PL239934B1 - Pochodne inhibitorów PSMA do znakowania ⁹⁹ᵐTc poprzez HYNIC, zestaw radiofarmaceutyczny, preparat radiofarmaceutyczny oraz ich zastosowanie w diagnostyce raka prostaty - Google Patents

Description

PL 239 934 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są nowe pochodne inhibitorów PSMA (Prostatę Specific Membrane Antigen) przystosowane do znakowania radionuklidem ^99mTc, zestawy farmaceutyczne do sporządzania znakowanych ^99mTc preparatów radiofarmaceutycznych, preparaty radiofarmaceutyczne oraz ich zastosowanie do diagnostyki raka prostaty i jego przerzutów.

Rak prostaty jest najczęściej występującym nowotworem u mężczyzn. Wczesna diagnostyka i terapia jest obecnie możliwa dzięki radioizotopowym markerom takim jak analogi inhibitora PSMA. Specyficzny dla prostaty antygen błonowy (PSMA) ulega ekspresji przede wszystkim w prawidłowych komórkach nabłonka gruczołowego prostaty i ulega podwyższeniu w raku prostaty, w tym w chorobie przerzutowej. Ponieważ nadekspresję PSMA obserwuje się praktycznie dla wszystkich typów raka prostaty, a jego ekspresja jest dalej zwiększona w słabo zróżnicowanych, przerzutowych i opornych na hormony nowotworach złośliwych [1], jest atrakcyjnym celem molekularnym do opracowania radiofarmaceutyków do wykrywania pierwotnego i przerzutowego raka gruczołu krokowego, oceny stopnia zaawansowania i leczenia choroby.

W ostatnich latach prowadzone są liczne prace nad specyficznymi inhibitorami PSMA o wysokim powinowactwie do komórek nowotworowych raka prostaty, które po wyznakowaniu odpowiednim radioizotopem mogą zostać wykorzystane do diagnostyki lub terapii. Niedawno wprowadzony na rynek marker 68Ga-PSMA-11 do pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) okazał się niezwykle przydatny do diagnostyki przerzutów raka prostaty i spowodował ogromne zainteresowanie wykorzystaniem innych analogów inhibitora PSMA.

Mimo, że w ostatnich latach widoczny jest duży wzrost zainteresowania procedurami diagnostycznymi PET, to jednak metoda SPECT z użyciem radiofarmaceutyków znakowanych radionuklidem technetu-99m (^99mTc) wciąż stanowi znaczącą większość ze wszystkich procedur medycyny nuklearnej (>85%). Technet-99m jest najpopularniejszym radionuklidem diagnostycznym co wynika zarówno z jego własności fizycznych (T1/2 6,01 h, Ey 141 keV), dostępności (generatory ⁹⁹Mo/^99mTc), bardzo bogatej chemii koordynacyjnej, a także ze względu na jego niską radiotoksyczność.

Już ponad 10 lat temu pojawiło się kilka prac na temat inhibitorów PSMA znakowanych ^99mTc, które w strukturze zawierają układ karbonylkowy do wiązania radionuklidu [2,3]. Jednak opisane preparaty posiadały pewne wady, jak chociażby wolną farmakokinetykę, duży wychwyt przez wątrobę, wolny klirens w przewodzie pokarmowym, co może zaburzyć ich zastosowanie w obrazowaniu raka prostaty, ponieważ najczęściej nowotwór przerzutuje do dolnego odcinka kręgosłupa, miednicy i węzłów chłonnych w obrębie jamy brzusznej. Zatem priorytetem było opracowanie inhibitorów PSMA wyznakowanych ^99mTc o polepszonej biodystrybucji i farmakokinetyce. W ostatnich latach powstało wiele analogów inhibitora PSMA, które zawierają układy chelatujące dla technetu-99m typu N4 lub HYNIC, które znacząco zmniejszyły lipofilowość radioznakowanych preparatów [4-6]. Z drugiej jednak strony, zgodnie z opublikowanymi przez autorów danymi biodystrybucji [4,5] i na podstawie wyników naszych badań podanych w przykładzie 6, opracowane preparaty charakteryzują się bardzo wysokim gromadzeniem w nerkach, co może utrudniać interpretację obrazów scyntygraficznych. Dodatkowymi niedogodnościami znanych pochodnych PSMA zawierających w strukturze HYNIC jako chelator, jest ograniczona trwałość tych związków. Wolna grupa hydrazynowa występująca w biokoniugatach HYNIC charakteryzuje się wysoką podatnością na reakcje utleniania i jako silny nukleofil może reagować ze związkami o właściwościach elektrofilowych. Tego typu niepożądane reakcje prowadzą do powstania różnych produktów ubocznych. Powoduje to duże trudności w oczyszczaniu, spadek czystości podczas liofilizacji, znaczne obniżenie wydajności syntezy i zmniejszenie trwałości gotowych zestawów.

W zgłoszeniu patentowym CA2924360A1 ujawniono związek, w którym chelatorem zamiast ugrupowania HYNIC jest m.in. DOTA. W tym dokumencie ujawniono kompleks obejmujący wspomniany związek i radionuklid w postaci ^99mTc oraz kompozycję farmaceutyczną tego kompleksu lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli lub estru i farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika. Ujawniono w tym zgłoszeniu również zastosowanie związku lub jego kompleksu w sposobie obrazowania pacjenta oraz diagnozowaniu raka prostaty i/lub jego przerzutów.

W publikacji międzynarodowego zgłoszenia patentowego WO2017/222362A1 ujawniono związek ^99mTc-EDDA/HYNIC-iPSMA, który jest radiofarmaceutykiem i zawiera HYNIC jako chelator oraz fragment iPSMA, natomiast zawiera inne linkery niż związek według wynalazku. Oprócz tego, publikacja

PL 239 934 BI naukowa w Nuclear Medicine and Biology 48 (2017) 69-75 ujawnia związek, który również zawiera HYNIC i różni się linkerami od związku objętego zakresem wynalazku, który również znalazł zastosowanie w wykrywaniu raka prostaty metodą SPECT.

Inny przykład stanowi związek będący przedmiotem publikacji w J Nuci Med 2015; 56:914-920. W skład jego cząsteczki wchodzi reszta Glu(mocznik)Lys, chelator DOTA zdolny do kompleksowania ⁶⁸Ga i ¹⁷⁷Lu oraz linker, w którego skład wchodzi ugrupowanie kwasu 4-aminometylocykloheksanokarboksylowego.

Przedmiotem wynalazku są pochodne inhibitora PSMA-HYNIC przedstawione wzorem ogólnym 1:

Wzór 1. (PSMA-L1-L2-HYNIC) przy czym: Li = L-Trp; L2 = 6Ahx lub 4Amc, gdzie L-Trp oznacza L-tryptofan, 6Ahx oznacza kwas 6-aminoheksanowy, a 4Amc oznacza kwas 4-aminometylocykloheksanokarboksylowy, oraz ich farmaceutycznie dopuszczalne sole.

Przedmiot wynalazku stanowią też pochodne hydrazonowe związków przedstawionych wzorem ogólnym 1, o wzorze ogólnym 2:

Wzór 2. (PSMA-Li-L₂-HYNIC-hydrazon) przy czym:

Li = L-Trp; L2 = 6Ahx lub 4Amc, gdzie L-Trp oznacza L-tryptofan, 6Ahx oznacza kwas 6-aminoheksanowy, a 4Amc oznacza kwas 4-aminometylocykloheksanokarboksylowy,

R = (SO₃H)C₆H₄ lub 4-(CH₃)₂NC₆H₄ lub 4-(HO)C₆H₃-3-(OCH₃) oraz ich farmaceutycznie dopuszczalne sole.

Przedmiotem wynalazku jest również preparat radiofarmaceutyczny charakteryzujący się tym, że został otrzymany z jednego ze związków wskazanych powyżej poprzez połączenie wiązaniem chemicznym z izotopem ^99mTc.

Kolejny przedmiot wynalazku stanowi zestaw farmaceutyczny do znakowania izotopem ^99mTc, charakteryzujący się tym, że zawiera jeden ze związków opisanych powyżej oraz substancje pomocnicze.

Korzystnie, zestaw występuje w postaci jałowego liofilizatu w otoczeniu gazu obojętnego.

Korzystnie, zestaw charakteryzuje się tym, że substancje pomocnicze wybrane są z grupy obejmującej chlorek cyny(ll), trycynę, kwas etylenodiaminodioctowy (EDDA) oraz substancje buforujące.

PL 239 934 B1

Kolejnym przedmiotem wynalazku są pochodne opisane powyżej do zastosowania w diagnostyce scyntygraficznej raka prostaty oraz jego przerzutów.

Jak wspomniano wyżej przedmiot wynalazku stanowią nowe cząsteczki ukierunkowane na specyficzne wiązanie z PSMA, zawierające hydrazynonikotynoamid (HYNIC) jako czynnik chelatujący dla radiometalu ^99mTc, w którym kwas etylenodiaminodioctowy (EDDA) lub trycyna są stosowane do uzupełnienia sfery koordynacyjnej radiometalu, charakteryzujący się tym, że w łańcuchu łączącym część biologicznie aktywną Glu-CO-Lys z fragmentem układu chelatu ^99mTc-EDDA/HYNIC znajduje się wbudowana cząsteczka tryptofanu (LTrp), która powoduje zwiększenie lipofilowości i zmniejszenie wychwytu znakowanego preparatu w nerkach.

Zaletą cząsteczek będących przedmiotem wynalazku jest łatwość przeprowadzenia ich w pochodne hydrazonowe, które są związkami o wyższej stabilności i tym samym są łatwiejsze w oczyszczaniu oraz przechowywaniu. Dodatkową zaletą jest to, że hydrazony powstałe na skutek zabezpieczenia hydrazyny wykazują intensywną absorpcję w zakresie widzialnym z uwagi na obecność układu chromoforowego sprzężonych wiązań podwójnych i dodatkowego podstawnika auksochromowego w pierścieniu aromatycznym. Pozwala to na ich łatwiejsze rozdzielenie i oczyszczenie na kolumnie chromatograficznej. Takie prowadzenie syntezy zwiększa wydajność o ok. 20-30% i przyspiesza cykl produkcyjny, co jest istotne z punktu widzenia wytwarzania związków będących przedmiotem wynalazku.

Istotną zaletę stanowi fakt, iż ugrupowanie HYNIC-hydrazon można w wysoce wydajny sposób bezpośrednio znakować technetem-99m bez konieczności wcześniejszego odbezpieczenia grupy hydrazynowej podatnej na reakcje uboczne. W przyjętych warunkach znakowania następuje hydroliza wiązania hydrazonowego.

Powszechnie stosowanym rozwiązaniem w radiofarmacji jest przygotowanie niezbędnych składników w postaci liofilizowanych zestawów do znakowania, które mogą być następnie znakowane radionuklidem uzyskanym z generatorów radionuklidowych, np. generatorów ⁹⁹Mo/^99mTc. Ułatwia to wydajne przygotowanie radiofarmaceutyku w pracowni szpitalnej bezpośrednio przed podaniem pacjentowi.

Celem wynalazku jest dostarczenie nowego specyficznego radiofarmaceutyku, w postaci zestawu radiofarmaceutycznego, do zastosowania w wykrywaniu techniką SPECT nowotworów z nadekspresją PSMA i jednocześnie charakteryzującego się odpowiednią biodystrybucją i farmakokinetyką z punktu widzenia jakości obrazowania jak i radiotoksyczności.

Opis figur

Fig. 1 przedstawia radiochromatogramy HPLC: A - ^99mTc-PSMA-T4; B - ^99mTc-hydrazon 4-(dimetyloaminobenzeno) PSMA-T4.

Fig. 2 przedstawia skan całego ciała i docelowe obrazowanie SPECT-CT, które pokazują liczne przerzuty do węzłów chłonnych kości i jamy brzusznej z intensywnym wychwytem znacznika.

Przykłady wykonania

Wynalazek został przedstawiony w poniższych przykładach wykonania, które jakkolwiek nie mają charakteru ograniczającego.

Nowe inhibitory PSMA zawierające HYNIC jako chelator i tryptofan jako modyfikatory lipofilowości, zsyntezowano na podłożu stałym, którego przygotowanie opisano w przykładzie 1, a syntezę koniugatów HYNIC-PSMA z wolną grupą hydrazynową w przykładzie 2. Syntezę oraz sposób oczyszczania związków według wynalazku na drodze przeprowadzenia w hydrazon HYNIC-PSMA opisano w przykładzie 3. W przykładzie 4 przedstawiono przygotowanie zestawu radiofarmaceutycznego do sporządzania ^99mTc-HYNIC-PSMA, zawierającego w swoim składzie jeden z inhibitorów PSMA wg wynalazku, chlorek cyny jako reduktor, substancje buforujące oraz koligandy dla Technetu-99m takie jak trycyna oraz EDDA. W przykładach 5 i 6 przedstawiono wyniki porównawczych badań właściwości in vitro i in vivo nowych związków będących przedmiotem wynalazku w stosunku do innych preparatów stosowanych do diagnostyki raka prostaty, a w przykładzie 7 przedstawiono wyniki wstępnych badań SPECT pacjentów z rakiem prostaty z zastosowaniem ^99mTc-HYNIC-PSMA według wynalazku.

P r z y k ł a d 1. Przygotowanie złoża Glu(tBu)-mocznik-Lys-NH2

Synteza substancji została przeprowadzona na stałym podłożu będącym złożem polistyrenowym Wang, używanym w syntezie peptydów.

PL 239 934 BI

Do grup hydroksylowych złoża przyłączono Fmoc-L-Lys(Aloc) w opisany wcześniej sposób [7].

Po zakończeniu reakcji złoże przemyto: Ν,Ν-dimetyloformamidem, roztworem 50% N,N-dimetyloformamidu w dichlorometanie, dichlorometanem, a następnie wysuszono pod próżnią.

Dwukrotny nadmiar molowy trifosgenu w suchym dichlorometanie oziębiono w łaźni z suchym lodem do <-50°C. Osobno przygotowano roztwór L-Glu(tBu)OtBu*HCI 0,75% N,N-diizopropyletylaminy w suchym dichlorometanie, stosując sześciokrotny nadmiar molowy. Roztwór ten powoli wkroplono, do roztworu trifosgenu mieszając, tak aby temperatura reakcji nie przekroczyła -50°C. Po zakończeniu wkraplania odstawiono łaźnię i zawartość mieszano do osiągnięcia temperatury pokojowej. Do tak

PL 239 934 BI otrzymanego roztworu izocyjanianu dodano wysuszone złoże z L-Lys(Aloc) i mieszano przez 3 dni. Odsączono złoże i przemyto je dichlorometanem. Wysuszono pod próżnią.

Reakcję odłączania Aloc prowadzono w ciemności. W naczyniu z ciemnego szkła rozpuszczono katalizator Pd[P(Ph)3]4 (tetrakis(trifenylofosfino)pallad(O)) w 10% roztworze morfoliny w suchym dichlorometanie w stosunku molowym 0,1. Spęcznione złoże mieszano 3 h w przygotowanym wcześniej roztworze. Złoże odsączono i przemyto: Ν,Ν-dimetyloformamidem, roztworem 2% N,N-diizopropyloetylaminy w Ν,Ν-dimetyloformamidzie, roztworem 20 mg/ml dietylotiokarbaminianu sodu w N,N-dimetyloformamidzie, Ν,Ν-dimetyloformamidem i dichlorometanem, a następnie wysuszono pod próżnią.

Przykład 2. Synteza PSMA-T4 (PSMA-LTrp-4Amc-HYNIC)

Do reakcji użyto złoża polistyrenowego Wang z Glu(tBu)-mocznik-Lys-NH2. Do wolnej grupy aminowej lizyny przyłączono Fmoc-L-Trp(Boc) używając heksafluorofosforanu 1-[(1-(cyjano-2-etoksy-2-oksoetylidenoaminooksy)dimetylaminomorfolino)]uroniowego (COMU) w opisany wcześniej sposób [8,9]. Złoże umieszczono w naczynku do syntezy peptydów. Spęczniono złoże mieszając je z dichlorometanem. W osobnym naczynku umieszczono: trzykrotny nadmiar molowy Fmoc-L-Trp(Boc), trzykrotny nadmiar molowy COMU i Ν,Ν-dimetyloformamid, mieszano do rozpuszczenia. Dodano Ν,Ν-diizopropyloetylaminy. Mieszano przez 5 min. Dodano dichlorometanu i wymieszano. Tak przygotowany roztwór zaaktywowanego aminokwasu przeniesiono do naczynka ze spęcznionym złożem i mieszano przez 1 h. Złoże przemyto: Ν,Ν-dimetyloformamidem, roztworem 50% N,N-dimetyloformamidu w dichlorometanie i dichlorometanem.

Odłączanie grupy zabezpieczającej Fmoc przeprowadzono w standardowy sposób używany przy syntezie peptydów [10]. Do naczynka ze spęcznionym złożem wlano roztwór 20% piperydyny w Ν,Ν-dimetyloformamidzie. Mieszano przez 30 min. Po tym czasie roztwór piperydyny wymieniono na świeży i mieszano następne 30 min. Złoże przemyto: Ν,Ν-dimetyloformamidem, roztworem 50% Ν,Ν-dimetyloformamidu w dichlorometanie a na koniec dichlorometanem.

PL 239 934 BI

Przyłączanie Fmoc-4Amc, jak i odłączanie grupy zabezpieczającej Fmoc przeprowadzono w sposób analogiczny do poprzedniego etapu syntezy. Spęczniono złoże mieszając je z dichlorometanem przez przynajmniej 20 min. W osobnym naczynku umieszczono: trzykrotny nadmiar molowy Fmoc-4Amc, trzykrotny nadmiar molowy COMU i Ν,Ν-dimetyloformamid, mieszano do rozpuszczenia. Dodano Ν,Ν-diizopropyloetylaminy. Mieszano przez 5 min. Dodano dichlorometanu i wymieszano. Tak przygotowany roztwór zaktywowanego aminokwasu przeniesiono do naczynka ze spęcznionym złożem i mieszano przez 1 h. Złoże przemyto: Ν,Ν-dimetyloformamidem, roztworem 50% N,N-dimetyloformamidu w dichlorometanie, a na koniec dichiorometanem.

Do naczynka ze spęcznionym złożem wlano roztwór 20% piperydyny w N,N-dimetyloformamidzie. Mieszano przez 30 min. Po tym czasie roztwór piperydyny wymieniono na świeży i mieszano następne 30 min. Złoże przemyto: Ν,Ν-dimetyloformamidem, roztworem 50% N,N-dimetyloformamidu w dichlorometanie i dichlorometanem.

Przyłączanie HYNIC-Boc przeprowadzono w sposób analogiczny do poprzedniego etapu syntezy. Spęczniono złoże mieszając je z dichlorometanem przez przynajmniej 20 min. W osobnym naczynku umieszczono: trzykrotny nadmiar molowy HYNIC-Boc, trzykrotny nadmiar molowy COMU i Ν,Ν-dimetyloformamid, mieszano do rozpuszczenia. Dodano Ν,Ν-diizopropyloetylaminy. Mieszano przez 5 min. Dodano dichlorometan i wymieszano. Tak przygotowany roztwór zaaktywowanego aminokwasu przeniesiono do naczynka ze spęcznionym złożem i mieszano przez 2 h. Złoże przemyto: Ν,Ν-dimetyloformamidem, roztworem 50% Ν,Ν-dimetyloformamidu w dichlorometanie, dichlorometanem i wysuszono pod próżnią.

PL 239 934 BI

W celu odłączenia produktu od złoża i odłączenia grup zabezpieczających w osobnym naczyniu przygotowano roztwór kwasu trifluoroooctowego z dodatkami triizopropylosilanu, fenolu, tioanizolu, wody i 1,2-etanoditiolu. Gotowy roztwór przeniesiono do naczynka ze złożem. Mieszano przez 3 h. Produkt wytrącono eterem dietylowym. Osad odwirowano i przemyto eterem dietylowym. Ogrzewano mieszając na wyparce do 60°C pod ciśnieniem 800 mbar przez 1 h od rozpuszczenia w 0,1% roztworze kwasu trifluorooctowego. Otrzymany roztwór zliofilizowano.

Zliofilizowany produkt rozpuszczono w mieszaninie acetonitryl/woda z dodatkiem 0,1% kwasu trifluorooctowego i następnie oczyszczano na preparatywnej kolumnie polimerowej HPLC w odwróconym układzie faz. Zebrane frakcje ze związkiem (PSMA-T4) spełniającym zadane wymagania czystości połączono, a następnie zliofilizowano.

W analogiczny sposób do PSMA-T4 otrzymano następujące połączenia:

PSMA-Nal-Amc-HYNIC (PSMA-T1) stosując Fmoc-L2Nal zamiast Fmoc-LTrp.

PSMA-Nal-6Ahx-HYNIC (PSMA-T2) stosując Fmoc-L2Nal zamiast Fmoc-LTrp. PSMA-LTrp-6Ahx-HYNIC (PSMA-T3) stosując Fmoc-6Ahx zamiast Fmoc-4Amc.

Tabela 1. Dane fizykochemiczne związków PSMA-T1,

PSMA-T2, PSMA-T3, PSMA-T4.

Związek	Wzór sumaryczny; Mc,; MS:m/z	Rozpuszczalność według Ph. Eur.	Postać	Czystość HPLC
PSMA-T 1	CwHsoNsOio; 790,86 g/mol; m/z=791,37[M+H]+	- woda: słabo rozpuszczalny - bufor fosforanowy pH 7,4: trudno rozpuszczalny - etanol: rozpuszczalny	Biały liofilizat	> 97,0%
PSMA-T2	C35H47N9O10; 764,34 g/mol; m/z=755,35[M+H]+	- woda: ni erozpuszczal ny - bufor fosforanowy pH 7,4: trudno rozpuszczalny - etanol: rozpuszczalny	Biały liofilizat	> 95,0%

PL 239 934 BI

PSMA-T3	C35H17N9O10; 753,34 g/mol; m/z=754,35[M+H]+	- woda: nierozpuszczalny - bufor fosforanowy pH 7,4: trudno rozpuszczalny - etanol: rozpuszczalny	Biały liofilizat	> 97,0%
PSMA-T4	C37H19N9O10; 779,36 g/mol; m/z=780,31[M+H]+	- woda: nierozpuszczalny - bufor fosforanowy pH 7,4: trudno rozpuszczalny - etanol: rozpuszczalny	Biały liofilizat	> 97,0%

Przykład 3. Synteza hydrazonów PSMA-T4 (PSMA-LTrp-4Amc-HYNIC)

przy czym:

R = (SO₃H)C₆H₄ lub 4-(CH₃)₂NC₆H₄ lub 4-(HO)C₆H₃-3-(OCH₃)

Do otrzymywania hydrazonów używa się surowy nieoczyszczony inhibitor PSMA-T4. Związek ten rozpuszcza się w roztworze woda/alkohol etylowy i dodaje roztwór alkoholowy odpowiedniego aldehydu w dziesięciokrotnym nadmiarze molowym w stosunku do inhibitora. Reakcję prowadzi się od 10 do 20 minut w temperaturze pokojowej, zależnie od zastosowanego aldehydu. Mieszaninę reakcyjną zawierającą hydrazon 4-(dimetyloaminobenzeno)PSMA-T4 oczyszcza się na kolumnie preparatywnej polimerowej w systemie HPLC w odwróconym układzie faz. Zebrane frakcje z hydrazonem PSMA-T4 spełniającym zadane wymagania czystości łączy się, a następnie liofilizuje. Zastosowana modyfikacja będąca przedmiotem wynalazku pozwala uzyskać związek, którego czas retencji różni się znacznie od czasu retencji PSMA-T4 i większości zanieczyszczeń trudnych do rozdzielenia w przypadku niemodyfikowanego peptydu. Upraszcza to i zwiększa wydajność procesu oczyszczania pochodnych hydrazonowych. Otrzymane związki charakteryzują się wysoką czystością - powyżej 99% i większą trwałością w roztworach. Przykładowo hydrazon 4-(dimetyloaminobenzeno) PSMA-T4 był stabilny w roztworze buforu fosforanowego pH=7 przez co najmniej dobę.

PL 239 934 Β1

Przykładowe hydrazony PSMA-T4 oraz ich charakterystykę fizykochemiczną przedstawiono w tabeli 2.

Tabela 2. Dane fizykochemiczne wybranych hydrazonów związku PSMA-T4.

Związek	Wzór sumaryczny; MCz, MS:m/z	Rozpuszczał ność według Ph. Eur.	Postać	Czystość HPLC
Hydrazon kwasu benzenosulfonowego PSMA-T4	C44H53N9O13S; 948,00 g/mol; m/z = 948,35 [M + H]+	-woda: rozpuszczalny -bufor fosforanowy pH 7,4: rozpuszczalny -etanol: rozpuszczalny	biały lub lekko żółty liofilizat	> 97,0%
Hydrazon 4- (dimetyloaminobenze no) PSMA-T4	CłftHssNioOin; 911,01 g/mol; m/z = 911,44 [M + H]+	woda: nierozpuszczalny - bufor fosforanowy pH 7,4: rozpuszczalny etanol: rozpuszczalny	żółty liofilizat	> 99%
Hydrazon wanilina PSMA-T4	C45H55N9OL2; M = 913,97 g/mol; m/z = 914,40 [M + H]+	woda: nierozpuszczalny - bufor fosforanowy pH 7,4: trudno rozpuszczalny etanol: rozpuszczalny	biały liofilizat	> 97,0%

Przykład 4. Przygotowanie zestawu radiofarmaceutycznego do sporządzania ^99mTc-HYNIC-PSMA

Zgodnie z wynalazkiem zestaw farmaceutyczny zawiera suchą kompozycję składników niezbędnych do znakowania technetem-99m, szczelnie zamkniętą w atmosferze azotu. W skład suchej kompozycji wchodzi inhibitor PSMA wg wynalazku, np. związek PSMA-T4 lub jego pochodna hydrazonowa, czynnik redukujący SnCl2 χ 2H2O, koligandy do uzyskania stabilnego kompleksu z radiometalem: trycyna oraz kwas etylenodiamino-(N,N’)-dioctowy (EDDA), a także bufor fosforanowy do stabilizacji pH.

Sposób farmaceutycznego otrzymywania zestawu polega na tym, że dla otrzymania suchej kompozycji sporządza się 0,1 M bufor fosforanowy pH 7,4, w którym przygotowuje się roztwór PSMA-T4 lub jego pochodnej hydrazonowej o stężeniu 0,01 pM do 0,05 pM, roztwór trycyny o stężeniu 0,06 mM do 0,56 mM, roztwór EDDA o stężeniu 0,03 mM do 0,09 mM. Przygotowany w ten sposób roztwór jest azotowany, a następnie zostaje dodany roztwór SnCl2 χ 2H2O o stężeniu 0,1 μΜ do 0,4 μΜ przygotowany w roztworze kwasu solnego o stężeniu 0,1 M do 0,5 M. Tak sporządzony roztwór przesącza się przez sączek bakteriologiczny 0,22 pm, a następnie rozdozowuje po 1 mL do szklanych sterylnych fiolek i zamraża. W kolejnym etapie prowadzony jest proces liofilizacji. Po zakończonym procesie liofilizacji komorę liofilizatora z zawartymi w niej fiolkami z preparatem wypełnia się azotem. Fiolki są zamykane wewnątrz komory liofilizatora korkami, a następnie po wyjęciu z komory dodatkowo zamykane metalowymi kapslami, które zapobiegają rozszczelnieniu fiolki. W ten sposób uzyskiwany jest jałowy i pozbawiony endotoksyn bakteryjnych zestaw radiofarmaceutyczny o przykładowym składzie:

PSMA-T4 lub jego pochodna hydrazonowa 20 pg

Trycyna 50 mg

PL 239 934 BI

EDDA 5 mg

SnClz χ 2H2O 40 pg

Na₂HPO₄ χ I2H2O 29 mg

NaH₂PO₄ χ 2H₂O 3,0 mg.

Sposób otrzymania preparatu radiofarmaceutycznego z zestawu zawierającego wyżej wymienioną kompozycję polega na tym, że do fiolki zawierającej suchą kompozycję wprowadza się 0,5-2,5 mL roztworu nadtechnecjanu sodu Na^99mTcO₄ o pożądanej radioaktywności w granicach 300-1500 MBq. Po rozpuszczeniu roztwór wygrzewa się w 100°C przez 15-30 min, a następnie schładza w temperaturze pokojowej 20 min. Czystość radiochemiczna tak otrzymanego preparatu zbadana metodą chromatografii cienkowarstwowej wynosi powyżej 90%. Preparaty radiofarmaceutyczne otrzymane w wyniku znakowania technetem-99m PSMA-T4 i pochodnych hydrazonowych są tożsame, co potwierdzono metodami HPLC oraz LC/MS (patrz fig. 1).

Przykład 5. Badania aktywności biologicznej in vitro

Istotną zaletą opisanych związków jest ich wysokie powinowactwo do receptora PSMA obecnego na komórkach raka prostaty. Przeprowadzone badania in vitro kompetycyjnego wiązania ligandów, na błonach komórek nowotworowych LNCaP, pozwoliły na wyznaczenie wartości IC50, czyli takiego stężenia w którym zostaje zachowana równowaga dysocjacji. Badanie przeprowadzono na płytkach 96-dołkowych z filtrami, na które nanoszono jednakową ilość błon. Następnie dodawano wzrastające stężenie nieaktywnych formulacji i aktywnego kompetycyjnego ¹³¹I-MIP1095, o wysokim powinowactwie do receptora. Po 2 h inkubacji filtry przemywano i wykonywano pomiar radioaktywności. Wartość IC50 określano z użyciem programu statystycznego GraphPad Prism 7.0.

W toku przeprowadzonego badania wartości IC50 dla związków objętych wynalazkiem - wynosiły one odpowiednio od 75 nM do 97 nM co oznacza, że związki według wynalazku charakteryzują się ponad 7-krotnie wyższym powinowactwem niż powszechnie dostępny znacznik do diagnostyki raka prostaty PSMA 11 (tabela 3).

Tabela 3. Porównanie powinowactwa in vitro PSMA-T1, PSMA-T2, PSMA-T3,

PSMA-T4 i PSMA 11 do receptora PSMA.

	PSMA 11	PSMA-T 1 (PSMA-NalAmc-HYNIC)	PSMA-T2 (PSMA-NalΑΗΧHYNIC)	PSMA-T3 (PSMA-TrpΑΗΧHYNIC)	PSMA-T4 (PSMA-TrpAmc-HYNIC)
IC50 [nM]	719	97	143	75	80
R2	0.956	0.963	0.926	0.984	0.972

Przykład 6. Biodystrybucja preparatów PSMA znakowanych technetem-99m

Do porównawczych badań biodystrybucji trzech preparatów PSMA znakowanych ^99mTc wykorzystano zdrowe myszy szczepu BALB/c (samce o masie ciała 18-27 g). Preparaty o aktywności ok. 6 MBq w objętości 0,1 mL podawano do żyły ogonowej. Po 4 godz. p.i.v. zwierzęta poddawano eutanazji wziewnej, a następnie pobierano wybrane organy, które ważono i mierzono zgromadzoną w nich radioaktywność. Lokowanie preparatu w wytypowanych organach lub tkankach podano jako %ID (procent dawki podanej) i %ID/g (procent dawki podanej na gram organu lub tkanki). Z zamieszczonych w tabeli 4 danych biodystrybucji wynika, że organem krytycznym dla technetowych preparatów PSMA są nerki, przy czym, znamiennym jest, że poziomy retencji radioaktywności w nerkach po podaniu preparatów opartych o analogii PSMA-T3 i PSMA-T4 były znacząco niższe niż w przypadku referencyjnego preparatu ^99mTc-iPSMA.

PL 239 934 B1

Tabela 4. Dane dotyczące biodystrybucji

Claims (10)

1. PL 239 934 BI

   Przykład 7. Zastosowanie kliniczne PSMA-T4 znakowanego technetem-99m

   Badanie SPECT-CT wykonano 1-3 h po dożylnym podaniu 9 pacjentom z rakiem prostaty preparatu ^99mTc-PSMA-T4 wg wynalazku. Obrazowanie prowadzono przy użyciu gamma Kamery SPECT-CT Symbia T2, Siemens. Do badania włączono 9 pacjentów po radykalnej terapii raka prostaty (całkowita prostatektomia lub ostateczna radioterapia). Pacjenci z progresją biochemiczną i danymi klinicznymi dotyczącymi nawrotu choroby byli badani pod kątem wznowy choroby. Prawidłową biodystrybucję radiofarmaceutyków o wysokiej aktywności tła obserwowano w wątrobie, śledzionie, nerkach, gruczołach ślinowych, jelitach i pęcherzu moczowym. U 7 pacjentów zaobserwowano dodatni miejscowy nawrót, przerzuty do węzłów chłonnych i/lub kości z intensywnym wychwytem znacznika. Wystąpiło podejrzenie wznowy miejscowej u 2 pacjentów z negatywnym wynikiem MRT.

   Literatura:

   [1] Sweat SD, Pacelli A, Murphy GP, Bostwick DG. Prostate-specific membranę antigen expression is greatest in prostatę adenocarcinoma and lymph node metastases. Urology. 1998; 52(4):637-40.
2. [2] Banerjee SR, Foss CA, Castanares M, et al. Synthesis and evaluation of technetium-99m- and rhenium-labeled inhibitors of the prostate-specific membranę antigen (PSMA). J Med. Chem. 2008; 51:4504-4517.
3. [3] Kularatne SA, Zhou Z, Yang J, Post CB, Low PS. Design, synthesis, and preclinical evaluation of prostate-specific membranę antigen targeted 99mTc-radioimaging agents. Mol Pharm. 2009; 6:790-800.
4. [4] Xiaoping Xu, et al. 99mTc-labeling and evaluation of a HYNIC modified small-molecular inhibitor of prostate-specific membranę antigen. Nuci. Med. Biol. 2017; 48:69-75.
5. [5] Guillermina Ferro-Flores, et al. Clinical translation of a PSMA inhibitor for 99mTc-based SPECT. Nuci. Med. Biol. 2017; 48:36-44.
6. [6] Robu S, Schottelius M, Eiber M, Maurer T, Gschwend J, Schwaiger M, Wester HJ. Preclinical Evaluation and First Patient Application of 99mTc-PSMA-l&S for SPECT Imaging and Radioguided Surgery in Prostatę Cancer. J Nuci Med. 2017; 58(2):235-242.
7. [7] Chan W. C., White P.D. Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis. A practical approach. 2004, 47^18.
8. [8] El-Faham A., Albericio F., COMU: A third generation of uranium-type coupling reagents. Journal of Peptide Science. 2010, 16: 6-9.
9. [9] Subiros-Funosas R., L. Nieto-Rodriguez L., Jensen K. J., Albericio F., COMU: scope and limitations ofthe latest innovation in peptide acyl transfer reagents. Journal of Peptide Science. 2010, 16:408-414.
10. [10] Chan W. C., White P.D. Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis. A practical approach. 2004, 51.

    Zastrzeżenia patentowe

    1. Pochodne inhibitora PSMA-HYNIC o wzorze ogólnym 1:

    Wzór 1. (PSMA-L1-L2-HYNIC) przy czym: Li = L-Trp; L2 = 6Ahx lub 4Amc, gdzie L-Trp oznacza L-tryptofan, 6Ahx oznacza kwas 6-aminoheksanowy, a 4Amc oznacza kwas 4-aminometylocykloheksanokarboksylowy, oraz ich farmaceutycznie dopuszczalne sole.

    PL 239 934 Β1

    2. Pochodne inhibitora PSMA-HYNIC stanowiące pochodne hydrazonowe o wzorze ogólnym 2:

    Wzór 2. (PSMA-Li-L₂-HYNIC-hydrazon) przy czym:

    Li = L-Trp; L2 = 6Ahx lub 4Amc, gdzie L-Trp oznacza L-tryptofan, 6Ahx oznacza kwas 6-aminoheksanowy, a 4Amc oznacza kwas 4-aminometylocykloheksanokarboksylowy,

    R = (SO₃H)C₆H₄ lub 4-(CH₃)₂NC₆H₄ lub 4-(HO)C₆H₃-3-(OCH₃), oraz ich farmaceutycznie dopuszczalne sole.

    3. Preparat radiofarmaceutyczny, znamienny tym, że zawiera związek określony w zastrzeżeniu 1 albo 2 połączony wiązaniem chemicznym z izotopem ^99mTc.

    4. Zestaw farmaceutyczny do znakowania izotopem ^mTc, znamienny tym, że zawiera związek określony w zastrzeżeniu 1 albo 2 oraz substancje pomocnicze.

    5. Zestaw według zastrz. 4, znamienny tym, że występuje w postaci jałowego liofilizatu w otoczeniu gazu obojętnego.

    6. Zestaw według któregokolwiek z zastrzeżeń od 4 do 5, znamienny tym, że substancje pomocnicze wybrane są z grupy obejmującej chlorek cyny(ll), trycynę, kwas etylenodiaminodioctowy (EDDA) oraz substancje buforujące.

    7. Pochodne określone w zastrzeżeniu 1 albo 2 do zastosowania w diagnostyce scyntygraficznej raka prostaty oraz jego przerzutów.