklonálních protilátek se značilo biotinem a sledovala se jejich vhodnost použití jako sekundární protilátky v sendvičovém testu ELISA. U 1,5 mg monoklonálních protilátek čištěných srážením se síranem amonným se upravilo pH na hodnotu 8,5 s 30 μΐ 0,5 M NaHCCb. Do roztoku protilátek se přidalo 0,75 mg Biotin-Osu N-hydroxysukcinimido-biotin (Biotin-Osu, Sigma, kat. č. H1759 z roztoku 5 mg ve 200 μΐ DMSO) a roztok se inkuboval po dobu 2 hodin při teplotě místnosti za stálého míchání. Pak následovala inkubace přes noc po dobu 2 až 8 °C. Reakční roztok se nanesl na kolonu PD10 naplněnou prostředkem Sephadex G-25M (Pharmacia kat. č. 170851-01), přičemž došlo k separaci biotinem značených monoklonálních protilátek a nadbytku nezreagovaného biotinuOsu.

První experimenty ukazují, že monoklonální protilátky 29.08 a 30 produkovaly nejsilnější signál ve srovnání s pozadím, když se použily v testu ELISA jako sekundární protilátky.

Reakce těchto dvou klonů se testovala znovu jako sekundární protilátky a protilátkami 12, 28, 29.08 a 50, které se použily k potažení destiček. Výsledky tohoto experimentu jasně ukazují, že monoklonální protilátky 28 jsou nejvhodnější pro potahování destiček.

Nejlepší výsledky co se týče intenzity a specifity signálu se získaly s monoklonálními protilátkami 28, které se použily při potahování mikrotitračních destiček, a monoklonálními protilátkami 29.08 značenými biotinem, které se použily jako sekundární protilátky. Při použití uvedených monoklonálních protilátek se získaly dobré výsledky se všemi třemi formami rhsLDLR (forma +291, +292 a +331). U všech forem absorbance při vlnové délce 492/405 nm byla hodnota optické hustoty přibližně 0,1.

• ·

Tři formy antigenu r-hsLDLR se analyzovaly v sériovém ředění v koncentračním rozmezí 0,9 až 1 000 ng/ml. Křivka odezvy na dávku se získala za použití monoklonálních protilátek 28 za účelem potažení a jako sekundární protilátky se použily biotinem značené monoklonální protilátky 29.08. Při použití této kombinace vznikla lineární odezva v koncentračním rozmezí 1 až 10 ng/ml r-hsLDLR.

Různé parametry, které mohou ovlivnit test ELISA, jako je koncentrace činidel, inkubační doba, výběr pufrů a destiček se optimalizovaly testováním následujících parametrů:

• potažení prohlubní mikrotitračních destiček monoklonálními protilátkami 28 v PBS v koncentraci 5 až 10 μg/ml.

• složení pufru:

a) PBS a Tween 20

b) Tris plus Ca²⁺ plus NaCI plus Tween 20 • blokovací roztoky:

a) 1% želatina v PBS, 0,05% Tween, 0,005% thimerosal

b) 1% BSA v PBS, 0,05% Tween, 0,005% thimerosal

c) 1% FBS v PBS, 0,05% Tween, 0,005% thimerosal

d) 1% mléko v PBS, 0,05% Tween, 0,005% thimerosal

e) O blok, Hy pep a Hy kvasinky • Druhé monoklonální protilátky 29.08 značené biotinem v koncentraci 1:500, 1:1 000, 1:2 000, 1:4 000, 1:8 000,

1:10 000 odpovídá koncentračnímu rozmezí 10,74 až 0,537 μς/ιηΐ.

• koncentrace extravidinu: 1:500, 1:1 000, 1:2 000, 1:4 000,

1:8 000, 1:10 000 odpovídá koncentračnímu rozmezí 4 až 0,2 μς/ηιΐ.

Na základě těchto experimentů se stanovil konečný postup sendvičového testu ELISA popsaného v příkladu 6 dále v textu.

• ·

Příklad 6: Zavedení testu sendvičová ELISA v případě r-hsLDLR

Sendvičový test ELISA vhodný pro r-hsLDLR se zavedl za použití monoklonálních protilátek 28 a 29.08. 96 prohlubní destičky se potáhlo 100 μΐ monoklonální protilátkou 28 čištěnou proteinem G (v koncentraci 5 μς/ml) přes noc při teplotě 2 až 8 °C při teplotě 37 °C. Destičky se pak pětkrát promyly PBS a 0,05% Tween 20. Destičky se inkubovaly s blokačním roztokem o objemu 200 μΐ (PBS, 1% BSA nebo želatina, 0,05% Tween 20, 0,05% thimerosal) po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C nebo přes noc při teplotě 4 °C a promyly se pětkrát PBS a 0,05% Tween

20. Do prohlubní se přidalo 100 μΐ vzorků nebo antigen z kalibrační křivky (CHO +291 r-hsLDLR, 0,5 až 32 ng/ml ředěného blokačního roztoku) a vše se inkubovalo při teplotě 37 °C po dobu 90 minut za stálého míchání. Destičky se pak promyly pětkrát roztokem PBS a 0,05% Tween 20.

Do každé prohlubně se přidalo 100 μΐ biotinem značených monoklonálních protilátek 29.08 (0,67 μρ/ml) v blokačním roztoku a vše se inkubovalo za stálého míchání po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C. destičky se pětkrát promyly roztokem PBS a 0,05% Tween 20. Do prohlubní se přidalo 100 μΐ běžně dostupný extravidin konjugovaný s peroxidázou (ExtrAvidin TM-Peroxidase BioMakor, kat. č. 0645-1) ředěný 1:10 000 a vše se inkubovalo za stálého míchání po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C. Destičky se pak promyly pětkrát roztokem PBS a 0,05% Tween 20. Do každé prohlubně se přidalo 125 μΐ shora uvedeného roztoku substrátu a vše se inkubovalo po dobu 10 minut až došlo ke zbarvení požadované intenzity. Reakce se zastavila přidáním 125 μΐ 4N HC1. Absorbance v 96 prohlubních destiček se odečítala za použití čtecího zařízení vhodného pro test ELISA pří vlnové délce 492 a 405 nm a

..·· · ···.. ... .. ...... ·· ·· výsledky se vypočítaly pomocí softwaru na PC, který je spojen se čtecím zařízením vhodným pro test ELISA.

Příklad 7: Izotyp monoklonálních protilátek

Izotyp Ig monoklonálních protilátek se stanovil použitím běžného křtu vhodného pro stanovení izotypu (PharMingen International) pod popisu výrobce. Klony 12.6, 28, 29.8 a 30 se identifikovaly jako IgG_x, zatímco se zjistilo, že klon 50.30 je třída IgM.

Příklad 8: Analýza westernovým přenosem SDS-PAGE

Forma 1291 čištěného r-hsLDLR a přirozený LDLR izolovaný z lidské moči se analyzoval westernovým přenosem za použití monoklonálních protilátek, které se vyvinuly proti r-hsLDLR. Na 12% SDS polyakrylamidový gel se naneslo do každé dráhy 100 ng CHO formy +291 r-hsLDLR nebo přirozený močový hsLDLR nebo surový TBP-1 (slouží jako negativní kontrola) za redukčních podmínek (40 mM DTT). Do jedné dráhy se nanesl hmotnostní markér s nízkou molekulovou hmotností (LMW). Tato sada vzorků se opakovala pětkrát. Proteiny oddělené na gelu se přenesly elektroelucí na nitrocelulózovou membránu. Membrány se inkubovaly v PBS, které obsahuje 10 % mléko s nízkým obsahem tuku, 0,1% Tween 20 po dobu 16 hodin. Membrány se pak nařezaly na proužky a každý proužek se inkuboval po dobu 2 hodin při teplotě místnosti s jednou z pěti vybraných monoklonálních protilátek 12.6, 30, 50.30, 28 nebo 29.08 (ascitická tekutina se ředila v poměru 1:4 000).

Proužky membrán se promyly PBS, který obsahuje 0,1% Tween 20 (3x po dobu 15 min.), a inkubovaly se po dobu jedné hodiny se sekundárními protilátkami při teplotě místnosti (sekundární protilátky jsou kozí anti-myší protilátky konjugované .1 s křenovou peroxidázou-alkalickou fosfatázou (ředěné v poměru 1:10 000, BioMakor).

Tyto proužky se promyly PBS, které obsahuje 0,1% Tween 20 (3X po dobu 15 minut). Pozitivní proužky se detekovaly na základě zesílené chemoluminiscence (ECL, Amersham).

Monoklonální protilátky 12.6 a 29.8 rozeznávají močový rhsLDLR stejně jako formu +291 westernovým přenosem (zobrazeno na obrázku č. 2) . Monoklonální protilátky 28 a 30 rozeznávají formu +291 čištěného r-hsLDLR.

Příklad 9: Inhibice antivirové aktivity r-hsLDLR monoklonálními protilátkami

U monoklonálních protilátek, které specificky reagují s rhsLDLR, se testovala jejich schopnost blokovat antivirovou aktivitu r-hsLDLR (forma +291) in vitro za použití cytopaticky působícího inhibičního testu (CPE) v systému VSV/WISH.

Buňky WISH (pocházející z lidského amnionu) se kultivovaly v kultivačním médiu MEM doplněném 10% FBS a 4 mM glutaminem při teplotě 37°C v inkubátoru v atmosféře 5% CO₂. Exponencionálně rostoucí buňky se přenesly na kultivační destičky s 96 prohlubněmi při hustotě 40 000 buněk v jedné

prohlubni	24	hodin	před začátkem testu. Testované	vzorky a
standardy	se	ředily	a přidaly se do	prohlubní,	které	obsahuj í
buňky.	VSB	se	bezprostředně	přidalo	do	prohlubní

s multiplicitou infekce (MOI) 0,5 jednotek tvořící plaky v jedné prohlubni. Destičky se inkubovaly 16 až 18 hodin při teplotě 37 °C a pak se promyly etanolem. Vrstva přeživších buněk se sledovala použitím Gramova barvení krystalickou violetí. Kvantifikace cytopatického účinku vztaženo na standard se provedlo vynesením intenzity zbarvení proti koncentraci standardu.

ί

V případě analyzování neutralizačního účinku protilátek proti r-hsLDLR se lipoprotein předem inkuboval po dobu 30 minut při teplotě 37 °C se zvýšenou koncentrací testovaných monoklonálních protilátek v ascitické tekutině. Tyto roztoky se pak přidaly do kultur buněk WISH do 96 prohlubní mikrotitračních destiček, pak následuje přidání vesikulárního viru způsobujícího stomatitidu (VSV). Po 18 hodinách inkubace se lýze buněk zprostředkovaná VSV stanovila barvením zbývajících buněk krystalickou violetí. Semi-kvantifikace cytopatického účinku vztaženého ke standardu se provedla vynesením intenzity zbarvení (stanoveno čtecím zařízením pro test ELISA) proti standardní koncentraci.

Účinek monoklonálních protilátek se testoval se zvyšující se koncentrací r-hsLDLR. Jak je zobrazeno v tabulce 1, zjistilo se, že dvě monoklonální protilátky (12.6 a 50.30) vykazují neutralizační aktivitu.

Při experimentu zobrazeném v tabulce č. 1 se testoval inhibiční účinek dvou monoklonálních protilátek, kdy ředění ascitické tekutiny bylo 1:40. Při tomto ředění monoklonální protilátky 12.6 vykazovaly vyšší aktivitu ve srovnání s monoklonálními protilátkami 50.30. To může vyplývat z vlastností monoklonálních protilátek, stejně jako z rozdílů v jejich koncentraci v ascitické tekutině.

Inhibiční účinek monoklonálních protilátek by se mohl obejít zvýšením r-hsLDLR vzhledem ke koncentraci monoklonálních protilátek. Ve skutečnosti při koncentraci rhsLDLR 62,5 jednotek/ml ani monoklonální protilátky při analyzované koncentraci neměly žádný účinek na aktivitu rhsLDLR.

Tabulka č. 1: Inhibice antivitové aktivity r-hsLDLR klony 12.6 a 50.30⁽¹⁾ • » • · · · · ·

VSV/monokl.	koncentrace	LDLR (U/ml)
protilátka	0	2,5	12,5	62,5
-VSV	1,5	1,2	1,6	1,5
+VSV	(0,25)	1	7 (1,7)	1,7
+VSV+klon 50.30	6(0,4)	0,88	(1,25)	1,62
+VSV+klon 12	5(0,5)	0,77	7 (0,7)	1, 67

⁽¹⁾ Inhibice antivirové aktivity r-hsLDLR proti v případě lyže buněk WISH zprostředkované VSV. Inhibiční účinek monoklonálních protilátek se stanovil při ředění ascitické tekutiny 1:40. Počet buněk, které přežily, je uveden v tabulce a vyjádřen jako hodnota OD. Čísla v závorkách vyjadřují opakování provedené při koncentracích LDLR 0 a 12,5 U/ml.

Inhibice antivirové aktivity r-hsLDLR se stanovila za použití zvýšených koncentrací monoklonálních protilátek 12.6 a 50.30. Monoklonální protilátky 12.6 při ředění ascitické tekutiny 1:40 inhibovaly antivirovou aktivitu r-hsLDLR z 60 % a při ředění 1:20 500 z 35 %. Klon 50.30 inhiboval aktivitu rhsLDLR při ředění ascitického roztoku 1:40 z 45 % a při ředění 1:20 500 z 15 %.

Křivka odpovídající na dávku získaná použitím obou monoklonálních protilátek a pozorování, že inhibiční účinek byl porušený nadbytkem r-hsLDLR, naznačuje, že monoklonální protilátky vykonávají svůj účinek navázáním na r-hsLDLR.

Příklad 10: Inhibice replikace HCV pomocí monoklonálních protilátek

U monoklonálních protilátek specifických pro r-hsLDLR se testovala jejich schopnost inhibovat replikaci HCV u lidských hepatocytů v primární kultuře, získala od ženy ve věku 57 let, části plic z důvodu metastáz při plíce).

Buněčná kultura FT167 se kde bylo nutné provést odnětí nádoru tlustého střeva (pravá

Primární kultury lidských hepatocytů se připravily ve dvou krocích způsobem perfúze kolagenázy (popisuje se v publikaci Maurel P. Adv. Drug Del. Rev. 22: 105-132 (1996) . Pichard L.

et al., Mol. Pharmacol. 41: 1047-1055 (1992), Ferrini JB. , et al., Chem-Biol. Interactions 107: 31-45 (1997)).

Životaschopnost buněk před nanesením na destičky se stanovila použitím vylučovacího testu trypanovou modří. Čtyři miliony buněk v kultivačním médiu o objemu 3 ml se umístilo na plastické misky o průměru 60 mm potažené kolagenem. Použilo se kultivační médium WilliamsΈ určené pro dlouhodobé kultivace neobsahující sérum upravené podle publikace Lanford R., et al., In Vitro Cell Dev. Biol. 25: 174-182 (1989). Toto kultivační médium se měnilo každých 48 hodin. Kultury se uchovávaly při teplotě 37 °C ve vlhké atmosféře vzduchu a 5% C0₂. Při těchto kultivačních podmínkách si lidské hepatocyty uchovávají svůj diferenciovaný fenotyp po dobu alespoň 35 dní (popisuje se v publikaci Ferrini JB. et al. , Chem-Biol. Interactions 107: 31-45 (1997)) a jsou citlivé vůči infekci HCV a umožňují replikaci virového genomu (popisuje se v publikaci Fournier C. et al., J. Gen. Virol. 79: 2367-2374 (1998)) .

Vzorek séra pozitivní na HCV:

Na základě testů s protilátkami proti HCV testem EIA HCV 3.0 a Chiron RIBA HCV 3.0 SIA se stanovila banka lidského séra pozitivních pacientů. Žádný z těchto pacientů nebyl infikován HBV nebo HIV. V každém séru vzorku HCV RNA se kvantitikoval monitorem Roche a provedly se testy na úrovni genomu sadou sond (Inno-Lipa HCV II, Innogenetics). Vzorky séra se uchovávaly při teplotě -80 °C v malém množství, aby se ···» · · · * • · · · · · ··· · · ··· * · · zabránilo cyklům mražení a tání. V těchto experimentech se použil vzorek S42 (genotyp 1b, naneslo se 410 000 kopií v 1 ml) .

Při infekci a následné léčbě se hepatytické kultury přenesly za sterilních podmínek do „laboratoře P3 (vysoká bezpečnost před lidskými mikroorganizmy). Tři dny po nanesení na plotny, kdy se buňky zotavily z traumatu izolace, infekce in vitro hepatocytů se uskutečnila přes noc inkubací s 25 μΐ vzorku séra pozitivního na HCV (S42) ve 3 ml kultivačního média. Po infekci se buňky třikrát promyly 3 ml čerstvého kultivačního média kultivace pokračovala za normálních podmínek v kultivačním médiu vhodném pro dlouhodobou kultivaci.

Buňky se šetřily 3 monoklonálními protilátkami určenými proti r-hsLDLR. Jsou to monoklonální protilátky 12.6, 28 a

29.8. 30 minut před infekcí se buňky vystavily působení 2 až 8 gg/ml různých monoklonálních protilátek. Pak se buňky infikovaly, jak se popisuje shora v textu.

Kontrolní kultury se infikovaly za podobných podmínek, ale v nepřítomnosti antivirové léčby. V paralelních experimentech se některé kultury ošetřily IFNa v množství 5 000 jednotek v jednom mililitru za podobných podmínek, které umožňují srovnání (IFNa v buňkách silně inhibuje replikaci HCV). Všechny ošetření se provedla ve dvou provedeních.

Pět dní po infekci se odstranilo médium a kultury se třikrát promyly chlazeným fyziologickým roztokem pufrovaným fosforečnanem. RNA se izolovala z 4xl0⁶ hepatocytů za použití extrakčního postupu s guanidinizothokyanátu s kyselým fenolem (popisuje se v publikaci Chomczynski P.N. an Sacchi N., Analyt. Biochem. 162: 156-159 (1987)). Vysrážená RNA se rozpustila v 50 μΐ vody ošetřené diethylpyrokarbonátem (DEPC) a stanovilo se její množství. Jeden mikrogram buněčné RNA se analyzoval testem rTth RT-PCR specifickým pro řetězec.

Aby se zabránilo možné kontaminaci, test RT-PCR specifický pro řetězec se provedl sekvenací za použití tří oddělených místností. RNA se rozpuštěná v 10 μΐ vody ošetřené DEPC se překryla minerálním olejem a zahřála se při teplotě 95 °C po dobu 1 minuty. Teplota se snížila na 70 °C a přidalo se 10 μΐ předem předehřáté reakční směsi pro cDNA. Teplota pak klesla na 60 °C po dobu 2 minut a došlo k teplotní hybridizaci a cDNA reakce se provedla po dobu 20 minut při teplotě 70 °C za použití DNA polymerázy rTth (Perkin-Elmer). Udržovala se teplota 70 °C, zatímco se přidalo 40 μΐ předem ohřátého média, které obsahuje EGTA jako chelatační činidlo Mn²⁺, aby se snížila aktivita rTth RT. Reakční zkumavky se udržovaly při teplotě 70 °C, zatímco se přidalo 40 μΐ zahřáté směsi PCR. Podmínky PCR upravené pro systém Gene Amp® PCR-Systém 9600 (Perkin-Elmer) zahrnovaly počáteční cyklus při 94 °C po dobu 1 minuty, 50 cyklů při teplotě 94 °C po dobu 15 vteřin, 58 °C po dobu 30 vteřin, 72 °C po dobu 30 vteřin a konečný krok extenze při teplotě 72 °C po dobu 7 minut. V případě testu pozitivního řetězce HCV RNA je sekvence reverzního primeru P3: 5'TGG/ATGCACGGTCTACGAGACCTC-3' (nt 342-320) a sekvence forward primeru P4 je 5'-CACTCCCCTGTAGGAACT-3' (nt: 38-56) (popisuje se v publikaci Laskus T. et al., J. Gen. Virol. 78: 2747-2750 (1997)). Stejné primery se použily v opačném pořadí za účelem detekce negativního řetězce. Jedna desetina amplifikovaného produktu se analyzovala gelovou elektroforézou na agarózovém gelu (2%), pak následovalo vybarvení pomocí BET a fotografování UV zářením. Ve všech sériích experimentů se provedlo ředění syntetického HCV RNA (+) a (-) řetězců a přidal se 1 pg celkové RNA získané z jater, aby se mohly analyzovat kultivované hepatocyty. Tyto směsi se používaly jako pozitivní kontroly v případě testu RT-PCR.

:::. · . . * ... .. ... .·· ·· ····

Obrázek č. 3 zobrazuje, že produkce negativního řetězce HCV v přítomnosti monoklonálních protilátek proti LDLR se zcela inhibovala v kultuře FT167.

Silně se inhibovala replikace virového genomu. Výsledky odpovídají skutečnosti, že LDLR může být receptorem HCV.

Přiklad 11: Produkce chimerových protilátek proti LDLR mRNA se izolovala z buněčné linie hybridomů, které produkují monoklonální protilátky specifické pro LDLR.

Specifická cDNA se syntetizovala s oligonukleotidy komplementárními s 5' koncem exonu CH1, který pochází z variabilní oblasti těžkého řetězce (oligo 1) a z 5' konce hexonu Ck variabilní oblasti lehkého řetězce (oligo 2), kdy se jako templát použije izolovaná mRNA.

Izolovaly se dvě cDNA, jedna z nich kóduje variabilní oblast (specifickou pro LDLR) těžkého řetězce a další variabilní oblast (specifická pro LDLR) lehkého řetězce. cDNA se klonovala a sekvenovala.

V případě konstrukce chimérového těžkého řetězce se variabilní oblast klonovaného genu těžkého řetězce lidského Ig zaměnila (použitím genetických manipulací) za klonovanou DNA, která kóduje myší variabilní oblast (specifická pro LDLR) těžkého řetězce. Genetické manipulace zahrnují extenzi variabilní oblasti, která pochází z lidského Ig, za použití specifických restrikčních enzymů a ligaci myší variabilní oblasti. Provedl se stejný postup, aby se získal chimerový lehký řetězec. Zkonstruovaly se dva savčí expresívní plazmidy.

Jeden zahrnuje chimerový gen těžkého řetězce a další zahrnuje chimerový gen lehkého řetězce. Oba vektory se použily ke společné transfekci buněčné linie hybridomů (SP6).

Produkce Ig specifického pro LDLR se testovala testem

ELISA a westernovým přenosem, kde se jako sekundární protilátky používá kultivační médium transfekovaných buněk. Afinita chimerových protilátek vůči jeho ligandům se monitorovala pomocí Biacore.

Příklad 12: Příprava transgenních myší, které se upravují metodami genového inženýrství, aby obsahovaly genové loci lidského ímunoglobulínu (xenomyši) a příprava lidských monoklonálních protilátek proti lidskému LDLR.

Příprava xenomyši se popisuje v patentovém dokumentu WO 98/24893 a v publikaci Mendez M., J. et al., Nátuře genetics 15: 146-56 (1997).

V knihovnách lidského-kvasinkového umělého chromozomu (YAC) se hledaly YAC obsahující variabilní oblast lidského těžkého řetězce (přibližně 1 000 kb) (klonovací metody YAC se používá v případě, že se vyžadují inzerty větší než 100 kb).

YAC se charakterizovaly analýzou Southernovým přenosem pomocí pulzní elektroforézy (PFGE). YAC by mělo zahrnovat oblasti Cp C5, Dh a Vh v uspořádání zárodečné linie.

Prostřednictvím využití přesahujících sekvencí obsažených v YAC se YAC rekombinovaly v kvasinkách strategií postupné f rekombinace. Před rekombinací se 3konec YAC (s oblastí V) ligoval k selekčnímu markéru HPRT. Struktura rekombinovaného YAC se potvrdila PFGE a Southernovou analýzou (přítomnost lokusu lidského těžkého řetězce z C oblasti do oblasti Vh v uspořádání zárodečné linie).

Acentrické rameno YAC se cílilo vektorem nesoucím úplnou konstantní oblast γ2, myší zesilovač, gen nesoucí rezistenci na neomycin za vzniku konečného těžkého řetězce nesoucího celou variabilní oblast . To znamená geny 82 Vh, geny 6 Jh a 3 různé konstantní oblasti Ομ CÓ Cy s jejich odpovídajícími regulačními sekvencemi. Tento YAC se označil jako yH2. Tato konstrukce se použila při produkci xenomyši.

Podobná strategie, jako je ta popsaná shora v textu využívaná při rekonstrukci loci kappa, je pouze tato: neomycinový selekční markér se ligoval do rekonstruovaného • YAC, který obsahuje celé loci kappa. Tento YAC se označil γΚ2.

YAC obsahující yH2 se zavedly do buněk ES prostřednictvím fúze YAC obsahující kvasinkový sferoplast s HPRT deficitním E14. TG3B myšími buňkami ES. Vybraly se buňky, které jsou pozitivní na HPRT. Rozmnožily se pozitivní klony a analyzovaly se Southernovou analýzou a analýzou CHEF přenosem. Vybraly se klony obsahující nedotčený yH2 YAC.

Zavedení a selekce yK2 YAC do buněk ES se uskutečnilo podobně jako v případě yH2 YAC.

Buňky ES obsahující YH2 se zavedly mikroinjekcí do myších blastocytů C57BL/6J. U produkovaných chimérických samic se hodnotil přenos buněčné linie na mláďata.

yH2 a/nebo yK2-transgenní myši se oplodnily pomocí myší Dl (homozygotní v případě cílených deaktivovaných myší s loci těžkého řetězce a řetězce kappa). Každý z kmene yH2, Dl t transgenních myši se oplodnily pomocí yK2, Dl transgenního kmene za vzniku xenomyšich kmenů.

Obnova vývoje buňky B a produkce protilátek v xenomyši se hodnotila průtokovou cytometrií a testem ELISA.

Imunizace xenomyši se uskutečnila způsobem popsaným v příkladu 2.

Způsoby přípravy hybridomů a testování pozitivních klonů jsou podobné jako ty popsané v příkladech 3 a 4.

Klony hybridomů 12.6, 28, 29.8, 30 a 50.30 se uložily v Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, Paris podle Budapešťské úmluvy pod přístupovým číslem 1-2390, 1-2391, 1-2392, 1-2393 a 1-2394.

Claims (8)

1. P A T E Ν T 0 V É N Á R 0 • · · · · ’ »·« ·· ··· ··· · K Y Monoklonální protilátka, chimerová protilátka, zcela humanizovaná protilátka, anti-anti- ID protilátka nebo

   jejich fragment, které specificky rozeznávají a váží se na lidský receptor LDL a jeho fragmenty s výjimkou monoklonálních protilátek Cl.
2. 2. Monoklonální protilátka podle nároku 1, která specificky rozeznává a váže se na lidský rozpustný receptor LDL.
3. 3. Monoklonální protilátka podle nároku 1, která je monoklonální protilátkou exprimovanou klonem hybridomu

   12.6 uloženým v CNCM s přístupovým číslem 1-2390.
4. 4. Monoklonální protilátkou podle nároku 1, kterou je monoklonální protilátka exprimovaná klonem hybridomu 28 uloženým v CNCM s přístupovým číslem 1-1291.
5. 5. Monoklonální protilátka podle nároku 1, kterou je monoklonální protilátka exprimována klonem hybridomu 29.8 uložená v CNCM s přístupovým číslem 1-2392.
6. 6. Monoklonální protilátka podle nároku 1, kterou je monoklonální protilátka exprimovaná klonem hybridomu 30 uloženým v CNCM s přístupovým číslem 1-2393.
7. 7. Monoklonální protilátka podle nároku 1, kterou je monoklonální protilátka exprimovaná klonem hybridomu 50.30 uloženým v CNCM s přístupovým číslem 1-2393.

   8. Monoklonální protilátky podle libovolného z nároků 3 až 7 patřící k izotypu imunoglobulinu IgGi nebo IgM.

   9. Způsob detekce a/nebo kvantifikace lidského LDLR, vyznačující se tím, že zahrnuje použití monoklonálních protilátek podle libovolného z nároků 1 až
8. 8.

   ► · · · · 4

   Monoklonální protilátky podle nároku 1, které je možné použít jako pár v testu ELISA.

   Monoklonální protilátky podle nároku 10, které se vytvořily klonem hybridomů 28 nebo klonem 29.8. Monoklonální protilátky podle nároku 1, které jsou schopny identifikovat LDLR analýzou westernovým přenosem. Monoklonální protilátky podle nároku 12, které vytvořily klon hybridomů 12.6, klon 28, klon 29.8 nebo klon 30. Monoklonální protilátky podle nároku 1 schopné neutralizovat antivirovou biologickou aktivitu r-hsLDLR. Monoklonální protilátky podle nároku 14, které vytvořil klon hybridomů 12.6 nebo klon 50.30.

   Monoklonální protilátky podle nároku 1 schopné inhibovat replikaci viru hepatitidy C.

   Monoklonální protilátky podle nároku 16, které vytvořil klon hybridomů 12.6, klon 28 nebo klon 29.8.

   Klon hybridomů 12.6 uložený u CNCM pod číslem 1-2390.

   Klon hybridomů 28 uložený u CNCM pod číslem 1-2391.

   Klon hybridomů 29.8 uložený u CNCM pod číslem 1-2392.

   Klon hybridomů 30 uložený u CNCM pod číslem 1-2393.

   Klon hybridomů 50.30 uložený u CNCM pod číslem 1-2393 Způsob přípravy monoklonální protilátky podle nároku 1, vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci klonovaného hybridomů obsahujícího slezinou buňku ze savce imunizovaného hsLDL a homogenní nebo heterogenní lymfoidní buňku v kapalném médiu nebo v břiše savce, což umožňuje hybridomů produkovat a akumulovat monoklonální protilátku. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, ž e imunogen LDLR je vysoce čistý lidský LDLR.

   Způsob vhodný pro čištění lidského LDLR, vyznačující se tím, že zahrnuje kontakt materiálu obsahujícího lidský LDLR s monoklonálními protilátkami podle libovolného z nároků 1 až 8