SE518008C2 - Parenteralt administrerbara mikropartiklar och förfarande för framställning av desamma - Google Patents

Description

»anno lO 15 20 25 30 35 51 ß ons 2 dessa polymerer också att gå under benämningen PLGA. PLGA bryts ned via esterhydrolys till mjölksyra och glykolsyra och har visat sig besitta utmärkt biokompatibilitet. Den ofarliga naturen hos PLGA kan dessutom exemplifieras av att åtskilliga parenterala beredningar för fördröjd fri- sättning baserade på dessa polymerer har godkänts av myn- digheter, däribland US Food and Drug Administration.

Parenteralt administrerbara produkter för fördröjd frisättning på marknaden idag baserade på PLGA innefattar Decapeptylm (Ibsen Biotech), Prostap SRW (Lederle), De- capeptyl® Depot (Ferring) och Zoladex® (Zeneca). Läke- medlen i dessa beredningar är alla peptider. Med andra ord består de av aminosyror kondenserade till en polymer med relativt låg polymerisationsgrad och de uppvisar ej någon väldefinierad tredimensionell struktur. Detta möj- liggör i sin tur vanligtvis användning av förhållandevis stränga betingelser under framställningen av dessa pro- dukter. Exempelvis kan strängsprutning och efterföljande storleksreducering utnyttjas, vilka tekniker inte torde vara tillåtna i samband med proteiner, eftersom dessa allmänt sett inte klarar så stränga betingelser.

Följaktligen föreligger det också behov av bered- ningar med reglerad frisättning för proteiner. Proteiner liknar peptider därigenom att de också består av aminosy- ror, men molekylerna är större och flertalet proteiner är beroende av en väldefinierad tredimensionell struktur vad beträffar många av sina egenskaper, däribland biologisk aktivitet och immunogenicitet. Deras tredimensionella struktur kan förstöras relativt lätt, t.ex. av höga tem- peraturer, ytinducerad denaturering samt i många fall ex- ponering för organiska lösningsmedel. En mycket allvarlig nackdel i samband med användning av PLGA, som är ett ut- märkt material i sig, för fördröjd frisättning av protei- ner är därför behovet av användning av organiska lös- ningsmedel för upplösning av nämnda PLGA, med åtföljande risk för att proteinets stabilitet påverkas negativt och att konformationsförändringar hos proteinet leder till en :s,nu 10 15 20 25 30 35 518 ons 3 immunologisk reaktion hos patienten, vilket kan ge bàde en förlust av den terapeutiska effekten genom bildning av hämmande antikroppar och toxiska biverkningar. Dà det är synnerligen svårt att med säkerhet avgöra om ett komplext protein i alla delar har bibehàllit sin tredimensionella struktur, är det av stor vikt att undvika att utsätta proteinet för betingelser som kan tänkas inducera konfor- mationsförändringar.

Trots stora ansträngningar i syfte att modifiera PLGA-teknologin för undvikande av detta inneboende pro- blem med proteininstabilitet under framställningsförfa- randet har utvecklingen inom detta omrâde gàtt mycket långsamt, och huvudanledningen till detta är sannolikt att de tredimensionella strukturerna för flertalet prote- iner är alltför känsliga för att motstå de använda till- verkningsbetingelserna och den kemiskt sura miljö som bildas vid nedbrytningen av PLGA-matriser. Den vetenskap- liga litteraturen innehåller ett flertal beskrivningar av stabilitetsproblem vid tillverkningen av mikrosfärer av PLGA pà grund av exponeringen för organiska lösningsme- del. Som ett exempel pà den sura miljö som bildas vid nedbrytningen av PLGA-matriser har det nyligen visats att pH-värdet i en PLGA-mikrosfär med en diameter pà cirka 40 pm visats sjunka till 1,5, vilket är fullt tillräckligt för att denaturera, eller pà annat sätt skada, många te- rapeutiskt användbara proteiner (Fu et al, Visual Eviden- ce of Acidic Environment Within Degrading Poly(lactic-co- glycolic acid) (PLGA) Microspheres. Pharmaceutical Rese- arch, Vol. 17, NO 1, 2000, 100-106). I det fall mikrosfä- rerna har en större diameter kan pH-värdet förväntas sjunka ytterligare pà grund av att de sura nedbrytnings- produkterna då får svårare att diffundera bort och att den autokatalytiska reaktionen intensifieras.

Den för närvarande vanligast använda tekniken för inneslutning av vattenlösliga substanser, sàsom proteiner och peptider, är användning av multipelemulsionssystem.

Läkemedelssubstansen löses i en vatten- eller buffertlös- :sn-n 10 15 20 25 30 35 518 008 4 ning och blandas därefter med ett med vatten oblandbart organiskt lösningsmedel innehållande den upplöste polyme- ren. En emulsion bildas vilken har vattenfasen som inre fas. Olika typer av emulgeringsmedel och kraftig ombland- ning utnyttjas ofta för skapande av denna första emul- sion. Denna emulsion överföres sedan, under omrörning, till en annan vätska, vanligtvis vatten, innehållande en annan polymer, t.ex. polyvinylalkohol, vilket ger en vat- ten/olja/vatten-trippelemulsion. Mikrosfärerna bringas därefter att hårdna eller härda på något sätt. Det vanli- gaste sättet är att utnyttja ett organiskt lösningsmedel med låg kokpunkt, typiskt diklormetan, och att avdriva lösningsmedlet. Om det organiska lösningsmedlet inte är helt oblandbart med vatten, kan en kontinuerlig extrak- tionsprocedur utnyttjas genom tillsats av mera vatten till trippelemulsionen. Ett antal variationer av denna allmänna procedur beskrivs också i litteraturen. I vissa fall blandas den primära emulsionen med en icke-vatten- baserad fas, t.ex. silikonolja. Fasta läkemedelsmaterial i stället för upplösta sådana kan också användas.

PLGA-mikrosfärer innehållande proteiner beskrivs i WO-Al-9013780, där huvudsärdraget är användning av mycket låga temperaturer under framställningen av mikrosfärerna i syfte att bevara hög biologisk aktivitet hos proteiner- na. Aktiviteten för inkapslat superoxiddismutas uppmättes men enbart på den del som frisattes från partiklarna.

Denna metod har använts för framställning av PLGA- mikrosfärer innehållande humant tillväxthormon i WO-Al- 9412158, varvid man dispergerar humant tillväxthormon i metylenklorid innehållande PLGA, sprayar den erhållna dispersionen i en behållare med frusen etanol med ett skikt av flytande kväve däröver i syfte att frysa de fina dropparna samt låter dessa sedimentera i kvävet på etano- len. Etanolen upptinas därefter och mikrosfärerna börjar sjunka i etanolen, där metylenkloriden extraheras i eta- nolen och mikrosfärerna bringas att hårdna. Med hjälp av denna metodik kan man bibehålla proteinstabiliteten bätt- 10 l5 20 25 30 35 518 008 5 re än vid flertalet andra processer för inneslutning av proteiner i PLGA-mikrosfärer, och nyligen har också en produkt blivit godkänd av registreringsmyndigheterna i USA. Det återstår emellertid fortfarande att entydigt pà- visa detta också för andra proteiner och problemet med exponering av det inneslutna biologiskt aktiva ämnet för ett mycket lågt pH under nedbrytningen av PLGA-matrisen kvarstår.

Vid de tidigare nämnda metoderna baserade på inkaps- ling med PLGA utsättes dock de aktiva substanserna för ett organiskt lösningsmedel, och detta är allmänt sett skadligt för stabiliteten hos ett protein. Dessutom är de omtalade emulsionsprocesserna komplicerade och sannolikt problematiska vid ett försök till uppskalning till in- dustriell skala. Vidare är många av de organiska lös- ningsmedel som utnyttjas vid mànga av dessa processer förknippade med miljömässiga problem, och deras höga af- finitet för PLGA-polymeren gör ett avlägsnande svårt.

Ett antal försök att lösa ovan beskrivna problem or- sakade av exponering av det biologiskt aktiva ämnet för en kemiskt sur miljö under bionedbrytningen av mikrosfär- matrisen och organiska lösningsmedel vid tillverknings- processen har beskrivits. För att undvika sur miljö under nedbrytningen har man försökt att byta ut PLGA som matris för mikrosfärerna mot en polymer som ger kemiskt neutrala nedbrytningsprodukter och för att undvika att utsätta det biologiskt aktiva ämnet för organiska lösningsmedel har man försökt att antingen tillverka mikrosfärerna i förväg och först efter upparbetning och torkning försökt ladda dem med det biologiskt aktiva ämnet, eller försökt ute- sluta eller begränsa det organiska lösningsmedlet under tillverkning av mikrosfärerna. Ett förfarande för att be- gränsa den använda mängden lösningsmedel vid användande av polymerer som endast kan lösas i organiska lösningsme- del beskrivs i WO 99/20253, vari begränsningen erhålls genom att en vattenbaserad PEG-lösning används för att bilda en emulsion. I denna skrift berörs inte någon tek- 10 15 20 25 30 35 518 008 6 nik för att koncentrera eller solidifiera den biologiskt aktiva substans som skall införlivas i mikropartiklarna.

Exempelvis har höggrenad stärkelse med relativt làg molvikt (maltodextrin, medelmolekylvikt ca 5000 Da) modi- fierats kovalent med akrylgrupper för överföring av denna stärkelse i en form som kan solidifieras till mikrosfärer och den erhållna polyakrylstärkelsen har överförts till partikulär form genom radikalpolymerisation i en emulsion med toluen/kloroform (4:l) som ytterfas (Characterization of Polyacryl Starch Microparticles as Carriers for Prote- ins and Drugs. Artursson et al, J Pharm Sci, 73, 1507- l5l3, rer, men tillverkningsbetingelserna utsätter det biolo- 1984). Proteiner kunde infàngas i dessa mikrosfä- giskt aktiva ämnet för både organiska lösningsmedel och höga skjuvkrafter vid tillverkningen av emulsionen. De erhållna mikrosfärerna löses upp enzymatiskt och pH kan förväntas bibehàllas neutralt. De erhållna mikrosfärerna är inte lämpliga för parenteral administration, speciellt upprepad sådan, av flera skäl. Allra väsentligast är den ofullständiga och mycket långsamma bionedbrytbarheten av både stärkelsematrisen (Biodegrable Microspheres IV. Fac- tors Affecting the Distribution and Degradation of Poly- acryl Starch Microparticles. Laakso et al, J Pharm Sci, 75, 962-967, 1986) tvärbinder stärkelsemolekylerna. Dessutom är dessa mik- och den syntetiska polymerkedja som rosfärer alltför smà, med en diameter <2 um, för att vara lämpliga för injektion i vävnaderna för förlängd frisätt- ning, då vävnadsmakrofager med lätthet kan fagocytera dem. Försök att höja nedbrytningshastigheten och graden av nedbrytning genom att införa en potentiellt bioned- brytbar estergrupp för att binda akrylgrupperna till den höggrenade stärkelsen ledde inte till avsett resultat och även dessa polyakrylstärkelsemikrosfärer bionedbröts alltför långsamt och ofullständigt under rimliga tidspe- rioder (BIODEGRADABLE MICROSPHERES: Some Properties of Polyacryl Starch Microparticles Prepared from Acrylic 10 15 20 25 30 35 518 008 7 acid Esterified Starch. Laakso and Sjöholm 1987 (76) pp 935-939. J Pharm Sci.).

Mikrosfärer av polyakryldextran har tillverkats i tvàfas-vattensystem (Stenekes et al, The Preparation of Dextran Microspheres in an All-Aqueous System: Effect of the Formulation Parameters on Particle Characteristics.

Pharmaceutical Research, Vol 15, No 4, 1998, 557-561 and Franssen och Hennink, A novel preparation method for po- lymeric microparticles without using organic solvents, Int J Pharm 168, 1-7, 1998). Med detta tillvägagångssätt undviker man att utsätta det biologiskt aktiva ämnet för organiska lösningsmedel men i övrigt får mikrosfärerna egenskaper motsvarande de egenskaper som har beskrivits för polyakrylstärkelsemikrosfärer ovan, vilket gör dem olämpliga för upprepad parenteral administration. Med tanke pà att människan inte har specifika dextrannedbry- tande enzymer bör nedbrytningshastigheten vara ännu lägre än för polyakrylstärkelsemikrosfärer. Användning av dex- tran är också förknippad med en viss risk för allvarliga allergiska reaktioner.

Tillverkning av stärkelsemikrosfärer med användning av icke kemiskt modifierad stärkelse med utnyttjande av en olja som ytterfas har beskrivits (US 4,713,249; Schrö- der, U., Crystallized carbohydrate spheres for slow rele- 1985 (112) 116-128; Schröder, U., Crystallized carbohydrate spheres as a slow ase and targeting. Methods Enzymol. release matrix for biologically active substances. Bioma- terials 5:100-104, 1984). dessa fall genom utfällning i aceton, vilket leder både Mikrosfärerna solidifieras i till att det biologiskt aktiva ämnet utsätts för ett or- ganiskt lösningsmedel och till att stärkelsens naturliga tendens att solidifieras genom fysikalisk tvärbindning inte utnyttjas under tillverkningsprocessen. Detta leder i sin tur till mikrosfärer med en inneboende instabilitet då stärkelsen efter resuspendering i vatten och vid expo- nering för kroppsvätskorna kommer att sträva efter att bilda sådana tvärbindingar. För att en vatten-i-olja 10 15 20 25 30 . . o ø n 518 008 8 emulsion skall erhàllas krävs höga skjuvkrafter och de mikrosfärer som bildas är alltför smà för att vara lämp- liga för parenteral förlängd frisättning.

I EP 213303 A2 beskrivs framställning av mikrosfärer av bland annat kemiskt omodifierad stärkelse i tvàfas- vat- tensystem, med utnyttjande av stärkelsens naturliga för- måga att solidifieras genom bildning av fysikaliska tvär- bindningar, och immobilisering av en substans i dessa mikrosfärer i syfte att undvika att exponera den biolo- giskt aktiva ämnet för organiska lösningsmedel. Den be- skrivna metodiken, i kombination med den stärkelsekvalité som definieras, ger inte upphov till fullständigt bioned- brytbara partiklar. De erhållna partiklarna är inte hel- ler lämpliga för injektion, framför allt för upprepade injektioner under längre tid, då den beskrivna stärkelse- kvalitén innehåller alltför höga mängder av främmande växtprotein. I motsats till vad som lärs ut av detta pa- tent har det nu också överraskande upptäckts att betyd- ligt bättre utbyte och högre laddning av den biologiskt aktiva molekylen kan erhållas om man använder betydligt högre koncentrationer av polymererna än vad som krävs för att bilda tvàfas-vattensystemet och detta leder också till fördelar vad gäller betingelserna för att erhålla stabila, icke aggregerade, mikrosfärer och deras stor- leksfördelning. De temperaturbehandlingar som beskrivs är inte användbara för känsliga makromolekyler och detsamma gäller upparbetningen som innefattar torkning med anting- en etanol eller aceton.

Alternativa metoder för att i tváfas-vattensystem I US 5 981 719 tillverkas mikropartiklar genom blandning av den biolo- tillverka mikrosfärer har beskrivits. giskt aktiva makromolekylen med en polymer vid ett pH nära den isoelektriska punkten för makromolekylen och stabilisering av mikrosfärerna genom tillförsel av ener- gi, företrädelsevis värme. Den lägsta andelen av makromo- lekyl, d.v.s. det biologiskt aktiva ämnet, i beredningen är 40% och detta är för de flesta applikationer för högt 10 15 20 25 30 35 518 nos 9 och leder till stor osäkerhet i den injicerade mängden aktiv substans då dosen av mikropartiklarna blir alltför làg. Även om tillverkningsmetoden beskrivs som mild och kapabel att bibehålla den biologiska aktiviteten av det infàngade biologiskt aktiva ämnet, stabiliseras mikropar- tiklarna genom värmning och i de angivna exemplen sker uppvärmning till minst 58°C i 30 min och i mänga fall till 70-90°C under motsvarande tid, vilket känsliga pro- teiner, vars biologiska aktivitet är beroende av en tre- dimensionell struktur, inte kan förväntas täla, och även i de fall proteinet skenbart har tält tillverkningspro- cessen föreligger en risk för smà, men ändock icke för- sumbara, förändringar i proteinets konformation. Som yt- terfas används alltid en kombination av tvà polymerer, oftast polyvinylpyrrolidon och PEG, vilket komplicerar tillverkningsförfarandet genom att bàda dessa substanser ska tvättas bort fràn mikrosfärerna pà ett reproducerbart och säkert sätt. De bildade mikropartiklarna är för smà (i exemplen anges värden under 0,1 pm i diameter) för att vara lämpliga för parenteral förlängd frisättning efter t.ex. subkutan injektion, dä makrofager, som är celler specialiserade på att fagocytera partiklar och som finns i vävnaderna, med lätthet förmàr att fagocytera mikrosfä- rer upp till 5-10, möjligen 20 pm, och de fagocyterade partiklarna lokaliseras intracellulärt i lysosomerna, där bàde partiklarna och den biologiskt aktiva substansen bryts ned, varvid den terapeutiska effekten gär förlorad.

Den mycket ringa partikelstorleken gör också upparbet- ningen av mikrosfärerna mer komplicerad, då önskvärda me- toder, inte kan användas. Motsvarande gäller för US 5 849 884.

I US 5 578 509 och EP 0 688 429 Bl beskrivs använd- ning av tvàfas-vattensystem för tillverkning av makromo- sàsom filtrering, lekylära mikropartikellösningar och kemisk eller termisk tvärbindning av de dehydrerade makromolekylerna till bildning av mikropartiklar. Det är i högsta grad icke önskvärt att kemiskt tvärbinda den biologiskt aktiva mak- .nare 10 15 20 25 30 518 oos 10 romolekylen, vare sig med sig själv eller med mikroparti- kelmatrisen, eftersom sådana kemiska modifieringar har flera allvarliga nackdelar, såsom reduktion av bioaktivi- teten av ett känsligt protein och risk för inducering av ett immunsvar mot de nya antigena determinanterna pà pro- teinet, vilket leder till ett behov av omfattande toxiko- logiska studier för att undersöka produktens säkerhet.

Mikropartiklar som tillverkats genom kemisk tvärbindning med glutaraldehyd är kända sedan tidigare och anses all- mänt olämpliga för upprepad administration parenteralt på människa. De mikropartiklar som beskrivs i US 5 578 509 lider generellt av samma nackdelar som beskrivits för US 5 981 719, med olämpliga tillverkningsbetingelser för känsliga proteiner, antingen genom att dessa utsätts för kemisk modifiering eller för skadliga temperaturer, och en mikropartikelstorleksfördelning som är för snäv för parenteral, förlängd frisättning och som komplicerar upp- arbetning av mikrosfärerna efter tillverkning.

I WO 97/14408 beskrivs användning av luftsuspen- sionsteknik för framställning av mikropartiklar för för- längd frisättning efter parenteral administration utan att det biologiskt aktiva ämnet exponeras för organiska lösningsmedel. Skriften ger emellertid ingen vägledning mot förfarandet enligt uppfinningen eller mot de nya mik- ropartiklar som kan erhållas därigenom.

I US 5 470 582 framställs en mikrosfär bestående av PLGA och innehållande en makromolekyl genom ett tvåstegs- förfarande, där själva mikrosfären tillverkas först med utnyttjande av organiska lösningsmedel och laddas med makromolekylen i ett senare steg, där det organiska lös- ningsmedlet redan har avlägsnats. Detta förfaringssätt leder till alltför lågt innehåll av det biologiskt aktiva ämnet, oftast 1-2%, och till att en mycket stor andel frisätts omedelbart efter injektion, vilket oftast är synnerligen olämpligt. Denna alltför snabba initiala fri- sättning är mycket hög redan vid en laddning av 1% och blir än mer uttalad vid högre innehåll av den aktiva sub- l0 15 20 25 30 35 n . . u n .n 51 s one ll stansen i mikrosfärerna. Vid nedbrytningen av PLGA-matri- sen sjunker pH till nivàer som oftast inte är acceptabla för känsliga makromolekyler.

Att stärkelse teoretiskt är ett mycket lämpligt, kanske till och med idealiskt, matrismaterial för mikro- partiklar har varit känt under läng tid eftersom stärkel- se inte behöver lösas i organiska lösningsmedel och har en naturlig tendens att solidifiera och eftersom det finns kroppsegna enzymer som kan bryta ned stärkelse till samt kroppsegna och neutrala ämnen, i slutänden glukos, att stärkelse, förmodligen pà grund av likheten med kroppseget glykogen, har visats vara icke immunogent.

Trots stora ansträngningar har emellertid stärkelse med egenskaper som möjliggör tillverkning av mikropartiklar lämpliga för parenteral användning och betingelser som möjliggör tillverkning av fullständigt bionedbrytbara mikropartiklar under milda betingelser som tillåter in- fängning av känsliga biologiskt aktiva substanser, såsom proteiner, ej beskrivits tidigare.

Stärkelsegranuler innehåller naturligt föroreningar, sàsom stärkelseproteiner, vilket gör dem olämpliga för injektion parenteralt. Vid oavsiktlig deponering av icke tillräckligt renad stärkelse, sàsom kan ske vid operatio- ner dà många typer av operationshandskar är pudrade med stabiliserade stärkelsegranuler, kan mycket allvarliga biverkningar uppkomma. Stärkelsegranuler i sig är inte heller lämpliga för upprepad parenteral administration av det skälet att de inte är fullständigt bionedbrytbara inom acceptabla tidsrymder.

Stärkelsemikrosfärer tillverkade av syrahydrolyserad och upprenad stärkelse har använts för parenteral admi- nistration pä människa. Mikrosfärerna tillverkades genom kemisk tvärbindning med epiklorhydrin under starkt alka- liska betingelser. Den kemiska modifiering som då erhölls av stärkelsen leder till en sänkning av bionedbrytbarhe- ten så att mikrosfärerna kan lösas upp fullständigt av kroppsegna enzymer, såsom a-amylas, men inte omvandlas 10 15 20 25 30 518 oos 12 fullständigt till glukos som slutprodukt. Varken till- verkningsmetoden eller de erhållna mikrosfärerna är lämp- liga för immobilisering av känsliga proteiner och sàsom framgår av kontrollförsöken är inte heller syrahydrolyse- rad stärkelse lämplig för framställning av vare sig full- ständigt biodegraderbara stärkelsemikrosfärer eller stär- kelsemikrosfärer innehållande en hög laddning av ett bio- säsom ett protein.

(HES) i höga doser till människa som en plasmaersättare. HES logiskt aktivt ämne, Hydroxietylstärkelse administreras parenteralt framställs genom att stärkelsegranuler frän stärkelse be- stående i stort uteslutande av höggrenat amylopektin, s.k. rolyseras för en minskning av molviktsfördelningen, och ”waxy maize”, eller vaxartad majsstärkelse, syrahyd- därefter hydroxietyleras under alkaliska betingelser samt syrahydrolyseras ytterligare en gäng för att en medelmol- vikt kring 200 000 Da skall uppnäs. Därefter utföres fil- trering, extraktion med aceton och spraytorkning. Hydrox- ietyleringens syfte är att förlänga effektens varaktig- het, dä icke modifierat amylopektin bryts ned mycket snabbt av a-amylas och dess uppehällstid i cirkulation är ca 10 minuter. HES är inte lämplig för framställning av fullständigt biodnedbrytbara mikrosfärer innehållande ett biologiskt aktivt ämne, eftersom den kemiska modifiering- en leder till en avsevärd sänkning i hastigheten för och fullständigheten i bionedbrytningen och till att stärkel- sens naturliga tendens att solidifieras genom bildande av icke kovalenta tvärbindningar eliminerats. Dessutom blir högkoncentrerade lösningar av HES alltför viskösa för att vara användbara för framställning av mikropartiklar. An- vändningen av HES i dessa höga doser visar att parente- ralt användbar stärkelse kan tillverkas, även om HES inte är användbar för tillverkning av mikrosfärer utan kemisk tvärbindning eller utfällning med organiska lösningsme- del.

I WO 99/00425 beskrivs användning av värmetäliga proteolytiska enzymer med brett pH-optimum för att rena - 10 15 20 25 30 Lu LT! 518 ons nosa 0 13 stärkelsegranuler från ytassocierade proteiner. De er- hållna granulerna är inte lämpliga för parenteral admi- nistration då de fortfarande innehåller de stärkelsepro- teiner som finns inuti granulerna och det finns risk för att rester av de tillsatta proteolytiska enzymerna finns kvar i granulerna. Granulerna är inte heller lämpliga för tillverkning av parenteralt administrerbara stärkelsemik- rosfärer i tvåfas-vattensystem, då de har fel molvikts- fördelning för att kunna användas i tillräckligt hög kon- centration, även efter upplösning, och i de fall mikro- sfärer kan erhållas är de troligtvis inte fullständigt biodnedbrytbara.

Användning av skjuvning för att modifiera molvikts- fördelningen av stärkelse, i syfte att få fram bättre stärkelse för framställning av tabletter, beskrivs i US 5,455,342. Den stärkelse som erhålls är inte lämplig för parenteral administration på grund av det höga innehållet av stärkelseproteiner, som eventuellt kan föreligga i de- naturerad form efter skjuvningen, och den erhållna stär- kelsen är inte heller lämplig för framställning av bio- nedbrytbara stärkelsemikrosfärer för parenteral administ- ration eller för användning i tvåfas-vattensystem för framställning av dylika stärkelsemikrosfärer.

Det är i många fall nödvändigt eller önskvärt att modifiera ett biologiskt aktivt ämne, t.ex. läkemedel från löslig till fast form, t.ex. för att förbättra dess stabilitet och/eller möjliggöra att på ett effektivt sätt framställa en formulering av ämnet ifråga. Till exempel kan det i en inneslutningsprocess som utnyttjar ett emul- sionsförfarande vara nödvändigt att använda en fast form av det biologiskt aktiva ämnet för att få en högre effek- tivitet genom undvikande av transport till den yttre fa- sen, eller gränsytan mellan yttre och inre fas, och för att bibehålla den biologiska aktiviteten av ämnet. För ämnen som tål stränga tillverkningsbetingelser kan strängsprutning och malning användas, men för känsliga biologiskt aktiva ämnen, såsom proteiner är det i de all- u v -.-«. -~ .- lO 15 20 25 30 b) Ul 518 008 14 ra flesta fall fràga om att erhålla den fasta formen ge- nom kemisk komplexbildning. Ett väl känt exempel pà sàdan läkemedelsberedning pà marknaden är kristallint insulin komplexbundet med zink.

Sålunda är det väl känt att för proteiner och pepti- der har komplexbindning med divalenta metalljoner, före- trädesvis zink, utnyttjats sedan länge för att överföra det biologiskt aktiva ämnet i fast form. Det finns dock ett flertal nackdelar med sådana processer. En nackdel är att det inte är möjligt att bilda användbara komplex av alla intressanta biologiskt aktiva ämnen och att många komplexbildare som används i forskningssammanhang inte är acceptabla för parenteral administration. En annan nack- del är den ofta komplicerade kemin som även i skenbart få kontrolle- är att regi- enkla fall kan kräva betydande insatser att rad och välkarakteriserad. En annan nackdel streringsmyndigheterna i vissa länder anser att även väl- kända och marknadsförda substanser efter dylik komplex- bildning är att anse som en ny kemisk substans, vilket leder till krav på extensiva och mycket dyrbara karakte- riseringar kemiskt, säkerhetsmässigt och kliniskt. Ytter- ligare nackdelar introduceras dà den aktiva substansen ska överföras i fast och torr form, då detta ofta invol- verar spraynings- och torkningsprocesser som är utrust- ningskrävande och i mànga fall kan vara komplexa. Mànga känsliga ämnen tál inte att utsättas för en luft/vatten- eller luft/organisk-vätskegränsyta eller för de skjuvk- rafter som krävs för att bilda spraydropparna. Det är inte heller ovanligt att problem med att dispergera eller resuspendera den i fast form överförda substansen efter torkningen inte leder till ett användbart resultat, t.ex. på grund av att dessa partiklar vidhäftar till varandra pá ett sådant sätt att de inte kan slàs isär med använ- dande av acceptabla betingelser. I flera av dessa proces- ser används organ ska lösningsmedel som riskerar att vara skadliga för känsliga biologiskt aktiva ämnen och perso- -v-v 10 15 20 25 30 35 . . Q ; »I 518 008 15 nal som kommer i kontakt med ämnena, samt har en negativ inverkan på miljön.

I US 5,654,0lO Och US 5,664,808 beskrivs framställ- ning av en fast form av rekombinant humant tillväxthor- mon, hGH, genom komplexbildning med zink för att skapa ett amorft komplex, som sedan mikroniseras genom ett ult- raljudsmunstycke och sprayas ner i flytande kväve för att frysa dropparna. Det flytande kvävet får sedan evaporera vid en temperatur på -80°C och det resulterande materia- let frystorkas. Förutom att processen är komplex och svår att applicera generellt så innefattar den en spraynings- process där det biologiskt aktiva ämnet utsätts för en vatten/luftyta och där den amorfa form av proteinet som bildas suspenderas i metylenklorid. Metylenklorid är ett i högsta grad oönskat organiskt lösningsmedel ur toxiko- logisk synpunkt, både för patienterna och arbetspersona- len.

Ett förfarande för framställning av parenteral admi- nistrerbara mikropartiklar med följande egenskaper skulle sålunda vara synnerliga önskvärt: 0 ett förfarande som gör det möjligt att infànga käns- liga biologiskt aktiva substanser i mikropartiklar med bibehållande av sin biologiska aktivitet; 0 ett förfarande medelst vilket men kan infànga biolo- giskt aktiva substanser under betingelser som inte utsätter dessa för organiska lösningsmedel, höga tem- peraturer eller höga skjuvkrafter och som medger att dessa bibehåller sin biologiska aktivitet; 0 ett förfarande som möjliggör hög laddning av en pa- renteralt administrerbar beredning med även känsliga biologiskt aktiva substanser. 0 ett förfarande medelst vilket man kan framställa en i huvudsak fullständigt bionedbrytbar och biokompatibel beredning som är lämplig att injicera parenteralt och vid vars nedbrytning kemiskt neutrala kroppsegna äm- nen bildas; |;»|| 10 15 20 25 30 35 518 008 16 ett förfarande medelst vilket man kan framställa en parenteralt injicerbar beredning med en storlek över- stigande 20 um och ännu hellre överstigande 30 um i syfte att undvika fagocytos av vävnadsmakrofager och förenkla upparbetning av densamma under tillverkning- en; ett förfarande för framställning av mikropartiklar innehållande en biologiskt aktiv substans, vilka kan användas som mellanprodukt vid framställning av en beredning för reglerad, förlängd eller fördröjd fri- sättning och som möjliggör rigorös kvalitetskontroll av den infàngade biologiska substansens kemiska sta- bilitet och biologiska aktivitet; ett förfarande som utnyttjar en parenteralt accepta- bel stärkelse som är lämplig för framställning av i huvudsak fullständigt bionedbrytbara stärkelsemikro- partiklar; ett förfarande som gör det möjligt att koncentrera eller solidifiera den biologiskt aktiva substans som ska införlivas i en parenteralt injicerbar beredning utan användning av kemisk komplexbildning; ett förfarande som gör det möjligt att koncentrera eller solidifiera den biologiskt aktiva substans som ska införlivas utan användning av kemisk komplexbild- ning och med bibehållande av substansens biologiska aktivitet; ett förfarande som gör det möjligt att koncentrera eller solidifiera den biologiskt aktiva substans som ska införlivas i en parenteralt administrerbar bered- ning utan att substansen utsätts för luft/vatten el- ler luft/organiskt lösningsmedelgränsytor. ett förfarande som gör det möjligt att koncentrera eller solidifiera den biologiskt aktiva substans som ska införlivas i en parenteralt administrerbar bered- ning utan användning av ett sprayningsförfarande el- ler torkningsförfarande; auuau 10 15 20 25 30 b) (_11 518 008 17 0 ett förfarande som gör det möjligt att undvika ett rekonstitutionssteg och/eller resuspenderingssteg av den biologiskt aktiva substansen fràn torrt tillstànd utan föregående stabilisering genom införlivande i mikropartiklar; 0 ett förfarande som gör det möjligt att koncentrera eller solidifiera den biologiskt aktiva substans som ska inkorporeras utan införande av ytterligare kemis- ka substanser vid utnyttjande av ett tvà-fas- vattensystem för tillverkning av mikropartiklar; 0 en i huvudsak fullständigt bionedbrytbar och biokom- patibel mikropartikulär beredning som är lämplig att injicera parenteralt och vid vars nedbrytning kemiskt neutrala kroppsegna ämnen bildas; 0 en mikropartikulär beredning innehållande en biolo- giskt aktiv substans och med en partikelstorleksför- delning som är lämplig för att drageras med hjälp av luftsuspensionsteknik samt med tillräckligt mekaniskt hàllfasthet för detta ändamål; 0 en dragerad mikropartikulär beredning innehållande en biologiskt aktiva substans, vilken beredning ger en kontrollerad frisättning efter parenteral administra- tion.

BESKRIVNING AV UPPFINNINGEN Enligt en första aspekt av föreliggande uppfinning tillhandahåller denna ett förfarande för framställning av mikropartiklar. Närmare bestämt är det fràga om fram- ställning av mikropartiklar som innehåller en biologiskt aktiv substans och som primärt är avsedda för parenteral administration av denna substans till ett däggdjur, spe- ciellt människa. I första hand är det fråga om framställ- ning av mikropartiklar avsedda för injektion. Eftersom mikropartiklarna i första hand är avsedda för injektion, är det företrädesvis fràga om framställning av partiklar med en medeldiameter inom intervallet 10-200 pm, vanligt- vis 20-100 um och speciellt 20-80 um. annu: 10 15 20 25 30 18 Uttrycket "mikropartiklar" används härvid i samband med uppfinningen som generell benämning för partiklar av viss storlek i enlighet med i och för sig känd teknik. En typ av mikropartiklar är sålunda mikrosfärer, vilka har i huvudsak sfärisk form, under det att begreppet mikropar- tikel generellt kan innefatta avvikelse från sådan ideal sfârisk form. Även det i och för sig kända begreppet mik- rokapsel faller inom uttrycket mikropartikel i enlighet med känd teknik.

Förfarandet enligt föreliggande uppfinning innefat- tar närmare bestämt att man a)bereder en vattenbaserad lösning av den biologiskt ak- tiva substans som ska införlivas i mikropartiklarna, b)blandar den i steg a) erhållna lösningen med en vat- tenbaserad lösning av polyetylenglykol (PEG) under så- dana betingelser att den biologiskt aktiva substansen koncentreras och/eller solidifieras, c)eventuellt tvättar den i steg b) erhållna koncentrera- de och/eller solidifierade biologiskt aktiva substan- sen, d)blandar den i steg b) eller c) erhållna koncentrerade och/eller solidifierade biologiskt aktiva substansen med en vattenbaserad stärkelselösning, e)blandar den i steg d) erhållna kompositionen med en vattenbaserad lösning av en polymer med förmåga att bilda ett tvåfas-vattensystem, så att det bildas en emulsion av stärkelsedroppar, vilka innehåller den bi- ologiskt aktiva substansen som inre fas i en yttre fas av nämnda polymerlösning, f)bringar eller tillåter de i steg e) erhållna stärkel- sedropparna att solidifieras till stärkelsemikropar- tiklar, g)torkar stärkelsemikropartiklarna från steg f), och In eventuellt applicerar ett frisättningsreglerande hölje av en biokompatibel och bionedbrytbar polymer pà de torkade stärkelsemikropartiklarna från steg f). 10 15 20 25 30 n . . » I l' 518 008 19 Även om det rent generellt är möjligt att införliva biologiskt aktiva substanser i mikropartiklar med hög ef- fektivitet dà den biologiskt aktiva substansen föreligger i löslig form under infàngningssteget, är det i vissa fall att föredraga att den biologiskt aktiva substansen överförs i fast form. Det kan till exempel röra sig om att ytterligare stabilisera den biologiskt aktiva sub- stansen under infàngningssteget, att öka utbytet eller laddningen ytterligare genom att överföra ämnet till en form som efter blandning med innerfasen (stärkelselös- ningen) ej kan fördelas ut i ytterfasen eller till gräns- ytan mellan inner- och ytterfas eller att överföra sub- stansen i en form som är sà inert som möjligt under till- verkningen av stärkelsemikropartiklarna, detta för att man exempelvis skall få förbättrade egenskaper vad avser storleksfördelningen av mikropartiklarna.

Det har sålunda mycket överraskande befunnits att PEG, som ofta används som polymer för att skapa den yttre fasen i ett tvàfas-vattensystem, också kan användas för att koncentrera och/eller solidifiera den biologiskt ak- tiva substans som ska infàngas, samt att detta kan utfö- ras under milda betingelser som kan bevara t.ex. ett pro- teins tredimensionella konformation och biologiska akti- vitet.

Detta förfarande har ett flertal fördelar jämfört med tidigare känd teknik. Grundläggande är att det inte är alla biologiskt aktiva ämnen som gär att komplexbinda kemiskt, t.ex. med zink, och det är inte alla komplexbil- dare som är acceptabla för parenteral administration. Det är för det första inte nödvändigt att komplexbinda den biologiskt aktiva substansen, företrädesvis ett protein eller en peptid, för att erhålla koncentrering- en/solidifieringen. Användningen av detta förfarande le- der för det andra ofta ocksà till bättre stabilitet under införlivandet i mikropartiklar jämfört med lösligt prote- in. Genom att förfarandet inte innefattar ett spraynings- eller torkningsförfarande innan den biologiskt aktiva 10 15 20 25 30 35 . . . - H 518 008 20 substansen införlivas i mikropartiklarna undviker man dessutom att utsätta den biologiskt aktiva substansen för (luft/vatten eller Vidare undviker man aggre- höga skjuvkrafter och för gränsytor luft/organiskt lösningsmedel). gering pà grund av elektrostatiska laddningar, något som är mycket vanligt förekommande för smà, torra partiklar.

Eventuella problem med vätning och resuspendering av ett torrt pulver av den biologiskt aktiva substansen kan ock- Rent generellt är vidare sprayningsförfaran- Inte heller är det så undvikas. den komplexa och svàrkontrollerade. nödvändigt att utnyttja processteg som nedfrysning och làngsam upptining för att överföra det biologiskt aktiva ämnet i torr form.

För steg a) av förfarandet enligt uppfinningen gäll- er att den vattenbaserade lösningen av den biologiskt ak- tiva substansen beredes medelst inom området väl kända metoder, vilka inte behöver beskrivas närmare här. Grund- läggande är dock naturligtvis att lösningen beredes under så milda betingelser, främst vad gäller temperatur och omrörning, att den biologiskt aktiva substansens bioakti- vitet bevaras. Ofta används dessutom inom området välkän- da, för parenteralt bruk acceptabla, buffertsubstanser för kontroll eller reglering av lösningens pH-värde. Vid behov kan dessutom också inom området välkända och för parenteralt bruk acceptabla ämnen användas för exempelvis justering av jonstyrka och osmolaritet. Den erhållna lös- ningen kan, när sà önskas, steriliseras medelst exempel- vis sterilfiltrering.

Genom användningen av den vattenbaserade lösningen av polyetylenglykol i steget b) kan en koncentrering av den biologiskt aktiva substansen, t.ex. ett protein, er- hàllas. Denna koncentrering resulterar ofta i att den bi- dvs bildar en fäll- ning, och att det därigenom bildas solida eller fasta ologiskt aktiva substansen faller ut, partiklar. Detta kan exempelvis påvisas med hjälp av ljusmikroskopisk undersökning. Dä processen ofta genomfö- res snabbt, är partiklarnas struktur oftast amorf. Även »ßpua 10 15 20 25 30 35 21 andra former av partiklar, t.ex. kristaller och underkylt glas, innefattas emellertid i uppfinningen, beroende på hur processen genomföres.

I begreppet koncentreras ligger emellertid också det fall då den biologiskt aktiva substansen inte faller ut utan enbart bildar en mer eller mindre högviskös lösning.

Inom begreppet solidifieras ligger sålunda även det fall då en sådan högviskös lösning bildar så stabila droppar att den i praktiken kan hanteras och införlivas i mikro- partiklar på i huvudsak samma sätt som om den vore en fällning. Den koncentrerade/solidifierade biologiskt ak- tiva substansen kan återfinnas i mikropartikelmatrisen i form av öar eller diskreta partiklar.

En utföringsform av förfarandet enligt uppfinningen representeras sålunda av det fall då steg b) utföres så att solidifieringen av den biologiskt aktiva substansen leder till utfällning av densamma.

En annan utföringsform innebär att steg b) utföres så att solidifieringen av den biologiskt aktiva substan- sen leder till en högviskös lösning, vilken uppvisar för- måga att bilda vid rumstemperatur hanterbara droppar.

Ytterligare en utföringsform av förfarandet innebär att steg b) utföres till en reversibelt solidifierad ak- tiv substans. Ännu en utföringsform av förfarandet innebär att den solidifierade biologiskt aktiva substansen bildar en pel- let eller en högviskös eller fast bottenfas vid centrifu- gering eller ultracentrifugering.

Med reversibelt solidifierad menas generellt att ifrågavarande biologiskt aktiva substans vid upplösning, i för varje unik biologiskt aktiv substans lämpligt medi- um och under lämpliga betingelser, och/eller vid frisätt- ning från mikropartiklarna in vitro och/eller in vivo återfås i väsentligen samma form, såväl kemiskt som bio- logiskt, som den hade före koncentrering- en/solidifieringen med polyetylenglykol. 10 15 20 25 30 35 u uno nu 518 nos 22 Att den solidifierade biologiskt aktiva substansen bildar en pellet eller en högviskös eller fast bottenfas vid centrifugering eller ultracentrifugering är ett sätt för pàvisande av den önskade koncentrering- en/solidifieringen. Detta innebär dessutom att substansen ifråga föreligger i annan fysikalisk form än den lösliga form som föreligger i steg a) efter beredningen av den vattenbaserade lösningen.

Att den biologiskt aktiva substansen föreligger i koncentrerad form innebär generellt att den föreligger i en koncentration som överstiger den koncentration, vilken kan erhållas vid upplösning av substansen ifråga i ett vattenhaltigt medium, med eller utan stabilisatorer och löslighetsbefrämjande ämnen, och under bibehållande av biologisk aktivitet och kemisk stabilitet.

Huruvida steg c) av förfarandet enligt uppfinningen behöver utföras eller ej, dvs om den erhållna koncentre- rade och/eller solidifierade aktiva substansen skall tvättas, och i så fall i vilken omfattning, får avgöras i varje enskilt fall och beror bl.a. på hur stor andel av den biologiskt aktiva substansen som föreligger i löst form i PEG-lösningen, om den lösta substansen är till- räckligt stabil i denna form för att kunna införlivas i mikropartiklarna utan att alltför stor mängd oönskade nedbrytningsprodukter bildas, vilken effekt denna lösta substans har på tillverkningen av mikropartiklarna, om man önskar använda andra betingelser, t.ex. vad gäller koncentration av och medelmolekylvikt för PEG, samt pH och jonstyrka, än vad som användes i steg b), om PEG ut- gör en stabilisator för den biologiskt aktiva substansen i sig eller genom att bibehålla substansen i olöst form eller förhindra adsorption till ytor.

Själva tvättningen av den koncentrerade och/eller solidifierade aktiva substansen kan ske medelst inom det- ta teknikområde etablerade lämpliga tekniker. I den allra enklaste formen kan centrifugeringstvättar användas, och i många fall är även filtrering användbar. I det senare lO 15 20 25 30 23 fallet används företrädesvis betingelser under vilka den koncentrerade och/eller solidifierade aktiva substansen inte tillåts torka, då detta kan leda till exempelvis klumpbildning, och tiden för processen förkortas genom applicering av tryck. Fundamentalt är givetvis att den vätska som används inte får lösa upp den koncentrerade och/eller solidifierade aktiva substansen, och vilka be- tingelser som är lämpliga får avgöras för varje enskild biologiskt aktiv substans. I många fall kan sådana be- tingelser väljas vad avser buffertsammansättning, till- satsämnen och temperaturer att detta krav uppfylls, och nödvändig information kan fås från litteraturen eller via enkla experiment. Naturligtvis kan tillsats av polymerer användas för undvikande av upplösning av den koncentrera- de och/eller solidifierade aktiva substansen, och i det allra enklaste fallet används samma sammansättning på PEG-lösningen som då koncentreringen/solidifieringen genomfördes.

En stärkelse som är speciellt lämplig i samband med förfarandet enligt uppfinningen, liksom ett förfarande för framställning av denna, finns noggrant beskriven i den svenska patentansökningen med inlämningsdag 2000-10- 06 och med titeln "Farmaceutisk acceptabel stärkelse".

Detaljer avseende stärkelsen och dess framställning kan med andra ord hämtas från nämnda svenska patentansökan, vars innehåll i detta avseende sålunda härmed upptas i föreliggande text via referens.

De viktigaste särdragen för sådan stärkelse kommer emellertid att beskrivas nedan. För att fullständigt bionedbrytbara mikropartiklar med högt utbyte av den ak- tiva substansen skall bildas i ett tvåfas-vattensystem och för att de erhållna stärkelsemikropartiklarna skall uppvisa de egenskaper som kommer att beskrivas nedan mås- te stärkelsen generellt till övervägande del bestå av höggrenad stärkelse, som i det naturliga tillståndet i stärkelsegranulen benämns amylopektin. Den skall dessutom 10 15 20 25 30 35 51 s oss 24 molekylviktsfördelning som gör det möjligt att uppná öns- kade koncentrationer och gelningshastigheter.

I detta sammanhang kan det tilläggas att begreppet bionedbrytbar innebär att mikropartiklarna efter parente- ral administration löses upp i kroppen till kroppsegna substanser, i slutänden t.ex. glukos. Bionedbrytbarheten kan bestämmas eller undersökas genom inkubation med lämp- ligt enzym, t.ex. alfa-amylas, in vitro. Det är härvid lämpligt att tillsätta enzymet ett flertal gànger under inkubationsperioden, så att man därigenom försäkrar sig om att det finns aktivt enzym närvarande i inkubations- blandningen hela tiden. Bionedbrytbarheten kan även un- dersökas genom parenteral injicering av mikropartiklarna, t.ex. subkutant eller intramuskulärt, och histologisk un- dersökning av vävnaden som en funktion av tiden.

Bionedbrytbara stärkelsemikropartiklar försvinner normalt fràn vävnaden inom nâgra veckor och oftast inom en vecka. I de fall dä stärkelsemikropartiklarna är över- dragna med ett frisättningsreglerande hölje, t.ex. drage- rade, är det oftast detta hölje som avgör hastigheten för bionedbrytbarheten, vilken i sin tur avgör när alfa- amylas blir tillgängligt för stärkelsematrisen.

Biokompatibiliteten kan också undersökas genom pa- renteral administration av mikropartiklarna, t.ex. subku- tant eller intramuskulärt, och histologisk utvärdering av vävnaden, varvid det är viktigt att beakta att den biolo- giskt aktiva substansen, som ofta är ett protein, i sig uppvisar förmåga att inducera t.ex. ett immunsvar i det fall den administreras i en annan art. Exempelvis kan sà- lunda mànga rekombinant framställda mänskliga proteiner ge upphov till immunsvar i försöksdjur.

Stärkelsen måste vidare ha en renhet som är accepta- bel för tillverkning av en parenteralt administrerbar be- redning. Den måste även kunna bilda tillräckligt stabila lösningar vid tillräckligt hög koncentration för att möj- liggöra inblandning av den biologiskt aktiva substansen under betingelser som medger att substansens bioaktivitet 10 15 20 25 30 35 u: .u 51 s 008 " 25 bibehålls, samtidigt som den spontant mäste kunna solidi- fieras på ett kontrollerat sätt för att stabila, men sam- tidigt bionedbrytbara, mikropartiklar skall erhållas. Hög koncentration av stärkelsen är också viktig för att för- hindra att den biologiskt aktiva substansen fördelas ut i oacceptabel utsträckning till den yttre fasen eller till gränsytan mellan den inre och den yttre fasen.

Ett antal föredragna utföringsformer med avseende på stärkelsens karaktär är följande.

Stärkelsen har lämpligen ett innehåll av amylopektin överstigande 85 vikt-%, där molekylvikten för nämnda amy- lopektin är reducerad, företrädesvis genom skjuvning, så att minst 80 vikt-% av materialet ligger inom intervallet 10-10000 kDa.

Vidare har stärkelsen lämpligen ett aminosyrakväve- innehåll understigande 50 pg per g torrvikt stärkelse.

Stärkelsen har företrädesvis en renhet av högst 20 pg, ännu hellre högst 10 pg och allra helst högst 5 pg, aminosyrakväve per g torrvikt stärkelse.

Molekylvikten för ovannämnda amylopektin är företrä- desvis reducerad, företrädesvis genom skjuvning eller ge- nom enzymatisk hydrolys, till exempel med isoamylas, så att minst 80 vikt-% av materialet ligger inom intervallet 100-4000 kDa, ännu hellre 200-1000 kDa och allra helst 300-600 kDa.

Stärkelsen har vidare företrädesvis ett innehåll av amylopektin med ifrågavarande reducerade molekylvikt överstigande 95 vikt-%, ännu hellre överstigande 98 vikt- %. Den kan dessutom naturligtvis till 100 vikt-% bestå av sådan amylopektin.

Enligt en annan föredragen utföringsform är stärkel- sen av sådan art att den kan lösas i vatten i en koncent- ration överstigande 25 vikt-%. Detta innebär generellt förmåga att lösa sig i vatten i enlighet med i och för sig känd teknik, dvs vanligtvis upplösning vid förhöjd temperatur, exempelvis upp till approximativt 80°C. 51 ß nos 26 Enligt ytterligare en föredragen utföringsform gäll- er att stärkelsen i huvudsak saknar kovalent bundna extra kemiska grupper av det slag som förekommer i hydroxie- tylstärkelse. Med detta menas generellt att stärkelsen 5 väsentligen enbart innehåller sådana grupper som finns i naturlig stärkelse och inte har modifierats pà annat sätt, såsom i exempelvis hydroxietylstärkelse.

En annan föredragen utföringsform innebär att stär- kelsen har ett endotoxininnehäll understigande 25 EU/g. 10 Ytterligare en föredragen utföringsform innebär att stärkelsen innehåller mindre än 100 mikroorganismer per gram, ofta t o m mindre än 10 mikroorganismer per gram.

Stärkelsen kan vidare definieras som att den är i huvudsak renad fràn ytlokaliserade proteiner, lipider och 15 endotoxiner medelst tvättning med vattenbaserad alkali- lösning, molekylviktsreducerad medelst skjuvning samt re- nad fràn invändiga proteiner medelst jonbyteskromatogra- fi, företrädesvis anjonbyteskromatografi.

Vad beträffar renheten i alla dessa sammanhang gäll- 20 er generellt att uttryck av typen ”väsentligen” eller ”i huvudsak” oftast innebär till minst 90 %, t.ex. 95 %, 99 % eller 99,9 %.

Att amylopektin utgör huvudbestàndsdelen i den an- vända stärkelsen innebär generellt att dess andel är 60- 25 100 vikt-%, räknat pà torrvikt stärkelse.

I vissa fall kan det härvid vara gynnsamt att använ- da en mindre andel, t.ex. 2-15 vikt-%, kortkedjig amylos för modifiering av gelningshastigheten i steg f). Medel- molekylvikten för nämnda amylos ligger företrädesvis inom 30 intervallet 2,5-70 kDa, speciellt 5-45 kDa. Övriga detal- jer beträffande kortkedjig amylos kan hämtas fràn US pa- tentskrift 3,88l,991.

Vid bildandet av den stärkelselösning som används i o|1;| steg d) används generellt uppvärmning enligt i och för 35 sig känd teknik för upplösning av stärkelsen. En speci- ellt föredragen utföringsform innebär härvid samtidigt att man löser upp stärkelsen under autoklavering, varvid lO 15 20 25 30 35 51 s ons f 27 den också företrädesvis steriliseras. Denna autoklavering genomförs i vattenhaltiga lösningar, t.ex. vatten för in- jektion eller lämplig buffert.

Om den biologiskt aktiva substansen är ett känsligt protein eller annan temperaturkänslig substans, fär stär- kelselösningen svalna till lämplig temperatur innan den förenas med substansen ifràga. Vilken temperatur som är lämplig avgörs i första hand av värmestabiliteten för den biologiskt aktiva substansen, men rent generellt gäller att en temperatur understigande ca 60°C, ännu hellre un- derstigande 55°C, är lämplig.

Enligt en föredragen utföringsform förenar man där- för den aktiva substansen, eller de aktiva substanserna, med stärkelselösningen vid en temperatur av högst 60°C, ännu hellre högst 55°C, och företrädesvis inom interval- let 20-45°C, speciellt 30-37°C.

För blandningsoperationen i steg d) gäller vidare att man lämpligen använder sig av ett viktförhàllande stärkelsezbiologiskt aktiv substans inom området från 3:1 till l0OOO:l För blandningsoperationen gäller dessutom, säsom har omtalats ovan, att den aktiva substansen koncentre- ras/solidifieras med utnyttjande av en PEG-lösning innan den blandas med stärkelselösningen. Det är möjligt att sätta stärkelselösningen till den biologiskt aktiva sub- stansen eller vice versa. Därefter skapas en homogen för- delning av den koncentrerade/solidifierade aktiva sub- stansen i stärkelselösningen medelst lämplig teknik. Sà- dan teknik är välkänd inom omrädet, varvid som exempel kan nämnas magnetomrörning, propelleromrörning eller an- vändning av en eller flera statiska mixrar.

Vid framställningen av stärkelsemikropartiklarna en- ligt föreliggande uppfinning bör koncentrationen av stär- kelse i den lösning som skall överföras till fast form, och i vilken den biologiskt aktiva substansen skall in- förlivas, vara minst 20 vikt-% för att stärkelsemikropar- tiklar med goda egenskaper skall bildas. Exakt vilken 51 ß nos 28 stärkelsekoncentration som fungerar bäst i varje enskilt fall kan pà ett enkelt sätt titreras ut för varje enskild biologiskt aktiv substans vid den laddning i mikropari- klarna som önskas i det enskilda fallet. Det bör i detta 5 sammanhang observeras, att den biologiskt aktiva substans som skall införlivas i mikropartiklarna kan påverka tvä- fas-systemet och stärkelsens gelningsegenskaper, vilket likaså innebär att sedvanliga för-försök utförs i syfte att bestämma de optimala betingelserna i det enskilda 10 fallet. Oftast visar försök att stärkelsekoncentrationen med fördel bör vara minst 30 vikt-% och i vissa speciella fall minst 40 vikt-%. Som högsta gräns gäller vanligtvis 50 vikt-%, speciellt högst 45 vikt-%. Det är normalt inte möjligt att erhålla dessa höga stärkelsekoncentrationer 15 utan användning av molekylviktsreducerad, höggrenad stär- kelse.

Beträffande den polymer som använts i steg e) i syf- te att bilda ett tväfas-vattensystem gäller att det inom just detta teknikomràde finns publicerad information om 20 ett stort antal polymerer med förmåga att bilda tvàfas- system med stärkelse som inre fas. Alla sàdana polymerer fär anses ligga inom ramen för föreliggande uppfinning.

En speciellt lämplig polymer i detta sammanhang är dock polyetylenglykol. Företrädesvis uppvisar denna polyety- 25 lenglykol en medelmolekylvikt av 5-35 kDa, ännu hellre 15-25 kDa och speciellt ca 20 kDa.

Polymeren löses upp i lämplig koncentration i vat- ten- eller vattenbaserad lösning, vilket uttryck även in- nefattar buffertlösning, och tempereras till lämplig tem- 30 peratur. Denna temperatur ligger företrädesvis inom in- tervallet 4-50°C, ännu hellre 10-40°C och oftast 10-37°C. -p-f Koncentrationen av polymeren i den vattenbaserade lös- ningen är lämpligen minst 20 vikt-% och företrädesvis minst 30 vikt-%, och lämpligen högst 45 vikt-%. Ett spe- 35 ciellt föredraget intervall är 30-40 vikt-%.

Blandningsoperationen i steg e) kan utföras pà många olika sätt, t.ex. genom användning av propelleromrörning 51 s o o s šïï* 29 eller minst en statisk mixer. Blandningen utföres normalt inom temperaturområdet 4-50°C, företrädesvis 20-40°C, ofta ca 37°C. Vid ett satsvis förfarande kan stärkelselösning- en sättas till polymerlösningen eller vice versa. I det 5 fall statiska mixrar eller blandare utnyttjas, utföres operationen lämpligen därigenom att de båda lösningarna pumpas i två separata rörledningar in i en gemensam rör- ledning som innehåller blandarna.

Emulsionen kan bildas under användning av låga 10 skjuvkrafter, då det inte föreligger någon hög ytspänning mellan faserna i vatten/vatten-emulsioner, till skillnad från olja/vatten- eller vatten/olja-emulsioner, och då det primärt är stärkelselösningens viskositet som skall övervinnas för att dropparna skall uppnå viss storleks- l5 fördelning. I de flesta fall är det tillräckligt med mag- net- eller propelleromrörning. I större skala, t.ex. då den mängd mikropartiklar som skall framställas överstiger 50 g, är det lämpligt att använda s.k. bafflar för erhål- lande av en ännu effektivare omrörning i den använda be- 20 hållaren. Ett alternativt sätt för att bilda vat- ten/vatten-emulsionen är användning av minst en statisk mixer, varvid stärkelselösningen lämpligen pumpas med re- glerad hastighet i ett rör, vari de statiska mixrarna har placerats. Pumpningen kan ske med vilken lämplig pump som 25 helst, förutsatt att den ger jämn flödeshastighet under dessa betingelser, inte utsätter blandningen för onödigt höga skjuvkrafter och är acceptabel för tillverkning av parenterala beredningar vad avser renhet och frånvaro av läckage av oönskade substanser. Även i de fall då statis- 3O ka mixrar används för skapande av emulsionen är det of- _ tast fördelaktigt att låta solidifieringen till mikropar- -y-E tiklar ske i ett kärl med lämplig omrörning.

En föredragen utföringsform av förfarandet enligt uppfinningen innebär att man i steg e) sätter polymerlös- 35 ningen till kompositionen i minst två steg, där en till- sats sker efter det att emulsionen har skapats eller bör- jat skapas. 10 15 20 25 30 35 51 s 008 30 Det ligger naturligtvis ocksä inom ramen för före- liggande uppfinning att tillsätta polymerlösningarna i flera steg och att därvid exempelvis ändra medelmolekyl- vikten och/eller koncentrationen av den använda polyme- ren, t.ex. för att öka koncentrationen av stärkelse i den inre fasen, i de fall detta är önskvärt.

Blandningsoperationen i steg e) utföres dessutom lämpligen under sådana betingelser att de bildade stär- kelsedropparna fär den för mikropartiklarna önskade stor- leken, dvs företrädesvis en medeldiameter, i torrt till- stånd, inom intervallet lO-200pm, ännu hellre 20-lOOpm och helst 20-80pm.

Viktigt i samband med solidiferingen av mikropartik- larna är att denna sker under betingelser som är milda för den ingående biologiskt aktiva substansen, eller sub- stanserna. Primärt är det med andra ord fràga om att an- vända sig av en temperatur som inte är skadlig för den närvarande substansen. Det har härvid överraskande visat sig, att kriterierna för detta och för att det skall bil- das stabila mikropartiklar med lämplig storleksfördelning lättare kan uppfyllas om man under solidifieringen använ- der sig av mera än en temperatur eller temperaturnivà.

Speciellt fördelaktigt är det om man inleder solidifie- ringsprocessen i tvàfas-systemet vid lägre temperatur än den temperatur som används i slutfasen av solidifiering- en. En föredragen utföringsform innebär att man inleder solidifieringen inom intervallet 1-20°C, företrädesvis 1- lO°C, speciellt runt 4°C, och avslutar densamma inom in- tervallet 20-55°C, företrädesvis 25-40°C, i synnerhet runt 37°C.

En bekräftelse pà att de valda betingelserna är kor- rekta eller lämpliga kan man fä genom att konstatera att stärkelsemikropartiklarna har önskad storleksfördelning, är stabila under de efterföljande tvättnings- och tork- ningsoperationerna och löses upp i huvudsak fullständigt enzymatiskt in vitro och/eller att den införlivade sub- stansen har kapslats in pà ett effektivt sätt och har bi- 518 ons 31 behàllen bioaktivitet. Det sistnämnda undersöks vanligt- vis med hjälp av kromatografiska metoder eller med hjälp av andra inom tekniken etablerade metoder, in vitro eller in vivo, efter upplösning av mikropartiklarna enzymatiskt 5 under milda betingelser, och är en viktig del i att för- säkra sig om ett robust och säkert tillverkningsförfaran- de för känsliga biologiskt aktiva substanser. Det är en stor fördel att mikropartiklarna kan lösas upp fullstän- digt under utnyttjande av milda betingelser, dä man där- lO igenom minimerar riskerna för preparationsinducerade ar- tefakter, som är vanligt förekommande då exempelvis orga- niska lösningsmedel behövs för upplösning av mikropartik- larna, vilket exempelvis är fallet då dessa består av en PLGA-matris. 15 De bildade mikropartiklarna tvättas företrädesvis på lämpligt sätt, för avlägsnande av yttre fas och av över- skott av aktiv substans. Sådan tvättning sker lämpligen genom filtrering, vilken möjliggörs av mikropartiklarnas goda mekaniska stabilitet och lämpliga storleksfördel- 20 ning. Ofta kan det också vara lämpligt med tvättning me- delst centrifugering, avlägsnande av supernatanten och resuspendering i tvättningsmediet. Vid varje tvättnings- I förfarande används ett eller flera lämpliga tvättningsme dier, vilka oftast är bufferthaltiga vattenlösningar. I 25 samband härmed kan också siktning vid behov användas för justering av mikropartiklarnas storleksfördelning, exem- pelvis för eliminering av innehållet av alltför små mik- ropartiklar och för säkerställande av att inga mikropar- .ÅÉ' tiklar över en viss storlek finns närvarande i den färdi- Q 30 ga produkten.

Torkningen av mikropartiklarna kan ske på något 'Vf lämpligt sätt, t.ex. genom spraytorkning, frystorkning eller vacuumtorkning. Vilken torkningsmetod som väljs i det enskilda fallet beror ofta på vad som är lämpligast 35 för bibehållande av den biologiska aktiviteten för den inneslutna biologiskt aktiva substansen. Även processö- verväganden kommer in i bilden, såsom kapacitet och ren- lO 15 20 25 30 35 n 1 cow n n ua n I I» 'i o -ø n n u o n u u I o c n ~ - . - v v n u n o v o u a a n I I n. nu nu n n u u u - wo 1 0 : _ fi u - u u o a n a 4 o n i C ; o n . av en nu n, HI HH 1 32 hetsaspekter. Frystorkning är ofta den föredragna tork- ningsmetoden, dà den rätt utformad är synnerligen mild med avseende pà den inneslutna biologiskt aktiva substan- sen. Att den införlivade biologiskt aktiva substansen har bibehàllit sin bioaktivitet kan fastställas medelst för substansen lämplig analys efter enzymatisk upplösning av mikropartikeln under milda betingelser. Lämpliga enzymer för användning i samband med stärkelse är alfa-amylas och amyloglukosidas, var för sig eller i kombination, varvid de i förekommande fall bör ha konstaterats vara fria fràn eventuella proteaser, som kan bryta ned proteiner. Närva- ro av proteaser kan detekteras med inom området kända me- toder och t ex genom att man i kontrollförsök blandar den biologiskt aktiva substansen och bestämmer dess integri- tet pà sedvanligt sätt efter inkubation med den avsedda enzymblandningen under de betingelser som sedan ska an- vändas för upplösning av mikropartiklarna. I de fall pre- parationen konstateras innehålla kontamination av protea- ser, kan den bytas mot en preparation med högre renhet eller renas fràn proteaser. Detta kan göras med inom om- rådet kända tekniker, t ex genom kromatografi med az- makroglobulin bundet till lämpligt kromatografimaterial.

För modifiering av frisättningsegenskaperna för mik- ropartiklarna kan man dessutom eventuellt också applicera ett frisättningsreglerande hölje av en biokompatibel och bionedbrytbar polymer. Exempel pà lämpliga polymerer i detta sammanhang finns i den kända tekniken, och speci- ellt kan polymerer av mjölksyra och glykolsyra (PLGA) nämnas. Appliceringen av ifrågavarande hölje sker före- trädesvis med hjälp av luftsuspensionsteknik. En speci- ellt lämplig sådan teknik finns beskriven i WO97/14408, och detaljer i detta avseende kan sålunda hämtas fràn denna skrift, vars innehåll härmed upptas i texten via referens. De stärkelsemikropartiklar som erhålles medelst förfarandet enligt föreliggande uppfinning är ytterst väl lämpade för dragering eller beläggning med hjälp av nämn- da luftsuspensionsteknik, och de erhållna belagda mikro- »min 10 15 20 25 30 35 51 e o 0 s 33 partiklarna är synnerligen väl lämpade för parenteral ad- ministration.

Vid användning av de framställda mikropartiklarna, vare sig de är belagda med ett frisättningsreglerande yttre hölje eller ej, och speciellt för möjliggörande av injektion, suspenderas de torra mikropartiklarna i ett lämpligt medium. Sådana medier samt förfaranden i dessa avseenden är väl kända inom området och torde inte behöva beskrivas närmare här. Själva injektionen kan göras genom en lämplig kanyl eller med en kanylfri injektor. Det är också möjligt att injicera mikropartiklarna med hjälp av en torrpulverinjektor, utan att de dessförinnan resuspen- deras i ett injektionsmedium.

Förutom de fördelar som har omtalats ovan gäller att förfarandet enligt uppfinningen uppvisar den fördelen att utbytet av den biologiskt aktiva substansen generellt är högt, att det är möjligt att erhålla ett mycket högt in- nehàll av den aktiva substansen i mikropartiklarna under bibehållande av substansens bioaktivitet, att de erhållna mikropartiklarna har rätt storleksfördelning för använd- ning för parenteral, reglerad (t.ex. fördröjd eller för- längd) frisättning, då de är för stora för att fagocyte- ras av makrofager och tillräckligt små för att kunna in- jiceras genom små kanyler, t.ex. 23G-25G, och att det vid nedbrytningen av mikropartiklarna bildas kroppsegna och neutrala nedbrytningsprodukter, varigenom man exempelvis kan undvika att den aktiva substansen utsättes för ett alltför lågt pH-värde. Dessutom är själva förfarandet synnerligen väl lämpat för rigorös kvalitetskontroll.

Förfarandet enligt uppfinningen är speciellt intres- sant i samband med proteiner, peptider, polypeptider, po- lynukleotider och polysackarider eller generellt andra läkemedel eller biologiskt aktiva substanser som är käns- liga för eller instabila i exempelvis organiska lösnings- medel. Rekombinant framställda proteiner är en mycket in- tressant grupp av biologiskt aktiva substanser. Allmänt sett gäller dock att uppfinningen inte är begränsad till 518 ons 34 närvaro av sådana substanser, eftersom uppfinningsidén är tillämpbar på vilken som helst biologiskt aktiv substans, som kan användas för parenteral administration. Förutom i samband med känslighets- eller instabilitetsproblem kan 5 uppfinningen sålunda också vara av speciellt intresse i sådana fall där det annars skulle vara svårt att avlägsna lösningsmedel eller där toxikologiska eller andra miljö- mässiga problem skulle kunna uppträda.

Exempel på biologiskt aktiva substanser av ovan an- 10 givet slag är tillväxthormon, erytropoietin, interferon (a,ß,y-typ), vaccin, epidermalt tillväxthormon, Faktor IV, V, VI, VII, VIII och IX, LHRH-analog, insulin, makro- fagkolonistimulerande faktor, granulocytkolonistimuleran- de faktor och interleukin. 15 Användbara biologiskt aktiva substanser av typ icke- proteinläkemedel kan väljas ur följande grupper: Antitumörmedel, antibiotika, antiinflammatoriska me- del, antihistaminer, sedativa medel, muskelavslappnande medel, antiepileptiska medel, antidepressionsmedel, anti- 2O allergiska medel, bronkodilatatorer, kardiotoniska medel, antiarrytmimedel, vasodilatatorer, antidiabetiska medel, antikoagulerande medel, hemostatiska medel, narkotiska medel och steroider.

Enligt en annan aspekt av uppfinningen hänför sig 25 denna också till nya mikropartiklar av det slag som kan framställas medelst förfarandet enligt uppfinningen. De nya mikropartiklarna enligt uppfinningen är emellertid inte begränsade till sàdana som kan framställas medelst nämnda förfarande utan omfattar alla mikropartiklar av 30 ifrågavarande slag oberoende av framställningsmetodiken.

Närmare bestämt är det fråga om mikropartiklar läm- ,H.. pade för parenteral administration, företrädesvis via in- jektion, pà ett däggdjur, speciellt människa, och inne- .flšs hållande en biologiskt aktiv substans, vilka mikropartik- 35 lar väsentligen har samma egenskaper som de mikropartik- lar vilka kan erhållas medelst det ovan beskrivna förfa- randet. »;>on 10 15 20 25 30 35 a -afo- 1 518 008 35 Enligt en aspekt av uppfinningen representeras dessa av mikropartiklar, vilka väsentligen består av parente- ralt administrerbar bionedbrytbar stärkelse som matris, vilken innehåller den biologiskt aktiva substansen i vä- sentligen icke-kemiskt komplexbunden form och i form av fasta partiklar med en medelstorlek inom området 0,05- 30pm.

Med medelstorlek menas härvid vanligtvis medeldiame- ter, åtminstone i fallet med sfäriska eller i huvudsak sfäriska partiklar. Vid annan konfiguration avses gene- rellt medelvärde för största utbredning av partikeln i någon riktning.

Enligt en utföringsform av uppfinningen gäller här- vid att partiklarna av den biologiskt aktiva substansen är erhållna genom utfällning, dvs föreligger i utfälld form.

De fasta partiklarna har företrädesvis en medelstor- lek inom området 0,2-lOpm, ännu hellre 0,5-Sum och allra helst 1-4pm.

En annan utföringsform representeras av mikropartik- lar, vari stärkelsen har ett aminosyrakväveinneháll un- derstigande 50 pg per g torrvikt stärkelse och vilka sak- nar kovalent kemisk tvärbindning mellan stärkelsemoleky- lerna.

En annan utföringsform avser mikropartiklar, vari stärkelsen har ett innehàll överstigande 85 viktprocent av amylopektin, för vilket minst 80 viktprocent har en medelmolekylvikt inom intervallet 10-1000 kDa.

Stärkelsen kan i övrigt uppvisa de särdrag som har omtalats i samband med förfarandet.

Företrädesvis uppvisar också mikropartiklarna ett frisättningsreglerande hölje av det slag som har omtalats i samband med förfarandet. Även beträffande föredragna varianter av detta hänvisas till förfarandet.

Andra mikropartiklar enligt uppfinningen är sådana, vari den biologiskt aktiva substansens bioaktivitet är minst 80%, företrädesvis minst 90% och helst väsentligen 10 15 20 25 30 35 »n u ~ u n - . u o o u I oo 518 008 36 bibehållen, uppvisade innan den införlivades i stärkelsen. jämfört med den bioaktivitet som substansen Andra mikropartiklar enligt uppfinningen är sådana, som är bionedbrytbara in vitro i närvaro av alfa-amylas och/eller amyloglukosidas.

Ytterligare andra är sådana som är bionedbrytbara och elimineras fràn vävnad efter subkutan eller intramus- kulär administration. Den biologiskt aktiva substansen är företrädesvis ett protein och ännu hellre ett rekombinant framställt protein.

Proteinet är företrädesvis valt bland proteinhormo- företrädesvis tillväxthormoner, företrädesvis FVII, VII, VIII och IX, LHRH-analoger, ner, koagulationsfakto- rer, insulin och insulinanaloger, C-peptid, glukagonliknande peptider, LHRH-analoger, leptiner, kolonistimulerande faktorer, företrädesvis makrofagkolonistimulerande fak- tor, granulocytstimulerande faktor och granulo- cyt/makrofagstimulerande faktor, interferoner, företrä- desvis interferon a, interferon ß och interferon X inter- leukiner och rekombinant framställda vacciner Allra helst är proteinet ett tillväxthormon, ellt ett humant tillväxthormon (hGH).

Att den biologiskt aktiva substansen i stärkelsema- speci- trisen föreligger i väsentligen icke-kemiskt komplexbun- den form innebär generellt att molförhàllandet totala me- tallkatjonerzbiologiskt aktiv substans är mindre än O,2:l. V Enligt den kända tekniken är det i första hand zink som har utnyttjats för komplexbindning i liknande samman- hang. Mikropartiklarna enligt uppfinningen uppvisar sà- lunda den fördelen att de väsentligen eller helt saknar sådan zink. Ännu hellre är ovannämnda molförhàllande metallkat- joner: biologiskt aktiv substans mindre än O,l:l, speci- ellt mindre än 0,01:l och allra helst naturligtvis så nära O som möjligt. lO 15 20 25 30 35 518 008 IÉ ' ' 37 I det fall det är fråga om ett humant tillväxthormon som biologiskt aktiv substans gäller att detta företrä- desvis är ett sådant, vars innehåll av dimerer är mindre än 2 vikt-%, och ännu hellre mindre än l vikt-% och av polymerer mindre än 0,2 vikt-%, företrädesvis mindre än 0,1 vikt-%.

Ytterligare en föredragen utföringsform av mikropar- tiklarna enligt uppfinningen är sådana vari den biolo- giskt aktiva substansen är humant tillväxthormon och för vilka frisättningskinetiken för nämnda hGH bestämd in vi- tro karaktäriseras av i huvudsak kontinuerlig och jämn frisättning under minst en vecka.

Mikropartiklar vilka bildar en parenteralt admini- strerbar, bionedbrytbar mikropartikelberedning innehål- lande en biologiskt aktiv substans, vilken under de för- sta 24 timmarna efter injektion uppvisar en frisättning av den aktiva subsansen som är mindre än 30% av den tota- la frisättningen, bestämt ur en koncentration-tid-kurva i form av förhållandet mellan area under kurvan under nämn- da första 24 timmar och total area under ifrågavarande kurva.

Företrädesvis gäller att frisättningen under de för- sta 24 timmarna efter injektionen är mindre än 20%, före- trädesvis mindre än 15%, ännu hellre mindre än 10% och allra helst mindre än 5%, av den totala frisättningen.

Mikropartiklar vilka ger en mikropartikelberedning av ovan nämnda typ, vilken under de första 48 timmarna efter injektion uppvisar en frisättning av den aktiva substansen där den maximala koncentrationen i plasma el- ler serum är mindre än 300% av den maximala koncentratio- .nen av den biologiskt aktiva substansen under någon tid- punkt överstigande 48 timmar efter injektion.

Nämnda maximala koncentration är företrädesvis mind- re än 200% och ännu hellre mindre än 100% av ifrågavaran- de maximala koncentration. 10 15 20 25 30 35 o ø u » - « ø . a - nu 518 008 38 Ett annat exempel är en mikropartikelberedning av ovan nämnt slag, vilken uppvisar en frisättning av den biologiskt aktiva substansen där biotillgängligheten av nämnda substans är minst 35% av den biotillgänglighet som erhålles när ifrågavarande substans injiceras intravenöst i löslig form.

Nämnda biotillgänglighet är företrädesvis minst 45%, ännu hellre minst 50%, av den biotillgänglighet som er- hàlles när den biologiskt aktiva substansen injiceras intravenöst.

Ytterligare ett exempel är en mikropartikelberedning av nämnt slag, vilken uppvisar en frisättning av den ak- tiva substansen karakteriserad av att i den frisättning som sker under vilken som helst sammanhängande sjudagars- period är kvoten mellan den högsta koncentrationen av den biologiskt aktiva substansen i serum eller plasma divide- rat med medelkoncentrationen under nämnda sjudagarsperiod mindre än 5, förutsatt att den valda sjudagarsperioden inte inkluderar de första 24 timmarna efter injektion.

Nämnda frisättning är företrädesvis mindre än 4 gänger, ännu hellre mindre än 3 gånger och allra helst mindre än 2 gånger.

En annan mikropartikelberedning som kan erhållas me- delst mikropartiklarna enligt uppfinningen uppvisar en frisättning av den biologiskt aktiva substansen där me- deluppehàllstiden för ifrågavarande substans är minst 4 dagar.

Företrädesvis är nämnda medeluppehàllstid minst 7 dagar, ännu hellre minst 9 dagar, t.ex. minst ll dagar eller speciellt minst 13 dagar.

De särdrag som har angivits för de ovan presenterade mikropartikelberedningarna kan kombineras i vilka som helst lämpliga kombinationer.

För de olika karakteristika som har angivits för mikropartikelberedningen ovan gäller mera specifikt att det primärt rör sig om begreppen MRT, burst och biotill- gänglighet. 10 15 20 25 30 @ | u - . ~ o . « - .u 518 008 39 Dessa kan definieras enligt följande. 24.32 Ett màl med beredningar för kontrollerad frisättning är att få en förlängd frisättning av det aktiva materia- let. Ett mått man kan använda för att kvantifiera fri- sättningstiden är medeluppehällstid eller ”mean resi- (MRT) farmakokinetik.

MRT dence time” som är det vedertagna begreppet inom är genomsnittstiden som molekylerna som intro- ducerats i kroppen uppehåller sig i kroppen. (Clinical Malcolm Phila- Pharmacokinetics. Concepts and Applications.

TM ed. Lea&Febiger, Rowland and Thomas N. Tozer. delphia London) MRT-värdet kan beräknas fràn plasmakoncentrationsda- ta genom följande formel. æ I :Cdz MRT = ° æ j Cd: 0 där C är plasmakoncentrationen och t år tiden Burst Ett vanligt problem med beredningar för kontrollerad frisättning för parenteralt bruk är att det omedelbart efter administrering i kroppen frisätts en stor del av läkemedlet under tidig fas. Detta kallas inom facklitte- raturen för ”burst-effect” Detta beror oftast pà att lä- kemedlet befinner sig pà ytan av formuleringen eller att formuleringen(som kan bestà av mikropartiklar) spricker upp. En läg bursteffekt är mycket önskvärd eftersom en hög koncentration av läkemedlet kan vara toxisk och dess- utom utnyttjas den del som försvinner snabbt första ti- den dåligt, vilket innebär att mer läkemedel krävs för att upprätthålla en terapeutiskt nivà av läkemedlet under den avsedda behandlingstiden. 10 15 20 25 30 518 008 40 Burst definieras som den andel av läkemedlet som ab- sorberas under de första 24 timmarna av den totala ande- len som absorberas.

Matematiskt kan man definiera det med hjälp av ”area under kurva”-beräkningar fràn plasmakoncentrationskurvor. 24/1 j' Cd: ° -1oo% w I Cd: 0 Burst = Biotillgänglighet Biotillgänglighet är ett màtt pà hur stor del av det tillförda läkemedlet som absorberas från administrations- stället till blodet i aktiv form. Biotillgänglighet jäm- förs ofta med data från intravenös tillförsel av läkemed- let, där man således inte har nâgra absorptionsbarriàrer, och kallas dä för absolut biotillgänglighet, Absolut biotillgänglighet definieras enligt följande formel: zAUCx-Div Dx-ACKQV där AUC xär area-under-kurvan värdet för den undersökta formuleringen, AUCiv är area-under-kurvan värdet för en intravenös tillförsel av läkemedlet, DX är dosen av läke- medlet i formuleringen och DW är den intravenösa dosen.

Bestämningen av frisättningsprofilen och de farmako- kinetiska parametrarna görs företrädesvis genom djurför- sök. Den mest relevanta arten, pà grund av sin likhet med människa, är gris. I de fall den biologiskt aktiva sub- stansen kan inducera ett immunsvar under testet som ris- kerar att påverka bestämningen av de farmakokinetiska pa- rametrarna för den biologiskt aktiva substansen bör häm- ning av immunsvaret användas, t.ex. genom läkemedelsbe- handling, vilket är känt inom teknikomrädet, och detaljer 10 15 20 25 30 35 518 008 v 41 kan hämtas ur den vetenskapliga litteraturen, till exem- (1999) 1-8) Andra intressanta mikropartiklar enligt uppfinningen pel Agersö et al, (J.Pharmacol Toxicol 41 år sådana som är bionedbrytbara in vitro i närvaro av alfa-amylas och/eller amyloglukosidas.

Ytterligare föredragna mikropartiklar är sådana som är bionedbrytbara och elimineras från vävnad efter subku- tan eller intramuskulär administration.

Vad beträffar bestämningen av den biologiska aktivi- teten för mikropartiklarna innehållande aktiv substans gäller att denna får ske på ett för varje enskild biolo- gisk substans lämpligt sätt. I de fall bestämningen sker i form av djurförsök, injiceras en viss mängd av den bio- logiskt aktiva substansen införlivad i stärkelsemikropar- tiklarna, eventuellt efter upplösning av dessa mikropar- tiklar enzymatiskt under milda betingelser i förväg och det biologiska svaret jämförs med det svar som erhålles efter injektion av motsvarande mängd av samma biologiskt aktiva substans i en lämplig lösning. I de fall utvärde- ringen sker in vitro, t ex i provrör eller i cellkultur, görs den biologiskt aktiva substansen helst helt till- gänglig före utvärderingen genom upplösning av stärkelse- mikropartiklarna enzymatiskt under milda betingelser, varefter aktiviteten bestäms och jämförs med aktiviteten för en kontrollösning med samma koncentration av ifråga- varande biologiskt aktiva substans. I alla händelser gäller att utvärderingen skall innefatta eventuella ospe- cifika effekter av stärkelsemikropartiklarnas nedbryt- ningsprodukter.

EXEMPEL Uppfinningen kommer nu att belysas ytterligare genom nedanstående icke-begränsande utföringsexempel.

Exempel 1 Procedur för framställning av högkoncentrerat/utfällt hGH lämpligt för immobilisering med PEG. lO 15 20 25 30 35 518 008 42 Till 343 mg hGH sättes 10 mM natriumfosfatbuffert, pH 6,4, till en total volym på 2,5 ml. PEG med en medel- molekylvikt på 20000 D löses i samma buffert till en kon- centration av 30% under justering av pH till ca 6,4. PEG- lösningen (25 ml) hälls i en bägare med en propeller, varefter temperaturen justeras till l5°C och hGH- lösningen (ca 1,25 ml) tillsätts under propelleromrörning och blandningen får stå i 75 min under fortsatt omrör- ning. Den erhållna suspensionen centrifugeras i en Sor- vall SS34 noggrant. Det utfällda proteinet kan tvättas en gång med Na-acetat pH 6,4 innehållande 2 mM zinkacetat (10 ml) och (20 min vid 5000 rpm). Supernatanten sugs av den erhållna supernatanten sugas av.

Exempel 2 Procedur för immobilisering av PEG-solidifierat hGH i stärkelsemikrosfärer tillverkade av höggrenad skjuvad stärkelse.

Stärkelsemikrosfärer tillverkas från skjuvad stär- kelse med en medelmolekylvikt på 390 kDa. Stärkelsen lö- ses genom värmning i 10 mM natriumfosfat, pH 6,4, till en koncentration av 40% och den erhållna stärkelselösningen tillåts svalna till ca 55°C. Därefter blandas 2,1 g av den erhållna stärkelselösningen med hela den i Exempel 1 framställda satsen av hGH, uppsuspenderad i 10 mM natri- umacetatbuffert innehållande 2 mM zinkacetat, pH 6,4, to- talt 2,9 ml, under omrörning till en homogen suspension av proteinet i stärkelselösning bildas. Till den erhållna suspensionen sättes 12 g av en PEG-lösning med en kon- centration av 42%, där medelmolekylvikten för PEG är 20 kDa. avslutas vid 37°C i 6 timmar. De erhållna stärkelsemikro- Solidifieringen initieras vid 4°C i 17 timmar och sfärerna innehållande hGH tvättas tre gånger med 38 ml 10 mM natriumacetatbuffert innehållande 2 mM zinkacetat, pH 6,4, och frystorkas. De erhållna mikrosfärerna löses upp med a-amylas och mängden införlivat hGH bestäms, t.ex. medelst analys med högtrycksvätskekromatografi. Andelen lO 15 20 25 30 35 518 008 a 43 dimer och polymer bestäms också, t.ex. med högtrycksväts- kekromatografi. Utbytet av stärkelsemikrosfärer innehål- lande hGH är generellt minst 80% och innehållet av hGH, uttryckt som torrvikt, är kring 15 viktprocent. Protei- nets innehåll av dimer är generellt renteral administration på människa.

Exempel 3 Procedur för dragering av stärkelsemikrosfärer innehål- lande PEG-koncentrerat hGH.

De erhållna hGH-innehållande stärkelsemikrosfärerna från Exempel 2 beläggs med ett frisättningsreglerande hölje av PLGA medelst luftsuspensionsteknik i enlighet med WO97/14408 med användande av en blandning bestående av 75% av RG502H och 25% av RG756 (båda från Boehringer Ingelheim). Efter drageringen löses drageringen upp med en blandning av metylenklorid och aceton i förhållandet 1:3 och efter borttvättande av dessa lösningsmedel, t.ex. genom upprepad centrifugering, löses mikrosfårerna upp med a-amylas. Innehållet av hGH bestäms, t.ex. genom ana- lys med högtrycksvätskekromatografi. Innehållet av dime- rer och polymer av proteinet bestäms också med samma tek- nik. Innehàllet av protein kan vara kring ll viktprocent.

Den andel av proteinet som föreligger i form av dimerer är <2% och av polymer <0,l%. Frisättningskinetiken för hGH från de dragerade mikrosfårerna kan bestämmas in vi- tro och karakteriseras av frånvaro av en oönskad burst och i övrigt av en kontinuerlig och jämn frisättning med en duration av kring en vecka. Med detta förfarande kan således parenteralt administrerbara mikrosfärer lämpliga för kontrollerad frisättning av hGH framställas.

Exempel 4 Procedur för framställning av högkoncentre- rat/utfällt hGH lämpligt för immobilisering med använd- ning av PEG. 518 008 t .nu en 44 Utfällt hGH framställs enligt Exempel 1 med den änd- ringen att fällningen tvättas i histidinbuffert, pH 4,9.

Claims (54)

10 15 20 25 30 35 . u ø . . | c n nu u o o ø no .n n 518008 o. n u u | | ø . ø n vn PATENTKRAV

1. Förfarande för framställning av parenteralt administrerbara mikropartiklar innehållande en biologiskt aktiv substans, vilket innefattar att man a)bereder en vattenbaserad lösning av den biologiskt aktiva substans som ska införlivas i mikropartiklarna, b)blandar den i steg a) erhållna lösningen med en vattenbaserad lösning av polyetylenglykol (PEG) under sådana betingelser att den biologiskt aktiva substansen koncentreras och/eller solidifieras, c) eventuellt tvättar den i steg b) erhållna koncentrerade och/eller solidifierade biologiskt aktiva substansen, d) blandar den i steg b) eller c) erhållna koncentrerade och/eller solidifierade biologiskt aktiva substansen med en vattenbaserad stärkelselösning, e) blandar den i steg d) erhållna kompositionen med en vattenbaserad lösning av en polymer med förmåga att bilda ett tvåfas-vattensystem, så att det bildas en emulsion av stärkelsedroppar, vilka innehåller den biologiskt aktiva substansen som inre fas i en yttre fas av nämnda polymerlösning, f) bringar eller tillåter de i steg e) erhållna stärkelsedropparna att solidifieras till stärkelsemikropartiklar, g) torkar stärkelsemikropartiklarna från steg f), och h) eventuellt applicerar ett frisättningsreglerande hölje av en biokompatibel och bionedbrytbar polymer på de torkade stärkelsemikropartiklarna från steg f).

2. Förfarande enligt krav 1, vari steg b) utföres så att solidifieringen av den biologiskt aktiva substansen leder till utfällning av densamma.

3. Förfarande enligt krav l, vari steg b) utföres så att solidifieringen av den biologiskt aktiva substansen leder till en högviskös lösning, vilken 10 15 20 25 30 35 518' 008 46 uppvisar förmåga att bilda vid rumstemperatur hanterbara droppar.

4. Förfarande enligt krav 2 eller 3, vari steg b) utföres till en reversibelt solidifierad aktiv substans.

5. Förfarande enligt något av kraven 2-4, vari den solidifierade biologiskt aktiva substansen bildar en pellet eller en högviskös eller fast bottenfas vid centrifugering eller ultracentrifugering.

6. Förfarande enligt något av de föregående kraven, vari man i steg d) utnyttjar en vattenbaserad stärkelselösning innefattande stärkelse som har ett innehåll av amylopektin överstigande 85 vikt-%, där molekylvikten för nämnda amylopektin är reducerad, företrädesvis genom skjuvning, så att minst 80 vikt-% av materialet ligger inom intervallet 10-10000 kDa.

7. Förfarande enligt något av de föregående kraven, vari man i steg d) utnyttjar en vattenbaserad stärkelselösning innefattande stärkelse som har ett aminosyrakväveinnehåll understigande 50 pg per g torrvikt stärkelse.

8. Förfarande enligt något av de föregående kraven, vari den i steg d) använda vattenbaserade stärkelselösningens stärkelsekoncentration är minst 20 vikt-%.

9. Förfarande enligt något av kraven 6-8, vari stärkelsen har en renhet av högst 20 pg, företrädesvis högst 10 pg, helst högst 5 pg, aminosyrakväve per g torrvikt stärkelse.

10. Förfarande enligt något av kraven 6-9, vari stärkelsen har ett innehåll av amylopektin med nämnda reducerade molekylvikt överstigande 95 vikt-%, företrädesvis överstigande 98 vikt-%.

11. ll. Förfarande enligt något av kraven 6-10, vari molekylvikten för nämnda amylopektin är reducerad så att minst 80 vikt-% av materialet ligger inom intervallet 10 15 20 25 30 35 u o o u n ø n ø nu n n Q u no 518 008 47 o | n o :u 100-4000 kDa, allra helst 300-600 kDa.

12. Förfarande enligt något av de föregående företrädesvis 200-1000 kDa, kraven, vari stärkelsen är sådan att den kan lösas i en koncentration överstigande 25 vikt-% i vatten.

13. Förfarande enligt något av de föregående kraven, vari stärkelsen väsentligen saknar kovalent bundna extra kemiska grupper av det slag som förekommer i hydroxietylstärkelse.

14. Förfarande enligt något av de föregående kraven, vari stärkelsen har ett endotoxininnehåll understigande 25 EU/g och innehåller mindre än 100 mikroorganismer per gram.

15. Förfarande enligt något av de föregående kraven, vari stärkelsen väsentligen är renad från ytlokaliserade proteiner, lipider och endotoxiner medelst tvättning med vattenbaserad alkalilösning, molekylviktsreducerad medelst skjuvning och renad från invändiga proteiner medelst jonbyteskromatografi, företrädesvis anjonbyteskromatografi.

16. Förfarande enligt något av kraven 6-15, vari man i steg d) som stärkelse också använder 2-15 vikt-% amylos med en medelmolekylvikt inom intervallet 2,5-70 kDa, räknat på torrvikt stärkelse. företrädesvis 5-45 kDa, där viktprocentandelen är

17. Förfarande enligt något av kraven 8-16, vari man i steg d) bereder en lösning med en stärkelsekoncentration av minst 30 vikt-%.

18. Förfarande enligt något av kraven 6-17, vari man i steg d) bereder en lösning med en stärkelsekoncentration av högst 50 vikt-%, företrädesvis högst 45 vikt-%.

19. Förfarande enligt något av kraven 6-18, vari den vattenbaserade stärkelselösningen i steg d) bereds under autoklavering av densamma.

20. Förfarande enligt något av de föregående kraven, vari man i steg d) förenar den aktiva substansen 10 15 20 25 30 35 o o u | a Q nn | ø a Q - a n 518 'D08 48 med stärkelselösningen vid en temperatur av högst 60°C, företrädesvis 20-45°C, speciellt 30-37°C.

21. Förfarande enligt något av de föregående kraven, vari man i steg d) bildar en komposition vari viktförhållandet mellan stärkelse och biologiskt aktiv substans ligger inom området fràn 3:1 till lOO0O:l.

22. Förfarande enligt något av de föregående kraven, vari blandningen i steg e) utföres vid en temperatur inom området 4-50°C, företrädesvis 10-40°C, speciellt 10-37°C.

23. Förfarande enligt något av de föregående kraven, vari blandningen i steg e) utföres med hjälp av minst en statisk mixer.

24. Förfarande enligt något av de föregående kraven, vari man i steg e) sätter polymerlösningen till kompositionen i minst två steg, där minst en av tillsatserna sker efter det att emulsionen har börjat skapas.

25. Förfarande enligt något av de föregående kraven, vari man i steg e) som vattenbaserad polymer använder polyetylenglykol.

26. Förfarande enligt krav 25, vari polyetylenglykolen har en medelmolekylvikt av 5-35 kDa, företrädesvis 15-25 kDa, speciellt ca 20 kDa.

27. Förfarande enligt något av de föregående kraven, vari man i steg e) bildar stärkelsedroppar vilka ger den för mikropartiklarna önskade storleken, företrädesvis en medelpartikeldiameter, i torrt tillstànd, lO0pm, inom intervallet 10-200 pm, företrädesvis 20- ännu hellre 20-80pm.

28. Förfarande enligt krav 27, vari man efter steg e) tvättar mikropartiklarna, genom filtrering, och eventuellt siktar dem för erhållande av önskad partikelstorleksfördelning.

29. Förfarande enligt något av de föregående kraven, vari solidifieringen i steg f) sker vid minst två 10 15 20 25 30 35 518' 008 49 0 o u ø 4 n ~ o | ø n a. temperaturer, där inledningen sker vid lägre temperatur än avslutningen.

30. Förfarande enligt krav 29, vari solidifieringen inledningsvis sker inom intervallet 1- 20°C, företrädesvis l-l0°C, speciellt runt 4°C, och avslutningsvis sker inom intervallet 20-55°C, företrädesvis 25-40°C, speciellt runt 37°C.

31. Förfarande enligt något av de föregående kraven, vari torkningen i steg g) utföres i form av spraytorkning, frystorkning eller vakuumtorkning, företrädesvis frystorkning.

32. Förfarande enligt något av de föregående kraven, vari man som biologiskt aktiv substans införlivar en substans vald ur den grupp som består av proteiner, peptider, polypeptider, polynukleotider och polysackarider, speciellt rekombinant framställda proteiner.

33. Förfarande enligt något av de föregående kraven, vari appliceringen av det frisättningsreglerande höljet i steg h) utföres medelst luftsuspensionsteknik.

34. Förfarande enligt något av de föregående kraven, vari det frisättningsreglerande höljet i steg h) bildas av en homo- eller sampolymer innehållande alfa- hydroxisyraenheter.

35. Förfarande enligt krav 34, vari alfa- hydroxisyran är mjölksyra och/eller glykolsyra.

36. Mikropartiklar lämpade för parenteral administration, företrädesvis via injektion, på ett däggdjur, speciellt människa, och innehållande en biologiskt aktiv substans, vilka väsentligen består av parenteralt administrerbar bionedbrytbar stärkelse som matris, vilken innehåller den biologiskt aktiva substansen i väsentligen icke-kemiskt komplexbunden form och i form av fasta partiklar med en medelstorlek inom området 0,05-30um.

37. Mikropartiklar enligt krav 36, vari den biologiskt aktiva substansen är en utfälld substans. 10 15 20 25 30 35

38. Mikropartiklar enligt krav 36 eller 37, vari partiklarna av den biologiskt aktiva substansen har en medelstorlek inom området 0,2-10um, företrädesvis 0,5- Spm, ännu hellre 1-4um.

39. Mikropartiklar enligt något av kraven 36-38, vari stärkelsen har ett innehåll överstigande 85 vikt-% av amylopektin, för vilket minst 80 vikt-% har en medelmolekylvikt inom intervallet 10-1000 kDA.

40. Mikropartiklar enligt något av kraven 36-39, vari stärkelsen har ett aminosyrakväveinnehåll understigande 50 pg per gram torrvikt stärkelse och vilka saknar kovalent kemisk tvàrbindning mellan stärkelsemolekylerna.

41. Mikropartiklar enligt något av kraven 36-40, vari stärkelsen är sådan som definieras i något av förfarandekraven 6-16.

42. Mikropartiklar enligt något av kraven 36-41, vilka har ett frisättningsreglerande hölje erhållet eller bildat enligt definitionen i något av förfarandekraven 33-35.

43. Mikropartiklar enligt något av kraven 36-42, vari den biologiska substansens bioaktivitet är minst 80%, bibehållen, uppvisade innan den införlivades i stärkelsen. företrädesvis minst 90% och helst väsentligen jämfört med den bioaktivitet som substansen

44. Mikropartiklar enligt något av kraven 36-43, vilka är bionedbrytbara in vitro i närvaro av alfa-amylas och/eller amyloglukosidas.

45. Mikropartiklar enligt något av kraven 36-44, vilka är bionedbrytbara och elimineras från vävnad efter subkutan eller intramuskulär administration.

46. Mikropartiklar enligt något av kraven 36-45, vari den biologiskt aktiva substansen är vald ur den grupp som består av proteiner, peptider, polypeptider, polynukleotider och polysackarider.

47. Mikropartiklar enligt krav 46, vari proteinet är ett rekombinant framställt protein. . vacan- 10 15 20 25 518' 008 51 n | - v no

48. Mikropartiklar enligt krav 46 eller 47, vari proteinet är valt bland tillväxthormoner, kolonistimulerande faktorer, erytropoietiner, interferoner och vacciner.

49. Mikropartiklar enligt krav 48, vari proteinet är är ett tillväxthormon.

50. Mikropartiklar enligt krav 49, vari tillväxthormonet är humant tillväxthormon (hGH).

51. Mikropartiklar enligt något av kraven 36-50, vari innehållet av tvåvärda metalljoner är sådant att molförhållandet totala metallkatjoner: biologiskt aktiv substans är mindre än 0,2:l, företrädesvis mindre än 0,1:l, ännu hellre mindre än 0,0l:l.

52. Mikropartiklar enligt krav 51, vari de angivna molförhållandena gäller för zink som nämnda metall.

53. Mikropartiklar enligt något av kraven 50-52, vari det humana tillväxthormonets innehåll av dimerer är <2 vikt-%, vikt-%, företrädesvis <1 vikt-% och av polymerer företrädesvis

54. Mikropartiklar enligt något av kraven 50-53, vari frisättningskinetiken för hGH bestämd in vitro karaktäriseras av i huvudsak kontinuerlig och jämn frisättning under minst en vecka. o a o ø o. u »nu en