SE518007C2

SE518007C2 - Förfarande för framställning av mikropartiklar

Info

Publication number: SE518007C2
Application number: SE0004217A
Authority: SE
Inventors: Mats Reslow; Monica Joensson; Timo Laakso
Original assignee: Bioglan Ab
Priority date: 2000-11-16
Filing date: 2000-11-16
Publication date: 2002-08-13
Also published as: SE0004217D0; US6616949B2; US20020086060A1; SE0004217L

Description

25 30 35 . a ~ . Q u ~ I I ﬂ' 518 007 à 2 dessa polymerer också att gå under benämningen PLGA. PLGA bryts ned via esterhydrolys till mjölksyra och glykolsyra och har visat sig besitta utmärkt biokompatibilitet. Den ofarliga naturen hos PLGA kan dessutom exemplifieras av att åtskilliga parenterala beredningar för fördröjd fri- sättning baserade på dessa polymerer har godkänts av myn- digheter, däribland US Food and Drug Administration.

Parenteralt administrerbara produkter för fördröjd frisättning på marknaden idag baserade på PLGA innefattar Decapeptylm (Ibsen Biotech), Prostap SRW (Lederle), De- och Zoladex® Läke- medlen i dessa beredningar är alla peptider. Med andra capeptyl® Depot (Ferring) (Zeneca). ord består de av aminosyror kondenserade till en polymer med relativt låg polymerisationsgrad och de uppvisar ej någon väldefinierad tredimensionell struktur. Detta möj- liggör i sin tur vanligtvis användning av förhållandevis stränga betingelser under framställningen av dessa pro- dukter. Exempelvis kan strängsprutning och efterföljande storleksreducering utnyttjas, vilka tekniker inte torde vara tillåtna i samband med proteiner, eftersom dessa allmänt sett inte klarar så stränga betingelser.

Följaktligen föreligger det också behov av bered- ningar med reglerad frisättning för proteiner. Proteiner liknar peptider därigenom att de också består av aminosy- ror, men molekylerna är större och flertalet proteiner är beroende av en väldefinierad tredimensionell struktur vad beträffar många av sina egenskaper, däribland biologisk aktivitet och immunogenicitet. Deras tredimensionella struktur kan förstöras relativt lätt, t.eX. av höga tem- peraturer, ytinducerad denaturering samt i många fall ex- ponering för organiska lösningsmedel. En mycket allvarlig nackdel i samband med användning av PLGA, som är ett ut- märkt material i sig, för fördröjd frisättning av protei- ner är därför behovet av användning av organiska lös- ningsmedel för upplösning av nämnda PLGA, med åtföljande risk för att proteinets stabilitet påverkas negativt och att konformationsförändringar hos proteinet leder till en 10 15 20 25 30 35 immunologisk reaktion hos patienten, vilket kan ge både en förlust av den terapeutiska effekten genom bildning av hämmande antikroppar och toxiska biverkningar. Då det är synnerligen svårt att med säkerhet avgöra om ett komplext protein i alla delar har bibehållit sin tredimensionella struktur, är det av stor vikt att undvika att utsätta proteinet för betingelser som kan tänkas inducera konfor- mationsförändringar.

Trots stora ansträngningar i syfte att modifiera PLGA-teknologin för undvikande av detta inneboende pro- blem med proteininstabilitet under framställningsförfa- randet har utvecklingen inom detta område gått mycket långsamt, och huvudanledningen till detta är sannolikt att de tredimensionella strukturerna för flertalet prote- iner är alltför känsliga för att motstå de använda till- verkningsbetingelserna och den kemiskt sura miljö som bildas vid nedbrytningen av PLGA-matriser. Den vetenskap- liga litteraturen innehåller ett flertal beskrivningar av stabilitetsproblem vid tillverkningen av mikrosfärer av PLGA på grund av exponeringen för organiska lösningsme- del. Som ett exempel på den sura miljö som bildas vid nedbrytningen av PLGA-matriser har det nyligen visats att pH-värdet i en PLGA-mikrosfär med en diameter på cirka 40 um visats sjunka till 1,5, vilket är fullt tillräckligt för att denaturera, eller på annat sätt skada, många te- rapeutiskt användbara proteiner (Fu et al, Visual Eviden- ce of Acidic Environment Within Degrading Poly(1actic-co- glycolic acid) (PLGA) Microspheres. Pharmaceutical Rese- arch, Vol. 17, No 1, 2000, 100-106). I det fall mikrosfä- rerna har en större diameter kan pH-värdet förväntas sjunka ytterligare på grund av att de sura nedbrytnings- produkterna då får svårare att diffundera bort och att den autokatalytiska reaktionen intensifieras.

Den för närvarande vanligast använda tekniken för inneslutning av vattenlösliga substanser, såsom proteiner och peptider, är användning av multipelemulsionssystem.

Läkemedelssubstansen löses i en vatten- eller buffertlös- lO 15 20 25 30 35 o. o . 51 s 007 4 ning och blandas därefter med ett med vatten oblandbart organiskt lösningsmedel innehållande den upplöste polyme- ren. En emulsion bildas vilken har vattenfasen som inre fas. Olika typer av emulgeringsmedel och kraftig ombland- ning utnyttjas ofta för skapande av denna första emul- sion. Denna emulsion överföres sedan, under omrörning, till en annan vätska, vanligtvis vatten, innehållande en annan polymer, t.ex. polyvinylalkohol, vilket ger en vat- ten/olja/vatten-trippelemulsion. Mikrosfärerna bringas därefter att hårdna eller härda på något sätt. Det vanli- gaste sättet är att utnyttja ett organiskt lösningsmedel med låg kokpunkt, typiskt diklormetan, och att avdriva lösningsmedlet. Om det organiska lösningsmedlet inte är helt oblandbart med vatten, kan en kontinuerlig extrak- tionsprocedur utnyttjas genom tillsats av mera vatten till trippelemulsionen. Ett antal variationer av denna allmänna procedur beskrivs också i litteraturen. I vissa fall blandas den primära emulsionen med en icke-vatten- baserad fas, t.ex. silikonolja. Fasta läkemedelsmaterial i stället för upplösta sådana kan också användas.

PLGA-mikrosfärer innehållande proteiner beskrivs i WO-Al-9013780, där huvudsärdraget är användning av mycket låga temperaturer under framställningen av mikrosfärerna» i syfte att bevara hög biologisk aktivitet hos proteiner- na. Aktiviteten för inkapslat superoxiddismutas uppmättes men enbart på den del som frisattes från partiklarna.

Denna metod har använts för framställning av PLGA- mikrosfärer innehållande humant tillväxthormon i WO-Al- 9412158, varvid man dispergerar humant tillväxthormon i metylenklorid innehållande PLGA, sprayar den erhållna dispersionen i en behållare med frusen etanol med ett skikt av flytande kväve däröver i syfte att frysa de fina dropparna samt låter dessa sedimentera i kvävet på etano- len. Etanolen upptinas därefter och mikrosfärerna börjar sjunka i etanolen, där metylenkloriden extraheras i eta- nolen och mikrosfärerna bringas att hårdna. Med hjälp av denna metodik kan man bibehålla proteinstabiliteten bätt- lO 15 20 25 30 35 - s1s oo? o o o o » ø o . u a u I 5 re än vid flertalet andra processer för inneslutning av proteiner i PLGA-mikrosfärer, och nyligen har också en produkt blivit godkänd av registreringsmyndigheterna i USA. Det återstår emellertid fortfarande att entydigt pà- visa detta också för andra proteiner och problemet med exponering av det inneslutna biologiskt aktiva ämnet för ett mycket lågt pH under nedbrytningen av PLGA-matrisen kvarstår.

Vid de tidigare nämnda metoderna baserade på inkaps- ling med PLGA utsättes dock de aktiva substanserna för ett organiskt lösningsmedel, och detta är allmänt sett skadligt för stabiliteten hos ett protein. Dessutom är de omtalade emulsionsprocesserna komplicerade och sannolikt problematiska vid ett försök till uppskalning till in- dustriell skala. Vidare är många av de organiska lös- ningsmedel som utnyttjas vid många av dessa processer förknippade med miljömässiga problem, och deras höga af- finitet för PLGA-polymeren gör ett avlägsnande svårt.

Ett antal försök att lösa ovan beskrivna problem or- sakade av exponering av det biologiskt aktiva ämnet för en kemiskt sur miljö under bionedbrytningen av mikrosfär- matrisen och organiska lösningsmedel vid tillverknings- processen har beskrivits. För att undvika sur miljö under nedbrytningen har man försökt att byta ut PLGA som matris för mikrosfärerna mot en polymer som ger kemiskt neutrala nedbrytningsprodukter och för att undvika att utsätta det biologiskt aktiva ämnet för organiska lösningsmedel har man försökt att antingen tillverka mikrosfärerna i förväg och först efter upparbetning och torkning försökt ladda dem med det biologiskt aktiva ämnet, eller försökt ute- sluta eller begränsa det organiska lösningsmedlet under tillverkning av mikrosfärerna. Ett förfarande för att be- gränsa den använda mängden lösningsmedel vid användande av polymerer som endast kan lösas i organiska lösningsme- del beskrivs i WO 99/20253, vari begränsningen erhålls genom att en vattenbaserad PEG-lösning används för att bilda en emulsion. I denna skrift berörs inte någon tek- anan- lO 15 20 25 30 35 51 a 007 6 nik för att koncentrera eller solidifiera den biologiskt aktiva substans som skall införlivas i mikropartiklarna.

I WO 97/14408 beskrivs användning av luftsuspen- sionsteknik för framställning av mikropartiklar för för- längd frisättning efter parenteral administration utan att det biologiskt aktiva ämnet exponeras för organiska lösningsmedel. Skriften ger emellertid ingen vägledning mot förfarandet enligt uppfinningen eller mot de nya mik- ropartiklar som kan erhållas därigenom.

I US 5 470 582 framställs en mikrosfär bestående av PLGA och innehållande en makromolekyl genom ett tvàstegs- förfarande, där själva mikrosfären tillverkas först med utnyttjande av organiska lösningsmedel och laddas med makromolekylen i ett senare steg, där det organiska lös- ningsmedlet redan har avlägsnats. Detta förfaringssätt leder till alltför lågt innehåll av det biologiskt aktiva ämnet, oftast l-2%, och till att en mycket stor andel frisätts omedelbart efter injektion, vilket oftast är synnerligen olämpligt. Denna alltför snabba initiala fri- sättning är mycket hög redan vid en laddning av 1% och blir än mer uttalad vid högre innehåll av den aktiva sub- stansen i mikrosfärerna. Vid nedbrytningen av PLGA-matri- sen sjunker pH till nivåer som oftast inte är acceptabla för känsliga makromolekyler.

Det är i många fall nödvändigt eller önskvärt att modifiera ett biologiskt aktivt ämne, t.ex. läkemedel från löslig till fast form, t.ex. för att förbättra dess stabilitet och/eller möjliggöra att på ett effektivt sätt framställa en formulering av ämnet ifråga. Till exempel kan det i en inneslutningsprocess som utnyttjar ett emul- sionsförfarande vara nödvändigt att använda en fast form av det biologiskt aktiva ämnet för att få en högre effek- tivitet genom undvikande av transport till den yttre fa- sen, eller gränsytan mellan yttre och inre fas, och för att bibehålla den biologiska aktiviteten av ämnet. I sam- band med t.ex. användning av PLGA som mikropartikelmatris föreligger det således ett behov av att stabilisera den 10 lS 20 25 30 35 con 4 e aan q n u~no n 518 007 7 biologiskt aktiva substansen både under själva införli- vandet i mikropartiklarna och under frisättningsfasen ef- ter parenteral administration, och därför är förfaranden för stabilisering av t.ex. makromolekyler synnerligen värdefulla. För ämnen som tål stränga tillverkningsbe- tingelser kan strängsprutning och malning användas, men för känsliga biologiskt aktiva ämnen, såsom proteiner är det i de allra flesta fall fråga om att erhålla den fasta formen genom kemisk komplexbildning. Ett väl känt exempel på sådan läkemedelsberedning på marknaden är kristallint insulin komplexbundet med zink.

Sålunda är det väl känt att för proteiner och pepti- der har komplexbindning med divalenta metalljoner, före- trädesvis zink, utnyttjats sedan länge för att överföra det biologiskt aktiva ämnet i fast form. Grundläggande är att det inte är alla biologiskt aktiva ämnen som går att komplexbinda kemiskt, och det är inte alla t ex med zink, komplexbildare som är acceptabla för parenteral administ- ration. Det finns dock ett flertal nackdelar med sådana processer. En nackdel är den ofta komplicerade kemin som även i skenbart enkla fall kan kräva betydande insatser att få kontrollerad och välkarakteriserad. En annan nack- del är att registreringsmyndigheterna i vissa länder an- ser att även välkända och marknadsförda substanser efter dylik komplexbildning är att anse som en ny kemisk sub- stans, vilket leder till krav på extensiva och mycket dyrbara karakteriseringar kemiskt, säkerhetsmässigt och kliniskt. Ytterligare nackdelar introduceras då den akti- då det- ta ofta involverar spraynings- och torkningsprocesser som va substansen ska överföras i fast och torr form, är utrustningskrävande och i många fall kan vara kom- plexa. Många känsliga ämnen tål inte att utsättas för en luft/vatten- eller luft/organisk-vätskegränsyta eller för de skjuvkrafter som krävs för att bilda spraydropparna.

Det är inte heller ovanligt att problem med att disperge- ra eller resuspendera den i fast form överförda substan- sen efter torkningen inte leder till ett användbart re- ...s ...- ~ »- ~v.~ av. a »- 10 15 20 25 30 35 nu . u a.øau. n 51 s 007 šïï* íšfï- 8 sultat, t.ex. pà grund av att dessa partiklar vidhäftar till varandra pà ett sådant sätt att de inte kan slås isär med användande av acceptabla betingelser. I flera av dessa processer används organiska lösningsmedel som ris- kerar att vara skadliga för känsliga biologiskt aktiva ämnen och personal som kommer i kontakt med ämnena, samt har en negativ inverkan pà miljön.

I US 5,654,0lO och US 5,664,808 beskrivs framställ- ning av en fast form av rekombinant human tillväxthormon, hGH, genom komplexbildning med zink för att skapa ett amorft komplex, som sedan mikroniseras genom ett ultra- ljudsmunstycke och sprayas ner i flytande kväve för att frysa dropparna. Det flytande kvävet får sedan evaporera vid en temperatur pà -80°C och det resulterande materia- let frystorkas. Förutom att processen är komplex och svär att applicera generellt så innefattar den en spraynings- process där det biologiskt aktiva ämnet utsätts för en vatten/luftyta och där den amorfa form av proteinet som bildas suspenderas i metylenklorid. Metylenklorid är ett i högsta grad oönskat organiskt lösningsmedel ur toxiko- logisk synpunkt, bäde för patienterna och arbetspersona- len.

Ett förfarande för framställning av parenteral admi- nistrerbara mikropartiklar med följande egenskaper skulle sålunda vara synnerliga önskvärt: 0 ett förfarande som gör det möjligt att koncentrera eller solidifiera den biologiskt aktiva substans som ska införlivas i en parenteralt injicerbar beredning utan användning av kemisk komplexbildning; 0 ett förfarande som gör det möjligt att koncentrera eller solidifiera den biologiskt aktiva substans som ska införlivas utan användning av kemisk komplexbild- ning och med bibehållande av substansens biologiska aktivitet; 0 ett förfarande som gör det möjligt att koncentrera eller solidifiera den biologiskt aktiva substans som ska införlivas i en parenteralt administrerbar bered- ~ u un u. 10 15 20 25 30 35 51 s u o 7 šïï* šïïš 9 ning utan att substansen utsätts för luft/vatten el- ler luft/organiskt lösningsmedelgränsytor. ett förfarande som gör det möjligt att koncentrera eller solidifiera den biologiskt aktiva substans som ska införlivas i en parenteralt administrerbar bered- ning utan användning av ett sprayningsförfarande el- ler torkningsförfarande; ett förfarande som gör det möjligt att undvika ett rekonstitutionssteg och/eller resuspenderingssteg av den biologiskt aktiva substansen från torrt tillstånd utan föregående stabilisering genom införlivande i mikropartiklar; ett förfarande som gör det möjligt att infànga käns- liga biologiskt aktiva substanser i mikropartiklar med bibehållande av sin biologiska aktivitet; ett förfarande medelst vilket man kan framställa en i huvudsak fullständigt bionedbrytbar och biokompatibel beredning som är lämplig att injicera parenteralt; ett förfarande medelst vilket man kan framställa en parenteralt injicerbar beredning med en storlek över- stigande 20 pm och ännu hellre överstigande 30 um i syfte att undvika fagocytos av vävnadsmakrofager och förenkla upparbetning av densamma under tillverkning- en; ett förfarande för framställning av mikropartiklar innehållande en biologiskt aktiv substans, vilka kan användas som mellanprodukt vid framställning av en beredning för reglerad, förlängd eller fördröjd fri- sättning; en i huvudsak fullständigt bionedbrytbar och biokom- patibel mikropartikulär beredning som är lämplig att injicera parenteralt; en mikropartikulär beredning innehållande en biolo- giskt aktiv substans och med en partikelstorleksför- delning som är lämplig för att drageras med hjälp av luftsuspensionsteknik samt med tillräckligt mekaniskt hållfasthet för detta ändamål; 10 15 20 25 30 35 ' 518 007 10 0 en dragerad mikropartikulär beredning innehållande en biologiskt aktiva substans, vilken beredning ger en kontrollerad frisättning efter parenteral administra- tion.

BESKRIVNING AV UPPFINNINGEN Föreliggande uppfinning tillhandahåller ett förfa- rande för framställning av mikropartiklar. Närmare be- stämt är det fråga om framställning av mikropartiklar som innehåller en biologiskt aktiv substans och som primärt är avsedda för parenteral administration av denna sub- stans till ett däggdjur, speciellt människa. I första hand är det fråga om framställning av mikropartiklar av- sedda för injektion. Eftersom mikropartiklarna i första hand är avsedda för injektion, är det företrädesvis fråga om framställning av partiklar med en medeldiameter inom intervallet 10-200 um, vanligtvis 20-100 um och speciellt 20-80 pm.

Uttrycket "mikropartiklar" används härvid i samband med uppfinningen som generell benämning för partiklar av viss storlek i enlighet med i och för sig känd teknik. En typ av mikropartiklar är sålunda mikrosfärer, vilka har i huvudsak sfärisk form, under det att begreppet mikropar- tikel generellt kan innefatta avvikelse från sådan ideal sfärisk form. Ãven det i och för sig kända begreppet mik- rokapsel faller inom uttrycket mikropartikel i enlighet med känd teknik.

Förfarandet enligt föreliggande uppfinning innefat- tar närmare bestämt att man a)bereder en vattenbaserad lösning av den biologiskt ak- tiva substans som ska införlivas i mikropartiklarna, erhållna lösningen med en vat- (PEG) dana betingelser att den biologiskt aktiva substansen b)blandar den i steg a) tenbaserad lösning av polyetylenglykol under så- koncentreras och/eller solidifieras, oscar lO 15 20 25 30 35 v . | u . » u . n o .n 518 007 ll c)eventuellt tvättar den i steg b) erhàllna koncentrera- de och/eller solidifierade biologiskt aktiva substan- sen, d)blandar den i steg b) eller c) erhàllna koncentrerade och/eller solidifierade biologiskt aktiva substansen med en lösning av en bionedbrytbar polymer i ett orga- niskt lösningsmedel, e)blandar den i steg d) erhållna kompositionen med en vattenbaserad lösning av en polymer med förmåga att bilda emulsion, så att det bildas en emulsion av drop- par av den bionedbrytbara polymeren, vilka innehåller den biologiskt aktiva substansen, som inre fas i en yttre fas av nämnda polymerlösning, f)bringar eller tillàter de i steg e) erhållna dropparna att solidifieras till mikropartiklar, g)torkar mikropartiklarna fràn steg f), och ln eventuellt applicerar ett frisättningsreglerande hölje av en biokompatibel och bionedbrytbar polymer pà de torkade mikropartiklarna fràn steg f). Även om det rent generellt är möjligt att införliva biologiskt aktiva substanser i mikropartiklar med hög ef- fektivitet då den biologiskt aktiva substansen föreligger i löslig form under infàngningssteget, är det i vissa fall att föredraga att den biologiskt aktiva substansen överförs i fast form. Det kan till exempel röra sig om att ytterligare stabilisera den biologiskt aktiva sub- stansen under infàngningssteget, vilket är speciellt vär- defullt för känsliga makromolekyler som utsätts för orga- niska lösningsmedel, att öka utbytet eller laddningen yt- terligare genom att överföra àmnet till en form som efter blandning med innerfasen (polymerlösningen) ej kan förde- las ut i ytterfasen eller till gränsytan mellan inner- och ytterfas eller att överföra substansen i en form som är så inert som möjligt under tillverkningen av mikropar- tiklarna, detta för att man exempelvis skall få förbätt- rade egenskaper vad avser storleksfördelningen av mikro- partiklarna. 10 15 20 25 30 35 s1s nov 12 Det har sålunda mycket överraskande befunnits att PEG, som ofta används som polymer för att skapa den yttre fasen i ett tvåfas-vattensystem, också kan användas för att koncentrera och/eller solidifiera den biologiskt ak- tiva substans som ska infàngas, samt att detta kan utfö- ras under milda betingelser som kan bevara t.ex. ett pro- teins tredimensionella konformation och biologiska akti- vitet.

Detta förfarande har ett flertal fördelar jämfört med tidigare känd teknik. Det är för det första inte nöd- vändigt att komplexbinda den biologiskt aktiva substan- sen, företrädesvis ett protein eller en peptid, för att erhålla koncentreringen/solidifieringen. Användningen av detta förfarande leder för det andra ofta också till bättre stabilitet under införlivandet i mikropartiklar jämfört med lösligt protein. Genom att förfarandet inte innefattar ett spraynings- eller torkningsförfarande in- nan den biologiskt aktiva substansen införlivas i mikro- partiklarna undviker man dessutom att utsätta den biolo- giskt aktiva substansen för höga skjuvkrafter och för gränsytor (luft/vatten eller luft/organiskt lösningsme- del). Vidare undviker man aggregering på grund av elek- trostatiska laddningar, något som är mycket vanligt före- kommande för små, torra partiklar. Eventuella problem med vätning och resuspendering av ett torrt pulver av den bi- ologiskt aktiva substansen kan också undvikas. Rent gene- rellt är vidare sprayningsförfaranden komplexa och svår- kontrollerade. Inte heller är det nödvändigt att utnyttja processteg som nedfrysning och långsam upptining för att överföra det biologiskt aktiva ämnet i torr form.

För steg a) av förfarandet enligt uppfinningen gäll- er att den vattenbaserade lösningen av den biologiskt ak- tiva substansen beredes medelst inom området väl kända metoder, vilka inte behöver beskrivas närmare här. Grund- läggande är dock naturligtvis att lösningen beredes under så milda betingelser, främst vad gäller temperatur och omrörning, att den biologiskt aktiva substansens bioakti- l0 15 20 25 30 35 518 007 1š.§ÉÉ_ 13 vitet bevaras. Ofta används dessutom inom området välkän- da, för parenteralt bruk acceptabla, buffertsubstanser för kontroll eller reglering av lösningens pH-värde. Vid behov kan dessutom också inom området välkända och för parenteralt bruk acceptabla ämnen användas för exempelvis justering av jonstyrka och osmolaritet. Den erhållna lös- ningen kan, när så önskas, steriliseras medelst exempel- vis sterilfiltrering.

Genom användningen av den vattenbaserade lösningen av polyetylenglykol i steget b) kan en koncentrering av den biologiskt aktiva substansen, t.ex. ett protein, er- hållas. Denna koncentrering resulterar ofta i att den bi- ologiskt aktiva substansen faller ut, dvs bildar en fäll- ning, och att det därigenom bildas solida eller fasta partiklar. Detta kan exempelvis pävisas med hjälp av ljusmikroskopisk undersökning. Då processen ofta genomfö- res snabbt, är partiklarnas struktur oftast amorf. Även andra former av partiklar, t.ex. kristaller och underkylt glas, innefattas emellertid i uppfinningen, beroende på hur processen genomföres.

I begreppet koncentreras ligger emellertid också det fall dä den biologiskt aktiva substansen inte faller ut utan enbart bildar en mer eller mindre högviskös lösning.

Inom begreppet solidifieras ligger sålunda även det fall då en sådan högviskös lösning bildar så stabila droppar att den i praktiken kan hanteras och införlivas i mikro- partiklar på i huvudsak samma sätt som om den vore en fällning. Den koncentrerade/solidifierade biologiskt ak- tiva substansen kan återfinnas i mikropartikelmatrisen i form av öar eller diskreta partiklar.

En utföringsform av förfarandet enligt uppfinningen representeras sålunda av det fall då steg b) utföres så att solidifieringen av den biologiskt aktiva substansen leder till utfällning av densamma.

En annan utföringsform innebär att steg b) utföres så att solidifieringen av den biologiskt aktiva substan- 10 15 20 25 30 35 518 D07 14 sen leder till en högviskös lösning, vilken uppvisar för- måga att bilda vid rumstemperatur hanterbara droppar.

Ytterligare en utföringsform av förfarandet innebär att steg b) tiv substans. utföres till en reversibelt solidifierad ak- Ännu en utföringsform av förfarandet innebär att den solidifierade biologiskt aktiva substansen bildar en pel- let eller en högviskös eller fast bottenfas vid centrifu- gering eller ultracentrifugering.

Med reversibelt solidifierad menas generellt att ifrågavarande biologiskt aktiva substans vid upplösning, i för varje unik biologiskt aktiv substans lämpligt medi- um och under lämpliga betingelser, och/eller vid frisätt- ning från mikropartiklarna in vitro och/eller in vivo återfås i väsentligen samma form, såväl kemiskt som bio- logiskt, som den hade före koncentrering- en/solidifieringen med polyetylenglykol.

Att den solidifierade biologiskt aktiva substansen bildar en pellet eller en högviskös eller fast bottensats vid centrifugering eller ultracentrifugering är ett sätt för påvisande av den önskade koncentrering- en/solidifieringen. Detta innebär dessutom att substansen ifråga föreligger i annan fysikalisk form än den lösliga form som föreligger i steg a) efter beredningen av den vattenbaserade lösningen.

Att den biologiskt aktiva substansen föreligger i koncentrerad form innebär generellt att den föreligger i en koncentration som överstiger den koncentration, vilken kan erhållas vid upplösning av substansen ifråga i ett vattenhaltigt medium, med eller utan stabilisatorer och löslighetsbefrämjande ämnen, och under bibehållande av biologisk aktivitet och kemisk stabilitet.

Huruvida steg c) av förfarandet enligt uppfinningen behöver utföras eller ej, dvs om den erhållna koncentre- rade och/eller solidifierade aktiva substansen skall tvättas, och i så fall i vilken omfattning, får avgöras i varje enskilt fall och beror bl.a. på hur stor andel av _ , . .- .n u. z ~__",,". u n .z :n . . . . . . . . . - v :I I: 2. - . . » : z 51 8 .'. ..."' . . '. . . . ':' .' i . - . . . . .- . . . . .. n . . 15 den biologiskt aktiva substansen som föreligger i löst form i PEG-lösningen, om den lösta substansen är till- räckligt stabil i denna form för att kunna införlivas i mikropartiklarna utan att alltför stor mängd oönskade 5 nedbrytningsprodukter bildas, vilken effekt denna lösta substans har på tillverkningen av mikropartiklarna, om man önskar använda andra betingelser, t.ex. vad gäller koncentration av och medelmolekylvikt för PEG, samt pH och jonstyrka, än vad som användes i steg b), om PEG ut- 10 gör en stabilisator för den biologiskt aktiva substansen i sig eller genom att bibehålla substansen i olöst form eller förhindra adsorption till ytor.

Själva tvättningen av den koncentrerade och/eller solidifierade aktiva substansen kan ske medelst inom det- 15 ta teknikområde etablerade lämpliga tekniker. I den allra enklaste formen kan centrifugeringstvättar användas, och i många fall är även filtrering användbar. I det senare fallet används företrädesvis betingelser under vilka den koncentrerade och/eller solidifierade aktiva substansen 20 inte tillåts torka, dä detta kan leda till exempelvis klumpbildning, och tiden för processen förkortas genom applicering av tryck. Fundamentalt är givetvis att den vätska som används inte får lösa upp den koncentrerade och/eller solidifierade aktiva substansen, och vilka be- 25 tingelser som är lämpliga får avgöras för varje enskild biologiskt aktiv substans. I många fall kan sådana be- tingelser väljas vad avser buffertsammansättning, till- satsämnen och temperaturer att detta krav uppfylls, och nödvändig information kan fås fràn litteraturen eller via :y§ 30 enkla experiment. Naturligtvis kan tillsats av polymerer =¿E användas för undvikande av upplösning av den koncentrera- de och/eller solidifierade aktiva substansen, och i det allra enklaste fallet används samma sammansättning pà PEG-lösningen som då koncentreringen/solidifieringen 35 genomfördes.

Den bionedbrytbara polymer som används i steg d) kan väljas enligt i och för sig känd teknik i detta avseende, 518 007 l6 dvs bland polymermaterial som är förut kända som matris- material för mikropartiklar, förutsatt att polymeren ifråga är löslig i organiskt lösningsmedel (härigenom un- dantas t.ex. stärkelse) och biokompatibel, dvs biologiskt 5 acceptabel.

Speciellt föredras dock en homo- eller sampolymer innehållande alfa-hydroxisyraenheter, företrädesvis mjölksyra och/eller glykolsyra, t.ex. PLGA.

Polymeren har företrädesvis en medelmolekylvikt inom 10 intervallet 2-200 kDA, ännu hellre 2-110 kDA, För blandningsoperationen i steg d) gäller att man lämpligen använder sig av ett viktförhällande bionedbryt- bar polymer:biologiskt aktiv substans inom omrâdet fràn 3:1 till 10 OOO:l l5 För blandningsoperationen gäller dessutom, såsom har omtalats ovan, att den aktiva substansen koncentre- ras/solidifieras med utnyttjande av en PEG-lösning innan den blandas med polymerlösningen. Det är möjligt att sät- ta polymerlösningen till den biologiskt aktiva substansen 20 eller vice versa. Därefter skapas en homogen fördelning av den koncentrerade/solidifierade aktiva substansen i polymerlösningen medelst lämplig teknik. Sådan teknik är välkänd inom området, varvid som exempel kan nämnas mag- netomrörning, propelleromrörning eller användning av en 25 eller flera statiska mixrar.

Beträffande den polymer som använts i steg e) i syf- te att ge en emulsion gäller att det inom just detta tek- nikomràde finns publicerad information om ett stort antal polymerer med förmåga att bilda sådana emulsioner. Alla -y-f 30 sädana polymerer får anses ligga inom ramen för förelig- gande uppfinning. En speciellt lämplig polymer i detta sammanhang är dock polyetylenglykol. Molekylvikten för polyetylenglykolen ligger vanligtvis inom området fràn ca l till 40 kDa, företrädesvis fràn 5 till 35 kDa. Beroende 35 pä denna molekylvikt och egenskaperna för den substans som skall inkapslas regleras koncentrationen av polyety- lenglykol så att den ligger inom området 20-80% lO 15 20 25 30 35 - | ø o ~ . | . - . n. 17 (vikt/vikt), företrädesvis 20-60% (vikt/vikt), såsom 30- 55% (vikt/vikt) eller 30-50% (vikt/vikt). används relativt hög PEG-koncentration i den yttre fasen, Med andra ord så att man erhåller en stabil emulsion och så att diffu- sion av aktiv beståndsdel förhindras från droppar- na/partiklarna. Bestämningen av den optimala koncentra- tionen kan göras med hjälp av experiment vilka är rela- tivt enkla att utföra för en fackman på området.

Blandningsoperationen i steg e) kan utföras på många olika sätt, t.ex. genom användning av propelleromrörning eller minst en statisk mixer. Blandningen utföres normalt inom temperaturområdet 4-50°C, företrädesvis 20-40°C, ofta ca 37°C. Vid ett satsvis förfarande kan lösningen av den första polymeren, t.ex. PLGA, sättas till den andra poly- t.ex. PEG, I det fall statiska mixrar eller blandare utnyttjas, utföres opera- merlösningen, eller vice versa. tionen lämpligen därigenom att de båda lösningarna pumpas i två separata rörledningar in i en gemensam rörledning som innehåller blandarna.

Emulsionen kan bildas under användning av låga skjuvkrafter. I de flesta fall är det tillräckligt med magnet- eller propelleromrörning. I större skala, t.ex. dä den mängd mikropartiklar som skall framställas över- stiger 50 g, är det lämpligt att använda s.k. bafflar för erhållande av en ännu effektivare omrörning i den använda behållaren. Ett alternativt sätt för att bilda emulsionen är användning av minst en statisk mixer, varvid den orga- niska polymerlösningen lämpligen pumpas med reglerad has- tighet i ett rör, vari de statiska mixrarna har place- rats. Pumpningen kan ske med vilken lämplig pump som helst, förutsatt att den ger jämn flödeshastighet under dessa betingelser, inte utsätter blandningen för onödigt höga skjuvkrafter och är acceptabel för tillverkning av parenterala beredningar vad avser renhet och frånvaro av läckage av oönskade substanser. Även i de fall då statis- ka mixrar används för skapande av emulsionen är det of- lO 15 20 25 30 35 ' 518 007 - u ø ø o u - . v . c n en 18 tast fördelaktigt att låta solidifieringen till mikropar- tiklar ske i ett kärl med lämplig omrörning.

En föredragen utföringsform av förfarandet enligt uppfinningen innebär att man i steg e) sätter polymerlös- ningen till kompositionen i minst tvâ steg, där en till- sats sker efter det att emulsionen har skapats eller bör- jat skapas.

Det ligger naturligtvis också inom ramen för före- liggande uppfinning att tillsätta polymerlösningarna i flera steg och att därvid exempelvis ändra medelmolekyl- vikten och/eller koncentrationen av den använda polyme- ren.

Blandningsoperationen i steg e) utföres dessutom lämpligen under sådana betingelser att de bildade drop- parna får den för mikropartiklarna önskade storleken, dvs företrädesvis en medeldiameter, i torrt tillstànd, ännu hellre 20-l0Opm och helst 20- 80pm. Andra inom området kända metoder för solidifiering inom intervallet lO-200pm, av mikropartiklarna ligger emellertid också inom ramen för uppfinningen.

Viktigt i samband med solidiferingen av mikropartik- larna är att denna sker under betingelser som är milda för den ingående biologiskt aktiva substansen, eller sub- stanserna. Primärt är det med andra ord fråga om att an- vända sig av en temperatur som inte är skadlig för den närvarande substansen.

En bekräftelse pá att de valda betingelserna är kor- rekta eller lämpliga kan man fà genom att konstatera att mikropartiklarna har önskad storleksfördelning, är stabi- la under de efterföljande tvättnings- och torkningsopera- tionerna och löses upp i huvudsak fullständigt in vitro och/eller att den införlivade substansen har kapslats in pà ett effektivt sätt och har bibehållen bioaktivitet.

Det sistnämnda undersöks vanligtvis med hjälp av kromato- grafiska metoder eller med hjälp av andra inom tekniken etablerade metoder, in vitro eller in vivo, efter upplös- ning av mikropartiklarna. 10 15 20 25 30 35 -n o . . ' j: :' v n n .u u. 518 007 19 De bildade mikropartiklarna tvättas företrädesvis pà lämpligt sätt, för avlägsnande av yttre fas och av över- skott av aktiv substans. Sàdan tvättning sker lämpligen genom filtrering, vilken möjliggörs av mikropartiklarnas goda mekaniska stabilitet och lämpliga storleksfördel- ning. Ofta kan det ocksà vara lämpligt med tvättning me- delst centrifugering, avlägsnande av supernatanten och resuspendering i tvättningsmediet. Vid varje tvättnings- förfarande används ett eller flera lämpliga tvättningsme- dier, vilka oftast är bufferthaltiga vattenlösningar. I samband härmed kan också siktning vid behov användas för justering av mikropartiklarnas storleksfördelning, exem- pelvis för eliminering av innehållet av alltför små mik- ropartiklar och för säkerställande av att inga mikropar- tiklar över en viss storlek finns närvarande i den färdi- ga produkten.

Torkningen av mikropartiklarna kan ske pà något lämpligt sätt, t.ex. genom spraytorkning, frystorkning eller vacuumtorkning. Vilken torkningsmetod som väljs i det enskilda fallet beror ofta på vad som är lämpligast för bibehållande av den biologiska aktiviteten för den inneslutna biologiskt aktiva substansen. Även processö- verväganden kommer in i bilden, såsom kapacitet och ren- hetsaspekter. Frystorkning är ofta den föredragna tork- ningsmetoden, dà den rätt utformad är synnerligen mild med avseende pä den inneslutna biologiskt aktiva substan- sen. Att den införlivade biologiskt aktiva substansen har bibehàllit sin bioaktivitet kan fastställas medelst för substansen lämplig analys efter upplösning av mikropar- tiklarna under milda betingelser.

För modifiering av frisättningsegenskaperna för mik- ropartiklarna kan man dessutom eventuellt också applicera ett frisättningsreglerande hölje av en biokompatibel och bionedbrytbar polymer. Exempel pà lämpliga polymerer i detta sammanhang finns i den kända tekniken, och speci- ellt kan polymerer av mjölksyra och glykolsyra (PLGA) nämnas. Appliceringen av ifrågavarande hölje sker före- lO 15 20 25 30 35 oas oo 518 007 20 trädesvis med hjälp av luftsuspensionsteknik. En speci- ellt lämplig sådan teknik finns beskriven i WO97/14408, och detaljer i detta avseende kan sålunda hämtas från denna skrift, vars innehåll härmed upptas i texten via referens. De mikropartiklar som erhålles medelst förfa- randet enligt föreliggande uppfinning är väl lämpade för dragering eller beläggning med hjälp av nämnda luftsus- pensionsteknik, och de erhållna belagda mikropartiklarna är synnerligen väl lämpade för parenteral administration.

Vid användning av de framställda mikropartiklarna, vare sig de är belagda med ett frisättningsreglerande yttre hölje eller ej, och speciellt för möjliggörande av injektion, suspenderas de torra mikropartiklarna i ett lämpligt medium. Sådana medier samt förfaranden i dessa avseenden är väl kända inom området och torde inte behöva beskrivas närmare här. Själva injektionen kan göras genom en lämplig kanyl eller med en kanylfri injektor. Det är också möjligt att injicera mikropartiklarna med hjälp av en torrpulverinjektor, utan att de dessförinnan resuspen- deras i ett injektionsmedium.

Förutom de fördelar som har omtalats ovan gäller att förfarandet enligt uppfinningen uppvisar den fördelen att utbytet av den biologiskt aktiva substansen generellt är högt, att det är möjligt att erhålla ett mycket högt in- nehåll av den aktiva substansen i mikropartiklarna under bibehållande av substansens bioaktivitet, att de erhållna mikropartiklarna har rätt storleksfördelning för använd- ning för parenteral, reglerad (t.ex. fördröjd eller för- längd) frisättning, då de är för stora för att fagocyte- ras av makrofager och tillräckligt små för att kunna in- jiceras genom små kanyler, t.ex. 23G-25G.

Förfarandet enligt uppfinningen är speciellt intres- sant i samband med proteiner, peptider, polypeptider, po- lynukleotider och polysackarider eller generellt andra läkemedel eller biologiskt aktiva substanser som är käns- liga för eller instabila i exempelvis organiska lösnings- medel. Rekombinant framställda proteiner är en mycket in- lO 15 20 25 30 35 1 f u. u n . , .. _ ::::'.: :Iﬁ I:cø .:.°~ L" < n a » H ,, , , , _ . f :_ : .I :oz : :; v -,- - -- . . . .n .n n n u n . . 21 tressant grupp av biologiskt aktiva substanser. Allmänt sett gäller dock att uppfinningen inte är begränsad till närvaro av sådana substanser, eftersom uppfinningsidén är tillämpbar på vilken som helst biologiskt aktiv substans, som kan användas för parenteral administration. Förutom i samband med känslighets- eller instabilitetsproblem kan uppfinningen sålunda också vara av speciellt intresse i sådana fall där det annars skulle vara svårt att avlägsna lösningsmedel eller där toxikologiska eller andra miljö- mässiga problem skulle kunna uppträda.

Exempel på biologiskt aktiva substanser av ovan an- givet slag är tillväxthormon, erytropoietin, interferon (a,ß,y-typ), vaccin, epidermalt tillväxthormon, Faktor IV, V, VI, VII, VIII och IX, LHRH-analog, insulin, makro- fagkolonistimulerande faktor, granulocytkolonistimuleran- de faktor och interleukin.

Användbara biologiskt aktiva substanser av typ icke- proteinläkemedel kan väljas ur följande grupper: antiinflammatoriska me- Antitumörmedel, antibiotika, del, antihistaminer, sedativa medel, muskelavslappnande medel, antiepileptiska medel, antidepressionsmedel, anti- allergiska medel, bronkodilatatorer, kardiotoniska medel, antiarrytmimedel, vasodilatatorer, antidiabetiska medel, antikoagulerande medel, hemostatiska medel, narkotiska medel och steroider.

I samband med uppfinningen gäller att begreppet bi- onedbrytbar innebär att mikropartiklarna efter parenteral administration löses upp i kroppen till kroppsegna sub- stanser, i slutänden t.ex. mjölksyra. Bionedbrytbarheten kan bestämmas eller undersökas genom inkubation med lämp- ligt medium in vitro. Bionedbrytbarheten kan även under- sökas genom parenteral injicering av mikropartiklarna, t.ex. subkutant eller intramuskulärt, och histologisk un- dersökning av vävnaden som en funktion av tiden.

Bionedbrytbara mikropartiklar av t.ex. PLGA försvin- ner normalt från vävnaden inom några veckor eller måna- der. 10 15 20 25 30 35 nu-ny u nu . ~.oøou u Q c n n . . »-.no v nu ~ 1 0 n v no con a 518 007 22 Biokompatibiliteten kan också undersökas genom pa- renteral administration av mikropartiklarna, t.ex. subku- tant eller intramuskulärt, och histologisk utvärdering av vävnaden, varvid det är viktigt att beakta att den biolo- giskt aktiva substansen, som ofta är ett protein, i sig uppvisar förmåga att inducera t.ex. ett immunförsvar i det fall den administreras i en annan art. Exempelvis kan sålunda många rekombinant framställda mänskliga proteiner ge upphov till immunsvar i försöksdjur.

De mikropartiklar som framställs med förfarandet en- ligt uppfinningen är lämpade för parenteral administra- tion, företrädesvis via injektion, på ett däggdjur, spe- ciellt människa, och innehåller en biologiskt aktiv sub- stans.

Enligt en variant av förfarandet representeras de av mikropartiklar, vilka väsentligen består av parenteralt administrerbar bionedbrytbar polymer som matris, vilken innehåller den biologiskt aktiva substansen i väsentligen icke-kemiskt komplexbunden form och i form av fasta par- tiklar med en medelstorlek inom området 0,05-30pm.

Med medelstorlek menas härvid vanligtvis medeldiame- ter, àtminstone i fallet med sfäriska eller i huvudsak sfäriska partiklar. vid annan konfiguration avses gene- rellt medelvärde för största utbredning av partikeln i någon riktning.

Enligt en utföringsform av uppfinningen gäller här- vid att partiklarna av den biologiskt aktiva substansen är erhållna genom utfällning, dvs föreligger i utfälld form.

De fasta partiklarna har företrädesvis en medelstor- lek inom området 0,2-10um, ännu hellre 0,5-Spm och allra helst 1-4pm.

Den bionedbrytbara polymeren är företrädesvis en homo- eller sampolymer innehållande alfa-hydroxisyra- enheter. Nämnda alfa-hydroxisyra är företrädesvis mjölk- syra och/eller glykolsyra. lO l5 20 25 30 35 u a a n - av o n 518 007 o 23 Företrädesvis uppvisar också mikropartiklarna ett frisättningsreglerande hölje av det slag som har omtalats ovan. En intressant utföringsform representeras av det fall då det frisättningsreglerande höljet har annan poly- mersammansättning än matrisen.

Andra mikropartiklar som kan framställas enligt upp- finningen är sådana, vari den biologiskt aktiva substan- sens bioaktivitet är minst 80%, företrädesvis minst 90% och helst väsentligen bibehållen, jämfört med den bioak- tivitet som substansen uppvisade innan den införlivades i polymeren.

Ytterligare andra är sådana som är bionedbrytbara och elimineras från vävnad efter subkutan eller intramus- kulär administration. Den biologiskt aktiva substansen är företrädesvis ett protein och ännu hellre ett rekombinant framställt protein.

Proteinet är företrädesvis valt bland tillväxthormo- ner, kolonistimulerande faktorer, erytropoietiner, inter- feroner och vaxiner.

Allra helst är proteinet ett tillväxthormon, speci- ellt ett humant tillväxthormon (hGH).

Att den biologiskt aktiva substansen i polymermatri- sen föreligger i väsentligen icke-kemiskt komplexbunden form innebär generellt att molförhållandet totala metall- katjoner: biologiskt aktiv substans är mindre än 0,2:1.

Enligt den kända tekniken är det i första hand zink som har utnyttjats för komplexbindning i liknande samman- hang. Mikropartiklarna enligt uppfinningen uppvisar så- lunda den fördelen att de väsentligen eller helt saknar sådan zink. Ännu hellre är ovannämnda molförhållande metallkajo- ner: biologiskt aktiv substans mindre än O,1:l, speciellt mindre än 0,0l:l och allra helst naturligtvis så nära 0 som möjligt.

I det fall det är fråga om ett humant tillväxthormon som biologiskt aktiv substans gäller att detta företrä- desvis är ett sådant, vars innehåll av dimerer är mindre 10 15 20 25 30 35 24 än 2 vikt-%, företrädesvis mindre än 1 vikt-% och av po- lymerer är mindre än 0,2 vikt-%, företrädesvis mindre än 0,1 vikt-%.

Mikropartiklar vilka bildar en parenteralt admini- strerbar, bionedbrytbar mikropartikelberedning innehål- lande en biologiskt aktiv substans, vilken under de för- sta 24 timmarna efter injektion uppvisar en frisättning av den aktiva substansen som är mindre än 30% av den to- tala frisättningen, bestämt ur en koncentration-tid-kurva i form av förhållandet mellan area under kurvan under nämnda första 24 timmar och total area under ifrågavaran- de kurva.

Företrädesvis gäller att frisättningen under de för- sta 24 timmarna efter injektionen är mindre än 20%, före- trädesvis mindre än 15%, ännu hellre mindre än 10% och allra helst mindre än 5%, av den totala frisättningen.

Mikropartiklar vilka ger en mikropartikelberedning av ovan nämnda typ, vilken under de första 48 timmarna efter injektion uppvisar en frisättning av den aktiva substansen där den maximala koncentrationen i plasma el- ler serum är mindre än 300% av den maximala koncentratio- nen av den biologiskt aktiva substansen under någon tid- punkt överstigande 48 timmar efter injektion.

Nämnda maximala koncentration är företrädesvis mind- re än 200% och ännu hellre mindre än 100% av ifrågavaran- de maximala koncentration.> Ett annat exempel är en mikropartikelberedning av ovan nämnt slag, vilken uppvisar en frisättning av den biologiskt aktiva substansen där biotillgängligheten av nämnda substans är minst 35% av den biotillgänglighet som erhålles när ifrågavarande substans injiceras intravenöst i löslig form.

Nämnda biotillgänglighet är företrädesvis minst 45%, ännu hellre minst 50%, av den biotillgänglighet som er- hàlles när den biologiskt aktiva substansen injiceras intravenöst. 10 15 20 25 30 35 -uo u. 518 007 25 Ytterligare ett exempel är en mikropartikelberedning av nämnt slag, vilken uppvisar en frisättning av den ak- tiva substansen karakteriserad av att i den frisättning som sker under vilken som helst sammanhängande sjudagars- period är kvoten mellan den högsta koncentrationen av den biologiskt aktiva substansen i serum eller plasma divide- rat med medelkoncentrationen under nämnda sjudagarsperiod mindre än 5, förutsatt att den valda sjudagarsperioden inte inkluderar de första 24 timmarna efter injektion.

Nämnda frisättning är företrädesvis mindre än 4 gånger, ännu hellre mindre än 3 gånger och allra helst mindre än 2 gånger.

En annan mikropartikelberedning som kan erhållas me- delst mikropartiklarna enligt uppfinningen uppvisar en frisättning av den biologiskt aktiva substansen där me- deluppehållstiden för ifrågavarande substans är minst 4 dagar.

Företrädesvis är nämnda medeluppehàllstid minst 7 dagar, ännu hellre minst 9 dagar, t.ex. minst ll dagar eller speciellt minst 13 dagar.

De särdrag som har angivits för de ovan presenterade mikropartikelberedningarna kan kombineras i vilka som helst lämpliga kombinationer.

För de olika karakteristika som har angivits för mikropartikelberedningen ovan gäller mera specifikt att det primärt rör sig om begreppen MRT, burst och biotill- gänglighet.

Dessa kan definieras enligt följande MRT Ett mål med beredningar för kontrollerad frisättning är att få en förlängd frisättning av det aktiva materia- let. Ett mått man kan använda för att kvantifiera fri- sättningstiden är medeluppehållstid eller ”mean resi- (MRT) farmakokinetik. dence time” som är det vedertagna begreppet inom 10 15 20 25 30 u v - . . u .a n n..- ufo o» 518 007 26 MRT är genomsnittstiden som molekylerna som intro- ducerats i kroppen uppehàller sig i kroppen. (Clinical Pharmacokinetics. Concepts and Applications. Malcolm Rowland and Thomas N. Tozer. 2“d ed. Lea&Febiger, Phila- delphia London) MRT-värdet kan beräknas från plasmakoncentrationsda- ta genom följande formel. 00 j :Cdr MRT = ° CD I Cd: 0 där C är plasmakoncentrationen och t är tiden Burst Ett vanligt problem med beredningar för kontrollerad frisättning för parenteralt bruk är att det omedelbart efter administrering i kroppen frisätts en stor del av läkemedlet under tidig fas. Detta kallas inom facklitte- raturen för ”burst-effect" Detta beror oftast pà att lä- kemedlet befinner sig pà ytan av formuleringen eller att formuleringen(som kan bestå av mikropartiklar) spricker upp. En läg bursteffekt är mycket önskvärd eftersom en hög koncentration av läkemedlet kan vara toxisk och dess- utom utnyttjas den del som försvinner snabbt första ti- den dåligt, vilket innebär att mer läkemedel krävs för att upprätthålla en terapeutiskt nivå av läkemedlet under den avsedda behandlingstiden.

Burst definieras som den andel av läkemedlet som ab- sorberas under de första 24 timmarna av den totala ande- len som absorberas.

Matematiskt kan man definiera det med hjälp av ”area under kurva”-beräkningar från plasmakoncentrationskurvor. z4h j Cd: of -1oo% [Cdr 0 Burst = 10 15 20 25 30 35 q ø - . .- 27 Biotillgänglighet Biotillgänglighet är ett mått på hur stor del av det tillförda läkemedlet som absorberas från administrations- stället till blodet i aktiv form. Biotillgänglighet jäm- förs ofta med data fràn intravenös tillförsel av läkemed- let, där man således inte har några absorptionsbarriärer, och kallas då för absolut biotillgänglighet, Absolut biotillgänglighet definieras enligt följande formel: F = 'Div Dx-ALKQV där AUC xär area-under-kurvan värdet för den undersökta formuleringen, AUCiv är area-under-kurvan värdet för en intravenös tillförsel av läkemedlet, DX är dosen av läke- medlet i formuleringen och Dm är den intravenösa dosen.

Bestämningen av frisättningsprofilen och de farmako- kinetiska parametrarna görs företrädesvis genom djurför- sök. Den mest relevanta arten, på grund av sin likhet med människa, är gris. I de fall den biologiskt aktiva sub- stansen kan inducera ett immunsvar under testet som ris- kerar att páverka bestämningen av de farmakokinetiska pa- rametrarna för den biologiskt aktiva substansen bör häm- ning av immunsvaret användas, t.ex. genom läkemedelsbe- handling, vilket är känt inom teknikomràdet, och detaljer kan hämtas ur den vetenskapliga litteraturen, till exem- (l999) l-8) Andra intressanta mikropartiklar enligt uppfinningen pel Agersö et al, (J.Pharmacol Toxicol 41 är sådana som är bionedbrytbara in vitro i närvaro av alfa-amylas och/eller amyloglukosidas.

Ytterligare föredragna mikropartiklar är sådana som är bionedbrytbara och elimineras från vävnad efter subku- tan eller intramuskulär administration.

Vad beträffar bestämningen av den biologiska aktivi- teten för mikropartiklarna innehållande aktiv substans gäller att denna får ske på ett för varje enskild biolo- 10 15 20 25 30 35 518 007 28 gisk substans lämpligt sätt. I de fall bestämningen sker i form av djurförsök, injiceras en viss mängd av den bio- logiskt aktiva substansen införlivad i mikropartiklarna, eventuellt efter upplösning av dessa mikropartiklar under milda betingelser i förväg och det biologiska svaret jäm- förs med det svar som erhålles efter injektion av motsva- rande mängd av samma biologiskt aktiva substans i en lämplig lösning. I de fall utvärderingen sker in vitro, t ex i provrör eller i cellkultur, görs den biologiskt ak- tiva substansen helst helt tillgänglig före utvärderingen genom upplösning av mikropartiklarna enzymatiskt under milda betingelser, varefter aktiviteten bestäms och jäm- förs med aktiviteten för en kontrollösning med samma kon- centration av ifrågavarande biologiskt aktiva substans. I alla händelser gäller att utvärderingen skall innefatta eventuella ospecifika effekter av mikropartiklarnas ned- brytningsprodukter.

EXEMPEL Uppfinningen kommer nu att belysas ytterligare genom nedanstående icke-begränsande utföringsexempel.

Exempel 1 Procedur för framställning av högkoncentrerat/utfällt hGH lämpligt för immobilisering med PEG.

Till 343 mg hGH sättes 10 mM natriumfosfatbuffert, pH 6,4, till en total volym pà 2,5 ml. PEG med en medel- molekylvikt pä 20000 D löses i samma buffert till en kon- centration av 30% under justering av pH till ca 6,4. PEG- lösningen (25 ml) hålls i en bägare med en propeller, varefter temperaturen justeras till 15°C och hGH- lösningen (ca 1,25 ml) tillsätts under propelleromrörning och blandningen fär stà i 75 min under fortsatt omrör- ning. Den erhållna suspensionen centrifugeras i en Sor- vall SS34 (20 min vid 5000 rpm). Supernatanten sugs av noggrant. Det utfällda proteinet kan tvättas en gäng med 10 15 20 25 30 35 . . Q . .a 518 007 29 Na-acetat pH 6,4 innehållande 2 mM zinkacetat (10 ml) och den erhållna supernatanten sugs av.

Exempel 2 Procedur för inkapsling av PEG- koncentrerat/solidifierat hGH i PLGA (poly(DL-laktid- samglykolid).

Först framställs en polymerlösning genom upplösning av 0.46 g PLGA (RG504H, Boehringer Ingelheim) i 3 ml etyl- acetat i ett teströr. Därefter sättes 44 mg PEG- koncentrerat/solidifierad hGH framställt enligt Exempel 1 till polymerlösningen och dispergeras homogent i polymer- lösningen genom virvelblandning (VF2, IKA-WERK) under en minut. Dispersionen placeras i en 5 ml spruta med en 18 G nål.

En 500 ml bägare innehållande 300 ml av 40% (vikt/vikt) polyetylenglykol 20000 förses med en propel- leromrörare med 4 blad. BSA/polymerdispersionen överförs till bägaren därigenom att den långsamt insprutas i PEG- lösningen. Omrörarhastigheten reduceras därefter och blandningen lämnas att stå över natten.

Omrörarhastigheten ställs på nytt på 8, och därefter tillsätts 400 ml avjoniserat vatten så att viskositeten reduceras i syfte att möjliggöra filtrering. Suspensionen filtreras sedan under användning av ett Millipore- membranfilter, typ DV, porstorlek 0,65 pm, tvättas med (3 x 300 ml) De resulterande mikropartiklarna utsätts därefter vatten och torkas i vacuum över natten. för ett försök avseende frisättning in vitro i 30 mM na- triumfosfat pH 7,4 vid 37°C med intermittent omrörning.

Studierna utförs genom suspendering av 40 mg mikrosfärer i 1,5 ml buffert. Vid speciella tidpunkter uttas l ml av ifrågavarande buffert och ersätts med färsk buffert. Re- sultaten visar att proteinets frisättning är fördröjd un- der flera veckor. 10 15 20 25 30 u o nu: u» 51 s 007 30 Exempel 3 Procedur för dragering av mikrosfärer innehållande PEG- koncentrerat hGH.

De erhållna hGH-innehållande mikrosfärerna från Ex- empel 2 beläggs med ett frisättningsreglerande hölje av PLGA medelst luftsuspensionsteknik i enlighet med WO97/14408 med användande av en blandning bestående av 75% av RG502H och 25% av RG756 Efter drageringen löses drageringen upp med en (båda fràn Boehringer Ing- elheim). blandning av metylenklorid och aceton i förhållandet 1:3 ge- In- och efter borttvättande av dessa lösningsmedel, t.ex. nom upprepad centrifugering, löses mikrosfärerna upp. nehàllet av hGH bestäms, t.ex. genom analys med hög- trycksvätskekromatografi. Innehållet av dimerer och poly- mer av proteinet bestäms också med samma teknik. Innehål- let av protein kan vara kring ll viktprocent. Den andel av proteinet som föreligger i form av dimerer är <2% och av polymer dragerade mikrosfärerna kan bestämmas in vitro och karak- teriseras av frànvaro av en oönskad burst och i övrigt av en kontinuerlig och jämn frisättning med en duration av kring en vecka. Med detta förfarande kan sàledes parente- ralt administrerbara mikrosfärer lämpliga för kontrolle- rad frisättning av hGH framställas.

Exempel 4 Procedur för framställning av högkoncentre- rat/utfällt hGH lämpligt för immobilisering med använd- ning av PEG.

Utfällt hGH framställs enligt Exempel 1 med den änd- ringen att fällningen tvättas i histidinbuffert, pH 4,9.

Claims

10 15 20 25 30 35 w a » nu n n ~n-cu o o -a ~ 518 007 31 PATENTKRAV

1. Förfarande för framställning av parenteralt admi- nistrerbara mikropartiklar innehållande en biologiskt ak- tiv substans, vilket innefattar att man a)bereder en vattenbaserad lösning av den biologiskt ak- tiva substans som ska införlivas i mikropartiklarna, erhållna lösningen med en vat- (PEG) under så- dana betingelser att den biologiskt aktiva substansen b)blandar den i steg a) tenbaserad lösning av polyetylenglykol koncentreras och/eller solidifieras, c) eventuellt tvättar den i steg b) erhållna koncentrera- de och/eller solidifierade biologiskt aktiva substan- sen, d) blandar den i steg b) och/eller solidifierade biologiskt aktiva substansen eller c) erhållna koncentrerade med en lösning av en bionedbrytbar polymer i ett orga- niskt lösningsmedel, e) blandar den i steg d) erhållna kompositionen med en vattenbaserad lösning av en polymer med förmåga att bilda en emulsion, så att det bildas en emulsion med droppar av den bionedbrytbara polymeren, vilka inne- håller den biologiskt aktiva substansen som inre fas i en yttre fas av nämnda polymerlösning, f) bringar eller tillåter de i steg e) erhållna dropparna att solidifieras till mikropartiklar, g) torkar mikropartiklarna från steg f), och h) eventuellt applicerar ett frisàttningsreglerande hölje av en biokompatibel och bionedbrytbar polymer på de torkade mikropartiklarna från steg f).

2. Förfarande enligt krav 1, vari steg b) utföres så att solidifieringen av den biologiskt aktiva substansen leder till utfällning av densamma.

3. Förfarande enligt krav 1, vari steg b) utföres så att solidifieringen av den biologiskt aktiva substansen leder till en högviskös lösning, vilken uppvisar förmåga att bilda vid rumstemperatur hanterbara droppar. 10 15 20 25 30 35 518 007 32

4. Förfarande enligt krav 2 eller 3, vari steg b) utföres till en reversibelt solidifierad aktiv substans.

5. Förfarande enligt något av kraven 2-4, vari den solidifierade biologiskt aktiva substansen bildar en pel- let eller en högviskös eller fast bottenfas vid centrifu- gering eller ultracentrifugering.

6. Förfarande enligt något av de föregående kraven, vari polymeren är en homo- eller sampolymer innehållande alfa-hydroxisyraenheter.

7. Förfarande enligt krav 6, vari alfa-hydroxisyran är mjölksyra och/eller glykolsyra.

8. Förfarande enligt något av de föregående kraven, vari man i steg d) utnyttjar en biokompatibel och bi- onedbrytbar polymer med en medelmolekylvikt inom inter- vallet 2-200 kDa, företrädesvis 2-110 kDa.

9. Förfarande enligt något av de föregående kraven, vari man i steg d) bildar en komposition vari viktförhål- landet mellan polymer och biologiskt aktiv substans lig- ger inom området fràn 3:1 till 10 OO0:1.

10. Förfarande enligt något av de föregående kraven, vari man i steg e) sätter polymerlösningen till komposi- tionen i minst två steg, där minst en av tillsatserna sker efter det att emulsionen har börjat skapas.

11. Förfarande enligt något av de föregående kraven, vari man i steg e) som vattenbaserad polymer använder en vattenbaserad lösning av polyetylenglykol.

12. Förfarande enligt krav 11, vari polyetylenglyko- len har en medelmolekylvikt av 1-40 kDa, företrädesvis 5- 35 kDa.

13. Förfarande enligt något av de föregående kraven, vari man i steg e) bildar polymerdroppar vilka ger den för mikropartiklarna önskade storleken, företrädesvis en medelpartikeldiameter, i torrt tillstånd, inom interval- let 10-200 pm, företrädesvis 20-100um, ännu hellre 20- 800m.

14. Förfarande enligt krav 13, vari man efter steg e) tvättar mikropartiklarna, genom filtrering, och even- 10 15 20 * 518 007 \ a 33 tuellt siktar dem för erhållande av önskad partikelstor- leksfördelning.

15. Förfarande enligt något av de föregående kraven, vari torkningen i steg g) utföres i form av spraytork- ning, frystorkning eller vakuumtorkning, företrädesvis frystorkning.

16. Förfarande enligt något av de föregående kraven, vari man som biologiskt aktiv substans införlivar en sub- stans vald ur den grupp som består av proteiner, pepti- der, polypeptider, polynukleotider och polysackarider, speciellt rekombinant framställda proteiner.

17. Förfarande enligt något av de föregående kraven, vari appliceringen av det frisättningsreglerande höljet i steg h) utföres medelst luftsuspensionsteknik.

18. Förfarande enligt något av de föregående kraven, vari det frisättningsreglerande höljet i steg h) bildas av en homo- eller sampolymer innehållande alfa- hydroxisyraenheter.

19. Förfarande enligt krav 18, vari alfa- hydroxisyran är mjölksyra och/eller glykolsyra.