[go: up one dir, main page]

RU2680404C2 - Способ очистки cys-связанных конъюгатов антитело-лекарственное средство - Google Patents

Способ очистки cys-связанных конъюгатов антитело-лекарственное средство Download PDF

Info

Publication number
RU2680404C2
RU2680404C2 RU2016132634A RU2016132634A RU2680404C2 RU 2680404 C2 RU2680404 C2 RU 2680404C2 RU 2016132634 A RU2016132634 A RU 2016132634A RU 2016132634 A RU2016132634 A RU 2016132634A RU 2680404 C2 RU2680404 C2 RU 2680404C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
antibodies against
antibody
column
antibodies
drug
Prior art date
Application number
RU2016132634A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2016132634A (ru
RU2016132634A3 (ru
Inventor
ДЕ Ги РО
Рююд Мартин ВЕРСТЕГЕН
Руди Герардус Элизабет КАУМАНС
Original Assignee
Синтон Байофармасьютикалс Б. В.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=49911439&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RU2680404(C2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Синтон Байофармасьютикалс Б. В. filed Critical Синтон Байофармасьютикалс Б. В.
Publication of RU2016132634A publication Critical patent/RU2016132634A/ru
Publication of RU2016132634A3 publication Critical patent/RU2016132634A3/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2680404C2 publication Critical patent/RU2680404C2/ru

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/22—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin
    • A61K31/223—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin of alpha-aminoacids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/44—Antibodies bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/32—Bonded phase chromatography
    • B01D15/325—Reversed phase
    • B01D15/327—Reversed phase with hydrophobic interaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/20—Partition-, reverse-phase or hydrophobic interaction chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Изобретение относится к медицине и касается способа очистки смеси цистеин-связанных конъюгатов антитело-лекарственное средство, в которой количество неконъюгированного антитела находится в диапазоне от 10 до 40% по массе. Где способ включает получение смеси в водном солевом растворе, загрузку полученного раствора на препаративную колонку для проведения хроматографии гидрофобного взаимодействия, сбор проточной фракции, которая содержит неконъюгированное антитело, промывку указанной колонки водным солевым раствором с одновременным сбором проточной фракции, элюирование указанной колонки водным солевым раствором с получением очищенной смеси цистеин-связанных конъюгатов антитело-лекарственное средство. Причем ни на одной из стадий не используют органический растворитель. Изобретение обеспечивает увеличение емкости колонки в связывании конъюгатов антитело-лекарственное средство, подлежащих очистке. 17 з.п. ф-лы, 3 ил., 6 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение предлагает способ очистки смеси цистеин (Cys)-связанных конъюгатов антитело-лекарственное средство (ADC), в частности, смеси, которая содержит неконъюгированное антитело в количестве 10-40% по массе.
Такие Cys-связанные ADC могут играть важную роль в новых способах лечения рака. Следовательно, разработка способа очистки смеси Cys-связанных ADC в промышленном (препаративном) масштабе имеет большое значение для будущего коммерческого успеха таких ADC.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В последние годы десятки ADC были приняты в доклинические и клинические разработки и два ADC были одобрены для продажи в последние пару лет. За исключением последних разработок по конъюгации линкер-лекарственных средств с (моноклональными) антителами (mAb), лекарственное средство, входящее в состав большинства ADC, участвующих в (пред)клинических исследованиях, и двух присутствующих в настоящее время на рынке ADC, присоединяют к антителу либо через N-атом остатка лизина, либо через S-атом остатка цистеина. Коммерческий продукт Kadcyla®, или адо-трастузумаба эмтансин (Roche/Genentech ImmunoGen), является примером лизин-связанного ADC, а Adcetris®, или брентуксимаба ведотин (Seattle Genetics/Takeda Millennium), является примером цистеин-связанного ADC. Одним из ADC, участвующих в настоящее время в (пред)клинических исследованиях, является цистеин-связанный ADC формулы (II), приведенной ниже, который содержит лекарственное средство дуокармицин, конъюгированное с трастузумабом через остаток цистеина.
Дуокармицины, впервые выделенные из культурального бульона видов Streptomyces, являются членами семейства противоопухолевых антибиотиков, которые включают дуокармицин A, дуокармицин SA и CC-1065. Биологическая активность этих чрезвычайно активных средств, по всей вероятности, обусловлена их способностью последовательность-специфически алкилировать ДНК по положению N3 аденина, присутствующего в малой бороздке, что инициирует каскад событий, заканчивающихся запуском механизма апоптотической гибели клеток.
Чтобы получить Cys-связанные ADC, антитело обычно частично восстанавливают, чтобы превратить одну или несколько межцепочечных дисульфидных связей в два или более свободных остатков цистеина. Тиольные или сульфгидрильные (SH) группы свободных остатков цистеина затем последовательно конъюгируют с молекулой линкер-лекарственное средство с получением Cys-связанного ADC. Как правило, данный процесс конъюгации дает случайную, гетерогенную смесь антител, нагруженных 0, 2, 4, 6 и 8 молекулами линкер-лекарственное средство. Чем ниже среднее отношение лекарственного средства к антителу (DAR), тем выше количество неконъюгированного антитела (DAR0) в реакционной смеси.
Известно, что нагрузка лекарственного средства оказывает влияние на противоопухолевую активность ADC, как описано, например, в K.J. Hamblett et al. in Clinical Cancer Research 10 (2004) 7063-7070. Нагрузка также влияет на CMC- (химия, производство и контроль) свойства, такие как агрегация.
WO2011/133039 тех же авторов, что и настоящая заявка, раскрывает ряд новых аналогов ДНК-алкилирующего средства CC-1065 и полученных на их основе конъюгатов антитело-лекарственное средство (ADC). В примере 15 описан способ получения ряда конъюгатов трастузумаб-дуокармицин с использованием 1,1-молярных эквивалентов восстановителя с получением 2 свободных тиольных групп на mAb. После гашения ADC очищают с помощью колонки, содержащей r-белок А, получая конъюгаты линкер-лекарственное средство со средним значением DAR примерно 2.
На предшествующем уровне техники описано применение хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC) в качестве стадии тонкой очистки, используемой во многих способах очистки моноклональных антител (mAb). Отмечено, что данный метод хроматографии особенно полезен для удаления агрегатов и обеспечивает хорошую очистку от других примесей, сопутствующих способу получения, таких как белок (белки) клетки-хозяина, ДНК, эндотоксины, выщелоченный белок А и эндогенные вирусы. HIC также представляет собой хорошо разработанный метод (аналитического) определения DAR и распределения нагрузки лекарственного средства в цистеин-связанных ADC (Laurent Ducry (ed.), Antibody-Drug Conjugates, Methods in Molecular Biology, 1045 (2013) 275-283). В главе 17 данной книги, под авторством Jun Ouyang, на фиг. 2, стр. 276, изображена типичная хроматограмма HIC Cys-связанного ADC (т.е. MC-VC-PABC-MMAE). Отмечено, что элюирование в градиенте уменьшающейся концентрации соли и повышающейся концентрации органического модификатора влияет на время удерживания на колонке молекул, нагруженных лекарственным средством, таким образом, что наименее гидрофобные, неконъюгированные формы (т.е. неконъюгированные антитела, DAR0), элюируются вначале, а наиболее гидрофобное антитело, нагруженное 8 молекулами линкер-лекарственное средство (DAR8), элюируется последним. Результаты, приведенные в таблице 2 на странице 279, показывают, что при средневзвешенном значении DAR 3,6 смесь Cys-связанных ADC содержит только 4,7% неконъюгированного антитела.
US4771128 описывает способ выделения и очистки конъюгатов токсинов с использованием HIC, в частности, в применении к иммуноглобулину (антителу), конъюгированному с токсическим инактивирующим рибосомы белком рицином А. Способ включает вначале удаление неконъюгированного рицина и агрегатов методом эксклюзионной хроматографии (т.е. гель-проникающей хроматографии, SEC), и затем разделение смеси конъюгатов методом гидрофобной гель-хроматографии (т.е. HIC, с использованием фенилсефарозы CL-4B в объеме 70 мл) путем элюирования растворами солей с уменьшением ионной силы. Неконъюгированный иммуноглобулин элюируется первым. И на стадии исключения по размерам, и на последующей стадии хроматографического разделения используют буфер, содержащий хлорид натрия (1 М), при скорости потока примерно 20-40 мл/ч, см. пример 1. В альтернативном варианте осуществления предлагают разделение и очистку методом хроматографии в "быстром потоке" (с использованием фенилсефарозы CL-4B и колонки диаметром 1 см, объем 3,14 мл), в котором неконъюгированный иммуноглобулин элюируется в первом объеме колонки раствором, содержащим фосфатный буфер/хлорид натрия (1,5 М), при скорости потока примерно 0,13 мл/ч, см. пример 2, а иммуноконъюгат элюируется во втором объеме колонки раствором, содержащим фосфатный буфер и 10-60 об.% органического растворителя (например, в примере 2 используют раствор, содержащий 60 об.% глицерина). Основным недостатком способов, описанных на предшествующем уровне техники, является применение органического растворителя, нежелательное и неприемлемое для способа, проводимого в промышленном масштабе.
Насколько известно заявителям, такая проблема, как масштабирование способа очистки ADC, не рассматривалась на предшествующем уровне техники.
Обзор предшествующего уровня техники со всей очевидностью демонстрирует, что существует потребность в новом способе очистки смесей Cys-связанных ADC. В частности, нужен способ очистки смесей Cys-связанных ADC со средним значением DAR примерно 2-3, которые, как правило, содержат относительно высокое количество неконъюгированных антител, иногда до 40% по массе, подходящий для проведения в промышленном препаративном масштабе и не требующий применения нескольких хроматографических стадий.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение предлагает новый способ очистки смеси цистеин-связанных конъюгатов антитело-лекарственное средство, в частности, смеси со средним значением DAR примерно 2-3, в которой количество неконъюгированных антител находится в диапазоне 10-40% по массе.
В первом аспекте настоящее изобретение предлагает способ очистки смеси цистеин-связанных конъюгатов антитело-лекарственное средство, в которой количество неконъюгированных антител находится в диапазоне 10-40% по массе, где способ включает:
a. растворение смеси в 0,2-1,5 М водном растворе соли;
b. загрузку полученного раствора на препаративную колонку для проведения хроматографии гидрофобного взаимодействия;
c. сбор проточной фракции, которая содержит неконъюгированное антитело;
d. промывание указанной колонки 0,2-1,5 М водным раствором соли с одновременным сбором проточной фракции; и
е. элюирование указанной колонки 0-100 мМ водным раствором соли с получением очищенной смеси цистеин-связанных конъюгатов антитело-лекарственное средство.
В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения смесь цистеин-связанных конъюгатов антитело-лекарственное средство имеет формулу (II)
Figure 00000001
где
Ab обозначает трастузумаб, а
q варьирует в диапазоне от 0 до 8.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фигуре 1 показан пример влияния количества восстанавливающего средства на распределение молекул DAR. При использовании 1,0 эквивалента восстанавливающего средства процент неконъюгированного антитела трастузумаба DAR0 составляет примерно 20% по массе.
На фигуре 2 изображены аналитические хроматограммы, полученные методом HIC, смесей цистеин-связанных конъюгатов антитело-лекарственное средство формулы (II) до и после очистки HIC в препаративном масштабе по способу, описанному в примере 3.
На фигуре 3 изображены аналитические хроматограммы, полученные методом HIC, смесей цистеин-связанных конъюгатов антитело-лекарственное средство формулы (II) до и после очистки HIC в препаративном масштабе по способу, описанному в примере 4.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В процессе разработки настоящего изобретения было обнаружено, что смесь цистеин-связанных конъюгатов антитело-лекарственное средство (Cys-связанные ADC), в которой количество неконъюгированного антитела находится в диапазоне 10-40% по массе, можно успешно очистить от неконъюгированного антитела (DAR0) и неконъюгированной молекулы линкер-лекарственное средство, которые обычно гасят после завершения реакции конъюгации, с помощью гидрофобной хроматографии. Способ в соответствии с настоящим изобретением включает:
a. растворение смеси в 0,2-1,5 М водном растворе соли;
b. загрузку полученного раствора на препаративную колонку для проведения хроматографии гидрофобного взаимодействия;
c. сбор проточной фракции, которая содержит неконъюгированное антитело;
d. промывание указанной колонки 0,2-1,5 М водным раствором соли с одновременным сбором проточной фракции; и
е. элюирование указанной колонки 0-100 мМ водным раствором соли с получением очищенной смеси цистеин-связанных конъюгатов антитело-лекарственное средство.
В контексте настоящего описания термин "соль" и термин "буфер" (солевой) имеют разные значения. Примеры солей и буферов, подходящих для применения в способе настоящего изобретения, приведены ниже. Предпочтительно в способе настоящего изобретения используют буферные водные растворы солей.
В способе настоящего изобретения используют только водные растворы, следовательно, ни на одной из стадий a, b, d или e не используют органический растворитель. Для ясности следует отметить, что стадию е можно проводить в отсутствии соли.
Заявленный способ включает приведение смеси Cys-связанных ADC в контакт с наполнителем колонки HIC в водном растворе соли в условиях загрузки колонки, в которых смесь антител, нагруженных 2-8 молекулами линкер-лекарственное средство, неконъюгированные молекулы линкер-лекарственное средство и примеси, как правило, агрегаты, связываются с наполнителем колонки, тогда как неконъюгированное антитело не связывается и сразу вымывается/протекает через колонку в условиях загрузки. Путем элюирования водным раствором соли с более низкой концентрацией можно отделить Cys-связанные ADC от неконъюгированной молекулы линкер-лекарственное средство и примесей, которые остаются связанными с наполнителем колонки/остаются на колонке.
Водные растворы соли, используемые для загрузки (стадия b) и промывания (стадия d) могут быть одинаковыми или разными. Предпочтительно для загрузки (стадия b) и промывания (стадия d) используют одинаковые водные растворы соли.
Как известно специалистам в данной области, и как описано в параграфе [0057] из US20100069617, оптимальные условия загрузки/связывания и элюирования для колонки HIC зависят от ряда факторов. Следовательно, изменение индивидуальных характеристик удерживания разных смесей ADC, например, вследствие изменений в антителе, линкере и лекарственном средстве, требует адаптации/оптимизации условий работы колонки HIC в соответствии с настоящим изобретением. Такая оптимизация, в первую очередь, включает определение гидрофобности смеси ADC, подлежащей очистки, например, путем определения (относительной) гидрофобности молекул DAR2 любого конкретного ADC и выбора (с учетом гидрофобности) наполнителя колонки. Кроме того, она включает выбор/оптимизацию концентрации водного раствора соли, используемого для загрузки/связывания, концентрации водного раствора соли, используемого для элюирования, концентрации забуферивающей соли и рН.
Смеси Cys-связанных ADC формул (I) и (II) в соответствии с настоящим изобретением содержат линкер-лекарственное средство, конъюгированное с антителом через атом S остатка цистеина, т.е. они представляют собой цистеин-связанные конъюгаты антитело-лекарственное средство. Как правило, остаток цистеина представляет собой природный остаток цистеина, который присутствует в тяжелой и/или легкой цепи антитела (Ab) и участвует в образовании межцепочечных дисульфидных связей. В частности, настоящее изобретение направлено на очистку соединений ADC, которые содержат линкер-лекарственное средство, конъюгированное посредством межцепочечных дисульфидных связей с Ab, более конкретно mAb. Например, антитела IgG1, как правило, содержат четыре межцепочечные дисульфидные связи, причем все четыре располагаются в шарнирном участке антитела, и после (частичного) восстановления дисульфидных связей молекула линкер-лекарственное средство случайным образом присоединяется к свободным тиольным группам.
Смеси Cys-связанных соединений ADC формул (I) и (II) настоящего изобретения можно получить с помощью методов и процедур, хорошо известных специалистам в данной области техники. Конъюгирование посредством межцепочечных дисульфидных связей можно осуществить после полного или частичного восстановления упомянутых дисульфидных связей. Подходящие способы получения таких соединений можно найти в описании и примерах WO2011/133039 авторов настоящей заявки. В частности, в примере 15 из WO2011/133039 описано частичное восстановление трастузумаба с получением 2 свободных тиольных групп на mAb и конъюгирование его с рядом молекул линкер-лекарственное средство с получением ADC со средними значениями DAR примерно 2. В примерах 7 и 8 WO2005/084390 описано частичное восстановление, частичное восстановление/частичное повторное окисление и стратегии полного восстановления для (частичной) нагрузки антител молекулами линкер-лекарственное средство vcMMAE.
Смесь цистеин-связанных конъюгатов антитело-лекарственное средство (Cys-связанные ADC), подлежащая очистке с помощью способа настоящего изобретения, содержит неконъюгированное антитело, количество которого варьирует в диапазоне 10-40% по массе, более предпочтительно в диапазоне 10-35% по массе, еще более предпочтительно в диапазоне 15-35% по массе. В данной области техники хорошо известно, что количество неконъюгированного антитела, присутствующего после конъюгации, уменьшается с увеличением среднего отношения лекарственного средства к антителу (DAR). Например, авторы настоящего изобретения обнаружили, что при использовании более 1,5 эквивалентов восстанавливающего средства для восстановления межцепочных дисульфидных мостиков моноклонального антитела трастузумаба, в смеси конъюгатов присутствует менее 10% по массе неконъюгированного антитела (DAR0). При использовании 1,0 эквивалента восстанавливающего средства максимальное количество DAR2, присутствующего в смеси конъюгатов, составляет примерно 50% по массе, а процент неконъюгированного антитела (DAR0) трастузумаба составляет примерно 20% по массе (см. фигуру 1). Следует отметить, что распределение значений DAR, соответствующее отношению восстанавливающее средство:mAb, варьирует в зависимости от используемых реагентов и условий реакции.
Способ настоящего изобретения является особенно предпочтительным, если желательно, чтобы среднее значение DAR составляло примерно 2-3, более предпочтительно от 2,6 до 2,9, еще более предпочтительно от 2,7 до 2,9.
В способе настоящего изобретения можно использовать любую коммерчески доступную препаративную колонку HIC. Примеры поставщиков таких колонок и/или подходящих наполнителей для колонок включают Tosoh Bioscience, GE Healthcare, Bio-Rad и Merck Millipore.
В качестве наполнителя для указанной колонки HIC можно использовать пропил-Fractrogel EMD (Merck), фенил-Fractrogel EMD (Merck Millipore), бутил-S-сефарозу (GE Healthcare), октилсефарозу (GE Healthcare), октил-Capto (GE Healthcare), бутил-Capto (GE Healthcare), фенил-Capto Impres (GE Healthcare), бутил-Capto Impres (GE Healthcare), Toyopearl PPG-600M (Tosoh Bioscience), гексил-Toyopearl 650 (Tosoh Bioscience), бутил-Toyopearl 650 (Tosoh Bioscience), фенил-Toyopearl 650 (Tosoh Bioscience), Эфир Toyopearl 650 (Tosoh Bioscience), трет-бутил-MacroPrep (Bio-Rad), фенил-MacroPrep (Bio-Rad), бутил-Cellufine (JNC Corporation), фенил-Cellufine (JNC Corporation) или Poros НР2 (Applied Biosystems).
Предпочтительно указанную колонку HIC наполняют смолами, поставляемыми GE Healthcare, такими как быстропроточная (FF) бутил-S-сефароза 6, октил-Capto, быстропроточная октил-сефароза 4, быстропроточная фенил-сефароза 6, бутил-Capto, быстропроточная бутил-сефароза 4 или бутил-Capto Impres, или смолой Toyopearl PPG-600M, поставляемой Tosoh Bioscience. Сведения об относительной гидрофобности и многих других характеристиках разных наполнителей/смол для колонок можно найти в информационных брошюрах по упомянутым смолам, которые можно получить от поставщиков. В соответствии со способом настоящего изобретения колонку HIC предпочтительно наполняют бутил-S-сефарозой 6 FF, бутил-Capto, бутил-сефарозой 4 FF, бутил-Capto Impres или Toyopearl PPG-600М, более предпочтительно, бутил-сефарозой 4 FF, бутил-Capto Impres или Toyopearl PPG-600М, наиболее предпочтительно, бутил-сефарозой 4 FF или Toyopearl PPG-600M.
Как правило, в соответствии со способом настоящего изобретения, высота корпуса колонки составляет примерно 20-25 см, предпочтительно примерно 20 см, а давление на колонке поддерживают на уровне ниже 2 бар.
Размеры колонки определяются количеством материала, содержащего ADC, которое желательно или необходимо загрузить на колонку HIC. Как известно специалистам в данной области, с увеличением внутреннего диаметра и длины колонки увеличивается количество материала, содержащего ADC, которое можно загрузить на колонку.
Препаративная колонка HIC, подходящая для применения в способе настоящего изобретения, как правило, имеет диаметр в диапазоне 4,0-2000 мм, предпочтительно 15-2000 мм, более предпочтительно 80-2000 мм, наиболее предпочтительно 400-2000 мм. Чем больше диаметр колонки, тем больше материала, содержащего ADC, можно загрузить на верхнюю часть колонки. Предпочтительно условия загрузки и промывания колонки выбирают так, чтобы неконъюгированные антитела (DAR0) проходили через колонку, не задерживаясь, что обеспечивает повышение емкости колонки. Например, если количество неконъюгирванного антитела, присутствующего в смеси Cys-связанных ADC, составляет 30% по массе, способ очистки настоящего изобретения допускает увеличение загрузки указанной колонки на 30%.
Количество материала, содержащего ADC, которое загружают на препаративную колонку, используемую в способе настоящего изобретения, обычно находится в диапазоне 5-50 г/л, предпочтительно в диапазоне 5-40 г/л, более предпочтительно, оно составляет 10-40 г/л, еще более предпочтительно 30-40 г/л наполнителя для колонки. С помощью способа настоящего изобретения можно успешно очистить партию размером от 20 до 2000 г, то есть, заявляемый в настоящем документе способ очистки HIC подходит для очистки материала, содержащего ADC, в промышленном масштабе, в соответствии с GMP (надлежащая практика организации производства).
Помимо диаметра и длины колонки также имеет значение средний размер частиц (d50,объем, средний размер частиц на основании распределения частиц по размерам в суммарном объеме) наполнителя для колонки.
В соответствии со способом настоящего изобретения выбранный размер частиц обеспечивает хорошее разделение при минимальной скорости потока. Размер частиц используемого в способе настоящего изобретения наполнителя для колонки находится в диапазоне 30-180 мкм.
Предпочтительно размер частиц наполнителя для колонки находится в диапазоне 35-100 мкм; еще более предпочтительно, размер частиц наполнителя для колонки находится в диапазоне 45-90 мкм.
В соответствии со способом настоящего изобретения скорость потока находится в диапазоне 50-300 см/час. Предпочтительно скорость потока находится в диапазоне 80-250 см/ч, более предпочтительно, 100-220 см/ч, наиболее предпочтительно, примерно 100-110 см/час.
На стадии е способа настоящего изобретения элюирование проводят либо в обычном режиме (то есть, элюирующий поток имеет такое же направление, как и поток, используемый для загрузки и промывки), или в обратном режиме (то есть, элюирующий поток имеет направление, противоположное направлению потока, используемого для загрузки и промывки). Обратный режим элюирования очищаемой смеси Cys-связанных ADC является особенно предпочтительным в том случае, когда используют смесь ADC (полученную в результате реакции конъюгации), очищенную от неконъюгированных молекул линкер-лекарственное средство, например, путем подвергания указанной (полученной в результате реакции конъюгации) смеси фильтрации (например, на активированном угле), перед применением заявленного способа очистки.
Предпочтительно соль для приготовления водного раствора соли выбирают из группы, включающей тиоцианат калия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид аммония, сульфат натрия, сульфат калия и сульфат аммония. Предпочтительно соль представляет собой хлорид натрия или сульфат аммония. Более предпочтительно, соль представляет собой сульфат аммония.
В соответствии со способом настоящего изобретения, соль для приготовления водного раствора, используемого для загрузки (стадия b) и промывки (стадия d), может быть такой же, как и соль для приготовления водного раствора, используемого для элюирования (стадия e), или отличаться от нее. Предпочтительно на стадиях b, d и e используют одну и ту же соль.
В соответствии со способом настоящего изобретения, концентрация водного раствора соли, используемого для загрузки (стадия b) и промывания колонки (стадия d), находится в диапазоне 0,2-1,5 М. Предпочтительно концентрация водного раствора соли составляет 0,2-1,0 М, более предпочтительно 0,45-0,9 М, наиболее предпочтительно 0,55-0,9 М.
В соответствии со способом настоящего изобретения, концентрация водного раствора соли, используемого для элюирования колонки (стадии e), находится в диапазоне 0-100 мМ. Предпочтительно концентрация водного раствора соли составляет 0-90 мМ, более предпочтительно 0-80 мМ, еще более предпочтительно 0-70 мМ и наиболее предпочтительно 0-55 мМ.
В соответствии со способом настоящего изобретения, предпочтительно водный раствор соли дополнительно содержит буфер. Предпочтительно водный раствор соли имеет концентрацию 0 мМ (стадия е) и содержит буфер. Предпочтительно буфер выбран из группы, включающей фосфат натрия, фосфат калия, фосфат аммония, ацетат натрия, ацетат калия, цитрат натрия, цитрат калия, цитрат аммония и их смеси. Предпочтительно буфер представляет собой фосфатный, ацетатный или цитратный буфер, или их смесь, такую как цитратно-фосфатный буфер. Более предпочтительно буфер представляет собой фосфат натрия или ацетат натрия.
В соответствии со способом настоящего изобретения, буфер для загрузки (стадия b), промывания (стадия d) и элюирования колонки (стадия e) имеет концентрацию 0-100 мМ, предпочтительно 0-50 мМ, более предпочтительно 20-30 мм. Предпочтительно на всех стадиях (стадии от a до e) способа настоящего изобретения используют забуференный водный раствор соли.
Забуференный водный раствор соли, который предпочтительно используют в способе настоящего изобретения, предпочтительно имеет рН примерно от 4 до 8, более предпочтительно примерно от 5 до 7, наиболее предпочтительно примерно от 5,0 до 5,5.
Гидрофобная хроматография ADC в соответствии со способом настоящего изобретения основана на различиях в гидрофобных свойствах неконъюгированных антител, антител, несущих до 8 молекул линкер-лекарственное средство, неконъюгированных молекул линкер-лекарственное средство и примесей, т.е. агрегатов, позволяющих осуществить разделение и выделить очищенную смесь Cys-связанных ADC. Чем выше гидрофобность антитела, ADC, молекулы линкер-лекарственное средство или примеси, тем сильнее они будут взаимодействовать с наполнителем колонки.
В соответствии со способом настоящего изобретения гидрофобность целевых ADC, содержащихся в смеси цистеин-связанных конъюгатов антитело-лекарственное средство, измеряют путем определения времени удерживания на аналитической колонке HIC по сравнению со стандартом, то есть, временем удерживания коммерчески доступного mAb трастузумаба (Herceptin®, Roche/Genentech). Для измерения гидрофобности используют образец ADC с конечной концентрацией цистеин-связанных конъюгатов антитело-лекарственное средство 1 мг/мл в 0,8 М растворе сульфата аммония и аналитическую колонку HIC TSKgel бутил-NPR (Tosoh Bioscience). Образец ADC элюируют с использованием линейного градиента от 100% буфера С (25 мМ фосфат натрия, 1,5 М сульфат аммония, рН 6,95) до 100% буфера D (25 мМ фосфат натрия, рН 6,95, 20% изопропанол), со скоростью 0,4 мл/мин в течение 20 мин, время удерживания молекул DAR2, содержащихся в образце ADC, определяют путем измерения оптической плотности при 214 нм по сравнению с трастузумабом (Herceptin®).
В соответствии со способом настоящего изобретения, с использованием аналитической колонки HIC и способа, описанного в предыдущем параграфе, молекулы Cys-связанных ADC DAR2 имеют относительную гидрофобность в диапазоне 0,1-0,6, предпочтительно 0,2-0,5, более предпочтительно 0,2-0,45, трастузумаб (Herceptin®) имеет время удерживания (Rt): 6,7 мин.
Способ настоящего изобретения особенно подходит для очистки смеси цистеин-связанных конъюгатов антитело-лекарственное средство формулы (I)
Figure 00000002
в которой
Ab обозначает антитело,
L обозначает связующую группу, выбранную из
Figure 00000003
V1 обозначает расщепляемый в определенных условиях дипептид, содержащий природные и/или неприродные аминокислоты,
CL обозначает циклизующий линкер, выбранный из
Figure 00000004
где n обозначает целое число в диапазоне от 1 до 16,
R выбран из Н, СН3, CH2CH3, OCH3, OCH2CH3, CF3, OCF3, Cl, F,
q варьирует от 0 до 8, и
DB обозначает ДНК-связывающий фрагмент, выбранный из
Figure 00000005
Такие смеси Cys-связанных ADC подробно описаны в WO2010/062171 и WO2011/133039 авторов настоящей заявки.
В соответствии со способом настоящего изобретения, расщепляемый в определенных условиях дипептид, содержащий природные и/или неприродные аминокислоты, предпочтительно выбран из группы, включающей фенилаланиллизин, валиллизин, валилаланин, аланиллизин, валилцитруллин, N-метилвалилцитруллин, фенилаланилцитруллин, изолейцилцитруллин, триптофаниллизин, триптофанилцитруллин, фенилаланиларгинин, фенилаланилаланин, фенилаланил-N9-тозиларгинин, фенилаланил-N9-нитроаргинин, лейциллизин, лейцилцитруллин и фенилаланил-O-бензоилтреонин. Предпочтительно дипептид представляет собой фенилаланиллизин, валиллизин или валилцитруллин.
В соответствии со способом настоящего изобретения, Ab выбрано из группы, включающей антитело против CD-19, антитело против CD22, антитело против CD30, антитело против CD33, антитело против CD56, антитело против CD70, антитело против CD74, антитело против CD-138, антитело против CLL-1, антитело против 5T4, антитело против CD303, антитело против Tag 72, антитело против углевода, подобного антигену Льюиса A, антитело против EphB3, антитело против HMW-MAA, антитело против CD38, антитело против Cripto, антитело против EphA2, антитело против GPNMB, антитело против интегрина, антитело против MN, антитело против HER2, антитело против PSMA, антитело против EGFR, антитело против CD203c, антитело против SLC44A4, антитело против нектина-4, антитело против мезотелина, антитело против CD44, антитело против CD79, антитело против FcRL5, антитело против MUC16, антитело против NaPi2b, анти-STEAP-1 антитело, антитело против ETBR, антитело против TF, антитело против MUC1, антитело против HGFR, антитело против CD37, антитело против FOLR1, антитело против CEACAM, антитело против TROP2, антитело против GCC, антитело против антигена Льюиса Y, антитело против LIV1, антитело против DLL3 и антитело против EPCAM. Антитело предпочтительно представляет собой моноклональное антитело (mAb).
В соответствии со способом настоящего изобретения, Ab, или предпочтительно mAb, представляет собой антитело против HER2. Более предпочтительно антитело представляет собой моноклональное антитело против HER2, такое как трастузумаб или биологически подобное ему антитело. В конкретном варианте осуществления способа настоящего изобретения смесь Cys-связанных ADC формулы (II) получают с использованием антитела трастузумаба или биологически подобного ему антитела, где указанное антитело восстанавливают трис(2-карбоксиэтил)фосфином (ТСЕР, 1,1 мольных эквивалентов на моль антитела) и подвергают взаимодействию с молекулой линкер-лекарственное средство формулы (III) (1,3 молярных эквивалентов на свободную тиольную группу). Конъюгирование обычно проводят в N,N-диметилацетамиде (DMAc) или диметилсульфоксиде (ДМСО), предпочтительно в DMAc.
Figure 00000006
В некоторых вариантах осуществления способа настоящего изобретения реакционную смесь после конъюгирования обрабатывают исходным раствором N-ацетилцистеина (1 молярный эквивалент на конъюгат линкер-лекарственное средство), чтобы блокировать реакционноспособные группы неконъюгированной молекулы линкер-лекарственное средство формулы (III).
В некоторых вариантах осуществления способа настоящего изобретения реакционную смесь после конъюгирования подвергают стадии фильтрования, чтобы удалить нерастворимый избыток молекулы линкер-лекарственное средство формулы (III). Удаление избытка молекулы линкер-лекарственное средство перед загрузкой реакционной смеси на колонку повышает емкость колонки. Можно использовать фильтры, хорошо известные специалистам в данной области техники.
Как правило, стадия фильтрации включает применение предфильтра и затем фильтра с допустимым значением абсолютного размера пор. Подходящие предфильтры включают объемные фильтры, содержащие активированный уголь. Предпочтительными являются такие фильтры, как ZetaCarbon SLP (3M).
Фильтры с подходящим абсолютным размером пор могут быть получены из полиэфирсульфона (PES), ацетата целлюлозы (CA) или поливинилиденфторида (PVDF). Предпочтительные фильтры включают фильтры из PVDF или PES, как правило, с абсолютным размером пор 0,2 мкм.
В некоторых вариантах осуществления способа настоящего изобретения реакционную смесь после конъюгирования готовят для очистки на колонке HIC с использованием фосфата натрия и сульфата аммония с конечной концентрацией фосфата натрия 20-30 мМ и сульфата аммония 0,55-0,65 М при рН 6,0-6,5 (буфер A).
В альтернативных вариантах осуществления способа настоящего изобретения реакционную смесь после конъюгирования готовят для очистки на колонке HIC с использованием ацетата натрия и сульфата аммония с конечной концентрацией ацетата натрия 20-30 мМ и 0,55-0,9 М сульфата аммония при рН 5,0-5,5 (буфер А).
В конкретном варианте осуществления способ настоящего изобретения включает использование колонки HIC (8 см ×20 см, быстропроточная бутил-сефароза 4), которую сначала уравновешивают буфером А (20-30 мМ фосфат натрия, 0,55-0,65 М сульфат аммония, рН 6,0-6,5) в объеме, равном трем объемам колонки, при скорости потока 100 см/ч, с последующим нанесением на колонку реакционной смеси, полученной после конъюгирования, в буфере А (стадия b) и сбором проточной фракции, содержащей неконъюгированное антитело (стадия c).
Стадия D включает промывание колонки HIC таким же буфером A (20-30 мМ фосфат натрия, 0,55-0,65 М сульфат аммония, рН 6,0-6,5), объем которого равен трем объемам колонки, при скорости потока 100 см/ч, и сбор проточной фракции, что позволяет удалить остаточные количества неконъюгированного антитела. Стадия е включает элюирование колонки HIC буфером В (20-30 мМ фосфат натрия, 45-55 мМ сульфат аммония, рН 6,0-6,5), объем которого равен трем объемам колонки, при скорости потока 100 см/ч, с получением очищенной смеси Cys-связанных ADC. Указанное элюирование можно проводить как в обычном режиме, или в реверсном режиме (как описано выше).
В другом конкретном варианте осуществления способ настоящего изобретения включает использование колонки HIC (1 см ×20 см, Toyopearl PPG-600M), которую сначала уравновешивают буфером А (20-30 мМ ацетат натрия, 0,55-0,9 М сульфат аммония, рН 5,0-5,5) в объеме, равном трем объемам колонки, при скорости потока 100 см/ч, с последующим нанесением на колонку реакционной смеси, полученной после конъюгирования, в буфере А (стадия b) и сбором проточной фракции, содержащей неконъюгированное антитело (стадия c).
После загрузки колонку HIC промывают таким же буфером А (20-30 мМ ацетат натрия, 0,55-0,9 М сульфат аммония, рН 5,0-5,5), объем которого равен трем объемам колонки, при скорости потока 100 см/ч, и собирают проточную фракцию, что позволяет удалить остаточные количества неконъюгированного антитела.
Стадия е включает элюирование колонки HIC буфером В (20-30 мМ ацетат натрия, рН 5,0-5,5), объем которого равен трем объемам колонки, при скорости потока 50-100 см/ч, с получением очищенной смеси Cys-связанных ADC. Указанное элюирование может проводить как в обычном режиме, так и в обратном режиме (как описано выше).
Полученная в результате очищенная смесь Cys-связанных ADC преимущественно содержит желательные молекулы DAR2 и DAR4. В указанных выше условиях большинство молекул DAR6 и DAR8, неконъюгированные молекулы линкер-лекарственное средство, а также любые агрегатные примеси остаются на колонке HIC. Промыванием колонки HIC водой для инъекций (WFI) можно элюировать молекулы DAR6 и DAR8, а также неконъюгированные молекулы линкер-лекарственное средство.
Способ настоящего изобретения особенно подходит для очистки смеси цистеин-связанных конъюгатов антитело-лекарственное средство формулы (II),
Figure 00000007
где
Ab обозначает трастузумаб, а
q варьирует от 0 до 8.
Удаление из указанной смеси ADC значительного количества неконъюгированных антител в результате применения способа очистки смеси Cys-связанных ADC настоящего изобретения приводит к увеличению среднего значения DAR. Например, как показано ниже в примере 3, среднее значение DAR для соединения Cys-связанного ADC формулы (II) увеличивается с 1,75 до 2,5 после очистки методом HIC.
После очистки методом HIC буфер, используемый для очистки Cys-связанного ADC, обычно заменяют на буфер для лиофилизации, после чего Cys-связанный ADC подвергают сушке из замороженного состояния с получением лиофилизированной массы, используя традиционные методы и традиционное оборудование.
ПРИМЕРЫ
Пример 1 - Получение раствора линкер-лекарственное средство, соединения формулы (III)
В защищенной среде изолятора (перчаточной камеры) достаточное количество твердого соединения формулы (III) отвешивают в бутылку. Твердое вещество растворяют в 100% DMAc до концентрации примерно 20 мМ. Затем бутылку вынимают из изолятора и хранят в вытяжном шкафу при комнатной температуре в защищенном от света месте. После определения точной концентрации раствор линкер-лекарственное средство разводят до 40 мМ.
Пример 2 - Конъюгирование молекулы линкер-лекарственное средство с трастузумабом
Моноклональное антитело (mAb) против HER2, трастузумаб, конъюгируют с молекулой линкер-лекарственное средство формулы (III), получая смесь цистеин-связанных конъюгатов антитело-лекарственное средство формулы (II).
Все операции проводят при непрерывном перемешивании в вытяжном шкафу.
Непосредственно перед конъюгированием раствор трастузумаба 60 мг/мл, также содержащий 4,2 мМ гистидина, 50 мМ трегалозы, 0,01% полисорбата 20, рН 6, смешивают в соотношении 2:1 с буфером для восстановления (4,2 мМ гистидина, 50 мМ трегалозы, 3 мМ ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) и 1 мМ TCEP, рН 6). Чтобы получить 2 свободные тиольные группы на молекулу mAb, восстанавливающее средство ТСЕР добавляют в соотношении 1,15 мольных эквивалентов на 1 эквивалент трастузумаба. После инкубации при комнатной температуре в течение 60 мин добавляют раствор Ν,Ν-диметилацетамида (DMAc) (100%) и линкер-лекарственное средство формулы (III) (10 мМ в DMAc, 2,2 эквивалента по отношению к mAb) так, чтобы конечная концентрация DMAc составляла 2,5% об/об.
После конъюгирования в течение ночи смесь фильтруют через фильтр с активированным углем (ZetaCarbon SLP, 3М) и затем через полиэфирсульфоновый (PES) фильтр 0,2 мкм, чтобы удалить нерастворимый избыток молекулы линкер-лекарственное средство формулы (III).
На фигурах 2А и 3А показаны хроматограммы двух разных партий реакционной смеси, полученной после конъюгирования, на аналитической колонке HIC (описано ниже). DAR8 не обнаружены. Рассчитанное среднее значение DAR составляет 1,75.
Пример 3 - Очистка методом HIC
Все хроматографические стадии проводят при комнатной температуре. Реакционную смесь, полученную после конъюгирования, готовят для очистки на колонке HIC путем смешивания с буфером, содержащим фосфат натрия (84 мМ) и сульфат аммония (2,21 М), в соотношении 1 объем буфера на 2 объема реакционной смеси, полученной после конъюгирования, до конечной концентрации фосфата натрия (26 мМ) и сульфата аммония (0,62 М) при рН 6,5.
Препаративную колонку 8 см ×20 см наполняют быстропроточной бутил-сефарозой 4 (GE Healthcare). Колонку уравновешивают буфером А (26 мМ фосфат натрия, 0,62 М сульфат аммония, рН 6,5), объем которого равен 3 объемам колонки, при скорости потока 100 см/час. Реакционную смесь после конъюгирования загружают на колонку в количестве до 10 г/л наполнителя колонки/смолы. Скорость потока была устанавливают на уровне 100 см/ч. В этих условиях неконъюгированное антитело (трастузумаб) не связывается с колонкой/протекает через колонку, которую дополнительно промывают буфером А (26 мМ фосфат натрия, 0,62 М сульфат аммония, рН 6,5) в объеме, равном 3 объемам колонки, при скорости потока 100 см/час. Проточные фракции со стадий загрузки и промывания собирают и объединяют. Элюирование молекул DAR2 и DAR4 цистеин-связанных конъюгатов антитело-лекарственное средство проводят с использованием буфера В (25 мМ фосфат натрия, 50 мМ сульфат аммония, рН 6,2) в объеме, равном 3 объемам колонки, при скорости потока 100 см/ч. В этих условиях любая оставшаяся неконъюгированная молекула линкер-лекарственное средство и большая часть цистеин-связанных конъюгатов антитело-лекарственное средство DAR6 остается на колонке. Путем промывания колонки водой для инъекций (WFI) в объеме, равном 2 объемам колонки, при скорости потока 100 см/ч элюируют все оставшиеся неконъюгированные молекулы линкер-лекарственное средство и большую часть цистеин-связанных конъюгатов антитело-лекарственное средство DAR6.
На фигуре 2В показана хроматограмма реакционной смеси, полученной после конъюгирования, на аналитической колонке HIC (описано ниже) после очистки методом HIC в препаративном масштабе. DAR8 не обнаружены. Рассчитанное среднее значение DAR составляет 2,50.
Пример 4 - Альтернативная очистка методом HIC
Все хроматографические стадии проводят при комнатной температуре. Отдельную партию реакционной смеси, полученной после конъюгирования, как описано выше, готовят для очистки на колонке HIC путем смешивания с буфером, содержащим ацетат натрия (75 мМ) и сульфат аммония (2,4 М), в соотношении 1 объем буфера и 2 объема реакционной смеси, полученной после конъюгирования, до конечной концентрации ацетата натрия (25 мМ) и сульфата аммония (0,8 М) при рН 5,3.
Препаративную колонку 1 см ×20 см наполняют Toyopearl PPG-600M (Tosoh Bioscience). Колонку уравновешивают буфером А (25 мМ ацетат натрия, 0,8 М сульфат аммония, рН 5,3) в объеме, равном 3 объемам колонки, при скорости потока 100 см/час. Реакционную смесь, полученную после конъюгирования, загружают на колонку в количестве до 35 г/л наполнителя для колонки/смолы. Скорость потока устанавливают на уровне 100 см/ч. В этих условиях неконъюгированное антитело (трастузумаб) не связывается с колонкой/протекает через колонку, которую дополнительно промывают буфером А (25 мМ ацетат натрия, 0,8 М сульфат аммония, рН 5,3) в объеме, равном 3,5 объемам колонки, при скорости потока 100 см/час. Проточные фракции со стадий загрузки и промывания собирают и объединяют. Элюирование молекул DAR2 и DAR4 цистеин-связанных конъюгатов антитело-лекарственное средство проводят с использованием буфера В (25 мМ ацетат натрия, рН 5,3) в объеме, равном 3,5 объемам колонки, при скорости потока 100 см/ч. В этих условиях любая оставшаяся неконъюгированная молекула линкер-лекарственное средство и большая часть цистеин-связанных конъюгатов антитело-лекарственное средство DAR6 остается на колонке. Путем промывания колонки 40% изопропанолом в объеме, равном 2 объемам колонки, при скорости потока 100 см/ч элюируют все оставшиеся неконъюгированные молекулы линкер-лекарственное средство и большую часть цистеин-связанных конъюгатов антитело-лекарственное средство DAR6.
На фигуре 3В показана хроматограмма реакционной смеси, полученной после конъюгирования, на аналитической колонке HIC (описано ниже) после очистки методом HIC в препаративном масштабе. DAR0 не обнаружены. Рассчитанное среднее значение DAR составляет 2,80.
Пример 5 - Анализ методом аналитической HIC
Анализ цистеин-связанных конъюгатов антитело-лекарственное средство проводят методом аналитической хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC). Образец получают путем разведения 10 мкл цистеин-связанного конъюгата антитело-лекарственное средство 90 мкл 0,89 М водного раствора сульфата аммония с получением конечной концентрации цистеин-связанного конъюгата антитело-лекарственное средство 1 мг/мл в 0,8 М сульфате аммония. 10 мкл образца вводят на колонку с TSKgel бутил-NPR (Tosoh Bioscience). Способ элюирования включает линейный градиент от 100% буфера С (25 мМ фосфат натрия, 1,5 М сульфат аммония, рН 6,95) до 100% буфера D (25 мМ фосфат натрия, рН 6,95, 20% изопропиловый спирт) со скоростью 0,4 мл/мин в течение 20 минут. Используют систему UPLC Waters Acquity класса H, оборудованную PDA-детектором и программным обеспечением Empower. Измеряют оптическую плотность при 214 нм и определяют время удерживания цистеин-связанных конъюгатов антитело-лекарственное средство.
Такой же аналитический метод применяют к образцу трастузумаб/Herceptin®, полученному по описанному выше способу, для которого время удерживания определяют при длине волны 214 нм.
Пример 6 - Определение относительной гидрофобности
Относительную гидрофобность цистеин-связанных конъюгатов антитело-лекарственное средство DAR2 рассчитывают с использованием времени удерживания (Rt) указанных молекул DAR2, входящих в состав смеси Cys-связанных ADC, и времени удерживания трастузумаб/Herceptin® по следующей формуле:
[Rt(DAR2)-Rt(трастузумаб/Herceptin®)]/Rt(трастузумаб/Herceptin®).
В соответствии с результатами, полученными на описанной выше аналитической колонке HIC, молекулы цистеин-связанного конъюгата антитело-лекарственное средство формулы (II), характеризующиеся DAR2, имеют время удерживания 9,6 мин и относительную гидрофобность 0,4, тогда как время удерживания трастузумаб/Herceptin® составляет 6,7 минут.

Claims (44)

1. Способ очистки смеси цистеин-связанных конъюгатов антитело-лекарственное средство формулы (I)
Figure 00000008
(I),
где
Ab обозначает антитело,
L обозначает связывающую группу, выбранную из
Figure 00000009
V1 обозначает расщепляемый в определенных условиях дипептид из природных и/или неприродных аминокислот,
CL обозначает циклизующий линкер, выбранный из
Figure 00000010
где n обозначает целое число от 1 до 16,
R выбран из Н, СН3, CH2CH3, OCH3, OCH2CH3, CF3, OCF3, Cl, F,
q варьирует от 0 до 8, и
DB обозначает ДНК-связывающую молекулу, выбранную из
Figure 00000011
Figure 00000012
Figure 00000013
и
Figure 00000014
,
в которой количество неконъюгированного антитела находится в диапазоне от 10 до 40% по массе, где способ включает:
a. получение смеси в 0,2-1,5 М водном солевом растворе;
b. загрузку полученного раствора на препаративную колонку для проведения хроматографии гидрофобного взаимодействия;
c. сбор проточной фракции, которая содержит неконъюгированное антитело;
d. промывку указанной колонки 0,2-1,5 М водным солевым раствором с одновременным сбором проточной фракции; и
е. элюирование указанной колонки 0-100 мМ водным солевым раствором с получением очищенной смеси цистеин-связанных конъюгатов антитело-лекарственное средство;
причем ни на одной из стадий a, b, d или e не используют органический растворитель.
2. Способ по п.1, в котором для наполнения указанной колонки используют пропил-Fractrogel EMD, фенил-Fractrogel EMD, бутил-S-сефарозу, октилсефарозу, октил-Capto, бутил-Capto, фенил-Capto Impres, бутил-Capto Impres, Toyopearl PPG-600M, гексил-Toyopearl 650, бутил-Toyopearl 650, фенил-Toyopearl 650, эфир Toyopearl 650, трет-бутил-MacroPrep, фенил-MacroPrep, бутил-Cellufine, фенил-Cellufine или Poros НР2.
3. Способ по п.1, где диаметр указанной колонки изменяется от 4,0 до 2000 мм.
4. Способ по п.1, где диаметр указанной колонки изменяется до 15 до 2000 мм.
5. Способ по п.1, где количество вещества, загружаемого на колонку, находится в диапазоне от 5 до 50 г/л наполнителя для колонки.
6. Способ по п.1, где количество вещества, загружаемого на колонку, находится в диапазоне от 5 до 40 г/л наполнителя для колонки.
7. Способ по п.1, где количество вещества, загружаемого на колонку, имеет средний размер частиц в диапазоне от 30 до 180 мкм.
8. Способ по п.1, где соль водного солевого раствора выбрана из группы, состоящей из тиоцианата калия, хлорида натрия, хлорида калия, хлорида аммония, сульфата натрия, сульфата калия и сульфата аммония.
9. Способ по п.1, где соль водного солевого раствора представляет собой хлорид натрия или сульфат аммония.
10. Способ по п.1, где водный солевой раствор дополнительно содержит буфер.
11. Способ по п.10, где буфер выбран из группы, состоящей из фосфата натрия, фосфата калия, фосфата аммония, ацетата натрия, ацетата калия, цитрата натрия, цитрата калия, цитрата аммония и их смеси.
12. Способ по п.10, где буфер представляет собой фосфат натрия или ацетат натрия.
13. Способ по п.10, где указанный водный солевой раствор забуферен до значения рН, равного 4-8.
14. Способ по п.1, где элюирование на стадии е проводят в обратном режиме.
15. Способ по п.1, где Ab выбрано из группы, состоящей из антитела против CD19, антитела против CD22, антитела против CD30, антитела против CD33, антитела против CD56, антитела против CD70, антитела против CD74, антитела против CD138, антитела против CLL-1, антитела против 5T4, антитела против CD303, антитела против Tag 72, антитела против углевода, подобного антигену Льюиса A, антитела против EphB3, антитела против HMW-MAA, антитела против CD38, антитела против Cripto, антитела против EphA2, антитела против GPNMB, антитела против интегрина, антитела против MN, антитела против HER2, антитела против PSMA, антитела против EGFR, антитела против CD203c, антитела против SLC44A4, антитела против нектина-4, антитела против мезотелина, антитела против CD44, антитела против CD79, антитела против FcRL5, антитела против MUC16, антитела против NaPi2b, анти-STEAP-1 антитела, антитела против ETBR, антитела против TF, антитела против MUC1, антитела против HGFR, антитела против CD37, антитела против FOLR1, антитела против CEACAM, антитела против TROP2, антитела против GCC, антитела против антигена Льюиса Y, антитела против LIV1, антитела против DLL3 и антитела против EPCAM.
16. Способ по п.1, где смесь цистеин-связанных конъюгатов антитело-лекарственное средство имеет формулу (II)
Figure 00000015
(II)
где
Ab обозначает трастузумаб и
q находится в диапазоне от 0 до 8.
17. Способ по п.16, где очищенная смесь указанных цистеин-связанных конъюгатов антитело-лекарственное средство формулы (II) имеет среднее значение соотношения лекарственного средства к антителу (DAR) от 2,6 до 2,9.
18. Способ по п.17, где среднее значение DAR равно 2,80.
RU2016132634A 2014-01-10 2015-01-09 Способ очистки cys-связанных конъюгатов антитело-лекарственное средство RU2680404C2 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14150789.7 2014-01-10
EP14150789 2014-01-10
PCT/EP2015/050304 WO2015104359A2 (en) 2014-01-10 2015-01-09 Method for purifying cys-linked antibody-drug conjugates

Publications (3)

Publication Number Publication Date
RU2016132634A RU2016132634A (ru) 2018-02-16
RU2016132634A3 RU2016132634A3 (ru) 2018-09-05
RU2680404C2 true RU2680404C2 (ru) 2019-02-21

Family

ID=49911439

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2016132634A RU2680404C2 (ru) 2014-01-10 2015-01-09 Способ очистки cys-связанных конъюгатов антитело-лекарственное средство

Country Status (22)

Country Link
US (1) US10266606B2 (ru)
EP (1) EP3092010B1 (ru)
JP (1) JP6419844B2 (ru)
KR (1) KR102323301B1 (ru)
CN (1) CN105899235B (ru)
AU (1) AU2015205574B2 (ru)
CA (1) CA2935456C (ru)
CL (1) CL2016001741A1 (ru)
CY (1) CY1120595T1 (ru)
DK (1) DK3092010T3 (ru)
ES (1) ES2687225T3 (ru)
HR (1) HRP20181525T1 (ru)
LT (1) LT3092010T (ru)
MX (1) MX373458B (ru)
MY (1) MY177390A (ru)
PL (1) PL3092010T3 (ru)
PT (1) PT3092010T (ru)
RU (1) RU2680404C2 (ru)
SG (1) SG11201605605SA (ru)
TR (1) TR201810856T4 (ru)
WO (1) WO2015104359A2 (ru)
ZA (1) ZA201604531B (ru)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9901567B2 (en) 2007-08-01 2018-02-27 Syntarga B.V. Substituted CC-1065 analogs and their conjugates
AU2011243294C1 (en) 2010-04-21 2015-12-03 Syntarga B.V. Novel conjugates of CC-1065 analogs and bifunctional linkers
PT3092010T (pt) 2014-01-10 2018-09-28 Synthon Biopharmaceuticals Bv Método para purificação de conjugados anticorpo-fármaco ligados por cys
PT2948183T (pt) 2014-01-10 2016-07-13 Univ Yale Conjugados anticorpo-fármaco de duocarmicina para utilização no tratamento de cancro do endométrio
PT3069735T (pt) 2014-01-10 2018-05-18 Synthon Biopharmaceuticals Bv Adc de duocarmicina para utilização no tratamento de cancro da bexiga
SG10201913977TA (en) 2014-05-22 2020-03-30 Synthon Biopharmaceuticals Bv Site-specific conjugation of linker drugs to antibodies and resulting adcs
PL3152191T3 (pl) 2014-06-05 2019-10-31 Synthon Biopharmaceuticals Bv Ulepszony sposób wytwarzania proleków duokarmycyny
LT3292149T (lt) 2015-05-04 2022-03-10 Cytomx Therapeutics, Inc. Aktyvinami antikūnai prieš cd71 ir jų naudojimo būdai
BR112018071105A2 (pt) 2016-04-15 2019-02-26 Macrogenics, Inc. conjugado de droga e anticorpo, molécula de ligação, composição farmacêutica e uso
EP3571221A2 (en) 2017-01-20 2019-11-27 Juno Therapeutics GmbH Cell surface conjugates and related cell compositions and methods
CA3056261A1 (en) 2017-04-07 2018-10-11 Juno Therapeutics, Inc. Engineered cells expressing prostate-specific membrane antigen (psma) or a modified form thereof and related methods
TWI847992B (zh) 2018-07-25 2024-07-11 日商第一三共股份有限公司 抗體-藥物結合物之有效的製造方法
CN109336967A (zh) * 2018-11-09 2019-02-15 杭州奕安济世生物药业有限公司 基于混合填料的抗体纯化方法
ES2972018T3 (es) * 2019-07-03 2024-06-10 Merck Patent Gmbh Purificación de conjugados anticuerpo-fármaco
EP4138888A1 (en) * 2020-04-23 2023-03-01 Eli Lilly and Company Subcutaneous absorption and bioavailability of antibodies
CN119139490A (zh) * 2023-06-14 2024-12-17 江苏迈威康新药研发有限公司 一种制备抗体药物偶联物的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999031120A1 (en) * 1997-12-12 1999-06-24 Genetics Institute, Inc. Novel tgf-beta protein purification methods
EA200601959A1 (ru) * 2004-04-23 2007-04-27 Конджачем Биотекнолоджис Инк. Способ очистки конъюгатов альбумина

Family Cites Families (86)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1238907A (en) 1984-02-21 1988-07-05 Robert C. Kelly 1,2,8,8a-tetrahydrocyclopropa¬c|pyrrolo(3,2-e)- indol-4(5h)-ones and related compounds
US4771128A (en) 1986-10-10 1988-09-13 Cetus Corporation Method of purifying toxin conjugates using hydrophobic interaction chromatography
JP2598819B2 (ja) 1986-12-19 1997-04-09 ジ・アップジョン・カンパニー 新規なｃｃ‐１０６５同族体
JP3380237B2 (ja) 1988-09-12 2003-02-24 ファルマシア・アンド・アップジョン・カンパニー ２のｃｐｉサブユニットを有する新規ｃｃ―１０６５アナログ類
MX9203460A (es) 1988-09-12 1992-09-01 Upjohn Co Nuevos analogos cc-1065 que tienen dos subunidades cpi.
CA2078118C (en) 1990-04-25 1999-11-16 Paul A. Aristoff Cc-1065 analogs
JPH05268205A (ja) 1992-03-19 1993-10-15 Fujitsu Ltd クロック切換え回路
ES2149768T3 (es) 1992-03-25 2000-11-16 Immunogen Inc Conjugados de agentes enlazantes de celulas derivados de cc-1065.
JP3514490B2 (ja) 1992-08-21 2004-03-31 杏林製薬株式会社 トリフルオロメチルピロロインドールカルボン酸エステル誘導体及びその製造方法
KR960702463A (ko) 1994-04-01 1996-04-27 나까무라 간노스께 Dc-89 유도체[dc-89 derivative]
JPH07309761A (ja) 1994-05-20 1995-11-28 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd デュオカルマイシン誘導体の安定化法
US5502068A (en) 1995-01-31 1996-03-26 Synphar Laboratories, Inc. Cyclopropylpyrroloindole-oligopeptide anticancer agents
US5646298A (en) 1995-06-07 1997-07-08 Procoron, Inc. Cyclopropylindole prodrugs
GB9516943D0 (en) 1995-08-18 1995-10-18 Cancer Soc Auckland Div Nz Inc Novel cyclopropylindoles and their secoprecursors,and their use as prodrugs
AU727608B2 (en) 1995-10-03 2000-12-14 Scripps Research Institute, The CBI analogs of CC-1065 and the duocarmycins
ES2244991T3 (es) 1996-03-08 2005-12-16 The Scripps Research Institute Analogosmcbi de cc-1065 y las duocarmicinas.
US5843937A (en) 1996-05-23 1998-12-01 Panorama Research, Inc. DNA-binding indole derivatives, their prodrugs and immunoconjugates as anticancer agents
US6060608A (en) 1996-05-31 2000-05-09 The Scripps Research Institute Analogs of CC-1065 and the duocarmycins
NZ334344A (en) 1996-09-12 2000-08-25 Cancer Res Campaign Tech benzo[e]indole and pyrrolo[3,2-e]indole compounds and their use as prodrugs
WO1998025900A1 (fr) 1996-12-13 1998-06-18 Shionogi & Co., Ltd. Composes presentant une activite antitumorale
GB9625913D0 (en) 1996-12-13 1997-01-29 Cancer Soc Auckland Div Nz Inc Novel cyclopropylindoles and their seco precursors,and their use as prodrugs
WO1998052925A1 (en) 1997-05-22 1998-11-26 The Scripps Research Institute Analogs of duocarmycin and cc-1065
CA2306420A1 (en) 1997-10-14 1999-04-22 The Scripps Research Institute Iso-cbi and iso-ci analogs of cc-1065 and the duocarmycins
US7214685B2 (en) 2000-05-02 2007-05-08 Lutz F. Tietze Prodrugs for a selective cancer therapy
AU2001262974A1 (en) 2000-05-03 2001-11-12 The Scripps Research Institute Dna alkylating agent and activation thereof
ATE310724T1 (de) 2000-09-19 2005-12-15 Taiho Pharmaceutical Co Ltd Zusammensetzungen und verfahren zur verwendung achirale analoge von cc1065 und den duocarmycinen
US7064117B2 (en) 2001-01-24 2006-06-20 Auckland Uniservices Limited Anti-cancer 2,3-dihydro-1H-pyrrolo[3,2-f]quinoline complexes of cobalt and chromium
ATE327750T1 (de) 2001-02-22 2006-06-15 Univ London Pharmacy Benz-indol- und benzo-chinolin-derivate als prodrugs zur tumorbehandlung
US7179921B2 (en) 2001-02-22 2007-02-20 School Of Pharmacy, University Of London Indoline and tetrahydro-quinolines as prodrugs for tumour treatment
ATE378328T1 (de) 2001-02-22 2007-11-15 Univ London Pharmacy Pyrrolo-indol- und pyrrolo-chinolin-derivate als prodrugs zur tumorbehandlung
EP1243276A1 (en) 2001-03-23 2002-09-25 Franciscus Marinus Hendrikus De Groot Elongated and multiple spacers containing activatible prodrugs
NZ529788A (en) 2001-05-31 2003-12-19 Medarex Inc Cytotoxins, prodrugs, linkers and stabilizers useful therefor
JP2005502703A (ja) 2001-09-07 2005-01-27 ザ スクリプス リサーチ インスティテュート Ｃｃ−１０６５およびデュオカルマイシンのｃｂｉ類似体
WO2003026577A2 (en) 2001-09-24 2003-04-03 Seattle Genetics, Inc. P-amidobenzylethers in drug delivery agents
US6756397B2 (en) 2002-04-05 2004-06-29 Immunogen, Inc. Prodrugs of CC-1065 analogs
US7235578B2 (en) 2002-05-17 2007-06-26 Auckland Uniservices Limited Processes for preparing 3-substituted 1-(chloromethyl)-1,2-dihydro-3H-[ring fused indol-5-yl-(amine-derived)] compounds and analogues thereof, and to products obtained therefrom
EP1575514A2 (en) 2002-07-31 2005-09-21 Seattle Genetics, Inc. Anti-cd20 antibody-drug conjugates for the treatment of cancer and immune disorders
EP1560599A1 (en) 2002-11-14 2005-08-10 Syntarga B.V. Prodrugs built as multiple self-elimination-release spacers
EP1592457B1 (en) 2003-01-27 2012-07-25 Endocyte, Inc. Folate-vinblastine conjugate as medicament
WO2004069201A2 (en) 2003-02-03 2004-08-19 Medlogics Device Corporation Compounds useful in coating stents to prevent and treat stenosis and restenosis
EP2100619B1 (en) 2003-02-20 2014-02-12 Seattle Genetics, Inc. Anti-CD70 antibody-drug conjugates and their use for the treatment of immune disorders
US20050026987A1 (en) 2003-05-13 2005-02-03 The Scripps Research Institute CBI analogues of the duocarmycins and CC-1065
WO2005032594A2 (en) 2003-10-03 2005-04-14 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Alkylators linked to polyamides as dna binding agents
US7282590B2 (en) 2004-02-12 2007-10-16 The Research Foundation Of State University Of New York Drug conjugates
AU2005218642B2 (en) 2004-03-02 2011-04-28 Seagen Inc. Partially loaded antibodies and methods of their conjugation
CA2562527A1 (en) 2004-04-21 2005-11-10 Alza Corporation Polymer conjugate releasable under mild thiolytic conditions
US20050239864A1 (en) 2004-04-23 2005-10-27 Yuqiang Wang Novel tumor-selective chemotherapeutic agents
US7517903B2 (en) 2004-05-19 2009-04-14 Medarex, Inc. Cytotoxic compounds and conjugates
CA2569679A1 (en) 2004-06-30 2006-01-12 Novartis Ag Conjugates of antibody and duoarmycin derivatives as antitumor agents
JP5149620B2 (ja) 2004-07-23 2013-02-20 エンドサイト，インコーポレイテッド ２価リンカーおよびその結合体
AU2005289453A1 (en) 2004-09-27 2006-04-06 Government of the United States of America, as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services, National Institutes of Health Modulating MxA expression
NZ536107A (en) 2004-10-22 2007-06-29 Auckland Uniservices Ltd Nitrobenzindoles and their use in cancer therapy
CA2598956A1 (en) 2005-02-24 2006-08-31 Pfizer Products Inc. Bicyclic heteroaromatic derivatives useful as anticancer agents
US7714016B2 (en) 2005-04-08 2010-05-11 Medarex, Inc. Cytotoxic compounds and conjugates with cleavable substrates
AU2006277117B2 (en) 2005-08-05 2013-01-10 Syntarga B.V. Triazole-containing releasable linkers and conjugates comprising the same
ES2416136T3 (es) 2005-09-26 2013-07-30 Medarex, Inc. Conjugados de anticuerpo-fármaco y su uso
CN101365679B (zh) 2005-10-26 2012-11-14 梅达莱克斯公司 制备cc-1065类似物的方法和化合物
WO2007059404A2 (en) 2005-11-10 2007-05-24 Medarex, Inc. Duocarmycin derivatives as novel cytotoxic compounds and conjugates
BRPI0707426A2 (pt) 2006-02-02 2011-05-03 Syntarga Bv composto, conjugado, uso de um composto, composição farmacêutica, processo para preparar uma composição farmacêutica, e, métodos de tratamento de um mamìfero estando em necessidade do mesmo, e de tratamento ou prevenção de um tumor em um mamìfero
EP1832577A1 (en) 2006-03-07 2007-09-12 Sanofi-Aventis Improved prodrugs of CC-1065 analogs
WO2008074004A2 (en) 2006-12-14 2008-06-19 Medarex, Inc. Human antibodies that bind cd70 and uses thereof
TWI412367B (zh) 2006-12-28 2013-10-21 Medarex Llc 化學鏈接劑與可裂解基質以及其之綴合物
TW200900059A (en) 2007-02-21 2009-01-01 Medarex Inc Chemical linkers with single amino acids and conjugates thereof
US9901567B2 (en) 2007-08-01 2018-02-27 Syntarga B.V. Substituted CC-1065 analogs and their conjugates
ES2433379T3 (es) 2007-08-01 2013-12-10 Syntarga B.V. Análogos de CC-1065 sustituidos y sus conjugados
WO2009026274A1 (en) 2007-08-22 2009-02-26 Medarex, Inc. Site-specific attachment of drugs or other agents to engineered antibodies with c-terminal extensions
US8377981B2 (en) 2007-11-13 2013-02-19 The Scripps Research Institute CBI derivatives subject to reductive activation
US20090162372A1 (en) 2007-11-30 2009-06-25 Medarex, Inc. Fibronectin ed-b antibodies, conjugates thereof, and methods of use
AR069747A1 (es) 2007-11-30 2010-02-17 Medarex Inc Conjugado anticuerpo monoclonal anti-b7h4- farmaco y metodos de utilizacion
US20120027782A1 (en) 2007-11-30 2012-02-02 Bristol-Myers Squibb Company Monoclonal antibody partner molecule conjugates directed to protein tyrosine kinase 7 (ptk7)
CA2707443A1 (en) 2007-11-30 2009-06-11 Bristol-Myers Squibb Company Conjugates of anti-rg-1 antibodies
KR101764081B1 (ko) 2008-04-30 2017-08-01 이뮤노젠 아이엔씨 가교제 및 그 용도
NZ571028A (en) 2008-09-03 2011-01-28 Auckland Uniservices Ltd Nitrobenzindole compounds and their use in cancer treatment
US20100069617A1 (en) 2008-09-12 2010-03-18 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Enhanced protein aggregate removal by mixed mode chromatography on hydrophobic interaction media in the presence of protein-excluded zwitterions
EP2349274A4 (en) 2008-09-17 2014-12-17 Endocyte Inc CONJUGATES OF ANTIFOLATES BINDING THE FOLATE RECEPTOR
MX2011004625A (es) 2008-11-03 2011-07-20 Syntarga Bv Analogos cc-1065 novedosos y sus conjugados.
WO2011022316A1 (en) 2009-08-20 2011-02-24 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Mirnas dysregulated in triple-negative breast cancer
AU2011243294C1 (en) 2010-04-21 2015-12-03 Syntarga B.V. Novel conjugates of CC-1065 analogs and bifunctional linkers
EP2380909A1 (en) 2010-04-26 2011-10-26 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. PTK-7 protein involved in breast cancer
CN103796678B (zh) 2011-04-20 2018-02-27 健玛保 针对her2的双特异性抗体
ES2708699T3 (es) 2011-09-29 2019-04-10 Seattle Genetics Inc Determinación de la masa intacta de compuestos de agentes conjugados con proteínas
PL4241849T3 (pl) 2011-10-14 2025-01-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Zastosowania i wyrób przemysłowy zawierający pertuzumab, inhibitor dimeryzacji HER2
US10010623B2 (en) 2012-02-16 2018-07-03 Ucl Business Plc Lysosome-cleavable linker
PT2948183T (pt) 2014-01-10 2016-07-13 Univ Yale Conjugados anticorpo-fármaco de duocarmicina para utilização no tratamento de cancro do endométrio
PT3092010T (pt) 2014-01-10 2018-09-28 Synthon Biopharmaceuticals Bv Método para purificação de conjugados anticorpo-fármaco ligados por cys
PT3069735T (pt) 2014-01-10 2018-05-18 Synthon Biopharmaceuticals Bv Adc de duocarmicina para utilização no tratamento de cancro da bexiga

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999031120A1 (en) * 1997-12-12 1999-06-24 Genetics Institute, Inc. Novel tgf-beta protein purification methods
EA200601959A1 (ru) * 2004-04-23 2007-04-27 Конджачем Биотекнолоджис Инк. Способ очистки конъюгатов альбумина

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JUN OUYANG. Drug-to-Antibody Ratio (DAR) and Drug Load Distribution by Hydrophobic Interaction Chromatography and Reversed Phase High-Perfomance Liquid Chromatography, Methods in Molecular Biology, V. 1045, 2013, P. 275-283. *
SHEN B.Q. et al. Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates. Nat Biotechnol. 2012 Jan 22;30(2):184-9. doi: 10.1038/nbt.2108. *
А.Н. ИБРАГИМОВ и др. Хроматографические методы очистки белков. - Казань: ФГАОУ ВПО КФУ, 2013.-48 с. *

Also Published As

Publication number Publication date
SG11201605605SA (en) 2016-08-30
EP3092010B1 (en) 2018-07-11
CN105899235B (zh) 2019-08-30
JP6419844B2 (ja) 2018-11-07
TR201810856T4 (tr) 2018-08-27
HRP20181525T1 (hr) 2018-11-16
MX373458B (es) 2025-03-05
MX2016009068A (es) 2016-09-28
MY177390A (en) 2020-09-14
PT3092010T (pt) 2018-09-28
US10266606B2 (en) 2019-04-23
CL2016001741A1 (es) 2017-05-12
KR20160106721A (ko) 2016-09-12
AU2015205574B2 (en) 2019-08-15
ZA201604531B (en) 2018-07-25
CA2935456A1 (en) 2015-07-16
LT3092010T (lt) 2018-10-25
US20160324979A1 (en) 2016-11-10
JP2017502085A (ja) 2017-01-19
CA2935456C (en) 2018-09-18
ES2687225T3 (es) 2018-10-24
CY1120595T1 (el) 2019-12-11
WO2015104359A3 (en) 2015-09-11
PL3092010T3 (pl) 2019-01-31
DK3092010T3 (en) 2018-08-27
EP3092010A2 (en) 2016-11-16
WO2015104359A2 (en) 2015-07-16
RU2016132634A (ru) 2018-02-16
AU2015205574A1 (en) 2016-07-07
CN105899235A (zh) 2016-08-24
KR102323301B1 (ko) 2021-11-09
RU2016132634A3 (ru) 2018-09-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2680404C2 (ru) Способ очистки cys-связанных конъюгатов антитело-лекарственное средство
CN113332449B (zh) 酶法制备同质的抗体-药物缀合物
Matsuda Current approaches for the purification of antibody–drug conjugates
RU2670748C2 (ru) Конъюгаты антител с лекарственными агентами, обладающие улучшенной стабильностью, и их применение
CN102940889A (zh) 药物缀合物组合物
TWI825297B (zh) 抗Her2 抗體藥物偶聯物藥物製劑
JP2023112042A (ja) カチオン交換クロマトグラフィーを使用した三重軽鎖抗体の分離
US20190216819A1 (en) Method of synthesising adcs using affinity resins
US20170326251A1 (en) Method of synthesizing antibody drug conjugates using affinity resins
Ziaei et al. Production and characterization of a camelid single domain anti-CD22 antibody conjugated to DM1
JP2022552349A (ja) Ｂリンパ球特異的アマトキシン抗体コンジュゲート
CN112969478B (zh) 可滤过的含倍癌霉素抗体-药物缀合物组合物及相关方法
RU2795196C9 (ru) Фармацевтические композиции конъюгата антитела к her2-лекарственного средства
WO2025043019A1 (en) Slc4a1 (band 3) binding single domain antibodies for increased blood retention
RU2771310C9 (ru) Способ двойной конъюгации для получения конъюгатов антитело-лекарственное средство
WO2025003396A1 (en) Pegylated linkers and uses thereof
Natarajan et al. PEGylation of Antibody Fragments to Improve Pharmacodynamics and Pharmacokinetics

Legal Events

Date Code Title Description
PD4A Correction of name of patent owner