RU2542382C2

RU2542382C2 - Биспецифические анти-vegf/анти-ang-2 антитела

Info

Publication number: RU2542382C2
Application number: RU2011117410/10A
Authority: RU
Inventors: БЭНЕР Моника; БРИНКМАНН Ульрих; ЖОРЖ Ги; ГРИЕП Ремко-Альберт; ИМХОФ-ЮНГ Забине; КАВЛЬЕ Анита; КЕТТЕНБЕРГЕР Хуберт; КЛАЙН Кристиан; Томас РЕГУЛА Йёрг; ШЭФЕР Вольфганг; Михаэль ШАНЦЕР Юрген; ШОЙЕР Вернер; ЗЕЕБЕР Штефан; ТОМАС Маркус
Original assignee: Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг
Priority date: 2008-10-08
Filing date: 2009-10-07
Publication date: 2015-02-20
Also published as: EP2344537A1; AU2009301431B8; JP5368570B2; AU2009301431A8; MX2011003190A; RU2640253C2; PT2344537E; WO2010040508A9; KR20130118994A; HK1199265A1; RU2011117410A; RU2014149553A; DK2344537T3; CR20110166A; HRP20140376T1; AU2009301431B2; JP2014039549A; TWI458492B; CA2739122C; US20150004166A1

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии. Описаны биспецифические антитела против фактора роста сосудистого эндотелия человека VEGF и ангиопоэтина-2 человека ANG-2, способы их получения, фармацевтические композиции, содержащие указанные антитела, и их применения. 6 н. и 7 з.п. ф-лы, 26 ил., 15 табл., 19 пр.

Description

Настоящее изобретение относится к биспецифическим антителам против фактора роста сосудистого эндотелия (human vascular endothelial growth factor - VEGF/VEGF-A) и против ангиопоэтина-2 человека (angiopoietin-2 - ANG-2), к способам их получения, фармацевтическим композициям, содержащим указанные антитела, и к их применению.

Предшествующий уровень техники

Ангиогенез присутствует в патогенезе различных заболеваний, в том числе солидных опухолей, внутриглазных неоваскулярных синдромов, например, пролиферативных ретинопатии или старческой дегенерации сетчатки (СДС), ревматоидного артрита и псориаза (Folkman J. и др., J. Biol. Chem. 267, 1992, сс.10931-10934; Klagsbrun М. и др., Annu. Rev. Physiol. 53, 1991, сс.217-239; и Garner А. в кн.: «Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach)), 1994, под ред. Garner А. и Klintworth G.K., 2-е изд., изд-во Marcel Dekker, Нью-Йорк, сс.1625-1710). При солидных опухолях неоваскуляризация обеспечивает опухолевым клеткам преимущество в росте и независимой пролиферации по сравнению с нормальными клетками. Таким образом, наблюдают корреляцию между плотностью микрососудов в срезах опухолей и выживаемостью пациента при раке груди, а также в некоторых других опухолях (Weidner N. И др., N Engl J Med. 324, 1991, сс.1-8; Horak E.R. и др., Lancet 340, 1992, сс.1120-1124; и Macchiarini Р. И др., Lancet 340, 1992, сс.145-146).

VEGF и анти-VEGF антитела

Фактор роста сосудистого эндотелия человека (Human vascular endothelial growth factor - VEGF/VEGF-A) (SEQ ID NO:105) описан, например, в работах Leung D.W. и др., Science 246, 1989, сс.1306-1309; Keck P.J. и др., Science 246, 1989, сс.1309-1312; Connolly D.T. и др., J. Biol. Chem. 264, 1989, сс.20017-20024. VEGF участвует в регуляции нормального и нарушенного ангиогенеза и неоваскуляризации, связанных с опухолевыми и внутриглазными расстройствами (FerraraN. и др., Endocr. Rev. 18, 1997, сс.4-25; Berkman R.A. и др., J. Clin. Invest. 91, 1993, сс.153-159; Brown L.F. и др., Human Pathol. 26, 1995, сс.86-91; Brown L.F. и др., Cancer Res. 53, 1993, cc.4727-4735; Mattern J. и др., Brit. J. Cancer. 73, 1996, cc.931-934; Dvorak H. и др., Am. J. Pathol. 146, 1995, cc.1029-1039). VEGF является гомодимерным гликопротеином, который выделен из разных источников. VEGF проявляет высокоспецифичное митогенное действие в отношении клеток эндотелия. VEGF обладает важными регуляторными функциями при формировании новых кровеносных сосудов на протяжении эмбрионального образования и развития сосудов и в процессе ангиогенеза на протяжении взрослого периода жизни (Carmeliet Р. и др., Nature, 380, 1996, сс.435-439; Ferrara N. и др., Nature, 380, 1996, сс.439-442; обзор Ferrara и Davis-Smyth, Endocrine Rev., 18, 1997, сс.4-25). Значение действия VEGF показано в исследованиях, выявивших, что инактивация одного аллеля VEGF приводит к гибели эмбриона из-за недостаточного развития сосудистой сети (Carmeliet Р. и др., Nature, 380, 1996, сс.435-439; Ferrara N. и др., Nature, 380, 1996, сс.439-442). Кроме того, VEGF обладает сильным хемоаттрактантным действием в отношении моноцитов и может индуцировать плазминогенный активатор и ингибитор плазминогенного активатора в клетках эндотелия, а также может индуцировать проницаемость микрососудов. Из-за указанной последней активности VEGF иногда относят к фактору проницаемости сосудов (vascular permeability factor - VPF). Выделение и свойства VEGF рассмотрены в обзорах; см. FerraraN. и др., J. Cellular Biochem., 47, 1991, сс.211-218, и Connolly J., Cellular Biochem., 47, 1991, сс.219-223. В другом варианте сплайсинг иРНК одного гена VEGF дает до пяти изоформ VEGF.

Анти-VEGF нейтрализующие антитела супрессируют рост различных линий опухолевых клеток человека в мышах (Kim I. и др., Nature 362, 1993, сс.841-844; Warren S.R. и др., J. Clin. Invest., 95, 1995, сс.1789-1797; Borgstrom Р. и др., Cancer Res. 56, 1996, сс.4032-4039; Melnyk О. и др., Cancer Res. 56, 1996, сс.921-924). WO 94/10202, WO 98/45332, WO 2005/00900 и WO 00/35956 относятся к антителам против VEGF. Гуманизированное моноклональное антитело бевацизумаб (продаваемое под коммерческим названием продукта Avastin®) является анти-VEGF антителом, применяемым в лечении опухолей (WO 98/45331).

Ранибизумаб (коммерческое название продукта - Lucentis®) является фрагментом моноклонального антитела, производным от того же исходного антитела мыши, что и бевацизумаб (авастин). Его молекула намного меньше исходной молекулы и обладает сродством, достаточным для обеспечения более сильного связывания с VEGF-A (WO 98/45331). Этот продукт является антиангиогенным средством, одобренным для лечения «влажного» типа возрастной дегенерации желтого пятна (age-related macular degeneration - ARMD), обычной формы возрастной потери зрения. Другим анти-VEGF антителом является, например, антитело HuMab G6-31, описанное, например, в US 2007/0141065.

ANG-2 и aHTH-ANG-2 антитела

Ангиопоэтин-2 человека (Human angiopoietin-2 - ANG-2) (в другом варианте используют аббревиатуру ANGPT2 или ANG2) (SEQ ID NO:106) описан в работах Maisonpierre Р.С. и др., Science 277, 1997, сс.55-60, и Cheung А.Н. и др., Genomics 48, 1998, сс.389-391. Ангиопоэтины-1 и -2 (ANG-1 (SEQ ID No:107) и ANG-2 (SEQ ID No:106)) были обнаружены в качестве лигандов для Tie - семейства тирозинкиназ, которые избирательно экспрессируются в эндотелии сосудов. Yancopoulos G.D. и др., Nature 407, 2000, сс.242-248. В настоящее время установлено четыре безусловных представителя семейства ангиопоэтина. Ангиопоэтин-3 и -4 (Ang-З и Ang-4) могут представлять в высокой степени дивергентные аналоги одного и того же генного локуса у мыши и человека. Kim I. и др., FEBS Let, 443, 1999, сс.353-56; Kim I. и др., J Biol Chem 274, 1999, cc.26523-26528. ANG-1 и ANG-2 первоначально были идентифицированы в экспериментах с культурами тканей в качестве агониста и антагониста, соответственно (по ANG-1 см. Davis S. и др., Cell 87, 1996, сс.1161-1169; по ANG-2 см. Maisonpierre Р.С. и др., Science 277, 1997, сс.55-60). Все известные ангиопоэтины связываются в основном с Tie2, и оба, Ang-1 и -2, связываются с Tie2 со сродством 3 нМ (Kd). Maisonpierre Р.С. и др., Science 277, 1997, сс.55-60. Установлено, что Ang-1 поддерживает выживаемость ЕС и стимулирует целостность эндотелия, Davis S. и др., Cell 87, 1996, сс.1161-1169; Kwak H.J. и др., FEBS Lett 448, 1999, сс.249-253; Suri С. и др., Science 282, 1998, сс.468-471; Thurston G. и др., Science 286, 1999, сс.251 1-14; Thurston G. и др., Nat. Med. 6, 2000, сс.460-463, несмотря на то, что ANG-2 обладает противоположным эффектом и стимулирует дестабилизацию и регрессию кровеносных сосудов при отсутствии факторов выживания VEGF или основного фактора роста фибробластов. Maisonpierre Р.С. и др., Science 277, 1997, сс.55-60. Однако в результате многих исследований функции ANG-2 был сделан вывод о более сложной ситуации. ANG-2 может быть сложным регулятором ремоделирования сосудов, которое играет роль и в распространении сосудов, и в регрессии сосудов. Подтверждая такие роли для ANG-2, исследование экспрессии показало, что ANG-2 быстро индуцируется вместе с VEGF у взрослых при распространении сосудов при ангиогенезе, хотя ANG-2 индуцируется в отсутствие VEGF при регрессии сосудов. Holash J. и др., Science 284, 1999, сс.1994-1998; Holash J. и др., Oncogene 18, 1999, сс.5356-5362. Согласуясь с контекстно-зависимой ролью, ANG-2 специфически связывает с тем же специфическим для эндотелия рецептором, Tie-2, который активируется Ang-1, но оказывает контекстно-зависимые воздействия на его активирование. Maisonpierre Р.С. и др., Science 277, 1997, сс.55-60.

Исследования ангиогенеза в роговице показали, что и ANG-1, и ANG-2 обладают сходными эффектами, действуя синергидно с VEGF по индукции роста новых кровеносных сосудов. Asahara Т. и др., Circ. Res. 83, 1998, сс.233-240. Вероятность того, что это доза-зависимый ответ эндотелия, повышается за счет наблюдения, заключающегося в том, что in vitro при высокой концентрации ANG-2 может также быть про-ангиогенным. Kim I. и др., Oncogene 19, 2000, сс.4549-4552. В высокой концентрации ANG-2 действует в качестве апоптозного фактора выживания для клеток эндотелия во время сывороточного депривационного апоптоза через активирование Tie2 через PI-3 киназу и метаболический путь Akt. Kim I. и др., Oncogene 19, 2000, сс.4549-4552.

Кроме того, по результатам экспериментов in vitro был сделан вывод о том, что при продолжительном воздействии эффекты ANG-2 могут постепенно сдвигаться от эффекта антагониста к агонисту Tie2, и позднее может непосредственно участвовать в формировании сосудистых трубок и стабилизации новых сосудов. Teichert-Kuliszewska К. и др., Cardiovasc. Res. 49, 2001, сс.659-670. Кроме того, если клетки эндотелия культивируют на фибриновом геле, также наблюдают активирование Tie2 за счет ANG-2, что предположительно означает, что действие ANG-2 может зависеть от состояния дифференциации клеток эндотелия. Teichert-Kuliszewska К. и др., Cardiovasc. Res. 49, 2001, сс.659-670. В клетках эндотелия микрососудов, культивируемых в трехмерном геле, ANG-2 также может индуцировать активирование Tie2 и формирование структур типа капилляров. Mochizuki Y. и др., J. Cell. Sci. 115, 2002, сс.175-183. Применение 3-D сферического совместного культивирования в качестве модели созревания сосудов in vitro показывает, что прямой контакт между клетками эндотелия и клетками мезенхимы аннулирует способность к реагированию на VEGF, хотя наличие VEGF и ANG-2 индуцирует распространение сосудов. Korff Т. и др., Faseb J. 15, 2001, сс.447-457. Etoh Т.Н. и др. показали, что у клеток эндотелия, которые конститутивно экспрессируют Tie2, регуляция экспрессии ММР-1, -9 и u-РА сильно повышается за счет ANG-2 в присутствии VEGF. Etoh Т. и др., Cancer Res. 61, 2001, сс.2145-2153. На модели зрачковой мембраны in vivo Lobov I.В. и др. показали, что ANG-2 в присутствии эндогенного VEGF индуцирует быстрое повышение диаметра капилляров, ремоделируя базальную пластинку, пролиферацию и миграцию клеток эндотелия и стимулирует распространение новых кровеносных сосудов. Lobov LB. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 2002, сс.11205-11210. Напротив, ANG-2 индуцирует гибель клеток эндотелия и регрессию сосудов без эндогенного VEGF. Lobov LB. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 2002, cc.11205-11210. Сходным образом на модели опухоли in vivo Vajkoczy P. и др. показали, что многоклеточные агрегаты инициируют рост сосудов путем ангиогенного распространения через одновременную экспрессию VEGFR-2 и ANG-2 эндотелием хозяина и опухоли. Vajkoczy Р. и др., J. Clin. Invest. 109, 2002, сс.777-785. Эта модель показывает, что закончившая начальный рост микроциркуляторная часть растущих опухолей отличается непрерывным ремоделированием, предположительно опосредованным экспрессией VEGF и ANG-2. Vajkoczy Р. и др., J Clin. Invest. 09, 2002, сс.777-785.

Исследования Tie-2 и ангиопоэтина-1 на модели нокаутных мышей показывают сходные фенотипы и подтверждают, что фосфорилирование Tie-2 после стимуляции ангиопоэтином-1 опосредует ремоделирование и стабилизацию формируемых сосудов, стимулируя полное развитие кровеносных сосудов во время ангиогенеза и поддержание адгезии клеток, поддерживающих клетки эндотелия (Dumont J. и др., Genes & Development, 8, 1994, сс.1897-1909; Sato T.N., Nature, 376, 1995, сс.70-74; Thurston G. и др., Nature Medicine, 6, 2000, cc.460-463). Предположительно роль ангиопоэтина-1 сохраняется у взрослых, у которых он экспрессируется в разных местах и конститутивно (Hanahan D., Science, 277, 1997, сс.48-50; Zagzag D. и др., Exp Neurology, 159, 1999, сс.391-400). Напротив, экспрессия ангиопоэтина-2 в основном ограничивается сайтами сосудистого ремоделирования, в которых ангиопоэтин-2 предположительно блокирует конститутивную стабилизацию или функцию созревания ангиопоэтина-1, позволяя сосудам ревертировать и остаться, пластическое состояние которых может быть в большей степени отвечающим на распространяющиеся сигналы (Hanahan D., 1997; Holash J. и др., Orzcogerze 18, 199, сс.5356-5362; Maisonpierre Р.С, 1997). При экспрессии ангиопоэтина-2 при патологическом ангиогенезе установлено, что многие типы опухолей экспрессируют ангиопоэтин-2 (Maisonpierre Р.С. и др., Science 277, 1997, сс.55-60). Функциональные исследования показали, что ангиопоэтин-2 вовлечен в опухолевый ангиогенез и установили ассоциацию сверхэкспрессии ангиопоэтина-2 с повышенным ростом опухолей на модели ксенотрансплантата у мышей (Ahmad S.A. и др., Cancer Res., 61, 2001, сс.1255-1259). В других исследованиях связывают сверхэкспрессию ангиопоэтина-2 с опухолевой гиперваскулярностью (Etoh Т. и др., Cancer Res. 61, 2001, сс.2145-2153; Tanaka F. и др., Cancer Res. 62, 2002, сс.124-129).

В последнее время было предложено использовать ангиопоэтин-1, ангиопоэтин-2 и/или Tie-2 в качестве возможных мишеней в терапии опухолей. Например, в US 6166185, US 5650490 и US 5814464 описаны анти-Tiе-2 лиганд и рецепторные антитела. Исследования с применением растворимого Tie-2 были описаны для снижения числа и размера опухолей у грызунов (Lin, 1997; Lin, 1998). Siemeister G. и др., Cancer Res. 59, 1999, сс.3185-3191, получили линии клеток меланомы человека, экспрессирующие внеклеточный домен от Tie-2, ввели их инъекцией голым мышам и описали растворимый Tie-2 для получения существенного подавления роста опухоли и опухолевого ангиогенеза. Оба рассматриваемых вместе агента, ангиопоэтин-1 и ангиопоэтин-2, связываются с Tie-2, и из этих исследований неясно, является ли ангиопоэтин-1, ангиопоэтин-2 или Tie-2 привлекательной мишенью для противоопухолевой терапии. Однако эффективная терапия против ангипоэтина-2 предположительно полезна в лечении заболеваний, например, рака, при котором прогрессирование зависит от аберрантного ангиогенеза, если блокируемый процесс может привести к предупреждению улучшения заболевания (Follunan J., Nature Medicine. 1, 1995, сс.27-31).

Кроме того, некоторые группы исследователей сообщают о применении антител и пептидов, связывающихся с ангиопоэтином-2. См., например, US 6166185 и US 2003/10124129, WO 03/030833, WO 2006/068953, WO 03/057134 или US 2006/0122370.

Исследование воздействия очаговой экспрессии ангиопоэтина-2 показало, что противоборствующий ангиопоэтин 1 /Tie-2 сигнал ослабляет плотную сосудистую структуру, тем самым, подвергая воздействию клетки эндотелия для активации сигналов от индукторов ангиогенеза, например, VEGF (Hanahan D., Science, 277, 1997, сс.48-50). Такой проангиогенный эффект, возникающий из-за ингибирования ангиопоэтина-1, показывает, что терапия, направленная против ангиопоэтина-1, не будет эффективным противоопухолевым лечением.

ANG-2 экспрессируется во время развития в местах ремоделирования кровеносных сосудов. Maisonpierre Р.С. и др., Science 277, 1997, сс.55-60. У взрослых индивидуумов экспрессия ANG-2 ограничена местами сосудистого ремоделирования, а также присутствует в высоко васкуляризованных опухолях, включая глиому, Osada Н. и др., Int. J. Oncol. 18, 2001, сс.305-309); Koga К. и др., Cancer Res. 61, 2001, cc.6248-6254, гепатоклеточную карциному, Tanaka S. и др., J. Clin. Invest. 103, 1999, cc.341-345, бородавчатый рак желудка, Etoh Т. и др., Cancer Res. 61, 2001, сс.2145-2153; Lee J.H. и др., Int. J. Oncol. 18, 2001, cc.355-361, рак щитовидки, Bunone G. и др., Am J Pathol 155, 1999, cc.1967-1976, немелкоклеточный рак легких, Wong M.P. и др., Lung Cancer 29, 2000, сс.11-22, рак толстой кишки, Ahmad S.A. и др., Cancer 92, 2001, сс.1138-1143, рак простаты Wurmbach J.H. и др., Anticancer Res. 20, 2000, сс.5217-5220. Установлено, что некоторые опухолевые клетки экспрессируют ANG-2. Например, Tanaka S. и др., J. Clin. Invest. 103, 1999, сс.341-345, обнаружили иРНК ANG-2 в 10 из 12 образцов гепатоклеточной карциномы человека (ГКК). Сотрудники группы Ellis установили, что ANG-2 экспрессируется повсеместно в эпителии опухоли. Ahmad S.A. и др., Cancer 92, 2001, 1138-1143. Другие исследователи опубликовали сходные результаты. Chen L. и др., J. Tongji Med. Univ. 21, 2001, сс.228-235. Путем выявления уровней иРНК ANG-2 в архивированных образцах рака груди человека, Sfiligoi С.и др., Int. J. Cancer 103, 2003, сс.466-474, установили, что иРНК ANG-2 существенным образом ассоциирована с инвазией вспомогательных лимфатических узлов, коротким периодом отсутствия болезни и плохой общей выживаемостью. Tanaka F. и др., Cancer Res. 62, 2002, сс.7124-7129, проанализировали в общей сложности 236 пациентов с немелкоклеточным раком легких (НМКРЛ) на стадиях развития заболевания с I по IIIА, соответственно. С помощью иммуногистохимии они установили, что 16,9% пациентов НМКРЛ являются ANG-2-положительными. Плотность микрососудов для ANG-2-положительных опухолей существенно выше, чем плотность микрососудов у ANG-2-отрицательных опухолей. Такой ангиогенный эффект ANG-2 наблюдают только при высокой экспрессии VEGF. Кроме того, положительная экспрессия ANG-2 является существенным фактором прогнозирования послеоперационного выживания. Tanaka F. и др., Cancer Res. 62, 2002, сс.7124-7129. Однако ими было установлено отсутствие существенной корреляции между экспрессией Ang-1 и плотностью микрососудов. Tanaka F. и др., Cancer Res. 62, 2002, сс.7124-7129. Эти результаты означают, что ANG-2 является индикатором плохого прогноза для пациентов с тяжелыми формами некоторых типов рака.

Ранее, используя модель ANG-2 нокаутных мышей, группа под руководством Yancopoulo сообщила, что ANG-2 необходим для постнатального ангиогенеза. Gale N.W. и др., Dev. Cell 3, 2002, сс.411-423. Ими было установлено, что запрограммированная в ходе развития регрессия сосудистой системы стекловидного тела не происходит у ANG-2 нокаутных мышей, и их кровеносные сосуды сетчатки не могут распространяться от центральной артерии сетчатки. Gale N.W. и др., Dev. Cell 3, 2002, сс.411-423. Они также установили, что делеция ANG-2 приводит к серьезным дефектам в структуре и функции лимфатической сосудистой сети. Gale N.W. и др., Dev. Cell 3, 2002, сс.411-423. Генетическое сохранение Ang-1 устраняет лимфатические дефекты, но не дефекты ангиогенеза. Gale N.W. и др., Dev. Cell 3, 2002, сс.411-423.

Peters и др. сообщают, что растворимый Tie-2, когда высвобождается либо в качестве рекомбинантного белка, либо в вирусном векторе экспрессии, ингибирует in vivo рост карциномы молочных желез мыши и меланому у модельных мышей. Lin Р. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 1998, сс.8829-8834; Lin P. и др., J. Clin. Invest. 100, 1997, cc.2072-2078. Плотность сосудов в ткани опухоли, которую лечили указанным способом, существенно понизилась. Кроме того, растворимый Tie-2 блокирует ангиогенез в роговице крысы, вызванный кондиционированными средами культур опухолевых клеток. Lin Р. и др., J. Clin. Invest. 100, 1997, сс.2072-2078. Кроме того, Isner и др. показали, что добавление ANG-2 к VEGF индуцирует намного более длительный и в большей степени периферический процесс формирования новых сосудов, чем добавление только одного VEGF. Asahara Т. и др., Circ. Res. 83, 1998, сс.233-240. Избыток рецептора Tie-2 предотвращает модулирование за счет ANG-2 индуцированного VEGF процесса формирования новых сосудов. Asahara Т. и др., Circ. Res. 83, 1998, сс.233-240. Siemeister G. и др., Cancer Res. 59, 1999, сс.3185-3191, показали на голых мышах с ксенотрансплантатами, что сверхэкспрессия внеклеточных связывающих лиганды доменов, либо Fit-1, либо Tie-2, у ксенотрансплантатов, приводящая к существенному подавлению метаболического пути, не может быть компенсирована сверхэкспрессией другого указанного домена, следовательно, метаболический путь рецептора VEGF и метаболический путь Tie-2 не следует рассматривать в качестве двух независимых медиаторов, имеющих существенное значение для процесса ангиогенеза in vivo. Siemeister G. и др., Cancer Res. 59, 1999, cc.3185-3191. Это подтверждено в нескольких последующих публикациях White R. и др., Ргос. Natl. Acad. Sci. USA 100, 2003, cc.5028-5033. В этих исследованиях было показано, что устойчивый к нуклеазе аптамер РНК, который специфически связывает и ингибирует ANG-2, в значительной степени подавляет процесс формирования новых сосудов, индуцированный bFGF, на модели ангиогенеза в микрокармане роговицы крысы.

Биспецифические антитела

В последнее время было создано много различных структур рекомбинантных антител, например, четырехвалентных биспецифических антител, путем гибридизации, например, структуры антитела и одноцепочечных доменов (см., например, Coloma M.J. и др., Nature Biotech 15, 1997, сс.159-163; WO 2001/077342; и Morrison, S.L., Nature Biotech 25 (2007) 1233-1234).

Кроме того, несколько других новых форматов, в которых сердцевинная структура антитела (IgA, IgD, IgE, IgG или IgM) больше не сохраняется, например, диатела, триатела или тетратела, миниантитела, было создано несколько одноцепочечных структур (scFv, Bis-scFv), которые могут связывать два или несколько антигенов (Holliger Р. и др., Nature Biotech 23, 2005, сс.1126-1136; Fischer N., Leger О., Pathobiology 74, 2007, cc.3-14; Shen J. и др., Journal of Immunological Methods 318, 2007, cc.65-74; Wu С. и др., Nature Biotech. 25, 2007, cc.1290-1297).

Все такие форматы используют линкеры, или для гибридизации сердцевины антитела (IgA, IgD, IgE, IgG или IgM) с дополнительным связывающим белком (например, scFv), или для гибридизации, например, двух фрагментов Fab или scFv (Fischer N., Leger О., Pathobiology 74, 2007, cc.3-14). Следует учитывать, что может быть желательно сохранение эффекторных функций, например, комплементзависимой цитотоксичности (complement-dependent cytotoxicity - CDC) или антителозависимой клеточной цитотоксичности (antibody-dependent cellular cytotoxicity - ADCC), которые опосредуются через связывание с рецептором Fc, путем поддержания высокой степени сходства с природными антителами.

В WO 2007/024715 сообщают об иммуноглобулинах с доменами двойной вариабельности в качестве сконструированных поливалентных и полиспецифичных связывающих белков. Способ получения димер антител с биологическим действием описан в US 6897044. Конструкция поливалентного Fv антитела, обладающая по меньшей мере четырьмя вариабельными доменами, которые связаны между собой через пептидные линкеры, описана в US 7129330. Димерные и полимерные антигенсвязывающие структуры описаны в US 2005/0079170. Трех- или четырехвалентный моноспецифический антигенсвязывающий белок, включающий три или четыре фрагмента Fab, связанные друг с другом через соединяющие структуры, который не является природным иммуноглобулином, описан в US 6511663. В WO 2006/020258 описаны четырехвалентные биспецифические антитела, которые могут эффективно экспрессироваться в прокариотических и эукариотических клетках и используются в лечении и методах диагностики. Способ разделения или преимущественного синтеза димеров, связанных через по меньшей мере одну внутрицепочечную дисульфидную связь, от димеров, которые не связаны через по меньшей мере одну внутрицепочечную дисульфидную связь, из смеси, включающей два типа полипептидных димеров, описан в US 2005/0163782. Биспецифические четырехвалентные рецепторы описаны в US 5959083. Сконструированные антитела с тремя или более функциональными сайтами связывания антигена описаны в WO 2001/077342.

Полиспецифичные и поливалентные антигенсвязывающие полипептиды описаны в WO 1997/001580. В WO 1992/004053 описаны гомоконъюгаты, обычно получаемые из моноклональных антител класса IgG, которые связываются с тем же антигенным детерминантом и являются ковалентно связанными синтетической перекрестной связью. Олигомерные моноклональные антитела с высокой авидностью в отношении антигена, описаны в WO 1991/06305, посредством чего олигомеры, обычно класса IgG, секретируются, имея два или несколько мономеров иммуноглобулина, связанных вместе для формирования четырехвалентных или шестивалентных молекул IgG. Полученные от овец антитела и сконструированные конструкции антител описаны в US 6350860, они могут применяться для лечения заболеваний, при которых действие интерферона гамма является патогенным. В US 2005/0100543 описаны нацеливаемые конструкции, которые являются поливалентными носителями биспецифичных антител, т.е. каждая молекула нацеливаемой конструкции может выступать в качестве носителя двух или нескольких биспецифичных антител. Генетически сконструированные биспецифические четырехвалентные антитела описаны в WO 1995/009917. В WO 2007/109254 описаны стабилизированные связывающие молекулы, которые состоят или включают стабилизированный фрагмент scFv.

Комбинация ингибиторов VEGF и ANG-2

WO 2007/068895 относится к комбинации антагониста ANG-2 и VEGF, KDR и/или FLTL антагонистов. WO 2007/089445 относится к комбинациям ингибиторов ANG-2 и VEGF.

WO 2003/106501 относится к гибридным белкам, связывающимся с ангиопоэтином и содержащим домен полимеризации. WO 2008/132568 гибридные белки связываются с ангиопоэтином и VEGF.

Краткое описание изобретение

Первым объектом по настоящему изобретению является биспецифическое антитело, специфически связывающееся с фактором роста сосудистого эндотелия человека (human vascular endothelial growth factor - VEGF) и с ангиопоэтином-2 человека (angiopoietin-2 - ANG-2), включающее первый сайт связывания антигена, который специфически связывается с VEGF человека, и второй сайт связывания антигена, который специфически связывается с ANG-2 человека.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения биспецифическое антитело по настоящему изобретению отличается тем, что

i) каждый из указанных сайтов связывания антигена представляет пару вариабельного домена тяжелой цепи антитела и вариабельного домена легкой цепи антитела;

ii) указанный первый сайт связывания антигена, специфически связывающийся с VEGF, включает в вариабельный домен тяжелой цепи область CDR3 последовательности SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:17 или SEQ ID NO:94, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:18 или SEQ ID NO:95, и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:19 или SEQ ID NO:96, и в вариабельный домен легкой цепи область CDR3 последовательности SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:20 или SEQ ID NO:97, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:21 или SEQ ID NO:98 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:22 или SEQ ID NO:99;

iii) указанный второй сайт связывания антигена, специфически связывающийся с ANG-2, включает в вариабельный домен тяжелой цепи область CDR3 последовательности SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:78 или SEQ ID NO:86, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:79 или SEQ ID NO:87 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:80 или SEQ ID NO:88, и в вариабельный домен легкой цепи область CDR3 последовательности SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:28 с мутациями T92L, H93Q и W94T, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:81 или SEQ ID NO:89, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:82 или SEQ ID NO:90, область CDR1 последовательности SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:83 или SEQ ID NO:91.

ii) указанный первый сайт связывания антигена, специфически связывающийся с VEGF, включает в вариабельный домен тяжелой цепи область CDR3 последовательности SEQ ID NO:1, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:2 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:3, и в вариабельный домен легкой цепи область CDR3 последовательности SEQ ID NO:4, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:5 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:6;

или указанный первый сайт связывания антигена, специфически связывающийся с VEGF, включает в вариабельный домен тяжелой цепи область CDR3 последовательности SEQ ID NO:9, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:10 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:11, и в вариабельный домен легкой цепи область CDR3 последовательности SEQ ID NO:12, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:13 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:14;

или указанный первый сайт связывания антигена, специфически связывающийся с VEGF, включает в вариабельный домен тяжелой цепи область CDR3 последовательности SEQ ID NO:17, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:18 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:19, и в вариабельный домен легкой цепи область CDR3 последовательности SEQ ID NO:20, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:21 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:22; и

iii) указанный второй сайт связывания антигена, специфически связывающийся с ANG-2, включает в вариабельный домен тяжелой цепи область CDR3 последовательности SEQ ID NO:25, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:26 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:27, и в вариабельный домен легкой цепи область CDR3 последовательности SEQ ID NO:28 или SEQ ID NO:28 с мутациями T92L, H93Q и W94T, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:29 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:30.

ii) указанный первый сайт связывания антигена, специфически связывающийся с VEGF, включает в качестве вариабельного домена тяжелой цепи последовательность SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:23 или SEQ ID NO:100, и в качестве вариабельного домена легкой цепи последовательность SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:101, и

iii) указанный второй сайт связывания антигена, специфически связывающийся с ANG-2, включает в вариабельный домен тяжелой цепи последовательность SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:84 или SEQ ID NO:92, и в качестве вариабельного домена легкой цепи последовательность SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:32 с мутациями T92L, H93Q и W94T SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:85 или SEQ ID NO:93.

i) указанный первый сайт связывания антигена, специфически связывающийся с VEGF, включает в вариабельный домен тяжелой цепи область CDR3 последовательности SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:94, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:95 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:96, в вариабельный домен легкой цепи область CDR3 последовательности SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:97, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:5 или SEQ ID NO:98 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:6 или SEQ ID NO:99;

iii) указанный второй сайт связывания антигена, специфически связывающийся с ANG-2, включает в качестве вариабельного домена тяжелой цепи область CDR3 последовательности SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:78 или SEQ ID NO:86, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:79 или SEQ ID NO:87 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:80 или SEQ ID NO:88, и в вариабельный домен легкой цепи область CDR3 последовательности SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:81 или SEQ ID NO:89, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:82 или SEQ ID NO:90 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:83 или SEQ ID NO:91.

ii) указанный первый сайт связывания антигена, специфически связывающийся с VEGF, включает в качестве вариабельного домена тяжелой цепи последовательность SEQ ID NO:7 или SEQ ID NO:100, и включает в качестве вариабельного домена легкой цепи последовательность SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:101, и

iii) указанный второй сайт связывания антигена, специфически связывающийся с ANG-2, включает в качестве вариабельного домена тяжелой цепи последовательность SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:84 или SEQ ID NO:92, и в качестве вариабельного домена легкой цепи последовательность SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:85 или SEQ ID NO:93.

iii) указанный второй сайт связывания антигена, специфически связывающийся с ANG-2, включает в вариабельный домен тяжелой цепи область CDR3 последовательности SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:78 или SEQ ID NO:86, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:

63, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:79 или SEQ ID NO:87, и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:

64, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:80 или SEQ ID NO:88, и в вариабельный домен легкой цепи область CDR3 последовательности SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:81 или SEQ ID NO:89, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:82 или SEQ ID NO:90 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:83 или SEQ ID NO:91.

iii) указанный второй сайт связывания антигена, специфически связывающийся с ANG-2, включает в качестве вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:84 или SEQ ID NO:92, и в качестве вариабельного домена легкой цепи последовательность SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:85 или SEQ ID NO:93.

ii) указанный первый сайт связывания антигена, специфически связывающийся с VEGF, включает в вариабельный домен тяжелой цепи область CDR3 последовательности SEQ ID NO:1, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:2 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:3, и в вариабельный домен легкой цепи область CDR3 последовательности SEQ ID NO:4, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:5 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:6; и

iii) указанный второй сайт связывания антигена, специфически связывающийся с ANG-2, включает в вариабельный домен тяжелой цепи CDR3 область последовательности SEQ ID NO:46, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:47 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:48, и в вариабельный домен легкой цепи область CDR3 последовательности SEQ ID NO:49, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:50 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:51.

ii) указанный первый сайт связывания антигена, специфически связывающийся с VEGF, включает в качестве вариабельного домена тяжелой цепи последовательность SEQ ID NO:7, и в качестве вариабельного домена легкой цепи последовательность SEQ ID NO:8, и

iii) указанный второй сайт связывания антигена, специфически связывающийся с ANG-2, включает в качестве вариабельного домена тяжелой цепи последовательность SEQ ID NO:52 и в качестве вариабельного домена легкой цепи последовательность SEQ ID NO:53.

ii) указанный первый сайт связывания антигена, специфически связывающийся с VEGF, включает в вариабельный домен тяжелой цепи область CDR3 последовательности SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:94, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:95 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:96, и в вариабельный домен легкой цепи область CDR3 последовательности SEQ ID NO:4, или SEQ ID NO:97, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:5 или SEQ ID NO:98, и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:6 или SEQ ID NO:99;

iii) указанный второй сайт связывания антигена, специфически связывающийся с ANG-2, включает в вариабельный домен тяжелой цепи область CDR3 последовательности SEQ ID NO:62 или SEQ ID NO:86, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:63 или SEQ ID NO:87 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:64 или SEQ ID NO:88, и в вариабельный домен легкой цепи область CDR3 последовательности SEQ ID NO:65 или SEQ ID NO:89, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:66 или SEQ ID NO:90 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:67 или SEQ ID NO:91.

ii) указанный первый сайт связывания антигена, специфически связывающийся с VEGF, включает в качестве вариабельного домена тяжелой цепи последовательность SEQ ID NO:7 или SEQ ID NO:100 и в качестве вариабельного домена легкой цепи последовательность SEQ ID NO:8 или SEQ IDNO:101, и

iii) указанный второй сайт связывания антигена, специфически связывающийся с ANG-2, включает в качестве вариабельного домена тяжелой цепи последовательность SEQ ID NO:68 или SEQ ID NO:92 и в качестве вариабельного домена легкой цепи последовательность SEQ ID NO:69, или SEQ ID NO:93.

iii) указанный второй сайт связывания антигена, специфически связывающийся с ANG-2, включает в вариабельный домен тяжелой цепи область CDR3 последовательности SEQ ID NO:62, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:63 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:64, и в вариабельный домен легкой цепи область CDR3 последовательности SEQ ID NO:65, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:66 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:67.

ii) указанный первый сайт связывания антигена, специфически связывающийся с VEGF, включает в качестве вариабельного домена тяжелой цепи последовательность SEQ ID NO:7, и в качестве вариабельного домена легкой цепи последовательность SEQ ID NO:8; и

iii) указанный второй сайт связывания антигена, специфически связывающийся с ANG-2, включает в качестве вариабельного домена тяжелой цепи последовательность SEQ ID NO:68 и в качестве вариабельного домена легкой цепи последовательность SEQ ID NO:69.

Указанные биспецифические антитела являются по меньшей мере двухвалентными и могут быть трехвалентными, четырехвалентными или поливалентными. Предпочтительно биспецифическое антитело по настоящему изобретению является двухвалентным, трехвалентным или четырехвалентным.

Другой объект настоящего изобретения является молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей цепочку указанного биспецифического антитела.

Настоящее изобретение также предусматривает векторы экспрессии, содержащие указанную нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению, способные экспрессировать указанную нуклеиновую кислоту в прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах, и клетки-хозяева, содержащие такие векторы, для рекомбинантной выработки антитела по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение дополнительно включает прокариотические или эукариотические клетки-хозяева, включающие вектор по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение также предусматривает способ получения биспецифического антитела по настоящему изобретению, отличающийся экспрессией нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению в прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах и выделением указанного биспецифического антитела из указанных клеток или из супернатанта культуры клеток. Настоящее изобретение дополнительно включает антитело, полученное таким рекомбинантным способом.

Другими объектами настоящего изобретения являются фармацевтическая композиция, включающая указанное биспецифическое антитело, указанная композиция для лечения рака, применение указанного биспецифического антитела для получения лекарственного средства для лечения рака, способ лечения пациента, больного раком, путем введения указанного биспецифического антитела пациенту, нуждающемуся в таком лечении.

Биспецифические антитела по настоящему изобретению полезны для больных людей, нуждающихся в лечении, нацеливаемом на VEGF и ANG-2. Антитела по настоящему изобретению обладают новыми и обладающими признаками изобретения свойствами, полезными для пациента с таким заболеванием, особенно с раковым заболеванием. Неожиданно было установлено, что биспецифические антитела по настоящему изобретению более эффективны при раковом росте и/или подавлении ангиогенеза опухоли по сравнению с комбинацией соответствующих моноспецифических исходных антител.

Подробное описание изобретения

Одним из вариантов осуществления настоящего изобретения является биспецифическое антитело, специфически связывающееся с VEGF человека и ANG-2 человека, включающее первый сайт связывания антигена, который специфически связывается с VEGF человека, и второй сайт связывания антигена, который специфически связывается с ANG-2 человека, отличающееся тем, что i) каждый из указанных сайтов связывания антигена представляет пару вариабельного домена тяжелой цепи антитела и вариабельного домена легкой цепи антитела;

ii) указанный первый сайт связывания антигена, специфически связывающийся с VEGF, включает в вариабельный домен тяжелой цепи область CDR3 последовательности SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:17 или SEQ ID NO:94, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:18 или SEQ ID NO:95 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:19 или SEQ ID NO:96, и в вариабельный домен легкой цепи область CDR3 последовательности SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:20 или SEQ ID NO:97, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:21 или SEQ ID NO:98 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:22 или SEQ ID NO:99;

iii) указанный второй сайт связывания антигена, специфически связывающийся с ANG-2, включает в вариабельный домен тяжелой цепи область CDR3 последовательности SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:78 или SEQ ID NO:86, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:79 или SEQ ID NO:87, и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:80 или SEQ ID NO:88, и в вариабельный домен легкой цепи область CDR3 последовательности SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:28 с мутациями T92L, H93Q и W94T, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:81 или SEQ ID NO:89, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:82 или SEQ ID NO:90, и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:83 или SEQ ID NO:91.

ii) указанный первый сайт связывания антигена, специфически связывающийся с VEGF, включает в вариабельный домен тяжелой цепи область CDR3 последовательности SEQ ID NO:1, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:2 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:3, и в вариабельный домен легкой цепи область CDR3 последовательности SEQ ID NO:4, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:5 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:6; или указанный первый сайт связывания антигена, специфически связывающийся с VEGF, включает в вариабельный домен тяжелой цепи область CDR3 последовательности SEQ ID NO:9, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:10 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:11, и в вариабельный домен легкой цепи область CDR3 последовательности SEQ ID NO:12, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:13 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:14; или указанный первый сайт связывания антигена, специфически связывающийся с VEGF, включает в вариабельный домен тяжелой цепи область CDR3 последовательности SEQ ID NO:17, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:18 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:19, и в вариабельный домен легкой цепи область CDR3 последовательности SEQ ID NO:20, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:21 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:22; и

iii) указанный второй сайт связывания антигена, специфически связывающийся с ANG-2, включает в качестве вариабельного домена тяжелой цепи последовательность SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:84 или SEQ ID NO:92 и в качестве вариабельного домена легкой цепи последовательность SEQ ID

NO:32, SEQ ID NO:32 с мутациями T92L, H93Q и W94T SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:85 или SEQ ID NO:93.

ii) указанный первый сайт связывания антигена, специфически связывающийся с VEGF, включает в вариабельный домен тяжелой цепи область CDR3 последовательности SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:94, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:95 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:96, и в вариабельный домен легкой цепи область CDR3 последовательности SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:97, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:5 или SEQ ID NO:98 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:6 или SEQ ID NO:99;

iii) указанный второй сайт связывания антигена, специфически связывающийся с ANG-2, включает в вариабельный домен тяжелой цепи область CDR3 последовательности SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:78 или SEQ ID NO:86, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:79 или SEQ ID NO:87 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:

64, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:80 или SEQ ID NO:88, и в вариабельный домен легкой цепи область CDR3 последовательности SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:81 или SEQ ID NO:89, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:82 или SEQ ID NO:90, и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:83 или SEQ ID NO:91.

ii) указанный первый сайт связывания антигена, специфически связывающийся с VEGF, включает в качестве вариабельного домена тяжелой цепи последовательность SEQ ID NO:7 или SEQ ID NO:100, и в качестве вариабельного домена легкой цепи последовательность SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:101, и

iii) указанный второй сайт связывания антигена, специфически связывающийся с ANG-2, включает в качестве вариабельного домена тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:84 или SEQ ID NO:92, и в качестве вариабельного домена легкой цепи последовательности SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:85 или SEQ ID NO:93.

ii) указанный второй сайт связывания антигена, специфически связывающийся с ANG-2, включает в вариабельный домен тяжелой цепи область CDR3 последовательности SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:78 или SEQ ID NO:86, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:

63, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:79 или SEQ ID NO:87 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:

64, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:80 или SEQ ID NO:88, и в вариабельный домен легкой цепи область CDR3 последовательности SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:81 или SEQ ID NO:

89, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:82 или SEQ ID NO:90 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:83 или SEQ ID NO:91.

ii) указанный второй сайт связывания антигена, специфически связывающийся с ANG-2, включает в качестве вариабельного домена тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:84 или SEQ ID NO:92 и в качестве вариабельного домена легкой цепи последовательности SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:85 или SEQ ID NO:93.

iii) указанный второй сайт связывания антигена, специфически связывающийся с ANG-2, включает в вариабельный домен тяжелой цепи область CDR3 последовательности SEQ ID NO:46, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:47 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:48, и в вариабельный домен легкой цепи область CDR3 последовательности SEQ ID NO:49, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:50 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:51.

ii) указанный первый сайт связывания антигена, специфически связывающийся с VEGF, включает в качестве вариабельного домена тяжелой цепи последовательность SEQ ID NO:7, или SEQ ID NO:100, и в качестве вариабельного домена легкой цепи последовательность SEQ ID NO:8 или SEQ IDNO:101, и

iii) указанный второй сайт связывания антигена, специфически связывающийся с ANG-2, включает в качестве вариабельного домена тяжелой цепи последовательность SEQ ID NO:68, или SEQ ID NO:92 и в качестве вариабельного домена легкой цепи последовательность SEQ ID NO:69, или SEQ ID NO:93.

ii) указанный первый сайт связывания антигена, специфически связывающийся с VEGF, включает в качестве вариабельного домена тяжелой цепи последовательность SEQ ID NO:7 и вариабельного домена легкой цепи последовательность SEQ ID NO:8; и

iii) указанный второй сайт связывания антигена, специфически связывающийся с ANG-2, включает в вариабельный домен тяжелой цепи область CDR3 последовательности SEQ ID NO:78, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:79 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:80, и в вариабельный домен легкой цепи область CDR3 последовательности SEQ ID NO:81, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:82 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:83.

ii) указанный первый сайт связывания антигена, специфически связывающийся с VEGF, включает в качестве вариабельного домена тяжелой цепи последовательность SEQ ID NO:7 и в качестве вариабельного домена легкой цепи последовательность SEQ ID NO:8, и

iii) указанный второй сайт связывания антигена, специфически связывающийся с ANG-2, включает в качестве вариабельного домена тяжелой цепи последовательность SEQ ID NO:84 и в качестве вариабельного домена легкой цепи последовательность SEQ ID NO:85.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено биспецифическое антитело, специфически связывающееся с фактором роста сосудистого эндотелия (human vascular endothelial growth factor - VEGF) и ангиопоэтином-2 человека (angiopoietin-2 - ANG-2), отличающееся тем, что исходное aHTH-ANG-2 антитело не является специфически связывающимся с ангиопоэтином-1 человека (ANG-1). К типичным исходным антителам, которые специфически связываются с ANG-2 человека, но не с ANG-1 человека, относятся, например, Ang2s_R3_LC03, Ang2s_LC09, Ang2i_LC06, Ang2i_LC07 и предпочтительно Ang2i_LC10, или антитела, связывающиеся с тем же эпитопом, что и Ang2s_R3_LC03, Ang2s_LC09, Ang2i_LC06, Ang2i_LC07, Ang2i_LC10, предпочтительно антитела, связывающиеся с тем же эпитопом, что и Ang2i_LC06, или Ang2i_LC10. Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения биспецифическое антитело специфически связывается с фактором роста сосудистого эндотелия человека (VEGF) и ангиопоэтином-2 человека (ANG-2), но не с ANG-1 человека (или в котором исходное aHTH-ANG-2 антитело не связывается специфически с ангиопоэтином-1 человека (ANG-1)) связывается с тем же эпитопом, что и Ang2s_R3_LC03, Ang2s_LC09, Ang2i_LC06, Ang2i_LC07, Ang2i_LC10, предпочтительно с тем же эпитопом, что и Ang2i_LC06 или Ang2i_LC10. Такие биспецифические антитела, специфически связывающиеся с фактором роста сосудистого эндотелия человека (VEGF) и ангиопоэтином-2 человека (ANG-2), но не с ANG-1 человека (или в котором исходное aHTH-ANG-2 антитело не связывается специфически с ангиопоэтином-1 человека (ANG-1)), могут обладать улучшенными свойствами, например, биологическим или фармакологическим действием, пониженной токсичностью или фармакокинетическим профилем, по сравнению с биспецифическими антителами, специфически связывающимися с фактором роста сосудистого эндотелия человека (VEGF) и ангиопоэтином-2 человека (ANG-2), а также с ANG-1 человека.

Таким образом, предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения предусматривает биспецифическое антитело, специфически связывающееся с VEGF человека и ANG-2 человека, включающее первый сайт связывания антигена, который специфически связывается с VEGF человека, и второй сайт связывания антигена, который специфически связывается с ANG-2 человека, отличающееся тем, что второй сайт связывания антигена не связывается специфически с ангиопоэтином-1 человека (ANG-1).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено биспецифическое антитело, специфически связывающееся с фактором роста сосудистого эндотелия человека (VEGF) и ангиопоэтином-2 человека (ANG-2), включающее первый сайт связывания антигена, который специфически связывается с VEGF человека, и второй сайт связывания антигена, который специфически связывается с ANG-2 человека, отличающееся тем, что соотношение величин связывающего сродства KD (антигенсвязывающий сайт, специфичный в отношении VEGF)/KD (антигенсвязывающий сайт, специфичный в отношении ANG-2) составляет 1,0-10,0, предпочтительно 1,5-8,0 (в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения - 5,0-8,0) и предпочтительно абсолютная величина KD находится в диапазоне 10^-8-10^-13 моля/л. Величины KD определяют по ANG-2/VEGF связыванию BIACORE (см. пример 2 и фиг.15А). Поскольку оба белка, VEGF человека и ANG-2 человека, выступают в качестве растворимых рецепторов-лигандов в сыворотке человека примерно в равных концентрациях, блокирование указанных обоих рецепторов-лигандов биспецифическим антителом, отличающимся тем, что соотношения величин связывающего сродства KD (антигенсвязывающий сайт, специфичный в отношении УЕОР)/КБ(антигенсвязывающий сайт, специфичный в отношении ANG-2) составляют 1,0-10,0, предпочтительно 1,5-8,0, и в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения - 5,0-8,0 и может привести к улучшенным свойствам, связанным с антиангиогенными эффектами, подавлением роста опухолей или с механизмом устойчивости во время лечения рака или сосудистых заболеваний с помощью такого биспецифического антитела. Предпочтительно указанное биспецифическое антитело отличается тем, что соотношение величин связывающего сродства KD (антигенсвязывающий сайт, специфичный в отношении VEGF)/KD (антигенсвязывающий сайт, специфичный в отношении ANG-2) составляет 1,0-10,0, предпочтительно 1,5-8,0 (в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения - 5,0-8,0), и указанное биспецифическое антитело включает в качестве первого сайта связывания антигена, специфически связывающегося с VEGF, вариабельный домен тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO:7 и вариабельный домен легкой цепи последовательности SEQ ID NO:8, в качестве указанного второго сайта связывания антигена специфически связывающегося с ANG-2, а) или вариабельный домен тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO:52, и вариабельный домен легкой цепи последовательности SEQ ID NO:53, или б) вариабельный домен тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO:84 и вариабельный домен легкой цепи последовательности SEQ ID NO:85.

В контексте настоящего изобретения понятие «антитело» относится к связывающему белку, который включает сайты связывания антигена. Понятия «сайт связывания» или «сайт связывания антигена» в контексте настоящего изобретения означают область (области) молекулы антитела, с которыми фактически связывается лиганд. Понятие «сайт связывания антигена» относится к вариабельным доменам тяжелой цепи антитела (VH), и/или вариабельным доменам легкой цепи антитела (VL), или к паре VH/VL, и может быть производным от целых антител или фрагментов антител, например, одноцепочечного фрагмента Fv, домена VH и/или домена VL, Fab или (Fab)2. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения каждый из сайтов связывания включает вариабельный домен тяжелой цепи антитела (VH) и/или вариабельный домен легкой цепи антитела (VL), и предпочтительно сформирован парой, состоящей из вариабельного домена легкой цепи антитела (VL) и вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VH).

Сайт связывания антигена и особенно вариабельные домены тяжелой цепи (VH) и/или вариабельные домены легкой цепи (VL) антитела, которые специфически связываются с фактором роста сосудистого эндотелия (VEGF), могут быть производными от а) известных анти-VEGF антител, например, описанных Kim и др., Nature 362, 1993, сс.841-844; Warren R.S. и др., J. Clin. Invest. 95, 1995, сс.1789-1797; Borgstrom Р. и др., Cancer Res. 56, 1996, сс.4032-4039; Melnyk О. и др., Cancer Res. 56, 1996, сс.921-924, WO 94/10202, WO 98/45332, WO 2005/00900, WO 00/35956 и US 2007/0141065, или б) новых анти-VEGF антител, полученных методами иммунизации de novo, используя inter alia или белок VEGF человека, или нуклеиновую кислоту или ее фрагменты, или методом фагового дисплея.

Сайт связывания антигена и особенно вариабельные домены тяжелой цепи (VH) антитела и/или вариабельные домены легкой цепи (VL) антитела, которые специфически связываются с ангиопоэтином-2 человека (ANG-2), могут быть производными от а) от известных aHTH-ANG-2 антител, например, описанных в WO 03/030833, WO 2006/068953, WO 2006/045049 или US 6166185, или б) из новых aHTH-ANG-2 антител, полученных, например, методами иммунизации de novo, используя inter alia или белок ANG-2 человека, или нуклеиновую кислоту, или ее фрагменты, или методом фагового дисплея.

Специфичностью антитела обозначают избирательное распознавание антитела для конкретного эпитопа антигена. Природные антитела, например, являются моноспецифическими.

Понятие «биспецифичные антитела» по настоящему изобретению означает антитела, которые обладают двумя разными специфичностями связывания антигена. Если антитело имеет более одной специфичности, распознаваемые эпитопы могут быть ассоциированы с одним антигеном или более чем с одним антигеном. Антитела по настоящему изобретению являются специфичными для двух разных антигенов, т.е. VEGF в виде первого антигена и ANG-2 в виде второго антигена.

Понятие «моноспецифичное антитело» в контексте настоящего изобретения относится к антителу, которое имеет один или несколько сайтов связывания, каждый из которых связывается с одним и тем же эпитопом одного и того же антигена.

Понятие «валентность» в контексте настоящего изобретения означает наличие специфического числа сайтов связывания в молекуле антитела. По существу понятия «двухвалентный», «четырехвалентный» и «шестивалентный» означают наличие двух сайтов связывания, четырех сайтов связывания и шести сайтов связывания, соответственно, в молекуле антитела. Биспецифические антитела по настоящему изобретению являются по меньшей мере «двухвалентными» и могут быть «трехвалентными» или «поливалентными» (например, «четырехвалентными» или «шестивалентными»). Предпочтительно биспецифическое антитело по настоящему изобретению является двухвалентным, трехвалентным или четырехвалентным. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения биспецифическое антитело является двухвалентным. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанное биспецифическое антитело является трехвалентным. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело является четырехвалентным.

Антитела по настоящему изобретению имеют два или более сайтов связывания и являются биспецифическими. То есть, антитела могут быть биспецифическими даже в тех случаях, когда имеется более двух сайтов связывания (т.е. если антитело трехвалентно или поливалентно). Биспецифические антитела по настоящему изобретению включают, например, поливалентные одноцепочечные антитела, диантитела и триантитела, а также антитела, имеющие структуру константного домена антитела полной длины, с которой связаны дополнительные сайты связывания антигена (например, одноцепочечный фрагмент Fv, домен VH и/или домен VL, Fab или (Fab)2) через один или несколько пептидных линкеров. Антитела могут быть полной длины от одного вида, или химерными, или гуманизированными. У антител с более чем двумя сайтами связывания антигена некоторые сайты связывания могут быть идентичными, пока белок имеет сайты связывания для двух разных антигенов. То есть, если первый сайт связывания специфичен для VEGF, то второй сайт связывания специфичен для ANG-2, и наоборот.

Фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF/VEGF-A) (SEQ ID NO:105) описан, например, Leung D.W. и др., Science 246, 1989, сс.1306-1309; Keck P.J. и др., Science 246, 1989, сс.1309-1312, и Connolly D.T. и др., J. Biol. Chem. 264, 1989, сс.20017-20024. VEGF участвует в регуляции нормального и измененного ангиогенеза и неоваскуляризации, связанных с опухолями и внутриглазными расстройствами (Ferrara N. и др., Endocr. Rev. 18, 1997, сс.4-25; Berkman R.A. и др., J. Clin. Invest. 91, 1993, сс.153-159; Brown L.F. и др., Human Pathol. 26, 1995, сс.86-91; Brown L.F. и др., Cancer Res. 53, 1993, cc.4727-4735; Mattern J. и др., Brit. J. Cancer. 73, 1996, cc.931-934; и Dvorak H и др., Am. J. Pathol. 146, 1995, cc.1029-1039). VEGF является гомодимерным гликопептидом, выделенным из нескольких источников. VEGF проявляет высокоспецифичное митогенное действие в отношении клеток эндотелия.

Ангиопоэтин-2 человека (ANG-2) (также обозначаемый «ANGPT2» или «ANG2») (SEQ ID NO:106) описан Maisonpierre P.C. и др., Science 277, 1997, cc.55-60, и Cheung A.H. и др., Genomics 48, 1998, cc.389-391. Ангиопоэтин-1 и ангиопоэтин-2 (ANG-1 (SEQ ID NO:107) и ANG-2(SEQ ID NO:106)) описаны в качестве лигандов для Tie - семейства тирозинкиназ, которые избирательно экспрессируются сосудистым эндотелием. Yancopoulos G.D. и др., Nature 407, 2000, сс.242-248. В настоящее время известно четыре характерных представителя семейства ангиопоэтина. Ангиопоэтин-3 и ангиопоэтин-4 (Ang-3 и Ang-4) могут представлять значительно измененные аналоги того же генного локуса у мышей и людей. Kim I. и др., FEBS Let, 443, 1999, сс.353-356; Kim I. и др., J Biol Chem 274, 1999, сс.26523-26528. ANG-1 и ANG-2 первоначально были выявлены в экспериментах с культурами ткани в качестве агонистов и антагонистов, соответственно (см. по ANG-1: Davis S. и др., Cell 87, 1996, сс.1161-1169; и по ANG-2: Maisonpierre Р.С. и др., Science 277, 1997, сс.55-60). Все известные ангиопоэтины связываются главным образом с Tie-2, и оба, Ang-1 и Ang-2 связываются с Tie-2 со сродством 3 нМ (Kd). Maisonpierre Р.С. и др., Science 277, 1997, сс.55-60.

Сайты связывания антигена антител по настоящему изобретению обычно содержат шесть комплементарно детерминируемых областей (complementarity determining область - CDR), которые влияют на различную степень сродства сайта связывания с антигеном. Имеется три вариабельных домена CDR тяжелой цепи (CDRH1, CDRH2 и CDRH3) и три вариабельных домена CDR легкой цепи (CDRL1, CDRL2 и CDRL3). Протяженность CDR и каркасных участков (FR) определяют путем сравнения с базами данных аминокислотных последовательностей, в которых такие области идентифицируют по вариабельности среди последовательностей. Также включенными в рамки охвата настоящего изобретения являются функциональные сайты связывания антигена, состоящие из меньшего числа CDR (т.е. где специфичность связывания определяется тремя, четырьмя или пятью областями CDR). Например, менее чем полный комплект из 6 CDR может быть достаточным для связывания. В некоторых случаях домена VH или VL может быть достаточно.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитела по настоящему изобретению дополнительно включают константные области иммуноглобулина из одного или нескольких классов иммуноглобулинов. К классам иммуноглобулина относятся изотипы IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, а также в случае IgG и IgA их подтипы. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения антитело по настоящему изобретению имеет константную доменную структуру антитела типа IgG, но содержит четыре сайта связывания антигена. Это дополняется, например, связыванием двух полных сайтов связывания антигена (например, одноцепочечного фрагмента Fv), специфически связывающихся с EGFR или с N-, или с С-конца тяжелой или легкой цепи полного антитела, специфически связывающегося с ANG-2. В другом варианте это дополнятся, например, связыванием двух полных связывающих пептидов, специфически связывающихся с ANG-2 с одним С-концом тяжелой цепи полного антитела, специфически связывающегося с VEGF. Четыре сайта связывания антигена предпочтительно включают два сайта связывания для каждой из двух разных связывающих специфичностей.

Понятия «моноклональное антитело» или «композиция моноклонального антитела» в контексте настоящего изобретения относится к получению молекул антитела одного аминокислотного состава.

Понятие «химерное антитело» относится к антителу, включающему вариабельную область, т.е. область связывания, из одного источника или вида, и по меньшей мере часть константной области, производной от другого источника или вида, обычно полученных методами рекомбинации ДНК. Химерные антитела, включающие вариабельную область грызуна и константную область человека, являются предпочтительными. К другим предпочтительным формам «химерного антитела», охватываемым настоящим изобретением, относятся те формы, в которых константная область была модифицирована и изменена относительно исходного антитела для выработки свойств по настоящему изобретению, особенно в отношении связывания Clq и/или связывания рецептора Fc (FcR). Такие химерные антитела также называются «антителами переключения класса». Химерные антитела являются продуктом экспрессии генов иммуноглобулина, включающих сегменты ДНК, кодирующие вариабельные области иммуноглобулина, и сегменты ДНК, кодирующие константные области иммуноглобулина. Методы получения химерных антител включают традиционные методики рекомбинации ДНК и трансфекции генов, хорошо известные в данной области. См., например, Morrison S.L. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1984, cc.6851-6855; US 5202238 и US 5204244.

Понятие «гуманизированное антитело» относится к антителам, в которых каркасный участок или «комплементарно детерминирующие области (CDR)» модифицированы для включения CDR иммуноглобулина другой специфичности по сравнению с CDR иммуноглобулина отличной специфичности по сравнению с иммуноспецифичностью исходного иммуноглобулина. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения CDR мыши переносят в каркасный участок антитела человека для получения «гуманизированного антитела». См., например, Riechmann L. и др., Nature 332, 1988, сс.323-327; и Neuberger M.S. и др., Nature 314, 1985, сс.268-270. Особенно предпочтительные области CDR соответствуют областям, представляющим последовательности, которые распознают антигены, указанные выше, для химерных антител. К другим формам «гуманизированного антитела» в настоящем изобретении относятся те формы, у которых константная область дополнительно модифицирована или изменена по сравнению с исходным антителом для получения свойств по настоящему изобретению, особенно в связи со связыванием Clq и/или со связыванием с рецептором Fc (FcR).

Понятие «антитело человека» в контексте настоящего изобретения относится к антителам, имеющим вариабельные и константные области, происходящие от последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Антитела человека известны в данной области (van Dijk М.А., van de Winkel J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5, 2001, cc.368-374). Антитела людей также могут быть получены у трансгенных животных (например, мышей), которые могут при иммунизации вырабатывать полный набор или определенные антитела человека при отсутствии выработки эндогенного иммуноглобулина. Перенос генных последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека у таких мутантных мышей зародышевой линии может привести к выработке антител человека в отношении измененного антигена (см. например, Jakobovits А. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1993, cc.2551-2555; Jakobovits А. и др., Nature 362, 1993, cc.255-258; Bruggemann M. и др., Year Immunol. 7, 1993, cc.33-40). Антитела человека также могут быть получены методом библиотек фагового дисплея (Hoogenboom H.R., Winter G.J. Mol. Biol. 227, 1992, cc.381-388; Marks J.D. и др., J. Mol. Biol. 222, 1991, cc.581-597). Методы Cole и др. и Boerner и др. также применимы для получения моноклональных антител человека (Cole S.P.C. и др., Monoclonal antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, 1985, cc.77-96; Boerner P. и др., J. Immunol. 147, 1991, cc.86-95). Согласно указанному выше для химерных и гуманизированных антител по настоящему изобретению понятие «антитело человека», используемое в настоящем изобретении, также включает такие антитела, которые модифицированы в константной области для получения свойств по настоящему изобретению, особенно в связи со связыванием Clq и/или связыванием FcR, например, путем «переключения класса», т.е. изменения или мутации частей Fc (например, с IgGl на IgG4 и/или мутация IgGl/IgG4).

Понятие «рекомбинантное антитело человека» в контексте настоящего изобретения включает все антитела человека, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют методами рекомбинации, например, антитела, выделенные из клеток-хозяев, например, клеток NSO или СНО, или из животного (например, мыши), трансгенного по генам иммуноглобулина человека, или антитела, экспрессированные с применением вектора рекомбинантной экспрессии, трансфецированного в клетки-хозяева. Такие рекомбинантные антитела людей содержат вариабельные и константные области в переустроенной форме. Рекомбинантные антитела по настоящему изобретению подвергают соматической гипермутации in vivo. Таким образом, аминокислотными последовательностями областей VH и VL рекомбинантных антител являются последовательности, которые происходят от последовательностей VH и VL зародышевой линии человека или связаны с ними, и могут в норме не существовать в природе в составе зародышевой линии антитела человека in vivo.

Понятие «вариабельный домен» (вариабельный домен легкой цепи (VL), вариабельная область тяжелой цепи (VH)), используемое в настоящем изобретении, означает каждую пару легкой и тяжелой цепи, которая участвует непосредственно в связывании антитела с антигеном. Домены вариабельных легкой и тяжелой цепей человека имеют одинаковую общую структуру, и каждый домен включает четыре каркасных участка (FR), у которых последовательности в высокой степени консервативны, соединенные тремя «гипервариабельными областями» (или комплементарно детерминируемыми областями, CDR). Каркасные участки принимают конформацию β-слоя, и области CDR могут формировать петли, соединяющие структуру β-слоя. Области CDR в каждой цепи поддерживаются в трехмерной структуре за счет каркасных участков и формируют вместе с областями CDR из другой цепи сайт связывания антигена. Области CDR3 тяжелой и легкой цепей антитела играют особенно важную роль в связывающей специфичности/сродстве антител по настоящему изобретению и, следовательно, представляют другой объект по настоящему изобретению.

Понятия «гипервариабельная область» или «антигенсвязывающая часть антитела» при использовании в настоящем изобретении относятся к аминокислотным остаткам антитела, ответственным за связывание антигена. Гипервариабельная область включает аминокислотные остатки из «комплементарно детерминируемых областей (complementarity determining областьs - CDR)». К понятию «каркасные участки (Framework - FR)» относятся те области вариабельного домена, которые отличаются от остатков гипервариабельной области, согласно описанному в настоящем изобретении. Следовательно, легкие и тяжелые цепи антитела включают от N-конца к С-концу домены FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Области CDR в каждой цепи отделены такими аминокислотами каркасных участков. Особенно CDR3 тяжелой цепи представляют область, которая наибольшим образом влияет на связывание антигена. Области CDR и FR определяют по стандартному подходу Kabat и др., описанному в кн. «Sequences of Proteins of Immunological Interest)), 1991, 5-е изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Мэриленд.

Биспецифические антитела по настоящему изобретению включают, помимо прочего, такие антитела, которые имеют «модификации консервативной последовательности» (обозначаемые «вариантами» биспецифических антител). К ним относятся модификации нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, которые не влияют или не изменяют указанные выше свойства антитела по настоящему изобретению. Модификации могут быть интродуцированы стандартными методами, известными в данной области, например, сайт-направленным мутагенезом и ПЦР-опосредованным мутагенезом. К консервативным аминокислотным замещениям относятся замещения, при которых аминокислотный остаток замещен аминокислотным остатком со сходной боковой цепью. Семейства аминокислотных остатков со сходными боковыми цепями описаны в данной области. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серии, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, прогнозировавшиеся аминокислотные остатки в биспецифическом <VEGF-ANG-2> <EGFR-IGF1R> антителе могут быть предпочтительно замещены другими аминокислотными остатками из семейства той же боковой цепи. «Вариантом» биспецифического <VEGF-ANG-2> антитела в контексте настоящего изобретения называется молекула, которая отличается по аминокислотной последовательности от «исходной» аминокислотной последовательности биспецифического <VEGF-ANG-2> антитела десятью, предпочтительно примерно двумя-пятью, добавлениями, делециями и/или замещениями в одной или нескольких вариабельных областях или константных областях исходного антитела. Аминокислотные замещения могут быть получены мутагенезом, основанным на молекулярном моделировании, описанном Riechmann L. и др., Nature 332, 1988, сс.323-327, и Queen С.и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1989, cc.10029-10033. К «варианту» биспецифического антитела <VEGF-ANG-2> по настоящему изобретению также относятся биспецифические антитела такого формата, в котором линкер (если он имеется) модифицирован или замещен другим линкером.

В контексте настоящего изобретения понятия «связывание» и «специфическое связывание» относится к связыванию антитела с эпитопом антигена (или VEGF человека, или ANG-2 человека) в анализе in vitro, предпочтительно методом плазмонного резонанса на установке BIAcore (фирма GE Healthcare, Упсала, Швеция) (пример 2), с очищенным антигеном дикого типа. Сродство при связывании выражают в терминах kа (константа скорости реакции для ассоциации антитела из комплекса антитело/антиген), k_D (константа диссоциации) и K_D (k_D/ka). Связывание или специфическое связывание означает связывающее сродство (К_D), составляющее 10^-8 молей/л или менее, предпочтительно от 10^-9 М до 10^-13 молей/л.

Связывание антитела с FcγRIII может быть исследовано методом BIAcore (фирма Pharmacia Biosensor АВ, Упсала, Швеция). Сродство при связывании выражают в терминах kа (константа скорости ассоциации антитела из комплекса антитело/антиген), k_D(константа диссоциации) и К_D (k_D/ka).

В контексте настоящего изобретения понятие «не связывающееся с ANG-1» или «не связывающееся специфически с ANG-1» означает, что антитело имеет величину ЕС₅₀ примерно 8000 нг/мл в анализе связывания ANG-1 методом ELISA in vitro (по примеру 9).

Понятие «эпитоп» относится к какому-либо полипептидному детерминанту, способному специфически связываться с антителом. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения детерминант эпитопа включает химически активные группы молекул, например, аминокислоты, боковые цепочки сахаров, фосфорил или сульфонил и, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, могут иметь специфические трехмерные структурные свойства и/или специфические характеристики заряда. Эпитоп является областью антигена, которая связывается антителом.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело рассматривают в качестве специфически связывающегося с антигеном, если оно преимущественно распознает антиген-мишень в сложной смеси белков и/или макромолекул.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения биспецифическое антитело включает исходное антитело полной длины в качестве основы.

Понятие «антитело полной длины» означает антитело, состоящее из двух «тяжелых цепей антитела полной длины» и двух «легких цепей антитела полной длины». Понятие «тяжелой цепи антитела полной длины» относится к полипептиду, состоящему в направлении от N-конца к С-концу из вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VH), константного домена 1 тяжелой цепи антитела (СН1), шарнирной области антитела (HR), константного домена 2 тяжелой цепи антитела (СН2) и константного домена 3 тяжелой цепи антитела (СН3), кратко обозначаемому VH-CH1-HR-CH2-CH3; и необязательно константному домену 4 тяжелой цепи антитела (СН4) в случае антитела подкласса IgE. Предпочтительно «тяжелой цепью антитела полной длины» является полипептид, состоящий в направлении от N-конца к С-концу из VH, CHI, HR, СН2 и СН3. Понятие «легкой цепи антитела полной длины» относится к полипептиду, состоящему в направлении от N-конца к С-концу из вариабельного домена легкой цепи антитела (VL) и константного домена легкой цепи антитела (CL), кратко обозначаемому VL-CL. Константный домен легкой цепи антитела (CL) может быть κ (каппа) или λ (лямбда). Две цепи антитела полной длины связаны вместе через внутриполипептидные дисульфидные связи между доменом CL и доменом СН1 и между шарнирными областями тяжелых цепей антитела полной длины. Примерами типичного антитела полной длины являются природные антитела типа IgG (например, IgG1 и IgG2), IgM, IgA, IgD и IgE. Антитела полной длины по настоящему изобретению могут происходить от одного вида, например, от человека, или они могут быть химерными или гуманизированными антителами. Антитела полной длины по настоящему изобретению включают два сайта связывания антигена, каждый из которых сформирован парой VH и VL, причем оба специфически связываются с одним и тем же антигеном. Таким образом, моноспецифическое двухвалентное (= полной длины) антитело, включающее первый сайт связывания антигена и состоящее из двух легких цепей антитела и двух тяжелых цепей антитела, является антителом полной длины. С-конец тяжелой и легкой цепи указанного антитела полной длины означает последнюю аминокислоту с С-конца указанной тяжелой или легкой цепи. N-конец тяжелой цепи или легкой цепи указанного антитела полной длины означает последнюю аминокислоту с N-конца указанной тяжелой или легкой цепи.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения структуры биспецифических антител, а именно применительно к биспецифическим антителам, специфически связывающимся с фактором роста сосудистого эндотелия человека (human vascular endothelial growth factor - VEGF) и с ангиопоэтином-2 человека (angiopoietin-2 - ANG-2) по настоящему изобретению, являются двухвалентными антителами с двумя разными специфичностями, например, а) описанными в WO 2009/080251, WO 2009/080252 или WO 2009/080253 (антитела с замененными доменами - см. пример 13) или б) основанными на scFab-Fc гибридном антителе, в котором один одноцепочечный фрагмент Fab (в итоге стабилизированный дисульфидной связью) является специфичным в отношении VEGF, и другой одноцепочечный фрагмент Fab (в итоге стабилизированный дисульфидной связью) является специфичным в отношении ANG-2 (см. пример 14) или в) описанными Ridgway J.B., Protein Eng. 9, 1996, сс.617-621; WO 96/027011; Merchant A.M. и др., Nature Biotech 16, 1998, cc.677-681; Atwell S. и др., J. Mol. Biol. 270, 1997, cc.26-35 и ЕР 1870459A1.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанное биспецифическое антитело по настоящему изобретению отличается включением аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:121, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:123 и SEQ ID NO:124 или их вариантов.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения биспецифическое антитело по настоящему изобретению отличается включением аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:125, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:127 и SEQ ID NO:128 или их вариантов.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения биспецифическое антитело по настоящему изобретению отличается включением аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:129, SEQ ID NO:130, SEQ ID NO:131 и SEQ ID NO:132 или их вариантов.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения биспецифическое антитело по настоящему изобретению отличается включением аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:133, и SEQ ID NO:134 или их вариантов.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения биспецифическое антитело по настоящему изобретению отличается включением аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:135, и SEQ ID NO:136 или их вариантов.

Эти аминокислотные последовательности основаны на вариабельных доменах тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO:7 и вариабельных доменах легкой цепи последовательности SEQ ID NO:8 (производной от бевацизумаба (авастина)) в качестве первого сайта связывания антигена с VEGF, и на вариабельных доменах тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO:52 и на вариабельных доменах легкой цепи последовательности SEQ ID NO:53 (производной от Ang2i_LC06)) в качестве второго сайта связывания антигена с ANG-2.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанное биспецифическое антитело является трехвалентным, использующим, например, форматы, основанные на антителе полной длины, специфически связывающемся с одним из двух антигенов VEGF или ANG-2, с которыми только с одного С-конца тяжелой цепи гибридизирован фрагмент scFab, который специфически связывается с другим из двух антигенов, VEGF или ANG-2, включая методику «выступ-во-впадину», согласно описанному, например, в патентной заявке ЕР Appl. No 09004909.9 (см. пример 11), или, например, форматы, основанные на антителе полной длины, специфически связывающиеся с одним из двух антигенов, VEGF или ANG-2, с которым только с одного С-конца тяжелой цепи VH или VH-CH1 фрагмента и гибридизированы с другого С-конца второй тяжелой цепи VL или VL-CL фрагмента, который специфически связывается с другим из двух антигенов, VEGF или ANG-2, включая методику «выступ-во-впадину», согласно описанию, например, в ЕР Appl. No 09005108.7 (см. пример 12).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения биспецифическое антитело по настоящему изобретению отличается включением аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:116, и SEQ ID NO:117 или их вариантов.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения биспецифическое антитело по настоящему изобретению отличается включением аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:119, и SEQ ID NO:120 или их вариантов.

Эти аминокислотные последовательности основаны на последовательности SEQ ID NO:7 вариабельных доменов тяжелой цепи и последовательности SEQ ID NO:8 вариабельных доменов легкой цепи (производных от бевацизумаба (авастина)) в качестве первого сайта связывания антигена, связывающегося с VEGF, и на последовательности SEQ ID NO:52 вариабельных доменов тяжелой цепи, и на последовательности SEQ ID NO:53 вариабельных доменов легкой цепи (производных от Ang2i_LC06)) в качестве второго сайта связывания антигена, связывающегося с ANG-2.

Предпочтительными форматами биспецифического антитела для биспецифического антитела, специфически связывающимися с фактором роста сосудистого эндотелия (VEGF) и с ангиопоэтином-2 человека (ANG-2) по настоящему изобретению, являются четырехвалентные антитела (TvAb) с двумя разными специфичностями согласно описанию, например, в WO 2007/024715, WO 2007/109254 или ЕР Appl. No 09004909.9. Так в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанное биспецифическое антитело является четырехвалентным, в котором использованы форматы согласно описанию, например, в WO 2007/024715, WO 2007/109254 или ЕР Appl. No 09004909.9 (см. примеры 1 или 10).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения биспецифическое четырехвалентное антитело TyAb-2441-бевацизумаб-LC06 отличается включением пептида последовательности SEQ ID NO:102 и легкой цепи последовательности SEQ ID NO:62 или их вариантов.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения биспецифическое антитело по настоящему изобретению отличается включением аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:109, и SEQ ID NO:110 или их вариантов.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения биспецифическое антитело по настоящему изобретению отличается включением аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:111 и SEQ ID NO:112 или их вариантов.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения биспецифическое антитело по настоящему изобретению отличается включением аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:113 и SEQ ID NO:114 или их вариантов.

Эти аминокислотные последовательности основаны на вариабельных доменах тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO:7 и вариабельных доменах легкой цепи последовательности SEQ ID NO:8 (производных от бевацизумаба (авастина)) в качестве первого сайта связывания антигена, связывающегося с VEGF, и на вариабельных доменах тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO:52 и на вариабельных доменах легкой цепи последовательности SEQ ID NO:53 (производных от Ang2i_LC06)) в качестве второго сайта связывания антигена, связывающегося с ANG-2.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения биспецифическое четырехвалентное антитело TyAb-2441-бевацизумаб-LС08 отличается включением пептида последовательности SEQ ID NO:103 и легкой цепи последовательности SEQ ID NO:62 или их вариантов.

Каждый сайт связывания антитела по настоящему изобретению может быть сформирован парой двух вариабельных доменов, т.е. одним вариабельным доменом тяжелой цепи и одним вариабельным доменом легкой цепи.

Минимальной детерминантой сайта связывания в антителе является область CDR3 тяжелой цепи.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения биспецифическое антитело по настоящему изобретению является четырехвалентным. В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанное четырехвалентное биспецифическое антитело отличается следующими признаками:

оно состоит из:

а) моноспецифического двухвалентного исходного антитела, состоящего из двух тяжелых цепей антитела полной длины и двух легких цепей антитела полной длины, в соответствии с чем каждая цепь включает только один вариабельный домен,

б) двух пептидных линкеров,

в) двух моноспецифических одновалентных одноцепочечных антител, каждое из которых состоит из вариабельного домена тяжелой цепи антитела, вариабельного домена легкой цепи антитела и одноцепочечного линкера между вариабельным доменом тяжелой цепи указанного антитела и вариабельным доменом легкой цепи указанного антитела;

и предпочтительно указанные одноцепочечные антитела связаны с одним и тем же концом (С- и N-концом) тяжелых цепей моноспецифического двухвалентного антитела, или, в другом варианте, с тем же концом (предпочтительно с С-концом) легких цепей моноспецифического двухвалентного антитела, и более предпочтительно с одним и тем же концом (С- и N-концом) тяжелых цепей моноспецифического двухвалентного антитела.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанное биспецифическое антитело является четырехвалентным и состоит из

а) антитела полной длины, включающего указанный сайт связывания антигена и состоящего из двух тяжелых цепей антитела и двух легких цепей антитела; и

б) двух идентичных одноцепочечных фрагментов Fab, включающих указанный второй сайт связывания антигена,

причем указанные одноцепочечные фрагменты Fab по пункту б) гибридизированы с указанным антителом полной длины по пункту а) через пептидный коннектор с С- или N-конца тяжелой или легкой цепи указанного антитела полной длины.

а) антитела полной длины, включающего указанный второй сайт связывания антигена и состоящего из двух тяжелых цепей антитела и двух легких цепей антитела; и

б) двух идентичных одноцепочечных фрагментов Fab, включающих указанный первый сайт связывания антигена,

Предпочтительно указанные одноцепочечные фрагменты Fab по пункту б) гибридизированы с указанным антителом полной длины по пункту а) через пептидный коннектор с С-конца тяжелой цепи или легкой цепи указанного антитела полной длины.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения два идентичных одноцепочечных фрагмента Fab, связывающихся со вторым антигеном, гибридизированы с указанным антителом полной длины через пептидный коннектор по С-концу каждой, тяжелой или легкой, цепи указанного антитела полной длины.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения два идентичных одноцепочечных фрагмента Fab, связывающихся со вторым антигеном, гибридизированы с указанным антителом полной длины через пептидный коннектор по С-концу каждой тяжелой цепи указанного антитела полной длины.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения два идентичных одноцепочечных фрагмента Fab, связывающихся со вторым антигеном, гибридизированы с указанным антителом полной длины через пептидный коннектор по С-концу каждой легкой цепи указанного антитела полной длины.

Такие варианты осуществления настоящего изобретения, включающие одноцепочечные фрагменты Fab, более подробно описаны, например, в патентной заявке ЕР Appl. No 09004909.9, включенной в настоящее изобретение в виде ссылки.

Понятие «пептидный линкер», используемый в настоящем изобретении, означает пептид с аминокислотными последовательностями, который предпочтительно является синтетическим. Эти пептидные линкеры по настоящему изобретению используют для связывания разных антигенсвязывающих сайтов и/или фрагментов антитела, в результате включающих разные антигенсвязывающие сайты (например, одноцепочечный фрагмент Fv, антитело полной длины, домен VH и/или домен VL, Fab, (Fab)2, часть Fc) вместе для формирования биспецифического антитела по настоящему изобретению. Пептиды-линкеры могут включать одну или несколько из следующих аминокислотных последовательностей, перечисленных в табл.1, а также другие случайным образом выбранные аминокислоты. Указанными пептидами-линкерами являются пептиды с аминокислотной последовательностью по меньшей мере из 5 аминокислот в длину, предпочтительно по меньшей мере из 10 аминокислот в длину, более предпочтительно из 10-50 аминокислот в длину. Предпочтительно указанные пептиды-линкеры по пункту б) являются пептидами с аминокислотной последовательностью, состоящей по меньшей мере из 10 аминокислот. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанным пептидом-линкером является (GxS)n с G = глицином, S = серином (х=3 и n=3, 4, 5 или 6) или (х=4 и n=2, 3, 4 или 5), предпочтительно х=4 и n=2 или 3, более предпочтительно с х=4, n=2 ((G₄S)₂). К указанному пептиду-линкеру (GxS)n могут быть добавлены также дополнительные G = глицины, например, GG или GGG.

Понятие «одноцепочечный линкер» в контексте настоящего изобретения означает пептид с аминокислотными последовательностями, который предпочтительно является синтетическим. Такие одноцепочечные линкеры по настоящему изобретению используют для связывания доменов VH и VL для формирования одноцепочечного фрагмента Fv. Предпочтительно указанный одноцепочечный линкер по пункту в) является пептидом с аминокислотной последовательностью длиной по меньшей мере 15 аминокислот, более предпочтительно длиной по меньшей мере 20 аминокислот. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанным одноцепочечным линкером является (GxS)n с G =глицином, S = серином (х=3 и n=4, 5 или 6) или (х=4 и n=3, 4 или 5), предпочтительно с х=4, n=4 или 5, более предпочтительно с х=4, n=4.

Кроме того, указанные одноцепочечные (одноцепочечный Fv) антитела предпочтительно стабилизированы дисульфидом. Такая дополнительная стабилизация одноцепочечного антитела достигается внедрением дисульфидной связи между вариабельными доменами одноцепочечных антител и описана, например, в WO 94/029350, Rajagopal V. и др., Prot. Engin. 10(12), 1997, сс.1453-1459; Kobayashi Н. и др., Nuclear Medicine & Biology 25, 1998, сс.387-393; или Schmidt М. и др., Oncogene 18, 1999, сс.1711-1721.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрены стабилизированные дисульфидной связью одноцепочечные (одноцепочечные Fv) антитела, причем дисульфидная связь между вариабельными доменами одноцепочечного антитела, включенная в антитело по настоящему изобретению, независимо для каждого одноцепочечного антитела выбрана из:

i) положения 44 вариабельного домена тяжелой цепи по отношению к вариабельному домену легкой цепи в положении 100,

ii) положения 105 вариабельного домена тяжелой цепи по отношению к вариабельному домену легкой цепи в положении 43, или

iii) положения 101 вариабельного домена тяжелой цепи по отношению к вариабельному домену легкой цепи в положении 100.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения дисульфидная связь между вариабельными доменами одноцепочечных антител, включенных в антитело по настоящему изобретению, находится между вариабельным доменом тяжелой цепи в положении 44 и вариабельным доменом легкой цепи в положении 100.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения дисульфидная связь между вариабельными доменами одноцепочечных антител, включенных в антитело по настоящему изобретению, находится между вариабельным доменом тяжелой цепи в положении 105 и вариабельным доменом легкой цепи в положении 43.

Структура такого четырехвалентного варианта биспецифического антитела по настоящему изобретению, специфически связывающегося с VEGF и ANG-2, в котором одним из антигенов А или Б является VEGF, а другим антигеном является ANG-2. Структура, основанная на антителе полной длины, специфически связывающаяся с антигеном А, с которым два (необязательно стабилизированных дисульфидной связью) одноцепочечных фрагмента Fv, специфически связывающихся с антигеном Б, связаны через пептидный линкер; структура приведена в качестве примера на схемах на фиг.1 и 2.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанные одноцепочечные (одноцепочечные Fv) антитела без указанной необязательной дисульфидной стабилизации между вариабельными доменами VH и VL одноцепочечного антитела (одноцепочечного Fv) являются предпочтительными.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанное четырехвалентное биспецифическое антитело отличается тем, что указанное моноспецифическое двухвалентное антитело по пункту а) специфически связывается с VEGF и указанные два одновалентных моноспецифических одноцепочечных антитела по пункту в) связываются с ANG-2.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанное четырехвалентное биспецифическое антитело отличается тем, что указанное моноспецифическое двухвалентное антитело по пункту а) специфически связывается с ANG-2 и указанные два одновалентных моноспецифических одноцепочечных антитела по пункту в) связываются с VEGF.

Понятие «одноцепочечный фрагмент Fab» (см. фиг.11) означает полипептид, состоящий из вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VH), константного домена 1 антитела (СН1), вариабельного домена легкой цепи антитела (VL), константного домена легкой цепи антитела (CL) и линкера, причем указанные доменные антитела и указанный линкер собраны в одном из следующих порядков в направлении от N-конца к С-концу: а) VH-CHl-линкер-VL-CL, б) VL-линкер-VH-CHl, в) VH-C1-линкер-VL-CHl или г) VL-CH1-линкер-VH-CL; и в котором указанный линкер является полипептидом, состоящим по меньшей мере из 30 аминокислот, предпочтительно из 30-50 аминокислот. Указанные одноцепочечные фрагменты Fab а) VH-CHl-линкер-VL-CL, б) VL-CL-линкер-VH-СН1, в) VH-CL-линкер-VL-CHl и г) VL-CH1-линкер-VH-CL стабилизированы через природную дисульфидную связь между доменом CL и доменом СН1. Понятие «N-конец» означает последнюю аминокислоту с N-конца. Понятие «С-конец» означает последнюю аминокислоту с С-конца.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанные домены антитела и указанный линкер в указанном одноцепочечном фрагменте Fab имеют одну из следующих организаций в направлении от N-конца к С-концу:

a) VH-CH1-линкер-VL-CL, или б) VL-CL-линкер-VH-СН1, более предпочтительно VL-C1-линкер-VH-CH1.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанные домены антитела и указанный линкер в указанном одноцепочечном фрагменте Fab имеют одну из следующих организаций в направлении от N-конца к С-концу:

а) VH-CL-линкер-VL-СН1 или б) VL-CH1-линкер-VH-CL.

Понятие «пептидный коннектор» в контексте настоящего изобретения означает пептид с аминокислотными последовательностями, которые предпочтительно являются синтетическими. Такие пептидные коннекторы по настоящему изобретению используют для гибридизации одноцепочечных фрагментов Fab с С- или N-конца антитела полной длины для формирования полиспецифического антитела по настоящему изобретению. Предпочтительно указанные пептидные коннекторы по пункту б) являются пептидами с аминокислотной последовательностью, составляющей в длину по меньшей мере 5 аминокислот, предпочтительно 5-100, более предпочтительно 10-50 аминокислот. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанным пептидом коннектором является (GxS)n или (GxS)nGm с G = глицином, S = серином, (х=3 и n=3, 4, 5 и m=0, 1, 2 или 3) или (х=4 и n=2, 3, 4 или 5 и m=0, 1, 2 или 3), предпочтительно х=4 и n=2 или 3, более предпочтительно с х=4, n=2. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанным пептидным коннектором является (G₄S)₂.

Понятие «линкер» в контексте настоящего изобретения означает пептид, предпочтительно синтезированный. Пептиды по настоящему изобретению используют для связывания a) VH-CH1 с VL-CL, б) VL-CL с VH-CH1, в) VH-CL с VL-CH1 или г) VL-CH1 с VH-CL для формирования следующих одноцепочечных фрагментов Fab по настоящему изобретению a) VH-CH1-линкер-VL-CL, б) VL-CL-линкер-VH-СН1, в) VH-CL-линкер-VL-СН1 или г) VL-СН1-линкер-VH-CL. Указанный линкер в составе одноцепочечных фрагментов Fab является пептидом с аминокислотной последовательностью длиной по меньшей мере 30 аминокислот, предпочтительно длиной 32-50 аминокислот. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанным линкером является (GxS)n с G = глицином, S = серином, (х=3 и n=8, 9 или 10 и m=0, 1, 2 или 3) или (х=4 и n=6,1 или 8 и m=0, 1, 2 или 3), предпочтительно с х=4, п=6 или 7 и m=0, 1,2 или 3, более предпочтительно с х=4, n=7 и m=2. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанным линкером является (G₄S)₆G₂.

Необязательно в указанном одноцепочечном фрагменте Fab помимо природной дисульфидной связи между CL-доменом и доменом СН1 вариабельный домен тяжелой цепи антитела (VH) и вариабельный домен легкой цепи антитела (VL) стабилизированы дисульфидной связью путем внедрения дисульфидной связи между следующими положениями:

i) положением 44 в вариабельном домене тяжелой цепи и положением 100 в вариабельном домене легкой цепи,

ii) положением 105 в вариабельном домене тяжелой цепи и положением 43 в вариабельном домене легкой цепи, или

iii) положением 101 в вариабельном домене тяжелой цепи и положением 100 в вариабельном домене легкой цепи (нумерация всегда приводится по индексу EU по Kabat).

Такая дополнительная стабилизация дисульфидной связью одноцепочечных фрагментов Fab достигается внедрением дисульфидной связи между вариабельными доменами VH и VL одноцепочечных фрагментов Fab. Методы внедрения неприродных дисульфидных мостиков для стабилизации одноцепочечного фрагмента Fv описаны, например, в WO 94/029350, Rajagopal V. и др., Prot. Engin. 1997, сс.1453-1459, Kobayashi Н. и др, Nuclear Medicine & Biology, 25, 1998, cc.387-393, или Schmidt M. и др., Oncogene 18, 1999, cc.1711-1721. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения оптимальная дисульфидная связь между вариабельными доменами одноцепочечных фрагментов Fab, включенная в антитело по настоящему изобретению, находится между положением 44 в вариабельном домене тяжелой цепи и положением 100 в вариабельном домене легкой цепи. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения оптимальная дисульфидная связь между вариабельными доменами одноцепочечных фрагментов Fab, включенных в антитело по настоящему изобретению, находится между положением 105 в вариабельном домене тяжелой цепи и положением 43 в вариабельном домене легкой цепи (нумерация всегда приводится по индексу EU по Kabat).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения одноцепочечный фрагмент Fab без указанной оптимальной стабилизации дисульфидной связью между вариабельными доменами VH и VL одноцепочечных фрагментов Fab является предпочтительным.

Предпочтительно указанный второй вариант осуществления четырехвалентного биспецифического антитела по настоящему изобретению включает два идентичных одноцепочечных фрагмента Fab (предпочтительно VL-CL-линкер-VH-СН1), которые оба гибридизированы с двумя С-концами двух тяжелых цепей или с двумя С-концами двух легких цепей указанного антитела полной длины по пункту а). Такая гибридизация приводит к двум идентичным гибридным пептидам (или i) тяжелой цепи и одноцепочечного фрагмента Fab или ii) легкой цепи и одноцепочечного фрагмента Fab), которые совместно экспрессируются либо с i) легкой цепью или тяжелой цепью антитела полной длины для получения биспецифического антитела по настоящему изобретению.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанное биспецифическое антитело отличается тем, что константная область происходит от человека.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанное биспецифическое антитело отличается тем, что константная область биспецифического антитела по настоящему изобретению представляет подкласс IgG1 человека или подкласс IgG1 человека с мутациями L234A и L235A.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанное биспецифическое антитело отличается тем, что константная область биспецифического антитела по настоящему изобретению представляет подкласс IgG2 человека.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанное биспецифическое антитело отличается тем, что константная область биспецифического антитела по настоящему изобретению представляет подкласс IgG3 человека.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанное биспецифическое антитело отличается тем, что константная область биспецифического антитела по настоящему изобретению представляет подкласс IgG4 человека, или подкласс IgG4 с дополнительной мутацией S228P.

В настоящее время установлено, что биспецифические антитела против VEGF человека и ANG-2 человека по настоящему изобретению обладают улучшенными свойствами, например, биологическим или фармакологическим действием, фармакокинетическими свойствами или токсичностью. Они показывают повышенное in vivo действие по подавлению роста опухолей и/или по подавлению ангиогенеза опухолей по сравнению с моноспецифическими исходными антителами против VEGF и ANG-2 (см. примеры 16, 17 и 18: сравнение разных биспецифических антител <VEGF-ANG-2> бевацизумаба-ANG2i-LC06 с моноспецифическими антителами - только с авастином (бевацизумабом), только с ANG2i-LC06, или с обоими в комбинации).

Кроме того, слабое проявление побочных токсических эффектов (которое выражается в улучшенной массе тела испытуемых животных, а также меньшая гибель испытуемых животных при применении in vivo) по сравнению с применением двух соответствующих отдельных моноспецифических антител против VEGF и ANG-2 в комбинации также проявляет преимущество биспецифических антител по настоящему изобретению.

Кроме того, биспецифические антитела по настоящему изобретению могут предоставить преимущества, например, пониженную дозу и/или частоту введения и одновременно меньшую стоимость.

Понятие «константная область», используемое в настоящем изобретении, означает сумму доменов антитела, отличных от вариабельной области.

Константная область непосредственно не участвует в связывании антигена, но проявляет разные эффекторные функции. В зависимости от аминокислотной последовательности константной области их тяжелых цепей антитела делят на классы: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть дополнительно поделены на подклассы, например, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, IgA1 и IgA2. Константные области тяжелой цепи, соответствующие разным классам антител, называются α, δ, ε, γ и µ, соответственно. Константные области легкой цепи, обнаруженные во всех пяти классах антител, называются κ (каппа) и λ (лямбда).

Понятие «константная область, происходящая от человека», используемое в настоящем изобретении, означает константную область тяжелой цепи антитела человека из подклассов IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 и/или константную область каппа или лямбда легкой цепи. Такие константные области известны в данной области и, например, описаны Kabat Е.А. (см. например Johnson G. и Wu Т.Т., Nucleic Acids Res. 28, 2000, cc.214-218; Kabat Е.А. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 1975, cc.2785-2788).

Хотя антитела подкласса IgG4 показывают пониженное связывание с рецептором Fc (FcγRIIIα), антитела других подклассов IgG проявляют прочное связывание. Однако Pro238, Asp265, Asp270, Asn297 (утрата углевода Fc), Рrо329, Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 и His435 являются остатками, которые в случае изменения также обеспечивают пониженное связывание с рецептором Fc (Shields R. L. и др., J. Biol. Chem. 276, 2001, cc.6591-6604; Lund J. и др., FASEB J. 9, 1995, cc.115-119; Morgan А. и др., Immunology 86, 1995, cc.319-324; EP 0307434).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело по настоящему изобретению обладает пониженным связыванием с FcR по сравнению с антителом IgG1 и моноспецифическим двухвалентным (полной длины) исходным антителом в отношении FcR связывания подкласса IgG4, или подкласса IgGl или IgG2 с мутацией в S228, L234, L235 и/или D265, и/или содержит мутацию PVA236. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения мутациями в моноспецифическом двухвалентном (полной длины) исходном антителе являются в IgG4 S228P и в IgGl L234A и L235A. Константные области тяжелой цепи показаны в последовательностях SEQ ID NO:35 и 36. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения константная область тяжелой цепи моноспецифического двухвалентного (полной длины) исходного антитела является последовательность SEQ ID NO:35 с мутациями L234A и L235A. В другом варианте осуществления настоящего изобретения константная область тяжелой цепи моноспецифического двухвалентного (полной длины) исходного антитела является последовательность SEQ ID NO:36 с мутацией S228P. В другом варианте осуществления настоящего изобретения константная область легкой цепи моноспецифического двухвалентного (полной длины) исходного антитела является областью каппа легкой цепи последовательности SEQ ID NO:37 или областью лямбда легкой цепи последовательности SEQ ID NO:34. Предпочтительно константная область тяжелой цепи моноспецифического двухвалентного (полной длины) исходного антитела является последовательностью SEQ ID NO:35 или SEQ ID NO:36 с мутацией S228P.

Константная область антитела непосредственно участвует в ADCC (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity - антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности) и CDC (complement-dependent cytotoxicity - комплемент-зависимой цитотоксичности). Активация комплемента (CDC) инициируется связыванием фактора Clq комплемента с константной областью антител большинства подклассов IgG. Связывание Clq с антителом вызывается определенными межбелковыми взаимодействиями по так называемому сайту связывания. Такие сайты связывания константной области известны в данной области и описаны, например, Lukas T.J. и др., J. Immunol. 127, 1981, сс.2555-2560; Brunhouse R. и Cebra J.J., Mol. Immunol. 16, 1979, сс.907-917; Burton D.R. и др., Nature 288, 1980, сс.338-344; Thommesen J.E. и др., Mol. Immunol. 37, 2000, cc.995-1004; Idusogie E.E. и др., J. Immunol. 164, 2000, cc.4178-4184; Hezareh M. и др., J. Virol. 75, 2001, cc.12161-12168; Morgan А. и др., Immunology 86, 1995, cc.319-324; и ЕР 0 307 434. Такие сайты связывания константной области, например, отличаются аминокислотами L234, L235, D270, N297, Е318, К320, К322, Р331 и Р329 (нумерация всегда приводится по индексу EU по Kabat).

Понятие «антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity - ADCC)» относится к лизису клеток-мишеней человека антителом по настоящему изобретению в присутствии эффекторных клеток. ADCC измеряют предпочтительно путем обработки препарата CCR5 экспрессирующих клеток с антителом по настоящему изобретению в присутствии эффекторных клеток, например, свежевыделенных МКПК или очищенных эффекторных клеток из лейкоцитных пленок, например, моноцитов или природных клеток-киллеров (natural killer - NK) или линий постоянно растущих NK.

Понятие «комплемент-зависимая цитотоксичность - complement-dependent cytotoxicity (CDC)» означает процесс, инициированный связыванием фактора Clq комплемента с частью Fc большинства подклассов IgG антител. Связывание Clq с антителом вызвано определенными межбелковыми взаимодействиями по так называемому сайту связывания. Такие сайты связывания части Fc известны в данной области (см. выше). Такие сайты связывания части Fc отличаются, например, аминокислотами L234, L235, D270, N297, Е318, К320, К322, Р331 и Р329 (нумерация приводится по индексу EU по Kabat). Антитела подклассов IgG1, IgG2 и IgG3 обычно проявляют активацию комплемента, включая связывание C1q и С3, a IgG4 не активирует систему комплемента и не связывается с C1q и/или С3.

Антитело по настоящему изобретению получают методами рекомбинации. Одним из объектов настоящего изобретения является нуклеиновая кислота, кодирующая антитело по настоящему изобретению, а другим объектом - клетки, включающие указанную нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело по настоящему изобретению. Получение антител методами рекомбинации известно в данной области и включает экспрессию белка в прокариотических и эукариотических клетках с последующим выделением антитела и обычно очисткой до фармацевтически приемлемой чистоты. Для экспрессии антител, указанной выше в клетках-хозяевах, нуклеиновые кислоты, кодирующие соответствующим образом модифицированные легкие и тяжелые цепи, инсертированы в векторы экспрессии стандартными методами. Экспрессию проводят в соответствующих прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах, например, клетках СНО, клетках NS0, клетках SP2/0, клетках НЕК293, клетках COS, клетках PER.C6, в клетках дрожжей или E.coli, и антитело выделяют из клеток (супернатанта или клеток после лизиса). Основные методы рекомбинантного получения антител известны в данной области и описаны, например, в обзорных статьях Makrides S.C., Protein Expr. Purif. 17, 1999, cc.183-202; Geisse S. и др., Protein Expr. Purif. 8, 1996, cc.271-282; Kaufman R.J., Mol. Biotechnol. 16, 2000, cc.151-160; Werner R.G., Drug Res. 48, 1998, cc.870-880.

Биспецифические антитела соответствующим образом отделяют от культуральной среды с помощью обычных методов очистки иммуноглобулина, например, хроматографией на белке А-сефарозе, гидроксилапатите, гель-электрофорезом, диализом или аффинной фроматографией. ДНК и РНК, кодирующие моноклональные антитела, легко выделить и секвенировать с помощью обычных методов. Гибридомные клетки могут служить источником таких ДНК и РНК. После выделения ДНК может быть инсертирована в векторы экспрессии, которые затем трансфецируют в клетки-хозяева, например, клетки НЕК293, клетки СНО или клетки миеломы, которые в других обстоятельствах не вырабатывают белок иммуноглобулин, для синтеза рекомбинантных моноклональных антител в клетках-хозяевах.

Варианты (или мутанты) аминокислотных последовательностей биспецифического антитела получают путем интродукции соответствующих нуклеотидных изменений в ДНК антитела или путем нуклеотидного синтеза. Такие модификации могут быть выполнены, однако в крайне ограниченном диапазоне, например, описанном выше. Например, модификации не изменяют указанные выше свойства антитела, например, изотип IgG и связывание антигена, но могут улучшить выход рекомбинантного продукта, стабильность белка или способствовать очистке.

Понятие «клетка-хозяин» в контексте настоящего изобретения означает какой-либо тип клеточной системы, который может быть сконструирован для выработки антител по настоящему изобретению. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения в качестве клеток-хозяев используют клетки НЕК293 и клетки СНО. В контексте настоящего изобретения понятия «клетки» и «линия клеток» используют взаимозаменяемо, а также включают последующие генерации этих клеток. Таким образом, понятия «трансформанты» и «трансформированные клетки» включают первичные клетки субъекта и культуры, производные от них независимо от числа пересевов. Также следует учитывать, что все последующие генерации клеток могут быть полностью неидентичными по ДНК из-за тщательно спланированных или случайных мутаций. К этим понятиям также относятся варианты клеток следующей генерации, которые имеют то же биологическое действие или функцию, выявляемые при скрининге первоначально трансформированных клеток.

Экспрессию в клетках NS0 описывают, например, Barnes L.M. и др., Cytotechnology 32, 2000, сс.109-123; Barnes L.M. и др., Biotech. Bioeng. 73, 2001, сс.261-270. Кратковременную экспрессию описывают, например, Durocher Y. и др., Nucl. Acids. Res. 30 Е9, 2002. Клонирование вариабельных доменов описано Orlandi R. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1989, cc.3833-3837; Carter P. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1992, cc.4285-4289; Norderhaug L. и др., J. Immunol. Methods 204, 1997, cc.77-87. Предпочтительная система кратковременной экспрессии (НЕК 293) описана Schlaeger E.-J. и Christensen К., Cytotechnology 30, 1999, сс.71-83, и Schlaeger E.-J., J. Immunol. Methods 194, 1996, cc.191-199.

Контрольные последовательности, применимые для прокариот, например, включают промотор, необязательно последовательности оператора и сайта связывания рибосомы. Известно, что эукариотические клетки используют промоторы, энхансеры и сигналы полиаденилирования.

Нуклеиновая кислота является «оперативно связанной», если она установлена в функциональной связи с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, ДНК предпоследовательности или секреторного лидера оперативно связана с ДНК полипептида, если она экспрессируется в качестве белка-предшественника, который участвует в секреции полипептида; промотор или энхансер оперативно связаны с кодирующей последовательностью, если она влияет на транскрипцию последовательности; или сайт связывания рибосомы является оперативно связанным с кодирующей последовательностью, если он располагается таким образом, чтобы способствовать трансляции. Обычно понятие «оперативно связанный» означает, что последовательности ДНК, будучи связанными, являются смежными, и, в случае секреторного лидера, соприкасаются и находятся в рамке считывания. Однако энхансеры необязательно должны быть смежными. Связывание дополняется лигированием по соответствующим сайтам рестрикции. Если таких сайтов нет, синтетические олигонуклеотидные праймеры или линкеры используют в соответствии с обычной практикой.

Очистку антител проводят для элиминации клеточных компонентов или других контаминантов, например, других нуклеиновых кислот или белков, стандартными методами, включающими обработку щелочью/SDS, расслоение при центрифугировании в градиенте CsCl, колоночную хроматографию, гель-электрофорез в агарозе, и другими известными в данной области методами. См. кн.: «Current Protocols in Molecular Biology», 1987, под ред. Ausubel F. и др., изд-во Greene Publishing and Wiley Interscience, Нью-Йорк. Различные методы были разработаны и широко применяются для очистки белка, например, аффинная хроматография с микробными белками (например, аффинная хроматография с белком А или белком G), ионообменная хроматография (например, катионобменная хроматография (карбоксиметильные смолы), анионообменная хроматография (аминоэтильные смолы) и хроматография смешанного действия), тиофильная адсорбция (например, с бета-меркаптоэтанолом и другими SH лигандами), хроматография гидрофобного взаимодействия или ароматической адсорбции (например, с фенил-сефарозой, аза-аренофильными смолами или м-аминофенилборной кислотой), аффинная хроматография с хелатами металлов (например, с Ni(II)- и Cu(II)-аффинным материалом), эксклюзионная хроматография и электрофоретические методы (например, электрофорез, капиллярный электрофорез) (Vijayalakshmi М.А., Appl. Biochem. Biotech. 75, 1998, cc.93-102).

Одним из объектов настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, включающая антитело по настоящему изобретению. Другим объектом настоящего изобретения является применение антитела по настоящему изобретению для получения фармацевтической композиции. Другим объектом настоящего изобретения является способ получения фармацевтической композиции, включающей антитело по настоящему изобретению. В другом объекте настоящего изобретения предусмотрена композиция, например, фармацевтическая композиция, содержащая антитело по настоящему изобретению, переработанное вместе с фармацевтическим носителем.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения биспецифическое антитело по настоящему изобретению предназначено для лечения рака.

Другим объектом настоящего изобретения является указанная фармацевтическая композиция для лечения рака.

Другим объектом настоящего изобретения является применение антитела по настоящему изобретению для получения лекарственного средства для лечения рака.

Другим объектом настоящего изобретения является способ лечения пациента, больного раком, путем введения антитела по настоящему изобретению пациенту, нуждающемуся в таком лечении.

В контексте настоящего изобретения понятие «фармацевтический носитель» включает какой-либо или все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические агенты и агенты задержки всасывания, а также другие физиологически совместимые агенты. Предпочтительно носитель применим для внутривенного, внутримышечного, подкожного, парентерального, спинального или эпидермального введения (например, инъекцией или инфузией).

Композиция по настоящему изобретению может вводиться разными способами, известными в данной области. Специалистам известно, что способ применения и/или способ введения могут варьировать в зависимости от требуемого результата. Для введения соединения по настоящему изобретению определенными способами введения может потребоваться нанесение покрытия на соединение или совместное введение материала, предупреждающего инактивацию соединения. Например, соединение может вводиться субъекту на соответствующем носителе, например, в липосомах или растворителе. К фармацевтически приемлемым растворителям относятся физиологический раствор и водные буферные растворы. К фармацевтическим носителям относятся стерильные водные растворы или дисперсии, а также стерильные порошки для быстрого получения стерильных инъекционных растворов или дисперсий. Применение таких сред и агентов для фармацевтически действующих веществ известно в данной области.

В контексте настоящего изобретения фразы «парентеральное введение» или «введенные парентерально» означают способы введения, отличающиеся от введения внутрь и местного введения, обычно осуществляемого путем инъекции, и означают, но ими не ограничиваются, внутривенное, внутримышечное, внутриартериальное, интратекальное, интракапсулярное, внутриглазное, интракардиальное, внутрикожное, внутрибрюшинное, внутритрахеальное, подкожное, субкутикулярное, внутрисуставное, внутрикапсулярное, субарахноидально, эпидурально и надчревное введение инъекцией или инфузией.

Понятие «рак», используемое в настоящем изобретении, относится к пролиферативным заболеваниям, например, к лимфомам, лимфоцитарным лейкозам, раку легких, немелкоклеточному раку легких, бронхоальвеолярному раку легкого, раку костей, раку поджелудочной железы, раку кожи, раку головы и шеи, кожной и внутриглазной меланоме, раку матки, раку яичника, раку прямой кишки, раку анальной области, раку желудка, раку толстой кишки, раку груди, раку матки, карциноме фаллопиевых труб, карциноме эндометрия, карциноме шейки матки, карциноме влагалища, карциноме вульвы, ходжкинской лимфоме, раку пищевода, раку тонкого кишечника, раку эндокринной системы, раку щитовидки, раку паращитовидки, раку надпочечников, саркоме мягких тканей, раку уретры, раку пениса, раку простаты, раку мочевого пузыря, раку почки или мочеточника, светлоклеточному раку, карциноме почечной лоханки, мезотелиоме, гепатоклеточному раку, раку желчных путей, неоплазмам центральной нервной системы (ЦНС), раку позвоночника, глиоме ствола мозга, мультиформной глиоме, астроцитоме, шваннозу, эпендимомам, медуллобластому, менингиоме, плоскоклеточной карциноме, питуитарной аденоме и саркоме Юинга, включая устойчивые версии какого-либо из указанных выше форм рака или комбинацию указанных выше одной или нескольких форм рака.

Другим объектом настоящего изобретения является биспецифическое антитело по настоящему изобретению или указанная фармацевтическая композиция в качестве антиангиогенного агента. Такой антиангиогенный агент может применяться для лечения рака, особенно солидных опухолей, и других сосудистых заболеваний.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения представлено биспецифическое антитело по настоящему изобретению для лечения сосудистых заболеваний.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения представлена указанная фармацевтическая композиция для лечения сосудистых заболеваний.

Другим объектом по настоящему изобретению является применение антитела по настоящему изобретению для получения лекарственного средства для лечения сосудистых заболеваний.

Другим объектом по настоящему изобретению является способ лечения пациента с сосудистыми заболеваниями путем введения антитела по настоящему изобретению пациенту, нуждающемуся в таком лечении.

К понятию «сосудистые заболевания» относятся рак, воспалительные заболевания, атеросклероз, ишемия, травмы, сепсис, хроническое обструктивное заболевание легких (ХОЗЛ), астма, диабет, СДС, ретинопатия, удар, ожирение, острое повреждение легких, кровоизлияние, сосудистые истечения, например, индуцированное цитокином, аллергия, болезнь Грейвса, аутоиммунный тиреоидит Хашимото, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, гигантоклеточный артериит, ревматоидный артрит, системная красная волчанка (СКВ), волчаночный нефрит, болезнь Крона, рассеянный склероз, язвенный колит, особенно солидные опухоли, внутриглазные сосудистые синдромы, например, пролиферативные ретинопатии или старческая дегенерация сетчатки (СДС), ревматоидный артрит и псориаз (Folkman J. и др., J. Biol. Chem. 267, 1992, сс.10931-10934; Klagsbrun М. и др., Annu. Rev. Physiol. 53, 1991, сс.217-239; и Garner А. в кн.: «Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach)), 1994, под ред. Garner А. и Klintworth G.K., 2-е изд., изд-во Marcel Dekker, Нью-Йорк, cc.1625-1710).

Эти композиции также могут содержать адъюванты, например, консерванты, увлажняющие агенты, эмульгирующие агенты и диспергирующие агенты. Гарантированного предупреждения наличия микроорганизмов можно достичь и описанными выше процедурами стерилизации, и включением различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, парабена, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты и др. Может быть желательным включение в композиции изотонических агентов, например, сахаров, натрия хлорида и других. Кроме того, пролонгированное всасывание инъекционной фармацевтической формы может быть достигнуто, например, включением агентов, которые отсрочивают всасывание, например, моностеарата алюминия и желатина.

Независимо от выбранного способа введения соединений по настоящему изобретению, которые могут применяться в соответствующей гидратированной форме, и/или фармацевтических композиций по настоящему изобретению, соединения перерабатывают в фармацевтически приемлемые лекарственные формы путем обычных методов, известных специалистам в данной области.

Фактические уровни дозирования действующих ингредиентов в фармацевтических композициях по настоящему изобретению могут варьировать таким образом, чтобы получить количество действующего ингредиента, эффективного для достижения требуемого терапевтического ответа для конкретного пациента, композиции и способа введения без токсичности для пациента. Выбранный уровень дозирования может зависеть от разных фармакокинетических факторов, включая действие определенных композиций по настоящему изобретению, способа введения, времени введения, скорости экскреции определенного вводимого соединения, длительности лечения, других лекарственных средств, соединений и/или материалов, используемых в комбинации с определенными используемыми композициями, возраста, пола, массы тела, состояния, общего состояния здоровья и истории болезни подвергаемого лечению пациента и других факторов, известных в медицине.

Композиция должна быть стерильной и жидкой до такой степени, чтобы композиция могла вводиться шприцом. Помимо воды носителем предпочтительно является изотонический буферный солевой раствор.

Должная текучесть может поддерживаться, например, применением покровных материалов, например, лецитина, поддержанием требуемого размера частиц в случае дисперсии и использованием поверхностно-активных веществ. Во многих случаях предпочтительно включать в композиции изотонические агенты, например, сахара, полиатомные спирты, например, маннит или сорбит и хлорид натрия.

В контексте настоящего изобретения понятия экспрессии «клеток», «клеточной линии» и «культуры клеток» используют взаимозаменяемо, и все эти обозначения также включают потомство указанных клеток. Таким образом, термины «трансформанты» и «трансформированные клетки» включают первичные клетки субъекта и полученные от него культуры клеток независимо от числа пересевов. Также следует учитывать, что все потомство может быть в точности неидентичным по содержанию ДНК из-за плановых или случайных мутаций. Варианты потомства клеток, которые имеют ту же функцию или биологическое действие, которые подвергали скринингу у исходных трансформированных клеток, также относятся к указанным терминам. Если подразумеваются другие значения, это будет ясно из контекста.

Понятие «трансформация» в контексте настоящего изобретения относится к процессу переноса векторов/нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина. Если клетки без труднопреодолимых барьеров в виде клеточных стенок используют в качестве клеток-хозяев, трансфекцию проводят, например, методом осаждения фосфатом кальция, описанным Graham F.L. и Van der Eb A.J., Virology 52, 1978, cc.546. Однако также могут применяться другие способы интродукции ДНК в клетки, например, инъекцией в ядро или гибридизацией протопластов. Если используют прокариотические клетки или клетки с прочным строением клеточной стенки, например, одним из методов трансфекции является обработка кальцием, использующая хлорид кальция согласно описанию Cohen S.N. и др, PNAS. 69, 1972, сс.2110-2114.

В контексте настоящего изобретения понятие «экспрессия» относится к процессу, с помощью которого нуклеиновая кислота транскрибируется в иРНК, и/или к процессу, с помощью которого транскрибированная иРНК (также называемая транскриптом) последовательно транслируется в пептиды, полипептиды или белки. Транскрипты и кодируемые полипептиды в совокупности называются генным продуктом. Если полинуклеотид происходит от геномной ДНК, экспрессия в эукариотических клетках может включать сплайсинг иРНК.

Понятие «вектор» означает молекулу нуклеиновой кислоты, в частности самореплицирующуюся, которая переносит инсертированную молекулу нуклеиновой кислоты в и/или между клетками-хозяевами. К этому понятию относятся векторы, которые действуют в основном для инсерции ДНК или РНК в клетку (например, интеграция в хромосому), репликации векторов, функция которых преимущественно заключается в репликации ДНК или РНК, и векторы экспрессии, которые действуют для транскрипции и/или трансляции ДНК или РНК. Также к этому понятию относятся векторы, которые обеспечивают более одной из описанных функций.

Понятие «вектор экспрессии» означает полинуклеотид, который при внедрении в определенные клетки-хозяева, может быть транскрибирован и транслирован в полипептид. Понятие «система экспрессии» обычно относится к соответствующим клеткам-хозяевам, включающим вектор экспрессии, который может функционировать для получения экспрессируемого продукта.

Описание аминокислотных последовательностей

SEQ ID NO:1	CDR3 тяжелой цепи, <VEGF> бевацизумаб
SEQ ID NO:2	CDR2 тяжелой цепи, <VEGF> бевацизумаб
SEQ ID NO:3	CDR1 тяжелой цепи, <VEGF> бевацизумаб
SEQ ID NO:4	CDR3 легкой цепи, <VEGF> бевацизумаб
SEQ ID NO:5	CDR2 легкой цепи, <VEGF> бевацизумаб
SEQ ID NO:6	CDR1 легкой цепи, <VEGF> бевацизумаб
SEQ ID NO:7	Вариабельный домен тяжелой цепи, <VEGF> бевацизумаб
SEQ ID NO:8	Вариабельный домен легкой цепи, <VEGF> бевацизумаб
SEQ ID NO:9	CDR3 тяжелой цепи, <VEGF> ранибизумаб
SEQ ID NO:10	CDR2 тяжелой цепи, <VEGF> ранибизумаб
SEQ ID NO:11	CDR1 тяжелой цепи, <VEGF> ранибизумаб
SEQ ID NO:12	CDR3 легкой цепи, <VEGF> ранибизумаб
SEQ ID NO:13	CDR2 легкой цепи, <VEGF> ранибизумаб
SEQ ID NO:14	CDR1 легкой цепи, <VEGF> ранибизумаб
SEQ ID NO:15	Вариабельный домен тяжелой цепи, <VEGF> ранибизумаб
SEQ ID NO:16	Вариабельный домен легкой цепи, <VEGF> ранибизумаб
SEQ ID NO:17	CDR3 тяжелой цепи, <VEGF> HuMab G6-31

SEQ ID NO:18	CDR2 тяжелой цепи, <VEGF> HuMab G6-31
SEQ ID NO:19	CDR1 тяжелой цепи, <VEGF> HuMab G6-31
SEQ ID NO:20	CDR3 легкой цепи, <VEGF> HuMab G6-31
SEQ ID NO:21	CDR2 легкой цепи, <VEGF> HuMab G6-31
SEQ ID NO:22	CDR1 легкой цепи, <VEGF> HuMab G6-31
SEQ ID NO:23	Вариабельный домен тяжелой цепи, <VEGF> HuMab G6-31
SEQ ID NO:24	Вариабельный домен легкой цепи, <VEGF> HuMab G6-31
SEQ ID NO:25	CDR3 тяжелой цепи, <ANG-2> Mab 536
SEQ ID NO:26	CDR2 тяжелой цепи, <ANG-2> Mab 536
SEQ ID NO:27	CDR1 тяжелой цепи, <ANG-2> Mab 536
SEQ ID NO:28	CDR3 легкой цепи, <ANG-2> Mab 536
SEQ ID NO:29	CDR2 легкой цепи, <ANG-2> Mab 536
SEQ ID NO:30	CDR1 легкой цепи, <ANG-2> Mab 536
SEQ ID NO:31	Вариабельный домен тяжелой цепи, <ANG-2> Mab 536
SEQ ID NO:32	Вариабельный домен легкой цепи, <ANG-2> Mab 536
SEQ ID NO:33	(G4S)4 линкер
SEQ ID NO:34	Константная область легкой цепи лямбда
SEQ ID NO:35	Константная область тяжелой цепи человека, производная от IgG1
SEQ ID NO:36	Константная область тяжелой цепи человека, производная от IgG4
SEQ ID NO:37	Константная область легкой цепи каппа
SEQ ID NO:38	CDR3 тяжелой цепи, <ANG-2> Ang2s_R3_LC03
SEQ ID NO:39	CDR2 тяжелой цепи, <ANG-2> Ang2s_R3_LC03
SEQ ID NO:40	CDR1 тяжелой цепи, <ANG-2> Ang2s_R3_LC03
SEQ ID NO:41	CDR3 легкой цепи, <ANG-2> Ang2s_R3_LC03

SEQ ID NO:42	CDR2 легкой цепи, <ANG-2> Ang2s_R3_LC03
SEQ ID NO:43	CDR1 легкой цепи, <ANG-2> Ang2s_R3_LC03
SEQ ID NO:44	Вариабельный домен тяжелой цепи, <ANG-2> Ang2s_R3_LC03
SEQ ID NO:45	Вариабельный домен легкой цепи, <ANG-2> Ang2s_R3_LC03
SEQ ID NO:46	CDR3 тяжелой цепи, <ANG-2> Ang2i_LC06
SEQ ID NO:47	CDR2 тяжелой цепи, <ANG-2> Ang2i_LC06
SEQ ID NO:48	CDR1 тяжелой цепи, <ANG-2> Ang2i_LC06
SEQ ID NO:49	CDR3 легкой цепи, <ANG-2> Ang2i_LC06
SEQ ID NO:50	CDR2 легкой цепи, <ANG-2> Ang2i_LC06
SEQ ID NO:51	CDR1 легкой цепи, <ANG-2> Ang2i_LC06
SEQ ID NO:52	Вариабельный домен тяжелой цепи, <ANG-2> Ang2i_LC06
SEQ ID NO:53	Вариабельный домен легкой цепи, <ANG-2> Ang2i_LC06
SEQ ID NO:54	CDR3 тяжелой цепи, <ANG-2> Ang2i_LC07
SEQ ID NO:55	CDR2 тяжелой цепи, <ANG-2> Ang2i_LC07
SEQ ID NO:56	CDR1 тяжелой цепи, <ANG-2> Ang2i_LC07
SEQ ID NO:57	CDR3 легкой цепи, <ANG-2> Ang2i_LC07
SEQ ID NO:58	CDR2 легкой цепи, <ANG-2> Ang2i_LC07
SEQ ID NO:59	CDR1 легкой цепи, <ANG-2> Ang2i_LC07
SEQ ID NO:60	Вариабельный домен тяжелой цепи, <ANG-2> Ang2i_LC07
SEQ ID NO:61	Вариабельный домен легкой цепи, <ANG-2> Ang2i_LC07
SEQ ID NO:62	CDR3 тяжелой цепи, <ANG-2> Ang2k_LC08
SEQ ID NO:63	CDR2 тяжелой цепи, <ANG-2> Ang2k_LC08
SEQ ID NO:64	CDR1 тяжелой цепи, <ANG-2> Ang2k_LC08
SEQ ID NO:65	CDR3 легкой цепи, <ANG-2> Ang2k_LC08

SEQ ID NO:66	CDR2 легкой цепи, <ANG-2> Ang2k_LC08
SEQ ID NO:67	CDR1 легкой цепи, <ANG-2> Ang2k_LC08
SEQ ID NO:68	Вариабельный домен тяжелой цепи, <ANG-2> Ang2k_LC08
SEQ ID NO:69	Вариабельный домен легкой цепи, <ANG-2> Ang2k_LC08
SEQ ID NO:70	CDR3 тяжелой цепи, <ANG-2> Ang2s_LC09
SEQ ID NO:71	CDR2 тяжелой цепи, <ANG-2> Ang2s_LC09
SEQ ID NO:72	CDR1 тяжелой цепи, <ANG-2> Ang2s_LC09
SEQ ID NO:73	CDR3 легкой цепи, <ANG-2> Ang2s_LC09
SEQ ID NO:74	CDR2 легкой цепи, <ANG-2> Ang2s_LC09
SEQ ID NO:75	CDR1 легкой цепи, <ANG-2> Ang2s_LC09
SEQ ID NO:76	Вариабельный домен тяжелой цепи, <ANG-2> Ang2s_LC09
SEQ ID NO:77	Вариабельный домен легкой цепи, <ANG-2> Ang2s_LC09
SEQ ID NO:78	CDR3 тяжелой цепи, <ANG-2> Ang2i_LC10
SEQ ID NO:79	CDR2 тяжелой цепи, <ANG-2> Ang2i_LC10
SEQ ID NO:80	CDR1 тяжелой цепи, <ANG-2> Ang2i_LC10
SEQ ID NO:81	CDR3 легкой цепи, <ANG-2> Ang2i_LC10
SEQ ID NO:82	CDR2 легкой цепи, <ANG-2> Ang2i_LC10
SEQ ID NO:83	CDR1 легкой цепи, <ANG-2> Ang2i_LC10
SEQ ID NO:84	Вариабельный домен тяжелой цепи, <ANG-2> Ang2i_LC10
SEQ ID NO:85	Вариабельный домен легкой цепи, <ANG-2> Ang2i_LC10
SEQ ID NO:86	CDR3 тяжелой цепи, <ANG-2> Ang2k_LCl 1
SEQ ID NO:87	CDR2 тяжелой цепи, <ANG-2> Ang2k_LCl 1
SEQ ID NO:88	CDR1 тяжелой цепи, <ANG-2> Ang2k_LCl 1
SEQ ID NO:89	CDR3 легкой цепи, <ANG-2> Ang2k_LCl 1

SEQ ID NO:90	CDR2 легкой цепи, <ANG-2> Ang2k_LC11
SEQ ID NO:91	CDR1 легкой цепи, <ANG-2> Ang2k_LC11
SEQ ID NO:92	Вариабельный домен тяжелой цепи, <ANG-2> Ang2k_LC11
SEQ ID NO:93	Вариабельный домен легкой цепи, <ANG-2> Ang2k_LC11
SEQ ID NO:94	CDR3 тяжелой цепи, <VEGF> B20-4.1
SEQ ID NO:95	CDR2 тяжелой цепи, <VEGF> B20-4.1
SEQ ID NO:96	CDR1 тяжелой цепи, <VEGF> B20-4.1
SEQ ID NO:98	CDR2 легкой цепи, <VEGF> B20-4.1
SEQ ID NO:99	CDR1 легкой цепи, <VEGF> B20-4.1
SEQ ID NO:100	Вариабельный домен тяжелой цепи, <VEGF> B20-4.1
SEQ ID NO:101	Вариабельный домен легкой цепи, <VEGF> B20-4.1
SEQ ID NO:102	Гибридный пептид тяжелой цепи бевацизумаба Ang2i_LC06 scFv антитела <VEGF-ANG-2> TvAb-2441-бевацизумаб-LС06
SEQ ID NO:103	Гибридный пептид тяжелой цепи бевацизумаба Ang2i_LC08 scFv антитела <VEGF-ANG-2> TyAb-2441-бевацизумаб-LС08
SEQ ID NO:104	Легкая цепь бевацизумаба
SEQ ID NO:105	Фактор роста сосудистого эндотелия человека (human vascular endothelial growth factor - (VEGF)
SEQ ID NO:106	Ангиопоэтин-2 человека (ANG-2)
SEQ ID NO:107	Ангиопоэтин-1 человека (ANG-1)
SEQ ID NO:108	Рецептор Tie-2 человека
SEQ ID NO:109	Тяжелая цепь 1 молекулы биспецифического четырехвалентного одноцепочечного Fab <VEGF-ANG-2> антитела scFAb-авастин-LC06-2620
SEQ ID NO:110	Легкая цепь молекулы биспецифического четырехвалентного одноцепочечного Fab <VEGF-ANG-2> антитела scFAb-авастин-LC06-2620
SEQ ID NO:111	Тяжелая цепь 1 молекулы биспецифического четырехвалентного одноцепочечного Fab <VEGF-ANG-2> антитела scFAb-авастин-Ang2i-LC06-2640
SEQ ID NO:112	Легкая цепь молекулы биспецифического четырехвалентного одноцепочечного Fab <VEGF-ANG-2> антитела scFab-Авастин-Ang2i-LC06-2640

SEQ ID NO:113	Тяжелая цепь 1 молекулы биспецифического четырехвалентного одноцепочечного Fab <VEGF-ANG-2> антитела scFab-Авастин-Ang2i-LC06-2641
SEQ ID NO:114	Легкая цепь молекулы биспецифического четырехвалентного одноцепочечного Fab <VEGF-ANG-2> антитела scFab-Авастин-Ang2i-LC06-2641
SEQ ID NO:115	Тяжелая цепь 1 молекулы биспецифического трехвалентного одноцепочечного Fab <VEGF-ANG-2> антитела авастин-LС06-КiH-С-scFab
SEQ ID NO:116	Тяжелая цепь 2 молекулы биспецифического трехвалентного одноцепочечного Fab <VEGF-ANG-2> антитела авастин-LС06-KiH-С-scFab
SEQ ID NO:117	Легкая цепь молекулы биспецифического трехвалентного <VEGF-ANG-2> антитела авастин-LC06-KiH-C-scFab
SEQ ID NO:118	Тяжелая цепь 1 молекулы биспецифического трехвалентного <VEGF-ANG-2> антитела авастин-LC06-C-Fab-6CSS
SEQ ID NO:119	Тяжелая цепь 2 молекулы биспецифического трехвалентного <VEGF-ANG-2> антитела авастин-LC06-C-Fab-6CSS
SEQ ID NO:120	Легкая цепь молекулы биспецифического трехвалентного <VEGF-ANG-2> антитела авастин-LC06-C-Fab-6CSS
SEQ ID NO:121	Тяжелая цепь 1 молекулы биспецифического двухвалентного с замененным доменом <VEGF-ANG-2> антитела авастин-LС06-СН1-CL
SEQ ID NO:122	Тяжелая цепь 2 молекулы биспецифического двухвалентного с замененным доменом <VEGF-ANG-2> антитела авастин-LС06-СН1-CL
SEQ ID NO:123	Легкая цепь 1 молекулы биспецифического двухвалентного с замененным доменом <VEGF-ANG-2> антитела авастин-LС06-СН1-CL
SEQ ID NO:124	Легкая цепь 2 молекулы биспецифического двухвалентного с замененным доменом <VEGF-ANG-2> антитела авастин-LС06-СН1-CL
SEQ ID NO:125	Тяжелая цепь 1 молекулы биспецифического двухвалентного с замененным доменом <VEGF-ANG-2> антитела авастин-LС06-VH-VL
SEQ ID NO:126	Тяжелая цепь 2 молекулы биспецифического двухвалентного с замененным доменом <VEGF-ANG-2> антитела авастин-LС06-VH-VL
SEQ ID NO:127	Легкая цепь 1 молекулы биспецифического двухвалентного с замененным доменом <VEGF-ANG-2> антитела авастин-LС06-VH-VL
SEQ ID NO:128	Легкая цепь 2 молекулы биспецифического двухвалентного с замененным доменом <VEGF-ANG-2> антитела авастин-LС06-VH-VL
SEQ ID NO:129	Тяжелая цепь 1 молекулы биспецифического двухвалентного с замененным доменом <VEGF-ANG-2> антитела авастин-LС06-VH-VL-SS
SEQ ID NO:130	Тяжелая цепь 2 молекулы биспецифического двухвалентного с замененным доменом <VEGF-ANG-2> антитела авастин-LС06-VH-VL-SS

SEQ ID NO:131	Легкая цепь 1 молекулы биспецифического двухвалентного с замененным доменом <VEGF-ANG-2> антитела авастин-LС06-VH-VL-SS
SEQ ID NO:132	Легкая цепь 2 молекулы биспецифического двухвалентного с замененным доменом <VEGF-ANG-2> антитела авастин-LС06-VH-VL-SS
SEQ ID NO:133	Тяжелая цепь 1 молекулы биспецифического двухвалентного ScFab-Fc гибрида <VEGF-ANG-2> антитела авастин-LC06-N-scFab
SEQ ID NO:134	Тяжелая цепь 2 молекулы биспецифического двухвалентного ScFab-Fc гибрида <VEGF-ANG-2> антитела авастин--LC06-N-scFab
SEQ ID NO:135	Тяжелая цепь 1 молекулы биспецифического двухвалентного ScFab-Fc гибрида <VEGF-ANG-2> антитела авастин-LC06-N-scFabSS
SEQ ID NO:136	Тяжелая цепь 2 молекулы биспецифического двухвалентного ScFab-Fc гибридного <VEGF-ANG-2> антитела авастин-LC06-N-scFabSS

Приводимые ниже примеры, перечни последовательностей и фигуры предусмотрены для лучшего понимания настоящего изобретения, область охвата которого ограничена формулой настоящего изобретения. Следует учитывать, что модификации могут быть получены в указанных ниже методах без отклонения от духа настоящего изобретения.

Описание фигур

Фиг.1А. Схематическое изображение одного из вариантов четырехвалентного биспецифического антитела по настоящему изобретению, связывающегося с VEGF и ANG-2, в котором одним из антигенов А или Б является VEGF, а другим антигеном является ANG-2. Структура основана на антителе полной длины, связывающемся с антигеном А, к которому два (необязательно стабилизированных дисульфидной связью) одноцепочечных фрагмента Fv, связывающихся с антигеном Б, присоединены через пептидный линкер.

Фиг.1Б. Схематическое изображение полученных биспецифических четырехвалентных антител с использованием номенклатуры TvAb (см. примеры) - либо без стабилизации дисульфидной связью, либо со стабилизацией дисульфидной связью фрагмента scFv.

Фиг.2А. Схематическое изображение стабилизированного дисульфидной связью <VEGF-ANG-2> биспецифического четырехвалентного антитела (= <VEGF-ANG-2> TvAb6; No. 2331, см. табл.3).

Фиг.2Б. Плазмидные карты модифицированных векторов тяжелой и легкой цепи, применяемых для экспрессии стабилизированного дисульфидной связью антитела <VEGF-ANG-2> TvAb6.

Фиг.3. SDS-PAGE очищенного стабилизированного дисульфидной связью <VEGF-ANG-2> TvAb6 в сравнении со «стандартным» IgG1 антителом человека G6-31 ( <VEGF> HuMab G6-31) в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях.

Фиг.4. Эксклюзионная хроматография очищенного стабилизированного дисульфидной связью <VEGF-ANG-2> TvAb6 в сравнении со «стандартным» IgGl антителом человека G6-31 показывает, что стабилизированное дисульфидной связью TvAb6 не формирует заново агрегаты при очистке.

Фиг.5. Схематическое изображение и результаты анализа связывания VEGF методом ELISA. Стабилизированное дисульфидной связью <VEGF-ANG-2> TvAb6 связывается с VEGF сопоставимо с <VEGF> G6-31. <ANG-2> Маb536 не связывается с VEGF.

Фиг.6А. Схематическое изображение и результаты анализа по связыванию ANG-2 методом ELISA. Стабилизированное дисульфидной связью <VEGF-ANG-2> TvAb6 связывается с ANG-2 сопоставимо со связыванием <ANG-2> Маb53б. <VEGF> G6-31 не связывается с ANG-2.

Фиг.6Б. Схематическое изображение и результаты анализа по связыванию ANG-2 методом поверхностного плазмонного резонанса (фирма Biacore). Стабилизированное дисульфидной связью антитело <VEGF-ANG-2> TvAb6 связывается с ANG-2 со сродством, сопоставимым со сродством антитела <ANG-2> Маb536.

Фиг.7. Схематическое изображение и результаты связывания VEGF-ANG-2 методом ELISA. Стабилизированное дисульфидной связью <VEGF-ANG-2> TvAb6 связывают одновременно с VEGF и ANG-2, хотя <VEGF> G6-31 и <ANG-2> Маb536 не могут одновременно связываться с VEGF и ANG-2.

Фиг.8А. Эффективность стабилизированного дисульфидной связью <VEGF-ANG-2> TvAb6 в сравнении с <ANG-2> Mab536, <VEGF> G6-31 и комбинацией Маb536 и G6-31 в ступенчатой подкожной модели ксенотрансплантата Со1о205 у бежевых мышей линии Scid (исследование ANG2_Pz_Colo205_003).

Фиг.8Б. Эффективность стабилизированного дисульфидной связью <VEGF-ANG-2> TvAb6 в сравнении с <ANG-2> Mab536, <VEGF> G6-31 и комбинацией МаЬ536 и G6-31 в ступенчатой подкожной модели ксенотрансплантата Со1о205 у бежевых мышей линии Scid (исследование ANG2_Pz_Colo205_005).

Фиг.9. Результаты блокирования индуцированного VEGF формирования трубок биспецифическим четырехвалентным антителом <VEGF-ANG-2> TvAb6.

Фиг.10А+Б. Количественный анализ блокирования индуцированного VEGF формирования трубок с помощью стабилизированного дисульфидной связью антитела <VEGF-ANG-2> TvAb6.

Фиг.11. Схематическое изображение анализа связывания VEGF методом поверхностного плазмонного резонанса (фирма Biacore).

Фиг.12. Кинетические характеристики двух <VEGF> антител <VEGF-Ang-2> TvAb6 и <VEGF> G6-31 на плоте Ka-Kd.

Фиг.13. Схематическое изображение анализа методом поверхностного плазмонного резонанса (фирма Biacore) по выявлению одновременного связывания ANGPT2 и VEGF биспецифическими антителами.

Фиг.14. Результаты экспериментов методом поверхностного плазмонного резонанса (фирма Biacore), показывающие, что TvAb6 связывает одновременно ANGPT2 и VEGF.

Фиг.15А+Б. А) Схематическое изображение анализа методом Biacore биспецифического и одновременного связывания биспецифических антител <VEGF-ANG-2>. Б) Результаты анализа методом Biacore, показывающие одновременное связывание ANG-2 и VEGF с TvAb-2441-бевацизумаб-LС06.

Фиг.16А+Б. Фосфорилирование Tie2 биспецифических антител <VEGF-ANG-2> TvAb-2441-бевацизумаб-LC06 и <VEGF-ANG-2> TvAb-2441 в сравнении с анти-Ang2 антителами <ANG-2> Ang2i_LC06 и <ANG-2> Ang2k_LC08.

Фиг.17. Схематическое изображение взаимодействия ангиопоэтина человека методом ELISA.

Фиг.18. VEGF-индуцированная пролиферация HUVEC клеток <VEGF-ANG-2>TvAb-2441-бевацизумаб-LС06 и <VEGF-ANG-2> TvAb-2441-бевацизумаб-LС08 и бевацизумаб.

Фиг.19. In vivo анти-ангиогенная эффективность биспецифического антитела <VEGF-ANG-2> бевацизумаб-LC06 антитела в сравнении с <ANG-2> ANG2i-LC06 и комбинацией <ANG-2> ANG2i-LC06 и авастина (бевацизумаба) в модели трансплантации Calu3, подвергнутая мониторингу через меченое анти-CD31 антитело и относительное изменение сигнала CD31 на протяжении лечения.

Экспериментальная часть

Примеры

Материалы и основные методы

Общая информация, касающаяся нуклеотидных последовательностей легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов человека, приведена в кн.: Kabat Е.А. и др. «Sequences of Proteins of Immunological Interest)), 1991, 5-е изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Мэриленд. Аминокислоты цепей антитела нумеруют и указывают по нумерации EU (Edelman G.M. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63, 1969, cc.78-85; и др. ((Sequences of Proteins of Immunological Interest)), 1991, 5-е изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Мэриленд).

Методы рекомбинации ДНК

Стандартные методы используют для работы с ДНК согласно описанию Sambrook J. и др. в кн.: ((Molecular cloning: A laboratory manual)), 1989, изд-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Нью-Йорк. Реагенты для молекулярной биологии применяют согласно инструкциям производителя.

Синтез генов

Требуемые генные сегменты создают из олигонуклеотидов, полученных химическим синтезом. Генные сегменты, фланкированные единственными сайтами расщепления эндонуклеазами рестрикции, собирают путем отжига и лигирования олигонуклеотидов, включая ПЦР амплификацию, и затем клонируют через указанные сайты рестрикции, например Kpnl/ SacI или AscI/PacI, в векторе pPCRScript (фирма Stratagene), основанном на векторе клонирования pGA4. Последовательности ДНК субклонированных генных фрагментов подтверждают сиквенсом ДНК. Синтез генных фрагментов располагают в определенном порядке по данным техническим условиям фирмы Geneart (Regensburg, Германия). Все генные сегменты, кодирующие легкую и тяжелую цепи биспецифических антител Ang-2/VEGF, синтезируют с 5'-конца ДНК кодирующий лидерный пептид (MGWSCIILFLVATATGVHS), который нацеливает белки для секреции в эукариотических клетках, и 5'-BamHI и 3'-Xbal сайты рестрикции. Последовательности ДНК, несущие стабилизированные дисульфидом «выступ-во-впадину» модифицированные тяжелые цепи, были сконструированы с мутациями S354C и T366W в «выступе» тяжелой цепи и с мутациями Y349C, T366S, L368A и Y407V во «впадине» тяжелой цепи.

Определение последовательности ДНК

Последовательности ДНК определяют двухцепочечным сиквенсом, выполненным на фирме MediGenomix GmbH (Martinsried, Германия) или Sequiserve GmbH (Vaterstetten, Германия).

Анализ последовательностей ДНК и белка и применение данных по последовательностям

Программное обеспечение фирмы GCG (фирма Genetics Computer Group, Мэдисон, Висконсин), версия 10.2, и версию 8.0 фирмы Infomax's Vector NT1 Advance используют для создания последовательностей, картирования, анализа, аннотации и иллюстрации.

Векторы экспрессии (для примера 1)

Для экспрессии описываемых антител применяют варианты экспрессирующих плазмид для временной экспрессии (например, в клетках НЕК293 EBNA или HEK293-F) или для стабильной экспрессии (например, в клетках СНО), основанных или на организации кДНК с промотором CMV-интрон А, или на геномной организации с промотором CMV (например, фиг.2Б). Рядом с кассетой экспрессии антитела векторы содержат: Репликатор, который допускает репликацию этой плазмиды в Е.coli, и ген В-лактамазы, который обусловливает устойчивость к ампициллину у Е.coli.

Единица транскрипции гена антитела состоит из следующих элементов: уникального сайта (сайтов) рестрикции с 5' конца

прямого раннего энхансера и промотора от цитомегаловируса человека, с расположенной за ним последовательностью интрона А в случае организации кДНК,

5'-нетранслируемую область гена антитела человека,

сигнальную последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина,

цепь антитела (тяжелую цепь, модифицированную тяжелую цепь или легкую цепь) или в качестве кДНК, или в качестве геномной организации с организацией экзона-интрона иммуноглобулина,

3'-нетранслируемую область с сигнальной последовательностью полиаденилирования и уникальный сайт (сайты) рестрикции с 3' конца.

Гибридные гены, включающие последовательности тяжелой цепи выбранного антитела и С-концевой гибрид scFv согласно описанному ниже, получены с помощью ПЦР и/или генным синтезом и собраны с помощью методов рекомбинации путем соединения соответствующих сегментов нуклеиновой кислоты, например, используя уникальные сайты Nsil и EcoRI в геномных векторах тяжелой цепи. Субклонируемые последовательности нуклеиновой кислоты контролируют сиквенсом ДНК. Для временной и для постоянной трансфекции повышенные количества плазмид получают путем создания плазмид из трансформированных культур Е. coli (фирма Nucleobond АХ, Macherey-Nagel).

Векторы экспрессии (например, 10-14)

Используют вектор экспрессии, который состоит из следующих элементов:

селективного маркера гена устойчивости к гигромицину,

репликон oriP вируса Эпштейна-Барра (Epstein-Barr virus - EBV),

репликон из вектора pUC18, который допускает репликацию этой плазмиды в Е.coli,

ген бета-лактамазы, который обусловливает устойчивость к ампициллину у Е.coli,

прямой ранний энхансер и промотор из цитомегаловируса человека (human cytomegalovirus - HCMV), сигнальная последовательность полиаденилирования («поли-А») 1-иммуноглобулина человека и уникальные сайты рестрикции BamHI и XbaI.

Гибридные гены иммуноглобулина, включающие конструкции тяжелой и легкой цепей, а также конструкции «выступ-во-впадину» с С-концевыми доменами VH и VL, получают генным синтезом и клонируют в плазмидах pGA18 (ampR) согласно описанному. Плазмиды pG18 (ampR), несущие синтезированные сегменты ДНК, и вектор экспрессии Roche расщепляют ферментами рестрикции BamHI и XbaI (фирма Roche Molecular Biochemicals) и подвергают агарозному гель-электрофорезу. Очищенные сегменты ДНК, кодирующие тяжелую и легкую цепи, затем лигируют с выделенным фрагментом вектора экспрессии BamHI/Xbal фирмы Roche, получая в итоге векторы экспрессии. Полученные в итоге векторы экспрессии трансформируют в клетки Е. coli, ДНК экспрессирующей плазмиды выделяют (фирма Miniprep) и подвергают анализу ферментами рестрикции и сиквенсу ДНК. Соответствующие клоны выращивают в 150 мл среды LB-Amp, опять выделяют плазмидную ДНК (фирма Maxiprep) и целостность последовательности подтверждают сиквенсом ДНК.

Методы работы с культурами клеток

Стандартные методы работы с культурами клеток используют согласно описанному в кн.: «Current Protocols in Cell Biology», 2000, под ред. Bonifacino J. S., Dasso M., Harford J. В., Lippincott-Schwartz J. и Yamada К. M., изд-во John Wiley & Sons, Inc.

Временная экспрессия в системе HEK293F (для примера 1)

Биспецифические антитела получают путем кратковременной трансформации двух плазмид, кодирующих тяжелую и модифицированную тяжелую цепь, соответственно, и соответствующую легкую цепь, используя систему HEK293-F (фирма Invitrogen) по инструкции производителя. Вкратце, клетки HEK293-F (фирма Invitrogen), растущие в суспензии, или в качалочной колбе, или в ферментере с мешалкой в среде для экспрессии FreeStyle 293 без сыворотки (фирма Invitrogen), трансфецируют смесью двух соответствующих экспрессирующих плазмид и 293фектина или фектина (фирма Invitrogen). Например, в качалочные колбы объемом 2 л (фирма Corning) клетки HEK293-F засевают с плотностью 1,0×10⁶ клеток/мл в 600 мл и инкубируют при 120 об/мин, 8% СО₂. Через сутки после трансфекции клеток при плотности клеток примерно 1,5×10⁶ клеток/мл примерно с 42 мл смеси А) 20 мл Opti-MEM (фирма Invitrogen) с 600 мкг суммарной плазмидной ДНК (1 мкг/мл), кодирующей тяжелую или модифицированную тяжелую цепь, соответственно, и соответствующую легкую цепь в эквимолярном соотношении, и Б) 20 мл Opti-MEM+1,2 мл 293фектина или фектина (2 мкл/мл). Исходя из потребления глюкозы, раствор глюкозы добавляют на протяжении курса ферментации. Супернатант, содержащий секретированное антитело, собирают через 5-10 суток, и антитела или непосредственно очищают из супернатанта, или супернатант замораживают и хранят.

Временные трансфекции системы HEK293-F (например 10-14)

Рекомбинантные варианты иммуноглобулина экспрессируют путем временной трансфекции эмбриональных почечных клеток человека 293-F, используя систему экспрессии FreeStyle™ 293 по инструкции производителя (фирма Invitrogen, USA). Вкратце, суспензию FreeStyle™ 293-F клеток культивируют в среде для экспрессии FreeStyle™ 293 при 37***С в атмосфере 8% СО₂, и клетки высевают в свежую среду с плотностью 1-2*106 жизнеспособных клеток/мл в день трансфекции. Комплексы ДНК-293Гесйп™ получают в среде Opti-MEM I (фирма Invitrogen, США), используя 325 мкл продукта 293fectin™ (фирма Invitrogen, Германия) и 250 мкг плазмидной ДНК тяжелой и легкой цепей в мольном соотношении 1:1 до конечного объема для трансфекции 250 мл. ДНК «выступ-во-впадину»-293фектин комплексы с двумя тяжелыми цепями и одной легкой цепью получают в среде Opti-MEM I (фирма Invitrogen, США), используя 325 мкл продукта 293fectin™ (фирма Invitrogen, Германия) и 250 мкг плазмидной ДНК «выступ-во-впадину» тяжелой цепи 1 и 2 и легкой цепи в мольном соотношении 1:1:2 до конечного объема для трансфекции 250 мл. ДНК «выступ-во-впадину»-293фектин комплексы с двумя тяжелыми цепями получают в среде Opti-MEM I (фирма Invitrogen, США), используя 325 мкл продукта 293fectin™ (фирма Invitrogen, Германия) и 250 мкг ДНК «выступ-во-впадину» тяжелой цепи 1 и 2 в мольном соотношении 1:1 до конечного объема для трансфекции 250 мл. Комплексы CrossMab ДНК-293фектин получают в среде Opti-MEM I (фирма Invitrogen, США), используя 325 мкл продукта 293fectin™ (фирма Invitrogen, Германия) и 250 мкг плазмидной ДНК «выступ-во-впадину» тяжелой цепи 1 и 2 и легкой цепи в мольном соотношении 1:1:1:1 до конечного объема для трансфекции 250 мл. Содержащие антитело супернатанты культур клеток собирают через 7 суток после трансфекции путем центрифугирования в режиме 14000 g в течение 30 мин и фильтруют через стерильный фильтр (0,22 мкм). Супернатанты хранят при -20°С до очистки.

Определение белка

Белковую концентрацию очищенного антитела и его производных определяют по оптической плотности (ОП) при 280 нм, используя коэффициент мольной экстинкции, рассчитанный на основе аминокислотной последовательности по Расе C.N. и др., Protein Science, 4, 1995, сс.2411-1423.

Определение концентрации антитела в супернатантах

Концентрацию антител и их производных в супернатантах культур клеток измеряют методом иммунопреципитации с применением агарозных гранул с белком А (фирма Roche). 60 мкл агарозных гранул с белком А трижды промывают в TBS-NP40 (50 мМ Tris, pH 7,5, 150 мМ NaCl, 1% Nonidet-P40). Затем 1-15 мл супернатанта культуры клеток наносят на агарозные гранулы с белком А, предварительно уравновешенные в TBS-NP40. После инкубирования в течение 1 ч при комнатной температуре гранулы отмывают на колонке Ultrafree-MC-filter (фирма Amicon) один раз с 0,5 мл TBS-NP40, дважды 0,5 мл 2х фосфатно-солевого буфера (2хфСБ, фирма Roche) и быстро четыре раза 0,5 мл 100 мМ Na цитрата pH 5,0. Связанное антитело элюируют добавлением 35 мкл буфера для образца NuPAGE® LDS (фирма Invitrogen). Половину образцов комбинируют с агентом восстановления образца NuPAGE® или оставляют невосстановленными, соответственно, и нагревают в течение 10 мин при 70°С. Затем 20 мкл наносят на 4-12% NuPAGE® Bis-Tris SDS-PAGE (фирма Invitrogen) (с буфером MOPS для метода SDS-PAGE в отсутствие восстановителя и с буфером MES с добавлением антиоксидантного подвижного буфера (фирма Invitrogen) для метода SDS-PAGE в присутствии восстановителя) и окрашивают кумасси синим.

Концентрацию антител и их производных в супернатантах культур клеток измеряют белок А-ВЭЖХ хроматографией. Вкратце, супернатанты культур клеток, содержащие антитела и их производные, связывающиеся с белком А, вносят в колонку HiTrap белок А (фирма GE Healthcare) в 50 мМ К2НР04, 300 мМ NaCl, pH 7,3 и элюируют с матрицы 550 мМ уксусной кислотой, pH 2,5 в системе Dionex HPLC-System. Элюированный белок подсчитывают по поглощению в УФ и объединяют области пиков. Очищенное стандартное IgG1 антитело является стандартом.

В другом варианте концентрацию антител и их производных в супернатантах культур клеток измеряют методом сэндвич-IgG-ELISA. Вкратце, планшеты А-96 для микротитрований StreptaWell High Bind Strepatavidin (фирма Roche) покрывают 100 мкл/лунку биотинилированного захваченной молекулы антитела против IgG человека F(ab')2 <h-Fcgamma> BI (фирма Dianova) в количестве 0,1 мкг/мл в течение 1 ч при комнатной температуре или в другом варианте в течение ночи при 4°С и затем трижды промывают 200 мкл/лунку ФСБ, 0,05% Tween (ФСБТ, фирма Sigma). По 100 мкл/лунку серийных разведений в ФСБ (фирма Sigma) супернатантов культур клеток, содержащих соответствующее антитело, добавляют в лунки и инкубируют в течение 1-2 ч на встряхивателе для микропланшетов для титрования при комнатной температуре. Лунки промывают трижды 200 мкл/лунку ФСБТ и связанное антитело обнаруживают с помощью 100 мкл F(ab')2 <hFcgamma> POD (фирма Dianova) в концентрации 0,1 мкг/мл в качестве выявляемого антитела в течение 1-2 ч на встряхивателе для микропланшетов для титрования при комнатной температуре. Несвязанное выявляемое антитело трижды промывают 200 мкл/лунку ФСБТ и связанное выявляемое антитело обнаруживают добавлением 100 мкл ABTS/лунку. Поглощение определяют на спектрофотометре Tecan Fluor при волне измерения 405 нм (контрольная длина волны 492 нм).

Очистка белка

Антитела очищают от фильтратов супернатантов культуры клеток по стандартным протоколам. Вкратце, антитела вносят в колонку с белком А-Sepharose (фирма GE Healthcare) и промывают в ФСБ. Элюцию антител проводят при кислой величине pH с последующей немедленной нейтрализацией образца. Агрегированный белок отделяют от мономерных антител эксклюзионной хроматографией (Superdex 200, фирма GE Healthcare) в 20 мМ гистидине, 140 мМ NaCl pH 6,0. Фракции мономерных антител объединяют, концентрируют при необходимости с помощью центрифугирующего устройства Amicon Ultra (MWCO: 30 К, фирма Millipore) и хранят при -80°С. Мономерные фракции антитела объединяют, быстро замораживают и хранят при -80°С. Часть образцов используют для последующего анализа белка и аналитического описания, например, методом SDS-PAGE, эксклюзионной хроматографии, масс-спектрометрии и определением эндотоксина (см. фиг.3 и 4).

SDS-PAGE

Гель-систему NuPAGE® Pre-Cast (фирма Invitrogen) применяют по инструкции производителя. В частности, применяют гели 4-20% NuPAGE® Novex® TRIS-Glycine Pre-Cast и подвижный буфер Novex® TRIS-глицин SDS (см., например, фиг.3). Восстановление образцов производят добавлением восстанавливающего агента NuPAGE® перед осуществлением движения в геле.

Аналитическая эксклюзионная хроматография

Эксклюзионную хроматографию для определения агрегирования и олигомерного состояния антител проводят с помощью ВЭЖХ. Вкратце, очищенные на белке А антитела вносят в колонку Tosoh TSKgel G3000SW в 300 мМ NaCl, 50 мМ КН₂РО₄/К₂НРО₄, pH 7,5 в системе ВЭЖХ Agilent HPLC 1100 или колонку Superdex 200 (фирма GE Healthcare) в 2 * ФСБ в системе ВЭЖХ Dionex HPLC-System. Элюированный белок подсчитывают по поглощению УФ и по интеграции площадей пиков. Стандартом служит BioRad Gel Filtration Standard 151-1901. (См., например, фиг.4).

Масс-спектрометрия

Общую дегликозилированную массу перекрестных антител определяют и подтверждают масс-спектрометрией с электроспреем (electrospray ionization mass spectrometry - ESI-MS). Вкратце, 100 мкг очищенных антител дегликозилируют с помощью 50 мЕд N-гликозидазы F (PNGaseF, ProZyme) в 100 мМ КН₂РО₄/К₂НРО₄, pH 7, при 37°С в течение 12-24 ч при концентрации белка до 2 мг/мл и затем мягко обессоливают с помощью ВЭЖХ на колонке Sephadex G25 (фирма GE Healthcare). Массу соответствующих тяжелой и легкой цепей определяют методом ESI-MS после дегликозилирования и восстановления. Вкратце, 50 мкг антитела в 115 мкл инкубируют с 60 мкл 1М ТСЕР и 50 мкл 8 М гуанидин гидрохлорида затем обессоливают. Общую массу и массу восстановленных тяжелой и легкой цепей определяют с помощью ESI-MS в системе Q-Star Elite MS, оборудованной источником NanoMate.

Связывание VEGF методом ELISA

Связывающие свойства четырехвалентных антител (TvAb) оценивают методом ELISA с белком полной длины VEGF165-His (фирма R&D Systems) (фиг.5). Для этого улучшенные прозрачные планшеты для микротитрований из полистерола Falcon покрывают 100 мкл 2 мкг/мл рекомбинантного VEGF 165 человека (фирма R&D Systems) в ФСБ в течение 2 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4°С. Лунки промывают трижды 300 мкл ФСБТ (0,2% Tween 20) и блокируют 200 мкл 2% БСА 0,1% Tween 20 в течение 30 мин при комнатной температуре и затем промывают трижды 300 мкл ФСБТ. 100 мкл/лунку серийных разведений (40 пМ -0,01 пМ) очищенного <VEGF-ANG-2> TvAb и в качестве контроля анти-ANG-2 антитела <ANG-2> антитела МаЬ536 человека (Oliner и др., Cancer Cell, 6(5), 2004, сс.507-516, US 2006/0122370) и анти-VEGF антитела <VEGF> антитело G6-31 (Liang и др., J Biol Chem, 281(2), 2006, сс.951-961; US 2007/0141065) в ФСБ (фирма Sigma) вносят в лунки и инкубируют в течение 1 ч на встряхивателе для микропланшетов для титрования при комнатной температуре. Лунки промывают трижды 300 мкл ФСБТ (0,2% Tween 20) и связанное антитело обнаруживают с помощью 100 мкл/лунку 0,1 мкг/мл F(ab') <hFcgamma> POD (фирма Immuno research) в 2% БСА 0,1% Tween 20 в качестве выявляемого антитела в течение 1 ч на встряхивателе для микропланшетов для титрования при комнатной температуре. Несвязанное выявляемое антитело отмывают трижды 300 мкл/лунку ФСБТ и связанное выявляемое антитело определяют добавлением 100 мкл ABTS/лунку. Определение поглощения проводят на спектрофотометре Tecan Fluor при измеряемой длине волны 405 нм (контрольная длина волны 492 нм).

Связывание VEGF: кинетические параметры связывания VEGF при 37°С, определенные методом поверхностного плазмонного резонанса (фирма Biacore")

Для дополнительного подтверждения данных ELISA связывание <VEGF> антител G6-31, или авастина и <VEGF-Ang-2> TvAb6, или TvAb-2441-бевацизумаб-ЕС06, или TvAb-2441-бевацизумаб-LC08 с VEGF анализируют количественно, используя метод поверхностного плазмонного резонанса на приборе Biacore Т100 по приводимому протоколу, и исследуют, используя пакет программ Т100: вкратце, <VEGF> антитела захватываются СМ5-чипом через связывание с козьим антителом против IgG человека (JIR 109-005-098). Захваченное антитело иммобилизуют связыванием через амино-группы, используя следующее стандартное связывание через амино-группы: буфер HBS-N используют в качестве подвижного буфера, активирование проводят путем смешивания EDC/NHS для достижения плотности лиганда 700 КЕ. Захваченное антитело разводят в связывающем буфере Na ацетате, pH 5,0, с=2 мкг/мл, в итоге активированные карбоксильные группы блокируют инъекцией 1 М этаноламина. Захват Mab <VEGF> антител проводят при скорости тока 5 мкл/мин и c(Mabs <VEGF> )=10 нМ, разводят подвижным буфером +1 мг/мл БСА; должен был достигнут уровень захвата примерно 30 КЕ. Антитело rhVEGF (rhVEGF, фирма R&D-Systems, номер в каталоге 293-VE) используют в качестве исследуемого соединения. Кинетические свойства связывания VEGF с антителами <VEGF> проводят при 37°С в ФСБ+0,005 об.% Tween20 в качестве подвижного буфера. Образец вводят инъекцией при скорости тока 50 мкл/мин, времени ассоциации 80 с и времени диссоциации 1200 с при серийных концентрациях rhVEGF от 300 до 0,29 нМ. Поверхность, свободную от захваченного антитела, регенерируют 10 мМ глицином, pH 1,5, при времени контакта 60 с после каждого аналитического цикла. Кинетические контакты подсчитывают, используя двойной эталонный метод (контроль: связывание rhVEGF с молекулой-ловушкой козьим антителом против IgG человека, контрольные пробы по измерению проточных кювет, концентрация rhVEGF «0», модель: связывание Лэнгмюра 1:1, (Rmax устанавливают на месте из-за связывания захваченной молекулы). Фиг.11 схематически показывает анализ Biacore.

Связывание ANG-2 методом ELISA

Связывающие свойства четырехвалентных антител (TvAb) оценивают методом ELISA с белком полной длины ангиопоэтин-2-His (фирма R&D Systems) (фиг.6а), улучшенные прозрачные планшеты для микротитрований из полистерола Falcon покрывают 100 мкл 1 мкг/мл рекомбинантного ангиопоэтина-2 человека (фирма R&D Systems, без носителя) в ФСБ на 2 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4°С. Лунки промывают трижды 300 мкл ФСБТ (0,2% Tween 20) и блокируют 200 мкл 2% БСА 0,1% Tween 20 в течение 30 мин при комнатной температуре и затем промывают трижды 300 мкл ФСБТ. По 100 мкл/лунку серийных разведений (от 40 пМ до 0,01 пМ) очищенного <VEGF-ANG-2> TvAb и в качестве контроля <ANG-2> антитело МаЬ536 и VEGF> антитело G6-31 в ФСБ (фирма Sigma) вносят в лунки и инкубируют в течение 1 ч на встряхивателе для микропланшетов для титрования при комнатной температуре. Лунки трижды промывают 300 мкл ФСБТ (0,2% Tween 20) и связанное антитело выявляют с помощью 100 мкл/лунку 0,1 мкг/мл F(ab') <hk> POD (фирма Biozol, номер в каталоге 206005) в 2% БСА 0,1% Tween 20 в качестве выявляемого антитела в течение 1 ч на встряхивателе для микропланшетов для титрования при комнатной температуре. Несвязанное выявляемое антитело трижды промывают 300 мкл/лунку ФСБТ и связанное выявляемое антитело обнаруживают добавлением 100 мкл ABTS/лунку. Поглощение определяют на спектрофотометре Tecan Fluor при волне измерения 405 нм (контрольная длина волны 492 нм).

Сравнительное связывание с ANG-1 и ANG-2 (связывание ANG-1 и ANG-2 методом ELISA)

Связывающие свойства антител оценивают методом ELISA с белком полной длины ангиопоэтин-2-His (фирма R&D Systems, номер в каталоге 623-AN/CF, или материал получают собственными силами) или ангиопоэтин-1-His (фирма R&D systems, номер в каталоге 923-AN). Для этого 96-луночные планшеты (улучшенные прозрачные планшеты для микротитрований из полистерола Falcon или Nunc Maxisorb) покрывают 100 мкл рекомбинантного ангиопоэтина-1 или ангиопоэтина-2 человека (без носителя) в концентрации 1 мкг/мл в ФСБ (фирма Sigma) в течение 2 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4°С. Лунки трижды промывают 300 мкл ФСБТ (0,2% Tween 20) и блокируют 200 мкл 2% БСА 0,1% Tween 20 в течение 30 мин при комнатной температуре, затем промывают трижды 300 мкл ФСБТ. По 100 мкл/лунку серийных разведений (от 40 пМ до 0,01 пМ) очищенного исследуемого антитела в ФСБ добавляют в лунки и инкубируют в течение 1 ч на встряхивателе для микропланшетов для титрования при комнатной температуре. Лунки промывают трижды 300 мкл ФСБТ (0,2% Tween 20) и связанное антитело выявляют с помощью 100 мкл/лунку 0,1 мкг/мл F(ab') <hk> POD (фирма Biozol, номер в каталоге 206005) в 2% БСА 0,1% Tween 20 в качестве выявляемого антитела в течение 1 ч на встряхивателе для микропланшетов для титрования при комнатной температуре. Несвязанное выявляемое антитело трижды промывают 300 мкл/лунку ФСБТ и связанное выявляемое антитело обнаруживают добавлением 100 мкл ABTS/лунку. Поглощение определяют на спектрофотометре Tecan Fluor при волне измерения 405 нм (контрольная длина волны 492 нм).

Связывание ANG-2 методом BIACORE

Связывание антител с антигеном, например, ANG-2 человека исследуют с помощью поверхностного плазмонного резонанса, используя прибор BIACORE Т100 (фирма GE Healthcare Biosciences АВ, Упсала, Швеция). Вкратце, для измерения сродства козьи <hIgG-Fcgamma> поликлональные антитела иммобилизуют на чипе СМ5 через аминную связь для презентации антител против ANG-2 человека (фиг.6Б). Связывание измеряют в буфере HBS (HBS-P (10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 0,005% Tween 20, ph 7,4), 25°С. Очищенный антиген ANG-2-His (фирма R&D systems или очистка произведена собственными силами) добавляют в раствор в разных концентрациях - от 6,25 нМ до 200. Ассоциацию измеряют закаливанием ANG-2 в течение 3 мин; диссоциацию измеряют промыванием поверхности чипа буфером HBS в течение 3 мин и величину KD оценивают, используя модель связывание Лэнгмюра 1:1. Из-за гетерогенности препарата ANG-2 нельзя наблюдать связывание 1:1; таким образом, величины KD представляют только примерные оценки. Данные по отрицательному контролю (например, кривые буфера) вычитают из кривых образцов для коррекции смещения системного исходного уровня и для уменьшения шума сигнала. Для анализа сенсограмм и для подсчета сродства применяют программное обеспечение Biacore Т100 Evaluation Software, версия 1.1.1. В другом варианте антиген Ang-2 может быть захвачен с уровнем захвата 2000-1700 КЕ через PentaHis антитело (PentaHis-Ab без БСА, фирма Qiagen, номер в каталоге 34660), которое иммобилизуют на чипе СМ5 через аминную связь (без БСА) (см. ниже).

Подавление связывания huANG-2 с Tie-2 (ELISA)

Взаимодействие методом ELISA проводят в 384-луночных планшетах для микротитрований (фирма MicroCoat, DE, номер в каталоге 464718) при комнатной температуре. После каждой стадии инкубирования планшеты промывают трижды буфером ФСБТ. Планшеты ELISA покрывают 0,5 мкг/мл белка Tie-2 (фирма R&D Systems, Великобритания, номер в каталоге 313-TI) в течение по меньшей мере 2 ч. Затем лунки блокируют ФСБ, обогащенным 0,2% Tween-20 и 2% БСА (фирма Roche Diagnostics GmbH, DE) в течение 1 ч. Разведения очищенных антител в ФСБ инкубируют вместе с 0,2 мкг/мл ангиопоэтином-2 человека (фирма R&D Systems, Великобритания, номер в каталоге 623-AN) в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывания смесь 0,5 мкг/мл биотинилированного анти-ангиопоэтин-2 клона ВАМ0981 (фирма R&D Systems, Великобритания) и разведенного 1:3000 стрептавидина HRP (фирма Roche Diagnostics GmbH, Делавэр, номер в каталоге 11089153001) добавляют на 1 ч. Затем планшеты промывают 6 раз с помощью ФСБТ. Планшеты обрабатывают свежеприготовленным реагентом ABTS (фирма Roche Diagnostics GmbH, Делавэр, буфер #204 530 001, таблетки #11112422001) в течение 30 мин при комнатной температуре. Поглощение измеряют при 405 нм. Связывание ANG-2-VEGF методом ELISA

Связывающие свойства четырехвалентных антител (TvAb) оценивают методом ELISA с иммобилизованным полной длины белком VEGF165-His (фирма R&D Systems) и белком ANG-2-His человека (фирма R&D Systems) для выявления связанного биспецифического антитела (фиг.7). Только биспецифическое антитело <VEGF-ANG-2> TvAb способно одновременно связываться с VEGF и ANG-2 и таким образом связывает два антигена, хотя моноспецифические «стандартные» IgG1 антитела не могут одновременно связываться с VEGF и ANG-2 (фиг.7).

Для этого улучшенные прозрачные планшеты для микротитрований из полистерола Falcon покрывают 100 мкл 2 мкг/мл рекомбинантного VEGF 165 человека (фирма R&D Systems) в ФСБ в течение 2 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4°С. Лунки промывают трижды 300 мкл ФСБТ (0,2% Tween 20) и блокируют 200 мкл 2% БСА 0,1% Tween 20 в течение 30 мин при комнатной температуре и затем промывают трижды 300 мкл ФСБТ. По 100 мкл/лунку серийных разведений (40 пМ - 0,01 пМ) очищенного <VEGF-ANG-2> TvAb и в качестве контроля <ANG-2> антитела Маb536 и VEGF> антитела G6-31 в ФСБ (фирма Sigma) вносят в лунки и инкубируют в течение 1 ч на встряхивателе для микропланшетов для титрования при комнатной температуре. Лунки промывают трижды 300 мкл ФСБТ (0,2% Tween 20) и связанное антитело выявляют добавлением 100 мкл 0,5 мкг/мл ANG-2-His человека (фирма R&D Systems) в ФСБ. Лунки промывают трижды 300 мкл ФСБТ (0,2% Tween 20) и связанный ANG-2 выявляют 100 мкл 0,5 мкг/мл <ANG-2> mIgG1-биотин антителом (ВАМ0981, фирма R&D Systems) в течение 1 ч при комнатной температуре. Несвязанное выявляемое антитело отмывают трижды с помощью 300 мкл ФСБТ (0,2% Tween 20) и связанное антитело выявляют добавлением 100 мкл 1:2000 конъюгата стрептавидин-POD (фирма Roche Diagnostics GmbH, номер в каталоге 11089153), разведенного 1:4 в блокирующем буфере в течение 1 ч при комнатной температуре. Несвязанный конъюгат стрептавидин-POD промывают три-шесть раз 300 мкл/лунку ФСБТ (0,2% Tween 20) и связанный конъюгат стрептавидин-POD обнаруживают добавлением 100 мкл ABTS/лунку. Поглощение определяют на спектрофотометре Tecan Fluor при волне измерения 405 нм (контрольная длина волны 492 нм).

Демонстрация одновременного связывания биспецифического четырехвалентного антитела <VEGF-Ang-2> TvAb6 с VEGF-A и Ang-2 с помощью Biacore

Для дальнейшего подтверждения результатов, полученных от связывания методом ELISA, проводят дополнительное исследование для подтверждения одновременного связывания с VEGF и Ang-2, используя метод поверхностного плазмонного резонанса на приборе Biacore Т100 по приводимому ниже протоколу, и исследуют, используя программное обеспечение Т100 (Т100 Control, версия 2.01, Т100 Evaluation, версия 2.01, Т100 Kinetics Summary, версия 1.01): происходит захват Ang-2 при уровне захвата 2000-1700 КЕ в ФСБ, 0,005 об.% Tween20 подвижном буфере через PentaHis антитело (PentaHis-Ab без БСА, фирма Qiagen, номер в каталоге 34660), которое может быть иммобилизовано на чипе СМ5 соединением через аминную связь (без БСА). Буфер HBS-N является подвижным буфером при соединении, активацию проводят путем смешивания EDC/NHS. Захваченное антитело PentaHis-Ab без БСА разводят в соединяющем буфере Na ацетате, pH 4,5, с=30 мкг/мл, в итоге остающиеся активированными карбоксильные группы блокируют инъекцией 1 М этаноламина; исследуют плотности лиганда 5000 и 17000 КЕ. Ang-2 в концентрации 500 нМ захватывают антителом PentaHis-Ab при скорости тока 5 мкл/мин разводят подвижным буфером+1 мг/мл БСА. Затем <Ang-2, VEGF> биспецифическое антитело, связывающееся с Ang-2 и с VEGF, проявляют путем инкубирования с rhVEGF и формирования комплекса сэндвич. Для этого биспецифическое антитело <VEGF-Ang-2> TvAb6 связывают с Ang-2 при скорости тока 50 мкл/мин и концентрации 100 нМ, разводят подвижным буфером+1 мг/мл БСА и выявляют одновременное связывание путем инкубирования с VEGF (rhVEGF, фирма R&D-Systems, номер в каталоге 293-VE) в ФСБ+0,005 об.% Tween20 подвижном буфере при скорости тока 50 мкл/мин и концентрации VEGF 150 нМ. Время ассоциации 120 с, время диссоциации 1200 с. Регенерацию проводят после каждого цикла при скорости тока 50 мкл/мин с 2 * 10 мМ глицина Н 2,0 и времени контакта 60 с. Сенсограммы корректируют, используя обычный двойной контроль (контроль: связывание биспецифического антитела и rhVEGF для захвата молекулы PentaHisAb). Контрольную пробу для каждого Ab измеряют при концентрации rhVEGF «0». Схема анализа Biacore показана на фиг.13. Другой формат анализа Biacore показан на фиг.15.

Получение линии клеток HEK293-Tie2

Для определения интерференции антител против ангиопоэтина-2 с ANGPT2 стимулирует фосфорилирование Tie2 и связывание ANGPT2 с Tie2 на клетках получают рекомбинантную линию клеток HEK293-Tie. Вкратце, плазмида на основе pcDNA3 (RB22-pcDNA3 Торо hTie2), кодирующая Tie2 человека полной длины (SEQ ID 108) под контролем промотора CMV и маркер устойчивости к неомицину, трансфецируют, используя Fugene (фирма Roche Applied Science) в качестве реагента трансфекции в клетки НЕК293 (АТСС), и устойчивые клетки отбирают на среде DMEM 10% ФСТ, 500 мкг/мл G418. Отдельные клоны выделяют с помощью цилиндра для клонирования и затем анализируют на наличие экспрессии Tie2 методом FACS. Клон 22 идентифицируют в качестве клона с высокой и стабильной экспрессией Tie2 при отсутствии G418 (НЕК293-Tie2 клон 22). HEK293-Tie2 клон 22 затем используют для клеточных исследований: исследования индуцированного ANGPT2 фосфорилирования Tie2 и исследования связывания клеточного лиганда ANGPT2.

Исследование индуцированного ANGPT2 фосфорилирования Tie2

Подавление индуцированного ANGPT2 фосфорилирования Tie2 антителами ANGPT2 измеряют следующим образом. HEK293-Tie2 клон 22 стимулируют с применением ANGPT2 в течение 5 мин при отсутствии или наличии ANGPT2 антитела и Р-Тiе2 подсчитывают методом сэндвич ELISA. Вкратце, 2×10⁵ клеток HEK293-Tie2 клон 22 на лунку выращивают в течение ночи в 96-луночных планшетах для микротитрования, покрытых поли-О-лизином в 100 мкл DMEM, 10% ФСТ, 500 мкг/мл генетицина. На следующий день ряд титрования антител ANGPT2 получают в планшете для микротитрования (4-кратное концентрирование, конечный объем 75 мкл/лунку, повторы) и перемешивают с 75 мкл ANGPT2 (фирма R&D systems, номер в каталоге 623-AN) разведения (3,2 мкг/мл в качестве раствора 4-х кратной концентрации). Антитела и ANGPT2 предварительно инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре. 100 мкл вносят к HEK293-Tie2 клон 22 клетки (предварительно инкубированные в течение 5 мин с 1 мМ NaV304, фирма Sigma, номер в каталоге S6508) и инкубируют в течение 5 мин при 37***С. Затем клетки промывают 200 мкл ледяного ФСБ+1 мМ NaV304 на лунку и лизируют добавлением 120 мкл лизирующего буфера (20 мМ Tris, pH 8,0, 137 мМ NaCl, 1% NP-40, 10% глицерин, 2 мМ EDTA, 1 мМ NaV304, 1 мМ PMSF и 10 мкг/мл апротинина) на лунку на льду. Клетки лизируют в течение 30 мин при 4***С на встряхивателе для микропланшетов для титрования при комнатной температуре и 100 мкл лизата переносят непосредственно в планшет для микротитрования p-Tie2 ELISA (фирма R&D Systems, R&D #DY990) без предварительного центрифугирования и без определения суммарного белка. Количества P-Tie2 подсчитывают по инструкциям производителя и величины IC50 по подавлению определяют, используя подключение XLfit4 анализа для Excel (один участок доза-ответ, модель 205). Величины IC50 могут сопоставляться в рамках эксперимента, но могут варьировать от эксперимента к эксперименту.

Анализ пролиферации клеток HUVEC, индуцированной VEGF

Выбирают пролиферацию индуцированных VEGF клеток HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cells, фирма Promocell, номер в каталоге С-12200) для измерения клеточной функции антител против VEGF. Вкратце, 5000 клеток HUVEC (клетки получены не более чем в пятом пересеве) на лунку 96-луночного планшета инкубируют в 100 мкл голодной среды ЕВМ-2 (эндотелиальной основной среды 2 - Endothelial basal medium 2, фирма Promocell, номер в каталоге С-22211, 0,5% ФСТ, пенициллин/стрептомицин) в 96-луночном планшете для микротитрований с покрытием коллагеном I BD Biocoat Collagen I (BD, номер в каталоге 354407 / 35640) в течение ночи. Варьирующие концентрации антитела смешивают с rhVEGF (30 нг/мл конечная концентрация, BD # 354107) и предварительно инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре. Затем смесь добавляют к клеткам HUVEC и инкубируют в течение 72 ч при 37°С в атмосфере 5% СО₂. В день проведения анализа планшет выравнивают до комнатной температуры в течение 30 мин и выживаемость клеток/пролиферацию определяют, используя набор для анализа выживаемости клеток по люминесценции CellTiter-GloTM по рекомендации производителя (фирма Promega, номер в каталоге G7571/2/3). Люминесценцию определяют на спектрофотометре.

Конструирование четырехвалентных биспецифических и четырехвалентных моноспецифических антител

Биспецифические антитела, связывающие VEGF (VEGF-A) и ANG-2 (ангиопоэтин-2) по настоящему изобретению, включают первый сайт связывания антигена, который связывается с VEGF, и второй сайт связывания антигена, который связывается с ANG-2. Могут применять в качестве первого сайта связывания антигена, связывающегося с VEGF, например, вариабельный домен тяжелой цепи SEQ ID NO:23, и вариабельные домены легкой цепи последовательности SEQ ID NO:24, которые оба происходят от полученного фаговым дисплеем анти-VEGF антитела человека G6-31, подробно описанного Liang W.C. и др., J Biol Chem. 281(2), 2006, сс.951-961, и в US 2007/0141065. В другом варианте, например, второй сайт связывания антигена, специфически связывающийся с VEGF, включает вариабельные домены тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO:7 или SEQ ID NO:100, и вариабельные домены легкой цепи последовательности SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:101 от анти-VEGF антител <VEGF> бевацизумаб и <VEGF> B20-4.1., предпочтительно от <VEGF> бевацизумаб.

Могут применяться в качестве второго сайта связывания антигена представленные вариабельные домены тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO:31 и вариабельные домены легкой цепи последовательности SEQ ID NO:32 или SEQ ID NO:32 с мутациями T92L, H93Q и W94T (нумерация по Kabat), которые все происходят от анти-ANG-2 антитела человека <ANG-2> Mab536, подробно описанного Oliner J. и др., Cancer Cell. 6(5), 2004, сс.507-516, и в US 2006/0122370. В другом варианте, например, второй сайт связывания антигена, специфически связывающийся с ANG-2, включает вариабельные домены тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:84 или SEQ ID NO:92, и вариабельные домены легкой цепи последовательностей SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:93 от aHTH-ANG-2 антител <ANG-2> Ang2s_R3_LC03, <ANG-2> Ang2i_LC06, <ANG-2> Ang2i_LC07, <ANG-2> Ang2k_LC08, <ANG-2> Ang2s_LC09, <ANG-2> Ang2i_LC10 или <ANG-2> Ang2k_LC11, предпочтительно от <ANG-2> Ang2i_LC06 или <ANG-2> Ang2k_LC08.

Для получения агентов, сочетающих свойства обоих антител, конструируют новые белки, производные от четырехвалентного биспецифического антитела. В этих молекулах рекомбинантные одноцепочечные связывающие молекулы одного антитела соединены методами гибридизации через рекомбинантный белок с другим антителом, которое сохраняется в формате IgG1 полной длины. Это второе антитело является носителем требуемой второй связывающей специфичности.

Методами молекулярной биологии по генному синтезу и по рекомбинации молекул вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и вариабельный домен легкой цепи (VL) соответствующего антитела связаны глицином-серином (G4S)3 или (G4S)4 одноцепочечным линкером для получения одноцепочечного фрагмента Fv (single chain Fv - scFv), который присоединяют к С-концу тяжелой цепи другого антитела, используя (G)6- или (G4S)3-линкер.

Кроме того, остатки цистеина интродуцируют в VH (включая положение 44 по Kabat) и VL (включая положение! 00 по Kabat) домен фрагмента scFv, связывающийся с ANG-2 или VEGF согласно описанному ранее (например WO 94/029350; Reiter, Y. и др., Nature biotechnology, 1996, сс.1239-1245; Young N.M. и др, FEBS Letters, 1995, сс.135-139; Rajagopal V. и др., Protein Engineering, 1997, сс.1453-1459).

Все эти молекулы получают рекомбинацией, очищают и описывают и оценивают экспрессию белка, стабильность и биологическое действие.

Краткое описание конструкций биспецифических антител, используемых для получения четырехвалентных биспецифических <VEGF-ANG-2> , <ANG-2-VEGF> антител и четырехвалентных моноспецифических <ANG-2> антител, приводят в табл.3. В настоящем изобретении используют обозначение «TvAb» для описания различных четырехвалентных белков.

Для получения биспецифических четырехвалентных антител <VEGF-ANG-2> TvAb5 и TvAb6 одноцепочечный фрагмент Fv (scFv), связывающийся с ангиопоэтином-2, который является производным от вариабельного домена тяжелой цепи (VH) последовательности SEQ ID NO:31, и вариабельный домен легкой цепи (VL) последовательности SEQ ID NO:32 с мутациями T92L, H93Q и W94T, который является производным от aHTH-ANG-2 антитела человека <ANG-2> Маb536, гибридизируют с последовательностью, соответствующей С-концу вектора тяжелой цепи анта-VEGF антитела человека <VEGF> G6-31 последовательности SEQ ID NO:23 и совместно экспрессируют с соответствующим вектором экспрессии легкой цепи, основанным на последовательности SEQ ID NO:24. Созданные конструкции представлены на фиг.1Б и перечислены в табл.3.

Для получения биспецифических четырехвалентных антител TvAb9 и TvAb 15 одноцепочечный фрагмент Fv (scFv), связывающийся с VEGF, который является производным от вариабельного домена тяжелой цепи (VH) последовательности SEQ ID NO:23, и вариабельный домен легкой цепи (VL) последовательности SEQ ID NO:24, который является производным от анти-VEGF антитела человека <VEGF> G6-31, гибридизируют с С-концом вектора тяжелой цепи aHTH-ANG-2 антитела человека <ANG-2> Mab536 последовательности SEQ ID NO:31 и совместно экспрессируют с соответствующим вектором экспрессии легкой цепи, основанным на последовательности SEQ ID NO:32. Созданные конструкции представлены на фиг.1Б и перечислены в табл.3.

Конструкции TvAb основаны, например, на:

а) аа) анти-VEGF антителе человека <VEGF> G6-31 и аб) двух одноцепочечных фрагментах Fv (scFv), связывающихся с ангиопоэтином-2, которые являются производными от вариабельного домена тяжелой цепи (VH) последовательности SEQ ID NO:31 и вариабельного домена легкой цепи (VL) последовательности SEQ ID NO:32 с мутациями T92L, H93Q и W94T, которые связаны с С-концом тяжелой цепи анти-VEGF антитела <VEGF> G6-31 (SEQ ID NO:23); или

б) ба) aHTH-ANG-2 антителе человека <ANG-2> Mab536 и бб) двух одноцепочечных фрагментах Fv (scFv), связывающихся с VEGF, которые являются производными от вариабельного домена тяжелой цепи (VH) последовательности SEQ ID NO:23 и вариабельного домена легкой цепи (VL) последовательности SEQ ID NO:24, которые связаны с С-концом тяжелой цепи aHTH-ANG-2 антитела <ANG-2> Маb536 (SEQ ID NO:31); или двух одноцепочечных фрагментах Fv (scFv), связывающихся с ангиопоэтином-2, которые являются производными от вариабельного домена тяжелой цепи (VH) последовательности SEQ ID NO:52 или последовательности SEQ ID NO:68, и вариабельного домена легкой цепи (VL) последовательности SEQ ID NO:53 или последовательности SEQ ID NO:69, которые связаны с С-концом тяжелой цепи анти-VEGF антитела <VEGF> бевацизумаба (авастина) (последовательностями получаемого гибридного пептида являются последовательности SEQ ID NO:102 или SEQ ID NO:103, которые совместно экспрессируются с легкой цепью бевацизумаба последовательности SEQ ID NO:104. (В другом варианте два одноцепочечных фрагмента Fv (scFv), связывающихся с ангиопоэтином-2, также могут быть связаны с С-концом легкой цепи или N-концом тяжелой цепи).

В другом варианте наряду с двумя одноцепочечными фрагментами Fv (scFv) также используют одноцепочечные фрагменты Fab согласно описанному выше (используя пептидные коннекторы для гибридизации с С- или N-концом), в патентной заявке ЕР Appl. No 09004909.9 и в примере 10.

Пример 1. Экспрессия и очистка биспецифических четырехвалентных антител <VEGF-ANG-2>, а именно TvAb5, TvAb6, TyAb-2441-бевацизумаб-LC06 и TvAb-2441-бевацизумаб -LC08

Легкие и тяжелые цепи соответствующих четырехвалентных биспецифических антител TvAb5 и TvAb6 конструируют в геномных векторах экспрессии, согласно описанному выше. Плазмиды амплифицируют в Е.coli, очищают и затем трансфецируют для временной экспрессии рекомбинантных белков в клетках HEK293-F (используя систему FreeStyle 293 фирмы Invitrogen). Через 7 суток супернатанты клеток НЕК 293-F собирают, фильтруют и очищают биспецифические антитела с помощью белка А и эксклюзионной хроматографии. Гомогенность всех конструкций биспецифических антител подтверждают методом SDS-PAGE в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях и с помощью аналитической эксклюзионной хроматографии. В условиях восстановления (фиг.3) полипептидные тяжелые цепи антитела <VEGF-ANG-2> TvAb6, несущие С-концевой гибрид scFv, четко показывают методом SDS-PAGE размеры молекул примерно 75 кДа, близкие к расчетным молекулярным массам. Масс-спектрометрия подтверждает идентичность очищенных конструкций антител. Уровни экспрессии всех конструкций, проанализированные ВЭЖХ с белком А, сходны с выходами продуктов экспрессии «стандартных» IgG. Уровни продуктивности белка составляют до 150 мг TvAb6 <VEGF-ANG-2> на литр супернатанта культуры клеток согласно определению методом ВЭЖХ с белком А.

Анализ методом эксклюзионной хроматографии очищенной, не стабилизированной дисульфидом конструкции TvAb5 с С-концевым гибридизированным фрагментом scFv к тяжелой цепи при сравнении со «стандартными» IgG показывает повышенную тенденцию к дополнительному агрегированию после очистки мономерного антитела путем эксклюзионной хроматографии (феномен так называемой «гирляндной цепи»). Эти данные подтверждают другие примеры (Rajagopal V. и др., Prot. Engin., 1997, сс.1453-1459; Kobayashi Н. и др, Nucl Med Biol., 1998, сс.387-393, или Schmidt М. и др, Oncogene 18,1999, сс.1711-1721), показывающие, что молекулы, которые содержат scFvs, не стабилизированные внутрицепочечными дисульфидными связями между VH и VL, проявляют повышенную тенденцию к агрегированию и пониженную продуктивность. Чтобы принять меры в связи с агрегированием таких биспецифических антител, используют стабилизированные дисульфидной связью части молекулы scFv. Для этого внедряют одноцепочечные замещения цистеина в VH и VL фрагмента scFv по определенным положениям (положения VH44/VL100 по схеме нумерации Kabat). Эти мутации способны формировать стабильные внутрицепочечные дисульфидные связи между VH и VL, которые в свою очередь стабилизируют получаемый модуль scFv, стабилизированный дисульфидной связью. Интродукция дисульфидов VH44/VL100 в scFv по С-концу Fv в антителе TvAb6 <VEGF-ANG-2> приводит к стабильному четырехвалентному антителу, которое не проявляет больше тенденции к агрегированию после очистки и остается в мономерном состоянии (фиг.4). Кроме того, TvAb6 <VEGF-ANG-2> не показывает повышения тенденции к агрегированию при повторяющихся циклах замораживания-оттаивания, например, при концентрации, применяемой in vitro и in vivo 3 мг/кг.

Все другие молекулы TvAb, описанные в табл.3 (например, TvAb-2441-бевацизумаб-LC06 и TyAb-2441-бевацизумаб-LC08), получают и описывают аналитически, аналогично описанной процедуре.

Пример 2. Одновременное связывание биспецифического четырехвалентного антитела <VEGF-ANG-2> TvAb6, TvAb-2441-бевацизумаб-LC06 и TyAb-2441-бевацизумаб-LC08 с VEGF-А и ANG-2

Связывание модулей scFv и фрагментов Fv, сохраняемых в IgG-модуле разных форматов биспецифических антител, сравнивают со связыванием IgG «дикого типа», от которых связывающие модули и биспецифические антитела являются производными. Исследования проводят в эквимолярных концентрациях путем проведения биохимических связываний ELISA и методом поверхностного плазмонного резонанса (фирма Biacore).

Для <VEGF-ANG-2> TvAb6 показано, что путем связывания VEGF методом ELISA, согласно описанному выше, что оно связывается с VEGF сопоставимо с его исходным антителом G6-31 при эквимолярной концентрации 0,625 пМ (фиг.5). Этот результат можно было предвидеть, поскольку область Fv антитела TvAb идентична соответствующей области у антитела G6-31. Небольшое отличие между <VEGF-ANG-2> TvAb6 и <VEGF> G6-31 имеется из-за небольших различий в концентрации белка и небольшой стерической интерференции С-концевого scFv со связыванием выявляемого <hFc> -POD антитела и может быть преодолено путем применения <hk> POD (фирма Biozol, номер в каталоге 206005) выявляемого антитела, используемого для связывания ANG-2 методом ELISA.

С помощью Biacore подтверждают эти данные, используя классические серийные разведения при 37°С (фиг.11). Эти данные показывают быстрые Коn-скорости k(а), составляющие 4,7-4,8×10⁶ 1/(мс), насыщение достигается при наивысших концентрациях VEGF. Koff-скорости достигают пределов технического описания (т.е. 5×10⁶ (с/с), вероятно, из-за двухвалентного связывания (эффекта авидности) в данных условиях в качестве результата димерного исследуемого соединения rhVEGF, хотя используют очень низкую плотность лиганда, приводящую в итоге к VEGF-ответу 10-15 КЕ. Тем не менее, кинетические константы разных <VEGF> антител могут быть сопоставлены этим методом и в пределах ошибки метода нет существенной разницы в кинетических константах выявляемого четырехвалентного биспецифического антитела <VEGF-Ang-2> TvAb6 и исходного антитела <VEGF> G6-31. Кинетические константы <VEGF-Ang-2> TvAb6 и <VEGF> G6-31 в этих условиях были практически идентичными по этому методу. Таким образом, можно сделать вывод, что TvAb6 полностью сохраняет способность связывать VEGF. Табл.4 показывает соответствующие кинетические константы и фиг.12 показывает кинетические признаки двух <VEGF> антител <VEGF-Ang-2> TvAb6 и <VEGF> G6-31 на плоте Ka-Kd.

Таблица 4
Кинетические свойства антител <VEGF-Ang-2> TvAb6 и <VEGF> G6-31
Измерение при 37°С	Ка	kd	t1/2	KD
Антитела	[1/(мсек)]	Г1/сек1	[мин]	[М]
<VEGF> G6-31	4,83Е+06	9.33Е-06	1237,8	1,93Е-12
<VEGF-Ang-2> TvAb6	4,72Е+06	7,24Е-06	1596,7	1,53Е-12

В другом эксперименте было показано связывание ANG-2 методом ELISA, используя <hk> - POD выявляемое антитело (фирма Biozol, номер в каталоге 206005), согласно описанному выше, что антитело <VEGF-ANG-2> TvAb6 связывает ANG-2 таким способом, который сопоставим со связыванием МаЬ536 в эквимолярной концентрации 0,039 пМ (фиг.6А). Из этого следует, что модуль scFv антитела TvAb6 сохраняет связывающие свойства в конструкции TvAb.

Для дальнейшего подтверждения этих результатов антитела <ANG-2> Mab536 и <VEGF-ANG-2> TvAb6 иммобилизуют вторичным антителом на чипе Biacore СМ5 и определяют кинетику связывания с ANG-2 человека. Из-за гетерогенности препарата ANG-2 нельзя наблюдать связывания 1:1; величины KD, таким образом, определяют только относительно. Анализ Biacore показывает, что антитело <VEGF-ANG-2> TvAb6 обладает определенной величиной KD 4,4 нМ для ANG-2. При сравнении Маb536 обладает определенной величиной KD 1,6 нМ. В рамках погрешности метода нет видимых отличий в типе связывания и сродстве между <ANG-2> Mab536 и <VEGF-ANG-2> TvAb6 (фиг.6Б). Таким образом, может быть сделан вывод, что модуль scFv в TvAb6 полностью сохраняет свои связывающие свойства в конструкции TvAb.

Чтобы подтвердить, что антитело <VEGF-ANG-2> TvAb6 способно одновременно связывать VEGF и ANG-2, используют анализы связывания ELISA Biacore, описанные выше.

С помощью анализа связывания VEGF-ANG-2 методом ELISA, описанного выше, показано, что только антитело <VEGF-ANG-2> TvAb6 способно связывать одновременно VEGF и ANG-2 при эквимолярной концентрации 0,625 пМ, а моноспецифические «стандартные» антитела IgGl <ANG-2> Mab536 и <VEGF> G6-31 не могут одновременно связывать VEGF и ANG-2 (фиг.7).

Фиг.14 показывает соответствующие данные, полученные методом Biacore. Одновременное связывание обоих антигенов, Ang-2 и VEGF, может быть показано для четырехвалентного биспецифического антитела <VEGF-Ang-2> TvAb6. Отрицательные контроли соответствуют ожидаемым: моноспецифическое антитело <Ang-2> Mab536 проявляет только связывание с Ang-2, не связывание с VEGF. Моноспецифическое антитело <VEGF> G6-31 проявляет связывание с VEGF, но совсем не связывается с Ang-2 (данные не представлены). По величинам относительного ответа четырехвалентного биспецифического антитела <VEGF-Ang-2> TvAb6, связывающегося с покрытой Ang-2 поверхностью, и последующего связывания с димерным VEGF связыванием стехиометрия может быть вычислена в диапазоне от 1:1 до 1:1,4. Взятые вместе применяемые исследования описанными методами ELISA и Biacore показали, что только антитело <VEGF-Ang-2> TvAb6 способно связываться одновременно с VEGF и Ang-2, причем моноспецифические «стандартные» IgG1 антитела <Ang-2> Mab536 и <VEGFY G6-31 не могут одновременно связывать VEGF и Ang-2 (фиг.15).

Схожие результаты, полученные с конструкциями TvAb-2441-бевацизумаб-LC06 и TyAb-2441-бевацизумаб-ЕС08 в аналогичном исследовании Biacore, показаны на фиг.15А. Связывание антител с антигеном, например ANG-2 и VEGF человека, исследуют поверхностным плазмонным резонансом, используя прибор BIACORE Т100 (фирма GE Healthcare Biosciences АВ, Упсала, Швеция). Вкратце, для измерений сродства козьи <hIgG-FcD> поликлональные антитела иммобилизуют на чипе СМ4 через соединение с амином для презентации биспецифических антител против ANG-2 и VEGF человека. Связывание измеряют в буфере HBS (HBS-P (10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 0,005% Tween 20, ph 7,4), 25°С. Очищенный ANG-2-His (фирма R&D systems или очищенный самостоятельно) вносят в разных концентрациях, от 6,25 нМ до 200 нМ, в раствор. Ассоциацию измеряют путем ANG-2-инъекции в течение 3 мин; диссоциацию измеряют путем промывания поверхности чипа буфером HBS в течение 3 мин и величину KD оценивают, используя модель связывание Лэнгмюра 1:1. Из-за гетерогенности препарата ANG-2 не наблюдают связывания 1:1; таким образом, величины KD определены только примерно.

VEGF (фирмы R&D systems) вносят в разных концентрациях от 6,25 нМ до 200 нМ в раствор. Ассоциацию измеряют путем VEGF -инъекции в течение 3 мин; диссоциацию измеряют путем промывания поверхности чипа буфером HBS в течение 3 мин и величину KD оценивают, используя модель связывание Лэнгмюра 1:1.

Порядок инъекции связывающих компонентов может быть изменен, сначала VEGF и затем Ang2, или наоборот.

Данные по отрицательному контролю (например, кривые буфера) вычитают из кривых образцов для коррекции смещения системного исходного уровня и для уменьшения шума сигнала. Используют Biacore Т100 Evaluation Software version 1.1.1 для анализа сенсограмм и для подсчета данных по сродству.

Антитело	Сродство hAng-2	Сродство hVEGF
TvAb-2441-бевацизумаб-LC06	2,3 нМ	0,35 нМ
TvAb-2441-бевацизумаб-LC08	0,7 нМ	0,34 нМ
G6-31	-	<0,1 нМ
МАb536	3 нМ	-
бевацизумаб	-	0,59 нМ

В итоге одновременное связывание TvAb-2441-бевацизумаб-LC06 и TvAb-2441-бевацизумаб-LС08 может быть показано путем последовательной инкубации с ANGPT2 и VEGF. На фиг.15Б показано, что ANGPT2 и VEGF могут быть одновременно связаны биспецифическими антителами.

Пример 3. In vivo эффективность стабилизированного дисульфидной связью биспецифического четырехвалентного антитела <VEGF-ANG-2> TvAb6 в сравнении с <ANG-2> Mab536 <VEGF> G6-31 и комбинацией Маb536 и G6-31 на ступенчатой подкожной модели подкожной ксенотрансплантации Соlо205 бежевых мышей линии Scid

Очищенное стабилизированное дисульфидной связью антитело <VEGF-ANG-2> TvAb6 (п00,2331 см. табл.3) сравнивают с антителами <ANG-2> Mab536, <VEGF> G6-31 и комбинацией антител <ANG-2> Mab536 и <VEGF> G6-31 в двухстадийных исследованиях на модели подкожной ксенотрансплантации Colo205 (Ang2_PZ_Colo205_003 и Ang2_PZ_Colo205_005) самок бежевых мышей линии Scid в разных дозах.

Антитела: <ANG-2> Маb536 получают в виде замороженного исходного раствора (с=4,5 мг/мл), <VEGF> G6-31 получают в виде замороженного раствора (с=0,6 мг/мл) и <VEGF-ANG-2> TvAb6 получают в виде замороженного исходного раствора (с=0,5 мг/мл) в 20 мМ гистидине, 140 мМ NaCl, pH 6,0. Раствор антитела разводят соответствующим образом в ФСБ из исходного раствора при необходимости перед инъекцией, а ФСБ используют в качестве растворителя.

Линии клеток и условия культивирования: клетки колоректального рака человека первоначально получают из коллекции АТСС и затем депонируют во внутреннем банке клеток фирмы Roche Penzberg. Линию раковых клеток обычным образом культивируют в среде RPMI-1640 (PAA, Laboratories, Австрия), обогащенной 10% фетальной сывороткой теленка (РАА Laboratories, Австрия) и 2 мМ L-глутамином, при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% СO₂. Пассажи со 2 по 5 используют для трансплантации.

Животные

Самок бежевых мышей линии SCID; возраст 4-5 недель на момент поставки (фирма Charles River, Германия) поддерживают в специфических условиях, исключающих наличие патогенов, при суточных циклах 12 ч света/12 ч темноты по установленным правилам (GV-Solas; Felasa; TierschG). Протокол исследования рассматривает и утверждает местный орган власти. После поставки животных содержат в условиях карантина в течение одной недели, чтобы они привыкли к новым условиям содержания и для наблюдения за ними. Постоянный мониторинг состояния здоровья животных проводят на регулярной основе. Диетическое питание (Provimi Kliba 3337) и воду (закисленную до pH 2,5-3) предоставляют по потребности. Возраст мышей в начале исследования составляет примерно 10 недель.

Мониторинг

У животных ежедневно осматривают проявление клинических симптомов и выявляют побочные эффекты. На протяжении мониторинга массу тела животных записывают и замеряют циркулем объем опухоли после определения стадии заболевания.

Инъекция опухолевых клеток

В день инъецирования клетки Соlо205 центрифугируют, однократно промывают и ресуспендируют в ФСБ. После дополнительного промывания в ФСБ определяют концентрацию клеток и размер клеток, используя счетчик клеток и систему анализа (Vi-CELL, фирма Beckman Coulter). Для инъекции клеток Соlо205 конечный титр доводят до 5,0×10Е⁷ клеток/мл, выживаемость примерно 90%. Затем 100 мкл такой суспензии, соответствующей 2,5×10⁶ клеток на животное, вводят инъекцией подкожно в правый бок мыши.

Лечение животных начинают в день рандомизации, через 16 суток после трансплантации клеток (исследование Ang2_PZ_Colo205_003) и через 14 суток после трансплантации клеток (исследование Ang2_PZ_Colo205_005) при среднем объеме опухоли 100 мм или 150 мм соответственно.

Схема дозирования до 74 суток (см. фиг.8А) исследования Ang2_PZ_Colo205_003:

В исследовании Ang2_PZ_Colo205_003 антитело <VEGF-ANG-2> TvAb6 по ошибке было взято в меньшей дозе, чем требовалось для эквимолярного соотношения. Дозу антитела <VEGF-ANG-2> TvAb6 выверили в исследовании Ang2_PZ_Colo205_005 таким образом, что животные получили в эквимолярном соотношении антитело <VEGF-ANG-2> TvAb6, связывающее сайты ANG-2 и VEGF, и комбинацию антител <VEGF> G6-31 и <ANG-2> Mab536.

Подавление роста опухоли на 74 сутки (см. фиг.8А) в исследовании Ane2 PZ Соlо205 003:

Антитело <VEGF-ANG-2> TvAb6 в дозе 7 мг/кг проявляет эффективность, сопоставимую с эффективностью комбинации <VEGF> G6-31 в количестве 5 мг/кг и <ANG-2> Mab536 в количестве 6 мг/кг и <VEGF> G6-31 в качестве отдельного агента в дозе 6 мг/кг (фиг.8А), а также превосходит отдельный агент <ANG-2> Mab536 в дозе 6 мг/кг. Поскольку модель Соlo205 подкожного введения высоко чувствительна к <VEGF> G6-31 антителу, которое блокирует VEGF и человека, и мыши, что приводит почти к полному подавлению роста опухоли, антитело <VEGF-ANG-2> TvAb6 таким образом не может быть отличимо от G6-31 в качестве единственного агента (6 мг/кг) в выбранных условиях эксперимента, хотя антитело <VEGF-ANG-2> TvAb6 проявляет сопоставимое ингибирование с ингибированием комбинацией <ANG-2> Mab536 и <VEGF> G6-31 в очевидно меньшей кумулятивной дозе ( <VEGF-ANG-2> TvAb6=56 мг/кг антитело по сравнению с комбинацией <ANG-2> Mab536 и <VEGF> G6-31=40+48=88 мг/кг антитело).

Схема дозирования на 63 сутки в исследовании Ang2_PZ_Colo205_005:

Подавление роста опухоли на 63 сутки в исследовании Ang2 PZ Colo205 005:

Антитело <VEGF-ANG-2> TvAb6 в дозе 4 мг/кг проявляет эффективность, сопоставимую с эффективностью комбинации антител <VEGF> G6-31 и <ANG-2> Маb536 в количестве 3 мг/кг каждого (фиг.8Б). Это первый пример, показывающий, что в меньшей дозе (относительно суммарной концентрации антитела - кумулятивная доза комбинации составляет 21+21=42 мг/кг против 28 мг/кг биспецифического антитела TvAb6) биспецифическое антитело, нацеливающееся на VEGF и ANG-2, может привести к более сильному противоопухолевому эффекту по сравнению с комбинацией соответствующих отдельных агентов, блокирующих VEGF и ANG-2, и превосходит каждый отдельный агент.

Пример 4. Блокирование формирования трубок, индуцированного VEGF

Для подтверждения, что действия, связанные с анти-VEGF, сохраняются у биспецифического четырехвалентного антитела <VEGF-ANG-2> TvAb6, в анализе индуцированного VEGF формирования трубок AngioKit TCS CellWorks (фирма CellSystems) показано, что антитело <VEGF-ANG-2> TvAb6, опосредующее доза-зависимое подавление формирования трубок, сопоставимо с моноспецифическим антителом <VEGF> G6-31. Исследование AngioKit TCS CellWorks проводят по следующей процедуре: клетки стимулируют каждый раз с помощью 2 нг/мл VEGF до лечения антителами на 1, 4, 7 и 9 сутки. Сосудистые трубки визуализируют окрашиванием эндотелиальных клеток, используя антитело CD31-PE (фирма BD Pharmingen, номер в каталоге 555446) на 11 сутки.

Изображения получают с 4-х кратным увеличением по длине трубок и число точек ветвления подсчитывают, используя модуль Angiogenesis Tube Formation Application в программе MetaMorph (фирма Molecular Devices). Величины и стандартные отклонения подсчитывают с помощью дублетов и анализа 4 изображений на образец. Фиг.9 показывает соответствующие результаты, а на фиг.10А и 10Б представлен количественный анализ. Ангиопоэтин-2 не влияет на формирование трубок, и, таким образом, в этом исследовании не рассматривают подавление ANG-2. Эти данные показывают, что биспецифическое антитело <VEGF-ANG-2> TvAb6 и моноспецифическое антитело <VEGF> G6-31 равно эффективны в подавлении формирования трубок, индуцированного VEGF.

Пример 5. Фосфорилирование Tie2

Для подтверждения, что активности, связанные с aHra-ANGPT2, сохраняются у биспецифических четырехвалентных <VEGF-ANGPT2> антител TyAb-2441-бевацизумаб-LС06 и TyAb-2441-бевацизумаб-LC08, было показано, что TyAb-2441-бевацизумаб-LС06 и TyAb-2441-бевацизумаб-LC08 взаимодействуют со стимулируемым ANGPT2 фосфорилированием Tie2 наподобие материнских клонов LC06 и LC08 в исследовании стимулируемого ANGPT2 фосфорилирования Tie2 согласно описанному выше.

В первом эксперименте оба биспецифических антитела, TvAb-2441-бевацизумаб-LC06 и TyAb-2441-бевацизумаб-LC08, показывают доза-зависимую интерференцию со стимулируемым ANGPT2 фосфорилированием Tie2 с величинами IC50, сопоставимыми с соответствующими величинами материнских клонов LC06 и LC08, согласно представленному на фиг.16А. Антитело TvAb-2441-бевацизумаб-LC06 интерферирует со стимулируемым ANGPT2 фосфорилированием Tie2 с величиной IC50 примерно 721 нг/мл, хотя LC06 интерферирует со стимулируемым ANGPT2 фосфорилированием Tie2 с величиной IC50 примерно 508 нг/мл. Антитело TyAb-2441-бевацизумаб-LC08 интерферирует со стимулируемым ANGPT2 фосфорилированием Tie2 с величиной IC50 примерно 364 нг/мл, хотя LC08 интерферирует со стимулируемым ANGPT2 фосфорилированием Tie2 с величиной IC50 примерно 499 нг/мл.

Во втором эксперименте оба биспецифических антитела TvAb-2441-бевацизумаб-LC06 и TvAb-2441-бевацизумаб-LC08 показывают доза-зависимую интерференцию со стимулируемым ANGPT2 фосфорилированием Tie2 с величинами IC50, сопоставимыми с соответствующими величинами материнских клонов LC06 и LC08, согласно представленному на фиг.16Б. Антитело TvAb-2441-бевацизумаб-LC06 интерферирует со стимулируемым ANGPT2 фосфорилированием Tie2 с величиной IC50 примерно 488 нг/мл, хотя LC06 интерферирует со стимулируемым ANGPT2 фосфорилированием Tie2 с величиной IC50 примерно 424 нг/мл. Антитело TvAb-2441-бевацизумаб-LC08 интерферирует со стимулируемым ANGPT2 фосфорилированием Tie2 с величиной IC50 примерно 490 нг/мл, хотя LC08 интерферирует со стимулируемым ANGPT2 фосфорилированием Tie2 с величиной IC50 примерно 399 нг/мл.

Вместе эти данные показывают, что биспецифические четырехвалентные <VEGF-ANGPT2> антитела TvAb-2441-бевацизумаб-LC06 и TvAb-2441-бевацизумаб-LC08 интерферируют со стимулируемым ANGPT2 фосфорилированием Tie2 подобно их материнским клонам LC06 и LC08 в пределах ошибки этого клеточного исследования.

Пример 6. Ингибирование связывания huANG-2 с Tie-2 (метод ELISA')

Анализ взаимодействия методом ELISA проводят в 384-луночных планшетах для микротитрований (фирма MicroCoat, Делавэр, номер в каталоге 464718) при комнатной температуре. После каждой стадии инкубирования планшеты промывают 3 раза с помощью ФСБТ. Планшеты ELISA покрывают 0,5 мкг/мл белка Tie-2 (фирма R&D Systems, Великобритания, номер в каталоге 313-TI) в течение по меньшей мере 2 ч. Затем лунки блокируют ФСБ, обогащенным 0,2% Tween-20 и 2% БСА (фирма Roche Diagnostics GmbH, Делавэр) в течение 1 ч. Разведения очищенных антител в ФСБ инкубируют вместе с 0,2 мкг/мл ангиопоэтина-2 человека (фирма R&D Systems, Великобритания, номер в каталоге 623-AN) в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывки смесь 0,5 мкг/мл биотинилированного анти-ангиопоэтин-2 клон ВАМ0981 антитела (фирма R&D Systems, Великобритания) и разведенного 1:3000 стрептавидина HRP (фирма Roche Diagnostics GmbH, Делавэр, Cat.No.11089153001) добавляют на 1 ч. Затем планшеты промывают 6 раз ФСБТ. Планшеты обрабатывают свежеприготовленным реагентом ABTS (фирма Roche Diagnostics GmbH, Делавэр, буфер 204530001, таблетки 11112422001) в течение 30 мин при комнатной температуре. Поглощение измеряют при 405 нм. Сводка данных по взаимодействию с Ang2 (метод ELISA)

<VEGF-ANG-2> биспецифическое антитело (или моноспецифические исходные антитела)	AVG IC50 (нг/мл)	STDEV
	hANG2
<VEGF-ANG-2>G6_31	>20000
TvAb-2441_G6_31_Ang2i_LC06	75	39
TvAb-2441_G6_31_Ang2k_LC08	66	31
TvAb-2441 бевацизумаб LC06	44	8
TvAb-2441 бевацизумаб LC08	42	11
<ANG-2>Mab 536	15	8
<VEGF>бевацизумаб	>20000
TvAb-3421 бевацизумаб_LC06	31	1
TyAb-4421_бевацизумаб_LC06	35	17
TyAb-4461_бевацизумаб_LC06	46	10

Пример 7. Подавление связывания hVEGF с рецептором hVEGF (метод ELISA)

Анализ проводят в 384-луночных планшетах для микротитрований (фирма MicroCoat, Делавэр, номер в каталоге 464718) при комнатной температуре. После каждой стадии инкубирования планшеты промывают трижды буфером ФСБТ. Сначала планшеты покрывают 0,5 мкг/мл белка hVEGF-R (фирма R&D Systems, Великобритания, номер в каталоге 321-FL) в течение по меньшей мере 2 ч. Затем лунки блокируют в ФСБ, обогащенном 0,2% Tween-20 и 2% БСА (фирма Roche Diagnostics GmbH, Делавэр) в течение 1 ч. Разведения очищенных антител в ФСБ инкубируют вместе с 0,15 мкг/мл huVEGF121 (фирма R&D Systems, Великобритания, номер в каталоге 298-VS) в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывки добавляют на 1 ч смесь 0,5 мкг/мл анти-VEGF клон Маb923 (фирма R&D Systems, Великобритания) и 1:2000 пероксидазы хрена (HRP), конъюгированной с F(ab')2 антимышиного IgG (фирма GE Healthcare, Великобритания, номер в каталоге NA9310V). Затем планшеты 6 раз промывают ФСБТ. Планшеты обрабатывают свежеприготовленным реагентом ABTS (фирма Roche Diagnostics GmbH, Делавэр, буфер 204530001, таблетки 11112422001) в течение 30 мин при комнатной температуре. Поглощение измеряют при 405 нм.

Сводка данных по взаимодействию с VEGF (метод ELISA)

<VEGF-ANG-2> биспецифическое антитело	AVG IC50 (нг/мл)	STDEV
	VEGF
<VEGF-ANG-2> G6 31	1431	130
TvAb-2441_G6_31_Ang2i_LC06	1654	213
TvAb-2441_G6_31_Ang2k_LC08	1392	184
TvAb-2441_бевацизумаб_LC06	2831	503
TvAb-2441_бевацизумаб_ЕС08	2305	972
TvAb-<ANG-2>Mab 536	>20000
TvAb-<VEGF>бевацизумаб	1584	357
TyAb-3421_бевацизумаб_LC06	2660	284
TvAb-4421_бевацизумаб_LC06	1980	1319
TvAb-4461_бевацизумаб_LC06	1677	394

Пример 8

Пролиферация HUVEC

Для подтверждения, что активности, связанные с анти-VEGF, сохраняются у биспецифических четырехвалентных <VEGF-ANG2> антител TvAb-2441-бевацизумаб-LC06 и TvAb-2441-бевацизумаб-LC08, было показано, что TvAb-2441-бевацизумаб-LC06 и TyAb-2441-бевацизумаб-LC08 интерферируют с индуцируемой VEGF пролиферацией клеток HUVEC наподобие материнских клонов LC06 и LC08 в исследовании индуцируемой VEGF пролиферацией клеток HUVEC согласно описанному выше.

Фиг.18 показывает, что, действительно, TvAb-2441-бевацизумаб-LC06 и TvAb-2441-бевацизумаб-LC08 интерферируют зависящим от концентрации образом с индуцируемой VEGF пролиферацией клеток HUVEC сопоставимо с исходным антителом бевацизумабом.

Пример 9. Исследование методом ELISA связывания с ANG-1 человека и с ANG-2 человека

Связывание исходных <ANG-2> антител Ang2i-LC06, Ang2i-LC07 и Ang2k-LC08 с ANG-1 человека и ANG-2 человека определяют связыванием ANG-1 или ANG-2 по методу ELISA согласно описанному выше (см. сравнение связывания с ANG-1 и ANG-2 (ANG-1 и ANG-2 связывание ELISA)). Вкратце, исследование типа ELISA основано на иммобилизации ангиопоэтина-1 или -2 дикого типа человека в планшете для микротитрования. Связывание антитела, направленного против иммобилизованного ANG-1 или ANG-2, измеряют через <Fc человека> (анти-IgG) антитело с конъюгатом POD. Серийные разведения антитела <ANG-2> позволяют определить концентрацию ЕС50. В качестве контроля используют анти-ANG-2 антитело человека <ANG-2> антитело Mab536 (Oliner и др., Cancer Cell. 6(5), 2004, сс.507-516, US 2006/0122370). Определенные концентрации ЕС50 суммированы в таблице внизу.

Антитело	Связывание hANG-1 EC50	Связывание hANG-2 ЕС50
<ANG-2> MAb536	2538 нг/мл	133 нг/мл
<ANG-2> Ang2i-LC06	>8000 нг/мл	84 нг/мл
<ANG-2> Ang2i-LC07	>8000 нг/мл	3006 нг/мл
<ANG-2> Ang2i-LC08	4044 нг/мл	105 нг/мл

Все антитела специфически связываются с ANG-2. Антитела МАb536 и Ang2k-LC08 также показывают специфическое связывание с ANG-1, хотя Ang2i-LC06 и Ang2i-LC07 не связываются специфически с ANG-1, поскольку у них величина ЕС50 составляет примерно 8000 нг/мл (предел обнаружения).

Пример 10. Экспрессия и очистка молекул биспецифических, четырехвалентных с одноцепочечными Fab <VEGF-ANG-2> антител scFAb-авастин-LC06-2620, scFab-авастин-Ang2i-LC06-2640 и scFab-авастин-Ang2i-LC06-2641

Подобно процедурам, описанным в примере 1, и в разделе материалов и методов, приведенном выше, все три молекулы биспецифических, четырехвалентных с одноцепочечными Fab <VEGF-ANG-2> антител - scFAb-авастин-LC06-2620, scFab-авастин-LC06-2640 и scFab-авастин-LC06-2641, основанные на <VEGF> бевацизумабе и <ANG-2> Ang2i-LC06, экспрессируют и очищают. Связывающее сродство и другие свойства определяют согласно описанному выше в примерах. Значимые (со временем модифицированные) аминокислотные последовательности легкой и тяжелой цепей таких биспецифических антител представлены в последовательностях SEQ ID NO:109-110 (scFAb-авастин-LC06-2620), в последовательностях SEQ ID NO:111-112 (scFAb-авастин-LC06-2640) и в последовательностях SEQ ID NO:113-114 (scFAb-авастин-LC06-2641).

Основные данные	scFAb-авастин-LC06-2620	scFAb-авастин-Ang2i-LC06-2640	scFAb-авастин-LC06-Ang2i-2641
Экспрессия (продуктивность)	29 мкг/мл	27 мкг/мл	18 мкг/мл
Очистка (выход, очистка до гомогенного состояния с помощью белка А)	21 мг, 57%	19 мг, 86%	12 мг, 90%
Гомогенность после препаративной высокоэффективной эксклюзионной хроматографии (ВЭЭХ)	98%	98%	99%
Функция
Сродство hANG-2 (фирма Biacore)	1,9 Е-9 М	1,8 Е-9М	1,9 Е-9 М
Сродство hVEGF (фирма Biacore)	1 Е-10 М	1Е-10 М	1Е-10 М

Пример 11. Экспрессия и очистка молекул биспецифического. трехвалентного с одноцепочечным Fab <VEGF-ANG-2> антитела авастин-LC06-KiH-C-scFab

Подобно процедурам, описанным в примере 1 и в разделе материалов и методов, приведенном выше, молекулы биспецифического, трехвалентного с одноцепочечным Fab <VEGF-ANG-2> антитела авастин-LC06-KiH-C-scFab, основанного на <VEGF> бевацизумабе и <ANG-2> Ang2i-LC06, экспрессируют и очищают. Связывающее сродство и другие свойства определяют согласно описанному выше в примерах. Значимые (со временем модифицированные) аминокислотные последовательности легкой и тяжелой цепей таких биспецифических антител представлены в последовательности SEQ ID NO:115-117 (авастин-LC06-KiH-C-scFab).

Основные данные	Авастин-LC06-KiH-C-scFab
Экспрессия (продуктивность)	15 мкг/мл
Очистка (выход, очистка до гомогенного состояния с помощью белка А)	4,8 мг, 91%
Гомогенность после препаративной высокоэффективной эксклюзионной хроматографии (ВЭЭХ)	97%
Функция
Сродство hANG-2 (фирма Biacore)	4,4 Е-9 М

Основные данные	Авастин-LC06-KiH-C-scFab
Сродство hVEGF (фирма Biacore)	1Е-10М

Пример 12. Экспрессия и очистка молекул биспецифического трехвалентного <VEGF-ANG-2> антитела авастин-LC06-C-Fab-6CSS

Подобно процедурам, описанным в примере 1 и в разделе материалов и методов, приведенном выше, молекулы биспецифического, трехвалентного <VEGF-ANG-2> антитела авастин-LC06-C-Fab-6CSS, основанного на <VEGF> бевацизумабе и <ANG-2> Ang2i-LC06, экспрессируют и очищают. Связывающее сродство и другие свойства определяют согласно описанному выше в примерах. Биспецифические, трехвалентные молекулы антитела этого формата в общем описаны в патентной заявке ЕР Appl. No 09005108.7. Значимые (со временем модифицированные) аминокислотные последовательности легкой и тяжелой цепей таких биспецифического <VEGF-ANG-2> антитела представлены в последовательности SEQ ID NO:118-120 (авастин-LC06-C-Fab-6CSS).

Основные данные	scFAb-авастин-LC06-2620	scFAb-авастин-LC06-2640	scFAb-авастин-LC06-2641
Экспрессия (продуктивность)	29 мкг/мл	27 мкг/мл	18 мкг/мл
Очистка (выход, очистка до гомогенного состояния с помощью белка А)	21 мг, 57%	19 мг, 86%	12 мг, 90%
Гомогенность после препаративной высокоэффективной эксклюзионной хроматографии (ВЭЭХ)	98%	98%	99%
Функция
Сродство hANG-2 (фирма Biacore)	1,9Е-9М	1,8Е-9М	1,9Е-9М
Сродство hVEGF (фирма Biacore)	1Е-10М	1Е-10М	1Е-10М

Пример 13. Экспрессия и очистка молекул биспецифических, трехвалентных с замещенным доменом <VEGF-ANG-2> антител авастин-LC06-CH1-CL, авастин-LC06-VH-VL и авастин-LC06-VH-VL-SS

Подобно процедурам, описанным в примере 1 и в разделе материалов и методов, приведенном выше, молекулы биспецифических, двухвалентных с замещенным доменом <VEGF-ANG-2> антител авастин-LС06-CH1-CL (CH-CL замещены согласно описанию в WO 2009/080253), авастин-LC06-VH-VL (VH-VL замещены согласно описанию в WO 2009/080252) и авастин-LC06-VH-VL-SS (VH-VL замещены согласно описанию в WO 2009/080252 и дополнительно интродуцирован дисульфидный мостик VH44 VL100), основанные на <VEGF> бевацизумабе и <ANG-2> Ang2i-LC06, экспрессируют и очищают. Связывающее сродство и другие свойства определяют согласно описанному выше в примерах. Значимые (со временем модифицированные) аминокислотные последовательности легкой и тяжелой цепей таких биспецифических антител

представлены в последовательностях SEQ ID NO:121-124 (авастин-LC06-СН1-CL), в последовательностях SEQ ID NO:125-128 (авастин-LC06-VH-VL) и в последовательностях SEQ ID NO:129-132 (авастин-LC06-VH-VL-SS).

Основные данные	авастин-LC06-CM-CH1-CL	авастин-LC06-CM-VH-VL	авастин-LC06-VH-VL-SS
Экспрессия (продуктивность)	87 мкг/мл	44 мкг/мл	65 мкг/мл
Очистка (выход, очистка до гомогенного состояния с помощью белка А)	50 мг, 62%	22 мг, 95%	91 мг, 74%
Гомогенность после препаративной высокоэффективной эксклюзионной хроматографии (ВЭЭХ)	84%	>99%	95%
Функция
Сродство hANG-2 (фирма Biacore)	1,3Е-9М	2,1Е-9М	1,46Е-9М
Сродство hVEGF (фирма Biacore)	1Е-10М	1Е-10М	1Е-10М

Пример 14. Экспрессия и очистка молекул биспецифических двухвалентных ScFab-Fc гибридных <VEGF-ANG-2> антител авастин-LC06-N-scFab и авастин-LC06-N-scFabSS

Подобно процедурам, описанным в примере 1 и в разделе материалов и методов, приведенном выше, молекулы биспецифического, двухвалентного ScFab-Fc гибридного <VEGF-ANG-2> антитела авастин-LC06-N-scFab и авастин-LC06-N-scFabSS, основанного на <VEGF> бевацизумабе и <ANG-2> Ang2i-LC06, экспрессируют и очищают. Связывающее сродство и другие свойства определяют согласно описанному выше в примерах. Значимые модифицированные аминокислотные последовательности тяжелой цепи таких биспецифических антител представлены в последовательностях SEQ ID NO:133-134 (Авастин-LC06-N-scFab) и в последовательностях SEQ ID NO:135 -136 (Авастин-LC06-N-scFabSS).

Основные данные	авастин-LC06-N-scFab	авастин-LC06-К-scFabSS
Экспрессия (продуктивность)		62 мкг/мл
Очистка (выход, очистка до гомогенного состояния с помощью белка А)		43%
Функция
Сродство hANG-2 (фирма Biacore)		1 нМ
Сродство hVEGF (фирма Biacore)		1 нМ

Пример 15. Подавление связывания hVEGF с рецептором hVEGF (ELISA), блокирование VEGF-индуцированного формирования трубок, подавление связывания huANG-2 с Tie-2 (ELISA), фосфорилирование Tie-2 и пролиферация HUVEC молекул биспецифического <VEGF-ANG-2> антитела из примеров 10-14

Подавление связывания hVEGF с рецептором hVEGF (ELISA), блокирование VEGF-индуцированного формирования трубок, подавление связывания huANG-2 с Tie-2 (ELISA), фосфорилирование Tie2 и пролиферация HUVEC молекул биспецифического <VEGF-ANG-2> антитела из примеров 10-14 могут быть определены подобно процедурам, описанным в разделе материалов и методов и в примерах 4-9, приведенных выше.

Пример 16. Эффективность in vivo биспецифического антитела <VEGF-ANG-2> в сравнении с <ANG-2> ANG2J-LC06 и комбинацией <ANG-2> ANG2i-LC06 и авастина в неподдающейся лечению модели ксенотрансплантата Со1о205 бежевых мышей линии Scid (после устойчивости к лечению бевацизумабом (авастином))

Линии клеток и условия культивирования:

Клетки колоректального рака человека Соlо205, первоначально полученные из коллекции АТСС и затем размноженные, депонируют во внутреннем банке клеток Roche Penzberg. Линию раковых клеток культивируют обычным способом в среде RPMI 1640 (РАА, Laboratories, Австрия), обогащенной 10% фетальной сыворотки теленка (РАА, Laboratories, Австрия) и 2 мМ L-глутамин, при 37°С во влажной атмосфере с 5% СO₂. Для трансплантации используют 2-5 пассажи.

Животные

Самок бежевых мышей линии SCID, возраст 4-5 недель на момент поставки (фирма Charles River, Германия), поддерживают в специфических условиях, исключающих наличие патогенов, при суточных циклах 12 ч света/12 ч темноты по установленным правилам (GV-Solas; Felasa; TierschG). Протокол исследования рассматривает и утверждает местный орган власти. После поставки животных содержат в условиях карантина в течение одной недели, чтобы они привыкли к новым условиям содержания и для наблюдения за ними. Постоянный мониторинг состояния здоровья проводят на регулярной основе. Диетическое питание (Provimi Kliba 3337) и воду (закисленную до pH 2,5-3) предоставляют по потребности. Возраст мышей в начале исследования составляет примерно 10 недель.

Инъекция опухолевых клеток

В день инъецирования опухолевые клетки собирают (трипсин-EDTA) из флаконов для культивирования (фирма Greiner) переносят в 50 мл культуральной среды, один раз промывают и ресуспендируют в ФСБ. После дополнительной стадии промывания в ФСБ и фильтрации (клеточный фильтр; Falcon 0100 мкм) конечный титр клеток доводят до 2,5 х 10⁷ / мл. Суспензию опухолевых клеток тщательно перемешивают пипеткой, чтобы избежать агрегирования. Затем суспензией заполняют туберкулиновый фильтр объемом 1,0 мл (фирма Braun Melsungen), используя широкую иглу (1,10 х 40 мм); для инъекции размер иглы меняют (0,45 х 25 мм) и для каждой инъекции используют новую иглу. Анестезию проводят, используя ингалятор Stephens для мелких животных в камере предварительного содержания (из плексиглаза), индивидуальные носовые маски для мышей (из силикона) и невоспламеняющееся и невзрывоопасное соединение Isoflurane (фирма cp-pharma) в закрытой системе циркуляции. За двое суток до инъекции у животных сбривают шерсть; при инъекции клеток у анестезированных животных анатомическим пинцетом аккуратно оттягивают кожу и по 100 мкл клеточной суспензии (=2,5×10⁶ клеток) вводят животным инъекцией под кожу в правый бок.

Лечение животных

Предварительная обработка:

Лечение животных начинают с 14 суток после трансплантации клеток (исследование Ang2_PZ_Colo205_008) при среднем объеме опухоли 100 мм³ до 150 мм³ соответственно. Мышей обрабатывают раз в неделю авастином (10 мг/кг) в течение периода длительностью 5 недель.

Вторичная обработка:

Затем мышей рандомизируют для второй обработки и разделяют на четыре группы по 10 мышей в каждой. Объем опухоли в начале второй обработки на 51 сутки находится в диапазоне 336-341 мм³. Мышам раз в неделю внутрибрюшинно вводят разные соединения согласно указанному в приводимой ниже таблице.

Группа	Число животных	Соединение	Доза (мг/кг) (нМ/кг)	Способ введения	Число обработок	Кумулятивная доза (мг/кг)
1	10	Авастин	10 мг/кг (68 нМ/кг)	Внутрибрюшинно раз в неделю	11	110
2	10	ANG2i-LC06	10 мг/кг (68 нМ/кг)	Внутрибрюшинно раз в неделю	6	60
3	10	ANG2i-LC06+Авастин	10 мг/кг (68 нМ/кг)+10 мг/кг (68 нМ/кг)	Внутрибрюшинно раз в неделю Внутрибрюшинно раз в неделю	6	60
3	10	ANG2i-LC06+Авастин	10 мг/кг (68 нМ/кг)+10 мг/кг (68 нМ/кг)	Внутрибрюшинно раз в неделю Внутрибрюшинно раз в неделю	11	110
4	10	TvAb-2441-бевацизумаб-LC06	13 мг/кг (64 нМ/кг)	Внутрибрюшинно раз в неделю	6	78

Мониторинг:

Состояние здоровья у животных оценивают дважды в неделю. Массу тела определяют дважды в неделю после инъекции клеток. Размеры опухоли измеряют циркулем, начиная в день постановки эксперимента и затем дважды в неделю на протяжении всего периода лечения. Объем опухоли рассчитывают по протоколу NCI (массы опухоли=1/2ab², где «а» и «б» означают длинный и короткий диаметры опухоли соответственно). Критериями прекращения исследования являются критическая масса опухоли (до 1,7 г или ⌀>1,5 см), потеря массы тела более чем на 20% от исходного уровня, изъязвление опухоли или плохое общее состояние животных.

Результаты: ингибирование роста опухоли (ИРО) на 91 сутки, основанное на средних величинах (%)

	ИРО
ANG2i-LC06 10 мг/кг (68 нМ/кг) внутрибрюшинно; авастин 10 мг/кг (68 нМ/кг) внутрибрюшинно	45,3
ANG2i-LC06 10 мг/кг внутрибрюшинно (68 нМ/кг)	44,4
TvAb-2441-бевацизумаб-LC06_13 мг/кг внутрибрюшинно (64 нМ/кг)	60,4

Результаты показывают, что биспецифическое <VEGF-ANG-2> антитело TvAb-2441-бевацизумаб-LC06 проявляет повышенное подавление роста опухоли (в пониженных дозах) в бевацизумаб(авастин)-устойчивых ксенотрансплантантных опухолях модели Соlо205 у бежевых мышей Scid по сравнению с лечением моноспецифическим антителом ANG2i-LC06, отдельно или в комбинации ANG2i-LC06 и авастина.

Пример 17. In vivo подавление опухолевого ангиогенеза при подкожном ксенотрансплантате Calu-3 НМКРЛ

Выявление через неинвазивную визуализацию in vivo ангиогенеза, используя анти-СР31 метку

Линии клеток и условия культивирования

Линия клеток аденокарциномы легких человека происходит от мужчины европеоидной расы с раком легких. Клетки получают от фирмы Roche, Kamakura и пассируют самостоятельно для используемого в работе банка клеток. Раковые клетки культивируют обычным образом в среде RPMI1640 (фирма PAN Biotech, Германия), обогащенной 10% фетальной сывороткой теленка (фирма PAN Biotech, Германия) и 2 мМ L-глутимином (фирма PAN Biotech, Германия) при 37°С во влажной атмосфере с 5% СО₂. Пассаж культуры проводят с трипсином/ EDTA 1×(PAN), проводя расщепление один раз в неделю.

Животные

Самок голых мышей линии BALB/c, возраст 4-5 недель на момент поставки (фирма Charles River, Германия), поддерживают в специфических условиях, исключающих наличие патогенов, при суточных циклах 12 ч света/12 ч темноты по установленным правилам (GV-Solas; Felasa; TierschG). Протокол исследования рассматривает и утверждает местный орган власти. После поставки животных содержат в условиях карантина в течение одной недели, чтобы они привыкли к новым условиям содержания и для наблюдения за ними. Постоянный мониторинг состояния здоровья проводят на регулярной основе. Диетическое питание (Provimi Kliba 3337) и воду (закисленную до pH 2,5-3) предоставляют по потребности. Возраст мышей в начале исследования составляет примерно 10 недель.

Инъекция опухолевых клеток

В день проведения инъекций раковые клетки собирают (трипсином-EDTA) во флаконах для культивирования (фирма Greiner) и переносят в 50 мл культуральной среды, промывают один раз и ресуспендируют в ФСБ. После стадии дополнительного промывания ФСБ и фильтрации (клеточный фильтр; Falcon 0100 мкм) итоговый титр клеток подводят до 5,0×10⁷/мл. Суспензию раковых клеток тщательно перемешивают пипеткой, чтобы избежать агрегирования клеток. Затем суспензию клеток помещают в туберкулиновый шприц объемом 1,0 мл (фирма Braun Melsungen), используя толстую иглу (1,10×40 мм); для инъекции берут другую иглу (0,45×25 мм) и для каждой инъекции используют новую иглу. Анестезию проводят, используя ингалятор Stephens для мелких животных в камере предварительного содержания (из плексиглаза), индивидуальные носовые маски для мышей (из силикона) и невоспламеняющееся и невзрывоопасное соединение Isoflurane (фирма ср-pharma) в закрытой системе циркуляции. За двое суток до инъекции у животных сбривают шерсть; при инъекции клеток у анестезированных животных анатомическим пинцетом аккуратно оттягивают кожу и по 100 мкл клеточной суспензии (=5×10⁶ клеток) вводят животным инъекцией под кожу в правый бок.

Лечение животных

На 35 сутки исследования мышей рандомизируют на группы статистического распределения в зависимости от массы тела и размера опухоли. Для лечения терапевтическими антителами в каждой группе, состоящей из 10 мышей, лечение терапевтическими антителами проводят раз в неделю внутрибрюшинным введением в течение 6 недель (см. фиг.19).

Группа 1: растворитель (Xolair) 10 мг/кг

Группа 2: авастин 10 мг/кг

Группа 3: комбинация моноспецифического антитела <VEGF> авастин 10 мг/кг+моноспецифическое антитело <ANG-2> Ang2i-LC06 10 мг/кг (=Авастин / Ang2i-LC06)

Группа 4: Биспецифическое <VEGF-ANG-2> антитело 2441-авастин-scFv-LC06 13,3 мг/кг

Мониторинг

Мониторинг кровеносных сосудов и ангиогенеза с меченым анти-СР31 антителом

Предварительные исследования показывают, что анти-СР3 1 антитело является наилучшим агентом для визуализации кровеносной сети опухоли. Этот агент нацеливает рецепторы эндотелия мыши CD31 и визуализирует отдельные кровеносные сосуды с низким соотношением сигнала к фону. Соответственно, визуализация для анти-СР31 антитела представляет реальную возможность визуализации сосудистой сети опухоли. По три мыши из каждой группы лечения выбирают и животным инъецируют внутривенно 50 мкг/мышь анти-СР3 антитела, меченного ковалентно органическим флюорофором Аlеха610 на 35, 49 и 79 сутки. Визуализацию в ближней инфракрасной части спектра проводят через 24 ч после каждого применения меченого антитела при анестезии путем ингаляции. Повышение и снижение сосудистой сети опухоли визуализируют применением системы MAESTRO для сравнения изображений. При лечении контрольным Mab Xolair и терапевтическим антителом авастином наблюдают повышение кровеносных сосудов опухоли с 35 по 79 сутки.

Напротив, комбинированное лечение авастином+Ang2i-LC06 и 2441-авастин-scFv-LC06 демонстрирует снижение сосудистой сети опухоли (фиг.19).

Площадь опухолевых областей подсчитывают вручную и определяют интенсивность сигнала (общий сигнал/время экспозиции). Средние изменения сигналов CD31 с 35 по 49 сутки и с 49 по 79 сутки наносят на фиг.19. Во всех группах наблюдают повышение сосудистой сети опухоли с 35 по 49 сутки. Хотя сигналы опухоли CD31 неуклонно повышались в группе 1 (продукт Xolair) и в группе 2 (авастин), сосудистая сеть опухоли существенно снижалась в группе 3 (комбинация авастина плюс <ANG-2> Ang2i-LC06) и в группе 4 (биспецифическое <VEGF-ANG-2> антитело 2441-авастин-scFv-LC06), причем в группе 4 четко проявляется наиболее выраженный антиангиогенный эффект (фиг.19).

Сразу после последнего визуального исследования in vivo опухоли удаляют (на 79 сутки), фиксируют в формалине и погружают в парафин для исследований ex vivo. Флуоресцентная микроскопия показывает многочисленные хорошо выраженные капилляры в опухолях, обработанных контрольным Mab Xolair. Некоторое количество кровеносных сосудов в опухоли наблюдают у мышей, обработанных авастином. Напротив, в группах лечения 3 и 4 существенно меньше кровеносных сосудов и они менее выражены в опухолях по сравнению с группами лечения 1 и 2, а в группе 4 наблюдают наиболее выраженный эффект. В группе 4 наблюдают меньшую плотность микрососудов, капилляры обычно меньше в размере и неструктурированные и слабее проявляются анти-СБ31 флуоресцентные сигналы по сравнению с группами 1, 2 и 3. Гистохимическое НЕ-окрашивание показывает некротические области внутри опухолей, занимающие до 90% во всех образцах в группе лечения биспецифическим антителом группы 4, которое очевидно превышает эффективность лечения для всех других групп лечения.

Пример 18. Эффективность in vivo биспецифических антител <VEGF-ANG-2> и сравнение с исходными моноспецифическими антителами (отдельно или в комбинации) в постадийной модели подкожного ксенотрансплантата Соlо205 у бежевых мышей линии Scid

Линии клеток и условия культивирования

Животные

Инъекция опухолевых клеток

В день инъекции клетки Соlо205 центрифугируют, однократно промывают и ресуспендируют в ФСБ. После дополнительного промывания ФСБ определяют концентрацию клеток и размер клеток, используя счетчик клеток и систему анализа (Vi-CELL, Beckman Coulter). Для инъекции клеток Соlо205 итоговый титр доводят до 5,0×10⁷ клеток/мл, выживаемость примерно составляет 90%. Затем 100 мкл этой суспензии, соответствующей 2,5×10⁶ клеток на животное, вносят подкожной инъекцией мышам в правый бок.

Лечение животных начинают в день рандомизации на 16 сутки после трансплантации клеток (исследование Ang2_PZ_Colo205_009) при среднем объеме опухоли 100 мм³ соответственно.

Схема дозирования в исследовании Ang2_PZ_Colo205_009:

Число животных	Соединение	Доза (мг/кг)	Способ введения
10	Растворитель Xolair	10	Внутрибрюшинно раз в неделю
10	<VEGF> авастин	10	Внутрибрюшинно раз в неделю
10	<ANG-2> Ang2i-LC06	10	Внутрибрюшинно раз в неделю
10	Ang2i-LC06+авастин	10	Внутрибрюшинно раз в неделю
10	Ang2i-LC06+авастин	10	Внутрибрюшинно раз в неделю
10	<VEGF-ANG-2> TvAb-2441-бевацизумаб-LC06	13,3	Внутрибрюшинно раз в неделю
10	<VEGF-ANG-2> авастин-LC06-CHl-CL	20	Внутрибрюшинно раз в неделю
10	<VEGF-ANG-2> scFAb-авастин-LC06-2620	16,6	Внутрибрюшинно раз в неделю

Мониторинг:

Результаты:

Ингибирование роста опухоли (ИРО) на 61 сутки, основанное на средних величинах (%)

		ИРО
<VEGF> авастин		66
<ANG-2> Ang2i-LC06		47
Ang2i-LC06+авастин		78
	ИРО
<VEGF-ANG-2> TvAb-2441-бевацизумаб-LC06	87
<VEGF-ANG-2> ввастин-LC06-CH1-CL	92
<VEGF-ANG-2> scFAb-aBacraH-LC06-2620	86

Результаты показывают, что все три биспецифических <VEGF-ANG-2> авастин (бевацизумаб)-ANG2i-LC06 антитела (все основаны на последовательностях бевацизумаба SEQ ID NO:7 и 8 и на ANG2i-LC06 последовательностях SEQ ID NO:52 и 53) проявляют повышенное подавление роста опухоли на модели трансплантата Соlо205 у бежевых мышей Scid по сравнению с лечением моноспецифическими антителами ANG2i-LC06 и только одним авастином или комбинацией ANG2i-LC06 и авастина.

Пример 19. Экспрессия, очистка и свойства молекул биспецифических антител <VEGF-ANG-2> , а именно scFAb-авастин-LC 10-2620, scFab-авастин-LC10-2640 и scFab-авастин-LC 10-2641, авастин-LC10-KiH-C-scFab, авастин-LC10-C-Fab-6CSS, авастин-LC10-CHl-CL, авастин-LC10-VH-VL и авастин-LC10-VH-VL-SS, авастин-LC10-N-scFab и авастин-LC10-N-scFabSS

Путем замещения доменов VH и VL антитела Ang2i-LC06 (SEQ ID NO:52 и 53) соответствующими доменами VH и VL антитела Ang2i-LC10 (SEQ ID NO:84 и 85) и используя (кроме такого замещения) аналогичные процедуры и последовательности, описанные в примерах 10-14, молекулы биспецифических антител <VEGF-ANG-2> , а именно scFAb-авастин-LC10-2620, scFab-авастин-LC10-2640 и scFab-авастин-LC 10-2641, авастин-LC10-KiH-C-scFab, авастин-LC10-C-Fab-6CSS, авастин-LC10-CHl-CL, авастин-LC10-VH-VL и авастин-LC10-VH-VL-SS, авастин-LC10-N-scFab и авастин-LC10-N-scFabSS, все основанные на <VEGF> бевацизумабе и <ANG-2> Ang2i-LC10, экспрессированы и очищены.

Связывающее сродство и другие свойства определяют in vitro согласно описанию в примерах выше.

Пример 20. In vivo эффективность молекул биспецифического антитела <VEGF-ANG-2>, а именно scFAb-авастин-LC10-2620, scFab-авастин-LC10-2640 и scFab-авастин-LC10-2641, авастин-LC10-KiH-C-scFab, авастин-LC10-C-Fab-6CSS, авастин-LC10-CHl-CL, авастин-LC10-VH-VL и авастин-LC10-VH-VL-SS, авастин-LC10-N-scFab и авастин-LC10-N-scFabSS

In vivo эффективность молекул биспецифического антитела <VEGF-ANG 2> , а именно scFAb-авастин-LC 10-2620, scFab-авастин-LCl0-2640 и scFab-авастин-LC 10-2641, авастин-LC 10-KiH-C-scFab, авастин-LC 10-C-Fab-6CSS, авастин-LC10-CHl-CL, авастин-LC 10-VH-VL и авастин-LC 10-VH-VL-SS, авастин-LC 10-N-scFab и авастин-LC 10-N-scFabSS, определяют подобно описанному выше в соответствующих примерах.

Claims

1. Биспецифическое антитело, специфически связывающееся с фактором роста сосудистого эндотелия человека VEGF и ангиопоэтином-2 человека (ANG-2), включающее первый сайт связывания антигена, который специфически связывается с VEGF человека, и второй сайт связывания антигена, который специфически связывается с ANG-2 человека, отличающееся тем, что
i) каждый из указанных сайтов связывания антигена представляет пару вариабельного домена тяжелой цепи антитела и вариабельного домена легкой цепи антитела;
ii) указанный первый сайт связывания антигена, специфически связывающийся с VEGF, включает вариабельный домен тяжелой цепи область CDR3 последовательности SEQ ID NO:1, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:2 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:3, и вариабельный домен легкой цепи область CDR3 последовательности SEQ ID NO:4, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:5 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:6; и
iii) указанный второй сайт связывания антигена, специфически связывающийся с ANG-2, включает вариабельный домен тяжелой цепи область CDR3 последовательности SEQ ID NO:46, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:47 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:48, и вариабельный домен легкой цепи область CDR3 последовательности SEQ ID NO:49, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:50 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:51.

2. Биспецифическое антитело по п.1, отличающееся тем, что второй сайт связывания антигена, который специфически связывается с ANG-2 человека, не связывается специфически с ангиопоэтином 1 человека (ANG-1).

3. Биспецифическое антитело по п.1 или 2, отличающееся тем, что соотношение величин связывающегося сродства KD сайта связывания антигена, специфичного в отношении VEGF/KD сайта связывания антигена, специфичного в отношении ANG-2, составляет 1,0-10,0.

4. Биспецифическое антитело по одному из пп.1-3, отличающееся тем, что указанное антитело является двухвалентным.

5. Фармацевтическая композиция для лечения рака и/или сосудистых заболеваний, включающая антитело по одному из пп.1-4.

6. Фармацевтическая композиция по п.5 для лечения рака.

7. Фармацевтическая композиция по п.5 для лечения сосудистых заболеваний.

8. Биспецифическое антитело по одному из пп.1-4 для лечения рака.

9. Биспецифическое антитело по любому из пп.1-4 для лечения сосудистых заболеваний.

10. Нуклеиновая кислота, кодирующая биспецифическое антитело по одному из пп.1-4.

11. Вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту по п.10, способный экспрессировать указанную нуклеиновую кислоту в прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах.

12. Прокариотическая или эукариотическая клетка-хозяин, предназначенная для получения биспецифического антитела по пп.1-4 и включающая вектор по п.11.

13. Способ получения биспецифического антитела по одному из пп.1-4, отличающийся экспрессией нуклеиновой кислоты по п.10 в прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах и выделением указанного биспецифического антитела из указанных клеток или супернатанта культуры клеток.