MXPA06003886A - Reactivos de enlace de inmunoglobulina naturales y metodos de fabricacion y uso de los mismos. - Google Patents

Abstract

Se describen reactivos de enlace de inmunoglobulina natural aislados junto con articulos de manufactura, composiciones y equipos que incluyen los reactivos de enlace de inmunoglobulina natural. Los reactivos y sustratos marcados que comprenden muestras o reactivos son provistos. Tambien se proporcionan metodos de seleccion, para fabricar y utilizar los reactivos.

Description

REACTIVOS DE ENLACE DE INMÜNOGLOBULINA NATURALES Y MÉTODOS DE FABRICACIÓN Y USO DE LOS MISMOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención es concerniente en general con reactivos de enlace que se enlazan preferiblemente a inmunoglobulinas naturales con respecto a las inmunoglobulinas desnaturalizadas. Esta invención también es concerniente en general con métodos para producir estos reactivos de enlace y usarlos en una variedad de instalaciones de investigación, diagnóstico y terapéuticas. Estos métodos y reactivos de enlace proporcionan un análisis sustancialmente mejorado y realzado de una amplia variedad de interacciones inmunológicas, en las que se incluyen, pero no limitadas a, aquella que involucran anticuerpos de anti-anticuerpo, tales como análisis de proteínas inmunoabsorbidas . Esta invención también es concerniente con nuevos anticuerpos y métodos para fabricarlos y usarlos, en los que se incluye pero no limitados a anticuerpos monoclonales 'y policlonales que se enlazan preferiblemente a inmunoglobulina natural . Esta invención también es concerniente con hibridomas que producen tales anticuerpos monoclonales también como células huésped recombinantes que expresan moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos . La presente invención también es concerniente con métodos y composiciones de investigación, terapéuticas, y diagnóstico que emplean estos anticuerpos y reactivos de enlace también como equipos que los contienen.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Una de las primeras demostraciones de la producción de anticuerpos monoclonal se hizo en 1975 por ohler y Milstein [256 NATURE 495-497 (1975)]. Desde entonces mucho esfuerzo se ha dirigido a la producción de varias células híbridas (llamadas "hibridomas" ) y con el uso del anticuerpo fabricado a partir de estos hibridomas para varias investigaciones científicas. Véase, por ejemplo la Patente estadounidense No. 4,515,893 intitulada "Hybrid Cell Line for Producing Complement-Fixing Monoclonal Antibody to Human T Cell" que ilustra algunas de las recompensas, complicaciones y varias de intentar producir anticuerpo monoclonal a partir de hibridomas. La producción de anticuerpos monoclonales está influenciada por los tipos de antígenos usados, también como los métodos de selección empleados para el aislamiento del hibridoma deseado . El sistema inmune tiende a montar una respuesta hacia los epítopos más abundantes, inmunodominantes en una mezcla de proteínas; por consiguiente, estas técnicas de producción de anticuerpo monoclonal tradicionales frecuentemente dan como resultado la generación de anticuerpos monoclonales contra epítopos inmunodominantes.

Cuando se trata de producir anticuerpos específicos para proteínas que son rara o deficientemente inmunogénicas, frecuentemente surge dificultad. Además, el aislamiento de anticuerpos específicos para una proteína con similaridad de secuencia significativa con otras proteínas puede también ser desafiante. La inmunización sustractiva es una técnica establecida utilizada para la generación de anticuerpos específicos para antígenos que menos abundantes, deficientemente inmunogénicas y/o similares en secuencia o estructura a otras proteínas [Zijlstra et al., "Targeting the Proteome/Epitome, Implementation of Substractive Immunization", 303(3= BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN., 733-744 (2003) ; Liang-June Yang y en-Liang Wang, "Preparation of Monoclonal Antibody Against Apoptosis-Associated Antigens of Hepatoma Cells by Substractive Immunization" , 8(5) WORLD J. GASTROENTEROL, 808-814 (2002)]. La purificación e identificación de una proteína objetivo a partir de una mezcla de proteínas crudas, tales como un lisado celular, se obtiene en general mediante inmunoprecipitación seguida por inmunoabsorción. La técnica de inmunoprecipitación utiliza anticuerpos específicos enlazados a un sustrato insoluble, tal como una resina, para capturar y precipitar la proteína de interés . Las proteínas sin enlazar son separadas mediante centrifugación y la proteína de interés es recuperada del soporte sólido mediante una solución reguladora del pH de elusión que también se desnaturaliza y libera el anticuerpo enlazado a la resina. El procedimiento de inmunoprecipitación clásico comúnmente usado en investigación de biología celular da como resultado la separación de la proteína inmunoprecipitada mediante análisis de SDS-PAGE. Sin embargo, las proteínas determinadas por SDS-PAGE también contienen cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo desnaturalizado que fue liberado de la resina. Esto complica el análisis de la proteína purificada, especialmente cuando se sigue la separación de SDS-PAGE mediante inmunoabsorción (por ejemplo, bandas de proteína) en donde los anticuerpos secundarios marcados usados para revelar el anticuerpo de inmunoabsorción también reaccionará con las cadenas pesadas y ligeras desnaturalizadas de los anticuerpos inmunoprecipitantes . Los datos de interpretación son impedidos adicionalmente cuando el peso molecular de la proteína de interés es cercano a las cadenas pesadas o ligeras del anticuerpo y la proteína es por consiguiente enmascarada por su presencia. La investigación proteómica depende extensamente de las técnicas de inmunoprecipitación/inmunoabsorción clásicas para muchos estudios, tales como patrones de expresión de proteína, interacciones proteína-proteína, modificaciones post-trasnacionales y función de proteína. Las técnicas y productos disponibles actualmente que intentan eliminar o minimizar el impacto de la presencia de las cadenas pesadas y ligeras sobre los productos inmunoabsorbidos han sido insatisfactorias, han encontrado uso limitado y no han ofrecido una buena solución a estos problemas. "Seize X" de Pierce Chemical de Rockford, IL utiliza un agente de reticulación, DSS, para reticular el anticuerpo primario a proteína A o G sobre una perla, orientando apropiadamente el anticuerpo de tal manera que el sitio de enlace de antígeno esté de frente a lo lejos del soporte de proteína A o G. esta técnica de inmovilización permite a los investigadores de la posibilidad de utilizar el anticuerpo primario y reducir la contaminación por cadenas pesadas y ligeras en su muestra final. Las desventajas del equipo Seize X incluyen factores tales como: (i) tiempo, se requiere una hora adicional para usar este para la mejora de las inmunoprecipitaciones y (ii) complejidad - se requieren etapas adicionales a ser agregadas a los procedimientos . Antes de la presente invención, ningún reactivo estaba disponible que reconozca preferiblemente la inmunoglobulina natural para este propósito. La presente invención proporciona tales reactivos y otros elementos que serán evidentes después de una revisión completa de lo siguiente .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona, en una modalidad, nuevos reactivos de enlace y métodos que los utilizan, para detectar preferiblemente inmunoglobulina natural . Estos reactivos de enlace y métodos para fabricarlos y usarlos proporcionan resultados sustancialmente mejorados en una amplia variedad de métodos de investigación, diagnóstico y terapéuticos, en los que se incluyen pero no limitados a cualquier método en donde este involucrada la detención de moléculas de anticuerpo naturales, tales como en procedimientos para detección de proteína inmunoabsorbida. Los reactivos de enlace de la presente invención y métodos que los utilizan son también útiles en una amplia variedad de técnicas de investigación y procedimientos de diagnóstico, cualesquiera que sean los anticuerpos anti-anticuerpo que son utilizados. Estos reactivos de enlace son denominados en la presente como reactivos de enlace inmunoglobulina-específicos naturales (NIgSBR) . NIgSBR puede ser cualquier tipo de molécula o compuesto en los que se incluyen pero no limitados a, moléculas orgánicas e inorgánicas pequeñas, proteínas, péptidos, anticuerpos, ácidos nucleicos, polisacáridos o cualquier otra molécula que se enlaza específicamente a la inmunoglobulina natural. Por ejemplo, el NIgSBR puede ser un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, una porción de anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una variante de anticuerpo, una proteína diseñada, un andamiaje de polímero, un compuesto diseñado, un polipéptido, un polímero fabricado en un sistema de mamífero, un polímero fabricado en un sistema no mamífero, un polímero fabricado en un E. coli mediante exhibición de fago o los semejantes. Estos NIgSBR pueden ser producidos, mediante selección de uno o más compuestos para identificar un compuesto que se enlace específicamente a inmunoglobulina natural. Por ejemplo, el NIgSBR puede ser identificado de una biblioteca, tal como una biblioteca de anticuerpo, una biblioteca de andamiaje de proteína, una biblioteca de exhibición de péptido, una biblioteca de evolución dirigida, una biblioteca a base de arreglo de proteína o los semejantes. Una composición que comprende el NIgSBR puede incluir el NIgSBR y otros materiales, tales como diluyentes, adyuvantes, portadores o los semejantes, dependiendo del uso para la composición. El NIgSBR puede ser marcado, por ejemplo con un agente quimioluminiscente, un radioisótopo, una enzima, un agente fluorescente, un agente cromogénico o los semejantes. Similarmente, artículos de manufactura (por ejemplo equipos para investigación o uso de diagnóstico) que incluyen el NIgSBR pueden incluir adicionalmente materiales de empaque y un contenedor o recipiente que comprende la composición, inmovilizada sobre un sustrato. La presente invención incluye métodos para identificar y aislar NIgSBR que proporciona NIgSBR que tienen una especificidad de enlace específica que permite la detección y/o cuantificación de inmunoglobulina natural. Se pueden usar ya sea métodos de detección en fase líquida o fase sólida con los NIgSBR de la invención. Por ejemplo, en varios formatos de detección preferidos, un NIgSBR o una muestra que es detectada por el NIgSBR se puede fijar a un sustrato sólido, por ejemplo una perla, una placa, una hoja, una banda, una cavidad, un tubo o los semejantes. Alternativamente, un formato de detección en fase líquida, por ejemplo seguido por electroforesis de componentes enlazados puede ser usado. Como se indica, la presente invención proporciona NIgSBR que incluye, en aspectos preferidos, envase anticuerpos y métodos para producirlos, para uso en procedimientos para detectar preferiblemente inmunoglobulina natural. Por ejemplo, la invención proporciona un método para producir por lo menos un reactivo de enlace inmunoglobulina-específico natural, tal como un anticuerpo inmuno-globulina-específico anti-natural (en este caso, el NIgSBR relevante es un "anti-NiSab" ) , al seleccionar anticuerpos surgidos contra un antígeno de inmunoglobulina para identificar anticuerpos que se enlazan específicamente a una inmunoglobulina natural . El anticuerpo puede tomar cualquiera de las formas indicadas en la presente y puede ser usado en cualquiera de los formatos de detección indicados para NIgSBR en general . Estos anticuerpos proporciona resultados sustancialmente mejorados en una amplia variedad de métodos de investigación, diagnóstico y terapéuticos, en los que se incluyen pero no limitados a, cualquier método en donde esté involucrada la detección de moléculas de anticuerpo naturales, tales como en procedimientos para detección de proteínas inmunoabsorbídas . Los métodos y anticuerpos de la presente invención también son útiles para una amplia variedad de técnicas de investigación y también procedimientos de diagnóstico, por ejemplo cualesquiera que sean los anticuerpos anti-anticuerpos utilizados. La capacidad única de los métodos y anticuerpos de la presente invención para enlazarse específicamente a inmunoglobulina natural proporciona resultados sustancialmente mejorado cuando son usados para metodológicas inmunológicas, en las que se incluyen, pero no limitadas a técnicas de inmunoprecipitación y bandas de proteínas . Así, preparaciones de anticuerpo homogéneas, por ejemplo que incluyen anti-NIgSAb aislados que tienen capacidad para distinguir entre inmunoglobulina y su estado natural contra desnaturalizado son provistas. Un anticuerpo de la invención puede ser por ejemplo un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, una porción de anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una variante de anticuerpo, un anti-NIgSAb, una porción de anti-NIgSAb, un fragmento de anti-NIgSAb, o una variante de anti-NIgSAb. El anticuerpo se puede criar en un mamífero tal como un humano, primate, roedor, ratón, rata, hámster, conejo, caballo, burro, oveja o cabra y/o puede ser quimérico, humanizado y/o puede ser un anti-NigSAb CDR-injertado. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser criado en el mamífero mediante inmunización sustractiva que incluye administración de una inmunoglobulina desnaturalizada seguida por inmunización con una inmunoglobulina natural. El anticuerpo policlonal resultante puede ser sustraído con inmunoglobulina desnaturalizada, por ejemplo anexado a un sustrato insoluble, por ejemplo, una perla, placa, cavidad, tubo, membrana u hoj a . También se proporcionan composiciones que incluyen un anti-NigSAb y un diluyente, adyuvante o portador apropiado. Productos de excisión y otras porciones y variantes específicas de los mismos, también como composición anti-NIgSAb, ácidos nucleicos de codificación o complementarios, vectores, células huésped, líneas celulares para producir anti-NigSAb, composiciones, formulaciones, dispositivos, artículos de manufactura, tales como equipos, animales transgénicos, células transgénicas, plantas transgénicas y métodos para fabricar y utilizar también como se describe y habilita en la presente y en combinación con lo que es conocido en la técnica. Por ejemplo, la invención proporciona un artículo de manufactura, por ejemplo para uso de investigación o diagnóstico que comprende un material de empaque y un contenedor o recipiente que comprende por lo menos un NigSBR, por ejemplo un anti-NIgSAb aislado. El NIgSBR tal como un anti-NigSAb, es comúnmente marcado detectablemente para facilitar el uso del artículo. Cualquier etiqueta o marcador disponible puede ser usado, por ejemplo un agente quimioluminiscente, un radioisótopo, una enzima, un agente fluorescente, un agente cromogénico o los semejantes. En un ejemplo, la etiqueta comprende una enzima que produce un producto detectable. Por ejemplo, la enzima puede ser una enzima HRP. Un artículo de manufactura que tiene un formato como un equipo puede incluir adicionalmente, por ejemplo instrucciones para usar el anti-NigSAb u otro NIgSBR, reactivos de control, diluyentes o los semejantes. Por lo menos un anticuerpo de la invención enlaza por lo menos un epítopo especificado específico a por lo menos una proteína de inmunoglobulina natural, subunidad, conformación, fragmento, porción o cualquier combinaciones de los mismos, en los que se incluyen pero no limitados a, cualquier epítopo encontrado en cadena pesada o ligera natural de cual clase o isotipo de molécula de inmunoglobulina. Por lo menos un epítopo puede comprender por lo menos una región de enlace de anticuerpo que comprende por lo menos una porción de la proteína, tal epítopo puede ser lineal o conformacional y puede consistir de 1 a 5 ó 5 o más aminoácidos de por lo menos una porción del mismo, tal como pero no limitado a, por lo menos un dominio, lineal o conformacional, encontrado en forma natural de la proteína de inmunoglobulina o cualquier porción de la misma. Un epítopo lineal que comprende una secuencia contigua de aminoácidos y un epítopo de conformación que comprende aminoácidos que puede no ser continuos pero son formados a partir de una estructura primaria, secundaria, terciaria o cuaternaria del antígeno . Por lo menos un anticuerpo de la presente invención se enlaza preferiblemente a la inmunoglobulina no desnaturalizada . Por lo menos un anti-NIgSAb en otra modalidad de la presente invención puede comprender opcionalmente por lo menos una porción especificada de por lo menos una región que determina la complementariedad (CDR) (por ejemplo, CDR1, CDR2 ó CDR3 de la región variable de cadena pesada o ligera) y/o por lo menos una región de estructura constante o variable de cualquier porción de la misma. La secuencia de aminoácidos de anti-NIgSAb puede además comprender opcionalmente por lo menos una sustitución, inserción o cancelación especificada como se describe en la presente o como es conocido en la técnica.

La presente invención proporciona por lo menos un anti-NIgSAb monoclonal aislado como se describe en la presente, en donde el anticuerpo tiene por lo menos una actividad tal como, pero no limitada a, la capacidad para enlazarse preferiblemente a moléculas - de inmunoglobulina naturales. Un anti-NIgSAb ya sea monoclonal o policlonal, puede así ser seleccionado en cuanto a una actividad correspondiente de acuerdo con métodos conocidos . En otra modalidad de la presente invención, se proporcionan métodos para preparar: (i) hibridomas que producen tales anticuerpos; (ii) anticuerpos policlonales; y (iii) otros reactivos de enlace que se enlazan preferiblemente a inmunoglobulina natural. En una modalidad relacionada, la presente invención también proporciona por lo menos un método para expresar por lo menos un anti-NIgSAb en un hibridoma o una célula huésped recombinante, que comprende cultivar un hibridoma o una célula huésped recombinante como se describe en la presente bajo condiciones en donde el anti-NIgSAb es expresado en cantidades detectables y/o recuperables . La célula huésped recombinante que expresa en anti-NIgSAb comprende una molécula de ácido nucleico que codifica el anti-NIgSAb. En otra modalidad, la presente invención también proporciona por lo menos una composición que comprende: (a) uno o más anti-NIgSAb aislado que codifica ácido nucleico, célula huésped recombinante, anti-NIgSAb, NIgSBR, y/o hibridoma como se describe en la presente; y (b) un portador o diluyente apropiado. El portador o diluyente puede ser opcionalmente de grado reactivo o aceptable farmacéuticamente, de acuerdo con los portadores o los diluyentes - conocidos y también puede ser secado o liofilizado. La composición puede opcionalmente comprender además por lo menos un compuesto, proteína o composición adicional. En una modalidad de la presente invención también incluye un equipo que comprende una o más de estas composiciones. El uso de los NIgSBR y métodos de la presente invención, anticuerpo desnaturalizado contaminante que puede ser, por ejemplo, transportado en procedimientos de inmunoprecipitación estándar, no interfiere con las etapas de inmunoabsorción finales. El NIgSBR y anti-NIgSAb de la presente invención mejoran sustancialmente la detección de una proteína de interés sobre un producto inmunoabsorbido y mejora sustancialmente la interpretación de datos y presentación de datos . El NIgSBR y anti-NIgSAb y métodos de la presente invención para fabricarlos y utilizarlos, son apropiados en una amplia variedad de procedimientos de investigación, terapéuticos y de diagnóstico en los que se incluyen pero no limitados a, procedimientos en los cuales pueden estar presentes moléculas de inmunoglobulina naturales y desnaturalizadas. Los métodos de la presente invención no agregan etapas extra a los protocolos de inmunoabsorción comúnmente utilizados y no requieren modificaciones a los procedimientos usados comúnmente en biología celular y laboratorios de investigación proteómicos . Por ejemplo, en tanto que las cadenas pesada y ligeras desnaturalizadas de los anticuerpos primarios transportados de las etapas de inmunoprecipitación pueden estar presentes en el inmunoabsorbido, no son detectadas o no son detectadas como tal, por el NIgSBR o anti-NIgSAb de la presente invención. El NigSBR, anti-NIgSAb y métodos de la presente invención simplifican y mejoran sustancialmente el análisis de las proteínas inmunoabsorbidas al eliminar la detección del anticuerpo desnaturalizado. La presente invención también proporciona, en un aspecto relacionado, moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden, complementarias o que hibridizan a, NIgSBR que codifica polinucleótido tal como anti-NIgSAb, que comprende por lo menos una secuencia especificada, dominio, porción o variante del mismo. La presente invención proporciona además vectores recombinantes que comprenden las moléculas de ácido nucleico anti-NIgSAb, células huésped que contienen tales ácidos nucleicos y/o vectores recombinantes, también como métodos para fabricar y/o usar tales ácidos nucleicos de anticuerpo, vectores y/o células huésped.

Estas y una amplia variedades adicionales de la presente invención son fácilmente evidentes para aquellos de habilidad ordinaria en la técnica como se revela en la presente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1 : Muestra el enlace preferencial de anticuerpos de la presente invención a inmunoglobulina natural en formato de bandas de proteína. Figura 2A Y Figura 2B compuesta por Paneles A y B: Muestra el resultado de los métodos de la presente invención para producir y seleccionar los anticuerpos que se enlazan preferiblemente a inmunoglobulina natural en formato de bandas de proteína. Figura 3 : Muestra el resultado de bandas de proteína utilizando anticuerpos convencionales que no se enlazan preferiblemente a inmunoglobulina natural (Carril 1) en comparación con anti-NIgSAb de la presente invención (Carril 2) . El Carril 3 muestra el Carril 2 re-absorbido con el anticuerpo convencional utilizado en el Carril 1.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona NIgSBR aislado tal como anti-NIgSAb, también como métodos para fabricarlos, composiciones y equipos que los comprenden y moléculas de ácido nucleico que codifican el anti-NIgSAb. La presente invención incluye además, pero no está limitada a, métodos para usar el NIgSBR y anti-NIgSAb de la presente invención, en las que se incluyen métodos de investigación, terapéuticos y de diagnóstico y dispositivos. El NIgSBR y anti-NIgSAb de la presente invención se enlazan específicamente a inmunoglobulina natural. "Enlaza específicamente" significa enlace de alta avidez y/o alta afinidad de un reactivo de enlace tal como un anticuerpo a un polipéptido específico, por ejemplo epítopo de una proteína de inmunoglobulina natural . El enlace de anticuerpo a un epitopo sobre este polipéptido específico es preferiblemente más fuerte que el enlace del mismo anticuerpo a cualquier otro epítopo, particularmente aquellos los cuales pueden estar presentes en moléculas en asociación con o en la misma muestra como el polipéptido específico de interés, como por ejemplo el anticuerpo se enlaza más fuertemente a una inmunoglobulina natural que las formas o fragmentos desnaturalizados de inmunoglobulina, de tal manera que al ajustar las condiciones de enlace, el anticuerpo se enlaza más preferiblemente a la inmunoglobulina natural y menos preferiblemente a las formas o fragmentos desnaturalizados de la inmunoglobulina. Los anticuerpo que se enlazan específicamente a un polipéptido de inmunoglobulina natural de interés puede ser capaz de enlazar otros polipéptidos, tales como inmunoglobulina desnaturalizada, a un nivel débil, pero todavía detectable (por ejemplo, 50% o menos, 40% o menos, 30% o menos, 20% o menos, 15% o menos, 10% o menos, 5% o menos, 1% o menos o 0.1% o menos del enlace mostrado para el polipéptido de inmunoglobulina natural de interés. Tal enlace diferencial o alternativamente enlace de fondo, es fácilmente discernible del enlace de anticuerpo específico con el polipéptido de inmunoglobulina natural de interés, por ejemplo mediante el uso de controles apropiados. Sin embargo, es fácilmente evidente para aquellos de habilidad ordinaria en la técnica que cualquier diferencia detectable entre el enlace a la inmunoglobulina natural y la inmunoglobulina desnaturalizada de muestra el enlace preferencial a la inmunoglobulina natural de interés. En general, el anti-NIgSAb de la presente invención que se enlaza preferiblemente a la inmunoglobulina natural con una afinidad de enlace de aproximadamente 106 moles/litro o más o aproximadamente 107 o aproximadamente 108 moles/litro o más, se enlaza específicamente a inmunoglobulina natural. Un compuesto biológico "aislado" tal como un anti- NigSAb es uno que está parcial o completamente purificado de los componentes biológicos con los que es producido. Por ejemplo, el anti-NigSAb puede ser parcialmente purificado de materiales celulares que son usados en la producción de anti-NigSAb. El término aislado no requiere purificación completa a la homogeneidad; más bien, el componente relevante está purificado comúnmente a una extensión suficiente para ser útil en un análisis relevante. El anti-NigSAb de la invención puede también ser considerado "recombinante" lo que indica que el anti-NigSAb o material de codificación del mismo (por ejemplo, un ácido nucleico recombinante, gen, polinucleótido, etc . ) ha sido producido o alterado mediante intervención humana. En general, el arreglo de partes de una molécula recombinante no es una configuración natural o la secuencia primaria del polinucleótido o polipéptido recombinante ha sido manipulado de alguna manera. La alteración para producir el material recombinante se puede efectuar sobre el material dentro o retirado de su ambiente o estado natural . Por ejemplo, un ácido nucleico que se presenta de manera estable en la naturaleza se convierte en un ácido nucleico recombinante si es alterado o si es transcrito del ADN el cual ha sido alterado, por medio de intervención humana, llevado a cabo dentro de la célula de la cual se origina. Un cuadro de lectura abierta de secuencia de gen es recombinante si aquella secuencia de nucleótidos ha sido retirada de su contexto natural y clonada a cualquier tipo de vector de ácido nucleico artificial . Los protocolos y reactivos para producir moléculas recombinantes, especialmente ácidos nucleicos recombinantes son comunes y de rutina en la técnica. El término "recombinante" también se puede referir a un organismo que alberga material recombinante, por ejemplo una célula, planta o animal que comprende un ácido nucleico recombinante se considera una célula recombinante, planta o animal. En algunas modalidades, un organismo recombinante es un organismo transgénico. El NIgSBR y anti-NIgSAb de la presente invención pueden opcionalmente ser marcados detectablemente para proporcionar un NIgSBR marcado detectablemente o anti-NIgSAb marcado detectablemente. "Marcado detectablemente", "NIgSBR marcado detectablemente" o "anti-NIgSAb marcado detectablemente" significa cualquier sustancia (un anticuerpo o fragmento de anticuerpo o cualquier otro compuesto que retenga especificada de enlace para la inmunoglobulina natural) , que tiene una etiqueta detectable anexada. La etiqueta detectable es normalmente anexada mediante conjugación química, pero en donde la etiqueta es un polipéptido, podría alternativamente ser anexada mediante técnicas de ingeniería genética. Los métodos para producción de proteínas marcadas detectablemente son también conocidas en la técnica. Las etiquetas detectables pueden ser seleccionadas de una variedad de tales etiquetas conocidas en la técnica pero normalmente son radioisótopos, fluoróforos, etiquetas paramagnéticas, enzimas (por ejemplo peroxidasa de rábano) , u otras porciones o compuestos los cuales ya sea emiten una señal detectable (por ejemplo, radioactividad, fluorescencia, color) o emiten una señal detectable después de exposición de la etiqueta a su sustrato. Varios pares de etiquetas/sustrato detectables (por ejemplo peroxidada de rábano) diaminobencidina, avidina/estreptavidina, lucifera-sa/luciferina) , métodos para marcar compuestos tales como anticuerpos y métodos para utilizar anticuerpos marcados son bien conocidos en la técnica (véase por ejemplo, Harlow and Lañe, eds. (Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988)) . El NIgSBR de la presente invención puede ser cualquier tipo de sustancia, en los que se incluyen proteínas, anticuerpos, péptidos, ácidos nucleicos, carbohidratos, polisacáridos y porciones o fragmentos de los mismos o cualquier otra molécula orgánica o inorgánica que se enlaza específicamente a la inmunoglobulina natural. Un anticuerpo de acuerdo con la presente invención incluye cualquier molécula que contiene proteína o péptido que comprende por lo menos una porción de una molécula de inmunoglobulina, tal como, pero no limitada a, por lo menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de una cadena pesada o ligera o una porción de enlace de ligando de la misma, una región variable de cadena pesada o ligera, una región constante de cadena pesada o ligera, una región de estructura o cualquier porción de la misma, que pueda ser incorporada a un anticuerpo de la presente invención. Un anticuerpo de la presente invención puede incluir o ser derivado de cualquier animal en los que se incluyen mamíferos, tales como pero no limitados a, un humano, un ratón, un conejo, una rata, un roedor, una cabra, un primate o cualesquier combinaciones de los mismos y los semejantes.

REACTIVO DE ENLACE O FUERZAS DE ENLACE ANTICUERPO/ANTÍGENO Las fuerzas que mantienen conjuntamente un antígeno y anticuerpo (o cualquier reactivo de enlace) son en esencia no diferentes de las interacciones no específicas que ocurren entre cualesquier dos proteínas no relacionadas, por ejemplo otras macromoléculas tales como albúmina de suero humana y transferina humana. Estas fuerzas intermoleculares son clasificadas comúnmente en cuatro áreas generales que incluyen: (1) electrostáticas; (2) enlaces de hidrógeno; (3) hidrofóbicas; y (4) Van der Waals. Las fuerzas electrostáticas son debidas a la atracción entre grupos iónicos cargados opuestamente cargados opuestamente en dos cadenas laterales de proteína. La fuerza de atracción (F) es inversamente proporcional al cuadrado de la distancia (d) entre las cargas. Las fuerzas de enlace de hidrógeno son provistas mediante la formación de puentes de hidrógeno reversibles entre grupos hidrofílicos tales como -OH, -NH2 y -COOH. Estas fuerzas son extensamente dependientes del posicionamiento estrecho de dos moléculas que portan estos grupos . Las fuerzas hidrofóbicas operan de la misma manera que las gotas de aceite en agua se fusionan para formar una sola gota grande. Así, los grupos hidrofóbicos no polares tales como las cadenas laterales en valina, leucina y fenilalanina tienden a asociarse en un ambiente acuoso . Finalmente, las fuerzas de Van der Waals son fuerzas creadas entre moléculas que dependen de la interacción entre las nubes de electrones externas . Información adicional con respecto a cada uno de los tipos diferentes de fuerzas se pueden obtener de "Essential Immunology" editado por I.M. Roitti (6a edición) Blackwell Scientific Publications, 1988. Con respecto a la presente investigación, NIgSBR o anti-NIgSAb exhiben algunas o todas estas fuerzas . Es al obtener una acumulación de estas fuerzas en cantidades más grandes que se puede obtener un NIgSBR o un anti-NIgSAb que tiene un alto grado de afinidad o fuerza de enlace a la proteína de inmunoglobulina natural . Aquel de habilidad ordinaria en la técnica puede seleccionar una amplia variedad de compuestos o anticuerpos para el enlace específico a inmunoglobulina natural utilizando los métodos en la presente en conjunción con aquel que está en general disponible en la técnica.

Medición de Reactivo de Enlace o Fuerza de Enlace Anticuerpo/Antígeno La afinidad de enlace entre un NIgSBR o un anti-NlgSAb e inmunoglobulina natural puede ser medida y es una acumulación de una medición de todas las fuerzas descritas anteriormente. Los procedimientos estándar para llevar a cabo tales mediciones son bien conocidos para aquellos de habilidad ordinaria en la técnica y pueden ser aplicados directamente para medir la afinidad de cualquier compuesto o anticuerpos de la presente invención para la inmunoglobulina natural . Un método estándar para la medición de la afinidad de enlace de anticuerpo/antígeno es por medio del uso de un tubo de diálisis que es un contenedor que consiste de un material que es permeable al antígeno pero impermeable al anticuerpo. Este método es también útil para otros reactivos de enlace que no son antic erpos, tales como un NIgSBR no anticuerpo de la presente invención. Los antígenos que son enlazados completa o parcial a anticuerpos son colocados dentro del tubo de diálisis en un solvente tal como agua. Luego el tubo es colocado dentro de un contenedor más grande que no contiene anticuerpos o antígeno pero contiene solamente el solvente, por ejemplo agua. Puesto que el antígeno se puede difundir a través de la membrana de diálisis del tubo, la concentración del antígeno dentro del tubo de diálisis y la concentración del antígeno dentro del contenedor externo más grande se comenzarán a equilibrar.

Después de colocar el tubo de diálisis al contenedor más grande y permitir que transcurra un tiempo hacia alcanzar un equilibrio, es posible medir la concentración del antígeno dentro del tubo de diálisis y dentro del contenedor circundante y luego determinar las diferencias en concentración. Esto hace posible calcular la cantidad de antígeno que permanece enlazado al anticuerpo en el tubo de diálisis y la cantidad que se disocia del anticuerpo y se funde al contenedor circundante . Al renovar constantemente el solvente (por ejemplo agua) dentro del contenedor circundante para remover cualquier antígeno que está difundido al mismo es posible disociar totalmente el anticuerpo del antígeno dentro del tubo de diálisis. Si el solvente circundante no es renovado el sistema alcanzará un equilibrio y es posible calcular la constante de equilibrio (K) de la reacción, esto es, la asociación y disasociación entre el anticuerpo y antígeno. La constante de equilibrio (K) es calculada ya que es una cantidad igual a la concentración del anticuerpo enlazado al antígeno dentro del tubo de diálisis dividido por la concentración del anticuerpo libre combinando los tiempos del sitio de la concentración del antígeno libre. La constante de equilibrio o valor de "K" es medida en general en términos de litros/mol. El valor K es una medida de la diferencia en la energía libre entre el antígeno y el anticuerpo en estado libre en comparación con la forma acomplejada del antígeno y anticuerpo.

Reactivo de Enlace o Avidez de Anticuerpo Como se indica anteriormente, el término "afinidad" describe el enlace de un reactivo de enlace tal como un anticuerpo a un solo determinante de antígeno. Sin embargo, frecuentemente es concerniente con la interacción de un anticuerpo con un antígeno multivalente. El término "avidez" es usado para expresar este enlace. Los factores que contribuyen a la avidez son complejos e incluyen la heterogeneidad de los anticuerpos en una prueba policlonal, que son concernientes contra más de un determinante sobre un antígeno y contra la heterogeneidad de los determinantes por sí mismos . La multivalencia de la mayoría de los antígenos conduce a un efecto en el cual el enlace de dos moléculas de antígeno por un anticuerpo es mayor y opcionalmente muchas veces mayor que la suma aritmética de las interacciones de anticuerpo individuales. Así, se puede entender que la avidez medida entre un anti-suero y un antígeno multivalente será un tanto mayor que la afinidad entre un anticuerpo y un solo determinante de antígeno. Como se usa en la presente, el término "epítopo" se refiere a aquella porción de cualquier molécula capaz de ser reconocida por y enlazada a un reactivo de enlace o un anticuerpo en una o más de las regiones de enlace de antígeno. Los epítopos pueden ser cualquier molécula o agrupación de las mismas en las que se incluyen pero no limitadas a aminoácidos y cadenas laterales de azúcares y pueden tener una estructura o conformación tridimensional específica. Un epítopo puede comprender cualquier porción de una molécula de proteína que incluye estructura primaria, secundaria, terciaria o cuaternaria, como aquellos son términos son usados en general en la técnica. Como se usa en la presente, un "anti-NIgSAb" , "porción de anti-NIgSAb" , o "fragmento de anti-NIgSAb" y/o "variante de anti-NIgSAb" y los semejantes incluyen cualquier molécula que contiene proteína o péptido que comprende por lo menos una porción de una molécula de inmunoglobulina, tal como pero no limitadas a, por lo menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de una cadena pesada o ligera o una porción de enlace de ligando de la misma, una región variable de cadena pesada o cadena ligera, una región constante de cadena pesada o cadena ligera, una región de estructura o cualquier porción de la misma. Como ejemplo no limitante, un anti-NIgSAb apropiado, porción o variante especificado de la presente invención puede enlazar por lo menos una molécula de inmunoglobulina natural o porciones especificadas, variantes o dominios de la misma. El término anti-NIgSAb o "anticuerpo" se propone adicionalmente abarcar anticuerpos, fragmentos de digestión de anticuerpo, porciones y variantes de anticuerpo específicos de los mismos, en los que se incluyen miméticos de anticuerpo o porciones de anticuerpos que imitan la estructura y/o función de un anticuerpo o fragmento o porción especificada del mismo, en las que se incluyen anticuerpos de cadena individual y fragmentos de los mismos. Los fragmentos funcionales incluyen fragmentos de enlace de antígeno que se enlazan a una molécula de inmunoglobulina no desnaturalizada. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo capaces de enlace a una molécula de inmunoglobulina natural o porciones de la misma incluyen pero no están limitados a, Fab (por ejemplo, mediante digestión de papaína) , Fab' (por ejemplo mediante digestión de pepsina y reducción parcial), y F(ab')2 (por ejemplo, mediante digestión de pepsina) , facb (por ejemplo, mediante digestión de plasmina) , pFc' (por ejemplo, mediante digestión de pepsina o plasmina) , Fd (por ejemplo, mediante digestión de pepsina, reducción parcial y re-agregación) , Fv ó scFv (por ejemplo, mediante técnicas de biología molecular) fragmentos' son abarcados por la presente invención. Véase también, Paul (ed.) FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY, CUARTA EDICIÓN, Lippincott-Raven, NY, NY (1999) , incorporado en la presente en su totalidad. Tales fragmentos pueden ser producidos mediante escisión enzimática, técnicas sintéticas o recombinantes, como es conocido en la técnica y/o como se describe en la presente. Los anticuerpos pueden también ser producidos en una variedad de formas truncadas utilizando genes de anticuerpos en los cuales uno o más codones de retención han sido introducidos corriente arriba del sitio de retención natural. Por ejemplo, un gen de combinación que codifica una porción de cadena pesada de F(ab')2 puede ser diseñada para incluir secuencias de ADN que codifican el dominio CHX y/o región de articulación de la cadena pesada. Las varias porciones de anticuerpos pueden ser unidas conjuntamente de manera química mediante técnicas convencionales o pueden ser preparadas como una proteína contigua utilizando técnicas de ingeniería genérica. Anticuerpos biespecíficos, heteroespecificos, heteroconjugados o similares pueden también ser usados que son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de enlace para por lo menos dos antígenos diferentes. En el caso presente, una de las especificidades de enlace es por lo menos una molécula de inmunoglobulina natural o porción de la misma, la otra es para cualquier otro antígeno. Métodos para fabricar anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos está basado en la co-expresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, en donde las dos cadenas pesadas tienen especificidades diferentes (Milstein and Cuello, 305 NATURE, 537 (1983)).

Debido a la clasificación aleatoria de las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de diez moléculas de anticuerpo diferentes, de las cuales solamente una tiene la estructura biespecífica correcta. Procedimientos similares son revelados por en WO 93/08829, Patentes estadounidenses 6,210,66 6,193,967 6,132,992; 6,106,833; 6,060,285; 6,037,453 6,010,902 5,989,530; 5,959,084; 5,959,083; 5,932,448 5,833,985 5,821,333; 5,807,706; 5,643,759; 5,601,819, 5,582,996 5,496,549; 4,676,980; WO 91/00360, WO 92/00373, EP 03089, Traunecker et al., 10 EMBO J. , 3655 (1991), Suresh et al., 121 METHODS IN ENZYMOLOGY, 210 (1986), cada uno de los cuales es incorporado en la presente por referencia.

Anticuerpos de la Presente Invención Por lo menos un anti-NIgSAb de la presente invención puede opcionalmente ser producido mediante una línea celular, línea celular mezclada, célula inmortalizada o población clonal de células inmortalizadas, como es bien conocido en la técnica. Véase, por ejemplo, Ausubel et al., (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, Nueva York (1987-2001)); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edición, (Cold Spring Harbor, NY (1989) y Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (3a Edición), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 2000 (colectivamente, "Sambrook"); Harlow and La e, Antibodies, A Laboratory Manual, (John Wiley & Sons, Inc. NY (1994-2001)); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, (John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001)), cada uno incorporado por completo en la presente por referencia. 7Anti-NIgSAb o fragmentos, porciones y variantes de los mismos pueden ser criados contra un antígeno inmunogénico apropiado, tal como proteína de inmunoglobulina aislada o una porción de la misma (en las que se incluyen moléculas sintéticas tales como péptidos sintéticos) y pueden ser anticuerpos policlonales o monoclonales . Otros anticuerpos específicos o mamíferos generales pueden ser criados similarmente. La preparación de antígenos inmunogénicos también como la producción de anticuerpos policlonales y monoclonales se puede llevar a cabo utilizando cualquier técnica apropiada conocida para aquellos de habilidad ordinaria en la técnica. En un procedimiento para preparar anticuerpos monoclonales, un hibridoma es producido al fusionar una línea celular inmortal apropiada (por ejemplo, una línea celular de mieloma) , tal como, pero no limitadas a, Sp2/0, Sp2/0-AG14, P3/NSl/Ag4-l, P3X63Ag8.653 , MCP-11, S-194, o los semejantes o heteromielomas, productos de fusión de los mismos o cualquier célula o célula de fusión derivada de los mismos o cualquier otra línea celular apropiada como es conocido en la técnica. Véase por ejemplo, www.atcc .org, www. lifetech. com o los semejantes, con células que producen anticuerpos, tales como, pero no limitadas a, células de baso aislado o clonado, sangre periférica, linfa, amígdala u otras células inmunes o células que contienen célula B o cualesquier otras células que expresan secuencias de estructura constante o variable de cadena pesada o ligera o secuencias de CDR, ya sea como ácido nucleico endógeno o heterólogo, como ADN genómico recombinante o endógeno, viral, bacteriano, algal, procariótico, anfibio, insecto, de reptiles, de peces, mamífero, roedor, equino, ovino, de cabra, de ovejas, de primates, eucariótico, cADN, rADN, ADN o ARN mitocondrial, ADN de cloroplasto o ARN, hnARN, mARN, tARN, de un solo, doble o triple hebra, hibridados y los semejantes o cualquier combinación de los mismos. Véase, por ejemplo, Ausubel, supra, y Colligan, Immunology, supra, Capítulo 2, incorporado en la presente por completo por referencia. Las células que producen anticuerpos pueden también ser obtenidas de la sangre periférica o preferiblemente, el bazo o nodos linfáticos de cualesquier animales apropiados que han sido inmunizados con el antígeno de interés. Cualquier otra célula huésped apropiada puede también ser usada para expresar ácido nucleico heterólogo o endógeno que codifica un anticuerpo, fragmento, porción o variante especificada del mismo. Las células fusionadas (hibridomas) o células recombinantes pueden ser aisladas utilizando condiciones de cultivo selectivas u otros métodos conocidos apropiados y clonados al limitar la división o clasificación celular u otros métodos conocidos . Las células que producen anticuerpos con la especificidad deseada pueden ser seleccionados mediante un análisis apropiado conocido para aquellos de habilidad ordinaria en la técnica (por ejemplo, ELISA) . Otros métodos apropiados para producir o aislar anticuerpos de la especificidad requerida pueden ser usados en los que se incluyen pero no limitados a, métodos que seleccionan anticuerpo recombinante a partir de un péptido o biblioteca de proteína (por ejemplo, pero no limitados a, un bacteriófago, ribosoma, oligonucleótido, ARN, cADN o los semejantes, biblioteca de exhibición; por ejemplo, tal como esta disponible de Cambridge antibody Technologies, Cambridgeshire, Reino Unido; MorphoSys Martinsreid/Planegg, DE; Biovation, Aberdeen, Escocia, Reino Unido; Biolnvent, Lund, Suecia; Dyax Corp., Enzo, Affymax/Biosite; Xoma, Berkeley, CA; Ixsys, Véase por ejemplo, EP 368,684, PCT/GB91/01134 PCT/GB92/01755; PCT/GB92/002240 ; PCT/GB92/00883 PCT/GB93/00605; US 08/350,260 (5/12/94), PCT/GB94/01422 PCT/GB94/02662, PCT/GB97/01835 ; (CAT/MRC) ; WO 90/14443; WO 90/14424; WO 90/14430; PCT/US94/1234 ; WO 92/18619; WO 96/07754 (Scripps) ; EP 614989 (MorphoSys) ; WO 95/16027 (Biolnvent) ; WO 88/06630; WO 90/3809 (Dyax) ; US 4,704,692 (Enzon) ; PCT/US91/02989 (Affymax) ; WO 89/06283; EP 371998; EP 550400; (Xoma) ; EP 229046; PCT/US91/07149 (Ixsys) ; o péptidos o proteínas generados estocásticamente - US 5,723, 323; 5,763,192; 5,814,476; 5,817,483; 5,824,514; 5,976,862; WO 86/05803; EP 590689 (Ixsys, ahora conocido como Applied Molecular Evolution (AME) , cada uno incorporado por completo en la presente por referencia) o que dependen de la inmunización de animales transgénicos (por ejemplo, ratones SCID, Nguyen, et al., 41 MICROBIOL. IMMUNOL., 901-907 (1997); Sandhu et al., 16 CRIT. REV. BIOTECHNOL., 95-118 (1996); Eren et al., 93 IMMUNOL., 154-161 (1998), cada uno incorporado por completo por referencia tales como patentes y solicitudes relacionadas) que son capaces de producir un repertorio de anticuerpos humanos, como es conocido en la técnica y/o como se describe en la presente. Tales técnicas incluyen pero no están limitadas a exhibición de ribosoma (Hanes et al . , 94 PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, 4937-4942 (Mayo 1997); Hanes et al., 95 PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, 14130-14135 (Noviembre, 1998) ; tecnologías que producen anticuerpo de una sola célula (por ejemplo, métodos de anticuerpo de linfocito seleccionado ("SLAM") (Patente estadounidense No, 5,627,052; Wen et al., 17 J. IMMUNOL., 887-892 (1987); Babcook et al., 93 PROC. NATL. ACAD-. SCI. USA, 7843-7848 (1996); microgota de gel y citometría de flujo (Powell et al., 8 BIOTECHNOL., 333-337 (1990); One Cell Systems, Cambridge, M?; Gray, et al., 182 J.

IMM. METH., 155-163 (1995); Kenny et al., 19 MOLEC. BIOL.

REPORTS, 125-134 (1994); Jonak et al., Progress Biotech, Vol . 5, In Vitro Immunization in Hybridoma Technology, (Borrebaeck (Ed.), Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, Netherlands (1988)). El anti-NIgSAb puede también opcionalmente ser generado mediante inmunización de un animal transgénico (por ejemplo ratón, rata, hámster, primate no humano y los semejantes) capaz de producir un repertorio de anticuerpos humanos, como se describe en la presente y/o como es conocido en la técnica. Las células que producen un anti-NIgSAb humano pueden ser aisladas a partir de tales animales e inmortalizadas utilizando métodos apropiados, tales como los métodos descritos en la presente. Ratones transgénicos que pueden producir un repertorio de anticuerpos humanos que se enlazan a antígenos humanos y otros antígenos extraños pueden ser producidos mediante métodos conocidos (por ejemplo pero no limitado a, Patentes Estadounidenses Nos., 5,770,428; 5,569,825; 5,545,806; 5,625,126; 5,625,825; 5,633,425; 5,661,016 y 5,789,650 expedida a Lonberg et al.; Jakobovits et al., WO 98/50433; Jakobovits et al., WO 98/24893; Lonberg et al., WO 98/24884; Lonberg et al., WO 97/13852; Lonberg et al., WO 94/25585; Kucherlapate et al., WO 96/34096; Kucherlapate et al., EP 0463151 Bl; Kucherlapate et al., EP 0710719 Al; Surani et al., Patente Estadounidense No. 5,545,807; Brugge ann et al., WO 90/04036; Bruggemann et al., EP 0438474 Bl; Lonberg et al., EP 0814259 A2 ; Lonberg et al., GB 2272440 A; Lonberg et al., 3687 NATURE, 856-859 (1994); Taylor et al., 6(4) INT. IMMUNOL. , 579-591 (1994); Green et al., 7 NATURE GENETICS, 13-21 (1994); Méndez et al., 15 NATURE GENETICS, 146-156 (1997); Taylor et al., 20(23) NUCLEIC ACIDS RESEARCH, 6287-6295 (1992); Tuaillon et al., 90(8) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, 3720-3724 (1993); Lonberg et al., 13(1) INT. REV. IMMUNOL., 65-93 (1995) y Fishwald et al., 14(7) NATL BIOTECHNOL, 845-851 (1996) , los cuales son cada uno incorporados completamente por referencia) . En general, estos ratones comprenden por lo menos un transgen que comprende ADN de por lo menos un sitio de inmunoglobulina humano que es funcionalmente reacomodado o que puede sufrir reacomodo funcional . Los sitios de inmunoglobulina endógenos en tales ratones pueden ser rotos o cancelados para eliminar la capacidad del animal para producir anticuerpos codificados por genes endógenos . Los anticuerpos monoespecíficos a inmunoglobulina natural son purificados a partir anti-suero de mamíferos que contiene anticuerpos reactivos contra inmunoglobulina natural o son preparados como anticuerpos monoclonales reactivos con inmunoglobulina no desnaturalizada utilizando la técnica de Kohler y Milstein, 256 NATURE 495-497 (1975) . Anticuerpo monoespecífico como se usa en la presente es definido como una sola especie de anticuerpo o múltiples especies de anticuerpos con características de enlace homogéneas para inmunoglobulina no desnaturalizada y puede ser monoclonal o policlonal . Enlace homogéneo como se usa en la presente se refiere a la capacidad de la especie de anticuerpo a enlazarse a un antígeno o epítopo específico, tales como aquellos asociados con la inmunoglobulina no desnaturalizada, como se describe anteriormente. Anticuerpos inmunoglobulina-específicos naturales son criados al inmunizar animales tales como ratones, ratas, conejillos de indias, conejos, cabras, caballos y/o los semejantes. Los conejos son un animal preferido, con una concentración apropiada de inmunoglobulina natural ya sea con o sin un adyuvante inmune .

Preparación de Anticuerpo Policlonal El suero pre-inmune es recolectado antes de la primera inmunización. Cada animal recibe, por ejemplo, entre aproximadamente 0.1 mg y aproximadamente 1000 mg de inmunoglobulina natural asociada con un adyuvante inmune aceptable . Tales adyuvantes aceptables incluyen pero están limitados a completo de Freund, incompleto de Freund, alum-precipitado, emulsión agua en aceite que contiene Coryneba.c ter ium parvr?i y tARN. La inmunización inicial consiste de inmunoglobulina natural preferiblemente en adyuvante completo de Freund en múltiples sitios ya sea subcutáneamente (SC) , intraperitonealmente (IP) o ambos. Cada animal es sangrado a intervalos regulares, preferiblemente semanalmente para determinar el título de anticuerpo. Los animales pueden recibir o no inyecciones de refuerzo enseguida de la inmunización inicial . Aquellos animales que reciben inyección de refuerzo se les dan en general una cantidad igual del antígeno en adyuvante incompleto de Freund por la misma ruta. Inyecciones de refuerzo son dadas aproximadamente en intervalos de tres semanas hasta que se obtienen títulos máximos. A aproximadamente siete días después de cada inmunización de refuerzo o alrededor de semanalmente después de una sola inmunización, los animales son sangrados, el suero recolectado y las alícuotas son almacenadas a una temperatura de aproximadamente -20°C. Este procedimiento puede ser utilizado para producir anti-NIgSAb policlonal de la presente invención.

Inmunización Sustractiva al Utilizar Tratamiento de Ciclofosfamida La inmunización sustractiva proporciona una alternativa poderosa a la inmunización estándar y permite la producción de anticuerpos verdaderamente únicos . La inmunización sustractiva ha sido amplia y exitosamente implementada para la producción de anticuerpos monoclonales de otra manera no obtenibles mediante inmunización estándar. La inmunización sustractiva utiliza un procedimiento de tolerización inmune distinto que puede mejorar sustancialmente la generación de anticuerpos monoclonales a antígenos deseados. El procedimiento está basado en tolerizar el animal huésped a inmunodominante o de otra manera antígeno (s) indeseable (tolerógeno) que puede estar estructural o funcionalmente relacionado con el antígeno de interés. La tolerización del animal huésped se puede obtener por medio de uno de varios métodos conocidos en el arte: tolerización de Alta Zona, Neonatal o tolerización Inducida por Fármaco. Luego el animal tolerizado es inoculado con el antígeno (inmunógeno) deseado y los anticuerpos generados mediante la respuesta inmune subsecuente son seleccionados en cuanto a la reactividad antigénica deseada. Al exterminar selectivamente las células B que han sido estimuladas para proliferar en respuesta a una molécula antigénica extraña, el fármaco citotóxico ciclofosfamida puede ser usado para manipular la polarización de la respuesta inmune normal . Después del tratamiento de ciclofosfamida la exposición subsecuente a aquellas moléculas no da como resultado ninguna respuesta inmunológica. Como una técnica de inmunización sustractiva, los ratones son expuestos al tolerógeno seguido por inyecciones de ciclofosfamida. Después que se ha permitido que el fármaco se despeje, los ratones son expuestos al inmunógeno. Teóricamente, el sistema inmune debe ser sensible inmunológicamente solo a aquellas moléculas en el inmunógeno que no son encontradas en el tolerógeno . Esta técnica de inmunización sustractiva puede ser usada para producir los anti-NIgSAb de la presente invención. El anti-NIgSAb de la presente invención puede ser identificado convenientemente utilizando técnicas conocidas en el arte, en las que se incluyen pero no limitadas a, bibliotecas de exhibición de péptido. Además, bibliotecas de exhibición de péptido pueden también ser usadas para identificar NIgSBR de la presente invención. Este método involucra la selección de grandes colecciones de péptidos en cuando a miembros individuales que son reconocidos o enlazados por la molécula objetivo, que en la presente invención puede ser inmunoglobulina natural o uno o más epítopos de la misma. La selección de bibliotecas de exhibición de péptido para encontrar reactivos de enlace es bien conocida en la técnica. Las secuencias de péptido aleatorias mostradas pueden ser de 3 a 5000 o más aminoácidos de longitud, frecuentemente de 5 a 100 aminoácidos de largo y frecuentemente de alrededor de 8 a 25 aminoácidos de largo.

Además de los métodos de síntesis química directos para preparar bibliotecas de péptidos, se han descrito varios métodos de ADN recombinantes . Un tipo involucra la exhibición de secuencias de péptido aleatorias sobre la superficie de un bacteriófago o célula. Cada bacteriófago o célula contiene la secuencia de nucleótidos que codifican la secuencia de péptidos mostrada particular. El anticuerpo u otra molécula objetivo es inmovilizado sobre un sustrato e incubado con bacteriófago o células que llevan la biblioteca de péptidos sobre su superficie. Después de varias rondas de selección mediante técnica de toma panorámica como se describe por ejemplo en Lu et al., BIO/TECHNOLOGY, 13:366-372 (1995), que es incorporado por referencia en la presente, colonias de bacteriófagos son secuenciadas para determinar la secuencia de péptidos común reconocida por el anticuerpo. Este método permite la identificación de la secuencia de reconocimiento de antígeno para el anticuerpo u otra molécula objetivo. Tales métodos son descritos en las publicaciones de patente PCT Nos. WO 91/18980, WO 91/19818 y WO 93/08278. Otro método bien conocido en la técnica para identificar reactivos de enlace en los que se incluyen NIgSBR, y anti-NIgSAb de la presente invención, que son específicos para una molécula objetivo particular, tal como inmunoglobulina natural o uno o más epítopos de la misma, es utilizar virus, bacteriófagos o células huésped que expresan el péptido o moléculas de proteína sobre su superficie. En este método, el ADN que codifica la proteína, péptido, anticuerpo, porción de anticuerpo, variante de anticuerpo, fragmento de anticuerpo, combi-cuerpo, proteína de fusión o proteína híbrida está contenido dentro del virus, bacteriófago, célula huésped u otro sistema competente de replicación. Estas moléculas son expresadas sobre la superficie del virus, bacteriófago, ribosoma, célula huésped u otro sistema competente de replicación y son seleccionadas mediante enlace a una o más moléculas objetivo inmovilizadas. Después de varias rondas de selección, el ADN que codifica las moléculas de enlace objetivo es aislado. Véase publicación de patente PCT No. WO 91/17271. Otros sistemas para generar bibliotecas de péptidos aleatorios y específicos tienen aspectos tanto en síntesis vitroquímica y métodos recombinantes. Bibliotecas de exhibición de ribosoma también son conocidas en la técnica y están disponibles comercialmente (Cambridge Antibody Technology, Biolnvent, Affitech, Biosite) . Véase, publicación de patente PCT Nos. WO 92/05258, WO 92/14843 y WO 96/19256. Véanse también Patentes Estadounidenses Nos. 5,658,754 y 5,643,768. Las bibliotecas de exhibición de péptido, bibliotecas de exhibición de fragmento de anticuerpo, bibliotecas de exhibición de proteína híbrida, bibliotecas de exhibición de proteína de fusión, vectores y equipos de selección para llevar a cabo estos métodos son bien conocidas en la técnica y/o están disponibles comercialmente de fuentes tales como Invitrogen (Carlsbad, California) , Cambridge Antibody Technologies (Cambridgeshire, Reino Unido) , Phylos, Inc. (Lexington, M?) , Dyax Corporation (Cambridge, MA) , Morphosys (Martinsried/Munich, Alemania) y Maxygen (Redwood City, CA) . Véanse, por ejemplo, Patentes Estadounidenses Nos. 4,704,692; 4,874,702; 4,939,66; 4,946,778; 5,260,203; 5,455,030; 5,518,889; 5,534,621; 5,656,730; 5,763,733; 5,767,260; 5,856,456 cedidas a Enzon; 5,233,409; 5,403,484; 5,571,698 y 5,837,500 cedidas a Dyax; 5,427,908 y 5,580,717 cedidas a Affymax; 5,885,793 está cedida a Cambridge Antibody Technologies; 5,750,373 cedida a Genentech; 5,618,920, 5,595,898; 5,576,195; 5,698,435; 5,693,493 y 5,698,417 cedidas a Xona; Colligan, supra; Ausubel, supra; o Sambrook, supra, cada una de las patentes y publicaciones de patente anteriores son incorporadas por completo por referencia en la presente . El NIgSBR de la presente invención puede también ser identificado a partir de diversas bibliotecas de compuestos . Tales compuestos pueden ser de una amplia variedad de tipos en los que se incluyen, pero no limitados a, péptidos, proteínas, anticuerpos, ácidos nucleicos, aptámeros de ADN, carbohidratos, polisacáridos, proteínas de fusión, moléculas híbridas tales como híbridos de péptido- ácido nucleico o cualquier otra molécula orgánica o inorgánica o combinación de moléculas. Bibliotecas de estos compuestos son seleccionadas en cuanto a cualesquier elementos que se enlazan a una molécula objetivo. Una amplia variedad de metodologías de selección aplicables son bien conocidas para aquellos de habilidad en la técnica. Moléculas objetivo para identificar NIgSBR de la presente invención de diversas bibliotecas incluyen, pero no están limitadas a, inmunoglobulina natural y cualquier epítopo de la misma. Diversas bibliotecas que son apropiadas para uso en la identificación de NIgSBR de la presente invención incluyen, pero no están limitadas a, bibliotecas a base de andamio de proteína, en donde un péptido que no es de inmunoglobulina es utilizado como estructura o andamio, sobre el cual se construyen segmentos de secuencias de aminoácidos variables que actúan como la región de enlace para una molécula objetivo. Es fácilmente evidente para aquellos de habilidad ordinaria en la técnica, que una amplia variedad de bibliotecas a base de andamio de proteína son apropiadas para uso en los métodos de la presente invención para identificar NIgSBR. Estas diversas bibliotecas también como métodos para seleccionarlas para identificar elementos que se enlazan a la molécula objetivo son bien conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, los andamios de proteína conocidos como "Trinectina" , a base de fibronectinas y la tecnología de exhibición conocida como "Profusión", de Phylos, Inc., Lexington, MA; Afi-cuerpos ++++ a base de S. aureus proteína A de aficuerpos AB; y anticalenos a base de lipocalina de Pieris Proteolab AG) . Moléculas de captura sin proteína tales como aptámeros de ADN que se enlazan a la proteína con alta especificidad y afinidad son también usados en bibliotecas . y arreglos (SomaLogic) . El proceso conocido en la técnica como "SELEX" es una metodología para la identificación de estos aptámeros de ácido nucleico. Estas moléculas son identificadas por aquel de habilidad ordinaria en la técnica utilizando estas técnicas disponibles para aislar NIgSBR de la presente invención. Bibliotecas a base de evolución de proteína dirigida y metodologías de selección pueden también ser usadas para identificar NIgSBR de la presente invención. Estas técnicas involucran en general inducir aleatoriamente mutaciones a nivel genético, seguidas por selección en cuanto a las características deseadas a nivel de proteína. Las bibliotecas a base de evolución de proteína dirigida y métodos para fabricar y seleccionarlas son bien conocidos en la técnica. Arreglos de proteína pueden también ser utilizados para identificar NIgSBR de la presente invención. Los arreglos de proteína son sistemas de análisis de enlace en fase sólida que utilizan proteínas inmovilizadas sobre superficies tales como vidrio, plástico, membranas, o cualquier otra superficie . Estos arreglos son usados para aislar elementos individuales de bibliotecas de exhibición que tienen las características de enlace seleccionadas. Los arreglos de proteínas pueden ser usados en los métodos de la presente invención para seleccionar en cuanto a NIgSBR y anti-NIgSAb de exhibición de fago o bibliotecas de exhibición de ribosoma. Los arreglos de proteínas son bien conocidos para aquellos de habilidad ordinaria en la técnica, también como los métodos para fabricarlas, y utilizarlas. Numerosas Patentes Estadounidenses y Solicitudes de Patente Estadounidenses Publicadas revelan la variedad de bibliotecas y métodos para fabricar y seleccionarlas para encontrar moléculas que se enlazan a un objetivo. Ejemplos de estas bibliotecas y métodos son revelados en las siguientes Patentes Estadounidenses y Solicitudes de Patente Estadounidenses Publicadas y cada una es incorporada por referencia en la presente. Véase por ejemplo, Patentes Estadounidenses Nos. 6,605,449, 6,537,776 y Solicitudes de Patente Estadounidense Nos. de Serie 2002/0146762 y 2002/0142394 cedidas a Diversa Corporation; Patente Estado No. 5,811,238 cedida a Affymax; Patente Estadounidense No. 6,489,103 cedida a Medical Research Council; Solicitud de Patente Estadounidense No. 2003/0186223 cedida a Dyax Corporation; Patentes Estadounidenses Nos. 6,376,190, 6,331,398, 6,114,120, 6,110,900, 5,843,653, 5,707,796, 6,159,690, 5,696,249, 5,670,637, 5,475,096, 5,270,163, Solicitudes de Patente Estadounidenses Nos. de Serie 2003/0157487, 2003/0044818 y 2002/0102599 cedidas a SELEX Techniques; Patentes Estadounidenses Nos. 6,613,514, 6,602,986, 6,586,182, 6,579,678, 6,576,467, 6,573,098, 6,518,065, 6,506,603, 6,506,602, 6,455,253, 6,444,468, 6,436,675, 6,420,175, 6,413,774, 6,395,547, 6,372,497, 6,355,484, 6,344,356, 6,335,160, 5,323,030, 6,319,713, 6,303,344, 6,278,861, 6,297,053, 6,291,242, 6,277,638, 6,180,406, 6,165,793, 6,117,679, Solicitudes de Patente Estadounidenses Nos. 2003/0186356 y 2003/0077613 cedidas a Maxygen; Patentes Estadounidenses Nos. 6,602,685, 6,537,749, 6,436,665, 6,429,300, 6,416,950, 6,312,927 y Solicitud de Patente Estado No. de Serie 2002/018267 cedida a Phylos; Patente Estadounidense No. 6,579,676, 5,411,861 y 5,955,264 cedidas a the General Hospital Corporation; Solicitudes de Patente Estadounidenses No. de Serie 2002/0051998 y 2001/0051855 cedidas a California Institute of Technology; Solicitud de Patente Estadounidense No. de Serie 2002/0164635 cedida a Rensselaer Polytechnic Institute. Solicitudes de Patente Estadounidenses Nos. de Serie 2003/0162218, 2003/0152943, 2003/0148353, 2003/0134351, 2003/0113738, 2003/0077613, 2002/0102734, 2002/0045175, 2003/0180718 y 2003/0167128. Cada una de estas patentes y solicitudes son incorporadas por referencia en la presente . El anti-NIgSAb de la presente invención puede también ser preparado utilizando por lo menos un ácido nucleico que codifica anti-NIgSAb para proporcionar animales o mamíferos transgénicos, tales como cabras, vacas, caballos, ovejas y los semejantes, que producen tales anticuerpos en su leche. Tales animales pueden ser provistos utilizando métodos conocidos. Véase, por ejemplo, pero no limitado a, Patentes Estadounidenses Nos. 5,827,690, 58,49,992, 4,873,316, 5,849,992, 5,994,161, 5,565,362, 5,304,489, y los semejantes, cada una de las cuales es incorporada por referencia en la presente por completo. El anti-NIgSAb de la presente invención puede adicionalmente ser preparado utilizando por lo menos un ácido nucleico que codifica anti-NIgSAb para proporcionar plantas transgénicas y células de planta cultivadas (por ejemplo, pero no limitados a, tabaco, patata y maíz) que producen tales anticuerpos, porciones especificadas o variantes en las partes de plantas o en células cultivadas de las mismas . Como ejemplo no limitante, las hojas de tabaco transgénicas que expresan proteínas recombinantes han sido usadas exitosamente para proporcionar grandes de proteínas recombinantes, por ejemplo utilizando un promotor inducible. Véase, por ejemplo Cramer et al., 240 CURR. TOP. MICROBIOL. IMMUNOL., 95-118 (1999) y referencias citadas en el mismo. También, se ha usado maíz transgénico para expresar proteínas mamíferas a niveles de producción comercialmente, con actividades biológicas equivalentes a aquellas producidas en otros sistemas recombinantes o purificadas a partir de fuentes naturales. Véase, por ejemplo Hood et al., 464 ADV. EXP. MED. BIOL., 127-147 (1999) y referencias citadas en el mismo. Anticuerpos han también sido producidos en grandes cantidades a partir de semillas de plantas transgénicas en las que se incluyen fragmentos de anticuerpos, tales como anticuerpos de una sola cadena (scFv) , en los que se incluyen semillas de tabaco y tubérculos de patata. Véase, por ejemplo Conrad et al., 38 PLANT MOL. Biol., 101-109 (1998) y referencias citadas en el mismo. Así, los anticuerpos de la presente invención pueden también ser producidos utilizando plantas transgénicas, de acuerdo con métodos conocidos. Véase también, por ejemplo Fischer et al., 30 BIOTECHNOL. APPL. BIOCHEM., 99-180 (Oct., 1999); Ma et al., 13 TRENDS BIOTECHNOL., 522-527 (1995); Ma et al., 109 PLANT PHYSIOL., 314-346 (1995); Whitelam et al., 22 BIOCHEM. SOC. TRANS., 940-944 (1994); Payne et al., PLANT CELL AND TISSUE CULTURE IN LIQUID SYSTEMS John Wiley & Sons, Inc. Nueva York, NYLON (1992) ; Gamborg y Phillips (eds) PLANT CELL, TISSUE AND ORGAN CULTURE; FUNDAMENTAL METHODS Springer Lab Manual, Springer- Verlag (Berlín Heidelberg Nueva York) (1995) ,- PLANT MOLECULAR BIOLOGY Croy (ed.) BIOS Scientific Publishers, Inc. (1993); Clark, Ed. PLANT MOLECULAR BIOLOGY; A Laboratory Manual Springer-Verlag, Berlín (1997) y referencias citadas en los mismos. Cada una de las referencias anteriores es incorporada en la presente por referencia por completo. Los anticuerpos de la invención pueden enlazar proteínas de inmunoglobulina natural con un amplio intervalo de afinidades (KD) • En una modalidad preferida, por lo menos un anti-NIgSAb de la presente invención puede opcionalmente enlazar proteína de inmunoglobulina natural con por lo menos una afinidad suficientemente alta para uso en bandas de proteínas . La afinidad o avidez de un anticuerpo por un antígeno puede ser determinada experimentalmente utilizando cualquier método apropiado. (Véase, por ejemplo, Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions" , In Fundamental Immunology, Cuarta Edición (W.E. Paul (ED.), Lippincott- Raven: Nueva York, Nueva York, 1999) ; Janis Kuby, Immunology, (W.H. Freeman and Company. Nueva York, Nueva York, 1992); y métodos descritos en los mismos) . La afinidad medida de una interacción anticuerpo-antígeno particular puede variar si es medida bajo diferentes condiciones (por ejemplo, concentración de sal, pH) . Así, las mediciones de afinidad y otros parámetros de antígeno-enlace (por ejemplo, KD, Ka, K¿) se efectúan preferiblemente con soluciones estándar de anticuerpo y antígeno y una solución reguladora del pH estándar, tales como las soluciones reguladoras del pH descritas en la presente.

Moléculas de Ácido Nucleico Utilizando la información provista en la misma, una molécula de ácido nucleico de la presente invención que codifica por lo menos un anti-NIgSAb puede ser obtenida utilizando métodos descritos en la presente o como se conocen en la técnica. Con el fin de obtener moléculas de ácido nucleico que codifican el anti-NIgSAb de la presente invención, la secuencia de aminoácidos del anticuerpo puede ser necesaria. Para efectuar esto, la proteína de anticuerpo puede ser purificada y la secuencia de aminoácidos parcial determinada mediante secuenciadores automáticos . No es necesario determinar toda la secuencia de aminoácidos, sino la secuencia lineal de dos regiones de 6 a 8 aminoácidos de la proteína es determinada para la producción de cebadores para la amplificación de PCR de un fragmento de ADN de anti-NIgSAb parcial . Una vez que se han identificado secuencias de aminoácidos apropiadas, las secuencias de ADN capaces de codificarlas son sintetizadas. Debido a que el código genético es degenerado, más de un codón puede ser utilizado para codificar un aminoácido particular y por consiguiente, la secuencia de aminoácidos puede ser codificada mediante cualquiera de un conjunto de oligonucleótidos de ADN degenerados. Solamente un miembro del conjunto será idéntico a una secuencia de anti-NIgSAb dada pero múltiples miembros son comúnmente capaces de hibridar a un ácido nucleico que codifica anti-NIgSAb aún si los oligonucleótidos de ácido nucleico de sonda tiene desajustes debido a la degeneración del código genético. Los oligonucleótidos de ADN degenerados desadaptados pueden comúnmente todavía hibridar suficientemente al ácido nucleico que codifica anti-NIgSAb para permitir la identificación y aislamiento del ácido nucleico que codifica el anticuerpo. El ADN aislado mediante estos métodos puede ser usado para seleccionar bibliotecas de ADN a partir de una variedad de tipos de células, de fuentes de invertebrados y vertebrados y para aislar genes homólogos. Los formatos de hibridación, en los que se incluyen pero no limitados a, fase en solución, fase sólida, fase mezclada o análisis de hibridación in situ son útiles para la detección de clones de interés . Una guía extensa a la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijseen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes Elsevier, Nueva York, también como en Sambrook, Berger y Ausubel (en la presente) . Estrategias de marcación o etiquetado para marcar o etiquetar ácidos nucleicos y estrategias de detección correspondientes se pueden encontrar, por ejemplo, en Haugland (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals Sixth Edition por Molecular Probes, Inc. (Eugene OR) ; o Haugland (2001) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals Eigth Edition por Molecular Probes, Inc. (Eugene OR) (Disponible en CD ROM) . Moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden estar en forma de ARN, tales como mARN, hnARN, tARN o cualquier otra forma o en forma de ADN, en los que se incluyen pero no limitados a, cADN y ADN genómico, por ejemplo obtenido mediante clonación o producido sintéticamente o cualesquier combinaciones de los mismos. El ADN puede ser doble hebra o una sola hebra o cualquier combinación de las mismas. Cualquier porción de por lo menos una hebra del ADN o ARN puede ser la hebra de codificación, también conocida como la hebra de sentido o puede ser la hebra sin codificación, también denominada como la hebra anti-sentido. Moléculas de ácido nucleico aisladas de la presente invención pueden incluir moléculas de ácido nucleico que comprenden un cuadro de lectura abierta (ORF) , opcionalmente con uno o más intrones, por ejemplo pero no limitado a, por lo menos una porción especificada de por lo menos un CDR, tal como CDR1, CDR2 y/o CDR3 de por lo menos una cadena pesada o una cadena ligera; moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia de codificación para un anti-NIgSAb o región variable y moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleótidos sustancialmente diferente de aquellas descritas anteriormente pero que, debido a la degeneración del código genético, todavía codifican por lo menos un anti-NIgSAb como se describe en la presente y/o como es conocido en la técnica. Por supuesto, el código genético es bien conocido en la técnica. Así, es rutina para aquel de habilidad ordinaria en la técnica generar tales variantes de ácido nucleico degenerados que codifican para anti-NIgSAb específicos de la presente invención. Véase, por ejemplo, Ausubel et al., supra, y tales variantes de ácido nucleico son incluidas en la presente invención. Como se indica en la presente, moléculas de ácido nucleico de la presente invención que comprenden un ácido nucleico que codifica un anti-NIgSAb pueden incluir, pero no están limitadas a, aquellas que codifican la secuencia de aminoácidos de un fragmento de anticuerpo, porción o variante por sí mismo; la secuencia de codificación para todo el anticuerpo o una porción del mismo; la secuencia de codificación para un anticuerpo, fragmento, porción o variante, también como secuencias adicionales, tales como la secuencia de codificación de por lo menos un líder de señal o péptido de fusión, con o sin la secuencias de codificación adicionales mencionadas anteriormente, tales como por lo menos un intrón, junto con secuencias de no codificación en las que se incluyen pero no limitadas a secuencias sin codificación 5' y 3', tales como las secuencias transcritas, no traducidas que juegan un papel en la transcripción, procesamiento de mARN en las que se incluyen división y señales de poliadenilación (por ejemplo - enlace de ribosoma y estabilidad de mARN) ; una secuencia de codificación adicional que codifica para aminoácidos adicionales, tales como aquellos que proporcionan funcionalidades adicionales. Así, la secuencia que codifica un anticuerpo puede ser fusionada a una secuencia marcadora, tal como una secuencia que codifica un péptido que facilita la purificación del anticuerpo fusionado que comprende un fragmento de anticuerpo, porción o variante.

Construcción de Ácidos Nucleicos Los ácidos nucleicos aislados de la presente invención pueden ser elaborados utilizando (a) métodos recombinantes, (b) técnicas sintéticas, (®) técnicas de purificación o combinaciones de las mismas como es bien conocido en la técnica. Los ácidos nucleicos pueden comprender convenientemente secuencias además de una secuencia de polinucleótidos de anti-NIgSAb de la presente invención. Por ejemplo, un sitio de multi-clonación que comprende uno o más sitios de restricción de endonucleasa puede ser insertado al ácido nucleico para ayudar en el aislamiento del polinucleótido. También, secuencias traducibles pueden ser insertada para ayudar en el aislamiento del polinucleótido traducido de la presente invención. Por ejemplo, una secuencia de marcador de hexa-histidina proporciona un medio conveniente para purificar las proteínas de la presente invención. El ácido nucleico de la presente invención-excluyendo la secuencia de codificación- es opcionalmente un vector, adaptador o enlazador para clonación y/o expresión de un polinucleótido de la presente invención. Secuencias adicionales pueden ser agregadas a tales secuencias de clonación, y/o expresión para optimizar su función en la clonación y/o expresión, para ayudar en el aislamiento del polinucleótido o mejorar la introducción del polinucleótido a una célula. El uso de vectores de clonación, vectores de expresión, adaptadores y enlazadores es bien conocido en la técnica. (Véase por ejemplo, Ausubel, supra,- o Sambrook, supra) Métodos recombinantes para Construir Ácidos Nucleicos Las composiciones de ácido nucleico aisladas de esta invención, tales como ARN, cADN, ADN genómico o cualquier combinación de los mismos, pueden ser obtenidas a partir de fuentes biológicas utilizando cualquier número de metodologías de clonación conocidas para aquellos de habilidad en la técnica. En algunas modalidades, sondas de oligonucleótidos que hibridan selectivamente, bajo condiciones severas a los polinucleótidos de la presente invención son usados para identificar la secuencia deseada en un cADN o biblioteca de ADN genómico. El aislamiento de ARN y construcción de cADN y bibliotecas genómicas es bien conocido para aquellos de habilidad ordinaria en la técnica. (Véase, por ejemplo, Ausubel, supra, o Sambrook, supra) .

Métodos Sintéticos para Construir Ácidos Nucleicos Los ácidos nucleicos aislados de la presente invención pueden también ser preparados mediante síntesis química directa mediante métodos conocidos (véase, por ejemplo Ausubel, supra) . La síntesis química produce en general un oligonucleótido de una sola hebra, el cual puede ser convertido en ADN de doble hebra mediante hibridación con una secuencia complementaria o mediante polimerización con una polimerasa de ADN utilizando la única hebra como plantilla. Aquel de habilidad en la técnica reconocerá que en tanto que la síntesis química de ADN es comúnmente más efectiva para secuencias de aproximadamente 100 o menos bases, secuencias más largas pueden ser obtenidas simplemente mediante la ligación de secuencias más cortas, vía métodos químicos o métodos mediados por ligación.

Cassettes de Expresión Reco binantes La presente invención proporciona además cassettes de expresión recombinantes que comprenden un ácido nucleico de la presente invención. Una secuencia de ácido nucleico de la presente invención, por ejemplo un cADN o una secuencia genómica que codifica un anticuerpo de la presente invención puede ser usado para construir un cassette de expresión recombinante que puede ser introducido a por lo menos una célula huésped deseada. Un cassette de expresión recombinante comprenderá comúnmente un polinucleótido de la presente invención enlazado operativamente a secuencias regulatorias de iniciación transcripcional que dirigirán la transcripción del polinucleótido en la célula huésped propuesta. Se pueden usar tanto promotores heterólogos como no heterólogos (esto es, endógenos) para dirigir la expresión de los ácidos nucleicos de la presente invención. En algunas modalidades, los ácidos nucleicos que sirven como promotor, mejorador u otros elementos pueden ser introducidos en la posición apropiada (corriente arriba, corriente abajo o en intrón) de una forma no heteróloga de un polinucleótido de la presente invención para regular ascendente o descendentemente la expresión de un polinucleótido de la presente invención. Por ejemplo, promotores endógenos pueden ser alterados in vivo o in vitro mediante mutación, cancelación y/o sustitución.

Vectores y Células Huésped La presente invención también es concerniente con vectores que incluyen moléculas de ácido nucleico aisladas de la presente invención, células huésped que son diseñadas genéticamente con los vectores recombinantes y la producción de por lo menos un anti-NIgSAb mediante técnicas recombinantes, como es bien conocido en la técnica. Véase por ejemplo, Sambrook et al., supra; Ausubel et al., supra, cada uno de los cuales incorporado por completo por referencia en la presente. Los polinucleótidos pueden opcionalmente ser unidos a un vector que contiene un marcador seleccionable para propagación en un huésped. En general, un vector de plásmido es introducido en un precipitado, tal como un precipitado de fosfato de calcio o en un complejo con un lípido cargado. Si el vector es un virus, puede ser empacado in vitro utilizando una línea celular de empaque apropiada y luego transducido a células huésped. El inserto de ADN debe ser enlazado operativamente a un promotor apropiado. Los constructos de expresión contendrán adicionalmente sitios para el inicio de la transcripción terminación y en la región transcrita, un sitio de enlace de ribosoma para translación. La porción de codificación de los transcriptos maduros expresada por los constructos incluirá preferiblemente una traducción que inicia al comienzo y un codón de terminación (por ej emplo UAA, UGA ó UAG) colocado apropiadamente en el extremo del mARN a ser traducido, con UAA y UAG preferidos para la expresión de células mamíferas o células eucariónticas . Los vectores de expresión incluirán de preferencia pero opcionalmente por lo menos un marcador seleccionable. Tales marcadores incluyen, pero no están limitados a, metotrexato (MTX) , dihidrofolato reductasa (DHFR, Patentes Estadounidenses Nos. 4,399,216; 4,634,665; 4,656,134; 4,956,288; 5,149,636 y 5,179,017; ampicilina, neomicina (G418) , ácido micofenólico o glutamina sintetasa (GS, Patentes Estadounidenses Nos. 5,122,464; 5,770,359 y 5,827,739) resistencia para el cultivo celular eucariótico y genes de resistencia a tetraciclina o ampicilina para cultivo en E. coli y otras bacterias o procarióticos (las patentes anteriores son incorporadas en la presente por referencia) . Medios y condiciones de cultivo asociados para las células huésped descritas anteriormente son conocidos en la técnica. Los vectores apropiados serán fácilmente evidentes para el técnico experimentado. La introducción de un constructo de vector a una célula huésped puede ser efectuada mediante transfección por fosfato de calcio, transfección moderada por DEAE, transfección catiónica moderada por lípido, electroporación, transducción, infección u otros métodos conocidos. Tales métodos son descritos en la técnica, tales como Sambrook, supra, Capítulos 1-4 y 16-18; Ausubel, supra, Capítulos 1, 9, 13, 15, 16. Por lo menos un anticuerpo de la presente invención puede ser expresado en forma modificada, tal como una proteína de fusión y puede incluir no solamente señales de secreción sino también regiones funcionales heterólogas adicionales. Por ejemplo, una región de aminoácidos adicionales, particularmente aminoácidos cargados, puede ser agregada al término N de un anticuerpo para mejorar la estabilidad y persistente en la célula huésped durante la purificación o durante la manipulación y almacenamiento subsecuentes. También, porciones de péptido pueden ser agregadas a un anticuerpo de la presente invención para facilitar la purificación. Tales regiones pueden ser separadas antes de la preparación final de un anticuerpo o por lo menos un fragmento del mismo. Tales métodos son descritos en muchos manuales de laboratorio estándar tales como Sambrook, supra, Capítulos 17.29-17.42 y 18.1-18.74; Ausubel, supra, Capítulos 16, 17 y 18. Aquellos de habilidad ordinaria en la técnica están conscientes de los numerosos sistemas de expresión disponibles para la expresión de un ácido nucleico que codifica una proteína de la presente invención.

Alternativamente, los ácidos nucleicos de la presente invención pueden ser expresados en una célula huésped al encender la expresión (mediante manipulación) en una célula huésped que contiene ADN endógeno que codifica un anticuerpo de la presente invención. Tales métodos son bien conocidos en la técnica, por ejemplo como se describe en las Patentes Estadounidenses Nos. 5,580,734; 5,641,670; 5,733,746 y 5,733,761, incorporados por completo en la presente por referencia. Ilustrativos de cultivos celulares útiles para la producción de los anticuerpos, por s especificadas o variantes de los mismos, son células de mamíferos. Los sistemas de células de mamífero frecuentemente estarán en forma de monocapas de células aunque también se pueden usar suspensiones o bioreactores de células mamíferas. Un número de líneas de célula huésped apropiada capaces de expresar proteínas glicosiladas intactas han sido desarrolladas en la técnica e incluyen las líneas celulares COS-1 (por ejemplo, ATCC CRL 1650), COS-7 (por ejemplo, ATCC CRL-1651) , HEK293, BHK21 (por ejemplo, ATCC CRL-10) , CHO (por ejemplo, ATCC CRL 1610) y BSC-1 (por ejemplo, ATCC CRL-26) , células Cos-7, células CHO, células hep G2 , células P3X63Ag8.653 , SP2/0-Agl4, células HeLa y los semejantes, que están disponibles fácilmente de, por ejemplo, American Type Culture Collection, Manassas, Va (www. atcc . org) . En una modalidad, las células huésped incluyen células de origen linfoide tales como células de mieloma y linfoma. Los vectores de expresión para estas células pueden incluir una o más de las siguientes secuencias de control de expresión, tales como, pero no limitadas a, un origen de replicación, un promotor (por ejemplo promotores de SV40 posteriores o prematuros, el promotor CMV (Puentes Estadounidenses Nos. 5,168,062 y 5,385,839), un promotor HSV tk, un promotor pgk (fosfoglicerato quinasa) , un promotor EF-1 alfa (Patente Estadounidense No. 5,266,491), por lo menos un promotor de inmunoglobulina humana; un mejorador y/o sitios de información de procesamiento, tales sitios de enlace de ribosoma, sitios de empalme de ARN, sitios de poliadenilación (por ejemplo un sitio de adición poli A T Ag SV40 grande) y secuencias de terminador transcripcionales. Véase, por ejemplo Ausubel et al., supra; Sambrook et al., supra. Otras células útiles para la producción de ácidos nucleicos o proteínas de la presente invención son conocidos y/o disponibles, por ejemplo de la American Type Culture Collection Catálogo de Líneas Celulares e Hibridomas (ww . atcc . org) u otras fuentes conocidas o comerciales . Cuando se usan células huésped eucariónticas, las secuencias de terminador de poliadenilación o transcripción son incorporadas comúnmente al vector. Un ejemplo de una secuencia de terminador es la secuencia de poliadenilación del gen de hormona de crecimiento bovino. También se pueden incluir secuencias para el empalme exacto del transcripto. Un ejemplo de una secuencia de empalme es el intrón VP1 de SV40 (Sprague et al., 45 J. VIROL., 773-781 (1983)). Adicionalmente, secuencias de gen para controlar la replicación en la célula huésped pueden ser incorporadas al vector como es conocido en la técnica.

Purificación de un Anticuerpo Un anti-NIgSAb puede ser recuperado y purificado de suero o cultivo celulares de hibridoma o recombinantes mediante métodos bien conocidos en los que se incluyen pero no limitados a, purificación de proteína A o purificación de proteína G, precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción con ácido, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxilapatita y cromatografía de lectina. También se puede emplear cromatografía líquida de alto desempeño ("HPLC") para la purificación. Véase, por ejemplo, Colligan, Current Protocols in Immunology, o Current Protocols in Protein Science, (John Wiley & Sons, Nueva York, Nueva York, 1997-2001), por ejemplo Capítulos 1, 4, 6, 8, 9, 10, cada uno de los cuales incorporado en la presente por referencia. Además de muchas de las otras referencias indicadas en la presente, una variedad de métodos de purificación y pliegue y re-pliegue de proteína asociados son bien conocidos en la técnica y pueden ser aplicados a anticuerpos u otras purificaciones de molécula de NIgSBR en los que se incluyen, por ejemplo, aquellos resumidos en R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, Nueva York (1982) ; Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182; Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. N. Y. (1990) ; Sandana Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc. (1997); Bollag et al., Protein Methods, 2a Edición Wiley-Liss, NYLON (1996) ; Walker The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ (1996) ,- Harris y Angal Protein Purification Applications : A Practical Approach IRL Press en Oxford, Oxford, Inglaterra (1990) ; Scopes Protein Purification Principies and Practice 3a Edición Springer Verlag, NY (1993) ; Janson y Ryden Protein Purification: Principies, High Resolution Methods and Applications, Segunda Edición Wiley-VCH, NY (1998) ; y Walker Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ (1998); y las referencias citadas en los mismos. El NIgSBR y anti-NIgSAb de la presente invención pueden incluir cualquiera de : productos purificados naturalmente, productos de procedimientos sintéticos químicos y productos producidos mediante técnicas recombinantes a partir de un huésped procarióntico o eucarióntico, en los que se incluyen, por ejemplo, bacterias, hongos, levaduras, plantas, insectos, células no mamíferas y mamíferas. Dependiendo del huésped empleado en un procedimiento de producción recombinante, el anticuerpo de la presente invención puede ser glicosilado o puede ser no glicosilado, glicosilado es preferido en ciertas modalidades. Tales métodos son descritos en muchos manuales de laboratorio estándar, tales como Sambrook, supra, Secciones 17.37-17.42; Ausubel, supra, Capítulos 10, 12, 13, 16, 18 y 20, Colligan, Protein Science, supra, Capítulos 12-14, todos incorporados por completo en la presente por referencia. El anti-NIgSAb policlonal de la presente invención puede ser tratado para separar cualesquier anticuerpos que se enlazan a inmunoglobulina desnaturalizada. Este tratamiento se puede efectuar al poner en contacto el anti-NIgSAb policlonal con inmunoglobulina desnaturalizada y luego separa los anticuerpos que están enlazados a la inmunoglobulina desnaturalizada. Esta remoción se puede obtener utilizando inmunoglobulina desnaturalizada que está anexada a un sustrato insoluble, por ejemplo. Cualquiera de los anticuerpos que se enlacen a la inmunoglobulina desnaturalizada anexada al sustrato puede ser separado del suministro de anticuerpos restantes al recolectar los anticuerpos sin enlazar o al sustrato insoluble con la inmunoglobulina desnaturalizada anexada junto con los anticuerpos enlazados a la inmunoglobulina desnaturalizada.

Es fácilmente evidente para aquellos de habilidad ordinaria en la técnica que el sustrato insoluble puede ser una perla, placa, cavidad, tubo, hoja o cualquiera de una amplia variedad de formas, tamaños o materiales.

Preparación de NIgSBR Cualquier NIgSBR que no es un anticuerpo puede ser identificado, aislado y caracterizado en general como se describe en la presente . Es fácilmente evidente para aquellos de habilidad ordinaria en la técnica que cualquier NIgSBR no anticuerpo particular será en general propenso a métodos y procedimientos estándar conocidos en la técnica como apropiados o adecuados para la clase particular de compuesto o molécula de NIgSBR. Aquel de habilidad ordinaria en la técnica apreciará fácilmente y será apto de seleccionar los métodos apropiados o adecuados para aislar, purificar, formular, manipular, etc., el NIgSBR de interés sin experimentación indebida. Como se indica para proteína o NIgSBR relacionado, la siguientes referencias proporcionan detalles considerables en cuanto a tales procedimientos: Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982) ; Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. N.Y. (1990); Sandana Biosperation of Proteins, Academic Press, Inc. (1997); Bollag et al., Protein Methods, 2a Edición Willey-Liss, NY (1996); Walker The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ (1996) ; Harris y Angal Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press en Oxford, Oxford, Inglaterra (1990) ; Scopes Protein Purification: Principies and Practice 3a Edición Wiley-VCH, NY (1998) ; y Walker Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ (1998) . Para manipulaciones de ácido nucleico, Sambrook y Ausubel proporcionan procedimientos detallados para aislar, purificar, formular y manipular ácidos nucleicos (también como proteínas y ciertas moléculas pequeñas) . Para técnicas de síntesis orgánicas y métodos para aislar, purificar, formular y manipular moléculas resultantes, véase por ejemplo, Organic Chemistry por Fessendon y Fassendon, (1982, Segunda Edición, Willard Grant Press, Boston Mass.); Advanced Organic Chemistry por March (Tercera Edición, 1985, Wiley and Sons, New York) ; y Advanced Organic Chemistry por Carey y Sundberg (Tercera Edición, Partes A y B, 1990, Plenu Press, Nueva York) . Detalles adicionales con respecto al aislamiento, purificación, formulación y manipulación de muchos compuestos se encuentra en el catálogo de Sigma 2004 (EUA) o el catálogo de Aldrich 2004 (Milwaukee, Wl, EUA) .

MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO La presente invención también proporciona anti-NlgSAb, marcados detectablemente como es describe en la presente, para uso en métodos de investigación, terapéuticos o de diagnóstico. El anti-NIgSAb de la presente invención es útil para una amplia variedad de procedimientos tales como pruebas inmunológicas que detectan o cuantifican otros antígenos o anticuerpos en una muestra o sobre un sustrato. Una prueba inmunológica para detectar anticuerpos comprende comúnmente incubar una muestra en presencia de un anti-NIgSAb marcado detectablemente de la presente invención y detectar el anticuerpo marcado que está enlazado en una muestra. Varios procedimientos de análisis clínicos son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describe en Immunoassays for the 80' s, (Eds. A. Voller et al., University Park, 1981) y en Paul (ed.) FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY, CUARTA EDICIÓN, Lippincott-Raven, NY, NY (1999). Así, un anti-NIgSAb, un NIgSBR o cualquier otra molécula de anticuerpo usada en el análisis, puede ser agregada a nitrocelulosa u otro soporte sólido que es capaz de inmovilizar células, contenidos celulares o proteínas. Luego el soporte puede ser lavado con soluciones reguladoras del pH apropiadas y otros reactivos deseados, seguido por tratamiento con anti-NIgSAb marcado detectablemente o NIgSBR marcado detectablemente . Luego el soporte de fase sólida puede ser lavado con la solución reguladora del pH una segunda vez para separar el anti-NIgSAb marcado detectablemente sin enlazar o NIgSBR marcado detectablemente sin enlazar. La cantidad de etiqueta enlazada sobre soporte sólido puede luego ser detectada o cuantificada mediante etapas de método conocidas . "Soporte de fase sólida" o "portador" incluye cualquier soporte capaz de enlazar péptido, proteína, antígeno o anticuerpo . Soportes o portadores bien conocidos incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextran, nylón, amilasas, celulosas naturales o modificadas, nitrocelulosa, poliacrilamidas, agarosas y magnetita. La naturaleza del portador puede ser ya sea soluble a alguna extensión o insoluble para los propósitos de la presente invención. El material de soporte puede tener virtualmente cualquier configuración estructural posible en tanto que la molécula acoplada sea capaz de enlazarse al antígeno o anticuerpo. Así, la configuración de soporte puede ser esférica, como en una perla o cilindrica, como en la superficie interna de un tubo de ensayo o la superficie externa de una varilla. Alternativamente, la superficie puede ser plana tal como una hoja, una caja de cultivo, banda de prueba, etc. Los soportes preferidos incluyen perlas de poliestireno y cavidades de una placa. Es fácilmente evidente para aquellos experimentados en la técnica que hay muchos otros portadores apropiados para el enlace de anticuerpo, péptido o antígeno o puede indagar los mismos mediante experimentación sistemática. Etapas de método bien conocidas pueden determinar la actividad de enlace de un lote dado de anti-NIgS7Ab o NIgSBR. Aquellos experimentados en la técnica pueden determinar condiciones de análisis operativas y óptimas mediante experimentación sistemática utilizando métodos bien conocidos además de aquellos revelados en la presente. La marcación detectable de un anti-NIgSAb o NIgSBR se puede efectuar al enlazar a una enzima para uso en una prueba inmunológica de enzima (EIA) , o prueba inmunoabsorbente enlazada a enzima (ELISA) . La enzima enlazada reacciona con el sustrato expuesto para generar una porción química que puede ser detectada por ejemplo mediante medios espectrofotométricos, fluorométricos o visuales. Las enzimas que pueden ser usadas para marcar detectablemente el anti-NIgSAb de la presente invención incluyen pero no están limitadas a malato deshidrogenasa, nucleasa estafilococal, delta-5-esteroide isomerasa, levadura alcohol deshidrogenasa, alfa-glicerofosfato deshidrogenasa, triosa fosfato isomerasa, peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, asparaginasa, glucosa oxidasa, beta-galactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, glucoaminasa y acetilcolinesterasa . Al marcar radioactivamente en anti-NIgSAb o NIgSBR es posible detectar inmunoglobulina no desnaturalizada por medio del uso de un radioinmunoanálisis (RÍA) (véase, por ejemplo, Work, et al., Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, North Holland Publishing Company, N.Y. (1978) . El isótopo radioactivo puede ser detectado mediante medios tales como el uso de un contador gamma o contador de centelleo o mediante autoradiografía. Los isótopos que son particularmente útiles para el propósito de la presente invención son: 3H, 125I, 131I, 35S, 14C, y 12L. También es posible marcar el anti-NIgSAb o NIgSBR con un compuesto fluorescente. Cuando el agente marcado fluorescente es expuesto a la luz de la longitud de onda apropiada, su presencia puede luego ser detectada debido a la fluorescencia. Entre los compuestos de marcación fluorescentes más comúnmente usados están isotiocianato de fluoresceína, - rodamina, ficoertrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehído y fluorescamina. Véase también, Haugland, HAND BOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH PRODUCTS, NINTH EDITION Molecular Probes, Inc., Eugene Oregon (2003) . El anti-NIgSAb o NIgSBR pueden también ser marcados detectablemente utilizando metales que emiten fluorescencia tales como 1?2Eu, u otros de la serie de lantánidos. Estos metales pueden ser anexados al anti-NIgSAb utilizando tales grupos quelantes metálicos como ácido dietilentriaminpentaacético (DTPA) o ácido etilendiamin- tetraacético (EDTA) . El anti-NIgSAb o NIgSBR puede también ser marcado detectablemente mediante acoplamiento a un compuesto quimioluminiscente . La presencia del anticuerpo marcado quimioluminscentemente es luego determinada al detectar la presencia de la luminiscencia que surge durante el curso de una reacción química. Ejemplos de compuestos de marcación quimioluminiscentes particularmente útiles son lu inol, éster teromático de acridinio, imidazol, sal de acridinio y éster de oxalato. Asimismo, un compuesto bioluminiscente puede ser usado para marcar el anti-NIgSAb o NIgSBR de la presente invención. La bioluminiscencia es un tipo de quimioluminiscencia encontrada en sistemas biológicos en los cuales una proteína catalítica incrementa la eficiencia de la reacción quimioluminiscente . La presencia de una proteína bioluminiscente es determinada al detectar la presencia de luminiscencia. Compuestos bioluminiscentes importantes por propósitos de marcación son luciferina, luciferasa y equorina . La detección del anti-NIgSAb o NIgSBR se puede efectuar, por ejemplo, vía un contador de centelleo, por ejemplo si la etiqueta detectable es un emisor gamma radioactivo o mediante un fluorómetro, por ejemplo, si la etiqueta es un material fluorescente . En el caso de una etiqueta de enzima, la detección se puede efectuar mediante métodos colorimétricos que emplean un sustrato para la enzima. La detección puede también ser llevada a cabo por comparación visual de la extensión de reacción enzimática, de un sustrato en comparación con estándares preparados similarmente . La detección in situ se puede efectuar, por ejemplo al separar una muestra histológica de un paciente y proporcionar la combinación de anti-NIgSAb marcado detectablemente o NIgSBR de la presente invención a tal muestra. El anti-NIgSAb o NIgSBR marcado detectablemente es provisto preferiblemente al aplicar o mediante recubrimiento del anti-NIgSAb o NIgSBR marcado detectablemente a una muestra biológica. Por medio del uso de tal procedimiento, es posible determinar no solamente la presencia de inmunoglobulina natural sino también la distribución de inmunoglobulina natural en el tejido examinado. Utilizando la presente invención, aquellos de habilidad ordinaria percibirán fácilmente que cualquiera de una amplia variedad de métodos histológicos (tales como procedimientos de teñido) pueden ser modificados con el fin de obtener tal detección in situ. El anti-NIgSAb o NIgSBR de la presente invención puede ser adaptado para uso en un análisis inmunométrico, también conocido como un análisis de "dos sitios" o análisis de "emparedado" . En un análisis inmunométrico típico, una cantidad de anticuerpo sin marcar (o fragmento de anticuerpo) es enlazado a un soporte sólido que es insoluble en el fluido que es probado y una cantidad de anti-NIgSAb o NIgSBR marcado detectablemente es agregada para permitir la detección y/o cuantificación del complejo ternario formado entre el antígeno, anticuerpo y agente marcado detectablemente en fase sólida. Los análisis inmunométricos típicos incluyen análisis "directos" en los cuales el anticuerpo enlazado en la fase sólida es puesto en contacto primero con la muestra que es probada para extraer el antígeno de la muestra mediante formación de un complejo anticuerpo-anticuerpo en fase sólida binario. Después de un período de incubación apropiado, el soporte sólido es lavado para separar el residuo de la muestra de fluido, incluyendo el antígeno sin reaccionar, si lo hay y luego se pone en contacto con la solución que tiene una cantidad conocida de anticuerpo marcado (que funciona como "molécula reportero") . Después de un segundo período de incubación para permitir que el anticuerpo marcado se acompleje con el antígeno enlazado al soporte sólido por medio del anticuerpo sin marcar, el soporte sólido es lavado una segunda vez para separar el anticuerpo marcado sin reaccionar. Este tipo de análisis de emparedado directo puede ser un simple análisis de "si/no" para determinar si el antígeno está presente o se puede hacer cuantitativamente al comparar la medida de anticuerpo marcado con aquella obtenida para una muestra estándar que contiene cantidades conocidas de inmunoglobulina no desnaturalizada. Tales análisis de "dos sitios" o "emparedado" son descritos por Wide (Radioimmune Assay Method, (Ed. Kirkham, Livingstone, Edinburgh (1970) 199-206) . Otros tipos de análisis de "emparedado" los cuales pueden también ser útiles con inmunoglobulina natural, son los llamados análisis "simultáneos" e "inverso" . Un análisis simultáneo involucra una sola etapa de incubación en donde el anticuerpo enlazado al soporte sólido, antígeno y anticuerpo marcado y otros reactivos deseados son agregados a la muestra que es probada al mismo tiempo. Después que la incubación está completa, el soporte sólido es lavado para separar el residuo de muestra de fluido y el anticuerpo marcado sin acomplejar. La presencia del anticuerpo marcado asociado con el soporte sólido es luego determinada como si estuviera en un análisis de emparedado "directo" convencional . En el análisis "inverso" la adición gradual primero de una solución de anticuerpo marcado a la muestra de fluido seguida por la adición del anticuerpo sin marcar enlazado a un soporte sólido después de un período de incubación apropiado es utilizado. Después de una segunda incubación, la fase sólida es lavada de manera convencional para liberarla del residuo de la muestra que es probada y la solución del anticuerpo marcado sin reaccionar. La presencia del anticuerpo marcado asociada con un soporte sólido es luego determinada como en los análisis "simultáneo" y "directo" . En una modalidad, una combinación de anti-NIgSAb y/o NIgSBR de la presente invención específicos para el mismos o epítopos separados puede ser usada para construir un análisis inmunoradiométrico de múltiples sitios sensible. Equipos o artículos de manufactura que contienen el anti-NIgSAb o NIgSBR de la presente invención pueden ser preparados . Tales equipos o artículos de manufactura son usados en la ejecución de procedimientos de investigación, terapéuticos o de diagnóstico. Comúnmente, en los métodos descritos en la presente, el anti-NIgSAb o NIgSBR son intercambiables y pueden ser sustituidos uno por el otro o usados en combinación uno con el otro, incluyendo en donde están marcados detectablemente . Los siguientes ejemplos ilustran la presente invención sin embargo, sin limitar la misma a los mismos.

Aquel de habilidad ordinaria reconocerá una variedad de parámetros y materiales esencialmente equivalentes que pueden ser sustituidos de acuerdo con la presente invención.

EJEMPLO 1 Preparación de anticuerpo Métodos de inmunización y fusión Ratas Lou/M fueron inmunizadas con inmunoglobulina de suero de ratón. Ratones Balb/c fueron inmunizados con inmunoglobulina de suero de conejo. El título de suero fue probado después de tres inmunizaciones. Los bazos de animales con alto título de suero fueron fusionados con un socio de fusión de mieloma de ratón, SP2/0. Protocolo de Fusión A. Preparación de medios 1) Medio básico IMDM: 2) Medio completo FBS al 20%: 500 ml de medio básico IMDM + 100 ml de FBS + 6.5 ml de P/S (concentración de solución concentrada: 10,000 unidades/ml de penicilina; 100,000 unidades/ml de estreptomicina) + 6.5 ml de- glutamina (concentración de solución concentrada: 200 µM) . 3 ) Complementos : HAT 100X HES 50x (Complemento de mejora de hibridoma) 4) Medio de fusión: 500 ml de medio completo 5 ml de HAT 10Ox 10 ml de HES 50x 5) 50% de PEG (Sigma, MW 1500) B . Preparación de Células de mieloma 1) Antes de la fusión, la línea celular de mieloma fue cultivada en por lo menos 10-20% de medio de FBS IMDM durante tres a cuatro días . La mieloma fue mantenida en fase logarítmica de crecimiento antes de la fusión de las células . 2) Utilizando un microscopio de luz, las células de mieloma fueron verificadas en cuanto a crecimiento y viabilidad. 3) Las células de mieloma fueron desalojadas moderadamente de la superficie de los matraces y transferidas a tubos cónicos de 50 ml . 4) Las células de mieloma fueron centrifugadas a 1100 rpm durante cinco minutos . 5) Los sobrenadantes fueron descartados y la pelotilla celular resuspendida en medio IMDM pleno. 6) Las células de mieloma fueron centrifugadas a 1100 rpm durante cinco minutos . 7) El sobrenadante fue descartado y la pelotilla celular resuspendida en medio de IMDM básico . 8) El lavado fue repetido una vez más y se llevó a cabo un conteo de células . C. La Preparación de las células de bazo se realizó como sigue : 1) El animal fue anestesiado y se efectuó una exsanguinación vía función cardiaca para recolectar tanta sangre como sea posible, seguida por dislocación cervical. 2) El animal fue bañado en etanol a 75% durante dos a tres minutos . 3) El animal fue colocado sobre su lado derecho para exponer el área ventral izquierda y sujetado en un soporte de Styrofoam que fue esterilizado con etanol al 75%. 4) La piel de la pata izquierda fue cortada con un par de tijeras en una forma de V. La incisión fue ampliada al jalar la piel a lo lejos del corte, exponiendo mediante esto el peritoneo abdominal . El bazo estaba visible como una masa oscura rojiza debajo del peritoneo del abdomen ventral izquierdo. 5) El peritoneo fue cortado abierto con un par de tijeras pequeñas para dejar expuesto el bazo. 6) El bazo fue disecado y las adhesiones retiradas para separar el bazo. El bazo fue colocado en un colador de células de tamiz de nylon pre-humectado colocado enzima de un tubo cónico de 50 ml . El bazo fue cortado en piezas pequeñas con un par de tijeras curvas pequeñas. 7) Las piezas de bazo fueron tamizadas contra el colador de células con un émbolo de jeringa de 1 ce y homogeneizadas con una acción de molienda. Las células de bazo fueron enjuagadas a un tubo cónico de 50 ml con medio de IMDM básico (penicilina/estreptomicina opcional) . Las células del bazo fueron homogeneizadas continuamente y enjuagadas hasta que todas las células de bazo estuvieran aisladas. 8) Las células del bazo fueron centrifugadas a 1100 rpm durante cinco minutos . El sobrenadante fue descartado y la pelotilla re-suspendida. Se agregan 40 ml de IMDM a las células y la centrifugación fue repetida como antes. Este fue el primer lavado . 9) La pelotilla de célula de bazo lavada fue resuspendida en medio de IMDM y se efectuó un conteo de células . D. La fusión de las células de bazo y mieloma se hizo como sigue : 1) Las células de bazo y células de mieloma fueron combinadas conjuntamente en una proporción de célula de bazo a célula de mieloma 2-5:1 (2:1 ó 3:1 es preferido) . 2) La mezcla de células fue centrifugada a 1500 rpm durante siete minutos . 3) El sobrenadante fue aspirado utilizando una pipeta pasteur de vidrio, que se asegura que no se encuentre humedad en sobre los lados del tubo cónico de 50 ml . 4) La pelotilla fue desalojada moderadamente al golpear el lado del tubo contra un soporte de estiroespu a. 5) PEG al 50% (pre-calentado a 37 °C) fue agregado gota a gota en un minuto en tanto que se agita ocasionalmente. Fusión de ratón o hámster 0.8-1.0 ml de PEG Fusión de rata 0.9-1.2 ml de PEG 6) Se permite que la suspensión de célula/50% de PEG reaccione. Fusión de ratón o hámster: 1 min 15 segundos Fusión de rata: 1 min 30 segundos 7) 15 ml de medio de IMDM pleno pre-calentado fueron agregados gradualmente en cinco minutos . a) 1 ml agregado en el primer minuto en tanto que se mezcla ocasionalmente . b) 2 ml de medio agregado durante el segundo minuto en tanto que se mezcla ocasionalmente. c) el medio restante fue agregado en los siguientes dos a tres minutos en tanto que se mezcla ocasionalmente. 8) La suspensión celular fue incubada en un baño de agua a 37°C durante dos a cinco minutos. 9) Las células fueron centrifugadas a 1000 rpm durante cinco minutos . 10) Los sobrenadantes fueron descartados y la pelotilla resuspendida moderadamente. Luego las células fueron transferida cuidadosamente al volumen apropiado del medio de fusión (medio HAT) . 11) Después de 30 minutos a una hora, el cultivo de híbridoma fue depositado a 200 µlitros/cavidad con puntas de orificio de ancho a placas de cultivo de tejido de fondo plano de 96 cavidades. 12) La mezcla fue cultivada a 37°C, 7% de incubador de C02 con 100% de humedad durante tres a cuatro días. 2/3 del sobrenadante fueron aspirados de todas las cavidades y luego agregado cuidadosamente otra vez a 140-180 µl/cavidad de medio de HT con puntas de orificio amplio para impedir el rompimiento a las colonias celulares . 13) El sobrenadante de hibridoma fue seleccionado durante los días 9 a 10.

Caracterización de Reactividad Preferencial del Anticuerpo a Inmunoglobulina Natural Selección: Todos los clones en las placas de 96 cavidades fueron seleccionados mediante ELISA como sigue: 1) La placa de ELISA fue recubierta con 100 µl/cavidad de IgG de suero de ratón en PBS a una concentración de 2 µg/ml. La placa fue sellada e incubada a 4°C durante toda la noche . 2) Las cavidades fueron aspiradas y lavadas tres veces con más de 300 µl/cavidad de solución reguladora de lavado. La placa fue invertida y manchada sobre papel absorbente para separar cualquier solución reguladora del pH residual . 3) Las cavidades fueron bloqueadas con 200 µl/cavidad de diluyente de análisis e incubadas a temperatura ambiente durante 1 hora. 4) La etapa dos fue repetida. ) 100 µl/cavidad de las muestras de TCS fueron agregados a las cavidades .- La placa fue sellada e incubada a temperatura ambiente durante 2 horas . 6) La etapa dos fue repetida para un total de cinco lavados . 7) 100 µl/cavidad del anticuerpo anti-rata de ratón HRP-conjugado fue agregado al diluyente de análisis a una concentración de 1:2000. La placa fue sellada e incubada a temperatura ambiente durante 1 hora. 8) La etapa 2 fue repetida para un total de cinco lavados . 9) El sustrato de ABTS fue des-helado en el transcurso de 20 minutos de uso y 11 µl de H202 al 30% fueron agregados por 11 ml de sustrato. 100 µl/cavidad de la solución de sustrato de ABTS fueron agregados a cada cavidad. La placa fue incubada a temperatura ambiente durante 10 a 20 minutos.

) La placa fue leída a 405 nm. Todos los clones positivos fueron seleccionados y se efectuaron las siguientes pruebas : 1) Prueba de especificidad: las placas de ELISA fueron recubiertas con 100 µl/cavidad de diferentes isótopos de ratón a 2 µg/ml en PBS. IgGl . 2a, 2b, G3 , IgA y IgM de ratón fueron agregados a la hilera A, B, C, D, E, F y G. Las muestras fueron agregadas a la columna 1, 2, 3, 4, etc. Las otras etapas de análisis se efectuaron como se describe para el protocolo de selección anterior. 2) Prueba de isótopo: las placas de ELISA fueron recubiertas con 100 µl/cavidad de diferente isótopo anti-ratón mAb a 2 µg/ml en PBS. IgGl . 2a, 2b, G3 , IgA y IgM de anti-ratón fueron agregados a la hilera A, B, C, D, E, F y G. Las muestras fueron agregadas a la columna 1, 2, 3, 4, etc. Las otras etapas de análisis se efectuaron como se describe para el protocolo de selección anterior. 3) Bandas de proteínas/pruebas inmunológicas de inmunoglobulina se hicieron como sigue: 1) Muestras de IgG de suero (natural y desnaturalizado) fueron preparadas para correr un gel de SDS-PAGE. 2) Las muestras fueron transferidas del gel sobre membranas de Immobilon-P siguiendo las instrucciones provistas por el fabricante del sistema de transferencia para mejores resultados de transferencia de proteína. 3 ) La mancha fue incubada con muestra de TCS en la solución reguladora del pH de enlace de anticuerpo durante toda la noche a 4°C. 4) Después de la incubación durante toda la noche de la membrana con la muestra, la mancha fue lavada cinco veces durante cinco minutos en TBST. 5) La mancha fue incubada con anti-lg HRP- conjugado a dilución 1:2000 durante una hora a temperatura ambiente . 6) Después de incubación del anti-NIgSAb, la mancha fue lavada cinco veces durante cinco minutos en TBST. 7) La mancha fue revelada siguiendo las instrucciones del sustrato de HRP quimioluminiscente de Pierce provistas por el fabricante. 8) La mancha fue expuesta a película fotográfica por el período de tiempo apropiado. Para mejores resultados, la exposición debe durar entre un minuto y cinco minutos para visualizar la señal quimioluminiscente correspondiente a la reacción anticuerpo-antígeno específica. Los clones que reaccionan con inmunoglobulina natural, pero no inmunoglobulina desnaturalizada, fueron escalados ascendentemente, purificados y conjugados a anti-NIgSAb de HRP y luego se efectuaron las pruebas de inmunoprecipitación/bandas de proteínas (IP/WB) : 4) IP/WB se realizó como sigue: Etapa I : La preparación del lisado celular se efectuó como sigue : 1. Cosecha de célula Jurkat aproximadamente 107 células. 2. Las células fueron lavadas con aproximadamente 10 ml de PBS en un tubo cónico y centrifugadas a 400 x g durante 10 minutos. 3. El sobrenadante fue descartado y la Etapa 2 fue repetida. 4. Después del segundo lavado, el sobrenadante fue descartado completamente y la pelotilla celular fue resuspendida en 1 ml de solución reguladora del pH de lisis fría que contiene cóctel de inhibir de proteasa IX (concentración final de 107 células/ml) . El tubo fue sometido a vórtice moderadamente. 5. El tubo fue colocado en hielo durante 30 minutos, con mezclado ocasional. 6. El lisado celular fue centrifugado a 10000 x g durante 15 minutos a 4°C. 7. El sobrenadante fue recolectado cuidadosamente sin alterar la pelotilla y transferido a un tubo limpio. El lisado celular puede ser congelado en este punto para almacenamiento a largo plazo a -80 °C. La pelotilla fue descartada. Etapa II: La Prelimpieza del Lisado Celular se hizo como sigue : 1. 50 µl de pasta aguada de perla anti-inmunoglobulina fueron transferidos a un tubo de ensayo y se agregaron 450 µl de solución reguladora del pH de lisis fría. La mezcla fue centrifugada a 10000 x g durante 60 segundos y la solución reguladora del pH de lisis fue separada. El lavado fue repetido con 500 µl de solución reguladora del pH de lisis fría y las perlas fueron resuspendidas en 50 µl de solución reguladora del pH de lisis fría. 2. Los 50 µl de pasta aguada de perlas de anti-inmunoglobulina y 500 µl de lisado celular fueron agregados a un tubo de ensayo e incubados sobre hielo durante 60 minutos. 3. La mezcla fue centrifugada a 10000 x g durante 10 minutos a 4°C y el sobrenadante fue transferido a un tubo de ensayo fresco. Si cualquier perla era trasferida, el sobrenadante debe ser recentrifugado y transferido a otro tubo de ensayo fresco. Etapa III: La inmunoprecipitación se hizo como sigue: 1. 5 µg de antígeno anti-humano de caspasa-7 fue agregado al tubo de ensayo que contiene el lisado pre-limpio frío. 2. La mezcla fue incubada a 4°C durante una hora. 3. 50 µl de suspensión de perla de anti-inmunoglobulina en solución reguladora de pH de lisis pre-enfriada fueron agregados a la mezcla (preparado como se instruye en la etapa de pre-limpieza 1 anterior) . 4. La mezcla fue incubada durante 1 hora a 4°C sobre una plataforma oscilante o un rotador. 5. El tubo de ensayo fue centrifugado a 10000 x g durante 60 segundos a 4°C. 6. El sobrenadante fue separado cuidadosa y completamente y las perlas fueron lavadas tres veces con 500 µl de solución reguladora del pH de lisis. Para minimizar el fondo, se tuvo cuidado de separar el sobrenadante completamente en estos lavados . 7. Después del último lavado, el sobrenadante fue aspirado y 500 µl de solución reguladora del pH de muestra fueron agregados a la pelotilla de perla que fue mezclada y calentada a 100°C durante 10 minutos. 8. La mezcla fue centrifugada a 10000 x g durante cinco minutos. Luego el sobrenadante fue recolectado y cargado sobre un gel SDS-PAGE. Las mezclas de sobrenadante pueden ser recolectada y mantenidas congeladas en este punto si el gel va a ser corrido más tarde. 9. Se sellan las instrucciones del fabricante para SDS-PAGE. 10. Las muestras fueron transferidas del gel de SDS-PAGE sobre membranas Immobilon-P siguiendo las instrucciones provistas por el fabricante del sistema de transferencia. 11. El secado fue incubado con mAb caspasa-7 anti-humano (anticuerpo primario) a 2 µg/ml en la solución reguladora del pH de enlace de anticuerpo durante toda la noche a 4°C. 12. Después de la incubación durante toda la noche de la membrana con el anticuerpo primario, el secado fue lavado cinco veces durante cinco minutos en TBST. 13. El secado fue incubado con mAb de segunda etapa HRP-conjugado (anti-NIgSAb) a una dilución de 1:25 durante una hora a temperatura ambiente. 14. Después de la incubación del anticuerpo secundario, el secado fue lavado cinco veces durante cinco minutos en TBST. 15. El secado fue revelado siguiendo las instrucciones del sustrato de HRP quimioluminiscente de Pierce. 16. El secado fue expuesto a película fotográfica por el período de tiempo apropiado. Para mejores resultados, se expone durante un minuto y cinco minutos para visualizar la señal quimioluminiscente correspondiente a la reacción de anticuerpo-antígeno específica. Los métodos de la presente invención enriquecidos selectivamente para el anticuerpo que enlaza con alta preferencia a inmunoglobulina natural para una señal óptima en tanto que se reducen las señales de fondo atribuibles al enlace de las moléculas de cadena ligera y cadena pesada desnaturalizadas portadas de las etapas de inmunoprecipitación. El anti-NIgSAb y NIgSBR de la presente invención, como se ejemplifica por el anticuerpo monoclonal producido por el clon eB144 para enlazar específicamente a inmunoglobulina natural sobre IP/bandas de proteína es mostrado en las Figuras 1, 2 y 3, en donde las figuras demuestran la ventaja sustancial del anti-NIgSAb y NIgSBR de la presente invención para reaccionar selectivamente con la inmunoglobulina natural solamente, en comparación con un anticuerpo policlonal convencional, que reacciona tanto con las moléculas de inmunoglobulina desnaturalizadas de cadena pesada y ligera. Como se muestra, la asignación de un valor de 100% de enlace a la inmunoglobulina natural, aproximadamente 0% de enlace a las moléculas de inmunoglobulina desnaturalizadas fue detectada con el anti-NIgSAb. Los resultados de una inmunoabsorción utilizando anti-NIgSAb marcado detectablemente de la presente invención son mostrados en la Figura 1. 100 ng de IL-2 humano recombinante fueron inmunoprecipitados con anticuerpo policlonal IL-2 anti-humano de conejo. SDS-PAGE fue cargado con 20 ng/por cavidad y transferidos a una membrana para las bandas de proteína. El carril 1 fue incubado con anticuerpo policlonal marcado convencional (Igs anti-conejo de Amersham, 1:5000) - bandas extras sobre el carril muestran contaminantes de cadena ligera y cadena pesada de inmunoglobulina desnaturalizada. El carril 2 es incubado con sobrenadante de Ig de anti-conejo de rata monoclonal marcado detectablemente preparado de acuerdo con los métodos de la presente invención. El proceso de selección en cuanto a la carencia de reacción de los anticuerpos producidos por los métodos de la presente invención con las inmunoglobulinas de conejo desnaturalizadas es mostrado. Cada carril fue probado utilizando un anticuerpo diferente. Los carriles correspondientes de cada panel fueron probados con el mismo anticuerpo. La producción de anticuerpos que se enlazan preferiblemente con anticuerpos naturales es mostrada. Los carriles 5, 6, 10, 12, 15 muestran cada uno anti-NIgSAb mostrando porca o ninguna reactividad de anticuerpo a la inmunoglobulina de conejo desnaturalizada mediante bandas de proteínas. Los carriles 4, 7, 8, 11, 13, 14, 16 y 17 cada uno reaccionaron tanto con inmunoglobulinas naturales como desnaturalizadas . La Figura 3 muestra la especificidad del anti-NIgSAb de la presente invención para la inmunoglobulina no desnaturalizada. El lisado celular JURKAT (0.5 ml de 1 x 107 células/ml) fue inmunoprecipitado con caspasa-7 de antihumano de ratón (5 µg) . SDS-PAGE fue cargado a 10 µl/cavidad (1 x 10s células) y transferido a una membrana para las bandas de proteínas . El carril 1 fue incubado con anticuerpo policlonal convencional marcado (Ig anti-ratón policlonal de Jackson, 1:5000) - bandas extra en el carril muestran contaminantes de cadena ligera y pesada. El carril 2 fue incubado con anti-NIgSAb marcado detectablemente (Ig anti-ratón) de la presente invención (1:300) . El carril 3 es un re-secado del carril 2 utilizando el anticuerpo policlonal convencional marcado (Ig anti-ratón policlonal de Jackson, 1:5000) que fue usado para el carril 1. La apariencia de las bandas extra en el carril 3 muestran contaminantes de cadena ligera y pesada, confirmando que el anti-NIgSAb marcado detectablemente (Ig anti-ratón) de la presente (1:300) se enlaza selectiva y preferiblemente a Ig natural con respecto al Ig desnaturalizado contaminante.

EJEMPLO 2 INMUNIZACIÓN SUSTRACTIVA PARA PREPARAR ANTI-NGSAB PQLICLONAL Procedimiento : Día 1: Se inyectan 6 ratones (i.p.) con tolerógenos (inmunoglobulina desnaturalizada) que .no se desean para la producción de anticuerpo final (25-50 mg) utilizando adyuvante completo. Diez minutos más tarde se inyectan 100 mg/kg de peso corporal de ciclofosfamida (SIGMA) en solución salina de pH regulado de fosfato estéril . Se compensa a 2 mg/ml de solución de ciclofosfamida para este propósito. Día 2: Se inyecta la ciclofosfamida otra vez (100 mg/kg de peso corporal) . Día 3: Se repite la inyección de ciclofosfamida. Día 7: Se sangran los ratones y se realiza un título de anticuerpo vía ELISA. Día 14: Se inyectan 6 ratones (i.p.) con tolerógeno (25-50 mg) que no se desean para la producción de anticuerpo final utilizando adyuvante incompleto. Diez minutos más tarde se inyectan 100 mg/kg de peso corporal de ciclofosfamida en solución salida de pH regulado de fosfato estéril . Día 15: Se inyecta la ciclofosfamida otra vez (100 m9/kg de peso corporal) . Día 16: Se repite la inyección de ciclofosfamida. Día 21: Se sangran los ratones y se realiza un título de anticuerpo. Sí no se requiere título de anticuerpo se procede a la siguiente etapa. Si todavía existe un título de anticuerpo se repiten las inyecciones con tolerógenos y ciclofosfamida . Día 28: Se inmuniza con el inmunógeno deseado (inmunoglobulina natural) utilizando adyuvante completo. Día 38: Se sangran los ratones y se efectúa el análisis de título de anticuerpo. Día 42 : Se repite la inmunización con inmunógeno utilizando adyuvante incompleto. Día 46: Se sangran ratones en cuanto a título de anticuerpo. Este anticuerpo representa el anti-NIgSAb policlonal. Si se desea, el título de anticuerpo (aproximadamente 1/103 o mayor) se obtiene se procede con la fusión celular el día siguiente si el anticuerpo monoclonal va a ser producido para los animales. Si el título deseado no es obtenido se repite el inmunógeno en inyecciones de adyuvante cada dos semanas hasta que se obtiene el título deseado.

EJEMPLO 3 CLONACIÓN Y EXPRESIÓN DE ANTI-NIGSAB EN CÉLULA DE MAMÍFERO Un vector de expresión mamífero típico contiene por lo menos un elemento promotor que modera el inicio de transcripción de mARN, la secuencia de codificación de anticuerpo y señales requeridas para la terminación de transcripción y poliadenilación del transcripto. Los elementos adicionales incluyen mejoradores, secuencias de Kozak y secuencias intermedias blanqueadas por sitios donadores y aceptores para el empalme de ARN. Una transcripción altamente eficiente puede ser obtenida con los promotores prematuros y tardíos de SV40, las repeticiones terminales largas (LTRS) de retrovirus, por ejemplo, RSV, HTLVI, HIVI y el promotor prematuro del citomegalovirus (CMV) . Sin embargo, los elementos celulares pueden también ser usados (por ejemplo, el promotor de actina humano) . Los vectores de expresión apropiados para uso en la práctica de la presente invención incluyen, por ejemplo, vectores tales como pIRESlneo, pRetro-Off, pRetro-On, PLXNS, o pLNCX (Clonetech Labs, Palo Alto, California), pcDNA3.1 (+/-), pcDNA/Zeo (+/-) o pcDNA3. l/Hygro (+/-) (Invitrogen), PSVL yPMSG (Pharmacia, Uppsala, Suecia) , pRSVcat (ATCC 37152) , pSV2dhfr (ATCC 37146) y pBC12MI (ATCC 67109) . Las células huésped mamíferas que podrían ser usadas incluyen células Hela 293, H9 y Jurkat, células de NIH3T3 de ratón y células C127, Cos 1, Cos 7 y CV 1, células quail QC1-3, células L de ratón y células de ovario de hámster chino (CHO) . Alternativamente, el gen puede ser expresado en líneas celulares estables que contienen el gen integrado a un cromosoma. La co-transfección con un marcador seleccionable tal como dhfr, gpt, neomicina, o higromicina permite la identificación y aislamiento de las células transfectadas. El gen transfectado puede también ser amplificado para expresar grandes cantidades del anticuerpo codificado. El marcador de DHFR (dihidrofolato reductasa) es útil para revelar líneas celulares que portan varios cientos o aún varios miles de copias del gen de interés . Otro marcador de selección útil es la enzima glutamina sintasa (GS) (Murphy et al., 227 BIOCHEM. J. , 277-279 (1991); y Bebbington et al., 10 BIO/TECHNOLOGY, 160-175 (1992)). Utilizando estos marcadores, las células mamíferas son cultivadas en medio de cultivo y las células con la resistencia más alta son seleccionadas. Estas líneas celulares contienen el (los) gen (es) amplificado (s) integrado a un cromosoma. Células de ovario de hámster chino (CHO) y células NSO son frecuentemente usadas para la producción de anticuerpos . Los vectores de expresión pCl y pC4 contiene el promotor fuerte (LTR) del virus de sarcoma de Rous (Cullen et al., 5 MOLEC. CELL. BIOL., 438-447 (1985)) más un fragmento del CMV-mej orador (Boshart et al., 41 CELL, 521-530 (1985)). Múltiples sitios de clonación, por ejemplo con los sitios de escisión de enzima de restricción BamHI, Xbal y Asp718, facilitan la clonación del gen de interés. Los vectores contienen además el intrón 3 ' , la señal de poliadenilación y terminación del gen de pre-proinsulina de rata.

EJEMPLO 4 GENERACIÓN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES REACTIVOS CON INMUNOGLOBULINA NO DESNATURALIZADA Los ratones pueden ser usados para generar anticuerpos monoclonales que pueden ser usados en los métodos de la presente invención.

Inmunización Uno o más programas de inmunización pueden ser usados para generar los hibridomas de anti-NIgSAb. Las primeras varias fusiones pueden ser efectuadas después del siguiente protocolo de inmunización ejemplar, pero otros protocolos conocidos similares pueden ser usados . Varios ratones macho hembra de catorce a veinte semanas y/o ratones macho castrados quirúrgicamente sin inmunizados IP y/o ID con 1 a 100 µg de la proteína de inmunoglobulina deseadas emulsificada con un volumen igual de TITERMAX o adyuvante de Freund completo en un volumen final de 100 a 400 µl (por ejemplo 200) . Cada ratón puede también recibir opcionalmente 1 a 10 µg en 100 µL de solución salina fisiológica en cada uno de los dos sitios SQ. Luego los ratones pueden ser inmunizados 1 a 7,5 a 12, 10 a 18, 17 a 25 y/o 21 a 34 días más tarde IP (1 a 400 µg) y SQ (l a 400 µg x 2) con la proteína de inmunoglobulina emulsificada con un volumen igual de TITERMAX o adyuvante de Freund incompleto. Los ratones pueden ser sangrados 12 a 25 y 25 a 40 días más tarde mediante función retro-orbital sin anticoagulante. Luego se permite que la sangre se coagule a temperatura ambiente durante 1 hora y el suero es recolectado y titulado • utilizando un análisis de EIA de anti-inmunoglobulina de acuerdo con métodos conocidos . Las fusiones son efectuadas cuando inyecciones repetidas no provocan que los títulos se incrementen. En aquel tiempo, se puede dar a los ratones una inyección de refuerzo IV final de 1 a 400 µg de la proteína de inmunoglobulina diluida en 100 µl de solución fisiológica. Tres días más tarde, los ratones pueden ser eutenizados mediante dislocación cervical y los bazos retirados asépticamente y sumergidos en 10 mL de solución salina de pH regulado de fosfato fría (PBS) que contiene 100 U/mL de penicilina, 100 µg/mL de estreptomicina y 0.25 µg/mL de anfotericina B (PESA) . Los esplenocitos son cosechados mediante perfusión estéril del bazo con PSA-PBS . Las células son lavadas una vez en PSA-PBS frío, contadas utilizando exclusión de tinte de azul de triptan y resuspendidas en medio RPMI 1640 que contiene Hepes 25 mM.

Fusión celular La fusión se puede llevar a cabo a una proporción de 1:1 a 1:10 de células de meiloma murinas a células de bazo viables de acuerdo con métodos conocidos, por ejemplo como es conocido en la técnica. Como ejemplo no limitante, las células de bazo y células de mieloma pueden ser aglomeradas conjuntamente. Luego la pelotilla puede ser resuspendida lentamente, en 30 segundos en solución de PEG/PBS al 50% (peso/volumen) (peso molecular de PEG 1,450, Sigma) a 37°C. Luego la fusión puede ser detenida al agregar lentamente 10.5 mL de medio RPMI 1640 que contiene Hepes 25 mM (37°C) durante un minuto. Las células fusionadas son centrifugadas durante cinco minutos a 500 a 1500 rpm. Luego las células son resuspendidas en medio HAT (medio RPMI 1640 que contiene Hepes 25 mM, suero de clon I fetal al 10% (Hyclone) , piruvato de sodio 1 mM, L-glutamina 4 mM, gentamicina 10 µg/mL, complemento de cultivo de origen 2.5% (Fisher), 10% de medio RPMI 653 acondicionado 1640/Hepes, 2-mercaptoetanol 50 µM, hipoxantina 100 µM, aminopterina 0.4 µM, y timidina 16 µM) y luego depositados a 200 µL/cavidad en quince placas de cultivo de tejido de fondo plano de 96 cavidades. Luego las placas son colocadas en un incubador a 37°C humidificado que contiene 5% de C02 y 95% de aire durante siete a diez días.

Detección de Anti-NIgSAb en Suero de Ratón Se puede usar EIA de fase sólida para seleccionar sueros de ratón en cuanto a anticuerpos de IgG humanos específicos para la inmunoglobulina natural. Brevemente, las placas pueden ser recubiertas con inmunoglobulina a 2 µg/mL en PBS durante toda la noche . Después de lavado en solución salina 0.15 M que contiene 0.02% de Tween 20 (volumen/volumen) , las cavidades pueden ser bloqueadas con 1% (peso/volumen) de BSA en PBS, 200 µL/cavidad durante una hora a temperatura ambiente. Las placas son usadas inmediatamente o congeladas a -20 °C para uso futuro. Diluciones de suero de ratón son incubadas sobre las placas recubiertas con inmunoglobulina a 50 µL/cavidad a temperatura ambiente durante una hora. Las placas son lavadas y luego probadas con 50 µL/cavidad de IgG anti-humano de cabra HRP-marcado, Fc-específico diluido 1:30,000 en 1% de BSA-PBS durante una hora a temperatura ambiente . Las placas pueden otra vez ser lavadas y se agrega 100 µL/cavidad de la solución de sustrato de citrato-fosfato (ácido cítrico 0.1 M y fosfato de sodio 0.2 M, 0.01% de H202 y 1 mg/mL de OPD) durante 15 minutos a temperatura ambiente. Luego se agrega la solución de retención (ácido sulfúrico 4N) a 25 µL/cavidad y los OD son leídos a 490 n vía un espectrofotómetro de placa autornatizado .

Detección de Inmunoglobulinas en Sobrenadantes de Hibridoma Inmunoglobulinas que segregan hibridomas gram positivas pueden ser detectadas utilizando un EIA apropiado. Brevemente, placas de disparo de 96 cavidades (VWR, 610744) pueden se recubiertas con 10 µg/mL de IgG Fc ++++ anti-ratón de cabra en solución reguladora del pH de carbonato de sodio durante toda la noche a 4°C. Las placas son lavadas y bloqueadas con 1% de BSA-PBS durante una hora a 37°C y usadas inmediatamente o congeladas a -20°C. Los sobrenadantes de hibridoma sin diluir son incubados sobre las placas durante una hora a 37°C. Las placas son lavadas y probadas con anti-ratón de cabra HPR marcado diluido 1:10,000 en 1% de BSA-PBS durante una hora a 37°C. Luego las placas son incubadas con solución de sustrato como se describe anteriormente .

Determinación de Reactividad anti-NIgSAb Los hibridomas, como se describe anteriormente, pueden ser analizadas simultáneamente en cuanto a reactividad con inmunoglobulina natural utilizando bandas de proteína de RÍA apropiadas u otro análisis. Los hibridomas que segregan anti-NIgSAb pueden ser expendidas en cultivo celular y sub-clonadas serialmente al limitar la dilución. Las poblaciones clónales resultantes pueden ser expandidas y crio-conservadas en medio de congelación (95% de PBS, 5% de DMSO) y almacenadas en nitrógeno líquido. Los anticuerpos monoclonales de la presente invención demostrarán especificidad por la inmunoglobulina natural en comparación con la inmunoglobulina desnaturalizada.

Tipificación e Isotipificación de Clase La determinación de isótopos de los anticuerpos se puede llevar a cabo utilizando un EIA en un formato similar aquel usado para seleccionar los sueros inmunes de ratón por títulos específicos. El antígeno puede ser recubierto sobre placas de 96 cavidades como se describe anteriormente y el anticuerpo purificado a 2 µg/mL puede ser incubado sobre la placa durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa es lavada y probada con IgGi anti-ratón de cabra HRP marcado o IgG3 anti-ratón de cabra HRP marcado o cualquier otro anticuerpo específico de clase o específico de isótopo diluido a 1:4000 en 1% de BSA-PBS durante una hora a temperatura ambiente. La placa es otra vez lavada e incubada con solución de sustrato como se describe anteriormente.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Generación de anticuerpos monoclonales anti-NIgSAB Varias fusiones son efectuadas y cada fusión es sembrada en quince placas (1440 cavidades/fusión) que producen varias docenas de anticuerpos específicos para la inmunoglobulina natural . Varias fusiones son efectuadas utilizando esplenocitos de ratón que son inmunizados con proteína de inmunoglobulina. Un conjunto de varios anticuerpos monoclonales inmunoglobulina-reactivos naturales son generados. El anti-NIgSAb está caracterizado además por demostrar enlace específico a inmunoglobulina natural en comparación con inmunoglobulina desnaturalizada.

CITAS Las siguientes referencias son incorporadas por completo en la presente por referencia: Ausubel et al. (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, Nueva York (1987-1991)); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edición (Cold Spring Harbor, NY (1989); y Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (3a Edición), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York (2000) ; Harlow y Lañe, Antibodies, A Laboratory Manual , (Cold Spring Harbor, NY (1989)); Colligan et al. (Eds.), Current Protocols in I munology, (John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001)); Colligan et al . , Current Protocols in Protein Science, (John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001)). Las siguientes referencias proporcionan detalles útiles con respecto a procedimientos útiles en conjunción con la presente invención y son también incorporados por completo por referencia en la presente. (1) Kohler, G. y C. Milstein, "Continuous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity" , NATURE, (1975), 256 (5517) .-495-7. (2) Harlow, E. y D. Lañe, Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1988. (3) "Lymphocyte Hybridomas" , Current Topics in Microbiology and Immunology, Volume 81 (F. Melchers, M. Potter, y N. Warner, Editores, Springer-Verlag, 1978) . (4) Brooks et al., "Subtractive Immunization Yields Monoclonal Antibodies that Specifically Inhibit Metástasis" , J. OF CELL. BIOL., (1993) 122 (6) : 1351-1359. (5) Williams, C.V., C.L. Stechmann y S.C. McLoon, "Subtractive Immunization Techniques for the Production of Monoclonal Antibodies to Rare Antigens", BIOTECHNIQUES, (1992) 12 (6) -.842-847. (6) Sleister, H.M. y A.G. Rao, "Subtractive Immunization: A tool for the Generation of Discriminatory Antibodies to Proteins of Similar Sequence", J. IMMUNOL.

METHODS. (2002) 261 (1-2) .-213-220. Todas las publicaciones, patentes u otros documentos citados en la presente son incorporados por completo en la presente por referencia, como si cada publicación, patente u otro documento estuviera indicado específicamente para ser incorporado por referencia en su totalidad. Estos documentos muestran el estado de la técnica al tiempo de la presente invención y/o proporcionan descripción y habilitación de la presente invención. Las publicaciones incluyen cualesquier publicaciones científicas o de patente o cualquier otra información disponible en cualquier formato de medios, en los que se incluyen todos los formatos grabados, electrónicos o impresos.

Claims (37)

1. REIVINDICACIONES 1. Un anti-NIgSAb aislado o recombinante.
2. 2. El anti-NIgSAb de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anti-NIgSAb se enlaza específicamente a una proteína de inmunoglobulina natural .
3. 3. El anti-NIgSAb de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el anticuerpo es seleccionado del grupo que consiste de: un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, una porción de anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una variante de anticuerpo, un anti-NIgSAb, una porción de anti-NIgSAb, un fragmento de anti-NIgSAb y una variante de anti-NIgSAb.
4. 4. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el anticuerpo es criado en un mamífero.
5. 5. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el mamífero es seleccionado del grupo que consiste de: un humano, un ratón, una rata, una cabra, un conejo, una oveja, un caballo, y un hámster .
6. 6. El anticuerpo policlonal de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el anticuerpo policlonal es criado en un mamífero mediante inmunización sustractiva con una inmunoglobulina desnaturalizada seguida por inmunización con la inmunoglobulina natural.
7. 7. El anticuerpo policlonal de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el anticuerpo policlonal es tratado para separar cualquier anticuerpo de inmunoglobulina anti-desnaturalizado al poner en contacto el anticuerpo policlonal con una inmunoglobulina desnaturalizada anexada a un sustrato insoluble.
8. 8. El anticuerpo policlonal de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el sustrato insoluble es seleccionado del grupo que consiste de: una perla, una placa, una cavidad, un tubo, una membrana o una hoja.
9. 9. El anti-NIgSAb de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anti-NIgSAb es producido por una célula animal recombinante o una célula huésped recombinante .
10. 10. El anti-NIgSAb de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la célula huésped recombinante es seleccionada del grupo que consiste de: una célula mamífera, una célula de insecto, una célula de levadura y una célula bacteriana.
11. 11. El anti-NIgSAb de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el anti-NIgSAb es producido mediante un bacteriófago.
12. 12. Una línea celular recombinante caracterizada porque expresa un anti-NIgSAb.
13. 13. Una composición caracterizada porque comprende por lo menos un anti-NIgSAb y un diluyente o portador.
14. 14. Un método para producir por lo menos un a'nti-NlgSAb, el método está caracterizado porque comprende: seleccionar anticuerpos criados contra un antígeno de inmunoglobulina para identificar anticuerpos que se enlazan específicamente a una inmunoglobulina natural .
15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el anti-NIgSAb es seleccionado del grupo que consiste de: un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, una porción de anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una variante de anticuerpo, un fragmento de anti-NIgSAb, una porción de anti-NIgSAb y una variante de anti-NIgSAb.
16. 16. Un artículo de manufactura para uso en investigación o diagnóstico, caracterizado porque comprende un material de empaque y un contenedor que comprende por lo menos un anti-NIgSAb aislado.
17. 17. El artículo de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el anti-NIgSAb es marcado detectablemente.
18. 18. El artículo de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la etiqueta es seleccionada del grupo que consiste de: un agente quimioluminiscente, -un radioisótopo, una enzima, un agente fluorescente y un agentes cromogénico.
19. 19. El artículo de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la etiqueta comprende HRP.
20. 20. El artículo de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el anticuerpo es criado en un animal seleccionado del grupo que consiste de: un ratón, una rata, un conejo, una cabra, un hámster y un caballo.
21. 21. Un método para detectar inmunoglobulina natural, el método está caracterizado porque comprende: poner en contacto una muestra con uno o más anti-NlgSAb y medir el enlace del anti-NIgSAb a la muestra.
22. 22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el anti-NIgSAb es marcado detectablemente .
23. 23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el anti- NIgSAb es una enzima que cataliza la formación de un producto de reacción detectable.
24. 24. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la muestra es inmovilizada sobre un sustrato.
25. 25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el sustrato es seleccionado del grupo que consiste de: una perla, una placa, una hoja, una banda, una cavidad, una membrana y un tubo.
26. 26. Un NIgSBR aislado o recombinante.
27. 27. El NIgSBR de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el NIgSBR es marcado detectablemente.
28. 28. El NIgSBR de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la etiqueta es seleccionada del grupo que consiste de: un agente quimioluminiscente, un radioisótopo, una enzima, un agente fluorescente y un agente cromogénico .
29. 29. Una composición caracterizada porque comprende un NIgSBR y un diluyente o portador apropiado.
30. 30. Un artículo de manufactura para uso en investigación o diagnóstico, caracterizado porque comprende materiales de empaque y un contenedor que comprende por lo menos un NIgSBR.
31. 31. Un método para producir por lo menos un NIgSBR que comprende seleccionar uno o más compuestos para identificar un compuesto que se enlaza específicamente a una inmunoglobulina natural.
32. 32. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el NIgSBR es identificado de una biblioteca seleccionada del grupo que consiste de: una biblioteca de andamio de proteína, una biblioteca de exhibición de péptido, una biblioteca de evolución directa y una biblioteca a base de arreglo de proteína.
33. 33. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el NIgSBR es seleccionado del grupo que consiste de: un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, una porción de anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una variante de anticuerpo, una proteína diseñada, un andamio de polímero, un compuesto diseñado, un polipéptido y un polímero elaborado en un sistema mamífero, un polímero elaborado en un sistema no mamífero y un polímero elaborado en E. coli mediante exhibición de fago.
34. 34. Un método para detectar una inmunoglobulina natural, el método está caracterizado porque comprende poner en contacto una muestra con una o más NIgSBR y medir el enlace del NIgSBR a la muestra.
35. 35. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el NIgSBR es marcado detectablemente .
36. 36. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque la muestra es inmovilizada sobre un sustrato .
37. 37. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el sustrato es seleccionado del grupo que consiste de: una perla, una placa, una hoja, una banda, una cavidad y un tubo.