RU2223316C2 - ШТАММ БАКТЕРИЙ rhodococcus ruber - ПРОДУЦЕНТ НИТРИЛГИДРАТАЗЫ - Google Patents
ШТАММ БАКТЕРИЙ rhodococcus ruber - ПРОДУЦЕНТ НИТРИЛГИДРАТАЗЫ Download PDFInfo
- Publication number
- RU2223316C2 RU2223316C2 RU2001133204/13A RU2001133204A RU2223316C2 RU 2223316 C2 RU2223316 C2 RU 2223316C2 RU 2001133204/13 A RU2001133204/13 A RU 2001133204/13A RU 2001133204 A RU2001133204 A RU 2001133204A RU 2223316 C2 RU2223316 C2 RU 2223316C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strain
- nitrile hydratase
- acrylonitrile
- rhodococcus ruber
- rhodococcus
- Prior art date
Links
- 108010024026 Nitrile hydratase Proteins 0.000 title claims abstract 5
- 241000187563 Rhodococcus ruber Species 0.000 title claims 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 3
- NLHHRLWOUZZQLW-UHFFFAOYSA-N Acrylonitrile Chemical compound C=CC#N NLHHRLWOUZZQLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 2
- 241000316848 Rhodococcus <scale insect> Species 0.000 abstract 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 abstract 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 abstract 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 abstract 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 abstract 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 abstract 1
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract 1
- 150000002825 nitriles Chemical class 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 abstract 1
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для синтеза амидов карбоновых кислот из соответствующих нитрилов. Штамм бактерий Rhodococcus ruber GT отличается быстрым ростом на простой органоминеральной среде при высокой активности нитрилгидратазы, достигающей 330 ммоль/мг/мин в отношении акрилонитрила. Нитрилгидратаза штамма Rhodococcus ruber GT термостабильна, применяется для биотехнологического синтеза акриламида гидратацией акрилонитрила в водных растворах. Изобретение обеспечивает высокую активность нитрилгидратазы в интервале концентраций получаемых амидов до 50%. 3 табл.
Description
Изобретение относится к биотехнологии и микробиологической промышленности и касается получения нового штамма бактерий, обладающего нитрилгидратазной активностью. Нитрилгидратаза-фермент, катализирующий процесс гидролиза нитрилов карбоновых кислот до соответствующих амидов.
Известны штаммы бактерий, продуцирующие фермент - нитрилгидратазу и способные к трансформации акрилонитрила в акриламид: Rhodococcus sp. N 771 [1], Rhodococcus sp. N 774 [2], Pseudomonas chlororophis B23 [3], Rhodococcus rhodochrous J-1 [4], Rhodococcus R312 [5], Rhodococcus rhodochrous M33 [6], Agrobacterium radiobacter SC-C15-1 [7]. Известен также штамм Bacillus cereus В5-продуцент нитрилгидратазы [8].
Наиболее близким по технической сущности и достигнутому результату является штамм Bacillus cereus В5. Недостатком этого штамма является быстрое снижение активности нитрилгидратазы при трансформации акрилонитрила в акриламид после достижения концентрации 40%.
Задачей изобретения является получение нового легко культивируемого штамма, с высокой активностью нитрилгидратазы в интервале концентраций получаемых амидов до 50%.
Для решения этой задачи предлагается штамм бактерий Rhodococcus ruber - продуцент нитрилгидратазы, используемый в биотехнологическом процессе получения акриламида и других амидов карбоновых кислот.
Штамм характеризуется следующими культуральными, морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.
Культуральные свойства: при росте на мясопептонном агаре штамм образует круглые колонии с блестящей или матовой поверхностью, от светло-кремового до красного цвета.
Морфологические признаки. Клетки грамположительные, не спорообразующие, факультативно анаэробные, палочковидные неправильной формы, размеры 0,6-1•2,0-25 мкм. Имеют цикл развития: ветвящиеся палочки-кокки. В возрасте 12-18 часов на мясопептонном агаре образуют слабо ветвящиеся нити, распадающиеся после 40-48 часов культивирования на короткие палочковидные и кокковидные клетки.
Хемотаксономические признаки: в клеточной стенке содержатся миколовые кислоты. LCN-A характерный для Rhodococcus ruber, арабиноза и галактоза. Основная диаминокислота клеточной стенки - мезо-диаминопимелиновая кислота.
Биохимические свойства приведены в табл. А.
Физиологические свойства: Температура роста 10-40oС, оптимальное значение 28-30oС. Штамм растет при рН 5-10, оптимальное значение рН 7,2. Штамм образует кислоту при росте на глюкозе, сахарозе и многоатомных спиртах. Не гидролизует желатин, крахмал и целлюлозу. В качестве источников азота использует соединения аммония и нитраты.
Чувствительность к антибактериальным препаратам:
Штамм чувствителен к хлорамфениколу, бензилпенициллину, ампициллину, канамицину, мономицину, стрептомицину, тетрациклину.
Штамм чувствителен к хлорамфениколу, бензилпенициллину, ампициллину, канамицину, мономицину, стрептомицину, тетрациклину.
Патогенность: штамм непатогенный.
На основании этих характеристик штамм был отнесен к виду Rhodococcus ruber, Штамм депонирован в Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганимов, под 612 от 27.11.2001.
Культура используемого в данном изобретении штамма бактерий может быть получена на различных видах сред, включающих различные источники углерода и азота, органические и неорганические соли, которые широко используются для получения культуры обычных бактерий.
Ферментативную активность определяли с использованием в качестве субстратов нитрилов карболовых кислот. За единицу удельной нитрилгидратазной активности принимали количество нитрилгидратазы, содержащейся в 1 мг сухого веса клеток, катализирующей образование 1 мкмоль амида в минуту (мкМ амид/мг сух.вес.•мин).
Примеры конкретного выполнения.
Пример 1. Заявляемый штамм Rhodococcus ruber GT был выделен из почвы следующим образом.
1,0 г почвы вносили в 100 мл среды следующего состава, г/л:
Глюкоза - 1
Ацетонитрил - 1
KH2PO4 - 0,8
K2HPO4•3H2O - 1,5
NaCl - 1
MgSO4•7H2O - 0,5
FeSO4•7H2O - 0,1
CoCl2•6H2O - 0,01
pH - 7,2
Суспензию культивировали в колбах Эрленмейера объемом 250 мл 3 суток при температуре 28oС и аэрации. 2 мл полученной суспензии ресуспендировали в 100 мл той же среды. Через двое суток отбирали 1 мл культуральной жидкости, серийно разводили в физиологическом растворе и высевали на агаризированную среду (1,5% агар-агара) с теми же компонентами. После инкубации в течение 72 ч при 30oС отбирали отдельные колонии и изучали их способность к трансформации акрилонитрила в акриламид. В результате был выделен штамм Rhodococcus ruber GT, обладающий нитрилгидратазной активностью.
Глюкоза - 1
Ацетонитрил - 1
KH2PO4 - 0,8
K2HPO4•3H2O - 1,5
NaCl - 1
MgSO4•7H2O - 0,5
FeSO4•7H2O - 0,1
CoCl2•6H2O - 0,01
pH - 7,2
Суспензию культивировали в колбах Эрленмейера объемом 250 мл 3 суток при температуре 28oС и аэрации. 2 мл полученной суспензии ресуспендировали в 100 мл той же среды. Через двое суток отбирали 1 мл культуральной жидкости, серийно разводили в физиологическом растворе и высевали на агаризированную среду (1,5% агар-агара) с теми же компонентами. После инкубации в течение 72 ч при 30oС отбирали отдельные колонии и изучали их способность к трансформации акрилонитрила в акриламид. В результате был выделен штамм Rhodococcus ruber GT, обладающий нитрилгидратазной активностью.
Пример 2. Выращивание бактериальных клеток штамма Rhodococcus ruber GT, обладающих нитрилгидратазной активностью.
Для выращивания штамма Rhodococcus ruber GT была использована синтетическая среда N следующего состава, г/л: КН2РО4 - 1.0, К2НРО4•3Н2О - 1.6, NaCl - 0.5, MgSO4•7H2O - 0.5, СаСl2 - 0.005, дополненная 2,5 мл/л раствора микроэлементов, содержащего FeSO4•7H2O - 10.0, СоСl2•6Н2О - 10.0, pH среды 7.2±0.2. В качестве источника углерода использовали 40% раствор глюкозы - 2.5 мл/л среды. Источником азота служил 1М раствор NH4Cl или (NН4)2SO4 - 5 мл/л среды. В качестве индуктора добавляли 1М ацетамид до конечной концентрации 10 мМ.
Из среды периодически отбирали пробы для определения концентрации клеток и их нитрилгидратазной активности. Активность нитрилгидратазы в отношении акрилонитрила при выходе культуры в стационарную фазу (период максимального накопления биомассы) была не менее 120 ед.
Пример 3 Использование штамма Rhodococcus ruber GT для трансформации акрилонитрила в акриламид.
Клетки культивировали в среде следующего состава, г/л:
Глюкоза - 1
Ацетонитрил - 1
KH2PO4 - 0,8
K2HPO4•3H2O - 1,5
NaCl - 1
MgSO4•7H2O - 0,5
FeSO4•7H2O - 0,1
pH - 7,2
Из среды периодически отбирали пробы для определения концентрации клеток и их нитрилгидратазной активности. Концентрацию клеток определяли фотометрически при длине волны 540 нм.
Глюкоза - 1
Ацетонитрил - 1
KH2PO4 - 0,8
K2HPO4•3H2O - 1,5
NaCl - 1
MgSO4•7H2O - 0,5
FeSO4•7H2O - 0,1
pH - 7,2
Из среды периодически отбирали пробы для определения концентрации клеток и их нитрилгидратазной активности. Концентрацию клеток определяли фотометрически при длине волны 540 нм.
Активность нитрилгидратазы оценивали следующим образом. 1 мл культуральной жидкости центрифугировали, клетки отмывали 0,01 М фосфатным буфером, рН 7,2. Клетки ресуспендировали в том же буфере до значения оптической плотности 0,1-0,6 (А 540 нм). К 2 мл клеточной суспензии добавляли акрилонитрил в количестве 30 мкл. Реакцию проводили при 25oС в течение 10 мин, а затем останавливали добавлением 0,1 мл 1 н. НСl. Бактериальные клетки отделяли центрифугированием. Концентрацию акриламида в надосадочной жидкости анализировали методом газожидкостной хроматографии. В качестве контроля использовали серийные разведения чистых препаратов акрилонитрила, акриламида и акриловой кислоты. Активность нитрилгидратазы в отношении акрилонитрила достигала 330 ед.
Пример 4. Использование штамма Rhodococcus ruber GT для трансформации нитрилов карбоновых кислот в соответствующие амиды.
Подготовку культуры Rhodococcus ruber GT и процесс трансформации нитрилов проводили аналогично примеру 2. В качестве субстратов реакции использовали нитрилы: ацетонитрил, пропионитрил, бутиронитрил, изобутиронитрил, акрилонитрил, адипонитрил, малонодинитрил и бензонитрил в количестве 30 мкл. Активность нитрилгидратазы оценивали аналогично примеру 2. Концентрацию амидов в надосадочной жидкости анализировали методом газожидкостной хроматографии. Активность нитрилгидратазы в отношении ацетонитрила достигала 590 ед.
Пример 5. Конверсия акрилонитрила в акриламид с применением штамма Rhodococcus ruber GТ
Клетки Rhodococcus ruber GT выращивали в ферментере объемом 10 л. Биомассу бактерий выделяли центрифугированием при 12000g 10 мин. Полученную биомассу с удельной активностью более 150 ед. использовали для синтеза акриламида. Синтез проводили в лабораторном термостатируемом химическом реакторе объемом 2 л при температуре 18-21oС, рН 7.3. Дозирование акрилонитрила осуществлялось таким образом, чтобы его концентрация не превышала 0,5%. За 7 часов синтеза получали 49-54% растворы акриламида. Выход акриламида составлял 99%. Акриловая кислота и остаточный акрилонитрил в реакционной массе не обнаружены.
Клетки Rhodococcus ruber GT выращивали в ферментере объемом 10 л. Биомассу бактерий выделяли центрифугированием при 12000g 10 мин. Полученную биомассу с удельной активностью более 150 ед. использовали для синтеза акриламида. Синтез проводили в лабораторном термостатируемом химическом реакторе объемом 2 л при температуре 18-21oС, рН 7.3. Дозирование акрилонитрила осуществлялось таким образом, чтобы его концентрация не превышала 0,5%. За 7 часов синтеза получали 49-54% растворы акриламида. Выход акриламида составлял 99%. Акриловая кислота и остаточный акрилонитрил в реакционной массе не обнаружены.
Заявляемый бактериальный штамм на основании таксономического изучения отнесен к роду Rhodococcus. Штамм отличается быстрым ростом, обладает нитрилгидратазной активностью, достигающей 330 ммоль/мг/мин в отношении акрилонитрила и осуществляющей гидролиз алифатических нитрилов до амидов. Индукция нитрилгидратазы достигается при выращивании клеток Rhodococcus ruber GТ на минеральной среде, содержащей в качестве индуктора нитрилы или амиды органических кислот, например ацетонитрил или ацетамид, а в качестве источника углерода - глюкозу или другие коммерчески доступные субстраты. Максимальная активность фермента наблюдается при 38oС.
Штамм Rhodococcus ruber GT может быть использован в биотехнологических процессах получения амидов, в частности растворов акриламида с концентрацией до 50%.
Источники информации
1. Brennan B. A. , Nelson M.J, Dumey L.T., Scarrow R.C. (1996) Nitrile hydratase from Rhodococcus rhodochrous Jl contains a non-corrin cobalt ion with two sullfur ligands. J. Am. Chem. Soc. 118, 9194-9195.
1. Brennan B. A. , Nelson M.J, Dumey L.T., Scarrow R.C. (1996) Nitrile hydratase from Rhodococcus rhodochrous Jl contains a non-corrin cobalt ion with two sullfur ligands. J. Am. Chem. Soc. 118, 9194-9195.
2. Nagamune Т., Honda J., Cho W.D., Kamiya N.. Teratani Y., Hirata A., Sasabe H. , Endo I. (1991) Cristallization of a photosensitive nitrile hydratase from Rhodococcus sp. N-771. J Mol. Biol. 220, 221-222.
3. Nagasava Т., Nanba H., Ryuno K., Yamada H. (1987) Nitrile hydratase of Pseudomonas chlororophis B23. Purification and characterization. Eur. J. Biochem. 162, 691-698.
4. Brennan В.A., Alms G., Nelson M.J., Dumey L.T., Scarrow R.C. (1996b) Nitrile hydratase from Rhodococcus rhodochrous J-1 contains a non-corrin cobalt ion with two sulfur ligands. J. Am. Chem, Soc. 118, 9194-9195.
5. Osprian I., Jarret C., Strauss U., Kroutil W., Orru R.V.A., Feifer U. , Willetts A.J., Faber K. Large-scale preparation of a nitrile-hydrolysing biocatalyst: Rhodococceus R 312 (CBS 717.73) // J. Mol. Catalysis B: Enzymatic 6 (1999) 555-560.
6. Патент RU 2053300.
7. Патент US 05395758.
8. Патент RU 2160778.
Claims (1)
- Штамм бактерий Rhodococcus ruber GT - продуцент нитрилгидратазы.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2001133204/13A RU2223316C2 (ru) | 2001-12-06 | 2001-12-06 | ШТАММ БАКТЕРИЙ rhodococcus ruber - ПРОДУЦЕНТ НИТРИЛГИДРАТАЗЫ |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2001133204/13A RU2223316C2 (ru) | 2001-12-06 | 2001-12-06 | ШТАММ БАКТЕРИЙ rhodococcus ruber - ПРОДУЦЕНТ НИТРИЛГИДРАТАЗЫ |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2001133204A RU2001133204A (ru) | 2003-06-20 |
RU2223316C2 true RU2223316C2 (ru) | 2004-02-10 |
Family
ID=32172187
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2001133204/13A RU2223316C2 (ru) | 2001-12-06 | 2001-12-06 | ШТАММ БАКТЕРИЙ rhodococcus ruber - ПРОДУЦЕНТ НИТРИЛГИДРАТАЗЫ |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2223316C2 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2520870C1 (ru) * | 2012-12-27 | 2014-06-27 | Кемира Оюй | Штамм бактерий rhodococcus aetherivorans bkm ac-2610d - продуцент нитрилгидратазы, способ его культивирования и способ получения акриламида |
-
2001
- 2001-12-06 RU RU2001133204/13A patent/RU2223316C2/ru not_active IP Right Cessation
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2520870C1 (ru) * | 2012-12-27 | 2014-06-27 | Кемира Оюй | Штамм бактерий rhodococcus aetherivorans bkm ac-2610d - продуцент нитрилгидратазы, способ его культивирования и способ получения акриламида |
US9518279B2 (en) | 2012-12-27 | 2016-12-13 | Kemira Oyj | Bacterial strain Rhodococcus aetherivorans VKM Ac-2610D producing nitrile hydratase, method of its cultivation and method for producing acrylamide |
US10138459B2 (en) | 2012-12-27 | 2018-11-27 | Kemira Oyj | Bacterial strain Rhodococcus aetherivorans VKM Ac-2610D producing nitrile hydratase, method of its cultivation and method for producing acrylamide |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR0134094B1 (ko) | 아미드의 생물학적 제조방법 | |
SU1512488A3 (ru) | Способ получени амида | |
RU2053300C1 (ru) | Штамм бактерий rhodococcus rhodochrous - продуцент нитрилгидратазы | |
EP0610049B1 (en) | Process for producing optically active alpha-hydroxycarboxylic acid having phenyl group | |
US5179014A (en) | Process for the preparation of amides using microorganisms | |
US5200331A (en) | Method of producing an amide utilizing a microorganism | |
KR870001811B1 (ko) | 미생물을 이용한 아미드의 제조방법 | |
JPH0338836B2 (ru) | ||
JP3154646B2 (ja) | グリコール酸の微生物学的製造法 | |
KR20040086309A (ko) | 효소 촉매의 조합을 사용하여 메타크릴산 및 아크릴산을제조하는 방법 | |
RU2223316C2 (ru) | ШТАММ БАКТЕРИЙ rhodococcus ruber - ПРОДУЦЕНТ НИТРИЛГИДРАТАЗЫ | |
JP2696424B2 (ja) | R(‐)―マンデル酸の製造法 | |
JPH04304892A (ja) | グリシンの生物学的製造法 | |
Gerasimova et al. | Screening, Characterization and Application of Cyanide‐resistant Nitrile Hydratases | |
RU2304165C1 (ru) | Способ получения акриловых мономеров и штамм бактерий rhodococcus rhodochrous для его осуществления | |
JPH04365491A (ja) | 4−ハロ−3−ヒドロキシブチルアミドの製造法 | |
SU1731814A1 (ru) | Штамм бактерий RноDососсUS RноDоснRоUS - продуцент нитрилгидратазы | |
RU2196822C1 (ru) | Штамм бактерий rhodococcus erythropolis - продуцент нитрилгидратазы | |
JP2670838B2 (ja) | L―α―アミノ酸類の製造方法 | |
JPH0440899A (ja) | α―ヒドロキシ―4―メチルチオブチルアミドの生物学的製造法 | |
RU2160778C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus сereus-продуцент нитрилгидратазы | |
JP3081649B2 (ja) | S−(+)−マンデルアミドおよびその誘導体の製造法 | |
JPH0681597B2 (ja) | アミド化合物の製造法 | |
RU2177034C1 (ru) | Штамм бактерий alcaligenes denitrificans-продуцент нитрилазы | |
RU2081169C1 (ru) | Штамм бактерий alcaligenes species - продуцент нитрилазы |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20111207 |