RU2799325C2 - ЛИОФИЛИЗАТ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКОГО РАДИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКОГО ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ РАДИОНУКЛИДА 99mTc - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области радиофармацевтики, а именно к лиофилизату для приготовления диагностического радиофармацевтического лекарственного препарата на основе радионуклида ^99mTc. Лиофилизат для получения диагностического радиофармацевтического лекарственного препарата на основе радионуклида ^99mTc, состоящий из смеси восстановителя – олова дихлорида двухводного (SnCl₂⋅2H₂O), солиганда – трицина (C₆H₁₃NO₅), носителя атомов радионуклида – ПСМА-тропной молекулы Hynic-iPSMA, солиганда EDDA (C₆H₁₂N₂O₄), а также глюконата натрия, отличающийся тем, что в состав входит 15 мг трицина, 0,015 мг олова дихлорида двухводного, 20 мг глюконата натрия, 5 мг EDDA, 0,025 мг Hynic-iPSMA. Вышеуказанное изобретение пригодно для получения инъекционного раствора диагностического радиофармацевтического лекарственного препарата на основе металлокомплекса ^99mTc-EDDA/Hynic-iPSMA с радиохимическим выходом не менее 98% и большей удельной активностью, чем заявлено в мировой практике. 1 з.п. ф-лы, 9 ил., 2 табл., 2 пр.

Description

Изобретение относится к области ядерной медицины, в частности к радиофармацевтике для визуализации локализации клеток, гиперэкспрессирующих рецепторы простатспецифического мембранного антигена (ПСМА-гиперэкспрессирующих клеток) рака предстательной железы методом однофотонной компьютерной томографии (ОФЭКТ-КТ) или планарной сцинтиграфии (ПС).

В настоящее время среди мужского населения России рак предстательной железы по заболеваемости занимает второе место по распространенности и уступает лишь злокачественным образованиям легочной системы. Согласно статистическим данным за 2019 год, 15,7% всех злокачественных заболеваний мужского населения приходится на рак предстательной железы (РПЖ), а динамика прироста за последние десять лет составила порядка 80% (число заболеваний на сто тысяч населения).

Помимо уже использующихся в клинической практике инструментальных методов диагностики данного заболевания (определение уровня ПСА в крови, УЗИ, МРТ), в настоящее время в мировой практике, а также с некоторым запозданием и в России, для целей получения информации о локализации очагов злокачественных новообразований (ЗНО) при РПЖ, в том числе и при метастазировании, находит свое применение метод диагностики с использованием таргетных тумаротропных радиофармацевтических лекарственных препаратов (РФЛП), визуализация распределения которых осуществляется, в зависимости от ядерно-физических характеристик радионуклида, методом позитронно-эмиссионной компьютерной томографией (ПЭТ-КТ) в случае использования позитрон-эмиттирующего радионуклида, либо методом однофотонной эмиссионной компьютерной томографии или планарной сцинтиграфии, в случае использования γ-эмиттриующего радионуклида в диапазоне энергии фотона ≈ 100 - 250 кэВ.

ПСМА представляет собой трансмембранный гликопротеин II типа, состоящий из 750 аминокислот, который распространен на поверхности клеток РПЖ и высоко гиперэкспрессируется ими, в частности при андроген-независимом, распространенном и метастатическом этапах заболевания. Последний факт наиболее важен, так как практически во всех случаях РПЖ становится андроген-независимым со временем. Таким образом, ПСМА обладает потенциалом для использования в качестве многообещающей мишени для диагностики данного заболевания, так как он распространён на всех стадиях и имеет селективную гипер-экспрессию (только в простате), присутствует на клеточной поверхности, но не попадает в кровоток и имеет ферментную или сигнальную активность (Патент EA 037512 B1, Улучшенные ингибиторы простатического специфического мембранного антигена (ПСМА), меченные 18f, и их применение в качестве визуализирующих агентов при раке простаты) (Фиг. 1). Установлено, что в клетке РПЖ присутствует до 10⁶ молекул ПСМА, что способствует возможности избирательного накопления радионуклида на поверхности клеток РПЖ за счет использования радионуклид-содержащих транспортных таргетных молекул, обладающих повышенной тропностью к ПСМА. Именно к такому типу молекул относится молекула общей структуры EDDA/Tricine-^99mTc-Hynic-2Nal-Lys-urea-Glu (^99mTc-Hynic-iPSMA), являющаяся главным диагностическим агентом в радиофармацевтическом лекарственном препарате, полученном из выносящегося на защиту набора лиофилизированных реагентов.

В мировой практике для таргетной доставки различных радионуклидов к клеткам РПЖ, а также к метастазам, зарекомендовали себя соединения, содержащие мочевинный мотив Glu-urea-Lys, ответственный за связывание с клетками РПЖ, а именно с цинкосодержащими доменами в ПСМА (HyunsooHa, HongmokKwon, TaehyeongLim, JaebongJang, Song-KyuPark, YoungjooByun, «Inhibitorsofprostate-specificmembraneantigeninthediagnosisandtherapyofmetastaticprostatecancer - areviewofpatentliterature», / Expertopinionontherapeuticpatents // 2021, doi:10.1080/13543776.2021.1878145).

Данный мотив остается неизменным, а мировое многообразие различных молекул, используемых для доставки радионуклидов к клеткам РПЖ достигается за счет видоизменения линкера в составе такой молекулы, а также хелатора (в случае использования радионуклида металла) или фрагмента для введения иона галогена (в случае использования радионуклида галогена, в частности, ¹⁸F). Данные молекулы отличаются линкором - большая часть молекулы между неизменным Glu-urea-Lys мотивом и связанным радионуклидом. Структура линкера в большей степени влияет на поведение молекулы в организме.

Далее более подробно будет рассмотрено именно использование молекул, содержащих хелатирующий агент, не затрагивая молекулы с фрагментом для введения иона галогена. При этом, будут рассмотрены ПСМА-активные молекулы, содержащие хелатирующие агенты для связывания именно радионуклида технеция-99, не затрагивая иные диагностические радионуклиды, и как следствие, хелаторы, образующие комплексные соединения с радионуклидами, не входящими в область наших научных интересов.

Наиболее распространенным методом радионуклидной диагностики локализации ПСМА-гиперэкспрессирующих клеток РПЖ является методика визуализации распределения радионуклида в теле пациента с помощью однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (ОФЭКТ-КТ), либо планарной сцинтиграфии (ПС) (Кумар А., Киреев В.С., «Обзор Российского рынка ядерной медицины», / Фундаментальные исследования // № 2, 134-138, 2018, doi: 10.17513/fr.42088). Основным отличием от ПЭТ-КТ исследования является меньшая точность метода, а точнее - образующегося изображения биораспределения γ-эмиттирующего радионуклида в теле пациента, что обусловлено, в первую очередь, меньшей энергией испускаемых/детектируемых γ-квантов по сравнению с энергией, образующейся при аннигиляции позитрона и электрона, а также отсутствием дублирующего γ-кванта под углом 180°, как при ПЭТ/КТ визуализации.

При этом, в количественном выражении доступность оборудования для ОФЭКТ-КТ и ПС визуализации практически на порядок больше, по сравнению с ПЭТ/КТ (Кумар А., Киреев В.С., «Обзор Российского рынка ядерной медицины», / Фундаментальные исследования // № 2, 134-138, 2018, doi: 10.17513/fr.42088), что является неоспоримым плюсом данного метода визуализации, по сравнению с ПЭТ-КТ исследованием. Также одно исследование на ОФЭКТ-КТ, а тем более при ПС, в среднем, обходится существенно дешевле аналогичного исследования на ПЭТ-КТ.

Самым распространенным диагностическим радионуклидом для ОФЭКТ/КТ визуализации является метастабильный изомер технеция ^99mTc (T_1/2 = 6,01 ч.), снятие возбуждения которого и переход в ⁹⁹Tc происходит с испусканием γ-кванта с энергией около 140 кэВ, что позволяет детектировать локализацию данного распада в теле пациента методом ОФЭКТ-КТ или ПС, и как следствие, визуализировать местонахождение ЗНО, в том числе и метастазов, при использовании туморотропных РФЛП на основе данного радионуклида, в частности, в составе комплекса с молекулами, обладающими повышенным сродством к ПСМА рецепторам, описанными выше.

В мировой практике известно несколько ПСМА-активных комплексных соединений с ^99mTc, содержащих Glu-urea-Lys фрагмент и обеспечивающих визуализацию локализации клеток РПЖ методом ОФЭКТ/КТ или ПС. Например, известен технеций- и рений-бис(гетероарильные) комплексы и методы их применения для ингибирования PSMA(RU 2532912 C2), включающий транспортную молекулу, содержащую Glu-urea-Glu (по аналогии с Glu-urea-Lys) фрагмент, комплекс такой молекулы с радионуклидами металлов технеция (^99mTc) или рения (¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re), а также применение таких комплексов для визуализации ПСМА-гиперэкспрессирующих клеток РПЖ, либо их терапии в случае использования металлокомплексов с радиоизотопами рения. Частным случаем данного изобретения является молекула ^99mTc-MIP-1404, с общей формулой:

.

Были проведены клинические исследования данного комплексного соединения (Kevin Mark Slawin et al, «A phase II study of ^99mTc-trofolastat (MIP-1404) SPECT/CT to identify and localize prostate cancer in high-risk patients undergoing radical prostatectomy (RP) and extended pelvic lymph node dissection (EPLND) compared to histopathology: An interim analysis.»2014 GenitourinaryCancersSymposium 2014 abstracts, / JournalofClinicalOncology // Vol. 32(4), 94-94, 2014), показавшие возможность визуализации локализации клеток РПЖ, однако основным недостатком получения данного радиофармацевтического лекарственного препарата является необходимость предварительного перевода пертехнетат анионов в трикарбоксильную форму, и в целом более сложный метод получения целевой металлокомплексной молекулы, чем в заявляемом нами на защиту решении.На первом этапе получения радиофармацевтического лекарственного препарата на основе ^99mTc-MIP-1404 проводится перевод пертехнетат анионов активностью около 1500 МБк, полученных из генератора в форме ^99mTcO₄ ^- в трикарбонильную промежуточную реакционоспособную форму [^99mTc(CO)₃(H₂O)₃]⁺, после чего, на втором этапе, идет взаимодействие трикарбонильного технеция-99м с молекулой MIP-1404 (100 мкг) при нагревании до 100°С в течение 30 минут, после чего, натретьем этапе, происходит выпаривание растворителя с последующим растворением образовавшегося сухого радиоактивного остатка в смеси трифторуксусной кислоты и дихлорметана в течение 45 минут при комнатной температуре для снятия защитных трет-бутильных групп, после чего, на четвертом этапе, образовавшуюся реакционную смесь концентрировали с использованием роторного испарителя с последующей очисткой на ВЭЖХ колонке, после чего целевой продукт растворяли в изотоническом растворе 0,9% натрия хлорида. В результате был получен раствор, пригодный для инъекционного введения, в котором радиохимическая чистота образованного металлокомплекса ^99mTc-MIP-1404 была не менее 95%, а радиохимический выход достигал 70% (ShawnM.Hillier, KevinP. Maresca, GenliangLu, RossD. Merkin, JohnC. Marquis, CraigN. Zimmerman,WilliamC. Eckelman, JohnL. Joyal, andJohnW. Babich, «^99mTc-LabeledSmall-MoleculeInhibitorsofProstate-pecificMembraneAntigenforMolecularImagingofProstateCancer», / THEJOURNALOFNUCLEARMEDICINE // Vol. 54 (8), 1369-1376, 2013, doi: 0.2967/jnumed.112.116624).

Однако, известный раствор достаточно трудоемок при получении целевого металлокомплекса, как по времени, так и по количеству операций, во-вторых, низкий радиохимический выход и радиохимическая чистота конечного продукта. Поэтому в защищаемом нами решении было принято не прибегать к концепции хелатирования технеции-99м в форме трикарбонил катиона, а использовать более быстрый и простой метод - восстановление галогенидами олова, в частности дихлоридом олова.

Необходимости перевода в трикарбонильную форму технеция-99м лишена, например, методика получения соединения ^99mTc-PSMA-I&S (StephanieRobu, MargretSchottelius, MatthiasEiber, TobiasMaurer, JürgenGschwend, MarkusSchwaiger, andHans-JürgenWester, «PreclinicalEvaluationandFirstPatientApplicationof ^99mTc-PSMA-I&SforSPECTImagingandRadioguidedSurgeryinProstateCancer», / THEJOURNALOFNUCLEARMEDICINE // Vol. 58 (2), 235-242, 2017, doi: 10.2967/jnumed.116.178939), используемого для визуализации локализации ПСМА-гиперэкспрессирующих клеток РПЖ методом ОФЭКТ-КТ или ПС, при которой в качестве визуализирующего агента используется металлокомплекс технеция-99м, также содержащий Glu-urea-Lys фрагмент - а именно: ^99mTc-MAS3-PSMA (^99mTc-PSMA-I&S), с общей формулой:

.

В данной разработке технеций связывается с атомом серы и тремя атомами азота, входящими в состав хелатора MAS3, представляющим из себя меркаптоацетил-три-серин. Данный хелатор образует связь с технецием-99м при нагревании до 90-100°С в течение 20 минут, при этом как было отмечено выше, отсутствует необходимость перевода пертехнетат аниона в трикарбонильную форму, а для целей связывания технеция-99м с молекулой MAS3-PSMA используется восстанавливающий агент - дихлорид олова.

Однако, к недостаткам методики приготовления относится, во-первых, достаточно сложная пептидная структура транспортной молекулы MAS3-PSMA, а, во-вторых, при реакции радиомечения от 10-30% активности технеция-99м не связывается с целевой молекулой, а оседает в виде коллоида, т.е. радиохимический выход не достигает 95% и лежит в диапазоне 65-85%, что влечет за собой необходимость включения дополнительной стадии очистки продукта на SPE картридже, а также потерю активности - до 30%, что может быть существенным недостатком с учетом ограниченного срока годности генератора технеция-99м. Авторами публикации был доработан состав набора лиофилизированных реагентов, состоящих из одного флакона, и обеспечивающих, как было заявлено, образование побочного коллоидного технеция-99м с выходом не более 99 % за счет добавления тартрата натрия. В итоге, набор лиофилизатов состоит из одного флакона, транспортная молекула бралась в размере 26-39 мкг, активность технеция-99м 1000 - 1200 МБк. Также, из плюсов данной разработки - более удобный способ получения готовой инъекционной формы, чем при получении ^99mTc-MIP-1404, с использованием хлорида олова в качестве восстанавливающего агента.

Следующий вариант создания радиофармацевтического лекарственного препарата на основе металлокомплекса технеция-99м и транспортной молекулы, содержащей Glu-urea-Lys фрагмент - это молекула ^99mTc-PSMA-Hynic (EP 3721907 А1).В данном патенте защищается группа схожих соединений общей структуры PSMA-L1-L2-Hynic, а также их металлокомплексы с технецием-99м. Наиболее перспективной разработкой заявляется молекула ^99mTc-EDDA/PSMA-T4, с общей формулой:

где, как и в примере выше для металлокомплекса ^99mTc-MAS3-PSMA, технеций-99м из пертехнетата натрия, полученного из генератора, подвергается восстановлению хлоридом олова и в восстановленной входе входит в состав металлокомплекса, образуя координационные связи с атомом азота гидразиновой группы хелатора Hynic-, а также с солигандом, роль которого выполняет комбинация EDDA (этилендиаминдиуксусная кислота) и трицина. Транспортная молекула PSMA-T4 (PSMA-LTrp-4Amc-Hynic) имеет неизменный для такого типа соединений Glu-urea-Lys мотив. Также в патенте защищается состав набора реагентов, состоящего из одного флакона и обеспечивающего, при добавлении раствора натрия пертехнетата-99м, а также при нагревании до 100°С в течение 15-30 минут образование комплекса ^99mTc-PSMA-T4 с радиохимическим выходом более 90%. Набор лиофилизатов состоит из одного флакона, транспортная молекула бралась в размере 20 мкг, активность технеция-99м 300 - 1500 МБк. Данный набор в России зарегистрирован в качестве комплектующего к медицинскому изделию - генератору Полгентек производства Polatom (Польша) и владельцем регистрационного удостоверения РУ является компания ООО «Медикэр».

Известны комплексы технеция и рения с бис(гетероарилами) и способы их применения (RU 2539584 С2).Изобретение относится к соединению, с общей формулой:

или его фармацевтически приемлемой соли, или сольвату. Значения радикалов следующие: R^t - Н, C₁-C₈ алкильная группа, ион аммония, ион щелочного или щелочноземельного металла; R₈₄ - незамещенный C_1-8 алкил; R - С_1-8 гидроксиалкил, C_1-8 алкоксиалкил, C_1-8 аминоалкил, (CH₂)₈(NHC(S)NH)Ph(SO₂NH₂), (CH₂)_dPh(SO₂NH₂), (CH₂)₅C(O)NH-(1-ацетилпирролидин-2-ил)борная кислота, (1-ацетилпирролидин-2-ил)борная кислота, (CH₂)₄CH(NH₂)CO₂H, (CH₂)₃CH(NH₂)CO₂H, (CH₂)₂CH(NH₂)CO₂H, -(CH₂)_d-R₈₀, -C(O)(CH₂)_d-R₈₀, или аминокислотный радикал; R₈₀ - карбоксилат, С_6-10 арил, 3-6 членный гетероциклил, аминокислота; d представляет собой целое число в интервале от 0 до 12 включительно; и R₈₂, R₈₃, R₈₅ и R₈₆ - водород, или замещенный или незамещенный алкил, простой эфир, сложный эфир, СН₂СН₂ОСН₂СН₃, СН₂СН(ОСН₃)₂, -(CH₂)_d-R₈₀, или (CH₂)_dR₈₇; где R₈₇ представляет собой фосфонат или фосфинат. Также предложен комплекс, содержащий вышеуказанное соединение и радионуклид технеций-99m, рений-186 или рений-188.

Однако, как и в патенте RU 2532912 C2, для образования металлокомплекса необходим трикарбонильный катион технеция-99м, получение которого - достаточно трудоемкая задача.

Самым близким является радиофармацевтический препарат для выявления сверхэкспрессиипростатспецифического мембранного антигена Tc-EDDA/ HYNIC-iPSMA (EA 201892668 A1), с общей формулой:

В данном случае, как и в примерах выше для ^99mTc-EDDA/PSMA-T4 и ^99mTc-MAS3-PSMA, восстановление технеция-99м происходит с помощью дихлорида олова, без образования трикарбонильной промежуточной формы, как для ^99mTc-MIP-1404, что является преимуществом. При этом, в основе металлокомплекса ^99mTc-EDDA/Hynic-iPSMA лежит концепция образования координационных связей с атомом азота гидразиновой группы хелатора Hynic, а также с солигандом, роль которого выполняет комбинация EDDA (этилендиаминдиуксусная кислота) и трицина, как и в примере выше с PSMA-T4 (такого рода хелатирование протекает быстрее, чем с использованием хелатора MAS3), вот только в структуре линкера молекулы Hynic-iPSMA (PSMA-L2Nal-Hynic), в отличие от PSMA-T4, отсутствует фрагмент транексамовой кислоты (4Amc), а также вместо триптофана (LTrp) используется 2-нафтилаланин (L2Nal). Именно за счет данного видоизменения в структуре линкера, полученный металлокомплекс ^99mTc-EDDA/Hynic-iPSMA проявляет наиболее предпочтительные фармакологические свойства по сравнению с ^99mTc-EDDA/PSMA-T4, а именно, например, величина IC50 для ^99mTc-EDDA/Hynic-iPSMA почти в 30 раз превосходит концентрацию для ^99mTc-EDDA/PSMA-T4. Также в патенте защищается состав набора реагентов (лиофилизатов), состоящего из одного флакона и обеспечивающего, при добавлении 1 мл 0,2 М фосфатного буферного раствора с рН = 7 и последующего добавления раствора натрия пертехнетата-99м образование комплекса ^99mTc-EDDA/Hynic-iPSMA с радиохимическим выходом более 98%. Набор лиофилизатов состоит из одного флакона, транспортная молекула бралась в размере 37,5 мкг, активность технеция-99м не указана.

Однако, при проведении экспериментальных работ, следуя рекомендациям заявки на патент, радиохимический выход не превысил 72%.

Именно поэтому, с учетом всех плюсов и преимуществ металлокомплекса ^99mTc-EDDA/Hynic-iPSMA по сравнению с остальными решениями, было решено доработать лиофилизированный реагент и условия образования металлокомплекса ^99mTc-EDDA/Hynic-iPSMA для достижения целевого радиохимического выхода 98% (Таблица 1).

Таблица 1
Сравнение ПСМА-активных металлокомплексов на основе технеция-99м
Металлокомплекс	Величина IC50 (нМ)	Набор лиофилизатов	Комментарии
99mTc-MIP-1404	1,07 ± 0,89 [5]	несколько флаконов	Наилучшее связывание с клетками, но самый сложный синтез, много реагентов, плохой радиохимический выход, много стадий и соотношение транспортная молекула : технеций-99м (100 мкг : 1500 МБк)
99mTc-MAS3-PSMA	39,7 [6]	один флакон	Среднее связывание с клетками, простой синтез из набора, образуется много коллоидного технеция-99м, из-за чего невысокий радиохимический выход, соотношение транспортная молекула : технеций-99м (26-39 мкг : 1000-1200 МБк)
99mTc-EDDA/PSMA-T4	80 (EP 3721907 А1 стр. 12)	один флакон	Наихудшее связывание с клетками, простой синтез и удовлетворительный радиохимический выход, наилучшее соотношение транспортная молекула : технеций-99м (20 мкг : 1500-МБк)
99mTc-EDDA/Hynic-iPSMA	2,9 ± 0,7 (EA 201892668 A1 стр. 9)	один флакон	Наилучшее сочетание хорошего связывания с клетками и простоты радиосинтеза, малый радиохимический выход при условиях согласно патенту на изобретение - реакция без нагревания, соотношение транспортная молекула : технеций-99м (37,5 мкг : нет информации о активности в МБк)

Известна также статья, в которой более детально описана методика формирования металлокомплекса ^99mTc-EDDA/Hynic-iPSMA с использованием набора лиофилизатов, при котором активность технеция-99м берется в количестве 555-740 МБк в 1 мл, раствор нагревается 10 минут при 95°С, что приводит к радиохимическому выходу, равному 98% (FranciscoOsvaldoGarcía-Pérez, JennyDavanzo, SergioLópez-Buenrostr1, ClaraSantos-Cuevas, GuillerminaFerro-Flores, MiguelAJímenez-Ríos, AnnaScavuzzo, ZaelSantana-Ríos, SevastiánMedina-Ornelas, «Headtoheadcomparisonperformanceof ^99mTc-EDDA/HYNIC-iPSMASPECT/CTand ⁶⁸Ga-PSMA-11 PET/ CTaprospectivestudyinbiochemicalrecurrenceprostatecancerpatients», / AmJNuclMedMolImaging // Vol. 8 (5), 332-340, 2018). При этом, даже с учетом достижения отличного радиохимического выхода, равного 98%, применяя нагревание (в отличие от методики по патенту EA 201892668 A1), соотношение транспортная молекула : технеций-99м (37,5 мкг : 555-740 МБк) приводит к не лучшей величине удельной активности готового препарата.

Задачей изобретения является создание лиофилизата, пригодного для получения инъекционного раствора диагностического радиофармацевтического лекарственного препарата на основе металлокомплекса ^99mTc-EDDA/Hynic-iPSMA с радиохимическим выходом не менее 98% и с большей удельной активностью, достигаемой использованием меньшего количества молекул Hynic-iPSMA в составе набора и большей возможной активностью раствора [^99mTc] пертехнетата натрия, полученного из генератора или экстрактора (до 1480 МБк).

Задача решается тем, что также как и в известном решении (EA 201892668 A1) в одном флаконе содержится лиофилизат смеси восстановителя - хлорида олова (SnCl₂ ⋅2H₂O), солиганда - трицина (C₆H₁₃NO₅), носителя атомов радионуклида - ПСМА-тропной молекулы Hynic-iPSMA, солиганда EDDA (C₆H₁₂N₂O₄), а также глюконата натрия, вместо маннита, и данный набор применяется для получения диагностического радиофармацевтического лекарственного препарата на основе металлокомплекса ^99mTc-EDDA/Hynic-iPSMA.

Особенность заявляемого способа является то, что в состав входит 15 мг трицина, 0,015 мг олова дихлорида двухводного, 20 мг глюконата натрия, 5 мг EDDA, 0,025 мг Hynic-iPSMA, с общей активностью полученного раствора - 1480 МБк.

Изобретение поясняется подробным описанием, таблицами, примерами и иллюстрациями на которых изображено:

Фиг. 1- Пример некоторых молекул, содержащих Glu-urea-Lys мотив в своем составе, а также радионуклид, инкорпорированный в молекулу за счет либо ковалентной связи по обменному механизму, либо за счет образования комплекса.(данные молекулы отличаются линкором - большая часть молекулы между неизменным Glu-urea-Lys мотивом и связанным радионуклидом. Структура линкера в большей степени влияет на поведение молекулы в организме.

Фиг. 2 - Диаграмма: динамика изменения активности ^99mTc-HYNIC-ПСМА и гидролизованного ^99mTc.

Фиг. 3 - Диаграмма: динамика изменения концентрации ^99mTc-Hynic-iPSMA в опухоли 22Rv1 мышей линии BALB/cnu/nu(nude) с раком предстательной железы после внутривенного введения (в % от введенной дозы на 1 г ткани).

Фиг. 4 - Диаграмма: динамика изменения концентрации ^99mTc-Hynic-iPSMA в крови мышей линии BALB/cnu/nu(nude) с раком предстательной железы после внутривенного введения (в % от введенной дозы на 1 г ткани).

Фиг. 5 - Диаграмма: динамика изменения концентрации ^99mTc-Hynic-iPSMA в мышце мышей линии BALB/cnu/nu(nude) с раком предстательной железы после внутривенного введения (в % от введенной дозы на 1 г ткани).

Фиг. 6 - Диаграмма: динамика изменения концентрации ^99mTc-Hynic-iPSMA в предстательной железе мышей линии BALB/cnu/nu(nude) с раком предстательной железы после внутривенного введения (в % от введенной дозы на 1 г ткани).

Фиг. 7 - Диаграмма: коэффициенты дифференциального накопления (КДН) ^99mTc-Hynic-iPSMA в опухоль предстательной железы Nude мышей по отношению к крови после внутривенного введения препарата.

Фиг. 8 - Диаграмма: коэффициенты дифференциального накопления (КДН) ^99mTc-Hynic-iPSMA в опухоль предстательной железы Nude мышей по отношению к мышце после внутривенного введения препарата.

Фиг. 9 -Диаграмма: коэффициенты дифференциального накопления (КДН) ^99mTc-Hynic-iPSMA в опухоль предстательной железы Nude мышей по отношению к нормальной предстательной железы после внутривенного введения препарата.

Изобретение осуществляют следующим образом.

В круглодонную колбу с двумя горловинами, емкостью 250 мл, снабженную магнитной мешалкой помещают 100 мл воды для инъекций, добавляют 1500 мг трицина, перемешивают до полного растворения, затем добавляют 1,5 мг двухлористого олова двухводного, тщательно перемешивают в течение 5 минут, затем добавляют 2000 мг глюконата натрия, перемешивают до полного растворения, затем добавляют 500 мг EDDA, тщательно перемешивают, затем добавляют 2,5 мг Hynic-iPSMA, после чего перемешивают в течение 5 минут. Полученный раствор фильтруют под вакуумом через ацетат-целлюлозный стерилизующий фильтр с размером пор 0,22 мкм. Фильтрованный раствор расфасовывают автоматической пипеткой с номиналом 100-1000 мкл во флаконы из дрота для лекарственных средств (ТУ 9461-010-00480514-99) вместимостью 10 мл по 1 мл в каждый (всего 100 флаконов). Весь процесс проводят в токе аргона. Затем флаконы помещают в камеру сублиматора на полку, охлажденную до минус 20°С. В камере создают давление 0,1-0,2 мм.рт.ст. с помощью вакуумного насоса. При этих условиях проводят лиофильную сушку в течение 43 ч, после этого камеру заполняют сухим аргоном до атмосферного давления. Затем флаконы удаляют из камеры, укупоривают резиновыми пробками и вальцуют алюминиевыми колпачками (ГОСТ Р 51314-99). На флакон наносят этикетку. Режим лиофилизации подробно представлен далее.

Методика лиофильной сушки реагентов.

Перед расфасовкой растворов компонентов для получения набора лиофилизатов включают сублимационную установку и охлаждают полки до минус 30°С. Флаконы с расфасованными растворами устанавливают на охлажденные полки, закрывают герметично двери сублимационной камеры и продолжают замораживание растворов во флаконах в течение 30 мин. После этого включают конденсер, доводят температуру конденсера до 50-55°С, включают вакуумный насос. После достижения вакуума 0,3 мм.рт.ст. отключают охлаждение полок и проводят лиофильную сушку в таком режиме (плавающий режим). В плавающем режиме через 20 ч вакуум в сублимационной камере достигает 4⋅10^-3 мм.рт.ст. Температура полок постепенно повышается до минус 12°С через 1 ч после начала сушки, через 3 ч температура полок повышается до минус 8°С, через 10 ч - до 0°С, через 20 ч до плюс 10°С, через 40 ч температура в камере повышается до плюс 24-27°С. При температуре плюс 24-27°С проводят сушку в течение 4 ч. Суммарная длительность сушки составляет 44 ч. После этого отключают вакуумный насос, открывают штуцер сублимационной камеры и через силиконовый шланг заполняют сублимационную камеру аргоном до атмосферного давления, фильтруя аргон через фильтр с размером пор 0,22 мкм. После этого открывают дверь сублимационной камеры, которая находится в стерильном помещении, удаляют поддоны с флаконами из камеры, быстро закрывают флаконы резиновыми пробками и обжимают алюминиевыми колпачками. На флаконы наклеивают этикетки, помещают их в холодильник и хранят при температуре плюс 2-8°С.

Во флаконе реагенты находятся в лиофилизированной форме (таблица 2). Содержимое флакона стерильно и находится в инертной среде, преимущественно в среде аргона, либо азота с минимальным содержанием кислорода.

Таблица 2
Состав флакона лиофилизата
Лиофилизат для изготовления РФЛП на основе металлокомплекса 99mTc-EDDA/Hynic-iPSMA	Флакон № 1
	Трицин, мг	SnCl2 * 2H2O, мг	Глюконат натрия, мг	EDDA, мг	Hynic-iPSMA, мг
	15	0,015	20	5	0,025

Во флаконе содержится стерильный лиофилизат смеси восстановителя - хлорида олова (SnCl₂ ⋅2H₂O), солиганда - трицина (C₆H₁₃NO₅), носителя атомов радионуклида - ПСМА-тропной молекулы Hynic-iPSMA, солиганда EDDA (C₆H₁₂N₂O₄), а также глюконата натрия. Олово дихлорид 2х-водный является восстановителем технеция-99м до более низкого валентного состояния, так как технеций-99м в высшем окисленном состоянии (степень окисления +7), полученный в форме [^99mTc] пертехнетат иона не образует комплекса с носителем (Hynic-iPSMA), трицин необходим для стабилизации восстановленного технеция и дальнейшей кросс-лигандирующей функции совместно с EDDA, а также образовании устойчивого металлокомплекса, глюконат натрия выполняет функцию буферного и кросс-линкерного агента.

Все реагенты есть в свободном коммерческом доступе. Молекула Hynic-iPSMA синтезируется методом пептидного синтеза.

Срок годности флакона составляет один год.

Экспериментальная часть.

Пример 1.

Получение потенциального диагностического РФЛП на основе металлокомплекса ^99mTc-EDDA/Hynic-iPSMA из заявляемого на защиту изделия - набора лиофилизатов, описанного выше.

Работы проводятся в асептических условиях с соблюдением норм радиационной безопасности.

Во флакон с лиофилизатом емкостью 10 см³, содержащий лиофилизированную смесь 15 мг трицина, 0,015 мг олова дихлоридадвухводного, 20 мг глюконата натрия, 5 мг EDDA, 0,025 мг Hynic-iPSMA добавляют до 1480 МБк раствора [^99mTc] пертехнетата натрия, полученного из генератора или экстрактора, в 0,5-2 мл физиологического раствора, перемешивают до полного растворения осадка. Смесь оставляют в защитном контейнере на 5 минут.

После выдерживания образовавшегося раствора в течение 5 минут, флакон с полученной смесью нагревают 25-30 минут при температуре 95°С.

После нагрева смесь охлаждают до комнатной температуры. Объем раствора доводят до 4,0 мл путем добавления физиологического раствора. При необходимости, полученный раствор фильтруют через шприцевую насадку с размером пор 0,22 мкм в стерильный флакон емкостью 10 см³.

Радиохимические примеси в виде несвязанного и гидролизованного ^99mTc не превышают 2,0 %. Стабильность РФЛП ^99mTc-Hynic-iPSMA сохраняется на уровне 97-98 % в течение 48 ч (Фиг. 2).

Контроль качества проводят с помощью ТСХ с последующим радиометрическим измерением участков ТСХ пластины.

Пример 2.

Изучение биораспределения металлокомплекса ^99mTc-Hynic-iPSMA на лабораторных животных.

Для экспериментальных работ использовали мышей линии BALB/cnu/nu(nude) с перевитыми клетками рака предстательной железы 22Rv1.

Динамика изменения концентрации ^99mTc-Hynic-iPSMA в опухоли мышей представлена на (Фиг. 3). Измерения проводились после внутривенного введения РФЛП, контроль осуществлялся в % от введенной дозы на 1 г ткани в течение времени. Уже через 5 мин после введения накопление ^99mTc-Hynic-iPSMA в опухоли составило 2,88 ± 0,24 %/г и оставалось практически неизменным в течение последующего часа. Максимальная концентрация ^99mTc-Hynic-iPSMA (3,91 ± 0,35 %/г) была зарегистрирована в срок 3 ч после введения, снижаясь к концу исследования до 1,81 ± 0,10 %/г через 48 ч после инъекции РФЛП.

В крови наибольшая зарегистрированная концентрация ^99mTc-Hynic-iPSMA составила 3,81 ± 0,44 %/г в срок 5 мин после введения. Однако уже через 1 ч концентрация препарата в крови снизилось более чем в 4 раза до 0,86 ± 0,03 %/г и продолжала снижаться до 0,11 ± 0,01 %/г 48 ч после инъекции РФЛП (Фиг. 4).

Невысокое содержание ^99mTc-Hynic-iPSMA было зарегистрировано в мышечной ткани: всего 1,21 ± 0,13 %/г в срок 5 мин после введения препарата и 0,01-0,32 %/г в последующие сроки (Фиг. 5).

Максимальная концентрация ^99mTc-Hynic-iPSMA в предстательной железе составила 2,31 ± 0,26 %/г в срок 5 мин после внутривенной инъекции препарата. В последующие сроки (1-48 ч) удельное содержание ^99mTc-Hynic-iPSMA не превышало 1 %/г (0,07-0,93 %/г) (Фиг. 6).

Для диагностических РФЛП важна не столько величина удельного содержания его в опухоли, сколько относительное накопление в ней по отношению к окружающим здоровым тканям, прежде всего крови и мышечной ткани. При анализе численных значений коэффициентов дифференциального накопления (КДН) опухоль/внутренние органы было установлено, что наиболее низкие величины КДН были отмечены через 5 мин после введения ^99mTc-Hynic-iPSMA. Так, в срок 5 мин после введения содержание ^99mTc-Hynic-iPSMA в опухоли было ниже, чем в крови (Фиг. 7).

В последующие сроки за счет накопления ^99mTc-Hynic-iPSMA в опухоли и выведения из внутренних органов и тканей наблюдался рост величин КДН, и для большинства органов и тканей эти значения были существенно выше 1. Максимальные значения КДН опухоль/кровь достигали 19,11 ± 2,50 и опухоль/предстательная железа - 36,48 ± 8,87 через 24 ч (Фиг. 7 и Фиг. 9), опухоль/мышца - 182,50 ± 22,07 через 48 ч (Фиг. 8).

Заявляемое изобретение позволяет получить диагностический радиофармацевтический лекарственный препарат с большей удельной активностью ^99mTc-EDDA/Hynic-iPSMA, чем заявлено в мировой практике, т.к. достигается возможность получения 1480 МБк продукта с радиохимическим выходом не менее 98%, уменьшая количество молекулы Hynic-iPSMA до 25 мкг, что достигается изменением концентрации некоторых вспомогательных веществ, а также применением глюконата натрия вместо маннита.

Claims (2)

1. Лиофилизат для получения диагностического радиофармацевтического лекарственного препарата на основе радионуклида ^99mTc, состоящий из смеси восстановителя – олова дихлорида двухводного (SnCl₂⋅2H₂O), солиганда – трицина (C₆H₁₃NO₅), носителя атомов радионуклида – ПСМА-тропной молекулы Hynic-iPSMA, солиганда EDDA (C₆H₁₂N₂O₄), а также глюконата натрия, отличающийся тем, что в состав входит 15 мг трицина, 0,015 мг олова дихлорида двухводного, 20 мг глюконата натрия, 5 мг EDDA, 0,025 мг Hynic-iPSMA.

2. Лиофилизат по п.1, отличающийся тем, что общая активность полученного раствора диагностического радиофармацевтического лекарственного препарата достигает 1480 МБк.

Images